シモン芋エキスとシモン芋由来のスフィンゴ糖脂質、及びその製造方法
【課題】ＢＳＥ等の危険性が無く、人体に安全で日々の摂取が可能な家畜の脳ガングリオシド代替を得るために、シモン芋より糖脂質を含有するシモン芋エキス、又はスフィンゴ糖脂質を製造する方法を提供する。またシモン芋由来の糖脂質、又はスフィンゴ糖脂質を含む神経細胞活性化剤、及びそれらを用いた健康食品を提供する。
【解決手段】
シモン芋を極性溶媒に浸たすことで糖脂質、若しくはスフィンゴ糖脂質を極性溶媒中に抽出し、得られる浸漬液を濃縮することによってシモン芋エキスを得る。また神経細胞の活性化作用は株化された神経芽細胞を用いてその効果を確認する。
【解決手段】
シモン芋を極性溶媒に浸たすことで糖脂質、若しくはスフィンゴ糖脂質を極性溶媒中に抽出し、得られる浸漬液を濃縮することによってシモン芋エキスを得る。また神経細胞の活性化作用は株化された神経芽細胞を用いてその効果を確認する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シモン芋由来の糖脂質を含有するシモン芋エキス、ならびにシモン芋由来のスフィンゴ糖脂質の製造方法と、それらを含む神経活性化剤等並びに健康食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、日本は本格的な高齢化時代に突入しようとしている。老化は人体に様々な影響を与えるが、中でも老人性痴呆や脳血管障害、神経障害等の老化に伴う脳や神経機能の低下や疾患は、今後の大きな問題となることが予想される。このような問題の対策としては、一つに老化に伴う脳や神経機能の低下の予防がある。予防には日々の適度な運動や読書等による脳への刺激のような生活習慣的な予防方法の他に、神経の機能改善や機能低下防止等の作用を有する医薬品の服用のような医学的な予防方法がある。また、医薬品と類似の作用が期待でき、かつ日々の摂取が可能な飲食品の摂取も挙げられる。この神経機能や学習行動を改善する医薬品や飲食品の有効成分として、近年ガングリオシドが注目されている。
【０００３】
ガングリオシドは、シアル酸を有するスフィンゴ糖脂質の総称である。その構造はスフィンゴシンと脂肪酸がアミド結合したセラミドと呼ばれる脂質にグルコース、ガラクトース、シアル酸等の糖鎖が結合したものであり、この糖鎖の種類によって多数の分子種が存在する。ガングリオシドは種々の細胞膜上に存在し、細胞分化や増殖、情報伝達、神経機能等において様々な生理機能を果たすことが明らかになっている。
【０００４】
ガングリオシドは動物の脳や神経組織に比較的多量に含まれている。したがって、従来のガングリオシドを得る方法は、特許文献４のように牛、豚、羊等の家畜の脳をはじめとする動物組織からエタノール等を用いて抽出する方法が一般的であった。ところが、近年、ＢＳＥ（牛海綿状脳症）が国際問題化したことによって家畜の脳からのガングリオシドの抽出は、ＢＳＥの原因である異常型プリオンタンパク質の混入する危険性が生じてきた。そこで、家畜の脳に代わる人体に安全なガングリオシドの原料が求められていた。
【特許文献１】特開平９−３０１８７４
【特許文献２】特開平１０−１０１５６８
【特許文献３】特開平１１−２４６４１８
【特許文献４】特開平１０−２１８８９２
【特許文献５】特開２００３−６１６１６
【特許文献６】特開２００５−２７５３４
【非特許文献１】Ｈａｄｊｉｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｏｕ Ｍ & Ｎｅｆｆ Ｎ．Ｈ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，（１９８８）５１（４），１１９０−６．
【非特許文献２】Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ Ｊ．Ｓ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．，（１９９２） ３１（１），１１２−９．
【非特許文献３】Ｓｈｉｂａｈａｒａ Ｓ．，ｅｔ ａｌ．， Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（２０００） ３３， ２４７−５１．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、家畜の脳に代わる人体に安全なガングリオシドの代替原料を提供することである。本発明の更なる課題は、前記ガングリオシドの代替原料を提供するために、その製造方法を提供することである。本発明の他の課題は、前記ガングリオシドの代替原料から製造されたガングリオシド代替物を含有する製品を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記課題を解決するためにガングリオシドの代替原料を人体に安全であり、また入手が比較的容易な植物に求めた。植物組織は通常糖脂質としてグリセロ糖脂質を多量に含有しており、スフィンゴ糖脂質は微量にしか存在しない。また、植物性スフィンゴ糖脂質のほとんどは、前記ガングリオシドからシアル酸残基が欠如した構造をもつアシアロガングリオシドとして存在している。このアシアロガングリオシドが動物細胞に対してガングリオシドと同様の作用を有するという報告はない。そのため、これまで植物組織が、動物性ガングリオシドの代替原料として注目されることはなかった。
【０００７】
しかし、本発明者らが鋭意探索した結果、シモン芋が他の植物と比較して多量のスフィンゴ糖脂質を含有することを見出した。シモン芋（Ｉｐｏｍｏｅａ ｂａｔａｔａｓ sp.）は、サツマ芋に近似するブラジル原産のヒルガオ科の植物で、白甘藷、白サツマ芋、又はカイアポ芋とも呼ばれている。従来からシモン芋の葉や茎にはカリウムやカルシウム等のミネラルの他、各種ビタミンが豊富に含まれていることが知られており、特許文献５又は６のように、シモン芋の葉や茎の乾燥粉末、乾燥物、搾汁液が健康食品として使用されている。ただし、これまでシモン芋の利用法としては、葉や茎を凍結乾燥した後、粉末化したものを単にカプセルに充填する等して利用する方法、搾汁液をそのまま飲用する方法、あるいは茶のように乾燥物を温水に浸漬した後にその抽出液を利用する方法がほとんどであり、特定の成分を抽出する方法は知られていなかった。
【０００８】
本発明者らは、さらに鋭意努力した結果、シモン芋由来の糖脂質、及びスフィンゴ糖脂質が動物請ガングリオシドのように動物の神経芽細胞等の神経突起を伸長促進する神経細胞の活性化作用を有することを見出した。前述のように植物性のスフィンゴ糖脂質が神経細胞の活性化する作用を有することはこれまでに報告はない。
【０００９】
本発明は、係る事実に基づいて完成された家畜の脳に代わる人体に安全なガングリオシドの代替原料としてのシモン芋由来の糖脂質、及びスフィンゴ糖脂質の提供と、それらをシモン芋から製造する方法等に関する。また、当該糖脂質やスフィンゴ糖脂質を含む健康食品、及び神経細胞活性化剤等に関する。すなわち、以下の発明を提供する。
【００１０】
（１）本発明は、シモン芋を極性溶媒中に浸たす浸漬工程と、前記浸漬工程で得られる浸漬液を濃縮する濃縮工程と、からなるシモン芋由来の糖脂質を含有するシモン芋エキスを製造するシモン芋エキス製造方法を提供する。
【００１１】
（２）本発明は、前記浸漬工程にて浸漬する前に、シモン芋を乾燥させる乾燥工程をさらに有するシモン芋エキス製造方法を提供する。
【００１２】
（３）本発明は、（１）、又は（２）の最初の工程でシモン芋の塊根を断片化する断片化工程をさらに有するシモン芋エキス製造方法を提供する。
【００１３】
（４）本発明は、前記濃縮工程が濃縮することにより得られる液状シモン芋エキスを乾燥させて固体状シモン芋エキスを得る工程であるシモン芋エキス製造方法を提供する。
【００１４】
（５）本発明は、前記（１）から（４）のいずれか一に記載のシモン芋エキス製造方法により得られるシモン芋エキスにアルカリ溶液を加えてグリセロ糖脂質を加水分解する加水分解工程と、前記加水分解工程で得られた加水分解溶液にクロロホルムと水を加えて混合した後、クロロホルム溶液を取得するクロロホルム溶液取得工程と、前記クロロホルム溶液取得工程で取得されたクロロホルム溶液からクロロホルムを除去してシモン芋由来のスフィンゴ糖脂質を取得するスフィンゴ糖脂質取得工程とからなるシモン芋由来のスフィンゴ糖脂質製造方法を提供する。
【００１５】
（６）本発明は、シモン由来の糖脂質を動物に投与して、神経細胞を活性化させる神経細胞活性化方法を提供する。
【００１６】
（７）本発明は、前記（１）から（４）のいずれか一に記載の方法で得られるシモン芋エキスに含まれる糖脂質を動物に投与して神経細胞を活性化させる神経細胞活性化方法を提供する。
【００１７】
（８）本発明は、シモン芋由来のスフィンゴ糖脂質を動物に投与して神経細胞を活性化させる神経細胞活性化方法を提供する。
【００１８】
（９）本発明は、前記（５）に記載の方法で得られるシモン芋由来のスフィンゴ糖脂質を動物に投与して神経細胞を活性化させる神経細胞活性化方法を提供する。
【００１９】
（１０）本発明は、シモン芋由来の糖脂質を有効成分として含む神経細胞を活性化する神経細胞活性化剤を提供する。
【００２０】
（１１）本発明は、前記シモン芋由来の糖脂質は前記（１）から（４）のいずれか一に記載の方法で得られるシモン芋エキスに含まれる糖脂質を有効成分として含む神経細胞を活性化する神経細胞活性化剤を提供する。
【００２１】
（１２）本発明は、シモン芋由来のスフィンゴ糖脂質を有効成分として含む神経細胞を活性化する神経細胞活性化剤を提供する。
【００２２】
（１３）本発明は、前記シモン芋由来のスフィンゴ糖脂質が前記（５）に記載の方法で得られるスフィンゴ糖脂質を有効成分として含む神経細胞を活性化する神経細胞活性化剤を提供する。
【００２３】
（１４）本発明は、前記（１）から（４）のいずれか一に記載の方法で得られるシモン芋エキスを含む健康食品を提供する。
【発明の効果】
【００２４】
本発明のシモン芋エキス製造方法によれば、シモン芋由来の糖脂質を含有するシモン芋エキスをシモン芋から大量に効率よく製造することができる。
【００２５】
本発明のシモン芋由来のスフィンゴ糖脂質製造方法によれば、シモン芋エキスからシモン芋由来のスフィンゴ糖脂質を効率よく製造することができる。
【００２６】
本発明のシモン芋由来の糖脂質又はスフィンゴ糖脂質は、神経細胞活性化作用を有することから、当該糖脂質又はスフィンゴ糖脂質を動物に投与することで、脳、及び神経の機能増進や機能改善ができる。
【００２７】
本発明によれば、シモン芋由来の糖脂質又はスフィンゴ糖脂質を有効成分とする神経細胞活性化作用剤を提供できる。特に本発明のスフィンゴ糖脂質は、神経細胞活性化作用を効能とする医薬として利用可能にすることができる。これは、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、脳卒中後遺症等の脳疾患、又は神経疾患を有する患者達に対して安全性の高い医薬品となり得る。
【００２８】
本発明のシモン芋由来の糖脂質を利用すれば、ＢＳＥの危険性が無く、日々摂取可能な安全性の高い飲食品を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
以下に、各発明を実施するための最良の形態を説明する。なお、本発明はこれらの実施の形態に何ら限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において、種々なる様態で実施しうる。
【００３０】
実施形態１は、請求項１等について説明する。実施形態２は、請求項２等について説明する。実施形態３は、請求項３等について説明する。実施形態４は、請求項４等について説明する。実施形態５は、請求項５等について説明する。実施形態６は、主に請求項６から１３について説明する。実施形態７は、主に請求項１４ついて説明する。
【００３１】
<<実施形態１>>
【００３２】
<実施形態１：概要> 実施形態１について説明する。本実施形態は、シモン芋由来の糖脂質を含有するシモン芋エキス製造方法を提供する。本実施形態はシモン芋から糖脂質を溶出させるために極性溶媒中に浸たし、それによって得られる浸漬液を濃縮することで当該糖脂質を含有するシモン芋エキスを得ることを特徴とする。
【００３３】
<実施形態１：構成> 以下、本実施形態の各工程の構成について説明する。
【００３４】
「浸漬工程」（Ｓ０１０１）は、シモン芋を極性溶媒中に浸たして、シモン芋中に含まれる糖脂質を当該溶媒中に抽出する工程である。
【００３５】
「極性溶媒」とは、電荷の偏りを持つ極性分子からなる溶媒である。例えば、アルコール、ベンゼン、若しくはトルエン等の極性有機溶媒、水、又はそれらの組み合わせによる混合液が該当する。当該浸漬工程に使用する極性溶媒の種類や組み合わせは問わない。ただし、抽出に使用した極性溶媒が最終産物のシモン芋エキス中に残存する場合であって、かつ人体に対して使用する場合には人体に対して毒性が非常に低いエタノールか、エタノール濃度が６０％以上の水との混合液を使用することが好ましい。糖脂質をより効率よく抽出するためには、１００%エタノール（通常は水が僅かに混在し、９９．５％となっている。）を使用することがより好ましい。
【００３６】
本発明で「糖脂質」とは、特に断りのない限り植物細胞内で生合成された植物性糖脂質を意味する。
【００３７】
シモン芋は、極性溶媒中に浸たす前に水等で洗浄し、表面に付着した土やゴミ等を十分に除去しておくことが望ましい。また、本実施形態に用いるシモン芋は塊根に限らない。例えば葉であってもよいし、茎であってもよいし、塊根状でない根であってもよい。
【００３８】
極性溶媒の分量は、使用するシモン芋の重量に対する当該極性溶媒の容量（容量／重量：Ｖ／Ｗ）が２倍から１０倍の範囲になるようにことが好ましい。例えば、極性溶媒がエタノールであって、Ｖ／Ｗが３倍の場合には、１５０ｍｌのエタノールに対してシモン芋５０ｇを用いることになる。ただし、この範囲に限定はされない。
【００３９】
シモン芋中に含まれる糖脂質を極性溶媒中に短時間でより効率よく抽出するために、当該極性溶媒を加熱してもよい。このとき当該極性溶媒の温度は、糖脂質が加熱で変性しない範囲、かつ使用する極性溶媒の取扱い上で安全性に問題のない範囲であれば特に問わない。当該糖脂質を抽出する上で効率のよい温度は極性溶媒の種類によって異なるが、例えば、エタノールを極性溶媒とする場合は５５℃から６５℃の範囲が好ましい。
【００４０】
極性溶媒を加熱する方法は、極性溶媒の温度を指定する温度付近まで加熱できる方法であれば特に問わない。例えば、温度調節装置が設置された恒温槽内でヒーター等の熱源によって加熱してもよいし、容器に入れて直火、若しくは湯煎によって火力を調節しながら加熱してもよい。また、シモン芋の浸漬と極性溶媒の加熱の順序は問わない。例えば、指定する温度まで極性溶媒を加熱した後にシモン芋を浸漬してもよいし、室温状態の極性溶媒にシモン芋を浸漬して指定する温度まで加熱してもよい。
【００４１】
当該極性溶媒全体の温度、及び濃度を均一化するために、加熱と共に当該極性溶媒の撹拌を行ってもよい。撹拌方法は、例えば、撹拌棒で撹拌してもよいし、撹拌装置を用いて撹拌してもよい。
【００４２】
シモン芋由来の糖脂質を十分に抽出するための浸漬の時間は、抽出するシモン芋の状態、極性溶媒の種類、極性溶媒の温度に依存する。例えば、常温のエタノールに生のシモン芋塊根を浸漬する場合は１０ヶ月以上を要するが、６０℃に加熱したエタノールに乾燥したシモン芋塊根の小片を浸漬する場合には約３時間でよい。また、乾燥したシモン芋の葉であれば６０℃のエタノールに約３0分浸漬すればよい。
【００４３】
「濃縮工程」（Ｓ０１０２）は、前記浸漬工程で得られる浸漬液から浸漬に用いた極性溶媒を減じ、浸漬液中に含まれるシモン芋由来の糖脂質の濃度を高める工程である。当該工程によってシモン芋由来の糖脂質を含有するシモン芋エキスを得る。
【００４４】
「浸漬液」は、前記浸漬工程後に糖脂質や、シモン芋から抽出される糖脂質をはじめとした各種成分を含有する極性溶媒より、シモン芋塊根の小片等の固形物を取り除いて得られる液体である。主だった固形物を取り除いた後に固形物の微小な粒子が当該浸漬液中に残存していても構わない。浸漬液を取り出す方法は、固形物を除去できる方法であれば特に問わない。例えば、前記浸漬工程後に得られるシモン芋と極性溶媒との混合物を濾過して固形物を除去してもよいし、当該混合物を遠心分離して、若しくは静置して固形物を沈殿させた後にその上清を取り出してもよいし、又はそれらの組み合わせであってもよい。
【００４５】
「シモン芋エキス」は、前記浸漬液から浸漬に用いた極性溶媒の大部分を除去して浸漬液中に存在するシモン芋由来の糖脂質の濃度を高めた液体である。糖脂質の濃度が、浸漬液の濃度よりも高ければ当該糖脂質の濃度は問わないが、好ましくは浸漬液の5倍以上の濃度、さらに好ましくは10倍以上の濃度である。
【００４６】
当該シモン芋エキスを得る方法は、濃縮過程において糖脂質の性質を変えないで浸漬液から極性溶媒を除去できる方法であれば特に問わない。例えば、エバポレーターを用いた蒸発濃縮法でもよいし、極性溶媒を風乾等で蒸発させる自然蒸発濃縮法でもよいし、浸漬液の冷却による濃縮法でもよい。
【００４７】
前記浸漬液の冷却による濃縮法とは、糖脂質が低温化で析出して沈殿する性質を利用した濃縮法である。例えば、極性溶媒がエタノールの場合、０℃以下に冷却することで当該浸漬液中の糖脂質が析出する。これを静置するか、若しくは冷却遠心して上清の全て、あるいは大部分を除去した後、沈殿した糖脂質を残った極性溶媒か、若しくは懸濁用に新たに加える極性溶媒で再懸濁する方法であってもよい。当該浸漬液の冷却による濃縮法で実施形態４に詳述する固体状シモン芋エキスを製造する場合には、沈殿した糖脂質を再懸濁する必要はない。当該工程により、浸漬液中に存在する糖脂質、遊離脂肪酸等の他、浸漬に使用した極性溶媒に抽出可能な成分を濃縮できる。
【００４８】
本実施形態で得られるシモン芋エキスは、シモン芋由来の糖脂質を含有する。当該シモン芋エキスに糖脂質が含まれる事実は、当該シモン芋エキスを薄層クロマトグラフィー（Ｔｈｉｎ−Ｌａｙｅｒ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：以下ＴＬＣとする。）上で展開した後、アンスロン硫酸で糖脂質を呈色する実験によって確認できる。アンスロン硫酸は糖脂質の糖鎖を構成するヘキソースを紫色に発色させることから、糖脂質の検出に広く使用されている試薬である。ＴＬＣで展開した物質が紫色に呈色すれば粗精製したサンプル内糖脂質が含まれることを意味する。
【００４９】
<実施形態１：方法> 図１は実施形態１の方法の一例を示したものである。この図に示すように、本実施形態の方法は、まず、シモン芋を極性溶媒中に浸たす（浸漬工程：Ｓ０１０１）。次に、前記浸漬工程で得られる浸漬液を濃縮する（濃縮工程：Ｓ０１０２）。以上の製造工程によって、シモン芋由来のシモン芋エキスを得る。
【００５０】
<実施形態１：効果> 本実施形態の方法によれば、シモン芋に含まれる糖脂質を極性溶媒中に抽出して濃縮することで、シモン芋エキスとして得ることができる。当該方法で得られたシモン芋エキスは、健康食品や神経細胞活性化剤を製造する上での原料として利用することができる。
【００５１】
<<実施形態２>>
【００５２】
<実施形態２：概要> 実施形態２について説明する。本実施形態は、シモン芋由来の糖脂質を含有するシモン芋エキス製造方法を提供する。当該方法は、前記実施形態１を基本とし、前記浸漬工程前にシモン芋を乾燥させる乾燥工程をさらに有することを特徴とする。
【００５３】
<実施形態２：構成> 実施形態２は、前記実施形態1を基本とする。したがって、本実施形態における方法の各工程の構成に関して、浸漬工程（Ｓ０２０２）と濃縮工程（Ｓ０２０３）については前記実施形態１と同様であることからそれらの説明は省略し、ここでは本実施形態に特徴的な乾燥工程についてその構成について以下で説明をする。
【００５４】
「乾燥工程」（Ｓ０２０１）は、シモン芋を乾燥させる工程である。本工程の「乾燥」とは、シモン芋中に含まれる水分を減ずることを言う。当該乾燥により、シモン芋中に含まれる水分を前記浸漬工程前に減じることにより前記極性溶媒がシモン芋組織内に浸透し易くなることから、脂質成分を極性溶媒中に短時間で効率よく抽出することができる。また、前記極性溶媒がエタノールである場合には、当該乾燥により、シモン芋組織内に浸透したエタノールの含水率が高くならない。すなわち、浸透したエタノールが細胞内の水分によって薄まらない。したがって、脂質成分をエタノール中に効率よく抽出することができる。
【００５５】
乾燥の方法は、シモン芋中に含まれる水分を減じることができれば特には問わない。例えば、外気に晒して放置するだけの自然乾燥法でもよいし、除湿剤とともに密閉容器内に入れて乾燥する除湿乾燥法でもよいし、晴天の昼間に日光と外気に当てて乾燥させる天日干し法でもよいし、送風装置等を用いて温風や冷風を当てる風乾燥法でもよいし、ヒーター等の熱源を用いた加熱乾燥法でもよいし、容器内で真空ポンプ等を用いて脱気する真空乾燥法でもよいし、シモン芋を凍らせたままの状態で乾燥する凍結乾燥（フリーズドライ）法でもよいし、又はそれらの組み合わせであってもよい。シモン芋中に含まれる糖脂質の性質を維持するためには凍結乾燥法が好ましい。これは、凍結乾燥法が低温で昇華により水分を除去することから、糖脂質の性質がほとんど変化しないためである。
【００５６】
シモン芋の乾燥時間は、前記乾燥方法や実施形態３で詳述する断片化工程後のシモン芋の状態によって適宜変えればよい。例えば、スライスした塊根を天日干し法で乾燥する場合は、冬季の晴天日の直射日光下で２週間から３週間程度乾燥することが好ましい。また、小片化した塊根を凍結乾燥法で乾燥する場合には−５０℃下で６時間以上乾燥することが好ましく、−５０℃下で24時間以上乾燥すればさらに好ましい。
【００５７】
当該工程によりシモン芋の含水率を乾燥前よりも９０％以下にすればよい。好ましくは、シモン芋の含水率を２０％以下にすることである。
【００５８】
本実施形態で得られるシモン芋エキスは、シモン芋由来の糖脂質を含有する。この事実は、前記実施形態１で述べた実験方法と同様の方法によって確認できる。実験の詳細な方法、及び実験結果は実施例１及び２と同様であることから、ここではその説明を省略する。
【００５９】
<実施形態２：方法> 図２は実施形態２の方法の一例を示したものである。まずシモン芋を乾燥させる（乾燥工程：Ｓ０２０１）。これ以降は実施形態１と同様である。すなわち、次に浸漬工程（Ｓ０２０２）を行い、続いて濃縮工程（Ｓ０２０３）を行う。以上の製造工程によって、シモン芋由来のシモン芋エキスを得る。
【００６０】
<実施形態２：効果> 本実施形態によれば、乾燥工程でシモン芋を乾燥して細胞内の水分を除去することによって、次に続く浸漬工程でシモン芋の細胞内部にまで極性溶媒が容易に浸透できる。これにより、極性溶媒中にシモン芋由来の糖脂質を効率よく抽出できる。
【００６１】
<<実施形態３>>
【００６２】
<実施形態３：概要> 実施形態３について説明する。本実施形態は、シモン芋由来の糖脂質を含有するシモン芋エキス製造方法を提供する。本実施形態のシモン芋由来のシモン芋エキス製造方法は、前記実施形態１又は２を基本とし、最初の工程としてシモン芋の塊根を断片化する断片化工程をさらに有することを特徴とする。
【００６３】
<実施形態３：構成> 実施形態３は、前記実施形態1又は２を基本とする。したがって、本実施形態において乾燥工程（Ｓ０３０２）と浸漬工程（Ｓ０３０３）と濃縮工程（Ｓ０３０４）については実施形態２と同様であることからそれらの説明は省略し、ここでは本実施形態に特徴的な断片化工程（Ｓ０３０１）の構成について以下で説明をする。
【００６４】
本実施形態ではシモン芋の塊根を用いる。「塊根」とは、シモン芋の根部に様々な栄養成分が蓄積されることで芋状となったものである。
【００６５】
「断片化工程」（Ｓ０３０１）とは、シモン芋の塊根を断片化する工程である。ここで言う「断片化」とは、シモン芋の塊根を切裁により小片にする意味に留まらず、塊根の内部組織を外部に露出させることを意味する。例えば、シモン芋の塊根表皮を剥離してもよいし、塊根をブロック状に切裁してもよいし、塊根をスライスしてもよいし、塊根を細切りにしてもよいし、塊根をすりおろしてもよいし、塊根を粉砕してもよいし、塊根を潰してもよいし、またそれらの組み合わせであってもよい。なお、塊根表皮を剥離した場合には当該表皮部分も含み、また、塊根を潰した場合には当該処理によって得られる搾汁液も含むものとする。当該断片化工程により塊根の内部組織を外部に露出させて、前記極性溶媒に直接触れる面積を大きくすることで、シモン芋の塊根に含有する糖脂質等の極性溶媒中への抽出効率を高めることができる。
【００６６】
本実施形態で得られるシモン芋エキスは、シモン芋由来の糖脂質を含有する。この事実は、前記実施形態１で述べた実験方法と同様の方法によって確認できる。実験の詳細な方法、及び実験結果は実施例１及び２に詳述するため、ここではその説明を省略する。
【００６７】
<実施形態３：方法> 図３は実施形態３での方法の一例を示したものである。この図で示す本実施形態の方法は、実施形態２の方法を基本としている。まずシモン芋の塊根を断片化する（断片化工程：Ｓ０３０１）。これ以降は実施形態２と同様である。すなわち、次に乾燥工程（Ｓ０３０２）を行い、続いて浸漬工程（Ｓ０３０３）を行う。そして最後に濃縮工程（Ｓ０２０４）を行う。以上の製造工程によって、シモン芋由来のシモン芋エキスを得る。
【００６８】
<実施形態３：効果> 本実施形態によれば、シモン芋を断片化して切断面を露出させることにより、シモン芋由来の糖脂質等をより多量に、より効率よく抽出することが可能となる。したがって、簡便かつ多量にシモン芋由来の糖脂質等を製造する上で有効である。
【００６９】
<<実施形態４>>
【００７０】
<実施形態４：概要> 実施形態４について説明する。本実施形態は、シモン芋由来の糖脂質を含有する固体状のシモン芋エキス製造方法の提供である。本実施形態のシモン芋エキス製造方法は、前記実施形態１から３のいずれか一の濃縮工程方法で得られる液状シモン芋エキスを乾燥させて固体状シモン芋エキスを得ることを特徴とする。
【００７１】
<実施形態４：構成> 実施形態４は、その前処理としてシモン芋由来のシモン芋エキスを得るために前記実施形態1から３のいずれか一を基本とする。本実施形態において断片化工程（Ｓ０４０１）と、乾燥工程（Ｓ０４０２）と、浸漬工程（Ｓ０４０３）と、については実施形態３と同様であることからそれらの説明は省略し、ここでは本実施形態に特徴的な濃縮工程（Ｓ０４０４）の構成について以下で説明をする。
【００７２】
「濃縮工程」（Ｓ０４０４）は、実施形態１から３のいずれか一の方法で得られる液状シモン芋エキスを乾燥させて固体状シモン芋エキスを得る工程である。
本工程の「乾燥」は、前記乾燥工程（Ｓ０２０１）の乾燥とは水分以外の液体も減じる点と乾燥させる対象が異なる。すなわち、本工程の「乾燥」では、シモン芋エキス中に溶解している糖脂質を固体として取りだすために、シモン芋エキス中に存在する水分、又は糖脂質の抽出に使用した極性溶媒等の液体を除去することを言う。ただし、液体の完全除去は必要ではなく、固体状になるか、又は含液体率（シモン芋エキスの完全乾燥重量に対する当該液体の割合）が２０％以下となればよい。
【００７３】
当該工程で液状シモン芋エキスを乾燥する方法は、液状シモン芋エキス中、若しくは実施形態１に記載の浸漬液の冷却よって得られる糖脂質の沈殿中に存在する水分、又は糖脂質の抽出に使用した極性溶媒等を除去することができ、さらにシモン芋エキス中の糖脂質が分解等の性質上の変化を生じない方法であれば特に問わない。例えば、外気に晒して放置するだけの自然乾燥法でもよいし、除湿剤とともに密閉容器内に入れる除湿乾燥法でもよいし、晴天の昼間に外気に晒して乾燥させる天日干し法でもよいし、送風装置等を用いて温風や冷風を送り乾燥させる風乾燥法でもよいし、ヒーター等の熱源を用いた加熱乾燥法でもよいし、容器内で真空ポンプ等を用いて脱気する真空乾燥法でもよいし、シモン芋エキスを凍結後に減圧下で乾燥する凍結乾燥（フリーズドライ）法でもよいし、シモン芋エキスを熱風と共に噴霧し極性溶媒のみを蒸発させる噴霧乾燥法でもよいし、またそれらの組み合わせであってもよい。
【００７４】
好ましくは凍結乾燥法がよい。これは、当該方法が低温で昇華により水分を除去することから、シモン芋中に含まれる糖脂質の性質の変化が少ないためである。当該方法で乾燥する場合、例えば、５０ｍｌのシモン芋エキスをトレイに流し入れ、凍結乾燥装置にて−５０℃で１２時間以上、好ましくは−５０℃で２４時間以上凍結乾燥処理を行うことで、シモン芋エキスの乾燥物を得ることができる。もちろん凍結乾燥の温度や時間はこの条件に限られない。
【００７５】
当該糖脂質を実施形態６、又は７で詳述する神経細胞活性化剤、又は健康食品として使用する場合には、賦形剤等を添加して乾燥させてもよい。
【００７６】
当該工程で得られた乾燥物は必要に応じて粉砕する。粉砕方法は、目的とする粒子サイズに粉砕できれば特に問わない。例えば回転歯による粉砕機を用いてもよいし、ミル（ｍｉｌｌ）を用いてもよいし、人が乳鉢等ですりつぶしてもよいし、又はその組み合わせであってもよい。粉砕した乾燥物の粒子形状は問わない。例えば、不定形であってもよいし、球形に近似の形状であってもよい。また、粒子サイズも約５ミリ以下であれば特に問わない。例えば、顆粒サイズであってもよいし、微粉サイズであってもよい。
【００７７】
本実施形態で得られる固体状シモン芋エキスは、シモン芋由来の糖脂質を含有する。この事実を証明する実験結果は実施例１とほとんど同様であることから、ここではその説明を省略する。
【００７８】
<実施形態４：方法> 図４は実施形態４での方法の一例を示したものである。この図で示す本実施形態の方法は、前記実施形態３の方法を基本としている。すなわち、まず断片化工程（Ｓ０４０１）を行い、次に乾燥工程（Ｓ０４０２）を行い、続いて浸漬工程（Ｓ０４０３）を行い、そして濃縮工程（Ｓ０４０４）を行い、液状シモン芋エキスを得る。ここまでは前記実施形態３と同様である。本実施形態では当該濃縮工程でさらに液状シモン芋エキスを乾燥させて固体状にする点で実施形態３と異なる。以上の工程によって、固体状のシモン芋由来のシモン芋エキスを得る。
【００７９】
<実施形態４：効果> 本実施形態によれば、液状シモン芋エキスを乾燥して固体状にすることにより保存性を高めることができる。また、液状に比べて携帯性にも優れている、さらに、実施形態６、又は７で詳述する神経細胞活性化剤、又は健康食品として錠剤や粉末剤に加工する上でも便利である。
【００８０】
<<実施形態５>>
【００８１】
<実施形態５：概要> 実施形態５について説明する。本実施形態は、実施形態１から４のいずれか一の方法で得られるシモン芋エキスから、さらにスフィンゴ糖脂質を高濃度に精製するシモン芋由来のスフィンゴ糖脂質製造方法の提供を特徴とする。
【００８２】
<実施形態５：構成> 本実施形態は、その前処理としてシモン芋由来の糖脂質を含むシモン芋エキスを得るために前記実施形態1から４のいずれか一を基本とする。したがって、本実施形態において断片化工程（Ｓ０５０１）と乾燥工程（Ｓ０５０２）と浸漬工程（Ｓ０５０３）と濃縮工程（Ｓ０５０４）とについては実施形態1から４のいずれか一と同様であることからそれらの説明は省略し、ここでは本実施形態に特徴的な加水分解工程（Ｓ０５０５）とクロロホルム溶液取得工程（Ｓ０５０６）とスフィンゴ糖脂質取得工程（Ｓ０５０７）とについて、それらの構成を以下で説明をする。
【００８３】
「加水分解工程」（Ｓ０５０５）は、前記実施形態1から４のいずれか一の方法で得られたシモン芋由来のシモン芋エキスにアルカリ溶液を加え、シモン芋エキス中に含まれるグリセロ糖脂質をアルカリ溶液によって加水分解する工程である。加水分解によってシモン芋エキス中のグリセロ糖脂質は、脂肪酸とグリセリンに分解される。
【００８４】
「アルカリ溶液」は、アルカリを極性溶媒で溶解した溶液である。本実施形態におけるアルカリ溶液は、例えば水酸化ナトリウム溶液又は水酸化カリウム溶液等を用いることができる。また極性溶媒としては、例えば、水、若しくはメタノールやエタノール等の低級アルコールを用いることができる。本実施形態におけるアルカリ溶液のアルカリ濃度、及び加える容量は、溶液中のアルカリの量が前記シモン芋エキス中に含まれるグリセロ糖脂質を完全に加水分解できるケン化価を有していればよい。
【００８５】
シモン芋エキスが液状の場合にはアルカリ溶液を加える前に、当該シモン芋エキスがペレット状の残滓になるまでシモン芋エキス中の極性溶媒を除去する処理を行ってもよい。除去する方法は、例えば実施形態４の濃縮工程で用いた乾燥方法と同様の方法であってもよい。
【００８６】
加水分解反応を促進するために、当該シモン芋エキスとアルカリ溶液の混合溶液を加熱してもよい。加熱温度は３０℃から５０℃の範囲が好ましい。加水分解反応の時間は温度に依存する。すなわち、低温ほど長くする。例えば、３７℃であれば２時間、５０℃であれば１時間のように適宜調整すればよい。
【００８７】
「クロロホルム溶液取得工程」（Ｓ０５０６）は、前記加水分解工程後の混合溶液にクロロホルムと水を加えて混合した混合液を、上層の水層と下層のクロロホルム層の２層に分離後、下層のクロロホルム層を回収する工程である。この工程により水層に移行したシモン芋由来のシモン芋エキス中に含まれる水溶性物質は除去される。ここで、脂肪酸とグリセリンは水溶性であることから、前記加水分解工程で加水分解されたグリセロ糖脂質は、当該工程で水層に移行し、除去されることになる。
【００８８】
本工程で、加水分解工程後の混合溶液にクロロホルムと水を加える際の容量比は、例えば、前記加水分解工程後の混合溶液の容量：クロロホルムの容量：水の容量は、容量比で４：８：３が好ましいが、これに限られない。混合の方法は、加水分解工程後の混合溶液とクロロホルムと水が十分に撹拌できれば手段は問わない。例えば、撹拌棒やスタラーバーによる撹拌装置を用いてもよいし、溶液を入れた容器に反転、回転、振動等を与える撹拌装置を用いてもよいし、手を用いて撹拌や反転等を与えてもよい
【００８９】
水層とクロロホルム層に分離するには、前記工程後に容器を静置するか、遠心機を用いて軽く遠心を行えばよい。分離時の温度は１０℃から３８℃の範囲であればよい。また、２層に分離した後、クロロホルム層を回収する方法は問わない。例えば、水面から管を通して下層のみを回収してもよいし、容器下部に設けたドレンコックを開いて下層のみを回収してもよい。
【００９０】
「スフィンゴ糖脂質取得工程」（Ｓ０５０７）は、前記クロロホルム溶液取得工程で得られたクロロホルム溶液からクロロホルムを除去することでシモン芋由来のスフィンゴ糖脂質を含む粗精製物を得る工程である。
【００９１】
クロロホルムを除去する方法は、クロロホルムのみを除去できる方法であれば特には問わない。例えばクロロホルムの蒸発による除去であってもよい。この時、送風や撹拌によってクロロホルムの蒸発を促進するようにしてもよい。除去後に得られる残滓をシモン芋由来のスフィンゴ糖脂質を含む粗精製物とする。当該粗精製物の状態は問わない。例えば、粘性のあるスラッジ状であってもよいし、粉末状であってもよいし、塊になっていてもよい。また、残滓をエタノール等の溶媒に再溶解してもよい。
【００９２】
本実施形態の方法で得られる粗精製物は、シモン芋由来のスフィンゴ糖脂質を高濃度で含んでいる。本実施形態の方法で得られるスフィンゴ糖脂質は、本実施形態で得られた試料をＴＬＣ上で展開した後、アンスロン硫酸で処理して糖脂質の検出することでアシアロガングリオシドとして確認できる。動物のガングリオシドの検出試薬としては、通常レゾルシノールが使用されるが、レゾルシノールはガングリオシドが有するシアル酸を発色させる試薬である。前述のように植物ではスフィンゴ糖脂質のほとんどがシアル酸残基を欠如したアシアロガングリオシドとして存在するため、レゾルシノールではシモン芋のスフィンゴ糖脂質を検出できない。そこで、シモン芋由来のスフィンゴ糖脂質はアシアロガングリオシドとみなして、アンスロン硫酸で検出する。当該実験の結果は実施例２、及び３に詳述するため、ここではその説明を省略する。
【００９３】
<実施形態５：方法> 図５は実施形態５の方法の一例を示したものである。図５で示す本実施形態の方法は、実施形態３の方法を基本としている。すなわち、まず断片化工程（Ｓ０５０１）を行い、次に乾燥工程（Ｓ０５０２）を行い、続いて浸漬工程（Ｓ０５０３）を行い、そして濃縮工程と（Ｓ０５０４）を行いシモン芋由来のシモン芋エキスを得る。ここまでは実施形態３と同様である。本実施形態では、さらに以下の工程を有する。まず、前記シモン芋由来のシモン芋エキスにアルカリ溶液を加えてグリセロ糖脂質を加水分解する（加水分解工程：Ｓ０５０５）。次に、クロロホルムと水を加えて混合した後、クロロホルム溶液層を取り出す（クロロホルム溶液取得工程：Ｓ０５０６）。最後に、クロロホルムを除去してシモン芋由来のスフィンゴ糖脂質を得る（スフィンゴ糖脂質取得工程：Ｓ０５０７）。以上の製造工程によって、シモン芋由来のスフィンゴ糖脂質を得る。
【００９４】
<実施形態５：効果> 本実施形態の方法によれば、シモン芋に含まれるスフィンゴ糖脂質を粗精製できる。また、本実施形態で得られる粗精製物は、シモン芋に含まれるスフィンゴ糖脂質を高濃度に含有することから医薬品や飲食品の原料として産業上様々な利用が可能である。
【００９５】
<<実施形態６>>
【００９６】
<実施形態６：概要> 実施形態６について説明する。本実施形態は、シモン芋由来の糖脂質、若しくはシモン芋由来のスフィンゴ糖脂質を動物に投与して、神経細胞を活性化する神経細胞活性化方法の提供と、シモン芋由来の糖脂質、若しくはシモン芋由来のスフィンゴ糖脂質を有効成分として含む神経細胞を活性化する神経細胞活性化剤の提供を特徴とする。
【００９７】
<実施形態６：構成> 実施形態６の構成要件について以下で説明する。
【００９８】
「動物」とは、神経系を有する生物を意味するが、好ましくは脊椎動物、さらに好ましくは哺乳動物を意味する。したがって、ヒトも当該動物に含まれる。
【００９９】
「投与」とは、シモン芋由来の糖脂質、若しくはシモン芋由来のスフィンゴ糖脂質を前記動物の体内に導入することを言う。
【０１００】
神経細胞活性化方法における「神経細胞」とは、生体内の中枢神経細胞や末梢神経細胞を意味する。これに対して神経細胞活性化剤における「神経細胞」とは、生体内の中枢神経細胞や末梢神経細胞に留まらず、中枢神経や末梢神経を構成する細胞の性質を有する細胞を含む。例えば、ＮＧＦ等の神経成長因子の作用によって神経細胞に分化する能力を有する細胞であってもよいし、生体より分離された後に培養される神経幹細胞や神経芽細胞等の株化された培養細胞であってもよい。
【０１０１】
「活性化」とは、機能を向上する作用、又は機能を維持する作用、又は細胞増殖を促進する作用を意味する。
【０１０２】
「神経細胞活性化」とは、前記神経細胞を活性化することを意味する。例えば、神経突起の伸長促進、又はシナプス形成の促進、又は有糸分裂の促進、又は神経変性の抑制、等が該当する。
【０１０３】
「神経細胞活性化剤」とは、前記神経細胞活性化の効果を有する薬剤、飲食品等である。当該活性化剤の状態は問わない。溶媒に溶解した液体状態であってもよいし、ゲル状体であってもよいし、ペースト状態であってもよいし、粉末状態であってもよいし、錠剤又はカプセルであってもよいし、原料として混入された状態であってもよい。
【０１０４】
本実施形態において「含む」とは、シモン芋由来の糖脂質、又はシモン芋由来のスフィンゴ糖脂質が前記神経細胞活性化に寄与し得る程度で含有されていることを言う。
【０１０５】
本実施形態のシモン芋由来の糖脂質は、前記実施形態１から４のいずれか一の方法で得られるシモン芋エキスに含有する糖脂質を用いてもよい。また、シモン芋由来のスフィンゴ糖脂質は、前記実施形態５の方法で得られるシモン芋由来のスフィンゴ糖脂質を用いてもよい。
【０１０６】
シモン芋由来の糖脂質、若しくはシモン芋由来のスフィンゴ糖脂質は、神経細胞活性化を有する。この事実は株化された培養細胞に、当該糖脂質や当該スフィンゴ糖脂質を添加し、その後の神経突起の伸長を観察する実験によって確認できる。シモン芋由来の糖脂質を用いた当該実験の詳細な方法、及びその結果については実施例５及び６で、またシモン芋由来のスフィンゴ糖脂質を用いた当該実験の詳細な方法、及びその結果については実施例７で詳述する。
【０１０７】
<実施形態６：方法> 本実施形態においてシモン芋由来の糖脂質、又はシモン芋由来のスフィンゴ糖脂質を動物に投与して、神経細胞を活性化する神経細胞活性化方法について以下で説明する。
【０１０８】
神経細胞活性化は、当該糖脂質、又はスフィンゴ糖脂質の投与によって達成される。投与の方法は、神経細胞活性化の効果が得られれば特に問わない。例えば、哺乳動物であれば経口投与、経直腸投与、脳室内投与、髄腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、経皮吸収、皮下投与、経鼻・吸入、舌下投与のいずれを用いてもよい。簡便、かつ投与する量を調整しやすいという点では経口投与が好ましい。
【０１０９】
また、本実施形態のシモン芋由来の糖脂質、又はシモン芋由来のスフィンゴ糖脂質を投与する量は、投与する動物個体の大きさ、投与する方法、及びそれによって得られる神経細胞活性化の効果に依存する。したがって、投与する方法に応じて神経細胞活性化の効果が得られる範囲で増減すればよい。例えば、２９週令のマウスで経口投与する場合、シモン芋由来のスフィンゴ糖脂質であれば１日あたり５〜１０ｍｇを餌に混ぜる等して与えれば、神経細胞活性化の効果が期待できる（参考：非特許文献１、非特許文献２）。
【０１１０】
<実施形態６：効果> 本実施形態によれば、シモン芋由来の糖脂質、若しくはシモン芋由来のスフィンゴ糖脂質を有効成分として、当該糖脂質や当該スフィンゴ糖脂質が有する神経細胞活性化を利用した脳や神経の機能向上、機能維持を目的とした生体に安全な植物性の薬剤や健康食品等を提供できる。また、当該神経細胞活性化剤を動物に投与することで、神経細胞の増殖促進や神経突起伸長の促進の作用によって老若を問わず記憶力の向上等の効果が期待できる。
【０１１１】
<<実施形態７>>
【０１１２】
<実施形態７：概要> 実施形態７について説明する。本実施形態は、実施形態１から４によって得られるシモン芋エキスを用いた健康食品の提供である。
【０１１３】
<実施形態７：構成> 本実施形態の構成について以下で説明する。
【０１１４】
「健康食品」は、通常健康の保持増進に資する食品として販売・利用されるもの全般を言う。例えば、栄養補助食品や、栄養強化食品や、機能性食品や、特定保健用食品等が該当する。しかし、本発明における「健康食品」は前記の意味に留まらず、実施形態１から４の方法で得られるシモン芋エキスを混入する食品全般を意味する。
【０１１５】
健康食品としてシモン芋エキスを使用する場合には、当該シモン芋エキスの状態は経口できれば特に問わない。例えば、未加工状態であってもよいし、未加工状態のままカプセルに充填されたものであってもよいし、圧縮成型により錠剤等に加工されたものでもあってもよい。あるいは、賦形剤を添加して粉状に加工された後に錠剤状に成型されたものであってもよいし、当該粉状に加工された後に植物油等と混合してカプセルに充填されたものであってもよい。賦形剤はデキストリン、又はデンプン、又は乳糖等が該当するが、同様の効果が得られるものであれば、これらに限定されない。また、賦形剤の含有率は４０％〜９０％の範囲が好ましい。さらに、他の健康食品や甘味料等と混合された状態であってもよいし、加工食品の素材、又は添加物として原料に加えてもよいし、液体であれば飲用前に加えて混合してもよいし、香辛料のように食用前に振り掛けた状態でもよい。
【０１１６】
<実施形態７：効果> 本実施形態によれば、シモン芋由来のシモン芋エキスを健康食品として使用することで当該シモン芋由来のシモン芋エキスに含まれる糖脂質を安全かつ容易に日々効率よく摂取することができる。
【実施例１】
【０１１７】
以下の実施例１から７をもって本発明をより具体的に説明するが、これらは単に例示するのみであり、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
<シモン芋由来の糖脂質を含有するシモン芋エキス製造方法>
前記実施形態３によるシモン芋由来の糖脂質を含有するシモン芋エキス製造方法に関する実施例を以下で説明する。
【０１１８】
（断片化工程）シモン芋の塊根１００ｇを水で洗浄し、表面に付着した泥やゴミ等の異物を除去した。次に、表皮のついた状態で塊根を切裁機に入れ、約１ｃｍ平方の小片状に断片化した。
【０１１９】
（乾燥工程）前記断片化工程で得られたシモン芋の塊根の小片を凍結乾燥装置（ＥＹＥＬＡ社）に入れ、−５０℃で１２時間の凍結乾燥処理を行った。
【０１２０】
（浸漬工程）得られたシモン芋の塊根の乾燥小片５０ｇを測り取り、恒温槽内で６０℃にプレヒートしたエタノール（９９．５％含有）１５０ｍｌに浸した後、撹拌をしながら６０℃で３時間抽出を行った。なお、実施例３でのコントロールとしてエタノールの代わりにプレヒートした水を用いて、他は同一条件で抽出を行った。
【０１２１】
（濃縮工程）前記浸漬工程後、シモン芋の塊根の乾燥小片と極性溶媒の混合物を吸引ビンに繋いだ漏斗内に移し、アスピレーターにより吸引した。吸引ビン内の液体を浸漬液として回収し、漏斗内の残渣は廃棄した。当該浸漬液をロータリーエバポレーター（ＥＹＥＬＡ社）を用いて、４０℃で３０分間濃縮した。これによって得られるシモン芋エキスは約５０ｍｌであり、これを「シモン芋エキス（サンプル）」として以降の実験に使用した。また、コントロールは「水抽出エキス（サンプル）」として実施例３の実験に使用した。
【実施例２】
【０１２２】
<シモン芋由来のスフィンゴ糖脂質製造方法>
前記実施形態５によるシモン芋由来のスフィンゴ糖脂質製造方法に関する実施例を以下で説明する。
【０１２３】
（加水分解工程）まず、実施例１で得られたシモン芋エキス５０ｍｌをさらに前記ロータリーエバポレーターを用いて、４０℃で６０分間処理し、シモン芋エキス中のエタノールと水分を完全に除去した。次に、残ったペレット状の濃縮物に０．４Ｎ水酸化カリウム／メタノール溶液を４０ｍｌ加えて再溶解した後、３７℃で２時間インキュベートした。
【０１２４】
（クロロホルム溶液取得工程）前記加水分解工程後に当該再溶解液：クロロホルム：水をそれぞれ４：８：３（容量比）で十分に混合した。続いて、軽く遠心を行った後、下層のクロロホルム層を回収した。
【０１２５】
（スフィンゴ糖脂質取得工程）前記クロロホルム溶液取得工程で回収したクロロホルム層の溶液からクロロホルムを撹拌しながら風乾燥で蒸発させて完全に除去した。蒸発後の残滓を「シモン芋由来のスフィンゴ糖脂質」とした。なお、以降の実験に使用するための液状サンプルとして調整するため、当該シモン芋由来のスフィンゴ糖脂質にクロロホルム：メタノール＝２：１（容量比）の混合液５ｍｌに再溶解したものを「シモン芋由来のスフィンゴ糖脂質サンプル」とした。
【実施例３】
【０１２６】
<シモン芋由来の糖脂質、及びスフィンゴ糖脂質の分析>
実施例１で得られるシモン芋エキス中にシモン芋由来の糖脂質が含まれること、及び実施例２で得られた産物にシモン芋由来のスフィンゴ糖脂質が高濃度で含まれることを確認するためにＴＬＣによって分析した。
【０１２７】
（糖脂質及びスフィンゴ糖脂質の分析）実施例１で得られた「シモン芋エキスサンプル」及び「水抽出エキスサンプル」と、実施例２で得られた「シモン芋由来のスフィンゴ糖脂質サンプル」とをそれぞれ５μｌずつＴＬＣに添付した。ＴＬＣの下端が浸る程度の展開液（アセトニトリル：イソプロパノール：５０ｍＭ塩化カリウム溶液＝１：１１．７：２．３）が入った容器内にＴＬＣを入れて密封し、展開を行った。溶媒がＴＬＣの上端付近に達した時に展開液からＴＬＣを取り出して展開を止めた。展開後のＴＬＣを十分に乾燥させた後、アンスロン硫酸を当該ＴＬＣに噴霧した。ＴＬＣ上で展開した糖脂質が呈色するまで１２０℃のホットプレートにて数分間加温した。最後にＴＬＣをデンシトメーター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）にて分析した。
【０１２８】
（結果）図６にＴＬＣの展開結果を示す。レーンＡは水抽出サンプルを、レーンＢはシモン芋エキスサンプルを、そしてレーンＣはシモン芋由来のスフィンゴ糖脂質サンプルをそれぞれ示している。矢印で示すバンド１は、ステロール配糖体である。ステロール配糖体は、ヘキソースを有するため呈色するがスフィンゴ糖脂質ではない。バンド２は、グリコシルセラミドである。グリコシルセラミドは、糖鎖部が単糖のみで構成されたスフィンゴ糖脂質の一つである。当該グリコシルセラミドは、ガングリオシド群、又はアシアロガングリオシド群の基本骨格となる分子であるが、本発明ではガングリオシド群、又はアシアロガングリオシド群のみを対象としていることから対象外物質として扱う。したがって、これらステロール配糖体やグリコシルセラミドは、実施例１、又は２の方法で得られる最終産物において不純物として混在し得る物質である。当該不純物の完全除去は困難であり、また後述の実施例７で示すように、これらの不純物はたとえ混入していてもシモン芋由来の糖脂質、並びにスフィンゴ糖脂質が有する神経細胞活性作用に何ら影響を及ぼすものではない。したがって、当該不純物の混入は無視できるものとして扱う。
【０１２９】
レーンＡでは、バンドはほとんど検出できなかった。これは、シモン芋の糖脂質の水抽出は極めて効率が悪いことを示している。これに対してエタノール抽出を行ったレーンＢでは、多数のバンドが検出された。バンド１又は２以外のバンドが、グリセロ糖脂質群とスフィンゴ糖脂質群に相当する。本結果により実施例１の方法によって得られたシモン芋エキスサンプル中には、水抽出サンプルと比較してグリセロ糖脂質群とスフィンゴ糖脂質群からなる糖脂質を多量に含有するが明らかとなった。
【０１３０】
レーンＣのバンド３a、３ｂ、３ｃ、３ｄはスフィンゴ糖脂質群である。実施例２の方法によってシモン芋エキスサンプル中のグリセロ糖脂質群が除去されたことから、レーンＢで見られたグリセロ糖脂質に相当するバンド群４が消失している。また、本発明のスフィンゴ糖脂質製造方法によって３a又は３ｃのようにレーンＢでは検出できなかったスフィンゴ糖脂質のバンドが検出された。さらに、３ｂのようにレーンＢで検出されたスフィンゴ糖脂質も高濃度に濃縮されていた。この結果により、実施例２の方法によって得られたシモン芋由来のスフィンゴ糖脂質サンプル中には、シモン芋由来のスフィンゴ糖脂質が高濃度で存在することが明らかとなった。
【実施例４】
【０１３１】
<シモン芋と他の食用植物におけるスフィンゴ糖脂質含有量の比較>
シモン芋が一般的に知られる食用植物よりもスフィンゴ糖脂質を多量に含有することを確認するために、シモン芋と他の食用植物におけるスフィンゴ糖脂質の含有量を比較検証した。
【０１３２】
（各食用植物エキスの製造方法）他の食用植物としては、シモン芋に近似の紅芋とサツマ芋、及び世界各地で主食として利用されているジャガイモと米を選択した。シモン芋、紅芋、サツマ芋、ジャガイモ、米をそれぞれ前記実施例１と同様の方法で処理して各食用植物エキスを調製した。ただし、米のみについては塊根ではなく精米を用いたため断片化工程を省いた。詳細な方法は実施例１と同様であることから省略する。
【０１３３】
（スフィンゴ糖脂質分析用サンプルの調製）前記製造方法で得られた各食用植物エキスを実施例２と同様の方法で処理して、それぞれのスフィンゴ糖脂質分析用サンプルを得た。詳細な方法は実施例２と同様であることから省略する。
【０１３４】
（スフィンゴ糖脂質の比較）前記スフィンゴ糖脂質分析用サンプルの調製で得られた各食用植物由来のスフィンゴ糖脂質分析用サンプルをそれぞれ５μｌずつＴＬＣに添付した。ここで、植物性アシアロガングリオシドは一般に市販されておらず、入手が困難であるため位置マーカーとして利用できるものがなかった。そこで、本実施例では入手の容易な動物性アシアロガングリオシドの一つであるＧＭ１を植物性アシアロガングリオシドの位置マーカーとして代用した。当該マーカーサンプルは、アシアロガングリオシドＧＭ１（ＳＩＧＭＡ社）１ｍｇをクロロホルム：メタノール＝２：１（容量比）の混合液５ｍｌに溶解した後、溶解液５μｌを他のサンプルと同様にＴＬＣに添付したものである。ＴＬＣの下端が浸る程度の展開液（アセトニトリル：イソプロパノール：５０ｍＭ塩化カリウム溶液＝１：１１．７：２．３）が入った容器内にＴＬＣを入れて密封し、展開を行った。溶媒がＴＬＣの上端付近に達した時に展開液からＴＬＣを取り出して展開を止めた。展開後のＴＬＣを十分に乾燥させた後、アンスロン硫酸を当該ＴＬＣに噴霧した。ＴＬＣ上で展開した糖脂質が呈色するまで１２０℃のホットプレートにて数分間加温する。最後にＴＬＣをデンシトメーター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）にて分析した。
【０１３５】
（結果）図７にその結果を示す。レーンＡは位置マーカーである動物性アシアロガングリオシドＧＭ１を、レーンＢはシモン芋由来のスフィンゴ糖脂質サンプルを、レーンＣは紅芋由来のスフィンゴ糖脂質サンプルを、レーンＤはサツマ芋由来のスフィンゴ糖脂質サンプルを、レーンＥはジャガイモ由来のスフィンゴ糖脂質サンプルを、レーンＦは米由来のスフィンゴ糖脂質サンプルを、それぞれ示している。レーンＡ以外で見られ、矢印で示すバンド１は前記ステロール配糖体である。レーンＢ、Ｃ、Ｄにおいて見られるバンド２は前記グリコシルセラミドである。またレーンＢ、Ｃ、Ｄでラダー状に見られるバンド３がスフィンゴ糖脂質群である。レーンＡにて４で示すバンドが動物性アシアロガングリオシドＧＭ１である。
【０１３６】
この図で示すように、スフィンゴ糖脂質はレーンＥ（ジャガイモ由来）とレーンＦ（米由来）では検出できず、またレーンＤ（サツマ芋由来）でもほとんど検出できなかった。スフィンゴ糖脂質が比較的多く検出できたのは、レーンＢ（シモン芋由来）とレーンＣ（紅芋由来）のみであった。注目すべき点はレーンＢのみでバンド５が検出されたことである。このバンド５のようなレーンＡの動物性アシアロガングリオシドＧＭ１に比較的近い展開速度を有するスフィンゴ糖脂質は、食用植物ではこれまでに知られていない。詳細に関しては現在解析中であるが、本発明者らは動物性アシアロガングリオシドＧＭ１の植物性近似物質と推測している。
【０１３７】
以上の結果から、シモン芋は主食として用いられる他の一般的な食用植物と比較して、非常に多くのスフィンゴ糖脂質を含有し、さらに近似の紅芋やサツマ芋にも見られない特有のスフィンゴ糖脂質（以下、植物性ＧＭ１近似物質とする。）を有していることが判明した。
【０１３８】
なお、植物細胞においてガングリオシドは極めて稀であることから、当該実施例においてアンスロン硫酸によって呈色されたスフィンゴ糖脂質は、そのほとんどが植物性アシアロガングリオシドと考えられる。
【実施例５】
【０１３９】
<シモン芋由来の糖脂質によるヒト神経芽細胞の活性化>
シモン芋由来の糖脂質がヒト神経芽細胞を活性化できるかについての検証を行った。実験方法と結果を以下で説明する。なお、本実施例以降で培養細胞に用いる器具や試薬、水等は特に断りのない限りは、原則として全て滅菌処理済みのものを使用し、操作はクリーンベンチ、又は無菌室にて行うことを前提とする。
【０１４０】
（添加サンプルの調製）１．シモン芋由来の糖脂質：前記実施例１で得られたシモン芋由来の糖脂質を含有するシモン芋エキス５ｍｌを凍結乾燥機で−５０℃で１２時間処理して凍結乾燥した。次に、乾燥物を乳鉢にて粉末になるまですり潰した。続いて、エタノール（９９．５％）で当該乾燥粉末を０．５μｇ／μｌの溶液になるように調整した。最後に、当該溶液を０．２２μｍフィルターで濾過滅菌して、「シモン芋糖脂質（サンプル）」とした。２．ポジティブコントロール：ＰＢＳ（−）緩衝液で神経成長因子ＮＧＦ（ＳＩＧＭＡ）を１００μｇ／ｍｌの溶液になるように調製した。当該溶液を０．２２μｍフィルターで濾過滅菌して、「ＮＧＦ（サンプル）」とした。
【０１４１】
（細胞培養方法とサンプルの添加）まず、株化された培養細胞であるヒト神経芽細胞（ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞）２．０×１０４ ｃｅｌｌｓを４ｍｌのＤＭＥＭ（ナカライテスク社）/１０％ＦＣＳ（ＧＩＢＣＯ社）の培地を入れた６ｃｍディッシュＡ、Ｂ、Ｃの３枚に播いた。続いて、当該ディッシュ３枚を３７℃、５％ＣＯ２濃度下で２４時間培養した。２４時間後、ディッシュＡはネガティブコントロールとして無添加にし、またディッシュＢには２００ｎｇ／ｍｌのＮＧＦサンプル添加した。ディッシュＣは５０μｌ（＝２５μｇ）のシモン芋サンプルを添加した。その後、各ディッシュは、再び３７℃、５％ＣＯ２濃度下で６日間培養した。各ディッシュの培地の交換は、この間特には行っていない。
【０１４２】
（培養細胞の観察）前記サンプルを添加後、２４時間毎に位相差顕微鏡を用いてヒト神経芽細胞の神経突起成長の状態を観察した。
【０１４３】
（結果）図８に各ディッシュ上のヒト神経芽細胞の状態を示す。０８０１から０８０３はディッシュＡ上の、０８０４と０８０５はディッシュＢ上の、そして０８０６から０８８はディッシュＣ上のヒト神経芽細胞の状態を示す。また、０８０１と０８０６はサンプル添加後１日目の細胞を示し、０８０２、０８０４、０８０７は２日目の細胞を示す。さらに０８０３、０８０５、０８０８は５日目の細胞を示す。
【０１４４】
無添加のディッシュＡでは５日後（０８０３）も神経突起の伸長は見られない。一方、シモン芋サンプルを添加したディッシュＣでは１日後（０８０６）に矢印で示す神経突起の伸長が多数の細胞で確認できた。ディッシュＣの細胞の神経突起は、その後培養によってさらに伸長し、５日目にはＮＧＦを添加したディッシュＢの５日目（０８０５）と同程度に伸長が促進された（０８０８）。以上の結果から、シモン芋由来の糖脂質は、動物性ガングリオシドと同様に神経細胞の神経突起の伸長を促進できることが明らかとなった。
【実施例６】
【０１４５】
<シモン芋由来の糖脂質によるＰＣ１２の神経突起様突起伸長活性評価>
シモン芋由来の糖脂質がラット副腎褐色細胞腫細胞ＰＣ１２を神経細胞に分化誘導し、神経突起様突起の伸長を活性するか、また細胞増殖活性を有するかの評価を行った。詳細な実験方法と結果を以下で説明する。
【０１４６】
（添加サンプルの調製）シモン芋由来の糖脂質としての「シモン芋エキスサンプル」、及びポジティブコントロールとしての「ＮＧＦサンプル」の調製は、共に実施例５と同様であることから説明を省略する。
【０１４７】
（細胞培養方法とサンプルの添加）シモン芋由来の糖脂質が有する神経突起様突起伸長活性をマイクロプレート上で評価できる系を非特許文献３を参考に検討した。まずＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ社）／１０％ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ社）／５％ＨＳ（Ｓｉｇｍａ社）培地中で培養したＰＣ１２細胞を、フィブロネクチンコートした９６ウェルのマイクロプレート上に２．０×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｍｌずつ分注後、前記ＮＧＦサンプルを終濃度１０ｎｇ／μｌで、また前記０．５μｇ／μｌシモン芋エキスサンプル（原液）を最終濃度２５０ｎｇ／μｌ（原液２倍希釈）、１２５ｎｇ／μｌ（原液４倍希釈）、そして６２．５ｎｇ／μｌ（原液８倍希釈）となるようにそれぞれ別個のウェルに添加した。その後、３７℃、５％ＣＯ２濃度下で３−４日間培養した。
【０１４８】
（培養細胞の観察と神経突起様突起伸長活性測定）神経突起様突起の状態については位相差顕微鏡で４日間観察した。また、神経突起様突起伸長の活性測定は、神経突起様突起の伸長指標となるアセチルコリンエステラーゼの活性として以下の手順で測定した。まず、培養最終日に培地を除去し、１ウェルあたり１８０μｌの５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．５）／０．１２Ｍ ＮａＣｌ／０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００／１ｍＭ ＥＤＴＡと、基質として２０μｌの５．６ｍＭ よう化アセチルチオコリン溶液を加えて室温で2時間処理した。次に、５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）／０．２％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００／１ｍＭ ＥＤＴＡを１６０μｌと０．４ｍＭ ＣＰＭを２０μｌ添加し、蛍光マイクロプレートリーダーを用いて励起光３６０ｎｍと既定光（測定光）４６０ｎｍにおける蛍光量をそれぞれ測定した。
【０１４９】
（細胞増殖活性の測定）シモン芋エキスが有する細胞増殖活性をアラマーブルー法により調べた。アラマーブルー法は細胞の生死を判別する方法である。具体的には培養細胞にアラマーブルー溶液を添加し、３７℃、５％ＣＯ２濃度下で数時間培養すると、生細胞ではミトコンドリア中のコハク酸デヒドロゲナーゼの活性で色が変化するのに対して、死細胞では当該酵素の失活からそのような変化は生じない。この発色のよる吸光度を測定することで細胞の生存率が算出できる。測定に使用した各細胞の条件は、神経突起様突起伸長活性測定で用いた細胞と同様である。
【０１５０】
（結果）図９に培養4日目におけるＰＣ１２細胞の神経突起様突起の伸長を、また図１０に培養4日目におけるＰＣ１２細胞のアセチルコリンエステラーゼ活性をそれぞれ図示する。図１０の縦軸はアセチルコリンエステラーゼ活性としての４６０ｎｍにおける蛍光量を示す。横軸は各サンプルであり、添加物はいずれも培地と細胞を含むウェルに加えた。個々での細胞とはＰＣ１２細胞であり、希釈液とはシモン芋エキスサンプルを希釈したものである。また、図中の星印が付記された結果はコントロールである水添加（レーン３）と比較したときの有意差がp<０．０１であるものを示す。
【０１５１】
ポジティブコントロールであるＮＧＦサンプルを加えたウェル内のＰＣ１２細胞は、神経突起様突起の伸長が確認された（図９のＡ）。また、ＮＧＦサンプルを加えたウェル内のＰＣ１２細胞は、アセチルコリンエステラーゼ活性もネガティブコントロールである水のみを添加した細胞（図１０ レーン３）と比べて増加していた（図１０ レーン４）。一方、シモン芋エキスサンプルを加えたウェル内のＰＣ１２細胞についても、ＮＧＦサンプルの場合と同様の神経突起様突起の伸長が確認された（図９のＢ：抽出原液添加）。また、シモン芋エキスサンプルを加えたウェル内のＰＣ１２細胞は、アセチルコリンエステラーゼ活性も水のみを添加した細胞（図１０ レーン３）と比べて、シモン芋エキスサンプルの２倍希釈（図１０ レーン５）、４倍希釈（図１０ レーン５）、そして８倍希釈（図１０ レーン７）のいずれもが有意な（p<０．０１）増加を示した。さらに、それらの増加の程度は、添加したシモン芋エキスサンプルの量依存的であった。
【０１５２】
上記結果から、水添加のアセチルコリンエステラーゼ活性を1とする時、ＮＧＦサンプルは２．５、シモン芋エキスサンプル２倍希釈は１．５、またシモン芋エキスサンプル４倍希釈は１．２であった。これからシモン芋エキスサンプルの2倍希釈溶液（終濃度２５０ｎｇ／μｌ）は、ＮＧＦ終濃度６．１ｎｇ／ｍｌと同程度の活性を有すると推察できる。
【０１５３】
図１１に培養4日目における細胞増殖活性の結果を示す。シモン芋エキスサンプルの２倍希釈（図１１ レーン５）、４倍希釈（図１１ レーン５）、そして８倍希釈（図１１ レーン７）は、水のみの添加（図１１ レーン３）と比較して、いずれの場合も有意な（p<０．０１）細胞増殖活性の増加を示した。また、その増加は量依存的であった。以上の結果からシモン芋由来の糖脂質は、PC１２に対して細胞増殖促進活性を有することが明らかとなった。
【実施例７】
【０１５４】
<シモン芋由来のスフィンゴ糖脂質によるヒト神経芽細胞の活性化の確認>
実施例５、又は６においてシモン芋由来の糖脂質で見られた神経突起若しくは神経突起様突起の伸長活性が、糖脂質の中のスフィンゴ糖脂質によるものかを確認した。また、実施例４で検出されたシモン芋特有のスフィンゴ糖脂質（植物性ＧＭ１近似物質）が特に神経突起の伸長活性を有するかを確認した。
【０１５５】
（添加サンプルの調製）
【０１５６】
１．シモン芋由来の糖脂質：「シモン芋糖脂質（サンプル）」の調製は前記実施例５と同様であることから説明を省略する。
【０１５７】
２．水抽出したシモン芋由来の糖脂質：実施例１で調製した水抽出エキスを実施例５のシモン芋エキスと同様の方法で処理したものを「水抽出シモン芋糖脂質（サンプル）」とした。
【０１５８】
３．スフィンゴ糖脂質分画と除スフィンゴ糖脂質分画：前記シモン芋糖脂質サンプルをシリカゲルカラムクロマトにてスフィンゴ糖脂質と除スフィンゴ糖脂質に分画した。分画の条件は以下の通り。まず、カラムにシリカゲルを１０ｇ充填し、１５ｍｌヘキサンで平衡化した。次に、前記シモン芋糖脂質サンプルをカラムに加え、１０ｍｌヘキサン／５ｍｌアセトン混合液で除スフィンゴ糖脂質分画を溶出した。続いて、ロータリーエバポレーター（ＥＹＥＬＡ社）を用いて溶出液からヘキサン／アセトンを蒸発除去した。得られた残滓にエタノールを加えて溶解し、最終濃度０．５μｇ／μｌになるように調整した。当該溶液を０．２２μｍフィルターで濾過滅菌して「除スフィンゴ糖脂質分画（サンプル）」とした。次に、除スフィンゴ糖脂質分画を溶出後のカラムを５ｍｌヘキサン／１０ｍｌアセトン混合液で洗浄した後、アセトン１５ｍｌでさらに洗浄した。続いて、１５ｍｌエタノールでスフィンゴ糖脂質分画を溶出した。その後、ロータリーエバポレーター（ＥＹＥＬＡ社）を用いて溶出液からエタノールを蒸発除去した。最後に得られた残滓にエタノールを加えて再溶解し、最終濃度０．５μｇ／μｌになるように調整した。当該溶液を０．２２μｍフィルターで濾過滅菌して「スフィンゴ糖脂質分画（サンプル）」とした。
【０１５９】
４．シモン芋特有のスフィンゴ糖脂質（植物性ＧＭ１近似物質）：まず、前記スフィンゴ糖脂質分画を約２〜３μｇＴＬＣプレートに添加した。展開条件は実施例４と同様なので説明は省略する。次に、展開後のＴＬＣプレートから目的とする植物性ＧＭ１近似物質に相当するバンドのシリカゲルを掻き取った。続いて、当該シリカゲルにエタノールを加え、超音波を１分間照射した後、６０℃で１時間加温した。この操作によってシリカゲルに吸着した植物性ＧＭ１近似物質を溶出させた。それから軽く遠心してシリカゲルを沈殿させて上清を採取した後、当該上清を０．４５μｍフィルターで濾過してシリカゲルを完全に除去した。その後、ロータリーエバポレーター（ＥＹＥＬＡ社）を用いて濾過液からエタノールを蒸発除去した。最後に得られた残滓にエタノールを加えて再溶解し、最終濃度０．５μｇ／μｌになるように調整した。当該溶液を０．２２μｍフィルターで濾過滅菌して「植物性ＧＭ１近似物質（サンプル）」とした。なお、同時に他のスフィンゴ糖脂質のバンドも同様の方法で精製した。
【０１６０】
５．コントロール：ポジティブコントロールである「ＮＧＦ（サンプル）」の調製は前記実施例５と同様であることから説明を省略する。また、ネガティブコントロールとして無添加のものを調製した。なお、コントロール以外のサンプルは全て実施例４と同様の方法によって、ＴＬＣにて展開し、その存在の確認を行った。
【０１６１】
（細胞培養方法とサンプルの添加）ヒト神経芽細胞（ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞）の培養条件、各サンプルの添加条件は全て実施例５と同条件であることから、その説明は省略する。
【０１６２】
（培養細胞の観察）前記各サンプルを添加後、２４時間毎に顕微鏡を用いてヒト神経芽細胞の神経突起成長の状態を毎日観察した。
【０１６３】
（結果）図１２に各サンプルを添加したときのＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞と、添加した各サンプルのＴＬＣ結果を図示する。細胞は各サンプル添加後１日（２４時間）後、及び２日（４８時間）後のものを図示した。ただし、ＮＧＦ添加（ポジティブコントロール）は２日後のみを図示した。また、各サンプル添加直後（０日）の細胞図は、無添加（ネガティブコントロール）の１日後と、いずれもほとんど変わらないため省略した。なお、無添加（１２０１、１２０２）、ＮＧＦ添加（１２０３）、そしてエタノール抽出シモン芋エキス添加（１２０４、１２０５）は、全条件を実施例５と同一の条件で行ったことから、同一の結果を図示した。各添加サンプルのＴＬＣ展開は実施例３と同様の方法で行った。ＴＬＣ展開のＡの各バンドは、グリコシルセラミド、ステロール配糖体、及びグリセロ糖脂質群である。Ｂはスフィンゴ糖脂質をシリカゲルカラムクロマトにて精製したサンプルに混入しているグリコシルセラミド、ステロール配糖体、及びグリセロ糖脂質群の一部である。これらを完全に除去することは困難であり、また後述の理由によりこれらの物質には神経細胞活性化作用がないことが明らかであることから、無視できるものとした。Ｃの各バンドはスフィンゴ糖脂質群である。Ｄのバンドは植物性ＧＭ１近似物質を示す。
【０１６４】
まず、水抽出物シモン芋糖脂質を添加した細胞は、細胞形態も無添加と同じく神経突起伸長促進の活性はみられなかった。ＴＬＣ展開図（１２１４）でも糖脂質が抽出されていないことが示されている。
【０１６５】
次に、エタノール抽出したシモン芋糖脂質を添加した細胞は、実施例５と同一の結果であり、１日後には多数の細胞で神経突起の伸長が観察された。
【０１６６】
続いて、除スフィンゴ糖脂質分画を添加した細胞は、水抽出シモン芋糖脂質や無添加と同じく神経突起伸長促進の活性の効果は１日目（１２０８）、２日目（１２０９）とも確認できなかった。展開図（１２１６）は、スフィンゴ糖脂質群が完全に除去されていることを示している。この結果から、シモン芋エキスに含まれるグリコシルセラミド、ステロール配糖体、及びグリセロ糖脂質群はＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞の神経突起伸長を促進させる活性を有しないことが示された。
【０１６７】
また、スフィンゴ糖脂質分画を添加した細胞は、１日目（１２１０）、２日目（１２１１）とも、ＮＧＦ添加した細胞（１２０３）と同様に神経突起伸長促進の活性が観察された。展開図（１２１７）は、当該分画におけるスフィンゴ糖脂質群、並びに除去しきれずに混入したグリコシルセラミド、ステロール配糖体、及びグリセロ糖脂質群の一部の存在を示している。ここで、１２０８、１２０９の結果からグリコシルセラミド、ステロール配糖体、及びグリセロ糖脂質群はＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞の神経突起伸長を促進させる活性を有しないことから、当該分画における神経突起伸長促進の活性は当該分画におけるスフィンゴ糖脂質群によるものである。これは同時にエタノール抽出したシモン芋エキスにおいても実質的な神経突起伸長促進の活性はシモン芋由来のスフィンゴ糖脂質によるものであると解することができる。
【０１６８】
さらに、スフィンゴ糖脂質群の各バンドをそれぞれ個別にＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞に添加したが、植物性ＧＭ１近似物質Ｄを添加した細胞が、特に強くその作用があることが確認できた（１２１２、１２１３、また、他の各バンドのスフィンゴ糖脂質のデータは図示せず。）。展開図（１２１８）は、スフィンゴ糖脂質の中で植物性ＧＭ１近似物質のみが精製されていることを示している。これにより、シモン芋のスフィンゴ糖脂質の中でも、シモン芋に特有に見られた植物性ＧＭ１近似物質が強い神経突起伸長作用を有することが示された。
【０１６９】
以上の結果から、シモン芋由来の糖脂質の中でもスフィンゴ糖脂質が神経突起伸長作用に影響を与えていることが明らかとなった。また、その中でも植物性ＧＭ１近似物質に神経突起の伸長活性を有することが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【０１７０】
【図１】実施形態１の方法を説明するための図。
【図２】実施形態２の方法を説明するための図。
【図３】実施形態３の方法を説明するための図。
【図４】実施形態４の方法を説明するための図。
【図５】実施形態５の方法を説明するための図。
【図６】実施例３のシモン芋由来の糖脂質、及びスフィンゴ糖脂質の分析結果。
【図７】実施例４のシモン芋と他の食用植物におけるスフィンゴ糖脂質含有量の比較結果。
【図８】実施例５のシモン芋由来の糖脂質による神経芽細胞の神経突起の伸長活性。
【図９】実施例６のシモン芋由来の糖脂質によるＰＣ１２の神経突起様突起の伸長活性。
【図１０】実施例６のシモン芋由来の糖脂質によるＰＣ１２細胞のアセチルコリンエステラーゼ活性。
【図１１】実施例６のシモン芋由来の糖脂質によるＰＣ１２細胞の細胞増殖活性。
【図１２】実施例７の各サンプルの添加による神経芽細胞の神経突起の伸長活性と、各サンプルのＴＬＣ展開図。
【符号の説明】
【０１７１】
１２０１：無添加１日目のＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞
１２０２：無添加２日目のＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞
１２０３：ＮＧＦ添加後２日目のＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞
１２０４：水抽出シモン芋エキス添加後１日目のＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞
１２０５：水抽出シモン芋エキス添加後２日目のＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞
１２０６：エタノール抽出シモン芋エキス添加後１日目のＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞
１２０７：エタノール抽出シモン芋エキス添加後２日目のＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞
１２０８：除スフィンゴ糖脂質分画添加後１日目のＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞
１２０９：除スフィンゴ糖脂質分画添加後２日目のＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞
１２１０：スフィンゴ糖脂質分画添加後１日目のＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞
１２１１：スフィンゴ糖脂質分画添加後２日目のＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞
１２１２：精製した植物性ＧＭ１近似物質添加後１日目のＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞
１２１３：精製した植物性ＧＭ１近似物質添加後２日目のＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞
１２１４：水抽出シモン芋エキスのＴＬＣ展開図
１２１５：エタノール抽出シモン芋エキスのＴＬＣ展開図
１２１６：除スフィンゴ糖脂質分画のＴＬＣ展開図
１２１７：スフィンゴ糖脂質分画のＴＬＣ展開図
１２１８：精製した植物性ＧＭ１近似物質のＴＬＣ展開図
Ａ：グリコシルセラミド、ステロール配糖体、及びグリセロ糖脂質群
Ｂ：除去しきれなかったＡの各物質
Ｃ：スフィンゴ糖脂質群
Ｄ：植物性ＧＭ１近似物質
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シモン芋由来の糖脂質を含有するシモン芋エキス、ならびにシモン芋由来のスフィンゴ糖脂質の製造方法と、それらを含む神経活性化剤等並びに健康食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、日本は本格的な高齢化時代に突入しようとしている。老化は人体に様々な影響を与えるが、中でも老人性痴呆や脳血管障害、神経障害等の老化に伴う脳や神経機能の低下や疾患は、今後の大きな問題となることが予想される。このような問題の対策としては、一つに老化に伴う脳や神経機能の低下の予防がある。予防には日々の適度な運動や読書等による脳への刺激のような生活習慣的な予防方法の他に、神経の機能改善や機能低下防止等の作用を有する医薬品の服用のような医学的な予防方法がある。また、医薬品と類似の作用が期待でき、かつ日々の摂取が可能な飲食品の摂取も挙げられる。この神経機能や学習行動を改善する医薬品や飲食品の有効成分として、近年ガングリオシドが注目されている。
【０００３】
ガングリオシドは、シアル酸を有するスフィンゴ糖脂質の総称である。その構造はスフィンゴシンと脂肪酸がアミド結合したセラミドと呼ばれる脂質にグルコース、ガラクトース、シアル酸等の糖鎖が結合したものであり、この糖鎖の種類によって多数の分子種が存在する。ガングリオシドは種々の細胞膜上に存在し、細胞分化や増殖、情報伝達、神経機能等において様々な生理機能を果たすことが明らかになっている。
【０００４】
ガングリオシドは動物の脳や神経組織に比較的多量に含まれている。したがって、従来のガングリオシドを得る方法は、特許文献４のように牛、豚、羊等の家畜の脳をはじめとする動物組織からエタノール等を用いて抽出する方法が一般的であった。ところが、近年、ＢＳＥ（牛海綿状脳症）が国際問題化したことによって家畜の脳からのガングリオシドの抽出は、ＢＳＥの原因である異常型プリオンタンパク質の混入する危険性が生じてきた。そこで、家畜の脳に代わる人体に安全なガングリオシドの原料が求められていた。
【特許文献１】特開平９−３０１８７４
【特許文献２】特開平１０−１０１５６８
【特許文献３】特開平１１−２４６４１８
【特許文献４】特開平１０−２１８８９２
【特許文献５】特開２００３−６１６１６
【特許文献６】特開２００５−２７５３４
【非特許文献１】Ｈａｄｊｉｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｏｕ Ｍ & Ｎｅｆｆ Ｎ．Ｈ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，（１９８８）５１（４），１１９０−６．
【非特許文献２】Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ Ｊ．Ｓ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．，（１９９２） ３１（１），１１２−９．
【非特許文献３】Ｓｈｉｂａｈａｒａ Ｓ．，ｅｔ ａｌ．， Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（２０００） ３３， ２４７−５１．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、家畜の脳に代わる人体に安全なガングリオシドの代替原料を提供することである。本発明の更なる課題は、前記ガングリオシドの代替原料を提供するために、その製造方法を提供することである。本発明の他の課題は、前記ガングリオシドの代替原料から製造されたガングリオシド代替物を含有する製品を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記課題を解決するためにガングリオシドの代替原料を人体に安全であり、また入手が比較的容易な植物に求めた。植物組織は通常糖脂質としてグリセロ糖脂質を多量に含有しており、スフィンゴ糖脂質は微量にしか存在しない。また、植物性スフィンゴ糖脂質のほとんどは、前記ガングリオシドからシアル酸残基が欠如した構造をもつアシアロガングリオシドとして存在している。このアシアロガングリオシドが動物細胞に対してガングリオシドと同様の作用を有するという報告はない。そのため、これまで植物組織が、動物性ガングリオシドの代替原料として注目されることはなかった。
【０００７】
しかし、本発明者らが鋭意探索した結果、シモン芋が他の植物と比較して多量のスフィンゴ糖脂質を含有することを見出した。シモン芋（Ｉｐｏｍｏｅａ ｂａｔａｔａｓ sp.）は、サツマ芋に近似するブラジル原産のヒルガオ科の植物で、白甘藷、白サツマ芋、又はカイアポ芋とも呼ばれている。従来からシモン芋の葉や茎にはカリウムやカルシウム等のミネラルの他、各種ビタミンが豊富に含まれていることが知られており、特許文献５又は６のように、シモン芋の葉や茎の乾燥粉末、乾燥物、搾汁液が健康食品として使用されている。ただし、これまでシモン芋の利用法としては、葉や茎を凍結乾燥した後、粉末化したものを単にカプセルに充填する等して利用する方法、搾汁液をそのまま飲用する方法、あるいは茶のように乾燥物を温水に浸漬した後にその抽出液を利用する方法がほとんどであり、特定の成分を抽出する方法は知られていなかった。
【０００８】
本発明者らは、さらに鋭意努力した結果、シモン芋由来の糖脂質、及びスフィンゴ糖脂質が動物請ガングリオシドのように動物の神経芽細胞等の神経突起を伸長促進する神経細胞の活性化作用を有することを見出した。前述のように植物性のスフィンゴ糖脂質が神経細胞の活性化する作用を有することはこれまでに報告はない。
【０００９】
本発明は、係る事実に基づいて完成された家畜の脳に代わる人体に安全なガングリオシドの代替原料としてのシモン芋由来の糖脂質、及びスフィンゴ糖脂質の提供と、それらをシモン芋から製造する方法等に関する。また、当該糖脂質やスフィンゴ糖脂質を含む健康食品、及び神経細胞活性化剤等に関する。すなわち、以下の発明を提供する。
【００１０】
（１）本発明は、シモン芋を極性溶媒中に浸たす浸漬工程と、前記浸漬工程で得られる浸漬液を濃縮する濃縮工程と、からなるシモン芋由来の糖脂質を含有するシモン芋エキスを製造するシモン芋エキス製造方法を提供する。
【００１１】
（２）本発明は、前記浸漬工程にて浸漬する前に、シモン芋を乾燥させる乾燥工程をさらに有するシモン芋エキス製造方法を提供する。
【００１２】
（３）本発明は、（１）、又は（２）の最初の工程でシモン芋の塊根を断片化する断片化工程をさらに有するシモン芋エキス製造方法を提供する。
【００１３】
（４）本発明は、前記濃縮工程が濃縮することにより得られる液状シモン芋エキスを乾燥させて固体状シモン芋エキスを得る工程であるシモン芋エキス製造方法を提供する。
【００１４】
（５）本発明は、前記（１）から（４）のいずれか一に記載のシモン芋エキス製造方法により得られるシモン芋エキスにアルカリ溶液を加えてグリセロ糖脂質を加水分解する加水分解工程と、前記加水分解工程で得られた加水分解溶液にクロロホルムと水を加えて混合した後、クロロホルム溶液を取得するクロロホルム溶液取得工程と、前記クロロホルム溶液取得工程で取得されたクロロホルム溶液からクロロホルムを除去してシモン芋由来のスフィンゴ糖脂質を取得するスフィンゴ糖脂質取得工程とからなるシモン芋由来のスフィンゴ糖脂質製造方法を提供する。
【００１５】
（６）本発明は、シモン由来の糖脂質を動物に投与して、神経細胞を活性化させる神経細胞活性化方法を提供する。
【００１６】
（７）本発明は、前記（１）から（４）のいずれか一に記載の方法で得られるシモン芋エキスに含まれる糖脂質を動物に投与して神経細胞を活性化させる神経細胞活性化方法を提供する。
【００１７】
（８）本発明は、シモン芋由来のスフィンゴ糖脂質を動物に投与して神経細胞を活性化させる神経細胞活性化方法を提供する。
【００１８】
（９）本発明は、前記（５）に記載の方法で得られるシモン芋由来のスフィンゴ糖脂質を動物に投与して神経細胞を活性化させる神経細胞活性化方法を提供する。
【００１９】
（１０）本発明は、シモン芋由来の糖脂質を有効成分として含む神経細胞を活性化する神経細胞活性化剤を提供する。
【００２０】
（１１）本発明は、前記シモン芋由来の糖脂質は前記（１）から（４）のいずれか一に記載の方法で得られるシモン芋エキスに含まれる糖脂質を有効成分として含む神経細胞を活性化する神経細胞活性化剤を提供する。
【００２１】
（１２）本発明は、シモン芋由来のスフィンゴ糖脂質を有効成分として含む神経細胞を活性化する神経細胞活性化剤を提供する。
【００２２】
（１３）本発明は、前記シモン芋由来のスフィンゴ糖脂質が前記（５）に記載の方法で得られるスフィンゴ糖脂質を有効成分として含む神経細胞を活性化する神経細胞活性化剤を提供する。
【００２３】
（１４）本発明は、前記（１）から（４）のいずれか一に記載の方法で得られるシモン芋エキスを含む健康食品を提供する。
【発明の効果】
【００２４】
本発明のシモン芋エキス製造方法によれば、シモン芋由来の糖脂質を含有するシモン芋エキスをシモン芋から大量に効率よく製造することができる。
【００２５】
本発明のシモン芋由来のスフィンゴ糖脂質製造方法によれば、シモン芋エキスからシモン芋由来のスフィンゴ糖脂質を効率よく製造することができる。
【００２６】
本発明のシモン芋由来の糖脂質又はスフィンゴ糖脂質は、神経細胞活性化作用を有することから、当該糖脂質又はスフィンゴ糖脂質を動物に投与することで、脳、及び神経の機能増進や機能改善ができる。
【００２７】
本発明によれば、シモン芋由来の糖脂質又はスフィンゴ糖脂質を有効成分とする神経細胞活性化作用剤を提供できる。特に本発明のスフィンゴ糖脂質は、神経細胞活性化作用を効能とする医薬として利用可能にすることができる。これは、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、脳卒中後遺症等の脳疾患、又は神経疾患を有する患者達に対して安全性の高い医薬品となり得る。
【００２８】
本発明のシモン芋由来の糖脂質を利用すれば、ＢＳＥの危険性が無く、日々摂取可能な安全性の高い飲食品を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
以下に、各発明を実施するための最良の形態を説明する。なお、本発明はこれらの実施の形態に何ら限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において、種々なる様態で実施しうる。
【００３０】
実施形態１は、請求項１等について説明する。実施形態２は、請求項２等について説明する。実施形態３は、請求項３等について説明する。実施形態４は、請求項４等について説明する。実施形態５は、請求項５等について説明する。実施形態６は、主に請求項６から１３について説明する。実施形態７は、主に請求項１４ついて説明する。
【００３１】
<<実施形態１>>
【００３２】
<実施形態１：概要> 実施形態１について説明する。本実施形態は、シモン芋由来の糖脂質を含有するシモン芋エキス製造方法を提供する。本実施形態はシモン芋から糖脂質を溶出させるために極性溶媒中に浸たし、それによって得られる浸漬液を濃縮することで当該糖脂質を含有するシモン芋エキスを得ることを特徴とする。
【００３３】
<実施形態１：構成> 以下、本実施形態の各工程の構成について説明する。
【００３４】
「浸漬工程」（Ｓ０１０１）は、シモン芋を極性溶媒中に浸たして、シモン芋中に含まれる糖脂質を当該溶媒中に抽出する工程である。
【００３５】
「極性溶媒」とは、電荷の偏りを持つ極性分子からなる溶媒である。例えば、アルコール、ベンゼン、若しくはトルエン等の極性有機溶媒、水、又はそれらの組み合わせによる混合液が該当する。当該浸漬工程に使用する極性溶媒の種類や組み合わせは問わない。ただし、抽出に使用した極性溶媒が最終産物のシモン芋エキス中に残存する場合であって、かつ人体に対して使用する場合には人体に対して毒性が非常に低いエタノールか、エタノール濃度が６０％以上の水との混合液を使用することが好ましい。糖脂質をより効率よく抽出するためには、１００%エタノール（通常は水が僅かに混在し、９９．５％となっている。）を使用することがより好ましい。
【００３６】
本発明で「糖脂質」とは、特に断りのない限り植物細胞内で生合成された植物性糖脂質を意味する。
【００３７】
シモン芋は、極性溶媒中に浸たす前に水等で洗浄し、表面に付着した土やゴミ等を十分に除去しておくことが望ましい。また、本実施形態に用いるシモン芋は塊根に限らない。例えば葉であってもよいし、茎であってもよいし、塊根状でない根であってもよい。
【００３８】
極性溶媒の分量は、使用するシモン芋の重量に対する当該極性溶媒の容量（容量／重量：Ｖ／Ｗ）が２倍から１０倍の範囲になるようにことが好ましい。例えば、極性溶媒がエタノールであって、Ｖ／Ｗが３倍の場合には、１５０ｍｌのエタノールに対してシモン芋５０ｇを用いることになる。ただし、この範囲に限定はされない。
【００３９】
シモン芋中に含まれる糖脂質を極性溶媒中に短時間でより効率よく抽出するために、当該極性溶媒を加熱してもよい。このとき当該極性溶媒の温度は、糖脂質が加熱で変性しない範囲、かつ使用する極性溶媒の取扱い上で安全性に問題のない範囲であれば特に問わない。当該糖脂質を抽出する上で効率のよい温度は極性溶媒の種類によって異なるが、例えば、エタノールを極性溶媒とする場合は５５℃から６５℃の範囲が好ましい。
【００４０】
極性溶媒を加熱する方法は、極性溶媒の温度を指定する温度付近まで加熱できる方法であれば特に問わない。例えば、温度調節装置が設置された恒温槽内でヒーター等の熱源によって加熱してもよいし、容器に入れて直火、若しくは湯煎によって火力を調節しながら加熱してもよい。また、シモン芋の浸漬と極性溶媒の加熱の順序は問わない。例えば、指定する温度まで極性溶媒を加熱した後にシモン芋を浸漬してもよいし、室温状態の極性溶媒にシモン芋を浸漬して指定する温度まで加熱してもよい。
【００４１】
当該極性溶媒全体の温度、及び濃度を均一化するために、加熱と共に当該極性溶媒の撹拌を行ってもよい。撹拌方法は、例えば、撹拌棒で撹拌してもよいし、撹拌装置を用いて撹拌してもよい。
【００４２】
シモン芋由来の糖脂質を十分に抽出するための浸漬の時間は、抽出するシモン芋の状態、極性溶媒の種類、極性溶媒の温度に依存する。例えば、常温のエタノールに生のシモン芋塊根を浸漬する場合は１０ヶ月以上を要するが、６０℃に加熱したエタノールに乾燥したシモン芋塊根の小片を浸漬する場合には約３時間でよい。また、乾燥したシモン芋の葉であれば６０℃のエタノールに約３0分浸漬すればよい。
【００４３】
「濃縮工程」（Ｓ０１０２）は、前記浸漬工程で得られる浸漬液から浸漬に用いた極性溶媒を減じ、浸漬液中に含まれるシモン芋由来の糖脂質の濃度を高める工程である。当該工程によってシモン芋由来の糖脂質を含有するシモン芋エキスを得る。
【００４４】
「浸漬液」は、前記浸漬工程後に糖脂質や、シモン芋から抽出される糖脂質をはじめとした各種成分を含有する極性溶媒より、シモン芋塊根の小片等の固形物を取り除いて得られる液体である。主だった固形物を取り除いた後に固形物の微小な粒子が当該浸漬液中に残存していても構わない。浸漬液を取り出す方法は、固形物を除去できる方法であれば特に問わない。例えば、前記浸漬工程後に得られるシモン芋と極性溶媒との混合物を濾過して固形物を除去してもよいし、当該混合物を遠心分離して、若しくは静置して固形物を沈殿させた後にその上清を取り出してもよいし、又はそれらの組み合わせであってもよい。
【００４５】
「シモン芋エキス」は、前記浸漬液から浸漬に用いた極性溶媒の大部分を除去して浸漬液中に存在するシモン芋由来の糖脂質の濃度を高めた液体である。糖脂質の濃度が、浸漬液の濃度よりも高ければ当該糖脂質の濃度は問わないが、好ましくは浸漬液の5倍以上の濃度、さらに好ましくは10倍以上の濃度である。
【００４６】
当該シモン芋エキスを得る方法は、濃縮過程において糖脂質の性質を変えないで浸漬液から極性溶媒を除去できる方法であれば特に問わない。例えば、エバポレーターを用いた蒸発濃縮法でもよいし、極性溶媒を風乾等で蒸発させる自然蒸発濃縮法でもよいし、浸漬液の冷却による濃縮法でもよい。
【００４７】
前記浸漬液の冷却による濃縮法とは、糖脂質が低温化で析出して沈殿する性質を利用した濃縮法である。例えば、極性溶媒がエタノールの場合、０℃以下に冷却することで当該浸漬液中の糖脂質が析出する。これを静置するか、若しくは冷却遠心して上清の全て、あるいは大部分を除去した後、沈殿した糖脂質を残った極性溶媒か、若しくは懸濁用に新たに加える極性溶媒で再懸濁する方法であってもよい。当該浸漬液の冷却による濃縮法で実施形態４に詳述する固体状シモン芋エキスを製造する場合には、沈殿した糖脂質を再懸濁する必要はない。当該工程により、浸漬液中に存在する糖脂質、遊離脂肪酸等の他、浸漬に使用した極性溶媒に抽出可能な成分を濃縮できる。
【００４８】
本実施形態で得られるシモン芋エキスは、シモン芋由来の糖脂質を含有する。当該シモン芋エキスに糖脂質が含まれる事実は、当該シモン芋エキスを薄層クロマトグラフィー（Ｔｈｉｎ−Ｌａｙｅｒ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：以下ＴＬＣとする。）上で展開した後、アンスロン硫酸で糖脂質を呈色する実験によって確認できる。アンスロン硫酸は糖脂質の糖鎖を構成するヘキソースを紫色に発色させることから、糖脂質の検出に広く使用されている試薬である。ＴＬＣで展開した物質が紫色に呈色すれば粗精製したサンプル内糖脂質が含まれることを意味する。
【００４９】
<実施形態１：方法> 図１は実施形態１の方法の一例を示したものである。この図に示すように、本実施形態の方法は、まず、シモン芋を極性溶媒中に浸たす（浸漬工程：Ｓ０１０１）。次に、前記浸漬工程で得られる浸漬液を濃縮する（濃縮工程：Ｓ０１０２）。以上の製造工程によって、シモン芋由来のシモン芋エキスを得る。
【００５０】
<実施形態１：効果> 本実施形態の方法によれば、シモン芋に含まれる糖脂質を極性溶媒中に抽出して濃縮することで、シモン芋エキスとして得ることができる。当該方法で得られたシモン芋エキスは、健康食品や神経細胞活性化剤を製造する上での原料として利用することができる。
【００５１】
<<実施形態２>>
【００５２】
<実施形態２：概要> 実施形態２について説明する。本実施形態は、シモン芋由来の糖脂質を含有するシモン芋エキス製造方法を提供する。当該方法は、前記実施形態１を基本とし、前記浸漬工程前にシモン芋を乾燥させる乾燥工程をさらに有することを特徴とする。
【００５３】
<実施形態２：構成> 実施形態２は、前記実施形態1を基本とする。したがって、本実施形態における方法の各工程の構成に関して、浸漬工程（Ｓ０２０２）と濃縮工程（Ｓ０２０３）については前記実施形態１と同様であることからそれらの説明は省略し、ここでは本実施形態に特徴的な乾燥工程についてその構成について以下で説明をする。
【００５４】
「乾燥工程」（Ｓ０２０１）は、シモン芋を乾燥させる工程である。本工程の「乾燥」とは、シモン芋中に含まれる水分を減ずることを言う。当該乾燥により、シモン芋中に含まれる水分を前記浸漬工程前に減じることにより前記極性溶媒がシモン芋組織内に浸透し易くなることから、脂質成分を極性溶媒中に短時間で効率よく抽出することができる。また、前記極性溶媒がエタノールである場合には、当該乾燥により、シモン芋組織内に浸透したエタノールの含水率が高くならない。すなわち、浸透したエタノールが細胞内の水分によって薄まらない。したがって、脂質成分をエタノール中に効率よく抽出することができる。
【００５５】
乾燥の方法は、シモン芋中に含まれる水分を減じることができれば特には問わない。例えば、外気に晒して放置するだけの自然乾燥法でもよいし、除湿剤とともに密閉容器内に入れて乾燥する除湿乾燥法でもよいし、晴天の昼間に日光と外気に当てて乾燥させる天日干し法でもよいし、送風装置等を用いて温風や冷風を当てる風乾燥法でもよいし、ヒーター等の熱源を用いた加熱乾燥法でもよいし、容器内で真空ポンプ等を用いて脱気する真空乾燥法でもよいし、シモン芋を凍らせたままの状態で乾燥する凍結乾燥（フリーズドライ）法でもよいし、又はそれらの組み合わせであってもよい。シモン芋中に含まれる糖脂質の性質を維持するためには凍結乾燥法が好ましい。これは、凍結乾燥法が低温で昇華により水分を除去することから、糖脂質の性質がほとんど変化しないためである。
【００５６】
シモン芋の乾燥時間は、前記乾燥方法や実施形態３で詳述する断片化工程後のシモン芋の状態によって適宜変えればよい。例えば、スライスした塊根を天日干し法で乾燥する場合は、冬季の晴天日の直射日光下で２週間から３週間程度乾燥することが好ましい。また、小片化した塊根を凍結乾燥法で乾燥する場合には−５０℃下で６時間以上乾燥することが好ましく、−５０℃下で24時間以上乾燥すればさらに好ましい。
【００５７】
当該工程によりシモン芋の含水率を乾燥前よりも９０％以下にすればよい。好ましくは、シモン芋の含水率を２０％以下にすることである。
【００５８】
本実施形態で得られるシモン芋エキスは、シモン芋由来の糖脂質を含有する。この事実は、前記実施形態１で述べた実験方法と同様の方法によって確認できる。実験の詳細な方法、及び実験結果は実施例１及び２と同様であることから、ここではその説明を省略する。
【００５９】
<実施形態２：方法> 図２は実施形態２の方法の一例を示したものである。まずシモン芋を乾燥させる（乾燥工程：Ｓ０２０１）。これ以降は実施形態１と同様である。すなわち、次に浸漬工程（Ｓ０２０２）を行い、続いて濃縮工程（Ｓ０２０３）を行う。以上の製造工程によって、シモン芋由来のシモン芋エキスを得る。
【００６０】
<実施形態２：効果> 本実施形態によれば、乾燥工程でシモン芋を乾燥して細胞内の水分を除去することによって、次に続く浸漬工程でシモン芋の細胞内部にまで極性溶媒が容易に浸透できる。これにより、極性溶媒中にシモン芋由来の糖脂質を効率よく抽出できる。
【００６１】
<<実施形態３>>
【００６２】
<実施形態３：概要> 実施形態３について説明する。本実施形態は、シモン芋由来の糖脂質を含有するシモン芋エキス製造方法を提供する。本実施形態のシモン芋由来のシモン芋エキス製造方法は、前記実施形態１又は２を基本とし、最初の工程としてシモン芋の塊根を断片化する断片化工程をさらに有することを特徴とする。
【００６３】
<実施形態３：構成> 実施形態３は、前記実施形態1又は２を基本とする。したがって、本実施形態において乾燥工程（Ｓ０３０２）と浸漬工程（Ｓ０３０３）と濃縮工程（Ｓ０３０４）については実施形態２と同様であることからそれらの説明は省略し、ここでは本実施形態に特徴的な断片化工程（Ｓ０３０１）の構成について以下で説明をする。
【００６４】
本実施形態ではシモン芋の塊根を用いる。「塊根」とは、シモン芋の根部に様々な栄養成分が蓄積されることで芋状となったものである。
【００６５】
「断片化工程」（Ｓ０３０１）とは、シモン芋の塊根を断片化する工程である。ここで言う「断片化」とは、シモン芋の塊根を切裁により小片にする意味に留まらず、塊根の内部組織を外部に露出させることを意味する。例えば、シモン芋の塊根表皮を剥離してもよいし、塊根をブロック状に切裁してもよいし、塊根をスライスしてもよいし、塊根を細切りにしてもよいし、塊根をすりおろしてもよいし、塊根を粉砕してもよいし、塊根を潰してもよいし、またそれらの組み合わせであってもよい。なお、塊根表皮を剥離した場合には当該表皮部分も含み、また、塊根を潰した場合には当該処理によって得られる搾汁液も含むものとする。当該断片化工程により塊根の内部組織を外部に露出させて、前記極性溶媒に直接触れる面積を大きくすることで、シモン芋の塊根に含有する糖脂質等の極性溶媒中への抽出効率を高めることができる。
【００６６】
本実施形態で得られるシモン芋エキスは、シモン芋由来の糖脂質を含有する。この事実は、前記実施形態１で述べた実験方法と同様の方法によって確認できる。実験の詳細な方法、及び実験結果は実施例１及び２に詳述するため、ここではその説明を省略する。
【００６７】
<実施形態３：方法> 図３は実施形態３での方法の一例を示したものである。この図で示す本実施形態の方法は、実施形態２の方法を基本としている。まずシモン芋の塊根を断片化する（断片化工程：Ｓ０３０１）。これ以降は実施形態２と同様である。すなわち、次に乾燥工程（Ｓ０３０２）を行い、続いて浸漬工程（Ｓ０３０３）を行う。そして最後に濃縮工程（Ｓ０２０４）を行う。以上の製造工程によって、シモン芋由来のシモン芋エキスを得る。
【００６８】
<実施形態３：効果> 本実施形態によれば、シモン芋を断片化して切断面を露出させることにより、シモン芋由来の糖脂質等をより多量に、より効率よく抽出することが可能となる。したがって、簡便かつ多量にシモン芋由来の糖脂質等を製造する上で有効である。
【００６９】
<<実施形態４>>
【００７０】
<実施形態４：概要> 実施形態４について説明する。本実施形態は、シモン芋由来の糖脂質を含有する固体状のシモン芋エキス製造方法の提供である。本実施形態のシモン芋エキス製造方法は、前記実施形態１から３のいずれか一の濃縮工程方法で得られる液状シモン芋エキスを乾燥させて固体状シモン芋エキスを得ることを特徴とする。
【００７１】
<実施形態４：構成> 実施形態４は、その前処理としてシモン芋由来のシモン芋エキスを得るために前記実施形態1から３のいずれか一を基本とする。本実施形態において断片化工程（Ｓ０４０１）と、乾燥工程（Ｓ０４０２）と、浸漬工程（Ｓ０４０３）と、については実施形態３と同様であることからそれらの説明は省略し、ここでは本実施形態に特徴的な濃縮工程（Ｓ０４０４）の構成について以下で説明をする。
【００７２】
「濃縮工程」（Ｓ０４０４）は、実施形態１から３のいずれか一の方法で得られる液状シモン芋エキスを乾燥させて固体状シモン芋エキスを得る工程である。
本工程の「乾燥」は、前記乾燥工程（Ｓ０２０１）の乾燥とは水分以外の液体も減じる点と乾燥させる対象が異なる。すなわち、本工程の「乾燥」では、シモン芋エキス中に溶解している糖脂質を固体として取りだすために、シモン芋エキス中に存在する水分、又は糖脂質の抽出に使用した極性溶媒等の液体を除去することを言う。ただし、液体の完全除去は必要ではなく、固体状になるか、又は含液体率（シモン芋エキスの完全乾燥重量に対する当該液体の割合）が２０％以下となればよい。
【００７３】
当該工程で液状シモン芋エキスを乾燥する方法は、液状シモン芋エキス中、若しくは実施形態１に記載の浸漬液の冷却よって得られる糖脂質の沈殿中に存在する水分、又は糖脂質の抽出に使用した極性溶媒等を除去することができ、さらにシモン芋エキス中の糖脂質が分解等の性質上の変化を生じない方法であれば特に問わない。例えば、外気に晒して放置するだけの自然乾燥法でもよいし、除湿剤とともに密閉容器内に入れる除湿乾燥法でもよいし、晴天の昼間に外気に晒して乾燥させる天日干し法でもよいし、送風装置等を用いて温風や冷風を送り乾燥させる風乾燥法でもよいし、ヒーター等の熱源を用いた加熱乾燥法でもよいし、容器内で真空ポンプ等を用いて脱気する真空乾燥法でもよいし、シモン芋エキスを凍結後に減圧下で乾燥する凍結乾燥（フリーズドライ）法でもよいし、シモン芋エキスを熱風と共に噴霧し極性溶媒のみを蒸発させる噴霧乾燥法でもよいし、またそれらの組み合わせであってもよい。
【００７４】
好ましくは凍結乾燥法がよい。これは、当該方法が低温で昇華により水分を除去することから、シモン芋中に含まれる糖脂質の性質の変化が少ないためである。当該方法で乾燥する場合、例えば、５０ｍｌのシモン芋エキスをトレイに流し入れ、凍結乾燥装置にて−５０℃で１２時間以上、好ましくは−５０℃で２４時間以上凍結乾燥処理を行うことで、シモン芋エキスの乾燥物を得ることができる。もちろん凍結乾燥の温度や時間はこの条件に限られない。
【００７５】
当該糖脂質を実施形態６、又は７で詳述する神経細胞活性化剤、又は健康食品として使用する場合には、賦形剤等を添加して乾燥させてもよい。
【００７６】
当該工程で得られた乾燥物は必要に応じて粉砕する。粉砕方法は、目的とする粒子サイズに粉砕できれば特に問わない。例えば回転歯による粉砕機を用いてもよいし、ミル（ｍｉｌｌ）を用いてもよいし、人が乳鉢等ですりつぶしてもよいし、又はその組み合わせであってもよい。粉砕した乾燥物の粒子形状は問わない。例えば、不定形であってもよいし、球形に近似の形状であってもよい。また、粒子サイズも約５ミリ以下であれば特に問わない。例えば、顆粒サイズであってもよいし、微粉サイズであってもよい。
【００７７】
本実施形態で得られる固体状シモン芋エキスは、シモン芋由来の糖脂質を含有する。この事実を証明する実験結果は実施例１とほとんど同様であることから、ここではその説明を省略する。
【００７８】
<実施形態４：方法> 図４は実施形態４での方法の一例を示したものである。この図で示す本実施形態の方法は、前記実施形態３の方法を基本としている。すなわち、まず断片化工程（Ｓ０４０１）を行い、次に乾燥工程（Ｓ０４０２）を行い、続いて浸漬工程（Ｓ０４０３）を行い、そして濃縮工程（Ｓ０４０４）を行い、液状シモン芋エキスを得る。ここまでは前記実施形態３と同様である。本実施形態では当該濃縮工程でさらに液状シモン芋エキスを乾燥させて固体状にする点で実施形態３と異なる。以上の工程によって、固体状のシモン芋由来のシモン芋エキスを得る。
【００７９】
<実施形態４：効果> 本実施形態によれば、液状シモン芋エキスを乾燥して固体状にすることにより保存性を高めることができる。また、液状に比べて携帯性にも優れている、さらに、実施形態６、又は７で詳述する神経細胞活性化剤、又は健康食品として錠剤や粉末剤に加工する上でも便利である。
【００８０】
<<実施形態５>>
【００８１】
<実施形態５：概要> 実施形態５について説明する。本実施形態は、実施形態１から４のいずれか一の方法で得られるシモン芋エキスから、さらにスフィンゴ糖脂質を高濃度に精製するシモン芋由来のスフィンゴ糖脂質製造方法の提供を特徴とする。
【００８２】
<実施形態５：構成> 本実施形態は、その前処理としてシモン芋由来の糖脂質を含むシモン芋エキスを得るために前記実施形態1から４のいずれか一を基本とする。したがって、本実施形態において断片化工程（Ｓ０５０１）と乾燥工程（Ｓ０５０２）と浸漬工程（Ｓ０５０３）と濃縮工程（Ｓ０５０４）とについては実施形態1から４のいずれか一と同様であることからそれらの説明は省略し、ここでは本実施形態に特徴的な加水分解工程（Ｓ０５０５）とクロロホルム溶液取得工程（Ｓ０５０６）とスフィンゴ糖脂質取得工程（Ｓ０５０７）とについて、それらの構成を以下で説明をする。
【００８３】
「加水分解工程」（Ｓ０５０５）は、前記実施形態1から４のいずれか一の方法で得られたシモン芋由来のシモン芋エキスにアルカリ溶液を加え、シモン芋エキス中に含まれるグリセロ糖脂質をアルカリ溶液によって加水分解する工程である。加水分解によってシモン芋エキス中のグリセロ糖脂質は、脂肪酸とグリセリンに分解される。
【００８４】
「アルカリ溶液」は、アルカリを極性溶媒で溶解した溶液である。本実施形態におけるアルカリ溶液は、例えば水酸化ナトリウム溶液又は水酸化カリウム溶液等を用いることができる。また極性溶媒としては、例えば、水、若しくはメタノールやエタノール等の低級アルコールを用いることができる。本実施形態におけるアルカリ溶液のアルカリ濃度、及び加える容量は、溶液中のアルカリの量が前記シモン芋エキス中に含まれるグリセロ糖脂質を完全に加水分解できるケン化価を有していればよい。
【００８５】
シモン芋エキスが液状の場合にはアルカリ溶液を加える前に、当該シモン芋エキスがペレット状の残滓になるまでシモン芋エキス中の極性溶媒を除去する処理を行ってもよい。除去する方法は、例えば実施形態４の濃縮工程で用いた乾燥方法と同様の方法であってもよい。
【００８６】
加水分解反応を促進するために、当該シモン芋エキスとアルカリ溶液の混合溶液を加熱してもよい。加熱温度は３０℃から５０℃の範囲が好ましい。加水分解反応の時間は温度に依存する。すなわち、低温ほど長くする。例えば、３７℃であれば２時間、５０℃であれば１時間のように適宜調整すればよい。
【００８７】
「クロロホルム溶液取得工程」（Ｓ０５０６）は、前記加水分解工程後の混合溶液にクロロホルムと水を加えて混合した混合液を、上層の水層と下層のクロロホルム層の２層に分離後、下層のクロロホルム層を回収する工程である。この工程により水層に移行したシモン芋由来のシモン芋エキス中に含まれる水溶性物質は除去される。ここで、脂肪酸とグリセリンは水溶性であることから、前記加水分解工程で加水分解されたグリセロ糖脂質は、当該工程で水層に移行し、除去されることになる。
【００８８】
本工程で、加水分解工程後の混合溶液にクロロホルムと水を加える際の容量比は、例えば、前記加水分解工程後の混合溶液の容量：クロロホルムの容量：水の容量は、容量比で４：８：３が好ましいが、これに限られない。混合の方法は、加水分解工程後の混合溶液とクロロホルムと水が十分に撹拌できれば手段は問わない。例えば、撹拌棒やスタラーバーによる撹拌装置を用いてもよいし、溶液を入れた容器に反転、回転、振動等を与える撹拌装置を用いてもよいし、手を用いて撹拌や反転等を与えてもよい
【００８９】
水層とクロロホルム層に分離するには、前記工程後に容器を静置するか、遠心機を用いて軽く遠心を行えばよい。分離時の温度は１０℃から３８℃の範囲であればよい。また、２層に分離した後、クロロホルム層を回収する方法は問わない。例えば、水面から管を通して下層のみを回収してもよいし、容器下部に設けたドレンコックを開いて下層のみを回収してもよい。
【００９０】
「スフィンゴ糖脂質取得工程」（Ｓ０５０７）は、前記クロロホルム溶液取得工程で得られたクロロホルム溶液からクロロホルムを除去することでシモン芋由来のスフィンゴ糖脂質を含む粗精製物を得る工程である。
【００９１】
クロロホルムを除去する方法は、クロロホルムのみを除去できる方法であれば特には問わない。例えばクロロホルムの蒸発による除去であってもよい。この時、送風や撹拌によってクロロホルムの蒸発を促進するようにしてもよい。除去後に得られる残滓をシモン芋由来のスフィンゴ糖脂質を含む粗精製物とする。当該粗精製物の状態は問わない。例えば、粘性のあるスラッジ状であってもよいし、粉末状であってもよいし、塊になっていてもよい。また、残滓をエタノール等の溶媒に再溶解してもよい。
【００９２】
本実施形態の方法で得られる粗精製物は、シモン芋由来のスフィンゴ糖脂質を高濃度で含んでいる。本実施形態の方法で得られるスフィンゴ糖脂質は、本実施形態で得られた試料をＴＬＣ上で展開した後、アンスロン硫酸で処理して糖脂質の検出することでアシアロガングリオシドとして確認できる。動物のガングリオシドの検出試薬としては、通常レゾルシノールが使用されるが、レゾルシノールはガングリオシドが有するシアル酸を発色させる試薬である。前述のように植物ではスフィンゴ糖脂質のほとんどがシアル酸残基を欠如したアシアロガングリオシドとして存在するため、レゾルシノールではシモン芋のスフィンゴ糖脂質を検出できない。そこで、シモン芋由来のスフィンゴ糖脂質はアシアロガングリオシドとみなして、アンスロン硫酸で検出する。当該実験の結果は実施例２、及び３に詳述するため、ここではその説明を省略する。
【００９３】
<実施形態５：方法> 図５は実施形態５の方法の一例を示したものである。図５で示す本実施形態の方法は、実施形態３の方法を基本としている。すなわち、まず断片化工程（Ｓ０５０１）を行い、次に乾燥工程（Ｓ０５０２）を行い、続いて浸漬工程（Ｓ０５０３）を行い、そして濃縮工程と（Ｓ０５０４）を行いシモン芋由来のシモン芋エキスを得る。ここまでは実施形態３と同様である。本実施形態では、さらに以下の工程を有する。まず、前記シモン芋由来のシモン芋エキスにアルカリ溶液を加えてグリセロ糖脂質を加水分解する（加水分解工程：Ｓ０５０５）。次に、クロロホルムと水を加えて混合した後、クロロホルム溶液層を取り出す（クロロホルム溶液取得工程：Ｓ０５０６）。最後に、クロロホルムを除去してシモン芋由来のスフィンゴ糖脂質を得る（スフィンゴ糖脂質取得工程：Ｓ０５０７）。以上の製造工程によって、シモン芋由来のスフィンゴ糖脂質を得る。
【００９４】
<実施形態５：効果> 本実施形態の方法によれば、シモン芋に含まれるスフィンゴ糖脂質を粗精製できる。また、本実施形態で得られる粗精製物は、シモン芋に含まれるスフィンゴ糖脂質を高濃度に含有することから医薬品や飲食品の原料として産業上様々な利用が可能である。
【００９５】
<<実施形態６>>
【００９６】
<実施形態６：概要> 実施形態６について説明する。本実施形態は、シモン芋由来の糖脂質、若しくはシモン芋由来のスフィンゴ糖脂質を動物に投与して、神経細胞を活性化する神経細胞活性化方法の提供と、シモン芋由来の糖脂質、若しくはシモン芋由来のスフィンゴ糖脂質を有効成分として含む神経細胞を活性化する神経細胞活性化剤の提供を特徴とする。
【００９７】
<実施形態６：構成> 実施形態６の構成要件について以下で説明する。
【００９８】
「動物」とは、神経系を有する生物を意味するが、好ましくは脊椎動物、さらに好ましくは哺乳動物を意味する。したがって、ヒトも当該動物に含まれる。
【００９９】
「投与」とは、シモン芋由来の糖脂質、若しくはシモン芋由来のスフィンゴ糖脂質を前記動物の体内に導入することを言う。
【０１００】
神経細胞活性化方法における「神経細胞」とは、生体内の中枢神経細胞や末梢神経細胞を意味する。これに対して神経細胞活性化剤における「神経細胞」とは、生体内の中枢神経細胞や末梢神経細胞に留まらず、中枢神経や末梢神経を構成する細胞の性質を有する細胞を含む。例えば、ＮＧＦ等の神経成長因子の作用によって神経細胞に分化する能力を有する細胞であってもよいし、生体より分離された後に培養される神経幹細胞や神経芽細胞等の株化された培養細胞であってもよい。
【０１０１】
「活性化」とは、機能を向上する作用、又は機能を維持する作用、又は細胞増殖を促進する作用を意味する。
【０１０２】
「神経細胞活性化」とは、前記神経細胞を活性化することを意味する。例えば、神経突起の伸長促進、又はシナプス形成の促進、又は有糸分裂の促進、又は神経変性の抑制、等が該当する。
【０１０３】
「神経細胞活性化剤」とは、前記神経細胞活性化の効果を有する薬剤、飲食品等である。当該活性化剤の状態は問わない。溶媒に溶解した液体状態であってもよいし、ゲル状体であってもよいし、ペースト状態であってもよいし、粉末状態であってもよいし、錠剤又はカプセルであってもよいし、原料として混入された状態であってもよい。
【０１０４】
本実施形態において「含む」とは、シモン芋由来の糖脂質、又はシモン芋由来のスフィンゴ糖脂質が前記神経細胞活性化に寄与し得る程度で含有されていることを言う。
【０１０５】
本実施形態のシモン芋由来の糖脂質は、前記実施形態１から４のいずれか一の方法で得られるシモン芋エキスに含有する糖脂質を用いてもよい。また、シモン芋由来のスフィンゴ糖脂質は、前記実施形態５の方法で得られるシモン芋由来のスフィンゴ糖脂質を用いてもよい。
【０１０６】
シモン芋由来の糖脂質、若しくはシモン芋由来のスフィンゴ糖脂質は、神経細胞活性化を有する。この事実は株化された培養細胞に、当該糖脂質や当該スフィンゴ糖脂質を添加し、その後の神経突起の伸長を観察する実験によって確認できる。シモン芋由来の糖脂質を用いた当該実験の詳細な方法、及びその結果については実施例５及び６で、またシモン芋由来のスフィンゴ糖脂質を用いた当該実験の詳細な方法、及びその結果については実施例７で詳述する。
【０１０７】
<実施形態６：方法> 本実施形態においてシモン芋由来の糖脂質、又はシモン芋由来のスフィンゴ糖脂質を動物に投与して、神経細胞を活性化する神経細胞活性化方法について以下で説明する。
【０１０８】
神経細胞活性化は、当該糖脂質、又はスフィンゴ糖脂質の投与によって達成される。投与の方法は、神経細胞活性化の効果が得られれば特に問わない。例えば、哺乳動物であれば経口投与、経直腸投与、脳室内投与、髄腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、経皮吸収、皮下投与、経鼻・吸入、舌下投与のいずれを用いてもよい。簡便、かつ投与する量を調整しやすいという点では経口投与が好ましい。
【０１０９】
また、本実施形態のシモン芋由来の糖脂質、又はシモン芋由来のスフィンゴ糖脂質を投与する量は、投与する動物個体の大きさ、投与する方法、及びそれによって得られる神経細胞活性化の効果に依存する。したがって、投与する方法に応じて神経細胞活性化の効果が得られる範囲で増減すればよい。例えば、２９週令のマウスで経口投与する場合、シモン芋由来のスフィンゴ糖脂質であれば１日あたり５〜１０ｍｇを餌に混ぜる等して与えれば、神経細胞活性化の効果が期待できる（参考：非特許文献１、非特許文献２）。
【０１１０】
<実施形態６：効果> 本実施形態によれば、シモン芋由来の糖脂質、若しくはシモン芋由来のスフィンゴ糖脂質を有効成分として、当該糖脂質や当該スフィンゴ糖脂質が有する神経細胞活性化を利用した脳や神経の機能向上、機能維持を目的とした生体に安全な植物性の薬剤や健康食品等を提供できる。また、当該神経細胞活性化剤を動物に投与することで、神経細胞の増殖促進や神経突起伸長の促進の作用によって老若を問わず記憶力の向上等の効果が期待できる。
【０１１１】
<<実施形態７>>
【０１１２】
<実施形態７：概要> 実施形態７について説明する。本実施形態は、実施形態１から４によって得られるシモン芋エキスを用いた健康食品の提供である。
【０１１３】
<実施形態７：構成> 本実施形態の構成について以下で説明する。
【０１１４】
「健康食品」は、通常健康の保持増進に資する食品として販売・利用されるもの全般を言う。例えば、栄養補助食品や、栄養強化食品や、機能性食品や、特定保健用食品等が該当する。しかし、本発明における「健康食品」は前記の意味に留まらず、実施形態１から４の方法で得られるシモン芋エキスを混入する食品全般を意味する。
【０１１５】
健康食品としてシモン芋エキスを使用する場合には、当該シモン芋エキスの状態は経口できれば特に問わない。例えば、未加工状態であってもよいし、未加工状態のままカプセルに充填されたものであってもよいし、圧縮成型により錠剤等に加工されたものでもあってもよい。あるいは、賦形剤を添加して粉状に加工された後に錠剤状に成型されたものであってもよいし、当該粉状に加工された後に植物油等と混合してカプセルに充填されたものであってもよい。賦形剤はデキストリン、又はデンプン、又は乳糖等が該当するが、同様の効果が得られるものであれば、これらに限定されない。また、賦形剤の含有率は４０％〜９０％の範囲が好ましい。さらに、他の健康食品や甘味料等と混合された状態であってもよいし、加工食品の素材、又は添加物として原料に加えてもよいし、液体であれば飲用前に加えて混合してもよいし、香辛料のように食用前に振り掛けた状態でもよい。
【０１１６】
<実施形態７：効果> 本実施形態によれば、シモン芋由来のシモン芋エキスを健康食品として使用することで当該シモン芋由来のシモン芋エキスに含まれる糖脂質を安全かつ容易に日々効率よく摂取することができる。
【実施例１】
【０１１７】
以下の実施例１から７をもって本発明をより具体的に説明するが、これらは単に例示するのみであり、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
<シモン芋由来の糖脂質を含有するシモン芋エキス製造方法>
前記実施形態３によるシモン芋由来の糖脂質を含有するシモン芋エキス製造方法に関する実施例を以下で説明する。
【０１１８】
（断片化工程）シモン芋の塊根１００ｇを水で洗浄し、表面に付着した泥やゴミ等の異物を除去した。次に、表皮のついた状態で塊根を切裁機に入れ、約１ｃｍ平方の小片状に断片化した。
【０１１９】
（乾燥工程）前記断片化工程で得られたシモン芋の塊根の小片を凍結乾燥装置（ＥＹＥＬＡ社）に入れ、−５０℃で１２時間の凍結乾燥処理を行った。
【０１２０】
（浸漬工程）得られたシモン芋の塊根の乾燥小片５０ｇを測り取り、恒温槽内で６０℃にプレヒートしたエタノール（９９．５％含有）１５０ｍｌに浸した後、撹拌をしながら６０℃で３時間抽出を行った。なお、実施例３でのコントロールとしてエタノールの代わりにプレヒートした水を用いて、他は同一条件で抽出を行った。
【０１２１】
（濃縮工程）前記浸漬工程後、シモン芋の塊根の乾燥小片と極性溶媒の混合物を吸引ビンに繋いだ漏斗内に移し、アスピレーターにより吸引した。吸引ビン内の液体を浸漬液として回収し、漏斗内の残渣は廃棄した。当該浸漬液をロータリーエバポレーター（ＥＹＥＬＡ社）を用いて、４０℃で３０分間濃縮した。これによって得られるシモン芋エキスは約５０ｍｌであり、これを「シモン芋エキス（サンプル）」として以降の実験に使用した。また、コントロールは「水抽出エキス（サンプル）」として実施例３の実験に使用した。
【実施例２】
【０１２２】
<シモン芋由来のスフィンゴ糖脂質製造方法>
前記実施形態５によるシモン芋由来のスフィンゴ糖脂質製造方法に関する実施例を以下で説明する。
【０１２３】
（加水分解工程）まず、実施例１で得られたシモン芋エキス５０ｍｌをさらに前記ロータリーエバポレーターを用いて、４０℃で６０分間処理し、シモン芋エキス中のエタノールと水分を完全に除去した。次に、残ったペレット状の濃縮物に０．４Ｎ水酸化カリウム／メタノール溶液を４０ｍｌ加えて再溶解した後、３７℃で２時間インキュベートした。
【０１２４】
（クロロホルム溶液取得工程）前記加水分解工程後に当該再溶解液：クロロホルム：水をそれぞれ４：８：３（容量比）で十分に混合した。続いて、軽く遠心を行った後、下層のクロロホルム層を回収した。
【０１２５】
（スフィンゴ糖脂質取得工程）前記クロロホルム溶液取得工程で回収したクロロホルム層の溶液からクロロホルムを撹拌しながら風乾燥で蒸発させて完全に除去した。蒸発後の残滓を「シモン芋由来のスフィンゴ糖脂質」とした。なお、以降の実験に使用するための液状サンプルとして調整するため、当該シモン芋由来のスフィンゴ糖脂質にクロロホルム：メタノール＝２：１（容量比）の混合液５ｍｌに再溶解したものを「シモン芋由来のスフィンゴ糖脂質サンプル」とした。
【実施例３】
【０１２６】
<シモン芋由来の糖脂質、及びスフィンゴ糖脂質の分析>
実施例１で得られるシモン芋エキス中にシモン芋由来の糖脂質が含まれること、及び実施例２で得られた産物にシモン芋由来のスフィンゴ糖脂質が高濃度で含まれることを確認するためにＴＬＣによって分析した。
【０１２７】
（糖脂質及びスフィンゴ糖脂質の分析）実施例１で得られた「シモン芋エキスサンプル」及び「水抽出エキスサンプル」と、実施例２で得られた「シモン芋由来のスフィンゴ糖脂質サンプル」とをそれぞれ５μｌずつＴＬＣに添付した。ＴＬＣの下端が浸る程度の展開液（アセトニトリル：イソプロパノール：５０ｍＭ塩化カリウム溶液＝１：１１．７：２．３）が入った容器内にＴＬＣを入れて密封し、展開を行った。溶媒がＴＬＣの上端付近に達した時に展開液からＴＬＣを取り出して展開を止めた。展開後のＴＬＣを十分に乾燥させた後、アンスロン硫酸を当該ＴＬＣに噴霧した。ＴＬＣ上で展開した糖脂質が呈色するまで１２０℃のホットプレートにて数分間加温した。最後にＴＬＣをデンシトメーター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）にて分析した。
【０１２８】
（結果）図６にＴＬＣの展開結果を示す。レーンＡは水抽出サンプルを、レーンＢはシモン芋エキスサンプルを、そしてレーンＣはシモン芋由来のスフィンゴ糖脂質サンプルをそれぞれ示している。矢印で示すバンド１は、ステロール配糖体である。ステロール配糖体は、ヘキソースを有するため呈色するがスフィンゴ糖脂質ではない。バンド２は、グリコシルセラミドである。グリコシルセラミドは、糖鎖部が単糖のみで構成されたスフィンゴ糖脂質の一つである。当該グリコシルセラミドは、ガングリオシド群、又はアシアロガングリオシド群の基本骨格となる分子であるが、本発明ではガングリオシド群、又はアシアロガングリオシド群のみを対象としていることから対象外物質として扱う。したがって、これらステロール配糖体やグリコシルセラミドは、実施例１、又は２の方法で得られる最終産物において不純物として混在し得る物質である。当該不純物の完全除去は困難であり、また後述の実施例７で示すように、これらの不純物はたとえ混入していてもシモン芋由来の糖脂質、並びにスフィンゴ糖脂質が有する神経細胞活性作用に何ら影響を及ぼすものではない。したがって、当該不純物の混入は無視できるものとして扱う。
【０１２９】
レーンＡでは、バンドはほとんど検出できなかった。これは、シモン芋の糖脂質の水抽出は極めて効率が悪いことを示している。これに対してエタノール抽出を行ったレーンＢでは、多数のバンドが検出された。バンド１又は２以外のバンドが、グリセロ糖脂質群とスフィンゴ糖脂質群に相当する。本結果により実施例１の方法によって得られたシモン芋エキスサンプル中には、水抽出サンプルと比較してグリセロ糖脂質群とスフィンゴ糖脂質群からなる糖脂質を多量に含有するが明らかとなった。
【０１３０】
レーンＣのバンド３a、３ｂ、３ｃ、３ｄはスフィンゴ糖脂質群である。実施例２の方法によってシモン芋エキスサンプル中のグリセロ糖脂質群が除去されたことから、レーンＢで見られたグリセロ糖脂質に相当するバンド群４が消失している。また、本発明のスフィンゴ糖脂質製造方法によって３a又は３ｃのようにレーンＢでは検出できなかったスフィンゴ糖脂質のバンドが検出された。さらに、３ｂのようにレーンＢで検出されたスフィンゴ糖脂質も高濃度に濃縮されていた。この結果により、実施例２の方法によって得られたシモン芋由来のスフィンゴ糖脂質サンプル中には、シモン芋由来のスフィンゴ糖脂質が高濃度で存在することが明らかとなった。
【実施例４】
【０１３１】
<シモン芋と他の食用植物におけるスフィンゴ糖脂質含有量の比較>
シモン芋が一般的に知られる食用植物よりもスフィンゴ糖脂質を多量に含有することを確認するために、シモン芋と他の食用植物におけるスフィンゴ糖脂質の含有量を比較検証した。
【０１３２】
（各食用植物エキスの製造方法）他の食用植物としては、シモン芋に近似の紅芋とサツマ芋、及び世界各地で主食として利用されているジャガイモと米を選択した。シモン芋、紅芋、サツマ芋、ジャガイモ、米をそれぞれ前記実施例１と同様の方法で処理して各食用植物エキスを調製した。ただし、米のみについては塊根ではなく精米を用いたため断片化工程を省いた。詳細な方法は実施例１と同様であることから省略する。
【０１３３】
（スフィンゴ糖脂質分析用サンプルの調製）前記製造方法で得られた各食用植物エキスを実施例２と同様の方法で処理して、それぞれのスフィンゴ糖脂質分析用サンプルを得た。詳細な方法は実施例２と同様であることから省略する。
【０１３４】
（スフィンゴ糖脂質の比較）前記スフィンゴ糖脂質分析用サンプルの調製で得られた各食用植物由来のスフィンゴ糖脂質分析用サンプルをそれぞれ５μｌずつＴＬＣに添付した。ここで、植物性アシアロガングリオシドは一般に市販されておらず、入手が困難であるため位置マーカーとして利用できるものがなかった。そこで、本実施例では入手の容易な動物性アシアロガングリオシドの一つであるＧＭ１を植物性アシアロガングリオシドの位置マーカーとして代用した。当該マーカーサンプルは、アシアロガングリオシドＧＭ１（ＳＩＧＭＡ社）１ｍｇをクロロホルム：メタノール＝２：１（容量比）の混合液５ｍｌに溶解した後、溶解液５μｌを他のサンプルと同様にＴＬＣに添付したものである。ＴＬＣの下端が浸る程度の展開液（アセトニトリル：イソプロパノール：５０ｍＭ塩化カリウム溶液＝１：１１．７：２．３）が入った容器内にＴＬＣを入れて密封し、展開を行った。溶媒がＴＬＣの上端付近に達した時に展開液からＴＬＣを取り出して展開を止めた。展開後のＴＬＣを十分に乾燥させた後、アンスロン硫酸を当該ＴＬＣに噴霧した。ＴＬＣ上で展開した糖脂質が呈色するまで１２０℃のホットプレートにて数分間加温する。最後にＴＬＣをデンシトメーター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）にて分析した。
【０１３５】
（結果）図７にその結果を示す。レーンＡは位置マーカーである動物性アシアロガングリオシドＧＭ１を、レーンＢはシモン芋由来のスフィンゴ糖脂質サンプルを、レーンＣは紅芋由来のスフィンゴ糖脂質サンプルを、レーンＤはサツマ芋由来のスフィンゴ糖脂質サンプルを、レーンＥはジャガイモ由来のスフィンゴ糖脂質サンプルを、レーンＦは米由来のスフィンゴ糖脂質サンプルを、それぞれ示している。レーンＡ以外で見られ、矢印で示すバンド１は前記ステロール配糖体である。レーンＢ、Ｃ、Ｄにおいて見られるバンド２は前記グリコシルセラミドである。またレーンＢ、Ｃ、Ｄでラダー状に見られるバンド３がスフィンゴ糖脂質群である。レーンＡにて４で示すバンドが動物性アシアロガングリオシドＧＭ１である。
【０１３６】
この図で示すように、スフィンゴ糖脂質はレーンＥ（ジャガイモ由来）とレーンＦ（米由来）では検出できず、またレーンＤ（サツマ芋由来）でもほとんど検出できなかった。スフィンゴ糖脂質が比較的多く検出できたのは、レーンＢ（シモン芋由来）とレーンＣ（紅芋由来）のみであった。注目すべき点はレーンＢのみでバンド５が検出されたことである。このバンド５のようなレーンＡの動物性アシアロガングリオシドＧＭ１に比較的近い展開速度を有するスフィンゴ糖脂質は、食用植物ではこれまでに知られていない。詳細に関しては現在解析中であるが、本発明者らは動物性アシアロガングリオシドＧＭ１の植物性近似物質と推測している。
【０１３７】
以上の結果から、シモン芋は主食として用いられる他の一般的な食用植物と比較して、非常に多くのスフィンゴ糖脂質を含有し、さらに近似の紅芋やサツマ芋にも見られない特有のスフィンゴ糖脂質（以下、植物性ＧＭ１近似物質とする。）を有していることが判明した。
【０１３８】
なお、植物細胞においてガングリオシドは極めて稀であることから、当該実施例においてアンスロン硫酸によって呈色されたスフィンゴ糖脂質は、そのほとんどが植物性アシアロガングリオシドと考えられる。
【実施例５】
【０１３９】
<シモン芋由来の糖脂質によるヒト神経芽細胞の活性化>
シモン芋由来の糖脂質がヒト神経芽細胞を活性化できるかについての検証を行った。実験方法と結果を以下で説明する。なお、本実施例以降で培養細胞に用いる器具や試薬、水等は特に断りのない限りは、原則として全て滅菌処理済みのものを使用し、操作はクリーンベンチ、又は無菌室にて行うことを前提とする。
【０１４０】
（添加サンプルの調製）１．シモン芋由来の糖脂質：前記実施例１で得られたシモン芋由来の糖脂質を含有するシモン芋エキス５ｍｌを凍結乾燥機で−５０℃で１２時間処理して凍結乾燥した。次に、乾燥物を乳鉢にて粉末になるまですり潰した。続いて、エタノール（９９．５％）で当該乾燥粉末を０．５μｇ／μｌの溶液になるように調整した。最後に、当該溶液を０．２２μｍフィルターで濾過滅菌して、「シモン芋糖脂質（サンプル）」とした。２．ポジティブコントロール：ＰＢＳ（−）緩衝液で神経成長因子ＮＧＦ（ＳＩＧＭＡ）を１００μｇ／ｍｌの溶液になるように調製した。当該溶液を０．２２μｍフィルターで濾過滅菌して、「ＮＧＦ（サンプル）」とした。
【０１４１】
（細胞培養方法とサンプルの添加）まず、株化された培養細胞であるヒト神経芽細胞（ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞）２．０×１０４ ｃｅｌｌｓを４ｍｌのＤＭＥＭ（ナカライテスク社）/１０％ＦＣＳ（ＧＩＢＣＯ社）の培地を入れた６ｃｍディッシュＡ、Ｂ、Ｃの３枚に播いた。続いて、当該ディッシュ３枚を３７℃、５％ＣＯ２濃度下で２４時間培養した。２４時間後、ディッシュＡはネガティブコントロールとして無添加にし、またディッシュＢには２００ｎｇ／ｍｌのＮＧＦサンプル添加した。ディッシュＣは５０μｌ（＝２５μｇ）のシモン芋サンプルを添加した。その後、各ディッシュは、再び３７℃、５％ＣＯ２濃度下で６日間培養した。各ディッシュの培地の交換は、この間特には行っていない。
【０１４２】
（培養細胞の観察）前記サンプルを添加後、２４時間毎に位相差顕微鏡を用いてヒト神経芽細胞の神経突起成長の状態を観察した。
【０１４３】
（結果）図８に各ディッシュ上のヒト神経芽細胞の状態を示す。０８０１から０８０３はディッシュＡ上の、０８０４と０８０５はディッシュＢ上の、そして０８０６から０８８はディッシュＣ上のヒト神経芽細胞の状態を示す。また、０８０１と０８０６はサンプル添加後１日目の細胞を示し、０８０２、０８０４、０８０７は２日目の細胞を示す。さらに０８０３、０８０５、０８０８は５日目の細胞を示す。
【０１４４】
無添加のディッシュＡでは５日後（０８０３）も神経突起の伸長は見られない。一方、シモン芋サンプルを添加したディッシュＣでは１日後（０８０６）に矢印で示す神経突起の伸長が多数の細胞で確認できた。ディッシュＣの細胞の神経突起は、その後培養によってさらに伸長し、５日目にはＮＧＦを添加したディッシュＢの５日目（０８０５）と同程度に伸長が促進された（０８０８）。以上の結果から、シモン芋由来の糖脂質は、動物性ガングリオシドと同様に神経細胞の神経突起の伸長を促進できることが明らかとなった。
【実施例６】
【０１４５】
<シモン芋由来の糖脂質によるＰＣ１２の神経突起様突起伸長活性評価>
シモン芋由来の糖脂質がラット副腎褐色細胞腫細胞ＰＣ１２を神経細胞に分化誘導し、神経突起様突起の伸長を活性するか、また細胞増殖活性を有するかの評価を行った。詳細な実験方法と結果を以下で説明する。
【０１４６】
（添加サンプルの調製）シモン芋由来の糖脂質としての「シモン芋エキスサンプル」、及びポジティブコントロールとしての「ＮＧＦサンプル」の調製は、共に実施例５と同様であることから説明を省略する。
【０１４７】
（細胞培養方法とサンプルの添加）シモン芋由来の糖脂質が有する神経突起様突起伸長活性をマイクロプレート上で評価できる系を非特許文献３を参考に検討した。まずＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ社）／１０％ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ社）／５％ＨＳ（Ｓｉｇｍａ社）培地中で培養したＰＣ１２細胞を、フィブロネクチンコートした９６ウェルのマイクロプレート上に２．０×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｍｌずつ分注後、前記ＮＧＦサンプルを終濃度１０ｎｇ／μｌで、また前記０．５μｇ／μｌシモン芋エキスサンプル（原液）を最終濃度２５０ｎｇ／μｌ（原液２倍希釈）、１２５ｎｇ／μｌ（原液４倍希釈）、そして６２．５ｎｇ／μｌ（原液８倍希釈）となるようにそれぞれ別個のウェルに添加した。その後、３７℃、５％ＣＯ２濃度下で３−４日間培養した。
【０１４８】
（培養細胞の観察と神経突起様突起伸長活性測定）神経突起様突起の状態については位相差顕微鏡で４日間観察した。また、神経突起様突起伸長の活性測定は、神経突起様突起の伸長指標となるアセチルコリンエステラーゼの活性として以下の手順で測定した。まず、培養最終日に培地を除去し、１ウェルあたり１８０μｌの５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．５）／０．１２Ｍ ＮａＣｌ／０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００／１ｍＭ ＥＤＴＡと、基質として２０μｌの５．６ｍＭ よう化アセチルチオコリン溶液を加えて室温で2時間処理した。次に、５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）／０．２％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００／１ｍＭ ＥＤＴＡを１６０μｌと０．４ｍＭ ＣＰＭを２０μｌ添加し、蛍光マイクロプレートリーダーを用いて励起光３６０ｎｍと既定光（測定光）４６０ｎｍにおける蛍光量をそれぞれ測定した。
【０１４９】
（細胞増殖活性の測定）シモン芋エキスが有する細胞増殖活性をアラマーブルー法により調べた。アラマーブルー法は細胞の生死を判別する方法である。具体的には培養細胞にアラマーブルー溶液を添加し、３７℃、５％ＣＯ２濃度下で数時間培養すると、生細胞ではミトコンドリア中のコハク酸デヒドロゲナーゼの活性で色が変化するのに対して、死細胞では当該酵素の失活からそのような変化は生じない。この発色のよる吸光度を測定することで細胞の生存率が算出できる。測定に使用した各細胞の条件は、神経突起様突起伸長活性測定で用いた細胞と同様である。
【０１５０】
（結果）図９に培養4日目におけるＰＣ１２細胞の神経突起様突起の伸長を、また図１０に培養4日目におけるＰＣ１２細胞のアセチルコリンエステラーゼ活性をそれぞれ図示する。図１０の縦軸はアセチルコリンエステラーゼ活性としての４６０ｎｍにおける蛍光量を示す。横軸は各サンプルであり、添加物はいずれも培地と細胞を含むウェルに加えた。個々での細胞とはＰＣ１２細胞であり、希釈液とはシモン芋エキスサンプルを希釈したものである。また、図中の星印が付記された結果はコントロールである水添加（レーン３）と比較したときの有意差がp<０．０１であるものを示す。
【０１５１】
ポジティブコントロールであるＮＧＦサンプルを加えたウェル内のＰＣ１２細胞は、神経突起様突起の伸長が確認された（図９のＡ）。また、ＮＧＦサンプルを加えたウェル内のＰＣ１２細胞は、アセチルコリンエステラーゼ活性もネガティブコントロールである水のみを添加した細胞（図１０ レーン３）と比べて増加していた（図１０ レーン４）。一方、シモン芋エキスサンプルを加えたウェル内のＰＣ１２細胞についても、ＮＧＦサンプルの場合と同様の神経突起様突起の伸長が確認された（図９のＢ：抽出原液添加）。また、シモン芋エキスサンプルを加えたウェル内のＰＣ１２細胞は、アセチルコリンエステラーゼ活性も水のみを添加した細胞（図１０ レーン３）と比べて、シモン芋エキスサンプルの２倍希釈（図１０ レーン５）、４倍希釈（図１０ レーン５）、そして８倍希釈（図１０ レーン７）のいずれもが有意な（p<０．０１）増加を示した。さらに、それらの増加の程度は、添加したシモン芋エキスサンプルの量依存的であった。
【０１５２】
上記結果から、水添加のアセチルコリンエステラーゼ活性を1とする時、ＮＧＦサンプルは２．５、シモン芋エキスサンプル２倍希釈は１．５、またシモン芋エキスサンプル４倍希釈は１．２であった。これからシモン芋エキスサンプルの2倍希釈溶液（終濃度２５０ｎｇ／μｌ）は、ＮＧＦ終濃度６．１ｎｇ／ｍｌと同程度の活性を有すると推察できる。
【０１５３】
図１１に培養4日目における細胞増殖活性の結果を示す。シモン芋エキスサンプルの２倍希釈（図１１ レーン５）、４倍希釈（図１１ レーン５）、そして８倍希釈（図１１ レーン７）は、水のみの添加（図１１ レーン３）と比較して、いずれの場合も有意な（p<０．０１）細胞増殖活性の増加を示した。また、その増加は量依存的であった。以上の結果からシモン芋由来の糖脂質は、PC１２に対して細胞増殖促進活性を有することが明らかとなった。
【実施例７】
【０１５４】
<シモン芋由来のスフィンゴ糖脂質によるヒト神経芽細胞の活性化の確認>
実施例５、又は６においてシモン芋由来の糖脂質で見られた神経突起若しくは神経突起様突起の伸長活性が、糖脂質の中のスフィンゴ糖脂質によるものかを確認した。また、実施例４で検出されたシモン芋特有のスフィンゴ糖脂質（植物性ＧＭ１近似物質）が特に神経突起の伸長活性を有するかを確認した。
【０１５５】
（添加サンプルの調製）
【０１５６】
１．シモン芋由来の糖脂質：「シモン芋糖脂質（サンプル）」の調製は前記実施例５と同様であることから説明を省略する。
【０１５７】
２．水抽出したシモン芋由来の糖脂質：実施例１で調製した水抽出エキスを実施例５のシモン芋エキスと同様の方法で処理したものを「水抽出シモン芋糖脂質（サンプル）」とした。
【０１５８】
３．スフィンゴ糖脂質分画と除スフィンゴ糖脂質分画：前記シモン芋糖脂質サンプルをシリカゲルカラムクロマトにてスフィンゴ糖脂質と除スフィンゴ糖脂質に分画した。分画の条件は以下の通り。まず、カラムにシリカゲルを１０ｇ充填し、１５ｍｌヘキサンで平衡化した。次に、前記シモン芋糖脂質サンプルをカラムに加え、１０ｍｌヘキサン／５ｍｌアセトン混合液で除スフィンゴ糖脂質分画を溶出した。続いて、ロータリーエバポレーター（ＥＹＥＬＡ社）を用いて溶出液からヘキサン／アセトンを蒸発除去した。得られた残滓にエタノールを加えて溶解し、最終濃度０．５μｇ／μｌになるように調整した。当該溶液を０．２２μｍフィルターで濾過滅菌して「除スフィンゴ糖脂質分画（サンプル）」とした。次に、除スフィンゴ糖脂質分画を溶出後のカラムを５ｍｌヘキサン／１０ｍｌアセトン混合液で洗浄した後、アセトン１５ｍｌでさらに洗浄した。続いて、１５ｍｌエタノールでスフィンゴ糖脂質分画を溶出した。その後、ロータリーエバポレーター（ＥＹＥＬＡ社）を用いて溶出液からエタノールを蒸発除去した。最後に得られた残滓にエタノールを加えて再溶解し、最終濃度０．５μｇ／μｌになるように調整した。当該溶液を０．２２μｍフィルターで濾過滅菌して「スフィンゴ糖脂質分画（サンプル）」とした。
【０１５９】
４．シモン芋特有のスフィンゴ糖脂質（植物性ＧＭ１近似物質）：まず、前記スフィンゴ糖脂質分画を約２〜３μｇＴＬＣプレートに添加した。展開条件は実施例４と同様なので説明は省略する。次に、展開後のＴＬＣプレートから目的とする植物性ＧＭ１近似物質に相当するバンドのシリカゲルを掻き取った。続いて、当該シリカゲルにエタノールを加え、超音波を１分間照射した後、６０℃で１時間加温した。この操作によってシリカゲルに吸着した植物性ＧＭ１近似物質を溶出させた。それから軽く遠心してシリカゲルを沈殿させて上清を採取した後、当該上清を０．４５μｍフィルターで濾過してシリカゲルを完全に除去した。その後、ロータリーエバポレーター（ＥＹＥＬＡ社）を用いて濾過液からエタノールを蒸発除去した。最後に得られた残滓にエタノールを加えて再溶解し、最終濃度０．５μｇ／μｌになるように調整した。当該溶液を０．２２μｍフィルターで濾過滅菌して「植物性ＧＭ１近似物質（サンプル）」とした。なお、同時に他のスフィンゴ糖脂質のバンドも同様の方法で精製した。
【０１６０】
５．コントロール：ポジティブコントロールである「ＮＧＦ（サンプル）」の調製は前記実施例５と同様であることから説明を省略する。また、ネガティブコントロールとして無添加のものを調製した。なお、コントロール以外のサンプルは全て実施例４と同様の方法によって、ＴＬＣにて展開し、その存在の確認を行った。
【０１６１】
（細胞培養方法とサンプルの添加）ヒト神経芽細胞（ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞）の培養条件、各サンプルの添加条件は全て実施例５と同条件であることから、その説明は省略する。
【０１６２】
（培養細胞の観察）前記各サンプルを添加後、２４時間毎に顕微鏡を用いてヒト神経芽細胞の神経突起成長の状態を毎日観察した。
【０１６３】
（結果）図１２に各サンプルを添加したときのＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞と、添加した各サンプルのＴＬＣ結果を図示する。細胞は各サンプル添加後１日（２４時間）後、及び２日（４８時間）後のものを図示した。ただし、ＮＧＦ添加（ポジティブコントロール）は２日後のみを図示した。また、各サンプル添加直後（０日）の細胞図は、無添加（ネガティブコントロール）の１日後と、いずれもほとんど変わらないため省略した。なお、無添加（１２０１、１２０２）、ＮＧＦ添加（１２０３）、そしてエタノール抽出シモン芋エキス添加（１２０４、１２０５）は、全条件を実施例５と同一の条件で行ったことから、同一の結果を図示した。各添加サンプルのＴＬＣ展開は実施例３と同様の方法で行った。ＴＬＣ展開のＡの各バンドは、グリコシルセラミド、ステロール配糖体、及びグリセロ糖脂質群である。Ｂはスフィンゴ糖脂質をシリカゲルカラムクロマトにて精製したサンプルに混入しているグリコシルセラミド、ステロール配糖体、及びグリセロ糖脂質群の一部である。これらを完全に除去することは困難であり、また後述の理由によりこれらの物質には神経細胞活性化作用がないことが明らかであることから、無視できるものとした。Ｃの各バンドはスフィンゴ糖脂質群である。Ｄのバンドは植物性ＧＭ１近似物質を示す。
【０１６４】
まず、水抽出物シモン芋糖脂質を添加した細胞は、細胞形態も無添加と同じく神経突起伸長促進の活性はみられなかった。ＴＬＣ展開図（１２１４）でも糖脂質が抽出されていないことが示されている。
【０１６５】
次に、エタノール抽出したシモン芋糖脂質を添加した細胞は、実施例５と同一の結果であり、１日後には多数の細胞で神経突起の伸長が観察された。
【０１６６】
続いて、除スフィンゴ糖脂質分画を添加した細胞は、水抽出シモン芋糖脂質や無添加と同じく神経突起伸長促進の活性の効果は１日目（１２０８）、２日目（１２０９）とも確認できなかった。展開図（１２１６）は、スフィンゴ糖脂質群が完全に除去されていることを示している。この結果から、シモン芋エキスに含まれるグリコシルセラミド、ステロール配糖体、及びグリセロ糖脂質群はＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞の神経突起伸長を促進させる活性を有しないことが示された。
【０１６７】
また、スフィンゴ糖脂質分画を添加した細胞は、１日目（１２１０）、２日目（１２１１）とも、ＮＧＦ添加した細胞（１２０３）と同様に神経突起伸長促進の活性が観察された。展開図（１２１７）は、当該分画におけるスフィンゴ糖脂質群、並びに除去しきれずに混入したグリコシルセラミド、ステロール配糖体、及びグリセロ糖脂質群の一部の存在を示している。ここで、１２０８、１２０９の結果からグリコシルセラミド、ステロール配糖体、及びグリセロ糖脂質群はＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞の神経突起伸長を促進させる活性を有しないことから、当該分画における神経突起伸長促進の活性は当該分画におけるスフィンゴ糖脂質群によるものである。これは同時にエタノール抽出したシモン芋エキスにおいても実質的な神経突起伸長促進の活性はシモン芋由来のスフィンゴ糖脂質によるものであると解することができる。
【０１６８】
さらに、スフィンゴ糖脂質群の各バンドをそれぞれ個別にＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞に添加したが、植物性ＧＭ１近似物質Ｄを添加した細胞が、特に強くその作用があることが確認できた（１２１２、１２１３、また、他の各バンドのスフィンゴ糖脂質のデータは図示せず。）。展開図（１２１８）は、スフィンゴ糖脂質の中で植物性ＧＭ１近似物質のみが精製されていることを示している。これにより、シモン芋のスフィンゴ糖脂質の中でも、シモン芋に特有に見られた植物性ＧＭ１近似物質が強い神経突起伸長作用を有することが示された。
【０１６９】
以上の結果から、シモン芋由来の糖脂質の中でもスフィンゴ糖脂質が神経突起伸長作用に影響を与えていることが明らかとなった。また、その中でも植物性ＧＭ１近似物質に神経突起の伸長活性を有することが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【０１７０】
【図１】実施形態１の方法を説明するための図。
【図２】実施形態２の方法を説明するための図。
【図３】実施形態３の方法を説明するための図。
【図４】実施形態４の方法を説明するための図。
【図５】実施形態５の方法を説明するための図。
【図６】実施例３のシモン芋由来の糖脂質、及びスフィンゴ糖脂質の分析結果。
【図７】実施例４のシモン芋と他の食用植物におけるスフィンゴ糖脂質含有量の比較結果。
【図８】実施例５のシモン芋由来の糖脂質による神経芽細胞の神経突起の伸長活性。
【図９】実施例６のシモン芋由来の糖脂質によるＰＣ１２の神経突起様突起の伸長活性。
【図１０】実施例６のシモン芋由来の糖脂質によるＰＣ１２細胞のアセチルコリンエステラーゼ活性。
【図１１】実施例６のシモン芋由来の糖脂質によるＰＣ１２細胞の細胞増殖活性。
【図１２】実施例７の各サンプルの添加による神経芽細胞の神経突起の伸長活性と、各サンプルのＴＬＣ展開図。
【符号の説明】
【０１７１】
１２０１：無添加１日目のＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞
１２０２：無添加２日目のＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞
１２０３：ＮＧＦ添加後２日目のＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞
１２０４：水抽出シモン芋エキス添加後１日目のＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞
１２０５：水抽出シモン芋エキス添加後２日目のＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞
１２０６：エタノール抽出シモン芋エキス添加後１日目のＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞
１２０７：エタノール抽出シモン芋エキス添加後２日目のＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞
１２０８：除スフィンゴ糖脂質分画添加後１日目のＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞
１２０９：除スフィンゴ糖脂質分画添加後２日目のＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞
１２１０：スフィンゴ糖脂質分画添加後１日目のＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞
１２１１：スフィンゴ糖脂質分画添加後２日目のＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞
１２１２：精製した植物性ＧＭ１近似物質添加後１日目のＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞
１２１３：精製した植物性ＧＭ１近似物質添加後２日目のＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞
１２１４：水抽出シモン芋エキスのＴＬＣ展開図
１２１５：エタノール抽出シモン芋エキスのＴＬＣ展開図
１２１６：除スフィンゴ糖脂質分画のＴＬＣ展開図
１２１７：スフィンゴ糖脂質分画のＴＬＣ展開図
１２１８：精製した植物性ＧＭ１近似物質のＴＬＣ展開図
Ａ：グリコシルセラミド、ステロール配糖体、及びグリセロ糖脂質群
Ｂ：除去しきれなかったＡの各物質
Ｃ：スフィンゴ糖脂質群
Ｄ：植物性ＧＭ１近似物質
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シモン芋を極性溶媒中に浸たす浸漬工程と、
前記浸漬工程で得られる浸漬液を濃縮する濃縮工程と、
からなるシモン芋由来の糖脂質を含有するシモン芋エキスを製造するシモン芋エキス製造方法。
【請求項２】
前記浸漬工程にて浸漬する前に、シモン芋を乾燥させる乾燥工程をさらに有する請求項１に記載のシモン芋エキス製造方法。
【請求項３】
最初にシモン芋の塊根を断片化する断片化工程をさらに有する請求項１又は２に記載のシモン芋エキス製造方法。
【請求項４】
前記濃縮工程は、濃縮することにより得られる液状シモン芋エキスを乾燥させて固体状シモン芋エキスを得る工程である請求項１から3のいずれか一に記載のシモン芋エキス製造方法。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか一に記載のシモン芋エキス製造方法により得られるシモン芋エキスにアルカリ溶液を加えてグリセロ糖脂質を加水分解する加水分解工程と、
前記加水分解工程で得られた加水分解溶液にクロロホルムと水を加えて混合した後、クロロホルム溶液を取得するクロロホルム溶液取得工程と、
前記クロロホルム溶液取得工程で取得されたクロロホルム溶液からクロロホルムを除去してシモン芋由来のスフィンゴ糖脂質を取得するスフィンゴ糖脂質取得工程と、
からなるシモン芋由来のスフィンゴ糖脂質製造方法。
【請求項６】
シモン由来の糖脂質を動物に投与して神経細胞を活性化させる神経細胞活性化方法。
【請求項７】
前記シモン芋由来の糖脂質は、請求項１から４のいずれか一に記載の方法で得られるシモン芋エキスに含まれる糖脂質である神経細胞活性化方法。
【請求項８】
シモン芋由来のスフィンゴ糖脂質を動物に投与して神経細胞を活性化させる神経細胞活性化方法。
【請求項９】
前記シモン芋由来のスフィンゴ糖脂質は請求項５に記載の方法で得られるスフィンゴ糖脂質である神経細胞活性化方法。
【請求項１０】
シモン芋由来の糖脂質を有効成分として含む神経細胞を活性化する神経細胞活性化剤。
【請求項１１】
前記シモン芋由来の糖脂質は、請求項１から４のいずれか一に記載の方法で得られるシモン芋エキスに含まれる糖脂質である請求項１０に記載の神経細胞活性化剤。
【請求項１２】
シモン芋由来のスフィンゴ糖脂質を有効成分として含む神経細胞を活性化する神経細胞活性化剤。
【請求項１３】
前記シモン芋由来のスフィンゴ糖脂質は、請求項５に記載の方法で得られるスフィンゴ糖脂質である請求項１２に記載の神経細胞活性化剤。
【請求項１４】
請求項１から４のいずれか一に記載の方法で得られるシモン芋エキスを含む健康食品。
【請求項１】
シモン芋を極性溶媒中に浸たす浸漬工程と、
前記浸漬工程で得られる浸漬液を濃縮する濃縮工程と、
からなるシモン芋由来の糖脂質を含有するシモン芋エキスを製造するシモン芋エキス製造方法。
【請求項２】
前記浸漬工程にて浸漬する前に、シモン芋を乾燥させる乾燥工程をさらに有する請求項１に記載のシモン芋エキス製造方法。
【請求項３】
最初にシモン芋の塊根を断片化する断片化工程をさらに有する請求項１又は２に記載のシモン芋エキス製造方法。
【請求項４】
前記濃縮工程は、濃縮することにより得られる液状シモン芋エキスを乾燥させて固体状シモン芋エキスを得る工程である請求項１から3のいずれか一に記載のシモン芋エキス製造方法。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか一に記載のシモン芋エキス製造方法により得られるシモン芋エキスにアルカリ溶液を加えてグリセロ糖脂質を加水分解する加水分解工程と、
前記加水分解工程で得られた加水分解溶液にクロロホルムと水を加えて混合した後、クロロホルム溶液を取得するクロロホルム溶液取得工程と、
前記クロロホルム溶液取得工程で取得されたクロロホルム溶液からクロロホルムを除去してシモン芋由来のスフィンゴ糖脂質を取得するスフィンゴ糖脂質取得工程と、
からなるシモン芋由来のスフィンゴ糖脂質製造方法。
【請求項６】
シモン由来の糖脂質を動物に投与して神経細胞を活性化させる神経細胞活性化方法。
【請求項７】
前記シモン芋由来の糖脂質は、請求項１から４のいずれか一に記載の方法で得られるシモン芋エキスに含まれる糖脂質である神経細胞活性化方法。
【請求項８】
シモン芋由来のスフィンゴ糖脂質を動物に投与して神経細胞を活性化させる神経細胞活性化方法。
【請求項９】
前記シモン芋由来のスフィンゴ糖脂質は請求項５に記載の方法で得られるスフィンゴ糖脂質である神経細胞活性化方法。
【請求項１０】
シモン芋由来の糖脂質を有効成分として含む神経細胞を活性化する神経細胞活性化剤。
【請求項１１】
前記シモン芋由来の糖脂質は、請求項１から４のいずれか一に記載の方法で得られるシモン芋エキスに含まれる糖脂質である請求項１０に記載の神経細胞活性化剤。
【請求項１２】
シモン芋由来のスフィンゴ糖脂質を有効成分として含む神経細胞を活性化する神経細胞活性化剤。
【請求項１３】
前記シモン芋由来のスフィンゴ糖脂質は、請求項５に記載の方法で得られるスフィンゴ糖脂質である請求項１２に記載の神経細胞活性化剤。
【請求項１４】
請求項１から４のいずれか一に記載の方法で得られるシモン芋エキスを含む健康食品。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公開番号】特開２００７−３１３３８（Ｐ２００７−３１３３８Ａ）
【公開日】平成１９年２月８日（２００７．２．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２１６８１３（Ｐ２００５−２１６８１３）
【出願日】平成１７年７月２７日（２００５．７．２７）
【出願人】（５０１０６０５１８）株式会社ディーエヌエーバンク (3)
【出願人】（５９５１０２１７８）沖縄県 (36)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年２月８日（２００７．２．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年７月２７日（２００５．７．２７）
【出願人】（５０１０６０５１８）株式会社ディーエヌエーバンク (3)
【出願人】（５９５１０２１７８）沖縄県 (36)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]