シアル酸産生を調節し、遺伝性封入体ミオパチーを治療する方法及び組成物
本発明の特定の実施形態によれば、系の中でのシアル酸の産生を調節する方法であって、系に野生型ＧＮＥコード核酸配列を与えるステップを含む方法が提供される。そのような実施形態によれば、系は、細胞、筋組織又は他の望ましい標的を含みうる。同様に、本発明は、変異型内因性ＧＮＥコード配列を含む系の中で野生型ＧＮＥを産生する方法を包含する。換言すれば、本発明は、機能的な野生型ＧＮＥコード配列を、例えば、変異型（欠陥を有する）ＧＮＥコード配列を有する細胞又は筋組織に与えるステップを含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００７年２月７日出願の米国特許仮出願第６０／９００,０３４号の優先権を主張し、参照により組み込むものである。
【０００２】
本発明の分野は、系中でのシアル酸産生を調節する方法及び組成物に関する。本発明の分野はさらに、遺伝性封入体ミオパチー及び／又はその症状を治療及び／又は予防する方法及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
遺伝性封入体ミオパチー（ＨＩＢＭ２，Hereditary Inclusion Body Myopathy）は、慢性の進行性骨格筋消耗障害であり、通常、年齢５０歳になる前に完全な身体障害をもたらす。現在、ＨＩＢＭ２に有効な治療処置は存在しない。この疾患の発症は、常染色体劣性変異のファミリーメンバーであるＧＮＥ遺伝子の発現に関係しており、ＧＮＥ遺伝子は、二機能性酵素であるＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ ２エピメラーゼ／ＭａｎＮＡｃキナーゼ（ＧＮＥ／ＭＮＫ，UDP-GlcNAc 2-epimerase / ManNAc kinase）をコードする。この酵素は、シアル酸生合成の最初の２ステップを触媒する律速二機能性酵素である。シアル酸産生の低減は、その結果として、極めて重要な筋タンパク質であるα−ジストログリカン（α−ＤＧ，alpha-dystroglycan）を含めた様々な糖タンパク質へのシアル酸付加の低減をもたらす。今度はこれが、筋機能の重度の不自由を引き起こし、その症候群の発症をもたらす。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の特定の実施形態によれば、系中でシアル酸の産生を調節する方法であって、系に野生型ＧＮＥコード核酸配列を与えるステップを含む方法を提供する。そのような実施形態によれば、系は、細胞、筋組織又は他の望ましい標的を含みうる。同様に、本発明は、変異型内因性ＧＮＥコード配列を含む系に野生型ＧＮＥを導入し、発現させる方法を包含する。換言すれば、本発明は、機能的な野生型ＧＮＥコード配列を、例えば変異型（欠陥を有する）ＧＮＥコード配列を有する細胞又は筋組織に与えるステップを含む。
【０００５】
本発明の追加の実施形態によれば、遺伝性封入体ミオパチーの影響を治療し、予防し、且つ／又は寛解させる方法が提供される。そのような方法は、通常、患者に野生型ＧＮＥコード核酸配列を与えるステップを含む。野生型ＧＮＥコード核酸配列は、筋肉注射又は静脈内投与によって、脂質ナノ粒子と共に患者に送達してもよい。
【０００６】
本発明のさらに別の実施形態によれば、系中で野生型ＧＮＥを発現するための新規な組成物が提供される。組成物は、脂質ナノ粒子内に配置され、又は脂質ナノ粒子に連結されている野生型ＧＮＥコード核酸配列を含むことが好ましい。脂質ナノ粒子は、筋細胞、筋組織又はこれらの構成成分を認識して、それらに結合できる作用物質で装飾されていてもよい。
【０００７】
この特許出願のファイルは、有色で作成された少なくとも１つの図を含有している。この特許の、有色図（複数可）を含むコピーは、請求及び必要な料金の支払いに応じて、米国特許商標局が提供するであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本明細書に記載のｐＵＭＶＣ３−ＧＮＥ発現ベクターの図である。
【図２】ＧＮＥ ｗｔ（ＮＢ８）、Ｍ７１２Ｔ（ＭＢ１８）及びＲ２６６Ｑ（Ｒ２６６Ｑ）の配列アラインメントを示す図である。元のＤＮＡ配列をアミノ酸配列に変換して、その中に位置する変異を図示した。
【図３】１０％血清中で培養されたＣＨＯ−Ｌｅｃ３細胞におけるＧＮＥ発現を示すゲル画像である。レーン１：未処置のＬｅｃ３細胞。レーン２：ｗｔ ＧＮＥ。レーン３：Ｍ７１２Ｔ ＧＮＥ。レーン４：Ｒ２６６Ｑ ＧＮＥ。
【図４】ＣＨＯ−Ｌｅｃ３細胞系におけるＧＮＥ発現を示すウエスタンブロット画像である。レーン１〜４：１０％ＦＢＳ中で培養されたＣＨＯ−Ｌｅｃ３細胞。レーン５〜８：２．５％ＦＢＳ中で培養されたＣＨＯ−Ｌｅｃ３細胞。レーン１及び５：未処置のＬｅｃ３細胞。レーン２及び６：ｗｔ ＧＮＥ。レーン３及び７：Ｍ７１２Ｔ ＧＮＥ。レーン４及び８：Ｒ２６６Ｑ ＧＮＥ。
【図５】形質移入されたＣＨＯ−Ｌｅｃ３細胞では、ＧＮＥ ｍＲＮＡが発現されているが、対照細胞では発現されていないことを示すゲル画像である。レーン１〜４は、連続希釈されたｐＵＭＶＣ３−ＧＮＥ−ｗｔ ＰＣＲ産物１５μｌを含有しており、これを用いて、Ｌｅｃ３試料中に存在するＧＮＥ ｍＲＮＡの量を定量した。レーン５〜６は、形質移入されているか、形質移入されていないＬｅｃ３細胞からのＰＣＲ産物１５μｌを含有している。
【図６】２．５％ＦＢＳの存在下で培養されたＣＨＯ−Ｌｅｃ３細胞内のＧＮＥ発現によって、シアル酸産生が刺激されることを示す棒グラフである。未処置のＬｅｃ３細胞（「ブランク」）と比較して、ＧＮＥ−ｗｔ（ｐ＝０．０１５７）形質移入の後では、シアル酸産生が有意に大きくなっていた。ＧＮＥ−Ｒ２６６Ｑ（ｐ＝０．０５６６）及びＧＮＥ−Ｍ７１２Ｔ（ｐ＝０．０７０８）は、有意性に接近していた。
【図７】ＧＭＰ ＤＮＡ複合体の筋肉内注射を用いた、本明細書に記載の毒性試験を要約する表である。
【図８】ＧＭＰ ＤＮＡ複合体の静脈内注射を用いた、本明細書に記載の毒性試験を要約する表である。
【図９】ＧＭＰ ＤＮＡ複合体の静脈内注射を用いた、本明細書に記載の毒性試験を要約する線グラフである。
【図１０】Plasma-Lyte（登録商標）中におけるＧＭＰ−ＧＮＥの筋肉内注射を施されたマウスの生存率を要約する線グラフである。
【図１１】Plasma-Lyte（登録商標）中におけるＧＭＰ−ＧＮＥの静脈内注射を施されたマウスの生存率を要約する線グラフである。
【図１２】水中におけるＧＭＰ−ＧＮＥの静脈内注射を施されたマウスの生存率を要約する線グラフである。
【図１３】異なった量のＧＮＥコードＤＮＡを投与された３つの異なる群のマウスにおける、筋組織内のＧＮＥ発現を要約する棒グラフである。各群には、２匹の異なったマウスが含まれていた。
【図１４】本明細書に記載のＧＮＥコード配列を注射されたマウスから得られたＧＮＥ ｍＲＮＡを示すゲル画像である。
【０００９】
配列表の簡単な説明
配列番号１〜６は、下記表１に示すＰＣＲプライマーの核酸配列である。
【００１０】
配列番号７〜８は、ＧＮＥ特異的ＰＣＲプライマーである。
【００１１】
配列番号９は、本明細書に記載し、且つ図１に示すＰＵＭＶＣ３−ｗｔ−ＤＮＡコンストラクトの核酸配列である。
【００１２】
配列番号１０は、ＰＵＭＶＣ３−ｗｔ−ＤＮＡコンストラクト内に含有されているＧＮＥコード配列である。
【００１３】
配列番号１１は、ＧＮＥの野生型アミノ酸配列である。
【００１４】
配列番号１２は、ＧＮＥ−Ｒ２６６Ｑの改変核酸配列である。
【００１５】
配列番号１３は、ＧＮＥ−Ｒ２６６Ｑの改変アミノ酸配列である。
【００１６】
配列番号１４は、ＧＮＥ−Ｍ７１２Ｔ（ＨＩＢＭ２を引き起こす変異）の変異型核酸配列である。
【００１７】
配列番号１５は、ＧＮＥ−Ｍ７１２Ｔ（ＨＩＢＭ２を引き起こす変異）の変異型アミノ酸配列である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の特定の実施形態によれば、系中でのシアル酸産生を調節する方法が提供される。この方法は通常、系に野生型ＧＮＥコード核酸配列を与えるステップを含む。野生型ＧＮＥコード核酸配列は、それに作動可能に連結されたプロモーターを含むことが好ましい。プロモーターは、機能的であり、且つ標的細胞内（又は標的の細胞外空間）でＧＮＥコード核酸配列の発現を促進できるものであることが好ましい。ＧＮＥコード配列に作動可能に連結できるプロモーターの非限定的な一例はＣＭＶプロモーターであり、これは、ＰＵＭＶＣ３−ｗｔ−ＤＮＡコンストラクトの野生型ＧＮＥコード核酸配列に作動可能に連結されていることが示されている（図１）。
【００１９】
本明細書で使用される場合、「ＧＮＥコード核酸配列」、「野生型ＧＮＥコード配列」及び「ＧＮＥコード配列」という用語、並びに同様な用語は、配列番号１１のアミノ酸配列によって表される、野生型の二機能性酵素ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ ２−エピメラーゼ／ ＭａｎＮＡｃキナーゼ（ＧＮＥ／ＭＮＫ）をコードする核酸配列を指す。ＧＮＥコード配列は、配列番号１０など、ＧＮＥの野生型をコードする核酸配列のみを含みうる。その代わりに、ＧＮＥコード配列は、プロモーター、終止配列及び／又は他のエレメントなどの他の転写調節エレメントと共に、ＧＮＥの野生型をコードする核酸配列を含みうる。そのようなＧＮＥコード配列の非限定的な一例は、図１に示すｐＵＭＶＣ３ ＧＮＥコンストラクトであり、これは配列番号９の核酸配列からなる。
【００２０】
「ＧＮＥコード核酸配列」、「野生型ＧＮＥコード配列」及び「ＧＮＥコード配列」という用語、並びに同様な用語は、遺伝コードの縮重によって、本明細書に添付された配列表に示す配列のいずれに示されている配列とも同一ではないが、それでもなお野生型ＧＮＥのアミノ酸配列（配列番号１１）をコードしている核酸配列又は異なったアミノ酸配列をコードする改変核酸配列を、その結果得られるＧＮＥタンパク質が同じ野生型ＧＮＥタンパク質の活性を実質的に保持している（又は改善されている）という条件で、さらに含むことを意味する。そのような改変ＧＮＥタンパク質の非限定的な例には、本明細書に記載のＧＮＥアイソフォームＲ２６６Ｑ（配列番号１３）が含まれる。すなわち、１つのアミノ酸が類似のアミノ酸に置換されるようなやり方で野生型ＧＮＥタンパク質のアミノ酸配列を改変するＧＮＥコード配列の改変、及びその変化（それが置換、欠失又は挿入であるかにかかわらず）がＧＮＥタンパク質の活性部位に負の影響を与えないため、ＧＮＥ活性に実質的に負の影響を与えない他の改変も本発明に包含される。
【００２１】
本明細書で使用される場合、「系」という用語は、どんなタイプの細胞も生物も含めた、本明細書に記載のＧＮＥコード配列を受容することができるどんな生物系も指す。加えて、「系」には、生物体内の細胞間隙も含まれうる。
【００２２】
本発明の特定の実施形態によれば、ＧＮＥコード配列は、適切な担体又は送達媒体の中に配置してもよく、又はそれに連結させてもよい。脂質担体（脂質ナノ粒子）、ウイルスベクター、生分解性重合体、重合体ミクロスフェア（例えば５０ｎｍ又はそれ未満）及び様々な結合系、並びに関連のサイトフェクチン(cytofectin)の使用を含めた、様々な戦略を用いて、本明細書に記載のＧＮＥコード配列を標的細胞内に送達できる。
【００２３】
リポソーム又は他の粒子形成組成物を使用したものは、本明細書に記載のＧＮＥコード配列の好ましい送達媒体である。リポソームは、細胞内取り込みを改善する一方で、本明細書に記載のＧＮＥコード配列などの生体分子を分解から保護するので、魅力的な担体である。ポリアニオン（例えばＤＮＡ）を送達するための、最も一般的に使用されている種類のリポソーム製剤は、陽イオン性脂質を含有するものである。
【００２４】
単独又は他の脂質及びホスファチジルエタノールアミンなどの両親媒性物質を含有する陽イオン性脂質を用いた高分子で、脂質集合体を形成させてもよい。脂質製剤の組成と、その調製方法との両方が、その結果得られる陰イオン性高分子−陽イオン性脂質集合体の構造及びサイズに影響を有することが当技術分野でよく知られている。インビトロ及びインビボにおける特定の細胞型へのポリアニオンの送達を最適化するために、これらの因子を調節することができる。
【００２５】
本明細書に記載のＧＮＥコード組成物を細胞送達するのに陽イオン性脂質を使用することは、いくつかの利点を有する。陽イオン性脂質を用いた陰イオン組成物の封入は、静電的相互作用により本質的に定量的である。加えて、陽イオン性脂質は陰電荷の細胞膜と相互作用して、それによって細胞膜輸送を開始させると考えられている。
【００２６】
プラスミドＤＮＡを小粒子内に封入することができ、それらの小粒子は通常、二重層脂質小胞中に封入された単一のプラスミドからなることが実験によって示された（Wheeler, et al., 1999, Gene Therapy 6, 271-281）。これらの粒子はしばしば、融合誘導脂質であるジオレオイルフォスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ，dioleoylphosphatidylethanolamine）及び低レベルの陽イオン性脂質を含有し、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ，poly(ethylene glycol)）コーティングの存在によって水性溶媒中に安定化することができる。
【００２７】
これらの脂質粒子は、それらが静脈内（ｉ．ｖ．，intravenous）注射の後に、延長された循環寿命を示すので、全身性の適用を有し、様々な組織及び臓器に、そのような領域の血管透過性を強化することにより選択的に蓄積させることができ、且つエンドソーム膜の破壊によってエンドサイトーシスのリソソーム経路を回避するように設計することができる。これらの特性は、実験上及び治療上の適用のため、ＧＮＥコード配列などの生理活性分子を、筋組織細胞などの様々な細胞型に送達するのに有用となりうる。様々な脂質核酸粒子及びそれの調製方法は、参照によりすべて全体として本明細書に組み込まれている、米国特許出願公開第２００８−００２００５８号、第２００３−００７７８２９号、第２００３−０１０８８８６号、第２００６−００５１４０５号、第２００６−００８３７８０号、第２００３−０１０４０４４号、第２００６−００５１４０５号、第２００４−０１４２０２５号、第２００６−００８３７８８０号、第２００５−００６４５９５号、第２００５−０１７５６８２号、第２００５−０１１８２５３号、第２００５−０２５５１５３号及び第２００５−０００８６８９号明細書、並びに米国特許第５８８５６１３号、第６５８６００１号、第６８５８２２５号、第６８５８２２４号、第６８１５４３２号、第６５８６４１０号、第６５３４４８４号及び第６２８７５９１号明細書に記載されている。
【００２８】
本発明は、ＧＮＥコード配列及び／又はそれらと共に使用される附随送達媒体を特定の細胞型、例えば筋細胞及び筋組織などに向けてターゲッティングできることを示す。例えば、多くの特異的相互作用によって、リポソームナノ粒子が細胞表面に結合するように方向付けることができる。この結合は、詳細に理解されているいくつかの細胞進入経路の１つによる、細胞内へのＤＮＡの取り込みを促進する。これらの相互作用による、ナノ粒子（例えばリポソーム）の迅速な隔離は、末梢循環内にそれらが存在している時間を短縮し、それによって、分解及び非特異的な取り込みの可能性を低減する。一般的なターゲッティング作用物質には、細胞表面のトランスフェリン受容体（ＴｒｆＲ，transferrin receptor）に結合するトランスフェリン（Ｔｒｆ，transferrin）、又は細胞表面のＴｒｆＲに結合する抗体（若しくはその誘導体）の使用が含まれるが、これらに限定されない。筋肉は、その細胞表面に比較的高濃度のＴｒｆＲを有する。隔離に用いる別の標的は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ，epidemal growth factor receptor）であり、これは、筋細胞及び他の上皮様細胞型の表面に広く存在している。Erbitux（ヒトでの使用が承認されているＥＧＦＲモノクローナル抗体）は、ＥＧＦＲターゲッティング用の例示的な作用物質であり、これも、本明細書に記載のリポソームナノ粒子を装飾するのに使用できる。追加のターゲッティング部分は、筋細胞上にのみ存在する（又は筋細胞に、より限定されている）特定の標的を認識して、それらに結合するレクチン又は小分子（ペプチド又は糖）でありうるが、これらに限定されない。より小さい（且つ、より高親和性でありうる）分子の利点は、それらが、使用するナノ粒子の表面に、より高密度で存在しうるであろうということである。
【００２９】
本明細書に記載のＧＮＥコード配列は、適切な送達媒体（リポソーム又は脂質ナノ粒子など）と共に、系に送達することが好ましく、よく知られている様々な技法のうちの任意のものを用いて、系に投与できる。例えば、哺乳動物の場合には、非経口注射を介して、ＧＮＥコード配列を哺乳動物に投与できる。本明細書で使用される場合、「非経口」という用語には、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑液包内又は注入技法が含まれる。
【００３０】
ＧＮＥコード配列及び関連の組成物は、毒性がなく薬学的に許容される、任意の従来の担体、アジュバント又は媒体を含有しうる。場合によっては、薬学的に許容できる酸、塩基又は緩衝剤によって、製剤のｐＨを調整して、処方された組成物又はその送達型の安定性を強化できる。例えば、既知な技術に従い、適した分散剤若しくは湿潤剤及び懸濁剤を用いて、注射用の無菌水性懸濁液又は油性懸濁液を処方できる。無菌注射用製剤は、毒性のない非経口的に許容される希釈剤又は溶媒中の無菌注射用溶液、懸濁液若しくは乳剤でよい。利用することができる許容される媒体及び溶媒には、水、米国薬局方リンゲル液及び等張食塩液が含まれる。加えて、無菌不揮発性油が、従来、溶媒又は懸濁媒として利用されている。この目的には、合成のモノグリセリド又はジグリセリドを含めたどんな無刺激不揮発性油も利用できる。加えて、注射用製剤中で、オレイン酸などの脂肪酸を用いてもよい。
【００３１】
特定の実施形態によれば、Plasma-Lyte（登録商標）（Baxter Laboratories社製、米国Illinois州Morton Grove所在）担体を利用して、とりわけ非経口注射用に、ＧＮＥコード配列を送達するのに使用できる。Plasma-Lyte（登録商標）は、静脈内投与に使用できる無菌の非発熱性等張液である。容積各１００ｍＬあたり、５２６ｍｇの米国薬局方塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、５０２ｍｇのグルコン酸ナトリウム（Ｃ６Ｈ１１ＮａＯ７）、３６８ｍｇの米国薬局方酢酸ナトリウム三水和物（Ｃ２Ｈ３ＮａＯ２・３Ｈ２Ｏ）、３７ｍｇの米国薬局方塩化カリウム（ＫＣｌ）及び３０ｍｇの米国薬局方塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ）を含有している。Plasma-Lyte（登録商標）は、抗菌剤を含有していない。ｐＨは、水酸化ナトリウムによって、約７．４（６．５〜８．０）に調整することが好ましい。
【００３２】
例えば、ＧＮＥコード配列を送達するのに使用される注射用製剤は、細菌保持フィルターを通した濾過によって、又は無菌固体組成物の形態で無菌化剤を組み入れることによって、無菌化することができ、この無菌固体組成物は、使用する前に、滅菌水、Plasma-Lyte（登録商標）又は他の無菌注射用媒体中に溶解又は分散させることができる。
【００３３】
系内におけるＧＮＥコード配列の発現を長期化する（又はその影響を長期化する）ために、皮下注射又は筋肉内注射からの組成物の吸収を遅くすることが望ましい場合がある。これは、水溶性が乏しい結晶性又は非晶質の物質の液体懸濁液を使用することによって実現できる。その場合、組成物の吸収速度は、溶解速度に依存しうる。この溶解速度は、さらに、結晶のサイズ及び結晶形態に依存しうる。
【００３４】
別法では、油性媒体中に組成物を溶解又は懸濁させることによって、非経口的に投与されたＧＮＥコード配列の吸収の遅延を実現させることができる。注射用のデポー剤形は、ポリラクチド−ポリグリコリドなどの生分解性重合体に入れたＧＮＥコード配列のマイクロカプセルマトリックスを生成することによって調製できる。ＧＮＥコード配列物質対重合体の比率及び使用する特定の重合体の性質に応じて、ＧＮＥコード配列の放出速度を制御することができる。他の生分解性重合体の例には、ポリ（オルトエステル）及びポリ（無水物）が含まれる。上述の通り、デポー剤注射用製剤は、筋組織などの標的体組織に適合したリポソーム中に（又はマイクロエマルション中にさえ）ＧＮＥコード配列を捕捉することによっても調製できる。
【００３５】
系中でのシアル酸産生を調節する方法に加えて、本発明はさらに、系中で野生型ＧＮＥを産生する方法を包含する。そのような実施形態によれば、系（例えばヒト患者の筋細胞）は、変異型の内因性ＧＮＥコード配列（例えば配列番号１４のＧＮＥ−Ｍ７１２Ｔ配列）を含みうる。換言すれば、本発明は、機能的な野生型ＧＮＥコード配列を、例えば変異型の（欠陥を有する）ＧＮＥコード配列を有する細胞又は筋組織に与えるステップを含む。野生型ＧＮＥコード配列は、例えば本明細書に記載のリポソーム又は脂質ナノ粒子を用いて、非経口注射によってそのような系に送達することができる。
【００３６】
本発明の追加の関連実施形態によれば、遺伝性封入体ミオパチー（ＨＩＢＭ２）の影響を治療し、予防し、且つ／又は寛解させる方法が提供される。そのような方法は、通常、治療有効量の野生型ＧＮＥコード核酸配列を患者に与えるステップを含む。特定の実施形態では、好ましくは、非経口注射によって、脂質ナノ粒子、及びPlasma-Lyte（登録商標）の担体に類似した担体と共に、野生型ＧＮＥコード核酸配列を患者に送達することができる。
【００３７】
野生型ＧＮＥコード核酸配列に関して、「治療有効量」という用語は、標的細胞内のシアル酸産生を増大させ、並びに／又は他の方法で患者におけるＨＩＢＭ２の影響を治療し、予防し、且つ／若しくは寛解させるのに十分なレベルの野生型ＧＮＥを、妥当な損益比で発現するのに十分な上記配列の量を指す。しかし、本発明の野生型ＧＮＥコード核酸配列及び関連組成物の１日総用量は、適切な医学的判断の範囲内で、主治医によって決定されることが理解されよう。
【００３８】
どんな特定の患者に関する特定の治療有効量レベルも、患者のＨＩＢＭ２障害の重症度；使用する特定のＧＮＥコード配列の活性；使用する送達媒体；患者の年齢、体重、健康全般、性別及び食事；使用する特定のＧＮＥコード配列の投与時間、投与経路及び排出速度；治療の継続期間；使用する特定のＧＮＥコード配列と併用されるか、同時使用される薬物；並びに医学分野でよく知られている同様な因子を含めた様々な因子に依存しうる。
【００３９】
患者の状態が改善した際に、必要な場合には、維持量のＧＮＥコード配列を投与してもよい。その後、症状が望ましいレベルに軽減された際に、改善された状態が保持されるレベルに、症状の関数として、投与の用量若しくは頻度、又はこれら両方を低減させてもよい。
【００４０】
本発明のさらに別の実施形態によれば、系中で野生型ＧＮＥを発現するための新規な組成物が提供される。これらの組成物は、野生型ＧＮＥコード核酸配列を含有していることが好ましい。本明細書に記載の通り、ＧＮＥコード核酸配列は、プロモーター及び終止配列などの様々な転写調節エレメントを含みうる。本発明によって包含される組成物の非限定的な例には、本明細書に記載され、図１に示されており、且つ配列番号９によって表されるｐＵＭＶＣ３−ＧＮＥ発現ベクターが含まれる。また、本発明の他の実施形態に関連して記載されている通り、ＧＮＥコード核酸配列は、リポソーム又は脂質ナノ粒子などの、系への送達に適した媒体の中に配置するか、又はそれに連結することができる。さらに、そのような実施形態によれば、送達媒体は、筋細胞又は筋組織などの標的細胞又は組織を認識して、それに結合できる作用物質で装飾されていてもよい。
［実施例］
【実施例１】
【００４１】
ＣＨＯ−Ｌｅｃ３細胞における外因性ＧＮＥの発現。
以下の実施例で、ヒトｃＤＮＡに由来するいくつかのＧＮＥ発現ベクターを作製した。ＧＮＥ欠失細胞（Ｌｅｃ３細胞）において、３つの異なったＧＮＥ形態、すなわち、野生型、Ｍ７１２Ｔ及びＲ２６６Ｑが活発に発現された。酵素活性は異なっているが、すべての酵素が、同様なタンパク質発現レベルを示した。下記に示される通り、形質移入されたＧＮＥ発現細胞系は、形質移入されていない細胞より有意に多くのシアル酸を産生した。
【００４２】
実施例１ 方法
ＧＮＥクローニング。ＧＮＥ ｃＤＮＡを含有する親ベクターは、Daniel Darvish氏（HIBM Research Group、米国California州Encino所在）によって提供されたものであり、それらには、ｐＧＮＥ−ＮＢ８（野生型）、ｐＧＮＥ−ＭＢ１８（Ｍ７１２Ｔ変異体）及びｐＧＮＥ−Ｒ２６６Ｑ（Ｒ２６６Ｑ変異体）が含まれていた。受け側のベクターであるｐＵＭＶＣ３は、Aldevron社（米国North Dakota州Fargo所在）から購入した。サブクローニングベクターであるpDrive（Qiagen社製、米国California州Valencia所在）は、Ｒ２６６Ｑ変異体を親ベクターから受け側ベクターにシャトルさせるのに用いた。
【００４３】
野生型ＧＮＥ及びＭ７１２Ｔ ＧＮＥを、Eco RI制限消化、ゲル精製及びＴ４ライゲーションを介して、親ベクターからｐＵＭＶＣ３にクローニングした。Ｒ２６６Ｑ変異体ＧＮＥは、Hind III + Xba I消化を介して、親ベクターからpDriveにクローニングし、その後、Sal I + Xba Iを介してｐＵＭＶＣ３に移動させた（図１）。すべてのｐＵＭＶＣ３−ＧＮＥクローンは、下記表１に示すプライマーを用いて、Seqwright社（米国Texas州Houston所在）が配列決定した。
【００４４】
【表１】
【００４５】
陽性のｐＵＭＶＣ３−ＧＮＥクローンを１７５ｍｌのＬＢブロス＋５０μｇ／ｍｌ Ｋａｎ中で終夜培養し、製造会社プロトコールに従って、１５０ｍｌの培養物をQiagen社製（米国California州Valencia所在）HiSpeed Plasmid Maxiキットで使用した。
【００４６】
ＤＮＡ：脂質複合体。この実施例で使用されたＤＮＡ：脂質複合体は、試験ＤＮＡ（ｐＵＭＶＣ３−ＧＮＥ）と、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ，1,2-Dioleoyl-3-Trimethylammonium-Propane）を室温で混合することによって産生した。ＤＯＴＡＰは、Avanti Polar Lipids社（米国Alabama州Alabaster所在）によって販売されている市販の脂質粒子である。望ましい全容積が得られるようにＤＯＴＡＰをｐＵＭＶＣ３−ＧＮＥ ＤＮＡと混合した。得られた全容積は、最終容積１μｌあたり、０．５μｇ ＤＮＡ：４ｍＭ ＤＯＴＡＰの最終比率を示した。
【００４７】
細胞培養。ＧＮＥ欠失ＣＨＯ−Ｌｅｃ３細胞は、Albert Einstein College of Medicineによって提供された。細胞を、５％ＣＯ２中３７℃において、４ｍＭ Ｌ−グルタミン及び１０％熱不活性化ウシ胎児血清を補充したα−ＭＥＭ培地中で培養した。一時的形質移入用の細胞は、６ウェルプレート内に１ウェルあたり１×１０６細胞でプレーティングし、終夜培養した。Ｌｅｃ３細胞は、１継代あたり２．５％ＦＢＳの低減によって、低濃度血清条件に馴化させた。
【００４８】
一時的形質移入。ＯｐｔｉＭＥＭ（Invitrogen社製、米国California州Carlsbad所在）中で、１ウェルあたり、６時間、ＤＮＡ：脂質複合体を用いてＬｅｃ３細胞に形質移入し、その後、培地を通常のα−ＭＥＭ増殖培地に変え、細胞を終夜培養した。ＤＮＡ：脂質複合体は、製造会社のプロトコールに従って、４μｇのＤＮＡを１０μｌのLipofectamine 2000（Invitrogen社製）と混合することによって形成させた。形質移入の２４時間後に、トリプシン消化によって細胞を採取し、後続のウエスタンブロットアッセイ又は酵素／糖アッセイの前に、ＰＢＳで１回洗浄した。
【００４９】
ｍＲＮＡの定量。製造会社（Qiagen社、米国California州Valencia所在）の指示に従ってRNeasyキットを用いて、１５０万の形質移入ＣＨＯ−Ｌｅｃ３細胞から全ＲＮＡを抽出した。NanoDrop 1000分光光度計（NanoDrop社製、米国Delaware州Wilmington所在）を用いて、精製されたＲＮＡを２６０／２８０比によって定量化した。オリゴｄＴプライマー及びTaqMan逆転写キット（ABI社製、米国California州Foster City所在）を用いて、５００ｎｇの全ＲＮＡをｃＤＮＡに変換した。２５ｎｇのｃＤＮＡ及び０．２ｐＭのプライマー（ＧＮＥ−Ｆ３＝5'-cggaagaagggcattgagcatc-3'（配列番号７）及びＧＮＥ−Ｒ３＝5'-tttgtcttgggtgtcagcatcc-3'（配列番号８））と共に、Sybr Green ＰＣＲマスターミックス（ABI社製、米国California州Foster City所在）を用いて、２５μｌのＰＣＲ反応物を、既知濃度のｐＵＭＶＣ３ＧＮＥ−ｗｔ ＤＮＡの系列希釈物と比較した。Sybr Green蛍光は、iQ5リアルタイムＰＣＲ検出システム（BioRad社製、米国California州Hercules所在）と、ＰＣＲ条件：酵素を活性化するために、９５℃、１０分間、そして産物を増幅するために、（９５℃−１５秒間及び５８℃−６０秒間）×４５サイクルとを用いて検出した。４％プレキャストアガロースＥゲル（Invitrogen社製、米国California州Carlsbad所在）において、１５μｌのＰＣＲ反応物を泳動し、G-box化学発光検出システム（米国Maryland州Frederick所在）を用いて、その画像を捕捉した。
【００５０】
ウエスタンブロット。約５×１０５の細胞をウエスタンブロット分析に用いた。１％プロテアーゼ阻害剤を加えた２０μｌのCell lytic（Sigma社製、米国Missouri州St. Louis所在）を用いて細胞ペレットを溶解させた。最高速度で５分間遠心処理して細胞破片を沈殿させ、５％β−ＭＥを含有しているLaemmli緩衝液（BioRad社製、米国California州Hercules所在）と上清とを１：１で混合した。１０％の変性ゲルにおける、１００Ｖ、２時間のポリアクリルアミド電気泳動によって、タンパク質試料を分離し、その後、２時間、１００ボルトを用いてＰＶＤＦ膜に転写した。ニワトリ抗ＧＮＥ（１：１００００希釈）及びマウス抗ＧａｐＤＨ（１：５００００希釈）を用いて、ＧＮＥ及びＧａｐＤＨに関してこの膜を終夜プロービングした。ＨＲＰ標識された二次抗体を用いて、一次抗体を検出し、West Dura検出試薬（Pierce社製、米国Illinois州Rockford所在）及びG-box化学発光カメラ（Syngene社製、米国Maryland州Frederick所在）を用いてそれらを可視化した。
【００５１】
シアル酸の定量。チオバルビツル酸法による膜結合シアル酸の定量には約４×１０６の細胞を用いた。細胞を水中に再懸濁し、２５ゲージの注射針の中を２０回通過させることによって溶解させ、遠心処理した。上清はブラッドフォードタンパク質濃度推定に使用し、残ったペレットは、１００μｌの２Ｍ酢酸中に再懸濁して、複合糖質に結合したシアル酸を遊離させるために、８０℃で１時間インキュベートした。１３７μｌの過ヨウ素酸溶液（５７ｍＭ Ｈ２ＳＯ４中に２．５ｍｇ／ｍｌ）を添加して、３７℃で１５分間インキュベートした。次に、５０μｌの亜ヒ酸ナトリウム溶液（０．５Ｍ ＨＣｌ中に２５ｍｇ／ｍｌ）を添加し、管を激しく振盪させ、確実に黄色〜茶色の色が完全に消失するようにした。このステップに続いて、１００μｌの２−チオバルビツール酸溶液（７１ｍｇ／ｍｌ、ＮａＯＨでｐＨ９．０に調整されている）を添加し、試料を１００℃で７．５分間加熱した。１ｍｌのブタノール／５％１２Ｍ ＨＣｌで、この溶液から抽出を行い、遠心処置によって相分離させた。有機相の吸光度を５４９ｎｍで測定した。シアル酸の量は、タンパク質１ｍｇあたりのシアル酸の量（ｎｍｏｌ）として測定した。
【００５２】
キナーゼ活性及びエピメラーゼ活性。ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ ２−エピメラーゼ活性は、比色分析アッセイで測定した。それは、最終容積２００μｌ中に、４５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ及び可変的な量のタンパク質を含有していた。反応は、３７℃で３０分間行い、１分間の煮沸によって停止させた。Morgan-Elson法を用いて、遊離されたＭａｎＮＡｃを検出した。簡潔には、１５０μｌの試料を３０μｌの０．８Ｍ Ｈ２ＢＯ３、ｐＨ９．１と混合し、３分間煮沸した。次に、８００μｌのＤＭＡＢ溶液（酢酸／１．２５％１０Ｎ ＨＣｌ中に１％（ｗ／ｖ）４−ジメチルアミノベンズアルデヒド）を添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。吸光度を５７８ｎｍで測定した。
【００５３】
ＭａｎＮＡｃキナーゼ活性は、放射測定アッセイによって測定した。それは、最終容積２００μｌ中に、６０ｍＭ トリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．１、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ ＭａｎＮＡｃ、５０ｎＣｉ［１４Ｃ］ＭａｎＮＡｃ、１０ｍＭ ＡＴＰ及び可変的な量のタンパク質を含有していた。反応は、３７℃で３０分間行い、３００μｌのエタノールを添加して停止させた。放射標識された化合物をペーパークロマトグラフィーで分離し、放射能を液体シンチレーション計測で測定した。
【００５４】
統計的分析。酵素活性及びシアル酸発現に関して、３回の独立した実験を行った。平均及び標準偏差は、Microsoft社製のExcelを用いて計算した。スチューデントｔ検定を用いて、未処置試料との比較における各処置群のｐ値を決定した。
【００５５】
実施例１ 結果
ＧＮＥクローン。試験されたＧＮＥ ｃＤＮＡクローンには、ヒト野生型ｃＤＮＡ及び２種のヒト変異体ｃＤＮＡが含まれていた。変異体には、Ｍ７１２Ｔ ＧＮＥ欠失クローン及びＲ２６６Ｑシアル酸尿症クローンが含まれていた。シアル酸尿症は、ＧＮＥのＣＭＰシアル酸結合部位における点変異によって引き起こされたヒト疾患であり、フィードバック阻害の減失及びシアル酸の大量産生をもたらす。制限消化クローニングによって、ＧＮＥ ｃＤＮＡを、それらの元のベクターから、発現ベクターであるｐＵＭＶＣ３にサブクローニングした。定方向制限酵素消化によってクローンをスクリーニングして、ＧＮＥ挿入配列が正しい方向性になっていることを確認した。クローニングの過程中に変異が起こらなかったことを確認するために、陽性クローンは、両方の方向性で配列決定した。この結果得られたクロマトグラムを、GenBank（受託番号ＮＭ＿００５４６７）から得たＧＮＥ配列と比較した。野生型はどんな変異も示さず、一方、Ｍ７１２Ｔクローン及びＲ２６６Ｑクローンは予測された点変異のみを含有していた（図２）。陽性ｐＵＭＶＣ３−ＧＮＥクローンは、マキシプレップ（maxi prep）プラスミド精製法を用いてスケールアップし、変異が起きていないことを確認するために再度配列決定した。これらのＤＮＡストックをその後のすべての実験に用いた。
【００５６】
遺伝子タンパク質発現。プラスミドＵＭＶＣ３−ＧＮＥ ＤＮＡを、ＣＨＯ−Ｌｅｃ３細胞に一時的に形質移入し、１０％血清中で２４時間培養し、その後、細胞を採取し、組換え体ＧＮＥ発現があるかどうか分析した。ＧＮＥウエスタンブロットによって、未処置のＬｅｃ３細胞（形質移入されなかった）はＧＮＥを発現せず、様々なｐＵＭＶＣ３クローンで形質移入されたＣＨＯ−Ｌｅｃ３細胞は高レベルの組換え体ＧＮＥを発現することが示された（図３）。発現レベルは、ＧＮＥアイソフォームに関係なく、比較的同等であった。第２の実験では、ＣＨＯ細胞が培地からシアル酸を組み込む能力を有するため、１０％又は２．５％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）中で培養したＣＨＯ−Ｌｅｃ３細胞に形質移入を行った後、組換え体ＧＮＥを発現させた。この場合も、ＧＮＥタンパク質発現は、ＧＮＥアイソフォーム及びＦＢＳの濃度に関係なく、比較的同等であった（図４）。
【００５７】
ｗｔ−ＧＮＥ ｍＲＮＡの定量。ＣＨＯ−Ｌｅｃ３細胞を１０％血清中で培養し、それらに、２４時間かけて、ｐＵＭＶＣ３−ＧＮＥ−ｗｔ ＤＮＡで一時的に形質移入し、発現された組換え体ＧＮＥ ＲＮＡの量を定量した。全ＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ｑＰＣＲを行って、ＧＮＥ転写産物由来の２３０ｂｐ断片を増幅した。ｐＵＭＶＣ３−ＧＮＥ−ｗｔの系列希釈を用いて、形質移入されたＬｅｃ３細胞で発現されたＧＮＥ−ｗｔの濃度が４．１ｐｇ／μｌに等しかったと決定した。ｑＰＣＲのダイナミックレンジは、５ｎｇ〜５ｆｇであり、対照（形質移入されていない）ＣＨＯ−Ｌｅｃ３細胞では、ＧＮＥ ｍＲＮＡ産物が検出されなかった（形質移入されていない細胞のｃＴ値は４２サイクル超であったが、これは５ｆｇ未満である）。したがって、組換え体ＧＮＥ ｍＲＮＡ発現は、形質移入されたＬｅｃ３細胞では検出されたが、形質移入されていない細胞は、検出可能な量のＧＮＥ ｍＲＮＡを有していなかった（図５）。
【００５８】
ＧＮＥ酵素アッセイ。ウエスタンブロットアッセイに加えて、酵素活性に関しても、形質移入された細胞のペレットのアリコートをアッセイした。下記表２に示す通り、組換え体ＧＮＥタンパク質を有するＬｅｃ３細胞又はこれを有しないＬｅｃ３細胞で、エピメラーゼ活性及びキナーゼ活性の両方を定量した。
【００５９】
【表２】
【００６０】
Ｌｅｃ３細胞のみでは、エピメラーゼ活性及びキナーゼ活性は両方とも３ｍＵ／ｍｇ未満であり、これはバックグランド活性を示すものである。野生型、Ｍ７１２Ｔ又はＲ２６６Ｑ ＧＮＥを発現する細胞は、それぞれ、平均で２２、３１及び２６ｍＵ／ｍｇのエピメラーゼ活性を有した。同じＬｅｃ３試料は、平均で３５、３７及び３３ｍＵ／ｍｇのキナーゼ活性を示した。組換え体ＧＮＥを発現する細胞のすべてが、未処置の細胞より有意に高い酵素活性を有し、エピメラーゼ活性及びキナーゼ活性の両方に関してｐ値が０．００６以下であった。３種の異なったＧＮＥアイソフォーム間では、酵素活性に統計的な相違がなく、ｐ値は０．１１〜０．４７の範囲にあった。
【００６１】
シアル酸アッセイ。細胞表面のシアル酸発現に関しても、形質移入されたＬｅｃ３細胞を試験した。Ｒ２６６Ｑ ＧＮＥで形質移入されたＬｅｃ３細胞は１．５倍多い量を有していたが、それを除いて、すべてのＬｅｃ３試料が約６．０ｎｍｏｌ／ｍｇの膜結合シアル酸を有していた。Ｒ２６６Ｑ変異体は、ＧＮＥのフィードバック阻害を欠失しており、細胞内シアル酸の過剰産生を引き起こすことが知られている。Ｌｅｃ３細胞は、シアル酸付加過少（undersialylated）のようであり、これは、野生型ＣＨＯ細胞と比較して約１００倍の野生型ＧＮＥの過剰発現によってではなく、シアル酸尿症変異体の発現によってのみ克服できた。
【００６２】
野生型（ｗｔ）ＧＮＥとＭ７１２Ｔ ＧＮＥとの間では相違が観察されなかった。ＦＢＳ由来のシアル酸によって欠陥のあるＧＮＥ経路がバイパスされうることが知られているので、これは、細胞培地からのシアル酸の取り込みによるものであった可能性が高い。この場合、野生型とＭ７１２Ｔとの間での相違がこのバイパスによって遮蔽されていたのかもしれない。それゆえ、培地中の血清（ＦＢＳ）のパーセントを低減させることによって、細胞培養条件を改変した。下記表３に示す通り、血清レベルが低減するのに従って、シアル酸産生が低減し、２．５％ＦＢＳで顕著な低減が実証された。
【００６３】
【表３】
【００６４】
細胞培地が無血清条件に近づくにつれて、シアル酸レベルが低減し続けたが、細胞形態及び増殖特性は変化しなかった。Ｌｅｃ３細胞でＧＮＥ遺伝子形質移入の影響を試験するためには、２．５％ＦＢＳ濃度の細胞培地が最適であると決定された。したがって、Ｌｅｃ３細胞を２．５％ＦＢＳ中で培養し、ｐＵＭＶＣ３−ＧＮＥクローンで形質移入した。ＧＮＥ発現は、ウエスタンブロットで同時に確認した（図４）。シアル酸産生の有意な増大が実際に実証され、この場合も、Ｒ２２６Ｑ変異体の影響が最も大きかった（図６：ＧＮＥ−ｗｔではｐ＝０．０１５７；ＧＮＥ Ｒ２６６Ｑではｐ＝０．０５６６）。ｗｔ ＧＮＥとＭ７１２Ｔ ＧＮＥとの間でのわずかではあるが、有意な相違が観察された。これは、変異体のシアル酸再付加能力が野生型のものより低いことを示しており、ＨＩＢＭ筋におけるものに類似した作用機序を示唆している。
【００６５】
筋機能の欠損をもたらしうる、筋膜におけるグリコシル化障害に関連した、ＧＮＥ遺伝子内の変異が、ＨＩＢＭ２に関する研究によって明らかにされる。ＨＩＢＭ２におけるＧＮＥ活性の減失がシアル酸産生を損ない、複合糖質の適切なシアル酸付加を妨げていると考えられている。レクチンへの反応性も、一部の筋繊維で可変的であり、これは、筋内の低シアル酸付加及び異常なグリコシル化が患者の罹患筋組織における自己貪食液胞及び／又はアミロイド沈着物の局限的蓄積に寄与している可能性があると示唆している。以上の例は、ＧＮＥ欠失ＣＨＯ−Ｌｅｃ３細胞における、ｍＲＮＡ発現及びタンパク質発現用の新規なＧＮＥ遺伝子／ＣＭＶプロモータープラスミドの効果を実証するものである。このプラスミドが、ＧＮＥ／ＭＮＫ酵素機能と、それに続くシアル酸産生の誘導とを回復できることが示された。
【実施例２】
【００６６】
外因性ＧＮＥのインビボ発現
以下の例は、本明細書に記載のＧＮＥコード配列が、生存マウスに形質移入する能力、及びそのようなマウスの筋組織でＧＮＥ発現を刺激する能力を実証するものである。
【００６７】
ＤＮＡ：脂質複合体。この実施例で使用された物質には、ｐＵＭＶＣ３−ｗｔ−ＤＮＡ（図１）及び１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）：コレステロール（ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ，1,2-Dioleoyl-3-Trimethylammonium-Propane:Cholesterol）が含まれており、これらが、合わせて脂質ナノ粒子／ＤＮＡ複合体に相当する。この実施例で使用されたＤＮＡ：脂質複合体は、ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌを試験ＤＮＡ（野生型、Ｍ７１２Ｔ又はＲ２６６Ｑ ｐＵＭＶＣ３−ＧＮＥ）と室温で混合することによって生成させた。ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌは、Avanti Polar Lipids社（米国Alabama州Alabaster所在）によって販売されている市販の脂質粒子である。望ましい全容積が得られるように、ＤＯＴＡＰ：ＣｈｏｌをｐＵＭＶＣ３−ＧＮＥ ＤＮＡと混合した。全容積は、最終容積１μｌあたり０．５μｇ ＤＮＡ対、４ｍＭ ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌという最終比率を示した。
【００６８】
筋肉内毒性。各セットが６匹のメスマウス及び６匹のオスマウスからなる１セットのマウス（週齢１０〜１２週、名目上２０ｇのＢＡＬＢ／ｃマウス）に、（１）Plasma-Lyte（登録商標）中に再構成した１０μｇ（８０μｌ）のＧＭＰ ＤＮＡ、（２）Plasma-Lyte（登録商標）中に再構成した４０μｇ（８０μｌ）のＧＭＰ ＤＮＡ、又は（３）０μｇ（８０μｌ）のＧＭＰ ＤＮＡ（対照として働き、空のリポソーム及びPlasma-Lyte（登録商標）からなっていた）を与えた。もう１セットのマウスは、全く注射されず、追加の対照として働いた。単回の注射を行い、注射の２週間後にマウスを屠殺し、それらの臓器及び体液を採取した。毒性は、注射後２４〜４８時間、１週間及び２週間に評価した。毒性は、筋組織の血清化学プロフィール、ＣＢＣ分析、総毒性及び免疫組織化学分析に基づいて評価した。
【００６９】
図７に示す通り、上述した組成物を与えられたマウスはいずれも、注射後２４時間、４８時間、１週間又は２週間で毒性を示さなかった。
【００７０】
静脈内毒性。各セットが６匹のメスマウス及び６匹のオスマウスからなる１セットのマウス（週齢１０〜１２週、名目上２０ｇのＢＡＬＢ／ｃマウス）に、（１）Plasma-Lyte（登録商標）中に再構成した１０μｇ（２００μｌ）のＧＭＰ ＤＮＡ、（２）Plasma-Lyte（登録商標）中に再構成した４０μｇ（２００μｌ）のＧＭＰ ＤＮＡ、（３）Plasma-Lyte（登録商標）中に再構成した１００μｇ（２００μｌ）のＧＭＰ ＤＮＡ、又は（４）０μｇ（２００μｌ）のＧＭＰ ＤＮＡ（対照として働き、空のリポソーム及びPlasma-Lyte（登録商標）からなっていた）も与えた。静脈内投与を行い、投与の２週間後にマウスを屠殺し、それらの臓器及び体液を採取した。毒性は、注射後２４〜４８時間、１週間及び２週間に評価した。毒性は上述の通りに評価した。
【００７１】
図８に示す通り、１０μｇのＧＭＰ ＤＮＡを与えたマウスはいずれも、注射後２４時間、４８時間、１週間又は２週間に毒性を示さず、２匹のメスマウスのみが投与後２４時間に急性毒性を示した（他のすべての時点において、他のすべてのマウスが、毒性のどんな徴候も示さなかった）。再度、図８を参照すると、１００μｇを与えた３匹のメスマウスが投与後２４時間で死亡し、別のメスマウスは投与後４８時間で死亡した。６匹のオスはすべて投与後２４時間で急性毒性を示した。しかし、これら６匹のマウスはすべて生き残り、投与後の４８時間、１週間又は２週間には毒性の徴候を示さなかった。図９は、ＧＭＰグレードＤＮＡ（Plasma-Lyte（登録商標）中に再構成したもの）を静脈内注射されたこれらのマウスの生存データを要約するものである。
【００７２】
Plasma-Lyte（登録商標）と水との比較。ＧＮＥコード配列をその中に配置できる好ましい担体を特定するために、Plasma-Lyte（登録商標）と水との間における毒性の比較を行った。Plasma-Lyte（登録商標）は、静脈内投与に使用できる無菌の非発熱性等張液である。容積各１００ｍＬあたり、５２６ｍｇの米国薬局方塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、５０２ｍｇのグルコン酸ナトリウム（Ｃ６Ｈ１１ＮａＯ７）、３６８ｍｇの米国薬局方酢酸ナトリウム三水和物（Ｃ２Ｈ３ＮａＯ２・３Ｈ２Ｏ）、３７ｍｇの米国薬局方塩化カリウム（ＫＣｌ）及び３０ｍｇの米国薬局方塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ）を含有している。Plasma-Lyte（登録商標）は、抗菌剤を含有していない。ｐＨは、水酸化ナトリウムによって、約７．４（６．５〜８．０）に調整することが好ましい。
【００７３】
図１０〜１２を参照すると、４匹のマウスからなる群に、Plasma-Lyte（登録商標）中に再構成されたＧＭＰ−ＧＮＥ ４０μｇ、１０μｇ又は０μｇを筋肉内注射で与えるか（図１０）；Plasma-Lyte（登録商標）中に再構成したＧＭＰ−ＧＮＥ １００μｇ、４０μｇ、１０μｇ又は０μｇを静脈内注射で与えるか（図１１）；或いは水中に再構成した１００μｇ、４０μｇ又は０μｇのＧＭＰ−ＧＮＥを静脈内注射で与えた（図１２）。水中に再構成したＧＭＰ−ＧＮＥ（図１２）と比較して、Plasma-Lyte（登録商標）中に再構成したＧＭＰ−ＧＮＥ（図１０〜１１）は有意に改善された（より低い）毒性学的性質を示した。
【００７４】
マウスにおけるＧＮＥ発現。各セットが４匹のマウスを含む、週齢１０〜１２週、名目上２０ｇのＢＡＬＢ／ｃマウス３セットに、様々な量のＧＮＥコード組成物、すなわち配列番号９によって表されるｐＵＭＶＣ３−ｗｔ−ＤＮＡコンストラクト（図１）及び１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）：コレステロール（合わせて上述の脂質ナノ粒子／ＧＮＥコード複合体に相当する）の筋肉内注射を施した。
【００７５】
この例では、第１群には、０μｇのＧＮＥコードＤＮＡを注射し、第２群には、１０μｇのＧＮＥコードＤＮＡを注射し、第３群には、４０μｇのＧＮＥコードＤＮＡを注射した。注射の２週間後にマウスを屠殺し、注射された筋組織を採取した。
【００７６】
次に、全ＲＮＡを筋組織から収集した。次に、各試料中に含有されていたＧＮＥ ｍＲＮＡ転写産物の量を、ＧＮＥ特異的なプライマーを用いて（そして、様々な量の既知濃度ＲＮＡを用いて標準曲線を作成し、これを、各試験試料中のＧＮＥ ｍＲＮＡの定量的な量を推定するのに用いた）、ＲＴ−ＰＣＲを介して測定した。下記表４は、ＲＴ−ＰＣＲによって測定された平均のＧＮＥ ｍＲＮＡ量（ｎｇ）（３つの各群内の２匹のマウスから得られたもの）を要約したものである。
【００７７】
【表４】
【００７８】
これらのデータを、さらに図１３に要約する。図１３は、各群（０、１０及び４０μｇのＧＮＥコードＤＮＡ）に関して測定し、ＲＮＡが抽出された筋組織の総量に対して標準化したＧＮＥ ｍＲＮＡの量を示す。図１３に示す通り、ＧＮＥコードＤＮＡ １０μｇの投与は有意なレベルのＧＮＥ発現をもたらし（０μｇの試料と比較して１８２倍のＧＮＥ発現レベルの増大）、ＧＮＥコードＤＮＡ ４０μｇの投与はさらに大きなレベルのＧＮＥ発現をもたらした（０μｇの試料と比較して１１１５倍のＧＮＥ発現レベルの増大）。これらのデータは、図１４のゲルに示すＰＣＲ結果と一致する。
【００７９】
本明細書に本発明の例示的な実施形態を記載したが、本発明が、記載されたものに限定されず、当業者ならば本発明の範囲又は趣旨から逸脱せずに他の様々な改変又は修正を行えることを理解するべきである。
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００７年２月７日出願の米国特許仮出願第６０／９００,０３４号の優先権を主張し、参照により組み込むものである。
【０００２】
本発明の分野は、系中でのシアル酸産生を調節する方法及び組成物に関する。本発明の分野はさらに、遺伝性封入体ミオパチー及び／又はその症状を治療及び／又は予防する方法及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
遺伝性封入体ミオパチー（ＨＩＢＭ２，Hereditary Inclusion Body Myopathy）は、慢性の進行性骨格筋消耗障害であり、通常、年齢５０歳になる前に完全な身体障害をもたらす。現在、ＨＩＢＭ２に有効な治療処置は存在しない。この疾患の発症は、常染色体劣性変異のファミリーメンバーであるＧＮＥ遺伝子の発現に関係しており、ＧＮＥ遺伝子は、二機能性酵素であるＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ ２エピメラーゼ／ＭａｎＮＡｃキナーゼ（ＧＮＥ／ＭＮＫ，UDP-GlcNAc 2-epimerase / ManNAc kinase）をコードする。この酵素は、シアル酸生合成の最初の２ステップを触媒する律速二機能性酵素である。シアル酸産生の低減は、その結果として、極めて重要な筋タンパク質であるα−ジストログリカン（α−ＤＧ，alpha-dystroglycan）を含めた様々な糖タンパク質へのシアル酸付加の低減をもたらす。今度はこれが、筋機能の重度の不自由を引き起こし、その症候群の発症をもたらす。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の特定の実施形態によれば、系中でシアル酸の産生を調節する方法であって、系に野生型ＧＮＥコード核酸配列を与えるステップを含む方法を提供する。そのような実施形態によれば、系は、細胞、筋組織又は他の望ましい標的を含みうる。同様に、本発明は、変異型内因性ＧＮＥコード配列を含む系に野生型ＧＮＥを導入し、発現させる方法を包含する。換言すれば、本発明は、機能的な野生型ＧＮＥコード配列を、例えば変異型（欠陥を有する）ＧＮＥコード配列を有する細胞又は筋組織に与えるステップを含む。
【０００５】
本発明の追加の実施形態によれば、遺伝性封入体ミオパチーの影響を治療し、予防し、且つ／又は寛解させる方法が提供される。そのような方法は、通常、患者に野生型ＧＮＥコード核酸配列を与えるステップを含む。野生型ＧＮＥコード核酸配列は、筋肉注射又は静脈内投与によって、脂質ナノ粒子と共に患者に送達してもよい。
【０００６】
本発明のさらに別の実施形態によれば、系中で野生型ＧＮＥを発現するための新規な組成物が提供される。組成物は、脂質ナノ粒子内に配置され、又は脂質ナノ粒子に連結されている野生型ＧＮＥコード核酸配列を含むことが好ましい。脂質ナノ粒子は、筋細胞、筋組織又はこれらの構成成分を認識して、それらに結合できる作用物質で装飾されていてもよい。
【０００７】
この特許出願のファイルは、有色で作成された少なくとも１つの図を含有している。この特許の、有色図（複数可）を含むコピーは、請求及び必要な料金の支払いに応じて、米国特許商標局が提供するであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本明細書に記載のｐＵＭＶＣ３−ＧＮＥ発現ベクターの図である。
【図２】ＧＮＥ ｗｔ（ＮＢ８）、Ｍ７１２Ｔ（ＭＢ１８）及びＲ２６６Ｑ（Ｒ２６６Ｑ）の配列アラインメントを示す図である。元のＤＮＡ配列をアミノ酸配列に変換して、その中に位置する変異を図示した。
【図３】１０％血清中で培養されたＣＨＯ−Ｌｅｃ３細胞におけるＧＮＥ発現を示すゲル画像である。レーン１：未処置のＬｅｃ３細胞。レーン２：ｗｔ ＧＮＥ。レーン３：Ｍ７１２Ｔ ＧＮＥ。レーン４：Ｒ２６６Ｑ ＧＮＥ。
【図４】ＣＨＯ−Ｌｅｃ３細胞系におけるＧＮＥ発現を示すウエスタンブロット画像である。レーン１〜４：１０％ＦＢＳ中で培養されたＣＨＯ−Ｌｅｃ３細胞。レーン５〜８：２．５％ＦＢＳ中で培養されたＣＨＯ−Ｌｅｃ３細胞。レーン１及び５：未処置のＬｅｃ３細胞。レーン２及び６：ｗｔ ＧＮＥ。レーン３及び７：Ｍ７１２Ｔ ＧＮＥ。レーン４及び８：Ｒ２６６Ｑ ＧＮＥ。
【図５】形質移入されたＣＨＯ−Ｌｅｃ３細胞では、ＧＮＥ ｍＲＮＡが発現されているが、対照細胞では発現されていないことを示すゲル画像である。レーン１〜４は、連続希釈されたｐＵＭＶＣ３−ＧＮＥ−ｗｔ ＰＣＲ産物１５μｌを含有しており、これを用いて、Ｌｅｃ３試料中に存在するＧＮＥ ｍＲＮＡの量を定量した。レーン５〜６は、形質移入されているか、形質移入されていないＬｅｃ３細胞からのＰＣＲ産物１５μｌを含有している。
【図６】２．５％ＦＢＳの存在下で培養されたＣＨＯ−Ｌｅｃ３細胞内のＧＮＥ発現によって、シアル酸産生が刺激されることを示す棒グラフである。未処置のＬｅｃ３細胞（「ブランク」）と比較して、ＧＮＥ−ｗｔ（ｐ＝０．０１５７）形質移入の後では、シアル酸産生が有意に大きくなっていた。ＧＮＥ−Ｒ２６６Ｑ（ｐ＝０．０５６６）及びＧＮＥ−Ｍ７１２Ｔ（ｐ＝０．０７０８）は、有意性に接近していた。
【図７】ＧＭＰ ＤＮＡ複合体の筋肉内注射を用いた、本明細書に記載の毒性試験を要約する表である。
【図８】ＧＭＰ ＤＮＡ複合体の静脈内注射を用いた、本明細書に記載の毒性試験を要約する表である。
【図９】ＧＭＰ ＤＮＡ複合体の静脈内注射を用いた、本明細書に記載の毒性試験を要約する線グラフである。
【図１０】Plasma-Lyte（登録商標）中におけるＧＭＰ−ＧＮＥの筋肉内注射を施されたマウスの生存率を要約する線グラフである。
【図１１】Plasma-Lyte（登録商標）中におけるＧＭＰ−ＧＮＥの静脈内注射を施されたマウスの生存率を要約する線グラフである。
【図１２】水中におけるＧＭＰ−ＧＮＥの静脈内注射を施されたマウスの生存率を要約する線グラフである。
【図１３】異なった量のＧＮＥコードＤＮＡを投与された３つの異なる群のマウスにおける、筋組織内のＧＮＥ発現を要約する棒グラフである。各群には、２匹の異なったマウスが含まれていた。
【図１４】本明細書に記載のＧＮＥコード配列を注射されたマウスから得られたＧＮＥ ｍＲＮＡを示すゲル画像である。
【０００９】
配列表の簡単な説明
配列番号１〜６は、下記表１に示すＰＣＲプライマーの核酸配列である。
【００１０】
配列番号７〜８は、ＧＮＥ特異的ＰＣＲプライマーである。
【００１１】
配列番号９は、本明細書に記載し、且つ図１に示すＰＵＭＶＣ３−ｗｔ−ＤＮＡコンストラクトの核酸配列である。
【００１２】
配列番号１０は、ＰＵＭＶＣ３−ｗｔ−ＤＮＡコンストラクト内に含有されているＧＮＥコード配列である。
【００１３】
配列番号１１は、ＧＮＥの野生型アミノ酸配列である。
【００１４】
配列番号１２は、ＧＮＥ−Ｒ２６６Ｑの改変核酸配列である。
【００１５】
配列番号１３は、ＧＮＥ−Ｒ２６６Ｑの改変アミノ酸配列である。
【００１６】
配列番号１４は、ＧＮＥ−Ｍ７１２Ｔ（ＨＩＢＭ２を引き起こす変異）の変異型核酸配列である。
【００１７】
配列番号１５は、ＧＮＥ−Ｍ７１２Ｔ（ＨＩＢＭ２を引き起こす変異）の変異型アミノ酸配列である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の特定の実施形態によれば、系中でのシアル酸産生を調節する方法が提供される。この方法は通常、系に野生型ＧＮＥコード核酸配列を与えるステップを含む。野生型ＧＮＥコード核酸配列は、それに作動可能に連結されたプロモーターを含むことが好ましい。プロモーターは、機能的であり、且つ標的細胞内（又は標的の細胞外空間）でＧＮＥコード核酸配列の発現を促進できるものであることが好ましい。ＧＮＥコード配列に作動可能に連結できるプロモーターの非限定的な一例はＣＭＶプロモーターであり、これは、ＰＵＭＶＣ３−ｗｔ−ＤＮＡコンストラクトの野生型ＧＮＥコード核酸配列に作動可能に連結されていることが示されている（図１）。
【００１９】
本明細書で使用される場合、「ＧＮＥコード核酸配列」、「野生型ＧＮＥコード配列」及び「ＧＮＥコード配列」という用語、並びに同様な用語は、配列番号１１のアミノ酸配列によって表される、野生型の二機能性酵素ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ ２−エピメラーゼ／ ＭａｎＮＡｃキナーゼ（ＧＮＥ／ＭＮＫ）をコードする核酸配列を指す。ＧＮＥコード配列は、配列番号１０など、ＧＮＥの野生型をコードする核酸配列のみを含みうる。その代わりに、ＧＮＥコード配列は、プロモーター、終止配列及び／又は他のエレメントなどの他の転写調節エレメントと共に、ＧＮＥの野生型をコードする核酸配列を含みうる。そのようなＧＮＥコード配列の非限定的な一例は、図１に示すｐＵＭＶＣ３ ＧＮＥコンストラクトであり、これは配列番号９の核酸配列からなる。
【００２０】
「ＧＮＥコード核酸配列」、「野生型ＧＮＥコード配列」及び「ＧＮＥコード配列」という用語、並びに同様な用語は、遺伝コードの縮重によって、本明細書に添付された配列表に示す配列のいずれに示されている配列とも同一ではないが、それでもなお野生型ＧＮＥのアミノ酸配列（配列番号１１）をコードしている核酸配列又は異なったアミノ酸配列をコードする改変核酸配列を、その結果得られるＧＮＥタンパク質が同じ野生型ＧＮＥタンパク質の活性を実質的に保持している（又は改善されている）という条件で、さらに含むことを意味する。そのような改変ＧＮＥタンパク質の非限定的な例には、本明細書に記載のＧＮＥアイソフォームＲ２６６Ｑ（配列番号１３）が含まれる。すなわち、１つのアミノ酸が類似のアミノ酸に置換されるようなやり方で野生型ＧＮＥタンパク質のアミノ酸配列を改変するＧＮＥコード配列の改変、及びその変化（それが置換、欠失又は挿入であるかにかかわらず）がＧＮＥタンパク質の活性部位に負の影響を与えないため、ＧＮＥ活性に実質的に負の影響を与えない他の改変も本発明に包含される。
【００２１】
本明細書で使用される場合、「系」という用語は、どんなタイプの細胞も生物も含めた、本明細書に記載のＧＮＥコード配列を受容することができるどんな生物系も指す。加えて、「系」には、生物体内の細胞間隙も含まれうる。
【００２２】
本発明の特定の実施形態によれば、ＧＮＥコード配列は、適切な担体又は送達媒体の中に配置してもよく、又はそれに連結させてもよい。脂質担体（脂質ナノ粒子）、ウイルスベクター、生分解性重合体、重合体ミクロスフェア（例えば５０ｎｍ又はそれ未満）及び様々な結合系、並びに関連のサイトフェクチン(cytofectin)の使用を含めた、様々な戦略を用いて、本明細書に記載のＧＮＥコード配列を標的細胞内に送達できる。
【００２３】
リポソーム又は他の粒子形成組成物を使用したものは、本明細書に記載のＧＮＥコード配列の好ましい送達媒体である。リポソームは、細胞内取り込みを改善する一方で、本明細書に記載のＧＮＥコード配列などの生体分子を分解から保護するので、魅力的な担体である。ポリアニオン（例えばＤＮＡ）を送達するための、最も一般的に使用されている種類のリポソーム製剤は、陽イオン性脂質を含有するものである。
【００２４】
単独又は他の脂質及びホスファチジルエタノールアミンなどの両親媒性物質を含有する陽イオン性脂質を用いた高分子で、脂質集合体を形成させてもよい。脂質製剤の組成と、その調製方法との両方が、その結果得られる陰イオン性高分子−陽イオン性脂質集合体の構造及びサイズに影響を有することが当技術分野でよく知られている。インビトロ及びインビボにおける特定の細胞型へのポリアニオンの送達を最適化するために、これらの因子を調節することができる。
【００２５】
本明細書に記載のＧＮＥコード組成物を細胞送達するのに陽イオン性脂質を使用することは、いくつかの利点を有する。陽イオン性脂質を用いた陰イオン組成物の封入は、静電的相互作用により本質的に定量的である。加えて、陽イオン性脂質は陰電荷の細胞膜と相互作用して、それによって細胞膜輸送を開始させると考えられている。
【００２６】
プラスミドＤＮＡを小粒子内に封入することができ、それらの小粒子は通常、二重層脂質小胞中に封入された単一のプラスミドからなることが実験によって示された（Wheeler, et al., 1999, Gene Therapy 6, 271-281）。これらの粒子はしばしば、融合誘導脂質であるジオレオイルフォスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ，dioleoylphosphatidylethanolamine）及び低レベルの陽イオン性脂質を含有し、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ，poly(ethylene glycol)）コーティングの存在によって水性溶媒中に安定化することができる。
【００２７】
これらの脂質粒子は、それらが静脈内（ｉ．ｖ．，intravenous）注射の後に、延長された循環寿命を示すので、全身性の適用を有し、様々な組織及び臓器に、そのような領域の血管透過性を強化することにより選択的に蓄積させることができ、且つエンドソーム膜の破壊によってエンドサイトーシスのリソソーム経路を回避するように設計することができる。これらの特性は、実験上及び治療上の適用のため、ＧＮＥコード配列などの生理活性分子を、筋組織細胞などの様々な細胞型に送達するのに有用となりうる。様々な脂質核酸粒子及びそれの調製方法は、参照によりすべて全体として本明細書に組み込まれている、米国特許出願公開第２００８−００２００５８号、第２００３−００７７８２９号、第２００３−０１０８８８６号、第２００６−００５１４０５号、第２００６−００８３７８０号、第２００３−０１０４０４４号、第２００６−００５１４０５号、第２００４−０１４２０２５号、第２００６−００８３７８８０号、第２００５−００６４５９５号、第２００５−０１７５６８２号、第２００５−０１１８２５３号、第２００５−０２５５１５３号及び第２００５−０００８６８９号明細書、並びに米国特許第５８８５６１３号、第６５８６００１号、第６８５８２２５号、第６８５８２２４号、第６８１５４３２号、第６５８６４１０号、第６５３４４８４号及び第６２８７５９１号明細書に記載されている。
【００２８】
本発明は、ＧＮＥコード配列及び／又はそれらと共に使用される附随送達媒体を特定の細胞型、例えば筋細胞及び筋組織などに向けてターゲッティングできることを示す。例えば、多くの特異的相互作用によって、リポソームナノ粒子が細胞表面に結合するように方向付けることができる。この結合は、詳細に理解されているいくつかの細胞進入経路の１つによる、細胞内へのＤＮＡの取り込みを促進する。これらの相互作用による、ナノ粒子（例えばリポソーム）の迅速な隔離は、末梢循環内にそれらが存在している時間を短縮し、それによって、分解及び非特異的な取り込みの可能性を低減する。一般的なターゲッティング作用物質には、細胞表面のトランスフェリン受容体（ＴｒｆＲ，transferrin receptor）に結合するトランスフェリン（Ｔｒｆ，transferrin）、又は細胞表面のＴｒｆＲに結合する抗体（若しくはその誘導体）の使用が含まれるが、これらに限定されない。筋肉は、その細胞表面に比較的高濃度のＴｒｆＲを有する。隔離に用いる別の標的は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ，epidemal growth factor receptor）であり、これは、筋細胞及び他の上皮様細胞型の表面に広く存在している。Erbitux（ヒトでの使用が承認されているＥＧＦＲモノクローナル抗体）は、ＥＧＦＲターゲッティング用の例示的な作用物質であり、これも、本明細書に記載のリポソームナノ粒子を装飾するのに使用できる。追加のターゲッティング部分は、筋細胞上にのみ存在する（又は筋細胞に、より限定されている）特定の標的を認識して、それらに結合するレクチン又は小分子（ペプチド又は糖）でありうるが、これらに限定されない。より小さい（且つ、より高親和性でありうる）分子の利点は、それらが、使用するナノ粒子の表面に、より高密度で存在しうるであろうということである。
【００２９】
本明細書に記載のＧＮＥコード配列は、適切な送達媒体（リポソーム又は脂質ナノ粒子など）と共に、系に送達することが好ましく、よく知られている様々な技法のうちの任意のものを用いて、系に投与できる。例えば、哺乳動物の場合には、非経口注射を介して、ＧＮＥコード配列を哺乳動物に投与できる。本明細書で使用される場合、「非経口」という用語には、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑液包内又は注入技法が含まれる。
【００３０】
ＧＮＥコード配列及び関連の組成物は、毒性がなく薬学的に許容される、任意の従来の担体、アジュバント又は媒体を含有しうる。場合によっては、薬学的に許容できる酸、塩基又は緩衝剤によって、製剤のｐＨを調整して、処方された組成物又はその送達型の安定性を強化できる。例えば、既知な技術に従い、適した分散剤若しくは湿潤剤及び懸濁剤を用いて、注射用の無菌水性懸濁液又は油性懸濁液を処方できる。無菌注射用製剤は、毒性のない非経口的に許容される希釈剤又は溶媒中の無菌注射用溶液、懸濁液若しくは乳剤でよい。利用することができる許容される媒体及び溶媒には、水、米国薬局方リンゲル液及び等張食塩液が含まれる。加えて、無菌不揮発性油が、従来、溶媒又は懸濁媒として利用されている。この目的には、合成のモノグリセリド又はジグリセリドを含めたどんな無刺激不揮発性油も利用できる。加えて、注射用製剤中で、オレイン酸などの脂肪酸を用いてもよい。
【００３１】
特定の実施形態によれば、Plasma-Lyte（登録商標）（Baxter Laboratories社製、米国Illinois州Morton Grove所在）担体を利用して、とりわけ非経口注射用に、ＧＮＥコード配列を送達するのに使用できる。Plasma-Lyte（登録商標）は、静脈内投与に使用できる無菌の非発熱性等張液である。容積各１００ｍＬあたり、５２６ｍｇの米国薬局方塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、５０２ｍｇのグルコン酸ナトリウム（Ｃ６Ｈ１１ＮａＯ７）、３６８ｍｇの米国薬局方酢酸ナトリウム三水和物（Ｃ２Ｈ３ＮａＯ２・３Ｈ２Ｏ）、３７ｍｇの米国薬局方塩化カリウム（ＫＣｌ）及び３０ｍｇの米国薬局方塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ）を含有している。Plasma-Lyte（登録商標）は、抗菌剤を含有していない。ｐＨは、水酸化ナトリウムによって、約７．４（６．５〜８．０）に調整することが好ましい。
【００３２】
例えば、ＧＮＥコード配列を送達するのに使用される注射用製剤は、細菌保持フィルターを通した濾過によって、又は無菌固体組成物の形態で無菌化剤を組み入れることによって、無菌化することができ、この無菌固体組成物は、使用する前に、滅菌水、Plasma-Lyte（登録商標）又は他の無菌注射用媒体中に溶解又は分散させることができる。
【００３３】
系内におけるＧＮＥコード配列の発現を長期化する（又はその影響を長期化する）ために、皮下注射又は筋肉内注射からの組成物の吸収を遅くすることが望ましい場合がある。これは、水溶性が乏しい結晶性又は非晶質の物質の液体懸濁液を使用することによって実現できる。その場合、組成物の吸収速度は、溶解速度に依存しうる。この溶解速度は、さらに、結晶のサイズ及び結晶形態に依存しうる。
【００３４】
別法では、油性媒体中に組成物を溶解又は懸濁させることによって、非経口的に投与されたＧＮＥコード配列の吸収の遅延を実現させることができる。注射用のデポー剤形は、ポリラクチド−ポリグリコリドなどの生分解性重合体に入れたＧＮＥコード配列のマイクロカプセルマトリックスを生成することによって調製できる。ＧＮＥコード配列物質対重合体の比率及び使用する特定の重合体の性質に応じて、ＧＮＥコード配列の放出速度を制御することができる。他の生分解性重合体の例には、ポリ（オルトエステル）及びポリ（無水物）が含まれる。上述の通り、デポー剤注射用製剤は、筋組織などの標的体組織に適合したリポソーム中に（又はマイクロエマルション中にさえ）ＧＮＥコード配列を捕捉することによっても調製できる。
【００３５】
系中でのシアル酸産生を調節する方法に加えて、本発明はさらに、系中で野生型ＧＮＥを産生する方法を包含する。そのような実施形態によれば、系（例えばヒト患者の筋細胞）は、変異型の内因性ＧＮＥコード配列（例えば配列番号１４のＧＮＥ−Ｍ７１２Ｔ配列）を含みうる。換言すれば、本発明は、機能的な野生型ＧＮＥコード配列を、例えば変異型の（欠陥を有する）ＧＮＥコード配列を有する細胞又は筋組織に与えるステップを含む。野生型ＧＮＥコード配列は、例えば本明細書に記載のリポソーム又は脂質ナノ粒子を用いて、非経口注射によってそのような系に送達することができる。
【００３６】
本発明の追加の関連実施形態によれば、遺伝性封入体ミオパチー（ＨＩＢＭ２）の影響を治療し、予防し、且つ／又は寛解させる方法が提供される。そのような方法は、通常、治療有効量の野生型ＧＮＥコード核酸配列を患者に与えるステップを含む。特定の実施形態では、好ましくは、非経口注射によって、脂質ナノ粒子、及びPlasma-Lyte（登録商標）の担体に類似した担体と共に、野生型ＧＮＥコード核酸配列を患者に送達することができる。
【００３７】
野生型ＧＮＥコード核酸配列に関して、「治療有効量」という用語は、標的細胞内のシアル酸産生を増大させ、並びに／又は他の方法で患者におけるＨＩＢＭ２の影響を治療し、予防し、且つ／若しくは寛解させるのに十分なレベルの野生型ＧＮＥを、妥当な損益比で発現するのに十分な上記配列の量を指す。しかし、本発明の野生型ＧＮＥコード核酸配列及び関連組成物の１日総用量は、適切な医学的判断の範囲内で、主治医によって決定されることが理解されよう。
【００３８】
どんな特定の患者に関する特定の治療有効量レベルも、患者のＨＩＢＭ２障害の重症度；使用する特定のＧＮＥコード配列の活性；使用する送達媒体；患者の年齢、体重、健康全般、性別及び食事；使用する特定のＧＮＥコード配列の投与時間、投与経路及び排出速度；治療の継続期間；使用する特定のＧＮＥコード配列と併用されるか、同時使用される薬物；並びに医学分野でよく知られている同様な因子を含めた様々な因子に依存しうる。
【００３９】
患者の状態が改善した際に、必要な場合には、維持量のＧＮＥコード配列を投与してもよい。その後、症状が望ましいレベルに軽減された際に、改善された状態が保持されるレベルに、症状の関数として、投与の用量若しくは頻度、又はこれら両方を低減させてもよい。
【００４０】
本発明のさらに別の実施形態によれば、系中で野生型ＧＮＥを発現するための新規な組成物が提供される。これらの組成物は、野生型ＧＮＥコード核酸配列を含有していることが好ましい。本明細書に記載の通り、ＧＮＥコード核酸配列は、プロモーター及び終止配列などの様々な転写調節エレメントを含みうる。本発明によって包含される組成物の非限定的な例には、本明細書に記載され、図１に示されており、且つ配列番号９によって表されるｐＵＭＶＣ３−ＧＮＥ発現ベクターが含まれる。また、本発明の他の実施形態に関連して記載されている通り、ＧＮＥコード核酸配列は、リポソーム又は脂質ナノ粒子などの、系への送達に適した媒体の中に配置するか、又はそれに連結することができる。さらに、そのような実施形態によれば、送達媒体は、筋細胞又は筋組織などの標的細胞又は組織を認識して、それに結合できる作用物質で装飾されていてもよい。
［実施例］
【実施例１】
【００４１】
ＣＨＯ−Ｌｅｃ３細胞における外因性ＧＮＥの発現。
以下の実施例で、ヒトｃＤＮＡに由来するいくつかのＧＮＥ発現ベクターを作製した。ＧＮＥ欠失細胞（Ｌｅｃ３細胞）において、３つの異なったＧＮＥ形態、すなわち、野生型、Ｍ７１２Ｔ及びＲ２６６Ｑが活発に発現された。酵素活性は異なっているが、すべての酵素が、同様なタンパク質発現レベルを示した。下記に示される通り、形質移入されたＧＮＥ発現細胞系は、形質移入されていない細胞より有意に多くのシアル酸を産生した。
【００４２】
実施例１ 方法
ＧＮＥクローニング。ＧＮＥ ｃＤＮＡを含有する親ベクターは、Daniel Darvish氏（HIBM Research Group、米国California州Encino所在）によって提供されたものであり、それらには、ｐＧＮＥ−ＮＢ８（野生型）、ｐＧＮＥ−ＭＢ１８（Ｍ７１２Ｔ変異体）及びｐＧＮＥ−Ｒ２６６Ｑ（Ｒ２６６Ｑ変異体）が含まれていた。受け側のベクターであるｐＵＭＶＣ３は、Aldevron社（米国North Dakota州Fargo所在）から購入した。サブクローニングベクターであるpDrive（Qiagen社製、米国California州Valencia所在）は、Ｒ２６６Ｑ変異体を親ベクターから受け側ベクターにシャトルさせるのに用いた。
【００４３】
野生型ＧＮＥ及びＭ７１２Ｔ ＧＮＥを、Eco RI制限消化、ゲル精製及びＴ４ライゲーションを介して、親ベクターからｐＵＭＶＣ３にクローニングした。Ｒ２６６Ｑ変異体ＧＮＥは、Hind III + Xba I消化を介して、親ベクターからpDriveにクローニングし、その後、Sal I + Xba Iを介してｐＵＭＶＣ３に移動させた（図１）。すべてのｐＵＭＶＣ３−ＧＮＥクローンは、下記表１に示すプライマーを用いて、Seqwright社（米国Texas州Houston所在）が配列決定した。
【００４４】
【表１】
【００４５】
陽性のｐＵＭＶＣ３−ＧＮＥクローンを１７５ｍｌのＬＢブロス＋５０μｇ／ｍｌ Ｋａｎ中で終夜培養し、製造会社プロトコールに従って、１５０ｍｌの培養物をQiagen社製（米国California州Valencia所在）HiSpeed Plasmid Maxiキットで使用した。
【００４６】
ＤＮＡ：脂質複合体。この実施例で使用されたＤＮＡ：脂質複合体は、試験ＤＮＡ（ｐＵＭＶＣ３−ＧＮＥ）と、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ，1,2-Dioleoyl-3-Trimethylammonium-Propane）を室温で混合することによって産生した。ＤＯＴＡＰは、Avanti Polar Lipids社（米国Alabama州Alabaster所在）によって販売されている市販の脂質粒子である。望ましい全容積が得られるようにＤＯＴＡＰをｐＵＭＶＣ３−ＧＮＥ ＤＮＡと混合した。得られた全容積は、最終容積１μｌあたり、０．５μｇ ＤＮＡ：４ｍＭ ＤＯＴＡＰの最終比率を示した。
【００４７】
細胞培養。ＧＮＥ欠失ＣＨＯ−Ｌｅｃ３細胞は、Albert Einstein College of Medicineによって提供された。細胞を、５％ＣＯ２中３７℃において、４ｍＭ Ｌ−グルタミン及び１０％熱不活性化ウシ胎児血清を補充したα−ＭＥＭ培地中で培養した。一時的形質移入用の細胞は、６ウェルプレート内に１ウェルあたり１×１０６細胞でプレーティングし、終夜培養した。Ｌｅｃ３細胞は、１継代あたり２．５％ＦＢＳの低減によって、低濃度血清条件に馴化させた。
【００４８】
一時的形質移入。ＯｐｔｉＭＥＭ（Invitrogen社製、米国California州Carlsbad所在）中で、１ウェルあたり、６時間、ＤＮＡ：脂質複合体を用いてＬｅｃ３細胞に形質移入し、その後、培地を通常のα−ＭＥＭ増殖培地に変え、細胞を終夜培養した。ＤＮＡ：脂質複合体は、製造会社のプロトコールに従って、４μｇのＤＮＡを１０μｌのLipofectamine 2000（Invitrogen社製）と混合することによって形成させた。形質移入の２４時間後に、トリプシン消化によって細胞を採取し、後続のウエスタンブロットアッセイ又は酵素／糖アッセイの前に、ＰＢＳで１回洗浄した。
【００４９】
ｍＲＮＡの定量。製造会社（Qiagen社、米国California州Valencia所在）の指示に従ってRNeasyキットを用いて、１５０万の形質移入ＣＨＯ−Ｌｅｃ３細胞から全ＲＮＡを抽出した。NanoDrop 1000分光光度計（NanoDrop社製、米国Delaware州Wilmington所在）を用いて、精製されたＲＮＡを２６０／２８０比によって定量化した。オリゴｄＴプライマー及びTaqMan逆転写キット（ABI社製、米国California州Foster City所在）を用いて、５００ｎｇの全ＲＮＡをｃＤＮＡに変換した。２５ｎｇのｃＤＮＡ及び０．２ｐＭのプライマー（ＧＮＥ−Ｆ３＝5'-cggaagaagggcattgagcatc-3'（配列番号７）及びＧＮＥ−Ｒ３＝5'-tttgtcttgggtgtcagcatcc-3'（配列番号８））と共に、Sybr Green ＰＣＲマスターミックス（ABI社製、米国California州Foster City所在）を用いて、２５μｌのＰＣＲ反応物を、既知濃度のｐＵＭＶＣ３ＧＮＥ−ｗｔ ＤＮＡの系列希釈物と比較した。Sybr Green蛍光は、iQ5リアルタイムＰＣＲ検出システム（BioRad社製、米国California州Hercules所在）と、ＰＣＲ条件：酵素を活性化するために、９５℃、１０分間、そして産物を増幅するために、（９５℃−１５秒間及び５８℃−６０秒間）×４５サイクルとを用いて検出した。４％プレキャストアガロースＥゲル（Invitrogen社製、米国California州Carlsbad所在）において、１５μｌのＰＣＲ反応物を泳動し、G-box化学発光検出システム（米国Maryland州Frederick所在）を用いて、その画像を捕捉した。
【００５０】
ウエスタンブロット。約５×１０５の細胞をウエスタンブロット分析に用いた。１％プロテアーゼ阻害剤を加えた２０μｌのCell lytic（Sigma社製、米国Missouri州St. Louis所在）を用いて細胞ペレットを溶解させた。最高速度で５分間遠心処理して細胞破片を沈殿させ、５％β−ＭＥを含有しているLaemmli緩衝液（BioRad社製、米国California州Hercules所在）と上清とを１：１で混合した。１０％の変性ゲルにおける、１００Ｖ、２時間のポリアクリルアミド電気泳動によって、タンパク質試料を分離し、その後、２時間、１００ボルトを用いてＰＶＤＦ膜に転写した。ニワトリ抗ＧＮＥ（１：１００００希釈）及びマウス抗ＧａｐＤＨ（１：５００００希釈）を用いて、ＧＮＥ及びＧａｐＤＨに関してこの膜を終夜プロービングした。ＨＲＰ標識された二次抗体を用いて、一次抗体を検出し、West Dura検出試薬（Pierce社製、米国Illinois州Rockford所在）及びG-box化学発光カメラ（Syngene社製、米国Maryland州Frederick所在）を用いてそれらを可視化した。
【００５１】
シアル酸の定量。チオバルビツル酸法による膜結合シアル酸の定量には約４×１０６の細胞を用いた。細胞を水中に再懸濁し、２５ゲージの注射針の中を２０回通過させることによって溶解させ、遠心処理した。上清はブラッドフォードタンパク質濃度推定に使用し、残ったペレットは、１００μｌの２Ｍ酢酸中に再懸濁して、複合糖質に結合したシアル酸を遊離させるために、８０℃で１時間インキュベートした。１３７μｌの過ヨウ素酸溶液（５７ｍＭ Ｈ２ＳＯ４中に２．５ｍｇ／ｍｌ）を添加して、３７℃で１５分間インキュベートした。次に、５０μｌの亜ヒ酸ナトリウム溶液（０．５Ｍ ＨＣｌ中に２５ｍｇ／ｍｌ）を添加し、管を激しく振盪させ、確実に黄色〜茶色の色が完全に消失するようにした。このステップに続いて、１００μｌの２−チオバルビツール酸溶液（７１ｍｇ／ｍｌ、ＮａＯＨでｐＨ９．０に調整されている）を添加し、試料を１００℃で７．５分間加熱した。１ｍｌのブタノール／５％１２Ｍ ＨＣｌで、この溶液から抽出を行い、遠心処置によって相分離させた。有機相の吸光度を５４９ｎｍで測定した。シアル酸の量は、タンパク質１ｍｇあたりのシアル酸の量（ｎｍｏｌ）として測定した。
【００５２】
キナーゼ活性及びエピメラーゼ活性。ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ ２−エピメラーゼ活性は、比色分析アッセイで測定した。それは、最終容積２００μｌ中に、４５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ及び可変的な量のタンパク質を含有していた。反応は、３７℃で３０分間行い、１分間の煮沸によって停止させた。Morgan-Elson法を用いて、遊離されたＭａｎＮＡｃを検出した。簡潔には、１５０μｌの試料を３０μｌの０．８Ｍ Ｈ２ＢＯ３、ｐＨ９．１と混合し、３分間煮沸した。次に、８００μｌのＤＭＡＢ溶液（酢酸／１．２５％１０Ｎ ＨＣｌ中に１％（ｗ／ｖ）４−ジメチルアミノベンズアルデヒド）を添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。吸光度を５７８ｎｍで測定した。
【００５３】
ＭａｎＮＡｃキナーゼ活性は、放射測定アッセイによって測定した。それは、最終容積２００μｌ中に、６０ｍＭ トリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．１、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ ＭａｎＮＡｃ、５０ｎＣｉ［１４Ｃ］ＭａｎＮＡｃ、１０ｍＭ ＡＴＰ及び可変的な量のタンパク質を含有していた。反応は、３７℃で３０分間行い、３００μｌのエタノールを添加して停止させた。放射標識された化合物をペーパークロマトグラフィーで分離し、放射能を液体シンチレーション計測で測定した。
【００５４】
統計的分析。酵素活性及びシアル酸発現に関して、３回の独立した実験を行った。平均及び標準偏差は、Microsoft社製のExcelを用いて計算した。スチューデントｔ検定を用いて、未処置試料との比較における各処置群のｐ値を決定した。
【００５５】
実施例１ 結果
ＧＮＥクローン。試験されたＧＮＥ ｃＤＮＡクローンには、ヒト野生型ｃＤＮＡ及び２種のヒト変異体ｃＤＮＡが含まれていた。変異体には、Ｍ７１２Ｔ ＧＮＥ欠失クローン及びＲ２６６Ｑシアル酸尿症クローンが含まれていた。シアル酸尿症は、ＧＮＥのＣＭＰシアル酸結合部位における点変異によって引き起こされたヒト疾患であり、フィードバック阻害の減失及びシアル酸の大量産生をもたらす。制限消化クローニングによって、ＧＮＥ ｃＤＮＡを、それらの元のベクターから、発現ベクターであるｐＵＭＶＣ３にサブクローニングした。定方向制限酵素消化によってクローンをスクリーニングして、ＧＮＥ挿入配列が正しい方向性になっていることを確認した。クローニングの過程中に変異が起こらなかったことを確認するために、陽性クローンは、両方の方向性で配列決定した。この結果得られたクロマトグラムを、GenBank（受託番号ＮＭ＿００５４６７）から得たＧＮＥ配列と比較した。野生型はどんな変異も示さず、一方、Ｍ７１２Ｔクローン及びＲ２６６Ｑクローンは予測された点変異のみを含有していた（図２）。陽性ｐＵＭＶＣ３−ＧＮＥクローンは、マキシプレップ（maxi prep）プラスミド精製法を用いてスケールアップし、変異が起きていないことを確認するために再度配列決定した。これらのＤＮＡストックをその後のすべての実験に用いた。
【００５６】
遺伝子タンパク質発現。プラスミドＵＭＶＣ３−ＧＮＥ ＤＮＡを、ＣＨＯ−Ｌｅｃ３細胞に一時的に形質移入し、１０％血清中で２４時間培養し、その後、細胞を採取し、組換え体ＧＮＥ発現があるかどうか分析した。ＧＮＥウエスタンブロットによって、未処置のＬｅｃ３細胞（形質移入されなかった）はＧＮＥを発現せず、様々なｐＵＭＶＣ３クローンで形質移入されたＣＨＯ−Ｌｅｃ３細胞は高レベルの組換え体ＧＮＥを発現することが示された（図３）。発現レベルは、ＧＮＥアイソフォームに関係なく、比較的同等であった。第２の実験では、ＣＨＯ細胞が培地からシアル酸を組み込む能力を有するため、１０％又は２．５％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）中で培養したＣＨＯ−Ｌｅｃ３細胞に形質移入を行った後、組換え体ＧＮＥを発現させた。この場合も、ＧＮＥタンパク質発現は、ＧＮＥアイソフォーム及びＦＢＳの濃度に関係なく、比較的同等であった（図４）。
【００５７】
ｗｔ−ＧＮＥ ｍＲＮＡの定量。ＣＨＯ−Ｌｅｃ３細胞を１０％血清中で培養し、それらに、２４時間かけて、ｐＵＭＶＣ３−ＧＮＥ−ｗｔ ＤＮＡで一時的に形質移入し、発現された組換え体ＧＮＥ ＲＮＡの量を定量した。全ＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ｑＰＣＲを行って、ＧＮＥ転写産物由来の２３０ｂｐ断片を増幅した。ｐＵＭＶＣ３−ＧＮＥ−ｗｔの系列希釈を用いて、形質移入されたＬｅｃ３細胞で発現されたＧＮＥ−ｗｔの濃度が４．１ｐｇ／μｌに等しかったと決定した。ｑＰＣＲのダイナミックレンジは、５ｎｇ〜５ｆｇであり、対照（形質移入されていない）ＣＨＯ−Ｌｅｃ３細胞では、ＧＮＥ ｍＲＮＡ産物が検出されなかった（形質移入されていない細胞のｃＴ値は４２サイクル超であったが、これは５ｆｇ未満である）。したがって、組換え体ＧＮＥ ｍＲＮＡ発現は、形質移入されたＬｅｃ３細胞では検出されたが、形質移入されていない細胞は、検出可能な量のＧＮＥ ｍＲＮＡを有していなかった（図５）。
【００５８】
ＧＮＥ酵素アッセイ。ウエスタンブロットアッセイに加えて、酵素活性に関しても、形質移入された細胞のペレットのアリコートをアッセイした。下記表２に示す通り、組換え体ＧＮＥタンパク質を有するＬｅｃ３細胞又はこれを有しないＬｅｃ３細胞で、エピメラーゼ活性及びキナーゼ活性の両方を定量した。
【００５９】
【表２】
【００６０】
Ｌｅｃ３細胞のみでは、エピメラーゼ活性及びキナーゼ活性は両方とも３ｍＵ／ｍｇ未満であり、これはバックグランド活性を示すものである。野生型、Ｍ７１２Ｔ又はＲ２６６Ｑ ＧＮＥを発現する細胞は、それぞれ、平均で２２、３１及び２６ｍＵ／ｍｇのエピメラーゼ活性を有した。同じＬｅｃ３試料は、平均で３５、３７及び３３ｍＵ／ｍｇのキナーゼ活性を示した。組換え体ＧＮＥを発現する細胞のすべてが、未処置の細胞より有意に高い酵素活性を有し、エピメラーゼ活性及びキナーゼ活性の両方に関してｐ値が０．００６以下であった。３種の異なったＧＮＥアイソフォーム間では、酵素活性に統計的な相違がなく、ｐ値は０．１１〜０．４７の範囲にあった。
【００６１】
シアル酸アッセイ。細胞表面のシアル酸発現に関しても、形質移入されたＬｅｃ３細胞を試験した。Ｒ２６６Ｑ ＧＮＥで形質移入されたＬｅｃ３細胞は１．５倍多い量を有していたが、それを除いて、すべてのＬｅｃ３試料が約６．０ｎｍｏｌ／ｍｇの膜結合シアル酸を有していた。Ｒ２６６Ｑ変異体は、ＧＮＥのフィードバック阻害を欠失しており、細胞内シアル酸の過剰産生を引き起こすことが知られている。Ｌｅｃ３細胞は、シアル酸付加過少（undersialylated）のようであり、これは、野生型ＣＨＯ細胞と比較して約１００倍の野生型ＧＮＥの過剰発現によってではなく、シアル酸尿症変異体の発現によってのみ克服できた。
【００６２】
野生型（ｗｔ）ＧＮＥとＭ７１２Ｔ ＧＮＥとの間では相違が観察されなかった。ＦＢＳ由来のシアル酸によって欠陥のあるＧＮＥ経路がバイパスされうることが知られているので、これは、細胞培地からのシアル酸の取り込みによるものであった可能性が高い。この場合、野生型とＭ７１２Ｔとの間での相違がこのバイパスによって遮蔽されていたのかもしれない。それゆえ、培地中の血清（ＦＢＳ）のパーセントを低減させることによって、細胞培養条件を改変した。下記表３に示す通り、血清レベルが低減するのに従って、シアル酸産生が低減し、２．５％ＦＢＳで顕著な低減が実証された。
【００６３】
【表３】
【００６４】
細胞培地が無血清条件に近づくにつれて、シアル酸レベルが低減し続けたが、細胞形態及び増殖特性は変化しなかった。Ｌｅｃ３細胞でＧＮＥ遺伝子形質移入の影響を試験するためには、２．５％ＦＢＳ濃度の細胞培地が最適であると決定された。したがって、Ｌｅｃ３細胞を２．５％ＦＢＳ中で培養し、ｐＵＭＶＣ３−ＧＮＥクローンで形質移入した。ＧＮＥ発現は、ウエスタンブロットで同時に確認した（図４）。シアル酸産生の有意な増大が実際に実証され、この場合も、Ｒ２２６Ｑ変異体の影響が最も大きかった（図６：ＧＮＥ−ｗｔではｐ＝０．０１５７；ＧＮＥ Ｒ２６６Ｑではｐ＝０．０５６６）。ｗｔ ＧＮＥとＭ７１２Ｔ ＧＮＥとの間でのわずかではあるが、有意な相違が観察された。これは、変異体のシアル酸再付加能力が野生型のものより低いことを示しており、ＨＩＢＭ筋におけるものに類似した作用機序を示唆している。
【００６５】
筋機能の欠損をもたらしうる、筋膜におけるグリコシル化障害に関連した、ＧＮＥ遺伝子内の変異が、ＨＩＢＭ２に関する研究によって明らかにされる。ＨＩＢＭ２におけるＧＮＥ活性の減失がシアル酸産生を損ない、複合糖質の適切なシアル酸付加を妨げていると考えられている。レクチンへの反応性も、一部の筋繊維で可変的であり、これは、筋内の低シアル酸付加及び異常なグリコシル化が患者の罹患筋組織における自己貪食液胞及び／又はアミロイド沈着物の局限的蓄積に寄与している可能性があると示唆している。以上の例は、ＧＮＥ欠失ＣＨＯ−Ｌｅｃ３細胞における、ｍＲＮＡ発現及びタンパク質発現用の新規なＧＮＥ遺伝子／ＣＭＶプロモータープラスミドの効果を実証するものである。このプラスミドが、ＧＮＥ／ＭＮＫ酵素機能と、それに続くシアル酸産生の誘導とを回復できることが示された。
【実施例２】
【００６６】
外因性ＧＮＥのインビボ発現
以下の例は、本明細書に記載のＧＮＥコード配列が、生存マウスに形質移入する能力、及びそのようなマウスの筋組織でＧＮＥ発現を刺激する能力を実証するものである。
【００６７】
ＤＮＡ：脂質複合体。この実施例で使用された物質には、ｐＵＭＶＣ３−ｗｔ−ＤＮＡ（図１）及び１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）：コレステロール（ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ，1,2-Dioleoyl-3-Trimethylammonium-Propane:Cholesterol）が含まれており、これらが、合わせて脂質ナノ粒子／ＤＮＡ複合体に相当する。この実施例で使用されたＤＮＡ：脂質複合体は、ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌを試験ＤＮＡ（野生型、Ｍ７１２Ｔ又はＲ２６６Ｑ ｐＵＭＶＣ３−ＧＮＥ）と室温で混合することによって生成させた。ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌは、Avanti Polar Lipids社（米国Alabama州Alabaster所在）によって販売されている市販の脂質粒子である。望ましい全容積が得られるように、ＤＯＴＡＰ：ＣｈｏｌをｐＵＭＶＣ３−ＧＮＥ ＤＮＡと混合した。全容積は、最終容積１μｌあたり０．５μｇ ＤＮＡ対、４ｍＭ ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌという最終比率を示した。
【００６８】
筋肉内毒性。各セットが６匹のメスマウス及び６匹のオスマウスからなる１セットのマウス（週齢１０〜１２週、名目上２０ｇのＢＡＬＢ／ｃマウス）に、（１）Plasma-Lyte（登録商標）中に再構成した１０μｇ（８０μｌ）のＧＭＰ ＤＮＡ、（２）Plasma-Lyte（登録商標）中に再構成した４０μｇ（８０μｌ）のＧＭＰ ＤＮＡ、又は（３）０μｇ（８０μｌ）のＧＭＰ ＤＮＡ（対照として働き、空のリポソーム及びPlasma-Lyte（登録商標）からなっていた）を与えた。もう１セットのマウスは、全く注射されず、追加の対照として働いた。単回の注射を行い、注射の２週間後にマウスを屠殺し、それらの臓器及び体液を採取した。毒性は、注射後２４〜４８時間、１週間及び２週間に評価した。毒性は、筋組織の血清化学プロフィール、ＣＢＣ分析、総毒性及び免疫組織化学分析に基づいて評価した。
【００６９】
図７に示す通り、上述した組成物を与えられたマウスはいずれも、注射後２４時間、４８時間、１週間又は２週間で毒性を示さなかった。
【００７０】
静脈内毒性。各セットが６匹のメスマウス及び６匹のオスマウスからなる１セットのマウス（週齢１０〜１２週、名目上２０ｇのＢＡＬＢ／ｃマウス）に、（１）Plasma-Lyte（登録商標）中に再構成した１０μｇ（２００μｌ）のＧＭＰ ＤＮＡ、（２）Plasma-Lyte（登録商標）中に再構成した４０μｇ（２００μｌ）のＧＭＰ ＤＮＡ、（３）Plasma-Lyte（登録商標）中に再構成した１００μｇ（２００μｌ）のＧＭＰ ＤＮＡ、又は（４）０μｇ（２００μｌ）のＧＭＰ ＤＮＡ（対照として働き、空のリポソーム及びPlasma-Lyte（登録商標）からなっていた）も与えた。静脈内投与を行い、投与の２週間後にマウスを屠殺し、それらの臓器及び体液を採取した。毒性は、注射後２４〜４８時間、１週間及び２週間に評価した。毒性は上述の通りに評価した。
【００７１】
図８に示す通り、１０μｇのＧＭＰ ＤＮＡを与えたマウスはいずれも、注射後２４時間、４８時間、１週間又は２週間に毒性を示さず、２匹のメスマウスのみが投与後２４時間に急性毒性を示した（他のすべての時点において、他のすべてのマウスが、毒性のどんな徴候も示さなかった）。再度、図８を参照すると、１００μｇを与えた３匹のメスマウスが投与後２４時間で死亡し、別のメスマウスは投与後４８時間で死亡した。６匹のオスはすべて投与後２４時間で急性毒性を示した。しかし、これら６匹のマウスはすべて生き残り、投与後の４８時間、１週間又は２週間には毒性の徴候を示さなかった。図９は、ＧＭＰグレードＤＮＡ（Plasma-Lyte（登録商標）中に再構成したもの）を静脈内注射されたこれらのマウスの生存データを要約するものである。
【００７２】
Plasma-Lyte（登録商標）と水との比較。ＧＮＥコード配列をその中に配置できる好ましい担体を特定するために、Plasma-Lyte（登録商標）と水との間における毒性の比較を行った。Plasma-Lyte（登録商標）は、静脈内投与に使用できる無菌の非発熱性等張液である。容積各１００ｍＬあたり、５２６ｍｇの米国薬局方塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、５０２ｍｇのグルコン酸ナトリウム（Ｃ６Ｈ１１ＮａＯ７）、３６８ｍｇの米国薬局方酢酸ナトリウム三水和物（Ｃ２Ｈ３ＮａＯ２・３Ｈ２Ｏ）、３７ｍｇの米国薬局方塩化カリウム（ＫＣｌ）及び３０ｍｇの米国薬局方塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ）を含有している。Plasma-Lyte（登録商標）は、抗菌剤を含有していない。ｐＨは、水酸化ナトリウムによって、約７．４（６．５〜８．０）に調整することが好ましい。
【００７３】
図１０〜１２を参照すると、４匹のマウスからなる群に、Plasma-Lyte（登録商標）中に再構成されたＧＭＰ−ＧＮＥ ４０μｇ、１０μｇ又は０μｇを筋肉内注射で与えるか（図１０）；Plasma-Lyte（登録商標）中に再構成したＧＭＰ−ＧＮＥ １００μｇ、４０μｇ、１０μｇ又は０μｇを静脈内注射で与えるか（図１１）；或いは水中に再構成した１００μｇ、４０μｇ又は０μｇのＧＭＰ−ＧＮＥを静脈内注射で与えた（図１２）。水中に再構成したＧＭＰ−ＧＮＥ（図１２）と比較して、Plasma-Lyte（登録商標）中に再構成したＧＭＰ−ＧＮＥ（図１０〜１１）は有意に改善された（より低い）毒性学的性質を示した。
【００７４】
マウスにおけるＧＮＥ発現。各セットが４匹のマウスを含む、週齢１０〜１２週、名目上２０ｇのＢＡＬＢ／ｃマウス３セットに、様々な量のＧＮＥコード組成物、すなわち配列番号９によって表されるｐＵＭＶＣ３−ｗｔ−ＤＮＡコンストラクト（図１）及び１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）：コレステロール（合わせて上述の脂質ナノ粒子／ＧＮＥコード複合体に相当する）の筋肉内注射を施した。
【００７５】
この例では、第１群には、０μｇのＧＮＥコードＤＮＡを注射し、第２群には、１０μｇのＧＮＥコードＤＮＡを注射し、第３群には、４０μｇのＧＮＥコードＤＮＡを注射した。注射の２週間後にマウスを屠殺し、注射された筋組織を採取した。
【００７６】
次に、全ＲＮＡを筋組織から収集した。次に、各試料中に含有されていたＧＮＥ ｍＲＮＡ転写産物の量を、ＧＮＥ特異的なプライマーを用いて（そして、様々な量の既知濃度ＲＮＡを用いて標準曲線を作成し、これを、各試験試料中のＧＮＥ ｍＲＮＡの定量的な量を推定するのに用いた）、ＲＴ−ＰＣＲを介して測定した。下記表４は、ＲＴ−ＰＣＲによって測定された平均のＧＮＥ ｍＲＮＡ量（ｎｇ）（３つの各群内の２匹のマウスから得られたもの）を要約したものである。
【００７７】
【表４】
【００７８】
これらのデータを、さらに図１３に要約する。図１３は、各群（０、１０及び４０μｇのＧＮＥコードＤＮＡ）に関して測定し、ＲＮＡが抽出された筋組織の総量に対して標準化したＧＮＥ ｍＲＮＡの量を示す。図１３に示す通り、ＧＮＥコードＤＮＡ １０μｇの投与は有意なレベルのＧＮＥ発現をもたらし（０μｇの試料と比較して１８２倍のＧＮＥ発現レベルの増大）、ＧＮＥコードＤＮＡ ４０μｇの投与はさらに大きなレベルのＧＮＥ発現をもたらした（０μｇの試料と比較して１１１５倍のＧＮＥ発現レベルの増大）。これらのデータは、図１４のゲルに示すＰＣＲ結果と一致する。
【００７９】
本明細書に本発明の例示的な実施形態を記載したが、本発明が、記載されたものに限定されず、当業者ならば本発明の範囲又は趣旨から逸脱せずに他の様々な改変又は修正を行えることを理解するべきである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
系中でのシアル酸の産生を調節する方法であって、前記系に野生型ＧＮＥコード核酸配列を与えるステップを含む方法。
【請求項２】
野生型ＧＮＥコード核酸配列が、野生型ＧＮＥコード核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
プロモーターがＣＭＶプロモーターである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
野生型ＧＮＥコード核酸配列を系に注射し、前記系が哺乳動物の筋組織を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
野生型ＧＮＥコード核酸配列が、脂質ナノ粒子内に配置され、又は脂質ナノ粒子に連結されている、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
野生型ＧＮＥコード核酸配列が配列番号９からなる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
脂質ナノ粒子が、筋細胞又はその構成成分を認識し、それに結合することができる１又は複数の作用物質を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
系中で野生型ＧＮＥを産生する方法であって、前記系が変異型内因性ＧＮＥコード配列を含み、前記系に野生型ＧＮＥコード核酸配列を与えるステップを含む方法。
【請求項９】
野生型ＧＮＥコード核酸配列が、野生型ＧＮＥコード核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
プロモーターがＣＭＶプロモーターである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
野生型ＧＮＥコード核酸配列を系に注射し、前記系が哺乳動物の筋組織を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
野生型ＧＮＥコード核酸配列が、脂質ナノ粒子内に配置され、又は脂質ナノ粒子に連結されている、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
野生型ＧＮＥコード核酸配列が配列番号９からなる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
脂質ナノ粒子が、筋細胞又はその構成成分を認識し、それに結合することができる１又は複数の作用物質を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
遺伝性封入体ミオパチーの影響を治療し、予防し、又は寛解させる方法であって、患者に野生型ＧＮＥコード核酸配列を与えるステップを含む方法。
【請求項１６】
野生型ＧＮＥコード核酸配列が、野生型ＧＮＥコード核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
プロモーターがＣＭＶプロモーターである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
野生型ＧＮＥコード核酸配列を患者の筋組織に注射する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
野生型ＧＮＥコード核酸配列が、脂質ナノ粒子内に配置され、又は脂質ナノ粒子に連結されている、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
野生型ＧＮＥコード核酸配列が配列番号９からなる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
脂質ナノ粒子が、筋細胞又はその構成成分を認識し、それに結合することができる１又は複数の作用物質を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
脂質ナノ粒子を患者に静脈内投与する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
系中で野生型ＧＮＥを発現させるための組成物であって、脂質ナノ粒子内に配置され、又は脂質ナノ粒子に連結されている野生型ＧＮＥコード核酸配列を含む組成物。
【請求項２４】
脂質ナノ粒子が、筋細胞又はその構成成分を認識し、それに結合することができる１又は複数の作用物質を含む、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２５】
野生型ＧＮＥコード核酸配列が配列番号９からなる、請求項２２に記載の組成物。
【請求項１】
系中でのシアル酸の産生を調節する方法であって、前記系に野生型ＧＮＥコード核酸配列を与えるステップを含む方法。
【請求項２】
野生型ＧＮＥコード核酸配列が、野生型ＧＮＥコード核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
プロモーターがＣＭＶプロモーターである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
野生型ＧＮＥコード核酸配列を系に注射し、前記系が哺乳動物の筋組織を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
野生型ＧＮＥコード核酸配列が、脂質ナノ粒子内に配置され、又は脂質ナノ粒子に連結されている、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
野生型ＧＮＥコード核酸配列が配列番号９からなる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
脂質ナノ粒子が、筋細胞又はその構成成分を認識し、それに結合することができる１又は複数の作用物質を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
系中で野生型ＧＮＥを産生する方法であって、前記系が変異型内因性ＧＮＥコード配列を含み、前記系に野生型ＧＮＥコード核酸配列を与えるステップを含む方法。
【請求項９】
野生型ＧＮＥコード核酸配列が、野生型ＧＮＥコード核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
プロモーターがＣＭＶプロモーターである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
野生型ＧＮＥコード核酸配列を系に注射し、前記系が哺乳動物の筋組織を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
野生型ＧＮＥコード核酸配列が、脂質ナノ粒子内に配置され、又は脂質ナノ粒子に連結されている、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
野生型ＧＮＥコード核酸配列が配列番号９からなる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
脂質ナノ粒子が、筋細胞又はその構成成分を認識し、それに結合することができる１又は複数の作用物質を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
遺伝性封入体ミオパチーの影響を治療し、予防し、又は寛解させる方法であって、患者に野生型ＧＮＥコード核酸配列を与えるステップを含む方法。
【請求項１６】
野生型ＧＮＥコード核酸配列が、野生型ＧＮＥコード核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
プロモーターがＣＭＶプロモーターである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
野生型ＧＮＥコード核酸配列を患者の筋組織に注射する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
野生型ＧＮＥコード核酸配列が、脂質ナノ粒子内に配置され、又は脂質ナノ粒子に連結されている、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
野生型ＧＮＥコード核酸配列が配列番号９からなる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
脂質ナノ粒子が、筋細胞又はその構成成分を認識し、それに結合することができる１又は複数の作用物質を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
脂質ナノ粒子を患者に静脈内投与する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
系中で野生型ＧＮＥを発現させるための組成物であって、脂質ナノ粒子内に配置され、又は脂質ナノ粒子に連結されている野生型ＧＮＥコード核酸配列を含む組成物。
【請求項２４】
脂質ナノ粒子が、筋細胞又はその構成成分を認識し、それに結合することができる１又は複数の作用物質を含む、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２５】
野生型ＧＮＥコード核酸配列が配列番号９からなる、請求項２２に記載の組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公表番号】特表２０１０−５１９１８４（Ｐ２０１０−５１９１８４Ａ）
【公表日】平成２２年６月３日（２０１０．６．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５４９１０６（Ｐ２００９−５４９１０６）
【出願日】平成２０年２月７日（２００８．２．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００１６５０
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０９７６２３
【国際公開日】平成２０年８月１４日（２００８．８．１４）
【出願人】（５０９２２３９８８）グラダリス インク． (1)
【氏名又は名称原語表記】ＧＲＡＤＡＬＩＳ，ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年６月３日（２０１０．６．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年２月７日（２００８．２．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００１６５０
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０９７６２３
【国際公開日】平成２０年８月１４日（２００８．８．１４）
【出願人】（５０９２２３９８８）グラダリス インク． (1)
【氏名又は名称原語表記】ＧＲＡＤＡＬＩＳ，ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
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