シチジン‐５´‐一リン酸‐Ｎ‐アセチルノイラミン酸およびＮ‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造法
【課題】 効率的なシチジン‐５´‐一リン酸‐Ｎ‐アセチルノイラミン酸およびＮ‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造法を提供する。
【解決手段】以下の（１）（２）より選ばれる蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、ＣＴＰおよびN‐アセチルノイラミン酸を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でCMP‐N‐アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃ）を生成、蓄積させ、該水性媒体中からＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃを採取することを特徴とするＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの製造法を提供することができる。（１） 特定のアミノ酸配列を有するＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ（２）特定の塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされ、かつＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質
【解決手段】以下の（１）（２）より選ばれる蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、ＣＴＰおよびN‐アセチルノイラミン酸を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でCMP‐N‐アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃ）を生成、蓄積させ、該水性媒体中からＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃを採取することを特徴とするＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの製造法を提供することができる。（１） 特定のアミノ酸配列を有するＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ（２）特定の塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされ、かつＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シチジン‐５´‐一リン酸‐Ｎ‐アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物を用いたシチジン‐５´‐一リン酸‐Ｎ‐アセチルノイラミン酸の製造法、およびＮ‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
シチジン‐５´‐一リン酸‐Ｎ‐アセチルノイラミン酸（以下ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃと略す）の製造法としては、ＣＴＰとＮ‐アセチルノイラミン酸から、精製したＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼによる酵素反応で製造する方法（非特許文献１）がよく知られているが、酵素の精製工程は複雑で費用もかかるため、工業生産には適さない。
精製酵素を用いずにＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃを製造する方法としては、ＣＴＰ前駆物質とＮ‐アセチルノイラミン酸を原料として、ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼを生産する微生物菌体を用いる方法（特許文献１）がある。この方法では、微生物本来の代謝活性を利用してオロット酸等の安価な原料からＣＴＰを供給するが、この方法で用いられている大腸菌由来のＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼの反応至適ｐＨは塩基性側にあることが明らかになっており（非特許文献２)、微生物菌体の代謝活性を利用するのに適した中性条件で、より効率的にＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃを合成する酵素の取得が求められている。
【０００３】
またシチジン‐５´‐一リン酸（以下ＣＭＰと略す）とＮ‐アセチルノイラミン酸またはＮ‐アセチルグルコサミンを原料として、ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼを発現する微生物菌体と酵母菌体を用いてＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃを製造する方法も知られている(非特許文献２)。この方法は、高価なＣＭＰと酵母菌体とを組み合わせて使わなくてはならず、より安価で効率的なＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの製造方法が求められている。
【０００４】
パスツレラ・マルトシダ（Pasteurella multocida）のpm0187で表されるＯＲＦは、クローニングがされており、該ＯＲＦにコードされる蛋白質を大腸菌を宿主細胞として発現させ、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有することが確認されている（非特許文献３）。
【特許文献１】国際公開特許第98‐12343号パンフレット
【特許文献２】国際公開特許第04‐009830号パンフレット
【非特許文献１】Appl. Microbiol. Biotechnol., 44, 59-67(1995)
【非特許文献２】J. Biol. Chem., 262, 17556-17562 (1987)
【非特許文献３】INFECT. IMMUN., 73, 1284-1294(2005)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、シチジン‐５´‐一リン酸‐Ｎ‐アセチルノイラミン酸合成酵素活性を生産する能力を有する微生物を用いたシチジン‐５´‐一リン酸‐Ｎ‐アセチルノイラミン酸の製造法、および該微生物を用いたＮ‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は以下の[１]〜[９]に関する。
［１］ 以下の（１）〜（５）より選ばれる蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、シチジン‐５´‐三リン酸（以下、ＣＴＰと略す）またはＣＴＰ前駆物質（I）およびＮ‐アセチルノイラミン酸を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でシチジン‐５´‐一リン酸‐Ｎ‐アセチルノイラミン酸（以下、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃと略す）を生成、蓄積させ、該水性媒体中からＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを採取することを特徴とするＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの製造法。
（１）配列番号１に表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
（２）配列番号１に表されるアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつCMP-NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
（３）配列番号１に表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有し、かつCMP‐NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
（４）配列番号２に表される塩基配列を有するＤＮＡにコードされる蛋白質
（５）配列番号２に表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされ、かつCMP-NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
[２] ＣＴＰまたはＣＴＰ前駆物質（I）が、ＣＴＰ前駆物質（II）からＣＴＰまたはＣＴＰ前駆物質（I）を生産する能力を有する原核生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、エネルギー供与体およびＣＴＰ前駆物質（II）を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でＣＴＰまたはＣＴＰ前駆物質（I）を生成、蓄積させて得られるＣＴＰまたはＣＴＰ前駆物質（I）である、請求項１に記載のＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの製造法。
【０００７】
［３］ Ｎ‐アセチルノイラミン酸が、Ｎ‐アセチルグルコサミン-２‐エピメラーゼとＮ‐アセチルノイラミン酸シンターゼとを生産する能力を有する微生物、またはそれぞれの蛋白質を生産する能力を有する２種の微生物の培養物もしくは該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、Ｎ‐アセチルグルコサミンおよびエネルギー供与体を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＮ‐アセチルノイラミン酸を生成、蓄積させて得られるＮ‐アセチルノイラミン酸である、請求項１または２に記載のＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの製造法。
［４］ Ｎ‐アセチルグルコサミン‐２‐エピメラーゼ、Ｎ‐アセチルノイラミン酸シンターゼおよび以下の（１）〜（５）より選ばれる蛋白質を生産する能力を有する一つの微生物またはこれらの蛋白質を生産する能力を任意の組み合わせですべて有する複数の微生物の培養物または該培養物の処理物、およびＣＴＰ前駆物質（II）からＣＴＰまたはＣＴＰ前駆物質（I）を生産する能力を有する原核生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、ＣＴＰ前駆物質（II）、Ｎ‐アセチルグルコサミンおよびエネルギー供与体を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを生成、蓄積させ、該水性媒体中からＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを採取することを特徴とする、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの製造法。
（１）配列番号１に表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
（２）配列番号１に表されるアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつCMP-NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
（３）配列番号１に表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有し、かつCMP‐NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
（４）配列番号２に表される塩基配列を有するＤＮＡにコードされる蛋白質
（５）配列番号２に表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされ、かつCMP-NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
［５］ N‐アセチルグルコサミン‐２‐エピメラーゼを生産する能力、N‐アセチルノイラミン酸シンターゼを生産する能力、以下の（１）〜（５）より選ばれる蛋白質を生産する能力およびＣＴＰ前駆物質（I）からＣＴＰを生産する能力を持っている１つの原核生物、またはこれらの能力を任意の組み合わせですべて有する複数の原核生物の培養物もしくは該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、エネルギー供与体、ＣＴＰ前駆物質（I）およびN‐アセチルグルコサミンを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃを生成、蓄積させ、該水性媒体中からＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃを採取することを特徴とする、ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの製造法。
（１）配列番号１に表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
（２）配列番号１に表されるアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質
（３）配列番号１に表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有し、かつＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質
（４）配列番号２に表される塩基配列を有するＤＮＡにコードされる蛋白質
（５）配列番号２に表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとス
トリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされ、かつＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質
［６］ シアリルトランスフェラーゼを生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、請求項１から５のいずれかの方法で製造されたＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃおよび受容体糖質を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でN‐アセチルノイラミン酸含有糖質を生成、蓄積させ、該水性媒体中からN‐アセチルノイラミン酸含有糖質を採取することを特徴とする、N‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造法。
［７］ 以下の（１）〜（５）より選ばれる蛋白質とシアリルトランスフェラーゼとを生産する能力を有する微生物、またはそれぞれの蛋白質を生産する能力を有する２種の微生物の培養物もしくは該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、N-アセチルノイラミン酸および受容体糖質を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でN‐アセチルノイラミン酸含有糖質を生成、蓄積させ、該水性媒体中からN‐アセチルノイラミン酸含有糖質を採取することを特徴とするN‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造法。
（１）配列番号１に表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
（２）配列番号１に表されるアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつCMP-NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
（３）配列番号１に表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有し、かつCMP‐NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
（４）配列番号２に表される塩基配列を有するＤＮＡにコードされる蛋白質
（５）配列番号２に表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされ、かつCMP-NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
［８］ N‐アセチルノイラミン酸が、Ｎ‐アセチルグルコサミン-２‐エピメラーゼとN‐アセチルノイラミン酸シンターゼとを生産する能力を有する微生物、またはそれぞれの蛋白質を生産する能力を有する２種の微生物の培養物もしくは該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、エネルギー供与体およびN‐アセチルグルコサミンを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でN‐アセチルノイラミン酸を生成、蓄積させることによって得られたものである、請求項７に記載のN‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造法。
［９］ N‐アセチルグルコサミン‐２‐エピメラーゼ、N‐アセチルノイラミン酸シンターゼ、以下の（１）〜（５）より選ばれる蛋白質およびシアリルトランスフェラーゼを生産する能力を持っている１つの微生物、またはこれらの蛋白質を生産する能力を任意の組み合わせですべて有する複数の微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、エネルギー供与体、N‐アセチルグルコサミンおよび受容体糖質を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でN‐アセチルノイラミン酸含有糖質を生成、蓄積させ、該水性媒体中からN‐アセチルノイラミン酸含有糖質を採取することを特徴とする、N‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造法。
（１）配列番号１に表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
（２）配列番号１に表されるアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつCMP-NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
（３）配列番号１に表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有し、かつCMP‐NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
（４）配列番号２に表される塩基配列を有するＤＮＡにコードされる蛋白質
（５）配列番号２に表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされ、かつCMP-NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、安価で効率的にシチジン‐５´‐一リン酸‐Ｎ‐アセチルノイラミン酸およびＮ‐アセチルノイラミン酸含有糖質を製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明で用いる微生物が生産するＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質としては、
（１）配列番号１に表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
（２）配列番号１に表されるアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質
（３）配列番号１に表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有し、かつＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質
（４）配列番号２に表される塩基配列を有するＤＮＡにコードされる蛋白質
（５）配列番号２に表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされ、かつＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質
をあげることができる。
【００１０】
１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質は、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)（以下、モレキュラー・クローニング第２版と略す）、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409(1982)、Gene, 34, 315 (1985)、Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより、取得することができる。
【００１１】
欠失、置換または付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換または付加できる程度の数であり、１個から数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
また、上記の配列番号１で表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたとは、同一配列中の任意かつ１もしくは複数のアミノ酸配列中の位置において、１または複数のアミノ酸残基の欠失、置換または付加があることを意味し、欠失、置換または付加が同時に生じてもよく、置換または付加されるアミノ酸残基は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸残基としては、L-アラニン、L-アスパラギン、L-アスパラギン酸、L-グルタミン、L-グルタミン酸、グリシン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-リジン、Ｌ-アルギニン、L-メチオニン、L-フェニルアラニン、L-プロリン、L-セリン、L-スレオニン、L-トリプトファン、L-チロシン、L-バリン、L-システインなどがあげられる。
【００１２】
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
また、上記の１以上のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有する蛋白質がＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有するためには、配列番号１記載のアミノ酸配列と、少なくとも８０％以上、通常は９０％以上、特に９５％以上、さらには９８％の同一性を有していることが好ましい。
【００１３】
アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST（Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)）やFASTA（Methods Enzymol., 183, 63 (1990)）を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている（J. Mol. Biol., 215, 403(1990)）。BLASTに基づいてBLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターは例えばScore＝100、wordlength＝12とする。また、BLASTに基づいてBLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは例えばscore＝50、wordlength＝3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（http://www.ncbi.nlm.nih.gov.）。
【００１４】
また、本発明で用いられるＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡとしては、配列番号２で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンセターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡをあげることができる。
ここでいう「ハイブリダイズする」とは、特定の塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部にＤＮＡがハイブリダイズすることである。したがって、該特定の塩基配列を有するＤＮＡまたはその一部は、ノーザンまたはサザンブロット解析のプローブとして用いることができ、またＰＣＲ解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できるＤＮＡである。プローブとして用いられるＤＮＡとしては、少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上のＤＮＡをあげることができ、プライマーとして用いられるＤＮＡとしては、少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上のＤＮＡをあげることができる。
【００１５】
ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えば当業者であれば本願明細書に従い、ハイブリダイゼーションの条件を決定することができる。該ハイブリダイゼーションの条件は、モレキュラー・クローニング第２版、第３版（２００１年）、Methods for General and Molecular Bacteriolgy, ASM Press（1994）、Immunology methods manual, Academic press(1996)に記載の他、多数の他の標準的な教科書に従って行うことができる。
【００１６】
上記のストリンジェントな条件とは、ＤＮＡを固定化したフィルターとプローブ、好ましくはプローブＤＮＡとを50％ホルムアミド、5×SSC（750mmol/lの塩化ナトリウム、75mmol/lのクエン酸ナトリウム）、50mmol/lのリン酸ナトリウム（pH7.6）、5×デンハルト溶液、10％の硫酸デキストラン、および20μg/lの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で42℃で一晩、インキュベートした後、例えば約65℃の0.2×SSC溶液中で該フィルターを洗浄する条件が好ましいが、より低いストリンジェント条件を用いることもできる。ストリンジェンな条件の変更は、ホルムアミドの濃度調整（ホルムアミドの濃度を下げるほど低ストリンジェントになる）、塩濃度および温度条件の変更により可能である。低ストリンジェント条件としては、例えば6×SSCE（20×SSCEは、3mol/lの塩化ナトリウム、0.2mol/lのリン酸二水素ナトリウム、0.02mol/lのEDTA、pH7.4）、0.5％のSDS、30％のホルムアミド、100μg/lの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、37℃で一晩インキュベートした後、50℃の1×SSC、0.1％SDS溶液を用いて洗浄する条件をあげることができる。また、さらに低いストリンジェントな条件としては、上記した低ストリンジェント条件において、高塩濃度（例えば5×SSC）の溶液を用いてハイブリダイゼーションを行った後、洗浄する条件をあげることができる。
【００１７】
上記した様々な条件は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加、または変更することにより設定することもできる。上記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。
上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えば上記したBLASTやFASTA等を用いて上記したパラメーター等に基づいて計算したときに、配列番号２で表される塩基配列と少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
【００１８】
配列番号２で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが、ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンセターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡであることは、例えば以下に記載した方法により、遺伝子組換え法を用いて該ＤＮＡにコードされる蛋白質を製造し、該蛋白質の活性を測定することにより確認することができる。
【００１９】
本発明のＮ‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造法に使用するシアリルトランスフェラーゼは、微生物が活性のある蛋白質として生産することができる蛋白質であればよく、好ましくは細菌等の原核生物または酵母、特に好ましくは原核生物由来の蛋白質がよい。具体的にはパスツレラ・マルトシダ（Pasteurella multocida） PM70株 由来のα-2,3-sialyltransferase （WO03/27297）、Photobacterium damselae JT0160株由来のα-2,6-sialyltransferase (GenBank ACCESSION No. BAA25316)などがあげられる。
【００２０】
本発明のＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃおよびＮ‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造法に使用するＮ‐アセチルグルコサミン‐２‐エピメラーゼは、微生物が活性のある蛋白質として生産することができる蛋白質であればよく、好ましくは細菌等の原核生物または酵母、特に好ましくは原核生物由来のものがよい。具体的にはSynechocystis sp. PCC6803株(Pasteur Culture Collection of Cyanobacteria, INSTITUTE PASTEUR)由来のＮ‐アセチルグルコサミン‐２−エピメラーゼ（WO00/47730)があげられる。
【００２１】
本発明のＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃおよびＮ‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造法に使用するＮ‐アセチルノイラミン酸シンターゼは、微生物が活性のある蛋白質として生産することができる蛋白質であればよく、好ましくは細菌等の原核生物または酵母、特に好ましくは原核生物由来のＮ‐アセチルノイラミン酸シンターゼがよい。具体的にはエシェリヒア・コリ（Escherichia coli） K1株由来のＮ‐アセチルノイラミン酸シンターゼ（GenBank ACCESSION No. AAC43302）があげられる。
［Ａ］ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの製造
（１）ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物の作製
本発明の方法で使用するＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物は、上記した本発明で使用するＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物であれば特に限定されず、該微生物としては、人為的な操作を行わなくても該ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有している微生物と、ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡで形質転換された微生物があげられる。
【００２２】
人為的な操作を行わなくともＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物としては、パスツレラ属に属する微生物、例えばPasteurella multocida PM70株（ミネソタ大学より分譲可能）があげられる。
上記した本発明で使用するＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡで形質転換された微生物としては、例えば配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡを適当な発現ベクターに挿入した組換え体ＤＮＡで形質転換された微生物、配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡを染色体上に挿入された微生物があげられる。
【００２３】
１）ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ断片の取得
上記した本発明で使用するＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡは、該蛋白質を生産する生物の染色体ＤＮＡ等からのクローニング、または該蛋白質をコードするＤＮＡをＤＮＡ合成機等を用いて合成することによって取得することができるが、例えば、配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡは、以下のようにして取得することができる。
【００２４】
配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡは、パスツレラ属の微生物より調製することができる。パスツレラ属に属する微生物としては、例えばPasteurella multocida をあげることができ、具体的にはPasteurella multocida PM70株(ミネソタ大学より分譲可能)をあげることができる。
Pasteurella multocidaに属する微生物を公知の方法（例えば、FEMS Microbiol. Lett., 166, 289 (1998)）により培養し、培養後、公知の方法（例えばカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーに記載の方法）により、該微生物のゲノムＤＮＡを単離精製することにより、該微生物のゲノムＤＮＡを取得することができる。
【００２５】
配列番号２で表される塩基配列に基づいたプライマーを調製し、ゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法（PCR Protocols, Academic Press (1990)）により配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡ断片を取得することができる。
また、配列番号２の塩基配列に基づいて設計された合成ＤＮＡをプローブとしたハイブリダイゼーション法などにより目的とするＤＮＡを取得することもできる。
【００２６】
取得したＤＮＡをそのまま、あるいは適当な制限酵素などで切断後、常法によりベクターに組み込み、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキシ法（Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463 (1977)）あるいはABI377（アプライド・バイオシステムズ ジャパン社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
【００２７】
上記の取得されたＤＮＡを組み込むベクターとしては、pBluescript KS(+)（ストラタジーン社製）、pDIRECT（Nucleic Acids Res., 18, 6069 (1990)）、pCR-Script Amp SK(+)（ストラタジーン社製）、pT7Blue（ノバジェン社製）、pCR II（インビトロジェン社製）およびpCR-TRAP（ジーンハンター社製）などをあげることができる。
更に、決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、パーセプティブ・バイオシステムズ社製8905型ＤＮＡ合成装置等を用いて化学合成することにより目的とするＤＮＡを調製することもできる。
【００２８】
２）ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物の作製
ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物は、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された方法等を用い、例えば以下の方法により、上記１）に記載の方法により取得したＤＮＡを宿主細胞中に導入することにより取得することができる。
【００２９】
上記１）で得られるＤＮＡをもとにして、必要に応じて、該蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。また、該蛋白質をコードする部分の塩基配列を、宿主の発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換することにより、該蛋白質の生産率を向上させることができる。
該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換え体ＤＮＡを作製する。
【００３０】
該組換え体ＤＮＡを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、本発明の製造法で用いる形質転換体を得ることができる。
宿主細胞としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞等、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、本発明の製造法に用いられるＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
【００３１】
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ（以下、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンターゼをコードするＤＮＡとも言う）を含有する組換え体ＤＮＡは原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンターゼをコードするＤＮＡ、転写終結配列より構成された組換え体ＤＮＡであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００３２】
発現ベクターとしては、pHelix1（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）、pKK233-2（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）、pSE280（インビトロジェン社製）、pGEMEX-1（プロメガ社製）、pQE-8（キアゲン社製）、pET-3（ノバジェン社製）、pKYP10（特開昭58-110600）、pKYP200（Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)）、pLSA1（Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)）、pGEL1（Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 4306 (1985)）、pBluescriptII SK(+)、pBluescript II KS(-)（ストラタジーン社製）、pTrS30（大腸菌JM109/pTrS30(FERM BP-5407)より調製）、pTrS32（大腸菌JM109/pTrS32(FERM BP-5408)より調製）、pPAC31 (WO98/12343)、pUC19（Gene, 33, 103 (1985)）、pSTV28(タカラバイオ社製)、pUC118（タカラバイオ社製）、pPA1（特開昭63-233798）等を例示することができる。
【００３３】
プロモーターとしては、大腸菌等の宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよい。例えば、trpプロモーター（Ｐtrp）、lacプロモーター（Ｐlac）、ＰLプロモーター、ＰRプロモーター、ＰSEプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等をあげることができる。またＰtrpを２つ直列させたプロモーター（Ｐtrp ×２）、tacプロモーター、lacT7プロモーター、let Iプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
【００３４】
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
組換え体ＤＮＡには、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンターゼをコードするＤＮＡを発現させるための転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
【００３５】
原核生物としては、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス属等に属する微生物、例えば、Escherichia coli XL1-Blue、Escherichia coli XL2-Blue、Escherichia coli DH1、Escherichia coli NM522、Escherichia coli MC1000、Escherichia coli KY3276、Escherichia coli W1485、Escherichia coli JM109、Escherichia coli HB101、Escherichia coli No.49、Escherichia coli W3110、Escherichia coli NY49、Escherichia coli HN0074 (FERM BP-4425)、Serratia ficaria、Serratia fonticola、Serratia liquefaciens、Serratia marcescens、Bacillus subtilis、Bacillus amyloliquefaciens、Brevibacterium immariophilum ATCC14068、Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066、Corynebacterium ammoniagenes、Corynebacterium glutamicum ATCC13032、Corynebacterium glutamicum ATCC14067、Corynebacterium glutamicum ATCC13869、Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870、Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354、Pseudomonas sp. D-0110等をあげることができる。
【００３６】
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法（Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)）、プロトプラスト法（特開昭63-248394）、エレクトロポレーション法（Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)）等をあげることができる。
酵母菌株を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、YEp13（ATCC37115）、YEp24（ATCC37051）、YCp50（ATCC37419）、pHS19、pHS15等を用いることができる。
【００３７】
プロモーターとしては、酵母菌株中で機能するものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、gal 1プロモーター、gal 10プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、MFα1 プロモーター、CUP 1プロモーター等のプロモーターをあげることができる。
宿主細胞としては、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、クルイベロミセス属、トリコスポロン属、シワニオミセス属、ピチア属、キャンディダ属等に属する酵母菌株をあげることができ、具体的には、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Kluyveromyces lactis、Trichosporon pullulans、Schwanniomyces alluvius、Pichia pastoris、Candida utilis等をあげることができる。
【００３８】
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法（Methods Enzymol., 194, 182 (1990)）、スフェロプラスト法（Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81, 4889 (1984)）、酢酸リチウム法（J. Bacteriol., 153, 163 (1983)）等をあげることができる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、pcDNA1.1、pcDNA1.1/Amp、pCDM8、pREP4（以上、インビトロジェン社）、pAGE107（特開平3-22979）、pAS3-3（特開平2-227075）、pAGE103（J. Biochem., 101, 1307 (1987)）、pAGE210、pAMo、pAMoA等を用いることができる。
【００３９】
プロモーターとしては、動物細胞中で機能するものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（CMV）のIE（immediate early）遺伝子のプロモーター、SV40の初期プロモーターあるいはメタロチオネインのプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトCMVのIE遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
【００４０】
宿主細胞としては、マウス・ミエローマ細胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ細胞、ヒトの細胞であるナマルバ（Namalwa）細胞またはNamalwa KJM-1細胞、ヒト胎児腎臓細胞、ヒト白血病細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるCHO細胞、HBT5637（特開昭63-299）等をあげることができる。
マウス・ミエローマ細胞としては、SP2/0、NSO等、ラット・ミエローマ細胞としてはYB2/0等、ヒト胎児腎臓細胞としてはHEK293(ATCC: CRL-1573)等、ヒト白血病細胞としては、BALL-1等、アフリカミドリザル腎臓細胞としてはCOS-1、COS-7等をあげることができる。
【００４１】
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法(Cytotechnology, 3, 133 (1990))、リン酸カルシウム法（特開平2-227075）、リポフェクション法（Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 7413 (1987)）、Virology, 52, 456 (1973)に記載の方法等をあげることができる。
【００４２】
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばBaculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992)、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Molecular Biology, A Laboratory Manual、Bio/Technology, 6, 47 (1988)等に記載された方法によって、蛋白質を発現することができる。
【００４３】
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、蛋白質を発現させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、pVL1392、pVL1393、pBlueBacIII（ともにインビトロジェン社製）等をあげることができる。
【００４４】
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus) 等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞、Trichoplusia niの卵巣細胞、カイコ卵巣由来の培養細胞等を用いることができる。
【００４５】
Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞としてはSf9、Sf21（バキュロウイルス・イクスプレッション・ベクターズ ア・ラボラトリー・マニュアル）等、Trichoplusia niの卵巣細胞としてはHigh 5、BTI-TN-5B1-4（インビトロジェン社製）等、カイコ卵巣由来の培養細胞としてはBombyx mori N4等をあげることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平2-227075）、リポフェクション法(Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 7413 (1987))等をあげることができる。
【００４６】
植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等をあげることができる。
プロモーターとしては、植物細胞中で機能するものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）の35Sプロモーター、イネアクチン１プロモーター等をあげることができる。
【００４７】
宿主細胞としては、タバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファルファ、イネ、コムギ、オオムギ等の植物細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Agrobacterium）（特開昭59-140885、特開昭60-70080、WO94/00977）、エレクトロポレーション法（特開昭60-251887）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許第2606856、特許第2517813）等をあげることができる。
【００４８】
また特に、本発明のＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの製造法およびＮ‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造法には、Ｎ‐アセチルノイラミン酸の分解活性が低下した微生物細胞を用いるのが好ましい。そのような微生物としては、例えばＮ‐アセチルノイラミン酸リアーゼ活性が低下した微生物をあげることができ、具体的には、Escherichia coli NAN8-71 (FERM BP-7908, WO03/72783)をあげることができる。
【００４９】
また、公知の方法によりＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを微生物の染色体に挿入することにより(J. Bacteriol., 180, 2063 (1998))、本発明の製造法で用いる微生物を作製することができる。
（２）ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物の調製
本発明の製造法に用いられるＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物を培地に培養する方法は、微生物の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
【００５０】
ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有するエシェリヒア・コリ等の原核生物あるいは酵母等を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類等を用いることができる。
【００５１】
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化物等を用いることができる。
【００５２】
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は15〜40℃がよく、培養時間は、通常5時間〜7日間である。培養中pHは3.0〜9.0に保持する。pHの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
【００５３】
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
【００５４】
ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する動物細胞を培養する培地としては、一般に使用されているRPMI1640培地(J. Am. Med. Assoc., 199, 519 (1967))、EagleのMEM培地(Science, 122, 501 (1952))、DMEM培地(Virology, 8, 396 (1959))、199培地(Proc. Soc. Biol. Med., 73, 1 (1950))またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。
【００５５】
培養は、通常pH6〜8、25〜40℃、5％ＣＯ2存在下等の条件下で1〜7日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する昆虫細胞を培養する培地としては、一般に使用されているTNM-FH培地(ファーミンジェン社製)、Sf-900 II SFM培地（ライフ・テクノロジーズ社製）、ExCell400、ExCell405(いずれもJRHバイオサイエンシーズ社製)、Grace's Insect Medium(Nature, 195, 788 (1962))等を用いることができる。
【００５６】
培養は、通常pH6〜7、25〜30℃等の条件下で1〜5日間行う。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する植物細胞は、細胞として、または植物の細胞や器官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ(MS)培地、ホワイト(White)培地、またはこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。
【００５７】
培養は、通常pH5〜9、20〜40℃の条件下で3〜60日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
（３）ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの製造
１）ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの製造１
上記（２）の培養により得られた微生物の培養物および該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、ＣＴＰまたはＣＴＰ前駆物質（I）およびＮ‐アセチルノイラミン酸を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃを生成、蓄積させ、該水性媒体中にＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃを製造することができる。
【００５８】
培養物の処理物としては、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物あるいは該菌体の固定化物など、細胞の状態を維持し、上記した微生物の培養物と実質的に同一の活性を有している培養物の処理物が用いられる。
【００５９】
ＣＴＰ前駆物質（I）としては、ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物が代謝してＣＴＰに変換できる物質であればいずれでもよく、好ましくは、ウラシル、オロチジン、ウリジン、シトシン、シチジン、ウリジン‐５´‐一リン酸（以下ＵＭＰと略す）、ウリジン‐５´‐三リン酸（以下ＵＴＰと略す）およびＣＭＰをあげることができ、微生物が大腸菌の場合は、シチジン、ＵＴＰおよびＣＭＰ、好ましくはＣＭＰをあげることができる。
【００６０】
水性媒体としては、水、りん酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ほう酸塩、クエン酸塩、トリスなどの緩衝液、メタノール、エタノールなどのアルコール類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類、アセトアミドなどのアミド類などをあげることができる。また、酵素源として用いた微生物の培養液を水性媒体として用いることができる。
ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの生成において、必要に応じて界面活性剤あるいは有機溶媒を添加してもよい。界面活性剤としては、ポリオキシエチレン・オクタデシルアミン（例えばナイミーンS-215、日本油脂社製）などの非イオン系界面活性剤、セチルトリメチルアンモニウム・ブロマイドやアルキルジメチル・ベンジルアンモニウムクロライド（例えばカチオンF2-40E、日本油脂社製）などのカチオン系界面活性剤、ラウロイル・ザルコシネートなどのアニオン系界面活性剤、アルキルジメチルアミン（例えば三級アミンFB、日本油脂社製）などの三級アミン類など、ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの生成を促進するものであればいずれでもよく、１種または数種を混合して使用することもできる。界面活性剤は、通常0.1〜50 g/lの濃度で用いられる。有機溶剤としては、キシレン、トルエン、脂肪族アルコール、アセトン、酢酸エチルなどがあげられ、通常0.1〜50 ml/lの濃度で用いられる。
【００６１】
ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの生成反応は水性媒体中、pH 5〜7.5、好ましくはpH 6.5〜7.5、20〜50℃の条件で1〜96時間行う。該生成反応において、必要に応じてＭｎＣｌ2、ＭｇＣｌ2、ＭｇＳＯ４等の無機塩、補酵素、フィチン酸等を添加することができる。
ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの製造に用いられるＣＴＰまたはＣＴＰ前駆物質（I）は、ＣＴＰ前駆物質（II）からＣＴＰまたはＣＴＰ前駆物質（I）を生産する能力を有する原核生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、エネルギー供与体およびＣＴＰ前駆物質（II）を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でＣＴＰまたはＣＴＰ前駆物質（I）を生成、蓄積させることによっても得ることができる。
【００６２】
ＣＴＰ前駆物質（II）としては、原核生物が代謝してＣＴＰまたはＣＴＰ前駆物質（I）に変換できる物質であればいずれでもよく、好ましくはオロット酸、ウラシル、オロチジン、ウリジン、シトシン、シチジン、ＣＭＰ、ＵＴＰおよびＵＭＰをあげることができ、より好ましくはオロット酸およびＣＭＰ、さらに好ましくはオロット酸をあげることができる。
【００６３】
ＣＴＰ前駆物質（II）からＣＴＰまたはＣＴＰ前駆物質（I）を生産する能力を有する原核生物としては、該能力を有する原核生物であれば特に制限はないが、好ましくはコリネバクテリウム属に属する原核生物、より好ましくはコリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）を用いるのがよい。
ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの製造に用いるＣＴＰまたはＣＴＰ前駆物質（I）は特に制限はなく、市販のＣＴＰまたはＣＴＰ前駆物質（I）を用いてもよいし、予め上記の方法で媒体中に生成、蓄積させ、該媒体中から採取することによって得られたＣＴＰまたはＣＴＰ前駆物質（I）を用いてもよい。また、ＣＴＰまたはＣＴＰ前駆物質（I）が生成、蓄積した上記の媒体をそのままＣＴＰまたはＣＴＰ前駆物質（I）として用いることもできる。さらにＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃを生成する反応とＣＴＰ前駆物質（II）からＣＴＰまたはＣＴＰ前駆物質（I）を生産する反応を同一媒体中で同時に行うことにより、同一水性媒体中でＣＴＰまたはＣＴＰ前駆物質（I）を生成させるとともに、ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃを生産することもできる。
【００６４】
ＣＴＰ前駆物質（II）からＣＴＰまたはＣＴＰ前駆物質（I）を生産する能力を有する原核生物の培養は（１）に記載の形質転換体の培養と同様の方法で行うことができる。
ＣＴＰ前駆物質（II）からＣＴＰまたはＣＴＰ前駆物質（I）を生産する能力を有する原核生物の処理物としては、前記した培養物の処理物と同じものをあげることができる。
ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの製造に用いるＣＴＰ、ＣＴＰ前駆物質（I）および（II）は、１ｍｍｏｌ／ｌ〜１ｍｏｌ／ｌの範囲で用いる。
【００６５】
ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの製造に用いるエネルギー供与体としては、微生物または原核生物が代謝することができ、かつアデノシン‐５´‐三リン酸（以下ＡＴＰと略す）などのエネルギー物質を生産させることができる物質であればいずれでもよく、例えばグルコース、フルクトース、シュークロース、ラクトース、マルトース、マンニトール、ソルビトール、Ｎ‐アセチルノイラミン酸等の炭水化物、ピルビン酸、乳酸、酢酸等の有機酸、グリシン、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸等のアミノ酸、糖蜜、澱粉加水分解物等をあげることができる。
【００６６】
ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの製造に用いるエネルギー供与体はいずれも、５ｍｏｌ／ｌ以下で用いることが好ましい。
ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの製造に用いるＮ‐アセチルノイラミン酸としては、市販品または微生物を用いて製造されたものなどいずれでもよく、好ましくはＮ‐アセチルグルコサミンからＮ‐アセチルノイラミン酸を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用いて製造したＮ‐アセチルノイラミン酸をあげることができる。
【００６７】
Ｎ‐アセチルグルコサミンからＮ‐アセチルノイラミン酸を生産する能力を有する微生物は、該能力を有する微生物であれば特に制限はないが、Ｎ‐アセチルグルコサミン‐２‐エピメラーゼを生産する能力を有する微生物およびＮ‐アセチルノイラミン酸シンターゼを生産する能力を有する微生物の２つの微生物の組み合せ、またはＮ‐アセチルグルコサミン‐２‐エピメラーゼおよびＮ‐アセチルノイラミン酸シンターゼを生産する能力を有する微生物をあげることができる。
【００６８】
上記した微生物としては、Ｎ‐アセチルグルコサミン‐２‐エピメラーゼをコードするＤＮＡおよび／またはＮ‐アセチルノイラミン酸シンターゼをコードするＤＮＡで形質転換された微生物をあげることができる。
Ｎ‐アセチルグルコサミン‐２‐エピメラーゼをコードするＤＮＡで形質転換された微生物およびＮ‐アセチルノイラミン酸シンターゼをコードするＤＮＡで形質転換された微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用いる時は、それぞれの微生物の培養物または該培養物の処理物の混合物を酵素源として用いてもよい。
【００６９】
Ｎ‐アセチルグルコサミン‐２‐エピメラーゼをコードするＤＮＡおよび／またはＮ‐アセチルノイラミン酸シンターゼをコードするＤＮＡで形質転換された微生物としては、該酵素をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡを保持する微生物、該酵素をコードするＤＮＡが染色体に挿入された微生物等があげられる。
Ｎ‐アセチルグルコサミン‐２‐エピメラーゼをコードするＤＮＡおよび／またはＮ‐アセチルノイラミン酸シンターゼをコードするＤＮＡで形質転換された微生物は、（１）に記載の方法に準じ、それぞれのＤＮＡの塩基配列に基づき取得することができる。また、該微生物の培養物は、（２）に記載の方法に準じて取得することができる。
【００７０】
Ｎ‐アセチルグルコサミン‐２‐エピメラーゼをコードするＤＮＡおよび／またはＮ‐アセチルノイラミン酸シンターゼをコードするＤＮＡで形質転換された微生物の培養物の処理物としては、前記した培養物の処理物と同じものをあげることができる。
Ｎ‐アセチルグルコサミン‐２‐エピメラーゼをコードするＤＮＡおよび／またはＮ‐アセチルノイラミン酸シンターゼをコードするＤＮＡで形質転換された微生物としては、例えばSynechocystis sp. PCC6803株由来のＮ‐アセチルグルコサミン‐２‐エピメラーゼをコードするＤＮＡおよびEscherichia coli由来のＮ‐アセチルノイラミン酸シンターゼをコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡであるpLT4を導入されたEscherichia coli NAN8-71/pLT4（WO03/72783）等があげられる。
【００７１】
[Ａ]の（２）と同様の方法によりＮ−アセチルグルコサミンからＮ−アセチルノイラミン酸を生産する能力を有する微生物を培養し、得られた培養物または該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、Ｎ‐アセチルグルコサミンおよびエネルギー供与体を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＮ‐アセチルノイラミン酸を生成、蓄積させることができる。
【００７２】
Ｎ‐アセチルグルコサミンからＮ‐アセチルノイラミン酸を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用いて得られるＮ‐アセチルノイラミン酸をＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの製造のための基質に用いるときは、上記の媒体中に生成、蓄積したＮ‐アセチルノイラミン酸を採取して用いてもよいし、Ｎ‐アセチルノイラミン酸が生成、蓄積した媒体をそのままＮ‐アセチルノイラミン酸として用いてもよい。
【００７３】
反応溶液からのＮ‐アセチルノイラミン酸の採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法によって行うことができる。
ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの製造に用いるＮ−アセチルノイラミン酸は、１ｍｍｏｌ／ｌ〜３ｍｏｌ／ｌの範囲で、好ましくは１０〜５００ｍｍｏｌ／ｌの範囲で用いる。
ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの生成に用いる各酵素源はいずれも、培養物を遠心分離して得られる菌体の湿重量にして１〜５００ｇ／ｌ、好ましくは５０〜３００ｇ／ｌで用いる。
【００７４】
水性媒体中に生成したＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの分離定量はＨＰＬＣを用いて公知の方法に従って行うことができる(WO98/12343)。
反応液中に生成したＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法によって行うことができる。
２）ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの製造２
Ｎ‐アセチルグルコサミン‐２‐エピメラーゼ、Ｎ‐アセチルノイラミン酸シンターゼおよび本発明で用いられるＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する一つの微生物またはこれらの蛋白質を生産する能力を任意の組み合わせですべて有する複数の微生物の培養物もしくは該培養物の処理物、およびＣＴＰ前駆物質（II）からＣＴＰまたはＣＴＰ前駆物質（I）を生産する能力を有する原核生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、ＣＴＰ前駆物質（II）、Ｎ‐アセチルグルコサミンおよびエネルギー供与体を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃを生成、蓄積させることができる。
【００７５】
Ｎ‐アセチルグルコサミン‐２‐エピメラーゼを生産する能力、Ｎ‐アセチルノイラミン酸シンターゼを生産する能力および本発明で用いられるＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を任意の組み合わせですべて有する複数の微生物としては、上記能力から選ばれる１つ以上の能力を有する微生物、前記で選択されなかった能力を１つ以上有する微生物、前記２つの微生物が有していない残りの能力のうち１つ以上の能力を有する微生物からなる複数の微生物をあげることができる。
【００７６】
Ｎ‐アセチルグルコサミン‐２‐エピメラーゼ、Ｎ‐アセチルノイラミン酸シンターゼおよび本発明で用いられるＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する一つの微生物またはこれらの蛋白質を生産する能力を任意の組み合わせですべて有する複数の微生物としては、上記の酵素または蛋白質をコードするＤＮＡで形質転換された１つまたは複数の微生物があげられる。
【００７７】
上記した微生物、および該微生物の培養物は、（１）および（２）に記載の方法に準じ、それぞれ取得することができる。
上記した微生物の培養物の処理物としては、１）に記載の培養物の処理物と同じものをあげることができる。
ＣＴＰ前駆物質（II）からＣＴＰまたはＣＴＰ前駆物質（I）を生産する能力を有する原核生物としては、１）に記載の原核生物をあげることができる。
【００７８】
ＣＴＰ前駆物質（II）からＣＴＰまたはＣＴＰ前駆物質（I）を生産する能力を有する原核生物の培養は（１）に記載の形質転換体の培養と同様の方法で行うことができる。
ＣＴＰ前駆物質（II）からＣＴＰまたはＣＴＰ前駆物質（I）を生産する能力を有する原核生物の培養物の処理物としては、１）に記載の培養物の処理物と同じものをあげることができる。
【００７９】
ＣＴＰ前駆物質（II）としては、１）に記載のＣＴＰ前駆物質（II）と同じものを用いることができ、１ｍｍｏｌ／ｌ〜１ｍｏｌ／ｌの範囲で用いることができる。
ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの製造法で用いられる水性媒体は、１）に記載のものと同じものを用いることができる。
ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの製造法において、必要に応じて界面活性剤あるいは有機溶媒を添加してもよく、１）に記載の界面活性剤あるいは有機溶媒と同じものを、いずれも同様の濃度で用いることができる。
【００８０】
ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの製造法において、ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの生成反応は、水性媒体中、ｐＨ５〜７．５、好ましくはｐＨ６．５〜７．５、２０〜５０℃の条件で１〜９６時間行う。該生成反応において、必要に応じてＭｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４等の無機塩、補酵素、フィチン酸等を添加することができる。
ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの製造法において用いるエネルギー供与体は、１）に記載のものと同じものを、同様の濃度で用いることができる。
【００８１】
ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの製造に用いるＮ‐アセチルグルコサミンは、特に制限はなく、市販品や微生物を利用して生産したもの(Metab. Eng., 7, 201(2005)) などを用いることができる。
ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの製造に用いるＮ‐アセチルグルコサミンは、１ｍｍｏｌ／ｌ〜３ｍｏｌ／ｌの範囲で、好ましくは１０〜５００ｍｍｏｌ／ｌの範囲で用いる。
【００８２】
ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの生成に用いる各酵素源はいずれも、培養物を遠心分離して得られる菌体の湿重量にして１〜５００ｇ／ｌ、好ましくは５０〜３００ｇ／ｌで用いる。
水性媒体中に生成したＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの分離定量はＨＰＬＣを用いて公知の方法(WO98/12343)に従って行うことができる。
反応液中に生成したＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法によって行うことができる。
３）ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの製造３
Ｎ‐アセチルグルコサミン‐２‐エピメラーゼを生産する能力、Ｎ‐アセチルノイラミン酸シンターゼを生産する能力、ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質を生産する能力およびＣＴＰ前駆物質（I）からＣＴＰを生産する能力を持っている１つの原核生物、またはこれらの能力を任意の組み合わせですべて有する複数の原核生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、エネルギー供与体、ＣＴＰ前駆物質（I）およびＮ‐アセチルグルコサミンを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃを生成、蓄積させることもできる。
【００８３】
Ｎ‐アセチルグルコサミン‐２‐エピメラーゼを生産する能力、Ｎ‐アセチルノイラミン酸シンターゼを生産する能力、ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質を生産する能力およびＣＴＰ前駆物質（I）からＣＴＰを生産する能力を任意の組み合わせですべて有する複数の原核生物としては、上記能力から選ばれる１つ以上の能力を有する原核生物、前記で選択されなかった能力を１つ以上有する原核生物、前記２つの原核生物が有していない残りの能力のうち１つ以上の能力を有する原核生物、および前記３つの原核生物が有していない残りの能力を有する原核生物からなる複数の原核生物をあげることができる。
【００８４】
Ｎ‐アセチルグルコサミン‐２‐エピメラーゼを生産する能力、Ｎ‐アセチルノイラミン酸シンターゼを生産する能力、ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質を生産する能力およびＣＴＰ前駆物質（I）からＣＴＰを生産する能力を持っている１つの原核生物としては、例えば、ＣＴＰ前駆物質（I）からＣＴＰを生産する能力を持っている原核生物であって、かつＮ‐アセチルグルコサミン‐２‐エピメラーゼ、Ｎ‐アセチルノイラミン酸シンターゼおよびＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡで形質転換された原核生物をあげることができる。
【００８５】
Ｎ‐アセチルグルコサミン‐２‐エピメラーゼを生産する能力、Ｎ‐アセチルノイラミン酸シンターゼを生産する能力、ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質を生産する能力およびＣＴＰ前駆物質（I）からＣＴＰを生産する能力を任意の組み合わせですべて有する複数の原核生物としては、ＣＴＰ前駆物質（I）からＣＴＰを生産する能力を有する原核生物であって、かつＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡで形質転換された原核生物、ならびにＮ‐アセチルグルコサミン‐２‐エピメラーゼをコードするＤＮＡおよびＮ‐アセチルノイラミン酸シンターゼをコードするＤＮＡで形質転換された原核生物をあげることができる。
【００８６】
該原核生物は、ＣＴＰ前駆物質（I）からＣＴＰを生産する能力を持っている原核生物を宿主として用い、（１）に記載の方法に準じ、それぞれのＤＮＡの塩基配列に基づいて取得することができる。
ＣＴＰ前駆物質（I）からＣＴＰを生産する能力を持っている原核生物としては、該能力を有する原核生物であれば特に制限はないが、好ましくはエシェリヒア属またはコリネバクテリウム属に属する原核生物、より好ましくはEshcerichia coliまたはCorynebacterium ammoniagenes、さらに好ましくはEshcerichia coliをあげることができる。
【００８７】
また、該原核生物の培養物は、（２）に記載の方法に準じて取得することができる。
該培養物の処理物としては、１）に記載の培養物の処理物と同じものをあげることができる。
ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの製造法に用いるＣＴＰ前駆物質（I）としては、１）に記載のＣＴＰ前駆物質（I）と同じものを同様の濃度で用いることができる。
【００８８】
ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの製造法に用いる水性媒体としては、１）に記載の水性媒体と同じものを用いることができる。
ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの製造法において、必要に応じて界面活性剤あるいは有機溶媒を添加してもよく、１）に記載の界面活性剤あるいは有機溶媒と同じものを、いずれも同様の濃度で用いることができる。
【００８９】
ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの製造法において、ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの生成反応は、水性媒体中、ｐＨ５〜７．５、好ましくはｐＨ６．５〜７．５、２０〜５０℃の条件で１〜９６時間行う。該生成反応において、必要に応じてＭｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４等の無機塩、補酵素、フィチン酸等を添加することができる。
ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの製造法において用いるエネルギー供与体は、１）に記載のものと同じものを、同様の濃度で用いることができる。
【００９０】
ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの製造に用いるＮ‐アセチルグルコサミンは、特に制限はなく、市販品や微生物を利用して生産したもの(Metab. Eng., 7, 201(2005))などを用いることができ、１ｍｍｏｌ／ｌ〜３ｍｏｌ／ｌの範囲で、好ましくは１０〜５００ｍｍｏｌ／ｌの範囲で用いる。
ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの生成に用いる各酵素源はいずれも、培養物を遠心分離して得られる菌体の湿重量にして１〜５００ｇ／ｌ、好ましくは５０〜３００ｇ／ｌで用いる。
【００９１】
水性媒体中に生成したＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの分離定量はＨＰＬＣを用いて公知の方法(WO98/12343)に従って行うことができる。
反応液中に生成したＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法によって行うことができる。
[Ｂ]Ｎ‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造
（１）シアリルトランスフェラーゼを生産する能力を有する微生物の作製
本発明の方法で使用するシアリルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物は、該能力を有する微生物であれば特に制限されないが、該微生物としては、人為的な操作を行わなくてもシアリルトランスフェラーゼを生産する能力を有している微生物と、シアリルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡで形質転換された微生物をあげることができる。
【００９２】
人為的な操作を行わなくてもシアリルトランスフェラーゼを生産する能力を有する微生物としては、パスツレラ属に属する微生物、例えばPasteurella multocida PM70株（ミネソタ大学より分譲可能）があげられる。
シアリルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡで形質転換された微生物としては、例えばPasteurella multocidaのpm0188で特定される塩基配列を有するＤＮＡ(WO03/27297)を適当な発現ベクターに挿入した組換え体ＤＮＡで形質転換された微生物、該塩基配列を有するＤＮＡを染色体上に挿入された微生物があげられる。該塩基配列を有するＤＮＡで形質転換された微生物は、その塩基配列に基づき[Ａ]の（１）および（２）に記載の方法に準じて同様に調製することができる。
（２）Ｎ‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造
１）Ｎ‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造１
上記［Ｂ］の（１）で得られるシアリルトランスフェラーゼを生産する能力を有する微生物の培養物は［Ａ］の（２）に記載の方法に従い調製することができる。
【００９３】
得られた培養物または該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、［Ａ］の（３）のいずれかの方法で得られるＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃおよび受容体糖質を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＮ‐アセチルノイラミン酸含有糖質を生成、蓄積させることができる。
Ｎ‐アセチルノイラミン酸含有糖質を製造する際に用いるＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃは、本発明の方法で製造したＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃであればよく、ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃが生成、蓄積した媒体中から採取したＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃを用いてもよいし、ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃが生成、蓄積した媒体をそのままＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃとして用いてもよい。
【００９４】
Ｎ‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造において用いられる受容体糖質としては、シアリルトランスフェラーゼの基質になるものであれば、オリゴ糖、多糖、ならびに糖蛋白質および糖脂質等の複合糖質などいずれでもよい。
オリゴ糖または多糖としては、非還元末端にガラクトースを有するオリゴ糖または多糖、あるいは非還元末端にＮ‐アセチルノイラミン酸を有するオリゴ糖または多糖をあげることができ、好ましくは非還元末端にラクトース、グロボトリオース、Ｎ‐アセチルラクトサミン、ラクト‐Ｎ‐テトラオース、ラクト‐Ｎ‐ネオテトラオース、ルイスaおよびルイスＸからなる群より選ばれる構造を有するオリゴ糖、または非還元末端にNeuAcα2-Galβ1-4GlcおよびNeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAcからなる群より選ばれる構造を有するオリゴ糖、より好ましくはラクトースをあげることができる。
【００９５】
複合糖質としては、非還元末端にガラクトースまたはＮ‐アセチルノイラミン酸を有する複合糖質をあげることができる。
Ｎ−アセチルノイラミン酸含有糖質の製造に用いる受容体糖質は、１ｍｍｏｌ／ｌ〜３ｍｏｌ／ｌ、好ましくは５０ｍｍｏｌ／ｌ〜１ｍｏｌ／ｌの範囲で用いる。
本発明のＮ−アセチルノイラミン酸含有糖質の製造法で生産されるＮ‐アセチルノイラミン酸含有糖質としては、受容体糖質にＮ‐アセチルノイラミン酸が付加した糖質、具体的には非還元末端にＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、ＮｅｕＡｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃおよびＮｅｕＡｃα２−８ＮｅｕＡｃからなる群より選ばれる構造を有するオリゴ糖を含む糖質をあげることができ、好ましくは３´‐シアリルラクトースまたは６´‐シアリルラクトースをあげることができる。
【００９６】
Ｎ‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造に用いるシアリルトランスフェラーゼを生産する能力を有する微生物の培養物の処理物としては、[Ａ］‐（３）の１）に記載の培養物の処理物と同じものをあげることができる。
Ｎ‐アセチルノイラミン酸含有糖質を製造する際に用いる水性媒体、界面活性剤および有機溶媒は、［Ａ］の（３）に記載のＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの製造方法に準じた方法で用いることができる。
【００９７】
Ｎ‐アセチルノイラミン酸含有糖質を製造する際の、ｐＨ、温度および時間等の条件については、［Ａ］の（３）に記載のＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの製造方法に準じた方法で用いることができる。
Ｎ−アセチルノイラミン酸含有糖質を製造する反応において、必要に応じてＭｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４等の無機塩、補酵素、フィチン酸等を添加することができる。
【００９８】
Ｎ−アセチルノイラミン酸含有糖質の製造に用いる各酵素源はいずれも、培養物を遠心分離して得られる菌体の湿重量にして１〜５００ｇ／ｌ、好ましくは５０〜３００ｇ／ｌの濃度で用いる。
水性媒体中に生成したＮ‐アセチルノイラミン酸含有糖質の分離定量はDionex社製の糖分析装置などを用いて行うことができる(Anal. Biochem., 189, 151 (1990))。
【００９９】
水性媒体中に生成したＮ‐アセチルノイラミン酸含有糖質の採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法によって行うことができる。
２）Ｎ‐アセチルノイラミン酸含有複合等質の製造２
ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質とシアリルトランスフェラーゼとを生産する能力を有する微生物、またはそれぞれの蛋白質を生産する能力を有する２種の微生物の培養物もしくは該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、Ｎ‐アセチルノイラミン酸および受容体糖質を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でＮ‐アセチルノイラミン酸含有糖質を生成、蓄積させ、該水性媒体中からＮ‐アセチルノイラミン酸含有糖質を採取することによりＮ‐アセチルノイラミン酸含有糖質を製造することもできる。
【０１００】
ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質およびシアリルトランスフェラーゼを生産する能力を有する微生物は、［Ａ］の（１）に準じた方法でそれぞれの蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列に基づいて作製することができ、該微生物の培養物は、［Ａ］の（２）に準じた方法で該微生物を培養することにより得ることができる。
ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質とシアリルトランスフェラーゼとを生産する能力を有する微生物、またはそれぞれの蛋白質を生産する能力を有する２種の微生物の培養物もしくは該培養物の処理物を酵素源として、Ｎ‐アセチルノイラミン酸含有糖質を製造するときは、必要に応じて媒体中にエネルギー供与体を加えてもよい。
【０１０１】
上記したエネルギー供与体は、微生物細胞内で代謝されてＡＴＰを生成することができる物質であればよく、具体的にはグルコース、フルクトース、シュークロース、ラクトース、マルトース、マンニトール、ソルビトール等の炭水化物、ピルビン酸、乳酸、酢酸等の有機酸、グリシン、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸等のアミノ酸、糖蜜、澱粉加水分解物等をあげることができる。
【０１０２】
Ｎ−アセチルノイラミン酸含有糖質の製造に用いるエネルギー供与体はいずれも、５ｍｏｌ／ｌ以下の濃度で用いることが好ましい。
Ｎ‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造に用いるＮ‐アセチルノイラミン酸は、市販品や、Ｎ−アセチルグルコサミンからＮ−アセチルノイラミン酸を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、Ｎ‐アセチルグルコサミンおよびエネルギー供与体を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＮ‐アセチルノイラミン酸を生成、蓄積させることにより製造したＮ‐アセチルノイラミン酸など、特に制限はない。
【０１０３】
また、Ｎ‐アセチルグルコサミンからＮ‐アセチルノイラミン酸を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源として製造したＮ‐アセチルノイラミン酸を用いるときは、媒体中に生成、蓄積したＮ‐アセチルノイラミン酸を分離精製して用いてもよいし、Ｎ‐アセチルノイラミン酸の生成、蓄積した媒体を、Ｎ‐アセチルノイラミン酸として用いてもよい。
【０１０４】
受容体糖質としては、［Ｂ］の（２）の１）の方法と同じ受容体糖質を用いることができ、またこの方法で生産されるＮ‐アセチルノイラミン酸含有糖質は、［Ｂ］の（２）の１）に記載のＮ‐アセチルノイラミン酸含有糖質と同じＮ‐アセチルノイラミン酸含有糖質である。
上記した微生物の培養物は、［Ａ］の（２）に記載の方法に準じて取得することができる。
【０１０５】
該培養物の処理物としては、［Ａ］‐（３）の１）に記載の培養物の処理物と同じものをあげることができる。
Ｎ‐アセチルノイラミン酸含有糖質を製造する際に用いる水性媒体あるいは界面活性剤または有機溶媒については、［Ａ］の（３）に記載のＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの製造方法に準じた方法で用いることができる。
【０１０６】
Ｎ‐アセチルノイラミン酸含有糖質を製造する際の、ｐＨ、温度または時間等の条件については、［Ａ］の（３）に記載のＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの製造方法に準じた方法で行うことができる。
Ｎ‐アセチルノイラミン酸含有糖質を製造する反応において、必要に応じてＭｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４等の無機塩、補酵素、フィチン酸等を添加することができる。
【０１０７】
Ｎ−アセチルノイラミン酸含有糖質の製造に用いる各酵素源はいずれも、培養物を遠心分離して得られる菌体の湿重量にして１〜５００ｇ／ｌ、好ましくは５０〜３００ｇ／ｌの濃度で用いる。
水性媒体中に生成したＮ‐アセチルノイラミン酸含有糖質の分離定量はDionex社製の糖分析装置などを用いて行うことができる(Anal. Biochem., 189, 151 (1990))。
【０１０８】
水性媒体中に生成したＮ‐アセチルノイラミン酸含有糖質の採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法によって行うことができる。
３）Ｎ‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造３
Ｎ‐アセチルノイラミン酸含有糖質は、Ｎ‐アセチルグルコサミン‐２‐エピメラーゼ、Ｎ‐アセチルノイラミン酸シンターゼ、ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質およびシアリルトランスフェラーゼのすべてを生産する能力を持っている１つの微生物、またはこれらの蛋白質を生産する能力を任意の組み合わせですべて有する複数の微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、エネルギー供与体、Ｎ‐アセチルグルコサミンおよび受容体糖質を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でＮ‐アセチルノイラミン酸含有糖質を生成、蓄積させ、該水性媒体中からＮ‐アセチルノイラミン酸含有糖質を採取することによっても製造することができる。
【０１０９】
Ｎ‐アセチルグルコサミン‐２‐エピメラーゼ、Ｎ‐アセチルノイラミン酸シンターゼ、ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質およびシアリルトランスフェラーゼを生産する能力を任意の組み合わせですべて有する複数の微生物としては、上記蛋白質から選ばれる１つ以上の蛋白質を生産する能力を有する微生物、前記で選択されなかった１つ以上の蛋白質を生産する能力を有する微生物、前記２つの微生物が有していない残りの蛋白質のうち１つ以上の蛋白質を生産する能力を有する微生物、および前記３つの微生物が有していない残りの蛋白質を生産する能力を有する微生物からなる複数の微生物をあげることができる。
【０１１０】
Ｎ‐アセチルグルコサミン‐２‐エピメラーゼ、Ｎ‐アセチルノイラミン酸シンターゼ、ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質およびシアリルトランスフェラーゼのすべてを生産する能力を持っている１つの微生物としては、Ｎ‐アセチルグルコサミン‐２‐エピメラーゼをコードするＤＮＡ、Ｎ‐アセチルノイラミン酸シンターゼをコードするＤＮＡ、ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡおよびシアリルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡで形質転換された微生物をあげることができる。
【０１１１】
Ｎ‐アセチルグルコサミン‐２‐エピメラーゼ、Ｎ‐アセチルノイラミン酸シンターゼ、ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質およびシアリルトランスフェラーゼを生産する能力を任意の組み合わせですべて有する複数の微生物としては、例えばＮ‐アセチルグルコサミン‐２‐エピメラーゼをコードするＤＮＡおよびＮ‐アセチルノイラミン酸シンターゼをコードするＤＮＡで形質転換された微生物、並びにＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡおよびシアリルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡで形質転換された微生物をあげることができる。
【０１１２】
上記した微生物は、［Ａ］の（１）に記載の方法に準じてそれぞれの蛋白質をコードする塩基配列に基づいて作製することができ、該微生物の培養物は、［Ａ］の（２）に記載の方法に準じて該微生物を培養し、得ることができる。
上記のＮ‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造法で用いるエネルギー供与体は、微生物細胞内で代謝されてＡＴＰやホスホエノールピルビン酸等に変換される物質であればよく、グルコース、フルクトース、シュークロース、ラクトース、マルトース、マンニトール、ソルビトール等の炭水化物、ピルビン酸、乳酸、酢酸等の有機酸、グリシン、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸等のアミノ酸、糖蜜、澱粉加水分解物等をあげることができ、いずれも、１ｍｍｏｌ／ｌ〜５ｍｏｌ／ｌの濃度で用いる。
【０１１３】
上記のＮ‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造法で用いるＮ‐アセチルグルコサミンは、市販品でも微生物を利用して製造したもの(Metab. Eng., 7, 201(2005))でもよく、また1ｍｍｏｌ／ｌ〜１ｍｏｌ／ｌの濃度で用いる。
上記のＮ‐アセチルノイラミン酸含有糖質を製造する際に用いる受容体糖質としては、［Ｂ］の（２）の１）の方法で用いる受容体糖質と同じものを用いることができ、また上記の方法で製造可能なＮ‐アセチルノイラミン酸含有糖質は、［Ｂ］の（２）の１）と同じＮ‐アセチルノイラミン酸含有糖質である。
【０１１４】
上記製造法で用いられる微生物の培養物は、［Ａ］の（２）に記載の方法に準じて取得することができる。
該培養物の処理物としては、［Ａ］の（３）の１）に記載の培養物の処理物と同じものをあげることができる。
上記のＮ‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造法に用いられる水性媒体あるいは界面活性剤または有機溶媒としては、［Ａ］の（３）に記載したものをあげることができ、当該記載に準じた方法で用いることができる。
【０１１５】
上記のＮ‐アセチルノイラミン酸含有糖質を製造する際の、ｐＨ、温度または時間等の条件としては、［Ａ］の（３）に記載の条件をあげることができる。
Ｎ‐アセチルノイラミン酸含有糖質を製造する反応において、必要に応じてＭｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４等の無機塩、補酵素、フィチン酸等を添加することができる。
上記のＮ‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造に用いる各酵素源はいずれも、培養物を遠心分離して得られる菌体の湿重量にして１〜５００ｇ／ｌ、好ましくは５０〜３００ｇ／ｌの濃度で用いる。
【０１１６】
上記の製造法により水性媒体中に生成したＮ‐アセチルノイラミン酸含有糖質の分離定量はDionex社製の糖分析装置などを用いて行うことができる(Anal. Biochem., 189, 151 (1990))。
水性媒体中に生成したＮ‐アセチルノイラミン酸含有糖質の採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法によって行うことができる。
【０１１７】
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【０１１８】
Pasteurella multocida由来のＣＭＰ-ＮｅｕＡｃシンターゼを使ったＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの生産
（１）Ｎ‐アセチルノイラミン酸リアーゼ遺伝子（nanA）欠損株の調製
Escherichia coli HN0074(FERM BP-4425)の染色体ＤＮＡ上のnanAが欠損した菌株は、ラムダファージの相同組換え系を利用した方法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 6641-6645(2000))を用いて作製した。
【０１１９】
使用するEscherichia coli HN0074(FERM BP-4425)の染色体ＤＮＡは、該微生物を公知の方法によって培養し、培養後カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーに記載の方法により単離精製した。プラスミドpKD46、pKD3およびpCP20は、エシェリヒア・コリ ジェネティックストックセンター（米国エール大学）から該プラスミドを保持するエシェリヒア・コリ株を入手し、該大腸菌から抽出したものを用いた。
【０１２０】
配列番号１３に表されるEscherichia coliのnanA遺伝子を含む塩基配列のうち、塩基番号１〜９５８および１９７１〜２８７４で表される塩基配列からなるＤＮＡ断片をＰＣＲ反応により増幅した。これらの増幅断片を、ｐＫＤ３を鋳型として増幅した、両端にFRT（FLP recognition target）サイトを持つcat（chloramphenicol acetyl transferase）遺伝子断片の両端に連結した。該連結断片を、あらかじめｐＫＤ４６を導入し、λ Red recombinaseを誘導発現させたEscherichia coli HN0074株にエレクトロポレーション法により導入した。該連結断片の導入株を培養し、cat遺伝子が染色体上に組み込まれたクロラムフェニコール耐性株を選択した。該クロラムフェニコール耐性株からｐＫＤ４６を除去した後、ｐＣＰ２０を導入してFLP recombinaseを誘導発現させ培養した後、cat遺伝子が取り除かれたクロラムフェニコール感受性株を選択し、最後にｐＣＰ２０を除去した。
【０１２１】
これらの一連の操作により、Escherichia coli HN0074株の染色体ＤＮＡ上の配列番号１３に表される塩基配列の塩基番号９５９〜１９７０に相当する部分が欠損した大腸菌を取得することができた。
当該nanA欠損株を、Escherichia coli N18-14と名づけた。
（２）発現ベクターpTK31の作製
発現ベクターpTrS32(FERM BP-5408)をPstIおよびHindIIIで酵素消化し、3.5kbのDNA断片を回収し、同様にpKYP10(特開昭58−110600)をPstIおよびHindIIIで酵素消化し、１．０ｋｂの断片を回収した。該３．５ｋｂと１．０ｋｂの断片を連結し、４．５ｋｂのpTrS31を取得した。
【０１２２】
pTrS31をClaIおよびPstIで酵素消化し得られた３．５ｋｂのＤＮＡ断片と、pPAC1(FERM BP-6054, WO 98/12343)をClaIおよびPstIで酵素消化して得られた２．３ｋｂのＤＮＡ断片とを連結し、５．８ｋｂのpNT22を取得した。
配列番号３および４で表される塩基配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてpTrS31を鋳型にＰＣＲを行って得られた３．８ kbのPCR産物をXhoIで酵素消化した。pUC4K（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）をSalIで酵素消化しカナマイシン耐性遺伝子を含む１．３ｋｂのＤＮＡ断片を取得し、上記のXhoI消化ＤＮＡ断片と連結した。
【０１２３】
その後、Stratagene社のSite-directed mutagenesis kitを用いて、カナマイシン耐性遺伝子上のClaIサイト、HindIIIサイトおよびNruIサイトの破壊を行い、４．９ｋｂのpTK31を造成した。
（３）ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ発現株の造成
Pasteurella multocida PM70株の染色体DNAは、ミネソタ大学より分譲されたものを用いた。
【０１２４】
配列番号５および６で表される塩基配列を有する合成ＤＮＡを用いて、Pasteurella multocida PM70株の染色体ＤＮＡより、ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼをコードすると推定されたＯＲＦを含むＤＮＡ断片を下記方法で増幅した。
上記合成ＤＮＡをプライマーセットとして用い、Pasteurella multocida PM70株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲは染色体ＤＮＡ０．１μｇ、プライマー各０．５μｍｏｌ／ｌ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）２．５ｕｎｉｔｓ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液５μｌ、ｄｅｏｘｙＮＴＰ 各２００μｍｏｌ／ｌを含む反応液５０μｌを用い、９８℃で１０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間の工程を３０回繰り返すことにより行った。
【０１２５】
ＰＣＲ反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、目的の断片が増幅されていることを確認後、残りの反応液をＱＩＡ ｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ （ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。各増幅されたＤＮＡ断片の溶出は、滅菌水５０μｌにて行った。
該ＤＮＡ断片をpCR-Blunt vector（インビトロジェン社製）と連結し、該連結反応液を用いて公知の方法によりEscherichia coli DH5α株を形質転換し、得られた形質転換体を５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地［バクトトリプトン（ディフコ社製）１０ｇ／ｌ、酵母エキス（ディフコ社製）１０ｇ／ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／ｌ、アガロース１５ｇ／ｌ］に塗布後、３０℃で一晩培養した。
【０１２６】
生育した形質転換体を５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ液体培地にて３０℃で一晩培養して得られた培養物からクラボウ社製核酸自動分離装置ＰＩ５０を用いてプラスミドを抽出した。
得られたプラスミドに含まれるＰＣＲ増幅断片の塩基配列を常法により決定し、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする、配列番号２で表される塩基配列であることを確認した。
【０１２７】
該プラスミドを制限酵素Csp45I、BamHIにより切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、約０．７ｋｂの断片をGENECLEANII kit（Qbiogene社製）を用いて回収した。同様に、pTK31を制限酵素ClaI、BamHIにより切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、４．６ｋｂの断片を回収した。
該０．７ｋｂと４．６ｋｂの断片とを、ライゲーションキット（タカラバイオ社製）を用いて連結した。連結反応は１６℃で１６時間行った。該連結反応液を用いてEscherichia coli ＤＨ５α株を公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体を５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
【０１２８】
生育した該形質転換体を５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ液体培地にて３０℃で一晩培養して得られた培養物から、クラボウ社製自動核酸分離装置ＰＩ５０を用いてプラスミドを抽出した。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認し、該プラスミドをpMnK1と命名した。
pMnK1を用いてEscherichia coli N18-14株を公知の方法に従って形質転換し、ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼを発現するEscherichia coli N18-14/pMnK1を取得した。
（４）Escherichia coli N18-14/pMnK1湿菌体の取得
実施例１（３）で得たEscherichia coli N18-14/pMnK1株を、カナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むLB培地１２５ｍｌの入った１Ｌ容バッフル付き三角フラスコに接種し、３０℃、２２０ｒｐｍの条件で１０時間培養した。該培養液１２５ｍｌを、カナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＴＢ＋Ｇｌｃ培地［グルコース１０ｇ／ｌ（別殺菌）、バクトトリプトン（ディフコ社製）１２ｇ／ｌ、酵母エキス（ディフコ社製）２４ｇ／ｌ、KH2PO4２．３ｇ／ｌ（別殺菌）、K2HPO4 １２．５ｇ／ｌ（別殺菌）］２．５Ｌの入った５Ｌ容培養槽に接種し、３０℃、６００ｒｐｍ、通気量２．５Ｌ／分の条件で８時間培養を行った。培養中、培地中のグルコースが消失した時点でさらにグルコース１０ｇ／ｌ溶液１２５ｍｌを添加した。該培養中、２８％アンモニア水を使用して培養液のｐHを７．０に維持した。
【０１２９】
該培養液を遠心分離し、湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いることができた。
（５）ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの生産
Escherichia coli N18-14/pMnK1株湿菌体 ２００ｇ／ｌ、K2HPO4７．３ｇ／ｌ、KH2PO4 １２．７ｇ／ｌ、MgSO4 １５ｇ／ｌ、フラクトース５０ｇ／ｌ、シアル酸３０ｇ／ｌ、CMP・2Na １７ｇ／ｌ、ナイミーンＳ−２１５ ４ｇ／ｌ、キシレン１０ｍｌ／ｌの組成からなる反応液３０ｍｌを２００ｍｌ容ビーカーに入れ、該反応液をマグネティック・スターラーを用い、９００ｒｐｍで攪拌し、３２℃で２６時間反応を行った。
【０１３０】
反応中、5N NaOHを用いて該反応液のpHを７．２に維持した。
該反応により、反応液中に１０ｇ／ｌのＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃ（Na塩）が生成した。
【実施例２】
【０１３１】
Ｎ−アセチルノイラミン酸含有糖質の製造
（１）Escherichia coli K235株由来ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンターゼ発現株の調製
配列番号７および８で表される塩基配列を有する合成ＤＮＡを用いて、Escherichia coli K235株(ATCC13027)の染色体ＤＮＡより、ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ遺伝子neuAを含むＤＮＡ断片を下記方法で増幅した。
上記合成ＤＮＡをプライマーセットとして、実施例１の（３）と同一の条件でＰＣＲを行った。
【０１３２】
該ＰＣＲ反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、目的の断片が増幅されていることを確認後、残りの反応液と等量のTE[10mmol/l Tris-HCl、1mmol/l EDTA (pH 8.0)]飽和フェノール／クロロホルム(1vol/vol)を添加し、混合した。
該混合液を遠心分離後、得られた上層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離しＤＮＡの沈殿を取得し、該ＤＮＡの沈殿を２０μｌのＴＥに溶解した。該溶解液５μｌを用い、ＤＮＡを制限酵素HindIIIおよびBamHIで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、１．３ｋｂの断片を回収した。
【０１３３】
pBluescript II SK(+)（ストラタジーン社製）０．２μｇを制限酵素HindIIIおよびＢａｍＨIで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に２．９ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
該１．３ｋｂおよび２．９ｋｂの断片をライゲーションキットを用いて、１６℃で１６時間、連結反応を行った。該連結反応液を用いてEscherichia coli NM522を公知の方法に従って形質転換し、得られた形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
【０１３４】
生育した形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地にて３０℃で一晩培養して得られた培養物から、クラボウ社製自動核酸分離装置ＰＩ５０を用いてプラスミドを抽出した。
得られたプラスミドに含まれるＰＣＲ増幅断片の塩基配列を常法により決定したところ、GenBank ACCESSION No. J05023に記載のEscherichia coli 由来のＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼをコードするneuAと同じ塩基配列であった。
【０１３５】
該プラスミドをClaIおよびBamHIで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、１．３ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
pNT22 ０．２μｇを制限酵素ClaIおよびBamHIで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に５．５ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
該１．３ｋｂおよび５．５ｋｂの断片をライゲーションキットを用いて、１６℃で１６時間、連結反応を行った。該連結反応液を用いてEscherichia coli NM522を公知の方法に従って形質転換し、形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
【０１３６】
生育した形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地にて３０℃で一晩培養して得られた培養物から、クラボウ社製自動核酸分離装置ＰＩ５０を用いてプラスミドを抽出した。該プラスミドの構造を制限酵素消化によって確認し、該プラスミドをpTA23と命名した。
配列番号９および１０で表される塩基配列を有するＤＮＡを用いてEscherichia coli W3110株の染色体ＤＮＡより、ＣＴＰシンターゼ遺伝子pyrGを含む部分を増幅した。上記と同様の方法で目的とするＤＮＡ断片の増幅を確認し、該ＤＮＡ断片の回収を行った。また、該ＤＮＡ断片の塩基配列を常法により決定したところ、GenBank ACCESSION No. M12843に記載のpyrGと同じ塩基配列であった。
【０１３７】
該ＤＮＡ断片をBglIIで酵素消化し、１．６ｋｂのＤＮＡ断片を、ｐＴＡ２３をBamHIで酵素消化して、６．８ｋｂのＤＮＡ断片をそれぞれ得た。該１．６ｋｂと６．８ｋｂのＤＮＡ断片を上記と同様の方法で連結し、Escherichia coli NM522に形質転換して得られた形質転換体から抽出したプラスミドをpYP41と命名した。
pYP41をHindIIIおよびSalIで制限酵素消化し、２．９ｋｂのＤＮＡ断片を取得した。同様にpTK31をHindIIIおよびSalIで制限酵素消化し、４．４ｋｂのＤＮＡ断片を取得した。
【０１３８】
該２．９ｋｂおよび４．４ｋｂのＤＮＡ断片を連結し、得られたプラスミドをpTCN21と命名した。pTCN21を公知の方法に従ってEscherichia coli HN0074株に導入し、得られた形質転換体をEscherichia coli HN0074/pTCN21と命名した。
（２）Ｎ‐アセチルノイラミン酸転移酵素発現株の調製
配列番号１１および１２で表される塩基配列を有するＤＮＡを用いてNeisseria gonorrhoeae ATCC33084株の染色体DNAよりα２，３‐シアル酸転移酵素遺伝子（以下、2,3-siaTとも言う）を含むＤＮＡ断片を下記方法により増幅した。
【０１３９】
上記合成ＤＮＡをプライマーセットとして用い、公知の方法で調製したNeisseria gonorrhoeae ATCC33084株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。実施例１（３）と同様の組成の反応液５０μｌを用い、９４℃で１分間、３７℃で２分間、７２℃で３分間の工程を３０回繰り返すことにより行った。
該ＰＣＲ反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、目的の断片が増幅されていることを確認後、残りの反応液と等量のTE飽和フェノール／クロロホルム(1vol/vol)を添加し、混合した。
【０１４０】
該混合液を遠心分離後、得られた上層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離しＤＮＡの沈殿を取得し、該ＤＮＡの沈殿を２０μｌのＴＥに溶解した。該溶解液５μｌを用い、ＤＮＡを制限酵素ClaIおよびBamHIで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、１．０ｋｂの断片を回収した。
【０１４１】
pBluescript II SK(+)（ストラタジーン社製）０．２μｇを制限酵素ＣｌａIおよびＢａｍＨIで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に２．９ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
該１．０ｋｂおよび２．９ｋｂの断片をライゲーションキットを用いて、１６℃で１６時間、連結反応を行った。該連結反応液を用いてEscherichia coli NM522を公知の方法に従って形質転換し、得られた形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
【０１４２】
生育した形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地にて３０℃で一晩培養して得られた培養物から、クラボウ社製自動核酸分離装置ＰＩ５０を用いてプラスミドを抽出した。
得られたプラスミドに含まれるＰＣＲ増幅断片の塩基配列を常法により決定したところ、Gen Bank ACCESSION No. U60664に記載のα２，３‐シアル酸転移酵素をコードする2,3-siaTと同じ塩基配列であった。
【０１４３】
該プラスミドをClaIおよびBamHIで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、１．０ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
pNT22 ０．２μｇを制限酵素ClaIおよびBamHIで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に５．５ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
該１．０ｋｂおよび５．５ｋｂの断片をライゲーションキットを用いて、１６℃で１６時間、連結反応を行った。該連結反応液を用いてEscherichia coli NM522を公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
【０１４４】
生育した形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地にて３０℃で一晩培養して得られた培養物から、クラボウ社製自動核酸分離装置ＰＩ５０を用いてプラスミドを抽出した。該プラスミドの構造を制限酵素消化によって確認し、該プラスミドをpYP3、pYP3をEscherichia coli NM522に導入して得られた形質転換体をEscherichia coli NM522/pYP3と命名した。
（３）Escherichia coli NM522/pYP3湿菌体の取得
上記（２）で得たNM522/pYP3株を、実施例１の（４）と同様に培地および培養条件で培養を行った。その際、カナマイシン５０μｇ／ｍｌの代わりにアンピシリン１００μｇ／ｍｌを用いた。また、５Ｌ容培養槽での培養は、３０℃で４時間、４０℃で４時間行った。得られた培養物を遠心分離し、湿菌体を取得した。
（４）Escherichia coli HN0074/pTCN21湿菌体の取得
上記（１）で得たHN0074/pTCN21株を、実施例１の（４）と同様に培養を行い、得られた培養物を遠心分離し、湿菌体を取得した。
（５）シアリルラクトースの生産
Escherichia coli N18-14/pMnK1株またはEscherichia coli HN0074/pTCN21の湿菌体 １２０ｇ／ｌ、Escherichia coli NM522/pYP3の湿菌体４０ｇ／ｌ、K2HPO4７．３ｇ／ｌ、KH2PO4 １２．７ｇ／ｌ、MgSO4 １５ｇ／ｌ、フラクトース５０ｇ／ｌ、シアル酸３０ｇ／ｌ、ラクトース５０ｇ／ｌ、ナイミーンＳ−２１５ ４ｇ／ｌ、キシレン１０ｍｌ／ｌの組成からなる反応液５０ｍｌ
を微生物培養装置ＢＭＪ(250ml)（エイブル社製）に入れ、６００ｒｐｍで攪拌しながら、３２℃で２４時間反応を行った。
【０１４５】
反応中、5N NaOHを用いて該反応液のpHを７．２に維持し、また１Ｌ／分の通気を行った。
N18-14/pMnK1を使用した反応では２９．０ｇ／ｌ、HN0074/pTCN21を使用した反応では１９．２ｇ／ｌの３´‐シアリルラクトースが蓄積した。
【産業上の利用可能性】
【０１４６】
本発明により、シチジン‐５´‐一リン酸‐Ｎ‐アセチルノイラミン酸およびＮ‐アセチルノイラミン酸含有糖質を効率よく製造することができる。
「配列表フリーテキスト」
配列番号３−人口配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４−人口配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５−人口配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６−人口配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７−人口配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８−人口配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９−人口配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１０−人口配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１１−人口配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１２−人口配列の説明：合成ＤＮＡ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シチジン‐５´‐一リン酸‐Ｎ‐アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物を用いたシチジン‐５´‐一リン酸‐Ｎ‐アセチルノイラミン酸の製造法、およびＮ‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
シチジン‐５´‐一リン酸‐Ｎ‐アセチルノイラミン酸（以下ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃと略す）の製造法としては、ＣＴＰとＮ‐アセチルノイラミン酸から、精製したＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼによる酵素反応で製造する方法（非特許文献１）がよく知られているが、酵素の精製工程は複雑で費用もかかるため、工業生産には適さない。
精製酵素を用いずにＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃを製造する方法としては、ＣＴＰ前駆物質とＮ‐アセチルノイラミン酸を原料として、ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼを生産する微生物菌体を用いる方法（特許文献１）がある。この方法では、微生物本来の代謝活性を利用してオロット酸等の安価な原料からＣＴＰを供給するが、この方法で用いられている大腸菌由来のＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼの反応至適ｐＨは塩基性側にあることが明らかになっており（非特許文献２)、微生物菌体の代謝活性を利用するのに適した中性条件で、より効率的にＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃを合成する酵素の取得が求められている。
【０００３】
またシチジン‐５´‐一リン酸（以下ＣＭＰと略す）とＮ‐アセチルノイラミン酸またはＮ‐アセチルグルコサミンを原料として、ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼを発現する微生物菌体と酵母菌体を用いてＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃを製造する方法も知られている(非特許文献２)。この方法は、高価なＣＭＰと酵母菌体とを組み合わせて使わなくてはならず、より安価で効率的なＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの製造方法が求められている。
【０００４】
パスツレラ・マルトシダ（Pasteurella multocida）のpm0187で表されるＯＲＦは、クローニングがされており、該ＯＲＦにコードされる蛋白質を大腸菌を宿主細胞として発現させ、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有することが確認されている（非特許文献３）。
【特許文献１】国際公開特許第98‐12343号パンフレット
【特許文献２】国際公開特許第04‐009830号パンフレット
【非特許文献１】Appl. Microbiol. Biotechnol., 44, 59-67(1995)
【非特許文献２】J. Biol. Chem., 262, 17556-17562 (1987)
【非特許文献３】INFECT. IMMUN., 73, 1284-1294(2005)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、シチジン‐５´‐一リン酸‐Ｎ‐アセチルノイラミン酸合成酵素活性を生産する能力を有する微生物を用いたシチジン‐５´‐一リン酸‐Ｎ‐アセチルノイラミン酸の製造法、および該微生物を用いたＮ‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は以下の[１]〜[９]に関する。
［１］ 以下の（１）〜（５）より選ばれる蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、シチジン‐５´‐三リン酸（以下、ＣＴＰと略す）またはＣＴＰ前駆物質（I）およびＮ‐アセチルノイラミン酸を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でシチジン‐５´‐一リン酸‐Ｎ‐アセチルノイラミン酸（以下、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃと略す）を生成、蓄積させ、該水性媒体中からＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを採取することを特徴とするＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの製造法。
（１）配列番号１に表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
（２）配列番号１に表されるアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつCMP-NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
（３）配列番号１に表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有し、かつCMP‐NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
（４）配列番号２に表される塩基配列を有するＤＮＡにコードされる蛋白質
（５）配列番号２に表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされ、かつCMP-NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
[２] ＣＴＰまたはＣＴＰ前駆物質（I）が、ＣＴＰ前駆物質（II）からＣＴＰまたはＣＴＰ前駆物質（I）を生産する能力を有する原核生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、エネルギー供与体およびＣＴＰ前駆物質（II）を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でＣＴＰまたはＣＴＰ前駆物質（I）を生成、蓄積させて得られるＣＴＰまたはＣＴＰ前駆物質（I）である、請求項１に記載のＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの製造法。
【０００７】
［３］ Ｎ‐アセチルノイラミン酸が、Ｎ‐アセチルグルコサミン-２‐エピメラーゼとＮ‐アセチルノイラミン酸シンターゼとを生産する能力を有する微生物、またはそれぞれの蛋白質を生産する能力を有する２種の微生物の培養物もしくは該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、Ｎ‐アセチルグルコサミンおよびエネルギー供与体を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＮ‐アセチルノイラミン酸を生成、蓄積させて得られるＮ‐アセチルノイラミン酸である、請求項１または２に記載のＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの製造法。
［４］ Ｎ‐アセチルグルコサミン‐２‐エピメラーゼ、Ｎ‐アセチルノイラミン酸シンターゼおよび以下の（１）〜（５）より選ばれる蛋白質を生産する能力を有する一つの微生物またはこれらの蛋白質を生産する能力を任意の組み合わせですべて有する複数の微生物の培養物または該培養物の処理物、およびＣＴＰ前駆物質（II）からＣＴＰまたはＣＴＰ前駆物質（I）を生産する能力を有する原核生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、ＣＴＰ前駆物質（II）、Ｎ‐アセチルグルコサミンおよびエネルギー供与体を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを生成、蓄積させ、該水性媒体中からＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを採取することを特徴とする、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの製造法。
（１）配列番号１に表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
（２）配列番号１に表されるアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつCMP-NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
（３）配列番号１に表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有し、かつCMP‐NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
（４）配列番号２に表される塩基配列を有するＤＮＡにコードされる蛋白質
（５）配列番号２に表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされ、かつCMP-NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
［５］ N‐アセチルグルコサミン‐２‐エピメラーゼを生産する能力、N‐アセチルノイラミン酸シンターゼを生産する能力、以下の（１）〜（５）より選ばれる蛋白質を生産する能力およびＣＴＰ前駆物質（I）からＣＴＰを生産する能力を持っている１つの原核生物、またはこれらの能力を任意の組み合わせですべて有する複数の原核生物の培養物もしくは該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、エネルギー供与体、ＣＴＰ前駆物質（I）およびN‐アセチルグルコサミンを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃを生成、蓄積させ、該水性媒体中からＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃを採取することを特徴とする、ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの製造法。
（１）配列番号１に表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
（２）配列番号１に表されるアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質
（３）配列番号１に表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有し、かつＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質
（４）配列番号２に表される塩基配列を有するＤＮＡにコードされる蛋白質
（５）配列番号２に表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとス
トリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされ、かつＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質
［６］ シアリルトランスフェラーゼを生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、請求項１から５のいずれかの方法で製造されたＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃおよび受容体糖質を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でN‐アセチルノイラミン酸含有糖質を生成、蓄積させ、該水性媒体中からN‐アセチルノイラミン酸含有糖質を採取することを特徴とする、N‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造法。
［７］ 以下の（１）〜（５）より選ばれる蛋白質とシアリルトランスフェラーゼとを生産する能力を有する微生物、またはそれぞれの蛋白質を生産する能力を有する２種の微生物の培養物もしくは該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、N-アセチルノイラミン酸および受容体糖質を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でN‐アセチルノイラミン酸含有糖質を生成、蓄積させ、該水性媒体中からN‐アセチルノイラミン酸含有糖質を採取することを特徴とするN‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造法。
（１）配列番号１に表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
（２）配列番号１に表されるアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつCMP-NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
（３）配列番号１に表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有し、かつCMP‐NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
（４）配列番号２に表される塩基配列を有するＤＮＡにコードされる蛋白質
（５）配列番号２に表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされ、かつCMP-NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
［８］ N‐アセチルノイラミン酸が、Ｎ‐アセチルグルコサミン-２‐エピメラーゼとN‐アセチルノイラミン酸シンターゼとを生産する能力を有する微生物、またはそれぞれの蛋白質を生産する能力を有する２種の微生物の培養物もしくは該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、エネルギー供与体およびN‐アセチルグルコサミンを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でN‐アセチルノイラミン酸を生成、蓄積させることによって得られたものである、請求項７に記載のN‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造法。
［９］ N‐アセチルグルコサミン‐２‐エピメラーゼ、N‐アセチルノイラミン酸シンターゼ、以下の（１）〜（５）より選ばれる蛋白質およびシアリルトランスフェラーゼを生産する能力を持っている１つの微生物、またはこれらの蛋白質を生産する能力を任意の組み合わせですべて有する複数の微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、エネルギー供与体、N‐アセチルグルコサミンおよび受容体糖質を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でN‐アセチルノイラミン酸含有糖質を生成、蓄積させ、該水性媒体中からN‐アセチルノイラミン酸含有糖質を採取することを特徴とする、N‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造法。
（１）配列番号１に表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
（２）配列番号１に表されるアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつCMP-NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
（３）配列番号１に表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有し、かつCMP‐NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
（４）配列番号２に表される塩基配列を有するＤＮＡにコードされる蛋白質
（５）配列番号２に表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされ、かつCMP-NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、安価で効率的にシチジン‐５´‐一リン酸‐Ｎ‐アセチルノイラミン酸およびＮ‐アセチルノイラミン酸含有糖質を製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明で用いる微生物が生産するＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質としては、
（１）配列番号１に表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
（２）配列番号１に表されるアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質
（３）配列番号１に表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有し、かつＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質
（４）配列番号２に表される塩基配列を有するＤＮＡにコードされる蛋白質
（５）配列番号２に表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされ、かつＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質
をあげることができる。
【００１０】
１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質は、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)（以下、モレキュラー・クローニング第２版と略す）、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409(1982)、Gene, 34, 315 (1985)、Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより、取得することができる。
【００１１】
欠失、置換または付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換または付加できる程度の数であり、１個から数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
また、上記の配列番号１で表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたとは、同一配列中の任意かつ１もしくは複数のアミノ酸配列中の位置において、１または複数のアミノ酸残基の欠失、置換または付加があることを意味し、欠失、置換または付加が同時に生じてもよく、置換または付加されるアミノ酸残基は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸残基としては、L-アラニン、L-アスパラギン、L-アスパラギン酸、L-グルタミン、L-グルタミン酸、グリシン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-リジン、Ｌ-アルギニン、L-メチオニン、L-フェニルアラニン、L-プロリン、L-セリン、L-スレオニン、L-トリプトファン、L-チロシン、L-バリン、L-システインなどがあげられる。
【００１２】
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
また、上記の１以上のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有する蛋白質がＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有するためには、配列番号１記載のアミノ酸配列と、少なくとも８０％以上、通常は９０％以上、特に９５％以上、さらには９８％の同一性を有していることが好ましい。
【００１３】
アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST（Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)）やFASTA（Methods Enzymol., 183, 63 (1990)）を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている（J. Mol. Biol., 215, 403(1990)）。BLASTに基づいてBLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターは例えばScore＝100、wordlength＝12とする。また、BLASTに基づいてBLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは例えばscore＝50、wordlength＝3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（http://www.ncbi.nlm.nih.gov.）。
【００１４】
また、本発明で用いられるＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡとしては、配列番号２で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンセターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡをあげることができる。
ここでいう「ハイブリダイズする」とは、特定の塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部にＤＮＡがハイブリダイズすることである。したがって、該特定の塩基配列を有するＤＮＡまたはその一部は、ノーザンまたはサザンブロット解析のプローブとして用いることができ、またＰＣＲ解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できるＤＮＡである。プローブとして用いられるＤＮＡとしては、少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上のＤＮＡをあげることができ、プライマーとして用いられるＤＮＡとしては、少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上のＤＮＡをあげることができる。
【００１５】
ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えば当業者であれば本願明細書に従い、ハイブリダイゼーションの条件を決定することができる。該ハイブリダイゼーションの条件は、モレキュラー・クローニング第２版、第３版（２００１年）、Methods for General and Molecular Bacteriolgy, ASM Press（1994）、Immunology methods manual, Academic press(1996)に記載の他、多数の他の標準的な教科書に従って行うことができる。
【００１６】
上記のストリンジェントな条件とは、ＤＮＡを固定化したフィルターとプローブ、好ましくはプローブＤＮＡとを50％ホルムアミド、5×SSC（750mmol/lの塩化ナトリウム、75mmol/lのクエン酸ナトリウム）、50mmol/lのリン酸ナトリウム（pH7.6）、5×デンハルト溶液、10％の硫酸デキストラン、および20μg/lの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で42℃で一晩、インキュベートした後、例えば約65℃の0.2×SSC溶液中で該フィルターを洗浄する条件が好ましいが、より低いストリンジェント条件を用いることもできる。ストリンジェンな条件の変更は、ホルムアミドの濃度調整（ホルムアミドの濃度を下げるほど低ストリンジェントになる）、塩濃度および温度条件の変更により可能である。低ストリンジェント条件としては、例えば6×SSCE（20×SSCEは、3mol/lの塩化ナトリウム、0.2mol/lのリン酸二水素ナトリウム、0.02mol/lのEDTA、pH7.4）、0.5％のSDS、30％のホルムアミド、100μg/lの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、37℃で一晩インキュベートした後、50℃の1×SSC、0.1％SDS溶液を用いて洗浄する条件をあげることができる。また、さらに低いストリンジェントな条件としては、上記した低ストリンジェント条件において、高塩濃度（例えば5×SSC）の溶液を用いてハイブリダイゼーションを行った後、洗浄する条件をあげることができる。
【００１７】
上記した様々な条件は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加、または変更することにより設定することもできる。上記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。
上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えば上記したBLASTやFASTA等を用いて上記したパラメーター等に基づいて計算したときに、配列番号２で表される塩基配列と少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
【００１８】
配列番号２で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが、ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンセターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡであることは、例えば以下に記載した方法により、遺伝子組換え法を用いて該ＤＮＡにコードされる蛋白質を製造し、該蛋白質の活性を測定することにより確認することができる。
【００１９】
本発明のＮ‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造法に使用するシアリルトランスフェラーゼは、微生物が活性のある蛋白質として生産することができる蛋白質であればよく、好ましくは細菌等の原核生物または酵母、特に好ましくは原核生物由来の蛋白質がよい。具体的にはパスツレラ・マルトシダ（Pasteurella multocida） PM70株 由来のα-2,3-sialyltransferase （WO03/27297）、Photobacterium damselae JT0160株由来のα-2,6-sialyltransferase (GenBank ACCESSION No. BAA25316)などがあげられる。
【００２０】
本発明のＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃおよびＮ‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造法に使用するＮ‐アセチルグルコサミン‐２‐エピメラーゼは、微生物が活性のある蛋白質として生産することができる蛋白質であればよく、好ましくは細菌等の原核生物または酵母、特に好ましくは原核生物由来のものがよい。具体的にはSynechocystis sp. PCC6803株(Pasteur Culture Collection of Cyanobacteria, INSTITUTE PASTEUR)由来のＮ‐アセチルグルコサミン‐２−エピメラーゼ（WO00/47730)があげられる。
【００２１】
本発明のＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃおよびＮ‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造法に使用するＮ‐アセチルノイラミン酸シンターゼは、微生物が活性のある蛋白質として生産することができる蛋白質であればよく、好ましくは細菌等の原核生物または酵母、特に好ましくは原核生物由来のＮ‐アセチルノイラミン酸シンターゼがよい。具体的にはエシェリヒア・コリ（Escherichia coli） K1株由来のＮ‐アセチルノイラミン酸シンターゼ（GenBank ACCESSION No. AAC43302）があげられる。
［Ａ］ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの製造
（１）ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物の作製
本発明の方法で使用するＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物は、上記した本発明で使用するＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物であれば特に限定されず、該微生物としては、人為的な操作を行わなくても該ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有している微生物と、ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡで形質転換された微生物があげられる。
【００２２】
人為的な操作を行わなくともＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物としては、パスツレラ属に属する微生物、例えばPasteurella multocida PM70株（ミネソタ大学より分譲可能）があげられる。
上記した本発明で使用するＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡで形質転換された微生物としては、例えば配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡを適当な発現ベクターに挿入した組換え体ＤＮＡで形質転換された微生物、配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡを染色体上に挿入された微生物があげられる。
【００２３】
１）ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ断片の取得
上記した本発明で使用するＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡは、該蛋白質を生産する生物の染色体ＤＮＡ等からのクローニング、または該蛋白質をコードするＤＮＡをＤＮＡ合成機等を用いて合成することによって取得することができるが、例えば、配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡは、以下のようにして取得することができる。
【００２４】
配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡは、パスツレラ属の微生物より調製することができる。パスツレラ属に属する微生物としては、例えばPasteurella multocida をあげることができ、具体的にはPasteurella multocida PM70株(ミネソタ大学より分譲可能)をあげることができる。
Pasteurella multocidaに属する微生物を公知の方法（例えば、FEMS Microbiol. Lett., 166, 289 (1998)）により培養し、培養後、公知の方法（例えばカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーに記載の方法）により、該微生物のゲノムＤＮＡを単離精製することにより、該微生物のゲノムＤＮＡを取得することができる。
【００２５】
配列番号２で表される塩基配列に基づいたプライマーを調製し、ゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法（PCR Protocols, Academic Press (1990)）により配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡ断片を取得することができる。
また、配列番号２の塩基配列に基づいて設計された合成ＤＮＡをプローブとしたハイブリダイゼーション法などにより目的とするＤＮＡを取得することもできる。
【００２６】
取得したＤＮＡをそのまま、あるいは適当な制限酵素などで切断後、常法によりベクターに組み込み、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキシ法（Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463 (1977)）あるいはABI377（アプライド・バイオシステムズ ジャパン社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
【００２７】
上記の取得されたＤＮＡを組み込むベクターとしては、pBluescript KS(+)（ストラタジーン社製）、pDIRECT（Nucleic Acids Res., 18, 6069 (1990)）、pCR-Script Amp SK(+)（ストラタジーン社製）、pT7Blue（ノバジェン社製）、pCR II（インビトロジェン社製）およびpCR-TRAP（ジーンハンター社製）などをあげることができる。
更に、決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、パーセプティブ・バイオシステムズ社製8905型ＤＮＡ合成装置等を用いて化学合成することにより目的とするＤＮＡを調製することもできる。
【００２８】
２）ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物の作製
ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物は、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された方法等を用い、例えば以下の方法により、上記１）に記載の方法により取得したＤＮＡを宿主細胞中に導入することにより取得することができる。
【００２９】
上記１）で得られるＤＮＡをもとにして、必要に応じて、該蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。また、該蛋白質をコードする部分の塩基配列を、宿主の発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換することにより、該蛋白質の生産率を向上させることができる。
該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換え体ＤＮＡを作製する。
【００３０】
該組換え体ＤＮＡを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、本発明の製造法で用いる形質転換体を得ることができる。
宿主細胞としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞等、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、本発明の製造法に用いられるＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
【００３１】
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ（以下、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンターゼをコードするＤＮＡとも言う）を含有する組換え体ＤＮＡは原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンターゼをコードするＤＮＡ、転写終結配列より構成された組換え体ＤＮＡであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００３２】
発現ベクターとしては、pHelix1（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）、pKK233-2（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）、pSE280（インビトロジェン社製）、pGEMEX-1（プロメガ社製）、pQE-8（キアゲン社製）、pET-3（ノバジェン社製）、pKYP10（特開昭58-110600）、pKYP200（Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)）、pLSA1（Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)）、pGEL1（Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 4306 (1985)）、pBluescriptII SK(+)、pBluescript II KS(-)（ストラタジーン社製）、pTrS30（大腸菌JM109/pTrS30(FERM BP-5407)より調製）、pTrS32（大腸菌JM109/pTrS32(FERM BP-5408)より調製）、pPAC31 (WO98/12343)、pUC19（Gene, 33, 103 (1985)）、pSTV28(タカラバイオ社製)、pUC118（タカラバイオ社製）、pPA1（特開昭63-233798）等を例示することができる。
【００３３】
プロモーターとしては、大腸菌等の宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよい。例えば、trpプロモーター（Ｐtrp）、lacプロモーター（Ｐlac）、ＰLプロモーター、ＰRプロモーター、ＰSEプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等をあげることができる。またＰtrpを２つ直列させたプロモーター（Ｐtrp ×２）、tacプロモーター、lacT7プロモーター、let Iプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
【００３４】
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
組換え体ＤＮＡには、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンターゼをコードするＤＮＡを発現させるための転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
【００３５】
原核生物としては、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス属等に属する微生物、例えば、Escherichia coli XL1-Blue、Escherichia coli XL2-Blue、Escherichia coli DH1、Escherichia coli NM522、Escherichia coli MC1000、Escherichia coli KY3276、Escherichia coli W1485、Escherichia coli JM109、Escherichia coli HB101、Escherichia coli No.49、Escherichia coli W3110、Escherichia coli NY49、Escherichia coli HN0074 (FERM BP-4425)、Serratia ficaria、Serratia fonticola、Serratia liquefaciens、Serratia marcescens、Bacillus subtilis、Bacillus amyloliquefaciens、Brevibacterium immariophilum ATCC14068、Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066、Corynebacterium ammoniagenes、Corynebacterium glutamicum ATCC13032、Corynebacterium glutamicum ATCC14067、Corynebacterium glutamicum ATCC13869、Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870、Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354、Pseudomonas sp. D-0110等をあげることができる。
【００３６】
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法（Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)）、プロトプラスト法（特開昭63-248394）、エレクトロポレーション法（Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)）等をあげることができる。
酵母菌株を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、YEp13（ATCC37115）、YEp24（ATCC37051）、YCp50（ATCC37419）、pHS19、pHS15等を用いることができる。
【００３７】
プロモーターとしては、酵母菌株中で機能するものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、gal 1プロモーター、gal 10プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、MFα1 プロモーター、CUP 1プロモーター等のプロモーターをあげることができる。
宿主細胞としては、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、クルイベロミセス属、トリコスポロン属、シワニオミセス属、ピチア属、キャンディダ属等に属する酵母菌株をあげることができ、具体的には、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Kluyveromyces lactis、Trichosporon pullulans、Schwanniomyces alluvius、Pichia pastoris、Candida utilis等をあげることができる。
【００３８】
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法（Methods Enzymol., 194, 182 (1990)）、スフェロプラスト法（Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81, 4889 (1984)）、酢酸リチウム法（J. Bacteriol., 153, 163 (1983)）等をあげることができる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、pcDNA1.1、pcDNA1.1/Amp、pCDM8、pREP4（以上、インビトロジェン社）、pAGE107（特開平3-22979）、pAS3-3（特開平2-227075）、pAGE103（J. Biochem., 101, 1307 (1987)）、pAGE210、pAMo、pAMoA等を用いることができる。
【００３９】
プロモーターとしては、動物細胞中で機能するものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（CMV）のIE（immediate early）遺伝子のプロモーター、SV40の初期プロモーターあるいはメタロチオネインのプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトCMVのIE遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
【００４０】
宿主細胞としては、マウス・ミエローマ細胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ細胞、ヒトの細胞であるナマルバ（Namalwa）細胞またはNamalwa KJM-1細胞、ヒト胎児腎臓細胞、ヒト白血病細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるCHO細胞、HBT5637（特開昭63-299）等をあげることができる。
マウス・ミエローマ細胞としては、SP2/0、NSO等、ラット・ミエローマ細胞としてはYB2/0等、ヒト胎児腎臓細胞としてはHEK293(ATCC: CRL-1573)等、ヒト白血病細胞としては、BALL-1等、アフリカミドリザル腎臓細胞としてはCOS-1、COS-7等をあげることができる。
【００４１】
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法(Cytotechnology, 3, 133 (1990))、リン酸カルシウム法（特開平2-227075）、リポフェクション法（Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 7413 (1987)）、Virology, 52, 456 (1973)に記載の方法等をあげることができる。
【００４２】
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばBaculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992)、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Molecular Biology, A Laboratory Manual、Bio/Technology, 6, 47 (1988)等に記載された方法によって、蛋白質を発現することができる。
【００４３】
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、蛋白質を発現させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、pVL1392、pVL1393、pBlueBacIII（ともにインビトロジェン社製）等をあげることができる。
【００４４】
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus) 等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞、Trichoplusia niの卵巣細胞、カイコ卵巣由来の培養細胞等を用いることができる。
【００４５】
Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞としてはSf9、Sf21（バキュロウイルス・イクスプレッション・ベクターズ ア・ラボラトリー・マニュアル）等、Trichoplusia niの卵巣細胞としてはHigh 5、BTI-TN-5B1-4（インビトロジェン社製）等、カイコ卵巣由来の培養細胞としてはBombyx mori N4等をあげることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平2-227075）、リポフェクション法(Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 7413 (1987))等をあげることができる。
【００４６】
植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等をあげることができる。
プロモーターとしては、植物細胞中で機能するものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）の35Sプロモーター、イネアクチン１プロモーター等をあげることができる。
【００４７】
宿主細胞としては、タバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファルファ、イネ、コムギ、オオムギ等の植物細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Agrobacterium）（特開昭59-140885、特開昭60-70080、WO94/00977）、エレクトロポレーション法（特開昭60-251887）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許第2606856、特許第2517813）等をあげることができる。
【００４８】
また特に、本発明のＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの製造法およびＮ‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造法には、Ｎ‐アセチルノイラミン酸の分解活性が低下した微生物細胞を用いるのが好ましい。そのような微生物としては、例えばＮ‐アセチルノイラミン酸リアーゼ活性が低下した微生物をあげることができ、具体的には、Escherichia coli NAN8-71 (FERM BP-7908, WO03/72783)をあげることができる。
【００４９】
また、公知の方法によりＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを微生物の染色体に挿入することにより(J. Bacteriol., 180, 2063 (1998))、本発明の製造法で用いる微生物を作製することができる。
（２）ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物の調製
本発明の製造法に用いられるＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物を培地に培養する方法は、微生物の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
【００５０】
ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有するエシェリヒア・コリ等の原核生物あるいは酵母等を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類等を用いることができる。
【００５１】
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化物等を用いることができる。
【００５２】
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は15〜40℃がよく、培養時間は、通常5時間〜7日間である。培養中pHは3.0〜9.0に保持する。pHの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
【００５３】
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
【００５４】
ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する動物細胞を培養する培地としては、一般に使用されているRPMI1640培地(J. Am. Med. Assoc., 199, 519 (1967))、EagleのMEM培地(Science, 122, 501 (1952))、DMEM培地(Virology, 8, 396 (1959))、199培地(Proc. Soc. Biol. Med., 73, 1 (1950))またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。
【００５５】
培養は、通常pH6〜8、25〜40℃、5％ＣＯ2存在下等の条件下で1〜7日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する昆虫細胞を培養する培地としては、一般に使用されているTNM-FH培地(ファーミンジェン社製)、Sf-900 II SFM培地（ライフ・テクノロジーズ社製）、ExCell400、ExCell405(いずれもJRHバイオサイエンシーズ社製)、Grace's Insect Medium(Nature, 195, 788 (1962))等を用いることができる。
【００５６】
培養は、通常pH6〜7、25〜30℃等の条件下で1〜5日間行う。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する植物細胞は、細胞として、または植物の細胞や器官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ(MS)培地、ホワイト(White)培地、またはこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。
【００５７】
培養は、通常pH5〜9、20〜40℃の条件下で3〜60日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
（３）ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの製造
１）ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの製造１
上記（２）の培養により得られた微生物の培養物および該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、ＣＴＰまたはＣＴＰ前駆物質（I）およびＮ‐アセチルノイラミン酸を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃを生成、蓄積させ、該水性媒体中にＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃを製造することができる。
【００５８】
培養物の処理物としては、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物あるいは該菌体の固定化物など、細胞の状態を維持し、上記した微生物の培養物と実質的に同一の活性を有している培養物の処理物が用いられる。
【００５９】
ＣＴＰ前駆物質（I）としては、ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物が代謝してＣＴＰに変換できる物質であればいずれでもよく、好ましくは、ウラシル、オロチジン、ウリジン、シトシン、シチジン、ウリジン‐５´‐一リン酸（以下ＵＭＰと略す）、ウリジン‐５´‐三リン酸（以下ＵＴＰと略す）およびＣＭＰをあげることができ、微生物が大腸菌の場合は、シチジン、ＵＴＰおよびＣＭＰ、好ましくはＣＭＰをあげることができる。
【００６０】
水性媒体としては、水、りん酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ほう酸塩、クエン酸塩、トリスなどの緩衝液、メタノール、エタノールなどのアルコール類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類、アセトアミドなどのアミド類などをあげることができる。また、酵素源として用いた微生物の培養液を水性媒体として用いることができる。
ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの生成において、必要に応じて界面活性剤あるいは有機溶媒を添加してもよい。界面活性剤としては、ポリオキシエチレン・オクタデシルアミン（例えばナイミーンS-215、日本油脂社製）などの非イオン系界面活性剤、セチルトリメチルアンモニウム・ブロマイドやアルキルジメチル・ベンジルアンモニウムクロライド（例えばカチオンF2-40E、日本油脂社製）などのカチオン系界面活性剤、ラウロイル・ザルコシネートなどのアニオン系界面活性剤、アルキルジメチルアミン（例えば三級アミンFB、日本油脂社製）などの三級アミン類など、ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの生成を促進するものであればいずれでもよく、１種または数種を混合して使用することもできる。界面活性剤は、通常0.1〜50 g/lの濃度で用いられる。有機溶剤としては、キシレン、トルエン、脂肪族アルコール、アセトン、酢酸エチルなどがあげられ、通常0.1〜50 ml/lの濃度で用いられる。
【００６１】
ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの生成反応は水性媒体中、pH 5〜7.5、好ましくはpH 6.5〜7.5、20〜50℃の条件で1〜96時間行う。該生成反応において、必要に応じてＭｎＣｌ2、ＭｇＣｌ2、ＭｇＳＯ４等の無機塩、補酵素、フィチン酸等を添加することができる。
ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの製造に用いられるＣＴＰまたはＣＴＰ前駆物質（I）は、ＣＴＰ前駆物質（II）からＣＴＰまたはＣＴＰ前駆物質（I）を生産する能力を有する原核生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、エネルギー供与体およびＣＴＰ前駆物質（II）を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でＣＴＰまたはＣＴＰ前駆物質（I）を生成、蓄積させることによっても得ることができる。
【００６２】
ＣＴＰ前駆物質（II）としては、原核生物が代謝してＣＴＰまたはＣＴＰ前駆物質（I）に変換できる物質であればいずれでもよく、好ましくはオロット酸、ウラシル、オロチジン、ウリジン、シトシン、シチジン、ＣＭＰ、ＵＴＰおよびＵＭＰをあげることができ、より好ましくはオロット酸およびＣＭＰ、さらに好ましくはオロット酸をあげることができる。
【００６３】
ＣＴＰ前駆物質（II）からＣＴＰまたはＣＴＰ前駆物質（I）を生産する能力を有する原核生物としては、該能力を有する原核生物であれば特に制限はないが、好ましくはコリネバクテリウム属に属する原核生物、より好ましくはコリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）を用いるのがよい。
ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの製造に用いるＣＴＰまたはＣＴＰ前駆物質（I）は特に制限はなく、市販のＣＴＰまたはＣＴＰ前駆物質（I）を用いてもよいし、予め上記の方法で媒体中に生成、蓄積させ、該媒体中から採取することによって得られたＣＴＰまたはＣＴＰ前駆物質（I）を用いてもよい。また、ＣＴＰまたはＣＴＰ前駆物質（I）が生成、蓄積した上記の媒体をそのままＣＴＰまたはＣＴＰ前駆物質（I）として用いることもできる。さらにＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃを生成する反応とＣＴＰ前駆物質（II）からＣＴＰまたはＣＴＰ前駆物質（I）を生産する反応を同一媒体中で同時に行うことにより、同一水性媒体中でＣＴＰまたはＣＴＰ前駆物質（I）を生成させるとともに、ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃを生産することもできる。
【００６４】
ＣＴＰ前駆物質（II）からＣＴＰまたはＣＴＰ前駆物質（I）を生産する能力を有する原核生物の培養は（１）に記載の形質転換体の培養と同様の方法で行うことができる。
ＣＴＰ前駆物質（II）からＣＴＰまたはＣＴＰ前駆物質（I）を生産する能力を有する原核生物の処理物としては、前記した培養物の処理物と同じものをあげることができる。
ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの製造に用いるＣＴＰ、ＣＴＰ前駆物質（I）および（II）は、１ｍｍｏｌ／ｌ〜１ｍｏｌ／ｌの範囲で用いる。
【００６５】
ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの製造に用いるエネルギー供与体としては、微生物または原核生物が代謝することができ、かつアデノシン‐５´‐三リン酸（以下ＡＴＰと略す）などのエネルギー物質を生産させることができる物質であればいずれでもよく、例えばグルコース、フルクトース、シュークロース、ラクトース、マルトース、マンニトール、ソルビトール、Ｎ‐アセチルノイラミン酸等の炭水化物、ピルビン酸、乳酸、酢酸等の有機酸、グリシン、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸等のアミノ酸、糖蜜、澱粉加水分解物等をあげることができる。
【００６６】
ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの製造に用いるエネルギー供与体はいずれも、５ｍｏｌ／ｌ以下で用いることが好ましい。
ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの製造に用いるＮ‐アセチルノイラミン酸としては、市販品または微生物を用いて製造されたものなどいずれでもよく、好ましくはＮ‐アセチルグルコサミンからＮ‐アセチルノイラミン酸を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用いて製造したＮ‐アセチルノイラミン酸をあげることができる。
【００６７】
Ｎ‐アセチルグルコサミンからＮ‐アセチルノイラミン酸を生産する能力を有する微生物は、該能力を有する微生物であれば特に制限はないが、Ｎ‐アセチルグルコサミン‐２‐エピメラーゼを生産する能力を有する微生物およびＮ‐アセチルノイラミン酸シンターゼを生産する能力を有する微生物の２つの微生物の組み合せ、またはＮ‐アセチルグルコサミン‐２‐エピメラーゼおよびＮ‐アセチルノイラミン酸シンターゼを生産する能力を有する微生物をあげることができる。
【００６８】
上記した微生物としては、Ｎ‐アセチルグルコサミン‐２‐エピメラーゼをコードするＤＮＡおよび／またはＮ‐アセチルノイラミン酸シンターゼをコードするＤＮＡで形質転換された微生物をあげることができる。
Ｎ‐アセチルグルコサミン‐２‐エピメラーゼをコードするＤＮＡで形質転換された微生物およびＮ‐アセチルノイラミン酸シンターゼをコードするＤＮＡで形質転換された微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用いる時は、それぞれの微生物の培養物または該培養物の処理物の混合物を酵素源として用いてもよい。
【００６９】
Ｎ‐アセチルグルコサミン‐２‐エピメラーゼをコードするＤＮＡおよび／またはＮ‐アセチルノイラミン酸シンターゼをコードするＤＮＡで形質転換された微生物としては、該酵素をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡを保持する微生物、該酵素をコードするＤＮＡが染色体に挿入された微生物等があげられる。
Ｎ‐アセチルグルコサミン‐２‐エピメラーゼをコードするＤＮＡおよび／またはＮ‐アセチルノイラミン酸シンターゼをコードするＤＮＡで形質転換された微生物は、（１）に記載の方法に準じ、それぞれのＤＮＡの塩基配列に基づき取得することができる。また、該微生物の培養物は、（２）に記載の方法に準じて取得することができる。
【００７０】
Ｎ‐アセチルグルコサミン‐２‐エピメラーゼをコードするＤＮＡおよび／またはＮ‐アセチルノイラミン酸シンターゼをコードするＤＮＡで形質転換された微生物の培養物の処理物としては、前記した培養物の処理物と同じものをあげることができる。
Ｎ‐アセチルグルコサミン‐２‐エピメラーゼをコードするＤＮＡおよび／またはＮ‐アセチルノイラミン酸シンターゼをコードするＤＮＡで形質転換された微生物としては、例えばSynechocystis sp. PCC6803株由来のＮ‐アセチルグルコサミン‐２‐エピメラーゼをコードするＤＮＡおよびEscherichia coli由来のＮ‐アセチルノイラミン酸シンターゼをコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡであるpLT4を導入されたEscherichia coli NAN8-71/pLT4（WO03/72783）等があげられる。
【００７１】
[Ａ]の（２）と同様の方法によりＮ−アセチルグルコサミンからＮ−アセチルノイラミン酸を生産する能力を有する微生物を培養し、得られた培養物または該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、Ｎ‐アセチルグルコサミンおよびエネルギー供与体を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＮ‐アセチルノイラミン酸を生成、蓄積させることができる。
【００７２】
Ｎ‐アセチルグルコサミンからＮ‐アセチルノイラミン酸を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用いて得られるＮ‐アセチルノイラミン酸をＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの製造のための基質に用いるときは、上記の媒体中に生成、蓄積したＮ‐アセチルノイラミン酸を採取して用いてもよいし、Ｎ‐アセチルノイラミン酸が生成、蓄積した媒体をそのままＮ‐アセチルノイラミン酸として用いてもよい。
【００７３】
反応溶液からのＮ‐アセチルノイラミン酸の採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法によって行うことができる。
ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの製造に用いるＮ−アセチルノイラミン酸は、１ｍｍｏｌ／ｌ〜３ｍｏｌ／ｌの範囲で、好ましくは１０〜５００ｍｍｏｌ／ｌの範囲で用いる。
ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの生成に用いる各酵素源はいずれも、培養物を遠心分離して得られる菌体の湿重量にして１〜５００ｇ／ｌ、好ましくは５０〜３００ｇ／ｌで用いる。
【００７４】
水性媒体中に生成したＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの分離定量はＨＰＬＣを用いて公知の方法に従って行うことができる(WO98/12343)。
反応液中に生成したＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法によって行うことができる。
２）ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの製造２
Ｎ‐アセチルグルコサミン‐２‐エピメラーゼ、Ｎ‐アセチルノイラミン酸シンターゼおよび本発明で用いられるＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する一つの微生物またはこれらの蛋白質を生産する能力を任意の組み合わせですべて有する複数の微生物の培養物もしくは該培養物の処理物、およびＣＴＰ前駆物質（II）からＣＴＰまたはＣＴＰ前駆物質（I）を生産する能力を有する原核生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、ＣＴＰ前駆物質（II）、Ｎ‐アセチルグルコサミンおよびエネルギー供与体を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃを生成、蓄積させることができる。
【００７５】
Ｎ‐アセチルグルコサミン‐２‐エピメラーゼを生産する能力、Ｎ‐アセチルノイラミン酸シンターゼを生産する能力および本発明で用いられるＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を任意の組み合わせですべて有する複数の微生物としては、上記能力から選ばれる１つ以上の能力を有する微生物、前記で選択されなかった能力を１つ以上有する微生物、前記２つの微生物が有していない残りの能力のうち１つ以上の能力を有する微生物からなる複数の微生物をあげることができる。
【００７６】
Ｎ‐アセチルグルコサミン‐２‐エピメラーゼ、Ｎ‐アセチルノイラミン酸シンターゼおよび本発明で用いられるＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する一つの微生物またはこれらの蛋白質を生産する能力を任意の組み合わせですべて有する複数の微生物としては、上記の酵素または蛋白質をコードするＤＮＡで形質転換された１つまたは複数の微生物があげられる。
【００７７】
上記した微生物、および該微生物の培養物は、（１）および（２）に記載の方法に準じ、それぞれ取得することができる。
上記した微生物の培養物の処理物としては、１）に記載の培養物の処理物と同じものをあげることができる。
ＣＴＰ前駆物質（II）からＣＴＰまたはＣＴＰ前駆物質（I）を生産する能力を有する原核生物としては、１）に記載の原核生物をあげることができる。
【００７８】
ＣＴＰ前駆物質（II）からＣＴＰまたはＣＴＰ前駆物質（I）を生産する能力を有する原核生物の培養は（１）に記載の形質転換体の培養と同様の方法で行うことができる。
ＣＴＰ前駆物質（II）からＣＴＰまたはＣＴＰ前駆物質（I）を生産する能力を有する原核生物の培養物の処理物としては、１）に記載の培養物の処理物と同じものをあげることができる。
【００７９】
ＣＴＰ前駆物質（II）としては、１）に記載のＣＴＰ前駆物質（II）と同じものを用いることができ、１ｍｍｏｌ／ｌ〜１ｍｏｌ／ｌの範囲で用いることができる。
ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの製造法で用いられる水性媒体は、１）に記載のものと同じものを用いることができる。
ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの製造法において、必要に応じて界面活性剤あるいは有機溶媒を添加してもよく、１）に記載の界面活性剤あるいは有機溶媒と同じものを、いずれも同様の濃度で用いることができる。
【００８０】
ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの製造法において、ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの生成反応は、水性媒体中、ｐＨ５〜７．５、好ましくはｐＨ６．５〜７．５、２０〜５０℃の条件で１〜９６時間行う。該生成反応において、必要に応じてＭｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４等の無機塩、補酵素、フィチン酸等を添加することができる。
ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの製造法において用いるエネルギー供与体は、１）に記載のものと同じものを、同様の濃度で用いることができる。
【００８１】
ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの製造に用いるＮ‐アセチルグルコサミンは、特に制限はなく、市販品や微生物を利用して生産したもの(Metab. Eng., 7, 201(2005)) などを用いることができる。
ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの製造に用いるＮ‐アセチルグルコサミンは、１ｍｍｏｌ／ｌ〜３ｍｏｌ／ｌの範囲で、好ましくは１０〜５００ｍｍｏｌ／ｌの範囲で用いる。
【００８２】
ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの生成に用いる各酵素源はいずれも、培養物を遠心分離して得られる菌体の湿重量にして１〜５００ｇ／ｌ、好ましくは５０〜３００ｇ／ｌで用いる。
水性媒体中に生成したＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの分離定量はＨＰＬＣを用いて公知の方法(WO98/12343)に従って行うことができる。
反応液中に生成したＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法によって行うことができる。
３）ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの製造３
Ｎ‐アセチルグルコサミン‐２‐エピメラーゼを生産する能力、Ｎ‐アセチルノイラミン酸シンターゼを生産する能力、ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質を生産する能力およびＣＴＰ前駆物質（I）からＣＴＰを生産する能力を持っている１つの原核生物、またはこれらの能力を任意の組み合わせですべて有する複数の原核生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、エネルギー供与体、ＣＴＰ前駆物質（I）およびＮ‐アセチルグルコサミンを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃを生成、蓄積させることもできる。
【００８３】
Ｎ‐アセチルグルコサミン‐２‐エピメラーゼを生産する能力、Ｎ‐アセチルノイラミン酸シンターゼを生産する能力、ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質を生産する能力およびＣＴＰ前駆物質（I）からＣＴＰを生産する能力を任意の組み合わせですべて有する複数の原核生物としては、上記能力から選ばれる１つ以上の能力を有する原核生物、前記で選択されなかった能力を１つ以上有する原核生物、前記２つの原核生物が有していない残りの能力のうち１つ以上の能力を有する原核生物、および前記３つの原核生物が有していない残りの能力を有する原核生物からなる複数の原核生物をあげることができる。
【００８４】
Ｎ‐アセチルグルコサミン‐２‐エピメラーゼを生産する能力、Ｎ‐アセチルノイラミン酸シンターゼを生産する能力、ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質を生産する能力およびＣＴＰ前駆物質（I）からＣＴＰを生産する能力を持っている１つの原核生物としては、例えば、ＣＴＰ前駆物質（I）からＣＴＰを生産する能力を持っている原核生物であって、かつＮ‐アセチルグルコサミン‐２‐エピメラーゼ、Ｎ‐アセチルノイラミン酸シンターゼおよびＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡで形質転換された原核生物をあげることができる。
【００８５】
Ｎ‐アセチルグルコサミン‐２‐エピメラーゼを生産する能力、Ｎ‐アセチルノイラミン酸シンターゼを生産する能力、ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質を生産する能力およびＣＴＰ前駆物質（I）からＣＴＰを生産する能力を任意の組み合わせですべて有する複数の原核生物としては、ＣＴＰ前駆物質（I）からＣＴＰを生産する能力を有する原核生物であって、かつＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡで形質転換された原核生物、ならびにＮ‐アセチルグルコサミン‐２‐エピメラーゼをコードするＤＮＡおよびＮ‐アセチルノイラミン酸シンターゼをコードするＤＮＡで形質転換された原核生物をあげることができる。
【００８６】
該原核生物は、ＣＴＰ前駆物質（I）からＣＴＰを生産する能力を持っている原核生物を宿主として用い、（１）に記載の方法に準じ、それぞれのＤＮＡの塩基配列に基づいて取得することができる。
ＣＴＰ前駆物質（I）からＣＴＰを生産する能力を持っている原核生物としては、該能力を有する原核生物であれば特に制限はないが、好ましくはエシェリヒア属またはコリネバクテリウム属に属する原核生物、より好ましくはEshcerichia coliまたはCorynebacterium ammoniagenes、さらに好ましくはEshcerichia coliをあげることができる。
【００８７】
また、該原核生物の培養物は、（２）に記載の方法に準じて取得することができる。
該培養物の処理物としては、１）に記載の培養物の処理物と同じものをあげることができる。
ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの製造法に用いるＣＴＰ前駆物質（I）としては、１）に記載のＣＴＰ前駆物質（I）と同じものを同様の濃度で用いることができる。
【００８８】
ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの製造法に用いる水性媒体としては、１）に記載の水性媒体と同じものを用いることができる。
ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの製造法において、必要に応じて界面活性剤あるいは有機溶媒を添加してもよく、１）に記載の界面活性剤あるいは有機溶媒と同じものを、いずれも同様の濃度で用いることができる。
【００８９】
ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの製造法において、ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの生成反応は、水性媒体中、ｐＨ５〜７．５、好ましくはｐＨ６．５〜７．５、２０〜５０℃の条件で１〜９６時間行う。該生成反応において、必要に応じてＭｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４等の無機塩、補酵素、フィチン酸等を添加することができる。
ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの製造法において用いるエネルギー供与体は、１）に記載のものと同じものを、同様の濃度で用いることができる。
【００９０】
ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの製造に用いるＮ‐アセチルグルコサミンは、特に制限はなく、市販品や微生物を利用して生産したもの(Metab. Eng., 7, 201(2005))などを用いることができ、１ｍｍｏｌ／ｌ〜３ｍｏｌ／ｌの範囲で、好ましくは１０〜５００ｍｍｏｌ／ｌの範囲で用いる。
ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの生成に用いる各酵素源はいずれも、培養物を遠心分離して得られる菌体の湿重量にして１〜５００ｇ／ｌ、好ましくは５０〜３００ｇ／ｌで用いる。
【００９１】
水性媒体中に生成したＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの分離定量はＨＰＬＣを用いて公知の方法(WO98/12343)に従って行うことができる。
反応液中に生成したＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法によって行うことができる。
[Ｂ]Ｎ‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造
（１）シアリルトランスフェラーゼを生産する能力を有する微生物の作製
本発明の方法で使用するシアリルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物は、該能力を有する微生物であれば特に制限されないが、該微生物としては、人為的な操作を行わなくてもシアリルトランスフェラーゼを生産する能力を有している微生物と、シアリルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡで形質転換された微生物をあげることができる。
【００９２】
人為的な操作を行わなくてもシアリルトランスフェラーゼを生産する能力を有する微生物としては、パスツレラ属に属する微生物、例えばPasteurella multocida PM70株（ミネソタ大学より分譲可能）があげられる。
シアリルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡで形質転換された微生物としては、例えばPasteurella multocidaのpm0188で特定される塩基配列を有するＤＮＡ(WO03/27297)を適当な発現ベクターに挿入した組換え体ＤＮＡで形質転換された微生物、該塩基配列を有するＤＮＡを染色体上に挿入された微生物があげられる。該塩基配列を有するＤＮＡで形質転換された微生物は、その塩基配列に基づき[Ａ]の（１）および（２）に記載の方法に準じて同様に調製することができる。
（２）Ｎ‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造
１）Ｎ‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造１
上記［Ｂ］の（１）で得られるシアリルトランスフェラーゼを生産する能力を有する微生物の培養物は［Ａ］の（２）に記載の方法に従い調製することができる。
【００９３】
得られた培養物または該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、［Ａ］の（３）のいずれかの方法で得られるＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃおよび受容体糖質を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＮ‐アセチルノイラミン酸含有糖質を生成、蓄積させることができる。
Ｎ‐アセチルノイラミン酸含有糖質を製造する際に用いるＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃは、本発明の方法で製造したＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃであればよく、ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃが生成、蓄積した媒体中から採取したＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃを用いてもよいし、ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃが生成、蓄積した媒体をそのままＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃとして用いてもよい。
【００９４】
Ｎ‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造において用いられる受容体糖質としては、シアリルトランスフェラーゼの基質になるものであれば、オリゴ糖、多糖、ならびに糖蛋白質および糖脂質等の複合糖質などいずれでもよい。
オリゴ糖または多糖としては、非還元末端にガラクトースを有するオリゴ糖または多糖、あるいは非還元末端にＮ‐アセチルノイラミン酸を有するオリゴ糖または多糖をあげることができ、好ましくは非還元末端にラクトース、グロボトリオース、Ｎ‐アセチルラクトサミン、ラクト‐Ｎ‐テトラオース、ラクト‐Ｎ‐ネオテトラオース、ルイスaおよびルイスＸからなる群より選ばれる構造を有するオリゴ糖、または非還元末端にNeuAcα2-Galβ1-4GlcおよびNeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAcからなる群より選ばれる構造を有するオリゴ糖、より好ましくはラクトースをあげることができる。
【００９５】
複合糖質としては、非還元末端にガラクトースまたはＮ‐アセチルノイラミン酸を有する複合糖質をあげることができる。
Ｎ−アセチルノイラミン酸含有糖質の製造に用いる受容体糖質は、１ｍｍｏｌ／ｌ〜３ｍｏｌ／ｌ、好ましくは５０ｍｍｏｌ／ｌ〜１ｍｏｌ／ｌの範囲で用いる。
本発明のＮ−アセチルノイラミン酸含有糖質の製造法で生産されるＮ‐アセチルノイラミン酸含有糖質としては、受容体糖質にＮ‐アセチルノイラミン酸が付加した糖質、具体的には非還元末端にＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、ＮｅｕＡｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃおよびＮｅｕＡｃα２−８ＮｅｕＡｃからなる群より選ばれる構造を有するオリゴ糖を含む糖質をあげることができ、好ましくは３´‐シアリルラクトースまたは６´‐シアリルラクトースをあげることができる。
【００９６】
Ｎ‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造に用いるシアリルトランスフェラーゼを生産する能力を有する微生物の培養物の処理物としては、[Ａ］‐（３）の１）に記載の培養物の処理物と同じものをあげることができる。
Ｎ‐アセチルノイラミン酸含有糖質を製造する際に用いる水性媒体、界面活性剤および有機溶媒は、［Ａ］の（３）に記載のＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの製造方法に準じた方法で用いることができる。
【００９７】
Ｎ‐アセチルノイラミン酸含有糖質を製造する際の、ｐＨ、温度および時間等の条件については、［Ａ］の（３）に記載のＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの製造方法に準じた方法で用いることができる。
Ｎ−アセチルノイラミン酸含有糖質を製造する反応において、必要に応じてＭｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４等の無機塩、補酵素、フィチン酸等を添加することができる。
【００９８】
Ｎ−アセチルノイラミン酸含有糖質の製造に用いる各酵素源はいずれも、培養物を遠心分離して得られる菌体の湿重量にして１〜５００ｇ／ｌ、好ましくは５０〜３００ｇ／ｌの濃度で用いる。
水性媒体中に生成したＮ‐アセチルノイラミン酸含有糖質の分離定量はDionex社製の糖分析装置などを用いて行うことができる(Anal. Biochem., 189, 151 (1990))。
【００９９】
水性媒体中に生成したＮ‐アセチルノイラミン酸含有糖質の採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法によって行うことができる。
２）Ｎ‐アセチルノイラミン酸含有複合等質の製造２
ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質とシアリルトランスフェラーゼとを生産する能力を有する微生物、またはそれぞれの蛋白質を生産する能力を有する２種の微生物の培養物もしくは該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、Ｎ‐アセチルノイラミン酸および受容体糖質を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でＮ‐アセチルノイラミン酸含有糖質を生成、蓄積させ、該水性媒体中からＮ‐アセチルノイラミン酸含有糖質を採取することによりＮ‐アセチルノイラミン酸含有糖質を製造することもできる。
【０１００】
ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質およびシアリルトランスフェラーゼを生産する能力を有する微生物は、［Ａ］の（１）に準じた方法でそれぞれの蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列に基づいて作製することができ、該微生物の培養物は、［Ａ］の（２）に準じた方法で該微生物を培養することにより得ることができる。
ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質とシアリルトランスフェラーゼとを生産する能力を有する微生物、またはそれぞれの蛋白質を生産する能力を有する２種の微生物の培養物もしくは該培養物の処理物を酵素源として、Ｎ‐アセチルノイラミン酸含有糖質を製造するときは、必要に応じて媒体中にエネルギー供与体を加えてもよい。
【０１０１】
上記したエネルギー供与体は、微生物細胞内で代謝されてＡＴＰを生成することができる物質であればよく、具体的にはグルコース、フルクトース、シュークロース、ラクトース、マルトース、マンニトール、ソルビトール等の炭水化物、ピルビン酸、乳酸、酢酸等の有機酸、グリシン、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸等のアミノ酸、糖蜜、澱粉加水分解物等をあげることができる。
【０１０２】
Ｎ−アセチルノイラミン酸含有糖質の製造に用いるエネルギー供与体はいずれも、５ｍｏｌ／ｌ以下の濃度で用いることが好ましい。
Ｎ‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造に用いるＮ‐アセチルノイラミン酸は、市販品や、Ｎ−アセチルグルコサミンからＮ−アセチルノイラミン酸を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、Ｎ‐アセチルグルコサミンおよびエネルギー供与体を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＮ‐アセチルノイラミン酸を生成、蓄積させることにより製造したＮ‐アセチルノイラミン酸など、特に制限はない。
【０１０３】
また、Ｎ‐アセチルグルコサミンからＮ‐アセチルノイラミン酸を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源として製造したＮ‐アセチルノイラミン酸を用いるときは、媒体中に生成、蓄積したＮ‐アセチルノイラミン酸を分離精製して用いてもよいし、Ｎ‐アセチルノイラミン酸の生成、蓄積した媒体を、Ｎ‐アセチルノイラミン酸として用いてもよい。
【０１０４】
受容体糖質としては、［Ｂ］の（２）の１）の方法と同じ受容体糖質を用いることができ、またこの方法で生産されるＮ‐アセチルノイラミン酸含有糖質は、［Ｂ］の（２）の１）に記載のＮ‐アセチルノイラミン酸含有糖質と同じＮ‐アセチルノイラミン酸含有糖質である。
上記した微生物の培養物は、［Ａ］の（２）に記載の方法に準じて取得することができる。
【０１０５】
該培養物の処理物としては、［Ａ］‐（３）の１）に記載の培養物の処理物と同じものをあげることができる。
Ｎ‐アセチルノイラミン酸含有糖質を製造する際に用いる水性媒体あるいは界面活性剤または有機溶媒については、［Ａ］の（３）に記載のＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの製造方法に準じた方法で用いることができる。
【０１０６】
Ｎ‐アセチルノイラミン酸含有糖質を製造する際の、ｐＨ、温度または時間等の条件については、［Ａ］の（３）に記載のＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの製造方法に準じた方法で行うことができる。
Ｎ‐アセチルノイラミン酸含有糖質を製造する反応において、必要に応じてＭｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４等の無機塩、補酵素、フィチン酸等を添加することができる。
【０１０７】
Ｎ−アセチルノイラミン酸含有糖質の製造に用いる各酵素源はいずれも、培養物を遠心分離して得られる菌体の湿重量にして１〜５００ｇ／ｌ、好ましくは５０〜３００ｇ／ｌの濃度で用いる。
水性媒体中に生成したＮ‐アセチルノイラミン酸含有糖質の分離定量はDionex社製の糖分析装置などを用いて行うことができる(Anal. Biochem., 189, 151 (1990))。
【０１０８】
水性媒体中に生成したＮ‐アセチルノイラミン酸含有糖質の採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法によって行うことができる。
３）Ｎ‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造３
Ｎ‐アセチルノイラミン酸含有糖質は、Ｎ‐アセチルグルコサミン‐２‐エピメラーゼ、Ｎ‐アセチルノイラミン酸シンターゼ、ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質およびシアリルトランスフェラーゼのすべてを生産する能力を持っている１つの微生物、またはこれらの蛋白質を生産する能力を任意の組み合わせですべて有する複数の微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、エネルギー供与体、Ｎ‐アセチルグルコサミンおよび受容体糖質を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でＮ‐アセチルノイラミン酸含有糖質を生成、蓄積させ、該水性媒体中からＮ‐アセチルノイラミン酸含有糖質を採取することによっても製造することができる。
【０１０９】
Ｎ‐アセチルグルコサミン‐２‐エピメラーゼ、Ｎ‐アセチルノイラミン酸シンターゼ、ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質およびシアリルトランスフェラーゼを生産する能力を任意の組み合わせですべて有する複数の微生物としては、上記蛋白質から選ばれる１つ以上の蛋白質を生産する能力を有する微生物、前記で選択されなかった１つ以上の蛋白質を生産する能力を有する微生物、前記２つの微生物が有していない残りの蛋白質のうち１つ以上の蛋白質を生産する能力を有する微生物、および前記３つの微生物が有していない残りの蛋白質を生産する能力を有する微生物からなる複数の微生物をあげることができる。
【０１１０】
Ｎ‐アセチルグルコサミン‐２‐エピメラーゼ、Ｎ‐アセチルノイラミン酸シンターゼ、ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質およびシアリルトランスフェラーゼのすべてを生産する能力を持っている１つの微生物としては、Ｎ‐アセチルグルコサミン‐２‐エピメラーゼをコードするＤＮＡ、Ｎ‐アセチルノイラミン酸シンターゼをコードするＤＮＡ、ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡおよびシアリルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡで形質転換された微生物をあげることができる。
【０１１１】
Ｎ‐アセチルグルコサミン‐２‐エピメラーゼ、Ｎ‐アセチルノイラミン酸シンターゼ、ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質およびシアリルトランスフェラーゼを生産する能力を任意の組み合わせですべて有する複数の微生物としては、例えばＮ‐アセチルグルコサミン‐２‐エピメラーゼをコードするＤＮＡおよびＮ‐アセチルノイラミン酸シンターゼをコードするＤＮＡで形質転換された微生物、並びにＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡおよびシアリルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡで形質転換された微生物をあげることができる。
【０１１２】
上記した微生物は、［Ａ］の（１）に記載の方法に準じてそれぞれの蛋白質をコードする塩基配列に基づいて作製することができ、該微生物の培養物は、［Ａ］の（２）に記載の方法に準じて該微生物を培養し、得ることができる。
上記のＮ‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造法で用いるエネルギー供与体は、微生物細胞内で代謝されてＡＴＰやホスホエノールピルビン酸等に変換される物質であればよく、グルコース、フルクトース、シュークロース、ラクトース、マルトース、マンニトール、ソルビトール等の炭水化物、ピルビン酸、乳酸、酢酸等の有機酸、グリシン、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸等のアミノ酸、糖蜜、澱粉加水分解物等をあげることができ、いずれも、１ｍｍｏｌ／ｌ〜５ｍｏｌ／ｌの濃度で用いる。
【０１１３】
上記のＮ‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造法で用いるＮ‐アセチルグルコサミンは、市販品でも微生物を利用して製造したもの(Metab. Eng., 7, 201(2005))でもよく、また1ｍｍｏｌ／ｌ〜１ｍｏｌ／ｌの濃度で用いる。
上記のＮ‐アセチルノイラミン酸含有糖質を製造する際に用いる受容体糖質としては、［Ｂ］の（２）の１）の方法で用いる受容体糖質と同じものを用いることができ、また上記の方法で製造可能なＮ‐アセチルノイラミン酸含有糖質は、［Ｂ］の（２）の１）と同じＮ‐アセチルノイラミン酸含有糖質である。
【０１１４】
上記製造法で用いられる微生物の培養物は、［Ａ］の（２）に記載の方法に準じて取得することができる。
該培養物の処理物としては、［Ａ］の（３）の１）に記載の培養物の処理物と同じものをあげることができる。
上記のＮ‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造法に用いられる水性媒体あるいは界面活性剤または有機溶媒としては、［Ａ］の（３）に記載したものをあげることができ、当該記載に準じた方法で用いることができる。
【０１１５】
上記のＮ‐アセチルノイラミン酸含有糖質を製造する際の、ｐＨ、温度または時間等の条件としては、［Ａ］の（３）に記載の条件をあげることができる。
Ｎ‐アセチルノイラミン酸含有糖質を製造する反応において、必要に応じてＭｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４等の無機塩、補酵素、フィチン酸等を添加することができる。
上記のＮ‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造に用いる各酵素源はいずれも、培養物を遠心分離して得られる菌体の湿重量にして１〜５００ｇ／ｌ、好ましくは５０〜３００ｇ／ｌの濃度で用いる。
【０１１６】
上記の製造法により水性媒体中に生成したＮ‐アセチルノイラミン酸含有糖質の分離定量はDionex社製の糖分析装置などを用いて行うことができる(Anal. Biochem., 189, 151 (1990))。
水性媒体中に生成したＮ‐アセチルノイラミン酸含有糖質の採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法によって行うことができる。
【０１１７】
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【０１１８】
Pasteurella multocida由来のＣＭＰ-ＮｅｕＡｃシンターゼを使ったＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの生産
（１）Ｎ‐アセチルノイラミン酸リアーゼ遺伝子（nanA）欠損株の調製
Escherichia coli HN0074(FERM BP-4425)の染色体ＤＮＡ上のnanAが欠損した菌株は、ラムダファージの相同組換え系を利用した方法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 6641-6645(2000))を用いて作製した。
【０１１９】
使用するEscherichia coli HN0074(FERM BP-4425)の染色体ＤＮＡは、該微生物を公知の方法によって培養し、培養後カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーに記載の方法により単離精製した。プラスミドpKD46、pKD3およびpCP20は、エシェリヒア・コリ ジェネティックストックセンター（米国エール大学）から該プラスミドを保持するエシェリヒア・コリ株を入手し、該大腸菌から抽出したものを用いた。
【０１２０】
配列番号１３に表されるEscherichia coliのnanA遺伝子を含む塩基配列のうち、塩基番号１〜９５８および１９７１〜２８７４で表される塩基配列からなるＤＮＡ断片をＰＣＲ反応により増幅した。これらの増幅断片を、ｐＫＤ３を鋳型として増幅した、両端にFRT（FLP recognition target）サイトを持つcat（chloramphenicol acetyl transferase）遺伝子断片の両端に連結した。該連結断片を、あらかじめｐＫＤ４６を導入し、λ Red recombinaseを誘導発現させたEscherichia coli HN0074株にエレクトロポレーション法により導入した。該連結断片の導入株を培養し、cat遺伝子が染色体上に組み込まれたクロラムフェニコール耐性株を選択した。該クロラムフェニコール耐性株からｐＫＤ４６を除去した後、ｐＣＰ２０を導入してFLP recombinaseを誘導発現させ培養した後、cat遺伝子が取り除かれたクロラムフェニコール感受性株を選択し、最後にｐＣＰ２０を除去した。
【０１２１】
これらの一連の操作により、Escherichia coli HN0074株の染色体ＤＮＡ上の配列番号１３に表される塩基配列の塩基番号９５９〜１９７０に相当する部分が欠損した大腸菌を取得することができた。
当該nanA欠損株を、Escherichia coli N18-14と名づけた。
（２）発現ベクターpTK31の作製
発現ベクターpTrS32(FERM BP-5408)をPstIおよびHindIIIで酵素消化し、3.5kbのDNA断片を回収し、同様にpKYP10(特開昭58−110600)をPstIおよびHindIIIで酵素消化し、１．０ｋｂの断片を回収した。該３．５ｋｂと１．０ｋｂの断片を連結し、４．５ｋｂのpTrS31を取得した。
【０１２２】
pTrS31をClaIおよびPstIで酵素消化し得られた３．５ｋｂのＤＮＡ断片と、pPAC1(FERM BP-6054, WO 98/12343)をClaIおよびPstIで酵素消化して得られた２．３ｋｂのＤＮＡ断片とを連結し、５．８ｋｂのpNT22を取得した。
配列番号３および４で表される塩基配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてpTrS31を鋳型にＰＣＲを行って得られた３．８ kbのPCR産物をXhoIで酵素消化した。pUC4K（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）をSalIで酵素消化しカナマイシン耐性遺伝子を含む１．３ｋｂのＤＮＡ断片を取得し、上記のXhoI消化ＤＮＡ断片と連結した。
【０１２３】
その後、Stratagene社のSite-directed mutagenesis kitを用いて、カナマイシン耐性遺伝子上のClaIサイト、HindIIIサイトおよびNruIサイトの破壊を行い、４．９ｋｂのpTK31を造成した。
（３）ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ発現株の造成
Pasteurella multocida PM70株の染色体DNAは、ミネソタ大学より分譲されたものを用いた。
【０１２４】
配列番号５および６で表される塩基配列を有する合成ＤＮＡを用いて、Pasteurella multocida PM70株の染色体ＤＮＡより、ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼをコードすると推定されたＯＲＦを含むＤＮＡ断片を下記方法で増幅した。
上記合成ＤＮＡをプライマーセットとして用い、Pasteurella multocida PM70株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲは染色体ＤＮＡ０．１μｇ、プライマー各０．５μｍｏｌ／ｌ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）２．５ｕｎｉｔｓ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液５μｌ、ｄｅｏｘｙＮＴＰ 各２００μｍｏｌ／ｌを含む反応液５０μｌを用い、９８℃で１０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間の工程を３０回繰り返すことにより行った。
【０１２５】
ＰＣＲ反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、目的の断片が増幅されていることを確認後、残りの反応液をＱＩＡ ｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ （ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。各増幅されたＤＮＡ断片の溶出は、滅菌水５０μｌにて行った。
該ＤＮＡ断片をpCR-Blunt vector（インビトロジェン社製）と連結し、該連結反応液を用いて公知の方法によりEscherichia coli DH5α株を形質転換し、得られた形質転換体を５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地［バクトトリプトン（ディフコ社製）１０ｇ／ｌ、酵母エキス（ディフコ社製）１０ｇ／ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／ｌ、アガロース１５ｇ／ｌ］に塗布後、３０℃で一晩培養した。
【０１２６】
生育した形質転換体を５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ液体培地にて３０℃で一晩培養して得られた培養物からクラボウ社製核酸自動分離装置ＰＩ５０を用いてプラスミドを抽出した。
得られたプラスミドに含まれるＰＣＲ増幅断片の塩基配列を常法により決定し、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする、配列番号２で表される塩基配列であることを確認した。
【０１２７】
該プラスミドを制限酵素Csp45I、BamHIにより切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、約０．７ｋｂの断片をGENECLEANII kit（Qbiogene社製）を用いて回収した。同様に、pTK31を制限酵素ClaI、BamHIにより切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、４．６ｋｂの断片を回収した。
該０．７ｋｂと４．６ｋｂの断片とを、ライゲーションキット（タカラバイオ社製）を用いて連結した。連結反応は１６℃で１６時間行った。該連結反応液を用いてEscherichia coli ＤＨ５α株を公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体を５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
【０１２８】
生育した該形質転換体を５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ液体培地にて３０℃で一晩培養して得られた培養物から、クラボウ社製自動核酸分離装置ＰＩ５０を用いてプラスミドを抽出した。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認し、該プラスミドをpMnK1と命名した。
pMnK1を用いてEscherichia coli N18-14株を公知の方法に従って形質転換し、ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼを発現するEscherichia coli N18-14/pMnK1を取得した。
（４）Escherichia coli N18-14/pMnK1湿菌体の取得
実施例１（３）で得たEscherichia coli N18-14/pMnK1株を、カナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むLB培地１２５ｍｌの入った１Ｌ容バッフル付き三角フラスコに接種し、３０℃、２２０ｒｐｍの条件で１０時間培養した。該培養液１２５ｍｌを、カナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＴＢ＋Ｇｌｃ培地［グルコース１０ｇ／ｌ（別殺菌）、バクトトリプトン（ディフコ社製）１２ｇ／ｌ、酵母エキス（ディフコ社製）２４ｇ／ｌ、KH2PO4２．３ｇ／ｌ（別殺菌）、K2HPO4 １２．５ｇ／ｌ（別殺菌）］２．５Ｌの入った５Ｌ容培養槽に接種し、３０℃、６００ｒｐｍ、通気量２．５Ｌ／分の条件で８時間培養を行った。培養中、培地中のグルコースが消失した時点でさらにグルコース１０ｇ／ｌ溶液１２５ｍｌを添加した。該培養中、２８％アンモニア水を使用して培養液のｐHを７．０に維持した。
【０１２９】
該培養液を遠心分離し、湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いることができた。
（５）ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの生産
Escherichia coli N18-14/pMnK1株湿菌体 ２００ｇ／ｌ、K2HPO4７．３ｇ／ｌ、KH2PO4 １２．７ｇ／ｌ、MgSO4 １５ｇ／ｌ、フラクトース５０ｇ／ｌ、シアル酸３０ｇ／ｌ、CMP・2Na １７ｇ／ｌ、ナイミーンＳ−２１５ ４ｇ／ｌ、キシレン１０ｍｌ／ｌの組成からなる反応液３０ｍｌを２００ｍｌ容ビーカーに入れ、該反応液をマグネティック・スターラーを用い、９００ｒｐｍで攪拌し、３２℃で２６時間反応を行った。
【０１３０】
反応中、5N NaOHを用いて該反応液のpHを７．２に維持した。
該反応により、反応液中に１０ｇ／ｌのＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃ（Na塩）が生成した。
【実施例２】
【０１３１】
Ｎ−アセチルノイラミン酸含有糖質の製造
（１）Escherichia coli K235株由来ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンターゼ発現株の調製
配列番号７および８で表される塩基配列を有する合成ＤＮＡを用いて、Escherichia coli K235株(ATCC13027)の染色体ＤＮＡより、ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼ遺伝子neuAを含むＤＮＡ断片を下記方法で増幅した。
上記合成ＤＮＡをプライマーセットとして、実施例１の（３）と同一の条件でＰＣＲを行った。
【０１３２】
該ＰＣＲ反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、目的の断片が増幅されていることを確認後、残りの反応液と等量のTE[10mmol/l Tris-HCl、1mmol/l EDTA (pH 8.0)]飽和フェノール／クロロホルム(1vol/vol)を添加し、混合した。
該混合液を遠心分離後、得られた上層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離しＤＮＡの沈殿を取得し、該ＤＮＡの沈殿を２０μｌのＴＥに溶解した。該溶解液５μｌを用い、ＤＮＡを制限酵素HindIIIおよびBamHIで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、１．３ｋｂの断片を回収した。
【０１３３】
pBluescript II SK(+)（ストラタジーン社製）０．２μｇを制限酵素HindIIIおよびＢａｍＨIで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に２．９ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
該１．３ｋｂおよび２．９ｋｂの断片をライゲーションキットを用いて、１６℃で１６時間、連結反応を行った。該連結反応液を用いてEscherichia coli NM522を公知の方法に従って形質転換し、得られた形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
【０１３４】
生育した形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地にて３０℃で一晩培養して得られた培養物から、クラボウ社製自動核酸分離装置ＰＩ５０を用いてプラスミドを抽出した。
得られたプラスミドに含まれるＰＣＲ増幅断片の塩基配列を常法により決定したところ、GenBank ACCESSION No. J05023に記載のEscherichia coli 由来のＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃシンターゼをコードするneuAと同じ塩基配列であった。
【０１３５】
該プラスミドをClaIおよびBamHIで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、１．３ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
pNT22 ０．２μｇを制限酵素ClaIおよびBamHIで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に５．５ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
該１．３ｋｂおよび５．５ｋｂの断片をライゲーションキットを用いて、１６℃で１６時間、連結反応を行った。該連結反応液を用いてEscherichia coli NM522を公知の方法に従って形質転換し、形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
【０１３６】
生育した形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地にて３０℃で一晩培養して得られた培養物から、クラボウ社製自動核酸分離装置ＰＩ５０を用いてプラスミドを抽出した。該プラスミドの構造を制限酵素消化によって確認し、該プラスミドをpTA23と命名した。
配列番号９および１０で表される塩基配列を有するＤＮＡを用いてEscherichia coli W3110株の染色体ＤＮＡより、ＣＴＰシンターゼ遺伝子pyrGを含む部分を増幅した。上記と同様の方法で目的とするＤＮＡ断片の増幅を確認し、該ＤＮＡ断片の回収を行った。また、該ＤＮＡ断片の塩基配列を常法により決定したところ、GenBank ACCESSION No. M12843に記載のpyrGと同じ塩基配列であった。
【０１３７】
該ＤＮＡ断片をBglIIで酵素消化し、１．６ｋｂのＤＮＡ断片を、ｐＴＡ２３をBamHIで酵素消化して、６．８ｋｂのＤＮＡ断片をそれぞれ得た。該１．６ｋｂと６．８ｋｂのＤＮＡ断片を上記と同様の方法で連結し、Escherichia coli NM522に形質転換して得られた形質転換体から抽出したプラスミドをpYP41と命名した。
pYP41をHindIIIおよびSalIで制限酵素消化し、２．９ｋｂのＤＮＡ断片を取得した。同様にpTK31をHindIIIおよびSalIで制限酵素消化し、４．４ｋｂのＤＮＡ断片を取得した。
【０１３８】
該２．９ｋｂおよび４．４ｋｂのＤＮＡ断片を連結し、得られたプラスミドをpTCN21と命名した。pTCN21を公知の方法に従ってEscherichia coli HN0074株に導入し、得られた形質転換体をEscherichia coli HN0074/pTCN21と命名した。
（２）Ｎ‐アセチルノイラミン酸転移酵素発現株の調製
配列番号１１および１２で表される塩基配列を有するＤＮＡを用いてNeisseria gonorrhoeae ATCC33084株の染色体DNAよりα２，３‐シアル酸転移酵素遺伝子（以下、2,3-siaTとも言う）を含むＤＮＡ断片を下記方法により増幅した。
【０１３９】
上記合成ＤＮＡをプライマーセットとして用い、公知の方法で調製したNeisseria gonorrhoeae ATCC33084株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。実施例１（３）と同様の組成の反応液５０μｌを用い、９４℃で１分間、３７℃で２分間、７２℃で３分間の工程を３０回繰り返すことにより行った。
該ＰＣＲ反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、目的の断片が増幅されていることを確認後、残りの反応液と等量のTE飽和フェノール／クロロホルム(1vol/vol)を添加し、混合した。
【０１４０】
該混合液を遠心分離後、得られた上層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離しＤＮＡの沈殿を取得し、該ＤＮＡの沈殿を２０μｌのＴＥに溶解した。該溶解液５μｌを用い、ＤＮＡを制限酵素ClaIおよびBamHIで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、１．０ｋｂの断片を回収した。
【０１４１】
pBluescript II SK(+)（ストラタジーン社製）０．２μｇを制限酵素ＣｌａIおよびＢａｍＨIで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に２．９ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
該１．０ｋｂおよび２．９ｋｂの断片をライゲーションキットを用いて、１６℃で１６時間、連結反応を行った。該連結反応液を用いてEscherichia coli NM522を公知の方法に従って形質転換し、得られた形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
【０１４２】
生育した形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地にて３０℃で一晩培養して得られた培養物から、クラボウ社製自動核酸分離装置ＰＩ５０を用いてプラスミドを抽出した。
得られたプラスミドに含まれるＰＣＲ増幅断片の塩基配列を常法により決定したところ、Gen Bank ACCESSION No. U60664に記載のα２，３‐シアル酸転移酵素をコードする2,3-siaTと同じ塩基配列であった。
【０１４３】
該プラスミドをClaIおよびBamHIで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、１．０ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
pNT22 ０．２μｇを制限酵素ClaIおよびBamHIで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に５．５ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
該１．０ｋｂおよび５．５ｋｂの断片をライゲーションキットを用いて、１６℃で１６時間、連結反応を行った。該連結反応液を用いてEscherichia coli NM522を公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
【０１４４】
生育した形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地にて３０℃で一晩培養して得られた培養物から、クラボウ社製自動核酸分離装置ＰＩ５０を用いてプラスミドを抽出した。該プラスミドの構造を制限酵素消化によって確認し、該プラスミドをpYP3、pYP3をEscherichia coli NM522に導入して得られた形質転換体をEscherichia coli NM522/pYP3と命名した。
（３）Escherichia coli NM522/pYP3湿菌体の取得
上記（２）で得たNM522/pYP3株を、実施例１の（４）と同様に培地および培養条件で培養を行った。その際、カナマイシン５０μｇ／ｍｌの代わりにアンピシリン１００μｇ／ｍｌを用いた。また、５Ｌ容培養槽での培養は、３０℃で４時間、４０℃で４時間行った。得られた培養物を遠心分離し、湿菌体を取得した。
（４）Escherichia coli HN0074/pTCN21湿菌体の取得
上記（１）で得たHN0074/pTCN21株を、実施例１の（４）と同様に培養を行い、得られた培養物を遠心分離し、湿菌体を取得した。
（５）シアリルラクトースの生産
Escherichia coli N18-14/pMnK1株またはEscherichia coli HN0074/pTCN21の湿菌体 １２０ｇ／ｌ、Escherichia coli NM522/pYP3の湿菌体４０ｇ／ｌ、K2HPO4７．３ｇ／ｌ、KH2PO4 １２．７ｇ／ｌ、MgSO4 １５ｇ／ｌ、フラクトース５０ｇ／ｌ、シアル酸３０ｇ／ｌ、ラクトース５０ｇ／ｌ、ナイミーンＳ−２１５ ４ｇ／ｌ、キシレン１０ｍｌ／ｌの組成からなる反応液５０ｍｌ
を微生物培養装置ＢＭＪ(250ml)（エイブル社製）に入れ、６００ｒｐｍで攪拌しながら、３２℃で２４時間反応を行った。
【０１４５】
反応中、5N NaOHを用いて該反応液のpHを７．２に維持し、また１Ｌ／分の通気を行った。
N18-14/pMnK1を使用した反応では２９．０ｇ／ｌ、HN0074/pTCN21を使用した反応では１９．２ｇ／ｌの３´‐シアリルラクトースが蓄積した。
【産業上の利用可能性】
【０１４６】
本発明により、シチジン‐５´‐一リン酸‐Ｎ‐アセチルノイラミン酸およびＮ‐アセチルノイラミン酸含有糖質を効率よく製造することができる。
「配列表フリーテキスト」
配列番号３−人口配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４−人口配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５−人口配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６−人口配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７−人口配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８−人口配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９−人口配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１０−人口配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１１−人口配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１２−人口配列の説明：合成ＤＮＡ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）〜（５）より選ばれる蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、シチジン‐5’‐三リン酸（以下、CTPと略す）またはCTP前駆物質（I）およびN‐アセチルノイラミン酸を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でシチジン‐5’‐一リン酸‐N‐アセチルノイラミン酸（以下、CMP-NeuAcと略す）を生成、蓄積させ、該水性媒体中からCMP-NeuAcを採取することを特徴とするCMP-NeuAcの製造法。
（１）配列番号１に表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
（２）配列番号１に表されるアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつCMP-NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
（３）配列番号１に表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有し、かつCMP‐NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
（４）配列番号２に表される塩基配列を有するＤＮＡにコードされる蛋白質
（５）配列番号２に表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされ、かつCMP-NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
【請求項２】
CTPまたはCTP前駆物質（I）が、CTP前駆物質（II）からCTPまたはCTP前駆物質（I）を生産する能力を有する原核生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、エネルギー供与体およびCTP前駆物質（II）を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でCTPまたはCTP前駆物質（I）を生成、蓄積させて得られるCTPまたはCTP前駆物質（I）である、請求項１に記載のCMP-NeuAcの製造法。
【請求項３】
N‐アセチルノイラミン酸が、Ｎ‐アセチルグルコサミン-２‐エピメラーゼとN‐アセチルノイラミン酸シンターゼとを生産する能力を有する微生物、またはそれぞれの蛋白質を生産する能力を有する２種の微生物の培養物もしくは該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、N‐アセチルグルコサミンおよびエネルギー供与体を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にN‐アセチルノイラミン酸を生成、蓄積させて得られるN-アセチルノイラミン酸である、請求項１または２に記載のCMP-NeuAcの製造法。
【請求項４】
N-アセチルグルコサミン‐２‐エピメラーゼ、N-アセチルノイラミン酸シンターゼおよび以下の（１）〜（５）より選ばれる蛋白質を生産する能力を有する一つの微生物またはこれらの蛋白質を生産する能力を任意の組み合わせですべて有する複数の微生物の培養物もしくは該培養物の処理物、およびCTP前駆物質（II）からCTPまたはCTP前駆物質（I）を生産する能力を有する原核生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、CTP前駆物質（II）、N‐アセチルグルコサミンおよびエネルギー供与体を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でCMP-NeuAcを生成、蓄積させ、該水性媒体中からCMP-NeuAcを採取することを特徴とする、CMP-NeuAcの製造法。
（１）配列番号１に表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
（２）配列番号１に表されるアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつCMP-NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
（３）配列番号１に表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有し、かつCMP‐NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
（４）配列番号２に表される塩基配列を有するＤＮＡにコードされる蛋白質
（５）配列番号２に表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされ、かつCMP-NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
【請求項５】
N‐アセチルグルコサミン‐２‐エピメラーゼを生産する能力、N‐アセチルノイラミン酸シンターゼを生産する能力、以下の（１）〜（５）より選ばれる蛋白質を生産する能力およびCTP前駆物質（I）からCTPを生産する能力を持っている１つの原核生物、またはこれらの能力を任意の組み合わせですべて有する複数の原核生物の培養物もしくは該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、エネルギー供与体、CTP前駆物質（I）およびN‐アセチルグルコサミンを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でCMP‐NeuAcを生成、蓄積させ、該水性媒体中からＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃを採取することを特徴とする、ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの製造法。
（１）配列番号１に表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
（２）配列番号１に表されるアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつCMP-NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
（３）配列番号１に表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有し、かつCMP‐NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
（４）配列番号２に表される塩基配列を有するＤＮＡにコードされる蛋白質
（５）配列番号２に表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされ、かつCMP-NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
【請求項６】
シアリルトランスフェラーゼを生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、請求項１から５のいずれかの方法で製造されたCMP-NeuAcおよび受容体糖質を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でN‐アセチルノイラミン酸含有糖質を生成、蓄積させ、該水性媒体中からN‐アセチルノイラミン酸含有糖質を採取することを特徴とする、N‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造法。
【請求項７】
以下の（１）〜（５）より選ばれる蛋白質とシアリルトランスフェラーゼとを生産する能力を有する微生物、またはそれぞれの蛋白質を生産する能力を有する2種の微生物の培養物もしくは該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、N-アセチルノイラミン酸および受容体糖質を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でN‐アセチルノイラミン酸含有糖質を生成、蓄積させ、該水性媒体中からN‐アセチルノイラミン酸含有糖質を採取することを特徴とするN‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造法。
（１）配列番号１に表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
（２）配列番号１に表されるアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつCMP-NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
（３）配列番号１に表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有し、かつCMP‐NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
（４）配列番号２に表される塩基配列を有するＤＮＡにコードされる蛋白質
（５）配列番号２に表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされ、かつCMP-NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
【請求項８】
N‐アセチルノイラミン酸が、Ｎ‐アセチルグルコサミン-２‐エピメラーゼとN‐アセチルノイラミン酸シンターゼとを生産する能力を有する微生物、またはそれぞれの蛋白質を生産する能力を有する２種の微生物の培養物もしくは該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、エネルギー供与体およびN‐アセチルグルコサミンを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でN‐アセチルノイラミン酸を生成、蓄積させることによって得られたものである、請求項７記載のN‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造法。
【請求項９】
N‐アセチルグルコサミン‐２‐エピメラーゼ、N‐アセチルノイラミン酸シンターゼ、以下の（１）〜（５）より選ばれる蛋白質およびシアリルトランスフェラーゼを生産する能力を持っている１つの微生物、またはこれらの蛋白質を生産する能力を任意の組み合わせですべて有する複数の微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、エネルギー供与体、N‐アセチルグルコサミンおよび受容体糖質を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でN-アセチルノイラミン酸含有糖質を生成、蓄積させ、該水性媒体中からN‐アセチルノイラミン酸含有糖質を採取することを特徴とする、N‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造法。
（１）配列番号１に表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
（２）配列番号１に表されるアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつCMP-NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
（３）配列番号１に表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有し、かつCMP‐NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
（４）配列番号２に表される塩基配列を有するＤＮＡにコードされる蛋白質
（５）配列番号２に表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされ、かつCMP-NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
【請求項１】
以下の（１）〜（５）より選ばれる蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、シチジン‐5’‐三リン酸（以下、CTPと略す）またはCTP前駆物質（I）およびN‐アセチルノイラミン酸を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でシチジン‐5’‐一リン酸‐N‐アセチルノイラミン酸（以下、CMP-NeuAcと略す）を生成、蓄積させ、該水性媒体中からCMP-NeuAcを採取することを特徴とするCMP-NeuAcの製造法。
（１）配列番号１に表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
（２）配列番号１に表されるアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつCMP-NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
（３）配列番号１に表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有し、かつCMP‐NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
（４）配列番号２に表される塩基配列を有するＤＮＡにコードされる蛋白質
（５）配列番号２に表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされ、かつCMP-NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
【請求項２】
CTPまたはCTP前駆物質（I）が、CTP前駆物質（II）からCTPまたはCTP前駆物質（I）を生産する能力を有する原核生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、エネルギー供与体およびCTP前駆物質（II）を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でCTPまたはCTP前駆物質（I）を生成、蓄積させて得られるCTPまたはCTP前駆物質（I）である、請求項１に記載のCMP-NeuAcの製造法。
【請求項３】
N‐アセチルノイラミン酸が、Ｎ‐アセチルグルコサミン-２‐エピメラーゼとN‐アセチルノイラミン酸シンターゼとを生産する能力を有する微生物、またはそれぞれの蛋白質を生産する能力を有する２種の微生物の培養物もしくは該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、N‐アセチルグルコサミンおよびエネルギー供与体を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にN‐アセチルノイラミン酸を生成、蓄積させて得られるN-アセチルノイラミン酸である、請求項１または２に記載のCMP-NeuAcの製造法。
【請求項４】
N-アセチルグルコサミン‐２‐エピメラーゼ、N-アセチルノイラミン酸シンターゼおよび以下の（１）〜（５）より選ばれる蛋白質を生産する能力を有する一つの微生物またはこれらの蛋白質を生産する能力を任意の組み合わせですべて有する複数の微生物の培養物もしくは該培養物の処理物、およびCTP前駆物質（II）からCTPまたはCTP前駆物質（I）を生産する能力を有する原核生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、CTP前駆物質（II）、N‐アセチルグルコサミンおよびエネルギー供与体を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でCMP-NeuAcを生成、蓄積させ、該水性媒体中からCMP-NeuAcを採取することを特徴とする、CMP-NeuAcの製造法。
（１）配列番号１に表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
（２）配列番号１に表されるアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつCMP-NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
（３）配列番号１に表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有し、かつCMP‐NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
（４）配列番号２に表される塩基配列を有するＤＮＡにコードされる蛋白質
（５）配列番号２に表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされ、かつCMP-NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
【請求項５】
N‐アセチルグルコサミン‐２‐エピメラーゼを生産する能力、N‐アセチルノイラミン酸シンターゼを生産する能力、以下の（１）〜（５）より選ばれる蛋白質を生産する能力およびCTP前駆物質（I）からCTPを生産する能力を持っている１つの原核生物、またはこれらの能力を任意の組み合わせですべて有する複数の原核生物の培養物もしくは該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、エネルギー供与体、CTP前駆物質（I）およびN‐アセチルグルコサミンを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でCMP‐NeuAcを生成、蓄積させ、該水性媒体中からＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃを採取することを特徴とする、ＣＭＰ‐ＮｅｕＡｃの製造法。
（１）配列番号１に表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
（２）配列番号１に表されるアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつCMP-NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
（３）配列番号１に表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有し、かつCMP‐NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
（４）配列番号２に表される塩基配列を有するＤＮＡにコードされる蛋白質
（５）配列番号２に表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされ、かつCMP-NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
【請求項６】
シアリルトランスフェラーゼを生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、請求項１から５のいずれかの方法で製造されたCMP-NeuAcおよび受容体糖質を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でN‐アセチルノイラミン酸含有糖質を生成、蓄積させ、該水性媒体中からN‐アセチルノイラミン酸含有糖質を採取することを特徴とする、N‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造法。
【請求項７】
以下の（１）〜（５）より選ばれる蛋白質とシアリルトランスフェラーゼとを生産する能力を有する微生物、またはそれぞれの蛋白質を生産する能力を有する2種の微生物の培養物もしくは該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、N-アセチルノイラミン酸および受容体糖質を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でN‐アセチルノイラミン酸含有糖質を生成、蓄積させ、該水性媒体中からN‐アセチルノイラミン酸含有糖質を採取することを特徴とするN‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造法。
（１）配列番号１に表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
（２）配列番号１に表されるアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつCMP-NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
（３）配列番号１に表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有し、かつCMP‐NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
（４）配列番号２に表される塩基配列を有するＤＮＡにコードされる蛋白質
（５）配列番号２に表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされ、かつCMP-NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
【請求項８】
N‐アセチルノイラミン酸が、Ｎ‐アセチルグルコサミン-２‐エピメラーゼとN‐アセチルノイラミン酸シンターゼとを生産する能力を有する微生物、またはそれぞれの蛋白質を生産する能力を有する２種の微生物の培養物もしくは該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、エネルギー供与体およびN‐アセチルグルコサミンを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でN‐アセチルノイラミン酸を生成、蓄積させることによって得られたものである、請求項７記載のN‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造法。
【請求項９】
N‐アセチルグルコサミン‐２‐エピメラーゼ、N‐アセチルノイラミン酸シンターゼ、以下の（１）〜（５）より選ばれる蛋白質およびシアリルトランスフェラーゼを生産する能力を持っている１つの微生物、またはこれらの蛋白質を生産する能力を任意の組み合わせですべて有する複数の微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、エネルギー供与体、N‐アセチルグルコサミンおよび受容体糖質を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でN-アセチルノイラミン酸含有糖質を生成、蓄積させ、該水性媒体中からN‐アセチルノイラミン酸含有糖質を採取することを特徴とする、N‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造法。
（１）配列番号１に表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
（２）配列番号１に表されるアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつCMP-NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
（３）配列番号１に表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有し、かつCMP‐NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
（４）配列番号２に表される塩基配列を有するＤＮＡにコードされる蛋白質
（５）配列番号２に表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされ、かつCMP-NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
【公開番号】特開２００８−５７９４（Ｐ２００８−５７９４Ａ）
【公開日】平成２０年１月１７日（２００８．１．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１８１０７１（Ｐ２００６−１８１０７１）
【出願日】平成１８年６月３０日（２００６．６．３０）
【出願人】（０００００１０２９）協和醗酵工業株式会社 (276)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１月１７日（２００８．１．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年６月３０日（２００６．６．３０）
【出願人】（０００００１０２９）協和醗酵工業株式会社 (276)
【Ｆターム（参考）】
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