シガトキシン類を認識するヒト化抗体
【課題】ヒト抗マウス応答を最小限にとどめ、かつシガトキシンに対する強い親和性を示すヒト化抗シガトキシン抗体を提供する。
【解決手段】ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＷ）と、ＦＥＲＭ ＢＰ−８２９２のハイブリドーマにより産生されるシガトキシン類を認識するマウス抗体１０Ｃ９の相補性決定領域（ＣＤＲ）とを含む可変領域をそれぞれ有する重鎖及び軽鎖を少なくとも含み、軽鎖及び重鎖のＦＷの特定の位置のアミノ酸が、前記マウス抗体１０Ｃ９の軽鎖の対応する位置に存在するアミノ酸で置き換えられていることを特徴とする、シガトキシンＣＴＸ３Ｃ又は５１−ヒドロキシ−ＣＴＸ３Ｃであるシガトキシン類を認識するヒト化抗体又はそのフラグメント。
【解決手段】ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＷ）と、ＦＥＲＭ ＢＰ−８２９２のハイブリドーマにより産生されるシガトキシン類を認識するマウス抗体１０Ｃ９の相補性決定領域（ＣＤＲ）とを含む可変領域をそれぞれ有する重鎖及び軽鎖を少なくとも含み、軽鎖及び重鎖のＦＷの特定の位置のアミノ酸が、前記マウス抗体１０Ｃ９の軽鎖の対応する位置に存在するアミノ酸で置き換えられていることを特徴とする、シガトキシンＣＴＸ３Ｃ又は５１−ヒドロキシ−ＣＴＸ３Ｃであるシガトキシン類を認識するヒト化抗体又はそのフラグメント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、シガトキシンＣＴＸ３Ｃ及び５１−ヒドロキシ−ＣＴＸ３Ｃを特異的に認識できるヒト化抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
食中毒シガテラは、ポリネシア、ハワイ、沖縄、カリブ海などの広いサンゴ礁海域で頻発し、年間２万人以上の中毒患者が発生している。シガテラ毒素は植物プランクトンが生産し、食物連鎖を介して魚介類に含まれることとなる。したがって、一旦発生すると多数の食用魚が広範に毒化して深刻な社会問題となることから、シガテラ毒素を迅速に検出することが食中毒シガテラの予防にとって重要である。
【０００３】
食中毒シガテラの主要成分であるシガトキシン類（ｃｉｇｕａｔｏｘｉｎ、ＣＴＸ）の免疫学的手法を用いた検出に関する研究は、ラジオイムノアッセイの発展に伴い、１９７７年頃から始まった。免疫学的手法による研究においては、シガトキシン類を認識する抗体が必要であるが、シガトキシン類は天然からごく微量しか採集されず、培養による生産も困難なことから、抗体を製造することも困難である。ハワイ大学ホカマらは、貴重な毒本体シガトキシンを用いて、モノクローナル抗体を調製し（非特許文献１参照）、この抗体を用いて、シガトキシン類を検出するための試薬、キットなどが開発されている。
【０００４】
ところで、シガトキシン類は、単一の化合物ではなく、多種の毒素の混合物であり、次の一般式：
【０００５】
【化１】
【０００６】
で表される４種（化合物１〜４）が主に知られている。
【０００７】
このような状況のなかで、本発明者らは、以前にシガトキシンＣＴＸ３Ｃの右末端の部分構造であるＩＪＫＬＭ環部を含む合成ハプテンを設計、合成し、この合成ハプテンのタンパク質コンジュゲートでマウスを免疫する工程を含む方法により、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ‐８２９３のハイブリドーマ３Ｄ１１を作製し、該ハイブリドーマを用いて、上記の化合物1及び３のシガトキシン類に特異性の高いモノクローナル抗体３Ｄ１１を製造することに成功した（特許文献１参照）。
【０００８】
さらに、本発明者らは、以前にシガトキシンＣＴＸ３Ｃの左末端の部分構造であるＡＢＣＤＥ環部を含む合成ハプテンを設計、合成し、この合成ハプテンのタンパク質コンジュゲートでマウスを免疫する工程を含む方法により、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ‐８２９２のハイブリドーマ１０Ｃ９を作製し、該ハイブリドーマを用いて、上記の化合物１及び２のシガトキシン類に特異性の高いモノクローナル抗体１０Ｃ９を調製することに成功した（特許文献２参照）。モノクローナル抗体１０Ｃ９のシガトキシンＣＴＸ３Ｃに対する解離定数（Ｋｄ）は、２．８ｎＭであった。
【０００９】
また、本発明者らは、上記の２種のモノクローナル抗体を組み合わせて、検出特性をより改善したサンドイッチ法により、シガトキシンＣＴＸ３Ｃを検出するキットを作製した（特許文献３及び非特許文献２参照）。
【００１０】
シガトキシン類は、神経細胞膜上のナトリウムチャネルに作用するので、神経細胞にナトリウムイオンの流入を引き起こす。この結果、軸索で脱分極が起こり、アセチルコリン等の神経伝達物質放出を促進すると考えられている。一方、シガトキシンの作用機構の研究が進められるにつれて、いくつかのアンタゴニストが発見されてきた。現在、シガトキシン類の解毒剤として、シガトキシン類のアンタゴニストである抗コリン性のアトロピンや、マンニトールの有効性が報告されている（非特許文献３参照）が、治療薬の開発には至っていない。シガテラ中毒を発症した場合、自然回復を待つしかないのが現状であり、現時点では有効な治療方法が存在しない。
【００１１】
これまでに本発明者らは、上記の２種のモノクローナル抗体（３Ｄ１１、１０Ｃ９）について、細胞を用いたｉｎ ｖｉｖｏでの試験及びマウスを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏでの試験を行い、２種の抗体を用いてシガテラ中毒に対する中和が有効であることを確認している（非特許文献４参照）。
【００１２】
１９７５年にハイブリドーマ技術が開発されて以来（非特許文献５参照）、モノクローナル抗体の産生が可能となり、マウスモノクローナル抗体は現在、様々な疾病の診断的手法として広く利用されている。しかしマウス抗体を治療薬としてヒト体内に投与すると、ヒト抗マウス抗体（ｈｕｍａｎ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；ＨＡＭＡ）応答が引き起こされ、この反応は時にヒトにとって致命的なものになりうる。このように、ヒト体内でマウス抗体は免疫原性を持つので、マウス抗体をヒトに直接投与することは回避することが望ましい。しかし、動物由来抗体の免疫原性を軽減するために、ヒトのモノクローナル抗体を作製することは、技術的及び倫理的問題により困難である。
【００１３】
そこで、マウス抗体の抗原結合部位を含む可変領域をヒト抗体の定常領域に接合したキメラ抗体を作製することが行われている。しかし、キメラ抗体もなお、その抗原性が高く、ヒト抗キメラ抗体（ｈｕｍａｎ ａｎｔｉ−ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；ＨＡＣＡ）応答を引き起こすと考えられる（非特許文献６参照）。
これを改善するため、マウス抗体の抗原結合に最も重要な相補性決定領域（ＣＤＲ）のみをヒト抗体フレームワークに移植した（ＣＤＲ−ｇｒａｆｔｉｎｇ）ヒト化抗体が開発されている。このようなヒト化抗体作製技術は１９９０年代から発展し、現在ではがん、白血病、関節リウマチなど多くの疾病にヒト化抗体が医薬品として用いられている。
【００１４】
ヒト化抗体の作製技術は、キメラ抗体作製よりも複雑な技術である。抗原に対する特異性や親和性を維持するためには、ＣＤＲの移植のみでは不十分な場合が多い。抗原との結合に重要なアミノ酸残基は、マウス抗体のフレームワーク領域にも存在するので、ヒト抗体フレームワークのアミノ酸残基をマウス抗体アミノ酸に戻す必要がある。このような残基を同定するには、Ｘ線結晶解析などによる構造情報があると理想的であることが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】特開２００３−５５４００号公報
【特許文献２】特許第３８４５７９６号公報
【特許文献３】特許第３８２０５１９号公報
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｔｏｘｉｃｏｎ 第１５巻、（１９７７年）、第３１７頁
【非特許文献２】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ 第１２５巻、（２００３年）、第７６０８頁
【非特許文献３】Ｌａｕｒｅｎｔら編、Ｃｉｇｕａｔｅｒａ： ｆｉｅｌｄ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｕｉｄｅ／ｕｎ ｇｕｉｄｅ ｐｒａｔｉｑｕｅ、Ｓｅｃｒｅｔａｒｉａｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｐａｃｉｆｉｃ Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ出版、（２００５年）
【非特許文献４】Ｔｏｘｉｃｏｎ 第５３巻、（２００９年）、第８０２頁
【非特許文献５】Ｎａｔｕｒｅ 第２５６巻、（１９７５年）、第４９５頁
【非特許文献６】Ｄｕｂｅｌ編、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ出版、（２００７年）、第１１９頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明の課題は、食中毒シガテラの治療薬開発のために、ヒト抗マウス応答を最小限にとどめ、かつシガトキシン類に対する強い親和性を示すヒト化抗シガトキシン抗体を提供することにある。
本発明者らは、上記の課題を解決するために、従来のマウス抗体をヒト化及び最適化して、従来のマウス抗体と同等の強い親和性をシガトキシン類に対して示すヒト化抗シガトキシン抗体を取得することに成功した。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
すなわち、本発明は、
ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＷ）と、
ＦＥＲＭ ＢＰ−８２９２のハイブリドーマにより産生されるシガトキシン類を認識するマウス抗体１０Ｃ９の相補性決定領域（ＣＤＲ）と
を含む可変領域をそれぞれ有する重鎖及び軽鎖を少なくとも含み、
軽鎖の４６位のアミノ酸と、任意に、１位、２位、７位、６０位及び７１位から選択される少なくとも１つの位置のアミノ酸とが、前記マウス抗体１０Ｃ９の軽鎖の対応する位置に存在するアミノ酸で置き換えられ、及び／又は
重鎖の９４位のアミノ酸と、任意に、５位、７１位及び７３位から選択される少なくとも１つの位置のアミノ酸とが、前記マウス抗体１０Ｃ９の重鎖の対応する位置に存在するアミノ酸で置き換えられており、
シガトキシンＣＴＸ３Ｃ又は５１−ヒドロキシ−ＣＴＸ３Ｃであるシガトキシン類を認識する、ヒト化抗体又はそのフラグメント（以下、単に「ヒト化抗体」ともいう）を提供する。
【００１９】
なお、本明細書において、免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列の番号付けは、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ：Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，１９９１で定義された免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖の番号付けの定義に従う。
任意の免疫グロブリンのアミノ酸配列の番号付けは、http://www.bioinf.org.uk/abs/abnumのウェブサイトで行うこともできる。
【００２０】
また、本発明は、上記のヒト化抗体の重鎖又はそのフラグメントをコードする配列を含むポリヌクレオチド、上記のヒト化抗体の軽鎖又はそのフラグメントをコードする配列を含むポリヌクレオチド、上記のポリヌクレオチドを含むベクター、上記のベクターが導入された宿主細胞、並びに上記の宿主細胞を培養して、上記のヒト化抗体又はそのフラグメントを発現させる工程を含むヒト化抗体又はそのフラグメントを生産する方法も提供する。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によって、シガトキシンに対して強い親和性を示すヒト化抗シガトキシン抗体が提供される。このような特質を有する本発明の抗体は、ヒトに投与したときに、マウス抗体と比較して免疫原性が低下していると考えられるので、食中毒シガテラの予防又は治療用の医薬品の開発に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１−１】マウス抗体１０Ｃ９及び作製したヒト化抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。ｍ１０Ｃ９：マウス１０Ｃ９抗体；１ＧＫＶ１Ｄ−３９＊０１：ヒトｇｅｒｍｌｉｎｅ配列の軽鎖Ｖ領域；１ＧＫＪ２＊０１：ヒトｇｅｒｍｌｉｎｅ配列の軽鎖Ｊ領域；ｈ１０Ｃ９ｇ−ＶＬ：グラフト化抗体；各ｈ１０Ｃ９ｄ−ＶＬ及びｈ１０Ｃ９ｏ−ＶＬ：設計したヒト化抗体；１ＧＫＣ＊０１：ヒトｇｅｒｍｌｉｎｅ配列の軽鎖定常領域。
【図１−２】マウス抗体１０Ｃ９及び作製したヒト化抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。ｍ１０Ｃ９：マウス１０Ｃ９抗体；１ＧＫＶ４−３１＊０３：ヒトｇｅｒｍｌｉｎｅ配列の重鎖Ｖ領域；１ＧＨＪ４＊０１：ヒトｇｅｒｍｌｉｎｅ配列の重鎖Ｊ領域；ｈ１０Ｃ９ｇ−ＶＨ：グラフト化抗体；各ｈ１０Ｃ９ｄ−ＶＨ及びｈ１０Ｃ９ｏ−ＶＨ：設計したヒト化抗体；１ＧＨＧ１＊０１：ヒトｇｅｒｍｌｉｎｅ配列の重鎖定常領域。
【図２】大腸菌内でマウス抗体及びヒト化抗体を産生するために使用されるＦａｂ発現ベクターの例を示す図である。
【図３】精製したマウス１０Ｃ９抗体及び記載されるヒト化抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す図である。
【図４】マウス１０Ｃ９抗体及び記載されるヒト化抗体を、抗マウス抗体及び／又は抗ヒト抗体で検出したウェスタンブロッティングの結果を示す図である。
【図５】マウス１０Ｃ９抗体及び各ヒト化抗体のＣＴＸ３Ｃ−ＡＢＣＤＥに対する抗原結合性をＥＬＩＳＡ法で調べた結果を示すグラフである。
【図６】精製したマウス１０Ｃ９抗体及び各ヒト化抗体のＣＴＸ３Ｃ−ＡＢＣＤＥに対する結合性をＢｉａｃｏｒｅで調べた結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本明細書において、「シガトキシン類」とは、マウス抗体１０Ｃ９が認識して結合できるシガトキシンＣＴＸ３Ｃ及び５１−ヒドロキシ−ＣＴＸ３Ｃから選択されるシガトキシンのことをいう。
【００２４】
本明細書において、「免疫グロブリン」及び「抗体」との用語は、同等の意味を有すると解される。「抗体」との用語は、一般的に、それに対する特定の「抗原」との関係において、機能に注目した名称であると解される。
【００２５】
本発明のヒト化抗体又はそのフラグメントは、シガトキシンＣＴＸ３Ｃ又は５１−ヒドロキシ−ＣＴＸ３Ｃであるシガトキシン類を認識して、これと結合できる。本発明のヒト化抗体のフラグメントとは、抗原に結合できるフラグメントであればよく、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2フラグメントを含む。
【００２６】
一般に、抗体分子の基本構造は、各クラス共通で、分子量５万〜７万の重鎖と２〜３万の軽鎖から構成される。重鎖は、通常約４４０個のアミノ酸を含むポリペプチド鎖からなり、クラスごとに特徴的な構造をもち、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥに対応してγ、μ、α、δ、ε鎖とよばれる。さらにＩｇＧには、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４が存在し、それぞれγ１、γ２、γ３、γ４とよばれている。軽鎖は、通常約２２０個のアミノ酸を含むポリペプチド鎖からなり、Ｌ型とＫ型の２種が知られており、それぞれλ、κ鎖とよばれる。抗体分子の基本構造のペプチド構成は、それぞれ相同な２本の重鎖及び２本の軽鎖が、ジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合）及び非共有結合によって結合され、分子量１５万〜１９万である。２種の軽鎖は、どの重鎖とも対をなすことができる。個々の抗体分子は、常に同一の軽鎖２本と同一の重鎖２本からできている。
【００２７】
鎖内Ｓ−Ｓ結合は、重鎖に四つ（μ、ε鎖には五つ）、軽鎖には二つあって、アミノ酸１００〜１１０残基ごとに一つのループを成し、この立体構造は各ループ間で類似していて、構造単位あるいはドメインとよばれる。重鎖、軽鎖ともにＮ末端に位置するドメインは、同種動物の同一クラス（サブクラス）からの標品であっても、そのアミノ酸配列が一定せず、可変領域（Ｖ領域、ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ、可変部）とよばれている（各ドメインは、それぞれ、ＶＨ及びＶＬと表される）。これよりＣ末端側のアミノ酸配列は、各クラスあるいはサブクラスごとにほぼ一定で定常領域（Ｃ領域、ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎ、定常部）とよばれている（各ドメインは、それぞれ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３あるいはＣＬと表される）。軽鎖及び重鎖の中で、可変及び定常領域は、重鎖も同じく約１０個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域を内含している状態で、約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって連結されている（一般に、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（基礎免疫学）（Ｐａｕｌ，Ｗ．編，第２版，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，１９８９、第７章を参照のこと）。
【００２８】
抗体の抗原決定部位はＶＨ及びＶＬによって構成され、結合の特異性はこの部位のアミノ酸配列によっている。一方、補体や各種細胞との結合といった生物学的活性は各クラスＩｇのＣ領域の構造の差を反映している。重鎖と軽鎖の可変領域の可変性は、どちらの鎖にも存在する３つの小さな超可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）にほぼ限られることがわかっており、これらの領域を相補性決定領域（ＣＤＲ、ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）と呼んでいる。可変領域の残りの部分はフレームワーク領域（ＦＷ、ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ）とよばれ、比較的一定である。通常、各可変領域の相補性決定領域の５〜１０個のアミノ酸だけが抗原結合部位を形成している。
通常、抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域には、３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１〜３）と、４つのＦＷ（ＦＷ１〜４）が含まれる。
【００２９】
本明細書において、「キメラ抗体」とは、可変領域がマウス抗体（ドナー異種抗体とも称する）由来であり、定常領域がヒト免疫グロブリン由来である抗体のことである。
本明細書において、「ヒト化抗体」とは、抗原特異的なマウス抗体分子の相補性決定領域（抗原結合部位）以外がヒト免疫グロブリンに由来する組換え抗体のことである。ヒト化抗体は、その機能の向上のためにアミノ酸の改変（置換、挿入、欠失及び／又は付加）を含むことができる。
【００３０】
一般に、ヒト化抗体の作製においては、相補性決定領域のアミノ酸配列のみを鋳型のヒト抗体フレームワークに移植しただけ（グラフト化抗体）では、多くの場合、オリジナルのマウス抗体よりも抗原結合活性が低下することが知られている。
本発明に用いられるマウス抗体１０Ｃ９のＣＤＲを、ヒト免疫グロブリンのフレームワークに移植することのみにより得られるグラフト化抗体も、シガトキシンＣＴＸ３Ｃに対する結合性は有するものの、抗原親和性が極めて低く、抗体医薬としての使用には好ましくないことが確認された（後記実施例Ｄ−５及びＤ−６を参照）。
【００３１】
本発明者らは、このようなヒト化抗体の活性低下を改善し、かつ、抗体医薬として使用するためにより優れたヒト化抗体を得るために検討を重ねた結果、上記の本発明のヒト化抗シガトキシン類抗体が、従来のマウス抗シガトキシン類抗体と比較して、抗原親和性を維持しつつ、免疫原性が低下され得るという有意に改善された特性を有することを見出した。
【００３２】
本発明のヒト化抗体に含まれるヒト免疫グロブリン（以下、「Ｉｇ」ともいう）のＦＷ領域は、マウス抗体１０Ｃ９のＦＷと同じ又は類似のコンホメーションをとることが好ましい。このことにより、マウス抗体のＣＤＲと融合させたときに、抗原との結合のための正しい空間的配向が保持できる確率が高くなる。
このために、本発明では、軽鎖のＦＷの４６位のアミノ酸と、任意に、１位、２位、７位、６０位及び７１位から選択される少なくとも１つの位置のアミノ酸とが、前記マウス抗体１０Ｃ９の軽鎖の対応する位置に存在するアミノ酸で置き換えられ、及び／又は
重鎖のＦＷの９４位のアミノ酸と、任意に、５位、７１位及び７３位から選択される少なくとも１つの位置のアミノ酸とが、前記マウス抗体１０Ｃ９の重鎖の対応する位置に存在するアミノ酸で置き換えられている。
【００３３】
上記の軽鎖及び重鎖のＦＷ領域内のマウス抗体１０Ｃ９の対応する位置に存在するアミノ酸で置き換えるアミノ酸は、軽鎖及び重鎖においてそれぞれ少なくとも１つである。軽鎖では、４６位のアミノ酸と、上記の任意に選択される位置のアミノ酸の１つ、２つ、３つ、４つ又は５つの位置のさらなるアミノ酸を置き換えることができ、重鎖では、９４位のアミノ酸と、上記の任意に選択される位置のアミノ酸の１つ、２つ又は３つの位置のさらなるアミノ酸を置き換えることができる。
【００３４】
本発明のヒト化抗体の重鎖及び軽鎖のＦＷ領域が由来するヒト免疫グロブリンは、天然に存在するヒト免疫グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ又はＩｇＥ）のＦＷ領域の配列であってもよいし、いくつかのサブクラスのヒト免疫グロブリンのＦＷ領域に共通するコンセンサス配列でもあり得る。Ｄｕｂｅｌ編，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｔｈｅｒｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ出版（２００７）を参照。
重鎖及び軽鎖のそれぞれに含まれる複数のＦＷ領域（ＦＷ１〜ＦＷ４）は、同じサブクラスのヒトＩｇに由来してもよいし、異なるサブクラスのヒトＩｇに由来してもよい。また、これらの複数のＦＷ領域は、同じ免疫グロブリンに由来してもよいし、異なる免疫グロブリンに由来してもよい。
【００３５】
ヒト免疫グロブリンのＦＷ領域のアミノ酸配列は公知であり、例えばＥｎｔｒｅｚ Ｐｒｏｔｅｉｎ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=protein）などのデータベースから入手できる。
【００３６】
上記のＦＷ領域として、ヒト免疫グロブリンのｇｅｒｍｌｉｎｅ配列を利用することもできる（Ｄｕｂｅｌ編，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ出版，ｐ．１１９，２００７；Ｈｗａｎｇら，Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｖｏｌ．３６，ｐ．３５，２００５）。ｇｅｒｍｌｉｎｅ配列とは、体細胞変異が生じる前の生物が元来有する生殖細胞の遺伝子系列であり、ヒト免疫グロブリンについてもデータベースが公開されている（http://imgt.cines.fr//IMGT#GENE-DB/GENElect?query=4.2+&species=Homo+sapiens）。
ヒトｇｅｒｍｌｉｎｅ配列は、特異的なモチーフの発現が最小であり、免疫原性（免疫システムが非自己として認識する可能性）を低く抑えることができると考えられている。
【００３７】
本発明のヒト化抗体のＦＷ領域は、マウス抗体１０Ｃ９の可変領域全体の配列と相同性が高くなるように選択したｇｅｒｍｌｉｎｅ配列に由来することが好ましい。このようにＦＷ領域を選択することにより、マウス抗体の重要なアミノ酸残基と同じ位置で等しいアミノ酸残基を有するＦＷ領域を用いることができる。また、ｇｅｒｍｌｉｎｅ配列を用いると、他の免疫グロブリン配列を用いるよりも、抗原結合活性の損失率が低いという利点もある。
【００３８】
本発明のヒト化抗体に用いるためのヒト免疫グロブリン配列は、既知のヒト免疫グロブリンｇｅｒｍｌｉｎｅ配列のデータベースを利用して、軽鎖及び重鎖それぞれについてマウス抗体可変領域のアミノ酸配列と相同性が高い配列を、コンピュータにより（例えばＢＬＡＳＴにより）比較することによって同定できる。この比較により、マウス抗体１０Ｃ９の可変領域と高い配列同一性を示すヒトｇｅｒｍｌｉｎｅからの軽鎖及び重鎖フレームワーク領域を選択できる。
【００３９】
本発明のヒト化抗体は、実質的にヒトＩｇからのＦＷ領域と、実質的にマウス抗体１０Ｃ９からのＣＤＲとを含む。このようなアミノ酸配列の並置は、天然には見られないので、ある種のアミノ酸の改変を加えることにより、より天然に近いコンホメーションを有し、抗原結合親和性の向上を導くことができる。
よって、得られるヒト化抗体の特性を最適化するために、フレームワーク領域内でどのアミノ酸残基を置換すればよいかを決定する（バックミューテーション残基）。一般に、マウス抗体に由来する残基をヒト化抗体に導入することは、ヒトの体内でのＨＡＭＡ応答を引き起こす危険性を増大させる可能性が高いので、最小限に抑えることが好ましい。
【００４０】
ＣＤＲコンホメーション及び／又は抗原への結合に対して考えられるその影響に基づいて、ＦＷ領域内で置換すべきアミノ酸を同定できる。
置換すべきアミノ酸残基は、（１）抗原に直接、非共有的に結合するアミノ酸残基、（２）ＣＤＲ領域に隣接するか、Ｃｈｏｔｈｉａら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．１９６，ｐ．９０１，１９８７；Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３４２，ｐ．８７８，１９８９）により提案される代替的定義づけの下でＣＤＲ領域の一部であるか、ＣＤＲループの立体配座の支持に関与するか（Ｆｏｏｔｅら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．２２４，ｐ．４８７，１９９２）、又はその他の形でＣＤＲ領域と相互作用するアミノ酸残基、又は（３）ＶＬ−ＶＨインタフェイスに参与するアミノ酸（Ｃｈｏｔｈｉａら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．１８６，ｐ．６５１，１９８５）であることが好ましい。
【００４１】
或いは、ＦＷ領域内で置換すべきアミノ酸残基は、マウス免疫グロブリン配列中でマウスの体細胞変異（ソマティック変異）が導入されたと考えられる位置に対応する位置のヒトＦＷ領域内のアミノ酸残基が好ましい。マウス免疫グロブリン中で体細胞変異が導入されたと考えられるアミノ酸残基は、マウス抗体１０Ｃ９のアミノ酸配列を、マウス免疫グロブリンｇｅｒｍｌｉｎｅ配列と、ＣｌｕｓｔａｌＷなどのアルゴリズムをデフォルト設定で用いて相同性がなるべく高くなるように整列させ、マウス抗体１０Ｃ９中の配列がｇｅｒｍｌｉｎｅ配列とは異なる位置のアミノ酸残基を選択することにより決定できる。体細胞変異が導入されたと考えられる位置のアミノ酸残基は、ヒト抗体にとっては普通でないアミノ酸であるので、マウス免疫グロブリン中で体細胞変異が導入された位置に対応する位置のヒト免疫グロブリンのアミノ酸をマウス抗体１０Ｃ９の対応する位置のアミノ酸残基で置換することにより、抗体の抗原結合性の低下を最小限に抑えて、ヒト化抗体を作製できる。
【００４２】
マウス１０Ｃ９抗体の立体構造は、Ｘ線結晶構造解析によって以前に報告されている（Ｕｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２８３，ｐ．１９４４０，２００８）。この立体構造情報に基づいて、抗原に直接結合するアミノ酸残基、及び抗原−抗体結合に間接的に関わる（結合部位の構造を維持する上で重要な）アミノ酸残基を同定できる。
【００４３】
上記の情報に基づいて鋭意検討を重ねた結果、本発明のヒト化抗体は、軽鎖の４６位と、任意に、１位、２位、７位、６０位及び７１位の少なくとも１つ、例えば１つ、２つ、３つ、４つ又は５つの位置のアミノ酸残基が、マウス抗体１０Ｃ９の対応する位置のアミノ酸残基で置き換えられ、かつ重鎖の９４位と、任意に、５位、７１位及び７３位の少なくとも１つ、例えば１つ、２つ又は３つの位置のアミノ酸残基が、マウス抗体１０Ｃ９の対応する位置のアミノ酸残基で置き換えられたものであることにより、シガトキシン類との良好な抗原結合特性を示すことが見出された。
これらの置換され得るアミノ酸は、図１に下線を付して示す。
【００４４】
本明細書において、「マウス抗体１０Ｃ９の対応する位置のアミノ酸残基」とは、上記のＫａｂａｔらによる免疫グロブリンの番号付けに従って番号を付したときに、ヒト免疫グロブリン中のアミノ酸残基と同じ番号を付与される位置のアミノ酸残基のことである。
【００４５】
本発明のヒト化抗体に用いられるマウス抗体１０Ｃ９のＣＤＲは、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに２００３年２月１３日に、ブダペスト条約に基づく寄託の移管申請により受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８２９２として寄託されたハイブリドーマ１０Ｃ９から生成されるマウス抗体１０Ｃ９のＣＤＲである。このマウス抗体１０Ｃ９は、シガトキシンＣＴＸ３Ｃ及び５１−ＯＨ−ＣＴＸ３ＣのＡＢＣＤＥ環部を特異的に認識する。この抗体については、特許第３８４５７９６号及び特許第３８２０５１９号を参照されたい。
【００４６】
マウス抗体１０Ｃ９のアミノ酸配列は、当該技術において公知の方法により決定できる。マウス抗体１０Ｃ９の軽鎖可変領域ＶＬ、軽鎖定常領域ＣＬ、重鎖可変領域ＶＨ及び重鎖定常領域ＣＨ１のｃＤＮＡ配列及びそれらから推測されるアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１、３、５及び７（ｃＤＮＡ配列）及び配列番号２、４、６及び８（アミノ酸配列）に示す。
【００４７】
本発明のヒト化抗体は、より好ましくは、配列番号１５〜１９及び２１のいずれか１つに示すアミノ酸配列を有する軽鎖と、配列番号２２〜２５及び２７のいずれか１つに示すアミノ酸配列を有する重鎖とを含む。
上記のヒト化抗体は、最も好ましくは、配列番号２１に示すアミノ酸配列を有する軽鎖と、配列番号２７に示すアミノ酸配列を有する重鎖とを含む。
【００４８】
本発明のヒト化抗体の定常領域としては、従来公知のヒト免疫グロブリンの定常領域を用いることができる。ヒトＩｇの定常領域は、軽鎖定常領域（ＣＬ領域）及び重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）からなるが、本発明のヒト化抗体又はそのフラグメントは、シガトキシン類との結合性を有するように、これらの定常領域のいずれかを適切に有することができる。
ヒト免疫グロブリンの可変領域について述べたことと同様に、上記の定常領域も、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ又はＩｇＥのサブクラスのヒト免疫グロブリンのいずれに基づくものであってもよい。好ましくは重鎖定常領域としてはヒトＩｇγ１を、また、軽鎖定常領域としてはヒトＩｇκを用いることができる。
また、軽鎖及び重鎖のそれぞれの定常領域は、同じサブクラスのヒトＩｇに基づいてもよいし、異なるサブクラスのヒトＩｇに基づいてもよい。
【００４９】
本発明のヒト化抗体は、本願明細書に開示される、本発明のヒト化抗体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを当該分野で公知の方法を使用して作製し、該ポリヌクレオチドを発現ベクターに導入し、得られた発現ベクターを宿主細胞に導入し、宿主細胞を培養することを含む方法により得ることができる。
培養後の培養液から、ヒト化抗体を精製してもよい。
上記の各工程は、当該分野で公知の種々の方法を使用して行うことができる。
【００５０】
上記の本発明の抗体の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、例えば、当業者に公知の核酸合成方法に従って、マウス１０Ｃ９抗体の重鎖及び軽鎖の各々のＣＤＲをコードする遺伝子断片を調製し、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域をコードする遺伝子断片を調製し、所定の位置に所定の変異を導入し、軽鎖及び重鎖のそれぞれのＣＤＲとＦＷ領域と定常領域の配列とを連結することを含む方法によって作製することができる。
核酸の合成は、化学的な核酸合成法を用いるか、適切な鋳型及びプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことにより増幅させる方法を用いることができる。
フレームワーク領域の所定の部位に所定の変異を導入する方法としては、部位特異的変異誘発法（Ａｕｓｅｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，８．１〜８．５章，１９８７）などの当業者に公知の種々の方法が使用され得る。
【００５１】
上記の重鎖及び軽鎖をコードするポリヌクレオチドは、それぞれ同じ発現ベクターに導入してもよいし、別々の発現ベクターに導入してもよい。
本明細書において、「発現ベクター」とは、遺伝子からのタンパク質の宿主細胞での発現に必要な配列（コードされる発現させるポリヌクレオチドに機能可能に連結されたプロモーター、リボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、転写終結部位など）を備えたベクターのことをいう。
【００５２】
ヒト化抗体遺伝子を連結させる発現ベクターとしては、ヒト化抗体遺伝子を発現できるものであれば特に制限されず、細菌由来、ウイルス由来（例えばアデノウイルス、レトロウイルス）などの公知の発現ベクターを用いることができる。
なお、発現ベクターとして予めヒトＩｇ定常領域遺伝子を保持するものを利用すれば、これに所望の配列を有する可変領域遺伝子を挿入するだけでヒト化抗体を発現できる発現ベクターとなるため好ましい。このような発現ベクターとしては、ｐＦＵＳＥ２−ＣＬＩｇ−ｈｋ、ｐＦＵＳＥ−ＣＨＩｇ−ｈＧ１（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社）などが知られている。
【００５３】
本発明の発現ベクターが含み得るプロモーターとしては、宿主細胞が大腸菌である場合、例えば、Ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｒｅｃＡ プロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔａｃプロモーターなどが挙げられる。宿主細胞がバチルス属菌の場合、プロモーターとしては、ＳＬ０１プロモーター、ＳＰ０２プロモーター、ｐｅｎＰ プロモーターなどが挙げられる。宿主細胞が酵母である場合、プロモーターとしては、例えば、ＰＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターが挙げられる。また、宿主が哺乳動物細胞等の真核細胞である場合、ＳＶ４０由来のプロモーター、ヒトＥＦ−１α由来プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、ヒートショックプロモーターなどが挙げられる。
【００５４】
上記の発現ベクターを導入する宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞のいずれであってもよく、発現ベクターの種類に応じて適宜選択できる。例えば、大腸菌（エシェリキア属菌）、バチルス属などの細菌細胞、サッカロマイセス属、ピキア属などの酵母細胞、Ｓｆ９などの昆虫細胞、哺乳動物細胞などを用いることができる。なかでも、簡便にヒト化抗体を生産できるので、大腸菌が好ましい。
上記の発現ベクターを宿主細胞に導入する方法は、宿主細胞の種類に応じて適宜選択でき、例えば、宿主細胞が大腸菌である場合、塩化カルシウム法を用いることができる。
【００５５】
発現ベクターを導入した宿主細胞は、宿主細胞の種類に応じた適切な培地中で、従来公知の方法に従って培養することにより、本発明のヒト化抗体を作製できる。
【００５６】
上記の培養は、特に宿主細胞が細菌である場合、栄養培地中で行うことが好ましい。栄養培地は、形質転換体の生育に必要な炭素源、無機窒素源もしくは有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、例えばグルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖など、無機窒素源もしくは有機窒素源としては、例えばアンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などが挙げられる。また、所望により他の栄養素（例えば、無機塩（例えば塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム）、ビタミン類、抗生物質（例えばテトラサイクリン、ネオマイシン、アンピシリン、カナマイシン等）など）を含んでいてもよい。
【００５７】
上記の宿主細胞が大腸菌である場合、好ましい培地としてＬＢ培地、Ｍ９培地（Ｍｉｌｌｅｒら、Ｅｘｐ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｐ．４３１，１９７２）などが例示される。この場合、培養は、必要により通気、撹拌しながら、通常１４〜４３℃、約３〜２４時間行うことができる。
宿主細胞がバチルス属菌の場合、必要により通気、撹拌をしながら、通常３０〜４０℃、約１６〜９６時間培養を行うことができる。
【００５８】
宿主細胞が酵母である場合、培地としては、例えばＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒ最小培地（Ｂｏｓｔｉａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．７７，ｐ．４５０５，１９８０）が挙げられ、ｐＨは５〜８であることが望ましい。培養は、通常、約２０〜３５℃で約１４〜１４４時間行なわれ、必要により通気や撹拌を行うこともできる。
宿主細胞が哺乳動物細胞の場合、培地としては、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地（Ｅａｇｌｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．１２２，ｐ．５０１，１９５２）、ＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．８，ｐ．３９６，１９５９）、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｅｏｒｇｅ Ｅ．ら，Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．，Ｖｏｌ．１９９，ｐ．５１９，１９６７）、１９９培地（Ｍｏｒｇａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．７３，ｐ．１，１９５０）等を用いることができる。培地のｐＨは約６〜８であるのが好ましく、培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜７２時間行なわれ、必要により通気や撹拌を行うこともできる。
【００５９】
宿主細胞が昆虫細胞の場合、例えば胎児牛血清を含むＧｒａｃｅ’ｓ培地（Ｓｍｉｔｈら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８２，ｐ．８４０４，１９８５）等が挙げられ、そのｐＨは約５〜８であるのが好ましい。培養は通常約２０〜４０℃で１５〜１００時間行なわれ、必要により通気や撹拌を行うこともできる。
【００６０】
上記の培養後、培養した宿主細胞及び／又は培養液を回収し、宿主細胞内及び／又は培養上清中に蓄積された抗体を単離して精製できる。
ヒト化抗体を単離、精製する方法としては、例えば塩析、溶媒沈澱法等の溶解度を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動など分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーやヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーなどの荷電を利用する方法、プロテインＡなどのアフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動などの等電点の差を利用する方法などが挙げられる。
【００６１】
こうして得られたヒト化抗シガトキシン抗体の抗原活性（抗原親和性）は、例えば、後記実施例に記載されるようなシガトキシンＣＴＸ−３Ｃを用いたＥＬＩＳＡや、Ｂｉａｃｏｒｅ（ＧＥヘルスケア・ジャパン社）などにより測定可能である。
【００６２】
本発明は、本発明のヒト化抗体又はそのフラグメントをコードする配列を含むポリヌクレオチドも提供する。
本明細書において、「コードする」とは、ｍＲＮＡに転写され、タンパク質に翻訳されたときに、コードされるアミノ酸配列を有するタンパク質を生成し得る遺伝子情報を、該ポリヌクレオチドが有することを意味する。
上記のポリヌクレオチドは、より好ましくは配列番号３０、３２〜３５及び４１のいずれか１つで表されるポリヌクレオチドを含むか、及び／又は配列番号３１、３７〜３９及び４２のいずれか１つで表されるポリヌクレオチドを含む。
上記のポリヌクレオチドは、最も好ましくは、配列番号４１及び／又は４２のポリヌクレオチドを含む。
【００６３】
本発明は、本発明のヒト化抗体又はそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドを含むベクターも提供する。
本発明のベクターは、上述した当該技術において公知の方法により作製された本発明のヒト化抗体又はそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドを、適切なベクターに挿入することにより得ることができる。本発明のベクターに用いることができるベクターは、上記の発現ベクターについて述べたものと同様である。
本発明のベクターは、上記のポリヌクレオチドの遺伝子産物の発現に必要な配列をさらに有することが好ましい。このような配列は、当該技術において公知であり、例えばコードされるポリヌクレオチドに機能可能に連結されたプロモーター、リボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、転写終結部位などを含む。
上記のベクターは、複製起点、エンハンサー、及び目的に応じて、通常用いられる選択マーカー（例えば、テトラサイクリン、アンピシリン又はカナマイシンに対する耐性遺伝子）を含んでいてもよい。
【００６４】
本発明はまた、上記のベクターが導入された宿主細胞も提供する。好ましい宿主細胞は、上記のとおりである。
【００６５】
本発明はまた、本発明のヒト化抗体又はそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドを適切な発現ベクターに導入し、得られた発現ベクターを適切な宿主細胞に導入し、得られた宿主細胞を培養することを含む、本発明のヒト化抗体又はそのフラグメントの生産方法も提供する。
本発明の生産方法は、宿主細胞及び／又はその培養液からヒト化抗体又はそのフラグメントを精製することをさらに含んでもよい。
本発明の生産方法の各工程は、上記の本発明のヒト化抗体又はそのフラグメントの作製について述べたことと同様である。
【００６６】
本発明のヒト化抗体又はそのフラグメントは、シガトキシン類を認識して結合することができるので、食中毒シガテラにより体内にシガトキシン類が存在する対象者（ヒト）に投与すれば、シガトキシン類を捕捉して、その毒性を低減できる可能性がある。
よって、本発明は、上記のヒト化抗体又はそのフラグメントを含む医薬組成物も提供する。該組成物は、食中毒シガテラの治療又は予防に用いることができる。
【００６７】
上記の組成物は、いずれの投与形態であってもよいが、静脈内投与用の形態が好ましい。
【００６８】
上記の組成物は、ヒト化抗体又はそのフラグメントとともに、少なくとも１種の医薬的に許容される医薬品添加物を含む。用い得る医薬品添加物は、投与形態に応じて、当該技術において公知の適切なものを用いることができる。
例えば静脈内投与用の医薬組成物の場合、医薬的に許容される医薬品添加物としては、溶剤（例えばオリーブ油、大豆油のような油性溶剤、水、アルコール、プロピレングリコールのような親水性溶剤など）、溶解補助剤（例えばポリエチレングリコール、コレステロールなど）、乳化剤（例えば界面活性剤など）、懸濁化剤（ポリビニル系化合物、セルロース類のような親水性高分子、界面活性剤など）、保存剤（例えばパラベン、ソルビン酸など）、着色剤などを用いることができる。
【００６９】
上記の医薬組成物は、対象者に治療又は予防上有効な量で投与することができる。治療又は予防上有効な量は、臨床試験などにより適宜決定できる。
【実施例】
【００７０】
以下に、本発明についてより具体的に理解するために、特定の実施例を示すが、これらは例示目的とするものであって、本発明を限定するものではない。
【００７１】
以下の記載について、キット等を使用した部分については特にことわりの無い限り添付のプロトコールに従った。
【００７２】
Ａ．マウス１０Ｃ９Ｆａｂ断片のクローニング及び配列決定
マウス抗シガトキシン抗体１０Ｃ９については、特許第３８４５７９６号公報に記載されている。
マウス１０Ｃ９抗体を産生するハイブリドーマ細胞（ＦＥＲＭ ＢＰ−８２９２）から、全ＲＮＡを分離した。ＰｒｏＳＴＡＲ ＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄ ＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）を用いて、逆転写により第１ストランドのｃＤＮＡを合成した。マウス抗体Ｆａｂ断片のコーディング配列のクローニングを可能にするように設計されたＰＣＲプライマー（Ｌｅｒｎｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２４６，ｐ．１２７５，１９８９）を用いて、重鎖及び軽鎖Ｆａｂ領域を得た。マウス抗体１０Ｃ９の軽鎖はＬ５とＬ９、重鎖はＨ３とＨ１２のＰＣＲプライマーを組み合わせて用いた（表１）。
【００７３】
【表１】
【００７４】
上記のプライマーを用いてＰＣＲ反応により増幅したｃＤＮＡフラグメントは、約７００ｂｐ長の主要生成物を有した。ｃＤＮＡフラグメントをｐＤｒｉｖｅベクター（ＱＩＡＧＥＮ社）にクローニングした。適正なサイズのインサートを含むベクターを、ＤＴＣＳ−Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ Ｋｉｔ及びＣＥＱ２０００ＸＬ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（ともにベックマンコールター社）を用いて配列決定した。
決定したマウス抗体１０Ｃ９の軽鎖可変領域ＶＬ、軽鎖定常領域ＣＬ、重鎖可変領域ＶＨ及び重鎖定常領域ＣＨ１のｃＤＮＡ配列及びそれらから推測されるアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１、３、５及び７（ｃＤＮＡ配列）及び配列番号２、４、６及び８（アミノ酸配列）に示す。
【００７５】
Ｂ．シガトキシン類を認識するヒト化抗体の設計
（１）フレームワーク構造配列のための相同ヒト抗体の選択
マウス１０Ｃ９軽鎖及び重鎖の可変領域に対して高い同一性を示すヒトｇｅｒｍｌｉｎｅ配列（Ｖ、Ｊ遺伝子領域）を、ＣｌｕｓｔａｌＷを用いたアミノ酸配列の比較により同定した。
マウス１０Ｃ９のＶＬ領域に対して、６１．５％という同一性百分率をもつヒトｇｅｒｍｌｉｎｅのκ鎖Ｖ領域（１ＧＫＶ１Ｄ−３９＊０１；配列番号９）及び７０．４％という同一百分率をもつＪ領域（１ＧＫＪ２＊０１；配列番号１０）が同定された。
【００７６】
マウス１０Ｃ９のＶＨ領域に対して、７０．４％という同一性百分率をもつヒトｇｅｒｍｌｉｎｅのＶ領域（１ＧＨＶ４−３１＊０３；配列番号１１）及び８６．７％という同一百分率をもつＪ領域（１ＧＨＪ４＊０１；配列番号１２）が同定された。
マウス抗体１０Ｃ９の可変領域と高い同一性を有するこれらのヒトｇｅｒｍｌｉｎｅ配列の各々からのフレームワーク構造領域（ＦＷ）のＶ領域及びＪ領域をそれぞれ軽鎖及び重鎖について連結したアミノ酸配列を基本として、本発明のヒト化抗体の軽鎖及び重鎖を設計することにした。
【００７７】
（２）相補性決定領域とフレームワーク構造領域の連結
ヒト化抗体のＶＬ及びＶＨ領域の作製のための次の段階として、マウス１０Ｃ９のＶＬ及びＶＨ領域からのＣＤＲを、（１）で設計したヒトｇｅｒｍｌｉｎｅ配列からのＦＷに連結させた。このマウス抗体のＣＤＲとヒト免疫グロブリンのＦＷ領域とを連結しただけのＶＬ領域及びＶＨ領域のバージョン（グラフト化抗体）を、ｈ１０Ｃ９ｇ−ＶＬ及びｈ１０Ｃ９ｇ−ＶＨと呼ぶこととした。ｈ１０Ｃ９ｇ−ＶＬ及びｈ１０Ｃ９ｇ−ＶＨのアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１３及び１４に示す。
【００７８】
（３）フレームワーク構造領域内のアミノ酸の置換
（ａ）軽鎖
上記のようにして設計されたｈ１０Ｃ９ｇ−ＶＬのアミノ酸配列において、以下の表２に示すように、軽鎖のＦＷの１位、２位、７位、４６位、６０位及び７１位の６個のアミノ酸の少なくとも１つを、マウス抗体１０Ｃ９の対応する位置に存在するアミノ酸に置換した。
【００７９】
【表２】
【００８０】
具体的には、ＦＷ１の位置１、２及び７のアミノ酸（ヒトｇｅｒｍｌｉｎｅ配列内に通常存在するアスパラギン酸、イソロイシン及びセリン）を、マウス抗体１０Ｃ９のＶＬ領域内の対応する位置に見られるグルタミン酸、ロイシン及びトレオニンに変更した。この位置のアミノ酸残基は、マウス免疫グロブリンｇｅｒｍｌｉｎｅ配列をマウス抗体１０Ｃ９の配列と比較したときに変異されている配列であり、マウス１０Ｃ９のＶＬ領域のソマティック変異の位置であると考えられ、抗体−抗原結合や抗体の構造を保持する上で間接的に関係があると考えられる。
【００８１】
ＦＷ２の位置４６のアミノ酸（ヒトｇｅｒｍｌｉｎｅ配列内に通常存在するロイシン）を、マウス抗体１０Ｃ９のＶＬ領域内の対応する位置に見られるアルギニンに変更した。マウス抗体１０Ｃ９のＶＬ領域内のこの位置にあるアルギニンは、結合部位の中央に位置づけされているものとして、既に決定されているマウス１０Ｃ９の立体構造（Ｕｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２８３，ｐ．１９４４０，２００８）内で観察され、抗体−抗原結合の間に抗原と直接相互作用している重要な残基であると考えられる。
【００８２】
ＦＷ３内の位置６０のアミノ酸（ヒトｇｅｒｍｌｉｎｅ配列内に通常存在するセリン）を、マウス抗体１０Ｃ９のＶＬ領域内の対応する位置に見られるグリシンに変更した。この位置にあるアミノ酸残基は、マウス抗体１０Ｃ９のＶＬ領域のソマティック変異の位置で、抗体−抗原結合や構造を保持する上で間接的に関係があると考えられる。
【００８３】
ＦＷ３の位置７１のアミノ酸（ヒトｇｅｒｍｌｉｎｅ配列内に通常存在するフェニルアラニン）を、マウス抗体１０Ｃ９のＶＬ領域内の対応する位置に見られるチロシンに変更した。マウス抗体１０Ｃ９のＶＬ領域内のこの位置にあるチロシンは、マウス１０Ｃ９ＶＬ領域のＣＤＲ２ループを支持する上で重要であると考えられる。この位置におけるフェニルアラニンの存在が、ＣＤＲ１ループの配置を分断する可能性がある。
【００８４】
（ｂ）重鎖
上記のようにして設計されたｈ１０Ｃ９ｇ−ＶＨのアミノ酸配列において、以下の表３に示すように、重鎖のＦＷの５位、７１位、７３位及び９４位の４個のアミノ酸の少なくとも１つを、マウス抗体１０Ｃ９の対応する位置に存在するアミノ酸に改変した。
【００８５】
【表３】
【００８６】
具体的には、ＦＷ１内の位置５のアミノ酸（ヒトｇｅｒｍｌｉｎｅ配列内に通常存在するグルタミン）を、マウス抗体１０Ｃ９ＶＨ領域内の対応する位置で見られるロイシンに変更した。マウス抗体１０Ｃ９ＶＨ領域内のこの位置にあるロイシンは、マウス１０Ｃ９のＶＨ領域のソマティック変異の位置であると考えられ、またＣＤＲ１ループを支持する上で重要であると考えられる。
【００８７】
ＦＷ３の位置７１のアミノ酸（ヒトｇｅｒｍｌｉｎｅ配列内に通常存在するバリン）を、マウス抗体１０Ｃ９のＶＨ領域内の対応する位置に見られるアルギニンに変更した。この位置にあるアルギニンは、マウス抗体１０Ｃ９のＶＨ領域のＣＤＲ２ループを支持する上で重要であると考えられる。この位置におけるバリンの存在が、ＶＨ領域のＣＤＲ２ループの配置を分断する可能性がある。
【００８８】
ＦＷ３の位置７３のアミノ酸（ヒトｇｅｒｍｌｉｎｅ配列内に通常存在するトレオニン）を、マウス抗体１０Ｃ９のＶＨ領域内の対応する位置で見られるセリンに変更した。マウス抗体１０Ｃ９のＶＨ領域内のこの位置にあるセリンは、マウス抗体１０Ｃ９のＶＨ領域のＣＤＲ２ループを支持する上で重要であると考えられる。
【００８９】
ＦＷ３内の位置９４のアミノ酸（ヒトｇｅｒｍｌｉｎｅ内に通常存在するアルギニン）を、マウス抗体１０Ｃ９のＶＨ領域内の対応する位置に見られるシステインに変更した。マウス抗体１０Ｃ９のＶＨ領域内のこの位置にあるシステインは、マウス抗体１０Ｃ９のＶＨ領域のソマティック変異の位置であると考えられ、またＣＤＲ３ループを支持する上で重要であると考えられる。
【００９０】
（４）定常領域の選択
マウス抗体１０Ｃ９の軽鎖のＣＬ及び重鎖のＣＨ１に対して高い同一性を示すヒトｇｅｒｍｌｉｎｅ配列のＣ遺伝子領域を、ＣｌｕｓｔａｌＷを用いたアミノ酸配列の比較により同定した。
マウス抗体１０Ｃ９の軽鎖Ｃ領域に対して、７０．４％という同一性百分率をもつヒトｇｅｒｍｌｉｎｅのκ鎖Ｃ領域（１ＧＫＣ＊０１；配列番号２８）が同定された。
マウス抗体１０Ｃ９の重鎖ＣＨ１領域に対して、６１．９％という同一性百分率をもつヒトｇｅｒｍｌｉｎｅのγ１鎖Ｃ領域（１ＧＨＧ１＊０１；配列番号２９）が同定された。
マウス抗体１０Ｃ９の定常領域と高い同一性を示すこれらのヒトｇｅｒｍｌｉｎｅ配列のＣＬ及びＣＨ１領域を、（３）で設計した可変領域に連結して、ヒト化抗体のＦａｂフラグメントの作製に使用した。
【００９１】
Ｃ．ヒト化抗体をコードするポリヌクレオチドの構築
Ｃ−１．ｈ１０Ｃ９ｄ−ＶＬ及びｈ１０Ｃ９ｄ−ＶＨを含む軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡの作製
（３）で設計した軽鎖及び重鎖の可変領域（ｈ１０Ｃ９ｄ−ＶＬ及びｈ１０Ｃ９ｄ−ＶＨ）を、（４）で選択した軽鎖及び重鎖の定常領域（ＣＬ（１ＧＫＣ＊０１）及びＣＨ１（１ＧＨＧ１＊０１））とそれぞれ連結したヒト化抗体のＦａｂフラグメントの軽鎖及び重鎖をそれぞれコードするＤＮＡを構築した。ＤＮＡの合成は、ＴＡＫＡＲＡ社に委託した。
ヒト化抗体軽鎖ＦａｂフラグメントはＳａｃＩ及びＸｂａＩの制限酵素認識部位をもつように作製し、ｐＭＤ１９内へクローニングさせた。適正な配列をもつクローンを、ｈ１０Ｃ９ｄＦａｂ-Ｌ（配列番号３０）と命名した。
ヒト化抗体重鎖ＦａｂフラグメントはＸｈｏＩ及びＳｐｅＩの制限酵素認識部位をもつように作製し、ｐＭＤ１９内へクローニングさせた。適正な配列をもつクローンを、ｈ１０Ｃ９ｄＦａｂ-Ｈ（配列番号３１）と命名した。
【００９２】
Ｃ−２．ｈ１０Ｃ９ｄ−ＶＬ−ａ〜ｅ又はｈ１０Ｃ９ｏ−ＶＬ、及びｈ１０Ｃ９ｄ−ＶＨ−ａ〜ｄ又はｈ１０Ｃ９ｏ−ＶＨを含む軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡの作製
上記のｈ１０Ｃ９ｄＦａｂ-Ｌ及びｈ１０Ｃ９ｄＦａｂ-Ｈの所望の位置のアミノ酸をマウス抗体１０Ｃ９の対応する位置のアミノ酸に変換するために、シグマジェノシス社に依頼して、表４に示すＰＣＲプライマーを合成した。
変換するアミノ酸の位置に従って選択される２組のプライマーを用いて、部位特異的変異誘発法を応用した市販のキット（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社；ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ）を用いてＤＮＡに変異導入を行った。ＤＴＣＳ−Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ Ｋｉｔ及びＣＥＱ２０００ＸＬ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（ともにベックマンコールター社）によりＤＮＡ配列を決定し、所望の配列をもつクローンを選択した。
【００９３】
【表４】
【００９４】
Ｃ−３．グラフト化抗体の作製
マウス抗体１０Ｃ９のＣＤＲと、ヒト免疫グロブリンのＦＷ領域とを連結したＶＬ領域及びＶＨ領域のバージョン（グラフト化抗体；ｈ１０Ｃ９ｇ−ＶＬ及びｈ１０Ｃ９ｇ−ＶＨ）と、（４）で選択した定常領域とを連結したＦａｂフラグメントは、ｈ１０Ｃ９ｄＦａｂ−ＶＬ及びｈ１０Ｃ９ｄＦａｂ−ＶＨを鋳型として表１のＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより構築された。ＤＴＣＳ−Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ Ｋｉｔ及びＣＥＱ２０００ＸＬ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（ともにベックマンコールター社）により配列決定して、適正な配列をもつクローンを、ｈ１０Ｃ９Ｆａｂｇ−Ｌ（配列番号４３）及びｈ１０Ｃ９Ｆａｂｇ−Ｈ（配列番号４４）と命名した。
【００９５】
Ｄ．マウス抗体及びヒト化抗体の発現及び分析
Ｄ−１．発現プラスミドの構築
マウス抗体及びヒト化抗体の発現には、抗体Ｆａｂ遺伝子を高効率に発現できることが報告されているｐＡＲＡ７（Ｍｉｙａｓｈｉｔａら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．２６７，ｐ．１２４７，１９９７）を発現ベクターとして用いた（図２）。ｐＡＲＡ７ベクターは、アラビノースにより誘導されるａｒａＢプロモーターを含む。さらに、シグナル配列をコードする塩基配列が付加されていて、発現されるポリペプチドは、大腸菌培養上清中に分泌される。
【００９６】
まず、マウス抗体の発現プラスミドは、次のようにして作製した。Ａ．でクローニングしたマウスＦａｂ重鎖をコードするＤＮＡ配列中には、ｐＡＲＡに挿入する際に利用する制限酵素ＸｈｏＩ認識部位が含まれる。そこで、表５に示した２組のプライマーを用いて、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）を用いてＤＮＡに変異導入を行った。ＤＴＣＳ−Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ Ｋｉｔ及びＣＥＱ２０００ＸＬ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（ともにベックマンコールター社）によりＤＮＡ配列を決定し、適正な配列をもつクローンをｍ１０Ｃ９Ｆａｂ−Ｈｍ（配列番号６５）と命名した。
【００９７】
【表５】
【００９８】
上記で作製したマウスＦａｂ重鎖をコードするＤＮＡ（ｍ１０Ｃ９Ｆａｂ−Ｈｍ）を、制限酵素ＸｈｏＩ認識部位及びＳｐｅＩ認識部位を利用して、ｐＡＲＡ７に挿入した。重鎖をコードするＤＮＡが挿入されたプラスミドに、Ａ．でクローニングしたマウスＦａｂ軽鎖をコードするＤＮＡ（ｍ１０Ｃ９Ｆａｂ−Ｌ；配列番号６８）を、制限酵素ＳａｃＩ認識部位及びＸｂａＩ認識部位を利用して挿入し、発現プラスミドを作製した。
【００９９】
ヒト化抗体の発現プラスミドは、以下のようにして作製した。Ｃ．で作製した各々のヒト化Ｆａｂ重鎖をコードするＤＮＡのそれぞれを、制限酵素ＸｈｏＩ認識部位及びＳｐｅＩ認識部位を利用して、ｐＡＲＡ７に挿入した。重鎖をコードするＤＮＡが挿入されたプラスミドに、Ｃ．で作製した各々のヒト化Ｆａｂ軽鎖をコードするＤＮＡのそれぞれを、制限酵素ＳａｃＩ認識部位及びＸｂａＩ認識部位を利用して挿入し、発現プラスミドを作製した。なお、軽鎖及び重鎖の可変領域の組み合わせは、以下の表６に示すとおりである。
【０１００】
【表６】
【０１０１】
これらの発現プラスミドを、大腸菌に導入して増殖させ、市販のプラスミド精製キット（ＱＩＡＧＥＮ社；ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ）により精製し、ＤＮＡ塩基配列解析によりＦａｂのコード領域の配列を確認した。ＤＮＡ塩基配列解析にはＤＴＣＳ−Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ Ｋｉｔ及びＣＥＱ２０００ＸＬ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（ともにベックマンコールター社）を使用した。
【０１０２】
ヒト化１０Ｃ９のうち、ｈ１０Ｃ９ｇＦａｂ及びｈ１０Ｃ９ｏＦａｂについては、マウスアミノ酸に置換した軽鎖内の位置１及び位置２と重鎖内の位置５がｐＡＲＡ７に挿入するための制限酵素認識部位に含まれるので、ｐＡＲＡ７に挿入後、合成プライマー（表７）を用いてヒトｇｅｒｍｌｉｎｅ由来アミノ酸に戻すためのＤＮＡ変異導入を行った。
【０１０３】
【表７】
【０１０４】
Ｄ−２．発現プラスミドによる大腸菌の形質転換及び培養
次に、上記のＤ−１のようにして精製した発現プラスミドを、常法に従って大腸菌ＭＣ１０６１株に導入し、ＬＢ寒天プレート（１００μｇ／ｍｌのアンピシリン含有）に播いて形質転換株を得た。この形質転換株を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＳＢ培地（Ｍｉｙａｓｈｉｔａら、上記文献）で増殖させ、発現誘導剤であるアラビノースを０．２％になるように添加して３０℃で３日間培養を行った。培養終了後、遠心分離を行い、抗体を含む培養上清を回収した。
【０１０５】
Ｄ−３．マウス抗体及びヒト化抗体の精製
上記の培養上清に硫酸アンモニウムを６５％飽和になるように加え、硫安沈殿を行った。遠心分離後の沈殿を１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液に再懸濁し、同緩衝液に対して透析を行った。遠心分離後、上清を０．４５μｍのフィルターでろ過した。この上清を材料として、プロテインＧカラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン社）を用いて精製した。その後、各分画フラクションについてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行うことによって、純度の高いＦａｂが得られたことを確認した（図３；マウス抗体１０Ｃ９Ｆａｂ（ｍ１０Ｃ９Ｆａｂ）、ｈ１０Ｃ９ｄＦａｂ、ｈ１０Ｃ９ｇＦａｂ及びｈ１０Ｃ９ｏＦａｂについてのみ結果を示す）。
【０１０６】
Ｄ−４．マウス抗体及びヒト化抗体の検出
Ｄ−２で作製した大腸菌で発現させたマウス抗体１０Ｃ９のＦａｂ及びそれぞれのヒト化抗体のＦａｂについて、ウェスタンブロッティングにより、アルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）又はアルカリフォスファターゼ標識抗ヒトＩｇＧ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いて、抗体の検出を行った。
【０１０７】
図４の結果から明らかなように、マウス抗体１０Ｃ９（ｍ１０Ｃ９Ｆａｂ）は抗マウス抗体によって検出されるが、抗ヒト抗体によっては検出されない。一方、作製したヒト化抗体ｈ１０Ｃ９ｄＦａｂは抗マウス抗体によって検出されないが、抗ヒト抗体によって検出された。その他のヒト化抗体（ｈ１０Ｃ９ｇＦａｂ、ｈ１０Ｃ９ｏＦａｂ、ｈ１０Ｃ９ｄＦａｂＭ１〜Ｍ９）についても抗ヒト抗体によって検出された。
よって、本発明のヒト化抗体は、抗ヒト抗体により認識されるが、抗マウス抗体によっては認識されないので、ヒトに投与した場合に、免疫原性が低いことが期待される。
【０１０８】
Ｄ−５．ＥＬＩＳＡによる抗原結合性の確認
シガトキシンＣＴＸ３ＣのＡＢＣＤＥ環部の構造を有する抗原（ＣＴＸ３Ｃ−ＡＢＣＤＥという）に対する各ヒト化抗体の結合活性を、マウス１０Ｃ９抗体と比較してＥＬＩＳＡによって検定した。ＥＬＩＳＡの方法は、特許第３８４５７９６号公報に記載された方法に従う。
９６ウェルＥＬＩＳＡ用プレート（ＣＯＳＴＡＲ社）の各ウェルにＣＴＸ３Ｃ−ＡＢＣＤＥ−ＢＳＡコンジュゲートを５０μＬ入れ、４℃で一晩放置して、プレートに固定化した。プレートを洗浄後、１％スキムミルクでブロッキングした。プレートをさらに洗浄した後、連続希釈したマウス抗体又はヒト化抗体を、ウェルに５０μＬずつ添加して、室温で１時間反応させた。
検出は、ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗ヒトＩｇＧ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）又はＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ（ＧＥヘルスケア・ジャパン社）を用いて行った。波長４９０ｎｍにおける吸光度を、マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＲａｄ社）を用いて測定した。
【０１０９】
図５は、マウス抗体１０Ｃ９（ｍ１０Ｃ９Ｆａｂ）とヒト化抗体（ｈ１０Ｃ９ｇＦａｂ、ｈ１０Ｃ９ｄＦａｂ、ｈ１０Ｃ９ｏＦａｂ、ｈ１０Ｃ９ｄＦａｂＭ１〜Ｍ９）の抗原との結合を比較している。その結果、マウスＣＤＲとヒトＩｇのＦＷ領域とを含むグラフト化抗体ｈ１０Ｃ９ｇＦａｂは、マウス抗体１０Ｃ９よりも、抗原に対する結合性が低かった。ｈ１０Ｃ９ｄＦａｂ及びｈ１０Ｃ９ｏＦａｂは、マウス１０Ｃ９抗体と同程度又はそれ以上の結合活性を示すことが確認された。ｈ１０Ｃ９ｄＦａｂＭ１〜Ｍ５、Ｍ７及びＭ８は、ｈ１０Ｃ９ｄＦａｂと比較して同程度又はそれ以上の結合活性を示すことが確認された。
しかし、軽鎖の４６位のアミノ酸がヒト免疫グロブリン由来のアミノ酸であるｈ１０Ｃ９ｄＦａｂＭ６、及び重鎖の９４位のアミノ酸がヒト免疫グロブリン由来のアミノ酸であるｈ１０Ｃ９ｄＦａｂＭ９は、結合活性が低下していることがわかった。
【０１１０】
Ｄ−６．Ｂｉａｃｏｒｅによる結合親和力の測定
マウス抗体１０Ｃ９（ｍ１０Ｃ９Ｆａｂ）又はヒト化抗体のシガトキシンＣＴＸ３Ｃ−ＡＢＣＤＥに対する結合活性を、表面プラズモン共鳴測定法を用いて確認した。
ＣＴＸ３Ｃ−ＡＢＣＤＥ−ＢＳＡコンジュゲートをＳｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５（ＧＥヘルスケア・ジャパン社）に固定化し、ＨＢＳ−ＥＰバッファー（ＧＥヘルスケア・ジャパン社）で連続希釈した各抗体溶液を用いて結合活性を確認した結果を、図６に示す。
Ｋｄ値を求めたところ、マウス抗体１０Ｃ９と比較してｈ１０Ｃ９ｇＦａｂは明らかに親和性が低下していた。
これに対して、ｈ１０Ｃ９ｄＦａｂ、ｈ１０Ｃ９ｏＦａｂ並びにｈ１０Ｃ９ｄＦａｂＭ１〜Ｍ５、Ｍ７及びＭ８は、ＣＴＸ３Ｃ−ＡＢＣＤＥに対するマウス抗体１０Ｃ９と同様又はわずかに良い結合親和力を示すことが確認された。
しかし、軽鎖の４６位のアミノ酸がヒト免疫グロブリン由来のアミノ酸であるｈ１０Ｃ９ｄＦａｂＭ６、及び重鎖の９４位のアミノ酸がヒト免疫グロブリン由来のアミノ酸であるｈ１０Ｃ９ｄＦａｂＭ９は、Ｋｄ値が非常に大きく、シガトキシン類との結合親和性が低いことがわかった。
【０１１１】
従って、本発明のヒト化抗体は、マウス抗体１０Ｃ９とほぼ同様の抗原親和性を有することがわかった。さらに、ヒトＦＷ内のわずかな修正（ＶＬの位置４６及びＶＨの位置９４）だけを有するヒト化抗体（ｈ１０Ｃ９ｏＦａｂ）であっても、マウス抗体と同様の抗原親和性でシガトキシンを認識できることがわかった。
【０１１２】
添付の配列表に示す配列は、以下のものに相当する。
【０１１３】
【表８−１】
【０１１４】
【表８−２】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、シガトキシンＣＴＸ３Ｃ及び５１−ヒドロキシ−ＣＴＸ３Ｃを特異的に認識できるヒト化抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
食中毒シガテラは、ポリネシア、ハワイ、沖縄、カリブ海などの広いサンゴ礁海域で頻発し、年間２万人以上の中毒患者が発生している。シガテラ毒素は植物プランクトンが生産し、食物連鎖を介して魚介類に含まれることとなる。したがって、一旦発生すると多数の食用魚が広範に毒化して深刻な社会問題となることから、シガテラ毒素を迅速に検出することが食中毒シガテラの予防にとって重要である。
【０００３】
食中毒シガテラの主要成分であるシガトキシン類（ｃｉｇｕａｔｏｘｉｎ、ＣＴＸ）の免疫学的手法を用いた検出に関する研究は、ラジオイムノアッセイの発展に伴い、１９７７年頃から始まった。免疫学的手法による研究においては、シガトキシン類を認識する抗体が必要であるが、シガトキシン類は天然からごく微量しか採集されず、培養による生産も困難なことから、抗体を製造することも困難である。ハワイ大学ホカマらは、貴重な毒本体シガトキシンを用いて、モノクローナル抗体を調製し（非特許文献１参照）、この抗体を用いて、シガトキシン類を検出するための試薬、キットなどが開発されている。
【０００４】
ところで、シガトキシン類は、単一の化合物ではなく、多種の毒素の混合物であり、次の一般式：
【０００５】
【化１】
【０００６】
で表される４種（化合物１〜４）が主に知られている。
【０００７】
このような状況のなかで、本発明者らは、以前にシガトキシンＣＴＸ３Ｃの右末端の部分構造であるＩＪＫＬＭ環部を含む合成ハプテンを設計、合成し、この合成ハプテンのタンパク質コンジュゲートでマウスを免疫する工程を含む方法により、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ‐８２９３のハイブリドーマ３Ｄ１１を作製し、該ハイブリドーマを用いて、上記の化合物1及び３のシガトキシン類に特異性の高いモノクローナル抗体３Ｄ１１を製造することに成功した（特許文献１参照）。
【０００８】
さらに、本発明者らは、以前にシガトキシンＣＴＸ３Ｃの左末端の部分構造であるＡＢＣＤＥ環部を含む合成ハプテンを設計、合成し、この合成ハプテンのタンパク質コンジュゲートでマウスを免疫する工程を含む方法により、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ‐８２９２のハイブリドーマ１０Ｃ９を作製し、該ハイブリドーマを用いて、上記の化合物１及び２のシガトキシン類に特異性の高いモノクローナル抗体１０Ｃ９を調製することに成功した（特許文献２参照）。モノクローナル抗体１０Ｃ９のシガトキシンＣＴＸ３Ｃに対する解離定数（Ｋｄ）は、２．８ｎＭであった。
【０００９】
また、本発明者らは、上記の２種のモノクローナル抗体を組み合わせて、検出特性をより改善したサンドイッチ法により、シガトキシンＣＴＸ３Ｃを検出するキットを作製した（特許文献３及び非特許文献２参照）。
【００１０】
シガトキシン類は、神経細胞膜上のナトリウムチャネルに作用するので、神経細胞にナトリウムイオンの流入を引き起こす。この結果、軸索で脱分極が起こり、アセチルコリン等の神経伝達物質放出を促進すると考えられている。一方、シガトキシンの作用機構の研究が進められるにつれて、いくつかのアンタゴニストが発見されてきた。現在、シガトキシン類の解毒剤として、シガトキシン類のアンタゴニストである抗コリン性のアトロピンや、マンニトールの有効性が報告されている（非特許文献３参照）が、治療薬の開発には至っていない。シガテラ中毒を発症した場合、自然回復を待つしかないのが現状であり、現時点では有効な治療方法が存在しない。
【００１１】
これまでに本発明者らは、上記の２種のモノクローナル抗体（３Ｄ１１、１０Ｃ９）について、細胞を用いたｉｎ ｖｉｖｏでの試験及びマウスを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏでの試験を行い、２種の抗体を用いてシガテラ中毒に対する中和が有効であることを確認している（非特許文献４参照）。
【００１２】
１９７５年にハイブリドーマ技術が開発されて以来（非特許文献５参照）、モノクローナル抗体の産生が可能となり、マウスモノクローナル抗体は現在、様々な疾病の診断的手法として広く利用されている。しかしマウス抗体を治療薬としてヒト体内に投与すると、ヒト抗マウス抗体（ｈｕｍａｎ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；ＨＡＭＡ）応答が引き起こされ、この反応は時にヒトにとって致命的なものになりうる。このように、ヒト体内でマウス抗体は免疫原性を持つので、マウス抗体をヒトに直接投与することは回避することが望ましい。しかし、動物由来抗体の免疫原性を軽減するために、ヒトのモノクローナル抗体を作製することは、技術的及び倫理的問題により困難である。
【００１３】
そこで、マウス抗体の抗原結合部位を含む可変領域をヒト抗体の定常領域に接合したキメラ抗体を作製することが行われている。しかし、キメラ抗体もなお、その抗原性が高く、ヒト抗キメラ抗体（ｈｕｍａｎ ａｎｔｉ−ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；ＨＡＣＡ）応答を引き起こすと考えられる（非特許文献６参照）。
これを改善するため、マウス抗体の抗原結合に最も重要な相補性決定領域（ＣＤＲ）のみをヒト抗体フレームワークに移植した（ＣＤＲ−ｇｒａｆｔｉｎｇ）ヒト化抗体が開発されている。このようなヒト化抗体作製技術は１９９０年代から発展し、現在ではがん、白血病、関節リウマチなど多くの疾病にヒト化抗体が医薬品として用いられている。
【００１４】
ヒト化抗体の作製技術は、キメラ抗体作製よりも複雑な技術である。抗原に対する特異性や親和性を維持するためには、ＣＤＲの移植のみでは不十分な場合が多い。抗原との結合に重要なアミノ酸残基は、マウス抗体のフレームワーク領域にも存在するので、ヒト抗体フレームワークのアミノ酸残基をマウス抗体アミノ酸に戻す必要がある。このような残基を同定するには、Ｘ線結晶解析などによる構造情報があると理想的であることが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】特開２００３−５５４００号公報
【特許文献２】特許第３８４５７９６号公報
【特許文献３】特許第３８２０５１９号公報
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｔｏｘｉｃｏｎ 第１５巻、（１９７７年）、第３１７頁
【非特許文献２】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ 第１２５巻、（２００３年）、第７６０８頁
【非特許文献３】Ｌａｕｒｅｎｔら編、Ｃｉｇｕａｔｅｒａ： ｆｉｅｌｄ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｕｉｄｅ／ｕｎ ｇｕｉｄｅ ｐｒａｔｉｑｕｅ、Ｓｅｃｒｅｔａｒｉａｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｐａｃｉｆｉｃ Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ出版、（２００５年）
【非特許文献４】Ｔｏｘｉｃｏｎ 第５３巻、（２００９年）、第８０２頁
【非特許文献５】Ｎａｔｕｒｅ 第２５６巻、（１９７５年）、第４９５頁
【非特許文献６】Ｄｕｂｅｌ編、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ出版、（２００７年）、第１１９頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明の課題は、食中毒シガテラの治療薬開発のために、ヒト抗マウス応答を最小限にとどめ、かつシガトキシン類に対する強い親和性を示すヒト化抗シガトキシン抗体を提供することにある。
本発明者らは、上記の課題を解決するために、従来のマウス抗体をヒト化及び最適化して、従来のマウス抗体と同等の強い親和性をシガトキシン類に対して示すヒト化抗シガトキシン抗体を取得することに成功した。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
すなわち、本発明は、
ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＷ）と、
ＦＥＲＭ ＢＰ−８２９２のハイブリドーマにより産生されるシガトキシン類を認識するマウス抗体１０Ｃ９の相補性決定領域（ＣＤＲ）と
を含む可変領域をそれぞれ有する重鎖及び軽鎖を少なくとも含み、
軽鎖の４６位のアミノ酸と、任意に、１位、２位、７位、６０位及び７１位から選択される少なくとも１つの位置のアミノ酸とが、前記マウス抗体１０Ｃ９の軽鎖の対応する位置に存在するアミノ酸で置き換えられ、及び／又は
重鎖の９４位のアミノ酸と、任意に、５位、７１位及び７３位から選択される少なくとも１つの位置のアミノ酸とが、前記マウス抗体１０Ｃ９の重鎖の対応する位置に存在するアミノ酸で置き換えられており、
シガトキシンＣＴＸ３Ｃ又は５１−ヒドロキシ−ＣＴＸ３Ｃであるシガトキシン類を認識する、ヒト化抗体又はそのフラグメント（以下、単に「ヒト化抗体」ともいう）を提供する。
【００１９】
なお、本明細書において、免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列の番号付けは、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ：Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，１９９１で定義された免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖の番号付けの定義に従う。
任意の免疫グロブリンのアミノ酸配列の番号付けは、http://www.bioinf.org.uk/abs/abnumのウェブサイトで行うこともできる。
【００２０】
また、本発明は、上記のヒト化抗体の重鎖又はそのフラグメントをコードする配列を含むポリヌクレオチド、上記のヒト化抗体の軽鎖又はそのフラグメントをコードする配列を含むポリヌクレオチド、上記のポリヌクレオチドを含むベクター、上記のベクターが導入された宿主細胞、並びに上記の宿主細胞を培養して、上記のヒト化抗体又はそのフラグメントを発現させる工程を含むヒト化抗体又はそのフラグメントを生産する方法も提供する。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によって、シガトキシンに対して強い親和性を示すヒト化抗シガトキシン抗体が提供される。このような特質を有する本発明の抗体は、ヒトに投与したときに、マウス抗体と比較して免疫原性が低下していると考えられるので、食中毒シガテラの予防又は治療用の医薬品の開発に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１−１】マウス抗体１０Ｃ９及び作製したヒト化抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。ｍ１０Ｃ９：マウス１０Ｃ９抗体；１ＧＫＶ１Ｄ−３９＊０１：ヒトｇｅｒｍｌｉｎｅ配列の軽鎖Ｖ領域；１ＧＫＪ２＊０１：ヒトｇｅｒｍｌｉｎｅ配列の軽鎖Ｊ領域；ｈ１０Ｃ９ｇ−ＶＬ：グラフト化抗体；各ｈ１０Ｃ９ｄ−ＶＬ及びｈ１０Ｃ９ｏ−ＶＬ：設計したヒト化抗体；１ＧＫＣ＊０１：ヒトｇｅｒｍｌｉｎｅ配列の軽鎖定常領域。
【図１−２】マウス抗体１０Ｃ９及び作製したヒト化抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。ｍ１０Ｃ９：マウス１０Ｃ９抗体；１ＧＫＶ４−３１＊０３：ヒトｇｅｒｍｌｉｎｅ配列の重鎖Ｖ領域；１ＧＨＪ４＊０１：ヒトｇｅｒｍｌｉｎｅ配列の重鎖Ｊ領域；ｈ１０Ｃ９ｇ−ＶＨ：グラフト化抗体；各ｈ１０Ｃ９ｄ−ＶＨ及びｈ１０Ｃ９ｏ−ＶＨ：設計したヒト化抗体；１ＧＨＧ１＊０１：ヒトｇｅｒｍｌｉｎｅ配列の重鎖定常領域。
【図２】大腸菌内でマウス抗体及びヒト化抗体を産生するために使用されるＦａｂ発現ベクターの例を示す図である。
【図３】精製したマウス１０Ｃ９抗体及び記載されるヒト化抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す図である。
【図４】マウス１０Ｃ９抗体及び記載されるヒト化抗体を、抗マウス抗体及び／又は抗ヒト抗体で検出したウェスタンブロッティングの結果を示す図である。
【図５】マウス１０Ｃ９抗体及び各ヒト化抗体のＣＴＸ３Ｃ−ＡＢＣＤＥに対する抗原結合性をＥＬＩＳＡ法で調べた結果を示すグラフである。
【図６】精製したマウス１０Ｃ９抗体及び各ヒト化抗体のＣＴＸ３Ｃ−ＡＢＣＤＥに対する結合性をＢｉａｃｏｒｅで調べた結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本明細書において、「シガトキシン類」とは、マウス抗体１０Ｃ９が認識して結合できるシガトキシンＣＴＸ３Ｃ及び５１−ヒドロキシ−ＣＴＸ３Ｃから選択されるシガトキシンのことをいう。
【００２４】
本明細書において、「免疫グロブリン」及び「抗体」との用語は、同等の意味を有すると解される。「抗体」との用語は、一般的に、それに対する特定の「抗原」との関係において、機能に注目した名称であると解される。
【００２５】
本発明のヒト化抗体又はそのフラグメントは、シガトキシンＣＴＸ３Ｃ又は５１−ヒドロキシ−ＣＴＸ３Ｃであるシガトキシン類を認識して、これと結合できる。本発明のヒト化抗体のフラグメントとは、抗原に結合できるフラグメントであればよく、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2フラグメントを含む。
【００２６】
一般に、抗体分子の基本構造は、各クラス共通で、分子量５万〜７万の重鎖と２〜３万の軽鎖から構成される。重鎖は、通常約４４０個のアミノ酸を含むポリペプチド鎖からなり、クラスごとに特徴的な構造をもち、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥに対応してγ、μ、α、δ、ε鎖とよばれる。さらにＩｇＧには、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４が存在し、それぞれγ１、γ２、γ３、γ４とよばれている。軽鎖は、通常約２２０個のアミノ酸を含むポリペプチド鎖からなり、Ｌ型とＫ型の２種が知られており、それぞれλ、κ鎖とよばれる。抗体分子の基本構造のペプチド構成は、それぞれ相同な２本の重鎖及び２本の軽鎖が、ジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合）及び非共有結合によって結合され、分子量１５万〜１９万である。２種の軽鎖は、どの重鎖とも対をなすことができる。個々の抗体分子は、常に同一の軽鎖２本と同一の重鎖２本からできている。
【００２７】
鎖内Ｓ−Ｓ結合は、重鎖に四つ（μ、ε鎖には五つ）、軽鎖には二つあって、アミノ酸１００〜１１０残基ごとに一つのループを成し、この立体構造は各ループ間で類似していて、構造単位あるいはドメインとよばれる。重鎖、軽鎖ともにＮ末端に位置するドメインは、同種動物の同一クラス（サブクラス）からの標品であっても、そのアミノ酸配列が一定せず、可変領域（Ｖ領域、ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ、可変部）とよばれている（各ドメインは、それぞれ、ＶＨ及びＶＬと表される）。これよりＣ末端側のアミノ酸配列は、各クラスあるいはサブクラスごとにほぼ一定で定常領域（Ｃ領域、ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎ、定常部）とよばれている（各ドメインは、それぞれ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３あるいはＣＬと表される）。軽鎖及び重鎖の中で、可変及び定常領域は、重鎖も同じく約１０個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域を内含している状態で、約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって連結されている（一般に、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（基礎免疫学）（Ｐａｕｌ，Ｗ．編，第２版，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，１９８９、第７章を参照のこと）。
【００２８】
抗体の抗原決定部位はＶＨ及びＶＬによって構成され、結合の特異性はこの部位のアミノ酸配列によっている。一方、補体や各種細胞との結合といった生物学的活性は各クラスＩｇのＣ領域の構造の差を反映している。重鎖と軽鎖の可変領域の可変性は、どちらの鎖にも存在する３つの小さな超可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）にほぼ限られることがわかっており、これらの領域を相補性決定領域（ＣＤＲ、ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）と呼んでいる。可変領域の残りの部分はフレームワーク領域（ＦＷ、ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ）とよばれ、比較的一定である。通常、各可変領域の相補性決定領域の５〜１０個のアミノ酸だけが抗原結合部位を形成している。
通常、抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域には、３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１〜３）と、４つのＦＷ（ＦＷ１〜４）が含まれる。
【００２９】
本明細書において、「キメラ抗体」とは、可変領域がマウス抗体（ドナー異種抗体とも称する）由来であり、定常領域がヒト免疫グロブリン由来である抗体のことである。
本明細書において、「ヒト化抗体」とは、抗原特異的なマウス抗体分子の相補性決定領域（抗原結合部位）以外がヒト免疫グロブリンに由来する組換え抗体のことである。ヒト化抗体は、その機能の向上のためにアミノ酸の改変（置換、挿入、欠失及び／又は付加）を含むことができる。
【００３０】
一般に、ヒト化抗体の作製においては、相補性決定領域のアミノ酸配列のみを鋳型のヒト抗体フレームワークに移植しただけ（グラフト化抗体）では、多くの場合、オリジナルのマウス抗体よりも抗原結合活性が低下することが知られている。
本発明に用いられるマウス抗体１０Ｃ９のＣＤＲを、ヒト免疫グロブリンのフレームワークに移植することのみにより得られるグラフト化抗体も、シガトキシンＣＴＸ３Ｃに対する結合性は有するものの、抗原親和性が極めて低く、抗体医薬としての使用には好ましくないことが確認された（後記実施例Ｄ−５及びＤ−６を参照）。
【００３１】
本発明者らは、このようなヒト化抗体の活性低下を改善し、かつ、抗体医薬として使用するためにより優れたヒト化抗体を得るために検討を重ねた結果、上記の本発明のヒト化抗シガトキシン類抗体が、従来のマウス抗シガトキシン類抗体と比較して、抗原親和性を維持しつつ、免疫原性が低下され得るという有意に改善された特性を有することを見出した。
【００３２】
本発明のヒト化抗体に含まれるヒト免疫グロブリン（以下、「Ｉｇ」ともいう）のＦＷ領域は、マウス抗体１０Ｃ９のＦＷと同じ又は類似のコンホメーションをとることが好ましい。このことにより、マウス抗体のＣＤＲと融合させたときに、抗原との結合のための正しい空間的配向が保持できる確率が高くなる。
このために、本発明では、軽鎖のＦＷの４６位のアミノ酸と、任意に、１位、２位、７位、６０位及び７１位から選択される少なくとも１つの位置のアミノ酸とが、前記マウス抗体１０Ｃ９の軽鎖の対応する位置に存在するアミノ酸で置き換えられ、及び／又は
重鎖のＦＷの９４位のアミノ酸と、任意に、５位、７１位及び７３位から選択される少なくとも１つの位置のアミノ酸とが、前記マウス抗体１０Ｃ９の重鎖の対応する位置に存在するアミノ酸で置き換えられている。
【００３３】
上記の軽鎖及び重鎖のＦＷ領域内のマウス抗体１０Ｃ９の対応する位置に存在するアミノ酸で置き換えるアミノ酸は、軽鎖及び重鎖においてそれぞれ少なくとも１つである。軽鎖では、４６位のアミノ酸と、上記の任意に選択される位置のアミノ酸の１つ、２つ、３つ、４つ又は５つの位置のさらなるアミノ酸を置き換えることができ、重鎖では、９４位のアミノ酸と、上記の任意に選択される位置のアミノ酸の１つ、２つ又は３つの位置のさらなるアミノ酸を置き換えることができる。
【００３４】
本発明のヒト化抗体の重鎖及び軽鎖のＦＷ領域が由来するヒト免疫グロブリンは、天然に存在するヒト免疫グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ又はＩｇＥ）のＦＷ領域の配列であってもよいし、いくつかのサブクラスのヒト免疫グロブリンのＦＷ領域に共通するコンセンサス配列でもあり得る。Ｄｕｂｅｌ編，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｔｈｅｒｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ出版（２００７）を参照。
重鎖及び軽鎖のそれぞれに含まれる複数のＦＷ領域（ＦＷ１〜ＦＷ４）は、同じサブクラスのヒトＩｇに由来してもよいし、異なるサブクラスのヒトＩｇに由来してもよい。また、これらの複数のＦＷ領域は、同じ免疫グロブリンに由来してもよいし、異なる免疫グロブリンに由来してもよい。
【００３５】
ヒト免疫グロブリンのＦＷ領域のアミノ酸配列は公知であり、例えばＥｎｔｒｅｚ Ｐｒｏｔｅｉｎ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=protein）などのデータベースから入手できる。
【００３６】
上記のＦＷ領域として、ヒト免疫グロブリンのｇｅｒｍｌｉｎｅ配列を利用することもできる（Ｄｕｂｅｌ編，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ出版，ｐ．１１９，２００７；Ｈｗａｎｇら，Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｖｏｌ．３６，ｐ．３５，２００５）。ｇｅｒｍｌｉｎｅ配列とは、体細胞変異が生じる前の生物が元来有する生殖細胞の遺伝子系列であり、ヒト免疫グロブリンについてもデータベースが公開されている（http://imgt.cines.fr//IMGT#GENE-DB/GENElect?query=4.2+&species=Homo+sapiens）。
ヒトｇｅｒｍｌｉｎｅ配列は、特異的なモチーフの発現が最小であり、免疫原性（免疫システムが非自己として認識する可能性）を低く抑えることができると考えられている。
【００３７】
本発明のヒト化抗体のＦＷ領域は、マウス抗体１０Ｃ９の可変領域全体の配列と相同性が高くなるように選択したｇｅｒｍｌｉｎｅ配列に由来することが好ましい。このようにＦＷ領域を選択することにより、マウス抗体の重要なアミノ酸残基と同じ位置で等しいアミノ酸残基を有するＦＷ領域を用いることができる。また、ｇｅｒｍｌｉｎｅ配列を用いると、他の免疫グロブリン配列を用いるよりも、抗原結合活性の損失率が低いという利点もある。
【００３８】
本発明のヒト化抗体に用いるためのヒト免疫グロブリン配列は、既知のヒト免疫グロブリンｇｅｒｍｌｉｎｅ配列のデータベースを利用して、軽鎖及び重鎖それぞれについてマウス抗体可変領域のアミノ酸配列と相同性が高い配列を、コンピュータにより（例えばＢＬＡＳＴにより）比較することによって同定できる。この比較により、マウス抗体１０Ｃ９の可変領域と高い配列同一性を示すヒトｇｅｒｍｌｉｎｅからの軽鎖及び重鎖フレームワーク領域を選択できる。
【００３９】
本発明のヒト化抗体は、実質的にヒトＩｇからのＦＷ領域と、実質的にマウス抗体１０Ｃ９からのＣＤＲとを含む。このようなアミノ酸配列の並置は、天然には見られないので、ある種のアミノ酸の改変を加えることにより、より天然に近いコンホメーションを有し、抗原結合親和性の向上を導くことができる。
よって、得られるヒト化抗体の特性を最適化するために、フレームワーク領域内でどのアミノ酸残基を置換すればよいかを決定する（バックミューテーション残基）。一般に、マウス抗体に由来する残基をヒト化抗体に導入することは、ヒトの体内でのＨＡＭＡ応答を引き起こす危険性を増大させる可能性が高いので、最小限に抑えることが好ましい。
【００４０】
ＣＤＲコンホメーション及び／又は抗原への結合に対して考えられるその影響に基づいて、ＦＷ領域内で置換すべきアミノ酸を同定できる。
置換すべきアミノ酸残基は、（１）抗原に直接、非共有的に結合するアミノ酸残基、（２）ＣＤＲ領域に隣接するか、Ｃｈｏｔｈｉａら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．１９６，ｐ．９０１，１９８７；Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３４２，ｐ．８７８，１９８９）により提案される代替的定義づけの下でＣＤＲ領域の一部であるか、ＣＤＲループの立体配座の支持に関与するか（Ｆｏｏｔｅら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．２２４，ｐ．４８７，１９９２）、又はその他の形でＣＤＲ領域と相互作用するアミノ酸残基、又は（３）ＶＬ−ＶＨインタフェイスに参与するアミノ酸（Ｃｈｏｔｈｉａら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．１８６，ｐ．６５１，１９８５）であることが好ましい。
【００４１】
或いは、ＦＷ領域内で置換すべきアミノ酸残基は、マウス免疫グロブリン配列中でマウスの体細胞変異（ソマティック変異）が導入されたと考えられる位置に対応する位置のヒトＦＷ領域内のアミノ酸残基が好ましい。マウス免疫グロブリン中で体細胞変異が導入されたと考えられるアミノ酸残基は、マウス抗体１０Ｃ９のアミノ酸配列を、マウス免疫グロブリンｇｅｒｍｌｉｎｅ配列と、ＣｌｕｓｔａｌＷなどのアルゴリズムをデフォルト設定で用いて相同性がなるべく高くなるように整列させ、マウス抗体１０Ｃ９中の配列がｇｅｒｍｌｉｎｅ配列とは異なる位置のアミノ酸残基を選択することにより決定できる。体細胞変異が導入されたと考えられる位置のアミノ酸残基は、ヒト抗体にとっては普通でないアミノ酸であるので、マウス免疫グロブリン中で体細胞変異が導入された位置に対応する位置のヒト免疫グロブリンのアミノ酸をマウス抗体１０Ｃ９の対応する位置のアミノ酸残基で置換することにより、抗体の抗原結合性の低下を最小限に抑えて、ヒト化抗体を作製できる。
【００４２】
マウス１０Ｃ９抗体の立体構造は、Ｘ線結晶構造解析によって以前に報告されている（Ｕｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２８３，ｐ．１９４４０，２００８）。この立体構造情報に基づいて、抗原に直接結合するアミノ酸残基、及び抗原−抗体結合に間接的に関わる（結合部位の構造を維持する上で重要な）アミノ酸残基を同定できる。
【００４３】
上記の情報に基づいて鋭意検討を重ねた結果、本発明のヒト化抗体は、軽鎖の４６位と、任意に、１位、２位、７位、６０位及び７１位の少なくとも１つ、例えば１つ、２つ、３つ、４つ又は５つの位置のアミノ酸残基が、マウス抗体１０Ｃ９の対応する位置のアミノ酸残基で置き換えられ、かつ重鎖の９４位と、任意に、５位、７１位及び７３位の少なくとも１つ、例えば１つ、２つ又は３つの位置のアミノ酸残基が、マウス抗体１０Ｃ９の対応する位置のアミノ酸残基で置き換えられたものであることにより、シガトキシン類との良好な抗原結合特性を示すことが見出された。
これらの置換され得るアミノ酸は、図１に下線を付して示す。
【００４４】
本明細書において、「マウス抗体１０Ｃ９の対応する位置のアミノ酸残基」とは、上記のＫａｂａｔらによる免疫グロブリンの番号付けに従って番号を付したときに、ヒト免疫グロブリン中のアミノ酸残基と同じ番号を付与される位置のアミノ酸残基のことである。
【００４５】
本発明のヒト化抗体に用いられるマウス抗体１０Ｃ９のＣＤＲは、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに２００３年２月１３日に、ブダペスト条約に基づく寄託の移管申請により受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８２９２として寄託されたハイブリドーマ１０Ｃ９から生成されるマウス抗体１０Ｃ９のＣＤＲである。このマウス抗体１０Ｃ９は、シガトキシンＣＴＸ３Ｃ及び５１−ＯＨ−ＣＴＸ３ＣのＡＢＣＤＥ環部を特異的に認識する。この抗体については、特許第３８４５７９６号及び特許第３８２０５１９号を参照されたい。
【００４６】
マウス抗体１０Ｃ９のアミノ酸配列は、当該技術において公知の方法により決定できる。マウス抗体１０Ｃ９の軽鎖可変領域ＶＬ、軽鎖定常領域ＣＬ、重鎖可変領域ＶＨ及び重鎖定常領域ＣＨ１のｃＤＮＡ配列及びそれらから推測されるアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１、３、５及び７（ｃＤＮＡ配列）及び配列番号２、４、６及び８（アミノ酸配列）に示す。
【００４７】
本発明のヒト化抗体は、より好ましくは、配列番号１５〜１９及び２１のいずれか１つに示すアミノ酸配列を有する軽鎖と、配列番号２２〜２５及び２７のいずれか１つに示すアミノ酸配列を有する重鎖とを含む。
上記のヒト化抗体は、最も好ましくは、配列番号２１に示すアミノ酸配列を有する軽鎖と、配列番号２７に示すアミノ酸配列を有する重鎖とを含む。
【００４８】
本発明のヒト化抗体の定常領域としては、従来公知のヒト免疫グロブリンの定常領域を用いることができる。ヒトＩｇの定常領域は、軽鎖定常領域（ＣＬ領域）及び重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）からなるが、本発明のヒト化抗体又はそのフラグメントは、シガトキシン類との結合性を有するように、これらの定常領域のいずれかを適切に有することができる。
ヒト免疫グロブリンの可変領域について述べたことと同様に、上記の定常領域も、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ又はＩｇＥのサブクラスのヒト免疫グロブリンのいずれに基づくものであってもよい。好ましくは重鎖定常領域としてはヒトＩｇγ１を、また、軽鎖定常領域としてはヒトＩｇκを用いることができる。
また、軽鎖及び重鎖のそれぞれの定常領域は、同じサブクラスのヒトＩｇに基づいてもよいし、異なるサブクラスのヒトＩｇに基づいてもよい。
【００４９】
本発明のヒト化抗体は、本願明細書に開示される、本発明のヒト化抗体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを当該分野で公知の方法を使用して作製し、該ポリヌクレオチドを発現ベクターに導入し、得られた発現ベクターを宿主細胞に導入し、宿主細胞を培養することを含む方法により得ることができる。
培養後の培養液から、ヒト化抗体を精製してもよい。
上記の各工程は、当該分野で公知の種々の方法を使用して行うことができる。
【００５０】
上記の本発明の抗体の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、例えば、当業者に公知の核酸合成方法に従って、マウス１０Ｃ９抗体の重鎖及び軽鎖の各々のＣＤＲをコードする遺伝子断片を調製し、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域をコードする遺伝子断片を調製し、所定の位置に所定の変異を導入し、軽鎖及び重鎖のそれぞれのＣＤＲとＦＷ領域と定常領域の配列とを連結することを含む方法によって作製することができる。
核酸の合成は、化学的な核酸合成法を用いるか、適切な鋳型及びプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことにより増幅させる方法を用いることができる。
フレームワーク領域の所定の部位に所定の変異を導入する方法としては、部位特異的変異誘発法（Ａｕｓｅｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，８．１〜８．５章，１９８７）などの当業者に公知の種々の方法が使用され得る。
【００５１】
上記の重鎖及び軽鎖をコードするポリヌクレオチドは、それぞれ同じ発現ベクターに導入してもよいし、別々の発現ベクターに導入してもよい。
本明細書において、「発現ベクター」とは、遺伝子からのタンパク質の宿主細胞での発現に必要な配列（コードされる発現させるポリヌクレオチドに機能可能に連結されたプロモーター、リボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、転写終結部位など）を備えたベクターのことをいう。
【００５２】
ヒト化抗体遺伝子を連結させる発現ベクターとしては、ヒト化抗体遺伝子を発現できるものであれば特に制限されず、細菌由来、ウイルス由来（例えばアデノウイルス、レトロウイルス）などの公知の発現ベクターを用いることができる。
なお、発現ベクターとして予めヒトＩｇ定常領域遺伝子を保持するものを利用すれば、これに所望の配列を有する可変領域遺伝子を挿入するだけでヒト化抗体を発現できる発現ベクターとなるため好ましい。このような発現ベクターとしては、ｐＦＵＳＥ２−ＣＬＩｇ−ｈｋ、ｐＦＵＳＥ−ＣＨＩｇ−ｈＧ１（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社）などが知られている。
【００５３】
本発明の発現ベクターが含み得るプロモーターとしては、宿主細胞が大腸菌である場合、例えば、Ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｒｅｃＡ プロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔａｃプロモーターなどが挙げられる。宿主細胞がバチルス属菌の場合、プロモーターとしては、ＳＬ０１プロモーター、ＳＰ０２プロモーター、ｐｅｎＰ プロモーターなどが挙げられる。宿主細胞が酵母である場合、プロモーターとしては、例えば、ＰＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターが挙げられる。また、宿主が哺乳動物細胞等の真核細胞である場合、ＳＶ４０由来のプロモーター、ヒトＥＦ−１α由来プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、ヒートショックプロモーターなどが挙げられる。
【００５４】
上記の発現ベクターを導入する宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞のいずれであってもよく、発現ベクターの種類に応じて適宜選択できる。例えば、大腸菌（エシェリキア属菌）、バチルス属などの細菌細胞、サッカロマイセス属、ピキア属などの酵母細胞、Ｓｆ９などの昆虫細胞、哺乳動物細胞などを用いることができる。なかでも、簡便にヒト化抗体を生産できるので、大腸菌が好ましい。
上記の発現ベクターを宿主細胞に導入する方法は、宿主細胞の種類に応じて適宜選択でき、例えば、宿主細胞が大腸菌である場合、塩化カルシウム法を用いることができる。
【００５５】
発現ベクターを導入した宿主細胞は、宿主細胞の種類に応じた適切な培地中で、従来公知の方法に従って培養することにより、本発明のヒト化抗体を作製できる。
【００５６】
上記の培養は、特に宿主細胞が細菌である場合、栄養培地中で行うことが好ましい。栄養培地は、形質転換体の生育に必要な炭素源、無機窒素源もしくは有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、例えばグルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖など、無機窒素源もしくは有機窒素源としては、例えばアンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などが挙げられる。また、所望により他の栄養素（例えば、無機塩（例えば塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム）、ビタミン類、抗生物質（例えばテトラサイクリン、ネオマイシン、アンピシリン、カナマイシン等）など）を含んでいてもよい。
【００５７】
上記の宿主細胞が大腸菌である場合、好ましい培地としてＬＢ培地、Ｍ９培地（Ｍｉｌｌｅｒら、Ｅｘｐ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｐ．４３１，１９７２）などが例示される。この場合、培養は、必要により通気、撹拌しながら、通常１４〜４３℃、約３〜２４時間行うことができる。
宿主細胞がバチルス属菌の場合、必要により通気、撹拌をしながら、通常３０〜４０℃、約１６〜９６時間培養を行うことができる。
【００５８】
宿主細胞が酵母である場合、培地としては、例えばＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒ最小培地（Ｂｏｓｔｉａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．７７，ｐ．４５０５，１９８０）が挙げられ、ｐＨは５〜８であることが望ましい。培養は、通常、約２０〜３５℃で約１４〜１４４時間行なわれ、必要により通気や撹拌を行うこともできる。
宿主細胞が哺乳動物細胞の場合、培地としては、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地（Ｅａｇｌｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．１２２，ｐ．５０１，１９５２）、ＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．８，ｐ．３９６，１９５９）、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｅｏｒｇｅ Ｅ．ら，Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．，Ｖｏｌ．１９９，ｐ．５１９，１９６７）、１９９培地（Ｍｏｒｇａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．７３，ｐ．１，１９５０）等を用いることができる。培地のｐＨは約６〜８であるのが好ましく、培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜７２時間行なわれ、必要により通気や撹拌を行うこともできる。
【００５９】
宿主細胞が昆虫細胞の場合、例えば胎児牛血清を含むＧｒａｃｅ’ｓ培地（Ｓｍｉｔｈら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８２，ｐ．８４０４，１９８５）等が挙げられ、そのｐＨは約５〜８であるのが好ましい。培養は通常約２０〜４０℃で１５〜１００時間行なわれ、必要により通気や撹拌を行うこともできる。
【００６０】
上記の培養後、培養した宿主細胞及び／又は培養液を回収し、宿主細胞内及び／又は培養上清中に蓄積された抗体を単離して精製できる。
ヒト化抗体を単離、精製する方法としては、例えば塩析、溶媒沈澱法等の溶解度を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動など分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーやヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーなどの荷電を利用する方法、プロテインＡなどのアフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動などの等電点の差を利用する方法などが挙げられる。
【００６１】
こうして得られたヒト化抗シガトキシン抗体の抗原活性（抗原親和性）は、例えば、後記実施例に記載されるようなシガトキシンＣＴＸ−３Ｃを用いたＥＬＩＳＡや、Ｂｉａｃｏｒｅ（ＧＥヘルスケア・ジャパン社）などにより測定可能である。
【００６２】
本発明は、本発明のヒト化抗体又はそのフラグメントをコードする配列を含むポリヌクレオチドも提供する。
本明細書において、「コードする」とは、ｍＲＮＡに転写され、タンパク質に翻訳されたときに、コードされるアミノ酸配列を有するタンパク質を生成し得る遺伝子情報を、該ポリヌクレオチドが有することを意味する。
上記のポリヌクレオチドは、より好ましくは配列番号３０、３２〜３５及び４１のいずれか１つで表されるポリヌクレオチドを含むか、及び／又は配列番号３１、３７〜３９及び４２のいずれか１つで表されるポリヌクレオチドを含む。
上記のポリヌクレオチドは、最も好ましくは、配列番号４１及び／又は４２のポリヌクレオチドを含む。
【００６３】
本発明は、本発明のヒト化抗体又はそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドを含むベクターも提供する。
本発明のベクターは、上述した当該技術において公知の方法により作製された本発明のヒト化抗体又はそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドを、適切なベクターに挿入することにより得ることができる。本発明のベクターに用いることができるベクターは、上記の発現ベクターについて述べたものと同様である。
本発明のベクターは、上記のポリヌクレオチドの遺伝子産物の発現に必要な配列をさらに有することが好ましい。このような配列は、当該技術において公知であり、例えばコードされるポリヌクレオチドに機能可能に連結されたプロモーター、リボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、転写終結部位などを含む。
上記のベクターは、複製起点、エンハンサー、及び目的に応じて、通常用いられる選択マーカー（例えば、テトラサイクリン、アンピシリン又はカナマイシンに対する耐性遺伝子）を含んでいてもよい。
【００６４】
本発明はまた、上記のベクターが導入された宿主細胞も提供する。好ましい宿主細胞は、上記のとおりである。
【００６５】
本発明はまた、本発明のヒト化抗体又はそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドを適切な発現ベクターに導入し、得られた発現ベクターを適切な宿主細胞に導入し、得られた宿主細胞を培養することを含む、本発明のヒト化抗体又はそのフラグメントの生産方法も提供する。
本発明の生産方法は、宿主細胞及び／又はその培養液からヒト化抗体又はそのフラグメントを精製することをさらに含んでもよい。
本発明の生産方法の各工程は、上記の本発明のヒト化抗体又はそのフラグメントの作製について述べたことと同様である。
【００６６】
本発明のヒト化抗体又はそのフラグメントは、シガトキシン類を認識して結合することができるので、食中毒シガテラにより体内にシガトキシン類が存在する対象者（ヒト）に投与すれば、シガトキシン類を捕捉して、その毒性を低減できる可能性がある。
よって、本発明は、上記のヒト化抗体又はそのフラグメントを含む医薬組成物も提供する。該組成物は、食中毒シガテラの治療又は予防に用いることができる。
【００６７】
上記の組成物は、いずれの投与形態であってもよいが、静脈内投与用の形態が好ましい。
【００６８】
上記の組成物は、ヒト化抗体又はそのフラグメントとともに、少なくとも１種の医薬的に許容される医薬品添加物を含む。用い得る医薬品添加物は、投与形態に応じて、当該技術において公知の適切なものを用いることができる。
例えば静脈内投与用の医薬組成物の場合、医薬的に許容される医薬品添加物としては、溶剤（例えばオリーブ油、大豆油のような油性溶剤、水、アルコール、プロピレングリコールのような親水性溶剤など）、溶解補助剤（例えばポリエチレングリコール、コレステロールなど）、乳化剤（例えば界面活性剤など）、懸濁化剤（ポリビニル系化合物、セルロース類のような親水性高分子、界面活性剤など）、保存剤（例えばパラベン、ソルビン酸など）、着色剤などを用いることができる。
【００６９】
上記の医薬組成物は、対象者に治療又は予防上有効な量で投与することができる。治療又は予防上有効な量は、臨床試験などにより適宜決定できる。
【実施例】
【００７０】
以下に、本発明についてより具体的に理解するために、特定の実施例を示すが、これらは例示目的とするものであって、本発明を限定するものではない。
【００７１】
以下の記載について、キット等を使用した部分については特にことわりの無い限り添付のプロトコールに従った。
【００７２】
Ａ．マウス１０Ｃ９Ｆａｂ断片のクローニング及び配列決定
マウス抗シガトキシン抗体１０Ｃ９については、特許第３８４５７９６号公報に記載されている。
マウス１０Ｃ９抗体を産生するハイブリドーマ細胞（ＦＥＲＭ ＢＰ−８２９２）から、全ＲＮＡを分離した。ＰｒｏＳＴＡＲ ＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄ ＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）を用いて、逆転写により第１ストランドのｃＤＮＡを合成した。マウス抗体Ｆａｂ断片のコーディング配列のクローニングを可能にするように設計されたＰＣＲプライマー（Ｌｅｒｎｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２４６，ｐ．１２７５，１９８９）を用いて、重鎖及び軽鎖Ｆａｂ領域を得た。マウス抗体１０Ｃ９の軽鎖はＬ５とＬ９、重鎖はＨ３とＨ１２のＰＣＲプライマーを組み合わせて用いた（表１）。
【００７３】
【表１】
【００７４】
上記のプライマーを用いてＰＣＲ反応により増幅したｃＤＮＡフラグメントは、約７００ｂｐ長の主要生成物を有した。ｃＤＮＡフラグメントをｐＤｒｉｖｅベクター（ＱＩＡＧＥＮ社）にクローニングした。適正なサイズのインサートを含むベクターを、ＤＴＣＳ−Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ Ｋｉｔ及びＣＥＱ２０００ＸＬ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（ともにベックマンコールター社）を用いて配列決定した。
決定したマウス抗体１０Ｃ９の軽鎖可変領域ＶＬ、軽鎖定常領域ＣＬ、重鎖可変領域ＶＨ及び重鎖定常領域ＣＨ１のｃＤＮＡ配列及びそれらから推測されるアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１、３、５及び７（ｃＤＮＡ配列）及び配列番号２、４、６及び８（アミノ酸配列）に示す。
【００７５】
Ｂ．シガトキシン類を認識するヒト化抗体の設計
（１）フレームワーク構造配列のための相同ヒト抗体の選択
マウス１０Ｃ９軽鎖及び重鎖の可変領域に対して高い同一性を示すヒトｇｅｒｍｌｉｎｅ配列（Ｖ、Ｊ遺伝子領域）を、ＣｌｕｓｔａｌＷを用いたアミノ酸配列の比較により同定した。
マウス１０Ｃ９のＶＬ領域に対して、６１．５％という同一性百分率をもつヒトｇｅｒｍｌｉｎｅのκ鎖Ｖ領域（１ＧＫＶ１Ｄ−３９＊０１；配列番号９）及び７０．４％という同一百分率をもつＪ領域（１ＧＫＪ２＊０１；配列番号１０）が同定された。
【００７６】
マウス１０Ｃ９のＶＨ領域に対して、７０．４％という同一性百分率をもつヒトｇｅｒｍｌｉｎｅのＶ領域（１ＧＨＶ４−３１＊０３；配列番号１１）及び８６．７％という同一百分率をもつＪ領域（１ＧＨＪ４＊０１；配列番号１２）が同定された。
マウス抗体１０Ｃ９の可変領域と高い同一性を有するこれらのヒトｇｅｒｍｌｉｎｅ配列の各々からのフレームワーク構造領域（ＦＷ）のＶ領域及びＪ領域をそれぞれ軽鎖及び重鎖について連結したアミノ酸配列を基本として、本発明のヒト化抗体の軽鎖及び重鎖を設計することにした。
【００７７】
（２）相補性決定領域とフレームワーク構造領域の連結
ヒト化抗体のＶＬ及びＶＨ領域の作製のための次の段階として、マウス１０Ｃ９のＶＬ及びＶＨ領域からのＣＤＲを、（１）で設計したヒトｇｅｒｍｌｉｎｅ配列からのＦＷに連結させた。このマウス抗体のＣＤＲとヒト免疫グロブリンのＦＷ領域とを連結しただけのＶＬ領域及びＶＨ領域のバージョン（グラフト化抗体）を、ｈ１０Ｃ９ｇ−ＶＬ及びｈ１０Ｃ９ｇ−ＶＨと呼ぶこととした。ｈ１０Ｃ９ｇ−ＶＬ及びｈ１０Ｃ９ｇ−ＶＨのアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１３及び１４に示す。
【００７８】
（３）フレームワーク構造領域内のアミノ酸の置換
（ａ）軽鎖
上記のようにして設計されたｈ１０Ｃ９ｇ−ＶＬのアミノ酸配列において、以下の表２に示すように、軽鎖のＦＷの１位、２位、７位、４６位、６０位及び７１位の６個のアミノ酸の少なくとも１つを、マウス抗体１０Ｃ９の対応する位置に存在するアミノ酸に置換した。
【００７９】
【表２】
【００８０】
具体的には、ＦＷ１の位置１、２及び７のアミノ酸（ヒトｇｅｒｍｌｉｎｅ配列内に通常存在するアスパラギン酸、イソロイシン及びセリン）を、マウス抗体１０Ｃ９のＶＬ領域内の対応する位置に見られるグルタミン酸、ロイシン及びトレオニンに変更した。この位置のアミノ酸残基は、マウス免疫グロブリンｇｅｒｍｌｉｎｅ配列をマウス抗体１０Ｃ９の配列と比較したときに変異されている配列であり、マウス１０Ｃ９のＶＬ領域のソマティック変異の位置であると考えられ、抗体−抗原結合や抗体の構造を保持する上で間接的に関係があると考えられる。
【００８１】
ＦＷ２の位置４６のアミノ酸（ヒトｇｅｒｍｌｉｎｅ配列内に通常存在するロイシン）を、マウス抗体１０Ｃ９のＶＬ領域内の対応する位置に見られるアルギニンに変更した。マウス抗体１０Ｃ９のＶＬ領域内のこの位置にあるアルギニンは、結合部位の中央に位置づけされているものとして、既に決定されているマウス１０Ｃ９の立体構造（Ｕｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２８３，ｐ．１９４４０，２００８）内で観察され、抗体−抗原結合の間に抗原と直接相互作用している重要な残基であると考えられる。
【００８２】
ＦＷ３内の位置６０のアミノ酸（ヒトｇｅｒｍｌｉｎｅ配列内に通常存在するセリン）を、マウス抗体１０Ｃ９のＶＬ領域内の対応する位置に見られるグリシンに変更した。この位置にあるアミノ酸残基は、マウス抗体１０Ｃ９のＶＬ領域のソマティック変異の位置で、抗体−抗原結合や構造を保持する上で間接的に関係があると考えられる。
【００８３】
ＦＷ３の位置７１のアミノ酸（ヒトｇｅｒｍｌｉｎｅ配列内に通常存在するフェニルアラニン）を、マウス抗体１０Ｃ９のＶＬ領域内の対応する位置に見られるチロシンに変更した。マウス抗体１０Ｃ９のＶＬ領域内のこの位置にあるチロシンは、マウス１０Ｃ９ＶＬ領域のＣＤＲ２ループを支持する上で重要であると考えられる。この位置におけるフェニルアラニンの存在が、ＣＤＲ１ループの配置を分断する可能性がある。
【００８４】
（ｂ）重鎖
上記のようにして設計されたｈ１０Ｃ９ｇ−ＶＨのアミノ酸配列において、以下の表３に示すように、重鎖のＦＷの５位、７１位、７３位及び９４位の４個のアミノ酸の少なくとも１つを、マウス抗体１０Ｃ９の対応する位置に存在するアミノ酸に改変した。
【００８５】
【表３】
【００８６】
具体的には、ＦＷ１内の位置５のアミノ酸（ヒトｇｅｒｍｌｉｎｅ配列内に通常存在するグルタミン）を、マウス抗体１０Ｃ９ＶＨ領域内の対応する位置で見られるロイシンに変更した。マウス抗体１０Ｃ９ＶＨ領域内のこの位置にあるロイシンは、マウス１０Ｃ９のＶＨ領域のソマティック変異の位置であると考えられ、またＣＤＲ１ループを支持する上で重要であると考えられる。
【００８７】
ＦＷ３の位置７１のアミノ酸（ヒトｇｅｒｍｌｉｎｅ配列内に通常存在するバリン）を、マウス抗体１０Ｃ９のＶＨ領域内の対応する位置に見られるアルギニンに変更した。この位置にあるアルギニンは、マウス抗体１０Ｃ９のＶＨ領域のＣＤＲ２ループを支持する上で重要であると考えられる。この位置におけるバリンの存在が、ＶＨ領域のＣＤＲ２ループの配置を分断する可能性がある。
【００８８】
ＦＷ３の位置７３のアミノ酸（ヒトｇｅｒｍｌｉｎｅ配列内に通常存在するトレオニン）を、マウス抗体１０Ｃ９のＶＨ領域内の対応する位置で見られるセリンに変更した。マウス抗体１０Ｃ９のＶＨ領域内のこの位置にあるセリンは、マウス抗体１０Ｃ９のＶＨ領域のＣＤＲ２ループを支持する上で重要であると考えられる。
【００８９】
ＦＷ３内の位置９４のアミノ酸（ヒトｇｅｒｍｌｉｎｅ内に通常存在するアルギニン）を、マウス抗体１０Ｃ９のＶＨ領域内の対応する位置に見られるシステインに変更した。マウス抗体１０Ｃ９のＶＨ領域内のこの位置にあるシステインは、マウス抗体１０Ｃ９のＶＨ領域のソマティック変異の位置であると考えられ、またＣＤＲ３ループを支持する上で重要であると考えられる。
【００９０】
（４）定常領域の選択
マウス抗体１０Ｃ９の軽鎖のＣＬ及び重鎖のＣＨ１に対して高い同一性を示すヒトｇｅｒｍｌｉｎｅ配列のＣ遺伝子領域を、ＣｌｕｓｔａｌＷを用いたアミノ酸配列の比較により同定した。
マウス抗体１０Ｃ９の軽鎖Ｃ領域に対して、７０．４％という同一性百分率をもつヒトｇｅｒｍｌｉｎｅのκ鎖Ｃ領域（１ＧＫＣ＊０１；配列番号２８）が同定された。
マウス抗体１０Ｃ９の重鎖ＣＨ１領域に対して、６１．９％という同一性百分率をもつヒトｇｅｒｍｌｉｎｅのγ１鎖Ｃ領域（１ＧＨＧ１＊０１；配列番号２９）が同定された。
マウス抗体１０Ｃ９の定常領域と高い同一性を示すこれらのヒトｇｅｒｍｌｉｎｅ配列のＣＬ及びＣＨ１領域を、（３）で設計した可変領域に連結して、ヒト化抗体のＦａｂフラグメントの作製に使用した。
【００９１】
Ｃ．ヒト化抗体をコードするポリヌクレオチドの構築
Ｃ−１．ｈ１０Ｃ９ｄ−ＶＬ及びｈ１０Ｃ９ｄ−ＶＨを含む軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡの作製
（３）で設計した軽鎖及び重鎖の可変領域（ｈ１０Ｃ９ｄ−ＶＬ及びｈ１０Ｃ９ｄ−ＶＨ）を、（４）で選択した軽鎖及び重鎖の定常領域（ＣＬ（１ＧＫＣ＊０１）及びＣＨ１（１ＧＨＧ１＊０１））とそれぞれ連結したヒト化抗体のＦａｂフラグメントの軽鎖及び重鎖をそれぞれコードするＤＮＡを構築した。ＤＮＡの合成は、ＴＡＫＡＲＡ社に委託した。
ヒト化抗体軽鎖ＦａｂフラグメントはＳａｃＩ及びＸｂａＩの制限酵素認識部位をもつように作製し、ｐＭＤ１９内へクローニングさせた。適正な配列をもつクローンを、ｈ１０Ｃ９ｄＦａｂ-Ｌ（配列番号３０）と命名した。
ヒト化抗体重鎖ＦａｂフラグメントはＸｈｏＩ及びＳｐｅＩの制限酵素認識部位をもつように作製し、ｐＭＤ１９内へクローニングさせた。適正な配列をもつクローンを、ｈ１０Ｃ９ｄＦａｂ-Ｈ（配列番号３１）と命名した。
【００９２】
Ｃ−２．ｈ１０Ｃ９ｄ−ＶＬ−ａ〜ｅ又はｈ１０Ｃ９ｏ−ＶＬ、及びｈ１０Ｃ９ｄ−ＶＨ−ａ〜ｄ又はｈ１０Ｃ９ｏ−ＶＨを含む軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡの作製
上記のｈ１０Ｃ９ｄＦａｂ-Ｌ及びｈ１０Ｃ９ｄＦａｂ-Ｈの所望の位置のアミノ酸をマウス抗体１０Ｃ９の対応する位置のアミノ酸に変換するために、シグマジェノシス社に依頼して、表４に示すＰＣＲプライマーを合成した。
変換するアミノ酸の位置に従って選択される２組のプライマーを用いて、部位特異的変異誘発法を応用した市販のキット（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社；ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ）を用いてＤＮＡに変異導入を行った。ＤＴＣＳ−Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ Ｋｉｔ及びＣＥＱ２０００ＸＬ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（ともにベックマンコールター社）によりＤＮＡ配列を決定し、所望の配列をもつクローンを選択した。
【００９３】
【表４】
【００９４】
Ｃ−３．グラフト化抗体の作製
マウス抗体１０Ｃ９のＣＤＲと、ヒト免疫グロブリンのＦＷ領域とを連結したＶＬ領域及びＶＨ領域のバージョン（グラフト化抗体；ｈ１０Ｃ９ｇ−ＶＬ及びｈ１０Ｃ９ｇ−ＶＨ）と、（４）で選択した定常領域とを連結したＦａｂフラグメントは、ｈ１０Ｃ９ｄＦａｂ−ＶＬ及びｈ１０Ｃ９ｄＦａｂ−ＶＨを鋳型として表１のＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより構築された。ＤＴＣＳ−Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ Ｋｉｔ及びＣＥＱ２０００ＸＬ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（ともにベックマンコールター社）により配列決定して、適正な配列をもつクローンを、ｈ１０Ｃ９Ｆａｂｇ−Ｌ（配列番号４３）及びｈ１０Ｃ９Ｆａｂｇ−Ｈ（配列番号４４）と命名した。
【００９５】
Ｄ．マウス抗体及びヒト化抗体の発現及び分析
Ｄ−１．発現プラスミドの構築
マウス抗体及びヒト化抗体の発現には、抗体Ｆａｂ遺伝子を高効率に発現できることが報告されているｐＡＲＡ７（Ｍｉｙａｓｈｉｔａら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．２６７，ｐ．１２４７，１９９７）を発現ベクターとして用いた（図２）。ｐＡＲＡ７ベクターは、アラビノースにより誘導されるａｒａＢプロモーターを含む。さらに、シグナル配列をコードする塩基配列が付加されていて、発現されるポリペプチドは、大腸菌培養上清中に分泌される。
【００９６】
まず、マウス抗体の発現プラスミドは、次のようにして作製した。Ａ．でクローニングしたマウスＦａｂ重鎖をコードするＤＮＡ配列中には、ｐＡＲＡに挿入する際に利用する制限酵素ＸｈｏＩ認識部位が含まれる。そこで、表５に示した２組のプライマーを用いて、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）を用いてＤＮＡに変異導入を行った。ＤＴＣＳ−Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ Ｋｉｔ及びＣＥＱ２０００ＸＬ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（ともにベックマンコールター社）によりＤＮＡ配列を決定し、適正な配列をもつクローンをｍ１０Ｃ９Ｆａｂ−Ｈｍ（配列番号６５）と命名した。
【００９７】
【表５】
【００９８】
上記で作製したマウスＦａｂ重鎖をコードするＤＮＡ（ｍ１０Ｃ９Ｆａｂ−Ｈｍ）を、制限酵素ＸｈｏＩ認識部位及びＳｐｅＩ認識部位を利用して、ｐＡＲＡ７に挿入した。重鎖をコードするＤＮＡが挿入されたプラスミドに、Ａ．でクローニングしたマウスＦａｂ軽鎖をコードするＤＮＡ（ｍ１０Ｃ９Ｆａｂ−Ｌ；配列番号６８）を、制限酵素ＳａｃＩ認識部位及びＸｂａＩ認識部位を利用して挿入し、発現プラスミドを作製した。
【００９９】
ヒト化抗体の発現プラスミドは、以下のようにして作製した。Ｃ．で作製した各々のヒト化Ｆａｂ重鎖をコードするＤＮＡのそれぞれを、制限酵素ＸｈｏＩ認識部位及びＳｐｅＩ認識部位を利用して、ｐＡＲＡ７に挿入した。重鎖をコードするＤＮＡが挿入されたプラスミドに、Ｃ．で作製した各々のヒト化Ｆａｂ軽鎖をコードするＤＮＡのそれぞれを、制限酵素ＳａｃＩ認識部位及びＸｂａＩ認識部位を利用して挿入し、発現プラスミドを作製した。なお、軽鎖及び重鎖の可変領域の組み合わせは、以下の表６に示すとおりである。
【０１００】
【表６】
【０１０１】
これらの発現プラスミドを、大腸菌に導入して増殖させ、市販のプラスミド精製キット（ＱＩＡＧＥＮ社；ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ）により精製し、ＤＮＡ塩基配列解析によりＦａｂのコード領域の配列を確認した。ＤＮＡ塩基配列解析にはＤＴＣＳ−Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ Ｋｉｔ及びＣＥＱ２０００ＸＬ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（ともにベックマンコールター社）を使用した。
【０１０２】
ヒト化１０Ｃ９のうち、ｈ１０Ｃ９ｇＦａｂ及びｈ１０Ｃ９ｏＦａｂについては、マウスアミノ酸に置換した軽鎖内の位置１及び位置２と重鎖内の位置５がｐＡＲＡ７に挿入するための制限酵素認識部位に含まれるので、ｐＡＲＡ７に挿入後、合成プライマー（表７）を用いてヒトｇｅｒｍｌｉｎｅ由来アミノ酸に戻すためのＤＮＡ変異導入を行った。
【０１０３】
【表７】
【０１０４】
Ｄ−２．発現プラスミドによる大腸菌の形質転換及び培養
次に、上記のＤ−１のようにして精製した発現プラスミドを、常法に従って大腸菌ＭＣ１０６１株に導入し、ＬＢ寒天プレート（１００μｇ／ｍｌのアンピシリン含有）に播いて形質転換株を得た。この形質転換株を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＳＢ培地（Ｍｉｙａｓｈｉｔａら、上記文献）で増殖させ、発現誘導剤であるアラビノースを０．２％になるように添加して３０℃で３日間培養を行った。培養終了後、遠心分離を行い、抗体を含む培養上清を回収した。
【０１０５】
Ｄ−３．マウス抗体及びヒト化抗体の精製
上記の培養上清に硫酸アンモニウムを６５％飽和になるように加え、硫安沈殿を行った。遠心分離後の沈殿を１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液に再懸濁し、同緩衝液に対して透析を行った。遠心分離後、上清を０．４５μｍのフィルターでろ過した。この上清を材料として、プロテインＧカラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン社）を用いて精製した。その後、各分画フラクションについてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行うことによって、純度の高いＦａｂが得られたことを確認した（図３；マウス抗体１０Ｃ９Ｆａｂ（ｍ１０Ｃ９Ｆａｂ）、ｈ１０Ｃ９ｄＦａｂ、ｈ１０Ｃ９ｇＦａｂ及びｈ１０Ｃ９ｏＦａｂについてのみ結果を示す）。
【０１０６】
Ｄ−４．マウス抗体及びヒト化抗体の検出
Ｄ−２で作製した大腸菌で発現させたマウス抗体１０Ｃ９のＦａｂ及びそれぞれのヒト化抗体のＦａｂについて、ウェスタンブロッティングにより、アルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）又はアルカリフォスファターゼ標識抗ヒトＩｇＧ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いて、抗体の検出を行った。
【０１０７】
図４の結果から明らかなように、マウス抗体１０Ｃ９（ｍ１０Ｃ９Ｆａｂ）は抗マウス抗体によって検出されるが、抗ヒト抗体によっては検出されない。一方、作製したヒト化抗体ｈ１０Ｃ９ｄＦａｂは抗マウス抗体によって検出されないが、抗ヒト抗体によって検出された。その他のヒト化抗体（ｈ１０Ｃ９ｇＦａｂ、ｈ１０Ｃ９ｏＦａｂ、ｈ１０Ｃ９ｄＦａｂＭ１〜Ｍ９）についても抗ヒト抗体によって検出された。
よって、本発明のヒト化抗体は、抗ヒト抗体により認識されるが、抗マウス抗体によっては認識されないので、ヒトに投与した場合に、免疫原性が低いことが期待される。
【０１０８】
Ｄ−５．ＥＬＩＳＡによる抗原結合性の確認
シガトキシンＣＴＸ３ＣのＡＢＣＤＥ環部の構造を有する抗原（ＣＴＸ３Ｃ−ＡＢＣＤＥという）に対する各ヒト化抗体の結合活性を、マウス１０Ｃ９抗体と比較してＥＬＩＳＡによって検定した。ＥＬＩＳＡの方法は、特許第３８４５７９６号公報に記載された方法に従う。
９６ウェルＥＬＩＳＡ用プレート（ＣＯＳＴＡＲ社）の各ウェルにＣＴＸ３Ｃ−ＡＢＣＤＥ−ＢＳＡコンジュゲートを５０μＬ入れ、４℃で一晩放置して、プレートに固定化した。プレートを洗浄後、１％スキムミルクでブロッキングした。プレートをさらに洗浄した後、連続希釈したマウス抗体又はヒト化抗体を、ウェルに５０μＬずつ添加して、室温で１時間反応させた。
検出は、ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗ヒトＩｇＧ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）又はＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ（ＧＥヘルスケア・ジャパン社）を用いて行った。波長４９０ｎｍにおける吸光度を、マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＲａｄ社）を用いて測定した。
【０１０９】
図５は、マウス抗体１０Ｃ９（ｍ１０Ｃ９Ｆａｂ）とヒト化抗体（ｈ１０Ｃ９ｇＦａｂ、ｈ１０Ｃ９ｄＦａｂ、ｈ１０Ｃ９ｏＦａｂ、ｈ１０Ｃ９ｄＦａｂＭ１〜Ｍ９）の抗原との結合を比較している。その結果、マウスＣＤＲとヒトＩｇのＦＷ領域とを含むグラフト化抗体ｈ１０Ｃ９ｇＦａｂは、マウス抗体１０Ｃ９よりも、抗原に対する結合性が低かった。ｈ１０Ｃ９ｄＦａｂ及びｈ１０Ｃ９ｏＦａｂは、マウス１０Ｃ９抗体と同程度又はそれ以上の結合活性を示すことが確認された。ｈ１０Ｃ９ｄＦａｂＭ１〜Ｍ５、Ｍ７及びＭ８は、ｈ１０Ｃ９ｄＦａｂと比較して同程度又はそれ以上の結合活性を示すことが確認された。
しかし、軽鎖の４６位のアミノ酸がヒト免疫グロブリン由来のアミノ酸であるｈ１０Ｃ９ｄＦａｂＭ６、及び重鎖の９４位のアミノ酸がヒト免疫グロブリン由来のアミノ酸であるｈ１０Ｃ９ｄＦａｂＭ９は、結合活性が低下していることがわかった。
【０１１０】
Ｄ−６．Ｂｉａｃｏｒｅによる結合親和力の測定
マウス抗体１０Ｃ９（ｍ１０Ｃ９Ｆａｂ）又はヒト化抗体のシガトキシンＣＴＸ３Ｃ−ＡＢＣＤＥに対する結合活性を、表面プラズモン共鳴測定法を用いて確認した。
ＣＴＸ３Ｃ−ＡＢＣＤＥ−ＢＳＡコンジュゲートをＳｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５（ＧＥヘルスケア・ジャパン社）に固定化し、ＨＢＳ−ＥＰバッファー（ＧＥヘルスケア・ジャパン社）で連続希釈した各抗体溶液を用いて結合活性を確認した結果を、図６に示す。
Ｋｄ値を求めたところ、マウス抗体１０Ｃ９と比較してｈ１０Ｃ９ｇＦａｂは明らかに親和性が低下していた。
これに対して、ｈ１０Ｃ９ｄＦａｂ、ｈ１０Ｃ９ｏＦａｂ並びにｈ１０Ｃ９ｄＦａｂＭ１〜Ｍ５、Ｍ７及びＭ８は、ＣＴＸ３Ｃ−ＡＢＣＤＥに対するマウス抗体１０Ｃ９と同様又はわずかに良い結合親和力を示すことが確認された。
しかし、軽鎖の４６位のアミノ酸がヒト免疫グロブリン由来のアミノ酸であるｈ１０Ｃ９ｄＦａｂＭ６、及び重鎖の９４位のアミノ酸がヒト免疫グロブリン由来のアミノ酸であるｈ１０Ｃ９ｄＦａｂＭ９は、Ｋｄ値が非常に大きく、シガトキシン類との結合親和性が低いことがわかった。
【０１１１】
従って、本発明のヒト化抗体は、マウス抗体１０Ｃ９とほぼ同様の抗原親和性を有することがわかった。さらに、ヒトＦＷ内のわずかな修正（ＶＬの位置４６及びＶＨの位置９４）だけを有するヒト化抗体（ｈ１０Ｃ９ｏＦａｂ）であっても、マウス抗体と同様の抗原親和性でシガトキシンを認識できることがわかった。
【０１１２】
添付の配列表に示す配列は、以下のものに相当する。
【０１１３】
【表８−１】
【０１１４】
【表８−２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＷ）と、
ＦＥＲＭ ＢＰ−８２９２のハイブリドーマにより産生されるシガトキシン類を認識するマウス抗体１０Ｃ９の相補性決定領域（ＣＤＲ）と
を含む可変領域をそれぞれ有する重鎖及び軽鎖を少なくとも含み、
軽鎖の４６位のアミノ酸と、任意に、１位、２位、７位、６０位及び７１位から選択される少なくとも１つの位置のアミノ酸とが、前記マウス抗体１０Ｃ９の軽鎖の対応する位置に存在するアミノ酸で置き換えられ、及び／又は
重鎖の９４位のアミノ酸と、任意に、５位、７１位及び７３位から選択される少なくとも１つの位置のアミノ酸とが、前記マウス抗体１０Ｃ９の重鎖の対応する位置に存在するアミノ酸で置き換えられており、
シガトキシンＣＴＸ３Ｃ又は５１−ヒドロキシ−ＣＴＸ３Ｃであるシガトキシン類を認識することを特徴とする、ヒト化抗体又はそのフラグメント。
【請求項２】
前記軽鎖が配列番号１５〜１９及び２１のいずれか１つのアミノ酸配列を有し、前記重鎖が配列番号２２〜２５及び２７のいずれか１つのアミノ酸配列を有する請求項１に記載のヒト化抗体又はそのフラグメント。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のヒト化抗体又はそのフラグメントをコードする配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項３に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項５】
請求項４に記載のベクターが導入された宿主細胞。
【請求項６】
請求項５に記載の宿主細胞を培養し、シガトキシンＣＴＸ３Ｃ又は５１−ヒドロキシ−ＣＴＸ３Ｃであるシガトキシン類を認識するヒト化抗体又はそのフラグメントを発現させる工程を含む前記ヒト化抗体又はそのフラグメントを生産する方法。
【請求項１】
ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＷ）と、
ＦＥＲＭ ＢＰ−８２９２のハイブリドーマにより産生されるシガトキシン類を認識するマウス抗体１０Ｃ９の相補性決定領域（ＣＤＲ）と
を含む可変領域をそれぞれ有する重鎖及び軽鎖を少なくとも含み、
軽鎖の４６位のアミノ酸と、任意に、１位、２位、７位、６０位及び７１位から選択される少なくとも１つの位置のアミノ酸とが、前記マウス抗体１０Ｃ９の軽鎖の対応する位置に存在するアミノ酸で置き換えられ、及び／又は
重鎖の９４位のアミノ酸と、任意に、５位、７１位及び７３位から選択される少なくとも１つの位置のアミノ酸とが、前記マウス抗体１０Ｃ９の重鎖の対応する位置に存在するアミノ酸で置き換えられており、
シガトキシンＣＴＸ３Ｃ又は５１−ヒドロキシ−ＣＴＸ３Ｃであるシガトキシン類を認識することを特徴とする、ヒト化抗体又はそのフラグメント。
【請求項２】
前記軽鎖が配列番号１５〜１９及び２１のいずれか１つのアミノ酸配列を有し、前記重鎖が配列番号２２〜２５及び２７のいずれか１つのアミノ酸配列を有する請求項１に記載のヒト化抗体又はそのフラグメント。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のヒト化抗体又はそのフラグメントをコードする配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項３に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項５】
請求項４に記載のベクターが導入された宿主細胞。
【請求項６】
請求項５に記載の宿主細胞を培養し、シガトキシンＣＴＸ３Ｃ又は５１−ヒドロキシ−ＣＴＸ３Ｃであるシガトキシン類を認識するヒト化抗体又はそのフラグメントを発現させる工程を含む前記ヒト化抗体又はそのフラグメントを生産する方法。
【図１−１】
【図１−２】
【図５】
【図６−１】
【図６−２】
【図６−３】
【図６−４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図１−２】
【図５】
【図６−１】
【図６−２】
【図６−３】
【図６−４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１１−２００１６４（Ｐ２０１１−２００１６４Ａ）
【公開日】平成２３年１０月１３日（２０１１．１０．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−７０３４９（Ｐ２０１０−７０３４９）
【出願日】平成２２年３月２５日（２０１０．３．２５）
【出願人】（５０５１２７７２１）公立大学法人大阪府立大学 (688)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１０月１３日（２０１１．１０．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月２５日（２０１０．３．２５）
【出願人】（５０５１２７７２１）公立大学法人大阪府立大学 (688)
【Ｆターム（参考）】
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