シナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物を有効成分として含む抗ウイルス用組成物
本発明は、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）またはコショウノキ（Ｄａｐｈｎｅ ｋｉｕｓｉａｎａ）の抽出物、またはその分画物を有効成分として含む抗ウイルス用組成物に関するもので、より詳細にはシナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞で免疫関連サイトカインであるインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）の分泌誘導性を通じて強力な抗ウイルス活性を示してウイルス性疾患に卓越した効果があるので、抗ウイルス用組成物に有用に用いることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）またはコショウノキ（Ｄａｐｈｎｅ ｋｉｕｓｉａｎａ）の抽出物、またはその分画物を有効成分として含む抗ウイルス用組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
人類が病んでいる多くの感染性疾患はウイルスによるもので、狂犬病、天然痘、脊髄炎、肝炎、黄熱、免疫欠乏症、脳炎及びエイズなどいろいろ深刻な疾病の原因になる。このようなウイルスによる感染性疾患は、風邪、はしか、お多福風邪及び水痘等のように非常に伝染性が強くて急性病勢を示すだけでなく、呼吸器、消化器障害を示したり、はしか及びサイトメガロウイルスのようなものは先天性異常を誘発して、腫瘍ウイルスとして知られたウイルスは、人体に腫瘍及び癌を誘発する。したがって、抗ウイルス剤に対する研究はずいぶん以前から現在まで活発に行なわれている。抗ウイルス剤は、人体内に侵入したウイルスの作用を弱化させたり消滅するようにしたりする薬剤であり、オセルタミビル（タミフル）、ザナミビル（リレンザ）、インターフェロン、免疫グロブリン製剤などがある。しかし、ウイルス感染による疾病の予防及び治療に用いてきた既存の抗ウイルス剤は、これら薬物に対する突然変異ウイルスによるウイルスの耐性及び副作用によって、持続的な使用には問題がある。したがって、前記従来の抗ウイルス剤が有する問題点を解決することができる新しい天産物由来の抗ウイルス剤の開発が求められていて、特に医薬品及び食品添加物としての使用に相応しいて毒性がない天然素材の開発が求められている。
【０００３】
一方、インターフェロン・ガンマ（ＩＦＮ−γ）は、免疫システムの活性化したＴ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が、ウイルス、寄生虫及び腫瘍細胞のような外部物質の侵入に対応して生成する天然タンパク質である。ＩＦＮ−γは、ウイルス感染の重要な指示因子である二重螺旋ＲＮＡの存在に対応してＴｈ１細胞、細胞傷害性Ｔ（Ｔｃ）細胞、樹枝状細胞またはＮＫ細胞などによって分泌する二量体サイトカインであり、タイプＩＩインターフェロンに属する。ＩＦＮ−γは、元来、大食細胞活性化因子と呼ばれるほど食細胞活性作用が強くて、現在の研究によると約３０個程度の遺伝子の転写変化を誘導して多様な免疫及び細胞反応（大食細胞の抗原提示増加、大食細胞でリソソーム（ｌｙｓｏｓｏｍｅ）活性増加及び活性化、Ｔｈ２細胞活性抑制、正常細胞でクラスＩ ＭＨＣ分子の発現増加、白血球細胞の移動性増加及びＮＫ細胞活性の増加）を生成することが知られている。ＩＦＮ−γは、宿主細胞内のウイルス複製を抑制して、ＮＫ細胞を活性化させて、リンパ細胞に対する抗原提示を増加させて、宿主細胞のウイルス感染に対する耐性を増加させることで免疫反応を助ける。抗原がマッチングされるＴ細胞及びＢ細胞に提示されれば、これら細胞が増殖して外部物質を戦略的で特異的な方法で除去する。このような点で抗原提示は、免疫反応で非常に重要な機序である。
【０００４】
ＮＫ細胞は、先天及び獲得免疫反応に関与することが知られている。ＮＫ細胞は、細胞毒性及びサイトカイン生成を通じてその効能（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を媒介して、受容体及び標的細胞に対するリガンドによって媒介される細胞毒性効能細胞に機能する。細胞毒性に対するＮＫ特異受容体としては、自然細胞毒性受容体（ｎａｔｕｒａｌ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ、ＮＣＲｓ）と呼ばれるＮＫｐ４６（非特許文献１），ＮＫｐ３０（非特許文献２）及びＮＫｐ４４（非特許文献３）などがある。ＮＣＲｓに対するリガンドは、インフルエンザウイルス（ＩＶ）のヘマグルチニン（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ，ＨＡ）、センダイウイルス（Ｓｅｎｄａｉ ｖｉｒｕｓ，ＳＶ）のヘマグルチニン・イノラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ−ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ，ＨＮ）（非特許文献４）及び膜結合されたヘパリンスルファートプロテオグリカン（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｈｅｐａｒｉｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ）（非特許文献５）などが知られている。また、ＮＫ細胞は、ＩＦＮ−γのようなサイトカイン分泌を通じて獲得免疫反応の発達を助けるのに重要な役割をして（非特許文献６）、ＩＦＮ−γがネズミサイトメガロウイルス（ｍｕｒｉｎｅ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）感染で抗ウイルス活性を有するということが報告された。ＮＫ細胞は、直接的な先天防御及び獲得免疫反応の形成にともに関与している。何種類かのマウスモデルで、ＮＫ細胞が腫瘍の発達と微生物感染を抑制した。特に、ＮＫ細胞は、マウスサイトメガロウイルス（ｍｏｕｓｅ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ，ＭＣＭＶ）感染の初期工程で直接ウイルス感染した細胞を死滅させて、ＩＦＮ−γを生成させることによって調節する役割をする。ＮＫ細胞内でＩＦＮ−γ生成に対する主要経路は、プロティンキナーゼＣθ（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ，ＰＫＣθ）の活性化に依存する。Ｔａｓｓｉ研究陣は、免疫受容体タイロシン活性化部位（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎｍｏｔｉｆ，ＩＴＡＭｓ）を通じて信号を伝達するＮＫ細胞受容体が関与することで、ＰＫＣθが速かに活性化すると報告した。ＰＫＣθ欠乏マウスからＮＫ細胞を分析した結果、ＰＫＣθはＩＴＡＭ媒介ＩＦＮ−γ分泌において必須要素であるということが明らかにされた（非特許文献７）。
【０００５】
ホスホリパーゼＣγ（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｃγ，ＰＬＣγ）は、ＩＦＮ−γ分泌で非常に本質的な基礎因子である。ＩＦＮ−γの基底水準は、ＰＬＣγ２−欠乏ＮＫ細胞内で著しく減少し、野生型細胞とは異なり、抗ＮＫ１．１による刺激によってもＩＦＮ−γ分泌が増加する結果を示さなかった（非特許文献８）。ＰＬＣγ２欠乏ＮＫ細胞は、ＩＦＮ−γまたは顆粒球マクファージコロニー刺激因子（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ，ＧＭ−ＣＳＦ）生成能力が大きく損傷され、ＰＬＣγ２は、ＮＫ１．１媒介サイトカイン生成だけではなくＮＫＧ２Ｄでも重要な役割をする（非特許文献９）。マウス内でＦｃ受容体（ＦｃＲｓ）のγ−鎖を含み、この受容体は結合されたアダプターＩＴＡＭｓ（ａｄａｐｔｏｒ’ｓ ＩＴＡＭｓ）のチロシン残基リン酸化結果に至るようになり、それは再び脾臓チロシンキナーゼ（ｓｐｌｅｅｎ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ，Ｓｙｋ）が集まるようにする。前記キナーゼは、Ｔ細胞活性化用リンカー、７６ｋＤａ、ＰＬＣ、ＰＩ３Ｋ及びＥｒｋキナーゼを含む多数の下部シグナル伝達メディエーターを活性化させる。総合的にこの信号伝達媒介者は、遺伝子転写、ＮＫ細胞が標的細胞を溶解させるのに用いる溶解性顆粒のエキソサイトーシス（ｅｘｏｃｙｔｏｓｉｓ）のための細胞プログラムを開示して、親炎症性ケモカイン及びサイトカイン、特にＩＦＮ−γを生成させる（非特許文献１０）。前記のように、ＩＦＮ−γは抗ウイルス作用、抗増殖作用及び免疫調節作用をするので、肝炎、多様なウイルス感染性疾患及び癌治療に利用されている。
【０００６】
一方、大部分のウイルスは、宿主のＩＦＮ反応に対して自体を保護するため、免疫回避戦略を示す。特に、ウイルスによるＩＦＮ−γ信号抑制に対する多様な機序が報告されている。例えば、エプスタイン・バー（Ｅｐｓｔｅｉｎ−ｂａｒｒ）ウイルスは、ＩＦＮ−γ受容体遺伝子発現を阻害して抗ウイルス性ＩＦＮ反応を防ぎ（非特許文献１１）、ヒト腫瘍誘導ヘルペスウイルスによってＩＦＮ−γ受容体１が阻害（非特許文献１２）されると報告している。ゆえに、ＩＦＮの分泌及び活性を促進させて抗ウイルス活性及び免疫活性を高めることができる物質の開発が必要である。
【０００７】
シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）は、双子葉植物ふうろそう目トウダイグサ科の落葉高木で学名は、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉで、よく油桐とも呼ばれる。中国が原産地で韓国の南部海岸地方でも育つ。木の高さは約７．５〜１０ｍまで伸びて、樹皮は灰色を帯びた茶色で皮目があって太い枝が四方に広がる。葉は互い違いに育ち心臓模様または丸い形で、花は５月に赤味を帯びた白で咲く。実は朔果で９月になると成熟するが丸くて三つの種子が入っている。南部脂肪ではシナアブラギリを緑陰樹や庭木として植えて、種子からは油を採取するが、この油を「桐油」と言う。東洋では桐油を伝統的に火を灯すのに用いられ、現代も産業用に重要に用いられている。
【０００８】
シナアブラギリの実は、東洋伝統医学で統土風痰、消腫毒、利二便意効能があり、風痰喉痺（喉頭結核、喉頭梅毒など）、疥癬、丹毒、やけど、膿疱瘡、食積腹脹、大小便不利を治療するのに用いた。根は、少食、利水、痰火、殺虫の効能があり、食積肥満、水腫、鼓脹、暁天、瘰癧、蛔虫症を治療するのに用いた。葉は、よう（癰）、解毒の効能があって癰瘡、丹毒、（つきへんに兼）瘡、凍瘡、疥癬、痢疾治療に用いた（非特許文献１３）。
【０００９】
シナアブラギリの化学成分研究を通じてシナアブラギリにジテルペノイドエステル、ステロール、タンニン、オイル、クマリン、コウマロリグナン（ｃｏｕｍａｒｏｌｉｇｎａｎ）系化合物が含有されているという研究結果が知られている（非特許文献１４、非特許文献１５、非特許文献１６、非特許文献１７、非特許文献１８）。シナアブラギリに対する生理活性研究では、ヒト多形核白血球活性因子（ｈｕｍａｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｎｕｃｌｅａｒ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）、ヒト好中球活性因子（ｈｕｍａｎ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）などが明らかにされ、シナアブラギリの抽出物及びジテルペンエステル（ｄｉｔｅｒｐｅｎｅ ｅｓｔｅｒｓ）によってエプスタイン−バーウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ）活性が誘導されると報告された。また、シナアブラギリの１２−Ｏ−ヘキサデカノイル−１６−ヒドロキシホルボール１３−アセテート（１２−Ｏ−ｈｅｘａｄｅｃａｎｏｙｌ−１６−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｏｒｂｏｌ １３−ａｃｅｔａｔｅ）は、ヒトＴ−リンパ球親和性ウイルスタイプＩ（ｈｕｍａｎ Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｈｉｃ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ Ｉ，ＨＴＬＶ−Ｉ）によって誘導されるリンパ球のコロニー形成を増大させる効能があると報告された。シナアブラギリの１２−Ｏ−パルミトイル−１６−ヒドロキシホルボール１３−アセテート（１２−Ｏ−Ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−１６−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｏｒｂｏｌ １３−ａｃｅｔａｔｅ）、１２−Ｏ−パルミトイル−４−ジオキシ−４β−１６−ヒドロキシホルボール１３−アセテート（１２−Ｏ−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−４−ｄｅｏｘｙ−４β−１６−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｏｒｂｏｌ １３−ａｃｅｔａｔｅ）は、魚類に対する毒性がロテノン（ｒｏｔｅｎｏｎｅ）と類似の程度であるということが明らかにされた（非特許文献１７、非特許文献１９、非特許文献２０、非特許文献２１、非特許文献２２、非特許文献２３）。
【００１０】
一方、コショウノキ（Ｄａｐｈｎｅ ｋｉｕｓｉａｎａ）は、双子葉植物桃金嬢目沈丁花科の常緑かつ葉潅木で、学名は、Ｄａｐｈｎｅ ｋｉｕｓｉａｎａで白沈丁花とも言う。原産地は韓国で、慶南巨済島と全南黒山島、チェジュドの標高５０〜１，３００ｍの海辺の山すそで主に育ち、その高さは約１ｍである。葉は互い違いに延びてだ円形または倒披針形で長さは約３〜８ｃｍ、幅は約１．２〜３．５ｃｍ程度で、端がのっぺりしていてつやがあり下部が細くなって短い葉の柄と連続する。花は雌雄異体で２〜４月に白い花が咲き、枝の先に集まって付いて香りが濃い。包葉は、広い披針形で花袋は短くて白色の綿毛があり、萼も綿毛があり４つに割れている。実は漿果でたまごのような球形で、長さは８ｍｍ程度である。５〜６月に朱色に熟する。茎は直立して紺色で、枝がたくさん出て被覆形の樹形を成す。
【００１１】
コショウノキ花は、東洋伝統医学で、咽喉疼痛、歯痛、リウマチ痛、天然痘、初期の乳腺癌を治療するのに用いられ、根は、咽喉炎治療に、葉は創傷、通風、慢性皮膚炎を治療するのに用いられてきたが、その生物学的活性はいまだに明確に知られていなかった（非特許文献１３）。コショウノキの化学成分研究によってコショウノキにアントシアニン系及びクマリン系化合物が含有されていることが報告された（非特許文献２４、非特許文献２５）。
【００１２】
しかし、まだ前記シナアブラギリまたはコショウノキの抗ウイルス活性及び免疫活性作用に関して報告されたことはない。
【００１３】
それで、本発明者等は、従来の抗ウイルス剤が有する問題点を解決することができる、植物に由来した天然抽出物から抗ウイルス用物質を発掘するために研究中、シナアブラギリの葉、幹及び実の抽出物、コショウノキの葉、幹、花及び根の抽出物、またはそれらの分画物がナチュラルキラー（ＮＫ）細胞でインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）の分泌を顕著に増加させて抗ウイルス効能を有することを確認することによって本発明を完成した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｓｉｖｏｒｉ，Ｓ．等．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，１９９７年，第１８６巻，ｐ．１１２９−１１３６
【非特許文献２】Ｐｅｎｄｅ，Ｄ．等．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，１９９９年，第１９０巻，ｐ．１５０５−１５１６
【非特許文献３】Ｃａｎｔｏｎｉ，Ｃ．等．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，１９９９年，第１８９巻，ｐ．７８７−７９６
【非特許文献４】Ａｒｎｏｎ，Ｔ．Ｉ．等．，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００１年，第３１巻，ｐ．２６８０−２６８９
【非特許文献５】Ｂｌｏｕｓｈｔａｉｎ，Ｎ．等．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００４年，第１７３巻，ｐ．２３９２−２４０１
【非特許文献６】Ｓｔｅｔｓｏｎ，Ｄ．Ｂ．等．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，２００３年，第１９８巻，ｐ．１０６９−１０７６
【非特許文献７】Ｔａｓｓｉ，Ｉ．等．，Ｂｌｏｏｄ，２００８年，第１１２巻，ｐ．４１０９−４１１６
【非特許文献８】Ｃａｒａｕｘ，Ａ．等．，Ｂｌｏｏｄ，２００６年，第１０７巻，ｐ．９９４−１００２
【非特許文献９】Ｒｅｇｕｎａｔｈａｎ，Ｊ．等．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００６年，第１７７巻，ｐ．５３６５−５３７６
【非特許文献１０】Ｔａｓｓｉ，Ｉ．等．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００５年，第１７５巻，ｐ．７４９−７５４
【非特許文献１１】Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｔ．Ｅ．，等．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２００１年，第１５巻，ｐ．７８７−７９９
【非特許文献１２】Ｌｉ，Ｑ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，２００７年，第８１巻，ｐ．２１１７−２１２７
【非特許文献１３】ジョン・ボソプ、シン・キンキョウ、図解郷薬大辞典、営林社、ソウル、１９９８年，ｐｐ．７４１−７４２
【非特許文献１４】Ｉｓｈｉｋｕｒａ，Ｎ．等．，Ｉ．Ｂｏｔａｎｉｃａｌ Ｍａｇａｚｉｎｅ，１９７５年，第８８巻，ｐ．４１−４５
【非特許文献１５】Ｎｏｎａｋａ，Ｇ．等．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，１９９０年，第３８巻，ｐ．８６１−８６５
【非特許文献１６】Ｆｏｚｄａｒ，Ｂ．Ｉ．等．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８９年，第２８巻，ｐ．２４５９−２４６１
【非特許文献１７】Ｈｉｒｏｔｏ，Ｍ．等．，Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９７９年，第４３巻，ｐ．２５２３−２５２９
【非特許文献１８】Ｏｋｕｄａ，Ｔ．等．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９７５年，第１４巻，ｐ．５０９−５１５
【非特許文献１９】Ｏｋｕｄａ，Ｔ．等．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９７５年，第１４巻，ｐ．２５１３−２５１４
【非特許文献２０】Ｓｈｉｃｈｉｊｏ，Ｓ．等，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ＋Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９８８年，第２７巻，ｐ．１８３−１８９
【非特許文献２１】Ｍａｔｓｕｄａ，Ｓ．等．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，１９８６年，第３８巻，ｐ．８５９−８６５
【非特許文献２２】Ｓｈｉｃｈｉｊｏ，Ｓ．等．，Ａｒｅｒｕｇｉ，１９８５年，第３４巻，ｐ．１９０−１９７
【非特許文献２３】Ｉｔｏ，Ｙ．等．，Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９８３年，第１８巻，ｐ．８７−９５
【非特許文献２４】Ｉｓｈｉｋｕｒａ，Ｎ，Ｉ．Ｂｏｔａｎｉｃａｌ Ｍａｇａｚｉｎｅ，１９７５年，第８８巻，ｐ．４１−４５
【非特許文献２５】Ｎａｋａｂａｙａｓｈｉ，Ｔ，Ｙａｋｕｇａｋｕ Ｚａｓｓｈｉ，１９５４年，第７４巻，ｐ．１９２−１９３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の目的は、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）またはコショウノキ（Ｄａｐｈｎｅ ｋｉｕｓｉａｎａ）の抽出物、またはその分画物を有効成分として含む抗ウイルス用組成物を提供することである。
【００１６】
また、本発明のまた他の目的は、薬学的に有効な量のシナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物を有効成分として含む組成物をウイルス性疾患にかかった個体に投与する工程を含むウイルス性疾患の改善または治療方法を提供する。
【００１７】
同時に、本発明のまた他の目的は、薬学的に有効な量のシナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物を有効成分として含む組成物を個体に投与する工程を含むウイルス性疾患の予防方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
前記目的を達成するために、本発明はシナアブラギリまたはコショウノキの抽出物を有効成分として含むウイルス性疾患の予防も治療用薬学的組成物を提供する。
【００１９】
また、本発明は前記シナアブラギリまたはコショウノキの抽出物を追加的に有機溶媒で抽出して製造された有機溶媒分画物を有効成分として含むウイルス性疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
【００２０】
また、本発明はシナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物を有効成分として含むウイルス性疾患の予防または改善用健康食品を提供する。
【００２１】
また、本発明はシナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物を有効成分として含むウイルス性疾患の予防または改善用飼料添加剤を提供する。
【００２２】
また、本発明は薬学的に有効な量のシナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物を有効成分として含む組成物をウイルス性疾患にかかった個体に投与する工程を含むウイルス性疾患の改善または治療方法を提供する。
【００２３】
また、本発明は薬学的に有効な量のシナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物を有効成分として含む組成物を個体に投与する工程を含むウイルス性疾患の予防方法を提供する。
【００２４】
また、本発明はシナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物をウイルス性疾患予防または治療用薬学的組成物の製造に用いる用途を提供する。
【００２５】
また、本発明はシナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物をウイルス性疾患予防または改善用健康食品の製造に用いる用途を提供する。
【００２６】
同時に、本発明はシナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物をウイルス性疾患予防または改善用飼料添加剤の製造に用いる用途を提供する。
【発明の効果】
【００２７】
本発明のシナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞で免疫関連サイトカインであるインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）の分泌誘導性を通じて強力な抗ウイルス活性を示してウイルス性疾患に卓越した効果があるので、抗ウイルス用組成物の有効成分として有用に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、シナアブラギリの葉、幹及び実それぞれのメタノール抽出物、それから分画したｎ−ヘキサン、エチルアセテート、ブタノールまたは水分画物をＮＫ９２細胞に処理した後、ＩＦＮ−γの分泌量を分析したグラフである：Ｍ：シナアブラギリのメタノール抽出物；Ｈ：シナアブラギリのｎ−ヘキサン分画物；Ｅ：シナアブラギリのエチルアセテート分画物；Ｂ：シナアブラギリのブタノール分画物；Ｗ：シナアブラギリの水分画物；ＮＣ：陰性対照群；及びＰＣ：陽性対照群。
【図２】図２は、シナアブラギリの葉、幹及び実それぞれの抽出物を分画した分画物をＮＫ９２細胞に処理した後、ＩＦＮ−γの分泌量を分析したグラフである：Ａ：シナアブラギリの葉のｎ−ヘキサン分画物；Ｂ：シナアブラギリの実のｎ−ヘキサン分画物；Ｃ：シナアブラギリの幹のｎ−ヘキサン分画物；及びＤ：シナアブラギリの実のエチルアセテート分画物。
【図３】図３は、コショウノキの葉、幹、花及び根それぞれのメタノール抽出物、それから分画したｎ−ヘキサン、エチルアセテート、ブタノールまたは水分画物をＮＫ９２細胞に処理した後、ＩＦＮ−γの分泌量を測定したグラフである：Ａ：コショウノキのメタノール抽出物；及びＢ：コショウノキのメタノール抽出物の有機溶媒分画物：Ｍ：コショウノキのメタノール抽出物；Ｈ：コショウノキのｎ−ヘキサン分画物；Ｅ：コショウノキのエチルアセテート分画物；Ｂ：コショウノキのブタノール分画物；Ｗ：コショウノキの水分画物；ＮＣ：陰性対照群；及びＰＣ：陽性対照群。
【図４】図４は、コショウノキの葉、幹、花及び根それぞれの抽出物を分画した分画物をＮＫ９２細胞に処理した後、ＩＦＮ−γの分泌量を分析したグラフである：Ａ：コショウノキのメタノール抽出物の有機溶媒分画物（ＤＫＣＳ：コショウノキの幹の栽培試料；及びＤＫＣＬ：コショウノキの葉の栽培試料）；Ｂ：コショウノキの葉の栽培試料のｎ−ヘキサン分画物；及びＣ：コショウノキの葉の栽培試料のエチルアセテート分画物。
【図５】図５は、シナアブラギリの葉、幹及び実それぞれのメタノール抽出物をＮＫ９２細胞に濃度別に処理した後、ＩＦＮ−γの分泌量を分析したグラフである。
【図６】図６は、コショウノキの抽出物のＩＦＮ−γ生成能力の最低活性濃度を測定したグラフである。
【図７】図７は、シナアブラギリの抽出物が処理されたＮＫ９２細胞でＩＦＮ−γｍＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲを通じて時間帯別に確認した図である。
【図８】図８は、コショウノキの抽出物が処理されたＮＫ９２細胞で、ＩＦＮ−α及びγ ｍＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲを通じて時間帯別に確認した図である。
【図９】図９は、Ｂａｙ−ｌｌ（ＮＦ−κＢ活性抑制因子）またはロテリン（ＰＫＣ活性抑制因子）の処理によってシナアブラギリの抽出物によって誘導されるＩＦＮ−γ生成変化を示した図である。
【図１０】図１０は、シナアブラギリまたはコショウノキの抽出物が処理されたＮＫ９２細胞の活性に関与する細胞表面物質の発現変化をＦＡＣＳで分析した図である。
【図１１】図１１は、インフルエンザウイルスが感染した肺上皮細胞株Ａ５４９細胞でシナアブラギリの抽出物の処理によるＩＦＮ−α及びβのｍＲＮＡ発現をＲＴ−ＰＣＲを通じて確認した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下、本発明で用いた用語を説明する。
【００３０】
本明細書で用いる用語「抽出物」は、当業界で粗抽出物（ｃｒｕｄｅ ｅｘｔｒａｃｔ）として通用する意味を有するが、広義的には下記の分画物も含む。
【００３１】
本明細書で用いる用語「分画物」は、抽出時に用いた溶媒と異なる溶媒を用いて本発明で目的とする活性を分画して得た活性分画物（ｆｒａｃｔｉｏｎ）を意味する。
【００３２】
本発明で用いる用語「予防」は、本発明の組成物の投与でウイルス性疾患を抑制したり進行を遅延させたりするすべての行為を意味する。
【００３３】
本発明で用いる用語「治療」及び「改善」は、本発明の組成物の投与によってウイルス性疾患の症状が好転または有利に変更されるすべての行為を意味する。
【００３４】
本発明で用いる用語「投与」は、任意の適切な方法で個体に所定の本発明の組成物を提供することを意味する。
【００３５】
本発明で用いる用語「個体」は、本発明の組成物を投与してウイルス性疾患の症状が好転し得る疾患を有したヒト、猿、犬、山羊、豚または鼠などすべての動物を意味する。
【００３６】
本明細書で用いる用語「飼料」は、家畜の生命を維持して乳、肉、卵、毛皮などを生産するのに必要な有機または無機栄養素を供給する物質を意味する。
【００３７】
以下、本発明を詳しく説明する。
【００３８】
本発明は、シナアブラギリまたはコショウノキの抽出物を有効成分として含むウイルス性疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
【００３９】
前記シナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物は、当業界で公知された多様な抽出方法によって得ることができる。
【００４０】
前記シナアブラギリまたはコショウノキの抽出物は、下記の工程を含む製造方法によって製造することが好ましいが、これに限定されない：
１）シナアブラギリまたはコショウノキに抽出溶媒を加えて抽出する工程；
２）工程１）の抽出物を冷却後にろ過する工程；及び
３）工程２）のろ過した抽出物を減圧濃縮した後に乾燥する工程。
【００４１】
前記方法において、工程１）のシナアブラギリまたはコショウノキは、栽培したものまたは市販のものなど制限なしに使用することができる。前記シナアブラギリは、乾燥した葉、幹または実のすべてが使用可能で、前記コショウノキは乾燥した葉、幹、花または根がすべて使用可能である。
【００４２】
前記抽出溶媒は、当業界で通常使用するどのような抽出溶媒も使用可能であり、水、アルコールまたはそれらの混合物を使用することが好ましい。前記アルコールとしては、Ｃ１〜Ｃ２低級アルコールを用いるのが好ましく、低級アルコールではエタノールまたはメタノールを用いることが好ましい。抽出方法では、振とう抽出、還流抽出、超臨界抽出または亜臨界抽出を用いることが好ましいが、これに限定されない。前記抽出溶媒を乾燥したシナアブラギリまたはコショウノキの分量の２〜２０倍添加して抽出することが好ましい。抽出温度は、２０〜５０°Ｃであることが好ましいがこれに限定されない。また、抽出時間は、１０〜４８時間であることが好ましく、２４時間がさらに好ましいがこれに限定されない。同時に、抽出回収は、３〜５回であることが好ましく、３回反復抽出することがさらに好ましいが、これに限定されない。
【００４３】
前記方法において、工程３）の減圧濃縮は、真空減圧濃縮機または真空回転蒸発きを用いることが好ましいが、これに限定されない。また、乾燥は、減圧乾燥、真空乾燥、沸騰乾燥、噴霧乾燥または凍結乾燥することが好ましいが、これに限定されない。
【００４４】
前記シナアブラギリまたはコショウノキの抽出物の分画物は、シナアブラギリまたはコショウノキの抽出物に、追加で有機溶媒を加えて有機溶媒分画物を製造する工程を含む製造方法によって製造することが好ましいが、これに限定されない。
【００４５】
前記方法において、前記有機溶媒は当業界で通常使用されるどのような抽出溶媒も使用可能であり、Ｃ１〜Ｃ４の無水または含水低級アルコール（メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ｎ−プロパノール、イソ−プロパノールまたはｎ−ブタノールなど）、前記低級アルコールと水との混合溶媒、アセトン、エチルアセテート、クロロホルム、１，３−ブチレングリコール、ヘキサン、ジエチルエーテルまたはブチルアセテートなどを使用することができる。前記有機溶媒は、ヘキサン、エチルアセテートまたはブタノールであることが好ましいが、これに限定されない。
【００４６】
前記シナアブラギリまたはコショウノキの抽出物に極性が低いものから高いものの順にヘキサン、エチルアセテート、ブタノール、水を順次に加えて各有機溶媒層の分画物を得ることが好ましく、分画物は分別ロートを用いて分画することが好ましいが、これに限定されない。具体的に、シナアブラギリまたはコショウノキの抽出物を蒸留水に懸濁してヘキサンを加えてヘキサン層を分離して、残った水層に再びエチルアセテートを加えてエチルアセテート層を分離して、残った水層に再びブタノールを加えてブタノール層を分離することができる。各有機溶媒層の分画物をすべて用いることができる。
【００４７】
前記シナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞でインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）の分泌誘導作用を通じて抗ウイルス活性を示すことが好ましいが、これに限定されない。
【００４８】
前記ウイルス性疾患は、豚インフルエンザウイルス（Ｓｗｉｎｅ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ、ＳＩＶ）、インフルエンザウイルス（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ）、新型インフルエンザＡ（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ ｓｕｂｔｙｐｅ Ｈ１Ｎ１）、鳥インフルエンザウイルス（ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ）、ライノウイルス（ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ）、アデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、コロナウイルス（ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）、パラインフルエンザウイルス（ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ）、呼吸器合抱体ウイルス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）、疱疹ウイルス（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ，ＨＳＶ）、後天性免疫欠乏症侯群ウイルス（ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ，ＨＩＶ）及び肝炎ウイルスからなる群から選択されるいずれか一つ以上のウイルスによって感染される疾患であることが好ましいが、これに限定されない。
【００４９】
本発明の組成物は、前記成分に追加で同一または類似の機能を示す有効成分を１種以上含むことができる。
【００５０】
本発明の組成物は、総重量に対して前記シナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物は、０．１〜５０重量部であることが好ましいが、これに限定されない。
【００５１】
本発明の組成物は、前記説明された有効成分以外に薬剤学的に許容される担体を含むことができる。本発明の組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常使用されるもので、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルなどを含むが、ここに限定されない。本発明の組成物は、前記成分以外に滑剤、湿潤剤、甘味料、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などを追加で含むことができる。相応しい薬剤学的に許容される担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ ｅｄ．，１９９５年）に詳しく記載されている。
【００５２】
本発明の組成物の適切な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食物、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性のような要因によって多様に処方され得る。一方、本発明の組成物の経口投与量は、１日当り０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ（体重）であることが好ましいが、これに限定されない。
【００５３】
本発明の組成物は、経口または非経口で投与することができ、非経口投与する場合、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、経皮投与などで投与することができる。本発明の組成物は、適用される疾患の種類によって、投与経路を決定することが好ましい。
【００５４】
本発明の組成物は、本発明が属する技術分野で通常の知識を有した者が容易に実施することができる方法によって、薬剤学的に許容される担体及び／または賦形剤を用いて製剤化することによって、単位用量形態で製造するかまたは多用量容器内に入れて製造することができる。ここで、剤形はオイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液または乳化液形態かエキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤の形態も可能で、分散剤または安定化剤を追加で含むことができる。
【００５５】
本発明者等は、シナアブラギリまたはコショウノキの抽出物またはその分画物の抗ウイルス活性を調べるため、シナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはそれらの分画物のインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）分泌誘導能を酵素結合免疫吸収分析（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ，ＥＬＩＳＡ）を通じて確認した。その結果、シナアブラギリの葉、幹または実の抽出物、またはその分画物（ｎ−ヘキサン、エチルアセテートまたはブタノール分画物）は、ＮＫ細胞でＩＦＮ−γの分泌を顕著に増加させ（表１、図１及び図２参照）、シナアブラギリの抽出物の濃度依存的にＩＦＮ−γの分泌が増加することを確認した（図５参照）。また、それぞれのコショウノキの葉、幹、花または根の抽出物、またはその分画物（ｎ−ヘキサン、エチルアセテートまたはブタノール分画物）は、ＮＫ細胞でＩＦＮ−γの分泌を顕著に増加させることが示され（表２、図３及び図４参照）、コショウノキの抽出物の濃度に依存的にＩＦＮ−γの分泌が増加することを確認した（図６参照）。ＩＦＮ−γのｍＲＮＡもまたシナアブラギリまたはコショウノキの抽出物が処理されたＮＫ９２細胞で顕著に増加した（図７及び図８参照）。一方、シナアブラギリの抽出物によるＩＦＮ−γ生成の誘導は、ＢａｙII処理によってＮＫ９２細胞内で減少することを確認することによって、シナアブラギリの抽出物によるＩＦＮ−γ生成の誘導がＮＦ−κＢ信号伝達によって媒介されるということを確認し、ＰＫＣ信号伝達抑制因子であるロテリンの処理によってＩＦＮ−γ生成が減少されることでＮＦ−κＢ信号伝達の上位信号伝達因子は、ＰＫＣの活性によるものであることを確認した（図９）。シナアブラギリまたはコショウノキの抽出物がＮＫ９２細胞の表面物質の発現に及ぼす影響をＦＡＣＳ分析を通じて確認した結果、ＮＫ細胞の活性に関与するＮＫＧ２Ｃ及びＤの発現が顕著に増加し、ＮＫ細胞のナチュラルキラー活性と関連したＮＫｐ４４の発現が顕著に増加したことを確認した（図１０参照）。同時に、シナアブラギリの抽出物をインフルエンザウイルスに感染したＡ５２９細胞に処理することで、ＩＦＮ−β発現の増加がさらに早くなることを確認した（図１１参照）。ここで、前記ＩＦＮ−γはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞で大食細胞活性因子と呼ばれるほど食細胞活性作用が強く、免疫及び細胞反応を生成することが知られたサイトカインである。それで、シナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物がＩＦＮ−γの分泌を誘導することによって強力な抗ウイルス活性を有することを確認した。
【００５６】
したがって、本発明のシナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物は、ウイルス性疾患の予防または治療用薬学的組成物として有用に用いられることが分かる。
【００５７】
また、本発明は薬学的に有効な量のシナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物を有効成分として含む薬学的組成物をウイルス性疾患にかかった個体に投与する工程を含む、ウイルス性疾患の改善または治療方法を提供する。
【００５８】
また、本発明は薬学的に有効な量のシナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物を有効成分として含む薬学的組成物を個体に投与する工程を含むウイルス性疾患の予防方法を提供する。
【００５９】
前記薬学的に有効な量というのは、０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇで、好ましくは、０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇであるが、これに限定されない。投与量は、特定患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与期間、投与方法、除去率、疾患の重症度等によって変化し得る。
【００６０】
前記個体は、脊椎動物であり、好ましくは哺乳動物で、より好ましくはネズミ、ウサギ、ギニアピッグ、ハムスター、犬、猫のような実験動物で、最も好ましいのはチンパンジー、ゴリラのような類人猿動物である。
【００６１】
前記投与方法は、経口または非経口投与することができ、非経口投与時には腹腔内注射、直腸内注射、皮下注射、静脈注射、筋肉内注射、子宮内硬膜注射、脳血管内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）注射または胸部内注射によって投与することができる。
【００６２】
前記ウイルス性疾患は、豚インフルエンザウイルス（ＳＩＶ）、インフルエンザウイルス、新型インフルエンザＡ（ｓｕｂｔｙｐｅ Ｈ１Ｎ１）、鳥インフルエンザウイルス、ライノウイルス、アデノウイルス、コロナウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合抱体ウイルス、疱疹ウイルス（ＨＳＶ）、後天性免疫欠乏症侯群ウイルス（ＨＩＶ）及び肝炎ウイルスからなる群から選択されるいずれか一つ以上のウイルスによって感染される疾患であることが好ましいが、これに限定されない。
【００６３】
本発明のシナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞で免疫関連サイトカインであるＩＦＮ−γの分泌誘導性を通じて強力な抗ウイルス活性を示してウイルス性疾患に卓越した効果があるので、ウイルス性疾患の予防または治療に有用に用いることができる。
【００６４】
また、本発明はシナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物を有効成分として含むウイルス性疾患の予防または改善用健康食品を提供する。
【００６５】
前記ウイルス性疾患は、豚インフルエンザウイルス（ＳＩＶ）、インフルエンザウイルス、新型インフルエンザＡ（ｓｕｂｔｙｐｅ Ｈ１Ｎ１）、鳥インフルエンザウイルス、ライノウイルス、アデノウイルス、コロナウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合抱体ウイルス、疱疹ウイルス（ＨＳＶ）、後天性免疫欠乏症侯群ウイルス（ＨＩＶ）及び肝炎ウイルスからなる群から選択されるいずれか一つ以上のウイルスによって感染される疾患であることが好ましいが、これに限定されない。
【００６６】
本発明のシナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物をそのまま添加するか他の食品または食品成分とともに用いることができ、通常的な方法によって適切に用いることができる。
【００６７】
本発明の健康食品は、食品製造時に通常的に添加される成分を含み、例えば、タンパク質、炭水化物、脂肪、栄養素及び調味剤を含む。
【００６８】
前記食品の種類には、特別な制限はない。前記シナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物を添加することができる食品の例としては、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンデー類、スナック類、お菓子類、ピザ、ラーメン、その他麺類、ガム類、アイスクリーム類を含んだ酪農製品、各種スープ、飲料水、お茶、ドリンク剤、アルコール飲料及びビタミン複合剤などがあり、通常的な意味での健康食品をすべて含む。
【００６９】
本発明の健康飲料組成物は、通常の飲料のようにさまざまな香味剤または天然炭水化物などを追加成分として含むことができる。上述した天然炭水化物は、ブドウ糖、果糖のようなモノサッカライド、マルトース、スクロースのようなジサッカライド、及びデキストリン、シクロデキストリンのようなポリサッカライド、キリシトール、ソルビトール、エリスリトール等の糖アルコールである。甘味剤としてはタウマチン、ステビア抽出物のような天然甘味料や、サッカリン、アスパルテームのような合成甘味剤などを使用することができる。前記天然炭水化物の割合は、本発明の組成物１００ｍｌ当り一般的に約０．０１〜０．０４ｇ、好ましくは約０．０２〜０．０３ｇである。
【００７０】
前記の他に本発明のシナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物はさまざまな営養剤、ビタミン、電解質、風味剤、着色剤、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に用いる炭酸化剤などを含むことができる。その他に本発明のシナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物は、天然フルーツジュース、フルーツジュース飲料及び野菜飲料の製造のための果肉を含むことができる。このような成分は、独立的にまたは混合して使用することができる。このような添加剤の割合は、大きく重要ではないが本発明の組成物１００重量部当たり０．０１〜０．１重量部の範囲で選択することが一般的である。
【００７１】
本発明のシナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物は、ＮＫ細胞で免疫関連サイトカインであるＩＦＮ−γの分泌誘導性を通じて強力な抗ウイルス活性を示してウイルス性疾患に卓越した効果があるので、ウイルス性疾患の予防または改善用健康食品に有用に用いることができる。
【００７２】
また、本発明は、シナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物を有効成分として含む、ウイルス性疾患の予防または改善用飼料添加剤を提供する。
【００７３】
前記ウイルス性疾患は、豚インフルエンザウイルス（ＳＩＶ）、インフルエンザウイルス、新型インフルエンザＡ（ｓｕｂｔｙｐｅ Ｈ１Ｎ１）、鳥インフルエンザウイルス、ライノウイルス、アデノウイルス、コロナウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合抱体ウイルス、疱疹ウイルス（ＨＳＶ）、後天性免疫欠乏症侯群ウイルス（ＨＩＶ）及び肝炎ウイルスからなる群から選択されるいずれか一つ以上のウイルスによって感染さる疾患であることが好ましいが、これに限定されない。
【００７４】
前記飼料添加剤は、抗ウイルス効能を有するので、家擒類、家畜などに倦まず弛まずに摂取するようにすることでウイルス性疾患を予防することができ、すでに発生したウイルス性疾患を改善することができる。飼料は、栄養価、主成分、流通、水分含量配合状態及び加工形態などによっていろいろに分類することができ、前記飼料は、粗飼料、濃厚飼料、補充飼料、タンパク質飼料、デンプン飼料、脂肪質飼料または繊維質飼料が使用可能であるが、これに限定されない。
【００７５】
本発明の飼料添加剤にはシナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物が０．１〜２０％重量部、脂肪分解酵素（リパーゼ）が０．００１〜０．０１％重量部、第３リン酸カルシウムが１〜２０％重量部、ビタミンＥが０．０１〜０．１％重量部、酵素粉末が１〜１０％重量部、乳酸菌が０．１〜１０％重量部、バシラス培養液が０．０１〜１０％重量部及びブドウ糖は２０〜９０％重量部で構成されていることが好ましいが、特別にこれに限定するのではなく、シナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物が有効量で添加されていれば、本発明の飼料添加剤として可能である。
【００７６】
前記有効量というのは、家擒類、家畜などが倦まず弛まず摂取するようにすることでウイルス性疾患を予防したり、すでに発生したウイルス性疾患を改善したりすることができる量を意味する。また、添加による利点を越す悪影響が生じない量が好ましい。
【００７７】
また前記飼料添加剤は、追加的に家擒類及び家畜等に許容される担体を含むことができる。本発明においては前記飼料添加剤をそのまままたは公知の担体、安定剤などを加えることができ、必要によってビタミン、アミノ酸類、ミネラル等の各種養分、抗酸化剤、抗生物質、抗菌剤及びその他の添加剤などを加えることもでき、その形状としては粉体、顆粒、ペレット、懸濁液等の適当な状態であり得る。本発明の飼料添加剤を供給する場合は、家擒類及び家畜等に対して単独でまたは飼料に混合して供給することができる。
【００７８】
本発明のシナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物は、ＮＫ 細胞で免疫関連サイトカインであるＩＦＮ−γの分泌誘導性を通じて強力な抗ウイルス活性を示してウイルス性疾患に卓越した効果があるので、ウイルス性疾患の予防または改善用飼料添加剤として有用に用いることができる。
【００７９】
また、本発明はシナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物をウイルス性疾患予防または治療用薬学的組成物の製造に用いる用途を提供する。
【００８０】
また、本発明はシナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物をウイルス性疾患予防または改善用健康食品の製造に用いる用途を提供する。
【００８１】
同時に、本発明はシナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物をウイルス性疾患予防または改善用飼料添加剤の製造に用いる用途を提供する。
【００８２】
前記ウイルス性疾患は、豚インフルエンザウイルス（ＳＩＶ）、インフルエンザウイルス、新型インフルエンザＡ（ｓｕｂｔｙｐｅ Ｈ１Ｎ１）、鳥インフルエンザウイルス、ライノウイルス、アデノウイルス、コロナウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合抱体ウイルス、疱疹ウイルス（ＨＳＶ）、後天性免疫欠乏症侯群ウイルス（ＨＩＶ）及び肝炎ウイルスからなる群から選択されるいずれか一つ以上のウイルスによって感染される疾患であることが好ましいが、これに限定されない。
【００８３】
本発明のシナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物は、ＮＫ細胞で免疫関連サイトカインであるＩＦＮ−γの分泌誘導性を通じて強力な抗ウイルス活性を示してウイルス性疾患に卓越した効果があるので、ウイルス性疾患の予防、改善または治療用薬学的組成物、健康食品、または飼料添加剤の製造に有用に用いることができる。
【００８４】
以下、本発明を実施例及び製造例によって詳しく説明する。
【００８５】
ただし、下記の実施例及び製造例は本発明を具体的に例示するだけのものであり、本発明の内容が実施例及び製造例によって限定されるのではない。
【００８６】
＜実施例１＞シナアブラギリまたはコショウノキの抽出物の製造
＜１−１＞シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）の葉、幹または実のメタノール抽出物の製造
シナアブラギリは、チェジュドの西帰浦で採取して、乾燥したシナアブラギリの葉、幹及び実それぞれ２ｋｇにメタノール４ｌを加えた後、常温で循環させながら２４時間抽出してろ過上澄み液を回収した。抽出後、溶媒を減圧濃縮してシナアブラギリの葉、幹及び実のメタノール抽出物をそれぞれ２７６ｇ、１２０ｇ及び１００ｇ得た。
【００８７】
＜１−２＞コショウノキの葉、幹、花または根のメタノール抽出物
コショウノキ（Ｄａｐｈｎｅ ｋｉｕｓｉａｎａ）は、全羅南道の務安で採取して、乾燥したコショウノキの葉、幹、花または根それぞれ１ｋｇにメタノール４ｌを加えた後、常温で循環させながら２４時間抽出してろ過上澄み液を回収した。抽出後、溶媒を減圧濃縮してコショウノキの葉、幹、花及び根のメタノール抽出物をそれぞれ１１８ｇ、１４０ｇ、８０ｇ及び１０５ｇ得た。
【００８８】
＜比較例１＞フジモドキのメタノール抽出物の製造
抗インフルエンザウイルス活性が報告されたフジモドキ（Ｄａｐｈｎｅ ｇｅｎｋｗａ）（韓国特許出願番号：１０−２００９−００３４１３２）は、京畿道の竜仁で採取し、フジモドキ乾燥物を用いて前記＜実施例１＞抽出物製造方法によってフジモドキのメタノール抽出物を製造した。
【００８９】
＜実施例２＞シナアブラギリまたはコショウノキの抽出物から分画物の製造
＜２−１＞シナアブラギリの分画物の製造
＜２−１−１＞シナアブラギリのｎ−ヘキサン分画物
前記実施例＜１−１＞で得たシナアブラギリの葉、幹及び実のメタノール抽出物をそれぞれ蒸留水１．５ｌに懸濁させて、ｎ−ヘキサン１．５ｌを加えて混合後、ｎ−ヘキサン可溶性分画部と水可溶性分画部を分離し、この過程を３回反復実施してｎ−ヘキサン可溶性分画部をろ過、減圧濃縮してシナアブラギリの葉、幹及び実のｎ−ヘキサン分画物をそれぞれ２７．６ｇ、２８ｇ及び４ｇ得た。
【００９０】
＜２−１−２＞シナアブラギリのエチルアセテート分画物
前記実施例＜２−１−１＞のシナアブラギリの葉、幹及び実のｎ−ヘキサン分画物を分離して残ったそれぞれの残り分画部にエチルアセテート１．５ｌを加えて混合後、エチルアセテート分画部を分離し、この過程を３回反復実施してエチルアセテート分画部をろ過、減圧濃縮してシナアブラギリの葉、幹及び実のエチルアセテート分画物をそれぞれ８０ｇ、１８ｇ及び４０ｇ得た。
【００９１】
＜２−１−３＞シナアブラギリのブタノール分画物
前記実施例＜２−１−２＞のシナアブラギリの葉、幹及び実のエチルアセテート分画物を分離して残ったそれぞれの残り分画部にブタノール１．５ｌを加えて混合後、ブタノール分画部を分離し、この過程を３回反復実施してブタノール分画部をろ過、減圧濃縮してシナアブラギリの葉、幹及び実のブタノール分画物をそれぞれ５５ｇ、２４ｇ、及び１２ｇ得た。
【００９２】
＜２−２＞コショウノキの分画物の製造
＜２−２−１＞コショウノキのｎ−ヘキサン分画物
前記実施例＜１−２＞で得たコショウノキの葉、幹、花及び根のメタノール抽出物から、前記実施例＜２−１−１＞に記載した方法によってコショウノキのｎ−ヘキサン分画物を製造して、コショウノキの葉、幹、花及び根のｎ−ヘキサン分画物をそれぞれ３１ｇ、３６ｇ、２１ｇ及び２７ｇ得た。
【００９３】
＜２−２−２＞コショウノキのエチルアセテート分画物
前記実施例＜２−１−２＞に記載した方法によってコショウノキのエチルアセテート分画物を製造して、コショウノキの葉、幹、花及び根のエチルアセテート分画物をそれぞれ７ｇ、８．４ｇ、５ｇ及び６ｇ得た。
【００９４】
＜２−２−３＞コショウノキのブタノール分画物の製造
前記実施例＜２−１−３＞に記載した方法によってコショウノキのブタノール分画物を製造して、コショウノキの葉、幹、花及び根のブタノール分画物をそれぞれ２０ｇ、２４ｇ、１４ｇ及び１８ｇ得た。
【００９５】
＜実施例３＞シナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物のインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）分泌誘導活性確認
＜３−１＞ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の培養
インターロイキン−２（ＩＬ−２）依存性ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞株ＮＫ９２（ｈｕｍａｎ ＮＫ ｌｙｍｐｈｏｍａ）は、米国微生物保存センター（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＡＴＣＣ）から購入した。ＮＫ９２細胞は、２０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（ＨｙＣｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）、２ｍＭ Ｌ−グルタメート、１００μｇ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含み、１００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２（Ｃｈｉｒｏｎ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）が添加されたα−ＭＥＭ（α−ｍｉｎｉｍａｌ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，ドイツ）培地で３７°Ｃ、５％ＣＯ２条件下で培養した。
【００９６】
＜３−２＞酵素結合免疫吸収分析（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ，ＥＬＩＳＡ）を通じたシナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物のインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）分泌誘導性確認
前記実施例＜３−１＞によって培養したＮＫ９２細胞の細胞培養液に２μｇ／ｍｌのシナアブラギリの葉、幹または葉の抽出物、またはそれらの分画物（ｎ−ヘキサン、エチルアセテート、ブタノールまたは水分画物）、またはコショウノキの葉、幹、花または根の抽出物、またはそれらの分画物をそれぞれ処理して３７°Ｃで１８時間培養した後、細胞を除去して上澄み液を得た。それぞれのＮＫ９２細胞の細胞培養液に存在するヒトＩＦＮ−γの定量は、商業的に購入可能なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）（Ｅｎｄｏｇｅｎ）を用いて製造者が指示したプロトコールによって酵素結合免疫吸収分析（ＥＬＩＳＡ）を遂行した。ここで、フジモドキの抽出物及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）をそれぞれ陽性（ＰＣ）及び陰性（ＮＣ）対照群として用いた。ＩＦＮ−γの定量値は、３回分析した値の平均±標準偏差として表示した。
【００９７】
その結果、シナアブラギリの抽出物またはその分画物の場合、表１及び図１に示したように、シナアブラギリの葉、幹及び実のメタノール抽出物を処理したそれぞれのＮＫ９２細胞では、約１．７〜２．０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ−γを分泌した。シナアブラギリの葉、幹または実の抽出物の分画物である、水層を除いた有機溶媒分画物（ｎ−ヘキサン、エチルアセテートまたはブタノール）を処理した場合には、ｎ−ヘキサン分画物は約１．７〜２．１ｎｇ／ｍｌ、エチルアセテート分画物は約１．５〜２．０ｎｇ／ｍｌ、ブタノール分画物は約１．２〜１．７ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ−γを分泌した。シナアブラギリの水分画物は約０．３〜０．４ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ−γを分泌して、シナアブラギリの抽出物または有機溶媒分画物に比べて顕著に低い分泌量を示し、ＩＦＮ−γ分泌誘導性がほとんどないことが示された。シナアブラギリの抽出物またはその分画物を処理した細胞は、すべて陰性対照群（０．３ｎｇ／ｍｌ）に比べて顕著に高いＩＦＮ−γ分泌量を示した（表１及図１）。また、図２に示したように、シナアブラギリの葉、幹または実の抽出物の分画物のＩＦＮ−γ分泌効果を確認した（図２）。このことから、シナアブラギリの葉、幹または実の抽出物、またはその分画物は、ＮＫ細胞でＩＦＮ−γの分泌誘導活性を有することを確認した。
【００９８】
一方、コショウノキの抽出物またはその分画物の場合、下記の表２及び図３に示したように、コショウノキのメタノール抽出物（葉、幹、花または根）で処理したそれぞれのＮＫ９２細胞では約２．４〜２．６ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ−γが分泌した。コショウノキの葉、幹、花及び根の抽出物の分画物である、水層を除いたそれぞれの有機溶媒分画物（ｎ−ヘキサン、エチルアセテートまたはブタノール）を処理した場合には、ｎ−ヘキサン分画物が約１．７〜１．８ｎｇ／ｍｌ、エチルアセテート分画物が約１．４〜１．８ｎｇ／ｍｌ、ブタノール分画物が１．６〜１．９ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ−γ分泌効果が示された。水分画物の場合には、約０．２〜０．４ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ−γを分泌して、ＩＦＮ−γ分泌誘導性がほとんどないことが示された。コショウノキの抽出物または分画物を処理した細胞は、すべて陰性対照群（０．３ｎｇ／ｍｌ）に比べて顕著に高いＩＦＮ−γ分泌量を示した（表２及び図３）。また、図４に示したように、コショウノキの葉、幹、花または根の抽出物の分画物のＩＦＮ−γ分泌効果を確認した（図４）。このことから、コショウノキの葉、幹、花または根の抽出物、またはその分画物は、ＮＫ細胞でＩＦＮ−γの分泌を促進することを確認した。
【００９９】
【表１】
【０１００】
【表２】
【０１０１】
＜３−３＞ＥＬＩＳＡ分析を通じたシナアブラギリまたはコショウノキの抽出物の濃度によるインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）分泌誘導活性確認
シナアブラギリの葉、幹及び実のメタノール抽出物、コショウノキのメタノール抽出物それぞれの濃度によるＩＮＦ−γ分泌量を前記実施例＜３−２＞の方法によって遂行した。ここで、メタノール抽出物はそれぞれ０．０１、０．１、１または、１０μｇ／ｍｌの濃度で添加した。
【０１０２】
その結果、図５に示したように、シナアブラギリの葉のメタノール抽出物は、１μｇ／ｍｌ以上の濃度でＩＮＦ−γの分泌量が顕著に増加し、シナアブラギリの幹または実のメタノール抽出物では、１０μｇ／ｍｌの濃度でＩＮＦ−γ分泌が急激な増加を示した（図５）。また、図６に示したように、コショウノキのメタノール抽出物は、１μｇ／ｍｌ以上の濃度でＩＮＦ−γの分泌量が顕著に増加した（図６）。このことから、シナアブラギリまたはコショウノキのメタノール抽出物の濃度に依存的にＩＮＦ−γ分泌が増加することを確認した。
【０１０３】
＜３−４＞インターフェロン−ガンマ分泌誘導に関連する遺伝子発現に対するシナアブラギリまたはコショウノキの抽出物またはその分画物の効果
ＮＫ９２細胞でＩＦＮ−α及びγ誘導に関連するｍＲＮＡ発現の変化を調べるために、ＲＴ−ＰＣＲを遂行した。ＮＫ９２細胞または肺上皮細胞株であるＡ５４９を２ｎｇのシナアブラギリまたはコショウノキの抽出物で１２時間培養した。培養後、１５分、３０分、４５分、１時間、４時間、及び１２時間後に細胞を溶解させた後に公知されたプロトコールにしたがってＲＮＡを分離して、ＲＴ−ＰＣＲを通じてＩＦＮ−γｍＲＮＡ発現を分析した。ここで、用いたＩＦＮ−γのプライマーは、正方向プライマーが５’−ＴＣＣＣＡＴＧＧＧＴＴＧＴＧＴＧＴＴＴＡ−３’で、逆方向プライマーは、５’−ＧＴＣＡＧＧＧＴＧＣＡＧＣＣＧＧ−３’であり、ＧＡＰＤＨを内部標準として用いたが、ここで用いたＧＡＰＤＨ正方向プライマーは、５’−ＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＴＴＣＣＡＧＧＡＧ−３’で、逆方向プライマーは、５’−ＡＣＡＧＴＣＴＴＣＴＧＧＧＴＧＧＣＡＧＴ−３’を用いた。
【０１０４】
前記ＲＴ−ＰＣＲ反応は、前記プライマー対とＴａｑポリマラーゼ（Ｔａｋａｒａ，Ｓｈｉｇａ，日本）を用いて遂行した。総ＲＮＡは、標準プロトコールによって分離し、ｃＤＮＡは製造者の指示にしたがってＡｃｃｕＳｃｒｉｐｔ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ １ｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて合成した。合成した１μｌのｃＤＮＡを０．５Ｕ ＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、１×ｂｕｆｆｅｒ及び１ｍＭ ｄＮＴＰ ｍｉｘ（Ｔａｋａｒａ）と前記プライマー対からなる２０μｌのＰＣＲ反応に用いた。ＰＣＲ反応による増幅は、次のような条件でＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲシステム２７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ ｃｉｔｙ，ＣＡ，米国）を用いて遂行した；９４°Ｃで５分、続いて９４°Ｃで４５秒、５６°Ｃで４５秒及び７２°Ｃで１分を２５〜４０サイクル行った後、最終延長反応は、７２°Ｃで７分間遂行した。ＰＣＲプライマーは、Ｂｉｏｎｅｅｒ社（韓国、大田）から購入し、Ｐｒｉｍｅｒ３プログラムを用いてデザインした。ＰＣＲ生成物は、１．５％アガロースゲル上で分離して臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）で染色してＧｅｌ Ｄｏｃ ２０００ＵＶ ｔｒａｎｓ−ｉｌｌｕｍｉｎａｔｏｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，米国）で視覚化した後、Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて分析した。各サンプルは、３回以上テストして代表データを提示した。
【０１０５】
その結果、図７に示したように、ＩＦＮ−γの転写体は、シナアブラギリの抽出物が処理されたＮＫ９２細胞で２時間後に著しく増加した。これは、ＩＦＮ−γ誘導のためのシナアブラギリの抽出物に対する反応は、転写水準で１〜２時間以内に誘導されたことが分かった（図７）。一方、図８に示したように、コショウノキが処理されたＮＫ９２細胞及び肺上皮細胞株であるＡ５４９細胞でＩＦＮ−γ及びＩＦＮ−α ｍＲＮＡの発現様相を時間帯別に確認した結果、ＩＦＮ−γの転写体はコショウノキの抽出物が処理されたＮＫ９２細胞で３時間後から著しく増加した。これは、ＩＦＮ−γ誘導のためのコショウノキの抽出物に対する反応は、転写水準で３時間以内に誘導されたことが分かった。Ａ５４９細胞においては、コショウノキの抽出物がＩＦＮ−α ｍＲＮＡの発現水準を増加させることが示された（図８）。
【０１０６】
＜実施例４＞シナアブラギリの抽出物のＩＦＮ−γ生成誘導効果に対するＮＦ−κＢ信号伝達経路依存性確認
シナアブラギリの抽出物のＩＦＮ−γ生成誘導効果が、ＮＦ−κＢ信号伝達経路に依存的であるということを立証するために、ＮＦ−κＢ抑制因子であるＢａｙＩＩ、または、ＰＫＣ信号伝達抑制因子であるロッテリン（Ｒｏｔｔｅｒｉｎ）をシナアブラギリの抽出物とともにＮＫ９２細胞に処理した。
【０１０７】
その結果、図９に示したように、シナアブラギリの抽出物によるＩＦＮ−γ生成の誘導は、ＢａｙII処理によってＮＫ９２細胞内で減少した。これは、ＢａｙII濃度に依存的だった。このことから、シナアブラギリの抽出物によるＩＦＮ−γ生成の誘導が、ＮＦ−κＢ信号伝達によって媒介されるということが分かった。また、ＰＫＣ信号伝達抑制因子であるロッテリンの処理によってＩＦＮ−γ生成が減少されることで、ＮＦ−κＢ信号伝達の上位信号伝達因子は、ＰＫＣの活性によるものであることが分かった（図９）。
【０１０８】
＜実施例５＞シナアブラギリまたはコショウノキの抽出物の細胞表面物質に対する影響確認
シナアブラギリまたはコショウノキの抽出物が処理されたＮＫ９２細胞の活性に関与する細胞表面物質の変化を確認するために、蛍光活性化細胞選別機（ＦＡＣＳ）で分析した。ここで、ＮＫ細胞の活性リガンド（ｌｉｇａｎｄ）として作用する ＮＫＧ２Ａ、Ｃ、及びＤ、自然殺害活性と関連するＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４及びＮｋｐ４６細胞表面物質の発現を分析した。
【０１０９】
その結果、図１０に示したように、シナアブラギリまたはコショウノキの抽出物は類似のＮＫ９２細胞の表面物質発現様相を示し、ＮＫ細胞の活性に関与するＮＫＧ２Ｃ及びＤの発現が著しく増加し、ＮＫ細胞のナチュラルキラー活性と関連したＮＫｐ４４の発現も顕著に増加したことが確認された（図１０）。
【０１１０】
＜実施例６＞ウイルスが感染された肺上皮細胞株に対するシナアブラギリの抽出物の影響確認
インフルエンザウイルスに感染した細胞に対するシナアブラギリの抽出物の効果を確認するために、インフルエンザウイルスが浸透した肺上皮細胞株であるＡ５４９細胞にシナアブラギリの抽出物を処理した後、前記実施例＜３−４＞の方法によってＲＴ−ＰＣＲを実施してＩＦＮ−α及びβ転写活性度を確認した。
【０１１１】
その結果、図１１に示したように、インフルエンザウイルスが処理されたＡ５４９細胞で２４時間後にＩＦＮ−α及びβの発現が示され、シナアブラギリの抽出物を前記ウイルスが処理されたＡ５２９細胞に処理することでＩＦＮ−αの発現量は減少し、ＩＦＮ−α発現の増加がさらに早くなる現象を示した（図１１）。
【産業上の利用可能性】
【０１１２】
前記のように、本発明のシナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物は、抗ウイルスに卓越した効果があるのでウイルス性疾患の予防及び治療用薬剤、またはウイルス性疾患の予防及び改善用健康食品及び飼料添加剤の開発と、これらを用いた予防または治療方法の研究に有用に用いることができる。
【配列表フリーテキスト】
【０１１３】
配列番号１：インターフェロン−ガンマ正方向プライマー
配列番号２：インターフェロン−ガンマ逆方向プライマー
配列番号３：ＧＡＰＤＨ正方向プライマー
配列番号４：ＧＡＰＤＨ逆方向プライマー
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）またはコショウノキ（Ｄａｐｈｎｅ ｋｉｕｓｉａｎａ）の抽出物、またはその分画物を有効成分として含む抗ウイルス用組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
人類が病んでいる多くの感染性疾患はウイルスによるもので、狂犬病、天然痘、脊髄炎、肝炎、黄熱、免疫欠乏症、脳炎及びエイズなどいろいろ深刻な疾病の原因になる。このようなウイルスによる感染性疾患は、風邪、はしか、お多福風邪及び水痘等のように非常に伝染性が強くて急性病勢を示すだけでなく、呼吸器、消化器障害を示したり、はしか及びサイトメガロウイルスのようなものは先天性異常を誘発して、腫瘍ウイルスとして知られたウイルスは、人体に腫瘍及び癌を誘発する。したがって、抗ウイルス剤に対する研究はずいぶん以前から現在まで活発に行なわれている。抗ウイルス剤は、人体内に侵入したウイルスの作用を弱化させたり消滅するようにしたりする薬剤であり、オセルタミビル（タミフル）、ザナミビル（リレンザ）、インターフェロン、免疫グロブリン製剤などがある。しかし、ウイルス感染による疾病の予防及び治療に用いてきた既存の抗ウイルス剤は、これら薬物に対する突然変異ウイルスによるウイルスの耐性及び副作用によって、持続的な使用には問題がある。したがって、前記従来の抗ウイルス剤が有する問題点を解決することができる新しい天産物由来の抗ウイルス剤の開発が求められていて、特に医薬品及び食品添加物としての使用に相応しいて毒性がない天然素材の開発が求められている。
【０００３】
一方、インターフェロン・ガンマ（ＩＦＮ−γ）は、免疫システムの活性化したＴ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が、ウイルス、寄生虫及び腫瘍細胞のような外部物質の侵入に対応して生成する天然タンパク質である。ＩＦＮ−γは、ウイルス感染の重要な指示因子である二重螺旋ＲＮＡの存在に対応してＴｈ１細胞、細胞傷害性Ｔ（Ｔｃ）細胞、樹枝状細胞またはＮＫ細胞などによって分泌する二量体サイトカインであり、タイプＩＩインターフェロンに属する。ＩＦＮ−γは、元来、大食細胞活性化因子と呼ばれるほど食細胞活性作用が強くて、現在の研究によると約３０個程度の遺伝子の転写変化を誘導して多様な免疫及び細胞反応（大食細胞の抗原提示増加、大食細胞でリソソーム（ｌｙｓｏｓｏｍｅ）活性増加及び活性化、Ｔｈ２細胞活性抑制、正常細胞でクラスＩ ＭＨＣ分子の発現増加、白血球細胞の移動性増加及びＮＫ細胞活性の増加）を生成することが知られている。ＩＦＮ−γは、宿主細胞内のウイルス複製を抑制して、ＮＫ細胞を活性化させて、リンパ細胞に対する抗原提示を増加させて、宿主細胞のウイルス感染に対する耐性を増加させることで免疫反応を助ける。抗原がマッチングされるＴ細胞及びＢ細胞に提示されれば、これら細胞が増殖して外部物質を戦略的で特異的な方法で除去する。このような点で抗原提示は、免疫反応で非常に重要な機序である。
【０００４】
ＮＫ細胞は、先天及び獲得免疫反応に関与することが知られている。ＮＫ細胞は、細胞毒性及びサイトカイン生成を通じてその効能（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を媒介して、受容体及び標的細胞に対するリガンドによって媒介される細胞毒性効能細胞に機能する。細胞毒性に対するＮＫ特異受容体としては、自然細胞毒性受容体（ｎａｔｕｒａｌ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ、ＮＣＲｓ）と呼ばれるＮＫｐ４６（非特許文献１），ＮＫｐ３０（非特許文献２）及びＮＫｐ４４（非特許文献３）などがある。ＮＣＲｓに対するリガンドは、インフルエンザウイルス（ＩＶ）のヘマグルチニン（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ，ＨＡ）、センダイウイルス（Ｓｅｎｄａｉ ｖｉｒｕｓ，ＳＶ）のヘマグルチニン・イノラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ−ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ，ＨＮ）（非特許文献４）及び膜結合されたヘパリンスルファートプロテオグリカン（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｈｅｐａｒｉｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ）（非特許文献５）などが知られている。また、ＮＫ細胞は、ＩＦＮ−γのようなサイトカイン分泌を通じて獲得免疫反応の発達を助けるのに重要な役割をして（非特許文献６）、ＩＦＮ−γがネズミサイトメガロウイルス（ｍｕｒｉｎｅ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）感染で抗ウイルス活性を有するということが報告された。ＮＫ細胞は、直接的な先天防御及び獲得免疫反応の形成にともに関与している。何種類かのマウスモデルで、ＮＫ細胞が腫瘍の発達と微生物感染を抑制した。特に、ＮＫ細胞は、マウスサイトメガロウイルス（ｍｏｕｓｅ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ，ＭＣＭＶ）感染の初期工程で直接ウイルス感染した細胞を死滅させて、ＩＦＮ−γを生成させることによって調節する役割をする。ＮＫ細胞内でＩＦＮ−γ生成に対する主要経路は、プロティンキナーゼＣθ（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ，ＰＫＣθ）の活性化に依存する。Ｔａｓｓｉ研究陣は、免疫受容体タイロシン活性化部位（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎｍｏｔｉｆ，ＩＴＡＭｓ）を通じて信号を伝達するＮＫ細胞受容体が関与することで、ＰＫＣθが速かに活性化すると報告した。ＰＫＣθ欠乏マウスからＮＫ細胞を分析した結果、ＰＫＣθはＩＴＡＭ媒介ＩＦＮ−γ分泌において必須要素であるということが明らかにされた（非特許文献７）。
【０００５】
ホスホリパーゼＣγ（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｃγ，ＰＬＣγ）は、ＩＦＮ−γ分泌で非常に本質的な基礎因子である。ＩＦＮ−γの基底水準は、ＰＬＣγ２−欠乏ＮＫ細胞内で著しく減少し、野生型細胞とは異なり、抗ＮＫ１．１による刺激によってもＩＦＮ−γ分泌が増加する結果を示さなかった（非特許文献８）。ＰＬＣγ２欠乏ＮＫ細胞は、ＩＦＮ−γまたは顆粒球マクファージコロニー刺激因子（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ，ＧＭ−ＣＳＦ）生成能力が大きく損傷され、ＰＬＣγ２は、ＮＫ１．１媒介サイトカイン生成だけではなくＮＫＧ２Ｄでも重要な役割をする（非特許文献９）。マウス内でＦｃ受容体（ＦｃＲｓ）のγ−鎖を含み、この受容体は結合されたアダプターＩＴＡＭｓ（ａｄａｐｔｏｒ’ｓ ＩＴＡＭｓ）のチロシン残基リン酸化結果に至るようになり、それは再び脾臓チロシンキナーゼ（ｓｐｌｅｅｎ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ，Ｓｙｋ）が集まるようにする。前記キナーゼは、Ｔ細胞活性化用リンカー、７６ｋＤａ、ＰＬＣ、ＰＩ３Ｋ及びＥｒｋキナーゼを含む多数の下部シグナル伝達メディエーターを活性化させる。総合的にこの信号伝達媒介者は、遺伝子転写、ＮＫ細胞が標的細胞を溶解させるのに用いる溶解性顆粒のエキソサイトーシス（ｅｘｏｃｙｔｏｓｉｓ）のための細胞プログラムを開示して、親炎症性ケモカイン及びサイトカイン、特にＩＦＮ−γを生成させる（非特許文献１０）。前記のように、ＩＦＮ−γは抗ウイルス作用、抗増殖作用及び免疫調節作用をするので、肝炎、多様なウイルス感染性疾患及び癌治療に利用されている。
【０００６】
一方、大部分のウイルスは、宿主のＩＦＮ反応に対して自体を保護するため、免疫回避戦略を示す。特に、ウイルスによるＩＦＮ−γ信号抑制に対する多様な機序が報告されている。例えば、エプスタイン・バー（Ｅｐｓｔｅｉｎ−ｂａｒｒ）ウイルスは、ＩＦＮ−γ受容体遺伝子発現を阻害して抗ウイルス性ＩＦＮ反応を防ぎ（非特許文献１１）、ヒト腫瘍誘導ヘルペスウイルスによってＩＦＮ−γ受容体１が阻害（非特許文献１２）されると報告している。ゆえに、ＩＦＮの分泌及び活性を促進させて抗ウイルス活性及び免疫活性を高めることができる物質の開発が必要である。
【０００７】
シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）は、双子葉植物ふうろそう目トウダイグサ科の落葉高木で学名は、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉで、よく油桐とも呼ばれる。中国が原産地で韓国の南部海岸地方でも育つ。木の高さは約７．５〜１０ｍまで伸びて、樹皮は灰色を帯びた茶色で皮目があって太い枝が四方に広がる。葉は互い違いに育ち心臓模様または丸い形で、花は５月に赤味を帯びた白で咲く。実は朔果で９月になると成熟するが丸くて三つの種子が入っている。南部脂肪ではシナアブラギリを緑陰樹や庭木として植えて、種子からは油を採取するが、この油を「桐油」と言う。東洋では桐油を伝統的に火を灯すのに用いられ、現代も産業用に重要に用いられている。
【０００８】
シナアブラギリの実は、東洋伝統医学で統土風痰、消腫毒、利二便意効能があり、風痰喉痺（喉頭結核、喉頭梅毒など）、疥癬、丹毒、やけど、膿疱瘡、食積腹脹、大小便不利を治療するのに用いた。根は、少食、利水、痰火、殺虫の効能があり、食積肥満、水腫、鼓脹、暁天、瘰癧、蛔虫症を治療するのに用いた。葉は、よう（癰）、解毒の効能があって癰瘡、丹毒、（つきへんに兼）瘡、凍瘡、疥癬、痢疾治療に用いた（非特許文献１３）。
【０００９】
シナアブラギリの化学成分研究を通じてシナアブラギリにジテルペノイドエステル、ステロール、タンニン、オイル、クマリン、コウマロリグナン（ｃｏｕｍａｒｏｌｉｇｎａｎ）系化合物が含有されているという研究結果が知られている（非特許文献１４、非特許文献１５、非特許文献１６、非特許文献１７、非特許文献１８）。シナアブラギリに対する生理活性研究では、ヒト多形核白血球活性因子（ｈｕｍａｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｎｕｃｌｅａｒ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）、ヒト好中球活性因子（ｈｕｍａｎ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）などが明らかにされ、シナアブラギリの抽出物及びジテルペンエステル（ｄｉｔｅｒｐｅｎｅ ｅｓｔｅｒｓ）によってエプスタイン−バーウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ）活性が誘導されると報告された。また、シナアブラギリの１２−Ｏ−ヘキサデカノイル−１６−ヒドロキシホルボール１３−アセテート（１２−Ｏ−ｈｅｘａｄｅｃａｎｏｙｌ−１６−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｏｒｂｏｌ １３−ａｃｅｔａｔｅ）は、ヒトＴ−リンパ球親和性ウイルスタイプＩ（ｈｕｍａｎ Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｈｉｃ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ Ｉ，ＨＴＬＶ−Ｉ）によって誘導されるリンパ球のコロニー形成を増大させる効能があると報告された。シナアブラギリの１２−Ｏ−パルミトイル−１６−ヒドロキシホルボール１３−アセテート（１２−Ｏ−Ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−１６−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｏｒｂｏｌ １３−ａｃｅｔａｔｅ）、１２−Ｏ−パルミトイル−４−ジオキシ−４β−１６−ヒドロキシホルボール１３−アセテート（１２−Ｏ−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−４−ｄｅｏｘｙ−４β−１６−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｏｒｂｏｌ １３−ａｃｅｔａｔｅ）は、魚類に対する毒性がロテノン（ｒｏｔｅｎｏｎｅ）と類似の程度であるということが明らかにされた（非特許文献１７、非特許文献１９、非特許文献２０、非特許文献２１、非特許文献２２、非特許文献２３）。
【００１０】
一方、コショウノキ（Ｄａｐｈｎｅ ｋｉｕｓｉａｎａ）は、双子葉植物桃金嬢目沈丁花科の常緑かつ葉潅木で、学名は、Ｄａｐｈｎｅ ｋｉｕｓｉａｎａで白沈丁花とも言う。原産地は韓国で、慶南巨済島と全南黒山島、チェジュドの標高５０〜１，３００ｍの海辺の山すそで主に育ち、その高さは約１ｍである。葉は互い違いに延びてだ円形または倒披針形で長さは約３〜８ｃｍ、幅は約１．２〜３．５ｃｍ程度で、端がのっぺりしていてつやがあり下部が細くなって短い葉の柄と連続する。花は雌雄異体で２〜４月に白い花が咲き、枝の先に集まって付いて香りが濃い。包葉は、広い披針形で花袋は短くて白色の綿毛があり、萼も綿毛があり４つに割れている。実は漿果でたまごのような球形で、長さは８ｍｍ程度である。５〜６月に朱色に熟する。茎は直立して紺色で、枝がたくさん出て被覆形の樹形を成す。
【００１１】
コショウノキ花は、東洋伝統医学で、咽喉疼痛、歯痛、リウマチ痛、天然痘、初期の乳腺癌を治療するのに用いられ、根は、咽喉炎治療に、葉は創傷、通風、慢性皮膚炎を治療するのに用いられてきたが、その生物学的活性はいまだに明確に知られていなかった（非特許文献１３）。コショウノキの化学成分研究によってコショウノキにアントシアニン系及びクマリン系化合物が含有されていることが報告された（非特許文献２４、非特許文献２５）。
【００１２】
しかし、まだ前記シナアブラギリまたはコショウノキの抗ウイルス活性及び免疫活性作用に関して報告されたことはない。
【００１３】
それで、本発明者等は、従来の抗ウイルス剤が有する問題点を解決することができる、植物に由来した天然抽出物から抗ウイルス用物質を発掘するために研究中、シナアブラギリの葉、幹及び実の抽出物、コショウノキの葉、幹、花及び根の抽出物、またはそれらの分画物がナチュラルキラー（ＮＫ）細胞でインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）の分泌を顕著に増加させて抗ウイルス効能を有することを確認することによって本発明を完成した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｓｉｖｏｒｉ，Ｓ．等．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，１９９７年，第１８６巻，ｐ．１１２９−１１３６
【非特許文献２】Ｐｅｎｄｅ，Ｄ．等．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，１９９９年，第１９０巻，ｐ．１５０５−１５１６
【非特許文献３】Ｃａｎｔｏｎｉ，Ｃ．等．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，１９９９年，第１８９巻，ｐ．７８７−７９６
【非特許文献４】Ａｒｎｏｎ，Ｔ．Ｉ．等．，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００１年，第３１巻，ｐ．２６８０−２６８９
【非特許文献５】Ｂｌｏｕｓｈｔａｉｎ，Ｎ．等．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００４年，第１７３巻，ｐ．２３９２−２４０１
【非特許文献６】Ｓｔｅｔｓｏｎ，Ｄ．Ｂ．等．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，２００３年，第１９８巻，ｐ．１０６９−１０７６
【非特許文献７】Ｔａｓｓｉ，Ｉ．等．，Ｂｌｏｏｄ，２００８年，第１１２巻，ｐ．４１０９−４１１６
【非特許文献８】Ｃａｒａｕｘ，Ａ．等．，Ｂｌｏｏｄ，２００６年，第１０７巻，ｐ．９９４−１００２
【非特許文献９】Ｒｅｇｕｎａｔｈａｎ，Ｊ．等．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００６年，第１７７巻，ｐ．５３６５−５３７６
【非特許文献１０】Ｔａｓｓｉ，Ｉ．等．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００５年，第１７５巻，ｐ．７４９−７５４
【非特許文献１１】Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｔ．Ｅ．，等．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２００１年，第１５巻，ｐ．７８７−７９９
【非特許文献１２】Ｌｉ，Ｑ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，２００７年，第８１巻，ｐ．２１１７−２１２７
【非特許文献１３】ジョン・ボソプ、シン・キンキョウ、図解郷薬大辞典、営林社、ソウル、１９９８年，ｐｐ．７４１−７４２
【非特許文献１４】Ｉｓｈｉｋｕｒａ，Ｎ．等．，Ｉ．Ｂｏｔａｎｉｃａｌ Ｍａｇａｚｉｎｅ，１９７５年，第８８巻，ｐ．４１−４５
【非特許文献１５】Ｎｏｎａｋａ，Ｇ．等．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，１９９０年，第３８巻，ｐ．８６１−８６５
【非特許文献１６】Ｆｏｚｄａｒ，Ｂ．Ｉ．等．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８９年，第２８巻，ｐ．２４５９−２４６１
【非特許文献１７】Ｈｉｒｏｔｏ，Ｍ．等．，Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９７９年，第４３巻，ｐ．２５２３−２５２９
【非特許文献１８】Ｏｋｕｄａ，Ｔ．等．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９７５年，第１４巻，ｐ．５０９−５１５
【非特許文献１９】Ｏｋｕｄａ，Ｔ．等．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９７５年，第１４巻，ｐ．２５１３−２５１４
【非特許文献２０】Ｓｈｉｃｈｉｊｏ，Ｓ．等，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ＋Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９８８年，第２７巻，ｐ．１８３−１８９
【非特許文献２１】Ｍａｔｓｕｄａ，Ｓ．等．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，１９８６年，第３８巻，ｐ．８５９−８６５
【非特許文献２２】Ｓｈｉｃｈｉｊｏ，Ｓ．等．，Ａｒｅｒｕｇｉ，１９８５年，第３４巻，ｐ．１９０−１９７
【非特許文献２３】Ｉｔｏ，Ｙ．等．，Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９８３年，第１８巻，ｐ．８７−９５
【非特許文献２４】Ｉｓｈｉｋｕｒａ，Ｎ，Ｉ．Ｂｏｔａｎｉｃａｌ Ｍａｇａｚｉｎｅ，１９７５年，第８８巻，ｐ．４１−４５
【非特許文献２５】Ｎａｋａｂａｙａｓｈｉ，Ｔ，Ｙａｋｕｇａｋｕ Ｚａｓｓｈｉ，１９５４年，第７４巻，ｐ．１９２−１９３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の目的は、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）またはコショウノキ（Ｄａｐｈｎｅ ｋｉｕｓｉａｎａ）の抽出物、またはその分画物を有効成分として含む抗ウイルス用組成物を提供することである。
【００１６】
また、本発明のまた他の目的は、薬学的に有効な量のシナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物を有効成分として含む組成物をウイルス性疾患にかかった個体に投与する工程を含むウイルス性疾患の改善または治療方法を提供する。
【００１７】
同時に、本発明のまた他の目的は、薬学的に有効な量のシナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物を有効成分として含む組成物を個体に投与する工程を含むウイルス性疾患の予防方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
前記目的を達成するために、本発明はシナアブラギリまたはコショウノキの抽出物を有効成分として含むウイルス性疾患の予防も治療用薬学的組成物を提供する。
【００１９】
また、本発明は前記シナアブラギリまたはコショウノキの抽出物を追加的に有機溶媒で抽出して製造された有機溶媒分画物を有効成分として含むウイルス性疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
【００２０】
また、本発明はシナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物を有効成分として含むウイルス性疾患の予防または改善用健康食品を提供する。
【００２１】
また、本発明はシナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物を有効成分として含むウイルス性疾患の予防または改善用飼料添加剤を提供する。
【００２２】
また、本発明は薬学的に有効な量のシナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物を有効成分として含む組成物をウイルス性疾患にかかった個体に投与する工程を含むウイルス性疾患の改善または治療方法を提供する。
【００２３】
また、本発明は薬学的に有効な量のシナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物を有効成分として含む組成物を個体に投与する工程を含むウイルス性疾患の予防方法を提供する。
【００２４】
また、本発明はシナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物をウイルス性疾患予防または治療用薬学的組成物の製造に用いる用途を提供する。
【００２５】
また、本発明はシナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物をウイルス性疾患予防または改善用健康食品の製造に用いる用途を提供する。
【００２６】
同時に、本発明はシナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物をウイルス性疾患予防または改善用飼料添加剤の製造に用いる用途を提供する。
【発明の効果】
【００２７】
本発明のシナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞で免疫関連サイトカインであるインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）の分泌誘導性を通じて強力な抗ウイルス活性を示してウイルス性疾患に卓越した効果があるので、抗ウイルス用組成物の有効成分として有用に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、シナアブラギリの葉、幹及び実それぞれのメタノール抽出物、それから分画したｎ−ヘキサン、エチルアセテート、ブタノールまたは水分画物をＮＫ９２細胞に処理した後、ＩＦＮ−γの分泌量を分析したグラフである：Ｍ：シナアブラギリのメタノール抽出物；Ｈ：シナアブラギリのｎ−ヘキサン分画物；Ｅ：シナアブラギリのエチルアセテート分画物；Ｂ：シナアブラギリのブタノール分画物；Ｗ：シナアブラギリの水分画物；ＮＣ：陰性対照群；及びＰＣ：陽性対照群。
【図２】図２は、シナアブラギリの葉、幹及び実それぞれの抽出物を分画した分画物をＮＫ９２細胞に処理した後、ＩＦＮ−γの分泌量を分析したグラフである：Ａ：シナアブラギリの葉のｎ−ヘキサン分画物；Ｂ：シナアブラギリの実のｎ−ヘキサン分画物；Ｃ：シナアブラギリの幹のｎ−ヘキサン分画物；及びＤ：シナアブラギリの実のエチルアセテート分画物。
【図３】図３は、コショウノキの葉、幹、花及び根それぞれのメタノール抽出物、それから分画したｎ−ヘキサン、エチルアセテート、ブタノールまたは水分画物をＮＫ９２細胞に処理した後、ＩＦＮ−γの分泌量を測定したグラフである：Ａ：コショウノキのメタノール抽出物；及びＢ：コショウノキのメタノール抽出物の有機溶媒分画物：Ｍ：コショウノキのメタノール抽出物；Ｈ：コショウノキのｎ−ヘキサン分画物；Ｅ：コショウノキのエチルアセテート分画物；Ｂ：コショウノキのブタノール分画物；Ｗ：コショウノキの水分画物；ＮＣ：陰性対照群；及びＰＣ：陽性対照群。
【図４】図４は、コショウノキの葉、幹、花及び根それぞれの抽出物を分画した分画物をＮＫ９２細胞に処理した後、ＩＦＮ−γの分泌量を分析したグラフである：Ａ：コショウノキのメタノール抽出物の有機溶媒分画物（ＤＫＣＳ：コショウノキの幹の栽培試料；及びＤＫＣＬ：コショウノキの葉の栽培試料）；Ｂ：コショウノキの葉の栽培試料のｎ−ヘキサン分画物；及びＣ：コショウノキの葉の栽培試料のエチルアセテート分画物。
【図５】図５は、シナアブラギリの葉、幹及び実それぞれのメタノール抽出物をＮＫ９２細胞に濃度別に処理した後、ＩＦＮ−γの分泌量を分析したグラフである。
【図６】図６は、コショウノキの抽出物のＩＦＮ−γ生成能力の最低活性濃度を測定したグラフである。
【図７】図７は、シナアブラギリの抽出物が処理されたＮＫ９２細胞でＩＦＮ−γｍＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲを通じて時間帯別に確認した図である。
【図８】図８は、コショウノキの抽出物が処理されたＮＫ９２細胞で、ＩＦＮ−α及びγ ｍＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲを通じて時間帯別に確認した図である。
【図９】図９は、Ｂａｙ−ｌｌ（ＮＦ−κＢ活性抑制因子）またはロテリン（ＰＫＣ活性抑制因子）の処理によってシナアブラギリの抽出物によって誘導されるＩＦＮ−γ生成変化を示した図である。
【図１０】図１０は、シナアブラギリまたはコショウノキの抽出物が処理されたＮＫ９２細胞の活性に関与する細胞表面物質の発現変化をＦＡＣＳで分析した図である。
【図１１】図１１は、インフルエンザウイルスが感染した肺上皮細胞株Ａ５４９細胞でシナアブラギリの抽出物の処理によるＩＦＮ−α及びβのｍＲＮＡ発現をＲＴ−ＰＣＲを通じて確認した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下、本発明で用いた用語を説明する。
【００３０】
本明細書で用いる用語「抽出物」は、当業界で粗抽出物（ｃｒｕｄｅ ｅｘｔｒａｃｔ）として通用する意味を有するが、広義的には下記の分画物も含む。
【００３１】
本明細書で用いる用語「分画物」は、抽出時に用いた溶媒と異なる溶媒を用いて本発明で目的とする活性を分画して得た活性分画物（ｆｒａｃｔｉｏｎ）を意味する。
【００３２】
本発明で用いる用語「予防」は、本発明の組成物の投与でウイルス性疾患を抑制したり進行を遅延させたりするすべての行為を意味する。
【００３３】
本発明で用いる用語「治療」及び「改善」は、本発明の組成物の投与によってウイルス性疾患の症状が好転または有利に変更されるすべての行為を意味する。
【００３４】
本発明で用いる用語「投与」は、任意の適切な方法で個体に所定の本発明の組成物を提供することを意味する。
【００３５】
本発明で用いる用語「個体」は、本発明の組成物を投与してウイルス性疾患の症状が好転し得る疾患を有したヒト、猿、犬、山羊、豚または鼠などすべての動物を意味する。
【００３６】
本明細書で用いる用語「飼料」は、家畜の生命を維持して乳、肉、卵、毛皮などを生産するのに必要な有機または無機栄養素を供給する物質を意味する。
【００３７】
以下、本発明を詳しく説明する。
【００３８】
本発明は、シナアブラギリまたはコショウノキの抽出物を有効成分として含むウイルス性疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
【００３９】
前記シナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物は、当業界で公知された多様な抽出方法によって得ることができる。
【００４０】
前記シナアブラギリまたはコショウノキの抽出物は、下記の工程を含む製造方法によって製造することが好ましいが、これに限定されない：
１）シナアブラギリまたはコショウノキに抽出溶媒を加えて抽出する工程；
２）工程１）の抽出物を冷却後にろ過する工程；及び
３）工程２）のろ過した抽出物を減圧濃縮した後に乾燥する工程。
【００４１】
前記方法において、工程１）のシナアブラギリまたはコショウノキは、栽培したものまたは市販のものなど制限なしに使用することができる。前記シナアブラギリは、乾燥した葉、幹または実のすべてが使用可能で、前記コショウノキは乾燥した葉、幹、花または根がすべて使用可能である。
【００４２】
前記抽出溶媒は、当業界で通常使用するどのような抽出溶媒も使用可能であり、水、アルコールまたはそれらの混合物を使用することが好ましい。前記アルコールとしては、Ｃ１〜Ｃ２低級アルコールを用いるのが好ましく、低級アルコールではエタノールまたはメタノールを用いることが好ましい。抽出方法では、振とう抽出、還流抽出、超臨界抽出または亜臨界抽出を用いることが好ましいが、これに限定されない。前記抽出溶媒を乾燥したシナアブラギリまたはコショウノキの分量の２〜２０倍添加して抽出することが好ましい。抽出温度は、２０〜５０°Ｃであることが好ましいがこれに限定されない。また、抽出時間は、１０〜４８時間であることが好ましく、２４時間がさらに好ましいがこれに限定されない。同時に、抽出回収は、３〜５回であることが好ましく、３回反復抽出することがさらに好ましいが、これに限定されない。
【００４３】
前記方法において、工程３）の減圧濃縮は、真空減圧濃縮機または真空回転蒸発きを用いることが好ましいが、これに限定されない。また、乾燥は、減圧乾燥、真空乾燥、沸騰乾燥、噴霧乾燥または凍結乾燥することが好ましいが、これに限定されない。
【００４４】
前記シナアブラギリまたはコショウノキの抽出物の分画物は、シナアブラギリまたはコショウノキの抽出物に、追加で有機溶媒を加えて有機溶媒分画物を製造する工程を含む製造方法によって製造することが好ましいが、これに限定されない。
【００４５】
前記方法において、前記有機溶媒は当業界で通常使用されるどのような抽出溶媒も使用可能であり、Ｃ１〜Ｃ４の無水または含水低級アルコール（メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ｎ−プロパノール、イソ−プロパノールまたはｎ−ブタノールなど）、前記低級アルコールと水との混合溶媒、アセトン、エチルアセテート、クロロホルム、１，３−ブチレングリコール、ヘキサン、ジエチルエーテルまたはブチルアセテートなどを使用することができる。前記有機溶媒は、ヘキサン、エチルアセテートまたはブタノールであることが好ましいが、これに限定されない。
【００４６】
前記シナアブラギリまたはコショウノキの抽出物に極性が低いものから高いものの順にヘキサン、エチルアセテート、ブタノール、水を順次に加えて各有機溶媒層の分画物を得ることが好ましく、分画物は分別ロートを用いて分画することが好ましいが、これに限定されない。具体的に、シナアブラギリまたはコショウノキの抽出物を蒸留水に懸濁してヘキサンを加えてヘキサン層を分離して、残った水層に再びエチルアセテートを加えてエチルアセテート層を分離して、残った水層に再びブタノールを加えてブタノール層を分離することができる。各有機溶媒層の分画物をすべて用いることができる。
【００４７】
前記シナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞でインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）の分泌誘導作用を通じて抗ウイルス活性を示すことが好ましいが、これに限定されない。
【００４８】
前記ウイルス性疾患は、豚インフルエンザウイルス（Ｓｗｉｎｅ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ、ＳＩＶ）、インフルエンザウイルス（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ）、新型インフルエンザＡ（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ ｓｕｂｔｙｐｅ Ｈ１Ｎ１）、鳥インフルエンザウイルス（ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ）、ライノウイルス（ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ）、アデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、コロナウイルス（ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）、パラインフルエンザウイルス（ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ）、呼吸器合抱体ウイルス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）、疱疹ウイルス（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ，ＨＳＶ）、後天性免疫欠乏症侯群ウイルス（ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ，ＨＩＶ）及び肝炎ウイルスからなる群から選択されるいずれか一つ以上のウイルスによって感染される疾患であることが好ましいが、これに限定されない。
【００４９】
本発明の組成物は、前記成分に追加で同一または類似の機能を示す有効成分を１種以上含むことができる。
【００５０】
本発明の組成物は、総重量に対して前記シナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物は、０．１〜５０重量部であることが好ましいが、これに限定されない。
【００５１】
本発明の組成物は、前記説明された有効成分以外に薬剤学的に許容される担体を含むことができる。本発明の組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常使用されるもので、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルなどを含むが、ここに限定されない。本発明の組成物は、前記成分以外に滑剤、湿潤剤、甘味料、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などを追加で含むことができる。相応しい薬剤学的に許容される担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ ｅｄ．，１９９５年）に詳しく記載されている。
【００５２】
本発明の組成物の適切な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食物、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性のような要因によって多様に処方され得る。一方、本発明の組成物の経口投与量は、１日当り０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ（体重）であることが好ましいが、これに限定されない。
【００５３】
本発明の組成物は、経口または非経口で投与することができ、非経口投与する場合、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、経皮投与などで投与することができる。本発明の組成物は、適用される疾患の種類によって、投与経路を決定することが好ましい。
【００５４】
本発明の組成物は、本発明が属する技術分野で通常の知識を有した者が容易に実施することができる方法によって、薬剤学的に許容される担体及び／または賦形剤を用いて製剤化することによって、単位用量形態で製造するかまたは多用量容器内に入れて製造することができる。ここで、剤形はオイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液または乳化液形態かエキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤の形態も可能で、分散剤または安定化剤を追加で含むことができる。
【００５５】
本発明者等は、シナアブラギリまたはコショウノキの抽出物またはその分画物の抗ウイルス活性を調べるため、シナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはそれらの分画物のインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）分泌誘導能を酵素結合免疫吸収分析（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ，ＥＬＩＳＡ）を通じて確認した。その結果、シナアブラギリの葉、幹または実の抽出物、またはその分画物（ｎ−ヘキサン、エチルアセテートまたはブタノール分画物）は、ＮＫ細胞でＩＦＮ−γの分泌を顕著に増加させ（表１、図１及び図２参照）、シナアブラギリの抽出物の濃度依存的にＩＦＮ−γの分泌が増加することを確認した（図５参照）。また、それぞれのコショウノキの葉、幹、花または根の抽出物、またはその分画物（ｎ−ヘキサン、エチルアセテートまたはブタノール分画物）は、ＮＫ細胞でＩＦＮ−γの分泌を顕著に増加させることが示され（表２、図３及び図４参照）、コショウノキの抽出物の濃度に依存的にＩＦＮ−γの分泌が増加することを確認した（図６参照）。ＩＦＮ−γのｍＲＮＡもまたシナアブラギリまたはコショウノキの抽出物が処理されたＮＫ９２細胞で顕著に増加した（図７及び図８参照）。一方、シナアブラギリの抽出物によるＩＦＮ−γ生成の誘導は、ＢａｙII処理によってＮＫ９２細胞内で減少することを確認することによって、シナアブラギリの抽出物によるＩＦＮ−γ生成の誘導がＮＦ−κＢ信号伝達によって媒介されるということを確認し、ＰＫＣ信号伝達抑制因子であるロテリンの処理によってＩＦＮ−γ生成が減少されることでＮＦ−κＢ信号伝達の上位信号伝達因子は、ＰＫＣの活性によるものであることを確認した（図９）。シナアブラギリまたはコショウノキの抽出物がＮＫ９２細胞の表面物質の発現に及ぼす影響をＦＡＣＳ分析を通じて確認した結果、ＮＫ細胞の活性に関与するＮＫＧ２Ｃ及びＤの発現が顕著に増加し、ＮＫ細胞のナチュラルキラー活性と関連したＮＫｐ４４の発現が顕著に増加したことを確認した（図１０参照）。同時に、シナアブラギリの抽出物をインフルエンザウイルスに感染したＡ５２９細胞に処理することで、ＩＦＮ−β発現の増加がさらに早くなることを確認した（図１１参照）。ここで、前記ＩＦＮ−γはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞で大食細胞活性因子と呼ばれるほど食細胞活性作用が強く、免疫及び細胞反応を生成することが知られたサイトカインである。それで、シナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物がＩＦＮ−γの分泌を誘導することによって強力な抗ウイルス活性を有することを確認した。
【００５６】
したがって、本発明のシナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物は、ウイルス性疾患の予防または治療用薬学的組成物として有用に用いられることが分かる。
【００５７】
また、本発明は薬学的に有効な量のシナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物を有効成分として含む薬学的組成物をウイルス性疾患にかかった個体に投与する工程を含む、ウイルス性疾患の改善または治療方法を提供する。
【００５８】
また、本発明は薬学的に有効な量のシナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物を有効成分として含む薬学的組成物を個体に投与する工程を含むウイルス性疾患の予防方法を提供する。
【００５９】
前記薬学的に有効な量というのは、０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇで、好ましくは、０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇであるが、これに限定されない。投与量は、特定患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与期間、投与方法、除去率、疾患の重症度等によって変化し得る。
【００６０】
前記個体は、脊椎動物であり、好ましくは哺乳動物で、より好ましくはネズミ、ウサギ、ギニアピッグ、ハムスター、犬、猫のような実験動物で、最も好ましいのはチンパンジー、ゴリラのような類人猿動物である。
【００６１】
前記投与方法は、経口または非経口投与することができ、非経口投与時には腹腔内注射、直腸内注射、皮下注射、静脈注射、筋肉内注射、子宮内硬膜注射、脳血管内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）注射または胸部内注射によって投与することができる。
【００６２】
前記ウイルス性疾患は、豚インフルエンザウイルス（ＳＩＶ）、インフルエンザウイルス、新型インフルエンザＡ（ｓｕｂｔｙｐｅ Ｈ１Ｎ１）、鳥インフルエンザウイルス、ライノウイルス、アデノウイルス、コロナウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合抱体ウイルス、疱疹ウイルス（ＨＳＶ）、後天性免疫欠乏症侯群ウイルス（ＨＩＶ）及び肝炎ウイルスからなる群から選択されるいずれか一つ以上のウイルスによって感染される疾患であることが好ましいが、これに限定されない。
【００６３】
本発明のシナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞で免疫関連サイトカインであるＩＦＮ−γの分泌誘導性を通じて強力な抗ウイルス活性を示してウイルス性疾患に卓越した効果があるので、ウイルス性疾患の予防または治療に有用に用いることができる。
【００６４】
また、本発明はシナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物を有効成分として含むウイルス性疾患の予防または改善用健康食品を提供する。
【００６５】
前記ウイルス性疾患は、豚インフルエンザウイルス（ＳＩＶ）、インフルエンザウイルス、新型インフルエンザＡ（ｓｕｂｔｙｐｅ Ｈ１Ｎ１）、鳥インフルエンザウイルス、ライノウイルス、アデノウイルス、コロナウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合抱体ウイルス、疱疹ウイルス（ＨＳＶ）、後天性免疫欠乏症侯群ウイルス（ＨＩＶ）及び肝炎ウイルスからなる群から選択されるいずれか一つ以上のウイルスによって感染される疾患であることが好ましいが、これに限定されない。
【００６６】
本発明のシナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物をそのまま添加するか他の食品または食品成分とともに用いることができ、通常的な方法によって適切に用いることができる。
【００６７】
本発明の健康食品は、食品製造時に通常的に添加される成分を含み、例えば、タンパク質、炭水化物、脂肪、栄養素及び調味剤を含む。
【００６８】
前記食品の種類には、特別な制限はない。前記シナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物を添加することができる食品の例としては、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンデー類、スナック類、お菓子類、ピザ、ラーメン、その他麺類、ガム類、アイスクリーム類を含んだ酪農製品、各種スープ、飲料水、お茶、ドリンク剤、アルコール飲料及びビタミン複合剤などがあり、通常的な意味での健康食品をすべて含む。
【００６９】
本発明の健康飲料組成物は、通常の飲料のようにさまざまな香味剤または天然炭水化物などを追加成分として含むことができる。上述した天然炭水化物は、ブドウ糖、果糖のようなモノサッカライド、マルトース、スクロースのようなジサッカライド、及びデキストリン、シクロデキストリンのようなポリサッカライド、キリシトール、ソルビトール、エリスリトール等の糖アルコールである。甘味剤としてはタウマチン、ステビア抽出物のような天然甘味料や、サッカリン、アスパルテームのような合成甘味剤などを使用することができる。前記天然炭水化物の割合は、本発明の組成物１００ｍｌ当り一般的に約０．０１〜０．０４ｇ、好ましくは約０．０２〜０．０３ｇである。
【００７０】
前記の他に本発明のシナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物はさまざまな営養剤、ビタミン、電解質、風味剤、着色剤、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に用いる炭酸化剤などを含むことができる。その他に本発明のシナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物は、天然フルーツジュース、フルーツジュース飲料及び野菜飲料の製造のための果肉を含むことができる。このような成分は、独立的にまたは混合して使用することができる。このような添加剤の割合は、大きく重要ではないが本発明の組成物１００重量部当たり０．０１〜０．１重量部の範囲で選択することが一般的である。
【００７１】
本発明のシナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物は、ＮＫ細胞で免疫関連サイトカインであるＩＦＮ−γの分泌誘導性を通じて強力な抗ウイルス活性を示してウイルス性疾患に卓越した効果があるので、ウイルス性疾患の予防または改善用健康食品に有用に用いることができる。
【００７２】
また、本発明は、シナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物を有効成分として含む、ウイルス性疾患の予防または改善用飼料添加剤を提供する。
【００７３】
前記ウイルス性疾患は、豚インフルエンザウイルス（ＳＩＶ）、インフルエンザウイルス、新型インフルエンザＡ（ｓｕｂｔｙｐｅ Ｈ１Ｎ１）、鳥インフルエンザウイルス、ライノウイルス、アデノウイルス、コロナウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合抱体ウイルス、疱疹ウイルス（ＨＳＶ）、後天性免疫欠乏症侯群ウイルス（ＨＩＶ）及び肝炎ウイルスからなる群から選択されるいずれか一つ以上のウイルスによって感染さる疾患であることが好ましいが、これに限定されない。
【００７４】
前記飼料添加剤は、抗ウイルス効能を有するので、家擒類、家畜などに倦まず弛まずに摂取するようにすることでウイルス性疾患を予防することができ、すでに発生したウイルス性疾患を改善することができる。飼料は、栄養価、主成分、流通、水分含量配合状態及び加工形態などによっていろいろに分類することができ、前記飼料は、粗飼料、濃厚飼料、補充飼料、タンパク質飼料、デンプン飼料、脂肪質飼料または繊維質飼料が使用可能であるが、これに限定されない。
【００７５】
本発明の飼料添加剤にはシナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物が０．１〜２０％重量部、脂肪分解酵素（リパーゼ）が０．００１〜０．０１％重量部、第３リン酸カルシウムが１〜２０％重量部、ビタミンＥが０．０１〜０．１％重量部、酵素粉末が１〜１０％重量部、乳酸菌が０．１〜１０％重量部、バシラス培養液が０．０１〜１０％重量部及びブドウ糖は２０〜９０％重量部で構成されていることが好ましいが、特別にこれに限定するのではなく、シナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物が有効量で添加されていれば、本発明の飼料添加剤として可能である。
【００７６】
前記有効量というのは、家擒類、家畜などが倦まず弛まず摂取するようにすることでウイルス性疾患を予防したり、すでに発生したウイルス性疾患を改善したりすることができる量を意味する。また、添加による利点を越す悪影響が生じない量が好ましい。
【００７７】
また前記飼料添加剤は、追加的に家擒類及び家畜等に許容される担体を含むことができる。本発明においては前記飼料添加剤をそのまままたは公知の担体、安定剤などを加えることができ、必要によってビタミン、アミノ酸類、ミネラル等の各種養分、抗酸化剤、抗生物質、抗菌剤及びその他の添加剤などを加えることもでき、その形状としては粉体、顆粒、ペレット、懸濁液等の適当な状態であり得る。本発明の飼料添加剤を供給する場合は、家擒類及び家畜等に対して単独でまたは飼料に混合して供給することができる。
【００７８】
本発明のシナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物は、ＮＫ 細胞で免疫関連サイトカインであるＩＦＮ−γの分泌誘導性を通じて強力な抗ウイルス活性を示してウイルス性疾患に卓越した効果があるので、ウイルス性疾患の予防または改善用飼料添加剤として有用に用いることができる。
【００７９】
また、本発明はシナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物をウイルス性疾患予防または治療用薬学的組成物の製造に用いる用途を提供する。
【００８０】
また、本発明はシナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物をウイルス性疾患予防または改善用健康食品の製造に用いる用途を提供する。
【００８１】
同時に、本発明はシナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物をウイルス性疾患予防または改善用飼料添加剤の製造に用いる用途を提供する。
【００８２】
前記ウイルス性疾患は、豚インフルエンザウイルス（ＳＩＶ）、インフルエンザウイルス、新型インフルエンザＡ（ｓｕｂｔｙｐｅ Ｈ１Ｎ１）、鳥インフルエンザウイルス、ライノウイルス、アデノウイルス、コロナウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合抱体ウイルス、疱疹ウイルス（ＨＳＶ）、後天性免疫欠乏症侯群ウイルス（ＨＩＶ）及び肝炎ウイルスからなる群から選択されるいずれか一つ以上のウイルスによって感染される疾患であることが好ましいが、これに限定されない。
【００８３】
本発明のシナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物は、ＮＫ細胞で免疫関連サイトカインであるＩＦＮ−γの分泌誘導性を通じて強力な抗ウイルス活性を示してウイルス性疾患に卓越した効果があるので、ウイルス性疾患の予防、改善または治療用薬学的組成物、健康食品、または飼料添加剤の製造に有用に用いることができる。
【００８４】
以下、本発明を実施例及び製造例によって詳しく説明する。
【００８５】
ただし、下記の実施例及び製造例は本発明を具体的に例示するだけのものであり、本発明の内容が実施例及び製造例によって限定されるのではない。
【００８６】
＜実施例１＞シナアブラギリまたはコショウノキの抽出物の製造
＜１−１＞シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）の葉、幹または実のメタノール抽出物の製造
シナアブラギリは、チェジュドの西帰浦で採取して、乾燥したシナアブラギリの葉、幹及び実それぞれ２ｋｇにメタノール４ｌを加えた後、常温で循環させながら２４時間抽出してろ過上澄み液を回収した。抽出後、溶媒を減圧濃縮してシナアブラギリの葉、幹及び実のメタノール抽出物をそれぞれ２７６ｇ、１２０ｇ及び１００ｇ得た。
【００８７】
＜１−２＞コショウノキの葉、幹、花または根のメタノール抽出物
コショウノキ（Ｄａｐｈｎｅ ｋｉｕｓｉａｎａ）は、全羅南道の務安で採取して、乾燥したコショウノキの葉、幹、花または根それぞれ１ｋｇにメタノール４ｌを加えた後、常温で循環させながら２４時間抽出してろ過上澄み液を回収した。抽出後、溶媒を減圧濃縮してコショウノキの葉、幹、花及び根のメタノール抽出物をそれぞれ１１８ｇ、１４０ｇ、８０ｇ及び１０５ｇ得た。
【００８８】
＜比較例１＞フジモドキのメタノール抽出物の製造
抗インフルエンザウイルス活性が報告されたフジモドキ（Ｄａｐｈｎｅ ｇｅｎｋｗａ）（韓国特許出願番号：１０−２００９−００３４１３２）は、京畿道の竜仁で採取し、フジモドキ乾燥物を用いて前記＜実施例１＞抽出物製造方法によってフジモドキのメタノール抽出物を製造した。
【００８９】
＜実施例２＞シナアブラギリまたはコショウノキの抽出物から分画物の製造
＜２−１＞シナアブラギリの分画物の製造
＜２−１−１＞シナアブラギリのｎ−ヘキサン分画物
前記実施例＜１−１＞で得たシナアブラギリの葉、幹及び実のメタノール抽出物をそれぞれ蒸留水１．５ｌに懸濁させて、ｎ−ヘキサン１．５ｌを加えて混合後、ｎ−ヘキサン可溶性分画部と水可溶性分画部を分離し、この過程を３回反復実施してｎ−ヘキサン可溶性分画部をろ過、減圧濃縮してシナアブラギリの葉、幹及び実のｎ−ヘキサン分画物をそれぞれ２７．６ｇ、２８ｇ及び４ｇ得た。
【００９０】
＜２−１−２＞シナアブラギリのエチルアセテート分画物
前記実施例＜２−１−１＞のシナアブラギリの葉、幹及び実のｎ−ヘキサン分画物を分離して残ったそれぞれの残り分画部にエチルアセテート１．５ｌを加えて混合後、エチルアセテート分画部を分離し、この過程を３回反復実施してエチルアセテート分画部をろ過、減圧濃縮してシナアブラギリの葉、幹及び実のエチルアセテート分画物をそれぞれ８０ｇ、１８ｇ及び４０ｇ得た。
【００９１】
＜２−１−３＞シナアブラギリのブタノール分画物
前記実施例＜２−１−２＞のシナアブラギリの葉、幹及び実のエチルアセテート分画物を分離して残ったそれぞれの残り分画部にブタノール１．５ｌを加えて混合後、ブタノール分画部を分離し、この過程を３回反復実施してブタノール分画部をろ過、減圧濃縮してシナアブラギリの葉、幹及び実のブタノール分画物をそれぞれ５５ｇ、２４ｇ、及び１２ｇ得た。
【００９２】
＜２−２＞コショウノキの分画物の製造
＜２−２−１＞コショウノキのｎ−ヘキサン分画物
前記実施例＜１−２＞で得たコショウノキの葉、幹、花及び根のメタノール抽出物から、前記実施例＜２−１−１＞に記載した方法によってコショウノキのｎ−ヘキサン分画物を製造して、コショウノキの葉、幹、花及び根のｎ−ヘキサン分画物をそれぞれ３１ｇ、３６ｇ、２１ｇ及び２７ｇ得た。
【００９３】
＜２−２−２＞コショウノキのエチルアセテート分画物
前記実施例＜２−１−２＞に記載した方法によってコショウノキのエチルアセテート分画物を製造して、コショウノキの葉、幹、花及び根のエチルアセテート分画物をそれぞれ７ｇ、８．４ｇ、５ｇ及び６ｇ得た。
【００９４】
＜２−２−３＞コショウノキのブタノール分画物の製造
前記実施例＜２−１−３＞に記載した方法によってコショウノキのブタノール分画物を製造して、コショウノキの葉、幹、花及び根のブタノール分画物をそれぞれ２０ｇ、２４ｇ、１４ｇ及び１８ｇ得た。
【００９５】
＜実施例３＞シナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物のインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）分泌誘導活性確認
＜３−１＞ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の培養
インターロイキン−２（ＩＬ−２）依存性ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞株ＮＫ９２（ｈｕｍａｎ ＮＫ ｌｙｍｐｈｏｍａ）は、米国微生物保存センター（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＡＴＣＣ）から購入した。ＮＫ９２細胞は、２０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（ＨｙＣｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）、２ｍＭ Ｌ−グルタメート、１００μｇ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含み、１００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２（Ｃｈｉｒｏｎ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）が添加されたα−ＭＥＭ（α−ｍｉｎｉｍａｌ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，ドイツ）培地で３７°Ｃ、５％ＣＯ２条件下で培養した。
【００９６】
＜３−２＞酵素結合免疫吸収分析（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ，ＥＬＩＳＡ）を通じたシナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物のインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）分泌誘導性確認
前記実施例＜３−１＞によって培養したＮＫ９２細胞の細胞培養液に２μｇ／ｍｌのシナアブラギリの葉、幹または葉の抽出物、またはそれらの分画物（ｎ−ヘキサン、エチルアセテート、ブタノールまたは水分画物）、またはコショウノキの葉、幹、花または根の抽出物、またはそれらの分画物をそれぞれ処理して３７°Ｃで１８時間培養した後、細胞を除去して上澄み液を得た。それぞれのＮＫ９２細胞の細胞培養液に存在するヒトＩＦＮ−γの定量は、商業的に購入可能なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）（Ｅｎｄｏｇｅｎ）を用いて製造者が指示したプロトコールによって酵素結合免疫吸収分析（ＥＬＩＳＡ）を遂行した。ここで、フジモドキの抽出物及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）をそれぞれ陽性（ＰＣ）及び陰性（ＮＣ）対照群として用いた。ＩＦＮ−γの定量値は、３回分析した値の平均±標準偏差として表示した。
【００９７】
その結果、シナアブラギリの抽出物またはその分画物の場合、表１及び図１に示したように、シナアブラギリの葉、幹及び実のメタノール抽出物を処理したそれぞれのＮＫ９２細胞では、約１．７〜２．０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ−γを分泌した。シナアブラギリの葉、幹または実の抽出物の分画物である、水層を除いた有機溶媒分画物（ｎ−ヘキサン、エチルアセテートまたはブタノール）を処理した場合には、ｎ−ヘキサン分画物は約１．７〜２．１ｎｇ／ｍｌ、エチルアセテート分画物は約１．５〜２．０ｎｇ／ｍｌ、ブタノール分画物は約１．２〜１．７ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ−γを分泌した。シナアブラギリの水分画物は約０．３〜０．４ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ−γを分泌して、シナアブラギリの抽出物または有機溶媒分画物に比べて顕著に低い分泌量を示し、ＩＦＮ−γ分泌誘導性がほとんどないことが示された。シナアブラギリの抽出物またはその分画物を処理した細胞は、すべて陰性対照群（０．３ｎｇ／ｍｌ）に比べて顕著に高いＩＦＮ−γ分泌量を示した（表１及図１）。また、図２に示したように、シナアブラギリの葉、幹または実の抽出物の分画物のＩＦＮ−γ分泌効果を確認した（図２）。このことから、シナアブラギリの葉、幹または実の抽出物、またはその分画物は、ＮＫ細胞でＩＦＮ−γの分泌誘導活性を有することを確認した。
【００９８】
一方、コショウノキの抽出物またはその分画物の場合、下記の表２及び図３に示したように、コショウノキのメタノール抽出物（葉、幹、花または根）で処理したそれぞれのＮＫ９２細胞では約２．４〜２．６ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ−γが分泌した。コショウノキの葉、幹、花及び根の抽出物の分画物である、水層を除いたそれぞれの有機溶媒分画物（ｎ−ヘキサン、エチルアセテートまたはブタノール）を処理した場合には、ｎ−ヘキサン分画物が約１．７〜１．８ｎｇ／ｍｌ、エチルアセテート分画物が約１．４〜１．８ｎｇ／ｍｌ、ブタノール分画物が１．６〜１．９ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ−γ分泌効果が示された。水分画物の場合には、約０．２〜０．４ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ−γを分泌して、ＩＦＮ−γ分泌誘導性がほとんどないことが示された。コショウノキの抽出物または分画物を処理した細胞は、すべて陰性対照群（０．３ｎｇ／ｍｌ）に比べて顕著に高いＩＦＮ−γ分泌量を示した（表２及び図３）。また、図４に示したように、コショウノキの葉、幹、花または根の抽出物の分画物のＩＦＮ−γ分泌効果を確認した（図４）。このことから、コショウノキの葉、幹、花または根の抽出物、またはその分画物は、ＮＫ細胞でＩＦＮ−γの分泌を促進することを確認した。
【００９９】
【表１】
【０１００】
【表２】
【０１０１】
＜３−３＞ＥＬＩＳＡ分析を通じたシナアブラギリまたはコショウノキの抽出物の濃度によるインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）分泌誘導活性確認
シナアブラギリの葉、幹及び実のメタノール抽出物、コショウノキのメタノール抽出物それぞれの濃度によるＩＮＦ−γ分泌量を前記実施例＜３−２＞の方法によって遂行した。ここで、メタノール抽出物はそれぞれ０．０１、０．１、１または、１０μｇ／ｍｌの濃度で添加した。
【０１０２】
その結果、図５に示したように、シナアブラギリの葉のメタノール抽出物は、１μｇ／ｍｌ以上の濃度でＩＮＦ−γの分泌量が顕著に増加し、シナアブラギリの幹または実のメタノール抽出物では、１０μｇ／ｍｌの濃度でＩＮＦ−γ分泌が急激な増加を示した（図５）。また、図６に示したように、コショウノキのメタノール抽出物は、１μｇ／ｍｌ以上の濃度でＩＮＦ−γの分泌量が顕著に増加した（図６）。このことから、シナアブラギリまたはコショウノキのメタノール抽出物の濃度に依存的にＩＮＦ−γ分泌が増加することを確認した。
【０１０３】
＜３−４＞インターフェロン−ガンマ分泌誘導に関連する遺伝子発現に対するシナアブラギリまたはコショウノキの抽出物またはその分画物の効果
ＮＫ９２細胞でＩＦＮ−α及びγ誘導に関連するｍＲＮＡ発現の変化を調べるために、ＲＴ−ＰＣＲを遂行した。ＮＫ９２細胞または肺上皮細胞株であるＡ５４９を２ｎｇのシナアブラギリまたはコショウノキの抽出物で１２時間培養した。培養後、１５分、３０分、４５分、１時間、４時間、及び１２時間後に細胞を溶解させた後に公知されたプロトコールにしたがってＲＮＡを分離して、ＲＴ−ＰＣＲを通じてＩＦＮ−γｍＲＮＡ発現を分析した。ここで、用いたＩＦＮ−γのプライマーは、正方向プライマーが５’−ＴＣＣＣＡＴＧＧＧＴＴＧＴＧＴＧＴＴＴＡ−３’で、逆方向プライマーは、５’−ＧＴＣＡＧＧＧＴＧＣＡＧＣＣＧＧ−３’であり、ＧＡＰＤＨを内部標準として用いたが、ここで用いたＧＡＰＤＨ正方向プライマーは、５’−ＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＴＴＣＣＡＧＧＡＧ−３’で、逆方向プライマーは、５’−ＡＣＡＧＴＣＴＴＣＴＧＧＧＴＧＧＣＡＧＴ−３’を用いた。
【０１０４】
前記ＲＴ−ＰＣＲ反応は、前記プライマー対とＴａｑポリマラーゼ（Ｔａｋａｒａ，Ｓｈｉｇａ，日本）を用いて遂行した。総ＲＮＡは、標準プロトコールによって分離し、ｃＤＮＡは製造者の指示にしたがってＡｃｃｕＳｃｒｉｐｔ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ １ｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて合成した。合成した１μｌのｃＤＮＡを０．５Ｕ ＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、１×ｂｕｆｆｅｒ及び１ｍＭ ｄＮＴＰ ｍｉｘ（Ｔａｋａｒａ）と前記プライマー対からなる２０μｌのＰＣＲ反応に用いた。ＰＣＲ反応による増幅は、次のような条件でＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲシステム２７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ ｃｉｔｙ，ＣＡ，米国）を用いて遂行した；９４°Ｃで５分、続いて９４°Ｃで４５秒、５６°Ｃで４５秒及び７２°Ｃで１分を２５〜４０サイクル行った後、最終延長反応は、７２°Ｃで７分間遂行した。ＰＣＲプライマーは、Ｂｉｏｎｅｅｒ社（韓国、大田）から購入し、Ｐｒｉｍｅｒ３プログラムを用いてデザインした。ＰＣＲ生成物は、１．５％アガロースゲル上で分離して臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）で染色してＧｅｌ Ｄｏｃ ２０００ＵＶ ｔｒａｎｓ−ｉｌｌｕｍｉｎａｔｏｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，米国）で視覚化した後、Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて分析した。各サンプルは、３回以上テストして代表データを提示した。
【０１０５】
その結果、図７に示したように、ＩＦＮ−γの転写体は、シナアブラギリの抽出物が処理されたＮＫ９２細胞で２時間後に著しく増加した。これは、ＩＦＮ−γ誘導のためのシナアブラギリの抽出物に対する反応は、転写水準で１〜２時間以内に誘導されたことが分かった（図７）。一方、図８に示したように、コショウノキが処理されたＮＫ９２細胞及び肺上皮細胞株であるＡ５４９細胞でＩＦＮ−γ及びＩＦＮ−α ｍＲＮＡの発現様相を時間帯別に確認した結果、ＩＦＮ−γの転写体はコショウノキの抽出物が処理されたＮＫ９２細胞で３時間後から著しく増加した。これは、ＩＦＮ−γ誘導のためのコショウノキの抽出物に対する反応は、転写水準で３時間以内に誘導されたことが分かった。Ａ５４９細胞においては、コショウノキの抽出物がＩＦＮ−α ｍＲＮＡの発現水準を増加させることが示された（図８）。
【０１０６】
＜実施例４＞シナアブラギリの抽出物のＩＦＮ−γ生成誘導効果に対するＮＦ−κＢ信号伝達経路依存性確認
シナアブラギリの抽出物のＩＦＮ−γ生成誘導効果が、ＮＦ−κＢ信号伝達経路に依存的であるということを立証するために、ＮＦ−κＢ抑制因子であるＢａｙＩＩ、または、ＰＫＣ信号伝達抑制因子であるロッテリン（Ｒｏｔｔｅｒｉｎ）をシナアブラギリの抽出物とともにＮＫ９２細胞に処理した。
【０１０７】
その結果、図９に示したように、シナアブラギリの抽出物によるＩＦＮ−γ生成の誘導は、ＢａｙII処理によってＮＫ９２細胞内で減少した。これは、ＢａｙII濃度に依存的だった。このことから、シナアブラギリの抽出物によるＩＦＮ−γ生成の誘導が、ＮＦ−κＢ信号伝達によって媒介されるということが分かった。また、ＰＫＣ信号伝達抑制因子であるロッテリンの処理によってＩＦＮ−γ生成が減少されることで、ＮＦ−κＢ信号伝達の上位信号伝達因子は、ＰＫＣの活性によるものであることが分かった（図９）。
【０１０８】
＜実施例５＞シナアブラギリまたはコショウノキの抽出物の細胞表面物質に対する影響確認
シナアブラギリまたはコショウノキの抽出物が処理されたＮＫ９２細胞の活性に関与する細胞表面物質の変化を確認するために、蛍光活性化細胞選別機（ＦＡＣＳ）で分析した。ここで、ＮＫ細胞の活性リガンド（ｌｉｇａｎｄ）として作用する ＮＫＧ２Ａ、Ｃ、及びＤ、自然殺害活性と関連するＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４及びＮｋｐ４６細胞表面物質の発現を分析した。
【０１０９】
その結果、図１０に示したように、シナアブラギリまたはコショウノキの抽出物は類似のＮＫ９２細胞の表面物質発現様相を示し、ＮＫ細胞の活性に関与するＮＫＧ２Ｃ及びＤの発現が著しく増加し、ＮＫ細胞のナチュラルキラー活性と関連したＮＫｐ４４の発現も顕著に増加したことが確認された（図１０）。
【０１１０】
＜実施例６＞ウイルスが感染された肺上皮細胞株に対するシナアブラギリの抽出物の影響確認
インフルエンザウイルスに感染した細胞に対するシナアブラギリの抽出物の効果を確認するために、インフルエンザウイルスが浸透した肺上皮細胞株であるＡ５４９細胞にシナアブラギリの抽出物を処理した後、前記実施例＜３−４＞の方法によってＲＴ−ＰＣＲを実施してＩＦＮ−α及びβ転写活性度を確認した。
【０１１１】
その結果、図１１に示したように、インフルエンザウイルスが処理されたＡ５４９細胞で２４時間後にＩＦＮ−α及びβの発現が示され、シナアブラギリの抽出物を前記ウイルスが処理されたＡ５２９細胞に処理することでＩＦＮ−αの発現量は減少し、ＩＦＮ−α発現の増加がさらに早くなる現象を示した（図１１）。
【産業上の利用可能性】
【０１１２】
前記のように、本発明のシナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物は、抗ウイルスに卓越した効果があるのでウイルス性疾患の予防及び治療用薬剤、またはウイルス性疾患の予防及び改善用健康食品及び飼料添加剤の開発と、これらを用いた予防または治療方法の研究に有用に用いることができる。
【配列表フリーテキスト】
【０１１３】
配列番号１：インターフェロン−ガンマ正方向プライマー
配列番号２：インターフェロン−ガンマ逆方向プライマー
配列番号３：ＧＡＰＤＨ正方向プライマー
配列番号４：ＧＡＰＤＨ逆方向プライマー
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）またはコショウノキ（Ｄａｐｈｎｅ ｋｉｕｓｉａｎａ）の抽出物を有効成分として含むウイルス性疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項２】
前記シナアブラギリまたはコショウノキの抽出物が、シナアブラギリまたはコショウノキの乾燥物を水、Ｃ１〜Ｃ２の低級アルコールまたはそれらの混合溶媒で抽出したことを特徴とする、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３】
前記シナアブラギリ乾燥物が、シナアブラギリの葉、幹または実であることを特徴とする、請求項２に記載の薬学的組成物。
【請求項４】
前記コショウノキ乾燥物が、コショウノキの葉、幹、花または根であることを特徴とする、請求項２に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
前記低級アルコールが、エタノールまたはメタノールであることを特徴とする、請求項２に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
請求項１に記載のシナアブラギリまたはコショウノキの抽出物を追加的に有機溶媒で抽出して製造された有機溶媒分画物を有効成分として含む、ウイルス性疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項７】
前記有機溶媒が、ヘキサン、エチルアセテートまたはブタノールであることを特徴とする、請求項６に記載の薬学的組成物。
【請求項８】
前記ウイルス性疾患が、豚インフルエンザウイルス（Ｓｗｉｎｅ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ、ＳＩＶ）、インフルエンザウイルス（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ）、新型インフルエンザＡウイルス（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ ｓｕｂｔｙｐｅ Ｈ１Ｎ１）、鳥インフルエンザウイルス（ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ）、ライノウイルス（ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ）、アデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、コロナウイルス（ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）、パラインフルエンザウイルス（ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ）、呼吸器合抱体ウイルス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）、疱疹ウイルス（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ，ＨＳＶ）、後天性免疫欠乏症侯群ウイルス（ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ，ＨＩＶ）及び肝炎ウイルスからなる群から選択されるいずれか一つ以上のウイルスによって感染する疾患であることを特徴とする、請求項１または請求項６のいずれかに記載の薬学的組成物。
【請求項９】
シナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物を有効成分として含む、ウイルス性疾患の予防または改善用健康食品。
【請求項１０】
前記ウイルス性疾患が、豚インフルエンザウイルス（ＳＩＶ）、インフルエンザウイルス、新型インフルエンザＡウイルス（ｓｕｂｔｙｐｅ Ｈ１Ｎ１）、鳥インフルエンザウイルス、ライノウイルス、アデノウイルス、コロナウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合抱体ウイルス、疱疹ウイルス（ＨＳＶ）、後天性免疫欠乏症侯群ウイルス（ＨＩＶ）及び肝炎ウイルスからなる群から選択されるいずれか一つ以上のウイルスによって感染する疾患であることを特徴とする、請求項９に記載の健康食品。
【請求項１１】
シナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物を有効成分として含む、ウイルス性疾患の予防または改善用飼料添加剤。
【請求項１２】
前記ウイルス性疾患が、豚インフルエンザウイルス（ＳＩＶ）、インフルエンザウイルス、新型インフルエンザＡウイルス（ｓｕｂｔｙｐｅ Ｈ１Ｎ１）、鳥インフルエンザウイルス、ライノウイルス、アデノウイルス、コロナウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合抱体ウイルス、疱疹ウイルス（ＨＳＶ）、後天性免疫欠乏症侯群ウイルス（ＨＩＶ）及び肝炎ウイルスからなる群から選択されるいずれか一つ以上のウイルスによって感染する疾患であることを特徴とする、請求項１１に記載の飼料添加剤。
【請求項１３】
薬学的に有効な量のシナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物を有効成分として含む、薬学的組成物をウイルス性疾患にかかった個体に投与する工程を含む、ウイルス性疾患の改善または治療方法。
【請求項１４】
薬学的に有効な量のシナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物を有効成分として含む、薬学的組成物を個体に投与する工程を含むウイルス性疾患の予防方法。
【請求項１５】
シナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物をウイルス性疾患予防または治療用薬学的組成物の製造に対する使用。
【請求項１６】
シナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物をウイルス性疾患予防または改善用健康食品の製造に対する使用。
【請求項１７】
シナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物をウイルス性疾患予防または改善用飼料添加剤の製造に対する使用。
【請求項１】
シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）またはコショウノキ（Ｄａｐｈｎｅ ｋｉｕｓｉａｎａ）の抽出物を有効成分として含むウイルス性疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項２】
前記シナアブラギリまたはコショウノキの抽出物が、シナアブラギリまたはコショウノキの乾燥物を水、Ｃ１〜Ｃ２の低級アルコールまたはそれらの混合溶媒で抽出したことを特徴とする、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３】
前記シナアブラギリ乾燥物が、シナアブラギリの葉、幹または実であることを特徴とする、請求項２に記載の薬学的組成物。
【請求項４】
前記コショウノキ乾燥物が、コショウノキの葉、幹、花または根であることを特徴とする、請求項２に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
前記低級アルコールが、エタノールまたはメタノールであることを特徴とする、請求項２に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
請求項１に記載のシナアブラギリまたはコショウノキの抽出物を追加的に有機溶媒で抽出して製造された有機溶媒分画物を有効成分として含む、ウイルス性疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項７】
前記有機溶媒が、ヘキサン、エチルアセテートまたはブタノールであることを特徴とする、請求項６に記載の薬学的組成物。
【請求項８】
前記ウイルス性疾患が、豚インフルエンザウイルス（Ｓｗｉｎｅ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ、ＳＩＶ）、インフルエンザウイルス（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ）、新型インフルエンザＡウイルス（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ ｓｕｂｔｙｐｅ Ｈ１Ｎ１）、鳥インフルエンザウイルス（ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ）、ライノウイルス（ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ）、アデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、コロナウイルス（ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）、パラインフルエンザウイルス（ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ）、呼吸器合抱体ウイルス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）、疱疹ウイルス（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ，ＨＳＶ）、後天性免疫欠乏症侯群ウイルス（ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ，ＨＩＶ）及び肝炎ウイルスからなる群から選択されるいずれか一つ以上のウイルスによって感染する疾患であることを特徴とする、請求項１または請求項６のいずれかに記載の薬学的組成物。
【請求項９】
シナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物を有効成分として含む、ウイルス性疾患の予防または改善用健康食品。
【請求項１０】
前記ウイルス性疾患が、豚インフルエンザウイルス（ＳＩＶ）、インフルエンザウイルス、新型インフルエンザＡウイルス（ｓｕｂｔｙｐｅ Ｈ１Ｎ１）、鳥インフルエンザウイルス、ライノウイルス、アデノウイルス、コロナウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合抱体ウイルス、疱疹ウイルス（ＨＳＶ）、後天性免疫欠乏症侯群ウイルス（ＨＩＶ）及び肝炎ウイルスからなる群から選択されるいずれか一つ以上のウイルスによって感染する疾患であることを特徴とする、請求項９に記載の健康食品。
【請求項１１】
シナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物を有効成分として含む、ウイルス性疾患の予防または改善用飼料添加剤。
【請求項１２】
前記ウイルス性疾患が、豚インフルエンザウイルス（ＳＩＶ）、インフルエンザウイルス、新型インフルエンザＡウイルス（ｓｕｂｔｙｐｅ Ｈ１Ｎ１）、鳥インフルエンザウイルス、ライノウイルス、アデノウイルス、コロナウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合抱体ウイルス、疱疹ウイルス（ＨＳＶ）、後天性免疫欠乏症侯群ウイルス（ＨＩＶ）及び肝炎ウイルスからなる群から選択されるいずれか一つ以上のウイルスによって感染する疾患であることを特徴とする、請求項１１に記載の飼料添加剤。
【請求項１３】
薬学的に有効な量のシナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物を有効成分として含む、薬学的組成物をウイルス性疾患にかかった個体に投与する工程を含む、ウイルス性疾患の改善または治療方法。
【請求項１４】
薬学的に有効な量のシナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物を有効成分として含む、薬学的組成物を個体に投与する工程を含むウイルス性疾患の予防方法。
【請求項１５】
シナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物をウイルス性疾患予防または治療用薬学的組成物の製造に対する使用。
【請求項１６】
シナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物をウイルス性疾患予防または改善用健康食品の製造に対する使用。
【請求項１７】
シナアブラギリまたはコショウノキの抽出物、またはその分画物をウイルス性疾患予防または改善用飼料添加剤の製造に対する使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公表番号】特表２０１３−５１００８３（Ｐ２０１３−５１００８３Ａ）
【公表日】平成２５年３月２１日（２０１３．３．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５３６７１０（Ｐ２０１２−５３６７１０）
【出願日】平成２２年１１月３日（２０１０．１１．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２０１０／００７７２４
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０５５９７９
【国際公開日】平成２３年５月１２日（２０１１．５．１２）
【出願人】（５０８１３９４５７）コリア リサーチ インスティテュート オブ バイオサイエンス アンド バイオテクノロジー (19)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年３月２１日（２０１３．３．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１１月３日（２０１０．１１．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２０１０／００７７２４
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０５５９７９
【国際公開日】平成２３年５月１２日（２０１１．５．１２）
【出願人】（５０８１３９４５７）コリア リサーチ インスティテュート オブ バイオサイエンス アンド バイオテクノロジー (19)
【Ｆターム（参考）】
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