コーヒー抽出物
本発明は、抗酸化及び抗炎症性特性を有するコーヒー抽出物を生成する方法、並びに本発明の抽出物の使用に関する。コーヒー抽出物は、コーヒー酸及び／又はフェルラ酸を含み、例えば微生物又は酵素で、コーヒー抽出物中に存在するクロロゲン酸を加水分解することによって生成できる。本発明のコーヒー抽出物は、例えば、食物又は飲料製品の成分として使用されてもよい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗酸化及び抗炎症性特性を有する改良されたコーヒー抽出物を生成する方法、抽出物を生成する方法、並びに本発明の抽出物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
コーヒー並びにカフェイン及びジテルペン（例えば、カフェストール、カーウェオール）などのコーヒー活性化合物は、げっ歯動物において解毒酵素（例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼＧＳＴ）を誘導することが示された（Ｃａｖｉｎ Ｃ．ら、１９９８年、「コーヒーに特有のジテルペンであるカフェストール及びカーウェオールは、二重機構によってアフラトキシンＢ１に誘導される遺伝毒性を防ぐ（Ｔｈｅ ｃｏｆｆｅｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｉｔｅｒｐｅｎｅｓ ｃａｆｅｓｔｏｌ ａｎｄ ｋａｈｗｅｏｌ ｐｒｏｔｅｃｔ ａｇａｉｎｓｔ ａｆｌａｔｏｘｉｎ Ｂ１−ｉｎｄｕｃｅｄ ｇｅｎｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｔｒｏｕｇｈ ａ ｄｕａｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．）。」、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ、１９巻、１３６９〜１３７５頁、Ｃａｖｉｎ，Ｃ．ら、２００３年、「コーヒーのジテルペンは、ラット及びヒトの培養系において、ベンゾ［ａ］ピレンの遺伝毒性を妨げる（Ｃｏｆｆｅｅ ｄｉｔｅｒｐｅｎｅｓ ｐｒｅｖｅｎｔ ｂｅｎｚｏ［ａ］ｐｙｒｅｎｅ ｇｅｎｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ ｒａｔ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｙｓｔｅｍｓ．）。」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ、３０６巻、４８８〜４９５頁、Ｈｕｂｅｒ，Ｗ．ら、２００２年ａ、「コーヒー成分であるカーウェオール及びカフェストールによる、ラットの特定の器官における化学的予防酵素であるグルクロニルトランスフェラーゼ及びグルタチオントランスフェラーゼの強化（Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｃｈｅｍｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｎｚｙｍｅｓ ｇｌｕｃｕｒｏｎｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ａｎｄ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｉｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｏｒｇａｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒａｔ ｂｙ ｔｈｅ ｃｏｆｆｅｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｋａｈｗｅｏｌ ａｎｄ ｃａｆｅｓｔｏｌ．）。」、Ａｒｃｈｉｖｅ ｏｆ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ、７６巻、２０９〜２１７頁）。コーヒーにより増進したＧＳＴ活性は、５日間でコーヒー８００ｍｌを摂取した後のヒトにおいて、さらに実証された（Ｓｔｅｉｎｋｅｌｌｎｅｒ，Ｈ．ら、２００５年、「コーヒー摂取は、血漿においてＧＳＴＰを誘導し、（＋／−）−抗−ベンゾ［ａ］ピレン−７，８−ジヒドロジオール−９，１０−エポキシドによって誘導されるＤＮＡ損傷からリンパ球を保護する：対照ヒト介入試験の結果（Ｃｏｆｆｅｅ ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｓ ＧＳＴＰ ｉｎ ｐｌａｓｍａ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ａｇａｉｎｓｔ （＋／−）−ａｎｔｉ−ｂｅｎｚｏ［ａ］ｐｙｒｅｎｅ−７，８−ｄｉｈｙｄｒｏｄｉｏｌ−９，１０−ｅｐｏｘｉｄｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ＤＮＡ−ｄａｍａｇｅ：ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ ｔｒｉａｌｓ．）。」、Ｍｕｔ．Ｒｅｓ．５９１巻、２６４〜２７５頁）。さらに、Ｒｉｃｈｅｌｌｅら、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．、４９巻、３４３８〜４２頁、（２００１年）は、生体外でのＬＤＬ酸化の遅延時間が、標準的な１杯分のコーヒーによって、実質的に増加することを示した。増進した全抗酸化能力は、コーヒー２００ｍｌを摂取した後、生体内でのヒト血漿においてもまた観察された（Ｎａｔｅｌｌａら、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．、５０巻、６２１１〜１６頁、２００２年）。
【０００３】
この種の抗酸化活性は、例えば癌、心臓病、退行性脳障害、及び老化に関与することがある損傷を与える遊離基を減少させることによって、「酸化ストレス」を防ぐことが知られている。
【０００４】
食物及び飲料製品の健康上の利益を増進させるために、増進した抗酸化活性やその他の有益な生物活性を有する製品を製造すること、並びに、例えば化粧及び医薬品ばかりでなく、食物及び飲料製品の特性を強化するために使用できる、抗酸化剤及び有益な生物活性を有するその他の化合物の天然源を発見することが望まれている。抗酸化特性は、分子自体の性質に本来備わっている可能性があるか、又は酸化ストレスに対する自然防御の誘導によって仲介され得る。
【発明の概要】
【０００５】
本発明者らは今、コーヒー酸の量が、乾燥物質１グラム当たり、少なくとも１ミリグラムであり、及び／又はフェルラ酸の量が、乾燥物質１グラム当たり、少なくとも０．５ミリグラムであるコーヒー抽出物を生成する方法、並びに、かかるコーヒー抽出物が、従来のコーヒー抽出物と比べて、抗酸化及び抗炎症性特性を向上させたことを見出した。したがって、本発明は、以下のステップ、ａ）水でコーヒー豆を抽出して、コーヒー抽出物を生成するステップ、及びｂ）クロロゲン酸を加水分解して、フェノール酸を生成するために、コーヒー抽出物を処理するステップを含む、コーヒー抽出物を生成する方法に関する。さらなる実施形態において、本発明は、本発明のコーヒー抽出物の使用、食物又は飲料製品を製造する方法、及び結果として生じる食物又は飲料製品に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】クロロゲン酸を加水分解する処理をしていないネスカフェレッドカップ（ＮＥＳＣＡＦＥ ＲＥＤ ＣＵＰ）（登録商標）（焙煎したコーヒー豆の抽出物）２００及び４００ｕｇ／ｍｌ、及びラクトバチルス・ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）で処理したネスカフェプロテクト（ＮＥＳＣＡＦＥ ＰＲＯＴＥＣＴ）（登録商標）２００及び４００ｕｇ／ｍｌで処理したラットの初代培養肝細胞、並びにコーヒー抽出物で処理していない対照試料におけるＧＳＴのサブユニット（ＧＳＴＡ４、ＧＳＴＰ１）及びヘム−オキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）のタンパク質発現を示すウェスタンブロットゲルの図である。詳細については、実施例１を参照されたい。
【図２】クロロゲン酸を加水分解する処理をしていないネスカフェレッドカップ（登録商標）（焙煎したコーヒー豆の抽出物）（ＲＮ）、クロロゲン酸を加水分解する処理をしていないネスカフェプロテクト（登録商標）（生及び焙煎したコーヒー豆の共抽出物）（Ｐ）、及びラクトバチルス・ジョンソニイで処理したネスカフェプロテクト（登録商標）（Ｌａ１−Ｐ）を５％含む食餌を２週間与えた雄性のラットの肝臓中での解毒酵素発現の誘導（ＧＳＴＰ１、ＮＱＯ１）を示すウェスタンブロットの図である。詳細については、実施例１を参照されたい。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明は、改良された抗酸化及び抗炎症性特性を有するコーヒー抽出物に関する。
【０００８】
本発明の一実施形態において、コーヒー抽出物は、コーヒー酸を、乾燥物質１グラム当たり、少なくとも２、少なくとも５、少なくとも１０、又は少なくとも２５ミリグラムなど、乾燥物質１グラム当たり、少なくとも１ミリグラム含む。別の実施形態において、コーヒー抽出物は、フェルラ酸を、乾燥物質１グラム当たり、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも５、又は少なくとも１０ミリグラムなど、乾燥物質１グラム当たり、少なくとも０．５ミリグラム含む。さらなる実施形態において、コーヒー酸の量に対するカフェオイルキナ酸及びジエステルの量の割合は、５０未満、１０未満、又は１未満など、１００未満（重量／重量）である。またさらなる実施形態において、フェルラ酸の量に対するフェルロイルキナ酸及びジエステルの量の割合は、１０未満、５未満、又は１未満など、３０未満（重量／重量）である。
【０００９】
本発明のコーヒー抽出物は、生コーヒー豆及び／又は焙煎したコーヒー豆の抽出物であってもよい。コーヒー抽出物を生成する多数の方法は、当技術分野において知られている。
【００１０】
本発明は、以下のステップ、ａ）水でコーヒー豆を抽出して、コーヒー抽出物を生成するステップ、及びｂ）クロロゲン酸をフェノール酸に加水分解するために、コーヒー抽出物を処理するステップを含む、コーヒー抽出物を生成する方法に、さらに関する。
【００１１】
抽出されるコーヒー豆は、挽かれていなくても、又は挽かれていてもよい。本発明の一実施形態において、生コーヒー豆は、焙煎したコーヒー豆と一緒に共抽出される、すなわち生及び焙煎したコーヒー豆は、同一の抽出系において、同時に抽出されて、混合した抽出物を得る。最も揮発性の高い芳香成分は、例えば、抽出物が純粋な可溶性コーヒーの生成のために使用される予定の場合、抽出前に豆から剥離されてもよい。揮発性の芳香成分の剥離方法は、当技術分野において、例えばＥＰ１０７８５７６から、よく知られている。
【００１２】
水及び／又は蒸気でのコーヒー豆の抽出は、当技術分野において、例えばＥＰ０９１６２６７から、よく知られている。抽出物は、濃縮ステップを経てもよく、クロロゲン酸を加水分解するための処理の前に、例えば、噴霧乾燥又は凍結乾燥によって、乾燥させてもよい。抽出物は、乾燥させた場合、クロロゲン酸を加水分解するための処理を達成するために、必要ならば、再懸濁してもよい。
【００１３】
クロロゲン酸は、トランス桂皮酸とキナ酸の間に形成されるエステルのファミリーである。クロロゲン酸は、主にキナ酸と種々の位置に結合したフェノール基（例えばコーヒー基、フェルラ基、クマル基、メトキシ桂皮基）のモノ−及びジエステルとして、コーヒー中に本来存在する。本発明の方法により、コーヒー抽出物中のクロロゲン酸（キナ酸エステル）は、加水分解して、フェノール酸を生成でき、例えば、クロロゲン酸３−、４−、又は５−カフェオイルキナ酸及びジエステル、並びに３−、４−、又は５−フェルロイルキナ酸及びジエステルは、加水分解して、それぞれコーヒー酸及びフェルラ酸を生成できる。方法の好ましい実施形態において、カフェオイルキナ酸及び／又はジエステルは、加水分解して、コーヒー酸を生成し、及び／又はフェルロイルキナ酸及び／又はジエステルは、加水分解して、フェルラ酸を生成する。本発明の一実施形態において、クロロゲン酸を加水分解して、フェノール酸を生成するための処理は、処理された抽出物中のコーヒー酸の量が、乾燥物質１グラム当たり、少なくとも２、少なくとも５、又は少なくとも１０ミリグラムなど、乾燥物質１グラム当たり、少なくとも１ミリグラムになるように実施される。本発明の別の実施形態において、クロロゲン酸を加水分解して、フェノール酸を生成するための処理は、処理されたコーヒー抽出物中のフェルラ酸の量が、乾燥物質１グラム当たり、少なくとも１、少なくとも２、又は少なくとも５ミリグラムなど、乾燥物質１グラム当たり、少なくとも０．５ミリグラムになるように実施される。さらなる実施形態において、コーヒー抽出物中に存在する、少なくとも３０％、少なくとも５０％、若しくは少なくとも７５％など、少なくとも２０％のカフェオイルキナ酸及びジエステル、及び／又はフェルロイルキナ酸及びジエステルは、クロロゲン酸を加水分解してフェノール酸を生成するための処理によって、加水分解される。
【００１４】
クロロゲン酸をフェノール酸に加水分解するための、抽出物の処理は、抽出の後又は間に実施してもよい。抽出物は、クロロゲン酸を加水分解するための処理の前、間、又は後に抽出されたコーヒー豆から分離してもよい。一実施形態において、抽出物は、クロロゲン酸を加水分解するための処理の後で、抽出されたコーヒー豆から分離されたままである、すなわち、抽出物は、クロロゲン酸を加水分解するための処理の後に再び、抽出されたコーヒー豆と接触させない。抽出されたコーヒー豆からの抽出物の分離は、任意の適切な方法で、例えば濾過又は遠心分離によって、実施してもよい。分離は、現実的に及び経済的に実行可能な、並びに抽出物の所望の使用の観点から必要とされる程度まで実施してもよい。したがって、分離は１００％完了していなくてもよく、例えば、豆からの溶解していない物質の微量部分が、分離の後に、抽出物と一緒に依然として存在していてもよい。
【００１５】
クロロゲン酸の加水分解は、任意の適切な方法によって実施できる。本発明の一実施形態において、加水分解は、コーヒー抽出物中のクロロゲン酸を加水分解することができる微生物と共にコーヒー抽出物をインキュベート又は発酵することによって実施される。クロロゲン酸を加水分解することができる微生物は、例えば、本明細書の実施例において開示されている通り確認できる。適切な微生物は、酵母、真菌、又は細菌から選択されてもよい。適切な微生物は、例えば、例えばアスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）などのアスペルギルス、例えばＬ．ジョンソニイ（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）（ＣＮＣＭ Ｉ−１２２５）などのラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、例えばＢ．ラクティス（Ｂ．ｌａｃｔｉｓ）（ＣＮＣＭ Ｉ−３４４６）などのビフィズス菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、又は、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母であってもよい。インキュベーション又は発酵は、クロロゲン酸の必要とされる加水分解を達成するために必要な時間、特定の微生物の成長のために適切な条件下で、コーヒー抽出物に、クロロゲン酸を加水分解することができる微生物を接種することによって実施してもよい。特定の条件は、例えば本明細書中に含まれる実施例を参照して、当業者によって容易に決定できる。本発明の別の実施形態において、クロロゲン酸の加水分解は、非複製微生物、例えば溶解細胞の使用によって実施される。適切な条件下で、溶解細胞と共にコーヒー抽出物をインキュベートすることによって、細胞溶解物中に存在する酵素が、クロロゲン酸を加水分解して、フェノール酸を生成できる。適切な細胞は、例えば、上述の微生物の細胞であってもよい。細胞可溶化物を生成する適切な方法は、当技術分野において知られている。
【００１６】
微生物の量及び発酵の条件は、クロロゲン酸の所望の加水分解を達成するのに適切であるべきであり、通例の方法により、例えば本明細書の実施例に開示された方法を使用して、当業者によって決定できる。
【００１７】
別の実施形態において、クロロゲン酸の加水分解は、クロロゲン酸を加水分解することができる酵素の使用によって実施される。適切な酵素は、例えばエステラーゼ、例えばアスペルギルス・ジャポニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）（日本のキッコーマン株式会社から市販されている）に由来するクロロゲン酸エステラーゼ、アスペルギルス・オリザエ（ＥＣ３．１．１．２０）（日本のキッコーマン株式会社から市販されている）からのタンナーゼ、パラターゼ（Ｐａｌａｔａｓｅ）２００００Ｌ（ＥＣ３．１．１．３）（デンマークのＮｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓから市販されている）である。酵素加水分解は、酵素反応のための従来の方法によって、例えば、必要とされる酵素活性のために適切な条件下で、コーヒー抽出物中に酵素を溶解又は懸濁することによって実施してもよい。酵素は、加水分解が起きた後で、例えば加熱によって不活化してもよい。酵素は、例えば膜又は不活性担体上に固定化してもまたよく、処理されるコーヒー抽出物は、加水分解の所望の程度が達成されるまで、膜上で又は担体を通して循環させてもよい。
【００１８】
使用される酵素の量及び条件は、クロロゲン酸の所望の加水分解を達成するのに適切であるべきであり、通例の方法により、例えば、クロロゲン酸の加水分解を決定するための本明細書の実施例に開示された方法を使用して、当業者によって決定することができる。
【００１９】
本発明は、本発明のコーヒー抽出物が、食物又は飲料製品の成分として使用される、上記食物又は飲料製品を製造する方法にもまた関する。抽出物は、抽出されたコーヒー豆から分離して使用され、すなわち豆からの溶解していない物質は、本明細書中に記載されている通り、分離によって実質的に除去され、食物又は飲料製品の製造において使用されない。食物又は飲料製品は、当技術分野において既知の任意の食物又は飲料製品であってもよい。好ましい実施形態において、食物又は飲料製品は、コーヒー製品、例えば可溶性コーヒー製品又はすぐに飲めるコーヒー製品である。可溶性コーヒー製品は、本発明の抽出物を濃縮し、乾燥することによって、製造してもよい。乾燥の前に、抽出物を、クロロゲン酸を加水分解するための処理を行わなかったコーヒー抽出物、例えば焙煎したコーヒー豆、生コーヒー豆、又はその両方の抽出物と混合してもよい。コーヒー抽出物から可溶性コーヒー製品を製造する方法は、当技術分野においてよく知られている。抽出物をコーヒー製品の製造のために使用する場合、抽出される豆は、例えば欧州特許出願公開第１０７８５７６号に記載の通り、抽出の前に、揮発性の芳香成分を除去するためのストリッピングにかけた可能性がある。次に、揮発性の芳香成分は、クロロゲン酸を加水分解するための処理の後、例えば乾燥の後で、抽出物に添加して戻して、芳香付けをした可溶性コーヒー製品を製造してもよい。本発明のコーヒー抽出物から製造された可溶性コーヒー製品は、そのまま販売されてもよく、又は、例えば、クリーマー及び／又は甘味料と混合され、クリーマー及び／又は甘味料を含むコーヒー飲料、例えばカプチーノ若しくはカフェラテを調製するために販売されてもよい。
【００２０】
本発明によるコーヒー抽出物は、食物又は飲料製品の成分として使用される場合、所望の効果を達成するために、上記食物又は飲料製品の製造工程における任意の適切なステップで添加してもよい。抽出物は、所望の効果、例えば抗酸化効果をもたらすのに適切ないずれの量でも添加されてもよい。本発明の方法によって製造された食物又は飲料製品は、例えば、コーヒーベースの飲料、茶ベースの飲料、ソフトドリンク、乳製品、菓子製品、又は栄養補助食品であってもよい。
【００２１】
本発明は、抗酸化剤としての、例えば製品中の成分としての本発明のコーヒー抽出物の使用にもまた関するものであり、上記製品は、抗酸化特性が、例えば、貯蔵の間、製品の成分の酸化を防ぐために望まれる、例えば食物又は飲料製品である。抗酸化剤は、いくつかの製品において一般に使用されており、本発明のコーヒー抽出物は、従来の抗酸化剤と同様に使用されてもよい。
【００２２】
本発明のコーヒー抽出物は、例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）などの解毒酵素を誘導することによって、及びＮｒｆ２−仲介遺伝子発現経路を増加させることによって、ヒト又は動物において、生体内で抗酸化能力を強化するために、また使用されてもよい。増加したＮｒｆ２活性関連遺伝子は、解毒作用を強化し、酸化ストレスに対する内因性防御を刺激することが報告された。これらの効果は、例えば、コーヒー抽出物の経口投与によって、又はヒト若しくは動物の肌への局所的適用によって達成してもよい。
【００２３】
本発明の抽出物は、例えば、炎症促進剤（例えばインターロイキン１ｂ、リポ多糖（ＬＰＳ））によるプロスタグランジンＥ２レベルの上昇を阻止することによって、炎症を抑制するために使用してもよい。
【００２４】
多くの健康問題及び障害は、酸化ストレス及び炎症に関連している。本発明のコーヒー抽出物は、かかる問題若しくは障害などを治療又は予防するために使用してもよい。関連する問題及び障害は、例えば、例えば紫外線放射によって引き起こされる光損傷、アトピー性皮膚炎、湿疹、落屑性、掻痒性、アレルギー性症状などの皮膚障害、脳障害、炎症、肥満、並びに、例えば皮膚癌及び肺癌などの癌である。
【００２５】
本発明のコーヒー抽出物は、例えば血糖値を低下させる、及び／又は、レプチン、インシュリン、及び／又はｃ−ペプチドの血中濃度を上昇させることによる抗糖尿病薬として；例えば骨ミネラル密度を上昇させることによる、例えばエストロゲン及び／又はプロゲステロンの血清濃度、及び／又はアルカリホスファターゼ活性を上昇させることによる骨再構築剤として；例えば抗血管新生効果を有する抗転移薬としてさらに使用してもよい。
【００２６】
本発明によるコーヒー抽出物は、皮膚障害、糖尿病、アレルギー、脳障害、炎症、肥満、及び／又は癌を、治療又は予防するための配合物の調製のために使用してもよい。配合物は、例えば経口投与又は皮膚への局所投与のためのいずれの適切な形態でも、例えば食物若しくは飲料製品、栄養補助食品、錠剤、外用水薬、又は化粧品の形態であってもよい。好ましい実施形態において、配合物は医薬である。
【実施例】
【００２７】
実施例１
ラクトバチルス・ジョンソニイの新鮮細胞によるネスカフェプロテクト（登録商標）の処理
Ｌ．ジョンソニイ（ＣＮＣＭ Ｉ−１２２５）の細胞を成長させ（７．０Ｅ０８ｃｆｕ／ｍｌ）、遠心分離した（５０００ｇ、１０分）。０．６１ｇ／ｍｌの濃度で、リン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）中にペレットを再懸濁した。ネスカフェプロテクト（登録商標）（生及び焙煎したコーヒー豆の乾燥共抽出物）３０ｍｇ／ｍｌを添加し、混合物を３７℃でインキュベートした。異なる反応時間で試料を抜き出し、遠心分離し（３０００ｇ、５分）、０．４５μｍ孔径のシリンジフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＳＬＨＡ０２５ＢＳ）を通して濾過し、ＨＰＬＣによって分析した。
【００２８】
同一の反応条件下であるが細菌なしで、平行して反応対照を実施した。
【００２９】
ラクトバチルス・ジョンソニイ抽出物（溶解細胞）によるネスカフェプロテクト（登録商標）の処理
Ｌ．ジョンソニイ（ＣＮＣＭ Ｉ−１２２５）の細胞を成長させ（７．０Ｅ０８ｃｆｕ／ｍｌ）、遠心分離した（５０００ｇ、１０分）。０．６１ｇ／ｍｌの濃度で、リン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）中にペレットを再懸濁した。次に、ガラスビーズ法を使用して、細胞を溶解させた。細胞調製物６００μｌをスクリューキャップチューブに入れ、０℃でガラスビーズ６００μｌを添加した。次に、チューブをミニビードビーター（Ｍｉｎｉ−Ｂｅａｄｂｅａｔｅｒ）中に強振動下で１分間入れ、氷で冷却し、ミニビードビーター中に、さらに１分間入れた。次に、ネスカフェプロテクト（登録商標）（３０ｍｇ／ｍｌ、リン酸緩衝液ｐＨ７．０）の溶液９００μｌに、粗細胞抽出物を添加し、混合物を３７℃でインキュベートした。異なる反応時間で試料を抜き出し、遠心分離し（３０００ｇ、５分）、０．４５μｍ孔径のシリンジフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＳＬＨＡ０２５ＢＳ）を通して濾過し、ＨＰＬＣによって分析した。
【００３０】
ラクトバチルス・ジョンソニイの噴霧乾燥調製物でのネスカフェプロテクト（登録商標）の処理
ネスカフェプロテクト（登録商標）３０ｍｇを、リン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）１ｍｌ又は水１ｍｌに溶解した。この溶液に、ラクトバチルス・ジョンソニイ（ＣＮＣＭ Ｉ−１２２５）の噴霧乾燥調製物（３．３Ｅ９ｃｆｕ／ｇ）１０ｍｇを添加した。次に、混合物を３７℃でインキュベートし、異なる反応時間で試料を抜き出した。遠心分離（３０００ｇ、５分）及び濾過（０．４５μｍ孔径のシリンジフィルター、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＳＬＨＡ０２５ＢＳ）後、ＨＰＬＣによって、試料を分析した。
【００３１】
ラクトバチルス・ジョンソニイ（ＣＮＣＭ Ｉ−１２２５）の噴霧乾燥調製物での生コーヒー抽出物の処理
乾燥生コーヒー抽出物３０ｍｇを、リン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）１ｍｌ又は水１ｍｌに溶解した。この溶液に、ラクトバチルス・ジョンソニイの噴霧乾燥調製物（３．３Ｅ９ｃｆｕ／ｇ）１０ｍｇを添加した。次に、混合物を３７℃でインキュベートし、異なる反応時間で試料を抜き出した。遠心分離（３０００ｇ、５分）及び濾過（０．４５μｍ孔径のシリンジフィルター、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＳＬＨＡ０２５ＢＳ）後、ＨＰＬＣによって、試料を分析した。
【００３２】
ラクトバチルス・ジョンソニイ（ＣＮＣＭ Ｉ−１２２５）の濃縮調製物でのネスカフェ（ＮＥＳＣＡＦＥ）（登録商標）の処理
ネスカフェスペシャルフィルター（ＮＥＳＣＡＦＥ ＳＰＥＣＩＡＬ ＦＩＬＴＲＥ）（登録商標）（焙煎したコーヒー豆の乾燥抽出物）４００ｍｇを沸騰水１ｍｌに溶解し、室温で３７℃まで、この溶液を冷却した。このコーヒー溶液２５０μｌに、ラクトバチルス・ジョンソニイの異なる量の濃縮調製物（５０μｌ、１００μｌ、３５０μｌ、７５０μｌ）を添加し、水で１ｍｌになるまで量を調整した。次に、混合物を３７℃で２時間及び４時間インキュベートした。遠心分離（３０００ｇ、５分）及び濾過後、ＨＰＬＣによって、試料を分析した。
【００３３】
ＨＰＬＣ分析
コーヒー試料を１％ｗ／ｗに希釈し、ＣＣ２５０／４Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ １００−５−Ｃ１８カラム（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）でＲＰ−ＨＰＬＣによって分析した。溶離系は、流量１ｍＬ／分で、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ水、０．１％ＴＦＡ、及びＣＨ３ＣＮであった。この方法により、外部標準検量線を使用して、カフェオイルキナ酸（ＣＱＡ）、フェルロイルキナ酸（ＦＱＡ）、ジカフェオイルキナ酸（ｄｉＣＱＡ）、フェルオイルキナ酸−ラクトン、コーヒー酸（ＣＡ）、及びフェルラ酸（ＦＡ）を同時に測定（３２５ｍｍでの吸光度）できた。時間０（ｔ０）での基準、又は細菌なしでの同時間の基準に対して結果を示した。
【００３４】
抗酸化剤応答配列（ＡＲＥ）ルシフェラーゼ分析
ネオマイシン選択可能マーカーを含むｐｃＤＮＡ３．１プラスミドと一緒に、ラットのグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼＡ２（ＧＳＴＡ２）中に存在するＡＲＥ８コピーを含むｐＧＬ−８ｘＡＲＥを、ヒトＭＣＦ７細胞に安定的に形質移入した（Ｗａｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、６６巻、１０９８３〜１０９９４頁、２００６年）。ＡＲＥ（抗酸化剤応答配列）は、解毒作用及び酸化ストレスに対する内因性防御に関与する遺伝子を制御する転写因子Ｎｒｆ２の結合部位である。プラスミドｐＧＬ−８ｘＡＲＥは、Ｎｒｆ２活性の監視を可能にする、８個のＮｒｆ２結合部位の下流にルシフェラーゼ遺伝子を含む。
【００３５】
コーヒーでの処理のために、ＤＭＥＭ成長培地の９６ウェルマイクロタイタープレートにＡＲＥｃ３２細胞を播種した。異なるコーヒーで２４時間処理した後、ホタルルシフェラーゼ活性を測定した。
【００３６】
タンパク質発現
コラゲナーゼ溶液でのスプラーグドーリーラットの肝臓の灌流によって、初代培養肝細胞を得た（Ｓｉｄｈｕら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３０１巻、１０３〜１１３頁、１９９３年）。トリパンブルー排除試験によって測定された細胞生存率は９０〜９５％の間の範囲であることがわかった。２ｍＭ Ｌ−グルタミン酸、１０ｍＭヘペスｐＨ７．４を、ＩＴＳ＋、ペニシリン／ストレプトマイシン１５０００Ｕ、１００ｎＭデキサメタゾン、及び５％ウシ胎仔血清（ハイ−クローン）を補ったウィリアムス培地３ｍｌで、６０ｍｍプラスチック組織培養皿上に、１．５×１０５細胞／ｃｍ２の密度で細胞を播種した。肝細胞を２時間付着させ、次に、ＥＢＳＳで洗浄して、細胞片及び付着しなかった細胞を除去した。デキサメタゾン２５ｎＭを含む、新鮮な血清を含まない培地を添加し、次に、マトリゲルのオーバーレイ（２３３ｇ／ｍｌ）を適用した。培地交換に続いて、２日に一度、新鮮なマトリゲルを培養物に添加した。解毒酵素及び抗酸化タンパク質発現についてのコーヒーの効果を研究するために、タンパク質抽出及びウェスタンブロット分析の前に、４８時間の細胞播種の２４時間後に、培地に試験材料を添加した（Ｃａｖｉｎら、Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ Ｔｏｘ．、４６巻、１２３９〜４８頁、２００８年）。
【００３７】
プロスタグランジンＥ２の生成のアッセイ
ヒト結腸ＨＴ−２９細胞を、異なるコーヒーで１５時間処理し、続いて炎症誘発剤ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）と一緒に６時間共培養した。競合酵素免疫測定法（ＥＩＡ）を使用して、ＨＴ−２９細胞中のＰＧＥ２生成の分析を測定した（Ｃａｖｉｎら、ＢＢＲＣ、３２７巻、７４２〜４９頁、２００５年）。
【００３８】
結果
フェノール酸生成のためのクロロゲン酸の加水分解
実験１：様々な反応時間及び細胞調製物量による、Ｌ．ジョンソニイ新鮮細胞でのネスカフェプロテクト（登録商標）の処理。結果を表１に示す。
【００３９】
【表１】
【００４０】
実験２：様々な反応時間及び細胞調製物量による、Ｌ．ジョンソニイ抽出物（溶解細胞）によるネスカフェプロテクト（登録商標）の処理。結果を表２に示す。
【００４１】
【表２】
【００４２】
実験３：ラクトバチルス・ジョンソニイの噴霧乾燥調製物によるネスカフェプロテクト（登録商標）の処理。結果を表３に示す。
【００４３】
【表３】
【００４４】
実験４：ラクトバチルス・ジョンソニイの噴霧乾燥調製物での生コーヒー抽出物の処理。結果を表４に示す。
【００４５】
【表４】
【００４６】
実験５：ラクトバチルス・ジョンソニイの濃縮調製物でのネスカフェ（登録商標）の処理。結果を表５に示す。
【００４７】
【表５】
【００４８】
表６は、クロロゲン酸を加水分解するための処理をしなかった生コーヒー豆の抽出物（対照試料）の２つの異なる試料における、いくつかの化合物の絶対濃度を示す。
【００４９】
【表６】
【００５０】
タンパク質の発現
ラット初代培養肝細胞において、ネスカフェレッドカップ（登録商標）（焙煎したコーヒー豆の抽出物）２００ｕｇ／ｍｌは４８時間の処理後、ウェスタンブロットにより、４００ｕｇ／ｍｌで、ＧＳＴサブユニット（ＧＳＴＡ４、ＧＳＴＰ１）及びヘム−オキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）のタンパク質発現の増加をもたらさず、ＧＳＴＰ１及びＨＯ−１発現の弱い誘導をもたらした。対照的に、ＧＳＴＡ４、ＧＳＴＰ１、及びＨＯ−１について、Ｌ．ジョンソニイで処理したネスカフェプロテクト（登録商標）２００ｕｇ／ｍｌ及び４００ｕｇ／ｍｌの両方で、異なるタンパク質発現のより強い誘導を観察した。結果を、ウェスタンブロットゲルとして図１に示す。
【００５１】
ネスカフェレッドカップ（登録商標）対ネスカフェプロテクト（登録商標）及びＬ．ジョンソニイで処理したネスカフェプロテクト（登録商標）を５％有する食餌を２週間与えたオスのラットの肝臓において得られたデータは、ラット初代培養肝細胞において観察された効果を確認した。未処理のネスカフェプロテクト（登録商標）（ＧＳＴＰ１、ＮＱＯ１）及び未処理のネスカフェレッドカップ（登録商標）（ＧＳＴＰ１、ＮＱＯ１）と比較して、解毒酵素発現の最強の誘導（ＧＳＴＰ１、ＮＱＯ１）が、Ｌ．ジョンソニイで処理したネスカフェプロテクト（登録商標）について見られた。結果を、ウェスタンブロットゲルとして図２に示す。
【００５２】
抗酸化剤応答配列（ＡＲＥ）ルシフェラーゼ分析
ラットＧＳＴＡ２−ＡＲＥレポーター構築体の数コピーで、安定的に形質移入されたヒト乳癌細胞（ＡＲＥｃ３２）を使用して、コーヒーによるＮｒｆ２−ＡＲＥ経路の活性化を実証した。クロロゲン酸を加水分解するための処理をしていない生コーヒー抽出物、及びＬ．ジョンソニイで２４時間処理した異なる生コーヒー抽出物は、Ｎｒｆ２−ルシフェラーゼレポーター活性における用量依存的上昇をもたらした（表７を参照されたい）。
【００５３】
【表７】
【００５４】
プロスタグランジンＥ２生成のアッセイ
ヒト結腸ＨＴ−２９細胞で、Ｌ．ジョンソニイで処理した生コーヒー抽出物の潜在的な抗炎症性効果を分析した。炎症誘発剤ＴＮＦ−αによる処理後、結腸細胞においてプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）レベルが誘導される。この研究において、異なるコーヒー抽出物（クロロゲン酸を加水分解するための処理をしていない生コーヒー抽出物、及びＬ．ジョンソニイで２４時間処理した異なる生コーヒー抽出物）で、細胞を２４時間前処理した。実験の最後の６時間に、ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加した。データ（表８を参照されたい）は、ＴＮＦ−αで処理した対照細胞と比較した、ＰＧＥ２生成のコーヒーによる明白な用量依存的減少を示した。
【００５５】
【表８】
【００５６】
実施例２
コーヒー試料
１００％ロブスタ生豆からの生コーヒー抽出物
ネスカフェプロテクト（登録商標）、生及び焙煎したコーヒー豆の乾燥共抽出物
【００５７】
酵素及び細胞
微生物 培地
ラクトバチルス・ジョンソニイ（ＣＮＣＭ Ｉ−１２２５） ＭＲＳ
ビフィズス菌ラクティスＢＢ１２（ＣＮＣＭ Ｉ−３４４６） ＭＲＳ＋システイン
ビフィズス菌ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）ＢＢ５３６（ＡＴＣＣ ＢＡＡ−９９９） ＭＲＳ＋システイン
【００５８】
アスペルギルス・ジャポニクス（日本のキッコーマン株式会社）由来のクロロゲン酸エステラーゼ（２４Ｕ／ｇ）。
アスペルギルス・オリザエ（日本のキッコーマン株式会社）からのタンナーゼ
【００５９】
細菌細胞の調製
攪拌せずに、嫌気性環境で、３７℃での培地における１６時間の培養に対応する静止期に十分到達した後で、試験した菌株を採取した（５０００ｇで１０分間の遠心分離）。菌株の最初の活性化のために、凍結保存培養物を新鮮な培地中に植菌し、一晩成長させた。この前培養物を使用して、培養物を植菌した。
【００６０】
細菌細胞でのコーヒー抽出物の処理
細菌の培養及び遠心分離の後で、０．６１ｇ／ｍｌの濃度で、リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中にペレットを再懸濁した。この細胞調製物２００μｌに、コーヒー溶液（３％）８００μｌを添加し、３７℃で、４時間、１６時間、及び２４時間、混合物をインキュベートした。
【００６１】
クロロゲン酸エステラーゼでのコーヒー抽出物の培養
コーヒー溶液（３％）８００μｌに、リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２００μｌ中のクロロゲン酸エステラーゼ（２５ｍｇ）の溶液を添加した。次に、３７℃で、４時間、１６時間、及び２４時間、混合物をインキュベートした。反応時間の後で、熱処理（３分、９０℃）によって酵素活性を止め、分析の前に混合物を濾過した。
【００６２】
ＡＲＥルシフェラーゼ分析
実施例１の通り
【００６３】
結果
ラットＧＳＴＡ２−ＡＲＥレポーター構築体の数コピーで、安定的に形質移入されたヒト乳癌細胞（ＡＲＥｃ３２）を使用して、コーヒーによる抗酸化Ｎｒｆ２−ＡＲＥ経路の活性化を実証した。クロロゲン酸を加水分解するための処理をしていない（未処理）生コーヒー抽出物、ラクトバチルス・ジョンソニイ（Ｌｊ）で２４時間処理した生コーヒー抽出物、ビフィズス菌ラクティス（Ｂｌ）で２４時間処理した生コーヒー抽出物、及びクロロゲン酸エステラーゼ（ＣＥ）で４時間処理した生コーヒー抽出物は全て、Ｎｒｆ２−ルシフェラーゼレポーター活性における用量依存的上昇をもたらした（表９）。
【００６４】
【表９】
【００６５】
異なる微生物及びクロロゲン酸エステラーゼで、生コーヒー抽出物を処理して、クロロゲン酸を加水分解した。結果を表１０に示す。
【００６６】
【表１０】
【００６７】
異なる微生物及びクロロゲン酸エステラーゼで、ネスカフェプロテクト（登録商標）を処理し、クロロゲン酸を加水分解した。結果を表１１に示す。
【００６８】
【表１１】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗酸化及び抗炎症性特性を有する改良されたコーヒー抽出物を生成する方法、抽出物を生成する方法、並びに本発明の抽出物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
コーヒー並びにカフェイン及びジテルペン（例えば、カフェストール、カーウェオール）などのコーヒー活性化合物は、げっ歯動物において解毒酵素（例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼＧＳＴ）を誘導することが示された（Ｃａｖｉｎ Ｃ．ら、１９９８年、「コーヒーに特有のジテルペンであるカフェストール及びカーウェオールは、二重機構によってアフラトキシンＢ１に誘導される遺伝毒性を防ぐ（Ｔｈｅ ｃｏｆｆｅｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｉｔｅｒｐｅｎｅｓ ｃａｆｅｓｔｏｌ ａｎｄ ｋａｈｗｅｏｌ ｐｒｏｔｅｃｔ ａｇａｉｎｓｔ ａｆｌａｔｏｘｉｎ Ｂ１−ｉｎｄｕｃｅｄ ｇｅｎｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｔｒｏｕｇｈ ａ ｄｕａｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．）。」、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ、１９巻、１３６９〜１３７５頁、Ｃａｖｉｎ，Ｃ．ら、２００３年、「コーヒーのジテルペンは、ラット及びヒトの培養系において、ベンゾ［ａ］ピレンの遺伝毒性を妨げる（Ｃｏｆｆｅｅ ｄｉｔｅｒｐｅｎｅｓ ｐｒｅｖｅｎｔ ｂｅｎｚｏ［ａ］ｐｙｒｅｎｅ ｇｅｎｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ ｒａｔ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｙｓｔｅｍｓ．）。」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ、３０６巻、４８８〜４９５頁、Ｈｕｂｅｒ，Ｗ．ら、２００２年ａ、「コーヒー成分であるカーウェオール及びカフェストールによる、ラットの特定の器官における化学的予防酵素であるグルクロニルトランスフェラーゼ及びグルタチオントランスフェラーゼの強化（Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｃｈｅｍｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｎｚｙｍｅｓ ｇｌｕｃｕｒｏｎｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ａｎｄ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｉｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｏｒｇａｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒａｔ ｂｙ ｔｈｅ ｃｏｆｆｅｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｋａｈｗｅｏｌ ａｎｄ ｃａｆｅｓｔｏｌ．）。」、Ａｒｃｈｉｖｅ ｏｆ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ、７６巻、２０９〜２１７頁）。コーヒーにより増進したＧＳＴ活性は、５日間でコーヒー８００ｍｌを摂取した後のヒトにおいて、さらに実証された（Ｓｔｅｉｎｋｅｌｌｎｅｒ，Ｈ．ら、２００５年、「コーヒー摂取は、血漿においてＧＳＴＰを誘導し、（＋／−）−抗−ベンゾ［ａ］ピレン−７，８−ジヒドロジオール−９，１０−エポキシドによって誘導されるＤＮＡ損傷からリンパ球を保護する：対照ヒト介入試験の結果（Ｃｏｆｆｅｅ ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｓ ＧＳＴＰ ｉｎ ｐｌａｓｍａ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ａｇａｉｎｓｔ （＋／−）−ａｎｔｉ−ｂｅｎｚｏ［ａ］ｐｙｒｅｎｅ−７，８−ｄｉｈｙｄｒｏｄｉｏｌ−９，１０−ｅｐｏｘｉｄｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ＤＮＡ−ｄａｍａｇｅ：ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ ｔｒｉａｌｓ．）。」、Ｍｕｔ．Ｒｅｓ．５９１巻、２６４〜２７５頁）。さらに、Ｒｉｃｈｅｌｌｅら、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．、４９巻、３４３８〜４２頁、（２００１年）は、生体外でのＬＤＬ酸化の遅延時間が、標準的な１杯分のコーヒーによって、実質的に増加することを示した。増進した全抗酸化能力は、コーヒー２００ｍｌを摂取した後、生体内でのヒト血漿においてもまた観察された（Ｎａｔｅｌｌａら、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．、５０巻、６２１１〜１６頁、２００２年）。
【０００３】
この種の抗酸化活性は、例えば癌、心臓病、退行性脳障害、及び老化に関与することがある損傷を与える遊離基を減少させることによって、「酸化ストレス」を防ぐことが知られている。
【０００４】
食物及び飲料製品の健康上の利益を増進させるために、増進した抗酸化活性やその他の有益な生物活性を有する製品を製造すること、並びに、例えば化粧及び医薬品ばかりでなく、食物及び飲料製品の特性を強化するために使用できる、抗酸化剤及び有益な生物活性を有するその他の化合物の天然源を発見することが望まれている。抗酸化特性は、分子自体の性質に本来備わっている可能性があるか、又は酸化ストレスに対する自然防御の誘導によって仲介され得る。
【発明の概要】
【０００５】
本発明者らは今、コーヒー酸の量が、乾燥物質１グラム当たり、少なくとも１ミリグラムであり、及び／又はフェルラ酸の量が、乾燥物質１グラム当たり、少なくとも０．５ミリグラムであるコーヒー抽出物を生成する方法、並びに、かかるコーヒー抽出物が、従来のコーヒー抽出物と比べて、抗酸化及び抗炎症性特性を向上させたことを見出した。したがって、本発明は、以下のステップ、ａ）水でコーヒー豆を抽出して、コーヒー抽出物を生成するステップ、及びｂ）クロロゲン酸を加水分解して、フェノール酸を生成するために、コーヒー抽出物を処理するステップを含む、コーヒー抽出物を生成する方法に関する。さらなる実施形態において、本発明は、本発明のコーヒー抽出物の使用、食物又は飲料製品を製造する方法、及び結果として生じる食物又は飲料製品に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】クロロゲン酸を加水分解する処理をしていないネスカフェレッドカップ（ＮＥＳＣＡＦＥ ＲＥＤ ＣＵＰ）（登録商標）（焙煎したコーヒー豆の抽出物）２００及び４００ｕｇ／ｍｌ、及びラクトバチルス・ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）で処理したネスカフェプロテクト（ＮＥＳＣＡＦＥ ＰＲＯＴＥＣＴ）（登録商標）２００及び４００ｕｇ／ｍｌで処理したラットの初代培養肝細胞、並びにコーヒー抽出物で処理していない対照試料におけるＧＳＴのサブユニット（ＧＳＴＡ４、ＧＳＴＰ１）及びヘム−オキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）のタンパク質発現を示すウェスタンブロットゲルの図である。詳細については、実施例１を参照されたい。
【図２】クロロゲン酸を加水分解する処理をしていないネスカフェレッドカップ（登録商標）（焙煎したコーヒー豆の抽出物）（ＲＮ）、クロロゲン酸を加水分解する処理をしていないネスカフェプロテクト（登録商標）（生及び焙煎したコーヒー豆の共抽出物）（Ｐ）、及びラクトバチルス・ジョンソニイで処理したネスカフェプロテクト（登録商標）（Ｌａ１−Ｐ）を５％含む食餌を２週間与えた雄性のラットの肝臓中での解毒酵素発現の誘導（ＧＳＴＰ１、ＮＱＯ１）を示すウェスタンブロットの図である。詳細については、実施例１を参照されたい。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明は、改良された抗酸化及び抗炎症性特性を有するコーヒー抽出物に関する。
【０００８】
本発明の一実施形態において、コーヒー抽出物は、コーヒー酸を、乾燥物質１グラム当たり、少なくとも２、少なくとも５、少なくとも１０、又は少なくとも２５ミリグラムなど、乾燥物質１グラム当たり、少なくとも１ミリグラム含む。別の実施形態において、コーヒー抽出物は、フェルラ酸を、乾燥物質１グラム当たり、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも５、又は少なくとも１０ミリグラムなど、乾燥物質１グラム当たり、少なくとも０．５ミリグラム含む。さらなる実施形態において、コーヒー酸の量に対するカフェオイルキナ酸及びジエステルの量の割合は、５０未満、１０未満、又は１未満など、１００未満（重量／重量）である。またさらなる実施形態において、フェルラ酸の量に対するフェルロイルキナ酸及びジエステルの量の割合は、１０未満、５未満、又は１未満など、３０未満（重量／重量）である。
【０００９】
本発明のコーヒー抽出物は、生コーヒー豆及び／又は焙煎したコーヒー豆の抽出物であってもよい。コーヒー抽出物を生成する多数の方法は、当技術分野において知られている。
【００１０】
本発明は、以下のステップ、ａ）水でコーヒー豆を抽出して、コーヒー抽出物を生成するステップ、及びｂ）クロロゲン酸をフェノール酸に加水分解するために、コーヒー抽出物を処理するステップを含む、コーヒー抽出物を生成する方法に、さらに関する。
【００１１】
抽出されるコーヒー豆は、挽かれていなくても、又は挽かれていてもよい。本発明の一実施形態において、生コーヒー豆は、焙煎したコーヒー豆と一緒に共抽出される、すなわち生及び焙煎したコーヒー豆は、同一の抽出系において、同時に抽出されて、混合した抽出物を得る。最も揮発性の高い芳香成分は、例えば、抽出物が純粋な可溶性コーヒーの生成のために使用される予定の場合、抽出前に豆から剥離されてもよい。揮発性の芳香成分の剥離方法は、当技術分野において、例えばＥＰ１０７８５７６から、よく知られている。
【００１２】
水及び／又は蒸気でのコーヒー豆の抽出は、当技術分野において、例えばＥＰ０９１６２６７から、よく知られている。抽出物は、濃縮ステップを経てもよく、クロロゲン酸を加水分解するための処理の前に、例えば、噴霧乾燥又は凍結乾燥によって、乾燥させてもよい。抽出物は、乾燥させた場合、クロロゲン酸を加水分解するための処理を達成するために、必要ならば、再懸濁してもよい。
【００１３】
クロロゲン酸は、トランス桂皮酸とキナ酸の間に形成されるエステルのファミリーである。クロロゲン酸は、主にキナ酸と種々の位置に結合したフェノール基（例えばコーヒー基、フェルラ基、クマル基、メトキシ桂皮基）のモノ−及びジエステルとして、コーヒー中に本来存在する。本発明の方法により、コーヒー抽出物中のクロロゲン酸（キナ酸エステル）は、加水分解して、フェノール酸を生成でき、例えば、クロロゲン酸３−、４−、又は５−カフェオイルキナ酸及びジエステル、並びに３−、４−、又は５−フェルロイルキナ酸及びジエステルは、加水分解して、それぞれコーヒー酸及びフェルラ酸を生成できる。方法の好ましい実施形態において、カフェオイルキナ酸及び／又はジエステルは、加水分解して、コーヒー酸を生成し、及び／又はフェルロイルキナ酸及び／又はジエステルは、加水分解して、フェルラ酸を生成する。本発明の一実施形態において、クロロゲン酸を加水分解して、フェノール酸を生成するための処理は、処理された抽出物中のコーヒー酸の量が、乾燥物質１グラム当たり、少なくとも２、少なくとも５、又は少なくとも１０ミリグラムなど、乾燥物質１グラム当たり、少なくとも１ミリグラムになるように実施される。本発明の別の実施形態において、クロロゲン酸を加水分解して、フェノール酸を生成するための処理は、処理されたコーヒー抽出物中のフェルラ酸の量が、乾燥物質１グラム当たり、少なくとも１、少なくとも２、又は少なくとも５ミリグラムなど、乾燥物質１グラム当たり、少なくとも０．５ミリグラムになるように実施される。さらなる実施形態において、コーヒー抽出物中に存在する、少なくとも３０％、少なくとも５０％、若しくは少なくとも７５％など、少なくとも２０％のカフェオイルキナ酸及びジエステル、及び／又はフェルロイルキナ酸及びジエステルは、クロロゲン酸を加水分解してフェノール酸を生成するための処理によって、加水分解される。
【００１４】
クロロゲン酸をフェノール酸に加水分解するための、抽出物の処理は、抽出の後又は間に実施してもよい。抽出物は、クロロゲン酸を加水分解するための処理の前、間、又は後に抽出されたコーヒー豆から分離してもよい。一実施形態において、抽出物は、クロロゲン酸を加水分解するための処理の後で、抽出されたコーヒー豆から分離されたままである、すなわち、抽出物は、クロロゲン酸を加水分解するための処理の後に再び、抽出されたコーヒー豆と接触させない。抽出されたコーヒー豆からの抽出物の分離は、任意の適切な方法で、例えば濾過又は遠心分離によって、実施してもよい。分離は、現実的に及び経済的に実行可能な、並びに抽出物の所望の使用の観点から必要とされる程度まで実施してもよい。したがって、分離は１００％完了していなくてもよく、例えば、豆からの溶解していない物質の微量部分が、分離の後に、抽出物と一緒に依然として存在していてもよい。
【００１５】
クロロゲン酸の加水分解は、任意の適切な方法によって実施できる。本発明の一実施形態において、加水分解は、コーヒー抽出物中のクロロゲン酸を加水分解することができる微生物と共にコーヒー抽出物をインキュベート又は発酵することによって実施される。クロロゲン酸を加水分解することができる微生物は、例えば、本明細書の実施例において開示されている通り確認できる。適切な微生物は、酵母、真菌、又は細菌から選択されてもよい。適切な微生物は、例えば、例えばアスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）などのアスペルギルス、例えばＬ．ジョンソニイ（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）（ＣＮＣＭ Ｉ−１２２５）などのラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、例えばＢ．ラクティス（Ｂ．ｌａｃｔｉｓ）（ＣＮＣＭ Ｉ−３４４６）などのビフィズス菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、又は、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母であってもよい。インキュベーション又は発酵は、クロロゲン酸の必要とされる加水分解を達成するために必要な時間、特定の微生物の成長のために適切な条件下で、コーヒー抽出物に、クロロゲン酸を加水分解することができる微生物を接種することによって実施してもよい。特定の条件は、例えば本明細書中に含まれる実施例を参照して、当業者によって容易に決定できる。本発明の別の実施形態において、クロロゲン酸の加水分解は、非複製微生物、例えば溶解細胞の使用によって実施される。適切な条件下で、溶解細胞と共にコーヒー抽出物をインキュベートすることによって、細胞溶解物中に存在する酵素が、クロロゲン酸を加水分解して、フェノール酸を生成できる。適切な細胞は、例えば、上述の微生物の細胞であってもよい。細胞可溶化物を生成する適切な方法は、当技術分野において知られている。
【００１６】
微生物の量及び発酵の条件は、クロロゲン酸の所望の加水分解を達成するのに適切であるべきであり、通例の方法により、例えば本明細書の実施例に開示された方法を使用して、当業者によって決定できる。
【００１７】
別の実施形態において、クロロゲン酸の加水分解は、クロロゲン酸を加水分解することができる酵素の使用によって実施される。適切な酵素は、例えばエステラーゼ、例えばアスペルギルス・ジャポニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）（日本のキッコーマン株式会社から市販されている）に由来するクロロゲン酸エステラーゼ、アスペルギルス・オリザエ（ＥＣ３．１．１．２０）（日本のキッコーマン株式会社から市販されている）からのタンナーゼ、パラターゼ（Ｐａｌａｔａｓｅ）２００００Ｌ（ＥＣ３．１．１．３）（デンマークのＮｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓから市販されている）である。酵素加水分解は、酵素反応のための従来の方法によって、例えば、必要とされる酵素活性のために適切な条件下で、コーヒー抽出物中に酵素を溶解又は懸濁することによって実施してもよい。酵素は、加水分解が起きた後で、例えば加熱によって不活化してもよい。酵素は、例えば膜又は不活性担体上に固定化してもまたよく、処理されるコーヒー抽出物は、加水分解の所望の程度が達成されるまで、膜上で又は担体を通して循環させてもよい。
【００１８】
使用される酵素の量及び条件は、クロロゲン酸の所望の加水分解を達成するのに適切であるべきであり、通例の方法により、例えば、クロロゲン酸の加水分解を決定するための本明細書の実施例に開示された方法を使用して、当業者によって決定することができる。
【００１９】
本発明は、本発明のコーヒー抽出物が、食物又は飲料製品の成分として使用される、上記食物又は飲料製品を製造する方法にもまた関する。抽出物は、抽出されたコーヒー豆から分離して使用され、すなわち豆からの溶解していない物質は、本明細書中に記載されている通り、分離によって実質的に除去され、食物又は飲料製品の製造において使用されない。食物又は飲料製品は、当技術分野において既知の任意の食物又は飲料製品であってもよい。好ましい実施形態において、食物又は飲料製品は、コーヒー製品、例えば可溶性コーヒー製品又はすぐに飲めるコーヒー製品である。可溶性コーヒー製品は、本発明の抽出物を濃縮し、乾燥することによって、製造してもよい。乾燥の前に、抽出物を、クロロゲン酸を加水分解するための処理を行わなかったコーヒー抽出物、例えば焙煎したコーヒー豆、生コーヒー豆、又はその両方の抽出物と混合してもよい。コーヒー抽出物から可溶性コーヒー製品を製造する方法は、当技術分野においてよく知られている。抽出物をコーヒー製品の製造のために使用する場合、抽出される豆は、例えば欧州特許出願公開第１０７８５７６号に記載の通り、抽出の前に、揮発性の芳香成分を除去するためのストリッピングにかけた可能性がある。次に、揮発性の芳香成分は、クロロゲン酸を加水分解するための処理の後、例えば乾燥の後で、抽出物に添加して戻して、芳香付けをした可溶性コーヒー製品を製造してもよい。本発明のコーヒー抽出物から製造された可溶性コーヒー製品は、そのまま販売されてもよく、又は、例えば、クリーマー及び／又は甘味料と混合され、クリーマー及び／又は甘味料を含むコーヒー飲料、例えばカプチーノ若しくはカフェラテを調製するために販売されてもよい。
【００２０】
本発明によるコーヒー抽出物は、食物又は飲料製品の成分として使用される場合、所望の効果を達成するために、上記食物又は飲料製品の製造工程における任意の適切なステップで添加してもよい。抽出物は、所望の効果、例えば抗酸化効果をもたらすのに適切ないずれの量でも添加されてもよい。本発明の方法によって製造された食物又は飲料製品は、例えば、コーヒーベースの飲料、茶ベースの飲料、ソフトドリンク、乳製品、菓子製品、又は栄養補助食品であってもよい。
【００２１】
本発明は、抗酸化剤としての、例えば製品中の成分としての本発明のコーヒー抽出物の使用にもまた関するものであり、上記製品は、抗酸化特性が、例えば、貯蔵の間、製品の成分の酸化を防ぐために望まれる、例えば食物又は飲料製品である。抗酸化剤は、いくつかの製品において一般に使用されており、本発明のコーヒー抽出物は、従来の抗酸化剤と同様に使用されてもよい。
【００２２】
本発明のコーヒー抽出物は、例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）などの解毒酵素を誘導することによって、及びＮｒｆ２−仲介遺伝子発現経路を増加させることによって、ヒト又は動物において、生体内で抗酸化能力を強化するために、また使用されてもよい。増加したＮｒｆ２活性関連遺伝子は、解毒作用を強化し、酸化ストレスに対する内因性防御を刺激することが報告された。これらの効果は、例えば、コーヒー抽出物の経口投与によって、又はヒト若しくは動物の肌への局所的適用によって達成してもよい。
【００２３】
本発明の抽出物は、例えば、炎症促進剤（例えばインターロイキン１ｂ、リポ多糖（ＬＰＳ））によるプロスタグランジンＥ２レベルの上昇を阻止することによって、炎症を抑制するために使用してもよい。
【００２４】
多くの健康問題及び障害は、酸化ストレス及び炎症に関連している。本発明のコーヒー抽出物は、かかる問題若しくは障害などを治療又は予防するために使用してもよい。関連する問題及び障害は、例えば、例えば紫外線放射によって引き起こされる光損傷、アトピー性皮膚炎、湿疹、落屑性、掻痒性、アレルギー性症状などの皮膚障害、脳障害、炎症、肥満、並びに、例えば皮膚癌及び肺癌などの癌である。
【００２５】
本発明のコーヒー抽出物は、例えば血糖値を低下させる、及び／又は、レプチン、インシュリン、及び／又はｃ−ペプチドの血中濃度を上昇させることによる抗糖尿病薬として；例えば骨ミネラル密度を上昇させることによる、例えばエストロゲン及び／又はプロゲステロンの血清濃度、及び／又はアルカリホスファターゼ活性を上昇させることによる骨再構築剤として；例えば抗血管新生効果を有する抗転移薬としてさらに使用してもよい。
【００２６】
本発明によるコーヒー抽出物は、皮膚障害、糖尿病、アレルギー、脳障害、炎症、肥満、及び／又は癌を、治療又は予防するための配合物の調製のために使用してもよい。配合物は、例えば経口投与又は皮膚への局所投与のためのいずれの適切な形態でも、例えば食物若しくは飲料製品、栄養補助食品、錠剤、外用水薬、又は化粧品の形態であってもよい。好ましい実施形態において、配合物は医薬である。
【実施例】
【００２７】
実施例１
ラクトバチルス・ジョンソニイの新鮮細胞によるネスカフェプロテクト（登録商標）の処理
Ｌ．ジョンソニイ（ＣＮＣＭ Ｉ−１２２５）の細胞を成長させ（７．０Ｅ０８ｃｆｕ／ｍｌ）、遠心分離した（５０００ｇ、１０分）。０．６１ｇ／ｍｌの濃度で、リン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）中にペレットを再懸濁した。ネスカフェプロテクト（登録商標）（生及び焙煎したコーヒー豆の乾燥共抽出物）３０ｍｇ／ｍｌを添加し、混合物を３７℃でインキュベートした。異なる反応時間で試料を抜き出し、遠心分離し（３０００ｇ、５分）、０．４５μｍ孔径のシリンジフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＳＬＨＡ０２５ＢＳ）を通して濾過し、ＨＰＬＣによって分析した。
【００２８】
同一の反応条件下であるが細菌なしで、平行して反応対照を実施した。
【００２９】
ラクトバチルス・ジョンソニイ抽出物（溶解細胞）によるネスカフェプロテクト（登録商標）の処理
Ｌ．ジョンソニイ（ＣＮＣＭ Ｉ−１２２５）の細胞を成長させ（７．０Ｅ０８ｃｆｕ／ｍｌ）、遠心分離した（５０００ｇ、１０分）。０．６１ｇ／ｍｌの濃度で、リン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）中にペレットを再懸濁した。次に、ガラスビーズ法を使用して、細胞を溶解させた。細胞調製物６００μｌをスクリューキャップチューブに入れ、０℃でガラスビーズ６００μｌを添加した。次に、チューブをミニビードビーター（Ｍｉｎｉ−Ｂｅａｄｂｅａｔｅｒ）中に強振動下で１分間入れ、氷で冷却し、ミニビードビーター中に、さらに１分間入れた。次に、ネスカフェプロテクト（登録商標）（３０ｍｇ／ｍｌ、リン酸緩衝液ｐＨ７．０）の溶液９００μｌに、粗細胞抽出物を添加し、混合物を３７℃でインキュベートした。異なる反応時間で試料を抜き出し、遠心分離し（３０００ｇ、５分）、０．４５μｍ孔径のシリンジフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＳＬＨＡ０２５ＢＳ）を通して濾過し、ＨＰＬＣによって分析した。
【００３０】
ラクトバチルス・ジョンソニイの噴霧乾燥調製物でのネスカフェプロテクト（登録商標）の処理
ネスカフェプロテクト（登録商標）３０ｍｇを、リン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）１ｍｌ又は水１ｍｌに溶解した。この溶液に、ラクトバチルス・ジョンソニイ（ＣＮＣＭ Ｉ−１２２５）の噴霧乾燥調製物（３．３Ｅ９ｃｆｕ／ｇ）１０ｍｇを添加した。次に、混合物を３７℃でインキュベートし、異なる反応時間で試料を抜き出した。遠心分離（３０００ｇ、５分）及び濾過（０．４５μｍ孔径のシリンジフィルター、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＳＬＨＡ０２５ＢＳ）後、ＨＰＬＣによって、試料を分析した。
【００３１】
ラクトバチルス・ジョンソニイ（ＣＮＣＭ Ｉ−１２２５）の噴霧乾燥調製物での生コーヒー抽出物の処理
乾燥生コーヒー抽出物３０ｍｇを、リン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）１ｍｌ又は水１ｍｌに溶解した。この溶液に、ラクトバチルス・ジョンソニイの噴霧乾燥調製物（３．３Ｅ９ｃｆｕ／ｇ）１０ｍｇを添加した。次に、混合物を３７℃でインキュベートし、異なる反応時間で試料を抜き出した。遠心分離（３０００ｇ、５分）及び濾過（０．４５μｍ孔径のシリンジフィルター、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＳＬＨＡ０２５ＢＳ）後、ＨＰＬＣによって、試料を分析した。
【００３２】
ラクトバチルス・ジョンソニイ（ＣＮＣＭ Ｉ−１２２５）の濃縮調製物でのネスカフェ（ＮＥＳＣＡＦＥ）（登録商標）の処理
ネスカフェスペシャルフィルター（ＮＥＳＣＡＦＥ ＳＰＥＣＩＡＬ ＦＩＬＴＲＥ）（登録商標）（焙煎したコーヒー豆の乾燥抽出物）４００ｍｇを沸騰水１ｍｌに溶解し、室温で３７℃まで、この溶液を冷却した。このコーヒー溶液２５０μｌに、ラクトバチルス・ジョンソニイの異なる量の濃縮調製物（５０μｌ、１００μｌ、３５０μｌ、７５０μｌ）を添加し、水で１ｍｌになるまで量を調整した。次に、混合物を３７℃で２時間及び４時間インキュベートした。遠心分離（３０００ｇ、５分）及び濾過後、ＨＰＬＣによって、試料を分析した。
【００３３】
ＨＰＬＣ分析
コーヒー試料を１％ｗ／ｗに希釈し、ＣＣ２５０／４Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ １００−５−Ｃ１８カラム（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）でＲＰ−ＨＰＬＣによって分析した。溶離系は、流量１ｍＬ／分で、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ水、０．１％ＴＦＡ、及びＣＨ３ＣＮであった。この方法により、外部標準検量線を使用して、カフェオイルキナ酸（ＣＱＡ）、フェルロイルキナ酸（ＦＱＡ）、ジカフェオイルキナ酸（ｄｉＣＱＡ）、フェルオイルキナ酸−ラクトン、コーヒー酸（ＣＡ）、及びフェルラ酸（ＦＡ）を同時に測定（３２５ｍｍでの吸光度）できた。時間０（ｔ０）での基準、又は細菌なしでの同時間の基準に対して結果を示した。
【００３４】
抗酸化剤応答配列（ＡＲＥ）ルシフェラーゼ分析
ネオマイシン選択可能マーカーを含むｐｃＤＮＡ３．１プラスミドと一緒に、ラットのグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼＡ２（ＧＳＴＡ２）中に存在するＡＲＥ８コピーを含むｐＧＬ−８ｘＡＲＥを、ヒトＭＣＦ７細胞に安定的に形質移入した（Ｗａｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、６６巻、１０９８３〜１０９９４頁、２００６年）。ＡＲＥ（抗酸化剤応答配列）は、解毒作用及び酸化ストレスに対する内因性防御に関与する遺伝子を制御する転写因子Ｎｒｆ２の結合部位である。プラスミドｐＧＬ−８ｘＡＲＥは、Ｎｒｆ２活性の監視を可能にする、８個のＮｒｆ２結合部位の下流にルシフェラーゼ遺伝子を含む。
【００３５】
コーヒーでの処理のために、ＤＭＥＭ成長培地の９６ウェルマイクロタイタープレートにＡＲＥｃ３２細胞を播種した。異なるコーヒーで２４時間処理した後、ホタルルシフェラーゼ活性を測定した。
【００３６】
タンパク質発現
コラゲナーゼ溶液でのスプラーグドーリーラットの肝臓の灌流によって、初代培養肝細胞を得た（Ｓｉｄｈｕら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３０１巻、１０３〜１１３頁、１９９３年）。トリパンブルー排除試験によって測定された細胞生存率は９０〜９５％の間の範囲であることがわかった。２ｍＭ Ｌ−グルタミン酸、１０ｍＭヘペスｐＨ７．４を、ＩＴＳ＋、ペニシリン／ストレプトマイシン１５０００Ｕ、１００ｎＭデキサメタゾン、及び５％ウシ胎仔血清（ハイ−クローン）を補ったウィリアムス培地３ｍｌで、６０ｍｍプラスチック組織培養皿上に、１．５×１０５細胞／ｃｍ２の密度で細胞を播種した。肝細胞を２時間付着させ、次に、ＥＢＳＳで洗浄して、細胞片及び付着しなかった細胞を除去した。デキサメタゾン２５ｎＭを含む、新鮮な血清を含まない培地を添加し、次に、マトリゲルのオーバーレイ（２３３ｇ／ｍｌ）を適用した。培地交換に続いて、２日に一度、新鮮なマトリゲルを培養物に添加した。解毒酵素及び抗酸化タンパク質発現についてのコーヒーの効果を研究するために、タンパク質抽出及びウェスタンブロット分析の前に、４８時間の細胞播種の２４時間後に、培地に試験材料を添加した（Ｃａｖｉｎら、Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ Ｔｏｘ．、４６巻、１２３９〜４８頁、２００８年）。
【００３７】
プロスタグランジンＥ２の生成のアッセイ
ヒト結腸ＨＴ−２９細胞を、異なるコーヒーで１５時間処理し、続いて炎症誘発剤ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）と一緒に６時間共培養した。競合酵素免疫測定法（ＥＩＡ）を使用して、ＨＴ−２９細胞中のＰＧＥ２生成の分析を測定した（Ｃａｖｉｎら、ＢＢＲＣ、３２７巻、７４２〜４９頁、２００５年）。
【００３８】
結果
フェノール酸生成のためのクロロゲン酸の加水分解
実験１：様々な反応時間及び細胞調製物量による、Ｌ．ジョンソニイ新鮮細胞でのネスカフェプロテクト（登録商標）の処理。結果を表１に示す。
【００３９】
【表１】
【００４０】
実験２：様々な反応時間及び細胞調製物量による、Ｌ．ジョンソニイ抽出物（溶解細胞）によるネスカフェプロテクト（登録商標）の処理。結果を表２に示す。
【００４１】
【表２】
【００４２】
実験３：ラクトバチルス・ジョンソニイの噴霧乾燥調製物によるネスカフェプロテクト（登録商標）の処理。結果を表３に示す。
【００４３】
【表３】
【００４４】
実験４：ラクトバチルス・ジョンソニイの噴霧乾燥調製物での生コーヒー抽出物の処理。結果を表４に示す。
【００４５】
【表４】
【００４６】
実験５：ラクトバチルス・ジョンソニイの濃縮調製物でのネスカフェ（登録商標）の処理。結果を表５に示す。
【００４７】
【表５】
【００４８】
表６は、クロロゲン酸を加水分解するための処理をしなかった生コーヒー豆の抽出物（対照試料）の２つの異なる試料における、いくつかの化合物の絶対濃度を示す。
【００４９】
【表６】
【００５０】
タンパク質の発現
ラット初代培養肝細胞において、ネスカフェレッドカップ（登録商標）（焙煎したコーヒー豆の抽出物）２００ｕｇ／ｍｌは４８時間の処理後、ウェスタンブロットにより、４００ｕｇ／ｍｌで、ＧＳＴサブユニット（ＧＳＴＡ４、ＧＳＴＰ１）及びヘム−オキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）のタンパク質発現の増加をもたらさず、ＧＳＴＰ１及びＨＯ−１発現の弱い誘導をもたらした。対照的に、ＧＳＴＡ４、ＧＳＴＰ１、及びＨＯ−１について、Ｌ．ジョンソニイで処理したネスカフェプロテクト（登録商標）２００ｕｇ／ｍｌ及び４００ｕｇ／ｍｌの両方で、異なるタンパク質発現のより強い誘導を観察した。結果を、ウェスタンブロットゲルとして図１に示す。
【００５１】
ネスカフェレッドカップ（登録商標）対ネスカフェプロテクト（登録商標）及びＬ．ジョンソニイで処理したネスカフェプロテクト（登録商標）を５％有する食餌を２週間与えたオスのラットの肝臓において得られたデータは、ラット初代培養肝細胞において観察された効果を確認した。未処理のネスカフェプロテクト（登録商標）（ＧＳＴＰ１、ＮＱＯ１）及び未処理のネスカフェレッドカップ（登録商標）（ＧＳＴＰ１、ＮＱＯ１）と比較して、解毒酵素発現の最強の誘導（ＧＳＴＰ１、ＮＱＯ１）が、Ｌ．ジョンソニイで処理したネスカフェプロテクト（登録商標）について見られた。結果を、ウェスタンブロットゲルとして図２に示す。
【００５２】
抗酸化剤応答配列（ＡＲＥ）ルシフェラーゼ分析
ラットＧＳＴＡ２−ＡＲＥレポーター構築体の数コピーで、安定的に形質移入されたヒト乳癌細胞（ＡＲＥｃ３２）を使用して、コーヒーによるＮｒｆ２−ＡＲＥ経路の活性化を実証した。クロロゲン酸を加水分解するための処理をしていない生コーヒー抽出物、及びＬ．ジョンソニイで２４時間処理した異なる生コーヒー抽出物は、Ｎｒｆ２−ルシフェラーゼレポーター活性における用量依存的上昇をもたらした（表７を参照されたい）。
【００５３】
【表７】
【００５４】
プロスタグランジンＥ２生成のアッセイ
ヒト結腸ＨＴ−２９細胞で、Ｌ．ジョンソニイで処理した生コーヒー抽出物の潜在的な抗炎症性効果を分析した。炎症誘発剤ＴＮＦ−αによる処理後、結腸細胞においてプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）レベルが誘導される。この研究において、異なるコーヒー抽出物（クロロゲン酸を加水分解するための処理をしていない生コーヒー抽出物、及びＬ．ジョンソニイで２４時間処理した異なる生コーヒー抽出物）で、細胞を２４時間前処理した。実験の最後の６時間に、ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加した。データ（表８を参照されたい）は、ＴＮＦ−αで処理した対照細胞と比較した、ＰＧＥ２生成のコーヒーによる明白な用量依存的減少を示した。
【００５５】
【表８】
【００５６】
実施例２
コーヒー試料
１００％ロブスタ生豆からの生コーヒー抽出物
ネスカフェプロテクト（登録商標）、生及び焙煎したコーヒー豆の乾燥共抽出物
【００５７】
酵素及び細胞
微生物 培地
ラクトバチルス・ジョンソニイ（ＣＮＣＭ Ｉ−１２２５） ＭＲＳ
ビフィズス菌ラクティスＢＢ１２（ＣＮＣＭ Ｉ−３４４６） ＭＲＳ＋システイン
ビフィズス菌ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）ＢＢ５３６（ＡＴＣＣ ＢＡＡ−９９９） ＭＲＳ＋システイン
【００５８】
アスペルギルス・ジャポニクス（日本のキッコーマン株式会社）由来のクロロゲン酸エステラーゼ（２４Ｕ／ｇ）。
アスペルギルス・オリザエ（日本のキッコーマン株式会社）からのタンナーゼ
【００５９】
細菌細胞の調製
攪拌せずに、嫌気性環境で、３７℃での培地における１６時間の培養に対応する静止期に十分到達した後で、試験した菌株を採取した（５０００ｇで１０分間の遠心分離）。菌株の最初の活性化のために、凍結保存培養物を新鮮な培地中に植菌し、一晩成長させた。この前培養物を使用して、培養物を植菌した。
【００６０】
細菌細胞でのコーヒー抽出物の処理
細菌の培養及び遠心分離の後で、０．６１ｇ／ｍｌの濃度で、リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中にペレットを再懸濁した。この細胞調製物２００μｌに、コーヒー溶液（３％）８００μｌを添加し、３７℃で、４時間、１６時間、及び２４時間、混合物をインキュベートした。
【００６１】
クロロゲン酸エステラーゼでのコーヒー抽出物の培養
コーヒー溶液（３％）８００μｌに、リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２００μｌ中のクロロゲン酸エステラーゼ（２５ｍｇ）の溶液を添加した。次に、３７℃で、４時間、１６時間、及び２４時間、混合物をインキュベートした。反応時間の後で、熱処理（３分、９０℃）によって酵素活性を止め、分析の前に混合物を濾過した。
【００６２】
ＡＲＥルシフェラーゼ分析
実施例１の通り
【００６３】
結果
ラットＧＳＴＡ２−ＡＲＥレポーター構築体の数コピーで、安定的に形質移入されたヒト乳癌細胞（ＡＲＥｃ３２）を使用して、コーヒーによる抗酸化Ｎｒｆ２−ＡＲＥ経路の活性化を実証した。クロロゲン酸を加水分解するための処理をしていない（未処理）生コーヒー抽出物、ラクトバチルス・ジョンソニイ（Ｌｊ）で２４時間処理した生コーヒー抽出物、ビフィズス菌ラクティス（Ｂｌ）で２４時間処理した生コーヒー抽出物、及びクロロゲン酸エステラーゼ（ＣＥ）で４時間処理した生コーヒー抽出物は全て、Ｎｒｆ２−ルシフェラーゼレポーター活性における用量依存的上昇をもたらした（表９）。
【００６４】
【表９】
【００６５】
異なる微生物及びクロロゲン酸エステラーゼで、生コーヒー抽出物を処理して、クロロゲン酸を加水分解した。結果を表１０に示す。
【００６６】
【表１０】
【００６７】
異なる微生物及びクロロゲン酸エステラーゼで、ネスカフェプロテクト（登録商標）を処理し、クロロゲン酸を加水分解した。結果を表１１に示す。
【００６８】
【表１１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ、
ａ）水でコーヒー豆を抽出して、コーヒー抽出物を生成するステップ、及び
ｂ）クロロゲン酸を加水分解して、フェノール酸を生成するために、コーヒー抽出物を処理するステップ
を含む、コーヒー抽出物を生成する方法。
【請求項２】
抽出されるコーヒー豆が、挽かれていないコーヒー豆である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップａ）において抽出されるコーヒー豆が、生コーヒー豆である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ステップａ）において生コーヒー豆が、焙煎したコーヒー豆と一緒に共抽出される、請求項３の方法。
【請求項５】
コーヒー抽出物が、ステップｂ）の処理の前、間、又は後に、抽出されたコーヒー豆から分離される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
コーヒー抽出物が、ステップｂ）の処理の後に、抽出されたコーヒー豆から分離されたままである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ステップａ）において得られた生コーヒー抽出物を、焙煎したコーヒー豆の抽出物と混合し、混合物を、ステップｂ）において処理する、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
ステップｂ）におけるクロロゲン酸の加水分解が、クロロゲン酸を加水分解して、フェノール酸を生成することができる微生物での発酵によって実施される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法によって生成されたコーヒー抽出物が、食物又は飲料製品の成分として使用される、食物又は飲料製品を製造する方法。
【請求項１０】
抗酸化剤としての、コーヒー酸の量が、乾燥物質１グラム当たり、少なくとも１ミリグラムであり、及び／又は、フェルラ酸の量が、乾燥物質１グラム当たり、少なくとも０．５ミリグラムである、コーヒー抽出物の使用。
【請求項１１】
医薬の調製のための、コーヒー酸の量が、乾燥物質１グラム当たり、少なくとも１ミリグラムであり、及び／又はフェルラ酸の量が、乾燥物質１グラム当たり、少なくとも０．５ミリグラムである、コーヒー抽出物の使用。
【請求項１２】
皮膚障害、糖尿病、脳障害、炎症、肥満、及び／又は癌を、治療又は予防する配合物の調製のための、コーヒー酸の量が、乾燥物質１グラム当たり、少なくとも１ミリグラムであり、及び／又はフェルラ酸の量が、乾燥物質１グラム当たり、少なくとも０．５ミリグラムである、コーヒー抽出物の使用。
【請求項１３】
骨再構築を促進するための、コーヒー酸の量が、乾燥物質１グラム当たり、少なくとも１ミリグラムであり、及び／又はフェルラ酸の量が、乾燥物質１グラム当たり、少なくとも０．５ミリグラムである、コーヒー抽出物の使用。
【請求項１４】
コーヒー抽出物中のコーヒー酸の量に対する、カフェオイルキナ酸及びジエステルの量の割合が、１００未満（重量／重量）である、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１５】
コーヒー抽出物中のフェルラ酸の量に対する、フェルロイルキナ酸及びジエステルの量の割合が、３０未満（重量／重量）である、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１】
以下のステップ、
ａ）水でコーヒー豆を抽出して、コーヒー抽出物を生成するステップ、及び
ｂ）クロロゲン酸を加水分解して、フェノール酸を生成するために、コーヒー抽出物を処理するステップ
を含む、コーヒー抽出物を生成する方法。
【請求項２】
抽出されるコーヒー豆が、挽かれていないコーヒー豆である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップａ）において抽出されるコーヒー豆が、生コーヒー豆である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ステップａ）において生コーヒー豆が、焙煎したコーヒー豆と一緒に共抽出される、請求項３の方法。
【請求項５】
コーヒー抽出物が、ステップｂ）の処理の前、間、又は後に、抽出されたコーヒー豆から分離される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
コーヒー抽出物が、ステップｂ）の処理の後に、抽出されたコーヒー豆から分離されたままである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ステップａ）において得られた生コーヒー抽出物を、焙煎したコーヒー豆の抽出物と混合し、混合物を、ステップｂ）において処理する、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
ステップｂ）におけるクロロゲン酸の加水分解が、クロロゲン酸を加水分解して、フェノール酸を生成することができる微生物での発酵によって実施される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法によって生成されたコーヒー抽出物が、食物又は飲料製品の成分として使用される、食物又は飲料製品を製造する方法。
【請求項１０】
抗酸化剤としての、コーヒー酸の量が、乾燥物質１グラム当たり、少なくとも１ミリグラムであり、及び／又は、フェルラ酸の量が、乾燥物質１グラム当たり、少なくとも０．５ミリグラムである、コーヒー抽出物の使用。
【請求項１１】
医薬の調製のための、コーヒー酸の量が、乾燥物質１グラム当たり、少なくとも１ミリグラムであり、及び／又はフェルラ酸の量が、乾燥物質１グラム当たり、少なくとも０．５ミリグラムである、コーヒー抽出物の使用。
【請求項１２】
皮膚障害、糖尿病、脳障害、炎症、肥満、及び／又は癌を、治療又は予防する配合物の調製のための、コーヒー酸の量が、乾燥物質１グラム当たり、少なくとも１ミリグラムであり、及び／又はフェルラ酸の量が、乾燥物質１グラム当たり、少なくとも０．５ミリグラムである、コーヒー抽出物の使用。
【請求項１３】
骨再構築を促進するための、コーヒー酸の量が、乾燥物質１グラム当たり、少なくとも１ミリグラムであり、及び／又はフェルラ酸の量が、乾燥物質１グラム当たり、少なくとも０．５ミリグラムである、コーヒー抽出物の使用。
【請求項１４】
コーヒー抽出物中のコーヒー酸の量に対する、カフェオイルキナ酸及びジエステルの量の割合が、１００未満（重量／重量）である、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１５】
コーヒー抽出物中のフェルラ酸の量に対する、フェルロイルキナ酸及びジエステルの量の割合が、３０未満（重量／重量）である、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の使用。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２０１１−５２０４２９（Ｐ２０１１−５２０４２９Ａ）
【公表日】平成２３年７月２１日（２０１１．７．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５０６６２６（Ｐ２０１１−５０６６２６）
【出願日】平成２１年３月１２日（２００９．３．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５２９３６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１３２８８８
【国際公開日】平成２１年１１月５日（２００９．１１．５）
【出願人】（５９９１３２９０４）ネステク ソシエテ アノニム (637)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年７月２１日（２０１１．７．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月１２日（２００９．３．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５２９３６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１３２８８８
【国際公開日】平成２１年１１月５日（２００９．１１．５）
【出願人】（５９９１３２９０４）ネステク ソシエテ アノニム (637)
【Ｆターム（参考）】
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