シグナル産生成分として使用する組成物及びこれを用いる方法
イムノアッセイのシグナル産生成分としての使用に好適な組成物及びそれを使用する方法。本発明の一局面に従って、この組成物は、アミノデキストランのコーティングを有し、そして金属キレートを含むキャリアを含む。この金属キレートは、キャリア１ミリグラム当たり少なくとも０.０６５μＭの量で存在し、そしてこのアミノデキストランコーティング密度は、平均してキャリア１ミリグラム当たり少なくともおよそ４５μｇである。本発明の別の局面において、キャリアは、以下の式：
Ｍ（Ｌ１）ｘ（Ｌ２）ｙ
を有する錯体で染色され、式中、Ｍは、ユーロピウム、テルビウム、ジスプロシウム、サマリウム、オスミウム及びルテニウムからなる群より選択される金属であり；Ｌ１は、ＤＰＰ、ＴＯＰＯ、ＴＰＰＯからなる群より選択されるリガンドであり；Ｌ２は、式（１）を有するリガンドを含み、式中Ｒは、１つ又はそれ以上の置換基であり、各々の置換基は電子供与基を含み；ｎ＝２〜１０であり；ｘ＝１〜２であり；そしてｙ＝２〜４である。
Ｍ（Ｌ１）ｘ（Ｌ２）ｙ
を有する錯体で染色され、式中、Ｍは、ユーロピウム、テルビウム、ジスプロシウム、サマリウム、オスミウム及びルテニウムからなる群より選択される金属であり；Ｌ１は、ＤＰＰ、ＴＯＰＯ、ＴＰＰＯからなる群より選択されるリガンドであり；Ｌ２は、式（１）を有するリガンドを含み、式中Ｒは、１つ又はそれ以上の置換基であり、各々の置換基は電子供与基を含み；ｎ＝２〜１０であり；ｘ＝１〜２であり；そしてｙ＝２〜４である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般的に、イムノアッセイのシグナル産生成分として有用な組成物に関する。特に本発明は、目的の分析物に対する強力なシグナル及び高度な特異性を同時に提供する組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
イムノアッセイ試薬は、大まかに２つの構成要素、即ち、シグナル産生（増幅としても知られている）機能性及びリガンド結合機能性に分類できる機能性を有する。このシグナル産生機能性は、分析物とのリガンド結合の検出に必要であり、そしてこのリガンド結合機能性は、分析物に対する試薬の特異性である。このリガンド結合活性は、リガンドが粒子表面に共有結合することによって果たされる。生物学的意味での抗体及び小さなハプテン、例えばチロキシンは、一般的なリガンドの例である。
【０００３】
蛍光性組成物及び化学ルミネセンス組成物は、イムノアッセイのシグナル産生成分において広く使用されている。典型的なシグナル産生成分は、蛍光性組成物又は化学ルミネセンス組成物で染色されたキャリア、例えばラテックス粒子を含む。特に金属キレートは、ストークスシフトが一般的に広く、発光ピークが鋭く、そして発光波長が長いので、蛍光染料及び化学ルミネセンス染料として広く使用されている。典型的には金属キレートは、金属、例えばユーロピウム、サマリウム又はテルビウム、及びリガンド、例えばチオフェントリフルオロブタンジオン（ＴＴＡ）、ナフチルトリフルオロブタンジオン（ＮＴＡ）及び４,７−ジフェニル−１,１０−フェナントロリン（ＤＰＰ）、トリオクチルホスフィンオキシド（ＴＯＰＯ）、トリフェニルホスフィンオキシド（ＴＰＰＯ）から形成される錯体である。いくつかの一般的に使用される金属キレートとしては、Ｅｕ（ＴＴＡ）3ＤＰＰ及びＥｕ（ＮＴＡ）3ＤＰＰが挙げられる。
【０００４】
アッセイ試薬の作製に使用される染色されたキャリアは、シグナル産生を与える能力及びリガンドの共有結合のための化学的機能性の両方を有さなければならない。リガンドの結合に使用されるプロセスは、リガンド結合機能性の特異性の質に重大であり得る。このリガンドの特異性は、結合化学の不適当な選択によっていくつかの点で損なわれる可能性がある。例えば、リガンドの受動的吸着が共有結合と同時に生じる場合、この受動的に吸着されたリガンドは、アッセイの間にキャリアから離れ得る。その結果生じる遊離リガンドは、アッセイの妨げとなり、そしてその感受性を減少させる。生じ得る別の問題は、他のキャリアへの試薬の非特異的結合であり、これは、分析物の非存在下でのイムノアッセイシグナルの上昇を導く。
【０００５】
リガンドはしばしば、ポリスチレン粒子の表面に直接結合するカルボキシ基を通じて、この粒子に結合する。このアプローチは、上記の問題の両方を有し得る。この受動的吸着の問題及び非特異的結合の問題は、ポリスチレン粒子とリガンドとの間に１つ又はそれ以上の固定されたヒドロゲルポリマー層、例えばアミノデキストランを導入することによって避けられ得る。吸着及び非特異的結合を排除するために、これらのヒドロゲルポリマーの連続層を有することが重要である。
【０００６】
しかし、従来の染料、例えばＥｕ（ＴＴＡ）3ＤＰＰ又はＥｕ（ＮＴＡ）3ＤＰＰで染色される粒子のコーティングは典型的に、非特異的結合を妨げるのに最適なコーティング密度をはるかに下回るアミノデキストランのコーティング密度しかもたらさない。このアミノデキストランのカップリング密度は典型的に、これらの染料が、試薬の化学ルミネセンス応答に関して最適レベルで添加されるときに、その最大密度から４０〜５０％減少する。より低いレベルの染料は、アミノデキストランコーティングプロセスをあまり干渉しない組成物を与えるが、染料の含有量を減少させると、強力なシグナルに不可欠な化学ルミネセンスもまた減少する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、特異的な結合アッセイにおいて、応答シグナルの増幅とシグナル産生成分の特異性との間により最適なバランスを提供する必要性が当該分野に残っている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の組成物は、非特異的結合の減少と応答シグナルの改善との間に最適なバランスを有するシグナル産生成分を提供する。
【０００９】
本発明の一局面に従って、イムノアッセイのシグナル産生成分としての使用に好適な組成物が提供される。この組成物は、アミノデキストランのコーティングを有し、そして金属キレートで染色されるキャリアを含む。この金属キレートは、キャリア１ミリグラム当たり少なくとも０.０６５μＭの量で存在し、そして平均のアミノデキストランコーティング密度は、キャリア１ミリグラム当たり少なくともおよそ４５μｇである。
【００１０】
本発明の別の局面に従った組成物は、アミノデキストランでコーティングされ、そして、以下の式：
Ｍ（Ｌ１）ｘ（Ｌ２）ｙ
を有する錯体を包含したキャリアを含み、
式中、Ｍは、ユーロピウム、テルビウム、ジスプロシウム、サマリウム、オスミウム及びルテニウムからなる群より選択される金属であり；
Ｌ１は、ＤＰＰ、ＴＯＰＯ及びＴＰＰＯからなる群より選択されるリガンドであり；
【００１１】
Ｌ２は、以下の式：
【化１】
を有するリガンドを包含し、
式中Ｒは、１つ又はそれ以上の置換基であり、各々の置換基は、電子供与基を包含し；そしてｎ＝２〜１０であり、ｘ＝１〜２であり、そしてｙ＝２〜４である。
【００１２】
本発明の別の局面に従って、分析物を含むと推測される試験サンプル中でこの分析物の存在又は量を検出する方法が提供される。この方法は、本発明の組成物をシグナル産生成分として用いてイムノアッセイを行うことを包含する。
【００１３】
上述の段落は、一般的な導入部分として与えられており、そして添付の特許請求の範囲を限定することは意図されない。本発明の好ましい実施態様は、本発明の他の局面と一緒になって、添付の図面とともに取り上げられる以下の詳細な説明を参照することによって最も良く理解される。
【００１４】
本発明の組成物は、イムノアッセイのシグナル産生成分として有用である。この組成物は一般的に、アミノデキストランでコーティングされるキャリアを含み、そしてその中に含まれる金属キレートを有する。この組成物は、非特異的結合によって引き起こされるエラーを減少させながら、目的の分析物の定量測定を可能にする強力な応答シグナルを提供する。
【００１５】
本発明に好適なキャリアとしては、固相材料、典型的には支持体又は表面が挙げられ、これは、多くの形状、例とえば細片、シート、棒、プレート、ウェル、チューブ、粒子又はビーズのうちのどれでもとり得る。この材料は通常、有機又は無機、膨潤性又は非膨潤性、多孔性又は非多孔性、磁性又は非磁性の水不溶性材料である。この表面は、親水性であり得るか、又は親水性を与え得る。この固体支持体としては、無機粉末、例えばシリカ、硫酸マグネシウム及びアルミナ；天然のポリマー材料、特にセルロース系材料及びセルロース由来の材料、例えば紙を含む繊維、例えばろ紙、クロマトグラフィー紙など；合成又は修飾された天然に存在するポリマー、例えばニトロセルロース、酢酸セルロース、ポリ塩化ビニル、ポリアクリルアミド、架橋デキストラン、アガロース、ポリアクリレート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（４−メチルブテン）、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ナイロン、ポリビニルブチレートなどが含まれ；それら自身で又は他の材料とともに使用され；バイオガラスとして入手可能なガラス、セラミックス、磁性材料、金属などが挙げられる。天然又は合成の集合体、例えばリポソーム、リン脂質ベシクル及び細胞がまた利用され得る。
【００１６】
本発明の一実施態様において、このキャリアは粒子である。本明細書中で使用される「粒子」は、球体、球状体、ビーズ及びまた他の形状も同様に包含する。好適な粒子は、典型的には少なくとも２０ｎｍ及びおよそ２０μｍ以下、通常少なくともおよそ４０ｎｍ及び１０μｍ未満、好ましくは０.１μｍ〜１０μｍ、より好ましくは０.１μｍ〜５μｍ、並びになおより好ましくは０.１５μｍ〜３μｍである。この粒子は、有機又は無機、膨潤性又は非膨潤性、多孔性又は非多孔性であり得、任意の密度、しかし好ましくは水に近い密度、一般的にはおよそ０.７ｇ／ｍｌ〜およそ１.５ｇ／ｍｌ、好ましくは水に懸濁可能な密度を有し、そして透明であり得るか、部分的に透明であり得るか又は不透明であり得る物質から構成される。この粒子は、コア−シェル粒子、例えば磁性のコア及び重合したモノマーの硬いシェルコーティングを有する粒子であり得る。この粒子は、好ましくは負電荷である。この粒子は、好ましくは固体、例えばポリマー粒子、金属ゾル（重金属、例えば金又は銀から構成される粒子）、ガラス粒子、ケイ素粒子、磁性粒子、染料クリスタリットである。
【００１７】
特に好ましい粒子の一つは、ラテックス粒子である。本明細書中で使用される「ラテックス」は、微粒子で水に懸濁可能な水不溶性のポリマー材料を意味する。このラテックスはしばしば、ポリエチレン、例えばポリスチレン−ブタジエン、ポリアクリルアミドポリスチレン、ポリスチレンを、アミノ基、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、アクリロニトリル−ブタジエン、スチレンコポリマー、ポリ酢酸ビニル−アクリレート、ポリビニルピリジン、塩化ビニルアクリレートコポリマーなどで置換される。非架橋性のスチレンポリマー及びカルボキシル化スチレン又は他の活性基、例えばアミノ、ヒドロキシル、ハロなどで官能基化されるスチレンが好ましい。多くの場合、ジエン、例えばブタジエンで置換されるスチレンのコポリマーが使用されるだろう。
【００１８】
本発明のキャリアは、１つ又はそれ以上のアミノデキストランの層でコーティングされる。アミノデキストランは、アミノ基で誘導体化されたグルコースポリマーで、およそ１０,０００〜およそ２,０００,０００、好ましくはおよそ５００,０００の分子量を有する。アミノデキストランの調製方法及びキャリアのコーティング方法は、当該分野で公知である。好適な方法は、ＵＳ ５,７０７,８７７の１８〜２０欄並びにＵＳ ５,６３９,６２０の２１欄及び２２欄に記載されている。
【００１９】
一つの好ましい方法において、アミノデキストランは、キャリアの表面のカルボキシル基又は他のアミン反応性官能基にアミノデキストランのアミノ基を共有結合させることによって、キャリア上にコーティングされる。このような方法は、「Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｃｏａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，Ｔｈｅｉｒ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｓｅ」という表題で２０００年３月６日に出願され、同一人に譲渡されそして同時係属中のＵＳ出願番号１０／２２０,６２３に記載及び提供されており、これらの開示の全体は、本明細書に参照によって組み込まれる。
【００２０】
このアミノデキストランコーティングは、特異的な結合アッセイにおいてキャリアの特異性を改善し、従ってイムノアッセイの感度を改善する。本発明の金属キレートが、少なくとも０．０６５μＭの高濃度で染料が存在するとき、予想外に、キャリア１ミリグラム当たり少なくともおよそ４５μｇの量のアミノデキストランによるキャリアのコーティングを可能とすることが発見されている。本発明の一つの好ましい実施態様に従って、このアミノデキストランコーティングは、キャリア１ミリグラム当たり少なくともおよそ４９μｇで存在する。
【００２１】
本発明の一つの好ましい実施態様において、このキャリアは、ＵＳ出願番号１０／２２０,６２３に記載されるように、多糖を含む第二の層でコーティングされ得る。この多糖は、アミン反応性官能基によってアミノデキストラン層に共有結合され得る。一つの好ましい実施態様において、この第二の層は、デキストランアルデヒドを含む。
【００２２】
金属キレートは、公知の方法、例えば染色を通じてキャリアに包含される。この金属キレートは、蛍光シグナル又は化学ルミネセンスシグナルの検出を可能にする。この金属キレートは、比較的高い濃度の金属キレートが、キャリアへのアミノデキストランコーティングの結合を妨げないように選択される。本発明の一実施態様に従って、この金属キレートは、キャリア１ミリグラム当たり少なくとも０.０６５μＭの量で存在し、一方アミノデキストランの平均コーティング密度は、キャリア１ミリグラム当たり少なくともおよそ４５μｇである。本発明の別の実施態様において、この金属キレートは、キャリア１ミリグラム当たり少なくとも０.０６５μＭ及びおよそ０.１５０μＭ未満、より好ましくはキャリア１ミリグラム当たりおよそ０.０７９μＭ〜およそ０.１５０μＭ、そしてより好ましくはキャリア１ミリグラム当たりおよそ０.０８７μＭの量で存在する。本発明の別の実施態様において、この金属キレートは、およそ０.１１０μＭ〜およそ１３５μＭの量で存在する。金属キレート及びアミノデキストランのこれらの濃度は、目的の分析物に対する応答シグナル及び成分特異性との適切なバランスを提供することが見出されている。
【００２３】
本発明の一実施態様に従って、この金属キレートは、以下の一般式：
Ｍ（Ｌ１）ｘ（Ｌ２）ｙ
を有し、
式中、Ｍは、ユーロピウム、テルビウム、ジスプロシウム、サマリウム、オスミウム及びルテニウムからなる群より選択される金属であり；
Ｌ１は、ＤＰＰ、ＴＯＰＯ及びＴＰＰＯからなる群より選択されるリガンドであり；
Ｌ２は、以下の式：
【化２】
を有するリガンドを包含し、
式中Ｒは、１つ又はそれ以上の置換基であり、各々の置換基は、電子供与基を包含し；
ｎ＝２〜１０であり；
ｘ＝１〜２であり；そして
ｙ＝２〜４である。
【００２４】
好適な電子供与基は、ペルフルオロアルキル基に対して過剰な負電荷を付与可能にするものである。一実施態様において、この電子供与基Ｒは、Ｃ1〜Ｃ6アルキル基、ジアルキルアミン基、エーテル基、チオエーテル基及びアリール基からなる群より選択される。
【００２５】
理論に束縛されることを望まずに、本発明の金属キレートは、キャリアをコーティングするアミノデキストランの量の最適化に有効であると考えられており、この理由は、この金属キレートは、既知の金属キレート染料と比較して予想外に安定な錯体を提供するからである。この錯体の安定性は、アミノデキストランのキャリアへの結合を阻害すると考えられている遊離金属量を減少させる。電子供与基Ｒが、リガンドのペルフルオロアルキル基に対してさらなる負電荷を付与可能にし、それによってペルフルオロアルキル基が錯体中の金属に結合する能力を改善することよって、錯体の安定性をさらに増大するとも考えられている。
【００２６】
本発明の一つの特定の実施態様によれば、Ｍはユーロピウムであり、そしてキャリアはラテックス粒子である。本発明の好ましい実施態様によれば、ｎ＝３又は７であり、そしてｘ＝１及びｙ＝３である。
【００２７】
本発明の特定の実施態様によれば、Ｌ２は、以下の式：
【化３】
の中から選択される。
【００２８】
上記のリガンドの好ましい実施態様において、ｎ＝３又はｎ＝７である。本発明の好ましい実施態様において、このリガンドＬ２は、２−（１',１',１',２',２',３',３'−ヘプタフルオロ−４',６'−ヘキサンジオン−６'−イル）−ナフチレン（ＮＨＡ）、及び４,４'−ビス（１'',１'',１'',２'',２'',３'',３''−ヘプタフルオロ−４'',６''−ヘキサンジオン−６''−イル）−ｏ−テルフェニル（ＢＨＨＴ）である。
【００２９】
本発明の特に好ましい実施態様において、この金属キレートは、Ｅｕ（ＮＨＡ）3ＤＰＰ及びＥｕ（ＢＨＨＴ）2ＤＰＰを含む。一般的にこの金属キレートは、有機溶媒中の所望の割合の金属リガンド分子及び遊離した塩酸を捕捉するに十分な塩基と金属塩化物とを混合することによって調製され得る。好適な合成は、それぞれ図１〜２に例示される。
【００３０】
本発明の金属キレート染料は、以下の比較実施例で証明されるように、従来の染料と比較して、比較的高い濃度の金属キレート染料で、より高い密度のアミノデキストランコーティングを可能にすることが見出された。一定量の最適化された染料濃度で、本発明の金属キレートは一般的に、従来の染料がビーズ１ｍｇ当たりおよそ２３μｇ〜およそ３５μｇであるのと比較して、ビーズ１ｍｇ当たりおよそ４５μｇ〜およそ５５μｇでのアミノデキストランコーティングを可能にする。従って、本発明の染料は、キャリアが非特異的結合量を減少させるに十分な量のアミノデキストランでコーティングされることを可能にしながら、特異的な結合アッセイのシグナル産生成分の一部として強力な応答シグナルを与えるに十分な量で存在し得る。
【００３１】
本発明の組成物は、特異的な結合アッセイのシグナル産生成分としての使用に好適である。この組成物は、シグナルが分析物へのリガンド結合に応答して測定される任意のイムノアッセイに好適である。当業者は、この組成物が多くのアッセイフォーマットにおいて広範な有用性を有することを容易に認識するだろう。
【００３２】
本発明の特異的結合アッセイの一実施態様において、シグナル産生成分を用いて、ＥＰ−Ａ２−０ ５１５ １９４に記載されるルミネセンス酸素チャネリングイムノアッセイ（ＬＯＣＩTM）を行う。分析物の定性測定又は定量測定のためのこの方法において、少なくとも１つの特異的結合パートナーが、本発明のキャリアに結合する。分析物を含むと推測される媒体を、この分析物が、励起状態で一重項酸素を産生し得る増感剤の量、及び近接し得る化学ルミネセンス化合物の量に影響を及ぼすような条件下で処理し、その結果この光増感剤によって産生される一重項酸素が、この化学ルミネセンス化合物を活性化し得、これは引き続いて光を産生し、そしてこの光、すなわちこの媒体中の分析物の量に関連している量を測定する。
【００３３】
別の実施態様において、このＬＯＣＩTM方法は、以下の工程を含む：（Ａ）同時又は完全若しくは部分的に連続してのいずれかで、（ｉ）分析物を含むと推測される媒体；（ii）励起状態で一重項酸素を産生し得る増感剤に結合した第一の特異的結合パートナー；及び（iii）一重項酸素とともに化学反応を受けて、同時又は引き続く光の放射により分解し得る得る準安定な中間体種を形成する物質である化学ルミネセンス化合物を含む組成物に結合した第二の特異的結合パートナーを混合する工程；（Ｂ）第一及び第二の特異的結合パートナーを含む錯体を形成する工程であって、この錯体形成は、増感剤を化学ルミネセンス化合物に近接させる工程、（Ｃ）この増感剤を活性化させて、一重項酸素を産生する工程；及び、この化学ルミネセンス化合物によって放射される光の量を測定する工程であって、この光は、媒体中の分析物の量に正比例又は反比例する。この化学ルミネセンス化合物を含む組成物はまた、活性化された化学ルミネセンス化合物によって励起される１つ又はそれ以上の蛍光分子を含み得る。この蛍光分子によって放射される光を測定して、媒体中の分析物の量を測定し得る。
【００３４】
このＬＯＣＩ方法を用いる本発明の一実施態様において、キャリアは、金属キレート及び酸素受容体の両方で染色され得る。酸素受容体は、一重項酸素と反応して、励起状態に急速に分解する極めて不安定な生成物を形成する成分である。この励起状態の過剰エネルギーは、数ナノ秒で起こるフォースターエネルギー転移によって染料に転移される。次いでこの金属キレート染料が、光子計数器で検出され得る光の光子を放射する。好適な酸素受容体は、ＵＳ出願番号５,５７８,４９８及び５,８１１,３１１に開示されている。一つの特に好ましい酸素受容体は、以下の式：
【化４】
を有するＣ−２８チオキセンである。
【実施例】
【００３５】
実施例：単一の産生成分の調製
カルボキシル化ラテックスビーズ（Ｓｅｒａｄｙｎより入手）の１０％溶液１００ｍＬ、１−メトキシ−２−プロパノール１３８ｍｌ、Ｄ.Ｉ.水２８０ｍＬ及び０.１Ｍ ＮａＯＨ１０ｍＬの混合物を、機械的撹拌機及び温度計を備えた三つ口フラスコ中に配置した。この混合物を、撹拌しながら８０℃にした。次いで別個の溶液を、１−メトキシ−２−プロパノール２２０ｍＬ中のＣ−２８チオキセン２ｇ及びＥｕ（ＮＨＡ）3ＤＰＰ２.７ｇを用いて調製し、そしてこの溶液を、溶解するまで撹拌しながら８０℃に加熱した。次いでこの染料溶液をビーズ溶液に注ぎ、そして８０℃で３０分間撹拌し、次いで徐々に４０℃まで冷却した。次いでこのビーズを、ＮａＯＨでｐＨ１０に調整した水中の１０％ｖ／ｖエタノールでのダイアフィルトレーションにより洗浄した。次いでこのビーズを、洗浄の間におよそ２０ｍｇ／ｍｌに濃縮し、次いで４℃で遮光して保管した。
【００３６】
次いでこのアミノデキストランコーティングを、以下の通りに適用した。染色されたビーズ（およそ２０ｍｇ／ｍｌ）１ｍＬを、３.８ｍｇ／ｍｌのＥＤＡＣの存在下、０.０５ＭのＭＥＳ／ｐＨ６.０中のヒドロキシプロピルアミノデキストラン（ＭＷ ５００Ｋ）２０ｍｇ／ｍｌと混合した。この混合物を室温で１６時間（暗所で）インキュベートした後、このビーズを、０.０５ＭのＭＥＳ／ｐＨ６.０の２ｍｌで１回洗浄し、次いで０.０５ＭのＭＥＳ、１.０ＭのＮａＣｌ／ｐＨ６.０の６ｍｌで洗浄した。最後にこのビーズを、０.０５ＭのＭＥＳ／ｐＨ６.０の１ｍｌに再懸濁して、コーティングされたビーズを得た。遠心分離法（Ｓｏｒｖａｌ ＲＣ−５Ｂ Ｐｌｕｓ遠心分離機又はＥｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離機−５４１５ Ｃを使用）によって洗浄を行い、そしてペレットを、音波処理（Ｂｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｆｅｒ−４５０を使用）によって再懸濁した。
【００３７】
次いで、デキストランアルデヒド層を、以下の通りに添加し得た。０.０５ＭのＭＥＳ中の２０ｍｇ／ｍｌデキストランアルデヒド１ｍｌを、２ｍｇ／ｍｌのＮａＢＨ3ＣＮの存在下、アミノデキストランでコーティングされた化学ルミネセンスビーズ１ｍｌと混合した。３７℃で２０時間（暗所）のインキュベーション後、このビーズを、ＭＥＳ緩衝液４ｍｌで１回洗浄し、次いで新たなＭＥＳ緩衝液５ｍｌで洗浄した。このビーズを、０.０５ＭのＭＥＳ、０.４％Ｔｗｅｅｎ−２０／ｐＨ６.０の０.５ｍｌ中に再懸濁して、およそ４０ｍｇ／ｍｌのコーティングビーズを得た。
【００３８】
比較実施例１
第一のセットのラテックス粒子を、Ｅｕ（ＮＴＡ）3ＤＰＰ及びチオキセンで染色し、そして本明細書中に記載される方法に従ってアミノデキストランでコーティングした。同様に、第二のセットのラテックス粒子を、Ｅｕ（ＮＨＡ）3ＤＰＰ及びチオキセンで染色し、そしてアミノデキストランでコーティングした。
各組成物に関して、アミノデキストランコーティング密度及び化学ルミネセンスを、種々の濃度の金属キレートで同時に測定した。このアミノデキストランコーティング密度を、アントロン及び８０％硫酸で処理した後に比色試験によって測定した。この化学ルミネセンスを、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒから販売されるＥｎｖｉｓｉｏｎ−ＡｌｐｈａリーダーによりＬＯＣＩカウントとして測定した。Ｅｕ（ＮＴＡ）3ＤＰＰのデータ点を表１にまとめ、そして曲線の当てはめにより図３に図式的に示した。Ｅｕ（ＮＨＡ）3ＤＰＰのデータ点を表２にまとめ、そして０.０９４までの濃度に関しては、曲線の当てはめにより図４に図式的に示した。
【００３９】
【表１】
【００４０】
【表２】
【００４１】
図３に見られ得るように、従来技術の組成物において、アミノデキストランローディング及びＬＯＣＩシグナルは、組成物に対する応答として同時にプラトー状態に保つことはできなかった。この応答シグナルは、およそ０.０８５ミリモルＥｕ／ビーズｇまでプラトーになり始めなかった。より高濃度で、このアミノデキストランコーティング濃度は、わずか３６μｇ／ビーズｍｇであり、そしてユーロピウム濃度が増大するにつれて減少し続けていた。
【００４２】
対照的に、図４に示されるように、本発明の化合物は、わずか０.０６５μｍ Ｅｕ／ビーズｇで、アミノデキストラン濃度及びＬＯＣＩシグナルに関して両方プラトーになり始めた。この濃度で、平均のアミノデキストランコーティング濃度は、４９μｇ／ビーズｍｇであった。さらに、このアミノデキストラン濃度は一般的に、ユーロピウム濃度が増大するにつれて安定を保った。
【００４３】
比較実施例２
Ｓｅｒａｄｙｎのラテックスビーズを、２つの従来の染料、Ｅｕ（ＴＴＡ）3ＤＰＰ及びＥｕ（ＮＴＡ）3ＤＰＰ、並びに本発明の２つの染料、Ｅｕ（ＢＨＨＴ）2ＤＰＰ及びＥｕ（ＮＨＡ）3ＤＰＰの各々に関して、ビーズ１グラム当たりユーロピウム染料０.１７１ｍｍｏｌ及びＣ−２８チオキセン０.３０３ｍｍｏｌで染色した。次いでこのビーズを、本明細書中に記載されるようにアミノデキストランでコーティングした。次いで、このアミノデキストラン密度を測定し、同様にその応答シグナルの増幅を測定した。このデータを、表３にまとめた。
【００４４】
すべてのシグナル産生成分は、ＬＯＣＩカウントによって測定されるような十分なシグナルを提供した。しかし、本発明の染料は、著しくより高い範囲のアミノデキストランコーティング密度をもたらした。
【００４５】
【表３】
【００４６】
本発明が広範な有用性及び適用を許容することが、当業者によって容易に理解されるはずである。本明細書中に記載されるもの以外の本発明の多くの実施態様及び適用、並びに多くの変異、改変及び等価な処理は、本発明の実体又は範囲を逸脱することなく、本発明及び上述の説明から明らかであるか、又はこれらによって正当に示唆される。
【００４７】
従って、本発明が特定の実施態様に関して本明細書中で詳細に記載されているが、この開示は、本発明の説明及び例示のためだけのものであり、そして単に本発明の完全かつ可能な開示を提供する目的のために行われることが理解されるべきである。上述の開示は、本発明を限定することも意図されず、本発明を限定すると解釈もされず、又はそうでなければ任意のこのような他の実施態様、適用、変異、改変及び等価な処理を排除することも意図されず、これらを排除すると解釈もされず、本発明は、添付の特許請求の範囲及びその等価物によってのみ限定される。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】本発明の金属キレートの一実施態様の合成を例示する図解である。
【図２】本発明の金属キレートの別の実施態様の合成を例示する図解である。
【図３】従来技術の組成物に関するアミノデキストラン濃度及び金属濃度の関数としての応答シグナルのグラフ表示である。
【図４】本発明の組成物に関するアミノデキストラン濃度及び金属濃度の関数としての応答シグナルのグラフ表示である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般的に、イムノアッセイのシグナル産生成分として有用な組成物に関する。特に本発明は、目的の分析物に対する強力なシグナル及び高度な特異性を同時に提供する組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
イムノアッセイ試薬は、大まかに２つの構成要素、即ち、シグナル産生（増幅としても知られている）機能性及びリガンド結合機能性に分類できる機能性を有する。このシグナル産生機能性は、分析物とのリガンド結合の検出に必要であり、そしてこのリガンド結合機能性は、分析物に対する試薬の特異性である。このリガンド結合活性は、リガンドが粒子表面に共有結合することによって果たされる。生物学的意味での抗体及び小さなハプテン、例えばチロキシンは、一般的なリガンドの例である。
【０００３】
蛍光性組成物及び化学ルミネセンス組成物は、イムノアッセイのシグナル産生成分において広く使用されている。典型的なシグナル産生成分は、蛍光性組成物又は化学ルミネセンス組成物で染色されたキャリア、例えばラテックス粒子を含む。特に金属キレートは、ストークスシフトが一般的に広く、発光ピークが鋭く、そして発光波長が長いので、蛍光染料及び化学ルミネセンス染料として広く使用されている。典型的には金属キレートは、金属、例えばユーロピウム、サマリウム又はテルビウム、及びリガンド、例えばチオフェントリフルオロブタンジオン（ＴＴＡ）、ナフチルトリフルオロブタンジオン（ＮＴＡ）及び４,７−ジフェニル−１,１０−フェナントロリン（ＤＰＰ）、トリオクチルホスフィンオキシド（ＴＯＰＯ）、トリフェニルホスフィンオキシド（ＴＰＰＯ）から形成される錯体である。いくつかの一般的に使用される金属キレートとしては、Ｅｕ（ＴＴＡ）3ＤＰＰ及びＥｕ（ＮＴＡ）3ＤＰＰが挙げられる。
【０００４】
アッセイ試薬の作製に使用される染色されたキャリアは、シグナル産生を与える能力及びリガンドの共有結合のための化学的機能性の両方を有さなければならない。リガンドの結合に使用されるプロセスは、リガンド結合機能性の特異性の質に重大であり得る。このリガンドの特異性は、結合化学の不適当な選択によっていくつかの点で損なわれる可能性がある。例えば、リガンドの受動的吸着が共有結合と同時に生じる場合、この受動的に吸着されたリガンドは、アッセイの間にキャリアから離れ得る。その結果生じる遊離リガンドは、アッセイの妨げとなり、そしてその感受性を減少させる。生じ得る別の問題は、他のキャリアへの試薬の非特異的結合であり、これは、分析物の非存在下でのイムノアッセイシグナルの上昇を導く。
【０００５】
リガンドはしばしば、ポリスチレン粒子の表面に直接結合するカルボキシ基を通じて、この粒子に結合する。このアプローチは、上記の問題の両方を有し得る。この受動的吸着の問題及び非特異的結合の問題は、ポリスチレン粒子とリガンドとの間に１つ又はそれ以上の固定されたヒドロゲルポリマー層、例えばアミノデキストランを導入することによって避けられ得る。吸着及び非特異的結合を排除するために、これらのヒドロゲルポリマーの連続層を有することが重要である。
【０００６】
しかし、従来の染料、例えばＥｕ（ＴＴＡ）3ＤＰＰ又はＥｕ（ＮＴＡ）3ＤＰＰで染色される粒子のコーティングは典型的に、非特異的結合を妨げるのに最適なコーティング密度をはるかに下回るアミノデキストランのコーティング密度しかもたらさない。このアミノデキストランのカップリング密度は典型的に、これらの染料が、試薬の化学ルミネセンス応答に関して最適レベルで添加されるときに、その最大密度から４０〜５０％減少する。より低いレベルの染料は、アミノデキストランコーティングプロセスをあまり干渉しない組成物を与えるが、染料の含有量を減少させると、強力なシグナルに不可欠な化学ルミネセンスもまた減少する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、特異的な結合アッセイにおいて、応答シグナルの増幅とシグナル産生成分の特異性との間により最適なバランスを提供する必要性が当該分野に残っている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の組成物は、非特異的結合の減少と応答シグナルの改善との間に最適なバランスを有するシグナル産生成分を提供する。
【０００９】
本発明の一局面に従って、イムノアッセイのシグナル産生成分としての使用に好適な組成物が提供される。この組成物は、アミノデキストランのコーティングを有し、そして金属キレートで染色されるキャリアを含む。この金属キレートは、キャリア１ミリグラム当たり少なくとも０.０６５μＭの量で存在し、そして平均のアミノデキストランコーティング密度は、キャリア１ミリグラム当たり少なくともおよそ４５μｇである。
【００１０】
本発明の別の局面に従った組成物は、アミノデキストランでコーティングされ、そして、以下の式：
Ｍ（Ｌ１）ｘ（Ｌ２）ｙ
を有する錯体を包含したキャリアを含み、
式中、Ｍは、ユーロピウム、テルビウム、ジスプロシウム、サマリウム、オスミウム及びルテニウムからなる群より選択される金属であり；
Ｌ１は、ＤＰＰ、ＴＯＰＯ及びＴＰＰＯからなる群より選択されるリガンドであり；
【００１１】
Ｌ２は、以下の式：
【化１】
を有するリガンドを包含し、
式中Ｒは、１つ又はそれ以上の置換基であり、各々の置換基は、電子供与基を包含し；そしてｎ＝２〜１０であり、ｘ＝１〜２であり、そしてｙ＝２〜４である。
【００１２】
本発明の別の局面に従って、分析物を含むと推測される試験サンプル中でこの分析物の存在又は量を検出する方法が提供される。この方法は、本発明の組成物をシグナル産生成分として用いてイムノアッセイを行うことを包含する。
【００１３】
上述の段落は、一般的な導入部分として与えられており、そして添付の特許請求の範囲を限定することは意図されない。本発明の好ましい実施態様は、本発明の他の局面と一緒になって、添付の図面とともに取り上げられる以下の詳細な説明を参照することによって最も良く理解される。
【００１４】
本発明の組成物は、イムノアッセイのシグナル産生成分として有用である。この組成物は一般的に、アミノデキストランでコーティングされるキャリアを含み、そしてその中に含まれる金属キレートを有する。この組成物は、非特異的結合によって引き起こされるエラーを減少させながら、目的の分析物の定量測定を可能にする強力な応答シグナルを提供する。
【００１５】
本発明に好適なキャリアとしては、固相材料、典型的には支持体又は表面が挙げられ、これは、多くの形状、例とえば細片、シート、棒、プレート、ウェル、チューブ、粒子又はビーズのうちのどれでもとり得る。この材料は通常、有機又は無機、膨潤性又は非膨潤性、多孔性又は非多孔性、磁性又は非磁性の水不溶性材料である。この表面は、親水性であり得るか、又は親水性を与え得る。この固体支持体としては、無機粉末、例えばシリカ、硫酸マグネシウム及びアルミナ；天然のポリマー材料、特にセルロース系材料及びセルロース由来の材料、例えば紙を含む繊維、例えばろ紙、クロマトグラフィー紙など；合成又は修飾された天然に存在するポリマー、例えばニトロセルロース、酢酸セルロース、ポリ塩化ビニル、ポリアクリルアミド、架橋デキストラン、アガロース、ポリアクリレート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（４−メチルブテン）、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ナイロン、ポリビニルブチレートなどが含まれ；それら自身で又は他の材料とともに使用され；バイオガラスとして入手可能なガラス、セラミックス、磁性材料、金属などが挙げられる。天然又は合成の集合体、例えばリポソーム、リン脂質ベシクル及び細胞がまた利用され得る。
【００１６】
本発明の一実施態様において、このキャリアは粒子である。本明細書中で使用される「粒子」は、球体、球状体、ビーズ及びまた他の形状も同様に包含する。好適な粒子は、典型的には少なくとも２０ｎｍ及びおよそ２０μｍ以下、通常少なくともおよそ４０ｎｍ及び１０μｍ未満、好ましくは０.１μｍ〜１０μｍ、より好ましくは０.１μｍ〜５μｍ、並びになおより好ましくは０.１５μｍ〜３μｍである。この粒子は、有機又は無機、膨潤性又は非膨潤性、多孔性又は非多孔性であり得、任意の密度、しかし好ましくは水に近い密度、一般的にはおよそ０.７ｇ／ｍｌ〜およそ１.５ｇ／ｍｌ、好ましくは水に懸濁可能な密度を有し、そして透明であり得るか、部分的に透明であり得るか又は不透明であり得る物質から構成される。この粒子は、コア−シェル粒子、例えば磁性のコア及び重合したモノマーの硬いシェルコーティングを有する粒子であり得る。この粒子は、好ましくは負電荷である。この粒子は、好ましくは固体、例えばポリマー粒子、金属ゾル（重金属、例えば金又は銀から構成される粒子）、ガラス粒子、ケイ素粒子、磁性粒子、染料クリスタリットである。
【００１７】
特に好ましい粒子の一つは、ラテックス粒子である。本明細書中で使用される「ラテックス」は、微粒子で水に懸濁可能な水不溶性のポリマー材料を意味する。このラテックスはしばしば、ポリエチレン、例えばポリスチレン−ブタジエン、ポリアクリルアミドポリスチレン、ポリスチレンを、アミノ基、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、アクリロニトリル−ブタジエン、スチレンコポリマー、ポリ酢酸ビニル−アクリレート、ポリビニルピリジン、塩化ビニルアクリレートコポリマーなどで置換される。非架橋性のスチレンポリマー及びカルボキシル化スチレン又は他の活性基、例えばアミノ、ヒドロキシル、ハロなどで官能基化されるスチレンが好ましい。多くの場合、ジエン、例えばブタジエンで置換されるスチレンのコポリマーが使用されるだろう。
【００１８】
本発明のキャリアは、１つ又はそれ以上のアミノデキストランの層でコーティングされる。アミノデキストランは、アミノ基で誘導体化されたグルコースポリマーで、およそ１０,０００〜およそ２,０００,０００、好ましくはおよそ５００,０００の分子量を有する。アミノデキストランの調製方法及びキャリアのコーティング方法は、当該分野で公知である。好適な方法は、ＵＳ ５,７０７,８７７の１８〜２０欄並びにＵＳ ５,６３９,６２０の２１欄及び２２欄に記載されている。
【００１９】
一つの好ましい方法において、アミノデキストランは、キャリアの表面のカルボキシル基又は他のアミン反応性官能基にアミノデキストランのアミノ基を共有結合させることによって、キャリア上にコーティングされる。このような方法は、「Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｃｏａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，Ｔｈｅｉｒ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｓｅ」という表題で２０００年３月６日に出願され、同一人に譲渡されそして同時係属中のＵＳ出願番号１０／２２０,６２３に記載及び提供されており、これらの開示の全体は、本明細書に参照によって組み込まれる。
【００２０】
このアミノデキストランコーティングは、特異的な結合アッセイにおいてキャリアの特異性を改善し、従ってイムノアッセイの感度を改善する。本発明の金属キレートが、少なくとも０．０６５μＭの高濃度で染料が存在するとき、予想外に、キャリア１ミリグラム当たり少なくともおよそ４５μｇの量のアミノデキストランによるキャリアのコーティングを可能とすることが発見されている。本発明の一つの好ましい実施態様に従って、このアミノデキストランコーティングは、キャリア１ミリグラム当たり少なくともおよそ４９μｇで存在する。
【００２１】
本発明の一つの好ましい実施態様において、このキャリアは、ＵＳ出願番号１０／２２０,６２３に記載されるように、多糖を含む第二の層でコーティングされ得る。この多糖は、アミン反応性官能基によってアミノデキストラン層に共有結合され得る。一つの好ましい実施態様において、この第二の層は、デキストランアルデヒドを含む。
【００２２】
金属キレートは、公知の方法、例えば染色を通じてキャリアに包含される。この金属キレートは、蛍光シグナル又は化学ルミネセンスシグナルの検出を可能にする。この金属キレートは、比較的高い濃度の金属キレートが、キャリアへのアミノデキストランコーティングの結合を妨げないように選択される。本発明の一実施態様に従って、この金属キレートは、キャリア１ミリグラム当たり少なくとも０.０６５μＭの量で存在し、一方アミノデキストランの平均コーティング密度は、キャリア１ミリグラム当たり少なくともおよそ４５μｇである。本発明の別の実施態様において、この金属キレートは、キャリア１ミリグラム当たり少なくとも０.０６５μＭ及びおよそ０.１５０μＭ未満、より好ましくはキャリア１ミリグラム当たりおよそ０.０７９μＭ〜およそ０.１５０μＭ、そしてより好ましくはキャリア１ミリグラム当たりおよそ０.０８７μＭの量で存在する。本発明の別の実施態様において、この金属キレートは、およそ０.１１０μＭ〜およそ１３５μＭの量で存在する。金属キレート及びアミノデキストランのこれらの濃度は、目的の分析物に対する応答シグナル及び成分特異性との適切なバランスを提供することが見出されている。
【００２３】
本発明の一実施態様に従って、この金属キレートは、以下の一般式：
Ｍ（Ｌ１）ｘ（Ｌ２）ｙ
を有し、
式中、Ｍは、ユーロピウム、テルビウム、ジスプロシウム、サマリウム、オスミウム及びルテニウムからなる群より選択される金属であり；
Ｌ１は、ＤＰＰ、ＴＯＰＯ及びＴＰＰＯからなる群より選択されるリガンドであり；
Ｌ２は、以下の式：
【化２】
を有するリガンドを包含し、
式中Ｒは、１つ又はそれ以上の置換基であり、各々の置換基は、電子供与基を包含し；
ｎ＝２〜１０であり；
ｘ＝１〜２であり；そして
ｙ＝２〜４である。
【００２４】
好適な電子供与基は、ペルフルオロアルキル基に対して過剰な負電荷を付与可能にするものである。一実施態様において、この電子供与基Ｒは、Ｃ1〜Ｃ6アルキル基、ジアルキルアミン基、エーテル基、チオエーテル基及びアリール基からなる群より選択される。
【００２５】
理論に束縛されることを望まずに、本発明の金属キレートは、キャリアをコーティングするアミノデキストランの量の最適化に有効であると考えられており、この理由は、この金属キレートは、既知の金属キレート染料と比較して予想外に安定な錯体を提供するからである。この錯体の安定性は、アミノデキストランのキャリアへの結合を阻害すると考えられている遊離金属量を減少させる。電子供与基Ｒが、リガンドのペルフルオロアルキル基に対してさらなる負電荷を付与可能にし、それによってペルフルオロアルキル基が錯体中の金属に結合する能力を改善することよって、錯体の安定性をさらに増大するとも考えられている。
【００２６】
本発明の一つの特定の実施態様によれば、Ｍはユーロピウムであり、そしてキャリアはラテックス粒子である。本発明の好ましい実施態様によれば、ｎ＝３又は７であり、そしてｘ＝１及びｙ＝３である。
【００２７】
本発明の特定の実施態様によれば、Ｌ２は、以下の式：
【化３】
の中から選択される。
【００２８】
上記のリガンドの好ましい実施態様において、ｎ＝３又はｎ＝７である。本発明の好ましい実施態様において、このリガンドＬ２は、２−（１',１',１',２',２',３',３'−ヘプタフルオロ−４',６'−ヘキサンジオン−６'−イル）−ナフチレン（ＮＨＡ）、及び４,４'−ビス（１'',１'',１'',２'',２'',３'',３''−ヘプタフルオロ−４'',６''−ヘキサンジオン−６''−イル）−ｏ−テルフェニル（ＢＨＨＴ）である。
【００２９】
本発明の特に好ましい実施態様において、この金属キレートは、Ｅｕ（ＮＨＡ）3ＤＰＰ及びＥｕ（ＢＨＨＴ）2ＤＰＰを含む。一般的にこの金属キレートは、有機溶媒中の所望の割合の金属リガンド分子及び遊離した塩酸を捕捉するに十分な塩基と金属塩化物とを混合することによって調製され得る。好適な合成は、それぞれ図１〜２に例示される。
【００３０】
本発明の金属キレート染料は、以下の比較実施例で証明されるように、従来の染料と比較して、比較的高い濃度の金属キレート染料で、より高い密度のアミノデキストランコーティングを可能にすることが見出された。一定量の最適化された染料濃度で、本発明の金属キレートは一般的に、従来の染料がビーズ１ｍｇ当たりおよそ２３μｇ〜およそ３５μｇであるのと比較して、ビーズ１ｍｇ当たりおよそ４５μｇ〜およそ５５μｇでのアミノデキストランコーティングを可能にする。従って、本発明の染料は、キャリアが非特異的結合量を減少させるに十分な量のアミノデキストランでコーティングされることを可能にしながら、特異的な結合アッセイのシグナル産生成分の一部として強力な応答シグナルを与えるに十分な量で存在し得る。
【００３１】
本発明の組成物は、特異的な結合アッセイのシグナル産生成分としての使用に好適である。この組成物は、シグナルが分析物へのリガンド結合に応答して測定される任意のイムノアッセイに好適である。当業者は、この組成物が多くのアッセイフォーマットにおいて広範な有用性を有することを容易に認識するだろう。
【００３２】
本発明の特異的結合アッセイの一実施態様において、シグナル産生成分を用いて、ＥＰ−Ａ２−０ ５１５ １９４に記載されるルミネセンス酸素チャネリングイムノアッセイ（ＬＯＣＩTM）を行う。分析物の定性測定又は定量測定のためのこの方法において、少なくとも１つの特異的結合パートナーが、本発明のキャリアに結合する。分析物を含むと推測される媒体を、この分析物が、励起状態で一重項酸素を産生し得る増感剤の量、及び近接し得る化学ルミネセンス化合物の量に影響を及ぼすような条件下で処理し、その結果この光増感剤によって産生される一重項酸素が、この化学ルミネセンス化合物を活性化し得、これは引き続いて光を産生し、そしてこの光、すなわちこの媒体中の分析物の量に関連している量を測定する。
【００３３】
別の実施態様において、このＬＯＣＩTM方法は、以下の工程を含む：（Ａ）同時又は完全若しくは部分的に連続してのいずれかで、（ｉ）分析物を含むと推測される媒体；（ii）励起状態で一重項酸素を産生し得る増感剤に結合した第一の特異的結合パートナー；及び（iii）一重項酸素とともに化学反応を受けて、同時又は引き続く光の放射により分解し得る得る準安定な中間体種を形成する物質である化学ルミネセンス化合物を含む組成物に結合した第二の特異的結合パートナーを混合する工程；（Ｂ）第一及び第二の特異的結合パートナーを含む錯体を形成する工程であって、この錯体形成は、増感剤を化学ルミネセンス化合物に近接させる工程、（Ｃ）この増感剤を活性化させて、一重項酸素を産生する工程；及び、この化学ルミネセンス化合物によって放射される光の量を測定する工程であって、この光は、媒体中の分析物の量に正比例又は反比例する。この化学ルミネセンス化合物を含む組成物はまた、活性化された化学ルミネセンス化合物によって励起される１つ又はそれ以上の蛍光分子を含み得る。この蛍光分子によって放射される光を測定して、媒体中の分析物の量を測定し得る。
【００３４】
このＬＯＣＩ方法を用いる本発明の一実施態様において、キャリアは、金属キレート及び酸素受容体の両方で染色され得る。酸素受容体は、一重項酸素と反応して、励起状態に急速に分解する極めて不安定な生成物を形成する成分である。この励起状態の過剰エネルギーは、数ナノ秒で起こるフォースターエネルギー転移によって染料に転移される。次いでこの金属キレート染料が、光子計数器で検出され得る光の光子を放射する。好適な酸素受容体は、ＵＳ出願番号５,５７８,４９８及び５,８１１,３１１に開示されている。一つの特に好ましい酸素受容体は、以下の式：
【化４】
を有するＣ−２８チオキセンである。
【実施例】
【００３５】
実施例：単一の産生成分の調製
カルボキシル化ラテックスビーズ（Ｓｅｒａｄｙｎより入手）の１０％溶液１００ｍＬ、１−メトキシ−２−プロパノール１３８ｍｌ、Ｄ.Ｉ.水２８０ｍＬ及び０.１Ｍ ＮａＯＨ１０ｍＬの混合物を、機械的撹拌機及び温度計を備えた三つ口フラスコ中に配置した。この混合物を、撹拌しながら８０℃にした。次いで別個の溶液を、１−メトキシ−２−プロパノール２２０ｍＬ中のＣ−２８チオキセン２ｇ及びＥｕ（ＮＨＡ）3ＤＰＰ２.７ｇを用いて調製し、そしてこの溶液を、溶解するまで撹拌しながら８０℃に加熱した。次いでこの染料溶液をビーズ溶液に注ぎ、そして８０℃で３０分間撹拌し、次いで徐々に４０℃まで冷却した。次いでこのビーズを、ＮａＯＨでｐＨ１０に調整した水中の１０％ｖ／ｖエタノールでのダイアフィルトレーションにより洗浄した。次いでこのビーズを、洗浄の間におよそ２０ｍｇ／ｍｌに濃縮し、次いで４℃で遮光して保管した。
【００３６】
次いでこのアミノデキストランコーティングを、以下の通りに適用した。染色されたビーズ（およそ２０ｍｇ／ｍｌ）１ｍＬを、３.８ｍｇ／ｍｌのＥＤＡＣの存在下、０.０５ＭのＭＥＳ／ｐＨ６.０中のヒドロキシプロピルアミノデキストラン（ＭＷ ５００Ｋ）２０ｍｇ／ｍｌと混合した。この混合物を室温で１６時間（暗所で）インキュベートした後、このビーズを、０.０５ＭのＭＥＳ／ｐＨ６.０の２ｍｌで１回洗浄し、次いで０.０５ＭのＭＥＳ、１.０ＭのＮａＣｌ／ｐＨ６.０の６ｍｌで洗浄した。最後にこのビーズを、０.０５ＭのＭＥＳ／ｐＨ６.０の１ｍｌに再懸濁して、コーティングされたビーズを得た。遠心分離法（Ｓｏｒｖａｌ ＲＣ−５Ｂ Ｐｌｕｓ遠心分離機又はＥｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離機−５４１５ Ｃを使用）によって洗浄を行い、そしてペレットを、音波処理（Ｂｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｆｅｒ−４５０を使用）によって再懸濁した。
【００３７】
次いで、デキストランアルデヒド層を、以下の通りに添加し得た。０.０５ＭのＭＥＳ中の２０ｍｇ／ｍｌデキストランアルデヒド１ｍｌを、２ｍｇ／ｍｌのＮａＢＨ3ＣＮの存在下、アミノデキストランでコーティングされた化学ルミネセンスビーズ１ｍｌと混合した。３７℃で２０時間（暗所）のインキュベーション後、このビーズを、ＭＥＳ緩衝液４ｍｌで１回洗浄し、次いで新たなＭＥＳ緩衝液５ｍｌで洗浄した。このビーズを、０.０５ＭのＭＥＳ、０.４％Ｔｗｅｅｎ−２０／ｐＨ６.０の０.５ｍｌ中に再懸濁して、およそ４０ｍｇ／ｍｌのコーティングビーズを得た。
【００３８】
比較実施例１
第一のセットのラテックス粒子を、Ｅｕ（ＮＴＡ）3ＤＰＰ及びチオキセンで染色し、そして本明細書中に記載される方法に従ってアミノデキストランでコーティングした。同様に、第二のセットのラテックス粒子を、Ｅｕ（ＮＨＡ）3ＤＰＰ及びチオキセンで染色し、そしてアミノデキストランでコーティングした。
各組成物に関して、アミノデキストランコーティング密度及び化学ルミネセンスを、種々の濃度の金属キレートで同時に測定した。このアミノデキストランコーティング密度を、アントロン及び８０％硫酸で処理した後に比色試験によって測定した。この化学ルミネセンスを、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒから販売されるＥｎｖｉｓｉｏｎ−ＡｌｐｈａリーダーによりＬＯＣＩカウントとして測定した。Ｅｕ（ＮＴＡ）3ＤＰＰのデータ点を表１にまとめ、そして曲線の当てはめにより図３に図式的に示した。Ｅｕ（ＮＨＡ）3ＤＰＰのデータ点を表２にまとめ、そして０.０９４までの濃度に関しては、曲線の当てはめにより図４に図式的に示した。
【００３９】
【表１】
【００４０】
【表２】
【００４１】
図３に見られ得るように、従来技術の組成物において、アミノデキストランローディング及びＬＯＣＩシグナルは、組成物に対する応答として同時にプラトー状態に保つことはできなかった。この応答シグナルは、およそ０.０８５ミリモルＥｕ／ビーズｇまでプラトーになり始めなかった。より高濃度で、このアミノデキストランコーティング濃度は、わずか３６μｇ／ビーズｍｇであり、そしてユーロピウム濃度が増大するにつれて減少し続けていた。
【００４２】
対照的に、図４に示されるように、本発明の化合物は、わずか０.０６５μｍ Ｅｕ／ビーズｇで、アミノデキストラン濃度及びＬＯＣＩシグナルに関して両方プラトーになり始めた。この濃度で、平均のアミノデキストランコーティング濃度は、４９μｇ／ビーズｍｇであった。さらに、このアミノデキストラン濃度は一般的に、ユーロピウム濃度が増大するにつれて安定を保った。
【００４３】
比較実施例２
Ｓｅｒａｄｙｎのラテックスビーズを、２つの従来の染料、Ｅｕ（ＴＴＡ）3ＤＰＰ及びＥｕ（ＮＴＡ）3ＤＰＰ、並びに本発明の２つの染料、Ｅｕ（ＢＨＨＴ）2ＤＰＰ及びＥｕ（ＮＨＡ）3ＤＰＰの各々に関して、ビーズ１グラム当たりユーロピウム染料０.１７１ｍｍｏｌ及びＣ−２８チオキセン０.３０３ｍｍｏｌで染色した。次いでこのビーズを、本明細書中に記載されるようにアミノデキストランでコーティングした。次いで、このアミノデキストラン密度を測定し、同様にその応答シグナルの増幅を測定した。このデータを、表３にまとめた。
【００４４】
すべてのシグナル産生成分は、ＬＯＣＩカウントによって測定されるような十分なシグナルを提供した。しかし、本発明の染料は、著しくより高い範囲のアミノデキストランコーティング密度をもたらした。
【００４５】
【表３】
【００４６】
本発明が広範な有用性及び適用を許容することが、当業者によって容易に理解されるはずである。本明細書中に記載されるもの以外の本発明の多くの実施態様及び適用、並びに多くの変異、改変及び等価な処理は、本発明の実体又は範囲を逸脱することなく、本発明及び上述の説明から明らかであるか、又はこれらによって正当に示唆される。
【００４７】
従って、本発明が特定の実施態様に関して本明細書中で詳細に記載されているが、この開示は、本発明の説明及び例示のためだけのものであり、そして単に本発明の完全かつ可能な開示を提供する目的のために行われることが理解されるべきである。上述の開示は、本発明を限定することも意図されず、本発明を限定すると解釈もされず、又はそうでなければ任意のこのような他の実施態様、適用、変異、改変及び等価な処理を排除することも意図されず、これらを排除すると解釈もされず、本発明は、添付の特許請求の範囲及びその等価物によってのみ限定される。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】本発明の金属キレートの一実施態様の合成を例示する図解である。
【図２】本発明の金属キレートの別の実施態様の合成を例示する図解である。
【図３】従来技術の組成物に関するアミノデキストラン濃度及び金属濃度の関数としての応答シグナルのグラフ表示である。
【図４】本発明の組成物に関するアミノデキストラン濃度及び金属濃度の関数としての応答シグナルのグラフ表示である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノデキストランのコーティングを有し、そしてその中に包含される金属キレートを有するキャリアであって、この金属キレートが、キャリア１ミリグラム当たり少なくとも０.０６５μＭの量で存在し、このアミノデキストランコーティング密度が、平均してキャリア１ミリグラム当たり少なくともおよそ４５μｇであるキャリアを含む、イムノアッセイのシグナル産生成分としての使用に好適な組成物。
【請求項２】
金属キレートが、キャリア１ミリグラム当たりおよそ０.０６５μＭ〜およそ０.１５０μＭの量で存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
金属キレートが、ユーロピウム錯体を包含する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
キャリアが、ラテックス粒子を包含する、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
イムノアッセイのシグナル産生成分としての使用に好適な組成物であって、この組成物が、
アミノデキストランでコーティングされ、そして以下の式：
Ｍ（Ｌ１）ｘ（Ｌ２）ｙ
を有する錯体をその中に包含したキャリア
を含み、ここで
Ｍは、ユーロピウム、テルビウム、ジスプロシウム、サマリウム、オスミウム及びルテニウムからなる群より選択される金属であり；
Ｌ１は、ＤＰＰ、ＴＯＰＯ、ＴＰＰＯからなる群より選択されるリガンドであり；
Ｌ２は、以下の式：
【化１】
［Ｒは、１つ又はそれ以上の置換基であり、各々の置換基は、電子供与基を包含し；
ｎ＝２〜１０である］を有するリガンドを包含し、
ｘ＝１〜２であり；そして
ｙ＝２〜４である、
上記組成物。
【請求項６】
各々のＲが、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、ジアルキルアミン、エーテル、チオエーテル及びアリールからなる群より独立して選択される、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
Ｍが、ユーロピウムを包含する、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
キャリアが、ラテックス粒子を包含する、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
ｎ＝３である、請求項５に記載の組成物。
【請求項１０】
ｘ＝１であり、そしてｙ＝３である、請求項６に記載の組成物。
【請求項１１】
ｎ＝７である、請求項５に記載の組成物。
【請求項１２】
Ｌ２が、以下：
【化２】
を包含する、請求項５に記載の組成物。
【請求項１３】
Ｌ２が、以下：
【化３】
を包含する、請求項５に記載の組成物。
【請求項１４】
Ｌ２が、以下：
【化４】
を包含する、請求項５に記載の組成物。
【請求項１５】
Ｌ２が、以下：
【化５】
を包含する、請求項５に記載の組成物。
【請求項１６】
Ｌ２が、以下：
【化６】
を包含する、請求項５に記載の組成物。
【請求項１７】
コーティングが、デキストランアルデヒドを含む第二の層をさらに含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項１８】
キャリアが、酸素受容体をさらに含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項１９】
請求項１に記載の組成物をシグナル産生成分として用いてイムノアッセイを行うことを含む、分析物を含むと推測される試験サンプル中でこの分析物の存在又は量を検出する方法。
【請求項２０】
イムノアッセイが、ルミネセンス酸素チャネリングイムノアッセイを包含する、請求項１９に記載の方法。
【請求項１】
アミノデキストランのコーティングを有し、そしてその中に包含される金属キレートを有するキャリアであって、この金属キレートが、キャリア１ミリグラム当たり少なくとも０.０６５μＭの量で存在し、このアミノデキストランコーティング密度が、平均してキャリア１ミリグラム当たり少なくともおよそ４５μｇであるキャリアを含む、イムノアッセイのシグナル産生成分としての使用に好適な組成物。
【請求項２】
金属キレートが、キャリア１ミリグラム当たりおよそ０.０６５μＭ〜およそ０.１５０μＭの量で存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
金属キレートが、ユーロピウム錯体を包含する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
キャリアが、ラテックス粒子を包含する、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
イムノアッセイのシグナル産生成分としての使用に好適な組成物であって、この組成物が、
アミノデキストランでコーティングされ、そして以下の式：
Ｍ（Ｌ１）ｘ（Ｌ２）ｙ
を有する錯体をその中に包含したキャリア
を含み、ここで
Ｍは、ユーロピウム、テルビウム、ジスプロシウム、サマリウム、オスミウム及びルテニウムからなる群より選択される金属であり；
Ｌ１は、ＤＰＰ、ＴＯＰＯ、ＴＰＰＯからなる群より選択されるリガンドであり；
Ｌ２は、以下の式：
【化１】
［Ｒは、１つ又はそれ以上の置換基であり、各々の置換基は、電子供与基を包含し；
ｎ＝２〜１０である］を有するリガンドを包含し、
ｘ＝１〜２であり；そして
ｙ＝２〜４である、
上記組成物。
【請求項６】
各々のＲが、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、ジアルキルアミン、エーテル、チオエーテル及びアリールからなる群より独立して選択される、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
Ｍが、ユーロピウムを包含する、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
キャリアが、ラテックス粒子を包含する、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
ｎ＝３である、請求項５に記載の組成物。
【請求項１０】
ｘ＝１であり、そしてｙ＝３である、請求項６に記載の組成物。
【請求項１１】
ｎ＝７である、請求項５に記載の組成物。
【請求項１２】
Ｌ２が、以下：
【化２】
を包含する、請求項５に記載の組成物。
【請求項１３】
Ｌ２が、以下：
【化３】
を包含する、請求項５に記載の組成物。
【請求項１４】
Ｌ２が、以下：
【化４】
を包含する、請求項５に記載の組成物。
【請求項１５】
Ｌ２が、以下：
【化５】
を包含する、請求項５に記載の組成物。
【請求項１６】
Ｌ２が、以下：
【化６】
を包含する、請求項５に記載の組成物。
【請求項１７】
コーティングが、デキストランアルデヒドを含む第二の層をさらに含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項１８】
キャリアが、酸素受容体をさらに含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項１９】
請求項１に記載の組成物をシグナル産生成分として用いてイムノアッセイを行うことを含む、分析物を含むと推測される試験サンプル中でこの分析物の存在又は量を検出する方法。
【請求項２０】
イムノアッセイが、ルミネセンス酸素チャネリングイムノアッセイを包含する、請求項１９に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２００８−５２８９６９（Ｐ２００８−５２８９６９Ａ）
【公表日】平成２０年７月３１日（２００８．７．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５５２２０４（Ｐ２００７−５５２２０４）
【出願日】平成１８年１月１７日（２００６．１．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／００１５２９
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０７８６１８
【国際公開日】平成１８年７月２７日（２００６．７．２７）
【出願人】（５０００２９７１８）デイド・ベーリング・インコーポレイテッド (20)
【氏名又は名称原語表記】ＤＡＤＥ ＢＥＨＲＩＮＧ ＩＮＣ．
【公表日】平成２０年７月３１日（２００８．７．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１月１７日（２００６．１．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／００１５２９
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０７８６１８
【国際公開日】平成１８年７月２７日（２００６．７．２７）
【出願人】（５０００２９７１８）デイド・ベーリング・インコーポレイテッド (20)
【氏名又は名称原語表記】ＤＡＤＥ ＢＥＨＲＩＮＧ ＩＮＣ．
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