シアロ糖鎖をアミド化修飾する方法

【課題】 ヒドラジドビーズなどの担体に捕捉されたシアロ糖鎖に対して、予め修飾を行うことで、アミノ化合物による標識を行い、その後シアロ糖鎖の分離や分析を効率的に行うことが可能になるシアロ糖鎖の修飾方法を提供すること。
【解決手段】 ヒドラジド基を有する担体に捕捉されたシアロ糖鎖に対して、非水系の有機溶媒中でアミド化を行うことにより、その後アミノ化合物による標識を行い、シアロ糖鎖の分離や分析を効率的に行うことが可能になることを見出した。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、シアロ糖鎖をアミド化修飾する方法、及びアミド化修飾されたシアロ糖鎖を含む糖鎖試料の調製方法に関する。
【背景技術】
【0002】
糖鎖は疾患により構造が変化することが知られていることから、新たな診断マーカーとして糖鎖が注目されている。例えば、シアロ糖鎖を有するタンパク質は、がんなどの疾患と関連する新たな診断マーカー開発の標的として注目されている。
【0003】
診断マーカーの探索を目的として糖鎖を鋭敏に検出する方法としては、糖鎖の質量分析を行う方法、および高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により糖鎖を分離した後に、分離した糖鎖の質量分析を行う方法が有力な手段となっている。しかしながら、シアロ糖鎖におけるシアル酸は不安定で分解し易いため、安定化のための化学修飾を行った後に、分析することが行われている。
【0004】
シアル酸を定量的に化学修飾するには、反応系内に過剰量の試薬の添加を要するため、試薬除去の工程が必要となる。そして、過剰試薬の除去を簡便に行うために、担体に糖鎖を固定化した後に化学修飾する方法が利用されている。
【0005】
担体に糖鎖を固定化した後にシアル酸を化学修飾する方法としては、例えば、ヒドラジドビーズに糖鎖を固定化した後、MTT試薬で糖鎖をメチルエステル化する方法が知られている(MTT試薬で糖鎖をメチルエステル化する方法については、非特許文献1を参照のこと)。また、メチルエステル化されたシアロ糖鎖を、ビーズから外し標識を行った後に質量分析を行う方法として、例えば、ヒドラジドビーズに固定化された糖鎖を外した後、aoWR試薬で標識し質量分析を行う方法が知られている。
【0006】
一方、HPLCによる分離を行った後に糖鎖の質量分析を行うには、HPLCによる糖鎖の分離の向上と高感度検出のために2AB試薬やPA試薬などのアミノ化合物で糖鎖を標識する方法が利用されている。しかしながら、これらアミノ化合物による標識は、酸性条件下で反応を行うため、メチルエステル化された部位が加水分解されやすいという問題があった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Miura Y. et al., Chemistry. 2007;13(17), 4797-804.
【非特許文献2】Toyoda M. et al., Anal. Chem. 2008;80(13), 5211-8.
【非特許文献3】Liu X. et al., Anal. Chem. 2010:82(19), 8300-6.
【非特許文献4】Sekiya S. et al., Anal. Chem. 2005:77(15), 4962-8.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、ヒドラジドビーズなどの担体に捕捉されたシアロ糖鎖に対し、予め修飾を行うことで、アミノ化合物による標識を行い、その後シアロ糖鎖の分離や分析を効率的に行うことが可能になるシアロ糖鎖の修飾方法を提供することにある。
【0009】
さらなる本発明の目的は、このような修飾方法により修飾されたシアロ糖鎖を含む糖鎖試料の調製方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0010】
アミド誘導体はエステル誘導体より加水分解されにくく安定であることが知られている。そして、シアル酸のカルボン酸をアミド化できる既知の方法としては、求核剤としてアミノ基を有する化合物であるアセトヒドラジドを用いる方法が採用されている(非特許文献2を参照のこと)。
【0011】
そこで、本発明者らは、まず、ヒドラジドゲルに捕捉されたシアロ糖鎖に対してアミド化修飾を行い、次いで、アミド化修飾されたシアロ糖鎖に対し、アミノ化合物による標識を行った。ここで、シアロ糖鎖のアミド化反応を、アミノ化合物による標識を行う際の条件と同様の酸性条件下で行った場合には、その後の逆相HPLCにより、標識された化合物が検出されなかった。
【0012】
本発明者らは、この原因について、シアロ糖鎖のアルデヒド基とヒドラジドゲルのヒドラジド基によるヒドラゾン結合が、アミド化の際の酸性条件下で加水分解し、糖鎖の標識前にゲルから糖鎖が遊離したことにあると仮定した。
【0013】
そこで、次に、本発明者らは、ヒドラゾン結合が加水分解されないよう、非水系の有機溶媒であるジメチルスルホキシド中で、シアロ糖鎖のアミド化反応を行い、その後、酸性条件下でアミノ化合物による標識を行い、逆相HPLCに供した。その結果、逆相HPLCにおいて標識化合物のピークが検出された。本発明者らは、さらに、このピークの化合物について、MALDI−MSに供したところ、アミド化されたシアロ糖鎖との同一性を示すシグナルが検出された。これら事実から、ヒドラジド基を有する担体に捕捉されたシアロ糖鎖に対して、非水系の有機溶媒中でアミド化を行うことにより、その後、シアロ糖鎖のアミノ化合物による標識を行い、シアロ糖鎖の分離や分析を効率的に行うことが可能であることが判明した。
【0014】
さらに、本発明者らは、非水系の有機溶媒中でアミド化を行う場合において、使用する求核剤などの諸条件について詳細な検討を行った。その結果、求核剤としてメチルアミン塩酸塩を用いる方法(非特許文献3を参照のこと)を利用することにより、シアル酸のカルボン酸のアミド化の効率を飛躍的に高めることができることをも見出した。
【0015】
すなわち、本発明は、ヒドラジド基を有する担体に捕捉されたシアロ糖鎖に対して、非水系の有機溶媒中でアミド化を行うことを特徴とする、シアロ糖鎖をアミド化修飾する方法、及びアミド化修飾されたシアロ糖鎖を含む糖鎖試料の調製方法に関し、より詳しくは、以下の発明を提供するものである。
【0016】
(1)シアロ糖鎖をアミド化修飾する方法であって、
(a)生体試料から糖鎖を遊離する工程、
(b)遊離させた糖鎖のアルデヒド基を、その表面にヒドラジド基を有する固相担体に接触させ、ヒドラゾン結合により、糖鎖を担体に捕捉する工程、
(c)捕捉した糖鎖のシアル酸を非水系の溶媒中でアミド化する工程、
を含む方法。
【0017】
(2)非水系の溶媒がジメチルスルホキシド、N,N−ジメチルホルムアミド、およびメタノールからなる群より選択される溶媒である、(1)に記載の方法。
【0018】
(3)工程(c)において、アミド化反応の求核剤としてメチルアミン塩酸塩を用いる、(1)または(2)に記載の方法。
【0019】
(4)工程(c)において、アミド化反応の縮合剤としてPyAOPを用いる、(1)から(3)のいずれかに記載の方法。
【0020】
(5)アミド化修飾されたシアロ糖鎖を含む糖鎖試料を調製する方法であって、
(a)生体試料から糖鎖を遊離する工程、
(b)遊離させた糖鎖のアルデヒド基を、その表面にヒドラジド基を有する担体に接触させ、ヒドラゾン結合により、糖鎖を担体に捕捉する工程、
(c)捕捉した糖鎖のシアル酸を非水系の溶媒中でアミド化する工程、
(d)捕捉した糖鎖を再遊離する工程、
を含む方法。
【0021】
(6)さらに、(e)再遊離した糖鎖に対し、アミノ基を有する化合物を作用させて還元的アミノ化反応を行い、アミノ基を有する化合物で当該糖鎖を標識する工程、を含む、(5)に記載の方法。
【0022】
(7)非水系の溶媒がジメチルスルホキシド、N,N−ジメチルホルムアミド、およびメタノールからなる群より選択される溶媒である、(5)または(6)に記載の方法。
【0023】
(8)工程(c)において、アミド化反応の求核剤としてメチルアミン塩酸塩を用いる、(5)から(7)のいずれかに記載の方法。
【0024】
(9)工程(c)において、アミド化反応の縮合剤としてPyAOPを用いる、(5)から(8)のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【0025】
本発明により、ヒドラジド基を有する担体に捕捉されたシアロ糖鎖に対して予め修飾を行うことで、アミノ化合物による標識を行った後に、効率的に、シアロ糖鎖のHPLCによる分離や、その分離後の質量分析を行うことが可能となった。また、新たな糖鎖バイオマーカー開発を目指した、シアロ糖鎖の比較定量解析が可能となった。
【図面の簡単な説明】
【0026】
【図1】上段:アセトヒドラジドを用いてアミド化されたα2−6シアル酸を有する糖鎖を表1に記載の条件で逆相HPLCにより検出した結果を示すグラフである。下段:アセトヒドラジドを用いてアミド化されたα2−3シアル酸を有する糖鎖を表1に記載の条件で逆相HPLCにより検出した結果を示すグラフである。
【図2】左:図1におけるピーク1を質量分析により検出した結果を示すグラフである。右:図1におけるピーク2を質量分析により検出した結果を示すグラフである。
【図3】上段:アミド化されたα2−6シアル酸を有する糖鎖を表2に記載の条件で逆相HPLCにより検出した結果を示すグラフである。下段:アミド化されたα2−3シアル酸を有する糖鎖を表2に記載の条件で逆相HPLCにより検出した結果を示すグラフである。
【図4】上段左:図3におけるピーク1を質量分析により検出した結果を示すグラフである。上段右:図3におけるピーク2を質量分析により検出した結果を示すグラフである。下段左:図3におけるピーク3を質量分析により検出した結果を示すグラフである。下段右:図3におけるピーク4を質量分析により検出した結果を示すグラフである。
【図5】上段:メチルアミン塩酸塩を用いてアミド化されたα2−6シアル酸を有する糖鎖を表2に記載の条件で逆相HPLCにより検出した結果を示すグラフである。下段:メチルアミン塩酸塩を用いてアミド化されたα2−3シアル酸を有する糖鎖を表2に記載の条件で逆相HPLCにより検出した結果を示すグラフである。
【図6】上段左:図5におけるピーク5を質量分析により検出した結果を示すグラフである。下段左:図5におけるピーク6を質量分析により検出した結果を示すグラフである。下段右:図5におけるピーク7を質量分析により検出した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0027】
(生体試料から糖鎖を遊離する工程)
本発明において糖鎖の遊離に用いる生体試料としては、例えば全血、血清、血漿、尿、唾液、細胞、組織、ウイルス、植物組織などが挙げられる。また、本発明においては、精製された、あるいは未精製の糖タンパク質を用いることができる。試料は脱脂、脱塩、タンパク質分画、熱変性などの方法により前処理されていてもよい。
【0028】
糖鎖遊離手段を用いて上記生体試料に含まれる糖鎖を含む分子(例えば、糖タンパク質)から糖鎖を遊離させる。糖鎖を遊離させる手段としては、N−グリコシダーゼあるいはO−グリコシダーゼを用いたグリコシダーゼ処理、ヒドラジン分解、アルカリ処理によるβ脱離などの方法を用いることができる。N型糖鎖の分析を行う場合は、N−グリコシダーゼを用いる方法が好ましい。グリコシダーゼ処理に先立って、トリプシンやキモトリプシンなどを用いてプロテアーゼ処理を行ってもよい。
【0029】
(遊離した糖鎖を担体に捕捉する工程)
本発明においては、次いで、遊離させた糖鎖のアルデヒド基を、その表面にヒドラジド基を有する固相担体に接触させ、ヒドラゾン結合により、糖鎖を担体に捕捉する。
【0030】
糖鎖は生体内物質のなかで唯一、アルデヒド基をもつ物質である。すなわち、糖鎖は水溶液などの状態で環状のヘミアセタール型と、非環状型のアルデヒド型とが平衡で存在する。タンパク質や核酸、脂質など糖鎖以外の生体内物質にはアルデヒド基が含まれていない。このことから、アルデヒド基と特異的に反応して安定な結合を形成するヒドラジド基を有する捕捉担体を利用すれば、糖鎖のみを選択的に捕捉することが可能である。
【0031】
糖鎖を捕捉するための担体としては、ポリマー粒子を用いることが好ましい。ポリマー粒子は、少なくとも表面の一部にヒドラジドを有した固体あるいはゲル粒子であることが好ましい。ポリマー粒子が固体粒子あるいはゲル粒子であれば、ポリマー粒子に糖鎖を捕捉させたのち、遠心分離やろ過などの手段によって容易に回収することができる。また、ポリマー粒子をカラムに充填して用いることも可能である。カラムに充填して用いる方法は、特に連続操作化の観点から重要となる。反応容器としてフィルタープレート(例えば、Millipore社製のMultiScreen Solvinert Filter Plate)を用いることにより、複数のサンプルを同時に処理することが可能となり、例えばゲルろ過に代表されるカラム操作による従来の精製手段と比較して、糖鎖精製のスループットが大幅に向上される。
【0032】
ポリマー粒子の形状は特に限定しないが、球状またはそれに類する形状が好ましい。ポリマー粒子が球状の場合、平均粒径は好ましくは0.05〜1000μmであり、より好ましくは0.05〜200μmであり、さらに好ましくは0.1〜200μmであり、最も好ましくは0.1〜100μmである。平均粒径が下限値未満では、ポリマー粒子をカラムに充填して用いる際、通液性が悪くなるために大きな圧力を加える必要がある。また、ポリマー粒子を遠心分離やろ過で回収することも困難となる。平均粒径が上限値を超えると、ポリマー粒子と試料溶液の接触面積が少なくなり、糖鎖捕捉の効率が低下する。本発明においては、ヒドラジド基含有ポリマー粒子である「BlotGlyco(R)」(住友ベークライト株式会社製、#BS−45603)を好適に用いることができる。
【0033】
糖鎖を特異的に捕捉するポリマー粒子によって糖鎖を捕捉する際の反応系のpHは、好ましくは2〜9、より好ましくは2〜7であり、さらに好ましくは2〜6である。pH調整のためには、各種緩衝液を用いることができる。糖鎖捕捉時の温度は、好ましくは4〜90℃、より好ましくは4〜70℃、さらに好ましくは30〜80℃であり、最も好ましくは40〜80℃である。反応時間は適宜設定することができる。ポリマー粒子をカラムに充填して試料溶液を通過させてもよい。
【0034】
ポリマー粒子を用いた場合、担体表面には糖鎖以外の莢雑物が非特異的に吸着しているため、これらを洗浄除去する必要がある。洗浄液としては、水、緩衝液、界面活性剤を含む水または緩衝液、有機溶剤などを適宜組み合わせて用いることが好ましい。特に好ましい形態は、界面活性剤を含む水または緩衝液で十分に洗浄したのち、有機溶剤で洗浄し、最後に水で洗浄する方法である。これらの洗浄により、非特異的吸着物がポリマー粒子表面から除去される。
【0035】
担体上の余剰官能基は、例えば、無水酢酸などを利用して、キャッピングすることができる。
【0036】
(捕捉した糖鎖のシアル酸を非水系の溶媒中でアミド化する工程)
本発明においては、次いで、担体に捕捉した糖鎖のシアル酸を非水系の溶媒中でアミド化する。
【0037】
アミド化反応に用いる非水系の溶媒としては、アミド化反応中にヒドラゾン結合の加水分解を生じさせない溶媒であれば特に制限はない。このような溶媒としては、例えば、ジメチルスルホキシドやN,N−ジメチルホルムアミドなどの極性非プロトン性溶媒やメタノールなどの極性プロトン性溶媒が挙げられる。
【0038】
アミド化試薬としては、求核剤として作用するものであれば特に制限はないが、例えば、アセトヒドラジド、メチルアミン塩酸塩(非特許文献3)、塩化アンモニウム(非特許文献4)を好適に用いることができる。シアロ糖鎖のアミド化の効率の観点からは、メチルアミン塩酸塩が特に好ましい。反応に用いるアミド化試薬の濃度は、1mM以上、好ましくは1M〜10Mである。
【0039】
pHを調製するために、必要に応じて、酸性あるいはアルカリ性の有機溶媒を添加してもよい。有機溶媒としては、例えば、酢酸やトリフルオロ
酢酸(TFA)が挙げられる。
【0040】
また、縮合剤として、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDAC)、HATU、PyAOP、COMU、DMT−MMを好適に用いることができる。アミド化試薬としてメチルアミン塩酸塩を使用する場合には、縮合剤としてPyAOPを使用するとシアロ糖鎖のアミド化の効率を高めることができる。
【0041】
本発明においては、シアロ糖鎖が担体に捕捉されているため、洗浄によって簡便に過剰試薬を除去することができ、また、これにより簡便にアミド化反応を繰り返すことができる。シアロ糖鎖のアミド化の効率を高めるために、アミド化反応は、2回以上、より好ましくは5回以上(例えば、10回以上)、繰り返すことが好ましい。
【0042】
(捕捉した糖鎖を再遊離する工程)
本発明においては、次いで、捕捉担体に結合した糖鎖を再遊離し、精製された糖鎖試料を得る工程を含むことができる。ヒドラジド基とアルデヒド基との反応によって生じるヒドラゾン結合は、酸処理によって容易に切断されるため、糖鎖を捕捉したのち、糖鎖を担体から簡単に切り離すことができる。この工程では、捕捉担体に結合した糖鎖を再遊離するために、酸と有機溶媒の混合溶媒あるいは酸と水と有機溶媒の混合溶媒にて酸処理を行うことが好ましい。酸と水と有機溶媒の混合溶媒の場合、水の含有率は好ましくは0.1%〜90%、より好ましくは0.1%〜80%、さらに好ましくは0.1%〜50%である。水の代わりに水性緩衝液を含有しても良い。緩衝液の濃度は好ましくは0.1mM〜1M、より好ましくは0.1mM〜500mM、さらに好ましくは1mM〜100mMである。反応溶液のpHは好ましくは2〜9、より好ましくは2〜7であり、さらに好ましくは2〜6である。使用する酸は例えば、酢酸、ギ酸、トリフルオロ酢酸、塩酸、クエン酸、リン酸、硫酸が好ましく、より好ましくは酢酸、ギ酸、トリフルオロ酢酸、リン酸、さらに好ましくは酢酸、トリフルオロ酢酸である。反応温度に関しては4〜90℃が好ましく、好ましくは25〜90℃で、さらに好ましくは40〜90℃である。反応時間は、10分間〜24時間、好ましくは10分間〜8時間、より好ましくは10分間〜3時間である。反応は、糖鎖を遊離させる反応を効率よく行う観点から、開放系で行って溶媒を完全に蒸発させることが好ましい。
【0043】
(再遊離した糖鎖を標識する工程)
本発明においては、再遊離した糖鎖に対し、アミノ基を有する化合物を作用させて還元的アミノ化反応を行い、アミノ基を有する化合物で当該糖鎖を標識する工程を含むことができる。
【0044】
反応系においてpHが酸性から中性の条件であるのが好ましく、好ましくは2〜9、より好ましくは2〜8であり、さらに好ましくは2〜7である。反応温度に関しては4〜90℃が好ましく、好ましくは25〜90℃で、さらに好ましくは40〜90℃である。アミノ化合物の濃度は、1mM〜10Mであるのが好ましく、還元剤の濃度は、1mM〜10Mであるのが好ましい。反応時間は、10分間〜24時間、好ましくは10分間〜8時間、より好ましくは10分間〜3時間である。
【0045】
ここで、アミノ基を有する化合物は、紫外可視吸収特性又は蛍光特性を有することが好ましく、例えば下記の群から選ばれる少なくとも1つの化合物であることが好ましい。
【0046】
2−Aminopyridine(PA)、2−Aminobenzamide(2AB)、8−Aminopyrene−1、3,6−trisulfonate、8−Aminonaphthalene−1,3,6−trisulphonate、7−amino−1,3−naphtalenedisulfonic acid、2−Amino9(10H)−acridone、5−Aminofluorescein、Dansylethylenediamine、7−Amino−4−methylcoumarine、2−Aminobenzoic acid、3−Aminobenzoic acid、7−Amino−1−naphthol、3−(Acetylamino)−6−aminoacridine、2−Amino−6−cyanoethylpyridine、Ethyl p−aminobenzoate、p−Aminobenzonitrile、及び7−aminonaphthalene−1,3−disulfonic acid。
【0047】
特に、アミノ化合物が2−aminobenzamideの場合、pHが酸性から中性の条件で、好ましくは2〜9、より好ましくは2〜8であり、さらに好ましくは2〜7である。反応温度に関しては4〜90℃、好ましくは30〜90℃で、さらに好ましくは40〜80℃である。アミノ化合物の濃度は1mM〜10M、好ましくは10mM〜10Mで、さらに好ましくは100mM〜1Mである。還元剤の濃度は、1mM〜10M、好ましくは10mM〜10M、さらに好ましくは100mM〜2Mである。反応時間は、10分間〜24時間、好ましくは10分間〜8時間、さらに好ましくは1時間〜3時間である。
【0048】
また、還元剤は例えば、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、メチルアミンボラン、ジメチルアミンボラン、トリメチルアミンボラン、ピコリンボラン、ピリジンボランなどが使用可能であるが、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを使用するのが反応性の面から考えて好ましい。
【0049】
この工程後、得られる溶液は標識された糖鎖と過剰量加えた未反応アミノ化合物、還元剤が存在するため、これら余剰試薬を除去する工程を行うのが好ましい。シリカカラムによる除去、ゲル濾過による除去、イオン交換樹脂による除去、いずれの方法を用いても良いが、シアル酸の離脱を防ぐために使用する溶媒は中性であるのが好ましい。
【0050】
(標識されたシアロ糖鎖を分析する工程)
得られた標識されたシアロ糖鎖については、HPLCに代表されるクロマトグラフィーにより分離することができる。さらに、クロマトグラフィーにより分離されたシアロ糖鎖は、MALDI−MSに代表される質量分析に供することより、質量電荷比(m/z値)を読み取ることができ、そのピークが検出される。質量電荷比やピーク強度(ピーク高さ、ピーク面積など任意の指標)から、糖鎖の定量や糖鎖の構造分析を行うことができる。糖鎖の分析においては、各種データベース(例えば、GlycoMod、Glycosuiteなど)を利用することができる。
【実施例】
【0051】
以下、実施例及び比較例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【0052】
[比較例1]
α2−6シアル酸を有する糖鎖A(上記の式(A)、5nmol)、α2−3シアル酸を有する糖鎖B(上記の式(B)、5nmol)を、BlotGlycoキット(住友ベークライト株式会社製)のゲルに結合させた。
【0053】
【化1】

【0054】
【化2】

【0055】
各シアロ糖鎖が固定化されたゲルを、HClを用いてpH3.5に合わせた1Mのアセトヒドラジド水溶液30μlに溶解し、1MのEDAC溶液4μlを添加し、2時間室温で反応させアミド化を行った。反応後、BlotGlycoキットの洗浄方法に従って過剰試薬を除去し、BlotGlycoキットの再遊離した糖鎖を標識する方法に従って糖鎖のPA標識を行った。得られたアミド化糖鎖AとBを逆相HPLCにて分析した。逆相HPLCの条件を表1に示す。
【0056】
【表1】

【0057】
なお、表1のA液及びB液は、それぞれ移動相を構成する液体であり、これらA液とB液とを混合して移動相の極性を調整するようになっている。また、表1において、「B:a%(T1分)→B:b%(T2分)」という記載は、B溶液の濃度を、(T2−T1)分間で、a%からb%まで変化させたことを意味する。ただし、T1、T2、a、bはそれぞれ実数を表わす。また、表1において%は体積を基準とした百分率を表わす。
【0058】
[実施例1]
比較例1におけるアミド化の条件は糖鎖とヒドラジドゲルの結合であるヒドラゾン結合を分解し易い条件であることから、修飾時にヒドラゾン結合が加水分解し、糖鎖のPA標識前にゲルから糖鎖が遊離したため、洗浄工程で糖鎖が除去され検出されなかったと考えられる。
【0059】
そこで、アミド化の修飾時にヒドラゾン結合が加水分解されないよう、非水系の有機溶媒であるDMSO中で反応させた。具体的には、各シアロ糖鎖が固定化されたゲルを、DMSOに溶解した2Mのアセトヒドラジド溶液100μlに溶解し、DMSOに溶解した1MのEDAC溶液4μlを添加し、2時間室温で反応させアミド化を行った。反応後、BlotGlycoキットの洗浄方法に従って過剰試薬を除去し、さらにBlotGlycoキットの再遊離した糖鎖を標識する方法に従って糖鎖のPA標識を行った。得られたアミド化糖鎖AとBを上記表1の条件で逆相HPLCにて分析した。
【0060】
その結果、図1の上段、下段に示すように、ピーク1と2がみられた。
【0061】
また、2つのピークをMALDI−MSに供したところピーク1からは質量電荷比(m/z)の値が790.35のシグナル(図2の左)、ピーク2からは質量電荷比(m/z)の値が790.43のシグナル(図2の右)が検出された。
【0062】
これらの質量電荷比(m/z)の値は、糖鎖AとBがアミド化されNaイオンが付加した質量数(790.30)にほぼ一致することから、アミド化されたシアロ糖鎖が得られたことが判明した。
【0063】
[実施例2]
実施例1において、アミド化されたシアロ糖鎖のシグナルが検出されたが、アミド化されていないシアロ糖鎖のシグナルも同時に検出された。シアロ糖鎖の修飾効率をより評価し易くするために、修飾されたシアロ糖鎖と未修飾のシアロ糖鎖が分離される条件(表2)で逆相HPLCを行った。
【0064】
【表2】

【0065】
なお、表2のA液及びB液は、それぞれ移動相を構成する液体であり、これらA液とB液とを混合して移動相の極性を調整するようになっている。また、表2において、「B:a%(T1分)→B:b%(T2分)」という記載は、B溶液の濃度を、(T2−T1)分間で、a%からb%まで変化させたことを意味する。ただし、T1、T2、a、bはそれぞれ実数を表わす。また、表2において%は体積を基準とした百分率を表わす。
【0066】
その結果、図3の上段と下段に示すように、ピーク1〜4が検出された。また、4つのピークの質量分析をネガティブイオンモードで行ったところ、ピーク1からは質量電荷比(m/z)の値が766.28のシグナル(図4の左上)、ピーク2からは質量電荷比(m/z)の値が710.24のシグナル(図4の右上)、ピーク3からは質量電荷比(m/z)の値が766.28のシグナル(図4の左下)、ピーク4からは質量電荷比(m/z)の値が710.24のシグナル(図4の右下)がそれぞれ検出された。766.28の質量電荷比(m/z)の値は、糖鎖AとBがアセトヒドラジドでアミド化された質量数(766.30)にほぼ一致し、710.24の質量電荷比(m/z)の値は、未修飾の糖鎖AとBの質量数(710.26)にほぼ一致した。本実施例においては、修飾された糖鎖AとBが10%以下であることが判明した。
【0067】
[実施例3]
シアル酸を有する糖鎖AとBをより効率的に修飾できる方法について検討を行った。その結果、アミド化試薬としてメチルアミン塩酸塩(非特許文献3)を求核剤として用いる手法を改良することにより、より効率的に修飾することが可能になった。
【0068】
具体的には、各シアロ糖鎖が固定化されたゲルに、DMSOに溶解した2.5Mのメチルアミン塩酸塩溶液を50μL及び99%の純度以上のN-メチルモルホリンを7.45μLを添加し、さらに、DMSOに溶解した0.5MのPyAOP溶液をpHが8.5から7.5の間になるように添加し、15分間室温で反応させアミド化を行った。反応後、BlotGlycoキットの洗浄方法に従って過剰試薬を除去した。この修飾工程を、合計10回繰り返した後、BlotGlycoキットの再遊離した糖鎖を標識する方法に従って糖鎖のPA標識を行った。得られたアミド化糖鎖AとBを表2に示した条件で逆相HPLCを行った。
【0069】
その結果、図5の上段と下段に示すように、ピーク5〜7が検出された。また、3つのピークの質量分析をネガティブイオンモードで行ったところ、ピーク5からは質量電荷比(m/z)の値が723.26のシグナル(図6の左上)、ピーク6からは質量電荷比(m/z)の値が723.26のシグナル(図6の左下)、ピーク7からは質量電荷比(m/z)の値が710.23のシグナル(図6の右下)がそれぞれ検出された。723.26の質量電荷比(m/z)の値は、糖鎖AとBがメチルアミンでアミド化された質量数(723.29)にほぼ一致し、710.24の質量電荷比(m/z)の値は、未修飾の糖鎖AとBの質量数(710.26)にほぼ一致した。本実施例においては、糖鎖AとBは90%以上が修飾されていることが判明した。
【0070】
[比較例2]
実施例3において、縮合剤としてHATUを用いた場合は、PyAOPの反応効率を100%とすると30%以下の収率でしか修飾物が得られなかった。なお、縮合剤としてEDAC、DMT−MMを試したが、修飾物は検出されなかった。
【0071】
[比較例3]
実施例3において、アミド化工程が1回の場合には、修飾物の収率は10%〜40%であった。
【0072】
[比較例4]
実施例3において、アミド化試薬(求核剤)としてアセトヒドラジドを用いて、アミド化の工程を10回繰返した場合、修飾物の収率は約45%であった。
【産業上の利用可能性】
【0073】
本発明によれば、シアロ糖鎖の分離や分析を効率的に行うことが可能となるため、本発明は、例えば、シアロ糖鎖を標的とした新たなバイオマーカーの開発に有用である、従って、本発明は、例えば、医療分野において大きく貢献しうるものである。

【特許請求の範囲】
【請求項1】
シアロ糖鎖をアミド化修飾する方法であって、
(a)生体試料から糖鎖を遊離する工程、
(b)遊離させた糖鎖のアルデヒド基を、その表面にヒドラジド基を有する固相担体に接触させ、ヒドラゾン結合により、糖鎖を担体に捕捉する工程、
(c)捕捉した糖鎖のシアル酸を非水系の溶媒中でアミド化する工程、
を含む方法。
【請求項2】
非水系の溶媒がジメチルスルホキシド、N,N−ジメチルホルムアミド、およびメタノールからなる群より選択される溶媒である、請求項1に記載の方法。
【請求項3】
工程(c)において、アミド化反応の求核剤としてメチルアミン塩酸塩を用いる、請求項1または2に記載の方法。
【請求項4】
工程(c)において、アミド化反応の縮合剤としてPyAOPを用いる、請求項1から3のいずれかに記載の方法。
【請求項5】
アミド化修飾されたシアロ糖鎖を含む糖鎖試料を調製する方法であって、
(a)生体試料から糖鎖を遊離する工程、
(b)遊離させた糖鎖のアルデヒド基を、その表面にヒドラジド基を有する担体に接触させ、ヒドラゾン結合により、糖鎖を担体に捕捉する工程、
(c)捕捉した糖鎖のシアル酸を非水系の溶媒中でアミド化する工程、
(d)捕捉した糖鎖を再遊離する工程、
を含む方法。
【請求項6】
さらに、
(e)再遊離した糖鎖に対し、アミノ基を有する化合物を作用させて還元的アミノ化反応を行い、アミノ基を有する化合物で当該糖鎖を標識する工程、
を含む、請求項5に記載の方法。
【請求項7】
非水系の溶媒がジメチルスルホキシド、N,N−ジメチルホルムアミド、およびメタノールからなる群より選択される溶媒である、請求項5または6に記載の方法。
【請求項8】
工程(c)において、アミド化反応の求核剤としてメチルアミン塩酸塩を用いる、請求項5から7のいずれかに記載の方法。
【請求項9】
工程(c)において、アミド化反応の縮合剤としてPyAOPを用いる、請求項5から8のいずれかに記載の方法。

【図1】
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【図2】
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【図3】
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【図4】
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【図5】
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【図6】
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【公開番号】特開2013−68594(P2013−68594A)
【公開日】平成25年4月18日(2013.4.18)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2011−277091(P2011−277091)
【出願日】平成23年12月19日(2011.12.19)
【出願人】(000002141)住友ベークライト株式会社 (2,927)
【Fターム(参考)】