サイトカイン及びＮＦ−ＫＢに影響を与える組成物及び方法
本発明は、有効量の植物ろ過物組成物を個体に投与することにより種々のサイトカイン及びＮＦ−κＢに影響を与える組成物及び方法を開示する。種々の例示的実施形態において、ＩＬ−１０及びＩＬ−２などの種々のインターロイキン並びにＮＦ−κＢを含む転写因子を制御することにより、炎症、癌、及び／又はＨＩＶなどの種々の感染症の有効な治療において前記組成物が有用であることが主張される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、サイトカインや転写因子などのタンパク質の産生及び／又は機能を変化させる組成物及び方法に関する。より具体的には、本発明は特定の淡水微生物、藻類、コケ、細菌及び／又は菌類の培養物又は共培養物から得られた組成物、並びに有効量の前記組成物を投与することにより炎症及び／又は癌及びＨＩＶなどの疾患を治療又は予防する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
サイトカインは、免疫系の細胞などの種々の細胞から分泌される、広範な種類のタンパク質である。サイトカインの一つの機能は様々なシグナルを細胞間で運び、それにより細胞の間で活性調節を行うことである。病原体と細胞との接触などのいくつかの因子は、細胞にサイトカインを分泌させることができ、それにより疾患を生じうる。ある場合には、細胞は、病原体又は疾患に対する自然防御を組織化するための手段としてサイトカインを分泌する。
【０００３】
サイトカインには数多くのものがあり、それらのうち多くのものは白血球細胞によって産生されるインターロイキン（「ＩＬ」）と一般的に称されている。また、インターロイキンにも数多くの異なる種類のものがあり、例えばＩＬ−２、ＩＬ−１０、及びＩＬ−１７Ａなどがある。これらの異なるインターロイキンは、炎症を減少又は増加させる、種々の細胞種の増殖及び機能を刺激する並びに抗体の産生を調節するなど、それぞれ特定の機能及び効果を有している。例えば、ＩＬ−２及びＴＮＦ−αは炎症に寄与し、炎症性タンパク質とみなしうるのに対し、ＩＬ−１０は炎症を減少させる抗炎症タンパク質であるとみなしうる。よって、産生されるＩＬ−２及びＴＮＦ−αの量が増加するにつれて、炎症も大きくなる。逆に産生されるＩＬ−１０の量が増加するにつれて、炎症は小さくなる。
【０００４】
インターロイキンは多くのプロセスに関与することが決定されており、これには炎症が含まれるがこれに限定されない。例えば、ＩＬ−２が免疫グロブリンの産生を抑制することを示唆する実質的な証拠が存在する。逆に、ＩＬ−１０が免疫グロブリンの産生を増強することを示唆する実質的な証拠も存在する。
【０００５】
別のサイトカインはインターフェロン−ガンマあるいはＩＦＮ−γである。ＩＦＮ−γはウイルスに対する先天性免疫及び獲得免疫並びに細胞内細菌防御機能の上で、並びに腫瘍制御の上で、非常に重要である。ＩＦＮ−γは３０を超える遺伝子の転写を変化させ、Ｔｈ２細胞活性を増加させる、ＮＫ細胞活性を増進する、及びこれら以外の種々の分子シグナル伝達経路に影響を与える、などの影響を生み出すことが示されている。
【０００６】
他のサイトカインとしては、免疫細胞の制御に関わる腫瘍壊死因子アルファあるいはＴＮＦ−αがある。さらに、ＴＮＦ−αの産生の上昇は、癌などの種々の人疾患に寄与する因子であると示唆されてきた。さらに別のサイトカインとしては顆粒球マクロファージコロニー刺激因子あるいはＧＭ−ＣＳＦがある。ＧＭ−ＣＳＦは幹細胞を刺激することが知られている白血球細胞増殖因子であり、免疫／炎症カスケードの一部である。
【０００７】
「核因子カッパベータ」あるいはＮＦ−κＢとして知られている転写因子は遺伝子転写の制御因子として機能する細胞内タンパク質であり、種々の生物学的プロセス及び病態において重要な役割を果たす。ＮＦ−κＢは感染に応答しての免疫系制御において、並びにシクロオキシゲナーゼ、一酸化窒素シンターゼ及びその他の炎症促進性タンパク質の産生など幾つかの炎症経路において、重要な役割を果たすことが見出されてきた。ＮＦ−κＢの不適当な調節は癌、炎症性疾患及び自己免疫疾患、敗血性ショック、ウイルス感染及び不適当な免疫発達に結びつけられており、幾つかの研究ではＮＦ−κＢはシナプス可塑性及び記憶に関連するプロセスに結びつけられている。ＮＦ−κＢ及び種々のサイトカインの役割は、Ｓａｒｋａｒ， ｅｔ ａｌ．著、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００６年４月１日発行）のＵｓｉｎｇ Ｃｈｅｍｏｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ Ａｇｅｎｔｓ ｔｏ Ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅ Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙというタイトルの論文で論じされており、この論文はその全体が参照により本明細書中に取り込まれる。さらに、ＨＩＶなど種々のウイルスはＮＦ−κＢとの分子結合部位を有しており、これは、ＮＦ−κＢがＨＩＶウイルスを潜在状態から活性状態へと活性化する上で非常に重要な成分でありうることを示している。
【０００８】
よって、サイトカイン及び／又はＮＦ−κＢの調節は種々の疾患の治療を提供する上での非常に重要なプロセスでありうる。例えば、ＩＬ−１０は抗炎症的性質を有しているため、慢性的な炎症状態にある患者においてＩＬ−１０を増加させることは炎症の治療に用いられうる。あるいは、ＮＦ−κＢはＨＩＶウイルスを潜在状態から活性状態に活性化する因子であるため、ＮＦ−κＢの量を減少させることによりＨＩＶウイルスが活性化されることを遅らせたり防止したりできる可能性がある。
【０００９】
現在、サイトカイン及びＮＦ−κＢを調節するための組成物及び方法が知られている。しかし、これら知られた組成物及び方法のうち多くのものは細胞に対して刺激性であったり、細胞に対する毒性を有する。さらに、サイトカイン及びＮＦ−κＢを調節するための多くの知られた組成物及び方法は、多くのサイトカインを同じ様に調節するものであり、それらのうち幾つかのものは治療の所望される総体的効果の妨げとなりうる。例えば、ＩＬ−１０などの抗炎症性サイトカインを上方制御する、炎症治療のための組成物及び方法が知られているが、これらの組成物ではＩＬ−１０の影響を減少させる炎症性サイトカインであるＩＬ−２も上方制御されてしまう。
【００１０】
このため、抗炎症性のサイトカイン及びＮＦ−κＢを制御し、これらに細胞レベルで影響を与える改良された組成物及び方法を提供することが有利となる。さらに、選択されたサイトカイン及びＮＦ−κＢを制御して多くの効果を達成し、種々の健康上の問題を治療することが可能な組成物及び方法を提供することが望ましいものになる。そのような、多数のサイトカインの特異的制御の一例は、炎症を抑制するために、ＩＬ−２を上方制御すること無しに、あるいはＩＬ−２を下方制御さえしつつ、ＩＬ−１０を上方制御して、これにより、炎症を減少させるために炎症促進性のサイトカインのレベルを減少若しくは維持しつつ抗炎症性サイトカインを増加させる組成物である。種々のサイトカイン及びＮＦ−κＢに影響を与える組成物及び方法であって、ただし刺激性でなく、非毒性であり、製造及び流通が容易で、かつ製造が高価ではない、組成物及び方法を提供することも望ましいこととなる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
詳細な説明に記載されるように、また本発明の種々の実施形態に従って、サイトカイン及びＮＦ−κＢに影響を与える組成物及び方法が開示される。一つの実施形態によれば、前記組成物は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−５８６３の特定の淡水微生物、藻類、コケ、細菌及び／又は菌類の培養物又は共培養物から得られる。
【００１２】
本発明の種々の例示的実施形態によれば、サイトカイン及びＮＦ−κＢに影響を与えて免疫応答を制御し、炎症を減少し、抗酸化活性を付与し、抗体産生を調節し、癌性腫瘍の成長を治療若しくは予防し、及びＨＩＶなどの感染を治療若しくは防止する、方法が開示される。この組成物は非毒性であり、ＩＬ−２及び／又はＴＮＦ−αなど他のサイトカインを維持又は減少させつつＩＬ−１０などの特定のサイトカインを選択的に上方制御して、炎症の減少などの所望の効果を達成することが可能である。本発明のさらに別の例示的実施形態においては、ＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性に影響を与える方法、及びＴＮＦ−αに誘導されたＮＦ−κＢ活性化を減少させる方法が開示される。さらに、本発明の種々の例示的実施形態によれば、ＩＬ−１０など特定の抗炎症性サイトカインを誘導する方法、特にＩＬ−２、ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γなど他の炎症促進性サイトカインは誘導しない方法が開示される。
【００１３】
本発明の主題は、明細書末尾において具体的に指摘され明確にクレームされている。しかしながら、本発明の実施形態は、付属の図面と併せて以下の説明を参照することによって最も良く理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１Ａ〜Ｄは、本発明の種々の例示的実施形態による電気泳動ゲル移動度シフトアッセイからの生データを示す。
【図２】図１Ａ〜図１Ｄに提示された実験で得られた結果の定量的分析を表した棒グラフを示し、それにより本発明の種々の例示的実施形態によるＮＦ−κＢに影響を与える方法の効能を示す。
【図３】本発明の種々の例示的実施形態による、サイトカインＩＬ−２の産生に対する方法の効能を表した棒グラフを示す。
【図４】本発明の種々の例示的実施形態による、サイトカインＩＬ−１０の産生に対する本方法の効能を表した棒グラフを示す。
【図５】本発明の種々の例示的実施形態による、サイトカインＩＬ−１７Ａの産生に対する本方法の効能を表した棒グラフを示す。
【図６】本発明の種々の例示的実施形態による、サイトカインＩＮＦ−γの産生に対する本方法の効能を表した棒グラフを示す。
【図７】本発明の種々の例示的実施形態による、サイトカインＴＮＦ−αの産生に対する本方法の効能を表した棒グラフを示す。
【図８】本発明の種々の例示的実施形態による、ＧＭ−ＣＳＦの産生に対する本方法の効能を表した棒グラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下の説明は、本発明の例示的実施形態の説明であり、本発明の範囲や利用可能性を限定することは何ら意図されていない。寧ろ、以下の説明は本発明の種々の実施形態を実施するための便利な例示を提供することを意図しているものである。本発明の範囲から逸脱しなければ、他の構成、組成、量、方法などを用いても構わない。以下で明らかになるように、本発明の精神及び範囲から逸脱しなければ、これらの実施形態に記載された方法に対して他の変更を種々加えても構わない。
【００１６】
本発明の種々の例示的実施形態によれば、本発明は種々のサイトカイン及びＮＦ−κＢに影響を与える組成物を投与することを含む。前記組成物は
、米国特許７，８０７，６２２（タイトル：”Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｐｈｙｔｏ−Ｐｅｒｃｏｌａｔｅ Ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ）、米国特許出願番号１２／８９７，５７４（タイトル：”Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｐｈｙｔｏ−Ｐｅｒｃｏｌａｔｅ Ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ”）、米国特許出願 １１／５８７，２６６（タイトル：”Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ Ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ”）、米国特許出願番号６１／３０６，５９１（タイトル：”Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｌｏｗｅｒｉｎｇ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ Ｗｉｔｈ ＰＡＺ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ”）及び米国特許出願番号６１／３１１，８３８（タイトル：”Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｉｎｇ Ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｗｉｔｈ ＰＡＺ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ”）などの、本願と同一人によって所有されている数多くの共係属中の特許出願に記載されている。上記の文献は全て、その全体が参照により本明細書中に取り込まれる。これらの米国出願からの優先権を主張する米国外での特許出願及びＰＣＴ特許出願の全ても、その全体が参照により本明細書中に取り込まれる。
【００１７】
本明細書中で「植物ろ過物」（ｐｈｙｔｏ−ｐｅｒｃｏｌａｔｅ）と称される組成物は、藻類、コケ、細菌及び菌類など特定の微生物の培養物又は共培養物から産生される分子から概して構成されている非毒性の組成物である。一つの例示的実施形態においては、植物ろ過物を作製するために用いられる培養物の寄託は、寄託番号ＰＴＡ−５８６３としてバージニア州マナサスのアメリカンタイプカルチャーコレクションに預けられている。この寄託物は、それを開示した特許が付与された際には公衆に利用可能となる。この寄託は３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８０８章及びＭＰＥＰ２４１０．０１章に従ってなされたものであり、よって、特許が付与された際は寄託された生物材料の公衆による入手可能性について預託者が課した制限は全て取消不能に除去されるという一つの例外事項を除き、この寄託物へのアクセスは、本出願が継続している間、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．１４章及び３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．１２２章の下でそのアクセスを認められた者として長官により決定された者に対し、その寄託物への参照をなすことによって認められる。
【００１８】
一つの例示的実施形態において、本明細書中に「植物ろ過物」として記載された組成物は以下に記載のプロセスにより作製される。この実施形態によれば、まず、ＡＴＣＣ培養物寄託番号ＰＴＡ−５８６３として現在寄託されている種類の培養物の、おおよそ１又はそれ以上のアリコート（ａｌｉｑｕｏｔ）を得る。１より多いアリコートを用いる種々の実施形態においては、それらのアリコートを１つのより大きな複合培養器中で一緒にし、以下に述べる方法を用いて維持してもよい。
【００１９】
この例示的実施形態によれば、凍結保存から成功裏に入手及び培養された培養物の各アリコートについて、その全量を滅菌脱イオン水を用いて全量が約１０ｍＬになるように希釈する（例えば、３アリコート（約４．５ｍｌ）を一緒にし、全量が３０ｍＬになるよう希釈する）。さらに、約１ｍＬの滅菌脱イオン温水中に約２０ｍｇの乾燥活性パン酵母を混合して得られた栄養ブレンド原液を調製し、室温で約２０分インキュベートし、約１０００の培養アリコートに十分な栄養を産生する。そして、調製した栄養ブレンドのうち約１μＬを各希釈アリコートに添加し（例えば、混合され希釈された３アリコートに対しては、調製した栄養ブレンド３μＬを添加し）、次に混合物を緩やかに渦状にかき混ぜる。
【００２０】
この例示的実施形態に係る植物ろ過物の製造の次のステップは、前記培養サンプルを栄養ブレンドと共に丸底ガラス培養器などの滅菌培養器中で、雰囲気を滅菌フィルター換気しながら、約１週間室温でインキュベートするステップを含む。この例示的実施形態においては、この混合物を週の半ばで一度渦状にかき混ぜ、約１２：１２時間サイクルの疑似日照の下で維持する。この週の後、おおよそ用いられた各希釈アリコートに対して約１μＬの新たに調製した栄養ブレンドを、前記培養器に添加し、この新たな混合物を好ましくは穏やかに渦状にかき混ぜる。この栄養ブレンドが加えられた培養サンプルを室温で約１週間さらにインキュベートし、好ましくは週の半ばで一度渦状にかき混ぜ、約１２：１２時間サイクルの疑似日照の下で維持する。
【００２１】
この例示的な植物ろ過物製造方法を続けながら、滅菌管とサイフォン又は蠕動ポンプとを用いて、培養器の底で生育している藻類バイオマスを撹乱すること無しに培養器のおおよそ上半分から液量をゆっくりと回収あるいは収集し、使用した各寄託アリコート当たり約５ｍＬを生成する。この液体を滅菌ガラス保存容器その他の適切な保存容器に保存して、滅菌フィルタ処理して所望の際に投与するようにしてもよい。前記培養器中の液量は滅菌脱イオン室温水を用いておおよそ回収前の体積まで補充すべきであり、それにより最終総体積は使用した各寄託アリコート当たり約１０ｍＬとなる。次に、新たに調製した栄養ブレンドを、使用された各アリコート当たりおおよそ１μＬ、前記培養器に添加し、そして混合物を穏やかに渦状にかき混ぜ、所望に応じて更なるサイクル、前記のやり方でインキュベートする。
【００２２】
この例示的実施形態を引き続き参照しながら、前記培養サンプル及び栄養ブレンドを、約１２：１２時間サイクルの疑似日照を維持しながら、室温で約１週間あるいはそれ以上インキュベートする。この培養液を栄養ブレンドとインキュベートしながら、先に回収した材料を約０．２μｍの孔径の滅菌膜フィルタ（又は当業者が認識する同様のフィルタ）でろ過し、最終的な生活性液体（本明細書中で「組成物」又は「植物ろ過物」と記載される）を生成する。フィルタに補足されたバイオマスを破壊又は収集してもよい。インキュベーション又はスケールアップの間に、培養物の要求に応じた補助的な微量栄養素又は微量ミネラルブレンドを培養物に加えて、元々の培養バイオマスの完全性を保全し、さらなる成長を支援するようにしてもよい。
【００２３】
さらに、この例示的製造方法によれば、培養液中で経時により（約８〜１２週間あるいはそれ以上）十分なバイオマスがひとたび生成されれば、必要に応じて、培養液をスケールアッププロセス中で以下の例示的なステップにより２つの等しい培養液に分割してもよい。最初に、培養液を穏やかにホモジナイズして、バイオマスを完全に懸濁させる。２番目に、前記均質な培養液のうち約半分を新たな滅菌ガラスその他の適切な培養器に移す。３番目に、室温の滅菌脱イオン水を用いて、これら２つの培養器の各々の中の液量を最初の培養体積に戻すように補充する。４番目に、各培養器に新たに調製された栄養ブレンド約１μＬを添加し、穏やかに渦状にかき混ぜる。５番目に、栄養ブレンドが添加された培養液を室温で約１週間、好ましくは週の半ばで１度渦状にかき混ぜ約１２：１２時間サイクルの疑似日照の下で維持しながら、インキュベートする。６番目に、培養器に約１μＬの新たに調製した栄養ブレンドをさらに添加する。７番目に、栄養ブレンドが添加された培養サンプルを室温で約１週間、好ましくは週の半ばで１度渦状にかき混ぜながら、さらにインキュベートする。最後に、このスケールアッププロセスについては、複数の培養液をより大きな培養器中で一緒にし、同様の一般的培養方法及び栄養−培養液体積比を用いて維持することもできることを述べておく。
【００２４】
植物ろ過物製造方法のこの例示的実施形態を引き続き参照しながら、上述したステップを必要に応じて実施して十分な量の植物ろ過物及びその種々の誘導体を生成する。ＰＲＯＡＬＧＡＺＭＥ（登録商標）の名前で販売されている植物ろ過物のサンプルを、アリゾナ州スコッツデールのＨｅａｌｔｈ Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ， Ｉｎｃ．から入手することも出来る。
【００２５】
組成物の製造方法及び組成物中の量に関する具体例が上記に与えられているが、組成物及び組成物の製造方法に対する種々の変形例を用いることができ、また本発明の範囲内となりうることを述べておく。さらに、植物ろ過物を製造するために、他の培養方法、希釈体積、生育培地若しくは栄養ブレンド、体積若しくは添加頻度、インキュベーション時間、培養器、回収若しくはろ過方法、などを用いることができることが想定され、また本発明の範囲内であり、上記の例示的方法は植物ろ過物の他の製造方法を排除することを意図したものではない。
【００２６】
本明細書中で、植物ろ過物の語は上記の組成物及びその誘導体を指す。植物ろ過物はまた、上記のプロセス又は当業者に認識可能なそのバリエーションにより作られた任意の組成物も指す。出願人は、本出願の出願後に「植物ろ過物」の語をより狭く定義する権利を保持する。
【００２７】
さらに、本発明の種々の例示的実施形態によれば、植物ろ過物は種々の画分に分離される。幾つかの例示的かつ非限定的なプロセスを以下に記載する。
【００２８】
一つの例示的実施形態によれば、植物ろ過物を、蠕動ポンプなどのポンプを用いて、毎分約６ｍＬの流速で２．７ｃｍ×２３ｃｍの寸法（それぞれ総容積でおおよそ１００ｍＬの樹脂）の４つのクロマトグラフィーカラムを連続して通過させる。この流速は最適な結合のために選択されたもので、最も遅い樹脂（Ｃ１８）の流速に基づいてもいる。このプロセスは、約１８０Ｌの植物ろ過物の分画を可能とするために最適化されている。その他のサンプル体積を収容するようにプロセスを最適化することなどの、これらの方法の他のバリエーション及び変形例は、当業者に自明であろう。下の表は成分の分離及び単離のための例示的なフローチャートを示している。
【化１】
【００２９】
ＤＥＡＥ樹脂などの樹脂を約１８Ｌが通過した後、カラムを新しいカラムに交換し、先の約１８Ｌからの結合物質を直ちに溶出し、０．２ミクロンのフィルタでろ過し、溶出物を滅菌容器中に保存する。同様に、この例示的実施形態により、陰イオン交換樹脂及び陽イオン交換樹脂を、約３６Ｌの材料がそれぞれを通過した後に交換する。単一の疎水性樹脂（Ｃ１８）はプロセス全体で用いる。最初の３つのカラムからの溶出画分は全て直ちに滅菌フィルタを通過させ、滅菌容器に保存する。Ｃ１８カラムに結合した材料の溶出には有機溶媒が必要で、これはその後、以下に詳述されるように除去される。前記４つのカラムのいずれにも結合しない材料は、有機成分の大部分が枯渇しており、「フロースルー」画分とラベルされ、後の試験及び使用のために滅菌容器に集められる。
【００３０】
分離プロセスの各ステップの詳細な説明を、本発明の一つの例示的実施形態に従って説明する。最初に、クロマトグラフィーカラム樹脂を以下のプロセスに従って調製する。ＤＥＡＥセルロース（タンパク質の分離のために広く用いられている弱陰イオン交換樹脂）をこの例示的プロセスで用いる。おおよそ２０ｇのＤＥＡＥセルロースをおおよそ３００ｍＬの水（この例示的実施形態では超純水が用いられる）で再水和し、１Ｌフラスコ中室温で一晩あるいはそれと同等の時間で膨潤させる。落ち着いた／充填樹脂から水をデカンテーションし、樹脂をさらに約３００ｍＬの超純水などの水の中に再懸濁する。この再懸濁及びデカンテーションの手順を約２４時間かけてさらに２回繰り返す。本例示的実施形態によれば、前記洗浄された樹脂を約２００ｍｌの０．１ＭＮａＯＨ／０．５ＭＮａＣｌ中に再懸濁し、次いで６００ｍｌのブフナー漏斗に移す。このフラスコをさらに約５０ｍｌの０．１ＭＮａＯＨ／０．５ＭＮａＣｌでリンスし、リンス中に懸濁された材料を前記漏斗に移す。溶液を重力により流す前に、前記樹脂をこの溶液中で約１０分落ち着かせる。次にこの樹脂を約７５０ｍｌの０．１ＭＮａＯＨ／０．５ＭＮａＣｌでさらにリンスする。このろ過手順を０．５ＭＮａＣｌを用いて繰り返し、０．１ＭＨＣｌ／０．５ＭＮａＣｌを用いてさらに繰り返す。この樹脂を、最初に約２Ｌの超純水などの水でリンスし、続いて流出液のｐＨが５より大きくなるまで約５Ｌの超純水でさらにリンスする。次に、このＤＥＡＥセルローススラリーを５つのカラム（本実施形態によれば、２．７×２３ｃｍの寸法の５つのカラム）に移し、落ち着かせる。充填されたカラムは総容積約１００ｍｌを有し、本例示的実施形態において使用されるまで４℃で保存する。
【００３１】
さらに、この例示的実施形態によれば、約１００ｇの乾燥樹脂、例えば塩化物形態で受領される、１００〜２００ドライメッシュ、１０６〜１８０μｍウエットビーズ径、４級アンモニウム官能性のカタログ番号１４０−１４４１のＢｉｏＲａｄ ＡＧ１−Ｘ８強塩基陰イオン交換樹脂、が用いられる。不要な酸化夾雑物を全て除去するため、樹脂を最初に脱イオン水で水和して消耗（ｅｘｈａｕｓｔ）させ、次に各カラムの底部にガラスフィルタを装着したガラスカラムにビーズをロードした。約３時間かけて約５００ｍＬの１．０Ｍ塩化ナトリウム溶液を前記樹脂に通すことで、前記樹脂は膨潤し、不要な酸化産物を放出する。このプロセスによって、前記樹脂は塩化物（Ｃｌ−）形に変換もされる。この塩処理の後、前記樹脂を約２リットルの脱イオン水でリンスして、余分な塩化ナトリウムを除去する。
【００３２】
今や完全に塩化物（Ｃｌ−）形となった陰イオン交換樹脂を、約５００ｍＬの２．０Ｍ水酸化ナトリウム溶液をカラムに約２時間かけて通すことで、水酸化物（−ＯＨ）形に変換する。流出液は若干色合いが悪く、アンモニア様の臭気を有していることがあるため、次に、この樹脂を重力サイホン滴下を用いて約７．０Ｌの脱イオン水で一晩リンスする。本例示的実施形態においては、このステップの後は、樹脂の流出液は透明、無色、かつ無臭である。前記カラムから溶出する溶液は、インジケーターストリップで測ったところ中性のｐＨである。この陰イオン交換樹脂は、この時点では、再生され使用準備が整っていると考えられる。
【００３３】
さらに、この例示的実施形態によれば、約１００ｇの乾燥樹脂、例えばミシガン州ミッドランドのＤｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｍｐａｎｙから入手可能な４００〜７００μｍのビーズ径及びスルホネート官能性を有するＤＯＷＥＸ ＭＯＮＯＳＰＨＥＲ（登録商標）８８強酸陽イオン交換樹脂、を用いる。陰イオン交換樹脂については、不要な酸化夾雑物は最初に脱イオン水で水和させ、次に各カラムの底にガラスフィルターを装着したガラスカラムにビーズをロードすることで除かれる。
この塩化ナトリウムによる消耗（ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ）により、前記樹脂は完全にナトリウム（Ｎａ＋）形に変換される。この塩処理の後、前記樹脂を約２．０リットルの脱イオン水でリンスすることで余分な塩化ナトリウムを除去する。
【００３４】
今や完全にナトリウム（Ｎａ＋）形である陽イオン交換樹脂を、約５００ｍＬの２．０Ｍ塩酸溶液をカラムに約２時間かけて通すことによって、酸（Ｈ＋）形に変換する。次に、インジケーターストリップで測定したカラムから溶出する溶液のｐＨが中性になるまで、この樹脂を約３．０Ｌの脱イオン水でリンスする。この陽イオン交換樹脂は、この時点では、再生され使用準備が整っていると考えられる。
【００３５】
さらに、この例示的実施形態によれば、シリカゲル９０Ｃ１８−逆相（Ｃ−１８）において、約２５ｇの樹脂を超純水に再懸濁し、カラムに詰め、使用前に約５倍体積の水で洗浄する。
【００３６】
この例示的実施形態の説明を続けながら、以下の段落は分画プロセスの詳細なタイムテーブルを与える。前記植物ろ過物は、流速約６．９ｍｌ／分で、一つのカラムからの流出液が次のカラムを流れるように連続して配置されたカラム群を通り抜けるようにポンプで送り込まれる。さらに、フロースルーを収集するために収集容器が清浄化及び乾燥される。貯められたフロースルーを０．２μｍフィルタシステムに通し、約４〜２５℃で保存する。
【００３７】
最初の約１８Ｌが通過した後、ＤＥＡＥセルロースカラムは除去され、ｐＨ８．３の１ＭのＮａＣｌ２５０ｍｌで溶出される。溶出液を０．２μフィルタでろ過し、ラベルして４℃で保存する。次に、新たなＤＥＡＥ−セルロースカラムを分画システムに設置し、プロセスを再開する。次の１８Ｌが通過した後に、前記ＤＥＡＥ−セルロースカラム、陰イオン交換カラム、及び陽イオン交換カラムを除去し、各々をｐＨ８．３の１ＭのＮａＣｌ約２５０ｍｌで溶出する。溶出液をそれぞれ個別の０．２μｍフィルタシステムに通し、ラベルして約４℃で保存する。
【００３８】
この例示的実施形態によれば、新たなＤＥＡＥ−セルロースカラム、陰イオン交換カラム及び陽イオン交換カラムが分画システムに設置され、プロセスが再開された。次の１８Ｌの後、前記ＤＥＡＥ−セルロースカラムを除去し、ｐＨ８．３のＮａＣｌ２５０ｍｌで溶出する。溶出液を０．２μｍフィルタシステムに通し、ラベルして４℃で保存する。（全物質から）Ｃ１８カラムに結合した物質の溶出：Ｃ−１８カラムは過剰量の水で廃液し、加圧窒素でパージして残留水を除去する。
【００３９】
次に、カラムに約５０ｍＬのアセトンを流し（ｆｌｕｓｈし）て、最後の微量の水及び有機物を除去し、約５０ｍＬの酢酸エチルを流し、最後に約５０ｍＬのヘキサンを流す。この溶液を過剰量の無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、ガラスウール又は類似の材料でろ過する。
【００４０】
次に、溶媒を窒素流で除去し、約５ｍＬのエチルアセテートで再構成して質量が既知のガラスバイアルに移す。溶媒を窒素で除去し、最終質量を測る。
【００４１】
さらに、ＤＥＡＥ−セルロースカラム、陰イオン交換カラム、及び陽イオン交換カラムをそれぞれｐＨ８．３の１ＭのＮａＣｌ約２５０ｍｌで溶出する。溶出物を個別の０．２μｍフィルタシステムに通し、ラベルして約４℃で保存する。陽イオン交換カラムからの溶出液１ｍＬ（図１〜８及び本発明の説明において画分３又は「Ｆ３」とラベルされている）は、植物ろ過物を最初の３つのカラムに前記の方法で通した後に陽イオン交換カラムから捕捉された溶出液で、分離プロセスに導入された未分離の植物ろ過物と比べると約１６０倍の濃縮物である（つまり、プロセスに導入した植物ろ過物１６０ｍＬにつき、１ｍＬの溶出液がＰＦ３で分離される）。
【００４２】
図１〜８中及び本発明の説明中Ｆ４とラベルされた画分４は、前記方法を用いて植物ろ過物に４つのカラム全てを通過させた後に分画シリーズの最後で捕捉されたフロースルーである。
【００４３】
その結果が図１〜８に提示されている実験において、与えられた希釈物は完全な未分離の植物ろ過物組成物又は指定された特定の画分のものである。例えば、Ｆ４で分離されたフロースルーの総体積は未分画の植物ろ過物のそれと同じであり、Ｆ４の全成分の相対濃度は未分離の植物ろ過物のそれと同じであったが、強陽イオン交換樹脂から溶出したＦ３画分の１：２０希釈物の成分の相対濃度は、未分離の植物ろ過物に対し約８倍濃縮されている（植物ろ過物１６０ｍＬにつきＦ３の１ｍＬが得られるため、１：２０希釈物ではその中の成分は未分離の植物ろ過物に対し約８倍濃縮されているのに相当する）。
【００４４】
この例示的実施形態によれば、植物ろ過物及びフロースルー／Ｆ４はカラムから出た直後のその元々の濃度の状態で、本明細書に記載されるように１：２０及び１：１００のみの希釈で試験された。末梢血単核細胞（「ＰＢＭＣ」）の培養物を、民間の販売元による正常な健康ヒト被験者から得た２バイアルの凍結末梢血単核細胞から調製し、２×１０ｍｌの培地に添加し、遠心した。末梢血単核細胞はＲＰＭＩ１６４０／５％ＦＢＳ中に再懸濁し、２４時間培養した（培地１１ｍｌ中に１バイアル分の凍結細胞）。
【００４５】
この例示的実施形態のための処理剤は３つの剤：未分離植物ろ過物（「ＰＡＺ」）、画分３（「Ｆ３」）、画分４（「Ｆ４」）を含んでいる。各々に対する処理濃度は１：２０及び１：１００であった。各剤についての、希釈による例示的なサンプル調製方法は次のとおりである。第１に、０．７ｍｌの剤（ＰＡＺ、Ｆ３又はＦ４）と６．３ｍｌのＲＰＭＩ１６４０／５％ＦＢＳとを一緒にして１：１０希釈物を調製し、総量７ｍｌの１：１０溶液を得る。第２に、（各剤の）１：１０希釈物１．２ｍｌとＲＰＭＩ１６４０／５％ＦＢＳ４．８ｍｌを一緒にすることによって１：５０希釈物を調製し、総量６ｍｌの１：５０溶液となる。さらに、希釈された画分３（Ｆ３）については、１ＭのＮａＯＨを用いてｐＨを７．０へと調製する。
【００４６】
この例示的実施形態によれば、播種、処理、及び検出は以下のステップによって達成される。２皿分の末梢血単核細胞を合わせ、少量の末梢血単核細胞を０．４％のトリパンブルーで染色し、末梢血単核細胞の細胞数を知られている技術を用いて計数する。
【００４７】
この実施形態においては、炎症性サイトカイン分泌の酵素結合免疫吸着測定（「ＥＬＩＳＡ」）分析、ヒトサイトカインの産生を並行して定量化するための商用キットに提供されたプロトコールを用いた。最初に、末梢血単核細胞を２４ウェルプレートに播種（培地３２０μｌ中、３３７，６００細胞／各ウェル）し、３７℃で４８時間インキュベートした。本例示的実施形態においては、さらに３２０μｌの培地を添加し、細胞を４８時間培養した。コントロール（対照）培養については、前記３２０μｌの追加的培地は追加成分を何ら含んでいなかった。幾つかのサイトカインの生産を刺激するために、末梢血単核細胞の並行培養物を５０ｎｇ／ｍｌのホルボールミリステートアセテート（「ＰＭＡ」）及び１μｇ／ｍｌのイオノマイシンで２４時間処理し、０．６４μｌＰＭＡ／０．６４μｌイオノマイシンを添加し、さらに２４時間インキュベーションした。末梢血単核細胞が植物ろ過物またはそこから得た画分で処理される培養物については、植物ろ過物またはそこから得られた画分３若しくは４の１：１０又は１：５０希釈物を含むさらなる培地３２０μｌ（これにより培養物中の最終希釈度は１：２０又は１：１００となる）を２４時間のインキュベーションの直前に添加し、ＰＭＡ＋イオノマイシン処理有り又は無しでさらに２４時間培養した。２連の末梢血単核細胞培養物を、これらの条件の各々について調べた。インキュベーション期間の最後に、培養物を遠心し、上清培地を回収してアリコートを−７０℃で保存した。次いで、培地サンプルの各々中に存在するサイトカイン量を、ヒト炎症性サイトカイン用多アナライトＥＬＩＳＡｒｒａｙキット（商品番号ＭＥＨ−００４Ａ）及びＳＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから提供された方法を用いて決定した。
【００４８】
植物ろ過物又はそこから分離された画分が、培養末梢血単核細胞の核タンパク質画分中のＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性に及ぼす影響の分析は、この例示的実施形態においては以下の様にして決定した。約１８．２６ｍＬの懸濁末梢血単核細胞を約１８ｍＬの培地に添加し、この細胞懸濁液（２ｍＬ中に２，７１８，０００細胞）の２ｍｌをそれぞれ６０ｍｍ培養皿に播種した。本例示的実施形態においては、さらに２ｍＬの培地を添加した。コントロール培養については、この２ｍＬの追加的培地は追加成分を何ら含んでいなかった。ＴＮＦ−αで刺激された細胞の培養を、２ｍＬの追加的培地を培養開始時に添加することも含め同じやり方で行ったが、ただし回収の１時間前に２μｌのＴＮＦ−α（５０ｎｇ／ｍｌ）をこれらの培養物に添加した。末梢血単核細胞が植物ろ過物又はそこから得られた分画によって処理される培養物については、植物ろ過物又はそこから得られた画分３若しくは４の１：１０又は１：５０希釈物を含む２ｍＬの追加培地（これにより培養液中の最終希釈度は１：２０又は１：１００となる）をインキュベーションの直前に添加した。ＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性の阻害についての２つのポジティブコントロールを行った。一つのケースでは、末梢血単核細胞を２５μＭのＧ２５３５の存在下で２４時間培養し、続いてＴＮＦ−α処理を１時間行った。２つ目のケースでは、末梢血単核細胞を２５μＭのゲニステインの存在下で２４時間培養し、続いてＴＮＦ−α処理を１時間行った。これらの条件それぞれについて２連の末梢血単核細胞培養物を試験し、次いで回収の前に３７℃で２４時間培養した。
【００４９】
インキュベーション期間の最後に、ＰｕｂＭｅｄ−Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ６５：６９３４（２００５年）に記載された方法に従って核タンパク質を細胞から抽出し、同族（ｃｏｇｎａｔｅ）ＮＦ−κＢのＤＮＡ結合エレメントに対応する合成放射標識ＤＮＡ配列へのＮＦ−κＢの結合について電気泳動移動度シフト解析（「ＥＭＳＡ」）をＰｕｂＭｅｄ−Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ６５：６９３４（２００５年）に記載されたものなどの確立されたプロトコールを用いて行った。
【００５０】
今度は図１〜８を参照して、本発明のある例示的実施形態に従って、「ＰＡＺ」の句で表される植物ろ過物及びその画分を用いて種々のサイトカイン及びＮＦ−κＢに影響を与える方法について論じる。種々のサイトカインの産生及びＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性に影響を与える組成物の具体例がここでは論じられるものの、本発明はそれらの例や、本明細書中で論じられる組成物の組成及び量、希釈、又は画分のみには制限はされない。ただし、出願人は特定の量、希釈、又は画分を後日クレームする権利を保持する。
【００５１】
図１Ａ〜１Ｄを具体的に参照しながら、ＮＦ−κＢが結合するＤＮＡ配列に対応し赤外線色素で標識されたデオキシオリゴヌクレオチドを用いて行われた、ＮＦ−κＢについての種々の電気泳動移動度シフト解析あるいは（「ＥＭＳＡ］）の生データが示される。具体的には、図１Ａ及び１Ｂは、赤外線スキャナー（Ｌｉ−Ｃｏｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を短時間用いて（図１Ａ）バンドを可視化した「低濃度」及び同じゲルから得られた画像を増強した（図１Ｂ）「高濃度」の両方の結果を示す。図１Ｃ及び１Ｄは、図１Ａ及び１Ｂに示された分析の基となった試験を、同じ量の核タンパク質を用いてより長時間（２時間に対し３時間）に渡って再度行ったときの結果を示す。
【００５２】
今度は図２を参照し、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）による刺激有り又は無しの場合の末梢血単核細胞中のＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性に対する、植物ろ過物及び完全な植物ろ過物組成物をクロマトグラフィーで処理して得られた種々の画分を投与したことによる影響が、本発明のある例示的実施形態に従って示されている。活性なＮＦ−κＢは同族（ｃｏｇｎａｔｅ）ＤＮＡ配列に結合し、炎症において重要な役割を果たす特定のタンパク質の転写を調節する二量体タンパク質である。このため、発現しＤＮＡに結合するＮＦ−κＢの量が多くなれば、産生される炎症性タンパク質の量も多くなり、炎症反応も大きくなる。ＮＦ−κＢ標的遺伝子のＤＮＡ配列に結合するＮＦ−κＢの総量を減少させると、炎症が減少すると共に、ＨＩＶウイルスなど種々のウイルスの活性化の減少などのＮＦ−κＢの他の効果も減少する。
【００５３】
図２に示されるように、コントロールの未刺激の未処理末梢血単核細胞を試験して、放射標識ＤＮＡプローブに結合するＮＦ−κＢの天然量を決定した。これは、１．０の相対ユニットで表されるＮＦ−κＢ活性のベースラインの測定を示すものである。この例によれば、腫瘍壊死因子アルファあるいはＴＮＦ−αが添加された場合、ＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性はほぼ２．０の相対レベルへと顕著に増加した。しかし、植物ろ過物（「ＰＡＺ」とラベル）の１：２０希釈物を含む組成物を末梢血単核細胞に添加すると、ＮＦ−κＢの濃度はコントロールに比較して大きく減少し、相対レベルは約０．４ユニットとなった。図２に示されるように、また、本発明の種々の例示的実施形態によれば、ＴＮＦ−αと組み合わせられた１：２０又は１：１００希釈の植物ろ過物、１：１００希釈の植物ろ過物単独、１：２０及び１：１００希釈の画分３及び４（「Ｆ３」及び「Ｆ４」とラベル）単独、及びＴＮＦ−αの存在下での１：１００希釈の画分３、はＮＦ−κＢの総濃度をコントロールに比較して減少させ、１：１００希釈の画分４にＴＮＦ−αを足したものはＮＦ−κＢ濃度を増加させた。図２には、ＴＮＦ−α、Ｇ２５３５＋ＴＮＦ−α、Ｇ２５３５単独、及びゲニステイン単独、を添加した結果も示されている。図２に示されるように、植物ろ過物単独、画分３及び画分４はＮＦ−κＢを阻害し、植物ろ過物及び画分３はどちらもＴＮＦ−αが誘導するＮＦ−κＢの活性化を阻害した。
【００５４】
よって、植物ろ過物を投与することで、ＮＦ−κＢのＤＮＡ結合能を減少し得、これは炎症を減少させる。さらに、ＮＦ−κＢの活性化はＨＩＶウイルスなど特定のウイルスの複製及び／又は機能を促進するため、ＮＦ−κＢの総ＤＮＡ結合活性を減少させることでＨＩＶなど特定のウイルスの病理学的効力を減少あるいは予防しうる。本発明は、ＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性減少の、現在知られあるいは将来発見されるいかなる効果も、植物ろ過物並びにその希釈物、画分及び誘導体を有効量投与することで達成できることを想定する。
【００５５】
今度は図３〜５を参照し、本発明の種々の例示的実施形態に従って、末梢血単核細胞による種々のインターロイキンの産生に対する植物ろ過物の影響を論じる。ＩＬ−１０やＩＬ−１７Ａなどある特定のインターロイキンが論じられるが、植物ろ過物は他のインターロイキンや他の炎症経路においても効果を有する。
【００５６】
特に図３を参照して、本発明の一つの例示的実施形態に従い、植物ろ過物及びその種々の希釈物及び画分を他の刺激物質の存在無しに末梢血単核細胞に添加した後に、あるいはＰＭＡで処理された末梢血単核細胞に添加したときの、産生されるＩＬ−２の量（１００，０００細胞当たりのＩＬ−２のｐｇ数で表される）を測定した。示されるように、未処理の培養末梢血単核細胞からなるコントロールは検出可能な量のＩＬ−２を培地中に分泌しなかったが、一方、ＰＭＡを培養末梢血単核細胞に添加したところ約１２５ｐｇ／１００，０００細胞のＩＬ−２分泌があった。培養末梢血単核細胞を植物ろ過物の１：２０又は１：１００希釈物で処理しても検出可能な量のＩＬ−２の産生の誘導は起こらなかった（つまり、コントロールの未処理末梢血単核細胞の場合とおおよそ同じ結果）。植物ろ過物の１：２０希釈物、１：１００希釈の画分３、及び１：２０希釈の画分４をＰＭＡで刺激された末梢血単核細胞に添加したところ、ＰＭＡ単独で処理した末梢血単核細胞よりもＩＬ−２の産生は減少した。植物ろ過物のクロマトグラフィー分画で得られた画分３及び画分４の１：２０及び１：１００希釈物で培養末梢血単核細胞を処理したところ、コントロールと同様に、検出可能な量のＩＬ−２の産生は誘導されなかった。しかし、この例示的実施形態によれば、１：１００希釈の植物ろ過物及び１：２０希釈の植物ろ過物の画分３及び１：１００の植物ろ過物の画分４を、ＰＭＡの存在下の末梢血単核細胞で試験したところ、ＰＭＡ単独を添加した場合に比べると、ＩＬ−２の総量は大きく変化はしなかった。
【００５７】
よって、この例示的実施形態に示されたように、植物ろ過物及びその希釈物、画分又は誘導体を添加することによってＩＬ−２産生を刺激する薬剤に応答して末梢血単核細胞から産生されるＩＬ−２濃度は減少し得、ただしこれらはそれ自体ではＩＬ−２の産生を刺激せず、またこのサイトカインの産生を誘導することが知られている薬剤（例えばＰＭＡ）によるＩＬ−２産生を増強することもない。植物ろ過物が末梢血単核細胞によるＩＬ−２の産生を減少する（又は増加させない）働きは、炎症量を減少させるその能力と共に、現在知られ又は将来発見されるＩＬ−２の他の効果も反映したものである。本発明の種々の実施形態によると、ＩＬ−２などの炎症性サイトカインを上方制御せず、同時にＩＬ−１０などの抗炎症性サイトカインを上方制御するその能力は、炎症量を減少させる上で有効であり、望ましくない副作用を減少する点で従来から利用されている治療法よりも優れている。
【００５８】
今度は図４を参照し、本発明の別の例示的実施形態に従って、植物ろ過物、その種々の画分及び希釈物、及びＰＭＡを培養末梢血単核細胞に添加したときのＩＬ−１０の総産生及び総分泌（１００，０００細胞当たりのＩＬ−１０のｐｇ数で表される）が図４に表される。図４に示されるように、植物ろ過物の１：２０希釈物単独、及びＰＭＡと組み合わせて試験された１：２０希釈物は、検出可能な量のＩＬ−１０を培地に分泌しなかったコントロール末梢血単核細胞と比較してＩＬ−１０の総分泌を増加させた。示されたこの一つの例示的実施形態において、植物ろ過物の種々の他の希釈物及び画分は、単独でもＰＭＡと組み合わせられても、ＩＬ−１０の総濃度に影響を与えないようであった。しかしながら、本明細書に記載される他の例示的実施形態の場合のように、画分３及び４は植物ろ過物の組成の内の低パーセンテージを含むに過ぎず、この結果は、ＩＬ−１０濃度を増加させなかった濃度及び画分の植物ろ過物がＩＬ−１０濃度を上昇させることは必然的に絶対あり得ないという点にまで本発明を限定するものではない。
【００５９】
このため、植物ろ過物はＩＬ−１０の総濃度を上昇しうる。ＩＬ−１０は抗炎症性サイトカインであるため、ＩＬ−１０の総濃度が上昇すると炎症量が減少するはずである。さらに、ＩＬ−１０に起因することが現在知られており又は将来発見される他の効果も、植物ろ過物の添加によって達成されることを、本発明は想定している。
【００６０】
本発明の種々の例示的実施形態によれば、植物ろ過物が炎症を減少させる効果は、ＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性を減少させるその効果単独、又はその効果とＩＬ−１０などの抗炎症性サイトカインの産生及び分泌を増加させること並びに後述するようにＩＬ−２などの炎症性サイトカインや腫瘍壊死因子−アルファ（「ＴＮＦ−α」）を減少させることとが組み合わさって、生じる。よって、本発明は、植物ろ過物が複数の異なる際と下院に同時に影響を及ぼして、種々の例示的実施形態による炎症減少などの総体的効果を達成することを想定している。
【００６１】
今度は図５を参照し、本発明の一つの例示的実施形態に従って、培養末梢血単核細胞の混合物に植物ろ過物を添加してＩＬ−１７Ａの総生産及び分泌に影響を与える（１００，０００細胞当たりのＩＬ−１７のｐｇ数で表す）ことを開示する。ＩＬ−１７Ａと並び、インターロイキン１７（インターロイキン１７Ａと同義）も植物ろ過物の添加により同様に影響を受ける。示されるように、未刺激の培養コントロール末梢血単核細胞は検出可能なレベルのＩＬ−１７Ａを分泌しないが、ＰＭＡを培養末梢血単核細胞に添加するとＩＬ−１７Ａは約３ｐｇ／１００，０００細胞へと顕著に増加した。１：２０希釈又は１：１００希釈の植物ろ過物を添加したところコントロール末梢血単核細胞からはＩＬ−１７Ａの検出可能な分泌が起こらなかった。１：２０希釈若しくは１：１００希釈の植物ろ過物又は１：１００希釈の画分４をＰＭＡ存在下で添加しても、ＰＭＡ単独に反応して分泌されるＩＬ−１７Ａのレベルに変化は見られなかった。植物ろ過物の画分３及び画分４は、１：２０希釈及び１：１００希釈どちらの場合でも、コントロール末梢血単核細胞からのＩＬ−１７Ａの検出可能な分泌を引き起こさなかった。植物ろ過物の画分３の１：２０希釈物を添加したところ、ＰＭＡ処理に応答して末梢血単核細胞によるＩＬ−１７Ａの分泌は約１ｐｇ／１００，０００細胞へと顕著に減少した。示されるように、植物ろ過物の画分３の１：１００希釈物及び植物ろ過物の画分４の１：２０希釈物によっても、ＰＭＡ処理に応答した末梢血単核細胞によるＩＬ−１７Ａ産生は減少した。
【００６２】
図６〜８を参照して、他のサイトカインに対する植物ろ過物の影響を開示する。具体的には、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）、及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）に対する、種々の希釈及び画分の植物ろ過物の影響を開示する。
【００６３】
図６に示されるように、また本発明の一例示的実施形態に従って、ＩＦＮ−γの濃度（１００，０００細胞当たりのＩＦＮ−γのｐｇ数で表す）に対する植物ろ過物の影響を開示する。この例示的実施形態によれば、未刺激の培養コントロール末梢血単核細胞は検出可能なレベルのＩＦＮ−γを分泌しなかったのに対し、培養末梢血単核細胞にＰＭＡを添加すると約７０ｐｇ／１００，０００細胞へと顕著なレベルのＩＦＮ−γの分泌が起こった。本例示的実施形態においては、１：２０希釈若しくは１：１００希釈の植物ろ過物、又はこれらの希釈度の画分３若しくは４を培養末梢血単核細胞に添加しても検出可能なレベルのＩＦＮ−γの分泌は起こらなかったが、１：２０希釈の植物ろ過物をＰＭＡと組み合わせて末梢血単核細胞に添加するとＰＭＡ単独により誘導されるＩＦＮ−γの総分泌が減少した。植物ろ過物の画分３の１：２０希釈を添加するとＰＭＡに誘導されるＩＦＮ−γの分泌は約１０ｐｇへと顕著に減少した。植物ろ過物の画分３の１：１００希釈は、植物ろ過物の画分４の１：２０希釈物の場合と同様に、ＰＭＡに誘導されるＩＦＮ−γ分泌を約６０ｐｇへと減少させた。
【００６４】
よって、植物ろ過物はＩＦＮ−γの産生を誘導せず、他の薬剤により引き起こされるＩＦＮ−γの総生産を調整してそれから得られうる利益を可能にしうる。
【００６５】
今度は図７を参照し、本発明の例示的実施形態に従って、ＴＮＦ−αの産生及び分泌（１００，０００細胞当たりの分泌ｐｇ数により表される）に対する植物ろ過物の影響を測定した。この例示的実施形態によれば、未刺激の培養コントロール末梢血単核細胞は検出可能なレベルのＴＮＦ−αを分泌せず、一方、ＰＭＡを培養末梢血単核細胞に添加すると約５０ｐｇ／１００，０００細胞へとＴＮＦ−αの顕著な分泌が起こった。１：１００希釈の植物ろ過物又は１：２０若しくは１：１００希釈の画分３又は１：２０若しくは１：１００希釈の植物ろ過物画分４は検出可能なレベルのＴＮＦ−αの分泌を誘導しなかった。植物ろ過物及びそこから得られた画分はＰＭＡにより誘導される培養末梢血単核細胞によるＴＮＦ−αの分泌を顕著には変化させなかった。
【００６６】
今度は図８を参照し、本発明の別の例示的実施形態に従って、種々の濃度及び画分の植物ろ過物を投与することが末梢血単核細胞によるＧＭ−ＣＳＦの産生及び分泌（１００，０００細胞当たりの分泌ｐｇ数で表す）に及ぼす影響を論じる。示されるように、未刺激培養末梢血単核細胞からなるコントロールは測定可能な量のＧＭ−ＣＳＦを産生せず、一方、ＰＭＡの添加により約５０ｐｇ／１００，０００細胞の分泌が誘導された。１：２０希釈の植物ろ過物は非常に低レベルのＧＭ−ＣＳＦの分泌（約５ｐｇ／１００，０００細胞）を誘導し、一方、１：００希釈の植物ろ過物又は種々の希釈度の画分３及び４はＧＭＣＳＦ分泌を誘導しなかった。さらに、どちらも１：２０希釈及び１：１００希釈の植物ろ過物及び画分３、並びに１：２０希釈の画分４は、ＰＭＡ存在下での末梢血単核細胞によるＧＭ−ＣＳＦの産生に影響を与えなかった。
【００６７】
よって、これらの例示的実施形態によれば、植物ろ過物それ自体は、種々の希釈度及び分画において、大した量のＧＭ−ＣＳＦの分泌を引き起こさず、また種々の希釈度及び画分の植物ろ過物は他の薬剤による処理の結果誘導されるＧＭ−ＣＳＦの産生を顕著には変化させない。
【００６８】
よって、本発明の種々の例示的実施形態によれば、植物ろ過物の投与により種々のサイトカイン及びＮＦ−κＢが制御され、炎症の減少などの特定の所望の効果が達成される。先行技術の組成物とは異なり、植物ろ過物は多数のサイトカインを制御して炎症の減少を達成することができる。例えば、上記に示され論じられたように、植物ろ過物の投与はＩＬ−２を上方制御することなしにＩＬ−１０を上方制御することができ、炎症をより大きく減少させることができる。
【００６９】
さらに、植物ろ過物並びにその種々の希釈物及び画分はＮＦ−κＢ、及びＴＮＦ−αに誘導されるＮＦ−κＢ活性化、を阻害することができ、このことは植物ろ過物が抗酸化剤として機能することを示している。また、ある例示的実施形態によれば、種々の希釈度及び画分の植物ろ過物、特に画分３、の投与は、ＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性を顕著に抑制する。有効量の植物ろ過物を投与してもＴＮＦ−αやＩＦＮ−γなどの特定の炎症促進性サイトカインは誘導されず、一方でＩＬ−１０などの種々の抗炎症性サイトカインが誘導され、炎症が減少する。さらに、これら種々の例示的実施形態によれば、植物ろ過物の投与は細胞又は組織に対して毒性あるいは刺激物質としての効果を有さない。
【００７０】
本発明の種々の原理が例示的実施形態により上記に記載されたことが理解されなければならない。しかしながら、具体的に記載されていないものに加えて、本発明を実施するのに用いられる上記の処方、比率、要素、材料、及び成分の多くの組み合わせ及び改変は、それらの原理から逸脱すること無しに変更する、特に具体的な環境及び作動要件に合わせる、ことが出来る。本発明のその他のバリエーション及び変形例は当業者には明らかであろうが、そのようなバリエーションや変形例も本開示によってカバーされることが意図されている。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、サイトカインや転写因子などのタンパク質の産生及び／又は機能を変化させる組成物及び方法に関する。より具体的には、本発明は特定の淡水微生物、藻類、コケ、細菌及び／又は菌類の培養物又は共培養物から得られた組成物、並びに有効量の前記組成物を投与することにより炎症及び／又は癌及びＨＩＶなどの疾患を治療又は予防する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
サイトカインは、免疫系の細胞などの種々の細胞から分泌される、広範な種類のタンパク質である。サイトカインの一つの機能は様々なシグナルを細胞間で運び、それにより細胞の間で活性調節を行うことである。病原体と細胞との接触などのいくつかの因子は、細胞にサイトカインを分泌させることができ、それにより疾患を生じうる。ある場合には、細胞は、病原体又は疾患に対する自然防御を組織化するための手段としてサイトカインを分泌する。
【０００３】
サイトカインには数多くのものがあり、それらのうち多くのものは白血球細胞によって産生されるインターロイキン（「ＩＬ」）と一般的に称されている。また、インターロイキンにも数多くの異なる種類のものがあり、例えばＩＬ−２、ＩＬ−１０、及びＩＬ−１７Ａなどがある。これらの異なるインターロイキンは、炎症を減少又は増加させる、種々の細胞種の増殖及び機能を刺激する並びに抗体の産生を調節するなど、それぞれ特定の機能及び効果を有している。例えば、ＩＬ−２及びＴＮＦ−αは炎症に寄与し、炎症性タンパク質とみなしうるのに対し、ＩＬ−１０は炎症を減少させる抗炎症タンパク質であるとみなしうる。よって、産生されるＩＬ−２及びＴＮＦ−αの量が増加するにつれて、炎症も大きくなる。逆に産生されるＩＬ−１０の量が増加するにつれて、炎症は小さくなる。
【０００４】
インターロイキンは多くのプロセスに関与することが決定されており、これには炎症が含まれるがこれに限定されない。例えば、ＩＬ−２が免疫グロブリンの産生を抑制することを示唆する実質的な証拠が存在する。逆に、ＩＬ−１０が免疫グロブリンの産生を増強することを示唆する実質的な証拠も存在する。
【０００５】
別のサイトカインはインターフェロン−ガンマあるいはＩＦＮ−γである。ＩＦＮ−γはウイルスに対する先天性免疫及び獲得免疫並びに細胞内細菌防御機能の上で、並びに腫瘍制御の上で、非常に重要である。ＩＦＮ−γは３０を超える遺伝子の転写を変化させ、Ｔｈ２細胞活性を増加させる、ＮＫ細胞活性を増進する、及びこれら以外の種々の分子シグナル伝達経路に影響を与える、などの影響を生み出すことが示されている。
【０００６】
他のサイトカインとしては、免疫細胞の制御に関わる腫瘍壊死因子アルファあるいはＴＮＦ−αがある。さらに、ＴＮＦ−αの産生の上昇は、癌などの種々の人疾患に寄与する因子であると示唆されてきた。さらに別のサイトカインとしては顆粒球マクロファージコロニー刺激因子あるいはＧＭ−ＣＳＦがある。ＧＭ−ＣＳＦは幹細胞を刺激することが知られている白血球細胞増殖因子であり、免疫／炎症カスケードの一部である。
【０００７】
「核因子カッパベータ」あるいはＮＦ−κＢとして知られている転写因子は遺伝子転写の制御因子として機能する細胞内タンパク質であり、種々の生物学的プロセス及び病態において重要な役割を果たす。ＮＦ−κＢは感染に応答しての免疫系制御において、並びにシクロオキシゲナーゼ、一酸化窒素シンターゼ及びその他の炎症促進性タンパク質の産生など幾つかの炎症経路において、重要な役割を果たすことが見出されてきた。ＮＦ−κＢの不適当な調節は癌、炎症性疾患及び自己免疫疾患、敗血性ショック、ウイルス感染及び不適当な免疫発達に結びつけられており、幾つかの研究ではＮＦ−κＢはシナプス可塑性及び記憶に関連するプロセスに結びつけられている。ＮＦ−κＢ及び種々のサイトカインの役割は、Ｓａｒｋａｒ， ｅｔ ａｌ．著、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００６年４月１日発行）のＵｓｉｎｇ Ｃｈｅｍｏｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ Ａｇｅｎｔｓ ｔｏ Ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅ Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙというタイトルの論文で論じされており、この論文はその全体が参照により本明細書中に取り込まれる。さらに、ＨＩＶなど種々のウイルスはＮＦ−κＢとの分子結合部位を有しており、これは、ＮＦ−κＢがＨＩＶウイルスを潜在状態から活性状態へと活性化する上で非常に重要な成分でありうることを示している。
【０００８】
よって、サイトカイン及び／又はＮＦ−κＢの調節は種々の疾患の治療を提供する上での非常に重要なプロセスでありうる。例えば、ＩＬ−１０は抗炎症的性質を有しているため、慢性的な炎症状態にある患者においてＩＬ−１０を増加させることは炎症の治療に用いられうる。あるいは、ＮＦ−κＢはＨＩＶウイルスを潜在状態から活性状態に活性化する因子であるため、ＮＦ−κＢの量を減少させることによりＨＩＶウイルスが活性化されることを遅らせたり防止したりできる可能性がある。
【０００９】
現在、サイトカイン及びＮＦ−κＢを調節するための組成物及び方法が知られている。しかし、これら知られた組成物及び方法のうち多くのものは細胞に対して刺激性であったり、細胞に対する毒性を有する。さらに、サイトカイン及びＮＦ−κＢを調節するための多くの知られた組成物及び方法は、多くのサイトカインを同じ様に調節するものであり、それらのうち幾つかのものは治療の所望される総体的効果の妨げとなりうる。例えば、ＩＬ−１０などの抗炎症性サイトカインを上方制御する、炎症治療のための組成物及び方法が知られているが、これらの組成物ではＩＬ−１０の影響を減少させる炎症性サイトカインであるＩＬ−２も上方制御されてしまう。
【００１０】
このため、抗炎症性のサイトカイン及びＮＦ−κＢを制御し、これらに細胞レベルで影響を与える改良された組成物及び方法を提供することが有利となる。さらに、選択されたサイトカイン及びＮＦ−κＢを制御して多くの効果を達成し、種々の健康上の問題を治療することが可能な組成物及び方法を提供することが望ましいものになる。そのような、多数のサイトカインの特異的制御の一例は、炎症を抑制するために、ＩＬ−２を上方制御すること無しに、あるいはＩＬ−２を下方制御さえしつつ、ＩＬ−１０を上方制御して、これにより、炎症を減少させるために炎症促進性のサイトカインのレベルを減少若しくは維持しつつ抗炎症性サイトカインを増加させる組成物である。種々のサイトカイン及びＮＦ−κＢに影響を与える組成物及び方法であって、ただし刺激性でなく、非毒性であり、製造及び流通が容易で、かつ製造が高価ではない、組成物及び方法を提供することも望ましいこととなる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
詳細な説明に記載されるように、また本発明の種々の実施形態に従って、サイトカイン及びＮＦ−κＢに影響を与える組成物及び方法が開示される。一つの実施形態によれば、前記組成物は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−５８６３の特定の淡水微生物、藻類、コケ、細菌及び／又は菌類の培養物又は共培養物から得られる。
【００１２】
本発明の種々の例示的実施形態によれば、サイトカイン及びＮＦ−κＢに影響を与えて免疫応答を制御し、炎症を減少し、抗酸化活性を付与し、抗体産生を調節し、癌性腫瘍の成長を治療若しくは予防し、及びＨＩＶなどの感染を治療若しくは防止する、方法が開示される。この組成物は非毒性であり、ＩＬ−２及び／又はＴＮＦ−αなど他のサイトカインを維持又は減少させつつＩＬ−１０などの特定のサイトカインを選択的に上方制御して、炎症の減少などの所望の効果を達成することが可能である。本発明のさらに別の例示的実施形態においては、ＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性に影響を与える方法、及びＴＮＦ−αに誘導されたＮＦ−κＢ活性化を減少させる方法が開示される。さらに、本発明の種々の例示的実施形態によれば、ＩＬ−１０など特定の抗炎症性サイトカインを誘導する方法、特にＩＬ−２、ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γなど他の炎症促進性サイトカインは誘導しない方法が開示される。
【００１３】
本発明の主題は、明細書末尾において具体的に指摘され明確にクレームされている。しかしながら、本発明の実施形態は、付属の図面と併せて以下の説明を参照することによって最も良く理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１Ａ〜Ｄは、本発明の種々の例示的実施形態による電気泳動ゲル移動度シフトアッセイからの生データを示す。
【図２】図１Ａ〜図１Ｄに提示された実験で得られた結果の定量的分析を表した棒グラフを示し、それにより本発明の種々の例示的実施形態によるＮＦ−κＢに影響を与える方法の効能を示す。
【図３】本発明の種々の例示的実施形態による、サイトカインＩＬ−２の産生に対する方法の効能を表した棒グラフを示す。
【図４】本発明の種々の例示的実施形態による、サイトカインＩＬ−１０の産生に対する本方法の効能を表した棒グラフを示す。
【図５】本発明の種々の例示的実施形態による、サイトカインＩＬ−１７Ａの産生に対する本方法の効能を表した棒グラフを示す。
【図６】本発明の種々の例示的実施形態による、サイトカインＩＮＦ−γの産生に対する本方法の効能を表した棒グラフを示す。
【図７】本発明の種々の例示的実施形態による、サイトカインＴＮＦ−αの産生に対する本方法の効能を表した棒グラフを示す。
【図８】本発明の種々の例示的実施形態による、ＧＭ−ＣＳＦの産生に対する本方法の効能を表した棒グラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下の説明は、本発明の例示的実施形態の説明であり、本発明の範囲や利用可能性を限定することは何ら意図されていない。寧ろ、以下の説明は本発明の種々の実施形態を実施するための便利な例示を提供することを意図しているものである。本発明の範囲から逸脱しなければ、他の構成、組成、量、方法などを用いても構わない。以下で明らかになるように、本発明の精神及び範囲から逸脱しなければ、これらの実施形態に記載された方法に対して他の変更を種々加えても構わない。
【００１６】
本発明の種々の例示的実施形態によれば、本発明は種々のサイトカイン及びＮＦ−κＢに影響を与える組成物を投与することを含む。前記組成物は
、米国特許７，８０７，６２２（タイトル：”Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｐｈｙｔｏ−Ｐｅｒｃｏｌａｔｅ Ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ）、米国特許出願番号１２／８９７，５７４（タイトル：”Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｐｈｙｔｏ−Ｐｅｒｃｏｌａｔｅ Ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ”）、米国特許出願 １１／５８７，２６６（タイトル：”Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ Ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ”）、米国特許出願番号６１／３０６，５９１（タイトル：”Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｌｏｗｅｒｉｎｇ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ Ｗｉｔｈ ＰＡＺ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ”）及び米国特許出願番号６１／３１１，８３８（タイトル：”Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｉｎｇ Ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｗｉｔｈ ＰＡＺ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ”）などの、本願と同一人によって所有されている数多くの共係属中の特許出願に記載されている。上記の文献は全て、その全体が参照により本明細書中に取り込まれる。これらの米国出願からの優先権を主張する米国外での特許出願及びＰＣＴ特許出願の全ても、その全体が参照により本明細書中に取り込まれる。
【００１７】
本明細書中で「植物ろ過物」（ｐｈｙｔｏ−ｐｅｒｃｏｌａｔｅ）と称される組成物は、藻類、コケ、細菌及び菌類など特定の微生物の培養物又は共培養物から産生される分子から概して構成されている非毒性の組成物である。一つの例示的実施形態においては、植物ろ過物を作製するために用いられる培養物の寄託は、寄託番号ＰＴＡ−５８６３としてバージニア州マナサスのアメリカンタイプカルチャーコレクションに預けられている。この寄託物は、それを開示した特許が付与された際には公衆に利用可能となる。この寄託は３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８０８章及びＭＰＥＰ２４１０．０１章に従ってなされたものであり、よって、特許が付与された際は寄託された生物材料の公衆による入手可能性について預託者が課した制限は全て取消不能に除去されるという一つの例外事項を除き、この寄託物へのアクセスは、本出願が継続している間、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．１４章及び３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．１２２章の下でそのアクセスを認められた者として長官により決定された者に対し、その寄託物への参照をなすことによって認められる。
【００１８】
一つの例示的実施形態において、本明細書中に「植物ろ過物」として記載された組成物は以下に記載のプロセスにより作製される。この実施形態によれば、まず、ＡＴＣＣ培養物寄託番号ＰＴＡ−５８６３として現在寄託されている種類の培養物の、おおよそ１又はそれ以上のアリコート（ａｌｉｑｕｏｔ）を得る。１より多いアリコートを用いる種々の実施形態においては、それらのアリコートを１つのより大きな複合培養器中で一緒にし、以下に述べる方法を用いて維持してもよい。
【００１９】
この例示的実施形態によれば、凍結保存から成功裏に入手及び培養された培養物の各アリコートについて、その全量を滅菌脱イオン水を用いて全量が約１０ｍＬになるように希釈する（例えば、３アリコート（約４．５ｍｌ）を一緒にし、全量が３０ｍＬになるよう希釈する）。さらに、約１ｍＬの滅菌脱イオン温水中に約２０ｍｇの乾燥活性パン酵母を混合して得られた栄養ブレンド原液を調製し、室温で約２０分インキュベートし、約１０００の培養アリコートに十分な栄養を産生する。そして、調製した栄養ブレンドのうち約１μＬを各希釈アリコートに添加し（例えば、混合され希釈された３アリコートに対しては、調製した栄養ブレンド３μＬを添加し）、次に混合物を緩やかに渦状にかき混ぜる。
【００２０】
この例示的実施形態に係る植物ろ過物の製造の次のステップは、前記培養サンプルを栄養ブレンドと共に丸底ガラス培養器などの滅菌培養器中で、雰囲気を滅菌フィルター換気しながら、約１週間室温でインキュベートするステップを含む。この例示的実施形態においては、この混合物を週の半ばで一度渦状にかき混ぜ、約１２：１２時間サイクルの疑似日照の下で維持する。この週の後、おおよそ用いられた各希釈アリコートに対して約１μＬの新たに調製した栄養ブレンドを、前記培養器に添加し、この新たな混合物を好ましくは穏やかに渦状にかき混ぜる。この栄養ブレンドが加えられた培養サンプルを室温で約１週間さらにインキュベートし、好ましくは週の半ばで一度渦状にかき混ぜ、約１２：１２時間サイクルの疑似日照の下で維持する。
【００２１】
この例示的な植物ろ過物製造方法を続けながら、滅菌管とサイフォン又は蠕動ポンプとを用いて、培養器の底で生育している藻類バイオマスを撹乱すること無しに培養器のおおよそ上半分から液量をゆっくりと回収あるいは収集し、使用した各寄託アリコート当たり約５ｍＬを生成する。この液体を滅菌ガラス保存容器その他の適切な保存容器に保存して、滅菌フィルタ処理して所望の際に投与するようにしてもよい。前記培養器中の液量は滅菌脱イオン室温水を用いておおよそ回収前の体積まで補充すべきであり、それにより最終総体積は使用した各寄託アリコート当たり約１０ｍＬとなる。次に、新たに調製した栄養ブレンドを、使用された各アリコート当たりおおよそ１μＬ、前記培養器に添加し、そして混合物を穏やかに渦状にかき混ぜ、所望に応じて更なるサイクル、前記のやり方でインキュベートする。
【００２２】
この例示的実施形態を引き続き参照しながら、前記培養サンプル及び栄養ブレンドを、約１２：１２時間サイクルの疑似日照を維持しながら、室温で約１週間あるいはそれ以上インキュベートする。この培養液を栄養ブレンドとインキュベートしながら、先に回収した材料を約０．２μｍの孔径の滅菌膜フィルタ（又は当業者が認識する同様のフィルタ）でろ過し、最終的な生活性液体（本明細書中で「組成物」又は「植物ろ過物」と記載される）を生成する。フィルタに補足されたバイオマスを破壊又は収集してもよい。インキュベーション又はスケールアップの間に、培養物の要求に応じた補助的な微量栄養素又は微量ミネラルブレンドを培養物に加えて、元々の培養バイオマスの完全性を保全し、さらなる成長を支援するようにしてもよい。
【００２３】
さらに、この例示的製造方法によれば、培養液中で経時により（約８〜１２週間あるいはそれ以上）十分なバイオマスがひとたび生成されれば、必要に応じて、培養液をスケールアッププロセス中で以下の例示的なステップにより２つの等しい培養液に分割してもよい。最初に、培養液を穏やかにホモジナイズして、バイオマスを完全に懸濁させる。２番目に、前記均質な培養液のうち約半分を新たな滅菌ガラスその他の適切な培養器に移す。３番目に、室温の滅菌脱イオン水を用いて、これら２つの培養器の各々の中の液量を最初の培養体積に戻すように補充する。４番目に、各培養器に新たに調製された栄養ブレンド約１μＬを添加し、穏やかに渦状にかき混ぜる。５番目に、栄養ブレンドが添加された培養液を室温で約１週間、好ましくは週の半ばで１度渦状にかき混ぜ約１２：１２時間サイクルの疑似日照の下で維持しながら、インキュベートする。６番目に、培養器に約１μＬの新たに調製した栄養ブレンドをさらに添加する。７番目に、栄養ブレンドが添加された培養サンプルを室温で約１週間、好ましくは週の半ばで１度渦状にかき混ぜながら、さらにインキュベートする。最後に、このスケールアッププロセスについては、複数の培養液をより大きな培養器中で一緒にし、同様の一般的培養方法及び栄養−培養液体積比を用いて維持することもできることを述べておく。
【００２４】
植物ろ過物製造方法のこの例示的実施形態を引き続き参照しながら、上述したステップを必要に応じて実施して十分な量の植物ろ過物及びその種々の誘導体を生成する。ＰＲＯＡＬＧＡＺＭＥ（登録商標）の名前で販売されている植物ろ過物のサンプルを、アリゾナ州スコッツデールのＨｅａｌｔｈ Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ， Ｉｎｃ．から入手することも出来る。
【００２５】
組成物の製造方法及び組成物中の量に関する具体例が上記に与えられているが、組成物及び組成物の製造方法に対する種々の変形例を用いることができ、また本発明の範囲内となりうることを述べておく。さらに、植物ろ過物を製造するために、他の培養方法、希釈体積、生育培地若しくは栄養ブレンド、体積若しくは添加頻度、インキュベーション時間、培養器、回収若しくはろ過方法、などを用いることができることが想定され、また本発明の範囲内であり、上記の例示的方法は植物ろ過物の他の製造方法を排除することを意図したものではない。
【００２６】
本明細書中で、植物ろ過物の語は上記の組成物及びその誘導体を指す。植物ろ過物はまた、上記のプロセス又は当業者に認識可能なそのバリエーションにより作られた任意の組成物も指す。出願人は、本出願の出願後に「植物ろ過物」の語をより狭く定義する権利を保持する。
【００２７】
さらに、本発明の種々の例示的実施形態によれば、植物ろ過物は種々の画分に分離される。幾つかの例示的かつ非限定的なプロセスを以下に記載する。
【００２８】
一つの例示的実施形態によれば、植物ろ過物を、蠕動ポンプなどのポンプを用いて、毎分約６ｍＬの流速で２．７ｃｍ×２３ｃｍの寸法（それぞれ総容積でおおよそ１００ｍＬの樹脂）の４つのクロマトグラフィーカラムを連続して通過させる。この流速は最適な結合のために選択されたもので、最も遅い樹脂（Ｃ１８）の流速に基づいてもいる。このプロセスは、約１８０Ｌの植物ろ過物の分画を可能とするために最適化されている。その他のサンプル体積を収容するようにプロセスを最適化することなどの、これらの方法の他のバリエーション及び変形例は、当業者に自明であろう。下の表は成分の分離及び単離のための例示的なフローチャートを示している。
【化１】
【００２９】
ＤＥＡＥ樹脂などの樹脂を約１８Ｌが通過した後、カラムを新しいカラムに交換し、先の約１８Ｌからの結合物質を直ちに溶出し、０．２ミクロンのフィルタでろ過し、溶出物を滅菌容器中に保存する。同様に、この例示的実施形態により、陰イオン交換樹脂及び陽イオン交換樹脂を、約３６Ｌの材料がそれぞれを通過した後に交換する。単一の疎水性樹脂（Ｃ１８）はプロセス全体で用いる。最初の３つのカラムからの溶出画分は全て直ちに滅菌フィルタを通過させ、滅菌容器に保存する。Ｃ１８カラムに結合した材料の溶出には有機溶媒が必要で、これはその後、以下に詳述されるように除去される。前記４つのカラムのいずれにも結合しない材料は、有機成分の大部分が枯渇しており、「フロースルー」画分とラベルされ、後の試験及び使用のために滅菌容器に集められる。
【００３０】
分離プロセスの各ステップの詳細な説明を、本発明の一つの例示的実施形態に従って説明する。最初に、クロマトグラフィーカラム樹脂を以下のプロセスに従って調製する。ＤＥＡＥセルロース（タンパク質の分離のために広く用いられている弱陰イオン交換樹脂）をこの例示的プロセスで用いる。おおよそ２０ｇのＤＥＡＥセルロースをおおよそ３００ｍＬの水（この例示的実施形態では超純水が用いられる）で再水和し、１Ｌフラスコ中室温で一晩あるいはそれと同等の時間で膨潤させる。落ち着いた／充填樹脂から水をデカンテーションし、樹脂をさらに約３００ｍＬの超純水などの水の中に再懸濁する。この再懸濁及びデカンテーションの手順を約２４時間かけてさらに２回繰り返す。本例示的実施形態によれば、前記洗浄された樹脂を約２００ｍｌの０．１ＭＮａＯＨ／０．５ＭＮａＣｌ中に再懸濁し、次いで６００ｍｌのブフナー漏斗に移す。このフラスコをさらに約５０ｍｌの０．１ＭＮａＯＨ／０．５ＭＮａＣｌでリンスし、リンス中に懸濁された材料を前記漏斗に移す。溶液を重力により流す前に、前記樹脂をこの溶液中で約１０分落ち着かせる。次にこの樹脂を約７５０ｍｌの０．１ＭＮａＯＨ／０．５ＭＮａＣｌでさらにリンスする。このろ過手順を０．５ＭＮａＣｌを用いて繰り返し、０．１ＭＨＣｌ／０．５ＭＮａＣｌを用いてさらに繰り返す。この樹脂を、最初に約２Ｌの超純水などの水でリンスし、続いて流出液のｐＨが５より大きくなるまで約５Ｌの超純水でさらにリンスする。次に、このＤＥＡＥセルローススラリーを５つのカラム（本実施形態によれば、２．７×２３ｃｍの寸法の５つのカラム）に移し、落ち着かせる。充填されたカラムは総容積約１００ｍｌを有し、本例示的実施形態において使用されるまで４℃で保存する。
【００３１】
さらに、この例示的実施形態によれば、約１００ｇの乾燥樹脂、例えば塩化物形態で受領される、１００〜２００ドライメッシュ、１０６〜１８０μｍウエットビーズ径、４級アンモニウム官能性のカタログ番号１４０−１４４１のＢｉｏＲａｄ ＡＧ１−Ｘ８強塩基陰イオン交換樹脂、が用いられる。不要な酸化夾雑物を全て除去するため、樹脂を最初に脱イオン水で水和して消耗（ｅｘｈａｕｓｔ）させ、次に各カラムの底部にガラスフィルタを装着したガラスカラムにビーズをロードした。約３時間かけて約５００ｍＬの１．０Ｍ塩化ナトリウム溶液を前記樹脂に通すことで、前記樹脂は膨潤し、不要な酸化産物を放出する。このプロセスによって、前記樹脂は塩化物（Ｃｌ−）形に変換もされる。この塩処理の後、前記樹脂を約２リットルの脱イオン水でリンスして、余分な塩化ナトリウムを除去する。
【００３２】
今や完全に塩化物（Ｃｌ−）形となった陰イオン交換樹脂を、約５００ｍＬの２．０Ｍ水酸化ナトリウム溶液をカラムに約２時間かけて通すことで、水酸化物（−ＯＨ）形に変換する。流出液は若干色合いが悪く、アンモニア様の臭気を有していることがあるため、次に、この樹脂を重力サイホン滴下を用いて約７．０Ｌの脱イオン水で一晩リンスする。本例示的実施形態においては、このステップの後は、樹脂の流出液は透明、無色、かつ無臭である。前記カラムから溶出する溶液は、インジケーターストリップで測ったところ中性のｐＨである。この陰イオン交換樹脂は、この時点では、再生され使用準備が整っていると考えられる。
【００３３】
さらに、この例示的実施形態によれば、約１００ｇの乾燥樹脂、例えばミシガン州ミッドランドのＤｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｍｐａｎｙから入手可能な４００〜７００μｍのビーズ径及びスルホネート官能性を有するＤＯＷＥＸ ＭＯＮＯＳＰＨＥＲ（登録商標）８８強酸陽イオン交換樹脂、を用いる。陰イオン交換樹脂については、不要な酸化夾雑物は最初に脱イオン水で水和させ、次に各カラムの底にガラスフィルターを装着したガラスカラムにビーズをロードすることで除かれる。
この塩化ナトリウムによる消耗（ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ）により、前記樹脂は完全にナトリウム（Ｎａ＋）形に変換される。この塩処理の後、前記樹脂を約２．０リットルの脱イオン水でリンスすることで余分な塩化ナトリウムを除去する。
【００３４】
今や完全にナトリウム（Ｎａ＋）形である陽イオン交換樹脂を、約５００ｍＬの２．０Ｍ塩酸溶液をカラムに約２時間かけて通すことによって、酸（Ｈ＋）形に変換する。次に、インジケーターストリップで測定したカラムから溶出する溶液のｐＨが中性になるまで、この樹脂を約３．０Ｌの脱イオン水でリンスする。この陽イオン交換樹脂は、この時点では、再生され使用準備が整っていると考えられる。
【００３５】
さらに、この例示的実施形態によれば、シリカゲル９０Ｃ１８−逆相（Ｃ−１８）において、約２５ｇの樹脂を超純水に再懸濁し、カラムに詰め、使用前に約５倍体積の水で洗浄する。
【００３６】
この例示的実施形態の説明を続けながら、以下の段落は分画プロセスの詳細なタイムテーブルを与える。前記植物ろ過物は、流速約６．９ｍｌ／分で、一つのカラムからの流出液が次のカラムを流れるように連続して配置されたカラム群を通り抜けるようにポンプで送り込まれる。さらに、フロースルーを収集するために収集容器が清浄化及び乾燥される。貯められたフロースルーを０．２μｍフィルタシステムに通し、約４〜２５℃で保存する。
【００３７】
最初の約１８Ｌが通過した後、ＤＥＡＥセルロースカラムは除去され、ｐＨ８．３の１ＭのＮａＣｌ２５０ｍｌで溶出される。溶出液を０．２μフィルタでろ過し、ラベルして４℃で保存する。次に、新たなＤＥＡＥ−セルロースカラムを分画システムに設置し、プロセスを再開する。次の１８Ｌが通過した後に、前記ＤＥＡＥ−セルロースカラム、陰イオン交換カラム、及び陽イオン交換カラムを除去し、各々をｐＨ８．３の１ＭのＮａＣｌ約２５０ｍｌで溶出する。溶出液をそれぞれ個別の０．２μｍフィルタシステムに通し、ラベルして約４℃で保存する。
【００３８】
この例示的実施形態によれば、新たなＤＥＡＥ−セルロースカラム、陰イオン交換カラム及び陽イオン交換カラムが分画システムに設置され、プロセスが再開された。次の１８Ｌの後、前記ＤＥＡＥ−セルロースカラムを除去し、ｐＨ８．３のＮａＣｌ２５０ｍｌで溶出する。溶出液を０．２μｍフィルタシステムに通し、ラベルして４℃で保存する。（全物質から）Ｃ１８カラムに結合した物質の溶出：Ｃ−１８カラムは過剰量の水で廃液し、加圧窒素でパージして残留水を除去する。
【００３９】
次に、カラムに約５０ｍＬのアセトンを流し（ｆｌｕｓｈし）て、最後の微量の水及び有機物を除去し、約５０ｍＬの酢酸エチルを流し、最後に約５０ｍＬのヘキサンを流す。この溶液を過剰量の無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、ガラスウール又は類似の材料でろ過する。
【００４０】
次に、溶媒を窒素流で除去し、約５ｍＬのエチルアセテートで再構成して質量が既知のガラスバイアルに移す。溶媒を窒素で除去し、最終質量を測る。
【００４１】
さらに、ＤＥＡＥ−セルロースカラム、陰イオン交換カラム、及び陽イオン交換カラムをそれぞれｐＨ８．３の１ＭのＮａＣｌ約２５０ｍｌで溶出する。溶出物を個別の０．２μｍフィルタシステムに通し、ラベルして約４℃で保存する。陽イオン交換カラムからの溶出液１ｍＬ（図１〜８及び本発明の説明において画分３又は「Ｆ３」とラベルされている）は、植物ろ過物を最初の３つのカラムに前記の方法で通した後に陽イオン交換カラムから捕捉された溶出液で、分離プロセスに導入された未分離の植物ろ過物と比べると約１６０倍の濃縮物である（つまり、プロセスに導入した植物ろ過物１６０ｍＬにつき、１ｍＬの溶出液がＰＦ３で分離される）。
【００４２】
図１〜８中及び本発明の説明中Ｆ４とラベルされた画分４は、前記方法を用いて植物ろ過物に４つのカラム全てを通過させた後に分画シリーズの最後で捕捉されたフロースルーである。
【００４３】
その結果が図１〜８に提示されている実験において、与えられた希釈物は完全な未分離の植物ろ過物組成物又は指定された特定の画分のものである。例えば、Ｆ４で分離されたフロースルーの総体積は未分画の植物ろ過物のそれと同じであり、Ｆ４の全成分の相対濃度は未分離の植物ろ過物のそれと同じであったが、強陽イオン交換樹脂から溶出したＦ３画分の１：２０希釈物の成分の相対濃度は、未分離の植物ろ過物に対し約８倍濃縮されている（植物ろ過物１６０ｍＬにつきＦ３の１ｍＬが得られるため、１：２０希釈物ではその中の成分は未分離の植物ろ過物に対し約８倍濃縮されているのに相当する）。
【００４４】
この例示的実施形態によれば、植物ろ過物及びフロースルー／Ｆ４はカラムから出た直後のその元々の濃度の状態で、本明細書に記載されるように１：２０及び１：１００のみの希釈で試験された。末梢血単核細胞（「ＰＢＭＣ」）の培養物を、民間の販売元による正常な健康ヒト被験者から得た２バイアルの凍結末梢血単核細胞から調製し、２×１０ｍｌの培地に添加し、遠心した。末梢血単核細胞はＲＰＭＩ１６４０／５％ＦＢＳ中に再懸濁し、２４時間培養した（培地１１ｍｌ中に１バイアル分の凍結細胞）。
【００４５】
この例示的実施形態のための処理剤は３つの剤：未分離植物ろ過物（「ＰＡＺ」）、画分３（「Ｆ３」）、画分４（「Ｆ４」）を含んでいる。各々に対する処理濃度は１：２０及び１：１００であった。各剤についての、希釈による例示的なサンプル調製方法は次のとおりである。第１に、０．７ｍｌの剤（ＰＡＺ、Ｆ３又はＦ４）と６．３ｍｌのＲＰＭＩ１６４０／５％ＦＢＳとを一緒にして１：１０希釈物を調製し、総量７ｍｌの１：１０溶液を得る。第２に、（各剤の）１：１０希釈物１．２ｍｌとＲＰＭＩ１６４０／５％ＦＢＳ４．８ｍｌを一緒にすることによって１：５０希釈物を調製し、総量６ｍｌの１：５０溶液となる。さらに、希釈された画分３（Ｆ３）については、１ＭのＮａＯＨを用いてｐＨを７．０へと調製する。
【００４６】
この例示的実施形態によれば、播種、処理、及び検出は以下のステップによって達成される。２皿分の末梢血単核細胞を合わせ、少量の末梢血単核細胞を０．４％のトリパンブルーで染色し、末梢血単核細胞の細胞数を知られている技術を用いて計数する。
【００４７】
この実施形態においては、炎症性サイトカイン分泌の酵素結合免疫吸着測定（「ＥＬＩＳＡ」）分析、ヒトサイトカインの産生を並行して定量化するための商用キットに提供されたプロトコールを用いた。最初に、末梢血単核細胞を２４ウェルプレートに播種（培地３２０μｌ中、３３７，６００細胞／各ウェル）し、３７℃で４８時間インキュベートした。本例示的実施形態においては、さらに３２０μｌの培地を添加し、細胞を４８時間培養した。コントロール（対照）培養については、前記３２０μｌの追加的培地は追加成分を何ら含んでいなかった。幾つかのサイトカインの生産を刺激するために、末梢血単核細胞の並行培養物を５０ｎｇ／ｍｌのホルボールミリステートアセテート（「ＰＭＡ」）及び１μｇ／ｍｌのイオノマイシンで２４時間処理し、０．６４μｌＰＭＡ／０．６４μｌイオノマイシンを添加し、さらに２４時間インキュベーションした。末梢血単核細胞が植物ろ過物またはそこから得た画分で処理される培養物については、植物ろ過物またはそこから得られた画分３若しくは４の１：１０又は１：５０希釈物を含むさらなる培地３２０μｌ（これにより培養物中の最終希釈度は１：２０又は１：１００となる）を２４時間のインキュベーションの直前に添加し、ＰＭＡ＋イオノマイシン処理有り又は無しでさらに２４時間培養した。２連の末梢血単核細胞培養物を、これらの条件の各々について調べた。インキュベーション期間の最後に、培養物を遠心し、上清培地を回収してアリコートを−７０℃で保存した。次いで、培地サンプルの各々中に存在するサイトカイン量を、ヒト炎症性サイトカイン用多アナライトＥＬＩＳＡｒｒａｙキット（商品番号ＭＥＨ−００４Ａ）及びＳＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから提供された方法を用いて決定した。
【００４８】
植物ろ過物又はそこから分離された画分が、培養末梢血単核細胞の核タンパク質画分中のＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性に及ぼす影響の分析は、この例示的実施形態においては以下の様にして決定した。約１８．２６ｍＬの懸濁末梢血単核細胞を約１８ｍＬの培地に添加し、この細胞懸濁液（２ｍＬ中に２，７１８，０００細胞）の２ｍｌをそれぞれ６０ｍｍ培養皿に播種した。本例示的実施形態においては、さらに２ｍＬの培地を添加した。コントロール培養については、この２ｍＬの追加的培地は追加成分を何ら含んでいなかった。ＴＮＦ−αで刺激された細胞の培養を、２ｍＬの追加的培地を培養開始時に添加することも含め同じやり方で行ったが、ただし回収の１時間前に２μｌのＴＮＦ−α（５０ｎｇ／ｍｌ）をこれらの培養物に添加した。末梢血単核細胞が植物ろ過物又はそこから得られた分画によって処理される培養物については、植物ろ過物又はそこから得られた画分３若しくは４の１：１０又は１：５０希釈物を含む２ｍＬの追加培地（これにより培養液中の最終希釈度は１：２０又は１：１００となる）をインキュベーションの直前に添加した。ＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性の阻害についての２つのポジティブコントロールを行った。一つのケースでは、末梢血単核細胞を２５μＭのＧ２５３５の存在下で２４時間培養し、続いてＴＮＦ−α処理を１時間行った。２つ目のケースでは、末梢血単核細胞を２５μＭのゲニステインの存在下で２４時間培養し、続いてＴＮＦ−α処理を１時間行った。これらの条件それぞれについて２連の末梢血単核細胞培養物を試験し、次いで回収の前に３７℃で２４時間培養した。
【００４９】
インキュベーション期間の最後に、ＰｕｂＭｅｄ−Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ６５：６９３４（２００５年）に記載された方法に従って核タンパク質を細胞から抽出し、同族（ｃｏｇｎａｔｅ）ＮＦ−κＢのＤＮＡ結合エレメントに対応する合成放射標識ＤＮＡ配列へのＮＦ−κＢの結合について電気泳動移動度シフト解析（「ＥＭＳＡ」）をＰｕｂＭｅｄ−Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ６５：６９３４（２００５年）に記載されたものなどの確立されたプロトコールを用いて行った。
【００５０】
今度は図１〜８を参照して、本発明のある例示的実施形態に従って、「ＰＡＺ」の句で表される植物ろ過物及びその画分を用いて種々のサイトカイン及びＮＦ−κＢに影響を与える方法について論じる。種々のサイトカインの産生及びＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性に影響を与える組成物の具体例がここでは論じられるものの、本発明はそれらの例や、本明細書中で論じられる組成物の組成及び量、希釈、又は画分のみには制限はされない。ただし、出願人は特定の量、希釈、又は画分を後日クレームする権利を保持する。
【００５１】
図１Ａ〜１Ｄを具体的に参照しながら、ＮＦ−κＢが結合するＤＮＡ配列に対応し赤外線色素で標識されたデオキシオリゴヌクレオチドを用いて行われた、ＮＦ−κＢについての種々の電気泳動移動度シフト解析あるいは（「ＥＭＳＡ］）の生データが示される。具体的には、図１Ａ及び１Ｂは、赤外線スキャナー（Ｌｉ−Ｃｏｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を短時間用いて（図１Ａ）バンドを可視化した「低濃度」及び同じゲルから得られた画像を増強した（図１Ｂ）「高濃度」の両方の結果を示す。図１Ｃ及び１Ｄは、図１Ａ及び１Ｂに示された分析の基となった試験を、同じ量の核タンパク質を用いてより長時間（２時間に対し３時間）に渡って再度行ったときの結果を示す。
【００５２】
今度は図２を参照し、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）による刺激有り又は無しの場合の末梢血単核細胞中のＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性に対する、植物ろ過物及び完全な植物ろ過物組成物をクロマトグラフィーで処理して得られた種々の画分を投与したことによる影響が、本発明のある例示的実施形態に従って示されている。活性なＮＦ−κＢは同族（ｃｏｇｎａｔｅ）ＤＮＡ配列に結合し、炎症において重要な役割を果たす特定のタンパク質の転写を調節する二量体タンパク質である。このため、発現しＤＮＡに結合するＮＦ−κＢの量が多くなれば、産生される炎症性タンパク質の量も多くなり、炎症反応も大きくなる。ＮＦ−κＢ標的遺伝子のＤＮＡ配列に結合するＮＦ−κＢの総量を減少させると、炎症が減少すると共に、ＨＩＶウイルスなど種々のウイルスの活性化の減少などのＮＦ−κＢの他の効果も減少する。
【００５３】
図２に示されるように、コントロールの未刺激の未処理末梢血単核細胞を試験して、放射標識ＤＮＡプローブに結合するＮＦ−κＢの天然量を決定した。これは、１．０の相対ユニットで表されるＮＦ−κＢ活性のベースラインの測定を示すものである。この例によれば、腫瘍壊死因子アルファあるいはＴＮＦ−αが添加された場合、ＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性はほぼ２．０の相対レベルへと顕著に増加した。しかし、植物ろ過物（「ＰＡＺ」とラベル）の１：２０希釈物を含む組成物を末梢血単核細胞に添加すると、ＮＦ−κＢの濃度はコントロールに比較して大きく減少し、相対レベルは約０．４ユニットとなった。図２に示されるように、また、本発明の種々の例示的実施形態によれば、ＴＮＦ−αと組み合わせられた１：２０又は１：１００希釈の植物ろ過物、１：１００希釈の植物ろ過物単独、１：２０及び１：１００希釈の画分３及び４（「Ｆ３」及び「Ｆ４」とラベル）単独、及びＴＮＦ−αの存在下での１：１００希釈の画分３、はＮＦ−κＢの総濃度をコントロールに比較して減少させ、１：１００希釈の画分４にＴＮＦ−αを足したものはＮＦ−κＢ濃度を増加させた。図２には、ＴＮＦ−α、Ｇ２５３５＋ＴＮＦ−α、Ｇ２５３５単独、及びゲニステイン単独、を添加した結果も示されている。図２に示されるように、植物ろ過物単独、画分３及び画分４はＮＦ−κＢを阻害し、植物ろ過物及び画分３はどちらもＴＮＦ−αが誘導するＮＦ−κＢの活性化を阻害した。
【００５４】
よって、植物ろ過物を投与することで、ＮＦ−κＢのＤＮＡ結合能を減少し得、これは炎症を減少させる。さらに、ＮＦ−κＢの活性化はＨＩＶウイルスなど特定のウイルスの複製及び／又は機能を促進するため、ＮＦ−κＢの総ＤＮＡ結合活性を減少させることでＨＩＶなど特定のウイルスの病理学的効力を減少あるいは予防しうる。本発明は、ＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性減少の、現在知られあるいは将来発見されるいかなる効果も、植物ろ過物並びにその希釈物、画分及び誘導体を有効量投与することで達成できることを想定する。
【００５５】
今度は図３〜５を参照し、本発明の種々の例示的実施形態に従って、末梢血単核細胞による種々のインターロイキンの産生に対する植物ろ過物の影響を論じる。ＩＬ−１０やＩＬ−１７Ａなどある特定のインターロイキンが論じられるが、植物ろ過物は他のインターロイキンや他の炎症経路においても効果を有する。
【００５６】
特に図３を参照して、本発明の一つの例示的実施形態に従い、植物ろ過物及びその種々の希釈物及び画分を他の刺激物質の存在無しに末梢血単核細胞に添加した後に、あるいはＰＭＡで処理された末梢血単核細胞に添加したときの、産生されるＩＬ−２の量（１００，０００細胞当たりのＩＬ−２のｐｇ数で表される）を測定した。示されるように、未処理の培養末梢血単核細胞からなるコントロールは検出可能な量のＩＬ−２を培地中に分泌しなかったが、一方、ＰＭＡを培養末梢血単核細胞に添加したところ約１２５ｐｇ／１００，０００細胞のＩＬ−２分泌があった。培養末梢血単核細胞を植物ろ過物の１：２０又は１：１００希釈物で処理しても検出可能な量のＩＬ−２の産生の誘導は起こらなかった（つまり、コントロールの未処理末梢血単核細胞の場合とおおよそ同じ結果）。植物ろ過物の１：２０希釈物、１：１００希釈の画分３、及び１：２０希釈の画分４をＰＭＡで刺激された末梢血単核細胞に添加したところ、ＰＭＡ単独で処理した末梢血単核細胞よりもＩＬ−２の産生は減少した。植物ろ過物のクロマトグラフィー分画で得られた画分３及び画分４の１：２０及び１：１００希釈物で培養末梢血単核細胞を処理したところ、コントロールと同様に、検出可能な量のＩＬ−２の産生は誘導されなかった。しかし、この例示的実施形態によれば、１：１００希釈の植物ろ過物及び１：２０希釈の植物ろ過物の画分３及び１：１００の植物ろ過物の画分４を、ＰＭＡの存在下の末梢血単核細胞で試験したところ、ＰＭＡ単独を添加した場合に比べると、ＩＬ−２の総量は大きく変化はしなかった。
【００５７】
よって、この例示的実施形態に示されたように、植物ろ過物及びその希釈物、画分又は誘導体を添加することによってＩＬ−２産生を刺激する薬剤に応答して末梢血単核細胞から産生されるＩＬ−２濃度は減少し得、ただしこれらはそれ自体ではＩＬ−２の産生を刺激せず、またこのサイトカインの産生を誘導することが知られている薬剤（例えばＰＭＡ）によるＩＬ−２産生を増強することもない。植物ろ過物が末梢血単核細胞によるＩＬ−２の産生を減少する（又は増加させない）働きは、炎症量を減少させるその能力と共に、現在知られ又は将来発見されるＩＬ−２の他の効果も反映したものである。本発明の種々の実施形態によると、ＩＬ−２などの炎症性サイトカインを上方制御せず、同時にＩＬ−１０などの抗炎症性サイトカインを上方制御するその能力は、炎症量を減少させる上で有効であり、望ましくない副作用を減少する点で従来から利用されている治療法よりも優れている。
【００５８】
今度は図４を参照し、本発明の別の例示的実施形態に従って、植物ろ過物、その種々の画分及び希釈物、及びＰＭＡを培養末梢血単核細胞に添加したときのＩＬ−１０の総産生及び総分泌（１００，０００細胞当たりのＩＬ−１０のｐｇ数で表される）が図４に表される。図４に示されるように、植物ろ過物の１：２０希釈物単独、及びＰＭＡと組み合わせて試験された１：２０希釈物は、検出可能な量のＩＬ−１０を培地に分泌しなかったコントロール末梢血単核細胞と比較してＩＬ−１０の総分泌を増加させた。示されたこの一つの例示的実施形態において、植物ろ過物の種々の他の希釈物及び画分は、単独でもＰＭＡと組み合わせられても、ＩＬ−１０の総濃度に影響を与えないようであった。しかしながら、本明細書に記載される他の例示的実施形態の場合のように、画分３及び４は植物ろ過物の組成の内の低パーセンテージを含むに過ぎず、この結果は、ＩＬ−１０濃度を増加させなかった濃度及び画分の植物ろ過物がＩＬ−１０濃度を上昇させることは必然的に絶対あり得ないという点にまで本発明を限定するものではない。
【００５９】
このため、植物ろ過物はＩＬ−１０の総濃度を上昇しうる。ＩＬ−１０は抗炎症性サイトカインであるため、ＩＬ−１０の総濃度が上昇すると炎症量が減少するはずである。さらに、ＩＬ−１０に起因することが現在知られており又は将来発見される他の効果も、植物ろ過物の添加によって達成されることを、本発明は想定している。
【００６０】
本発明の種々の例示的実施形態によれば、植物ろ過物が炎症を減少させる効果は、ＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性を減少させるその効果単独、又はその効果とＩＬ−１０などの抗炎症性サイトカインの産生及び分泌を増加させること並びに後述するようにＩＬ−２などの炎症性サイトカインや腫瘍壊死因子−アルファ（「ＴＮＦ−α」）を減少させることとが組み合わさって、生じる。よって、本発明は、植物ろ過物が複数の異なる際と下院に同時に影響を及ぼして、種々の例示的実施形態による炎症減少などの総体的効果を達成することを想定している。
【００６１】
今度は図５を参照し、本発明の一つの例示的実施形態に従って、培養末梢血単核細胞の混合物に植物ろ過物を添加してＩＬ−１７Ａの総生産及び分泌に影響を与える（１００，０００細胞当たりのＩＬ−１７のｐｇ数で表す）ことを開示する。ＩＬ−１７Ａと並び、インターロイキン１７（インターロイキン１７Ａと同義）も植物ろ過物の添加により同様に影響を受ける。示されるように、未刺激の培養コントロール末梢血単核細胞は検出可能なレベルのＩＬ−１７Ａを分泌しないが、ＰＭＡを培養末梢血単核細胞に添加するとＩＬ−１７Ａは約３ｐｇ／１００，０００細胞へと顕著に増加した。１：２０希釈又は１：１００希釈の植物ろ過物を添加したところコントロール末梢血単核細胞からはＩＬ−１７Ａの検出可能な分泌が起こらなかった。１：２０希釈若しくは１：１００希釈の植物ろ過物又は１：１００希釈の画分４をＰＭＡ存在下で添加しても、ＰＭＡ単独に反応して分泌されるＩＬ−１７Ａのレベルに変化は見られなかった。植物ろ過物の画分３及び画分４は、１：２０希釈及び１：１００希釈どちらの場合でも、コントロール末梢血単核細胞からのＩＬ−１７Ａの検出可能な分泌を引き起こさなかった。植物ろ過物の画分３の１：２０希釈物を添加したところ、ＰＭＡ処理に応答して末梢血単核細胞によるＩＬ−１７Ａの分泌は約１ｐｇ／１００，０００細胞へと顕著に減少した。示されるように、植物ろ過物の画分３の１：１００希釈物及び植物ろ過物の画分４の１：２０希釈物によっても、ＰＭＡ処理に応答した末梢血単核細胞によるＩＬ−１７Ａ産生は減少した。
【００６２】
図６〜８を参照して、他のサイトカインに対する植物ろ過物の影響を開示する。具体的には、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）、及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）に対する、種々の希釈及び画分の植物ろ過物の影響を開示する。
【００６３】
図６に示されるように、また本発明の一例示的実施形態に従って、ＩＦＮ−γの濃度（１００，０００細胞当たりのＩＦＮ−γのｐｇ数で表す）に対する植物ろ過物の影響を開示する。この例示的実施形態によれば、未刺激の培養コントロール末梢血単核細胞は検出可能なレベルのＩＦＮ−γを分泌しなかったのに対し、培養末梢血単核細胞にＰＭＡを添加すると約７０ｐｇ／１００，０００細胞へと顕著なレベルのＩＦＮ−γの分泌が起こった。本例示的実施形態においては、１：２０希釈若しくは１：１００希釈の植物ろ過物、又はこれらの希釈度の画分３若しくは４を培養末梢血単核細胞に添加しても検出可能なレベルのＩＦＮ−γの分泌は起こらなかったが、１：２０希釈の植物ろ過物をＰＭＡと組み合わせて末梢血単核細胞に添加するとＰＭＡ単独により誘導されるＩＦＮ−γの総分泌が減少した。植物ろ過物の画分３の１：２０希釈を添加するとＰＭＡに誘導されるＩＦＮ−γの分泌は約１０ｐｇへと顕著に減少した。植物ろ過物の画分３の１：１００希釈は、植物ろ過物の画分４の１：２０希釈物の場合と同様に、ＰＭＡに誘導されるＩＦＮ−γ分泌を約６０ｐｇへと減少させた。
【００６４】
よって、植物ろ過物はＩＦＮ−γの産生を誘導せず、他の薬剤により引き起こされるＩＦＮ−γの総生産を調整してそれから得られうる利益を可能にしうる。
【００６５】
今度は図７を参照し、本発明の例示的実施形態に従って、ＴＮＦ−αの産生及び分泌（１００，０００細胞当たりの分泌ｐｇ数により表される）に対する植物ろ過物の影響を測定した。この例示的実施形態によれば、未刺激の培養コントロール末梢血単核細胞は検出可能なレベルのＴＮＦ−αを分泌せず、一方、ＰＭＡを培養末梢血単核細胞に添加すると約５０ｐｇ／１００，０００細胞へとＴＮＦ−αの顕著な分泌が起こった。１：１００希釈の植物ろ過物又は１：２０若しくは１：１００希釈の画分３又は１：２０若しくは１：１００希釈の植物ろ過物画分４は検出可能なレベルのＴＮＦ−αの分泌を誘導しなかった。植物ろ過物及びそこから得られた画分はＰＭＡにより誘導される培養末梢血単核細胞によるＴＮＦ−αの分泌を顕著には変化させなかった。
【００６６】
今度は図８を参照し、本発明の別の例示的実施形態に従って、種々の濃度及び画分の植物ろ過物を投与することが末梢血単核細胞によるＧＭ−ＣＳＦの産生及び分泌（１００，０００細胞当たりの分泌ｐｇ数で表す）に及ぼす影響を論じる。示されるように、未刺激培養末梢血単核細胞からなるコントロールは測定可能な量のＧＭ−ＣＳＦを産生せず、一方、ＰＭＡの添加により約５０ｐｇ／１００，０００細胞の分泌が誘導された。１：２０希釈の植物ろ過物は非常に低レベルのＧＭ−ＣＳＦの分泌（約５ｐｇ／１００，０００細胞）を誘導し、一方、１：００希釈の植物ろ過物又は種々の希釈度の画分３及び４はＧＭＣＳＦ分泌を誘導しなかった。さらに、どちらも１：２０希釈及び１：１００希釈の植物ろ過物及び画分３、並びに１：２０希釈の画分４は、ＰＭＡ存在下での末梢血単核細胞によるＧＭ−ＣＳＦの産生に影響を与えなかった。
【００６７】
よって、これらの例示的実施形態によれば、植物ろ過物それ自体は、種々の希釈度及び分画において、大した量のＧＭ−ＣＳＦの分泌を引き起こさず、また種々の希釈度及び画分の植物ろ過物は他の薬剤による処理の結果誘導されるＧＭ−ＣＳＦの産生を顕著には変化させない。
【００６８】
よって、本発明の種々の例示的実施形態によれば、植物ろ過物の投与により種々のサイトカイン及びＮＦ−κＢが制御され、炎症の減少などの特定の所望の効果が達成される。先行技術の組成物とは異なり、植物ろ過物は多数のサイトカインを制御して炎症の減少を達成することができる。例えば、上記に示され論じられたように、植物ろ過物の投与はＩＬ−２を上方制御することなしにＩＬ−１０を上方制御することができ、炎症をより大きく減少させることができる。
【００６９】
さらに、植物ろ過物並びにその種々の希釈物及び画分はＮＦ−κＢ、及びＴＮＦ−αに誘導されるＮＦ−κＢ活性化、を阻害することができ、このことは植物ろ過物が抗酸化剤として機能することを示している。また、ある例示的実施形態によれば、種々の希釈度及び画分の植物ろ過物、特に画分３、の投与は、ＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性を顕著に抑制する。有効量の植物ろ過物を投与してもＴＮＦ−αやＩＦＮ−γなどの特定の炎症促進性サイトカインは誘導されず、一方でＩＬ−１０などの種々の抗炎症性サイトカインが誘導され、炎症が減少する。さらに、これら種々の例示的実施形態によれば、植物ろ過物の投与は細胞又は組織に対して毒性あるいは刺激物質としての効果を有さない。
【００７０】
本発明の種々の原理が例示的実施形態により上記に記載されたことが理解されなければならない。しかしながら、具体的に記載されていないものに加えて、本発明を実施するのに用いられる上記の処方、比率、要素、材料、及び成分の多くの組み合わせ及び改変は、それらの原理から逸脱すること無しに変更する、特に具体的な環境及び作動要件に合わせる、ことが出来る。本発明のその他のバリエーション及び変形例は当業者には明らかであろうが、そのようなバリエーションや変形例も本開示によってカバーされることが意図されている。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＴＣＣ寄託＃ＰＴＡ−５８６３の微生物群を培養して得られる植物ろ過物の有効量を投与することを含み、炎症促進性のサイトカインを下方制御しながら抗炎症性サイトカインを上方制御する前記植物ろ過物によって炎症が処置される、炎症を治療する方法。
【請求項２】
前記抗炎症性サイトカインがＩＬ−１０を含み、炎症性サイトカインがＩＬ−２を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記炎症性サイトカインがＴＮＦ−αを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記炎症性サイトカインがＩＦＮ−γを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記抗炎症性サイトカインがＩＬ−１０を含み、前記炎症性サイトカインがＩＬ−２、ＴＮＦ−α、及びＩＦＮ−γを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記植物ろ過物が細胞レベルでサイトカインの発現に影響を与える、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記植物ろ過物がさらにＮＦ−κＢの活性化に影響を与える、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ＡＴＣＣ寄託＃ＰＴＡ−５８６３の微生物群を培養して得られる植物ろ過物の有効量を投与することを含む、ＮＦ−κＢに影響を与える方法。
【請求項９】
前記ＮＦ−κＢに影響を与えることが、ＮＦ−κＢの発現、活性化又はＤＮＡ−結合活性を減少させることにより起こる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＮＦ−κＢに影響を与えることが炎症を抑制する、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＮＦ−κＢに影響を与えることが、種々のウイルスに影響を与える、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記ウイルスがＨＩＶウイルスを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＮＦ−κＢに影響を与えることが、癌も含め免疫系の異常を治療又は予防する、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
ＮＦκＢに影響を与えることが、宿主の免疫応答に影響を与える、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
ＡＴＣＣ寄託＃ＰＴＡ−５８６３の微生物群を培養して得られる植物ろ過物の有効量を投与することを含む、サイトカインに影響を与える方法。
【請求項１６】
前記影響を受けるサイトカインがインターロイキンを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記影響を受けるサイトカインがＴＮＦ−αを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記影響を受けるサイトカインがＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７Ａ、及びＩＬ−１７を含み、前記ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７Ａ、及びＩＬ−１７に影響を与えることにより免疫応答が制御される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１】
ＡＴＣＣ寄託＃ＰＴＡ−５８６３の微生物群を培養して得られる植物ろ過物の有効量を投与することを含み、炎症促進性のサイトカインを下方制御しながら抗炎症性サイトカインを上方制御する前記植物ろ過物によって炎症が処置される、炎症を治療する方法。
【請求項２】
前記抗炎症性サイトカインがＩＬ−１０を含み、炎症性サイトカインがＩＬ−２を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記炎症性サイトカインがＴＮＦ−αを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記炎症性サイトカインがＩＦＮ−γを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記抗炎症性サイトカインがＩＬ−１０を含み、前記炎症性サイトカインがＩＬ−２、ＴＮＦ−α、及びＩＦＮ−γを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記植物ろ過物が細胞レベルでサイトカインの発現に影響を与える、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記植物ろ過物がさらにＮＦ−κＢの活性化に影響を与える、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ＡＴＣＣ寄託＃ＰＴＡ−５８６３の微生物群を培養して得られる植物ろ過物の有効量を投与することを含む、ＮＦ−κＢに影響を与える方法。
【請求項９】
前記ＮＦ−κＢに影響を与えることが、ＮＦ−κＢの発現、活性化又はＤＮＡ−結合活性を減少させることにより起こる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＮＦ−κＢに影響を与えることが炎症を抑制する、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＮＦ−κＢに影響を与えることが、種々のウイルスに影響を与える、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記ウイルスがＨＩＶウイルスを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＮＦ−κＢに影響を与えることが、癌も含め免疫系の異常を治療又は予防する、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
ＮＦκＢに影響を与えることが、宿主の免疫応答に影響を与える、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
ＡＴＣＣ寄託＃ＰＴＡ−５８６３の微生物群を培養して得られる植物ろ過物の有効量を投与することを含む、サイトカインに影響を与える方法。
【請求項１６】
前記影響を受けるサイトカインがインターロイキンを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記影響を受けるサイトカインがＴＮＦ−αを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記影響を受けるサイトカインがＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７Ａ、及びＩＬ−１７を含み、前記ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７Ａ、及びＩＬ−１７に影響を与えることにより免疫応答が制御される、請求項１５に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２０１３−５１０９０５（Ｐ２０１３−５１０９０５Ａ）
【公表日】平成２５年３月２８日（２０１３．３．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５３９９７４（Ｐ２０１２−５３９９７４）
【出願日】平成２２年１１月１６日（２０１０．１１．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５６８６２
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０６０４２７
【国際公開日】平成２３年５月１９日（２０１１．５．１９）
【出願人】（５１２１２８３８０）ヘルス エンハンスメント プロダクツ インク (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年３月２８日（２０１３．３．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１１月１６日（２０１０．１１．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５６８６２
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０６０４２７
【国際公開日】平成２３年５月１９日（２０１１．５．１９）
【出願人】（５１２１２８３８０）ヘルス エンハンスメント プロダクツ インク (1)
【Ｆターム（参考）】
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