シグナルペプチド、それをコードするＤＮＡ配列、該配列を含む発現構築物、プラスミド及び微生物細胞並びに組み換えタンパク質の発酵的製造方法
【課題】新規のシグナルペプチドを提供する。
【解決手段】シグナルペプチドであって、切断部位前の最後の３つのアミノ酸が、アラニン−フェニルアラニン−アラニン（ＡＦＡ）であることを特徴とするシグナルペプチドによって解決される。
【解決手段】シグナルペプチドであって、切断部位前の最後の３つのアミノ酸が、アラニン−フェニルアラニン−アラニン（ＡＦＡ）であることを特徴とするシグナルペプチドによって解決される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組み換えタンパク質の製造のためのシグナルペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
組み換えタンパク質の大容量の経済的な製造は、バイオテクノロジー産業と医薬品産業にとってますます重要となっている。一般に、組み換えタンパク質は、哺乳類細胞か又は微生物系のいずれかにおいて製造される。微生物系は、こうすることで組み換えタンパク質がより短時間でかつ少ないコストで製造できるという利点を、哺乳類細胞培養に対して有している。従って組み換えタンパク質の製造のためには、とりわけ細菌、有利にはエシェリキア属の細菌、特に有利にはＥ．コリが適している。Ｅ．コリでは、組み換えタンパク質は、原則的に、種々の様式で製造することができる：
１． 可溶性タンパク質として細胞内産生；
２． 封入体（"インクルージョンボディー"）として細胞内産生；
３． ペリプラズム又は栄養培地への分泌。
【０００３】
組み換えタンパク質の製造方法は、その際常に、２つの部分に分かれる。第一の部分は、粗産物をもたらす発酵である。粗産物とは、この場合には、組み換えタンパク質と、更にくわえて不純物となる宿主固有のタンパク質とを含有する発酵成果物を指す。製造方法の第二の部分は、粗産物から出発する組み換えタンパク質の精製を含む。
【０００４】
組み換えタンパク質の労力と費用は、発酵直後に組み換えタンパク質と並んで宿主タンパク質を含む混合物として存在する粗産物の製造コストの他に、実質的に、所望の組み換えタンパク質へと粗産物を精製するコストによっても決められる。精製は、たいていの場合に、クロマトグラフィー法による複数の段階を介して行われる。その際、部分的に免疫原となるか又は毒性がある不純物としての宿主タンパク質の除去精製が重要な役割を担う。
【０００５】
Ｅ．コリにおけるタンパク質の分泌は、たいていの場合に、いわゆるｓｅｃ経路（Ｄｒｉｅｓｓｅｎ他（１９９８年））を介して行われる。この系は、細菌固有のタンパク質の排出を担っている。このタンパク質のための遺伝子は、５′末端に、それぞれいわゆるシグナル配列を有する。タンパク質合成において、該配列はシグナルペプチドに翻訳され、そして細胞質膜を通じたタンパク質の分泌をもたらす。分泌の後に、シグナルペプチドは、シグナルペプチダーゼといった酵素によって開裂され、成熟タンパク質が遊離される。
【０００６】
ｓｅｃ系は、組換体、例えば異種タンパク質の分泌のためにも使用することができる（Ｌｅｅ他著、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３０８，２００５年）。そのために、産生されるべき組み換えタンパク質のための組み換え遺伝子を、シグナル配列と結合させる（"読み枠内融合"（ｉｎ ｆｒａｍｅ Ｆｕｓｉｏｎ））。これは、シグナルペプチド−タンパク質融合物の産生をもたらす。シグナル配列によってコードされるシグナルペプチドは、細胞質膜を通ってペリプラズムへの組み換えタンパク質の分泌を、細菌固有のｓｅｃ系によって媒介する。その際、シグナルペプチドは、シグナルペプチドと組み換えタンパク質との間の切断部位で開裂され、そして所望の組み換えタンパク質がペリプラズム中に得られる。その後に組み換えタンパク質は、ペリプラズムから精製することができる。
【０００７】
分泌は、他の製造方法と比較して、組み換えタンパク質が、直接的に、本来の可溶性の正しく折り畳まれたタンパク質として得られ、"封入体"法に対して、収率の高い損失を伴う工程である変性と再度の復元を行う必要が無いという利点を有する。更に、この場合に粗産物は、細胞内の可溶性産物と比較して僅かな宿主タンパク質で汚染されているに過ぎない。それというのも細菌のペリプラズムは、細胞質よりもはるかに少ない宿主タンパク質しか含まないからである。
【０００８】
規定の条件下で又は規定の細菌株において、組み換えタンパク質は、ペリプラズムから栄養培地中に遊離され（例えばＲａｙ他（２００２年）；ＥＰ０３３８４１０号Ｂ１；Ｎａｇａｈａｒｉ他（１９８５年）；Ｙａｎｇ他（１９９８年）；ＥＰ０６７７１０９号Ｂ１）、そしてそこから精製することができる。
【０００９】
タンパク質の栄養培地中への分泌は、ペリプラズムへの分泌と比較して、タンパク質がその際にさらに純粋な形で存在するという更なる利点を有する。更に、最初の精製段階として、ペリプラズムの面倒な調製又は細胞の分解は必要なく、全細胞のはるかに容易な再現可能に行える分離が必要とされるだけである。
【００１０】
言及したように、産生されるべきタンパク質の分泌のために、それをコードする遺伝子をシグナル配列と結合させるため、産生されるべきタンパク質はまずはシグナル配列によってコードされるシグナルペプチドとの融合物として産生されることとなる。このシグナルペプチドは、産生されるタンパク質の分泌をもたらす。
【００１１】
シグナルペプチドは３つの領域から構成されている：Ｎ末端のＮ領域（１〜５アミノ酸）は、一般に、正電荷を有する１つ以上のアミノ酸を有する。中央に位置するＨ領域は、大抵は、多くが疎水性である７〜１５個のアミノ酸からなる。一般に、３〜７個のアミノ酸を含むＣ領域は、切断部位前の位置−１と位置−３に、主に中性の短鎖アミノ酸（Ａ，Ｇ，Ｓ，Ｔ，Ｃ）を有する。
【００１２】
種々のシグナル配列と属するシグナルペプチドは、先行技術において記載されており、例えばｐｈｏＡ、ｏｍｐＡ、ｐｅｌＢ、ｏｍｐＦ、ｏｍｐＴ、ｌａｍＢ、ｍａｌＥ、スタフィロコッカスのプロテインＡ、ＳｔＩＩ（ＣｈｏｉとＬｅｅ（２００４年）；ＥＰ０３９６６１２号Ｂ１）である。
【００１３】
種々の菌株、例えばクレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）（クレブシエラ・ニューモニアエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｍ５ａ１）由来のシクロデキストリン−グリコシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴアーゼ）のシグナルペプチド並びにそれらのＥ．コリ菌株におけるＣＧＴアーゼの分泌のための使用は、ＵＳ５３９５９２７号に記載されている。
【００１４】
同様に、組み換えタンパク質、例えばヒルジン誘導体を、Ｅ．コリ菌株中で、組み換えタンパク質のための遺伝子とＣＧＴアーゼのシグナル配列とを融合させることで産生させ、分泌させることができることが記載されている（ＥＰ０４４８０９３号Ｂ１）。特定のヒルジン誘導体の場合には、振盪フラスコ培養において２５０ｍｇ／ｌの収率がもたらされ、発酵においては２．６３ｇ／ｌの収率がもたらされる。ＥＰ０４４８０９３号Ｂ１は、しかしながらまた、別の組み換えタンパク質では、２５ｍｇ／ｌまでの収率しか得られないことも記載している。従って、ＣＧＴアーゼのシグナルペプチドは、全ての別の公知のシグナルペプチドも同様に、任意の組み換えタンパク質の分泌を同等の高さの収率で媒介することができない。各組み換えタンパク質は固有のＤＮＡ配列によってコードされ、かつ特にシグナル配列と組み換えタンパク質をコードする配列との間の接合部位でのＤＮＡ配列がそれと異なるので、一般に、各組み換えタンパク質について最適なシグナルペプチドを見出さねばならない。
【特許文献１】Ｌｅｅ他著、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３０８，２００５年
【特許文献２】ＥＰ０３３８４１０号Ｂ１
【特許文献３】ＥＰ０６７７１０９号Ｂ１
【特許文献４】ＥＰ０３９６６１２号Ｂ１
【特許文献５】ＵＳ５３９５９２７号
【非特許文献１】ＥＰ０４４８０９３号Ｂ１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の課題は、新規のシグナルペプチドを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
前記課題は、シグナルペプチドであって、切断部位前の最後の３つのアミノ酸が、アラニン−フェニルアラニン−アラニン（ＡＦＡ）であることを特徴とするシグナルペプチドによって解決される。
【００１７】
有利には、該シグナルペプチドは、アミノ酸配列：ＭＫＲＮＲＦＦＮＴＳＡＡＩＡＩＳＩＡＬＱＩＦＦＰＳＡＳＡＦＡ（配列番号１）を有するか、又は配列番号１と比較して、１〜１０個の、有利には１〜５個の、特に有利には１〜３個のアミノ酸が、切断部位前の最後の３個のアミノ酸を除いて改変されているアミノ酸配列を有する。
【００１８】
前記のように、シグナルペプチドは、規定の群のアミノ酸（例えば荷電した又は疎水性の又は短鎖の）を有する種々の領域からなる。従って、当業者は、アミノ酸を他の匹敵する特性を有するアミノ酸によって交換することによって、特性が変化していない新規のシグナルペプチドを作製することができる。
【００１９】
前記の理由から、本発明によるシグナルペプチドとしては、配列番号２と比較して、１〜１０個の、特に有利には１〜５個の、特に有利には１〜３個のアミノ酸が改変されたものを察することができる。有利には、それは、類似の生化学的特性を有するアミノ酸、例えば塩基性アミノ酸（リジン、アルギニン、ヒスチジン）を、塩基性アミノ酸と交換すること、酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン）を酸性アミノ酸と交換すること、疎水性アミノ酸を疎水性アミノ酸と交換することなどである。アミノ酸の生化学的特性に関する概要を、図１に示す。
【００２０】
更に本発明は、本発明によるシグナルペプチドをコードするシグナル配列に関する。
【００２１】
該配列は、切断部位を有するシグナルペプチドをコードし、該切断部位前のその最後の３個のアミノ酸がアラニン−フェニルアラニン−アラニンであることを特徴とする。
【００２２】
有利には、該配列は、ＤＮＡ配列
【化１】
（配列番号２）並びに縮重された遺伝子コードに基づき配列番号１のアミノ酸配列をコードする全てのＤＮＡ配列を有するシグナル配列である。
【００２３】
スクリーニングの範囲において、ＣＧＴアーゼのシグナル配列（ＭＫＲＮＲＦＦＮＴＳＡＡＩＡＩＳＩＡＬＮＴＦＦＣＳＭＱＴＩＡ、配列番号３）の改変によって得られる種々のシグナル配列を、その特性に関して比較した。驚くべきことに、本発明によるシグナル配列は、ＣＧＴアーゼのシグナル配列又は他のシグナル配列よりも、より広範囲の組み換えタンパク質をより高収率で宿主細胞中で産生させ、分泌させるために適していることが判明した。
【００２４】
本発明によるＤＮＡ配列は、遺伝子合成によって又は相応のオリゴヌクレオチドのライゲーションによって、当業者に公知の方法によって得ることができる。本発明によるＤＮＡ配列は、読み枠内で（ｉｎ ｆｒａｍｅ）、当業者に公知の方法（例えばＬｅｅ他（２００５年）と同様に）に従って、産生されるべき組み換えタンパク質の遺伝子と結合され、それをベクター中に導入することができる。
【００２５】
有利には、このシグナル配列と組み換え遺伝子との組合せ物は、Ｅ．コリにおいて機能的な発現シグナル（プロモーター、転写開始部位、翻訳開始部位、リボソーム結合部位）を備える。プロモーターとしては、当業者に公知のあらゆるプロモーター、例えば一方では誘導可能なプロモーター、例えばｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、λＰＬプロモーター、ａｒａプロモーター又はｔｅｔプロモーター又はそれらから誘導される配列が適している。他方では、構成的プロモーター、例えばＧＡＰＤＨプロモーターを使用することによって構成的な発現を行うこともできる。しかしながら、通常は、産生されるべき組み換えタンパク質の遺伝子と結合されたプロモーターを使用することもできる。
【００２６】
従って、本発明は、発現シグナルと、本発明によるシグナル配列と、産生されるべき組み換えタンパク質をコードする読み枠内で結合された組み換え遺伝子とを含む発現構築物にも関する。
【００２７】
この本発明による発現構築物は、当業者に公知の方法を使用して宿主細胞に導入される。それは、例えばベクター上で、例えばプラスミド上で、例えば公知の発現ベクターの誘導体、例えばｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＡＳＫ−ＩＢＡ３又はｐＥＴ上で行われる。プラスミドのための選択マーカーとしては、例えばアンピシリン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、カナマイシン又は別の抗生物質に対する耐性をコードする遺伝子が適している。
【００２８】
従って、本発明によるシグナル配列又は本発明による発現構築物を有するプラスミドも本発明の対象である。
【００２９】
組み換えタンパク質は、有利には異種タンパク質である。有利には、組み換えタンパク質は、工業的アプローチで使用されるタンパク質又は医薬品作用物質として使用されるタンパク質（バイオロジクス、生体医薬品）である。係るタンパク質は、例えばヒルジン、インスリン、インターフェロン、例えばα−インターフェロン又はβ−インターフェロン（例えばインターフェロンα２ｂ）、抗体もしくは抗体フラグメント（例えばＦａｂフラグメント、ｓｃＦｖ）又は別の結合タンパク質もしくは酵素、例えばＣＧＴアーゼである。
【００３０】
本発明による発現構築物は、当業者に公知の方法に従って微生物細胞（宿主細胞）中に導入される。結果として、本発明による発現構築物は、更にプラスミドとして宿主細胞中に存在しても、又は宿主細胞の染色体中に組み込まれてもよい。
【００３１】
従って、本発明によるシグナル配列又は本発明による発現構築物又は本発明によるプラスミドを有する微生物細胞も本発明の対象である。
【００３２】
宿主細胞は、腸内細菌科からの細菌株の細胞、有利にはエシェリキア・コリの種の菌株である。特に、エシェリキア（Ｅ．）・コリ菌株であって、本発明による発現構築物での形質転換後に発酵によって、本発明による発現構築物で形質転換されたＥ．コリＷ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）よりも高濃度の組み換えタンパク質をペリプラズム中もしくは栄養培地中に示すという点で優れているＥ．コリ菌株が好ましい。
【００３３】
殊に好ましくは、その菌株は、以下のＥ．コリ菌株：
− ＢＬＲ：Ｒａｙ他（２００２年）、Ｎｏｖａｇｅｎで購入できる
− Ｋ８０２＝ＣＧＳＣ*５６１０：Ｙａｎｇ他（１９９８年）
− ＷＣＭ１０５：ＥＰ０３３８４１０号Ｂ１に従って製造できる
− ＭＭ２８＝ＣＧＳＣ*＃５８９２：Ｎａｇａｈａｒｉ他（１９８５年）
− ＲＶ３０８＝ＡＴＣＣ**３１６０８；ＥＰ０６７７１０９号Ｂ１
− ＲＲ１：ＡＴＣＣ**３１４３４：Ｎａｇａｈａｒｉ他（１９８５年）
である。
* 大腸菌ストックセンター（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ）ＣＧＳＣ（８３０ Ｋｌｉｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｔｏｗｅｒ，ＭＣＤ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ，２６６ Ｗｈｉｔｎｅｙ Ａｖｅ．，ＰＯ ｂｏｘ ２０８１０３，Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ）から購入できる
** ＬＧＣ Ｐｒｏｍｏｃｈｅｍ（Ｍｅｒｃａｔｏｒｓｔｒ．５１，４６４８５ Ｗｅｓｅｌ，ドイツ在）から購入できる
産生されたタンパク質の分泌は、宿主細胞のｓｅｃ装置によって行われる。引き続きペリプラズムへの分泌の後に、シグナルペプチダーゼ（例えばＥ．コリではＬｅｐＢ）によって本発明によるシグナルペプチドは開裂されて、所望の組み換えタンパク質が生ずる。
【００３４】
従って、本発明は、本発明による発現構築物を有する宿主細胞によって発酵培地中で組み換えタンパク質を発酵的に製造するための方法にも関する。前記方法は、本発明による宿主菌株を発酵培地中で培養し、該宿主菌株が組み換えタンパク質を読み枠内でのシグナルペプチド−タンパク質融合物の形で産生し、その際、該シグナルペプチドは、本発明によるシグナルペプチドでありかつ該シグナルペプチドは、細胞質膜を通じてペリプラズム中にシグナルペプチド−タンパク質融合物を分泌した場合にシグナルペプチドと組み換えタンパク質との間の切断部位で開裂され、そして所望の組み換えタンパク質がペリプラズム中もしくは発酵培地中で得られ、その組み換えタンパク質を発酵後に精製することを特徴としている。
【００３５】
組み換えタンパク質は、発酵において、ペリプラズム中に又は有利には発酵培地中に分泌される。
【００３６】
組み換えタンパク質は、宿主細胞のペリプラズムからか又は有利には発酵培地から細胞の分離によって精製することができる。
【００３７】
組み換えタンパク質の本発明による製造のための微生物菌株の発酵は、有利には完全培地又は最少塩培地中で行われる。これらの培地は、文献から公知である。
【００３８】
炭素源としては、原則的に、あらゆる使用可能な糖、糖アルコール、有機酸もしくはそれらの塩、デンプン加水分解物、蜜ろう又は別の物質を使用することができる。その際、グルコース又はグリセリンを使用することが好ましい。また複数の種々異なる炭素源を組み合わせて供給することも可能である。窒素源としては、尿素、アンモニア及びそれらの塩、硝酸塩並びに他のＮ源を用いることができる。可能な窒素源には、複合アミノ酸混合物、例えば酵母エキス、ペプトン、麦芽エキス、大豆ペプトン、カザミノ酸、コーンスティープリカー及びＮＺアミン（例えばＫｅｒｒｙ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＵＳＡ）も該当する。
【００３９】
更に、該培地に、ビタミン、塩、酵母エキス、アミノ酸及び微量元素のような他の成分を添加してよく、それによって細胞増殖が向上する。
【００４０】
菌株のインキュベートは、有利には好気的培養条件下で、１６〜１５０時間の時間にわたって、かつその都度の菌株に最適な増殖温度の範囲で行われる。
【００４１】
最適な温度範囲としては、１５〜５５℃が好ましい。特に、２８〜３７℃の温度が好ましい。
【００４２】
菌株の培養は、振盪フラスコ又は発酵器において実施することができ、その際、容量に関する制限は与えられていない。その培養は、回分法、流加法又は連続法で実施することができる。
【００４３】
その際、組み換えタンパク質の発現は、構成的に、すなわち非誘導的にも、又は物理的もしくは生理学的な刺激による誘導によって行われる。発現は、例えばプロモーターを誘導する物質、例えばｌａｃプロモーターもしくはｔａｃプロモーターの場合にはラクトースもしくはＩＰＴＧの添加によって誘導することができる。
【００４４】
ペリプラズムもしくは培養培地からのタンパク質の精製は、当業者に公知の方法に従って、例えば細胞の破壊又は分離、クロマトグラフィー的な精製、タンパク質の複合体化、濾過又は沈降によって行うことができる。
【００４５】
次の実施例は、本発明を更に説明するために用いられるものである。
【実施例】
【００４６】
実施例１：本発明によるシグナル配列及び本発明によるベクターの作製
出発プラスミドとして、プラスミドｐＣＧＴを以下のように作製する：
配列番号４を有し、クレブシエラ・ニューモニアエＭ５ａ１由来のシクロデキストリン−グリコシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴアーゼ）遺伝子を有するＤＮＡ断片（Ｇｅｎｂａｎｋ番号Ｍ１５２６４）を、遺伝子合成によって製造した。このＤＮＡ断片を、発現ベクターｐＪＦ１１８ｕｔ（図２）中にクローニングした。該ベクターは、ＤＳＭＺ−ドイツ微生物細胞培養収集館（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）で番号ＤＳＭ１８５９６として寄託されている。ｐＪＦ１１８ｕｔは、公知の発現ベクターｐＫＫ２２３−３（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）の誘導体であり、β−ラクタマーゼ遺伝子とテトラサイクリン耐性遺伝子の他に、さらに同様にプラスミド上に存在するＬａｃＩｑ遺伝子産物によって再始動されかつ例えばＤ−ラクトースもしくはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）のようなインデューサーによってスイッチオンすることができるｔａｃプロモーターをも有する。プラスミドｐＪＦ１１８ｕｔを、制限酵素ＥｃｏＲＩで完全に切断し、かつそれぞれ直鎖状ＤＮＡ断片の５′末端で突出した塩基を、Ｓ１ヌクレアーゼで分解した。前記のようにして予備調製されたベクターＤＮＡ分子を、ＣＧＴアーゼを含むＤＮＡ断片（配列番号４）とＴ４−リガーゼを使用してライゲーションした。菌株ＤＨ５αを、ライゲーションバッチでＣａＣｌ2法に従って形質転換し、その際、アンピシリン（１００ｍｇ／ｌ）によってプラスミド保有細胞について選択した。アンピシリン耐性形質転換体から、再びプラスミドを単離し、そして制限分析によって調査した。前記のようにして作製された、ＣＧＴアーゼ遺伝子の発現がｔａｃプロモーターの制御下にあるプラスミドを、ｐＣＧＴと呼称した（図３）。
【００４７】
ＣＧＴアーゼのためのシグナル配列に融合されたＣＧＴアーゼのための遺伝子を除去した：そのために８４４８ｂｐの大きさのプラスミドを、制限酵素ＳｓｐＩ及びＰａｃＩによって部分消化によって当業者に公知の方法に従って切断した。６３９０ｂｐの大きさの断片を単離し、そしてクレノウ酵素で処理し、それによって末端を平滑化させた。２０５８ｂｐの大きさの断片を除去した。
【００４８】
次いで、以下の４つのＤＮＡ断片を遺伝子合成によって製造した：
ｐｈｏＡ−ＩＦＮα２ｂ 配列番号５
【化２】
ｏｍｐＡ−ＩＦＮα２ｂ 配列番号６
【化３】
ｃｇｔ−ＩＦＮα２ｂ 配列番号７
【化４】
ＡＦＡ−ＩＦＮα２ｂ 配列番号８
【化５】
【００４９】
全てのＤＮＡ断片は、ｔａｃプロモーター領域と、インターフェロンα２ｂのための遺伝子と、４つの種々のシグナル配列（太字で示した）とを有する。これらの４つの種々のシグナル配列は、以下の４つの種々のシグナルペプチドをコードし、その際、最初の３つのシグナルペプチド（配列番号９、１０、３）は、先行技術から公知であり、四番目のシグナルペプチド（配列番号２）は、本発明によるものである：
ｐｈｏＡ： ＭＫＱＳＴＩＡＬＡＬＬＰＬＬＦＴＰＶＴＫＡ
配列番号９
ｏｍｐＡ： ＭＫＫＴＡＩＡＩＡＶＡＬＡＧＦＡＴＶＡＱＡ
配列番号１０
ｃｇｔ： ＭＫＲＮＲＦＦＮＴＳＡＡＩＡＩＳＩＡＬＮＴＦＦＣＳＭＱＴＩＡ
配列番号３
ＡＦＡ： ＭＫＲＮＲＦＦＮＴＳＡＡＩＡＩＳＩＡＬＱＩＦＦＰＳＡＳＡＦＡ
配列番号２
前記のクローニングによって以下の４つのプラスミドが得られた：
− ｐＫＰ６５１（ｐｈｏＡ−シグナル配列） 図４
− ｐＫＰ６５２（ｏｍｐＡ−シグナル配列） 図５
− ｐＫＰＩＦＮ（ｃｇｔ−シグナル配列） 図６
− ｐＢａＢＩＦＮ１（ＡＦＡ：本発明によるシグナル配列） 図７
これらのプラスミドを、公知の方法によってＥ．コリ菌株ＤＨ５αに導入した。本発明による基株ＤＨ５α／ｐＢａＢＩＦＮ１は、ＤＳＭＺ（ドイツ微生物細胞培養収集館、Ｄ−３８１４２ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）で番号ＤＳＭ１８３４３としてブタペスト条約に従って寄託された。
【００５０】
実施例２：本発明によるシグナル配列を使用することによるインターフェロン産生の増大
プラスミドｐＫＰ６５１（ｐｈｏＡ−シグナル配列）、ｐＫＰ６５２（ｏｍｐＡ−シグナル配列）、ｐＫＰＩＦＮ（ｃｇｔ−シグナル配列）及びｐＢａＢＩＦＮ１（本発明によるＡＦＡ−シグナル配列）（実施例１を参照のこと）を、菌株ＷＣＭ１０５（ＥＰ０３３８４１０号Ｂ１に従って製造できる）中に通常の方法（ＣａＣｌ2−形質転換によって）に従って導入した。プラスミド保有菌株についての選択は、アンピシリン（１００ｍｇ／Ｌ）によって実施した。
【００５１】
以下の菌株が得られた：
− ＷＣＭ１０５／ｐＫＰ６５１（ｐｈｏＡ−シグナル配列）
− ＷＣＭ１０５／ｐＫＰ６５２（ｏｍｐＡ−シグナル配列）
− ＷＣＭ１０５／ｐＫＰＩＦＮ（ｃｇｔ−シグナル配列）
− ＷＣＭ１０５／ｐＢａＢＩＦＮ１（ＡＦＡ−シグナル配列）
得られた菌株中でのインターフェロンα２ｂの産生を調査した。そのために、それらの菌株を、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンと１％のグルコースとを有する１０ｍｌのＬＢ培地中で３０℃において培養した。６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ６００）が０．５になったら、インターフェロンα２ｂの産生を、ＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド）を０．５ｍＭまで添加することによって誘導する。培養上清において、２４時間後、４８時間後及び７２時間後で、形成されかつ分泌されたインターフェロンを、ＳＤＳゲル中でのタンパク質の分離と抗インターフェロン特異抗体でのイムノブロットでの検出によって以下のようにして定量化した。
【００５２】
それぞれ１μｌ（４８時間及び７２時間）もしくは５μｌ（２４時間）の上清を、サンプルバッファーと混合した（２×Ｔｒｉｓ ＳＤＳ−サンプルバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ カタログ番号ＬＣ２６７６）：０．１２５Ｍのトリス塩酸（ｐＨ６．８）、４％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ、２０％（ｖ／ｖ）のグリセリン、０．００５％（ｖ／ｖ）のブロモフェノールブルー、５％のβ−メルカプトエタノール）。更に、定義された量のインターフェロンα２ｂを、スタンダードとして一緒に施与した。タンパク質の変性を、１００℃に５分間加熱し、氷上で２分間冷却し、そして遠心分離することによって実施した。それらのタンパク質を、電気泳動によって、１２％のＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ カタログ番号ＮＰ０３４１）中で、１×ＭＥＳ含有ランニングバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ カタログ番号ＮＰ０００２）を用いて分離させた（電気泳動パラメータ：２００Ｖで４０分間）。イムノブロットによる検出と定量化を、以下の仕様に従って実施した：
【００５３】
湿式ブロッティング法での転写：
モジュール：Ａｍｅｒｓｈａｍ：Ｈｏｅｆｅｒ ＴＥ ２２ Ｍｉｎｉ Ｔａｎｋ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｕｎｉｔ、コード番号：８０−６２０４−２６。
【００５４】
メンブレン：ニトロセルロースメンブレン（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ，ＢＡ８５，硝酸セルロース（Ｅ），０．４５μｍの細孔サイズ）
Ｗｈａｔｍａｎフィルタとニトロセルロースメンブレンを、適切な大きさに切断し、そして発泡物品（スポンジ）で転写バッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ カタログ番号ＬＣ３６７５）に気泡なく染み込ませた。
【００５５】
積層の構成：黒い格子、カソードとの接続、各３ｍｍ厚を有する２つのスポンジ、Ｗｈａｔｍａｎペーパー、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル、ＮＣメンブレン、Ｗｈａｔｍａｎ、６ｍｍ厚を有する１つのスポンジ、白い格子、アノードとの接続
転写条件：Ｉ＝２００ｍＡの一定の電流、Ｕ＝無制限、運転時間６０分
【００５６】
プレハイブリダイゼーション
２５ｍｌのプレハイブリダイゼーションバッファー中で該メンブレンをインキュベートする。
室温で３０分間振り動かす。
【００５７】
一次抗体のハイブリダイゼーション
２５ｍｌのプレハイブリダイゼーションバッファー＋０．１５μｇ／ｍｌ（→３．７５μｇ）の抗ヒトＩＦＮΑ抗体（Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ ＥＣ，Ｂｉｏｚｏｌを経由した カタログ番号：５００−Ｐ３２Ａ）中で該メンブレンをインキュベートする。
【００５８】
室温で９０分間又は一晩振り動かす。
【００５９】
洗浄
１×ＰＢＳと一緒に室温で１０秒間振り動かし、バッファーを捨てる。
１×ＰＢＳと一緒に室温で１５分間２回振り動かし、バッファーを捨てる。
【００６０】
二次抗体のハイブリダイゼーション
２５ｍｌのプレハイブリダイゼーションバッファー＋２５μｌ（１：１０００）のヤギ抗ウサギＩｇＧセイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲート（ＨＲＰ）（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｉｏｚｏｌを経由した カタログ番号４０５０−０５）中で該メンブレンをインキュベートする。
【００６１】
室温で６０分間振り動かす。
【００６２】
洗浄
１×ＰＢＳと一緒に室温で１０秒間振り動かし、バッファーを捨てる。
１×ＰＢＳと一緒に室温で１５分間２回振り動かし、バッファーを捨てる。
【００６３】
化学発光による検出
Ｌｕｍｉ−Ｌｉｇｈｔウェスタンブロッティング基質（Ｒｏｃｈｅ，カタログ番号２０１５２００）を準備する：Ｌｕｍｉ−Ｌｉｇｈｔルミノール／エンハンサー溶液とＬｕｍｉ−Ｌｉｇｈｔ安定ペルオキシド溶液とを１：１の比率で混合する：ＮＣメンブレン当たり３ｍｌ。
【００６４】
ブロットを室温でＬｕｍｉ−Ｌｉｇｈｔウェスタンブロッティング基質と一緒に５分間インキュベートし、過剰の水気を切り、メンブレンをラップフィルムで覆って、直ちにＸ線フィルム（Ｋｏｄａｋ、Ｘ−ＯＭＡＴ）を載せ、２分間暴露し、現像し、そして固定する。シグナルが弱い場合に、暴露をより長時間にわたり繰り返す。
【００６５】
バッファー
プレハイブリダイゼーションバッファー：１×ＰＢＳ中の５％脱脂粉乳
１０×ＰＢＳ：１００ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、１．５ＭのＮａＣｌ、ＮａＯＨでｐＨ７．５、０．５％のＴｒｉｔｏｎ１００
１×ＰＢＳ：１０×ＰＢＳを完全脱塩水で１：１０希釈したもの
【００６６】
定量化
定量的評価は、Ｂｉｏｒａｄ社製のＧＳ−８００ Ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒでイムノブロットをスキャンすることによって、Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ １−Ｄ分析ソフト（Ｂｉｏｒａｄ）を用いて、施与されたスタンダードと比較することによって実施した。
【００６７】
図９は、前記の実施例からのイムノブロットを示している。第１表において、定量化されたインターフェロンα２ｂの収率をまとめる：
【表１】
【００６８】
第１表：それぞれ使用されたシグナル配列の点で異なる種々のプラスミドを用いて２４時間後、４８時間後又は７２時間後に得られたインターフェロンα２ｂの収率
これらの結果は、配列番号２の本発明によるシグナル配列が、産生されるべきタンパク質の収率及び分泌に関して、別のシグナル配列より優れていることを一義的に示している。
【００６９】
実施例３：本発明によるシグナル配列の挿入によって改善されたＣＧＴアーゼ産生プラスミドの作製
プラスミドｐＣＧＴ（実施例１を参照）は、ＣＧＴアーゼのためのシグナル配列と読み枠内で融合されたＣＧＴアーゼのための遺伝子を有する。このシグナル配列を、ここで本発明によるシグナル配列と交換した。
【００７０】
そのために８４４８ｂｐの大きさのプラスミドを、制限酵素ＳｓｐＩ及びＢｇｌＩＩによって部分消化によって当業者に公知の方法に従って切断した。８１１９ｂｐの大きさの断片を単離し、そしてクレノウ酵素で処理し、それによって末端を平滑化させた。ＣＧＴアーゼのシグナル配列と、約１５０ｂｐのＣＧＴアーゼ遺伝子の５末端とを有する３２９ｂｐの大きさの断片を除去した。
【００７１】
前記の断片と配列に関して、ＣＧＴアーゼのシグナル配列が本発明によるシグナル配列と交換されていること以外は同一である以下の３２９ｂｐの大きさのＤＮＡ断片を遺伝子合成によって製造した：
【化６】
【００７２】
このＤＮＡ断片を、単離された８１１９ｂｐの大きさの断片と、当業者に公知の方法に従ってライゲーションした。それによって得られたプラスミドｐＣＭ２０７ＡＦＡを、配列決定によって配列の精度について調査した。
【００７３】
実施例４：本発明によるシグナル配列を使用することによるＣＧＴアーゼ産生の改善
プラスミドｐＣＭ７０３ＡＦＡとプラスミドｐＣＧＴ（実施例３を参照）を、以下の菌株に通常の方法に従って（例えばＣａＣｌ2法によって）形質転換により導入した：
− Ｋ８０２＝ＣＧＳＣ*５６１０：Ｙａｎｇ他（１９９８年）
− ＷＣＭ１０５：ＥＰ０３３８４１０号Ｂ１に従って製造できる
プラスミド保有菌株についての選択は、アンピシリン（１００ｍｇ／Ｌ）によって実施した。それによって以下の本発明による菌株：
− ＷＣＭ１０５／ｐＣＭ７０３ＡＦＡ
− Ｋ８０２／ｐＣＭ７０３ＡＦＡ
及び以下の対照菌株：
− ＷＣＭ１０５／ｐＣＧＴ
− Ｋ８０２／ｐＣＧＴ
が得られた。
【００７４】
これらの菌株を、シクロデキストリン−グリコシルトランスフェラーゼの製造のために使用し、そして１％のグルコースと１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを有する１０ｍｌのＬＢ培地中で３０℃において培養した。ＯＤが０．５となったら、シクロデキストリン−グリコシルトランスフェラーゼの産生を、ＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド）を０．５ｍＭまで添加することによって誘導した。
【００７５】
該菌株の培養上清において、シクロデキストリン−グリコシルトランスフェラーゼの収率を以下の活性試験によって測定した：
試験バッファー：５ｍＭのトリス塩酸バッファー（＞ｐＨ６．５）、５ｍＭのＣａＳＯ4・２Ｈ2Ｏ
基質：試験バッファー（ｐＨ６．５）中の１０％のＮｏｒｅｄｕｘ溶液
試験バッチ：１ｍｌの基質溶液＋１ｍｌの遠心分離された培養上清（５分、１２０００ｒｐｍ）＋３ｍｌのメタノール
反応温度：４０℃
酵素試験：
・ 溶液を予熱する（約５分、４０℃で）。
【００７６】
・ 酵素溶液を基質溶液に添加する；迅速に混合する（渦ミキサ（Ｗｈｉｒｌ−Ｍｉｘｅｒ））。
【００７７】
・ ４０℃で３分間インキュベートする。
【００７８】
・ 酵素反応をメタノールの添加によって停止させる；迅速に混合する（渦ミキサ）。
【００７９】
・ バッチを氷上で冷却する（約５分間）。
【００８０】
・ 遠心分離（５分、１２０００ｒｐｍ）をし、そして澄明な上清をピペットで取り出す。
【００８１】
・ 生じたＣＤをＨＰＬＣによって分析する。
【００８２】
酵素活性：Ａ＝Ｇ*Ｖ１*Ｖ２／（ｔ*ＭＧ）（ユニット／ｍｌ）
Ａ＝活性
Ｇ＝ＣＤの含有率（ｍｇ／ｌ）＝試験バッチ：単位表面×１０4／標準溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）／単位表面
Ｖ１＝希釈係数／試験バッチ（→５）
Ｖ２＝希釈係数／酵素溶液
ｔ＝反応時間（分）（→３）
ＭＧ＝分子量（ｇ／モル）（ＣＤ→９７３）
１ユニット＝１マイクロモルの産物／分
第２表は、本発明による菌株の高められた特異的なシクロデキストリン−グリコシルトランスフェラーゼ収率を示している。
【００８３】
【表２】
【００８４】
第２表：種々の菌株におけるシクロデキストリン−グリコシルトランスフェラーゼの収率
実施例５：本発明によるシグナル配列を使用することによるヒルジン産生の改善
特許ＥＰ０４４８０９３号Ｂ１に記載されるプラスミドｐＣＭＴ２０３を、使用されるシグナル配列を本発明によるシグナル配列ＡＦＡと交換することで改変させた。この交換は、実施例１及び実施例３と同様に実施した。得られたプラスミドをｐＣＭＴ２０３ＡＦＡと呼称した。ｐＣＭＴ２０３及びｐＣＭＴ２０３ＡＦＡを、菌株ＷＣＭ１０５（ＥＰ０３３８４１０号Ｂ１に従って製造できる）中に、通常の方法による形質転換によって（例えばＣａＣｌ2−形質転換によって）導入した。
【００８５】
プラスミド保有菌株についての選択は、アンピシリン（１００ｍｇ／Ｌ）によって実施した。
【００８６】
以下の菌株が得られた：
− ＷＣＭ１０５／ｐＣＭＴ２０３
− ＷＣＭ１０５／ｐＣＭＴ２０３ＡＦＡ
両方の菌株を、ＥＰ０４４８０９３号Ｂ１に記載されるように、１０ｌの発酵器中で培養し、そして得られたヒルジンを、ＥＰ０４４８０９３号Ｂ１に記載されるように、ＩＰＴＧの添加４５時間後に定量化した。
【００８７】
第３表中の結果は、本発明によるシグナル配列を使用することでヒルジンの高められた収率がもたらされることを示している。
【００８８】
【表３】
【００８９】
第３表：種々の菌株における、ＩＰＴＧの添加４５時間後での１０ｌの発酵におけるヒルジンの収率（ＡＴ−Ｕ／ｍｌ及びｇ／Ｌ）
実施例６：本発明によるシグナル配列を使用することによる、機能的なＦａｂ抗体フラグメントの産生の改善
本実施例は、良好に特徴付けられた抗リゾチーム抗体Ｄ１．３のＦａｂフラグメントの改善された製造を記載する。
【００９０】
抗リゾチームＦａｂフラグメントの遺伝子のクローニングと発現のための出発ベクターとして、プラスミドｐＪＦ１１８ｕｔ（実施例１を参照）を使用した。このプラスミド中に、２つの連続した工程において、抗リゾチームＦａｂフラグメントの重鎖（ＶH−ＣH１−ドメイン）もしくは軽鎖（ＶL−ＣL−ドメイン）についての両方の読み枠を、それぞれシグナル配列を含めてクローニングした。そのために以下のように実施した：
配列番号１２を有するＤＮＡ断片（重鎖）を、遺伝子合成によって製造し、そして該ＤＮＡ断片は、Ｅ．コリのｏｍｐＡ遺伝子のシグナル配列と、Ｆａｂフラグメントの重鎖（ＶH−ＣＨ１）のための読み枠とからなる遺伝子融合物を含む。この読み枠直後に６個のヒスチジンコドンが引き続き、従って融合タンパク質のＣ末端を形成している。このヒスチジンタグによって、後に完全に会合されたＦａｂフラグメントの簡単な精製が親和性クロマトグラフィーによって可能となる。このＤＮＡ断片を、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩで切断し、そして同じ制限酵素で切断されている発現ベクターｐＪＦ１１８ｕｔとライゲーションした。このクローニングから得られた、重鎖のための遺伝子の発現がｔａｃプロモーターの制御下にあるプラスミドを、ｐＨＣ−Ａｎｔｉ−Ｌｙｓｏｚｙｍと呼称した。
【００９１】
配列番号１３を有するＤＮＡ断片（軽鎖）を、同様に遺伝子合成によって製造し、そして該ＤＮＡ断片は、配列番号３に記載されるＣＧＴアーゼのシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列（配列番号７において太字で示した）と、Ｆａｂフラグメントの軽鎖（ＶL−ＣL）のための読み枠とからなる遺伝子融合物を含む。このＤＮＡ断片を、まず、制限酵素ＰｓｔＩで切断し、引き続き同じ制限酵素で切断されているベクターｐＨＣ−Ａｎｔｉ−Ｌｙｓｏｚｙｍとライゲーションした。こうして得られたプラスミドを、ｐＦａｂ−Ａｎｔｉ−Ｌｙｓｏｚｙｍ（図９）と呼称した。前記のようにして、重鎖と軽鎖についてのそれぞれの読み枠からなる、ｔａｃプロモーターの制御下にある人工オペロンを作製した。従って、インデューサー（例えばＩＰＴＧ）の添加によって、両方の遺伝子の同期発現が可能である。
【００９２】
本発明によるプラスミドｐＦａｂ−Ａｎｔｉ−ＬｙｓｏｚｙｍＶＬＡＦＡ及びｐＦａｂ−Ａｎｔｉ−ＬｙｓｏｚｙｍＶＨＡＦＡの製造のために、実施例１に記載されるのと同様にして、軽鎖のためのシグナル配列（ｐＦａｂ−Ａｎｔｉ−ＬｙｓｏｚｙｍＶＬＡＦＡ）か又は重鎖のためのシグナル配列（ｐＦａｂ−Ａｎｔｉ−ＬｙｓｏｚｙｍＬＨＡＦＡ）かのいずれかを、配列番号２の本発明によるシグナル配列と交換した。
【００９３】
抗リゾチームＦａｂフラグメントの製造ために、菌株ＷＣＭ１０５（実施例４を参照）を、プラスミドｐＦａｂ−Ａｎｔｉ−Ｌｙｓｏｚｙｍ、ｐＦａｂ−Ａｎｔｉ−ＬｙｓｏｚｙｍＶＬＡＦＡもしくはｐＦａｂ−Ａｎｔｉ−ＬｙｓｏｚｙｍＶＨＡＦＡで、ＣａＣｌ2法に従って形質転換させた。プラスミド保有細胞についての選択は、アンピシリン（１００ｍｇ／ｌ）によって実施した。
【００９４】
抗リゾチームＦａｂフラグメントの製造を、１０ｌ規模で実施した。製造は、１０ｌの撹拌槽型発酵器中で実施した。６ｌの培地ＦＭ４（１．５ｇ／ｌのＫＨ2ＰＯ4；５ｇ／ｌの（ＮＨ4）2ＳＯ4；０．３ｇ／ｌのＭｇＳＯ4×７Ｈ2Ｏ；０．０５ｇ／ｌのＣａＣｌ2×２Ｈ2Ｏ、０．０７５ｇ／ｌのＦｅＳＯ4×７Ｈ2Ｏ；１ｇ／ｌのＮａ3クエン酸塩×２Ｈ2Ｏ；０．５ｇ／ｌのＮａＣｌ；１ｍｌ／ｌの微量元素溶液（０．１５ｇ／ｌのＮａ2ＭｏＯ4×２Ｈ2Ｏ；２．５ｇ／ｌのＮａ3ＢＯ3；０．７ｇ／ｌのＣｏＣｌ2×６Ｈ2Ｏ；０．２５ｇ／ｌのＣｕＳＯ4×５Ｈ2Ｏ；１．６ｇ／ｌのＭｎＣｌ2×４Ｈ2Ｏ；０．３ｇ／ｌのＺｎＳＯ4×７Ｈ2Ｏ）；５ｍｇ／ｌのビタミンＢ1；３ｇ／ｌのフィトン；１．５ｇ／ｌの酵母エキス；１０ｇ／ｌのグルコース；１００ｍｇ／ｌのアンピシリン）で満たされた発酵器に、１：１０の比率で、一晩同じ培地中で培養された前培養を植えた。発酵の間に、３０℃の温度に調整し、そしてｐＨ値をＮＨ4ＯＨもしくはＨ3ＰＯ4を計量供給することによって７．０の値に一定に保った。グルコースは、発酵にわたって計量供給され、その際、培地中の最大グルコース濃度を１０ｇ／ｌ未満にすることに努めた。発現の誘導は、対数増殖期の終わりにイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を０．１ｍＭで添加することによって実施した。
【００９５】
７２時間の発酵後に、試料を取りだし、細胞を培養培地の遠心分離によって分離した。培養上清からの抗リゾチームＦａｂフラグメントの精製は、Ｓｋｅｒｒａ（１９９４年、Ｇｅｎｅ １４１，７９−８４）に記載される親和性クロマトグラフィーによって実施した。
【００９６】
精製された抗リゾチームＦａｂフラグメントの定量化並びに活性の測定は、抗原としてリゾチームを用いたＥＬＩＳＡ試験（Ｓｋｅｒｒａ，１９９４年、Ｇｅｎｅ １４１，７９−８４）によって実施した。
【００９７】
第４表において、それぞれ２０ｍｌの培養上清から７２時間の発酵後に単離することができた機能的な抗リゾチームＦａｂフラグメントの収率を列記する。
【００９８】
第４表：７２時間の発酵後の培養上清中での抗リゾチームＦａｂフラグメントの収率
【表４】
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】図１は、アミノ酸の概要を示している。
【図２】図２は、プラスミドｐＪＦ１１８ｕｔのプラスミド地図を示している。
【図３】図３は、プラスミドｐＣＧＴのプラスミド地図を示している。
【図４】図４は、プラスミドｐＫＰ６５１のプラスミド地図を示している。
【図５】図５は、プラスミドｐＫＰ６５２のプラスミド地図を示している。
【図６】図６は、プラスミドｐＫＰＩＦＮのプラスミド地図を示している。
【図７】図７は、プラスミドｐＢａＢＩＦＮ１のプラスミド地図を示している。
【図８】図８は、プラスミドｐＦａｂ−Ａｎｔｉ−Ｌｙｓｏｚｙｍのプラスミド地図を示している。
【図９】図９は、インターフェロンα２ｂを産生する細胞（実施例２を参照）の培養上清が分析されるイムノブロットを示している。 レーン１：サイズ基準 レーン２とレーン３：２０ｎｇと４０ｎｇのインターフェロンα２ｂ レーン４〜６：２４時間後、４８時間後、７２時間後の、プラスミドｐＢａＢＩＦＮ１を有する培養の上清 レーン７〜９：２４時間後、４８時間後、７２時間後の、プラスミドｐＫＰＩＦＮを有する培養の上清 レーン１０〜１２：２４時間後、４８時間後、７２時間後の、プラスミドｐＫＰ６５１を有する培養の上清 レーン１３〜１５：２４時間後、４８時間後、７２時間後の、プラスミドｐＫＰ６５２を有する培養の上清 ２４時間の場合に、それぞれ５μｌが施与され、４８時間及び７２時間の場合に、１μｌが施与された。 それらの細胞は、シグナル配列において相違するインターフェロンα２ｂ−発現プラスミドを有する。形成されたインターフェロンα２ｂを、抗体によって検出した（矢印）。本発明によるシグナル配列の使用は、インターフェロンα２ｂ産生の向上をもたらす。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組み換えタンパク質の製造のためのシグナルペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
組み換えタンパク質の大容量の経済的な製造は、バイオテクノロジー産業と医薬品産業にとってますます重要となっている。一般に、組み換えタンパク質は、哺乳類細胞か又は微生物系のいずれかにおいて製造される。微生物系は、こうすることで組み換えタンパク質がより短時間でかつ少ないコストで製造できるという利点を、哺乳類細胞培養に対して有している。従って組み換えタンパク質の製造のためには、とりわけ細菌、有利にはエシェリキア属の細菌、特に有利にはＥ．コリが適している。Ｅ．コリでは、組み換えタンパク質は、原則的に、種々の様式で製造することができる：
１． 可溶性タンパク質として細胞内産生；
２． 封入体（"インクルージョンボディー"）として細胞内産生；
３． ペリプラズム又は栄養培地への分泌。
【０００３】
組み換えタンパク質の製造方法は、その際常に、２つの部分に分かれる。第一の部分は、粗産物をもたらす発酵である。粗産物とは、この場合には、組み換えタンパク質と、更にくわえて不純物となる宿主固有のタンパク質とを含有する発酵成果物を指す。製造方法の第二の部分は、粗産物から出発する組み換えタンパク質の精製を含む。
【０００４】
組み換えタンパク質の労力と費用は、発酵直後に組み換えタンパク質と並んで宿主タンパク質を含む混合物として存在する粗産物の製造コストの他に、実質的に、所望の組み換えタンパク質へと粗産物を精製するコストによっても決められる。精製は、たいていの場合に、クロマトグラフィー法による複数の段階を介して行われる。その際、部分的に免疫原となるか又は毒性がある不純物としての宿主タンパク質の除去精製が重要な役割を担う。
【０００５】
Ｅ．コリにおけるタンパク質の分泌は、たいていの場合に、いわゆるｓｅｃ経路（Ｄｒｉｅｓｓｅｎ他（１９９８年））を介して行われる。この系は、細菌固有のタンパク質の排出を担っている。このタンパク質のための遺伝子は、５′末端に、それぞれいわゆるシグナル配列を有する。タンパク質合成において、該配列はシグナルペプチドに翻訳され、そして細胞質膜を通じたタンパク質の分泌をもたらす。分泌の後に、シグナルペプチドは、シグナルペプチダーゼといった酵素によって開裂され、成熟タンパク質が遊離される。
【０００６】
ｓｅｃ系は、組換体、例えば異種タンパク質の分泌のためにも使用することができる（Ｌｅｅ他著、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３０８，２００５年）。そのために、産生されるべき組み換えタンパク質のための組み換え遺伝子を、シグナル配列と結合させる（"読み枠内融合"（ｉｎ ｆｒａｍｅ Ｆｕｓｉｏｎ））。これは、シグナルペプチド−タンパク質融合物の産生をもたらす。シグナル配列によってコードされるシグナルペプチドは、細胞質膜を通ってペリプラズムへの組み換えタンパク質の分泌を、細菌固有のｓｅｃ系によって媒介する。その際、シグナルペプチドは、シグナルペプチドと組み換えタンパク質との間の切断部位で開裂され、そして所望の組み換えタンパク質がペリプラズム中に得られる。その後に組み換えタンパク質は、ペリプラズムから精製することができる。
【０００７】
分泌は、他の製造方法と比較して、組み換えタンパク質が、直接的に、本来の可溶性の正しく折り畳まれたタンパク質として得られ、"封入体"法に対して、収率の高い損失を伴う工程である変性と再度の復元を行う必要が無いという利点を有する。更に、この場合に粗産物は、細胞内の可溶性産物と比較して僅かな宿主タンパク質で汚染されているに過ぎない。それというのも細菌のペリプラズムは、細胞質よりもはるかに少ない宿主タンパク質しか含まないからである。
【０００８】
規定の条件下で又は規定の細菌株において、組み換えタンパク質は、ペリプラズムから栄養培地中に遊離され（例えばＲａｙ他（２００２年）；ＥＰ０３３８４１０号Ｂ１；Ｎａｇａｈａｒｉ他（１９８５年）；Ｙａｎｇ他（１９９８年）；ＥＰ０６７７１０９号Ｂ１）、そしてそこから精製することができる。
【０００９】
タンパク質の栄養培地中への分泌は、ペリプラズムへの分泌と比較して、タンパク質がその際にさらに純粋な形で存在するという更なる利点を有する。更に、最初の精製段階として、ペリプラズムの面倒な調製又は細胞の分解は必要なく、全細胞のはるかに容易な再現可能に行える分離が必要とされるだけである。
【００１０】
言及したように、産生されるべきタンパク質の分泌のために、それをコードする遺伝子をシグナル配列と結合させるため、産生されるべきタンパク質はまずはシグナル配列によってコードされるシグナルペプチドとの融合物として産生されることとなる。このシグナルペプチドは、産生されるタンパク質の分泌をもたらす。
【００１１】
シグナルペプチドは３つの領域から構成されている：Ｎ末端のＮ領域（１〜５アミノ酸）は、一般に、正電荷を有する１つ以上のアミノ酸を有する。中央に位置するＨ領域は、大抵は、多くが疎水性である７〜１５個のアミノ酸からなる。一般に、３〜７個のアミノ酸を含むＣ領域は、切断部位前の位置−１と位置−３に、主に中性の短鎖アミノ酸（Ａ，Ｇ，Ｓ，Ｔ，Ｃ）を有する。
【００１２】
種々のシグナル配列と属するシグナルペプチドは、先行技術において記載されており、例えばｐｈｏＡ、ｏｍｐＡ、ｐｅｌＢ、ｏｍｐＦ、ｏｍｐＴ、ｌａｍＢ、ｍａｌＥ、スタフィロコッカスのプロテインＡ、ＳｔＩＩ（ＣｈｏｉとＬｅｅ（２００４年）；ＥＰ０３９６６１２号Ｂ１）である。
【００１３】
種々の菌株、例えばクレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）（クレブシエラ・ニューモニアエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｍ５ａ１）由来のシクロデキストリン−グリコシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴアーゼ）のシグナルペプチド並びにそれらのＥ．コリ菌株におけるＣＧＴアーゼの分泌のための使用は、ＵＳ５３９５９２７号に記載されている。
【００１４】
同様に、組み換えタンパク質、例えばヒルジン誘導体を、Ｅ．コリ菌株中で、組み換えタンパク質のための遺伝子とＣＧＴアーゼのシグナル配列とを融合させることで産生させ、分泌させることができることが記載されている（ＥＰ０４４８０９３号Ｂ１）。特定のヒルジン誘導体の場合には、振盪フラスコ培養において２５０ｍｇ／ｌの収率がもたらされ、発酵においては２．６３ｇ／ｌの収率がもたらされる。ＥＰ０４４８０９３号Ｂ１は、しかしながらまた、別の組み換えタンパク質では、２５ｍｇ／ｌまでの収率しか得られないことも記載している。従って、ＣＧＴアーゼのシグナルペプチドは、全ての別の公知のシグナルペプチドも同様に、任意の組み換えタンパク質の分泌を同等の高さの収率で媒介することができない。各組み換えタンパク質は固有のＤＮＡ配列によってコードされ、かつ特にシグナル配列と組み換えタンパク質をコードする配列との間の接合部位でのＤＮＡ配列がそれと異なるので、一般に、各組み換えタンパク質について最適なシグナルペプチドを見出さねばならない。
【特許文献１】Ｌｅｅ他著、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３０８，２００５年
【特許文献２】ＥＰ０３３８４１０号Ｂ１
【特許文献３】ＥＰ０６７７１０９号Ｂ１
【特許文献４】ＥＰ０３９６６１２号Ｂ１
【特許文献５】ＵＳ５３９５９２７号
【非特許文献１】ＥＰ０４４８０９３号Ｂ１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の課題は、新規のシグナルペプチドを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
前記課題は、シグナルペプチドであって、切断部位前の最後の３つのアミノ酸が、アラニン−フェニルアラニン−アラニン（ＡＦＡ）であることを特徴とするシグナルペプチドによって解決される。
【００１７】
有利には、該シグナルペプチドは、アミノ酸配列：ＭＫＲＮＲＦＦＮＴＳＡＡＩＡＩＳＩＡＬＱＩＦＦＰＳＡＳＡＦＡ（配列番号１）を有するか、又は配列番号１と比較して、１〜１０個の、有利には１〜５個の、特に有利には１〜３個のアミノ酸が、切断部位前の最後の３個のアミノ酸を除いて改変されているアミノ酸配列を有する。
【００１８】
前記のように、シグナルペプチドは、規定の群のアミノ酸（例えば荷電した又は疎水性の又は短鎖の）を有する種々の領域からなる。従って、当業者は、アミノ酸を他の匹敵する特性を有するアミノ酸によって交換することによって、特性が変化していない新規のシグナルペプチドを作製することができる。
【００１９】
前記の理由から、本発明によるシグナルペプチドとしては、配列番号２と比較して、１〜１０個の、特に有利には１〜５個の、特に有利には１〜３個のアミノ酸が改変されたものを察することができる。有利には、それは、類似の生化学的特性を有するアミノ酸、例えば塩基性アミノ酸（リジン、アルギニン、ヒスチジン）を、塩基性アミノ酸と交換すること、酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン）を酸性アミノ酸と交換すること、疎水性アミノ酸を疎水性アミノ酸と交換することなどである。アミノ酸の生化学的特性に関する概要を、図１に示す。
【００２０】
更に本発明は、本発明によるシグナルペプチドをコードするシグナル配列に関する。
【００２１】
該配列は、切断部位を有するシグナルペプチドをコードし、該切断部位前のその最後の３個のアミノ酸がアラニン−フェニルアラニン−アラニンであることを特徴とする。
【００２２】
有利には、該配列は、ＤＮＡ配列
【化１】
（配列番号２）並びに縮重された遺伝子コードに基づき配列番号１のアミノ酸配列をコードする全てのＤＮＡ配列を有するシグナル配列である。
【００２３】
スクリーニングの範囲において、ＣＧＴアーゼのシグナル配列（ＭＫＲＮＲＦＦＮＴＳＡＡＩＡＩＳＩＡＬＮＴＦＦＣＳＭＱＴＩＡ、配列番号３）の改変によって得られる種々のシグナル配列を、その特性に関して比較した。驚くべきことに、本発明によるシグナル配列は、ＣＧＴアーゼのシグナル配列又は他のシグナル配列よりも、より広範囲の組み換えタンパク質をより高収率で宿主細胞中で産生させ、分泌させるために適していることが判明した。
【００２４】
本発明によるＤＮＡ配列は、遺伝子合成によって又は相応のオリゴヌクレオチドのライゲーションによって、当業者に公知の方法によって得ることができる。本発明によるＤＮＡ配列は、読み枠内で（ｉｎ ｆｒａｍｅ）、当業者に公知の方法（例えばＬｅｅ他（２００５年）と同様に）に従って、産生されるべき組み換えタンパク質の遺伝子と結合され、それをベクター中に導入することができる。
【００２５】
有利には、このシグナル配列と組み換え遺伝子との組合せ物は、Ｅ．コリにおいて機能的な発現シグナル（プロモーター、転写開始部位、翻訳開始部位、リボソーム結合部位）を備える。プロモーターとしては、当業者に公知のあらゆるプロモーター、例えば一方では誘導可能なプロモーター、例えばｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、λＰＬプロモーター、ａｒａプロモーター又はｔｅｔプロモーター又はそれらから誘導される配列が適している。他方では、構成的プロモーター、例えばＧＡＰＤＨプロモーターを使用することによって構成的な発現を行うこともできる。しかしながら、通常は、産生されるべき組み換えタンパク質の遺伝子と結合されたプロモーターを使用することもできる。
【００２６】
従って、本発明は、発現シグナルと、本発明によるシグナル配列と、産生されるべき組み換えタンパク質をコードする読み枠内で結合された組み換え遺伝子とを含む発現構築物にも関する。
【００２７】
この本発明による発現構築物は、当業者に公知の方法を使用して宿主細胞に導入される。それは、例えばベクター上で、例えばプラスミド上で、例えば公知の発現ベクターの誘導体、例えばｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＡＳＫ−ＩＢＡ３又はｐＥＴ上で行われる。プラスミドのための選択マーカーとしては、例えばアンピシリン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、カナマイシン又は別の抗生物質に対する耐性をコードする遺伝子が適している。
【００２８】
従って、本発明によるシグナル配列又は本発明による発現構築物を有するプラスミドも本発明の対象である。
【００２９】
組み換えタンパク質は、有利には異種タンパク質である。有利には、組み換えタンパク質は、工業的アプローチで使用されるタンパク質又は医薬品作用物質として使用されるタンパク質（バイオロジクス、生体医薬品）である。係るタンパク質は、例えばヒルジン、インスリン、インターフェロン、例えばα−インターフェロン又はβ−インターフェロン（例えばインターフェロンα２ｂ）、抗体もしくは抗体フラグメント（例えばＦａｂフラグメント、ｓｃＦｖ）又は別の結合タンパク質もしくは酵素、例えばＣＧＴアーゼである。
【００３０】
本発明による発現構築物は、当業者に公知の方法に従って微生物細胞（宿主細胞）中に導入される。結果として、本発明による発現構築物は、更にプラスミドとして宿主細胞中に存在しても、又は宿主細胞の染色体中に組み込まれてもよい。
【００３１】
従って、本発明によるシグナル配列又は本発明による発現構築物又は本発明によるプラスミドを有する微生物細胞も本発明の対象である。
【００３２】
宿主細胞は、腸内細菌科からの細菌株の細胞、有利にはエシェリキア・コリの種の菌株である。特に、エシェリキア（Ｅ．）・コリ菌株であって、本発明による発現構築物での形質転換後に発酵によって、本発明による発現構築物で形質転換されたＥ．コリＷ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）よりも高濃度の組み換えタンパク質をペリプラズム中もしくは栄養培地中に示すという点で優れているＥ．コリ菌株が好ましい。
【００３３】
殊に好ましくは、その菌株は、以下のＥ．コリ菌株：
− ＢＬＲ：Ｒａｙ他（２００２年）、Ｎｏｖａｇｅｎで購入できる
− Ｋ８０２＝ＣＧＳＣ*５６１０：Ｙａｎｇ他（１９９８年）
− ＷＣＭ１０５：ＥＰ０３３８４１０号Ｂ１に従って製造できる
− ＭＭ２８＝ＣＧＳＣ*＃５８９２：Ｎａｇａｈａｒｉ他（１９８５年）
− ＲＶ３０８＝ＡＴＣＣ**３１６０８；ＥＰ０６７７１０９号Ｂ１
− ＲＲ１：ＡＴＣＣ**３１４３４：Ｎａｇａｈａｒｉ他（１９８５年）
である。
* 大腸菌ストックセンター（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ）ＣＧＳＣ（８３０ Ｋｌｉｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｔｏｗｅｒ，ＭＣＤ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ，２６６ Ｗｈｉｔｎｅｙ Ａｖｅ．，ＰＯ ｂｏｘ ２０８１０３，Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ）から購入できる
** ＬＧＣ Ｐｒｏｍｏｃｈｅｍ（Ｍｅｒｃａｔｏｒｓｔｒ．５１，４６４８５ Ｗｅｓｅｌ，ドイツ在）から購入できる
産生されたタンパク質の分泌は、宿主細胞のｓｅｃ装置によって行われる。引き続きペリプラズムへの分泌の後に、シグナルペプチダーゼ（例えばＥ．コリではＬｅｐＢ）によって本発明によるシグナルペプチドは開裂されて、所望の組み換えタンパク質が生ずる。
【００３４】
従って、本発明は、本発明による発現構築物を有する宿主細胞によって発酵培地中で組み換えタンパク質を発酵的に製造するための方法にも関する。前記方法は、本発明による宿主菌株を発酵培地中で培養し、該宿主菌株が組み換えタンパク質を読み枠内でのシグナルペプチド−タンパク質融合物の形で産生し、その際、該シグナルペプチドは、本発明によるシグナルペプチドでありかつ該シグナルペプチドは、細胞質膜を通じてペリプラズム中にシグナルペプチド−タンパク質融合物を分泌した場合にシグナルペプチドと組み換えタンパク質との間の切断部位で開裂され、そして所望の組み換えタンパク質がペリプラズム中もしくは発酵培地中で得られ、その組み換えタンパク質を発酵後に精製することを特徴としている。
【００３５】
組み換えタンパク質は、発酵において、ペリプラズム中に又は有利には発酵培地中に分泌される。
【００３６】
組み換えタンパク質は、宿主細胞のペリプラズムからか又は有利には発酵培地から細胞の分離によって精製することができる。
【００３７】
組み換えタンパク質の本発明による製造のための微生物菌株の発酵は、有利には完全培地又は最少塩培地中で行われる。これらの培地は、文献から公知である。
【００３８】
炭素源としては、原則的に、あらゆる使用可能な糖、糖アルコール、有機酸もしくはそれらの塩、デンプン加水分解物、蜜ろう又は別の物質を使用することができる。その際、グルコース又はグリセリンを使用することが好ましい。また複数の種々異なる炭素源を組み合わせて供給することも可能である。窒素源としては、尿素、アンモニア及びそれらの塩、硝酸塩並びに他のＮ源を用いることができる。可能な窒素源には、複合アミノ酸混合物、例えば酵母エキス、ペプトン、麦芽エキス、大豆ペプトン、カザミノ酸、コーンスティープリカー及びＮＺアミン（例えばＫｅｒｒｙ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＵＳＡ）も該当する。
【００３９】
更に、該培地に、ビタミン、塩、酵母エキス、アミノ酸及び微量元素のような他の成分を添加してよく、それによって細胞増殖が向上する。
【００４０】
菌株のインキュベートは、有利には好気的培養条件下で、１６〜１５０時間の時間にわたって、かつその都度の菌株に最適な増殖温度の範囲で行われる。
【００４１】
最適な温度範囲としては、１５〜５５℃が好ましい。特に、２８〜３７℃の温度が好ましい。
【００４２】
菌株の培養は、振盪フラスコ又は発酵器において実施することができ、その際、容量に関する制限は与えられていない。その培養は、回分法、流加法又は連続法で実施することができる。
【００４３】
その際、組み換えタンパク質の発現は、構成的に、すなわち非誘導的にも、又は物理的もしくは生理学的な刺激による誘導によって行われる。発現は、例えばプロモーターを誘導する物質、例えばｌａｃプロモーターもしくはｔａｃプロモーターの場合にはラクトースもしくはＩＰＴＧの添加によって誘導することができる。
【００４４】
ペリプラズムもしくは培養培地からのタンパク質の精製は、当業者に公知の方法に従って、例えば細胞の破壊又は分離、クロマトグラフィー的な精製、タンパク質の複合体化、濾過又は沈降によって行うことができる。
【００４５】
次の実施例は、本発明を更に説明するために用いられるものである。
【実施例】
【００４６】
実施例１：本発明によるシグナル配列及び本発明によるベクターの作製
出発プラスミドとして、プラスミドｐＣＧＴを以下のように作製する：
配列番号４を有し、クレブシエラ・ニューモニアエＭ５ａ１由来のシクロデキストリン−グリコシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴアーゼ）遺伝子を有するＤＮＡ断片（Ｇｅｎｂａｎｋ番号Ｍ１５２６４）を、遺伝子合成によって製造した。このＤＮＡ断片を、発現ベクターｐＪＦ１１８ｕｔ（図２）中にクローニングした。該ベクターは、ＤＳＭＺ−ドイツ微生物細胞培養収集館（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）で番号ＤＳＭ１８５９６として寄託されている。ｐＪＦ１１８ｕｔは、公知の発現ベクターｐＫＫ２２３−３（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）の誘導体であり、β−ラクタマーゼ遺伝子とテトラサイクリン耐性遺伝子の他に、さらに同様にプラスミド上に存在するＬａｃＩｑ遺伝子産物によって再始動されかつ例えばＤ−ラクトースもしくはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）のようなインデューサーによってスイッチオンすることができるｔａｃプロモーターをも有する。プラスミドｐＪＦ１１８ｕｔを、制限酵素ＥｃｏＲＩで完全に切断し、かつそれぞれ直鎖状ＤＮＡ断片の５′末端で突出した塩基を、Ｓ１ヌクレアーゼで分解した。前記のようにして予備調製されたベクターＤＮＡ分子を、ＣＧＴアーゼを含むＤＮＡ断片（配列番号４）とＴ４−リガーゼを使用してライゲーションした。菌株ＤＨ５αを、ライゲーションバッチでＣａＣｌ2法に従って形質転換し、その際、アンピシリン（１００ｍｇ／ｌ）によってプラスミド保有細胞について選択した。アンピシリン耐性形質転換体から、再びプラスミドを単離し、そして制限分析によって調査した。前記のようにして作製された、ＣＧＴアーゼ遺伝子の発現がｔａｃプロモーターの制御下にあるプラスミドを、ｐＣＧＴと呼称した（図３）。
【００４７】
ＣＧＴアーゼのためのシグナル配列に融合されたＣＧＴアーゼのための遺伝子を除去した：そのために８４４８ｂｐの大きさのプラスミドを、制限酵素ＳｓｐＩ及びＰａｃＩによって部分消化によって当業者に公知の方法に従って切断した。６３９０ｂｐの大きさの断片を単離し、そしてクレノウ酵素で処理し、それによって末端を平滑化させた。２０５８ｂｐの大きさの断片を除去した。
【００４８】
次いで、以下の４つのＤＮＡ断片を遺伝子合成によって製造した：
ｐｈｏＡ−ＩＦＮα２ｂ 配列番号５
【化２】
ｏｍｐＡ−ＩＦＮα２ｂ 配列番号６
【化３】
ｃｇｔ−ＩＦＮα２ｂ 配列番号７
【化４】
ＡＦＡ−ＩＦＮα２ｂ 配列番号８
【化５】
【００４９】
全てのＤＮＡ断片は、ｔａｃプロモーター領域と、インターフェロンα２ｂのための遺伝子と、４つの種々のシグナル配列（太字で示した）とを有する。これらの４つの種々のシグナル配列は、以下の４つの種々のシグナルペプチドをコードし、その際、最初の３つのシグナルペプチド（配列番号９、１０、３）は、先行技術から公知であり、四番目のシグナルペプチド（配列番号２）は、本発明によるものである：
ｐｈｏＡ： ＭＫＱＳＴＩＡＬＡＬＬＰＬＬＦＴＰＶＴＫＡ
配列番号９
ｏｍｐＡ： ＭＫＫＴＡＩＡＩＡＶＡＬＡＧＦＡＴＶＡＱＡ
配列番号１０
ｃｇｔ： ＭＫＲＮＲＦＦＮＴＳＡＡＩＡＩＳＩＡＬＮＴＦＦＣＳＭＱＴＩＡ
配列番号３
ＡＦＡ： ＭＫＲＮＲＦＦＮＴＳＡＡＩＡＩＳＩＡＬＱＩＦＦＰＳＡＳＡＦＡ
配列番号２
前記のクローニングによって以下の４つのプラスミドが得られた：
− ｐＫＰ６５１（ｐｈｏＡ−シグナル配列） 図４
− ｐＫＰ６５２（ｏｍｐＡ−シグナル配列） 図５
− ｐＫＰＩＦＮ（ｃｇｔ−シグナル配列） 図６
− ｐＢａＢＩＦＮ１（ＡＦＡ：本発明によるシグナル配列） 図７
これらのプラスミドを、公知の方法によってＥ．コリ菌株ＤＨ５αに導入した。本発明による基株ＤＨ５α／ｐＢａＢＩＦＮ１は、ＤＳＭＺ（ドイツ微生物細胞培養収集館、Ｄ−３８１４２ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）で番号ＤＳＭ１８３４３としてブタペスト条約に従って寄託された。
【００５０】
実施例２：本発明によるシグナル配列を使用することによるインターフェロン産生の増大
プラスミドｐＫＰ６５１（ｐｈｏＡ−シグナル配列）、ｐＫＰ６５２（ｏｍｐＡ−シグナル配列）、ｐＫＰＩＦＮ（ｃｇｔ−シグナル配列）及びｐＢａＢＩＦＮ１（本発明によるＡＦＡ−シグナル配列）（実施例１を参照のこと）を、菌株ＷＣＭ１０５（ＥＰ０３３８４１０号Ｂ１に従って製造できる）中に通常の方法（ＣａＣｌ2−形質転換によって）に従って導入した。プラスミド保有菌株についての選択は、アンピシリン（１００ｍｇ／Ｌ）によって実施した。
【００５１】
以下の菌株が得られた：
− ＷＣＭ１０５／ｐＫＰ６５１（ｐｈｏＡ−シグナル配列）
− ＷＣＭ１０５／ｐＫＰ６５２（ｏｍｐＡ−シグナル配列）
− ＷＣＭ１０５／ｐＫＰＩＦＮ（ｃｇｔ−シグナル配列）
− ＷＣＭ１０５／ｐＢａＢＩＦＮ１（ＡＦＡ−シグナル配列）
得られた菌株中でのインターフェロンα２ｂの産生を調査した。そのために、それらの菌株を、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンと１％のグルコースとを有する１０ｍｌのＬＢ培地中で３０℃において培養した。６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ６００）が０．５になったら、インターフェロンα２ｂの産生を、ＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド）を０．５ｍＭまで添加することによって誘導する。培養上清において、２４時間後、４８時間後及び７２時間後で、形成されかつ分泌されたインターフェロンを、ＳＤＳゲル中でのタンパク質の分離と抗インターフェロン特異抗体でのイムノブロットでの検出によって以下のようにして定量化した。
【００５２】
それぞれ１μｌ（４８時間及び７２時間）もしくは５μｌ（２４時間）の上清を、サンプルバッファーと混合した（２×Ｔｒｉｓ ＳＤＳ−サンプルバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ カタログ番号ＬＣ２６７６）：０．１２５Ｍのトリス塩酸（ｐＨ６．８）、４％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ、２０％（ｖ／ｖ）のグリセリン、０．００５％（ｖ／ｖ）のブロモフェノールブルー、５％のβ−メルカプトエタノール）。更に、定義された量のインターフェロンα２ｂを、スタンダードとして一緒に施与した。タンパク質の変性を、１００℃に５分間加熱し、氷上で２分間冷却し、そして遠心分離することによって実施した。それらのタンパク質を、電気泳動によって、１２％のＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ カタログ番号ＮＰ０３４１）中で、１×ＭＥＳ含有ランニングバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ カタログ番号ＮＰ０００２）を用いて分離させた（電気泳動パラメータ：２００Ｖで４０分間）。イムノブロットによる検出と定量化を、以下の仕様に従って実施した：
【００５３】
湿式ブロッティング法での転写：
モジュール：Ａｍｅｒｓｈａｍ：Ｈｏｅｆｅｒ ＴＥ ２２ Ｍｉｎｉ Ｔａｎｋ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｕｎｉｔ、コード番号：８０−６２０４−２６。
【００５４】
メンブレン：ニトロセルロースメンブレン（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ，ＢＡ８５，硝酸セルロース（Ｅ），０．４５μｍの細孔サイズ）
Ｗｈａｔｍａｎフィルタとニトロセルロースメンブレンを、適切な大きさに切断し、そして発泡物品（スポンジ）で転写バッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ カタログ番号ＬＣ３６７５）に気泡なく染み込ませた。
【００５５】
積層の構成：黒い格子、カソードとの接続、各３ｍｍ厚を有する２つのスポンジ、Ｗｈａｔｍａｎペーパー、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル、ＮＣメンブレン、Ｗｈａｔｍａｎ、６ｍｍ厚を有する１つのスポンジ、白い格子、アノードとの接続
転写条件：Ｉ＝２００ｍＡの一定の電流、Ｕ＝無制限、運転時間６０分
【００５６】
プレハイブリダイゼーション
２５ｍｌのプレハイブリダイゼーションバッファー中で該メンブレンをインキュベートする。
室温で３０分間振り動かす。
【００５７】
一次抗体のハイブリダイゼーション
２５ｍｌのプレハイブリダイゼーションバッファー＋０．１５μｇ／ｍｌ（→３．７５μｇ）の抗ヒトＩＦＮΑ抗体（Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ ＥＣ，Ｂｉｏｚｏｌを経由した カタログ番号：５００−Ｐ３２Ａ）中で該メンブレンをインキュベートする。
【００５８】
室温で９０分間又は一晩振り動かす。
【００５９】
洗浄
１×ＰＢＳと一緒に室温で１０秒間振り動かし、バッファーを捨てる。
１×ＰＢＳと一緒に室温で１５分間２回振り動かし、バッファーを捨てる。
【００６０】
二次抗体のハイブリダイゼーション
２５ｍｌのプレハイブリダイゼーションバッファー＋２５μｌ（１：１０００）のヤギ抗ウサギＩｇＧセイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲート（ＨＲＰ）（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｉｏｚｏｌを経由した カタログ番号４０５０−０５）中で該メンブレンをインキュベートする。
【００６１】
室温で６０分間振り動かす。
【００６２】
洗浄
１×ＰＢＳと一緒に室温で１０秒間振り動かし、バッファーを捨てる。
１×ＰＢＳと一緒に室温で１５分間２回振り動かし、バッファーを捨てる。
【００６３】
化学発光による検出
Ｌｕｍｉ−Ｌｉｇｈｔウェスタンブロッティング基質（Ｒｏｃｈｅ，カタログ番号２０１５２００）を準備する：Ｌｕｍｉ−Ｌｉｇｈｔルミノール／エンハンサー溶液とＬｕｍｉ−Ｌｉｇｈｔ安定ペルオキシド溶液とを１：１の比率で混合する：ＮＣメンブレン当たり３ｍｌ。
【００６４】
ブロットを室温でＬｕｍｉ−Ｌｉｇｈｔウェスタンブロッティング基質と一緒に５分間インキュベートし、過剰の水気を切り、メンブレンをラップフィルムで覆って、直ちにＸ線フィルム（Ｋｏｄａｋ、Ｘ−ＯＭＡＴ）を載せ、２分間暴露し、現像し、そして固定する。シグナルが弱い場合に、暴露をより長時間にわたり繰り返す。
【００６５】
バッファー
プレハイブリダイゼーションバッファー：１×ＰＢＳ中の５％脱脂粉乳
１０×ＰＢＳ：１００ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、１．５ＭのＮａＣｌ、ＮａＯＨでｐＨ７．５、０．５％のＴｒｉｔｏｎ１００
１×ＰＢＳ：１０×ＰＢＳを完全脱塩水で１：１０希釈したもの
【００６６】
定量化
定量的評価は、Ｂｉｏｒａｄ社製のＧＳ−８００ Ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒでイムノブロットをスキャンすることによって、Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ １−Ｄ分析ソフト（Ｂｉｏｒａｄ）を用いて、施与されたスタンダードと比較することによって実施した。
【００６７】
図９は、前記の実施例からのイムノブロットを示している。第１表において、定量化されたインターフェロンα２ｂの収率をまとめる：
【表１】
【００６８】
第１表：それぞれ使用されたシグナル配列の点で異なる種々のプラスミドを用いて２４時間後、４８時間後又は７２時間後に得られたインターフェロンα２ｂの収率
これらの結果は、配列番号２の本発明によるシグナル配列が、産生されるべきタンパク質の収率及び分泌に関して、別のシグナル配列より優れていることを一義的に示している。
【００６９】
実施例３：本発明によるシグナル配列の挿入によって改善されたＣＧＴアーゼ産生プラスミドの作製
プラスミドｐＣＧＴ（実施例１を参照）は、ＣＧＴアーゼのためのシグナル配列と読み枠内で融合されたＣＧＴアーゼのための遺伝子を有する。このシグナル配列を、ここで本発明によるシグナル配列と交換した。
【００７０】
そのために８４４８ｂｐの大きさのプラスミドを、制限酵素ＳｓｐＩ及びＢｇｌＩＩによって部分消化によって当業者に公知の方法に従って切断した。８１１９ｂｐの大きさの断片を単離し、そしてクレノウ酵素で処理し、それによって末端を平滑化させた。ＣＧＴアーゼのシグナル配列と、約１５０ｂｐのＣＧＴアーゼ遺伝子の５末端とを有する３２９ｂｐの大きさの断片を除去した。
【００７１】
前記の断片と配列に関して、ＣＧＴアーゼのシグナル配列が本発明によるシグナル配列と交換されていること以外は同一である以下の３２９ｂｐの大きさのＤＮＡ断片を遺伝子合成によって製造した：
【化６】
【００７２】
このＤＮＡ断片を、単離された８１１９ｂｐの大きさの断片と、当業者に公知の方法に従ってライゲーションした。それによって得られたプラスミドｐＣＭ２０７ＡＦＡを、配列決定によって配列の精度について調査した。
【００７３】
実施例４：本発明によるシグナル配列を使用することによるＣＧＴアーゼ産生の改善
プラスミドｐＣＭ７０３ＡＦＡとプラスミドｐＣＧＴ（実施例３を参照）を、以下の菌株に通常の方法に従って（例えばＣａＣｌ2法によって）形質転換により導入した：
− Ｋ８０２＝ＣＧＳＣ*５６１０：Ｙａｎｇ他（１９９８年）
− ＷＣＭ１０５：ＥＰ０３３８４１０号Ｂ１に従って製造できる
プラスミド保有菌株についての選択は、アンピシリン（１００ｍｇ／Ｌ）によって実施した。それによって以下の本発明による菌株：
− ＷＣＭ１０５／ｐＣＭ７０３ＡＦＡ
− Ｋ８０２／ｐＣＭ７０３ＡＦＡ
及び以下の対照菌株：
− ＷＣＭ１０５／ｐＣＧＴ
− Ｋ８０２／ｐＣＧＴ
が得られた。
【００７４】
これらの菌株を、シクロデキストリン−グリコシルトランスフェラーゼの製造のために使用し、そして１％のグルコースと１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを有する１０ｍｌのＬＢ培地中で３０℃において培養した。ＯＤが０．５となったら、シクロデキストリン−グリコシルトランスフェラーゼの産生を、ＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド）を０．５ｍＭまで添加することによって誘導した。
【００７５】
該菌株の培養上清において、シクロデキストリン−グリコシルトランスフェラーゼの収率を以下の活性試験によって測定した：
試験バッファー：５ｍＭのトリス塩酸バッファー（＞ｐＨ６．５）、５ｍＭのＣａＳＯ4・２Ｈ2Ｏ
基質：試験バッファー（ｐＨ６．５）中の１０％のＮｏｒｅｄｕｘ溶液
試験バッチ：１ｍｌの基質溶液＋１ｍｌの遠心分離された培養上清（５分、１２０００ｒｐｍ）＋３ｍｌのメタノール
反応温度：４０℃
酵素試験：
・ 溶液を予熱する（約５分、４０℃で）。
【００７６】
・ 酵素溶液を基質溶液に添加する；迅速に混合する（渦ミキサ（Ｗｈｉｒｌ−Ｍｉｘｅｒ））。
【００７７】
・ ４０℃で３分間インキュベートする。
【００７８】
・ 酵素反応をメタノールの添加によって停止させる；迅速に混合する（渦ミキサ）。
【００７９】
・ バッチを氷上で冷却する（約５分間）。
【００８０】
・ 遠心分離（５分、１２０００ｒｐｍ）をし、そして澄明な上清をピペットで取り出す。
【００８１】
・ 生じたＣＤをＨＰＬＣによって分析する。
【００８２】
酵素活性：Ａ＝Ｇ*Ｖ１*Ｖ２／（ｔ*ＭＧ）（ユニット／ｍｌ）
Ａ＝活性
Ｇ＝ＣＤの含有率（ｍｇ／ｌ）＝試験バッチ：単位表面×１０4／標準溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）／単位表面
Ｖ１＝希釈係数／試験バッチ（→５）
Ｖ２＝希釈係数／酵素溶液
ｔ＝反応時間（分）（→３）
ＭＧ＝分子量（ｇ／モル）（ＣＤ→９７３）
１ユニット＝１マイクロモルの産物／分
第２表は、本発明による菌株の高められた特異的なシクロデキストリン−グリコシルトランスフェラーゼ収率を示している。
【００８３】
【表２】
【００８４】
第２表：種々の菌株におけるシクロデキストリン−グリコシルトランスフェラーゼの収率
実施例５：本発明によるシグナル配列を使用することによるヒルジン産生の改善
特許ＥＰ０４４８０９３号Ｂ１に記載されるプラスミドｐＣＭＴ２０３を、使用されるシグナル配列を本発明によるシグナル配列ＡＦＡと交換することで改変させた。この交換は、実施例１及び実施例３と同様に実施した。得られたプラスミドをｐＣＭＴ２０３ＡＦＡと呼称した。ｐＣＭＴ２０３及びｐＣＭＴ２０３ＡＦＡを、菌株ＷＣＭ１０５（ＥＰ０３３８４１０号Ｂ１に従って製造できる）中に、通常の方法による形質転換によって（例えばＣａＣｌ2−形質転換によって）導入した。
【００８５】
プラスミド保有菌株についての選択は、アンピシリン（１００ｍｇ／Ｌ）によって実施した。
【００８６】
以下の菌株が得られた：
− ＷＣＭ１０５／ｐＣＭＴ２０３
− ＷＣＭ１０５／ｐＣＭＴ２０３ＡＦＡ
両方の菌株を、ＥＰ０４４８０９３号Ｂ１に記載されるように、１０ｌの発酵器中で培養し、そして得られたヒルジンを、ＥＰ０４４８０９３号Ｂ１に記載されるように、ＩＰＴＧの添加４５時間後に定量化した。
【００８７】
第３表中の結果は、本発明によるシグナル配列を使用することでヒルジンの高められた収率がもたらされることを示している。
【００８８】
【表３】
【００８９】
第３表：種々の菌株における、ＩＰＴＧの添加４５時間後での１０ｌの発酵におけるヒルジンの収率（ＡＴ−Ｕ／ｍｌ及びｇ／Ｌ）
実施例６：本発明によるシグナル配列を使用することによる、機能的なＦａｂ抗体フラグメントの産生の改善
本実施例は、良好に特徴付けられた抗リゾチーム抗体Ｄ１．３のＦａｂフラグメントの改善された製造を記載する。
【００９０】
抗リゾチームＦａｂフラグメントの遺伝子のクローニングと発現のための出発ベクターとして、プラスミドｐＪＦ１１８ｕｔ（実施例１を参照）を使用した。このプラスミド中に、２つの連続した工程において、抗リゾチームＦａｂフラグメントの重鎖（ＶH−ＣH１−ドメイン）もしくは軽鎖（ＶL−ＣL−ドメイン）についての両方の読み枠を、それぞれシグナル配列を含めてクローニングした。そのために以下のように実施した：
配列番号１２を有するＤＮＡ断片（重鎖）を、遺伝子合成によって製造し、そして該ＤＮＡ断片は、Ｅ．コリのｏｍｐＡ遺伝子のシグナル配列と、Ｆａｂフラグメントの重鎖（ＶH−ＣＨ１）のための読み枠とからなる遺伝子融合物を含む。この読み枠直後に６個のヒスチジンコドンが引き続き、従って融合タンパク質のＣ末端を形成している。このヒスチジンタグによって、後に完全に会合されたＦａｂフラグメントの簡単な精製が親和性クロマトグラフィーによって可能となる。このＤＮＡ断片を、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩで切断し、そして同じ制限酵素で切断されている発現ベクターｐＪＦ１１８ｕｔとライゲーションした。このクローニングから得られた、重鎖のための遺伝子の発現がｔａｃプロモーターの制御下にあるプラスミドを、ｐＨＣ−Ａｎｔｉ−Ｌｙｓｏｚｙｍと呼称した。
【００９１】
配列番号１３を有するＤＮＡ断片（軽鎖）を、同様に遺伝子合成によって製造し、そして該ＤＮＡ断片は、配列番号３に記載されるＣＧＴアーゼのシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列（配列番号７において太字で示した）と、Ｆａｂフラグメントの軽鎖（ＶL−ＣL）のための読み枠とからなる遺伝子融合物を含む。このＤＮＡ断片を、まず、制限酵素ＰｓｔＩで切断し、引き続き同じ制限酵素で切断されているベクターｐＨＣ−Ａｎｔｉ−Ｌｙｓｏｚｙｍとライゲーションした。こうして得られたプラスミドを、ｐＦａｂ−Ａｎｔｉ−Ｌｙｓｏｚｙｍ（図９）と呼称した。前記のようにして、重鎖と軽鎖についてのそれぞれの読み枠からなる、ｔａｃプロモーターの制御下にある人工オペロンを作製した。従って、インデューサー（例えばＩＰＴＧ）の添加によって、両方の遺伝子の同期発現が可能である。
【００９２】
本発明によるプラスミドｐＦａｂ−Ａｎｔｉ−ＬｙｓｏｚｙｍＶＬＡＦＡ及びｐＦａｂ−Ａｎｔｉ−ＬｙｓｏｚｙｍＶＨＡＦＡの製造のために、実施例１に記載されるのと同様にして、軽鎖のためのシグナル配列（ｐＦａｂ−Ａｎｔｉ−ＬｙｓｏｚｙｍＶＬＡＦＡ）か又は重鎖のためのシグナル配列（ｐＦａｂ−Ａｎｔｉ−ＬｙｓｏｚｙｍＬＨＡＦＡ）かのいずれかを、配列番号２の本発明によるシグナル配列と交換した。
【００９３】
抗リゾチームＦａｂフラグメントの製造ために、菌株ＷＣＭ１０５（実施例４を参照）を、プラスミドｐＦａｂ−Ａｎｔｉ−Ｌｙｓｏｚｙｍ、ｐＦａｂ−Ａｎｔｉ−ＬｙｓｏｚｙｍＶＬＡＦＡもしくはｐＦａｂ−Ａｎｔｉ−ＬｙｓｏｚｙｍＶＨＡＦＡで、ＣａＣｌ2法に従って形質転換させた。プラスミド保有細胞についての選択は、アンピシリン（１００ｍｇ／ｌ）によって実施した。
【００９４】
抗リゾチームＦａｂフラグメントの製造を、１０ｌ規模で実施した。製造は、１０ｌの撹拌槽型発酵器中で実施した。６ｌの培地ＦＭ４（１．５ｇ／ｌのＫＨ2ＰＯ4；５ｇ／ｌの（ＮＨ4）2ＳＯ4；０．３ｇ／ｌのＭｇＳＯ4×７Ｈ2Ｏ；０．０５ｇ／ｌのＣａＣｌ2×２Ｈ2Ｏ、０．０７５ｇ／ｌのＦｅＳＯ4×７Ｈ2Ｏ；１ｇ／ｌのＮａ3クエン酸塩×２Ｈ2Ｏ；０．５ｇ／ｌのＮａＣｌ；１ｍｌ／ｌの微量元素溶液（０．１５ｇ／ｌのＮａ2ＭｏＯ4×２Ｈ2Ｏ；２．５ｇ／ｌのＮａ3ＢＯ3；０．７ｇ／ｌのＣｏＣｌ2×６Ｈ2Ｏ；０．２５ｇ／ｌのＣｕＳＯ4×５Ｈ2Ｏ；１．６ｇ／ｌのＭｎＣｌ2×４Ｈ2Ｏ；０．３ｇ／ｌのＺｎＳＯ4×７Ｈ2Ｏ）；５ｍｇ／ｌのビタミンＢ1；３ｇ／ｌのフィトン；１．５ｇ／ｌの酵母エキス；１０ｇ／ｌのグルコース；１００ｍｇ／ｌのアンピシリン）で満たされた発酵器に、１：１０の比率で、一晩同じ培地中で培養された前培養を植えた。発酵の間に、３０℃の温度に調整し、そしてｐＨ値をＮＨ4ＯＨもしくはＨ3ＰＯ4を計量供給することによって７．０の値に一定に保った。グルコースは、発酵にわたって計量供給され、その際、培地中の最大グルコース濃度を１０ｇ／ｌ未満にすることに努めた。発現の誘導は、対数増殖期の終わりにイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を０．１ｍＭで添加することによって実施した。
【００９５】
７２時間の発酵後に、試料を取りだし、細胞を培養培地の遠心分離によって分離した。培養上清からの抗リゾチームＦａｂフラグメントの精製は、Ｓｋｅｒｒａ（１９９４年、Ｇｅｎｅ １４１，７９−８４）に記載される親和性クロマトグラフィーによって実施した。
【００９６】
精製された抗リゾチームＦａｂフラグメントの定量化並びに活性の測定は、抗原としてリゾチームを用いたＥＬＩＳＡ試験（Ｓｋｅｒｒａ，１９９４年、Ｇｅｎｅ １４１，７９−８４）によって実施した。
【００９７】
第４表において、それぞれ２０ｍｌの培養上清から７２時間の発酵後に単離することができた機能的な抗リゾチームＦａｂフラグメントの収率を列記する。
【００９８】
第４表：７２時間の発酵後の培養上清中での抗リゾチームＦａｂフラグメントの収率
【表４】
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】図１は、アミノ酸の概要を示している。
【図２】図２は、プラスミドｐＪＦ１１８ｕｔのプラスミド地図を示している。
【図３】図３は、プラスミドｐＣＧＴのプラスミド地図を示している。
【図４】図４は、プラスミドｐＫＰ６５１のプラスミド地図を示している。
【図５】図５は、プラスミドｐＫＰ６５２のプラスミド地図を示している。
【図６】図６は、プラスミドｐＫＰＩＦＮのプラスミド地図を示している。
【図７】図７は、プラスミドｐＢａＢＩＦＮ１のプラスミド地図を示している。
【図８】図８は、プラスミドｐＦａｂ−Ａｎｔｉ−Ｌｙｓｏｚｙｍのプラスミド地図を示している。
【図９】図９は、インターフェロンα２ｂを産生する細胞（実施例２を参照）の培養上清が分析されるイムノブロットを示している。 レーン１：サイズ基準 レーン２とレーン３：２０ｎｇと４０ｎｇのインターフェロンα２ｂ レーン４〜６：２４時間後、４８時間後、７２時間後の、プラスミドｐＢａＢＩＦＮ１を有する培養の上清 レーン７〜９：２４時間後、４８時間後、７２時間後の、プラスミドｐＫＰＩＦＮを有する培養の上清 レーン１０〜１２：２４時間後、４８時間後、７２時間後の、プラスミドｐＫＰ６５１を有する培養の上清 レーン１３〜１５：２４時間後、４８時間後、７２時間後の、プラスミドｐＫＰ６５２を有する培養の上清 ２４時間の場合に、それぞれ５μｌが施与され、４８時間及び７２時間の場合に、１μｌが施与された。 それらの細胞は、シグナル配列において相違するインターフェロンα２ｂ−発現プラスミドを有する。形成されたインターフェロンα２ｂを、抗体によって検出した（矢印）。本発明によるシグナル配列の使用は、インターフェロンα２ｂ産生の向上をもたらす。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組み換えタンパク質との切断部位を有するシグナルペプチドであって、その切断部位前の最後の３個のアミノ酸が、アラニン−フェニルアラニン−アラニン（ＡＦＡ）であることを特徴とするシグナルペプチド。
【請求項２】
請求項１記載のシグナルペプチドであって、アミノ酸配列：ＭＫＲＮＲＦＦＮＴＳＡＡＩＡＩＳＩＡＬＱＩＦＦＰＳＡＳＡＦＡ（配列番号１）を有するか、又は配列番号１と比較して、１〜１０個の、有利には１〜５個の、特に有利には１〜３個のアミノ酸が、切断部位前の最後の３個のアミノ酸を除いて改変されているアミノ酸配列を有することを特徴とするシグナルペプチド。
【請求項３】
請求項１又は２記載のシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列。
【請求項４】
請求項３記載のＤＮＡ配列であって、塩基配列：
【化１】
（配列番号２）並びに縮重された遺伝子コードに基づき、配列番号１のアミノ酸配列をコードするあらゆる塩基配列を特徴するＤＮＡ配列。
【請求項５】
発現シグナルと、請求項３又は４に記載のＤＮＡ配列と、読み枠内で結合された組み換えタンパク質をコードする組み換え遺伝子とを含む発現構築物。
【請求項６】
請求項３又は４記載のＤＮＡ配列又は請求項５記載の発現構築物を有するプラスミド。
【請求項７】
請求項３又は４記載のＤＮＡ配列又は請求項５記載の発現構築物又は請求項６記載のプラスミドを有する微生物細胞。
【請求項８】
請求項７記載の微生物細胞であって、それが腸内細菌科の細菌株の細胞、有利にはエシェリキア・コリの種の菌株の細胞であることを特徴とする微生物細胞。
【請求項９】
組み換えタンパク質の発酵的製造方法において、請求項７又は８記載の微生物細胞を、発酵培地中で培養し、該微生物細胞が組み換えタンパク質をシグナルペプチド−タンパク質融合物の形で産生し、その際、該シグナルペプチドは、請求項１又は２記載のシグナルペプチドでありかつ該シグナルペプチドは、細胞質膜を通じてペリプラズム中にシグナルペプチド−タンパク質融合物を分泌した場合に、シグナルペプチドと組み換えタンパク質との間の切断部位で開裂され、そして所望の組み換えタンパク質がペリプラズム中もしくは発酵培地中で得られ、その組み換えタンパク質を発酵後に精製することを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項９記載の方法において、組み換えタンパク質が、工業的アプローチで使用されるタンパク質又は医薬作用物質として使用されるタンパク質であることを特徴とする方法。
【請求項１】
組み換えタンパク質との切断部位を有するシグナルペプチドであって、その切断部位前の最後の３個のアミノ酸が、アラニン−フェニルアラニン−アラニン（ＡＦＡ）であることを特徴とするシグナルペプチド。
【請求項２】
請求項１記載のシグナルペプチドであって、アミノ酸配列：ＭＫＲＮＲＦＦＮＴＳＡＡＩＡＩＳＩＡＬＱＩＦＦＰＳＡＳＡＦＡ（配列番号１）を有するか、又は配列番号１と比較して、１〜１０個の、有利には１〜５個の、特に有利には１〜３個のアミノ酸が、切断部位前の最後の３個のアミノ酸を除いて改変されているアミノ酸配列を有することを特徴とするシグナルペプチド。
【請求項３】
請求項１又は２記載のシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列。
【請求項４】
請求項３記載のＤＮＡ配列であって、塩基配列：
【化１】
（配列番号２）並びに縮重された遺伝子コードに基づき、配列番号１のアミノ酸配列をコードするあらゆる塩基配列を特徴するＤＮＡ配列。
【請求項５】
発現シグナルと、請求項３又は４に記載のＤＮＡ配列と、読み枠内で結合された組み換えタンパク質をコードする組み換え遺伝子とを含む発現構築物。
【請求項６】
請求項３又は４記載のＤＮＡ配列又は請求項５記載の発現構築物を有するプラスミド。
【請求項７】
請求項３又は４記載のＤＮＡ配列又は請求項５記載の発現構築物又は請求項６記載のプラスミドを有する微生物細胞。
【請求項８】
請求項７記載の微生物細胞であって、それが腸内細菌科の細菌株の細胞、有利にはエシェリキア・コリの種の菌株の細胞であることを特徴とする微生物細胞。
【請求項９】
組み換えタンパク質の発酵的製造方法において、請求項７又は８記載の微生物細胞を、発酵培地中で培養し、該微生物細胞が組み換えタンパク質をシグナルペプチド−タンパク質融合物の形で産生し、その際、該シグナルペプチドは、請求項１又は２記載のシグナルペプチドでありかつ該シグナルペプチドは、細胞質膜を通じてペリプラズム中にシグナルペプチド−タンパク質融合物を分泌した場合に、シグナルペプチドと組み換えタンパク質との間の切断部位で開裂され、そして所望の組み換えタンパク質がペリプラズム中もしくは発酵培地中で得られ、その組み換えタンパク質を発酵後に精製することを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項９記載の方法において、組み換えタンパク質が、工業的アプローチで使用されるタンパク質又は医薬作用物質として使用されるタンパク質であることを特徴とする方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２００８−７３０４４（Ｐ２００８−７３０４４Ａ）
【公開日】平成２０年４月３日（２００８．４．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２４８１３３（Ｐ２００７−２４８１３３）
【出願日】平成１９年９月２５日（２００７．９．２５）
【出願人】（３９０００８９６９）ワッカー ケミー アクチエンゲゼルシャフト (417)
【氏名又は名称原語表記】Ｗａｃｋｅｒ Ｃｈｅｍｉｅ ＡＧ
【住所又は居所原語表記】Ｈａｎｎｓ−Ｓｅｉｄｅｌ−Ｐｌａｔｚ ４， Ｄ−８１７３７ Ｍｕｅｎｃｈｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年４月３日（２００８．４．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年９月２５日（２００７．９．２５）
【出願人】（３９０００８９６９）ワッカー ケミー アクチエンゲゼルシャフト (417)
【氏名又は名称原語表記】Ｗａｃｋｅｒ Ｃｈｅｍｉｅ ＡＧ
【住所又は居所原語表記】Ｈａｎｎｓ−Ｓｅｉｄｅｌ−Ｐｌａｔｚ ４， Ｄ−８１７３７ Ｍｕｅｎｃｈｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
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