ショウジョウバエ由来生理活性ペプチド
【課題】害虫駆除薬又は医薬として有用なショウジョウバエ由来の新規生理活性ペプチドの提供。
【解決手段】特定な配列のアミノ酸配列からなるペプチド又はペプチドアミド、当該アミノ酸配列において、システイン残基を除く１〜５個のアミノ酸残基が置換等がされたアミノ酸配列からなり、変異前のペプチド又はペプチドアミドと同等のＩＤＡ−１Ｒに対する結合活性を有する変異ペプチド又はペプチドアミド、及び上記と異なる、特定な配列のアミノ酸配列において、システイン残基を除く１〜３個のアミノ酸残基が置換等がされたアミノ酸配列からなり、変異前のペプチド又はペプチドアミドと同等のＩＤＡ−２Ｒに対する結合活性を有する変異ペプチド又はペプチドアミドからなる群より選ばれる、単離されたペプチド又はペプチドアミド。
【解決手段】特定な配列のアミノ酸配列からなるペプチド又はペプチドアミド、当該アミノ酸配列において、システイン残基を除く１〜５個のアミノ酸残基が置換等がされたアミノ酸配列からなり、変異前のペプチド又はペプチドアミドと同等のＩＤＡ−１Ｒに対する結合活性を有する変異ペプチド又はペプチドアミド、及び上記と異なる、特定な配列のアミノ酸配列において、システイン残基を除く１〜３個のアミノ酸残基が置換等がされたアミノ酸配列からなり、変異前のペプチド又はペプチドアミドと同等のＩＤＡ−２Ｒに対する結合活性を有する変異ペプチド又はペプチドアミドからなる群より選ばれる、単離されたペプチド又はペプチドアミド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ショウジョウバエ由来生理活性ペプチドに関し、害虫駆除薬または医薬の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くのＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）に対するリガンド、特に生理活性ペプチドは、幅広い生理現象に関わっていることから医薬品としての応用が進められている。しかし、ショウジョウバエを含む昆虫では未知の生理活性ペプチドの探索はあまり行われていなかった。昆虫における生理活性ペプチドとその受容体に関する最近の知見として、脂質動員ホルモン（ＡＫＨ）の受容体の発見（非特許文献１）、ＧＰＣＲとβ−２−アレスチン２との相互作用に基づく、ショウジョウバエ神経ペプチド受容体の同定（非特許文献２）などが知られている。
【０００３】
オーファンＧＰＣＲに対する内在性リガンドの探索は活発に行われているが、近年、哺乳類での新たな発見に関する報告は減少している。一例として、オーファンＧＰＣＲとして知られていた成長ホルモン分泌促進因子受容体（ＧＨＳ−Ｒ）の内在性リガンドとして、ラットおよびヒトのグレリン（Ghrelin）が報告された（非特許文献３）。グレリンは、医薬品への応用開発が進められている。本発明者らは、最近、ネコのグレリンを同定した（非特許文献４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】PNAS, 2002, Vol.99, pp.3446-3451
【非特許文献２】Journal of Biological Chemistry, 2003, Vol.278, pp.52172-52178
【非特許文献３】Nature, 1999, Vol.402, pp.656-660
【非特許文献４】Domestic Animal Endocrinology, 2007, Vol.32, pp.93-105
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
天然に存在する生理活性物質は、これまでに医薬品の有効成分、生活必需品の成分として利用され、人類の健康増進に大いに貢献してきた。したがって、新規生理活性物質の探索は、新規有効成分医薬品ばかりではなく新規効能医薬品の候補を提供するためにも重要であるが、哺乳類での未知の生理活性ペプチドリガンドの発見は減少している。したがって、本発明の目的は、新規生理活性ペプチドを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、ショウジョウバエオーファンＧＰＣＲとして、哺乳類オーファン受容体であるbombesin receptor subtype-3(BRS-3)受容体に類似しているＣＧ１４５９３（ＩＤＡ−１Ｒ）およびＣＧ３０１０６（ＩＤＡ−２Ｒ）に着目し、内在性リガンドを探索した。その結果、ＣＧ１４５９３（ＩＤＡ−１Ｒ）およびＣＧ３０１０６（ＩＤＡ−２Ｒ）に対する内在性リガンドをそれぞれ単離し、当該リガンドと相同なアミノ酸配列を有するペプチドが様々な昆虫においても存在することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
本発明は、以下のものを提供する：
〔１〕 （１）配列番号１〜３のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチドまたはペプチドアミド、
（２）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるペプチドまたはペプチドアミド、
（３）配列番号１〜３のいずれかで表されるアミノ酸配列において、システイン残基を除く１〜５個のアミノ酸残基が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列からなる変異ペプチドまたは変異ペプチドアミドであって、変異前のペプチドまたはペプチドアミドと同等のショウジョウバエＩＤＡ−１Ｒに対する結合活性を有するペプチドまたはペプチドアミド、および
（４）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、システイン残基を除く１〜３個のアミノ酸残基が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列からなる変異ペプチドまたは変異ペプチドアミドであって、変異前のペプチドまたはペプチドアミドと同等のショウジョウバエＩＤＡ−２Ｒに対する結合活性を有するペプチドまたはペプチドアミド
からなる群より選ばれる、単離されたペプチドまたはペプチドアミド。
〔２〕 （１）配列番号１〜３のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチドまたはペプチドアミド、
（２）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるペプチドまたはペプチドアミド、
（３）配列番号１〜３のいずれかで表されるアミノ酸配列において、システイン残基を除く１〜５個のアミノ酸残基が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列からなる変異ペプチドまたは変異ペプチドアミドであって、変異前のペプチドまたはペプチドアミドと同等のショウジョウバエＩＤＡ−１Ｒに対する結合活性を有するペプチドまたはペプチドアミド、および
（４）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、システイン残基を除く１〜３個のアミノ酸残基が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列からなる変異ペプチドまたは変異ペプチドアミドであって、変異前のペプチドまたはペプチドアミドと同等のショウジョウバエＩＤＡ−２Ｒに対する結合活性を有するペプチドまたはペプチドアミド
からなる群より選ばれるペプチドまたはペプチドアミドからなる、ＩＤＡ−１ＲまたはＩＤＡ−２Ｒに対するリガンド。
〔３〕 前記〔１〕記載のペプチドまたはペプチドアミドを少なくとも１種含有する、昆虫の摂食抑制剤。
〔４〕 前記〔１〕記載のペプチドまたはペプチドアミドを少なくとも１種含有する、害虫駆除剤。
〔５〕 前記〔１〕記載のペプチドまたはペプチドアミドに結合する抗体。
〔６〕 前記〔１〕記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド。
〔７〕 idalin-1および／またはidalin-2の発現を特異的に阻害する物質を含有する、昆虫の成長促進剤。
〔８〕 下記いずれかの二本鎖ＲＮＡを含有する、前記〔７〕記載の成長促進剤：
配列番号５の塩基配列に対応するｍＲＮＡにおける１９〜２５個の連続する塩基配列を含むセンス鎖と、その相補配列を含むアンチセンス鎖の組み合わせ；または
配列番号７の塩基配列に対応するｍＲＮＡにおける１９〜２５個の連続する塩基配列を含むセンス鎖と、その相補配列を含むアンチセンス鎖の組み合わせ。
〔９〕 ＩＤＡ−１Ｒおよび／またはＩＤＡ−２Ｒの発現または機能を阻害する物質を含有する、昆虫の成長促進剤。
〔１０〕 ＩＤＡ−１Ｒおよび／またはＩＤＡ−２Ｒの発現または機能を調節する物質が、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかである、前記〔９〕記載の成長促進剤：
（ｉ）ＩＤＡ−１Ｒおよび／またはＩＤＡ−２Ｒをコードする遺伝子のアンチセンス核酸、リボザイム、ＲＮＡｉ誘導性核酸、デコイ核酸またはターゲッティングベクター、
（ｉｉ）ＩＤＡ−１Ｒおよび／またはＩＤＡ−２Ｒに対する抗体、当該抗体をコードする核酸、当該ＩＤＡ−１Ｒおよび／またはＩＤＡ−２Ｒのドミナントネガティブ変異体または当該変異体をコードする核酸、または
（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の核酸を含む発現ベクター。
〔１１〕 ＲＮＡｉ誘導性核酸が下記いずれかの二本鎖ＲＮＡである、前記〔１０〕記載の成長促進剤：
配列番号３４の塩基配列に対応するｍＲＮＡにおける１９〜２５個の連続する塩基配列を含むセンス鎖と、その相補配列を含むアンチセンス鎖の組み合わせ；または
配列番号３６の塩基配列に対応するｍＲＮＡにおける１９〜２５個の連続する塩基配列を含むセンス鎖と、その相補配列を含むアンチセンス鎖の組み合わせ。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の単離されたペプチドまたはペプチドアミドは、ショウジョウバエオーファンＧＰＣＲであるＣＧ１４５９３（ＩＤＡ−１Ｒ）またはＣＧ３０１０６（ＩＤＡ−２Ｒ）に結合するリガンドであり、それぞれidalin-1またはidalin-2ファミリーを構成する。idalin-1およびidalin-2は、多くの昆虫で高度に保存されていた。idalin-1の過剰発現ショウジョウバエは摂食が抑制され、幼虫の発育、成虫への羽化率が低い。idalin-1の作用をブロックしたハエは、摂食量が増加する。ショウジョウバエを絶食させると、idalin-1の発現量が減少する。以上の点から、idalin-1およびidalin-2は昆虫における摂食抑制ペプチドであり、害虫の発育阻害剤としての利用が期待される。また、idalin-1およびidalin-2は、昆虫にのみ作用するので哺乳類には安全である。さらに、idalin-1およびidalin-2は、ペプチドであるので分解されやすく環境への負荷が少ない。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】脊椎動物Bombesin/Gastrin Releasing Peptide receptorファミリーに属する遺伝子ならびにショウジョウバエＧＰＣＲのＣＧ１４５９３（ＩＤＡ−１Ｒ）およびＣＧ３０１０６（ＩＤＡ−２Ｒ）の系統樹である。
【図２】ショウジョウバエペプチド抽出物からゲル濾過で展開したサンプルをＣＧ１４５９３（ＩＤＡ−１Ｒ）過剰発現ＣＨＯ細胞に添加し、細胞内カルシウム上昇活性を示す（黒棒）グラフである。
【図３】ＣＧ１４５９３（ＩＤＡ−１Ｒ）に対する最終精製を示すチャートである。
【図４】ＣＧ１４５９３（ＩＤＡ−１Ｒ）に対する最終精製物をアミノ酸シークエンス、質量分析により解析した結果から導き出されたアミノ酸配列、ＣＧ１４３７５(idalin-1)を示す。２位のシステインと９位のシステインとの間には分子内ジスルフィド結合を有する。
【図５】ＣＧ１４５９３（ＩＤＡ−１Ｒ）に結合するリガンドidalin-1の前駆体ＣＧ１４３７５のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。idalin-1が由来する領域を下線にて示す。（１）配列番号１、（２）配列番号２、（３）配列番号３、（注）Ｃ末端アミド化のためのアミドドナーとしてのグリシン。それぞれの配列は最終精製後、質量分析にて確認した。また、配列１〜３についてＣ末端アミド化がされていない物も確認した。
【図６】idalin-1をジチオスレイトール（ＤＴＴ）にて還元し、Ｓ−Ｓ結合が切れた物をＨＰＬＣで回収したチャートを示す。
【図７】ショウジョウバエペプチド抽出物からゲル濾過で展開したサンプルをＣＧ３０１０６（ＩＤＡ−２Ｒ）過剰発現ＣＨＯ細胞に添加し、細胞内カルシウム上昇活性を示す（黒棒）グラフである。
【図８】ＣＧ３０１０６（ＩＤＡ−２Ｒ）に対する最終精製を示すチャートである。
【図９】ＣＧ３０１０６（ＩＤＡ−２Ｒ）に対する最終精製物をアミノ酸シークエンス、質量分析により解析した結果から導き出されたアミノ酸配列、ＣＧ１４３５８(idalin-2)を示す。２位のシステインと９位のシステインとの間には分子内ジスルフィド結合を有する。
【図１０】ＣＧ３０１０６（ＩＤＡ−２Ｒ）に結合するリガンドidalin-2の前駆体ＣＧ１４３５８のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。idalin-2が由来する領域を下線にて示す。配列番号４、（注）Ｃ末端アミド化のためのアミドドナーとしてのグリシン。
【図１１】idalin-2をジチオスレイトール(ＤＴＴ)にて還元し、Ｓ−Ｓ結合が切れた物をＨＰＬＣで回収したチャートを示す。
【図１２Ａ】ＩＤＡ−１Ｒ（ＣＧ１４５９３）とidalin-1（ＣＧ１４３７５：配列番号１）またはidalin-2（ＣＧ１４３５８：配列番号４）との結合試験の結果を示す。ＩＤＡ−１Ｒ過剰発現ＣＨＯ細胞での細胞内カルシウムの変化を示す。
【図１２Ｂ】ＩＤＡ−２Ｒ（ＣＧ３０１０６）とidalin-1（ＣＧ１４３７５：配列番号１）またはidalin-2（ＣＧ１４３５８：配列番号４）との結合試験の結果を示す。ＩＤＡ−２Ｒ過剰発現ＣＨＯ細胞での細胞内カルシウムの変化を示す。
【図１３】リアルタイムＰＣＲによるショウジョウバエ（オス、メス）の頭部と身体におけるidalin-1、idalin-2、ＩＤＡ−１Ｒ、ＩＤＡ−２ＲのｍＲＮＡの発現量の解析結果を示す。
【図１４】ラジオイムノアッセイによるidalin-1 Ｃ末端側認識特異抗体の抗体価チェックの結果を示す。
【図１５】ラジオイムノアッセイによるidalin-1 Ｃ末端側認識特異抗体のスタンダードチェックの結果を示す。
【図１６】ラジオイムノアッセイによるidalin-1トランスジェニックハエとＲＮＡｉハエにおけるidalin-1の含量を示す。
【図１７】idalin-1トランスジェニックハエ（図１７Ａ、Ｂ）とコントロールハエ（図１７Ｃ、Ｄ）の幼虫の壁を登る行動を比較した図である。
【図１８】コントロールハエにおいて絶食後のidalin-1、idalin-2 ｍＲＮＡの発現量をリアルタイムＰＣＲにて解析した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本明細書において、アミノ酸、（ポリ）ペプチド、（ポリ）ヌクレオチドなどの略号による表示は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの規定〔IUPAC-IUB Communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138: 9 (1984)〕、「塩基配列またはアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（日本国特許庁編）、および当該分野における慣用記号に従う。
【００１１】
本明細書において「ポリヌクレオチド」または「遺伝子」とは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡならびにＲＮＡを包含する趣旨で用いられる。また、その長さによって特に制限されるものではない。したがって、本明細書においてポリヌクレオチドとは、特に言及しない限り、ゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡおよびｃＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ（正鎖）および該正鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（相補鎖）、ならびにこれらの断片のいずれもが含まれる。また当該「ポリヌクレオチド」には、特定の塩基配列（配列番号：５または７）で示される「ポリヌクレオチド」だけでなく、これらによりコードされるポリ（ペプチド）と生物学的機能が同等であるポリ（ペプチド）（例えば同族体（ホモログやスプライスバリアントなど）、変異体および誘導体）をコードする「ポリヌクレオチド」が包含される。かかる同族体、変異体または誘導体をコードする「ポリヌクレオチド」としては、具体的には、ストリンジェントな条件下で、前記の配列番号：５または７で示されるいずれかの特定塩基配列の相補配列とハイブリダイズする塩基配列からなる「ポリヌクレオチド」を挙げることができる。なお、ここでストリンジェントな条件は、Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA) に教示されるように、核酸の融解温度（Ｔｍ）に基づいて決定することができる。例えばハイブリダイズ後の洗浄条件として、通常「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」程度の条件を挙げることができる。相補鎖はかかる条件で洗浄しても対象とする正鎖とハイブリダイズ状態を維持するものであることが好ましい。特に制限されないが、より厳しいハイブリダイズ条件として「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度、さらに厳しいハイブリダイズ条件として「０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度の洗浄条件を挙げることができる。
【００１２】
例えばショウジョウバエ由来のポリ（ペプチド）のホモログをコードするポリヌクレオチドとしては、当該ポリ（ペプチド）をコードするショウジョウバエ遺伝子に対応する蚊、カイコ、ハチなどの昆虫を始めとする他生物種の遺伝子が例示でき、これらの遺伝子（ホモログ）は、HomoloGene（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/HomoloGene/）により同定することができる。具体的には、特定のショウジョウバエの塩基配列をBLAST（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）にかけて一致する（Scoreが最も高く、E-valueが０でかつIdentityが１００％を示す）配列のアクセッション番号を取得する。そのアクセッション番号をUniGene（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/）に入力して得られたUniGene Cluster ID（Hs.で示す番号）をHomoloGeneに入力する。結果として得られた他の生物種の遺伝子とショウジョウバエ遺伝子との遺伝子ホモログの相関を示したリストから、特定の塩基配列で示されるショウジョウバエ遺伝子に対応する遺伝子（ホモログ）として他の生物種の遺伝子を選抜することができる。
なお、ポリヌクレオチドまたは遺伝子は、機能領域の別を問うものではなく、例えば発現制御領域、コード領域、エキソンまたはイントロンを含むことができる。
【００１３】
単離された本発明のペプチドまたはペプチドアミドは、本発明者らにより見出された下記（１）idalin-1および（２）idalin-2（これらは、ショウジョウバエに由来するものである）、ならびにそれらと同等の活性を有する変異ペプチドまたは変異ペプチドアミド（３）および（４）から構成されるペプチド群である。本発明においては、ペプチドまたはペプチドアミドのいずれも本発明の目的に使用することができる。本発明のペプチドまたはペプチドアミドは、図７に示すように、２つのシステイン残基が分子内ジスルフィド結合している。特に明記しない限り、本発明のペプチドまたはペプチドアミドは、ジスルフィド結合を有するものである。
【００１４】
（１）idalin-1：
ＧＣＱＡＹＧＨＶＣＹＧＧＨ−ＮＨ２（配列番号１）
ＫＫＧＣＱＡＹＧＨＶＣＹＧＧＨ−ＮＨ２（配列番号２）
ＡＱＱＳＱＡＫＫＧＣＱＡＹＧＨＶＣＹＧＧＨ−ＮＨ２（配列番号３）
上記アミノ酸配列のそれぞれについて、Ｃ末端はアミド化されていてもいなくてもよい。以下、idalin-1を代表して、配列番号１で表されるペプチドアミドをidalin-1と称する場合がある。
【００１５】
（２）idalin-2：
ＳＣＬＥＹＧＨＳＣＷＧＡＨ−ＮＨ２（配列番号４）
上記アミノ酸配列のＣ末端はアミド化されていてもいなくてもよい。以下、idalin-2を代表して、配列番号４で表されるペプチドアミドをidalin-2と称する場合がある。
【００１６】
（３）idalin-1の変異ペプチドまたは変異ペプチドアミド
配列番号１〜３のいずれかで表されるアミノ酸配列において、システイン残基を除く１〜５個（好ましくは１〜３個）のアミノ酸残基が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列からなる変異ペプチドまたは変異ペプチドアミドであっても、変異前のペプチドまたはペプチドアミドと同等のショウジョウバエＩＤＡ−１Ｒに対する結合活性を有する限り本発明のペプチドまたはペプチドアミドに含まれる。
ここで「同等のＩＤＡ−１Ｒに対する結合活性を有する」とは、実施例４に示す受容体結合試験において、変異前のペプチドまたはペプチドアミドと同等の結合親和性を有することをいう。同等の結合親和性としては、１０−１１〜１０−６Ｍ程度の結合親和性が例示される。
【００１７】
「アミノ酸残基の置換」としては、例えば保存的アミノ酸置換があげられる。保存的アミノ酸置換とは、特定のアミノ酸を、そのアミノ酸の側鎖と同様の性質の側鎖を有するアミノ酸で置換することをいう。具体的には、保存的アミノ酸置換では、特定のアミノ酸は、そのアミノ酸と同じグループに属する他のアミノ酸により置換される。同様の性質の側鎖を有するアミノ酸のグループは、当該分野で公知である。例えば、このようなアミノ酸のグループとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、中性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）があげられる。また、中性側鎖を有するアミノ酸は、さらに、極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン）、および非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）に分類することもできる。また、他のグループとして、例えば、芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン）、水酸基（アルコール性水酸基、フェノール性水酸基）を含む側鎖を有するアミノ酸（例えば、セリン、トレオニン、チロシン）などもあげることができる。また、ヒスチジンとメチオニンとの置換、グルタミン酸とセリンとの置換などもあげられる。
【００１８】
「アミノ酸残基の欠失」としては、例えば、各配列番号で表されるアミノ酸配列の中から、システイン残基を除く任意のアミノ酸残基を選択して欠失させることがあげられる。
【００１９】
「アミノ酸残基の付加」としては、各配列番号で表されるアミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端側に、１〜５個のアミノ酸残基を付加させることがあげられる。
【００２０】
idalin-1の変異ペプチドまたは変異ペプチドアミドの好適な具体例は、表１にリストされている。
【００２１】
（４）idalin-2の変異ペプチドまたは変異ペプチドアミド
配列番号４で表されるアミノ酸配列において、システイン残基を除く１〜３個のアミノ酸残基が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列であっても、変異前のペプチドまたはペプチドアミドと同等のショウジョウバエＩＤＡ−２Ｒに対する結合活性を有する限り、本発明のペプチドまたはペプチドアミドに含まれる。
ここで「同等のＩＤＡ−２Ｒに対する結合活性を有する」とは、実施例４ならびに図１２ＡおよびＢに示す受容体結合試験において、変異前のペプチドまたはペプチドアミドと同等の結合親和性を有することをいう。同等の結合親和性としては、１０−１１〜１０−６Ｍ程度の結合親和性が例示される。
【００２２】
「アミノ酸残基の置換」、「アミノ酸残基の欠失」および「アミノ酸残基の付加」は、上記（３）で説明した通りである。
【００２３】
idalin-2の変異ペプチドまたは変異ペプチドアミドの好適な具体例は、表２にリストされている。
【００２４】
上記アミノ酸はＬ体、Ｄ体およびＤＬ体を包含するものであるが、通常、Ｌ体であることが好ましい。本発明のペプチドは、通常のペプチド合成法によって合成され本発明に供することができるが、製造方法、合成方法、調達方法等については、特に限定されない。本発明のペプチドは、通常のペプチド合成装置を用いることにより、当業者であれば容易に合成することができる。また、本発明のペプチドアミドも常法によりペプチドのＣ末端をアミド化することにより、当業者であれば容易に合成することができる。
【００２５】
本発明のペプチドまたはペプチドアミドは、上述したような結合親和性を有することより、ＩＤＡ−１Ｒ（ＣＧ１４５９３、GenBank Accession No. NM_136355、idalin-1受容体とも称する）またはＩＤＡ−２Ｒ（ＣＧ３０１０６、GenBank Accession No. NM_137397、idalin-2受容体とも称する）に対するリガンドとして有用である。
【００２６】
（５）摂食抑制剤
本発明のペプチドまたはペプチドアミドは、ＩＤＡ−１ＲまたはＩＤＡ−２Ｒに対するリガンドであり、当該受容体に結合することによって、昆虫の摂食行動を抑制することができる。本発明は、本発明のペプチドまたはペプチドアミドを少なくとも１種含有する昆虫の摂食抑制剤を提供する。摂食抑制剤は、ペプチドまたはペプチドアミドのいずれか１種であっても２種以上であってもよい。２種以上含有する場合、その種類は特に限定されない。ペプチドまたはペプチドアミドの配合量は、適宜設定すればよいが、通常、摂食抑制剤中、０．０１〜９９．５重量％である。
【００２７】
本発明の摂食抑制剤は、昆虫を誘引するための誘引剤を含んでいてもよい。前記誘引剤としては、特に制限されないが、例えば、ビール酵母、蛹粉、酒かす、オキアミパウダー、卵黄、キャベツパウダー、キャロットパウダー、チキンエキスパウダー、シーズニングオイル、ストロベリーパウダー、ピーチパウダー、マッシュルームエキス、魚粉、牛（豚）肉粉等が挙げられる。誘引剤は、１種のみであってもよいし、２種以上であってもよい。誘引剤の配合量は、適宜設定すればよいが、通常、摂食抑制剤中、０．０１〜５０重量％である。
【００２８】
本発明の摂食抑制剤には、本発明の効果を損なわない範囲で、さらに必要に応じて、上記以外の成分を配合することができる。例えば、フェニル−β−ナフリルアミン、α−ナフリルアミン、Ｎ，Ｎ−ジ−第三ブチル−ｐ−フェニレンジアミン、２，６−ジ−第三ブチル−ｐ−クレゾール（ＢＨＴ）、２，６−第三ブチル−フェノール、２，４−ジ−メチル−６−第三ブチルフェノール、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）等の酸化防止剤；黄色２号、黄色４号、赤色２号、赤色３号、赤色１０２号、青色１号、青色２号、緑色２０１号、緑色２０２号等の色素；カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カラギーナン、キサンタンガム、デンプン類等の粘度調整剤；リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム等のｐＨ調整剤；水、エタノール、トウモロコシ油、ゴマ油等の溶剤；香料；などを配合することができる。
【００２９】
（６）害虫駆除剤
本発明は、本発明のペプチドまたはペプチドアミドを少なくとも１種含有する害虫駆除剤を提供する。害虫駆除剤は、ペプチドまたはペプチドアミドのいずれか１種であっても２種以上であってもよい。２種以上含有する場合、その種類は特に限定されない。ペプチドまたはペプチドアミドの配合量は、適宜設定すればよいが、通常、害虫駆除剤中、０．０１〜９９．５重量％である。
【００３０】
本発明の害虫駆除剤は、昆虫を誘引するための誘引剤を含んでいてもよい。前記誘引剤としては、特に制限されないが、例えば、ビール酵母、蛹粉、酒かす、オキアミパウダー、卵黄、キャベツパウダー、キャロットパウダー、チキンエキスパウダー、シーズニングオイル、ストロベリーパウダー、ピーチパウダー、マッシュルームエキス、魚粉、牛（豚）肉粉等が挙げられる。誘引剤は、１種のみであってもよいし、２種以上であってもよい。誘引剤の配合量は、適宜設定すればよいが、通常、摂食抑制剤中、０．０１〜５０重量％である。
【００３１】
本発明の害虫駆除剤には、本発明の効果を損なわない範囲で、さらに必要に応じて、上記以外の成分を配合することができる。例えば、フェニル−β−ナフリルアミン、α−ナフリルアミン、Ｎ，Ｎ−ジ−第三ブチル−ｐ−フェニレンジアミン、２，６−ジ−第三ブチル−ｐ−クレゾール（ＢＨＴ）、２，６−第三ブチル−フェノール、２，４−ジ−メチル−６−第三ブチルフェノール、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）等の酸化防止剤；黄色２号、黄色４号、赤色２号、赤色３号、赤色１０２号、青色１号、青色２号、緑色２０１号、緑色２０２号等の色素；カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カラギーナン、キサンタンガム、デンプン類等の粘度調整剤；安息香酸デナトニウム、トウガラシ粉末等の誤食防止剤；リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム等のｐＨ調整剤；水、エタノール、トウモロコシ油、ゴマ油等の溶剤；香料；などを配合することができる。
【００３２】
本発明の摂食抑制剤または害虫駆除剤は、単独で、または昆虫の餌と混合し、昆虫の生態系を考慮して、昆虫がアクセス可能な態様で昆虫に与えることができる。あるいは、害虫駆除剤は、積極的に昆虫の体内に導入することも好ましい。
【００３３】
（７）抗体
本発明は、本発明のペプチドまたはペプチドアミドに結合する抗体を提供する。本発明の抗体は、本発明のペプチドまたはペプチドアミドの検出手段、本発明のペプチドまたはペプチドアミドの阻害作用を通じて昆虫の食欲の増進作用が期待される。本発明の「抗体」には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、またはＦａｂフラグメントやＦａｂ発現ライブラリーによって生成されるフラグメントなどのように抗原結合性を有する前記抗体の一部が包含される。
【００３４】
前記抗体は、自体公知の方法により製造することができる。以下、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を例にとって、説明する。
ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、例えば免疫原（本発明のペプチドまたはペプチドアミド）を、必要に応じてフロイントアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ）と共に、哺乳動物、例えばポリクローナル抗体の場合、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ヤギ、ウマまたはウシなど、好ましくはマウス、ラット、ハムスター、モルモット、ヤギ、ウマまたはウサギに免疫する。モノクローナル抗体の場合は、同様の方法で、マウス、ラット、ハムスターなどに免疫する。
【００３５】
本発明のペプチドまたはペプチドアミドは、そのまま免疫原として用いることも可能であるが、分子量１万以上の高分子化合物との複合体として免疫することが望ましい。従って、免疫原として使用するとき、本発明のペプチドは、自体公知の方法により高分子化合物（例、タンパク質（以下、キャリアタンパク質と記載する場合がある）など）との複合体としてもよい。例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを上記記載の方法に従って合成し、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、ウサギ血清アルブミン（ＲＳＡ）、オボアルブミン（ＯＶＡ）、スカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）、チログロブリン（ＴＧ）、免疫グロブリン等のキャリアタンパク質との複合体を形成させる。当該複合体は、その後好ましい免疫原として用いることができる。
【００３６】
前記ペプチドとキャリアタンパク質との複合体を形成させるなどの目的で、本発明のペプチドには１〜２個、好ましくは１個のアミノ酸を付加することが出来る。付加されるアミノ酸の位置はペプチドのいずれの位置でもよく、特に限定されないが、ペプチドのＮ末端またはＣ末端が好ましい。
【００３７】
複合体の形成においては、本発明のペプチドの抗原性を維持することができる限り、限定なく公知の方法を適用することができる。例えば、本発明のペプチドにシステイン残基を導入し、当該システインの側鎖であるＳＨ基を介して前記高分子化合物（キャリアタンパク質）のアミノ基と結合させることもできる（ＭＢＳ法）。また、タンパク質のリジン残基のεアミノ基や、αアミノ基などのアミノ基同士を結合させることもできる（グルタルアルデヒド法）。
【００３８】
ポリクローナル抗体は、具体的には下記のようにして製造することができる。すなわち、免疫原をマウス、ラット、ハムスター、モルモット、ヤギ、ウマまたはウサギ、好ましくはヤギ、ウマまたはウサギ、より好ましくはウサギの皮下内、筋肉内、静脈内、フッドパッド内あるいは腹腔内に１〜数回注射することにより免疫感作を施す。通常、初回免疫から約１〜１４日毎に１〜５回免疫を行って、最終免疫より約１〜５日後に免疫感作された該哺乳動物から血清を取得する。
【００３９】
血清そのものをポリクローナル抗体として用いることも可能であるが、限外ろ過、硫安分画、ユーグロブリン沈澱法、カプロイン酸法、カプリル酸法、イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥまたはＤＥ５２等）、抗イムノグロブリンカラムもしくはプロテインＡ／Ｇカラム、免疫原を架橋させたカラム等を用いたアフィニティカラムクロマトグラフィーにより、該抗体を単離および／または精製し、得られた精製抗体を用いることも可能である。
【００４０】
モノクローナル抗体の製造方法としては、例えば下記の方法が挙げられる。まず上記免疫感作動物から得た該抗体産生細胞と自己抗体産生能のない骨髄腫系細胞（ミエローマ細胞）からハイブリドーマを調製し、該ハイブリドーマをクローン化する。すなわち、ハイブリドーマの培養上清を検体として、免疫学的手法により、哺乳動物の免疫に用いた本発明のペプチドに対する特異的親和性を示しかつキャリアタンパク質と交差反応性を示さないモノクローナル抗体を産生するクローンを選択する。次いで、当該ハイブリドーマの培養上清などから、自体公知の方法によって抗体を製造することができる。
【００４１】
具体的には、下記のようにしてモノクローナル抗体を製造することができる。すなわち、免疫原を、マウス、ラットまたはハムスターの皮下内、筋肉内、静脈内、フッドパッド内もしくは腹腔内に１〜数回注射するか、または移植することにより免疫感作を施す。通常、初回免疫から約１〜１４日毎に１〜４回免疫を行って、最終免疫より約１〜５日後に免疫感作された該哺乳動物の脾臓などから抗体産生細胞を取得する。
【００４２】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ（融合細胞）の調製は、ケーラーおよびミルシュタインらの方法（Nature,Vol.256,アポトーシス.495-497,1975）ならびにそれらに準じる修飾方法に従って行うことができる。すなわち、前述の如く免疫感作された哺乳動物から取得される脾臓、リンパ節、骨髄または扁桃等、好ましくは脾臓に含まれる抗体産生細胞と、好ましくはマウス、ラット、モルモット、ハムスターまたはウサギ等の哺乳動物、より好ましくはマウスまたはラット由来の自己抗体産生能のないミエローマ細胞との細胞融合により、ハイブリドーマを得る。
【００４３】
細胞融合に用いられるミエローマ細胞としては、例えばマウス由来ミエローマＰ３／Ｘ６３−ＡＧ８．６５３（６５３；ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ１５８０）、Ｐ３／ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１（ＮＳ−１）、Ｐ３／Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（Ｓｐ２／０、Ｓｐ２）、ＰＡＩ、Ｆ０またはＢＷ５１４７、ラット由来ミエローマ２１０ＲＣＹ３−Ａｇ．２．３．が挙げられる。
【００４４】
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングは、得られたハイブリドーマを、例えばマイクロタイタープレート内で培養し、増殖の見られたウェルの培養上清の、前述の免疫感作で用いた本発明のペプチドに対する反応性および前記上清のキャリアタンパク質に対する反応性を、例えばＥＬＩＳＡ等の免疫測定法によって測定し、比較することによって行うことができる。
【００４５】
スクリーニングによりクローン化されたハイブリドーマは、培地（例えば、１０％牛胎仔血清を含むＤＭＥＭ）を用いて培養される。そして、その培養液の遠心上清をモノクローナル抗体溶液とすることができる。また、該ハイブリドーマを、該ハイブリドーマに由来する動物の腹腔に注入することにより、動物に腹水を生成させ、該動物から得られた腹水をモノクローナル抗体溶液とすることができる。モノクローナル抗体は、上述のポリクローナル抗体と同様の方法で、単離および／または精製されることが好ましい。
【００４６】
（８）ポリヌクレオチド
本発明は、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリペプチドは、具体的には、idalin-1またはidalin-2の前駆体をコードする配列番号５または７で表される塩基配列全長からなるものであってもよく、その一部からなるものであってもよい。
【００４７】
（９）成長促進剤
idalin-1およびidalin-2は、摂食抑制作用を有する生理活性ペプチドであり、生体内でのidalin-1および／またはidalin-2の発現を特異的に阻害する物質は、昆虫の食欲を増進し、成長を促進させる作用を有することが期待される。本発明は、idalin-1および／またはidalin-2の発現を特異的に阻害する物質を含有する、昆虫の成長促進剤を提供する。
【００４８】
本発明の成長促進剤に有効成分として含まれるidalin-1の発現を特異的に阻害する物質は、idalin-1の前駆体（例えば、配列番号５および６）の転写過程に作用してその発現を特異的に阻害する物質であれば特に限定されるものではない。また、本発明の成長促進剤に有効成分として含まれるidalin-2の発現を特異的に阻害する物質は、idalin-2の前駆体（例えば、配列番号７および８）の転写過程に作用してその発現を特異的に阻害する物質であれば特に限定されるものではない。かかる阻害物質としては、ＲＮＡｉ誘導性核酸、アンチセンス核酸もしくはリボザイムまたはそれらの発現ベクターが挙げられる。
【００４９】
前記ＲＮＡｉ誘導性核酸とは、細胞内に導入されることにより、ＲＮＡ干渉を誘導し得るポリヌクレオチドをいい、好ましくはＲＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡのキメラ分子である。ＲＮＡ干渉とは、ｍＲＮＡと同一の塩基配列（またはその部分配列）を含む２本鎖構造のＲＮＡが、当該ｍＲＮＡの発現を抑制する効果をいう。このＲＮＡｉ効果を得るには、例えば、少なくとも１９の連続する標的ｍＲＮＡと同一の塩基配列（またはその部分配列）を有する２本鎖構造のＲＮＡを用いることが好ましい。ただし、idalin-1またはidalin-2の発現阻害作用を有していれば数塩基置換されているものであってもよく、１９塩基長よりも短いＲＮＡであってもよい。２本鎖構造は、センス鎖とアンチセンス鎖の異なるストランドで構成されていてもよいし、一つのＲＮＡのステムループ構造によって与えられる２本鎖（ｓｈＲＮＡ）であってもよい。ＲＮＡｉ誘導性核酸としては、例えばｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどが挙げられる。
【００５０】
ＲＮＡｉ誘導性核酸は、転写抑制活性が強いという観点から、ｓｉＲＮＡが好ましい。idalin-1またはidalin-2に対するｓｉＲＮＡは、idalin-1またはidalin-2のｍＲＮＡの任意の部分を標的とすることができる。idalin-1またはidalin-2に対するｓｉＲＮＡ分子は、ＲＮＡｉ効果を誘導できる限り特に制限されないが、例えば１９〜２７塩基長、好ましくは２１〜２５塩基長である。idalin-1またはidalin-2に対するｓｉＲＮＡは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二重鎖である。具体的には、idalin-1に対するｓｉＲＮＡは、配列番号５の塩基配列に対応するｍＲＮＡにおける１９〜２５個の連続する塩基配列を含むセンス鎖と、その相補配列を含むアンチセンス鎖からなるものである。idalin-2に対するｓｉＲＮＡは、配列番号７の塩基配列に対応するｍＲＮＡにおける１９〜２５個の連続する塩基配列を含むセンス鎖と、その相補配列を含むアンチセンス鎖からなるものである。idalin-1またはidalin-2に対するｓｉＲＮＡは、センス鎖、アンチセンス鎖の一方または双方の５’末端または３’末端においてオーバーハング（overhang）を有していてもよい。オーバーハングは、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の末端における１〜数個（例、１、２または３個）の塩基の付加により形成されるものである。ｓｉＲＮＡの設計方法は、当業者に公知であり、ｓｉＲＮＡの様々な設計ソフトウエアまたはアルゴリズムを用いて、上記塩基配列から適切なｓｉＲＮＡの塩基配列を選択することができる。
【００５１】
ＲＮＡｉ誘導性核酸は、ＲＮＡを構成する天然のヌクレオチドから構成されていてもよいが、ヌクレアーゼ耐性の向上もしくは安定化、相補鎖核酸とのアフィニティーの向上または細胞透過性を高めるために、ヌクレオチドに修飾を施したヌクレオチド誘導体を一部含んでいてもよい。ヌクレオチド誘導体としては、例えば糖部修飾ヌクレオチド、リン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチド、塩基修飾ヌクレオチド、ならびに糖部、リン酸ジエステル結合および塩基の少なくとも一つが修飾されたヌクレオチド等があげられる。
【００５２】
idalin-1に対するアンチセンス核酸またはidalin-2に対するアンチセンス核酸は、idalin-1またはidalin-2の前駆体の転写産物（ｍＲＮＡまたは初期転写産物）を発現する細胞の生理的条件下で該転写産物とハイブリダイズし得る塩基配列からなり、且つハイブリダイズした状態で該転写産物にコードされるポリペプチドの翻訳を阻害し得るポリヌクレオチドをいう。アンチセンス核酸の種類はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいし、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよい。アンチセンス核酸は、天然型のリン酸ジエステル結合を有するものであっても、分解酵素に安定なチオリン酸型（リン酸結合のＰ＝ＯをＰ＝Ｓに置換）や２’−Ｏ−メチル型等の修飾ヌクレオチドであってもよい。アンチセンス核酸の設計に重要な他の要素として、水溶性および細胞膜透過性を高めること等が挙げられるが、これらはリポソームやマイクロスフェアを使用するなどの剤形の工夫によっても克服できる。アンチセンス核酸の長さは、idalin-1またはidalin-2の前駆体の転写産物（例、配列番号５または配列番号７の塩基配列に対応するｍＲＮＡ）と特異的にハイブリダイズし得る限り特に制限はなく、短いもので約１５塩基程度、長いもので転写産物の全配列に相補的な配列を含むような配列であってもよい。合成の容易さや抗原性の問題等から、例えば約１５塩基以上、好ましくは約１５〜約３０塩基、より好ましくは約１８塩基〜約３０塩基からなるオリゴヌクレオチドが例示される。さらに、アンチセンス核酸は、idalin-1またはidalin-2の転写産物とハイブリダイズして翻訳を阻害するだけでなく、二本鎖ＤＮＡと結合して三重鎖（トリプレックス）を形成し、ｍＲＮＡへの転写を阻害し得るものであってもよい。
【００５３】
本明細書において、「相補的である」とは、塩基配列間で約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、更に好ましくは約９５％以上、最も好ましくは１００％の相補性を有することをいう。本明細書における塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝−３）にて計算することができる。
【００５４】
前記「リボザイム」とは核酸を切断する酵素活性を有するＲＮＡをいうが、最近では当該酵素活性部位の塩基配列を有するオリゴＤＮＡも同様に核酸切断活性を有することが明らかになっているので、本明細書では配列特異的な核酸切断活性を有する限りＤＮＡをも包含する概念として用いる。具体的には、リボザイムは、idalin-1またはidalin-2をコードするｍＲＮＡまたは初期転写産物を、コード領域の内部（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）で特異的に切断し得る。リボザイムとして最も汎用性の高いものとしては、ウイロイドやウイルソイド等の感染性ＲＮＡに見られるセルフスプライシングＲＮＡがあり、ハンマーヘッド型やヘアピン型等が知られている。ハンマーヘッド型は約４０塩基程度で酵素活性を発揮し、ハンマーヘッド構造をとる部分に隣接する両端の数塩基ずつ（合わせて約１０塩基程度）をｍＲＮＡの所望の切断部位と相補的な配列にすることにより、標的ｍＲＮＡのみを特異的に切断することが可能である。さらに、リボザイムを、それをコードするＤＮＡを含む発現ベクターの形態で使用する場合には、転写産物の細胞質への移行を促進するために、ｔＲＮＡを改変した配列をさらに連結したハイブリッドリボザイムとすることもできる（Nucleic Acids Res., 29(13): 2780-2788 (2001)）。
【００５５】
idalin-1およびidalin-2特異的阻害物質は、発現ベクターとしても提供され得る。かかる発現ベクターは、idalin-1およびidalin-2特異的阻害物質をコードするポリヌクレオチド、および当該ポリヌクレオチドに機能可能に連結されたプロモーターを含む。
【００５６】
前記プロモーターは、その制御下にある発現対象の核酸の種類により適宜選択され得るが、基本的には昆虫細胞で機能するプロモーターであれば限定なく使用することができ、例えば、ショウジョウバエ熱ショックタンパク質プロモーター、前記熱ショックタンパク質プロモーターと酵母ＧＡＬ４−ＵＡＳシステムとを組み合わせたプロモーター、ショウジョウバエアクチンプロモーター等が挙げられる。
【００５７】
好適には、本発明の昆虫の成長促進剤は、下記いずれかの二本鎖ＲＮＡを含む：
配列番号５の塩基配列に対応するｍＲＮＡにおける１９〜２５個の連続する塩基配列を含むセンス鎖と、その相補配列を含むアンチセンス鎖の組み合わせ；または
配列番号７の塩基配列に対応するｍＲＮＡにおける１９〜２５個の連続する塩基配列を含むセンス鎖と、その相補配列を含むアンチセンス鎖の組み合わせ。
【００５８】
本発明の成長促進剤は、含まれる成分および目的に応じて配合量を適宜設定することができる。通常、成長促進剤中、０．０１〜９９．５重量％である。
【００５９】
本発明の成長促進剤は、昆虫を誘引するための誘引剤を含んでいてもよい。前記誘引剤としては、特に制限されないが、例えば、ビール酵母、蛹粉、酒かす、オキアミパウダー、卵黄、キャベツパウダー、キャロットパウダー、チキンエキスパウダー、シーズニングオイル、ストロベリーパウダー、ピーチパウダー、マッシュルームエキス、魚粉、牛（豚）肉粉等が挙げられる。誘引剤は、１種のみであってもよいし、２種以上であってもよい。誘引剤の配合量は、適宜設定すればよいが、通常、成長促進剤中、０．０１〜５０重量％である。
【００６０】
本発明の成長促進剤には、本発明の効果を損なわない範囲で、さらに必要に応じて、上記以外の成分を配合することができる。例えば、フェニル−β−ナフリルアミン、α−ナフリルアミン、Ｎ，Ｎ−ジ−第三ブチル−ｐ−フェニレンジアミン、２，６−ジ−第三ブチル−ｐ−クレゾール（ＢＨＴ）、２，６−第三ブチル−フェノール、２，４−ジ−メチル−６−第三ブチルフェノール、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）等の酸化防止剤；黄色２号、黄色４号、赤色２号、赤色３号、赤色１０２号、青色１号、青色２号、緑色２０１号、緑色２０２号等の色素；カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カラギーナン、キサンタンガム、デンプン類等の粘度調整剤；リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム等のｐＨ調整剤；水、エタノール、トウモロコシ油、ゴマ油等の溶剤；香料；などを配合することができる。
【００６１】
本発明の成長促進剤は、単独で、または昆虫の餌と混合し、昆虫の生態系を考慮して、昆虫がアクセス可能な態様で昆虫に与えることができる。
【００６２】
生体内でのidalin-1および／またはidalin-2の作用は、それらの受容体への結合を介して発揮されるものであるから、該受容体の発現または機能を特異的に阻害する物質も、昆虫の食欲を増進し、成長を促進させる作用を有することが期待される。本発明は、ＩＤＡ−１Ｒおよび／またはＩＤＡ−２Ｒの発現または機能を阻害する物質を含有する、昆虫の成長促進剤を提供する。
【００６３】
ＩＤＡ−１ＲおよびＩＤＡ−２Ｒは、上述したように、idalin-1受容体およびidalin-2受容体とも称し、それらの塩基配列およびアミノ酸配列は、公知である。例えば、ショウショウバエ由来のＩＤＡ−１Ｒ（ＣＧ１４５９３）の塩基配列およびアミノ酸配列はGenBank Accession No. NM_136355として登録され、それぞれ配列番号３４および配列番号３５で示す。例えば、ショウショウバエ由来のＩＤＡ−２Ｒ（ＣＧ３０１０６）の塩基配列およびアミノ酸配列はGenBank Accession No. NM_137397として登録され、それぞれ配列番号３６および配列番号３７で示す。上述したように、ＩＤＡ−１ＲおよびＩＤＡ−２Ｒは、ホモログなどを含む概念であり、ショウショウバエ由来のＩＤＡ−１ＲおよびＩＤＡ−２Ｒに対するホモログは、Homologeneにより同定することができる。
【００６４】
ＩＤＡ−１Ｒおよび／またはＩＤＡ−２Ｒの発現または機能を阻害する物質は、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかであることが好ましい。
（ｉ）ＩＤＡ−１Ｒおよび／またはＩＤＡ−２Ｒをコードする遺伝子のアンチセンス核酸、リボザイム、ＲＮＡｉ誘導性核酸、デコイ核酸またはターゲッティングベクター、
（ｉｉ）ＩＤＡ−１Ｒおよび／またはＩＤＡ−２Ｒに対する抗体、当該抗体をコードする核酸、当該ＩＤＡ−１Ｒおよび／またはＩＤＡ−２Ｒのドミナントネガティブ変異体または当該変異体をコードする核酸、または
（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の核酸を含む発現ベクター。
【００６５】
ＩＤＡ−１Ｒおよび／またはＩＤＡ−２Ｒの発現を阻害する物質がアンチセンス核酸、リボザイム、ＲＮＡｉ誘導性核酸、デコイ核酸などの核酸分子である場合、本発明の成長促進剤は、当該核酸分子をコードする発現ベクターを有効成分とすることもできる。当該発現ベクターは、通常、上記の核酸分子をコードするオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドが、投与対象である昆虫細胞内でプロモーター活性を発揮し得るプロモーターに機能的に連結されている。アンチセンス核酸、リボザイム、ＲＮＡｉ誘導性核酸、デコイ核酸およびその発現ベクターについては、idalin-1およびidalin-2の発現を阻害する物質において説明した通りである。
【００６６】
ＩＤＡ−１Ｒおよび／またはＩＤＡ−２Ｒの発現を阻害する物質の別の態様は、ターゲティングベクターである。本発明で用いられるターゲティングベクターは、当該ＩＤＡ−１Ｒおよび／またはＩＤＡ−２Ｒをコードする遺伝子の相同組換えを誘導し得る遺伝子に相同な第一のポリヌクレオチドおよび第二のポリヌクレオチド、並びに選択マーカーを含む。第一および第二のポリヌクレオチドは、当該ＩＤＡ−１Ｒおよび／またはＩＤＡ−２Ｒをコードする遺伝子を含むゲノムＤＮＡに対して、相同組換えを生じるのに十分な程度の配列同一性および長さを有するポリヌクレオチドである。第一および第二のポリヌクレオチドは、当該遺伝子を含むゲノムＤＮＡにおいて、第一および第二のポリヌクレオチドに対して相同な２つの領域の間に存在するゲノムＤＮＡ部分領域が欠失すると、当該遺伝子の機能的欠損がもたらされるように選択される。選択マーカーとしては、ポジティブ選択マーカー（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ＢＰＨ）遺伝子、ブラスティシジンＳデアミナーゼ遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子）、ネガティブ選択マーカー（例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子、ジフテリア毒素Ａフラグメント（ＤＴＡ）遺伝子）などが挙げられる。ターゲティングベクターは、ポジティブ選択マーカー、ネガティブ選択マーカーのいずれか一方、または両方を含むことができる。ターゲティングベクターはまた、２以上のリコンビナーゼ標的配列（例えば、バクテリオファージＰ１由来のＣｒｅ／ｌｏｘＰシステムで用いられるｌｏｘＰ配列、酵母由来のＦＬＰ／ＦＲＴシステムで用いられるＦＲＴ配列）を含んでいてもよい。
【００６７】
ＩＤＡ−１Ｒおよび／またはＩＤＡ−２Ｒの機能を阻害する物質の一態様は、当該ＩＤＡ−１Ｒおよび／またはＩＤＡ−２Ｒに対する抗体、当該抗体をコードする核酸（プロモーター活性を有する核酸に機能可能に連結されたもの）、または当該核酸を含む発現ベクターである。当該抗体は、当該ＩＤＡ−１Ｒおよび／またはＩＤＡ−２Ｒを認識するものであれば特に制限されず、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれであってもよく、周知の免疫学的手法により作製することができる。また、当該抗体は、抗体のフラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２）、組換え抗体（例えば、単鎖抗体）であってもよい。
【００６８】
ＩＤＡ−１Ｒおよび／またはＩＤＡ−２Ｒの機能を阻害する物質の別の一態様は、当該ＩＤＡ−１Ｒおよび／またはＩＤＡ−２Ｒのドミナントネガティブ変異体、当該変異体をコードする核酸（プロモーター活性を有する核酸に機能可能に連結されたもの）、当該核酸を含む発現ベクター、低分子有機化合物などが例示される。
【００６９】
ＩＤＡ−１Ｒおよび／またはＩＤＡ−２Ｒのドミナントネガティブ変異体とは、当該ＩＤＡ−１Ｒおよび／またはＩＤＡ−２Ｒに対する変異の導入によりその活性が低減したものをいう。当該ドミナントネガティブ変異体は、天然のＩＤＡ−１Ｒおよび／またはＩＤＡ−２Ｒと競合することで間接的にその活性を阻害することができる。当該ドミナントネガティブ変異体は、当該ＩＤＡ−１Ｒおよび／またはＩＤＡ−２Ｒをコードする核酸に変異を導入することによって作製することができる。その変異としては、例えば、ミリストイル化部位、ＤＮＡ結合部位並びにこれらの部位以外の部位における、当該部位が担う機能の低下をもたらすようなアミノ酸の変異（例えば、１以上のアミノ酸の欠失、置換、付加）が挙げられる。当該変異は、ＰＣＲや公知のキットを用いる自体公知の方法により導入することができる。
【００７０】
好適には、本発明の昆虫の成長促進剤の有効成分はＲＮＡｉ誘導性核酸であり、下記いずれかの二本鎖ＲＮＡを含む：
配列番号３４の塩基配列に対応するｍＲＮＡにおける１９〜２５個の連続する塩基配列を含むセンス鎖と、その相補配列を含むアンチセンス鎖の組み合わせ；または
配列番号３６の塩基配列に対応するｍＲＮＡにおける１９〜２５個の連続する塩基配列を含むセンス鎖と、その相補配列を含むアンチセンス鎖の組み合わせ。
【００７１】
本発明の摂食抑制剤もしくは害虫駆除剤または成長促進剤は、目的に応じて昆虫を適宜選択して投与することができる。摂食抑制剤は、害虫を対象とすることが好ましく、成長促進剤は、益虫を対象とすることが好ましい。
【００７２】
本発明が対象とする害虫及びダニ類として、鱗翅目害虫、例えばアオムシ、ハスモンヨトウ、アワノメイガ、コナガ、ニカメイチュウ、コブノメイガ、ドクガ等；半翅目害虫、例えば、ツマグロヨコバイ、トビイロウンカ、ヒメトビウンカ、ヤノネカイガラムシ、モモアカアブラムシ、ワタアブラムシ、ニセダイコンアブラムシ、アオカメムシ、オンシツコナジラミ、シラミ、トコジラミ、コロモジラミ、サシガメ等；鞘翅目害虫、例えば、アズキゾウムシ、コクゾウムシ、ニジュウヤホシテントウ、ヒメコガネ、コロラドポテトビートル、イネミズゾウムシ、マツノゴマダラカミキリ、キクイムシ、ハネカクシ等；直翅目害虫、例えば、チャバネゴキブリ、クロゴキブリ、ワモンゴキブリ、ケラ、バッタ、ヤマトシロアリ、イエシロアリ等；双翅目害虫、例えば、イエバエ、キンバエ、クロバエ、サシバエ、サシチョウバエ、メルラアブ、ツェツェバエ、アブ、ブユ、ヌカカ、ネッタイシマカ、ヒトスジシマカ、アカイエカ、シナハマダラカ、コガタアカイエカ、イエカ、ヤブカ、ヌマカ等；ダニ類、例えば、イエダニ、マダニ、ツツガムシ、ヒメダニ、ヒゼンダニ、チリダニ、コナダニ等をあげることができる。
【００７３】
本発明が対象とする益虫として、ミツバチ、カイコ、カブトムシなどをあげることができる。
【実施例】
【００７４】
以下、実施例により本発明をさらに説明するが、本発明はいかなる意味においてもこれらに限定されるものではない。
【００７５】
実施例１：細胞培養、トランスフェクション、ＧＰＣＲ発現細胞株の調製
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、ＣＨＯ培地（１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補足したＭＥＭ−alpha、これらの試薬は、Gibco製のものを使用した）中で維持した。
【００７６】
脊椎動物Bombesin/Gastrin Releasing Peptide receptorファミリー（図１を参照）に関連するショウジョウバエＧＰＣＲのＣＧ１４５９３およびＣＧ３０１０６のｃＤＮＡクローニングは、reverse transcriptase（ＲＴ−）ＰＣＲ法を用いて行った。ショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）の成虫の全長ｃＤＮＡを、以下のプライマーセット：
ＣＧ１４５９３（ＮＭ＿１３６３５５）
5’-cacctgagacatcttgcccaggag-3’（配列番号２６）
5’-gtgtttcggtacctccatttat-3’（配列番号２７）
ＣＧ３０１０６（ＮＭ＿１３７３９７）
5’-caccaaatcgagcggactcagtacat-3’（配列番号２８）
5’-gtggcctgtaattcctgtaaactc-3’（配列番号２９）
を用いて増幅した。ＰＣＲの条件は、以下の通りであった：
ＰＣＲ反応液(Takara)
10xPyrobest buffer II ５μｌ
dNTP mix ４μｌ
primer S (１μＭ) ５μｌ
AS (１μＭ) ５μｌ
Pyobest ０．２５μｌ
H２O ２９．７５μｌ
cDNA １μｌ
全量 ５０μｌ
温度条件
94℃ 2minを1 cycleの後、
98℃ 10sec、55℃ 30sec、および72℃ 2minを30 cyclesし、
72℃ 3minを1 cycleし、4℃に冷却した。
得られた増幅産物（ＣＧ１４５９３ １５３４ｂｐ、ＣＧ３０１０６ １５９６ｂｐ）をpcDNA3.2/V5/GW/D-TOPO発現ベクター（Invitrogen）にクローニングし、シークエンシングにより配列を確認した。
【００７７】
発現ベクターＣＧ１４５９３−pcDNA3.2/V5/GW/D-TOPOおよび３０１０６−pcDNA3.2/V5/GW/D-TOPOのＣＨＯ細胞へのトランスフェクションは、トランスフェクション試薬としてＦｕｇｅｎｅ６（Boehringer Mannheim）を用いて、販売業者の指示書に従って行った。抗生物質による選択（１ｍｇ/ｍｌ Ｇ４１８）およびクローン選択の後、ＣＧ１４５９３発現ＣＨＯ細胞株およびＣＧＣＧ３０１０６発現ＣＨＯ細胞株をそれぞれ得た。以下、各細胞株をＣＨＯ−ＣＧ１４５９３およびＣＨＯ−ＣＧ３０１０６と称する。
【００７８】
実施例２：ショウジョウバエidalin-1およびidalin-2の精製
ショウジョウバエの成虫（３５０ｇ）を１０倍容量の脱イオン水を加えて１０分間煮沸し、０℃まで冷却した。酢酸を添加し（最終ｐＨ３．０）、Kinematica polytronでホモジナイズした後、ホモジネートを遠心分離し、上清を分離してエバポレーターにて３分の１量まで濃縮した。次に２倍量のアセトンを加え、一晩４℃にて攪拌後、遠心し上清をグラスフィルターにて濾過した。エバポレーターにてアセトン除去後、SepPak C18カートリッジ（Waters）を用いて脱塩、濃縮し、０．１％トリフルオロ酢酸でリンスした後、０．１％トリフルオロ酢酸中６０％アセトニトリルで各カートリッジから溶出した。溶出液を凍結乾燥させ、出発材料として用いた。前記凍結乾燥物を１Ｍ酢酸に溶解し、ＳＰ−ＳｅｐｈａｄｅｘＣ−２５（Ｈ＋型）カラムに吸着させ、１Ｍ酢酸で平衡化した。１Ｍ酢酸、２Ｍピリジンおよび２Ｍピリジン−酢酸（ｐＨ５．０）での連続溶出により、ＳＰ−Ｉ、ＳＰ−IIおよびＳＰ−IIIの各フラクションを得た。
【００７９】
次に、凍結乾燥した塩基性ペプチドフラクションＳＰ−IIIを、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−５０ゲルろ過カラムにかけ、分画した。各フラクションのリガンド活性を以下のように調べた。
ＣＨＯ−ＣＧ１４５９３およびＣＨＯ−ＣＧ３０１０６は、各細胞表面にＧＰＣＲであるＣＧ１４５９３またはＣＧ３０１０６が発現し、当該受容体にリガンドが結合すると、細胞内カルシウム濃度が上昇することが期待されるので、細胞内カルシウム濃度の変化を測定することによって、各受容体に結合するリガンド活性を追跡した。
ＣＨＯ−ＣＧ１４５９３およびＣＨＯ−ＣＧ３０１０６をＣＨＯ培地中で維持し、上記で分画したフラクションの一部を各培地に添加し、当該細胞における細胞内カルシウムイオン濃度（[Ｃａ２＋]ｉ）の変化を、蛍光イメージングプレートリーダー（FLEX）システム（Molecular Devices）を用いて既報（Nature, 1999; 402: pp.656-660）に準じて測定した。すなわち、アッセイの１２〜１５時間前にＣＨＯ−ＣＧ１４５９３またはＣＨＯ−ＣＧ３０１０６細胞（５×１０４細胞）を９６ウェルの黒壁マイクロプレート（Corning）に播種した。細胞をFLEX Calcium 4 Assay Kit（Molecular Devices）１００μｌとともに１時間インキュベートした後、蛍光イメージングプレートリーダー（FLEX）に供し、サンプル（フラクション）が蛍光の変化を誘導するか否かを測定した。最大[Ｃａ２＋]ｉの変化を三連で決定した。結果をそれぞれ図２、７に示す。カルシウムイオン濃度の上昇したフラクションを活性フラクションとしてさらなる精製に供した。
【００８０】
プールした活性フラクションを、TSK−GEL CM−25Wカラム（Tosoh）を用いるカルボキシメチル（ＣＭ）イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供した。ＨＰＬＣの条件は、以下の通りである。
溶離液：１０％アセトニトリル中、ギ酸アンモニウム１０ｍＭ−０．６Ｍの直線勾配
溶出速度：１ｍｌ／分（１６−１３６分）
各フラクションについて上述のようにFLEXシステムで細胞内カルシウムイオン濃度の変化を測定し、活性フラクションをプールし、さらに以下の精製に供した。
【００８１】
プールした活性フラクションを、μＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅＣ１８カラム（Waters）を用いる逆相（ＲＰ）−ＨＰＬＣに供した。ＨＰＬＣの条件は、以下の通りである。
溶離液：０．１％トリフルオロ酢酸中（ＴＦＡ）、１０−６０％アセトニトリルの直線勾配
溶出速度：１ｍｌ／分（８０分）
【００８２】
さらに、活性フラクションをＣｈｅｍｃｏｓｏｒｂ ３ＯＤＳ−Ｈカラム（Chemco）を用いるＲＰ−ＨＰＬＣに供した。ＨＰＬＣの条件は、以下の通りである。
溶離液：０．１％トリフルオロ酢酸中（ＴＦＡ）、１０−６０％アセトニトリルの直線勾配
溶出速度：０．２ｍｌ／分（８０分）
結果を図３、８に示す。
吸収ピークに相当するフラクションを集め、各フラクションの一部をFLEXシステムにより測定した。約２０ｐｍｏｌの主要活性フラクションの最終精製ペプチドを、プロテインシークエンサー（モデル４９４、Applied Biosystems）で解析した。また、約１ｐｍｏｌの各活性フラクションを用いて、マトリックス支援レーザー脱着−イオン化飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析計およびＶｏｙａｇｅｒ−ＤＥ ＰＲＯ instrument（Applied Biosystems）により分子量を決定した。
【００８３】
その結果、ＣＧ１４５９３に結合するリガンドとしてidalin-1、およびＣＧ３０１０６に結合するリガンドとしてidalin-2を単離し、精製することに成功した。得られたペプチドリガンドの配列を以下に示す。
【００８４】
idalin-1：
GCQAYGHVCYGGH-NH2 （配列番号１、図５の(1)以下下線で示す領域）
KKGCQAYGHVCYGGH-NH2 （配列番号２、図５の(2)以下下線で示す領域）
AQQSQAKKGCQAYGHVCYGGH-NH2 （配列番号３、図５の(3)以下下線で示す領域）
idalin-2：
SCLEYGHSCWGAH-NH2 （配列番号４、図１０の下線で示す領域）
【００８５】
idalin-1として、上記３種のペプチドが単離され、Ｃ末端のアミド体と非アミド体の両方が得られた。また、上記ペプチド中に存在する２つのシステインは、分子内ジスルフィド結合を有していた。idalin-1をジチオスレイトール（ＤＴＴ）にて還元し、Ｓ−Ｓ結合が切れた物をＨＰＬＣで回収したチャートを図６に示す。Ｓ−Ｓ結合が還元されたペプチドを、後述する実施例４で受容体との結合アッセイをしても活性がなかった。このことから、Ｓ−Ｓ結合が活性に必要であることがわかった。以下の解析は、配列番号１で示されるペプチドアミドをidalin-1の代表として用いた（図４）。
【００８６】
idalin-2も、Ｃ末端のアミド体と非アミド体の両方が得られた。また、上記ペプチド中に存在する２つのシステインは、分子内ジスルフィド結合を有していた（図８）。idalin-2をジチオスレイトール（ＤＴＴ）にて還元し、Ｓ−Ｓ結合が切れた物をＨＰＬＣで回収したチャートを図１１に示す。Ｓ−Ｓ結合が還元されたペプチドを、後述する実施例４で受容体との結合アッセイをしても活性がなかった。このことから、Ｓ−Ｓ結合が活性に必要であることがわかった。
得られたidalin-1およびidalin-2のアミノ酸配列に基づいて、他の昆虫のゲノムデータベースを探索し、他の昆虫種に存在するidalin-1様ペプチドおよびidalin-2様ペプチドをアラインした。結果を表１および表２に示す。
【００８７】
【表１】
【００８８】
【表２】
【００８９】
実施例３：idalin-1およびidalin-2の前駆体のクローニング
idalin-1およびidalin-2の前駆体は、既にデータベース上で公開されており：
idalin-1前駆体ＣＧ１４３７５（ＮＭ＿１４２０２８）および
idalin-2前駆体ＣＧ１４３５８（ＮＭ＿００１１０４３１４）、
公開されている塩基配列に基づいてプライマーを設計し、クローニングした。
idalin-1の前駆体の塩基配列およびアミノ酸配列をそれぞれ配列番号５および６に示し、idalin-2の前駆体の塩基配列およびアミノ酸配列をそれぞれ配列番号７および８に示す。
【００９０】
実施例４：idalin-1およびidalin-2と受容体との結合実験
合成idalin-1およびidalin-2は、ペプチド研究所（大阪）にて合成し、FLEX buffer(kit含有)のＨａｎｋ’ｓ ＢＳＳ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ）にて溶解した。以下、実施例２に記載の方法と同様にして、表３に示すペプチドと受容体との結合試験を実施した。結果を表３および図１２Ａ、Ｂに示す。
【００９１】
【表３】
【００９２】
実施例５：idalin-1トランスジェニックハエの作出および解析
以下のプライマーセットを準備した：
D,CG14375-S1NotI
idalin-1
5’-ATTGCGGCCGCcaccagccaagtgcaagtatc-3’（配列番号３０）
D,CG14375-AS1XbaI
5’-ATTTCTAGAcggtttttaatgtacgttgtgg-3’（配列番号３１）
idalin-2
5’-ATTGCGGCCGCcgtgcagcttgcgaaataata-3’（配列番号３２）
5’-ATTTCTAGActtctggcttagctagcgtgttatc-3’（配列番号３３）。
sense primer にNotIで、並びにanitsense primerにXbaIで制限酵素サイトをつけ、LA taqを用いてショウジョウバエ成虫ｃＤＮＡをテンプレートにしてＰＣＲを行った。バンドを切り出して精製し、DNA Ligation Kit Ver.2.1 (TaKaRa)にてpUASTベクターにライゲーションした。大腸菌にて増幅後、プラスミドを精製した。精製済みプラスミドを、
Genetic Services Inc.(MA,USA)（http://www.geneticservices.com/index.htm）に送付し、トランスジェニックハエの作出を依頼した。卵にインジェクション後、生まれたショウジョウバエをw1118と掛け合わせて得られたハエをライン化した。このトランスジェニックハエ（ホモ）を、全ての神経細胞で酵母GAL4タンパク質が発現するelav-GAL4系統のトランスジェニックハエ（ホモ）と交配して生まれてきた第一世代のトランスジェニックハエ（それぞれのトランスジーンについてヘテロ）を実験に使用した。このハエでは、idalin-1が全ての神経細胞で過剰に発現している。
【００９３】
idalin-1トランスジェニックハエ（ヘテロ）では、コントロールのハエ（elav-GAL4のみを持つヘテロのトランスジェニックハエ）に比べて、孵化しない率が７５％、さなぎにならない率が７２％に低下しており、全体として卵から羽化する率はコントロールの半分以下であった。
【００９４】
次に、交配中のハエを、水で軽く湿らせた濾紙（Whatman 3MM paper)を内壁に付着するように設置した飼育用プラスチックバイアルで２日間産卵させ、その５日後に濾紙を取り出して、サナギの形成位置を観察した。
【００９５】
結果を図１７に示す。idalin-1トランスジェニックハエ（ヘテロ）の幼虫は、コントロールのハエ（図１７Ｃ、Ｄ）に比べて、バイアルの壁に沿わせた紙（水で湿らせたもの）を登る数が有意に少なかった（図１７Ａ、Ｂ）。また、idalin-1トランスジェニックハエ（ヘテロ）の幼虫は、摂食行動がコントロールに比べて有意に減少し、餌から動こうとしなかった。トランスジェニックハエではサナギがほとんど餌近辺の下部に集中しており、濾紙を上方に登っていないことがわかる。
【００９６】
実施例６：ＩＤＡ−１Ｒ受容体遺伝子破壊系統の解析
ＩＤＡ−１Ｒ遺伝子内に、Ｐエレメントが挿入されたトランスジェニックハエ系統（w[1118]; Mi{ET1}CG14593[MB03316]）をBloomington Drosophila Stock Centerより取り寄せ（Bloomington Stock Number:23531）、解析に用いた。この系統でＩＤＡ−１Ｒ遺伝子が挿入破壊されていることは、RT-PCRでＩＤＡ−１Ｒ遺伝子の発現が強く減少していることで確認した。
【００９７】
ＩＤＡ−１Ｒ遺伝子破壊系統のハエとコントロールのハエ（遺伝子挿入破壊のないw[1118]系統のハエ）の幼虫に対して、色素入りの餌を与え、摂食量を吸光度で測定し、比較した。その結果、ＩＤＡ−１Ｒ遺伝子破壊系統では、コントロールに比べて摂食量が１．６倍に増加した。
【００９８】
実施例７：リアルタイムＰＣＲによるショウジョウバエのidalin-1、idalin-2、ＩＤＡ−１Ｒ、ＩＤＡ−２ＲのｍＲＮＡの発現量の解析
リアルタイムＰＣＲによるショウジョウバエ（オス、メス）の頭部と身体におけるidalin-1、idalin-2、ＩＤＡ−１Ｒ、ＩＤＡ−２ＲのｍＲＮＡの発現量の解析結果を図１３に示す。その結果、前記ｍＲＮＡは、中枢および末梢に広く分布しているので、摂食行動のみならず様々な生理作用に関与している可能性がある。
【００９９】
次に、コントロール（野生型）ハエにおいて絶食後のidalin-1、idalin-2 ｍＲＮＡの発現量をリアルタイムＰＣＲにて解析した。結果を図１８に示す。idalin-1の発現量は、絶食により有意に抑制されることがわかる。
【０１００】
実施例８：idalin-1 Ｃ末端側認識特異抗体
idalin-1 Ｃ末端側を抗原としてウサギを免疫してポリクローナル抗体を作製し、抗体価および特異性を検討した。ラジオイムノアッセイによるidalin-1 Ｃ末端側認識特異抗体の抗体価チェックの結果を図１４に示す。また、ラジオイムノアッセイによるidalin-1 Ｃ末端側認識特異抗体のスタンダードチェックの結果を図１５に示す。その結果、該抗体は、抗体価が656100単位であり、idalin-1に特異的に結合しidalin-2には結合しないことが確認された。
【０１０１】
次に、前記抗体を用いて、ラジオイムノアッセイによるidalin-1トランスジェニックハエとＲＮＡｉハエにおけるidalin-1の含量を調べた。結果を図１６に示す。野生型（wild）と比べて、トランスジェニック（ＴＧ）では約１０倍に増加し、ＲＮＡｉではidalin-1がほとんど検出されなかった。
【産業上の利用可能性】
【０１０２】
本発明のペプチドまたはペプチドアミドは、害虫の駆除および益虫の繁殖に貢献することができる。また、哺乳動物の新規医薬成分の候補ともなりうる。
以上、本発明の具体的な態様のいくつかを詳細に説明したが、当業者であれば示された特定の態様には、本発明の教示と利点から実質的に逸脱しない範囲で様々な修正と変更をなすことは可能である。従って、そのような修正及び変更も、すべて後記の特許請求の範囲で請求される本発明の精神と範囲内に含まれるものである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ショウジョウバエ由来生理活性ペプチドに関し、害虫駆除薬または医薬の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くのＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）に対するリガンド、特に生理活性ペプチドは、幅広い生理現象に関わっていることから医薬品としての応用が進められている。しかし、ショウジョウバエを含む昆虫では未知の生理活性ペプチドの探索はあまり行われていなかった。昆虫における生理活性ペプチドとその受容体に関する最近の知見として、脂質動員ホルモン（ＡＫＨ）の受容体の発見（非特許文献１）、ＧＰＣＲとβ−２−アレスチン２との相互作用に基づく、ショウジョウバエ神経ペプチド受容体の同定（非特許文献２）などが知られている。
【０００３】
オーファンＧＰＣＲに対する内在性リガンドの探索は活発に行われているが、近年、哺乳類での新たな発見に関する報告は減少している。一例として、オーファンＧＰＣＲとして知られていた成長ホルモン分泌促進因子受容体（ＧＨＳ−Ｒ）の内在性リガンドとして、ラットおよびヒトのグレリン（Ghrelin）が報告された（非特許文献３）。グレリンは、医薬品への応用開発が進められている。本発明者らは、最近、ネコのグレリンを同定した（非特許文献４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】PNAS, 2002, Vol.99, pp.3446-3451
【非特許文献２】Journal of Biological Chemistry, 2003, Vol.278, pp.52172-52178
【非特許文献３】Nature, 1999, Vol.402, pp.656-660
【非特許文献４】Domestic Animal Endocrinology, 2007, Vol.32, pp.93-105
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
天然に存在する生理活性物質は、これまでに医薬品の有効成分、生活必需品の成分として利用され、人類の健康増進に大いに貢献してきた。したがって、新規生理活性物質の探索は、新規有効成分医薬品ばかりではなく新規効能医薬品の候補を提供するためにも重要であるが、哺乳類での未知の生理活性ペプチドリガンドの発見は減少している。したがって、本発明の目的は、新規生理活性ペプチドを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、ショウジョウバエオーファンＧＰＣＲとして、哺乳類オーファン受容体であるbombesin receptor subtype-3(BRS-3)受容体に類似しているＣＧ１４５９３（ＩＤＡ−１Ｒ）およびＣＧ３０１０６（ＩＤＡ−２Ｒ）に着目し、内在性リガンドを探索した。その結果、ＣＧ１４５９３（ＩＤＡ−１Ｒ）およびＣＧ３０１０６（ＩＤＡ−２Ｒ）に対する内在性リガンドをそれぞれ単離し、当該リガンドと相同なアミノ酸配列を有するペプチドが様々な昆虫においても存在することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
本発明は、以下のものを提供する：
〔１〕 （１）配列番号１〜３のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチドまたはペプチドアミド、
（２）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるペプチドまたはペプチドアミド、
（３）配列番号１〜３のいずれかで表されるアミノ酸配列において、システイン残基を除く１〜５個のアミノ酸残基が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列からなる変異ペプチドまたは変異ペプチドアミドであって、変異前のペプチドまたはペプチドアミドと同等のショウジョウバエＩＤＡ−１Ｒに対する結合活性を有するペプチドまたはペプチドアミド、および
（４）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、システイン残基を除く１〜３個のアミノ酸残基が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列からなる変異ペプチドまたは変異ペプチドアミドであって、変異前のペプチドまたはペプチドアミドと同等のショウジョウバエＩＤＡ−２Ｒに対する結合活性を有するペプチドまたはペプチドアミド
からなる群より選ばれる、単離されたペプチドまたはペプチドアミド。
〔２〕 （１）配列番号１〜３のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチドまたはペプチドアミド、
（２）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるペプチドまたはペプチドアミド、
（３）配列番号１〜３のいずれかで表されるアミノ酸配列において、システイン残基を除く１〜５個のアミノ酸残基が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列からなる変異ペプチドまたは変異ペプチドアミドであって、変異前のペプチドまたはペプチドアミドと同等のショウジョウバエＩＤＡ−１Ｒに対する結合活性を有するペプチドまたはペプチドアミド、および
（４）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、システイン残基を除く１〜３個のアミノ酸残基が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列からなる変異ペプチドまたは変異ペプチドアミドであって、変異前のペプチドまたはペプチドアミドと同等のショウジョウバエＩＤＡ−２Ｒに対する結合活性を有するペプチドまたはペプチドアミド
からなる群より選ばれるペプチドまたはペプチドアミドからなる、ＩＤＡ−１ＲまたはＩＤＡ−２Ｒに対するリガンド。
〔３〕 前記〔１〕記載のペプチドまたはペプチドアミドを少なくとも１種含有する、昆虫の摂食抑制剤。
〔４〕 前記〔１〕記載のペプチドまたはペプチドアミドを少なくとも１種含有する、害虫駆除剤。
〔５〕 前記〔１〕記載のペプチドまたはペプチドアミドに結合する抗体。
〔６〕 前記〔１〕記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド。
〔７〕 idalin-1および／またはidalin-2の発現を特異的に阻害する物質を含有する、昆虫の成長促進剤。
〔８〕 下記いずれかの二本鎖ＲＮＡを含有する、前記〔７〕記載の成長促進剤：
配列番号５の塩基配列に対応するｍＲＮＡにおける１９〜２５個の連続する塩基配列を含むセンス鎖と、その相補配列を含むアンチセンス鎖の組み合わせ；または
配列番号７の塩基配列に対応するｍＲＮＡにおける１９〜２５個の連続する塩基配列を含むセンス鎖と、その相補配列を含むアンチセンス鎖の組み合わせ。
〔９〕 ＩＤＡ−１Ｒおよび／またはＩＤＡ−２Ｒの発現または機能を阻害する物質を含有する、昆虫の成長促進剤。
〔１０〕 ＩＤＡ−１Ｒおよび／またはＩＤＡ−２Ｒの発現または機能を調節する物質が、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかである、前記〔９〕記載の成長促進剤：
（ｉ）ＩＤＡ−１Ｒおよび／またはＩＤＡ−２Ｒをコードする遺伝子のアンチセンス核酸、リボザイム、ＲＮＡｉ誘導性核酸、デコイ核酸またはターゲッティングベクター、
（ｉｉ）ＩＤＡ−１Ｒおよび／またはＩＤＡ−２Ｒに対する抗体、当該抗体をコードする核酸、当該ＩＤＡ−１Ｒおよび／またはＩＤＡ−２Ｒのドミナントネガティブ変異体または当該変異体をコードする核酸、または
（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の核酸を含む発現ベクター。
〔１１〕 ＲＮＡｉ誘導性核酸が下記いずれかの二本鎖ＲＮＡである、前記〔１０〕記載の成長促進剤：
配列番号３４の塩基配列に対応するｍＲＮＡにおける１９〜２５個の連続する塩基配列を含むセンス鎖と、その相補配列を含むアンチセンス鎖の組み合わせ；または
配列番号３６の塩基配列に対応するｍＲＮＡにおける１９〜２５個の連続する塩基配列を含むセンス鎖と、その相補配列を含むアンチセンス鎖の組み合わせ。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の単離されたペプチドまたはペプチドアミドは、ショウジョウバエオーファンＧＰＣＲであるＣＧ１４５９３（ＩＤＡ−１Ｒ）またはＣＧ３０１０６（ＩＤＡ−２Ｒ）に結合するリガンドであり、それぞれidalin-1またはidalin-2ファミリーを構成する。idalin-1およびidalin-2は、多くの昆虫で高度に保存されていた。idalin-1の過剰発現ショウジョウバエは摂食が抑制され、幼虫の発育、成虫への羽化率が低い。idalin-1の作用をブロックしたハエは、摂食量が増加する。ショウジョウバエを絶食させると、idalin-1の発現量が減少する。以上の点から、idalin-1およびidalin-2は昆虫における摂食抑制ペプチドであり、害虫の発育阻害剤としての利用が期待される。また、idalin-1およびidalin-2は、昆虫にのみ作用するので哺乳類には安全である。さらに、idalin-1およびidalin-2は、ペプチドであるので分解されやすく環境への負荷が少ない。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】脊椎動物Bombesin/Gastrin Releasing Peptide receptorファミリーに属する遺伝子ならびにショウジョウバエＧＰＣＲのＣＧ１４５９３（ＩＤＡ−１Ｒ）およびＣＧ３０１０６（ＩＤＡ−２Ｒ）の系統樹である。
【図２】ショウジョウバエペプチド抽出物からゲル濾過で展開したサンプルをＣＧ１４５９３（ＩＤＡ−１Ｒ）過剰発現ＣＨＯ細胞に添加し、細胞内カルシウム上昇活性を示す（黒棒）グラフである。
【図３】ＣＧ１４５９３（ＩＤＡ−１Ｒ）に対する最終精製を示すチャートである。
【図４】ＣＧ１４５９３（ＩＤＡ−１Ｒ）に対する最終精製物をアミノ酸シークエンス、質量分析により解析した結果から導き出されたアミノ酸配列、ＣＧ１４３７５(idalin-1)を示す。２位のシステインと９位のシステインとの間には分子内ジスルフィド結合を有する。
【図５】ＣＧ１４５９３（ＩＤＡ−１Ｒ）に結合するリガンドidalin-1の前駆体ＣＧ１４３７５のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。idalin-1が由来する領域を下線にて示す。（１）配列番号１、（２）配列番号２、（３）配列番号３、（注）Ｃ末端アミド化のためのアミドドナーとしてのグリシン。それぞれの配列は最終精製後、質量分析にて確認した。また、配列１〜３についてＣ末端アミド化がされていない物も確認した。
【図６】idalin-1をジチオスレイトール（ＤＴＴ）にて還元し、Ｓ−Ｓ結合が切れた物をＨＰＬＣで回収したチャートを示す。
【図７】ショウジョウバエペプチド抽出物からゲル濾過で展開したサンプルをＣＧ３０１０６（ＩＤＡ−２Ｒ）過剰発現ＣＨＯ細胞に添加し、細胞内カルシウム上昇活性を示す（黒棒）グラフである。
【図８】ＣＧ３０１０６（ＩＤＡ−２Ｒ）に対する最終精製を示すチャートである。
【図９】ＣＧ３０１０６（ＩＤＡ−２Ｒ）に対する最終精製物をアミノ酸シークエンス、質量分析により解析した結果から導き出されたアミノ酸配列、ＣＧ１４３５８(idalin-2)を示す。２位のシステインと９位のシステインとの間には分子内ジスルフィド結合を有する。
【図１０】ＣＧ３０１０６（ＩＤＡ−２Ｒ）に結合するリガンドidalin-2の前駆体ＣＧ１４３５８のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。idalin-2が由来する領域を下線にて示す。配列番号４、（注）Ｃ末端アミド化のためのアミドドナーとしてのグリシン。
【図１１】idalin-2をジチオスレイトール(ＤＴＴ)にて還元し、Ｓ−Ｓ結合が切れた物をＨＰＬＣで回収したチャートを示す。
【図１２Ａ】ＩＤＡ−１Ｒ（ＣＧ１４５９３）とidalin-1（ＣＧ１４３７５：配列番号１）またはidalin-2（ＣＧ１４３５８：配列番号４）との結合試験の結果を示す。ＩＤＡ−１Ｒ過剰発現ＣＨＯ細胞での細胞内カルシウムの変化を示す。
【図１２Ｂ】ＩＤＡ−２Ｒ（ＣＧ３０１０６）とidalin-1（ＣＧ１４３７５：配列番号１）またはidalin-2（ＣＧ１４３５８：配列番号４）との結合試験の結果を示す。ＩＤＡ−２Ｒ過剰発現ＣＨＯ細胞での細胞内カルシウムの変化を示す。
【図１３】リアルタイムＰＣＲによるショウジョウバエ（オス、メス）の頭部と身体におけるidalin-1、idalin-2、ＩＤＡ−１Ｒ、ＩＤＡ−２ＲのｍＲＮＡの発現量の解析結果を示す。
【図１４】ラジオイムノアッセイによるidalin-1 Ｃ末端側認識特異抗体の抗体価チェックの結果を示す。
【図１５】ラジオイムノアッセイによるidalin-1 Ｃ末端側認識特異抗体のスタンダードチェックの結果を示す。
【図１６】ラジオイムノアッセイによるidalin-1トランスジェニックハエとＲＮＡｉハエにおけるidalin-1の含量を示す。
【図１７】idalin-1トランスジェニックハエ（図１７Ａ、Ｂ）とコントロールハエ（図１７Ｃ、Ｄ）の幼虫の壁を登る行動を比較した図である。
【図１８】コントロールハエにおいて絶食後のidalin-1、idalin-2 ｍＲＮＡの発現量をリアルタイムＰＣＲにて解析した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本明細書において、アミノ酸、（ポリ）ペプチド、（ポリ）ヌクレオチドなどの略号による表示は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの規定〔IUPAC-IUB Communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138: 9 (1984)〕、「塩基配列またはアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（日本国特許庁編）、および当該分野における慣用記号に従う。
【００１１】
本明細書において「ポリヌクレオチド」または「遺伝子」とは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡならびにＲＮＡを包含する趣旨で用いられる。また、その長さによって特に制限されるものではない。したがって、本明細書においてポリヌクレオチドとは、特に言及しない限り、ゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡおよびｃＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ（正鎖）および該正鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（相補鎖）、ならびにこれらの断片のいずれもが含まれる。また当該「ポリヌクレオチド」には、特定の塩基配列（配列番号：５または７）で示される「ポリヌクレオチド」だけでなく、これらによりコードされるポリ（ペプチド）と生物学的機能が同等であるポリ（ペプチド）（例えば同族体（ホモログやスプライスバリアントなど）、変異体および誘導体）をコードする「ポリヌクレオチド」が包含される。かかる同族体、変異体または誘導体をコードする「ポリヌクレオチド」としては、具体的には、ストリンジェントな条件下で、前記の配列番号：５または７で示されるいずれかの特定塩基配列の相補配列とハイブリダイズする塩基配列からなる「ポリヌクレオチド」を挙げることができる。なお、ここでストリンジェントな条件は、Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA) に教示されるように、核酸の融解温度（Ｔｍ）に基づいて決定することができる。例えばハイブリダイズ後の洗浄条件として、通常「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」程度の条件を挙げることができる。相補鎖はかかる条件で洗浄しても対象とする正鎖とハイブリダイズ状態を維持するものであることが好ましい。特に制限されないが、より厳しいハイブリダイズ条件として「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度、さらに厳しいハイブリダイズ条件として「０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度の洗浄条件を挙げることができる。
【００１２】
例えばショウジョウバエ由来のポリ（ペプチド）のホモログをコードするポリヌクレオチドとしては、当該ポリ（ペプチド）をコードするショウジョウバエ遺伝子に対応する蚊、カイコ、ハチなどの昆虫を始めとする他生物種の遺伝子が例示でき、これらの遺伝子（ホモログ）は、HomoloGene（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/HomoloGene/）により同定することができる。具体的には、特定のショウジョウバエの塩基配列をBLAST（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）にかけて一致する（Scoreが最も高く、E-valueが０でかつIdentityが１００％を示す）配列のアクセッション番号を取得する。そのアクセッション番号をUniGene（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/）に入力して得られたUniGene Cluster ID（Hs.で示す番号）をHomoloGeneに入力する。結果として得られた他の生物種の遺伝子とショウジョウバエ遺伝子との遺伝子ホモログの相関を示したリストから、特定の塩基配列で示されるショウジョウバエ遺伝子に対応する遺伝子（ホモログ）として他の生物種の遺伝子を選抜することができる。
なお、ポリヌクレオチドまたは遺伝子は、機能領域の別を問うものではなく、例えば発現制御領域、コード領域、エキソンまたはイントロンを含むことができる。
【００１３】
単離された本発明のペプチドまたはペプチドアミドは、本発明者らにより見出された下記（１）idalin-1および（２）idalin-2（これらは、ショウジョウバエに由来するものである）、ならびにそれらと同等の活性を有する変異ペプチドまたは変異ペプチドアミド（３）および（４）から構成されるペプチド群である。本発明においては、ペプチドまたはペプチドアミドのいずれも本発明の目的に使用することができる。本発明のペプチドまたはペプチドアミドは、図７に示すように、２つのシステイン残基が分子内ジスルフィド結合している。特に明記しない限り、本発明のペプチドまたはペプチドアミドは、ジスルフィド結合を有するものである。
【００１４】
（１）idalin-1：
ＧＣＱＡＹＧＨＶＣＹＧＧＨ−ＮＨ２（配列番号１）
ＫＫＧＣＱＡＹＧＨＶＣＹＧＧＨ−ＮＨ２（配列番号２）
ＡＱＱＳＱＡＫＫＧＣＱＡＹＧＨＶＣＹＧＧＨ−ＮＨ２（配列番号３）
上記アミノ酸配列のそれぞれについて、Ｃ末端はアミド化されていてもいなくてもよい。以下、idalin-1を代表して、配列番号１で表されるペプチドアミドをidalin-1と称する場合がある。
【００１５】
（２）idalin-2：
ＳＣＬＥＹＧＨＳＣＷＧＡＨ−ＮＨ２（配列番号４）
上記アミノ酸配列のＣ末端はアミド化されていてもいなくてもよい。以下、idalin-2を代表して、配列番号４で表されるペプチドアミドをidalin-2と称する場合がある。
【００１６】
（３）idalin-1の変異ペプチドまたは変異ペプチドアミド
配列番号１〜３のいずれかで表されるアミノ酸配列において、システイン残基を除く１〜５個（好ましくは１〜３個）のアミノ酸残基が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列からなる変異ペプチドまたは変異ペプチドアミドであっても、変異前のペプチドまたはペプチドアミドと同等のショウジョウバエＩＤＡ−１Ｒに対する結合活性を有する限り本発明のペプチドまたはペプチドアミドに含まれる。
ここで「同等のＩＤＡ−１Ｒに対する結合活性を有する」とは、実施例４に示す受容体結合試験において、変異前のペプチドまたはペプチドアミドと同等の結合親和性を有することをいう。同等の結合親和性としては、１０−１１〜１０−６Ｍ程度の結合親和性が例示される。
【００１７】
「アミノ酸残基の置換」としては、例えば保存的アミノ酸置換があげられる。保存的アミノ酸置換とは、特定のアミノ酸を、そのアミノ酸の側鎖と同様の性質の側鎖を有するアミノ酸で置換することをいう。具体的には、保存的アミノ酸置換では、特定のアミノ酸は、そのアミノ酸と同じグループに属する他のアミノ酸により置換される。同様の性質の側鎖を有するアミノ酸のグループは、当該分野で公知である。例えば、このようなアミノ酸のグループとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、中性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）があげられる。また、中性側鎖を有するアミノ酸は、さらに、極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン）、および非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）に分類することもできる。また、他のグループとして、例えば、芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン）、水酸基（アルコール性水酸基、フェノール性水酸基）を含む側鎖を有するアミノ酸（例えば、セリン、トレオニン、チロシン）などもあげることができる。また、ヒスチジンとメチオニンとの置換、グルタミン酸とセリンとの置換などもあげられる。
【００１８】
「アミノ酸残基の欠失」としては、例えば、各配列番号で表されるアミノ酸配列の中から、システイン残基を除く任意のアミノ酸残基を選択して欠失させることがあげられる。
【００１９】
「アミノ酸残基の付加」としては、各配列番号で表されるアミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端側に、１〜５個のアミノ酸残基を付加させることがあげられる。
【００２０】
idalin-1の変異ペプチドまたは変異ペプチドアミドの好適な具体例は、表１にリストされている。
【００２１】
（４）idalin-2の変異ペプチドまたは変異ペプチドアミド
配列番号４で表されるアミノ酸配列において、システイン残基を除く１〜３個のアミノ酸残基が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列であっても、変異前のペプチドまたはペプチドアミドと同等のショウジョウバエＩＤＡ−２Ｒに対する結合活性を有する限り、本発明のペプチドまたはペプチドアミドに含まれる。
ここで「同等のＩＤＡ−２Ｒに対する結合活性を有する」とは、実施例４ならびに図１２ＡおよびＢに示す受容体結合試験において、変異前のペプチドまたはペプチドアミドと同等の結合親和性を有することをいう。同等の結合親和性としては、１０−１１〜１０−６Ｍ程度の結合親和性が例示される。
【００２２】
「アミノ酸残基の置換」、「アミノ酸残基の欠失」および「アミノ酸残基の付加」は、上記（３）で説明した通りである。
【００２３】
idalin-2の変異ペプチドまたは変異ペプチドアミドの好適な具体例は、表２にリストされている。
【００２４】
上記アミノ酸はＬ体、Ｄ体およびＤＬ体を包含するものであるが、通常、Ｌ体であることが好ましい。本発明のペプチドは、通常のペプチド合成法によって合成され本発明に供することができるが、製造方法、合成方法、調達方法等については、特に限定されない。本発明のペプチドは、通常のペプチド合成装置を用いることにより、当業者であれば容易に合成することができる。また、本発明のペプチドアミドも常法によりペプチドのＣ末端をアミド化することにより、当業者であれば容易に合成することができる。
【００２５】
本発明のペプチドまたはペプチドアミドは、上述したような結合親和性を有することより、ＩＤＡ−１Ｒ（ＣＧ１４５９３、GenBank Accession No. NM_136355、idalin-1受容体とも称する）またはＩＤＡ−２Ｒ（ＣＧ３０１０６、GenBank Accession No. NM_137397、idalin-2受容体とも称する）に対するリガンドとして有用である。
【００２６】
（５）摂食抑制剤
本発明のペプチドまたはペプチドアミドは、ＩＤＡ−１ＲまたはＩＤＡ−２Ｒに対するリガンドであり、当該受容体に結合することによって、昆虫の摂食行動を抑制することができる。本発明は、本発明のペプチドまたはペプチドアミドを少なくとも１種含有する昆虫の摂食抑制剤を提供する。摂食抑制剤は、ペプチドまたはペプチドアミドのいずれか１種であっても２種以上であってもよい。２種以上含有する場合、その種類は特に限定されない。ペプチドまたはペプチドアミドの配合量は、適宜設定すればよいが、通常、摂食抑制剤中、０．０１〜９９．５重量％である。
【００２７】
本発明の摂食抑制剤は、昆虫を誘引するための誘引剤を含んでいてもよい。前記誘引剤としては、特に制限されないが、例えば、ビール酵母、蛹粉、酒かす、オキアミパウダー、卵黄、キャベツパウダー、キャロットパウダー、チキンエキスパウダー、シーズニングオイル、ストロベリーパウダー、ピーチパウダー、マッシュルームエキス、魚粉、牛（豚）肉粉等が挙げられる。誘引剤は、１種のみであってもよいし、２種以上であってもよい。誘引剤の配合量は、適宜設定すればよいが、通常、摂食抑制剤中、０．０１〜５０重量％である。
【００２８】
本発明の摂食抑制剤には、本発明の効果を損なわない範囲で、さらに必要に応じて、上記以外の成分を配合することができる。例えば、フェニル−β−ナフリルアミン、α−ナフリルアミン、Ｎ，Ｎ−ジ−第三ブチル−ｐ−フェニレンジアミン、２，６−ジ−第三ブチル−ｐ−クレゾール（ＢＨＴ）、２，６−第三ブチル−フェノール、２，４−ジ−メチル−６−第三ブチルフェノール、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）等の酸化防止剤；黄色２号、黄色４号、赤色２号、赤色３号、赤色１０２号、青色１号、青色２号、緑色２０１号、緑色２０２号等の色素；カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カラギーナン、キサンタンガム、デンプン類等の粘度調整剤；リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム等のｐＨ調整剤；水、エタノール、トウモロコシ油、ゴマ油等の溶剤；香料；などを配合することができる。
【００２９】
（６）害虫駆除剤
本発明は、本発明のペプチドまたはペプチドアミドを少なくとも１種含有する害虫駆除剤を提供する。害虫駆除剤は、ペプチドまたはペプチドアミドのいずれか１種であっても２種以上であってもよい。２種以上含有する場合、その種類は特に限定されない。ペプチドまたはペプチドアミドの配合量は、適宜設定すればよいが、通常、害虫駆除剤中、０．０１〜９９．５重量％である。
【００３０】
本発明の害虫駆除剤は、昆虫を誘引するための誘引剤を含んでいてもよい。前記誘引剤としては、特に制限されないが、例えば、ビール酵母、蛹粉、酒かす、オキアミパウダー、卵黄、キャベツパウダー、キャロットパウダー、チキンエキスパウダー、シーズニングオイル、ストロベリーパウダー、ピーチパウダー、マッシュルームエキス、魚粉、牛（豚）肉粉等が挙げられる。誘引剤は、１種のみであってもよいし、２種以上であってもよい。誘引剤の配合量は、適宜設定すればよいが、通常、摂食抑制剤中、０．０１〜５０重量％である。
【００３１】
本発明の害虫駆除剤には、本発明の効果を損なわない範囲で、さらに必要に応じて、上記以外の成分を配合することができる。例えば、フェニル−β−ナフリルアミン、α−ナフリルアミン、Ｎ，Ｎ−ジ−第三ブチル−ｐ−フェニレンジアミン、２，６−ジ−第三ブチル−ｐ−クレゾール（ＢＨＴ）、２，６−第三ブチル−フェノール、２，４−ジ−メチル−６−第三ブチルフェノール、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）等の酸化防止剤；黄色２号、黄色４号、赤色２号、赤色３号、赤色１０２号、青色１号、青色２号、緑色２０１号、緑色２０２号等の色素；カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カラギーナン、キサンタンガム、デンプン類等の粘度調整剤；安息香酸デナトニウム、トウガラシ粉末等の誤食防止剤；リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム等のｐＨ調整剤；水、エタノール、トウモロコシ油、ゴマ油等の溶剤；香料；などを配合することができる。
【００３２】
本発明の摂食抑制剤または害虫駆除剤は、単独で、または昆虫の餌と混合し、昆虫の生態系を考慮して、昆虫がアクセス可能な態様で昆虫に与えることができる。あるいは、害虫駆除剤は、積極的に昆虫の体内に導入することも好ましい。
【００３３】
（７）抗体
本発明は、本発明のペプチドまたはペプチドアミドに結合する抗体を提供する。本発明の抗体は、本発明のペプチドまたはペプチドアミドの検出手段、本発明のペプチドまたはペプチドアミドの阻害作用を通じて昆虫の食欲の増進作用が期待される。本発明の「抗体」には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、またはＦａｂフラグメントやＦａｂ発現ライブラリーによって生成されるフラグメントなどのように抗原結合性を有する前記抗体の一部が包含される。
【００３４】
前記抗体は、自体公知の方法により製造することができる。以下、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を例にとって、説明する。
ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、例えば免疫原（本発明のペプチドまたはペプチドアミド）を、必要に応じてフロイントアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ）と共に、哺乳動物、例えばポリクローナル抗体の場合、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ヤギ、ウマまたはウシなど、好ましくはマウス、ラット、ハムスター、モルモット、ヤギ、ウマまたはウサギに免疫する。モノクローナル抗体の場合は、同様の方法で、マウス、ラット、ハムスターなどに免疫する。
【００３５】
本発明のペプチドまたはペプチドアミドは、そのまま免疫原として用いることも可能であるが、分子量１万以上の高分子化合物との複合体として免疫することが望ましい。従って、免疫原として使用するとき、本発明のペプチドは、自体公知の方法により高分子化合物（例、タンパク質（以下、キャリアタンパク質と記載する場合がある）など）との複合体としてもよい。例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを上記記載の方法に従って合成し、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、ウサギ血清アルブミン（ＲＳＡ）、オボアルブミン（ＯＶＡ）、スカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）、チログロブリン（ＴＧ）、免疫グロブリン等のキャリアタンパク質との複合体を形成させる。当該複合体は、その後好ましい免疫原として用いることができる。
【００３６】
前記ペプチドとキャリアタンパク質との複合体を形成させるなどの目的で、本発明のペプチドには１〜２個、好ましくは１個のアミノ酸を付加することが出来る。付加されるアミノ酸の位置はペプチドのいずれの位置でもよく、特に限定されないが、ペプチドのＮ末端またはＣ末端が好ましい。
【００３７】
複合体の形成においては、本発明のペプチドの抗原性を維持することができる限り、限定なく公知の方法を適用することができる。例えば、本発明のペプチドにシステイン残基を導入し、当該システインの側鎖であるＳＨ基を介して前記高分子化合物（キャリアタンパク質）のアミノ基と結合させることもできる（ＭＢＳ法）。また、タンパク質のリジン残基のεアミノ基や、αアミノ基などのアミノ基同士を結合させることもできる（グルタルアルデヒド法）。
【００３８】
ポリクローナル抗体は、具体的には下記のようにして製造することができる。すなわち、免疫原をマウス、ラット、ハムスター、モルモット、ヤギ、ウマまたはウサギ、好ましくはヤギ、ウマまたはウサギ、より好ましくはウサギの皮下内、筋肉内、静脈内、フッドパッド内あるいは腹腔内に１〜数回注射することにより免疫感作を施す。通常、初回免疫から約１〜１４日毎に１〜５回免疫を行って、最終免疫より約１〜５日後に免疫感作された該哺乳動物から血清を取得する。
【００３９】
血清そのものをポリクローナル抗体として用いることも可能であるが、限外ろ過、硫安分画、ユーグロブリン沈澱法、カプロイン酸法、カプリル酸法、イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥまたはＤＥ５２等）、抗イムノグロブリンカラムもしくはプロテインＡ／Ｇカラム、免疫原を架橋させたカラム等を用いたアフィニティカラムクロマトグラフィーにより、該抗体を単離および／または精製し、得られた精製抗体を用いることも可能である。
【００４０】
モノクローナル抗体の製造方法としては、例えば下記の方法が挙げられる。まず上記免疫感作動物から得た該抗体産生細胞と自己抗体産生能のない骨髄腫系細胞（ミエローマ細胞）からハイブリドーマを調製し、該ハイブリドーマをクローン化する。すなわち、ハイブリドーマの培養上清を検体として、免疫学的手法により、哺乳動物の免疫に用いた本発明のペプチドに対する特異的親和性を示しかつキャリアタンパク質と交差反応性を示さないモノクローナル抗体を産生するクローンを選択する。次いで、当該ハイブリドーマの培養上清などから、自体公知の方法によって抗体を製造することができる。
【００４１】
具体的には、下記のようにしてモノクローナル抗体を製造することができる。すなわち、免疫原を、マウス、ラットまたはハムスターの皮下内、筋肉内、静脈内、フッドパッド内もしくは腹腔内に１〜数回注射するか、または移植することにより免疫感作を施す。通常、初回免疫から約１〜１４日毎に１〜４回免疫を行って、最終免疫より約１〜５日後に免疫感作された該哺乳動物の脾臓などから抗体産生細胞を取得する。
【００４２】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ（融合細胞）の調製は、ケーラーおよびミルシュタインらの方法（Nature,Vol.256,アポトーシス.495-497,1975）ならびにそれらに準じる修飾方法に従って行うことができる。すなわち、前述の如く免疫感作された哺乳動物から取得される脾臓、リンパ節、骨髄または扁桃等、好ましくは脾臓に含まれる抗体産生細胞と、好ましくはマウス、ラット、モルモット、ハムスターまたはウサギ等の哺乳動物、より好ましくはマウスまたはラット由来の自己抗体産生能のないミエローマ細胞との細胞融合により、ハイブリドーマを得る。
【００４３】
細胞融合に用いられるミエローマ細胞としては、例えばマウス由来ミエローマＰ３／Ｘ６３−ＡＧ８．６５３（６５３；ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ１５８０）、Ｐ３／ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１（ＮＳ−１）、Ｐ３／Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（Ｓｐ２／０、Ｓｐ２）、ＰＡＩ、Ｆ０またはＢＷ５１４７、ラット由来ミエローマ２１０ＲＣＹ３−Ａｇ．２．３．が挙げられる。
【００４４】
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングは、得られたハイブリドーマを、例えばマイクロタイタープレート内で培養し、増殖の見られたウェルの培養上清の、前述の免疫感作で用いた本発明のペプチドに対する反応性および前記上清のキャリアタンパク質に対する反応性を、例えばＥＬＩＳＡ等の免疫測定法によって測定し、比較することによって行うことができる。
【００４５】
スクリーニングによりクローン化されたハイブリドーマは、培地（例えば、１０％牛胎仔血清を含むＤＭＥＭ）を用いて培養される。そして、その培養液の遠心上清をモノクローナル抗体溶液とすることができる。また、該ハイブリドーマを、該ハイブリドーマに由来する動物の腹腔に注入することにより、動物に腹水を生成させ、該動物から得られた腹水をモノクローナル抗体溶液とすることができる。モノクローナル抗体は、上述のポリクローナル抗体と同様の方法で、単離および／または精製されることが好ましい。
【００４６】
（８）ポリヌクレオチド
本発明は、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリペプチドは、具体的には、idalin-1またはidalin-2の前駆体をコードする配列番号５または７で表される塩基配列全長からなるものであってもよく、その一部からなるものであってもよい。
【００４７】
（９）成長促進剤
idalin-1およびidalin-2は、摂食抑制作用を有する生理活性ペプチドであり、生体内でのidalin-1および／またはidalin-2の発現を特異的に阻害する物質は、昆虫の食欲を増進し、成長を促進させる作用を有することが期待される。本発明は、idalin-1および／またはidalin-2の発現を特異的に阻害する物質を含有する、昆虫の成長促進剤を提供する。
【００４８】
本発明の成長促進剤に有効成分として含まれるidalin-1の発現を特異的に阻害する物質は、idalin-1の前駆体（例えば、配列番号５および６）の転写過程に作用してその発現を特異的に阻害する物質であれば特に限定されるものではない。また、本発明の成長促進剤に有効成分として含まれるidalin-2の発現を特異的に阻害する物質は、idalin-2の前駆体（例えば、配列番号７および８）の転写過程に作用してその発現を特異的に阻害する物質であれば特に限定されるものではない。かかる阻害物質としては、ＲＮＡｉ誘導性核酸、アンチセンス核酸もしくはリボザイムまたはそれらの発現ベクターが挙げられる。
【００４９】
前記ＲＮＡｉ誘導性核酸とは、細胞内に導入されることにより、ＲＮＡ干渉を誘導し得るポリヌクレオチドをいい、好ましくはＲＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡのキメラ分子である。ＲＮＡ干渉とは、ｍＲＮＡと同一の塩基配列（またはその部分配列）を含む２本鎖構造のＲＮＡが、当該ｍＲＮＡの発現を抑制する効果をいう。このＲＮＡｉ効果を得るには、例えば、少なくとも１９の連続する標的ｍＲＮＡと同一の塩基配列（またはその部分配列）を有する２本鎖構造のＲＮＡを用いることが好ましい。ただし、idalin-1またはidalin-2の発現阻害作用を有していれば数塩基置換されているものであってもよく、１９塩基長よりも短いＲＮＡであってもよい。２本鎖構造は、センス鎖とアンチセンス鎖の異なるストランドで構成されていてもよいし、一つのＲＮＡのステムループ構造によって与えられる２本鎖（ｓｈＲＮＡ）であってもよい。ＲＮＡｉ誘導性核酸としては、例えばｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどが挙げられる。
【００５０】
ＲＮＡｉ誘導性核酸は、転写抑制活性が強いという観点から、ｓｉＲＮＡが好ましい。idalin-1またはidalin-2に対するｓｉＲＮＡは、idalin-1またはidalin-2のｍＲＮＡの任意の部分を標的とすることができる。idalin-1またはidalin-2に対するｓｉＲＮＡ分子は、ＲＮＡｉ効果を誘導できる限り特に制限されないが、例えば１９〜２７塩基長、好ましくは２１〜２５塩基長である。idalin-1またはidalin-2に対するｓｉＲＮＡは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二重鎖である。具体的には、idalin-1に対するｓｉＲＮＡは、配列番号５の塩基配列に対応するｍＲＮＡにおける１９〜２５個の連続する塩基配列を含むセンス鎖と、その相補配列を含むアンチセンス鎖からなるものである。idalin-2に対するｓｉＲＮＡは、配列番号７の塩基配列に対応するｍＲＮＡにおける１９〜２５個の連続する塩基配列を含むセンス鎖と、その相補配列を含むアンチセンス鎖からなるものである。idalin-1またはidalin-2に対するｓｉＲＮＡは、センス鎖、アンチセンス鎖の一方または双方の５’末端または３’末端においてオーバーハング（overhang）を有していてもよい。オーバーハングは、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の末端における１〜数個（例、１、２または３個）の塩基の付加により形成されるものである。ｓｉＲＮＡの設計方法は、当業者に公知であり、ｓｉＲＮＡの様々な設計ソフトウエアまたはアルゴリズムを用いて、上記塩基配列から適切なｓｉＲＮＡの塩基配列を選択することができる。
【００５１】
ＲＮＡｉ誘導性核酸は、ＲＮＡを構成する天然のヌクレオチドから構成されていてもよいが、ヌクレアーゼ耐性の向上もしくは安定化、相補鎖核酸とのアフィニティーの向上または細胞透過性を高めるために、ヌクレオチドに修飾を施したヌクレオチド誘導体を一部含んでいてもよい。ヌクレオチド誘導体としては、例えば糖部修飾ヌクレオチド、リン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチド、塩基修飾ヌクレオチド、ならびに糖部、リン酸ジエステル結合および塩基の少なくとも一つが修飾されたヌクレオチド等があげられる。
【００５２】
idalin-1に対するアンチセンス核酸またはidalin-2に対するアンチセンス核酸は、idalin-1またはidalin-2の前駆体の転写産物（ｍＲＮＡまたは初期転写産物）を発現する細胞の生理的条件下で該転写産物とハイブリダイズし得る塩基配列からなり、且つハイブリダイズした状態で該転写産物にコードされるポリペプチドの翻訳を阻害し得るポリヌクレオチドをいう。アンチセンス核酸の種類はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいし、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよい。アンチセンス核酸は、天然型のリン酸ジエステル結合を有するものであっても、分解酵素に安定なチオリン酸型（リン酸結合のＰ＝ＯをＰ＝Ｓに置換）や２’−Ｏ−メチル型等の修飾ヌクレオチドであってもよい。アンチセンス核酸の設計に重要な他の要素として、水溶性および細胞膜透過性を高めること等が挙げられるが、これらはリポソームやマイクロスフェアを使用するなどの剤形の工夫によっても克服できる。アンチセンス核酸の長さは、idalin-1またはidalin-2の前駆体の転写産物（例、配列番号５または配列番号７の塩基配列に対応するｍＲＮＡ）と特異的にハイブリダイズし得る限り特に制限はなく、短いもので約１５塩基程度、長いもので転写産物の全配列に相補的な配列を含むような配列であってもよい。合成の容易さや抗原性の問題等から、例えば約１５塩基以上、好ましくは約１５〜約３０塩基、より好ましくは約１８塩基〜約３０塩基からなるオリゴヌクレオチドが例示される。さらに、アンチセンス核酸は、idalin-1またはidalin-2の転写産物とハイブリダイズして翻訳を阻害するだけでなく、二本鎖ＤＮＡと結合して三重鎖（トリプレックス）を形成し、ｍＲＮＡへの転写を阻害し得るものであってもよい。
【００５３】
本明細書において、「相補的である」とは、塩基配列間で約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、更に好ましくは約９５％以上、最も好ましくは１００％の相補性を有することをいう。本明細書における塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝−３）にて計算することができる。
【００５４】
前記「リボザイム」とは核酸を切断する酵素活性を有するＲＮＡをいうが、最近では当該酵素活性部位の塩基配列を有するオリゴＤＮＡも同様に核酸切断活性を有することが明らかになっているので、本明細書では配列特異的な核酸切断活性を有する限りＤＮＡをも包含する概念として用いる。具体的には、リボザイムは、idalin-1またはidalin-2をコードするｍＲＮＡまたは初期転写産物を、コード領域の内部（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）で特異的に切断し得る。リボザイムとして最も汎用性の高いものとしては、ウイロイドやウイルソイド等の感染性ＲＮＡに見られるセルフスプライシングＲＮＡがあり、ハンマーヘッド型やヘアピン型等が知られている。ハンマーヘッド型は約４０塩基程度で酵素活性を発揮し、ハンマーヘッド構造をとる部分に隣接する両端の数塩基ずつ（合わせて約１０塩基程度）をｍＲＮＡの所望の切断部位と相補的な配列にすることにより、標的ｍＲＮＡのみを特異的に切断することが可能である。さらに、リボザイムを、それをコードするＤＮＡを含む発現ベクターの形態で使用する場合には、転写産物の細胞質への移行を促進するために、ｔＲＮＡを改変した配列をさらに連結したハイブリッドリボザイムとすることもできる（Nucleic Acids Res., 29(13): 2780-2788 (2001)）。
【００５５】
idalin-1およびidalin-2特異的阻害物質は、発現ベクターとしても提供され得る。かかる発現ベクターは、idalin-1およびidalin-2特異的阻害物質をコードするポリヌクレオチド、および当該ポリヌクレオチドに機能可能に連結されたプロモーターを含む。
【００５６】
前記プロモーターは、その制御下にある発現対象の核酸の種類により適宜選択され得るが、基本的には昆虫細胞で機能するプロモーターであれば限定なく使用することができ、例えば、ショウジョウバエ熱ショックタンパク質プロモーター、前記熱ショックタンパク質プロモーターと酵母ＧＡＬ４−ＵＡＳシステムとを組み合わせたプロモーター、ショウジョウバエアクチンプロモーター等が挙げられる。
【００５７】
好適には、本発明の昆虫の成長促進剤は、下記いずれかの二本鎖ＲＮＡを含む：
配列番号５の塩基配列に対応するｍＲＮＡにおける１９〜２５個の連続する塩基配列を含むセンス鎖と、その相補配列を含むアンチセンス鎖の組み合わせ；または
配列番号７の塩基配列に対応するｍＲＮＡにおける１９〜２５個の連続する塩基配列を含むセンス鎖と、その相補配列を含むアンチセンス鎖の組み合わせ。
【００５８】
本発明の成長促進剤は、含まれる成分および目的に応じて配合量を適宜設定することができる。通常、成長促進剤中、０．０１〜９９．５重量％である。
【００５９】
本発明の成長促進剤は、昆虫を誘引するための誘引剤を含んでいてもよい。前記誘引剤としては、特に制限されないが、例えば、ビール酵母、蛹粉、酒かす、オキアミパウダー、卵黄、キャベツパウダー、キャロットパウダー、チキンエキスパウダー、シーズニングオイル、ストロベリーパウダー、ピーチパウダー、マッシュルームエキス、魚粉、牛（豚）肉粉等が挙げられる。誘引剤は、１種のみであってもよいし、２種以上であってもよい。誘引剤の配合量は、適宜設定すればよいが、通常、成長促進剤中、０．０１〜５０重量％である。
【００６０】
本発明の成長促進剤には、本発明の効果を損なわない範囲で、さらに必要に応じて、上記以外の成分を配合することができる。例えば、フェニル−β−ナフリルアミン、α−ナフリルアミン、Ｎ，Ｎ−ジ−第三ブチル−ｐ−フェニレンジアミン、２，６−ジ−第三ブチル−ｐ−クレゾール（ＢＨＴ）、２，６−第三ブチル−フェノール、２，４−ジ−メチル−６−第三ブチルフェノール、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）等の酸化防止剤；黄色２号、黄色４号、赤色２号、赤色３号、赤色１０２号、青色１号、青色２号、緑色２０１号、緑色２０２号等の色素；カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カラギーナン、キサンタンガム、デンプン類等の粘度調整剤；リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム等のｐＨ調整剤；水、エタノール、トウモロコシ油、ゴマ油等の溶剤；香料；などを配合することができる。
【００６１】
本発明の成長促進剤は、単独で、または昆虫の餌と混合し、昆虫の生態系を考慮して、昆虫がアクセス可能な態様で昆虫に与えることができる。
【００６２】
生体内でのidalin-1および／またはidalin-2の作用は、それらの受容体への結合を介して発揮されるものであるから、該受容体の発現または機能を特異的に阻害する物質も、昆虫の食欲を増進し、成長を促進させる作用を有することが期待される。本発明は、ＩＤＡ−１Ｒおよび／またはＩＤＡ−２Ｒの発現または機能を阻害する物質を含有する、昆虫の成長促進剤を提供する。
【００６３】
ＩＤＡ−１ＲおよびＩＤＡ−２Ｒは、上述したように、idalin-1受容体およびidalin-2受容体とも称し、それらの塩基配列およびアミノ酸配列は、公知である。例えば、ショウショウバエ由来のＩＤＡ−１Ｒ（ＣＧ１４５９３）の塩基配列およびアミノ酸配列はGenBank Accession No. NM_136355として登録され、それぞれ配列番号３４および配列番号３５で示す。例えば、ショウショウバエ由来のＩＤＡ−２Ｒ（ＣＧ３０１０６）の塩基配列およびアミノ酸配列はGenBank Accession No. NM_137397として登録され、それぞれ配列番号３６および配列番号３７で示す。上述したように、ＩＤＡ−１ＲおよびＩＤＡ−２Ｒは、ホモログなどを含む概念であり、ショウショウバエ由来のＩＤＡ−１ＲおよびＩＤＡ−２Ｒに対するホモログは、Homologeneにより同定することができる。
【００６４】
ＩＤＡ−１Ｒおよび／またはＩＤＡ−２Ｒの発現または機能を阻害する物質は、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかであることが好ましい。
（ｉ）ＩＤＡ−１Ｒおよび／またはＩＤＡ−２Ｒをコードする遺伝子のアンチセンス核酸、リボザイム、ＲＮＡｉ誘導性核酸、デコイ核酸またはターゲッティングベクター、
（ｉｉ）ＩＤＡ−１Ｒおよび／またはＩＤＡ−２Ｒに対する抗体、当該抗体をコードする核酸、当該ＩＤＡ−１Ｒおよび／またはＩＤＡ−２Ｒのドミナントネガティブ変異体または当該変異体をコードする核酸、または
（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の核酸を含む発現ベクター。
【００６５】
ＩＤＡ−１Ｒおよび／またはＩＤＡ−２Ｒの発現を阻害する物質がアンチセンス核酸、リボザイム、ＲＮＡｉ誘導性核酸、デコイ核酸などの核酸分子である場合、本発明の成長促進剤は、当該核酸分子をコードする発現ベクターを有効成分とすることもできる。当該発現ベクターは、通常、上記の核酸分子をコードするオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドが、投与対象である昆虫細胞内でプロモーター活性を発揮し得るプロモーターに機能的に連結されている。アンチセンス核酸、リボザイム、ＲＮＡｉ誘導性核酸、デコイ核酸およびその発現ベクターについては、idalin-1およびidalin-2の発現を阻害する物質において説明した通りである。
【００６６】
ＩＤＡ−１Ｒおよび／またはＩＤＡ−２Ｒの発現を阻害する物質の別の態様は、ターゲティングベクターである。本発明で用いられるターゲティングベクターは、当該ＩＤＡ−１Ｒおよび／またはＩＤＡ−２Ｒをコードする遺伝子の相同組換えを誘導し得る遺伝子に相同な第一のポリヌクレオチドおよび第二のポリヌクレオチド、並びに選択マーカーを含む。第一および第二のポリヌクレオチドは、当該ＩＤＡ−１Ｒおよび／またはＩＤＡ−２Ｒをコードする遺伝子を含むゲノムＤＮＡに対して、相同組換えを生じるのに十分な程度の配列同一性および長さを有するポリヌクレオチドである。第一および第二のポリヌクレオチドは、当該遺伝子を含むゲノムＤＮＡにおいて、第一および第二のポリヌクレオチドに対して相同な２つの領域の間に存在するゲノムＤＮＡ部分領域が欠失すると、当該遺伝子の機能的欠損がもたらされるように選択される。選択マーカーとしては、ポジティブ選択マーカー（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ＢＰＨ）遺伝子、ブラスティシジンＳデアミナーゼ遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子）、ネガティブ選択マーカー（例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子、ジフテリア毒素Ａフラグメント（ＤＴＡ）遺伝子）などが挙げられる。ターゲティングベクターは、ポジティブ選択マーカー、ネガティブ選択マーカーのいずれか一方、または両方を含むことができる。ターゲティングベクターはまた、２以上のリコンビナーゼ標的配列（例えば、バクテリオファージＰ１由来のＣｒｅ／ｌｏｘＰシステムで用いられるｌｏｘＰ配列、酵母由来のＦＬＰ／ＦＲＴシステムで用いられるＦＲＴ配列）を含んでいてもよい。
【００６７】
ＩＤＡ−１Ｒおよび／またはＩＤＡ−２Ｒの機能を阻害する物質の一態様は、当該ＩＤＡ−１Ｒおよび／またはＩＤＡ−２Ｒに対する抗体、当該抗体をコードする核酸（プロモーター活性を有する核酸に機能可能に連結されたもの）、または当該核酸を含む発現ベクターである。当該抗体は、当該ＩＤＡ−１Ｒおよび／またはＩＤＡ−２Ｒを認識するものであれば特に制限されず、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれであってもよく、周知の免疫学的手法により作製することができる。また、当該抗体は、抗体のフラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２）、組換え抗体（例えば、単鎖抗体）であってもよい。
【００６８】
ＩＤＡ−１Ｒおよび／またはＩＤＡ−２Ｒの機能を阻害する物質の別の一態様は、当該ＩＤＡ−１Ｒおよび／またはＩＤＡ−２Ｒのドミナントネガティブ変異体、当該変異体をコードする核酸（プロモーター活性を有する核酸に機能可能に連結されたもの）、当該核酸を含む発現ベクター、低分子有機化合物などが例示される。
【００６９】
ＩＤＡ−１Ｒおよび／またはＩＤＡ−２Ｒのドミナントネガティブ変異体とは、当該ＩＤＡ−１Ｒおよび／またはＩＤＡ−２Ｒに対する変異の導入によりその活性が低減したものをいう。当該ドミナントネガティブ変異体は、天然のＩＤＡ−１Ｒおよび／またはＩＤＡ−２Ｒと競合することで間接的にその活性を阻害することができる。当該ドミナントネガティブ変異体は、当該ＩＤＡ−１Ｒおよび／またはＩＤＡ−２Ｒをコードする核酸に変異を導入することによって作製することができる。その変異としては、例えば、ミリストイル化部位、ＤＮＡ結合部位並びにこれらの部位以外の部位における、当該部位が担う機能の低下をもたらすようなアミノ酸の変異（例えば、１以上のアミノ酸の欠失、置換、付加）が挙げられる。当該変異は、ＰＣＲや公知のキットを用いる自体公知の方法により導入することができる。
【００７０】
好適には、本発明の昆虫の成長促進剤の有効成分はＲＮＡｉ誘導性核酸であり、下記いずれかの二本鎖ＲＮＡを含む：
配列番号３４の塩基配列に対応するｍＲＮＡにおける１９〜２５個の連続する塩基配列を含むセンス鎖と、その相補配列を含むアンチセンス鎖の組み合わせ；または
配列番号３６の塩基配列に対応するｍＲＮＡにおける１９〜２５個の連続する塩基配列を含むセンス鎖と、その相補配列を含むアンチセンス鎖の組み合わせ。
【００７１】
本発明の摂食抑制剤もしくは害虫駆除剤または成長促進剤は、目的に応じて昆虫を適宜選択して投与することができる。摂食抑制剤は、害虫を対象とすることが好ましく、成長促進剤は、益虫を対象とすることが好ましい。
【００７２】
本発明が対象とする害虫及びダニ類として、鱗翅目害虫、例えばアオムシ、ハスモンヨトウ、アワノメイガ、コナガ、ニカメイチュウ、コブノメイガ、ドクガ等；半翅目害虫、例えば、ツマグロヨコバイ、トビイロウンカ、ヒメトビウンカ、ヤノネカイガラムシ、モモアカアブラムシ、ワタアブラムシ、ニセダイコンアブラムシ、アオカメムシ、オンシツコナジラミ、シラミ、トコジラミ、コロモジラミ、サシガメ等；鞘翅目害虫、例えば、アズキゾウムシ、コクゾウムシ、ニジュウヤホシテントウ、ヒメコガネ、コロラドポテトビートル、イネミズゾウムシ、マツノゴマダラカミキリ、キクイムシ、ハネカクシ等；直翅目害虫、例えば、チャバネゴキブリ、クロゴキブリ、ワモンゴキブリ、ケラ、バッタ、ヤマトシロアリ、イエシロアリ等；双翅目害虫、例えば、イエバエ、キンバエ、クロバエ、サシバエ、サシチョウバエ、メルラアブ、ツェツェバエ、アブ、ブユ、ヌカカ、ネッタイシマカ、ヒトスジシマカ、アカイエカ、シナハマダラカ、コガタアカイエカ、イエカ、ヤブカ、ヌマカ等；ダニ類、例えば、イエダニ、マダニ、ツツガムシ、ヒメダニ、ヒゼンダニ、チリダニ、コナダニ等をあげることができる。
【００７３】
本発明が対象とする益虫として、ミツバチ、カイコ、カブトムシなどをあげることができる。
【実施例】
【００７４】
以下、実施例により本発明をさらに説明するが、本発明はいかなる意味においてもこれらに限定されるものではない。
【００７５】
実施例１：細胞培養、トランスフェクション、ＧＰＣＲ発現細胞株の調製
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、ＣＨＯ培地（１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補足したＭＥＭ−alpha、これらの試薬は、Gibco製のものを使用した）中で維持した。
【００７６】
脊椎動物Bombesin/Gastrin Releasing Peptide receptorファミリー（図１を参照）に関連するショウジョウバエＧＰＣＲのＣＧ１４５９３およびＣＧ３０１０６のｃＤＮＡクローニングは、reverse transcriptase（ＲＴ−）ＰＣＲ法を用いて行った。ショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）の成虫の全長ｃＤＮＡを、以下のプライマーセット：
ＣＧ１４５９３（ＮＭ＿１３６３５５）
5’-cacctgagacatcttgcccaggag-3’（配列番号２６）
5’-gtgtttcggtacctccatttat-3’（配列番号２７）
ＣＧ３０１０６（ＮＭ＿１３７３９７）
5’-caccaaatcgagcggactcagtacat-3’（配列番号２８）
5’-gtggcctgtaattcctgtaaactc-3’（配列番号２９）
を用いて増幅した。ＰＣＲの条件は、以下の通りであった：
ＰＣＲ反応液(Takara)
10xPyrobest buffer II ５μｌ
dNTP mix ４μｌ
primer S (１μＭ) ５μｌ
AS (１μＭ) ５μｌ
Pyobest ０．２５μｌ
H２O ２９．７５μｌ
cDNA １μｌ
全量 ５０μｌ
温度条件
94℃ 2minを1 cycleの後、
98℃ 10sec、55℃ 30sec、および72℃ 2minを30 cyclesし、
72℃ 3minを1 cycleし、4℃に冷却した。
得られた増幅産物（ＣＧ１４５９３ １５３４ｂｐ、ＣＧ３０１０６ １５９６ｂｐ）をpcDNA3.2/V5/GW/D-TOPO発現ベクター（Invitrogen）にクローニングし、シークエンシングにより配列を確認した。
【００７７】
発現ベクターＣＧ１４５９３−pcDNA3.2/V5/GW/D-TOPOおよび３０１０６−pcDNA3.2/V5/GW/D-TOPOのＣＨＯ細胞へのトランスフェクションは、トランスフェクション試薬としてＦｕｇｅｎｅ６（Boehringer Mannheim）を用いて、販売業者の指示書に従って行った。抗生物質による選択（１ｍｇ/ｍｌ Ｇ４１８）およびクローン選択の後、ＣＧ１４５９３発現ＣＨＯ細胞株およびＣＧＣＧ３０１０６発現ＣＨＯ細胞株をそれぞれ得た。以下、各細胞株をＣＨＯ−ＣＧ１４５９３およびＣＨＯ−ＣＧ３０１０６と称する。
【００７８】
実施例２：ショウジョウバエidalin-1およびidalin-2の精製
ショウジョウバエの成虫（３５０ｇ）を１０倍容量の脱イオン水を加えて１０分間煮沸し、０℃まで冷却した。酢酸を添加し（最終ｐＨ３．０）、Kinematica polytronでホモジナイズした後、ホモジネートを遠心分離し、上清を分離してエバポレーターにて３分の１量まで濃縮した。次に２倍量のアセトンを加え、一晩４℃にて攪拌後、遠心し上清をグラスフィルターにて濾過した。エバポレーターにてアセトン除去後、SepPak C18カートリッジ（Waters）を用いて脱塩、濃縮し、０．１％トリフルオロ酢酸でリンスした後、０．１％トリフルオロ酢酸中６０％アセトニトリルで各カートリッジから溶出した。溶出液を凍結乾燥させ、出発材料として用いた。前記凍結乾燥物を１Ｍ酢酸に溶解し、ＳＰ−ＳｅｐｈａｄｅｘＣ−２５（Ｈ＋型）カラムに吸着させ、１Ｍ酢酸で平衡化した。１Ｍ酢酸、２Ｍピリジンおよび２Ｍピリジン−酢酸（ｐＨ５．０）での連続溶出により、ＳＰ−Ｉ、ＳＰ−IIおよびＳＰ−IIIの各フラクションを得た。
【００７９】
次に、凍結乾燥した塩基性ペプチドフラクションＳＰ−IIIを、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−５０ゲルろ過カラムにかけ、分画した。各フラクションのリガンド活性を以下のように調べた。
ＣＨＯ−ＣＧ１４５９３およびＣＨＯ−ＣＧ３０１０６は、各細胞表面にＧＰＣＲであるＣＧ１４５９３またはＣＧ３０１０６が発現し、当該受容体にリガンドが結合すると、細胞内カルシウム濃度が上昇することが期待されるので、細胞内カルシウム濃度の変化を測定することによって、各受容体に結合するリガンド活性を追跡した。
ＣＨＯ−ＣＧ１４５９３およびＣＨＯ−ＣＧ３０１０６をＣＨＯ培地中で維持し、上記で分画したフラクションの一部を各培地に添加し、当該細胞における細胞内カルシウムイオン濃度（[Ｃａ２＋]ｉ）の変化を、蛍光イメージングプレートリーダー（FLEX）システム（Molecular Devices）を用いて既報（Nature, 1999; 402: pp.656-660）に準じて測定した。すなわち、アッセイの１２〜１５時間前にＣＨＯ−ＣＧ１４５９３またはＣＨＯ−ＣＧ３０１０６細胞（５×１０４細胞）を９６ウェルの黒壁マイクロプレート（Corning）に播種した。細胞をFLEX Calcium 4 Assay Kit（Molecular Devices）１００μｌとともに１時間インキュベートした後、蛍光イメージングプレートリーダー（FLEX）に供し、サンプル（フラクション）が蛍光の変化を誘導するか否かを測定した。最大[Ｃａ２＋]ｉの変化を三連で決定した。結果をそれぞれ図２、７に示す。カルシウムイオン濃度の上昇したフラクションを活性フラクションとしてさらなる精製に供した。
【００８０】
プールした活性フラクションを、TSK−GEL CM−25Wカラム（Tosoh）を用いるカルボキシメチル（ＣＭ）イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供した。ＨＰＬＣの条件は、以下の通りである。
溶離液：１０％アセトニトリル中、ギ酸アンモニウム１０ｍＭ−０．６Ｍの直線勾配
溶出速度：１ｍｌ／分（１６−１３６分）
各フラクションについて上述のようにFLEXシステムで細胞内カルシウムイオン濃度の変化を測定し、活性フラクションをプールし、さらに以下の精製に供した。
【００８１】
プールした活性フラクションを、μＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅＣ１８カラム（Waters）を用いる逆相（ＲＰ）−ＨＰＬＣに供した。ＨＰＬＣの条件は、以下の通りである。
溶離液：０．１％トリフルオロ酢酸中（ＴＦＡ）、１０−６０％アセトニトリルの直線勾配
溶出速度：１ｍｌ／分（８０分）
【００８２】
さらに、活性フラクションをＣｈｅｍｃｏｓｏｒｂ ３ＯＤＳ−Ｈカラム（Chemco）を用いるＲＰ−ＨＰＬＣに供した。ＨＰＬＣの条件は、以下の通りである。
溶離液：０．１％トリフルオロ酢酸中（ＴＦＡ）、１０−６０％アセトニトリルの直線勾配
溶出速度：０．２ｍｌ／分（８０分）
結果を図３、８に示す。
吸収ピークに相当するフラクションを集め、各フラクションの一部をFLEXシステムにより測定した。約２０ｐｍｏｌの主要活性フラクションの最終精製ペプチドを、プロテインシークエンサー（モデル４９４、Applied Biosystems）で解析した。また、約１ｐｍｏｌの各活性フラクションを用いて、マトリックス支援レーザー脱着−イオン化飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析計およびＶｏｙａｇｅｒ−ＤＥ ＰＲＯ instrument（Applied Biosystems）により分子量を決定した。
【００８３】
その結果、ＣＧ１４５９３に結合するリガンドとしてidalin-1、およびＣＧ３０１０６に結合するリガンドとしてidalin-2を単離し、精製することに成功した。得られたペプチドリガンドの配列を以下に示す。
【００８４】
idalin-1：
GCQAYGHVCYGGH-NH2 （配列番号１、図５の(1)以下下線で示す領域）
KKGCQAYGHVCYGGH-NH2 （配列番号２、図５の(2)以下下線で示す領域）
AQQSQAKKGCQAYGHVCYGGH-NH2 （配列番号３、図５の(3)以下下線で示す領域）
idalin-2：
SCLEYGHSCWGAH-NH2 （配列番号４、図１０の下線で示す領域）
【００８５】
idalin-1として、上記３種のペプチドが単離され、Ｃ末端のアミド体と非アミド体の両方が得られた。また、上記ペプチド中に存在する２つのシステインは、分子内ジスルフィド結合を有していた。idalin-1をジチオスレイトール（ＤＴＴ）にて還元し、Ｓ−Ｓ結合が切れた物をＨＰＬＣで回収したチャートを図６に示す。Ｓ−Ｓ結合が還元されたペプチドを、後述する実施例４で受容体との結合アッセイをしても活性がなかった。このことから、Ｓ−Ｓ結合が活性に必要であることがわかった。以下の解析は、配列番号１で示されるペプチドアミドをidalin-1の代表として用いた（図４）。
【００８６】
idalin-2も、Ｃ末端のアミド体と非アミド体の両方が得られた。また、上記ペプチド中に存在する２つのシステインは、分子内ジスルフィド結合を有していた（図８）。idalin-2をジチオスレイトール（ＤＴＴ）にて還元し、Ｓ−Ｓ結合が切れた物をＨＰＬＣで回収したチャートを図１１に示す。Ｓ−Ｓ結合が還元されたペプチドを、後述する実施例４で受容体との結合アッセイをしても活性がなかった。このことから、Ｓ−Ｓ結合が活性に必要であることがわかった。
得られたidalin-1およびidalin-2のアミノ酸配列に基づいて、他の昆虫のゲノムデータベースを探索し、他の昆虫種に存在するidalin-1様ペプチドおよびidalin-2様ペプチドをアラインした。結果を表１および表２に示す。
【００８７】
【表１】
【００８８】
【表２】
【００８９】
実施例３：idalin-1およびidalin-2の前駆体のクローニング
idalin-1およびidalin-2の前駆体は、既にデータベース上で公開されており：
idalin-1前駆体ＣＧ１４３７５（ＮＭ＿１４２０２８）および
idalin-2前駆体ＣＧ１４３５８（ＮＭ＿００１１０４３１４）、
公開されている塩基配列に基づいてプライマーを設計し、クローニングした。
idalin-1の前駆体の塩基配列およびアミノ酸配列をそれぞれ配列番号５および６に示し、idalin-2の前駆体の塩基配列およびアミノ酸配列をそれぞれ配列番号７および８に示す。
【００９０】
実施例４：idalin-1およびidalin-2と受容体との結合実験
合成idalin-1およびidalin-2は、ペプチド研究所（大阪）にて合成し、FLEX buffer(kit含有)のＨａｎｋ’ｓ ＢＳＳ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ）にて溶解した。以下、実施例２に記載の方法と同様にして、表３に示すペプチドと受容体との結合試験を実施した。結果を表３および図１２Ａ、Ｂに示す。
【００９１】
【表３】
【００９２】
実施例５：idalin-1トランスジェニックハエの作出および解析
以下のプライマーセットを準備した：
D,CG14375-S1NotI
idalin-1
5’-ATTGCGGCCGCcaccagccaagtgcaagtatc-3’（配列番号３０）
D,CG14375-AS1XbaI
5’-ATTTCTAGAcggtttttaatgtacgttgtgg-3’（配列番号３１）
idalin-2
5’-ATTGCGGCCGCcgtgcagcttgcgaaataata-3’（配列番号３２）
5’-ATTTCTAGActtctggcttagctagcgtgttatc-3’（配列番号３３）。
sense primer にNotIで、並びにanitsense primerにXbaIで制限酵素サイトをつけ、LA taqを用いてショウジョウバエ成虫ｃＤＮＡをテンプレートにしてＰＣＲを行った。バンドを切り出して精製し、DNA Ligation Kit Ver.2.1 (TaKaRa)にてpUASTベクターにライゲーションした。大腸菌にて増幅後、プラスミドを精製した。精製済みプラスミドを、
Genetic Services Inc.(MA,USA)（http://www.geneticservices.com/index.htm）に送付し、トランスジェニックハエの作出を依頼した。卵にインジェクション後、生まれたショウジョウバエをw1118と掛け合わせて得られたハエをライン化した。このトランスジェニックハエ（ホモ）を、全ての神経細胞で酵母GAL4タンパク質が発現するelav-GAL4系統のトランスジェニックハエ（ホモ）と交配して生まれてきた第一世代のトランスジェニックハエ（それぞれのトランスジーンについてヘテロ）を実験に使用した。このハエでは、idalin-1が全ての神経細胞で過剰に発現している。
【００９３】
idalin-1トランスジェニックハエ（ヘテロ）では、コントロールのハエ（elav-GAL4のみを持つヘテロのトランスジェニックハエ）に比べて、孵化しない率が７５％、さなぎにならない率が７２％に低下しており、全体として卵から羽化する率はコントロールの半分以下であった。
【００９４】
次に、交配中のハエを、水で軽く湿らせた濾紙（Whatman 3MM paper)を内壁に付着するように設置した飼育用プラスチックバイアルで２日間産卵させ、その５日後に濾紙を取り出して、サナギの形成位置を観察した。
【００９５】
結果を図１７に示す。idalin-1トランスジェニックハエ（ヘテロ）の幼虫は、コントロールのハエ（図１７Ｃ、Ｄ）に比べて、バイアルの壁に沿わせた紙（水で湿らせたもの）を登る数が有意に少なかった（図１７Ａ、Ｂ）。また、idalin-1トランスジェニックハエ（ヘテロ）の幼虫は、摂食行動がコントロールに比べて有意に減少し、餌から動こうとしなかった。トランスジェニックハエではサナギがほとんど餌近辺の下部に集中しており、濾紙を上方に登っていないことがわかる。
【００９６】
実施例６：ＩＤＡ−１Ｒ受容体遺伝子破壊系統の解析
ＩＤＡ−１Ｒ遺伝子内に、Ｐエレメントが挿入されたトランスジェニックハエ系統（w[1118]; Mi{ET1}CG14593[MB03316]）をBloomington Drosophila Stock Centerより取り寄せ（Bloomington Stock Number:23531）、解析に用いた。この系統でＩＤＡ−１Ｒ遺伝子が挿入破壊されていることは、RT-PCRでＩＤＡ−１Ｒ遺伝子の発現が強く減少していることで確認した。
【００９７】
ＩＤＡ−１Ｒ遺伝子破壊系統のハエとコントロールのハエ（遺伝子挿入破壊のないw[1118]系統のハエ）の幼虫に対して、色素入りの餌を与え、摂食量を吸光度で測定し、比較した。その結果、ＩＤＡ−１Ｒ遺伝子破壊系統では、コントロールに比べて摂食量が１．６倍に増加した。
【００９８】
実施例７：リアルタイムＰＣＲによるショウジョウバエのidalin-1、idalin-2、ＩＤＡ−１Ｒ、ＩＤＡ−２ＲのｍＲＮＡの発現量の解析
リアルタイムＰＣＲによるショウジョウバエ（オス、メス）の頭部と身体におけるidalin-1、idalin-2、ＩＤＡ−１Ｒ、ＩＤＡ−２ＲのｍＲＮＡの発現量の解析結果を図１３に示す。その結果、前記ｍＲＮＡは、中枢および末梢に広く分布しているので、摂食行動のみならず様々な生理作用に関与している可能性がある。
【００９９】
次に、コントロール（野生型）ハエにおいて絶食後のidalin-1、idalin-2 ｍＲＮＡの発現量をリアルタイムＰＣＲにて解析した。結果を図１８に示す。idalin-1の発現量は、絶食により有意に抑制されることがわかる。
【０１００】
実施例８：idalin-1 Ｃ末端側認識特異抗体
idalin-1 Ｃ末端側を抗原としてウサギを免疫してポリクローナル抗体を作製し、抗体価および特異性を検討した。ラジオイムノアッセイによるidalin-1 Ｃ末端側認識特異抗体の抗体価チェックの結果を図１４に示す。また、ラジオイムノアッセイによるidalin-1 Ｃ末端側認識特異抗体のスタンダードチェックの結果を図１５に示す。その結果、該抗体は、抗体価が656100単位であり、idalin-1に特異的に結合しidalin-2には結合しないことが確認された。
【０１０１】
次に、前記抗体を用いて、ラジオイムノアッセイによるidalin-1トランスジェニックハエとＲＮＡｉハエにおけるidalin-1の含量を調べた。結果を図１６に示す。野生型（wild）と比べて、トランスジェニック（ＴＧ）では約１０倍に増加し、ＲＮＡｉではidalin-1がほとんど検出されなかった。
【産業上の利用可能性】
【０１０２】
本発明のペプチドまたはペプチドアミドは、害虫の駆除および益虫の繁殖に貢献することができる。また、哺乳動物の新規医薬成分の候補ともなりうる。
以上、本発明の具体的な態様のいくつかを詳細に説明したが、当業者であれば示された特定の態様には、本発明の教示と利点から実質的に逸脱しない範囲で様々な修正と変更をなすことは可能である。従って、そのような修正及び変更も、すべて後記の特許請求の範囲で請求される本発明の精神と範囲内に含まれるものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）配列番号１〜３のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチドまたはペプチドアミド、
（２）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるペプチドまたはペプチドアミド、
（３）配列番号１〜３のいずれかで表されるアミノ酸配列において、システイン残基を除く１〜５個のアミノ酸残基が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列からなる変異ペプチドまたは変異ペプチドアミドであって、変異前のペプチドまたはペプチドアミドと同等のショウジョウバエＩＤＡ−１Ｒに対する結合活性を有するペプチドまたはペプチドアミド、および
（４）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、システイン残基を除く１〜３個のアミノ酸残基が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列からなる変異ペプチドまたは変異ペプチドアミドであって、変異前のペプチドまたはペプチドアミドと同等のショウジョウバエＩＤＡ−２Ｒに対する結合活性を有するペプチドまたはペプチドアミド
からなる群より選ばれる、単離されたペプチドまたはペプチドアミド。
【請求項２】
（１）配列番号１〜３のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチドまたはペプチドアミド、
（２）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるペプチドまたはペプチドアミド、
（３）配列番号１〜３のいずれかで表されるアミノ酸配列において、システイン残基を除く１〜５個のアミノ酸残基が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列からなる変異ペプチドまたは変異ペプチドアミドであって、変異前のペプチドまたはペプチドアミドと同等のショウジョウバエＩＤＡ−１Ｒに対する結合活性を有するペプチドまたはペプチドアミド、および
（４）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、システイン残基を除く１〜３個のアミノ酸残基が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列からなる変異ペプチドまたは変異ペプチドアミドであって、変異前のペプチドまたはペプチドアミドと同等のショウジョウバエＩＤＡ−２Ｒに対する結合活性を有するペプチドまたはペプチドアミド
からなる群より選ばれるペプチドまたはペプチドアミドからなる、ＩＤＡ−１ＲまたはＩＤＡ−２Ｒに対するリガンド。
【請求項３】
請求項１記載のペプチドまたはペプチドアミドを少なくとも１種含有する、昆虫の摂食抑制剤。
【請求項４】
請求項１記載のペプチドまたはペプチドアミドを少なくとも１種含有する、害虫駆除剤。
【請求項５】
請求項１記載のペプチドまたはペプチドアミドに結合する抗体。
【請求項６】
請求項１記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項７】
idalin-1および／またはidalin-2の発現を特異的に阻害する物質を含有する、昆虫の成長促進剤。
【請求項８】
下記いずれかの二本鎖ＲＮＡを含有する、請求項７記載の成長促進剤：
配列番号５の塩基配列に対応するｍＲＮＡにおける１９〜２５個の連続する塩基配列を含むセンス鎖と、その相補配列を含むアンチセンス鎖の組み合わせ；または
配列番号７の塩基配列に対応するｍＲＮＡにおける１９〜２５個の連続する塩基配列を含むセンス鎖と、その相補配列を含むアンチセンス鎖の組み合わせ。
【請求項９】
ＩＤＡ−１Ｒおよび／またはＩＤＡ−２Ｒの発現または機能を阻害する物質を含有する、昆虫の成長促進剤。
【請求項１０】
ＩＤＡ−１Ｒおよび／またはＩＤＡ−２Ｒの発現または機能を調節する物質が、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかである、請求項９記載の成長促進剤：
（ｉ）ＩＤＡ−１Ｒおよび／またはＩＤＡ−２Ｒをコードする遺伝子のアンチセンス核酸、リボザイム、ＲＮＡｉ誘導性核酸、デコイ核酸またはターゲッティングベクター、
（ｉｉ）ＩＤＡ−１Ｒおよび／またはＩＤＡ−２Ｒに対する抗体、当該抗体をコードする核酸、当該ＩＤＡ−１Ｒおよび／またはＩＤＡ−２Ｒのドミナントネガティブ変異体または当該変異体をコードする核酸、または
（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の核酸を含む発現ベクター。
【請求項１１】
ＲＮＡｉ誘導性核酸が下記いずれかの二本鎖ＲＮＡである、請求項１０記載の成長促進剤：
配列番号３４の塩基配列に対応するｍＲＮＡにおける１９〜２５個の連続する塩基配列を含むセンス鎖と、その相補配列を含むアンチセンス鎖の組み合わせ；または
配列番号３６の塩基配列に対応するｍＲＮＡにおける１９〜２５個の連続する塩基配列を含むセンス鎖と、その相補配列を含むアンチセンス鎖の組み合わせ。
【請求項１】
（１）配列番号１〜３のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチドまたはペプチドアミド、
（２）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるペプチドまたはペプチドアミド、
（３）配列番号１〜３のいずれかで表されるアミノ酸配列において、システイン残基を除く１〜５個のアミノ酸残基が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列からなる変異ペプチドまたは変異ペプチドアミドであって、変異前のペプチドまたはペプチドアミドと同等のショウジョウバエＩＤＡ−１Ｒに対する結合活性を有するペプチドまたはペプチドアミド、および
（４）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、システイン残基を除く１〜３個のアミノ酸残基が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列からなる変異ペプチドまたは変異ペプチドアミドであって、変異前のペプチドまたはペプチドアミドと同等のショウジョウバエＩＤＡ−２Ｒに対する結合活性を有するペプチドまたはペプチドアミド
からなる群より選ばれる、単離されたペプチドまたはペプチドアミド。
【請求項２】
（１）配列番号１〜３のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチドまたはペプチドアミド、
（２）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるペプチドまたはペプチドアミド、
（３）配列番号１〜３のいずれかで表されるアミノ酸配列において、システイン残基を除く１〜５個のアミノ酸残基が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列からなる変異ペプチドまたは変異ペプチドアミドであって、変異前のペプチドまたはペプチドアミドと同等のショウジョウバエＩＤＡ−１Ｒに対する結合活性を有するペプチドまたはペプチドアミド、および
（４）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、システイン残基を除く１〜３個のアミノ酸残基が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列からなる変異ペプチドまたは変異ペプチドアミドであって、変異前のペプチドまたはペプチドアミドと同等のショウジョウバエＩＤＡ−２Ｒに対する結合活性を有するペプチドまたはペプチドアミド
からなる群より選ばれるペプチドまたはペプチドアミドからなる、ＩＤＡ−１ＲまたはＩＤＡ−２Ｒに対するリガンド。
【請求項３】
請求項１記載のペプチドまたはペプチドアミドを少なくとも１種含有する、昆虫の摂食抑制剤。
【請求項４】
請求項１記載のペプチドまたはペプチドアミドを少なくとも１種含有する、害虫駆除剤。
【請求項５】
請求項１記載のペプチドまたはペプチドアミドに結合する抗体。
【請求項６】
請求項１記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項７】
idalin-1および／またはidalin-2の発現を特異的に阻害する物質を含有する、昆虫の成長促進剤。
【請求項８】
下記いずれかの二本鎖ＲＮＡを含有する、請求項７記載の成長促進剤：
配列番号５の塩基配列に対応するｍＲＮＡにおける１９〜２５個の連続する塩基配列を含むセンス鎖と、その相補配列を含むアンチセンス鎖の組み合わせ；または
配列番号７の塩基配列に対応するｍＲＮＡにおける１９〜２５個の連続する塩基配列を含むセンス鎖と、その相補配列を含むアンチセンス鎖の組み合わせ。
【請求項９】
ＩＤＡ−１Ｒおよび／またはＩＤＡ−２Ｒの発現または機能を阻害する物質を含有する、昆虫の成長促進剤。
【請求項１０】
ＩＤＡ−１Ｒおよび／またはＩＤＡ−２Ｒの発現または機能を調節する物質が、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかである、請求項９記載の成長促進剤：
（ｉ）ＩＤＡ−１Ｒおよび／またはＩＤＡ−２Ｒをコードする遺伝子のアンチセンス核酸、リボザイム、ＲＮＡｉ誘導性核酸、デコイ核酸またはターゲッティングベクター、
（ｉｉ）ＩＤＡ−１Ｒおよび／またはＩＤＡ−２Ｒに対する抗体、当該抗体をコードする核酸、当該ＩＤＡ−１Ｒおよび／またはＩＤＡ−２Ｒのドミナントネガティブ変異体または当該変異体をコードする核酸、または
（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の核酸を含む発現ベクター。
【請求項１１】
ＲＮＡｉ誘導性核酸が下記いずれかの二本鎖ＲＮＡである、請求項１０記載の成長促進剤：
配列番号３４の塩基配列に対応するｍＲＮＡにおける１９〜２５個の連続する塩基配列を含むセンス鎖と、その相補配列を含むアンチセンス鎖の組み合わせ；または
配列番号３６の塩基配列に対応するｍＲＮＡにおける１９〜２５個の連続する塩基配列を含むセンス鎖と、その相補配列を含むアンチセンス鎖の組み合わせ。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１８】
【図１７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１８】
【図１７】
【公開番号】特開２０１１−１７７１２８（Ｐ２０１１−１７７１２８Ａ）
【公開日】平成２３年９月１５日（２０１１．９．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−４５８１６（Ｐ２０１０−４５８１６）
【出願日】平成２２年３月２日（２０１０．３．２）
【出願人】（５９９０４５９０３）学校法人 久留米大学 (72)
【出願人】（５０４１５９２３５）国立大学法人 熊本大学 (314)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年９月１５日（２０１１．９．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月２日（２０１０．３．２）
【出願人】（５９９０４５９０３）学校法人 久留米大学 (72)
【出願人】（５０４１５９２３５）国立大学法人 熊本大学 (314)
【Ｆターム（参考）】
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