シクラメンの花器官形成関連転写因子をコードする遺伝子
【課題】シクラメンの花器官形成関連転写因子および転写因子をコードする遺伝子を提供する。
【解決手段】ＣｐＭＡＤＳ１、ＣｐＭＡＤＳ２、ＣｐＭＡＤＳ３と命名した、シクラメンのＭＡＤＳ遺伝子をコードする３種類のシクラメンの花器官形成を制御する転写因子の遺伝子。シクラメンのＭＡＤＳボックス転写因子の機能を抑制することによってシクラメンの花の形態が改変された植物体を得ることができる。それゆえ、各種農業や園芸、アグリビジネス、さらには農産物を加工する産業や食品産業等に利用可能であり、しかも非常に有用である。
【解決手段】ＣｐＭＡＤＳ１、ＣｐＭＡＤＳ２、ＣｐＭＡＤＳ３と命名した、シクラメンのＭＡＤＳ遺伝子をコードする３種類のシクラメンの花器官形成を制御する転写因子の遺伝子。シクラメンのＭＡＤＳボックス転写因子の機能を抑制することによってシクラメンの花の形態が改変された植物体を得ることができる。それゆえ、各種農業や園芸、アグリビジネス、さらには農産物を加工する産業や食品産業等に利用可能であり、しかも非常に有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シクラメンの花器官形成関連転写因子をコードする遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
花の形態は園芸植物の観賞性における重要な要素の一つである。花の発生は、花序分裂組織から花原基として分化するところから始まり、花原基に含まれる花芽分裂組織から、がく片、花びら、雄しべ、雌しべの４種類の花器官が分化する。その後、分化した花器官を含む複合器官として成熟した花が形成される。八重咲きと呼ばれる花は、花弁の内側の雄しべや雌しべが並んでいる場所に、雄しべや雌しべの形態が改変されて花弁に変化したものが形成されて、花弁数が増加して花弁だけで花が構成されているように見える状態を指す。このような植物は、新規な園芸植物の創出に利用できる等、農業上の有用性が高い。
【０００３】
このような高等植物における花の形態の発生は一般にＡＢＣモデルによって説明されており、このモデルはＭＡＤＳボックスファミリーに属するＡ、Ｂ、Ｃのクラスの遺伝子の転写制御を介して花の形態が変化すると考えられている（酒井一、花 の形 態形 成の分子遺伝学、新版「植物の形 を決める分子機構」（秀潤社）150-163 (2000)）。ＭＡＤＳボックスファミリー遺伝子 は、ＭＡＤＳボックスと呼ばれる保存性領域を含む転写因子をコードする遺伝子 で、３０以上の遺伝子 からなる遺伝子 ファミリーを形 成している。例えばＡＰＥＴＡＬＡ１（ＡＰ１）、ＡＰＥＴＡＬＡ（ＡＰ２）などのＡクラス遺伝子、ＡＰＥＴＡＬＡ３（ＡＰ３）、ＰＩＳＴＩＬＬＡＴＡ（ＰＩ）などのＢクラス遺伝子、そしてＡＧＡＭＯＵＳ（ＡＧ）のＣクラス遺伝子など転写因子が挙げられ、これらの変異体で花の形態の変化が確認されている。
【０００４】
これまで、植物の花弁の形態や数の改変は、一般に植物の品種を掛け合わせる交配育種や自然界で発生する突然変異により行われている。しかし、従来の交配育種では、目的とする形態を有する植物を生産するためには、長い年月と、熟練者の経験が必要であり、また突然変異は目的とする形態の発生が制御できないため、簡易かつ確実に花器官の形態を改変する方法が求められている。
【０００５】
近年、遺伝子工学的に花の形態を改変する方法として、任意の転写因子を転写抑制因子に転換するペプチドを利用する方法が知られている（例えば、特許文献１〜７）。種々の転写因子と上記ペプチドとを融合させた融合タンパク質（キメラタンパク質）をコードする遺伝子を植物体内に導入することより、転写因子が転写抑制因子に転換され、該転写因子が転写を促進する標的遺伝子の発現が抑制された植物体を生産することが可能で、具体的には、上記のＭＡＤＳボックスファミリー遺伝子であるシロイヌナズナのＡＰ３遺伝子やＡＧ遺伝子の発現を、それぞれの遺伝子のプロモーター領域に結合するリプレッサーを用いて抑制し、雄性不稔体の生産方法や花弁数を増加させる方法を確立している（特許文献８〜９）。
【０００６】
しかしながら、シロイヌナズナのＡＧ遺伝子のキメラリプレッサーを導入したトレニアでは、花弁数の増加は認められていないなど、使用する転写因子の植物起源と、目的とする植物種によっては、機能しないことがある（非特許文献１）。
【０００７】
一方、シクラメンは冬を代表する鉢花として国内出荷数の上位を占める重要な花卉園芸植物であるが、前記した遺伝子工学的手法によって花の形態を改変するには、シクラメンの花器官形成に関与する転写因子遺伝子の取得が重要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００１−２６９１７７公報
【特許文献２】特開２００１−２６９１７８公報
【特許文献３】特開２００１−２９２７７６公報
【特許文献４】特開２００１−２９２７７７公報
【特許文献５】特開２００１−２６９１７６公報
【特許文献６】特開２００１−２６９１７９公報
【特許文献７】国際公開第０３／０５５９０３号パンフレット
【特許文献８】特開２００５−１９２４８３公報
【特許文献９】特開２００６−４２７２９公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Plant Biotechnology，2008年，25巻，P45-53
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
シクラメンの花器官形成に関与する転写因子は知られていないのが現状で、本発明は、シクラメンの花器官形成関連転写因子をコードする遺伝子を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、シクラメンの花器官形成を制御する転写因子をコードする遺伝子を同定することに成功し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は、以下を包含する。
［１］（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のアミノ酸配列を含むシクラメンの花器官形成関連転写因子をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、シクラメンの花器官形成に関与し、かつ転写因子活性を有するアミノ酸配列
（ｃ）配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号１の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、シクラメンの花器官形成に関与する転写因子をコードするＤＮＡ
（ｅ）配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつシクラメンの花器官形成に関与する転写因子をコードするＤＮＡ
【００１３】
［２］（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のアミノ酸配列を含むシクラメンの花器官形成関連転写因子をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号４のアミノ酸配列
（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、シクラメンの花器官形成に関与し、かつ転写因子活性を有するアミノ酸配列
（ｃ）配列番号３の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号３の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、シクラメンの花器官形成に関与する転写因子をコードするＤＮＡ
（ｅ）配列番号３の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつシクラメンの花器官形成に関与する転写因子をコードするＤＮＡ
【００１４】
［３］（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のアミノ酸配列を含むシクラメンの花器官形成関連転写因子をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号６のアミノ酸配列
（ｂ）配列番号６のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、シクラメンの花器官形成に関与し、かつ転写因子活性を有するアミノ酸配列
（ｃ）配列番号５の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号５の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、シクラメンの花器官形成に関与する転写因子をコードするＤＮＡ
（ｅ）配列番号５の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつシクラメンの花器官形成に関与する転写因子をコードするＤＮＡ
【００１５】
［４］（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のアミノ酸配列を含むシクラメンの花器官形成関連転写因子をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号８のアミノ酸配列
（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、シクラメンの花器官形成に関与し、かつ転写因子活性を有するアミノ酸配列
（ｃ）配列番号７の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号７の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、シクラメンの花器官形成に関与する転写因子をコードするＤＮＡ
（ｅ）配列番号７の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつシクラメンの花器官形成に関与する転写因子をコードするＤＮＡ
【００１６】
［５］（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のアミノ酸配列を含むシクラメンの花器官形成関連転写因子をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号１０のアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、シクラメンの花器官形成に関与し、かつ転写因子活性を有するアミノ酸配列
（ｃ）配列番号９の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号９の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、シクラメンの花器官形成に関与する転写因子をコードするＤＮＡ
（ｅ）配列番号９の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつシクラメンの花器官形成に関与する転写因子をコードするＤＮＡ
【００１７】
［６］（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のアミノ酸配列を含むシクラメンの花器官形成関連転写因子をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、シクラメンの花器官形成に関与し、かつ転写因子活性を有するアミノ酸配列
（ｃ）配列番号１１の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号１１の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、シクラメンの花器官形成に関与する転写因子をコードするＤＮＡ
（ｅ）配列番号１１の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつシクラメンの花器官形成に関与する転写因子をコードするＤＮＡ
【００１８】
［７］（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のアミノ酸配列を含むシクラメンの花器官形成関連転写因子をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号１４のアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、シクラメンの花器官形成に関与し、かつ転写因子活性を有するアミノ酸配列
（ｃ）配列番号１３の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号１３の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、シクラメンの花器官形成に関与する転写因子をコードするＤＮＡ
（ｅ）配列番号１３の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつシクラメンの花器官形成に関与する転写因子をコードするＤＮＡ
【００１９】
［８］（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のアミノ酸配列を含むシクラメンの花器官形成関連転写因子をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号１６のアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１６のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、シクラメンの花器官形成に関与し、かつ転写因子活性を有するアミノ酸配列
（ｃ）配列番号１５の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号１５の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、シクラメンの花器官形成に関与する転写因子をコードするＤＮＡ
（ｅ）配列番号１５の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつシクラメンの花器官形成に関与する転写因子をコードするＤＮＡ
【００２０】
［９］前記転写因子をコードする請求項１、２、３、４、５、６、７又は８記載のＤＮＡと転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードする配列番号１７のＤＮＡとを融合させたキメラ遺伝子
【００２１】
［１０］前記［９］記載の遺伝子を含む発現ベクター。
【００２２】
［１１］前記［１０］記載の発現ベクターを含む形質転換シクラメン植物。
【発明の効果】
【００２３】
本発明により、シクラメンの花器官形成関連転写因子をコードする遺伝子が提供される。本発明の遺伝子は、シクラメンの花器官の形態を変化させる分子育種に使用できる点で有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】シクラメンＭＡＤＳ−ボックス転写因子遺伝子の系統樹
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下、本発明を詳細に説明する。なお、本発明はこれに限定されるものではない。
シクラメン植物の花器官の形態に関与する転写因子としては、シクラメンのＭＡＤＳボックスファミリーに属する転写因子を挙げることができる。
【００２６】
本発明で用いられる転写因子の代表的な一例としては、シクラメンのＡＰ１タンパク質、ＡＰ３ａタンパク質、ＡＰ３ｂタンパク質、ＰＩタンパク質、ＳＴＫタンパク質、ＭＡＤＳ１タンパク質、ＭＡＤＳ２タンパク質またはＭＡＤＳ３タンパク質を挙げることができる。ＡＰ１タンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質である。ＡＰ３ａタンパク質は、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質である。ＡＰ３ｂタンパク質は、配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質である。ＰＩタンパク質配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質である。ＳＴＫタンパク質配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質である。ＭＡＤＳ１タンパク質配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質である。ＭＡＤＳ２タンパク質配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質である。ＭＡＤＳ３タンパク質は、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質である。
【００２７】
ただし、上記転写因子は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４および配列番号１６に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であっても、下記転写抑制転換ペプチドとのキメラタンパク質として植物に導入したときにシクラメン植物の花器官の形態を改変しうるものであれば本発明にて用いることができる。
【００２８】
なお、上記の配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４および配列番号１６に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列における「１個又は数個」の範囲は特に限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１個から５個、特に好ましくは１個から３個を意味する。
【００２９】
本発明で用いられるキメラタンパク質を生産する際には、後述するように、公知の遺伝子組換え技術を好適に用いることができる。そこで、本発明にかかる植物体の生産方法には、上記転写因子をコードする遺伝子が好適に用いることができる。
【００３０】
例えば、転写因子としてシクラメンのＡＰ１タンパク質を用いる場合には、このＡＰ１タンパク質をコードする遺伝子（説明の便宜上、ＣｐＡＰ１遺伝子と称する）を挙げることができる。ＣｐＡＰ１遺伝子の具体的な一例としては、配列番号１に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）として含むポリヌクレオチドを挙げることができる。また、例えば、転写因子としてシクラメンのＡＰ３ａタンパク質を用いる場合には、このＡＰ３ａタンパク質をコードする遺伝子（説明の便宜上、ＣｐＡＰ３ａ遺伝子と称する）を挙げることができる。ＣｐＡＰ３ａ遺伝子の具体的な一例としては、配列番号３に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）として含むポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００３１】
もちろん、本発明で用いられる転写因子をコードするＤＮＡとしては、上記の例に限定されるものではなく、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３または１５に示される塩基配列と相同性を有するＤＮＡであってもよい。具体的には、例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３または１５に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、転写抑制転換ペプチドとのキメラタンパク質として植物に導入したときに植物の花の形態を改変しうるタンパク質をコードするＤＮＡ等を挙げることができる。なお、ここでストリンジェントな条件でハイブリダイズするとは、好ましくは６０℃で２×ＳＳＣ洗浄条件下で結合することを意味し、より好ましくは６０℃で０．１×ＳＳＣ洗浄条件下で結合することを意味する。また、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４または１６に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ等を挙げることができる。
【００３２】
上記ハイブリダイゼーションは、J. Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual,2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory(1989)に記載されている方法等、従来公知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなる（非特異ＤＮＡはハイブリダイズしがたくなる）。
【００３３】
上記転写因子をコードするＤＮＡをシクラメンから取得する方法は特に限定されるものではなく、従来公知の方法により、多くの植物から単離することができる。例えば、既知の転写因子の塩基配列に基づき作製したプライマー対を用いることができる。このプライマー対を用いて、植物のｃＤＮＡ又はゲノミックＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うこと等により上記ＤＮＡを得ることができる。また、上記転写因子をコードするＤＮＡは、従来公知の方法により化学合成して得ることもできる。
【００３４】
シクラメン植物の花器官の形態形成に関与する転写因子の機能を抑制する方法は特に限定されるものではなく、転写抑制因子を植物に導入して内在性の転写因子の活性を抑制する方法や、遺伝子破壊やＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）などにより転写因子をコードする遺伝子の発現を抑制する方法が例示されるが、この中では、上記転写因子と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとを融合させたキメラタンパク質を、植物体で生産させることが好ましい。これによって得られる植物体では、上記転写因子の機能が抑制されるため、花器官が形態変化したシクラメン植物体を生産することができる。つまり、上記転写因子は、シクラメンの花器官の形態形成、に不可欠なものであるため、上記転写因子が転写抑制因子に転換されることにより、花器官の形態形成に異常が引き起こされる。
【００３５】
なお、本方法においては、上記転写因子が標的とする遺伝子は特定される必要がない。結果として、花器官の形態が改変されることから、上記標的遺伝子は、花器官の形成過程において、花器官の形態に影響を与える機能を有する遺伝子であることが推定されるが、その機能や構造の特定がされていなくても、本方法においては、その転写抑制を有効に行うことができる。
【００３６】
本発明で用いられる、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチド（説明の便宜上、転写抑制転換ペプチドと称する）としては、特に限定されるものではなく、転写因子と融合させたキメラタンパク質を形成させることにより、当該転写因子の機能を抑制することができるペプチドであればよい。具体的には、例えば、本発明者によって見出された転写抑制転換ペプチド（特許文献１〜７）を挙げることができ、好ましくは配列番号１７記載のＬＤＬＤＬＥＬＲＬＧＦＡペプチドがよい。各種転写抑制転換ペプチドは、上記で説明した転写因子と融合してキメラタンパク質とすることにより、当該転写因子を転写抑制因子とすることができる。
【００３７】
したがって、本発明では、上記転写抑制転換ペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いて、転写因子をコードするＤＮＡとのキメラＤＮＡを得れば、キメラタンパク質を生産させることができる。具体的には、上記転写抑制転換ペプチドをコードするポリヌクレオチド（説明の便宜上、転写抑制転換ポリヌクレオチドと称する）と上記転写因子をコードするＤＮＡとを連結することによりキメラＤＮＡを構築して、植物細胞に導入する。これによりキメラタンパク質を生産させることができる。
【００３８】
上記転写抑制転換ポリヌクレオチドの具体的な塩基配列は特に限定されるものではなく、遺伝暗号に基づいて、上記転写抑制転換ペプチドのアミノ酸配列に対応する塩基配列を含んでいればよい。また、必要に応じて、上記転写抑制転換ポリヌクレオチドは、転写因子ＤＮＡと連結するための連結部位となる塩基配列を含んでいてもよい。さらに、上記転写抑制転換ポリヌクレオチドのアミノ酸読み枠と転写因子ＤＮＡの読み枠とが一致しないような場合に、これらを一致させるための付加的な塩基配列を含んでいてもよい。
【００３９】
本発明で用いられるキメラタンパク質は、転写因子をコードするＤＮＡと転写抑制転換ポリヌクレオチドとを連結した上記キメラＤＮＡから得ることができる。したがって、上記キメラタンパク質は、上記転写因子と、上記転写抑制転換ペプチドとが含まれていればよく、その構成は特に限定されるものではない。例えば、転写因子と転写抑制転換ペプチドとの間をつなぐためのリンカー機能を有するポリペプチドや、ＨｉｓやＭｙｃ、Ｆｌａｇ等のようにキメラタンパク質をエピトープ標識するためのポリペプチド等、各種の付加的なポリペプチドが含まれていてもよい。さらに上記キメラタンパク質には、必要に応じて、ポリペプチド以外の構造、例えば、糖鎖やイソプレノイド基等が含まれていてもよい。なお、キメラタンパク質において、転写因子と転写抑制転換ペプチドの順番は特に制限されず、いずれをアミノ末端側にしてもよい。
【００４０】
本発明にかかる植物体の生産方法は、上記で説明したキメラタンパク質を植物体で生産させ、シクラメン植物の花器官の形態を改変する過程を含んでいれば特に限定されるものではないが、本発明にかかる植物体の生産方法を具体的な工程で示せば、例えば、発現ベクター構築工程、形質転換工程、選抜工程等の工程を含む生産方法として挙げることができる。このうち、本発明では、少なくとも形質転換工程が含まれていればよい。
【００４１】
本発明において行われる発現ベクター構築工程は、上記で説明した転写因子をコードするＤＮＡと、転写抑制転換ポリヌクレオチドと、プロモーターとを含む組換え発現ベクターを構築する工程であれば特に限定されるものではない。
【００４２】
上記プロモーターは、植物体内で遺伝子を発現させることが可能なプロモーターであれば特に限定されるものではなく、公知のプロモーターを好適に用いることができる。かかるプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓ）、アクチンプロモーター、ノパリン合成酵素のプロモーター、タバコのＰＲ１ａ遺伝子プロモーター、トマトのリブロース１，５−二リン酸カルボキシラーゼ・オキシダーゼ小サブユニットプロモーター等を挙げることができる。また、花器官特異的に発現するプロモーター等を挙げることができる。上記プロモーターは、転写因子をコードするＤＮＡと転写抑制転換ポリヌクレオチドとを連結したキメラＤＮＡを発現しうるように連結され、ベクター内に導入されていればよく、組換え発現ベクターとしての具体的な構造は特に限定されるものではない。
【００４３】
ターミネーターは転写終結部位としての機能を有していれば特に限定されるものではなく、公知のものであってもよい。例えば、具体的には、ノパリン合成酵素遺伝子の転写終結領域（Ｎｏｓターミネーター）、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓの転写終結領域（ＣａＭＶ３５Ｓターミネーター）等を好ましく用いることができる。
【００４４】
上記選別マーカーとしては、例えば薬剤耐性遺伝子を用いることができる。かかる薬剤耐性遺伝子の具体的な一例としては、例えば、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール等に対する薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。これにより、上記抗生物質を含む培地中で生育する植物体を選択することによって、形質転換された植物体を容易に選別することができる。
【００４５】
上記組換え発現ベクターの構築方法についても特に限定されるものではなく、適宜選択された母体となるベクターに、上記プロモーター、転写因子をコードするＤＮＡ、および転写抑制転換ポリヌクレオチド、並びに必要に応じて上記他のＤＮＡセグメントを所定の順序となるように導入すればよい。例えば、転写因子をコードするＤＮＡと転写抑制転換ポリヌクレオチドとを連結してキメラＤＮＡを構築し、次に、このキメラＤＮＡとプロモーターと（必要に応じてターミネーター等）とを連結して発現カセットを構築し、これをベクターに導入すればよい。
【００４６】
本発明において行われる形質転換工程は、上記で説明した組換え発現ベクターを植物細胞に導入して、キメラタンパク質を生産させるようになっていればよい。
上記組換え発現ベクターを植物細胞に導入する方法（形質転換方法）は特に限定されるものではなく、植物細胞に応じた適切な従来公知の方法を用いることができる。具体的には、例えば、アグロバクテリウムを用いる方法や直接植物細胞に導入する方法を用いることができる。組換え発現ベクターを直接植物細胞に導入する方法としては、例えば、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法（電気穿孔法）、ポリエチレングリコール法、パーティクルガン法、プロトプラスト融合法、リン酸カルシウム法等を用いることができる。
【００４７】
上記組換え発現ベクターが導入される植物細胞としては、例えば、花、葉、根等の植物器官における各組織の細胞、カルス、不定胚、懸濁培養細胞等を挙げることができる。
本発明において「花器官の形態形成」が改変されているとは、花器官の形態に関する形質が改変されていれば、特に限定されるものではない。花器官の形態としては、例えば、花柄の長さ、花びらの形状、花びらの模様、花びらの色、がくの形状、さやの形状、雄しべの形状、雌しべの形状等を挙げることができ、果実の形態も含まれ。また、花器官の形態形成が改変されるとは、単独の形態が改変される場合と、複数の形態が同時に改変される場合を含む。
【００４８】
本発明における植物体とは、成育した植物個体、植物細胞、植物組織、カルス、種子の少なくとも何れかが含まれる。つまり、本発明では、最終的に植物個体まで成育させることができる状態のものであれば、全て植物体と見なす。また、上記植物細胞には、種々の形態の植物細胞が含まれる。かかる植物細胞としては、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片等が含まれる。これらの植物細胞を増殖・分化させることにより植物体を得ることができる。なお、植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて、従来公知の方法を用いて行うことができる。したがって、本発明にかかる植物体の生産方法では、植物細胞から植物体を再生させる再生工程が含まれていてもよい。
【００４９】
ここで、本発明にかかる花器官の形態が改変された植物体はシクラメン属に含まれるものであれば特に限定されるものではない。
以下に、本発明の実施例の例示により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。以下の実験操作の手順は特に記述しない限り、「モレキュラー クローニング（Molecular Cloning） 第２版」（J．Sambrookら、Cold Spring Habor Laboratory press，１９８９年）に記載されている方法に従った。
【実施例】
【００５０】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
【００５１】
［実施例１］
（１）シクラメンのｍＲＮＡの調製
シクラメン（品種：フレグランスミニ）の蕾４ｇを液体窒素存在下で凍結後、凍結した花弁を乳棒乳鉢を用いて粉砕した。この粉砕物に２×ＣＴＡＢ溶液（すなわち２％臭化セチルトリメチルアンモニウムと０.１Ｍ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ９.５）と２０ｍＭ ＥＤＴＡと１.４Ｍ ＮａＣｌと４％ β−メルカプトエタノールとの混合物）４０ｍｌを加えた。得られた混合物を撹拌した後、６５℃で１０分間インキュベートした。次にインキュベートした該混合物をクロロフォルム抽出に２回かけた。得られたクロロフォルム抽出液にイソプロパノールを加えて核酸を析出させた。核酸よりなる沈澱を８０００g、４℃で１５分間遠心分離を行い、核酸をを回収した。その核酸をＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）と１ｍＭ ＥＤＴＡの混合物）４ｍｌに溶解し、得られた溶液に１０Ｍ 塩化リチウム溶液１ｍｌを加えた。得られた混合液を氷上に２時間置いた後、１９０００ｇ、４℃で１０分間遠心分離すると、ＲＮＡが沈澱した。そのＲＮＡを分け取り、蒸留水に溶解し、さらにそのＲＮＡ溶液をフェノール抽出およびエタノール沈殿することによりＲＮＡを精製した。さらに、これで得られた全ＲＮＡの精製品から、ｍＲＮＡの単離をｍＲＮＡ精製キット（タカラバイオ社製、Oligotex−Mag ｍRNA purification Kit）により行うと、シクラメンのｍＲＮＡを約６μｇ得た。
【００５２】
［実施例2］
（２）ＭＡＤＳボックス転写因子クローニング用ｃＤＮＡ断片の作製
シクラメンのＭＡＤＳボックス転写因子のｃＤＮＡ断片クローニング用のプローブをＲＴ−ＰＣＲ(Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction)を用いて作製するために、まずプライマーの設計を行った。そのために、シロイヌナズナを含めた花卉類のＡＧ遺伝子をもとにアライメントを作成した。
下記に示す塩基配列を有する５種類のオリゴヌクレオチドをプライマーＮｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．４、Ｎｏ．５ として化学合成により作製した。
Ｎｏ．１（プライマー配列：配列番号１８ ）
5’-GCICWTGARMTNTCNRTNYTNTGYGATGC-3’
Ｎｏ．２（プライマー配列：配列番号１９ ）
5’-GCGGATCCRTTYTGYTCYTGDATIGCYTTYTC-3’
Ｎｏ．３（プライマー配列：配列番号２０ ）
5’-ATGGSIMGIGGIAARATISARAT-3’
Ｎｏ．４（プライマー配列：配列番号２１ ）
5’-GGIMGIGGIAARATIGARATIAARMGIAT-3’
Ｎｏ．５（プライマー配列：配列番号２２ ）
5’-GTNCARYTNAARRMGNATNGARAAYAAGAT-3’
但し、上記の２つの塩基配列においてk＝gまたはt；w＝aまたはt；r＝gまたはa；y＝tまたはc;m= aまたはcを意味する。
【００５３】
なお、上記の５種類のオリゴヌクレオチドの作製はＤＮＡ合成装置（Model ３９１、アプライドバイオシステムズ社製）を用いてオリゴヌクレオチドを合成し、さらにその合成品をイオン交換ＨＰＬＣで精製することにより行った。
【００５４】
次に上記（１）で得た全ＲＮＡ１μｇをテンプレートとして、逆転転写反応液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭのｄＮＴＰ(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)混合物、２．５μＭ オリゴ（dT）Oligo(dT)12-18 primer、ライフテックオリエンタル社製）、ＲＮＡ阻害剤（RNase Inhibitor、タカラバイオ社製 ２０単位および逆転写酵素（AMV Reverse Transcriptase XL タカラバイオ社製 ５単位）２０μlを調製し、逆転写反応を行った。逆転写反応は３０℃ １０分間、５０℃ ３０分間、９９℃ ５分間、４℃ ５分間インキュベートする条件で行った。
【００５５】
更にプライマーＮｏ．１、Ｎｏ．２、各０．１５μＭをプライマーとし、上記で得られた逆転写反応液を含むＰＣＲ法用の増幅反応液を調整し、ＤＮＡの増幅反応を行った。ここで使用される増幅反応液は、ＰＣＲキット（タカラバイオ社製、LA PCR Kit Ver.2.1）により調製した。
ＰＣＲ法によるＤＮＡの上記の増幅反応は、ＰＣＲ反応装置（BioRad社製、iCyceサーマルサイクラー ）を用いて、変性を９４℃、３０秒間、アニーリングを55℃、１分間、また伸張を６８℃、３０秒間行う３つの反応操作を３０回繰り返すことによって実施した。
【００５６】
同様にプライマーNo.３と市販のＵｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｉｍｅｒ Ａ Ｍｉｘ (SMART RACE cDNA Amplification Kit, Clontech/Takara Bio Inc.)
Ｎｏ．Ｘ（プライマー配列：配列番号２３ ）
5’-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3’
各０．１５μＭをプライマーとし、ＤＮＡの増幅反応を行った。
同様にプライマーＮｏ．４とＮｏ．Ｘ、各０．１５μＭをプライマーとし、ＤＮＡの増幅反応を行った。
同様にプライマーＮｏ．５とＮｏ．Ｘ、各０．１５μＭをプライマーとし、ＤＮＡの増幅反応を行った。
上記のようにして増幅された数種類のシクラメンのＭＡＤＳボックスのｃＤＮＡの一部をプローブＤＮＡとして以下のクローニングに用いた。
【００５７】
［実施例３］
（３）３’ＲＡＣＥ および５’ＲＡＣＥ (Rapid amplification of cDNA ends)法によるシクラメンのＭＡＤＳボックス ｃＤＮＡのクローニング
（ｉ）シクラメンのＡＰ１のｃＤＮＡを増幅するために、プライマーの設計を行った。
すなわち、下記に示す塩基配列を有する２種類のオリゴヌクレオチドをプライマーとして設計し、化学合成により作製した。なお、上記のプライマーのオリゴヌクレオチドの作製はＤＮＡ合成サービス(北海道システムサイエンス社)を利用した。
プライマーＮｏ．６（配列番号２４に示す） AP1F2
5’-GGGAAGGGTGGAAATGAAGAGGATTG-3’
プライマーＮｏ．７（配列番号２５に示す） AP1R2
5’-GCCCTCAAGCGGCAAAGCATCCAA-3’
【００５８】
次に、３’RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends（Invitrogen社製）および上記のプライマーＮｏ．６として構築された合成オリゴヌクレオチドの各１０ｐｍｏｌをプライマーとして用いて、上記（１）で得たｍＲＮＡ０．１μgからシクラメンのＡＰ１ｃＤＮＡ下流域の増幅を行った。上記した３’ＲＡＣＥ法におけるシクラメンｃＤＮＡの増幅反応は、ＰＣＲ反応装置（BioRad社製、iCyceサーマルサイクラー）を用いて、変性を９４℃で３０秒間行い、アニーリングを５２℃で１分間行い、また伸張を７２℃で１分間行う３つの反応操作を３５回繰り返すことによって実施した。
【００５９】
次に、５’RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends（Invitrogen社製）および上記のプライマーＮｏ．７として構築された2種類の合成オリゴヌクレオチドの各１０ｐｍｏｌをプライマーとして用いて、上記（１）で得たｍＲＮＡ０．１μｇからシクラメンのＡＰ１ｃＤＮＡ上流域の増幅を行った。上記した５’ＲＡＣＥ法におけるシクラメンｃＤＮＡの増幅反応は、ＰＣＲ反応装置（BioRad社製、iCyceサーマルサイクラー）を用いて、変性を９４℃で３０秒間行い、アニーリングを５２℃で１分間行い、また伸張を７２℃で１分間行う３つの反応操作を３５回繰り返すことによって実施した。
【００６０】
上記で得られた増幅反応産物をＴＡベクターｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｖｅｃｔｏｒ(Navagen社製)のTAサイトに連結した。得られた連結ベクターを大腸菌ＤＨ５αに形質転換することにより、増幅反応産物であるＤＮＡを保持する形質転換された大腸菌を得た。
上記のＤＮＡ断片がクローニングされた大腸菌をそれぞれ複数個選抜し、この大腸菌が保持するプラスミドDNAの塩基配列解析を行った。この塩基配列の決定は、プラスミド精製キット（QIAfilter Plasmid Midi Kit（QIAGEN社製））およびDNAシークエンス受託サービス(ファスマック社)を利用し、行った。
【００６１】
その結果、前記の増幅反応産物のＤＮＡ断片はすべてポリＡシグナルを含むｃＤＮＡであることが確認された。決定された塩基配列より予想されるアミノ酸配列をこれまで明らかにされているＡＰ１遺伝子のアミノ酸配列と比較することにより、上記の増幅反応産物であるｃＤＮＡ断片はシクラメンのＡＰ１遺伝子をコードするｃＤＮＡの一部領域を含むＤＮＡ断片である事を確認した。上記のｃＤＮＡ断片の遺伝子をそれぞれＣｐＡＰ１と命名した。
【００６２】
上記で決定されたＣｐＡＰ１ｃＤＮＡの５’側上流域および３’側下流域の塩基配列を結合するために、ソフトウエアＧｅｎｅｔｙｘ（ゼネティクス社製）を用い、塩基配列Ａｌｉｇｎｍｅｎｔファイルをソフトウェアの初期設定条件で作成することによって、個の塩基よりなる一つのｃＤＮＡとしての塩基配列を得た。ＣｐＡＰ１ｃＤＮＡは２４６個の塩基よりなる単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のＤＮＡ配列を含む。
【００６３】
（ｉｉ）シクラメンのＰＩのｃＤＮＡを増幅するために、プライマーの設計を行った。
すなわち、下記に示す塩基配列を有する２種類のオリゴヌクレオチドをプライマーとして設計し、化学合成により作製した。なお、上記のプライマーのオリゴヌクレオチドの作製はＤＮＡ合成サービス（北海道システムサイエンス社）を利用した。
プライマーＮｏ．８（配列番号２６に示す） PIF
5’-AAGGAGATCTCGGTCTTGTGTGATGC-3’
プライマーＮｏ．９（配列番号２７に示す） PIR
5’-GGAGAAAGGCATCTGAGGCTGGTACT-3’
【００６４】
上記（ｉ）記載の方法と同様の方法で、シクラメンのＰＩの増幅断片を得た。
その結果、前記の増幅反応産物のＤＮＡ断片はすべてポリＡシグナルを含むｃＤＮＡであることが確認された。決定された塩基配列より予想されるアミノ酸配列をこれまで明らかにされているＰＩ遺伝子のアミノ酸配列と比較することにより、上記の増幅反応産物であるｃＤＮＡ断片はシクラメンのＰＩ遺伝子をコードするｃＤＮＡの一部領域を含むＤＮＡ断片である事を確認した。上記のｃＤＮＡ断片の遺伝子をそれぞれＣｐＰＩと命名した。
【００６５】
上記で決定されたＣｐＰＩｃＤＮＡの５’側上流域および３’側下流域の塩基配列を結合するために、ソフトウエアＧｅｎｅｔｙｘ（ゼネティクス社製）を用い、塩基配列Ａｌｉｇｎｍｅｎｔファイルをソフトウェアの初期設定条件で作成することによって、個の塩基よりなる一つのｃＤＮＡとしての塩基配列を得た。ＣｐＰＩｃＤＮＡは２０６個の塩基よりなる単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のＤＮＡ配列を含む。
【００６６】
（ｉｉｉ）シクラメンのＡＰ３のｃＤＮＡを増幅するために、プライマーの設計を行った。
すなわち、下記に示す塩基配列を有する２種類のオリゴヌクレオチドをプライマーとして設計し、化学合成により作製した。なお、上記のプライマーのオリゴヌクレオチドの作製はＤＮＡ合成サービス（北海道システムサイエンス社）を利用した。
プライマーＮｏ．１０（配列番号２８に示す） AP3aF
5’-CTGCATAGGGAGATTCGGCAAAGGAT-3’
プライマーＮｏ．１１（配列番号２９に示す） AP3aR
5’-AGAAATCCCGGCTCTGAGTTGAATGT-3’
プライマーＮｏ．１２（配列番号３０に示す） AP3bF
5’-TCACCATGAGAAAATGCAAGAGCAGA-3’
プライマーＮｏ．１３（配列番号３１に示す） AP3bR
5’-CGTTTATTAAGCGAGGCGAAGGTCAT-3’
【００６７】
上記（ｉ）記載の方法と同様の方法で、シクラメンのＡＰ３の増幅断片を２種類得た。
その結果、前記の増幅反応産物のＤＮＡ断片はすべてポリＡシグナルを含むｃＤＮＡであることが確認された。決定された塩基配列より予想されるアミノ酸配列をこれまで明らかにされているＡＰ３遺伝子のアミノ酸配列と比較することにより、上記の増幅反応産物であるｃＤＮＡ断片はシクラメンのＡＰ３遺伝子をコードする２種類のｃＤＮＡの一部領域を含むＤＮＡ断片である事を確認した。上記のｃＤＮＡ断片の遺伝子をそれぞれＣｐＡＰ３ａ、ＣｐＡＰ３ｂと命名した。
【００６８】
上記で決定されたＣｐＡＰ３ａ およびＣｐＡＰ３ｂのｃＤＮＡの５’側上流域および３’側下流域の塩基配列を結合するために、ソフトウエアＧｅｎｅｔｙｘ（ゼネティクス社製）を用い、塩基配列Ａｌｉｇｎｍｅｎｔファイルをソフトウェアの初期設定条件で作成することによって、個の塩基よりなる一つのｃＤＮＡとしての塩基配列を得た。ＣｐＡＰ３ａｃＤＮＡは２２６個の塩基よりなる単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のＤＮＡ配列を含む。ＣｐＡＰ３ｂｃＤＮＡは２２５個の塩基よりなる単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のＤＮＡ配列を含む。
【００６９】
（ｉｖ）シクラメンのＳＴＫのｃＤＮＡを増幅するために、プライマーの設計を行った。
すなわち、下記に示す塩基配列を有する２種類のオリゴヌクレオチドをプライマーとして設計し、化学合成により作製した。なお、上記のプライマーのオリゴヌクレオチドの作製はＤＮＡ合成サービス（北海道システムサイエンス社）を利用した。
プライマーＮｏ．１４（配列番号３２に示す） STKF
5’-CAACCGCCAGGTCACTTTTTGTAAGA-3’
プライマーＮｏ．１５（配列番号３３に示す） STKR
5’-GACGGTCCTTCCTCCATTAGGTTGAG-3’
【００７０】
上記（ｉ）記載の方法と同様の方法で、シクラメンのＳＴＫの増幅断片を得た。
その結果、前記の増幅反応産物のＤＮＡ断片はすべてポリＡシグナルを含むｃＤＮＡであることが確認された。決定された塩基配列より予想されるアミノ酸配列をこれまで明らかにされているＳＴＫ遺伝子のアミノ酸配列と比較することにより、上記の増幅反応産物であるｃＤＮＡ断片はシクラメンのＳＴＫ遺伝子をコードするｃＤＮＡの一部領域を含むＤＮＡ断片である事を確認した。上記のｃＤＮＡ断片の遺伝子をそれぞれＣｐＳＴＫと命名した。
【００７１】
上記で決定されたＣｐＳＴＫｃＤＮＡの５’側上流域および３’側下流域の塩基配列を結合するために、ソフトウエアＧｅｎｅｔｙｘ（ゼネティクス社製）を用い、塩基配列Ａｌｉｇｎｍｅｎｔファイルをソフトウェアの初期設定条件で作成することによって、個の塩基よりなる一つのｃＤＮＡとしての塩基配列を得た。ＣｐＳＴＫｃＤＮＡは２２２個の塩基よりなる単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のＤＮＡ配列を含む。
【００７２】
（ｖ）シクラメンのＭＡＤＳのｃＤＮＡを増幅するために、プライマーの設計を行った。
すなわち、下記に示す塩基配列を有する２種類のオリゴヌクレオチドをプライマーとして設計し、化学合成により作製した。
なお、上記のプライマーのオリゴヌクレオチドの作製はＤＮＡ合成サービス（北海道システムサイエンス社）を利用した。
プライマーＮｏ．１６（配列番号３４に示す） MADS1F
5’-TAACAATGCAGGAAGAGAGATGGAGCA-3’
プライマーＮｏ．１７（配列番号３５に示す） MADS1R
5’-GATCAAGCCATTCCCATTTTGATCTTG-3’
プライマーＮｏ．１８（配列番号３６に示す） MADS2F
5’-CACAATACATGCTGGATCAGCTCACTG-3’
プライマーＮｏ．１９（配列番号３７に示す） MADS2R
5’-AATGCATCACACGTTTGTTCAGGTTTC-3’
プライマーＮｏ．２０（配列番号３８に示す） MADS3F
5’-GCTACAAAAGCAGCTGTGTGGCAGTG-3’
プライマーＮｏ．２１（配列番号３９に示す） MADS3R
5’-CCGCAAGTTAACAGCAGCGTACAACA-3’
【００７３】
上記（ｉ）記載の方法と同様の方法で、シクラメンのＭＡＤＳの増幅断片を３種類得た。
その結果、前記の増幅反応産物のＤＮＡ断片はすべてポリＡシグナルを含むｃＤＮＡであることが確認された。決定された塩基配列より予想されるアミノ酸配列をこれまで明らかにされているＭＡＤＳ遺伝子のアミノ酸配列と比較することにより、上記の増幅反応産物であるｃＤＮＡ断片はシクラメンのＭＡＤＳ遺伝子をコードする３種類のｃＤＮＡの一部領域を含むＤＮＡ断片である事を確認した。上記のｃＤＮＡ断片の遺伝子をそれぞれＣｐＭＡＤＳ１、ＣｐＭＡＤＳ２、ＣｐＭＡＤＳ３と命名した。
【００７４】
上記で決定されたＣｐＭＡＤＳ１、ＣｐＭＡＤＳ２およびＣｐＭＡＤＳ３のｃＤＮＡの５’側上流域および３’側下流域の塩基配列を結合するために、ソフトウエアＧｅｎｅｔｙｘ（ゼネティクス社）を用い、塩基配列Ａｌｉｇｎｍｅｎｔファイルをソフトウェアの初期設定条件で作成することによって、個の塩基よりなる一つのｃＤＮＡとしての塩基配列を得た。ＣｐＭＡＤＳ１ｃＤＮＡは２４５個の塩基よりなる単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のＤＮＡ配列を含む。ＣｐＭＡＤＳ２ｃＤＮＡは２４７個の塩基よりなる単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のＤＮＡ配列を含む。ＣｐＭＡＤＳ３ｃＤＮＡは１８９個の塩基よりなる単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のＤＮＡ配列を含む。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明では、シクラメンのＭＡＤＳボックス転写因子の機能を抑制することによってシクラメンの花の形態が改変された植物体を得ることができる。それゆえ、本発明は、各種農業や園芸、アグリビジネス、さらには農産物を加工する産業や食品産業等に利用可能であり、しかも非常に有用であると考えられる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シクラメンの花器官形成関連転写因子をコードする遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
花の形態は園芸植物の観賞性における重要な要素の一つである。花の発生は、花序分裂組織から花原基として分化するところから始まり、花原基に含まれる花芽分裂組織から、がく片、花びら、雄しべ、雌しべの４種類の花器官が分化する。その後、分化した花器官を含む複合器官として成熟した花が形成される。八重咲きと呼ばれる花は、花弁の内側の雄しべや雌しべが並んでいる場所に、雄しべや雌しべの形態が改変されて花弁に変化したものが形成されて、花弁数が増加して花弁だけで花が構成されているように見える状態を指す。このような植物は、新規な園芸植物の創出に利用できる等、農業上の有用性が高い。
【０００３】
このような高等植物における花の形態の発生は一般にＡＢＣモデルによって説明されており、このモデルはＭＡＤＳボックスファミリーに属するＡ、Ｂ、Ｃのクラスの遺伝子の転写制御を介して花の形態が変化すると考えられている（酒井一、花 の形 態形 成の分子遺伝学、新版「植物の形 を決める分子機構」（秀潤社）150-163 (2000)）。ＭＡＤＳボックスファミリー遺伝子 は、ＭＡＤＳボックスと呼ばれる保存性領域を含む転写因子をコードする遺伝子 で、３０以上の遺伝子 からなる遺伝子 ファミリーを形 成している。例えばＡＰＥＴＡＬＡ１（ＡＰ１）、ＡＰＥＴＡＬＡ（ＡＰ２）などのＡクラス遺伝子、ＡＰＥＴＡＬＡ３（ＡＰ３）、ＰＩＳＴＩＬＬＡＴＡ（ＰＩ）などのＢクラス遺伝子、そしてＡＧＡＭＯＵＳ（ＡＧ）のＣクラス遺伝子など転写因子が挙げられ、これらの変異体で花の形態の変化が確認されている。
【０００４】
これまで、植物の花弁の形態や数の改変は、一般に植物の品種を掛け合わせる交配育種や自然界で発生する突然変異により行われている。しかし、従来の交配育種では、目的とする形態を有する植物を生産するためには、長い年月と、熟練者の経験が必要であり、また突然変異は目的とする形態の発生が制御できないため、簡易かつ確実に花器官の形態を改変する方法が求められている。
【０００５】
近年、遺伝子工学的に花の形態を改変する方法として、任意の転写因子を転写抑制因子に転換するペプチドを利用する方法が知られている（例えば、特許文献１〜７）。種々の転写因子と上記ペプチドとを融合させた融合タンパク質（キメラタンパク質）をコードする遺伝子を植物体内に導入することより、転写因子が転写抑制因子に転換され、該転写因子が転写を促進する標的遺伝子の発現が抑制された植物体を生産することが可能で、具体的には、上記のＭＡＤＳボックスファミリー遺伝子であるシロイヌナズナのＡＰ３遺伝子やＡＧ遺伝子の発現を、それぞれの遺伝子のプロモーター領域に結合するリプレッサーを用いて抑制し、雄性不稔体の生産方法や花弁数を増加させる方法を確立している（特許文献８〜９）。
【０００６】
しかしながら、シロイヌナズナのＡＧ遺伝子のキメラリプレッサーを導入したトレニアでは、花弁数の増加は認められていないなど、使用する転写因子の植物起源と、目的とする植物種によっては、機能しないことがある（非特許文献１）。
【０００７】
一方、シクラメンは冬を代表する鉢花として国内出荷数の上位を占める重要な花卉園芸植物であるが、前記した遺伝子工学的手法によって花の形態を改変するには、シクラメンの花器官形成に関与する転写因子遺伝子の取得が重要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００１−２６９１７７公報
【特許文献２】特開２００１−２６９１７８公報
【特許文献３】特開２００１−２９２７７６公報
【特許文献４】特開２００１−２９２７７７公報
【特許文献５】特開２００１−２６９１７６公報
【特許文献６】特開２００１−２６９１７９公報
【特許文献７】国際公開第０３／０５５９０３号パンフレット
【特許文献８】特開２００５−１９２４８３公報
【特許文献９】特開２００６−４２７２９公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Plant Biotechnology，2008年，25巻，P45-53
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
シクラメンの花器官形成に関与する転写因子は知られていないのが現状で、本発明は、シクラメンの花器官形成関連転写因子をコードする遺伝子を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、シクラメンの花器官形成を制御する転写因子をコードする遺伝子を同定することに成功し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は、以下を包含する。
［１］（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のアミノ酸配列を含むシクラメンの花器官形成関連転写因子をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、シクラメンの花器官形成に関与し、かつ転写因子活性を有するアミノ酸配列
（ｃ）配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号１の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、シクラメンの花器官形成に関与する転写因子をコードするＤＮＡ
（ｅ）配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつシクラメンの花器官形成に関与する転写因子をコードするＤＮＡ
【００１３】
［２］（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のアミノ酸配列を含むシクラメンの花器官形成関連転写因子をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号４のアミノ酸配列
（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、シクラメンの花器官形成に関与し、かつ転写因子活性を有するアミノ酸配列
（ｃ）配列番号３の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号３の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、シクラメンの花器官形成に関与する転写因子をコードするＤＮＡ
（ｅ）配列番号３の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつシクラメンの花器官形成に関与する転写因子をコードするＤＮＡ
【００１４】
［３］（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のアミノ酸配列を含むシクラメンの花器官形成関連転写因子をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号６のアミノ酸配列
（ｂ）配列番号６のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、シクラメンの花器官形成に関与し、かつ転写因子活性を有するアミノ酸配列
（ｃ）配列番号５の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号５の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、シクラメンの花器官形成に関与する転写因子をコードするＤＮＡ
（ｅ）配列番号５の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつシクラメンの花器官形成に関与する転写因子をコードするＤＮＡ
【００１５】
［４］（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のアミノ酸配列を含むシクラメンの花器官形成関連転写因子をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号８のアミノ酸配列
（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、シクラメンの花器官形成に関与し、かつ転写因子活性を有するアミノ酸配列
（ｃ）配列番号７の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号７の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、シクラメンの花器官形成に関与する転写因子をコードするＤＮＡ
（ｅ）配列番号７の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつシクラメンの花器官形成に関与する転写因子をコードするＤＮＡ
【００１６】
［５］（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のアミノ酸配列を含むシクラメンの花器官形成関連転写因子をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号１０のアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、シクラメンの花器官形成に関与し、かつ転写因子活性を有するアミノ酸配列
（ｃ）配列番号９の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号９の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、シクラメンの花器官形成に関与する転写因子をコードするＤＮＡ
（ｅ）配列番号９の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつシクラメンの花器官形成に関与する転写因子をコードするＤＮＡ
【００１７】
［６］（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のアミノ酸配列を含むシクラメンの花器官形成関連転写因子をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、シクラメンの花器官形成に関与し、かつ転写因子活性を有するアミノ酸配列
（ｃ）配列番号１１の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号１１の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、シクラメンの花器官形成に関与する転写因子をコードするＤＮＡ
（ｅ）配列番号１１の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつシクラメンの花器官形成に関与する転写因子をコードするＤＮＡ
【００１８】
［７］（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のアミノ酸配列を含むシクラメンの花器官形成関連転写因子をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号１４のアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、シクラメンの花器官形成に関与し、かつ転写因子活性を有するアミノ酸配列
（ｃ）配列番号１３の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号１３の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、シクラメンの花器官形成に関与する転写因子をコードするＤＮＡ
（ｅ）配列番号１３の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつシクラメンの花器官形成に関与する転写因子をコードするＤＮＡ
【００１９】
［８］（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のアミノ酸配列を含むシクラメンの花器官形成関連転写因子をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号１６のアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１６のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、シクラメンの花器官形成に関与し、かつ転写因子活性を有するアミノ酸配列
（ｃ）配列番号１５の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号１５の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、シクラメンの花器官形成に関与する転写因子をコードするＤＮＡ
（ｅ）配列番号１５の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつシクラメンの花器官形成に関与する転写因子をコードするＤＮＡ
【００２０】
［９］前記転写因子をコードする請求項１、２、３、４、５、６、７又は８記載のＤＮＡと転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードする配列番号１７のＤＮＡとを融合させたキメラ遺伝子
【００２１】
［１０］前記［９］記載の遺伝子を含む発現ベクター。
【００２２】
［１１］前記［１０］記載の発現ベクターを含む形質転換シクラメン植物。
【発明の効果】
【００２３】
本発明により、シクラメンの花器官形成関連転写因子をコードする遺伝子が提供される。本発明の遺伝子は、シクラメンの花器官の形態を変化させる分子育種に使用できる点で有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】シクラメンＭＡＤＳ−ボックス転写因子遺伝子の系統樹
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下、本発明を詳細に説明する。なお、本発明はこれに限定されるものではない。
シクラメン植物の花器官の形態に関与する転写因子としては、シクラメンのＭＡＤＳボックスファミリーに属する転写因子を挙げることができる。
【００２６】
本発明で用いられる転写因子の代表的な一例としては、シクラメンのＡＰ１タンパク質、ＡＰ３ａタンパク質、ＡＰ３ｂタンパク質、ＰＩタンパク質、ＳＴＫタンパク質、ＭＡＤＳ１タンパク質、ＭＡＤＳ２タンパク質またはＭＡＤＳ３タンパク質を挙げることができる。ＡＰ１タンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質である。ＡＰ３ａタンパク質は、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質である。ＡＰ３ｂタンパク質は、配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質である。ＰＩタンパク質配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質である。ＳＴＫタンパク質配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質である。ＭＡＤＳ１タンパク質配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質である。ＭＡＤＳ２タンパク質配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質である。ＭＡＤＳ３タンパク質は、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質である。
【００２７】
ただし、上記転写因子は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４および配列番号１６に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であっても、下記転写抑制転換ペプチドとのキメラタンパク質として植物に導入したときにシクラメン植物の花器官の形態を改変しうるものであれば本発明にて用いることができる。
【００２８】
なお、上記の配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４および配列番号１６に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列における「１個又は数個」の範囲は特に限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１個から５個、特に好ましくは１個から３個を意味する。
【００２９】
本発明で用いられるキメラタンパク質を生産する際には、後述するように、公知の遺伝子組換え技術を好適に用いることができる。そこで、本発明にかかる植物体の生産方法には、上記転写因子をコードする遺伝子が好適に用いることができる。
【００３０】
例えば、転写因子としてシクラメンのＡＰ１タンパク質を用いる場合には、このＡＰ１タンパク質をコードする遺伝子（説明の便宜上、ＣｐＡＰ１遺伝子と称する）を挙げることができる。ＣｐＡＰ１遺伝子の具体的な一例としては、配列番号１に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）として含むポリヌクレオチドを挙げることができる。また、例えば、転写因子としてシクラメンのＡＰ３ａタンパク質を用いる場合には、このＡＰ３ａタンパク質をコードする遺伝子（説明の便宜上、ＣｐＡＰ３ａ遺伝子と称する）を挙げることができる。ＣｐＡＰ３ａ遺伝子の具体的な一例としては、配列番号３に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）として含むポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００３１】
もちろん、本発明で用いられる転写因子をコードするＤＮＡとしては、上記の例に限定されるものではなく、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３または１５に示される塩基配列と相同性を有するＤＮＡであってもよい。具体的には、例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３または１５に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、転写抑制転換ペプチドとのキメラタンパク質として植物に導入したときに植物の花の形態を改変しうるタンパク質をコードするＤＮＡ等を挙げることができる。なお、ここでストリンジェントな条件でハイブリダイズするとは、好ましくは６０℃で２×ＳＳＣ洗浄条件下で結合することを意味し、より好ましくは６０℃で０．１×ＳＳＣ洗浄条件下で結合することを意味する。また、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４または１６に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ等を挙げることができる。
【００３２】
上記ハイブリダイゼーションは、J. Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual,2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory(1989)に記載されている方法等、従来公知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなる（非特異ＤＮＡはハイブリダイズしがたくなる）。
【００３３】
上記転写因子をコードするＤＮＡをシクラメンから取得する方法は特に限定されるものではなく、従来公知の方法により、多くの植物から単離することができる。例えば、既知の転写因子の塩基配列に基づき作製したプライマー対を用いることができる。このプライマー対を用いて、植物のｃＤＮＡ又はゲノミックＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うこと等により上記ＤＮＡを得ることができる。また、上記転写因子をコードするＤＮＡは、従来公知の方法により化学合成して得ることもできる。
【００３４】
シクラメン植物の花器官の形態形成に関与する転写因子の機能を抑制する方法は特に限定されるものではなく、転写抑制因子を植物に導入して内在性の転写因子の活性を抑制する方法や、遺伝子破壊やＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）などにより転写因子をコードする遺伝子の発現を抑制する方法が例示されるが、この中では、上記転写因子と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとを融合させたキメラタンパク質を、植物体で生産させることが好ましい。これによって得られる植物体では、上記転写因子の機能が抑制されるため、花器官が形態変化したシクラメン植物体を生産することができる。つまり、上記転写因子は、シクラメンの花器官の形態形成、に不可欠なものであるため、上記転写因子が転写抑制因子に転換されることにより、花器官の形態形成に異常が引き起こされる。
【００３５】
なお、本方法においては、上記転写因子が標的とする遺伝子は特定される必要がない。結果として、花器官の形態が改変されることから、上記標的遺伝子は、花器官の形成過程において、花器官の形態に影響を与える機能を有する遺伝子であることが推定されるが、その機能や構造の特定がされていなくても、本方法においては、その転写抑制を有効に行うことができる。
【００３６】
本発明で用いられる、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチド（説明の便宜上、転写抑制転換ペプチドと称する）としては、特に限定されるものではなく、転写因子と融合させたキメラタンパク質を形成させることにより、当該転写因子の機能を抑制することができるペプチドであればよい。具体的には、例えば、本発明者によって見出された転写抑制転換ペプチド（特許文献１〜７）を挙げることができ、好ましくは配列番号１７記載のＬＤＬＤＬＥＬＲＬＧＦＡペプチドがよい。各種転写抑制転換ペプチドは、上記で説明した転写因子と融合してキメラタンパク質とすることにより、当該転写因子を転写抑制因子とすることができる。
【００３７】
したがって、本発明では、上記転写抑制転換ペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いて、転写因子をコードするＤＮＡとのキメラＤＮＡを得れば、キメラタンパク質を生産させることができる。具体的には、上記転写抑制転換ペプチドをコードするポリヌクレオチド（説明の便宜上、転写抑制転換ポリヌクレオチドと称する）と上記転写因子をコードするＤＮＡとを連結することによりキメラＤＮＡを構築して、植物細胞に導入する。これによりキメラタンパク質を生産させることができる。
【００３８】
上記転写抑制転換ポリヌクレオチドの具体的な塩基配列は特に限定されるものではなく、遺伝暗号に基づいて、上記転写抑制転換ペプチドのアミノ酸配列に対応する塩基配列を含んでいればよい。また、必要に応じて、上記転写抑制転換ポリヌクレオチドは、転写因子ＤＮＡと連結するための連結部位となる塩基配列を含んでいてもよい。さらに、上記転写抑制転換ポリヌクレオチドのアミノ酸読み枠と転写因子ＤＮＡの読み枠とが一致しないような場合に、これらを一致させるための付加的な塩基配列を含んでいてもよい。
【００３９】
本発明で用いられるキメラタンパク質は、転写因子をコードするＤＮＡと転写抑制転換ポリヌクレオチドとを連結した上記キメラＤＮＡから得ることができる。したがって、上記キメラタンパク質は、上記転写因子と、上記転写抑制転換ペプチドとが含まれていればよく、その構成は特に限定されるものではない。例えば、転写因子と転写抑制転換ペプチドとの間をつなぐためのリンカー機能を有するポリペプチドや、ＨｉｓやＭｙｃ、Ｆｌａｇ等のようにキメラタンパク質をエピトープ標識するためのポリペプチド等、各種の付加的なポリペプチドが含まれていてもよい。さらに上記キメラタンパク質には、必要に応じて、ポリペプチド以外の構造、例えば、糖鎖やイソプレノイド基等が含まれていてもよい。なお、キメラタンパク質において、転写因子と転写抑制転換ペプチドの順番は特に制限されず、いずれをアミノ末端側にしてもよい。
【００４０】
本発明にかかる植物体の生産方法は、上記で説明したキメラタンパク質を植物体で生産させ、シクラメン植物の花器官の形態を改変する過程を含んでいれば特に限定されるものではないが、本発明にかかる植物体の生産方法を具体的な工程で示せば、例えば、発現ベクター構築工程、形質転換工程、選抜工程等の工程を含む生産方法として挙げることができる。このうち、本発明では、少なくとも形質転換工程が含まれていればよい。
【００４１】
本発明において行われる発現ベクター構築工程は、上記で説明した転写因子をコードするＤＮＡと、転写抑制転換ポリヌクレオチドと、プロモーターとを含む組換え発現ベクターを構築する工程であれば特に限定されるものではない。
【００４２】
上記プロモーターは、植物体内で遺伝子を発現させることが可能なプロモーターであれば特に限定されるものではなく、公知のプロモーターを好適に用いることができる。かかるプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓ）、アクチンプロモーター、ノパリン合成酵素のプロモーター、タバコのＰＲ１ａ遺伝子プロモーター、トマトのリブロース１，５−二リン酸カルボキシラーゼ・オキシダーゼ小サブユニットプロモーター等を挙げることができる。また、花器官特異的に発現するプロモーター等を挙げることができる。上記プロモーターは、転写因子をコードするＤＮＡと転写抑制転換ポリヌクレオチドとを連結したキメラＤＮＡを発現しうるように連結され、ベクター内に導入されていればよく、組換え発現ベクターとしての具体的な構造は特に限定されるものではない。
【００４３】
ターミネーターは転写終結部位としての機能を有していれば特に限定されるものではなく、公知のものであってもよい。例えば、具体的には、ノパリン合成酵素遺伝子の転写終結領域（Ｎｏｓターミネーター）、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓの転写終結領域（ＣａＭＶ３５Ｓターミネーター）等を好ましく用いることができる。
【００４４】
上記選別マーカーとしては、例えば薬剤耐性遺伝子を用いることができる。かかる薬剤耐性遺伝子の具体的な一例としては、例えば、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール等に対する薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。これにより、上記抗生物質を含む培地中で生育する植物体を選択することによって、形質転換された植物体を容易に選別することができる。
【００４５】
上記組換え発現ベクターの構築方法についても特に限定されるものではなく、適宜選択された母体となるベクターに、上記プロモーター、転写因子をコードするＤＮＡ、および転写抑制転換ポリヌクレオチド、並びに必要に応じて上記他のＤＮＡセグメントを所定の順序となるように導入すればよい。例えば、転写因子をコードするＤＮＡと転写抑制転換ポリヌクレオチドとを連結してキメラＤＮＡを構築し、次に、このキメラＤＮＡとプロモーターと（必要に応じてターミネーター等）とを連結して発現カセットを構築し、これをベクターに導入すればよい。
【００４６】
本発明において行われる形質転換工程は、上記で説明した組換え発現ベクターを植物細胞に導入して、キメラタンパク質を生産させるようになっていればよい。
上記組換え発現ベクターを植物細胞に導入する方法（形質転換方法）は特に限定されるものではなく、植物細胞に応じた適切な従来公知の方法を用いることができる。具体的には、例えば、アグロバクテリウムを用いる方法や直接植物細胞に導入する方法を用いることができる。組換え発現ベクターを直接植物細胞に導入する方法としては、例えば、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法（電気穿孔法）、ポリエチレングリコール法、パーティクルガン法、プロトプラスト融合法、リン酸カルシウム法等を用いることができる。
【００４７】
上記組換え発現ベクターが導入される植物細胞としては、例えば、花、葉、根等の植物器官における各組織の細胞、カルス、不定胚、懸濁培養細胞等を挙げることができる。
本発明において「花器官の形態形成」が改変されているとは、花器官の形態に関する形質が改変されていれば、特に限定されるものではない。花器官の形態としては、例えば、花柄の長さ、花びらの形状、花びらの模様、花びらの色、がくの形状、さやの形状、雄しべの形状、雌しべの形状等を挙げることができ、果実の形態も含まれ。また、花器官の形態形成が改変されるとは、単独の形態が改変される場合と、複数の形態が同時に改変される場合を含む。
【００４８】
本発明における植物体とは、成育した植物個体、植物細胞、植物組織、カルス、種子の少なくとも何れかが含まれる。つまり、本発明では、最終的に植物個体まで成育させることができる状態のものであれば、全て植物体と見なす。また、上記植物細胞には、種々の形態の植物細胞が含まれる。かかる植物細胞としては、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片等が含まれる。これらの植物細胞を増殖・分化させることにより植物体を得ることができる。なお、植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて、従来公知の方法を用いて行うことができる。したがって、本発明にかかる植物体の生産方法では、植物細胞から植物体を再生させる再生工程が含まれていてもよい。
【００４９】
ここで、本発明にかかる花器官の形態が改変された植物体はシクラメン属に含まれるものであれば特に限定されるものではない。
以下に、本発明の実施例の例示により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。以下の実験操作の手順は特に記述しない限り、「モレキュラー クローニング（Molecular Cloning） 第２版」（J．Sambrookら、Cold Spring Habor Laboratory press，１９８９年）に記載されている方法に従った。
【実施例】
【００５０】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
【００５１】
［実施例１］
（１）シクラメンのｍＲＮＡの調製
シクラメン（品種：フレグランスミニ）の蕾４ｇを液体窒素存在下で凍結後、凍結した花弁を乳棒乳鉢を用いて粉砕した。この粉砕物に２×ＣＴＡＢ溶液（すなわち２％臭化セチルトリメチルアンモニウムと０.１Ｍ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ９.５）と２０ｍＭ ＥＤＴＡと１.４Ｍ ＮａＣｌと４％ β−メルカプトエタノールとの混合物）４０ｍｌを加えた。得られた混合物を撹拌した後、６５℃で１０分間インキュベートした。次にインキュベートした該混合物をクロロフォルム抽出に２回かけた。得られたクロロフォルム抽出液にイソプロパノールを加えて核酸を析出させた。核酸よりなる沈澱を８０００g、４℃で１５分間遠心分離を行い、核酸をを回収した。その核酸をＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）と１ｍＭ ＥＤＴＡの混合物）４ｍｌに溶解し、得られた溶液に１０Ｍ 塩化リチウム溶液１ｍｌを加えた。得られた混合液を氷上に２時間置いた後、１９０００ｇ、４℃で１０分間遠心分離すると、ＲＮＡが沈澱した。そのＲＮＡを分け取り、蒸留水に溶解し、さらにそのＲＮＡ溶液をフェノール抽出およびエタノール沈殿することによりＲＮＡを精製した。さらに、これで得られた全ＲＮＡの精製品から、ｍＲＮＡの単離をｍＲＮＡ精製キット（タカラバイオ社製、Oligotex−Mag ｍRNA purification Kit）により行うと、シクラメンのｍＲＮＡを約６μｇ得た。
【００５２】
［実施例2］
（２）ＭＡＤＳボックス転写因子クローニング用ｃＤＮＡ断片の作製
シクラメンのＭＡＤＳボックス転写因子のｃＤＮＡ断片クローニング用のプローブをＲＴ−ＰＣＲ(Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction)を用いて作製するために、まずプライマーの設計を行った。そのために、シロイヌナズナを含めた花卉類のＡＧ遺伝子をもとにアライメントを作成した。
下記に示す塩基配列を有する５種類のオリゴヌクレオチドをプライマーＮｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．４、Ｎｏ．５ として化学合成により作製した。
Ｎｏ．１（プライマー配列：配列番号１８ ）
5’-GCICWTGARMTNTCNRTNYTNTGYGATGC-3’
Ｎｏ．２（プライマー配列：配列番号１９ ）
5’-GCGGATCCRTTYTGYTCYTGDATIGCYTTYTC-3’
Ｎｏ．３（プライマー配列：配列番号２０ ）
5’-ATGGSIMGIGGIAARATISARAT-3’
Ｎｏ．４（プライマー配列：配列番号２１ ）
5’-GGIMGIGGIAARATIGARATIAARMGIAT-3’
Ｎｏ．５（プライマー配列：配列番号２２ ）
5’-GTNCARYTNAARRMGNATNGARAAYAAGAT-3’
但し、上記の２つの塩基配列においてk＝gまたはt；w＝aまたはt；r＝gまたはa；y＝tまたはc;m= aまたはcを意味する。
【００５３】
なお、上記の５種類のオリゴヌクレオチドの作製はＤＮＡ合成装置（Model ３９１、アプライドバイオシステムズ社製）を用いてオリゴヌクレオチドを合成し、さらにその合成品をイオン交換ＨＰＬＣで精製することにより行った。
【００５４】
次に上記（１）で得た全ＲＮＡ１μｇをテンプレートとして、逆転転写反応液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭのｄＮＴＰ(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)混合物、２．５μＭ オリゴ（dT）Oligo(dT)12-18 primer、ライフテックオリエンタル社製）、ＲＮＡ阻害剤（RNase Inhibitor、タカラバイオ社製 ２０単位および逆転写酵素（AMV Reverse Transcriptase XL タカラバイオ社製 ５単位）２０μlを調製し、逆転写反応を行った。逆転写反応は３０℃ １０分間、５０℃ ３０分間、９９℃ ５分間、４℃ ５分間インキュベートする条件で行った。
【００５５】
更にプライマーＮｏ．１、Ｎｏ．２、各０．１５μＭをプライマーとし、上記で得られた逆転写反応液を含むＰＣＲ法用の増幅反応液を調整し、ＤＮＡの増幅反応を行った。ここで使用される増幅反応液は、ＰＣＲキット（タカラバイオ社製、LA PCR Kit Ver.2.1）により調製した。
ＰＣＲ法によるＤＮＡの上記の増幅反応は、ＰＣＲ反応装置（BioRad社製、iCyceサーマルサイクラー ）を用いて、変性を９４℃、３０秒間、アニーリングを55℃、１分間、また伸張を６８℃、３０秒間行う３つの反応操作を３０回繰り返すことによって実施した。
【００５６】
同様にプライマーNo.３と市販のＵｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｉｍｅｒ Ａ Ｍｉｘ (SMART RACE cDNA Amplification Kit, Clontech/Takara Bio Inc.)
Ｎｏ．Ｘ（プライマー配列：配列番号２３ ）
5’-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3’
各０．１５μＭをプライマーとし、ＤＮＡの増幅反応を行った。
同様にプライマーＮｏ．４とＮｏ．Ｘ、各０．１５μＭをプライマーとし、ＤＮＡの増幅反応を行った。
同様にプライマーＮｏ．５とＮｏ．Ｘ、各０．１５μＭをプライマーとし、ＤＮＡの増幅反応を行った。
上記のようにして増幅された数種類のシクラメンのＭＡＤＳボックスのｃＤＮＡの一部をプローブＤＮＡとして以下のクローニングに用いた。
【００５７】
［実施例３］
（３）３’ＲＡＣＥ および５’ＲＡＣＥ (Rapid amplification of cDNA ends)法によるシクラメンのＭＡＤＳボックス ｃＤＮＡのクローニング
（ｉ）シクラメンのＡＰ１のｃＤＮＡを増幅するために、プライマーの設計を行った。
すなわち、下記に示す塩基配列を有する２種類のオリゴヌクレオチドをプライマーとして設計し、化学合成により作製した。なお、上記のプライマーのオリゴヌクレオチドの作製はＤＮＡ合成サービス(北海道システムサイエンス社)を利用した。
プライマーＮｏ．６（配列番号２４に示す） AP1F2
5’-GGGAAGGGTGGAAATGAAGAGGATTG-3’
プライマーＮｏ．７（配列番号２５に示す） AP1R2
5’-GCCCTCAAGCGGCAAAGCATCCAA-3’
【００５８】
次に、３’RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends（Invitrogen社製）および上記のプライマーＮｏ．６として構築された合成オリゴヌクレオチドの各１０ｐｍｏｌをプライマーとして用いて、上記（１）で得たｍＲＮＡ０．１μgからシクラメンのＡＰ１ｃＤＮＡ下流域の増幅を行った。上記した３’ＲＡＣＥ法におけるシクラメンｃＤＮＡの増幅反応は、ＰＣＲ反応装置（BioRad社製、iCyceサーマルサイクラー）を用いて、変性を９４℃で３０秒間行い、アニーリングを５２℃で１分間行い、また伸張を７２℃で１分間行う３つの反応操作を３５回繰り返すことによって実施した。
【００５９】
次に、５’RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends（Invitrogen社製）および上記のプライマーＮｏ．７として構築された2種類の合成オリゴヌクレオチドの各１０ｐｍｏｌをプライマーとして用いて、上記（１）で得たｍＲＮＡ０．１μｇからシクラメンのＡＰ１ｃＤＮＡ上流域の増幅を行った。上記した５’ＲＡＣＥ法におけるシクラメンｃＤＮＡの増幅反応は、ＰＣＲ反応装置（BioRad社製、iCyceサーマルサイクラー）を用いて、変性を９４℃で３０秒間行い、アニーリングを５２℃で１分間行い、また伸張を７２℃で１分間行う３つの反応操作を３５回繰り返すことによって実施した。
【００６０】
上記で得られた増幅反応産物をＴＡベクターｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｖｅｃｔｏｒ(Navagen社製)のTAサイトに連結した。得られた連結ベクターを大腸菌ＤＨ５αに形質転換することにより、増幅反応産物であるＤＮＡを保持する形質転換された大腸菌を得た。
上記のＤＮＡ断片がクローニングされた大腸菌をそれぞれ複数個選抜し、この大腸菌が保持するプラスミドDNAの塩基配列解析を行った。この塩基配列の決定は、プラスミド精製キット（QIAfilter Plasmid Midi Kit（QIAGEN社製））およびDNAシークエンス受託サービス(ファスマック社)を利用し、行った。
【００６１】
その結果、前記の増幅反応産物のＤＮＡ断片はすべてポリＡシグナルを含むｃＤＮＡであることが確認された。決定された塩基配列より予想されるアミノ酸配列をこれまで明らかにされているＡＰ１遺伝子のアミノ酸配列と比較することにより、上記の増幅反応産物であるｃＤＮＡ断片はシクラメンのＡＰ１遺伝子をコードするｃＤＮＡの一部領域を含むＤＮＡ断片である事を確認した。上記のｃＤＮＡ断片の遺伝子をそれぞれＣｐＡＰ１と命名した。
【００６２】
上記で決定されたＣｐＡＰ１ｃＤＮＡの５’側上流域および３’側下流域の塩基配列を結合するために、ソフトウエアＧｅｎｅｔｙｘ（ゼネティクス社製）を用い、塩基配列Ａｌｉｇｎｍｅｎｔファイルをソフトウェアの初期設定条件で作成することによって、個の塩基よりなる一つのｃＤＮＡとしての塩基配列を得た。ＣｐＡＰ１ｃＤＮＡは２４６個の塩基よりなる単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のＤＮＡ配列を含む。
【００６３】
（ｉｉ）シクラメンのＰＩのｃＤＮＡを増幅するために、プライマーの設計を行った。
すなわち、下記に示す塩基配列を有する２種類のオリゴヌクレオチドをプライマーとして設計し、化学合成により作製した。なお、上記のプライマーのオリゴヌクレオチドの作製はＤＮＡ合成サービス（北海道システムサイエンス社）を利用した。
プライマーＮｏ．８（配列番号２６に示す） PIF
5’-AAGGAGATCTCGGTCTTGTGTGATGC-3’
プライマーＮｏ．９（配列番号２７に示す） PIR
5’-GGAGAAAGGCATCTGAGGCTGGTACT-3’
【００６４】
上記（ｉ）記載の方法と同様の方法で、シクラメンのＰＩの増幅断片を得た。
その結果、前記の増幅反応産物のＤＮＡ断片はすべてポリＡシグナルを含むｃＤＮＡであることが確認された。決定された塩基配列より予想されるアミノ酸配列をこれまで明らかにされているＰＩ遺伝子のアミノ酸配列と比較することにより、上記の増幅反応産物であるｃＤＮＡ断片はシクラメンのＰＩ遺伝子をコードするｃＤＮＡの一部領域を含むＤＮＡ断片である事を確認した。上記のｃＤＮＡ断片の遺伝子をそれぞれＣｐＰＩと命名した。
【００６５】
上記で決定されたＣｐＰＩｃＤＮＡの５’側上流域および３’側下流域の塩基配列を結合するために、ソフトウエアＧｅｎｅｔｙｘ（ゼネティクス社製）を用い、塩基配列Ａｌｉｇｎｍｅｎｔファイルをソフトウェアの初期設定条件で作成することによって、個の塩基よりなる一つのｃＤＮＡとしての塩基配列を得た。ＣｐＰＩｃＤＮＡは２０６個の塩基よりなる単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のＤＮＡ配列を含む。
【００６６】
（ｉｉｉ）シクラメンのＡＰ３のｃＤＮＡを増幅するために、プライマーの設計を行った。
すなわち、下記に示す塩基配列を有する２種類のオリゴヌクレオチドをプライマーとして設計し、化学合成により作製した。なお、上記のプライマーのオリゴヌクレオチドの作製はＤＮＡ合成サービス（北海道システムサイエンス社）を利用した。
プライマーＮｏ．１０（配列番号２８に示す） AP3aF
5’-CTGCATAGGGAGATTCGGCAAAGGAT-3’
プライマーＮｏ．１１（配列番号２９に示す） AP3aR
5’-AGAAATCCCGGCTCTGAGTTGAATGT-3’
プライマーＮｏ．１２（配列番号３０に示す） AP3bF
5’-TCACCATGAGAAAATGCAAGAGCAGA-3’
プライマーＮｏ．１３（配列番号３１に示す） AP3bR
5’-CGTTTATTAAGCGAGGCGAAGGTCAT-3’
【００６７】
上記（ｉ）記載の方法と同様の方法で、シクラメンのＡＰ３の増幅断片を２種類得た。
その結果、前記の増幅反応産物のＤＮＡ断片はすべてポリＡシグナルを含むｃＤＮＡであることが確認された。決定された塩基配列より予想されるアミノ酸配列をこれまで明らかにされているＡＰ３遺伝子のアミノ酸配列と比較することにより、上記の増幅反応産物であるｃＤＮＡ断片はシクラメンのＡＰ３遺伝子をコードする２種類のｃＤＮＡの一部領域を含むＤＮＡ断片である事を確認した。上記のｃＤＮＡ断片の遺伝子をそれぞれＣｐＡＰ３ａ、ＣｐＡＰ３ｂと命名した。
【００６８】
上記で決定されたＣｐＡＰ３ａ およびＣｐＡＰ３ｂのｃＤＮＡの５’側上流域および３’側下流域の塩基配列を結合するために、ソフトウエアＧｅｎｅｔｙｘ（ゼネティクス社製）を用い、塩基配列Ａｌｉｇｎｍｅｎｔファイルをソフトウェアの初期設定条件で作成することによって、個の塩基よりなる一つのｃＤＮＡとしての塩基配列を得た。ＣｐＡＰ３ａｃＤＮＡは２２６個の塩基よりなる単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のＤＮＡ配列を含む。ＣｐＡＰ３ｂｃＤＮＡは２２５個の塩基よりなる単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のＤＮＡ配列を含む。
【００６９】
（ｉｖ）シクラメンのＳＴＫのｃＤＮＡを増幅するために、プライマーの設計を行った。
すなわち、下記に示す塩基配列を有する２種類のオリゴヌクレオチドをプライマーとして設計し、化学合成により作製した。なお、上記のプライマーのオリゴヌクレオチドの作製はＤＮＡ合成サービス（北海道システムサイエンス社）を利用した。
プライマーＮｏ．１４（配列番号３２に示す） STKF
5’-CAACCGCCAGGTCACTTTTTGTAAGA-3’
プライマーＮｏ．１５（配列番号３３に示す） STKR
5’-GACGGTCCTTCCTCCATTAGGTTGAG-3’
【００７０】
上記（ｉ）記載の方法と同様の方法で、シクラメンのＳＴＫの増幅断片を得た。
その結果、前記の増幅反応産物のＤＮＡ断片はすべてポリＡシグナルを含むｃＤＮＡであることが確認された。決定された塩基配列より予想されるアミノ酸配列をこれまで明らかにされているＳＴＫ遺伝子のアミノ酸配列と比較することにより、上記の増幅反応産物であるｃＤＮＡ断片はシクラメンのＳＴＫ遺伝子をコードするｃＤＮＡの一部領域を含むＤＮＡ断片である事を確認した。上記のｃＤＮＡ断片の遺伝子をそれぞれＣｐＳＴＫと命名した。
【００７１】
上記で決定されたＣｐＳＴＫｃＤＮＡの５’側上流域および３’側下流域の塩基配列を結合するために、ソフトウエアＧｅｎｅｔｙｘ（ゼネティクス社製）を用い、塩基配列Ａｌｉｇｎｍｅｎｔファイルをソフトウェアの初期設定条件で作成することによって、個の塩基よりなる一つのｃＤＮＡとしての塩基配列を得た。ＣｐＳＴＫｃＤＮＡは２２２個の塩基よりなる単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のＤＮＡ配列を含む。
【００７２】
（ｖ）シクラメンのＭＡＤＳのｃＤＮＡを増幅するために、プライマーの設計を行った。
すなわち、下記に示す塩基配列を有する２種類のオリゴヌクレオチドをプライマーとして設計し、化学合成により作製した。
なお、上記のプライマーのオリゴヌクレオチドの作製はＤＮＡ合成サービス（北海道システムサイエンス社）を利用した。
プライマーＮｏ．１６（配列番号３４に示す） MADS1F
5’-TAACAATGCAGGAAGAGAGATGGAGCA-3’
プライマーＮｏ．１７（配列番号３５に示す） MADS1R
5’-GATCAAGCCATTCCCATTTTGATCTTG-3’
プライマーＮｏ．１８（配列番号３６に示す） MADS2F
5’-CACAATACATGCTGGATCAGCTCACTG-3’
プライマーＮｏ．１９（配列番号３７に示す） MADS2R
5’-AATGCATCACACGTTTGTTCAGGTTTC-3’
プライマーＮｏ．２０（配列番号３８に示す） MADS3F
5’-GCTACAAAAGCAGCTGTGTGGCAGTG-3’
プライマーＮｏ．２１（配列番号３９に示す） MADS3R
5’-CCGCAAGTTAACAGCAGCGTACAACA-3’
【００７３】
上記（ｉ）記載の方法と同様の方法で、シクラメンのＭＡＤＳの増幅断片を３種類得た。
その結果、前記の増幅反応産物のＤＮＡ断片はすべてポリＡシグナルを含むｃＤＮＡであることが確認された。決定された塩基配列より予想されるアミノ酸配列をこれまで明らかにされているＭＡＤＳ遺伝子のアミノ酸配列と比較することにより、上記の増幅反応産物であるｃＤＮＡ断片はシクラメンのＭＡＤＳ遺伝子をコードする３種類のｃＤＮＡの一部領域を含むＤＮＡ断片である事を確認した。上記のｃＤＮＡ断片の遺伝子をそれぞれＣｐＭＡＤＳ１、ＣｐＭＡＤＳ２、ＣｐＭＡＤＳ３と命名した。
【００７４】
上記で決定されたＣｐＭＡＤＳ１、ＣｐＭＡＤＳ２およびＣｐＭＡＤＳ３のｃＤＮＡの５’側上流域および３’側下流域の塩基配列を結合するために、ソフトウエアＧｅｎｅｔｙｘ（ゼネティクス社）を用い、塩基配列Ａｌｉｇｎｍｅｎｔファイルをソフトウェアの初期設定条件で作成することによって、個の塩基よりなる一つのｃＤＮＡとしての塩基配列を得た。ＣｐＭＡＤＳ１ｃＤＮＡは２４５個の塩基よりなる単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のＤＮＡ配列を含む。ＣｐＭＡＤＳ２ｃＤＮＡは２４７個の塩基よりなる単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のＤＮＡ配列を含む。ＣｐＭＡＤＳ３ｃＤＮＡは１８９個の塩基よりなる単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のＤＮＡ配列を含む。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明では、シクラメンのＭＡＤＳボックス転写因子の機能を抑制することによってシクラメンの花の形態が改変された植物体を得ることができる。それゆえ、本発明は、各種農業や園芸、アグリビジネス、さらには農産物を加工する産業や食品産業等に利用可能であり、しかも非常に有用であると考えられる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のアミノ酸配列を含むシクラメンの花器官形成関連転写因子をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、シクラメンの花器官形成に関与し、かつ転写因子活性を有するアミノ酸配列
（ｃ）配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号１の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、シクラメンの花器官形成に関与する転写因子をコードするＤＮＡ
（ｅ）配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつシクラメンの花器官形成に関与する転写因子をコードするＤＮＡ
【請求項２】
以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のアミノ酸配列を含むシクラメンの花器官形成関連転写因子をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号４のアミノ酸配列
（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、シクラメンの花器官形成に関与し、かつ転写因子活性を有するアミノ酸配列
（ｃ）配列番号３の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号３の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、シクラメンの花器官形成に関与する転写因子をコードするＤＮＡ
（ｅ）配列番号３の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつシクラメンの花器官形成に関与する転写因子をコードするＤＮＡ
【請求項３】
以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のアミノ酸配列を含むシクラメンの花器官形成関連転写因子をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号６のアミノ酸配列
（ｂ）配列番号６のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、シクラメンの花器官形成に関与し、かつ転写因子活性を有するアミノ酸配列
（ｃ）配列番号５の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号５の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、シクラメンの花器官形成に関与する転写因子をコードするＤＮＡ
（ｅ）配列番号５の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつシクラメンの花器官形成に関与する転写因子をコードするＤＮＡ
【請求項４】
以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のアミノ酸配列を含むシクラメンの花器官形成関連転写因子をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号８のアミノ酸配列
（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、シクラメンの花器官形成に関与し、かつ転写因子活性を有するアミノ酸配列
（ｃ）配列番号７の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号７の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、シクラメンの花器官形成に関与する転写因子をコードするＤＮＡ
（ｅ）配列番号７の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつシクラメンの花器官形成に関与する転写因子をコードするＤＮＡ
【請求項５】
以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のアミノ酸配列を含むシクラメンの花器官形成関連転写因子をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号１０のアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、シクラメンの花器官形成に関与し、かつ転写因子活性を有するアミノ酸配列
（ｃ）配列番号９の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号９の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、シクラメンの花器官形成に関与する転写因子をコードするＤＮＡ
（ｅ）配列番号９の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつシクラメンの花器官形成に関与する転写因子をコードするＤＮＡ
【請求項６】
以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のアミノ酸配列を含むシクラメンの花器官形成関連転写因子をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、シクラメンの花器官形成に関与し、かつ転写因子活性を有するアミノ酸配列
（ｃ）配列番号１１の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号１１の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、シクラメンの花器官形成に関与する転写因子をコードするＤＮＡ
（ｅ）配列番号１１の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつシクラメンの花器官形成に関与する転写因子をコードするＤＮＡ
【請求項７】
以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のアミノ酸配列を含むシクラメンの花器官形成関連転写因子をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号１４のアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、シクラメンの花器官形成に関与し、かつ転写因子活性を有するアミノ酸配列
（ｃ）配列番号１３の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号１３の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、シクラメンの花器官形成に関与する転写因子をコードするＤＮＡ
（ｅ）配列番号１３の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつシクラメンの花器官形成に関与する転写因子をコードするＤＮＡ
【請求項８】
以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のアミノ酸配列を含むシクラメンの花器官形成関連転写因子をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号１６のアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１６のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、シクラメンの花器官形成に関与し、かつ転写因子活性を有するアミノ酸配列
（ｃ）配列番号１５の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号１５の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、シクラメンの花器官形成に関与する転写因子をコードするＤＮＡ
（ｅ）配列番号１５の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつシクラメンの花器官形成に関与する転写因子をコードするＤＮＡ
【請求項９】
前記転写因子をコードする請求項１、２、３、４、５、６、７又は８記載のＤＮＡと転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードする配列番号１７のＤＮＡとを融合させたキメラ遺伝子
【請求項１０】
請求項９記載の遺伝子を含む発現ベクター。
【請求項１１】
請求項１０記載の発現ベクターを含む形質転換シクラメン植物。
【請求項１】
以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のアミノ酸配列を含むシクラメンの花器官形成関連転写因子をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、シクラメンの花器官形成に関与し、かつ転写因子活性を有するアミノ酸配列
（ｃ）配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号１の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、シクラメンの花器官形成に関与する転写因子をコードするＤＮＡ
（ｅ）配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつシクラメンの花器官形成に関与する転写因子をコードするＤＮＡ
【請求項２】
以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のアミノ酸配列を含むシクラメンの花器官形成関連転写因子をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号４のアミノ酸配列
（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、シクラメンの花器官形成に関与し、かつ転写因子活性を有するアミノ酸配列
（ｃ）配列番号３の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号３の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、シクラメンの花器官形成に関与する転写因子をコードするＤＮＡ
（ｅ）配列番号３の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつシクラメンの花器官形成に関与する転写因子をコードするＤＮＡ
【請求項３】
以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のアミノ酸配列を含むシクラメンの花器官形成関連転写因子をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号６のアミノ酸配列
（ｂ）配列番号６のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、シクラメンの花器官形成に関与し、かつ転写因子活性を有するアミノ酸配列
（ｃ）配列番号５の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号５の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、シクラメンの花器官形成に関与する転写因子をコードするＤＮＡ
（ｅ）配列番号５の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつシクラメンの花器官形成に関与する転写因子をコードするＤＮＡ
【請求項４】
以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のアミノ酸配列を含むシクラメンの花器官形成関連転写因子をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号８のアミノ酸配列
（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、シクラメンの花器官形成に関与し、かつ転写因子活性を有するアミノ酸配列
（ｃ）配列番号７の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号７の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、シクラメンの花器官形成に関与する転写因子をコードするＤＮＡ
（ｅ）配列番号７の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつシクラメンの花器官形成に関与する転写因子をコードするＤＮＡ
【請求項５】
以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のアミノ酸配列を含むシクラメンの花器官形成関連転写因子をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号１０のアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、シクラメンの花器官形成に関与し、かつ転写因子活性を有するアミノ酸配列
（ｃ）配列番号９の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号９の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、シクラメンの花器官形成に関与する転写因子をコードするＤＮＡ
（ｅ）配列番号９の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつシクラメンの花器官形成に関与する転写因子をコードするＤＮＡ
【請求項６】
以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のアミノ酸配列を含むシクラメンの花器官形成関連転写因子をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、シクラメンの花器官形成に関与し、かつ転写因子活性を有するアミノ酸配列
（ｃ）配列番号１１の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号１１の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、シクラメンの花器官形成に関与する転写因子をコードするＤＮＡ
（ｅ）配列番号１１の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつシクラメンの花器官形成に関与する転写因子をコードするＤＮＡ
【請求項７】
以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のアミノ酸配列を含むシクラメンの花器官形成関連転写因子をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号１４のアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、シクラメンの花器官形成に関与し、かつ転写因子活性を有するアミノ酸配列
（ｃ）配列番号１３の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号１３の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、シクラメンの花器官形成に関与する転写因子をコードするＤＮＡ
（ｅ）配列番号１３の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつシクラメンの花器官形成に関与する転写因子をコードするＤＮＡ
【請求項８】
以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のアミノ酸配列を含むシクラメンの花器官形成関連転写因子をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号１６のアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１６のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、シクラメンの花器官形成に関与し、かつ転写因子活性を有するアミノ酸配列
（ｃ）配列番号１５の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号１５の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、シクラメンの花器官形成に関与する転写因子をコードするＤＮＡ
（ｅ）配列番号１５の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつシクラメンの花器官形成に関与する転写因子をコードするＤＮＡ
【請求項９】
前記転写因子をコードする請求項１、２、３、４、５、６、７又は８記載のＤＮＡと転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードする配列番号１７のＤＮＡとを融合させたキメラ遺伝子
【請求項１０】
請求項９記載の遺伝子を含む発現ベクター。
【請求項１１】
請求項１０記載の発現ベクターを含む形質転換シクラメン植物。
【図１】
【公開番号】特開２０１２−２００１６５（Ｐ２０１２−２００１６５Ａ）
【公開日】平成２４年１０月２２日（２０１２．１０．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−６５８２９（Ｐ２０１１−６５８２９）
【出願日】平成２３年３月２４日（２０１１．３．２４）
【出願人】（０００２４２００２）北興化学工業株式会社 (182)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１０月２２日（２０１２．１０．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年３月２４日（２０１１．３．２４）
【出願人】（０００２４２００２）北興化学工業株式会社 (182)
【Ｆターム（参考）】
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