シート形成評価方法
【課題】 シート状細胞培養物の製造工程において、シート化状態を正確、簡便かつ迅速に判断するための方法、シート化状態を判断する工程を含む製造方法、ならびに前記方法のためのシステムを提供することを目的とする。
【解決手段】 シート形成細胞のシート化培養において、液体培地中の非接着細胞濃度またはその変化を測定することにより、シート状細胞培養物のシート化状態を判定する方法により、上記課題が解決された。
【解決手段】 シート形成細胞のシート化培養において、液体培地中の非接着細胞濃度またはその変化を測定することにより、シート状細胞培養物のシート化状態を判定する方法により、上記課題が解決された。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シート状細胞培養物が正しく形成されたか否かを判定するためのシステム、および該システムを用いたシート状細胞培養物、特にヒト及び動物の疾病、傷病の治療に用いるシート状細胞培養物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の心臓病に対する治療の革新的進歩にかかわらず、重症心不全に対する治療体系は未だ確立されていない。心不全の治療法としては、βブロッカーやＡＣＥ阻害剤による内科治療が行われるが、これらの治療が奏功しないほど重症化した心不全には、補助人工心臓や心臓移植などの置換型治療、つまり外科治療が行われる。
【０００３】
このような外科治療の対象となる重症心不全には、進行した弁膜症や高度の心筋虚血に起因するもの、急性心筋梗塞やその合併症、急性心筋炎、虚血性心筋症（ＩＣＭ）、拡張型心筋症（ＤＣＭ）などによる慢性心不全やその急性憎悪など、多種多様の原因がある。
これらの原因と重症度に応じて弁形成術や置換術、冠動脈バイパス術、左室形成術、機械的補助循環などが適用される。
【０００４】
この中で、ＩＣＭやＤＣＭによる高度の左室機能低下から心不全を来たしたものについては、心臓移植や人工心臓による置換型治療のみが有効な治療法とされてきた。しかしながら、これら重症心不全患者に対する置換型治療は、慢性的なドナー不足、継続的な免疫抑制の必要性、合併症の発症など解決すべき問題が多く、すべての重症心不全に対する普遍的な治療法とは言い難い。
【０００５】
その一方、最近、重症心不全治療の解決策として新しい再生医療の展開が不可欠と考えられている。
重症心筋梗塞等においては、心筋細胞が機能不全に陥り、さらに線維芽細胞の増殖、間質の線維化が進行し心不全を呈するようになる。心不全の進行に伴い、心筋細胞は傷害されてアポトーシスに陥るが、心筋細胞は殆ど細胞分裂をおこさないため、心筋細胞数は減少し心機能の低下もさらに進む。
このような重症心不全患者に対する心機能回復には細胞移植法が有用とされ、既に自己骨格筋芽細胞による臨床応用が開始されている。
【０００６】
近年、その一例として、組織工学を応用した温度応答性培養皿を用いることによって、成体の心筋以外の部分に由来する細胞を含む心臓に適用可能な三次元に構成された細胞培養物と、その製造方法が提供された（特許文献１）。
【０００７】
また、製造工程由来不純物を用いない方法でシート状細胞培養物を製造する試みがなされてきた。例えば、播種細胞数のコントロールや、加圧などによって、製造工程由来不純物を含まないシート状細胞培養物およびその製造方法が提供された（特許文献２および３）。
【０００８】
一方、培養容器表面に接着する性質を有する細胞を培養して増殖させる過程において、培養容器と細胞との接着状態を観察する技術は知られている。例えば特許文献４には、増殖させた培養細胞を培養容器から剥離して回収する際に、培養容器内の輝度情報を測定し、かかる輝度情報に基づいてその剥離状態を判定する装置が開示されている。特許文献５には、接着依存性細胞を増殖培養する際に、その増殖能の指標として培養容器に接着するまでの時間を採用し、増殖性の接着細胞が培養容器に接着する際に伸展する性質を利用して、接着細胞と未接着細胞とを選別する装置が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特表２００７−５２８７５５号公報
【特許文献２】特開２０１０−８１８２９号公報
【特許文献３】特開２０１０−２２６９６２号公報
【特許文献４】ＷＯ２００７／１３６０７３
【特許文献５】特開２００１−２０５６０２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、シート状細胞培養物の製造工程において、シート状細胞培養物のシート化状態を判定するための方法、液体培地中の非接着細胞濃度またはその変化を測定するステップを含むシート状細胞培養物の製造方法、および該方法を用いたシステムを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
医療の現場においてシート状細胞培養物を用いて対象を治療する場合、用いるシート状細胞培養物を形成するためにシート形成細胞をシート化培養するが、使用する直前にシート状細胞培養物を剥離、回収することが望ましい。この際、シート状細胞培養物が正しく形成されていないとシート状細胞培養物が回収できないため、剥離する前にシート状細胞培養物が剥離可能な程度に形成されているか否かを判断する必要が生じてきた。本発明者らは、シート化培養においては、シート形成の進捗度合いがシート形成細胞の接着率に依存していることを新たに見出した。さらに鋭意研究を続ける中で、シート化培養中の細胞培養物の液体培地中に存在する細胞の濃度またはその変化を観察することにより、正確、簡便かつ非侵襲的にシート状細胞培養物のシート化状態を判定できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１２】
すなわち本発明は、以下の［１］〜［８］に関する。
［１］シート形成細胞のシート化培養において、液体培地中の非接着細胞濃度またはその変化を測定することにより、シート状細胞培養物のシート化状態を判定する方法。
［２］シート形成細胞をシート化培養する工程、および液体培地中の非接着細胞濃度またはその変化を測定することにより、シート状細胞培養物の形成を判定する工程を含む、シート状細胞培養物の製造方法。
［３］シート形成細胞をシート化培養する培養容器を収納する収納部、液体培地中の非接着細胞濃度またはその変化を測定するための測定部、および前記測定部で測定された測定値を解析して非接着細胞率を算出する解析部を含む、シート形成細胞のシート化状態を判定するためのシステム。
【００１３】
［４］測定部が、撮像部を含む、［３］に記載のシステム。
［５］解析が、撮像部からの画像データにおいて所定の階調値以下の階調値を有する画素の割合を算出することを含む、［４］に記載のシステム。
［６］測定部が、液体培地を攪拌するための攪拌部を含む、［３］に記載のシステム。
［７］測定部が、液体培地の一部を採取する採取部を含む、［３］または［６］に記載のシステム。
［８］非接着細胞濃度の測定が、非接着細胞数の計数である、［３］、［６］または［７］に記載のシステム。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、シート化培養されたシート状細胞培養物が正しく形成されているか否か（剥離可能なレベルに到達しているか否か）を正確に判定することが可能となる。したがって、医療などの現場において適切な培養物の選択が簡便となり、迅速に治療に適用することが可能となる。さらに、シート状細胞培養物が形成され、剥離すべきタイミングを正確に判断することが出来るため、シートを確実に形成するために過剰に培養する必要がなくなり、過剰な培養に起因する品質の低下、例えば骨格筋芽細胞における望まない分化の進行など、を防ぐことが出来る。特に本発明の方法により、シート状細胞培養物の形成を非侵襲的に判定することが可能となるため、ロット単位ではなく個別のシート状細胞培養物に対して本発明の方法が適用できるので、より正確にシート状細胞培養物の形成を判定できるようになる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、播種直後から６時間後までの培養容器底面の変化を示す図である。Ａは播種直後、Ｂは播種の１．５時間後、Ｃは播種の３時間後、Ｄは播種の４．５時間後、Ｅは播種の６時間後の図である。これらを解析してみると、シート状細胞培養物の一部を構成する細胞（黒色の点状に見えるもの）が時間とともに増大し、培地中に浮遊して沈降している細胞（白い点状に見えるもの）が時間とともに減少していることがわかる。
【図２】図２は、本発明の一態様における、システムの処理のフロー図を表す。
【図３】図３は、本発明の一態様における、システムのブロック図を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、シート形成細胞のシート化培養において、液体培地中の非接着細胞濃度またはその変化を測定することにより、シート状細胞培養物のシート化状態を判定する方法に関する。
【００１７】
本発明において、「シート形成細胞」とは、播種し、インキュベートすることにより、シート状細胞培養物を形成することができる細胞をいう。したがって、本発明において「シート形成細胞の培養」とは、シート状細胞培養物の形成のための培養を行うことを意味し、本明細書においては「シート化培養」と同義である。上述のとおり、シート状細胞培養物の製造において、製造工程由来不純物が混入することは好ましくない。したがって、本発明においてシート化培養は、実質的に増殖することなくシート状細胞培養物を形成し得る密度でシート形成細胞を播種し、培養することを意味する。シート形成細胞は具体的には、これに限定するものではないが、例えば骨格筋芽細胞、皮膚細胞、角膜上皮細胞、歯根膜細胞、心筋細胞、肝細胞、膵細胞、口腔粘膜上皮細胞などが挙げられ、好ましくは骨格筋芽細胞が挙げられる。
【００１８】
「実質的に増殖することなくシート状細胞培養物を形成し得る密度」とは、成長因子を含まない非増殖系の培養液で培養した場合に、シート状細胞培養物を形成することができる細胞密度を意味する。例えば、骨格筋芽細胞の場合、成長因子を含む培養液を用いる方法では、シート状細胞培養物を形成するために、約６，５００個／ｃｍ２の密度の細胞をプレートに播種していたが（例えば、特許文献１参照）、かかる密度の細胞を、成長因子を含まない培養液で培養してもシート状の細胞培養物を形成することはできない。したがって、本発明におけるシート形成細胞の播種密度は、成長因子を含む培養液を用いる方法、すなわち細胞の増殖を少なくとも目的の一部とする培養におけるものよりも高いものである。具体的には、例えば、骨格筋芽細胞については、かかる密度は典型的には３００，０００個／ｃｍ２以上である。細胞密度の上限は、細胞培養物の形成が損なわれず、細胞が分化に移行しなければ特に制限されないが、骨格筋芽細胞については、例えば、１，０００，０００個／ｃｍ２である。当業者であれば、本発明に適した細胞密度を、実験により適宜決定することができる。培養期間中、細胞は増殖してもしなくてもよいが、増殖するとしても、細胞の性状が変化する程には増殖しない。例えば、骨格筋芽細胞はコンフルエントになると分化を開始するが、本発明においては、骨格筋芽細胞は、細胞培養物は形成するが、分化に移行しない密度で播種される。
【００１９】
本発明の好ましい態様において、細胞は計測誤差の範囲を超えて増殖しない。細胞が増殖したか否かは、例えば、播種時の細胞数と、細胞培養物形成後の細胞数とを比較することにより評価することができる。本発明において、シート状細胞培養物形成後の細胞数は、典型的には播種時の細胞数の３００％以下、好ましくは２００％以下、より好ましくは１５０％以下、さらに好ましくは１２５％以下、特に好ましくは１００％以下である。
本発明において「液体培地」とは、細胞の培養に用い得る細胞培養液を意味し、単に「培地」または「培養液」という場合もある。上述のとおり、本発明において液体培地は、細胞の生存を維持でき、シート状細胞培養物を形成し得るものであれば何を用いてもよいが、好ましくは成長因子を含まない液体培地である。典型的には、アミノ酸、ビタミン類、電解質を主成分としたものが利用できる。本発明の一態様において、液体培地は、細胞培養用の基礎培地をベースにしたものである。かかる基礎培地には、これに限定するものではないが例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、Ｆ１２、ＤＭＥ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＣＤＢ（ＭＣＤＢ１０２、１０４、１０７、１３１、１５３、１９９など）、Ｌ１５、ＳｋＢＭ、ＲＩＴＣ８０−７などが含まれる。これらの基礎培地の多くは市販されており、その組成も公知となっている。
【００２０】
本発明の方法は、液体培地中の非接着細胞濃度を測定することでシート状細胞培養物の形成を判定するものである。本明細書において「非接着細胞濃度」とは、液体培地中の浮遊細胞の濃度を意味し、すなわち、シート化培養において培養容器と接着していない細胞の、液体培地中の存在濃度を意味する。非接着細胞濃度は、文字通りの意味での液体培地中の細胞濃度のみならず、それと同等と見なせるものも包含される。これに限定するものではないが、同等と見なせるものの一例として、培養容器底面を観察した際の観察データなどが挙げられる。シート化培養中は静置してインキュベートするため、通常非接着細胞も液体培地中に沈んでいる。培養容器の底面に接着した接着細胞は黒いドット状に観察されるが、非接着細胞は白い球状に観察することができるため、容易に判別可能である。接着細胞と非接着細胞を識別可能であれば、一視野中の非接着細胞の数を調べることで、液体培地中の細胞濃度を予測できることは当業者には容易に理解できるところであり、したがって、一視野中の非接着細胞の数のみならず、視野観察画像データそのものも上記非接着細胞濃度に包含される。
【００２１】
非接着細胞濃度の計測において、液体培地を攪拌し、培養容器底面に存在する非接着細胞を液体培地中で浮遊させ、懸濁状態とした上で計測することも可能である。シート化培養においてシート化の過程にある細胞は、培養容器底面でシート状細胞培養物の一部として接着しているため、液体培地を攪拌しても浮遊しない。しかしながら底面やシート状細胞培養物に接着していない細胞は、液体培地を攪拌することにより液体培地中に浮遊するため、正確な非接着細胞濃度を計測することができる。したがって本発明の方法の一態様において、液体培地を攪拌し、採取した液体培地中の浮遊細胞数を計測する工程を含むことができる。
【００２２】
非接着細胞濃度は、培養のある時点での濃度を計測し、それを初期濃度（すなわち播種濃度）と比較してもよいし、ある２つの時点での濃度を比較して変化をみてもよい。かかる濃度またはその変化を測定することで、シート形成細胞のシート化状態を判定することができる。本明細書において「シート化状態」は「シート化の進捗度合い」とも表され、シート状細胞培養物の形成度合いを表すものである。
【００２３】
本発明に用いられるシート化培養においては、通常の培養と比較して高密度でシート形成細胞を播種し、実質的に細胞は分裂、増殖せずに培養容器に接着し、シート状細胞培養物を形成することとなる。通常の培養であれば、播種した細胞のほぼ全てが培養容器に接着し、増殖を開始してシートを形成するため、播種した細胞はほぼすべて接着し、シート形成において液体培地中に浮遊細胞が存在することはほとんどない。しかし、本発明に用いられるシート化培養においては、シート状細胞培養物の形成は、シート形成細胞が培養容器に接着してシート状細胞培養物の一部を構成することで進行するため、液体培地中に播種された細胞のうち、浮遊細胞が少なくなれば、すなわち非接着細胞濃度が小さくなれば、シート化が進行しているといえる。したがって、シート化状態は非接着細胞率から一義的に決定され得る。シート化状態としては、これに限定するものではないが、例えば、完成状態を１００％としたときの完成度を百分率で表したものなどでもよいし、所定の値以上の完成度のものを「合格」とするものであってもよい。
【００２４】
シート状細胞培養物の製造において、シート化培養を行う時間が短すぎるとシートの形成が不十分となるために好ましくない。逆にシート化培養を行う時間が長すぎると、高い細胞密度の中に長時間置かれることで細胞に負荷がかかり、例えば分化が起こったり、細胞死を起こしてしまうことが考えられるため、やはり好ましくない。シート化培養の培養時間は、好ましくは１６〜４８時間である。本発明の方法は、特にシート状細胞培養物の製造において、シート状細胞培養物形成の進捗度合いを確認し、最適なタイミングでシート化培養を終了することにより、品質の高いシート状細胞培養物を提供することを可能にする。したがって本発明には、シート形成細胞をシート化培養する工程、および液体培地中の非接着細胞濃度またはその変化を測定することにより、シート状細胞培養物の形成を判定する工程を含む、シート状細胞培養物の製造方法が包含される。
【００２５】
本発明の別の側面は、上記方法を実行するためのシステムを包含する。かかるシステムとしては、シート形成細胞をシート化培養する培養容器を収納する収納部、液体培地中の非接着細胞濃度を測定するための測定部、および前記測定部で測定された測定値を解析して非接着細胞率を算出する解析部を含む、シート形成細胞のシート化状態を判定するための前記システムが含まれる。
【００２６】
本発明のシステムは、液体培地中のシート形成細胞の濃度（非接着細胞濃度）を測定するための測定部を含む。かかる非接着細胞濃度には、上述の通り文字通りの意味での液体培地中の細胞濃度のみならず、それと同等と見なせるものも包含され得、したがって液体培地中の細胞濃度を直接予測可能なデータであればいかなる形式で表されてもよく、測定部が有する測定装置に依存して変化し得る。したがって非接着細胞濃度は、これに限定するものではないが例えば、画像データであってもよいし数値データであってもよい。例えば測定装置が撮像装置である場合は、非接着細胞濃度は画像データとして取得されるし、例えば測定装置が吸光度計または濁度計である場合には、非接着細胞濃度は透過光強度または濁度という数値データとして取得されることになる。測定部は、前記非接着細胞濃度のデータが得られる測定装置を含むものであればいかなるものであってもよく、これに限定するものではないが例えば撮像装置、透過光検出器、色相色差計などが挙げられ、データの汎用性や処理の多様性、試料への非侵襲性などの観点から、測定部が撮像部を含み、非接着細胞濃度が画像データとして取得されることが好ましい。
【００２７】
本発明のシステムは、上記非接着細胞濃度を解析し、非接着細胞率を算出する解析部を含む。本明細書において「非接着細胞率」とは、全播種細胞のうちどの程度の細胞が液体培地中に存在しているかを表す割合を意味する。具体的には、これに限定するものではないが例えば、全播種細胞中の非接着細胞の割合、顕微鏡観察した際の一視野における全細胞数に対する非接着細胞の割合または視野中に占める非接着細胞の占有面積、液体培地を攪拌して採取した際に採取サンプル中に含まれる浮遊細胞の数などが挙げられる。解析部で行われる解析は、得られる非接着細胞濃度のデータの形式によって変化し得る。これに限定するものではないが、例えば得られた画像データを処理して非接着細胞領域の占有面積を求めてもよいし、得られた画像データにおいて一視野中の非接着細胞数を計数してもよいし、得られた透過光強度データの経時変化から非接着細胞率の検量線を描いてもよい。当業者であれば、公知の方法を用いて、得られたデータから非接着細胞率を算出することができる。
【００２８】
上述の通り、本発明に用いられるシート化培養においては、通常の培養と比較して高密度でシート形成細胞を播種し、実質的に細胞は分裂、増殖せずに培養容器に接着し、シート状細胞培養物を形成することとなるため、通常の培養であれば指標とはなり得ない非接着細胞率を指標として、シート化状態を判定することが可能である。当然非接着細胞濃度もある程度の指標にはなるが、播種濃度に依存しない指標である非接着細胞率を指標とすることが好ましい。シート化状態の評価はいかなる方法で行ってもよい。例えば２５％、２０％、１５％、１０％、５％など、所定の閾値を設定し、非接着細胞率が該閾値以下の場合にシート形成が完了したと判断してもよいし、非接着細胞率を基にシート形成の進捗度合いを数値で表現してもよい。
【００２９】
前記非接着細胞濃度は、解析部によって解析される前に、解析部内の記録媒体に記録され得る。したがって解析部は、記録部を有していてもよい。記録部としては、例えば磁気テープ、磁気ディスク、光ディスク、光磁気ディスク、フラッシュメモリなど、電気的に記録されるものであってもよいし、例えば紙、写真など、物理的に記録されるものであってもよい。
【００３０】
上記閾値の設定値は、播種するシート形成細胞の数などに依存して変化し得、使用の形態に応じて入力される任意の値であってもよいし、あらかじめ上記記録部に記録された値でもよい。したがって解析部は入力部を備えていてよい。入力部の形態は、例えばキーボード、センサー（該センサーは測定部の測定装置と同一のものであってもよい）、タッチパネルなど、当業者に知られたあらゆる入力部が用いられ得る。最も好ましくは、設定値は０、すなわち播種した細胞が全て接着した状態である。設定値は、測定部によって測定される値や所望のシート形成度合いに依存して変化するため、設定値は使用の際に任意に入力され得る。設定値の入力部は、上記入力部と共通であってもよいし、異なっていてもよい。
【００３１】
解析部において、好ましくは測定部で測定された接着状態および／または解析部による接着率および／または解析結果が、情報として外部に出力される。したがって解析部は、該情報の出力部を備えていてよい。情報の出力手段としては、例えば外部モニター、ランプ、ブザー、予め登録された携帯電話やインターネットメールアドレスへの送信など、剥離完了の情報を操作する人間に知らせるものであってもよいし、プリンタなど、記録部に出力されるものであってもよい。
【００３２】
収納部は、培養容器の周辺環境を制御し得る制御部を有していてよい。周辺環境とは、これに限定されるものではないが、例えば温度、圧力、湿度、ＣＯ２濃度などが挙げられる。したがって制御部は、制御すべき設定を入力する入力部や、設定値を記録しておく記録部、現在の周辺環境の状態を測定する測定部、測定部にて測定した情報などを出力する出力部などを有していてよい。また、かかる制御部は、解析部とＣＰＵ、入力部、出力部および／または記録部を共有していてもよい。
【００３３】
また、本発明の一態様において、収納部は、培養容器周辺を細胞培養に適した環境に保つことが可能である。したがって、かかる態様における収納部は、細胞培養インキュベーターとして機能することができる。この態様において、収納部をインキュベーターとして用いてシート化培養し、インキュベートと平行して本発明の判定を実行することが可能である。
【００３４】
本発明の一態様において、測定部は撮像部を含み、したがって非接着細胞濃度のデータは画像データとして得られる。本発明のシート化培養においては、通常の培養と比較して高密度でシート形成細胞を播種するため、通常培養の接着細胞とは異なり、接着細胞が黒いドット状になることが新たに見出された。接着細胞が黒いドット状に見える理由として、通常の培養においては播種細胞密度が低いため、接着面積を伸展させるように接着することができるが、本願のシート化培養においては播種細胞密度が高いため、細胞が接着面を伸展させることが困難なことに加え、細胞密度が高いことがと考えられる。
【００３５】
したがって、シート化培養の場合には、色相または階調値の違いによって、視野内の接着細胞領域と非接着細胞領域とを容易に識別することが可能である。例えば、画像全体を、非接着細胞を示す領域とそれ以外の領域に区分けし、画像全体のうち非接着細胞を示す領域がどの程度の割合で存在するかを求めることで、非接着細胞率を算出可能である。
【００３６】
本態様の一例として、例えば画像データを白（階調値０）および黒（階調値２５５）のモノクロ二階調化処理、すなわち２５６階調グレースケール処理し、所定の階調値以下の階調値を有する画素の割合を計測することで、上記非接着細胞率を求めることが可能である。閾値となる所定の階調値は、得られる画像データの明度によって変化し得、これに限定するものではないが例えば５０以下、１００以下、１２８以下、１５０以下、２００以下などであってよい。
【００３７】
本発明の別の態様において、測定部が、液体培地を攪拌する攪拌部をさらに含む。本明細書において、「攪拌」とは、液体培地を流動させることにより、細胞分布を変化させ得る任意の行為を意味する。本発明のシート化培養において、培養容器は静置された状態であるため、非接着細胞も培養容器の下に滞留することになる。したがって液体培地から直接細胞濃度を計測するためには、一度攪拌することで、非接着細胞の分布を均一化することが好ましい。攪拌は、細胞に損傷を与えない行為が好ましく、典型的には、振動を与える、スターラーで攪拌する、ピペッティングするなどが挙げられる。本態様の攪拌部としては、これに限定するものではないが、例えば振動機、ロータリーシェーカー、マグネティックスターラー、ピペットなどが挙げられる。細胞への損傷の少なさ、簡便性などの観点から、振動による攪拌が好ましい。攪拌は、任意に設定された所定の時間行われる。
【００３８】
本態様のシステムは、さらに攪拌を制御するための攪拌制御部を有してもよい。攪拌制御部により、攪拌の時間、強度、攪拌方法などを制御する。かかる攪拌制御部は、解析部と一体であってもよく、したがって本態様において、解析部は攪拌制御部を兼ねてもよい。解析部の有する入力部はかかる制御のための設定値の入力部を兼ねていてもよい。
【００３９】
本発明の一態様において、測定部が、液体培地の一部を採取する採取部を含む。攪拌して非接着細胞が均一化されると、該採取部が液体培地の一部を採取する。採取された液体培地は、測定の後容器に戻されてもよいし、廃棄されてもよい。
採取された液体培地は、試料として非接着細胞濃度を測定される。測定は非接着細胞濃度を求められるものであれば何でもよく、あらゆる公知の方法を用いることができる。具体的には、これに限定するものではないが、例えば吸光度測定、非接着細胞数の計数などが挙げられる。非接着細胞濃度を直接的かつ正確に計測できるという観点から、好ましくは非接着細胞濃度の測定は、非接着細胞数の計数である。
【００４０】
以下に本発明の具体的な態様を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの具体例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４１】
例１：非接着細胞の観察
ヒト全血から得た血清を、２０％ｗ／ｖとなるようにＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Invitrogen製）に加え、フィルターユニット（ナルジェヌンクインターナショナル社製、孔サイズ０．２μｍ）にてろ過してシート形成培地とした。このシート形成培地１０ｍＬに６×１０７個の骨格筋芽細胞を懸濁し、１０ｃｍ温度応答性培養皿（セルシード製）に播種し、３７℃、５％ＣＯ２濃度の条件で、１２〜２６時間培養した。細胞播種直後、１．５時間後、３時間後、４．５時間後、６時間後にそれぞれ細胞を倒立型リサーチ顕微鏡で観察し、撮像した。結果を図１に示す。
【００４２】
図１から明らかなように、非接着細胞は白いドット状に観察され、経時的に減少していく。この白いドット状に見える部分を、画像解析装置を用いてカウントすることで、非接着細胞濃度を測定する。さらに、二値化画像を用いて白い部分の総面積を解析することで、非接着細胞の占有面積を観察することも可能である。
【００４３】
例２：採取部および細胞数測定装置を有するシステム
図２には、本発明の一態様における処理のフローチャートを例示し、図３にはかかる態様のシステムのブロック図を示す。この例において、測定部はサンプリング装置および細胞数測定装置を含んでいる。
本態様では、シート化培養を任意の所定の時間行う。その後、サンプリング回数を参照し、設定値以上であった場合、異常終了のインジケータを点灯させ、培養を終了する。設定値以下であった場合、所定の時間振動させ、液体培地を攪拌する。攪拌終了後、液体培地をサンプリングし、細胞数測定装置でサンプル中の細胞数を計数する。このとき、参照したサンプリング回数値に１を加える。採取するサンプルの量は任意に設定してよく、変化し得る。細胞数が設定値以下である、すなわち非接着細胞濃度が所定の値以下であった場合、培養を停止してシート状細胞培養物の剥離工程へと進む。細胞数が設定値以上であった場合は、設定された時間追加培養を行う。追加培養終了後、再度サンプリング回数の参照工程へと戻る。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明によれば、シート化培養されたシート状細胞培養物が正しく形成されているか否かを、正確、簡便かつ迅速に判定することが可能となる。したがって、医療などの現場において適切な培養物の選択が簡便となり、迅速に治療に適用することが可能となる。さらに、シート状細胞培養物が形成され、剥離すべきタイミングを正確に判断することが出来るため、シートを確実に形成するために過剰に培養する必要がなくなり、過剰な培養に起因する品質の低下、例えば骨格筋芽細胞における望まない分化の進行など、を防ぐことが出来る。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シート状細胞培養物が正しく形成されたか否かを判定するためのシステム、および該システムを用いたシート状細胞培養物、特にヒト及び動物の疾病、傷病の治療に用いるシート状細胞培養物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の心臓病に対する治療の革新的進歩にかかわらず、重症心不全に対する治療体系は未だ確立されていない。心不全の治療法としては、βブロッカーやＡＣＥ阻害剤による内科治療が行われるが、これらの治療が奏功しないほど重症化した心不全には、補助人工心臓や心臓移植などの置換型治療、つまり外科治療が行われる。
【０００３】
このような外科治療の対象となる重症心不全には、進行した弁膜症や高度の心筋虚血に起因するもの、急性心筋梗塞やその合併症、急性心筋炎、虚血性心筋症（ＩＣＭ）、拡張型心筋症（ＤＣＭ）などによる慢性心不全やその急性憎悪など、多種多様の原因がある。
これらの原因と重症度に応じて弁形成術や置換術、冠動脈バイパス術、左室形成術、機械的補助循環などが適用される。
【０００４】
この中で、ＩＣＭやＤＣＭによる高度の左室機能低下から心不全を来たしたものについては、心臓移植や人工心臓による置換型治療のみが有効な治療法とされてきた。しかしながら、これら重症心不全患者に対する置換型治療は、慢性的なドナー不足、継続的な免疫抑制の必要性、合併症の発症など解決すべき問題が多く、すべての重症心不全に対する普遍的な治療法とは言い難い。
【０００５】
その一方、最近、重症心不全治療の解決策として新しい再生医療の展開が不可欠と考えられている。
重症心筋梗塞等においては、心筋細胞が機能不全に陥り、さらに線維芽細胞の増殖、間質の線維化が進行し心不全を呈するようになる。心不全の進行に伴い、心筋細胞は傷害されてアポトーシスに陥るが、心筋細胞は殆ど細胞分裂をおこさないため、心筋細胞数は減少し心機能の低下もさらに進む。
このような重症心不全患者に対する心機能回復には細胞移植法が有用とされ、既に自己骨格筋芽細胞による臨床応用が開始されている。
【０００６】
近年、その一例として、組織工学を応用した温度応答性培養皿を用いることによって、成体の心筋以外の部分に由来する細胞を含む心臓に適用可能な三次元に構成された細胞培養物と、その製造方法が提供された（特許文献１）。
【０００７】
また、製造工程由来不純物を用いない方法でシート状細胞培養物を製造する試みがなされてきた。例えば、播種細胞数のコントロールや、加圧などによって、製造工程由来不純物を含まないシート状細胞培養物およびその製造方法が提供された（特許文献２および３）。
【０００８】
一方、培養容器表面に接着する性質を有する細胞を培養して増殖させる過程において、培養容器と細胞との接着状態を観察する技術は知られている。例えば特許文献４には、増殖させた培養細胞を培養容器から剥離して回収する際に、培養容器内の輝度情報を測定し、かかる輝度情報に基づいてその剥離状態を判定する装置が開示されている。特許文献５には、接着依存性細胞を増殖培養する際に、その増殖能の指標として培養容器に接着するまでの時間を採用し、増殖性の接着細胞が培養容器に接着する際に伸展する性質を利用して、接着細胞と未接着細胞とを選別する装置が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特表２００７−５２８７５５号公報
【特許文献２】特開２０１０−８１８２９号公報
【特許文献３】特開２０１０−２２６９６２号公報
【特許文献４】ＷＯ２００７／１３６０７３
【特許文献５】特開２００１−２０５６０２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、シート状細胞培養物の製造工程において、シート状細胞培養物のシート化状態を判定するための方法、液体培地中の非接着細胞濃度またはその変化を測定するステップを含むシート状細胞培養物の製造方法、および該方法を用いたシステムを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
医療の現場においてシート状細胞培養物を用いて対象を治療する場合、用いるシート状細胞培養物を形成するためにシート形成細胞をシート化培養するが、使用する直前にシート状細胞培養物を剥離、回収することが望ましい。この際、シート状細胞培養物が正しく形成されていないとシート状細胞培養物が回収できないため、剥離する前にシート状細胞培養物が剥離可能な程度に形成されているか否かを判断する必要が生じてきた。本発明者らは、シート化培養においては、シート形成の進捗度合いがシート形成細胞の接着率に依存していることを新たに見出した。さらに鋭意研究を続ける中で、シート化培養中の細胞培養物の液体培地中に存在する細胞の濃度またはその変化を観察することにより、正確、簡便かつ非侵襲的にシート状細胞培養物のシート化状態を判定できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１２】
すなわち本発明は、以下の［１］〜［８］に関する。
［１］シート形成細胞のシート化培養において、液体培地中の非接着細胞濃度またはその変化を測定することにより、シート状細胞培養物のシート化状態を判定する方法。
［２］シート形成細胞をシート化培養する工程、および液体培地中の非接着細胞濃度またはその変化を測定することにより、シート状細胞培養物の形成を判定する工程を含む、シート状細胞培養物の製造方法。
［３］シート形成細胞をシート化培養する培養容器を収納する収納部、液体培地中の非接着細胞濃度またはその変化を測定するための測定部、および前記測定部で測定された測定値を解析して非接着細胞率を算出する解析部を含む、シート形成細胞のシート化状態を判定するためのシステム。
【００１３】
［４］測定部が、撮像部を含む、［３］に記載のシステム。
［５］解析が、撮像部からの画像データにおいて所定の階調値以下の階調値を有する画素の割合を算出することを含む、［４］に記載のシステム。
［６］測定部が、液体培地を攪拌するための攪拌部を含む、［３］に記載のシステム。
［７］測定部が、液体培地の一部を採取する採取部を含む、［３］または［６］に記載のシステム。
［８］非接着細胞濃度の測定が、非接着細胞数の計数である、［３］、［６］または［７］に記載のシステム。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、シート化培養されたシート状細胞培養物が正しく形成されているか否か（剥離可能なレベルに到達しているか否か）を正確に判定することが可能となる。したがって、医療などの現場において適切な培養物の選択が簡便となり、迅速に治療に適用することが可能となる。さらに、シート状細胞培養物が形成され、剥離すべきタイミングを正確に判断することが出来るため、シートを確実に形成するために過剰に培養する必要がなくなり、過剰な培養に起因する品質の低下、例えば骨格筋芽細胞における望まない分化の進行など、を防ぐことが出来る。特に本発明の方法により、シート状細胞培養物の形成を非侵襲的に判定することが可能となるため、ロット単位ではなく個別のシート状細胞培養物に対して本発明の方法が適用できるので、より正確にシート状細胞培養物の形成を判定できるようになる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、播種直後から６時間後までの培養容器底面の変化を示す図である。Ａは播種直後、Ｂは播種の１．５時間後、Ｃは播種の３時間後、Ｄは播種の４．５時間後、Ｅは播種の６時間後の図である。これらを解析してみると、シート状細胞培養物の一部を構成する細胞（黒色の点状に見えるもの）が時間とともに増大し、培地中に浮遊して沈降している細胞（白い点状に見えるもの）が時間とともに減少していることがわかる。
【図２】図２は、本発明の一態様における、システムの処理のフロー図を表す。
【図３】図３は、本発明の一態様における、システムのブロック図を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、シート形成細胞のシート化培養において、液体培地中の非接着細胞濃度またはその変化を測定することにより、シート状細胞培養物のシート化状態を判定する方法に関する。
【００１７】
本発明において、「シート形成細胞」とは、播種し、インキュベートすることにより、シート状細胞培養物を形成することができる細胞をいう。したがって、本発明において「シート形成細胞の培養」とは、シート状細胞培養物の形成のための培養を行うことを意味し、本明細書においては「シート化培養」と同義である。上述のとおり、シート状細胞培養物の製造において、製造工程由来不純物が混入することは好ましくない。したがって、本発明においてシート化培養は、実質的に増殖することなくシート状細胞培養物を形成し得る密度でシート形成細胞を播種し、培養することを意味する。シート形成細胞は具体的には、これに限定するものではないが、例えば骨格筋芽細胞、皮膚細胞、角膜上皮細胞、歯根膜細胞、心筋細胞、肝細胞、膵細胞、口腔粘膜上皮細胞などが挙げられ、好ましくは骨格筋芽細胞が挙げられる。
【００１８】
「実質的に増殖することなくシート状細胞培養物を形成し得る密度」とは、成長因子を含まない非増殖系の培養液で培養した場合に、シート状細胞培養物を形成することができる細胞密度を意味する。例えば、骨格筋芽細胞の場合、成長因子を含む培養液を用いる方法では、シート状細胞培養物を形成するために、約６，５００個／ｃｍ２の密度の細胞をプレートに播種していたが（例えば、特許文献１参照）、かかる密度の細胞を、成長因子を含まない培養液で培養してもシート状の細胞培養物を形成することはできない。したがって、本発明におけるシート形成細胞の播種密度は、成長因子を含む培養液を用いる方法、すなわち細胞の増殖を少なくとも目的の一部とする培養におけるものよりも高いものである。具体的には、例えば、骨格筋芽細胞については、かかる密度は典型的には３００，０００個／ｃｍ２以上である。細胞密度の上限は、細胞培養物の形成が損なわれず、細胞が分化に移行しなければ特に制限されないが、骨格筋芽細胞については、例えば、１，０００，０００個／ｃｍ２である。当業者であれば、本発明に適した細胞密度を、実験により適宜決定することができる。培養期間中、細胞は増殖してもしなくてもよいが、増殖するとしても、細胞の性状が変化する程には増殖しない。例えば、骨格筋芽細胞はコンフルエントになると分化を開始するが、本発明においては、骨格筋芽細胞は、細胞培養物は形成するが、分化に移行しない密度で播種される。
【００１９】
本発明の好ましい態様において、細胞は計測誤差の範囲を超えて増殖しない。細胞が増殖したか否かは、例えば、播種時の細胞数と、細胞培養物形成後の細胞数とを比較することにより評価することができる。本発明において、シート状細胞培養物形成後の細胞数は、典型的には播種時の細胞数の３００％以下、好ましくは２００％以下、より好ましくは１５０％以下、さらに好ましくは１２５％以下、特に好ましくは１００％以下である。
本発明において「液体培地」とは、細胞の培養に用い得る細胞培養液を意味し、単に「培地」または「培養液」という場合もある。上述のとおり、本発明において液体培地は、細胞の生存を維持でき、シート状細胞培養物を形成し得るものであれば何を用いてもよいが、好ましくは成長因子を含まない液体培地である。典型的には、アミノ酸、ビタミン類、電解質を主成分としたものが利用できる。本発明の一態様において、液体培地は、細胞培養用の基礎培地をベースにしたものである。かかる基礎培地には、これに限定するものではないが例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、Ｆ１２、ＤＭＥ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＣＤＢ（ＭＣＤＢ１０２、１０４、１０７、１３１、１５３、１９９など）、Ｌ１５、ＳｋＢＭ、ＲＩＴＣ８０−７などが含まれる。これらの基礎培地の多くは市販されており、その組成も公知となっている。
【００２０】
本発明の方法は、液体培地中の非接着細胞濃度を測定することでシート状細胞培養物の形成を判定するものである。本明細書において「非接着細胞濃度」とは、液体培地中の浮遊細胞の濃度を意味し、すなわち、シート化培養において培養容器と接着していない細胞の、液体培地中の存在濃度を意味する。非接着細胞濃度は、文字通りの意味での液体培地中の細胞濃度のみならず、それと同等と見なせるものも包含される。これに限定するものではないが、同等と見なせるものの一例として、培養容器底面を観察した際の観察データなどが挙げられる。シート化培養中は静置してインキュベートするため、通常非接着細胞も液体培地中に沈んでいる。培養容器の底面に接着した接着細胞は黒いドット状に観察されるが、非接着細胞は白い球状に観察することができるため、容易に判別可能である。接着細胞と非接着細胞を識別可能であれば、一視野中の非接着細胞の数を調べることで、液体培地中の細胞濃度を予測できることは当業者には容易に理解できるところであり、したがって、一視野中の非接着細胞の数のみならず、視野観察画像データそのものも上記非接着細胞濃度に包含される。
【００２１】
非接着細胞濃度の計測において、液体培地を攪拌し、培養容器底面に存在する非接着細胞を液体培地中で浮遊させ、懸濁状態とした上で計測することも可能である。シート化培養においてシート化の過程にある細胞は、培養容器底面でシート状細胞培養物の一部として接着しているため、液体培地を攪拌しても浮遊しない。しかしながら底面やシート状細胞培養物に接着していない細胞は、液体培地を攪拌することにより液体培地中に浮遊するため、正確な非接着細胞濃度を計測することができる。したがって本発明の方法の一態様において、液体培地を攪拌し、採取した液体培地中の浮遊細胞数を計測する工程を含むことができる。
【００２２】
非接着細胞濃度は、培養のある時点での濃度を計測し、それを初期濃度（すなわち播種濃度）と比較してもよいし、ある２つの時点での濃度を比較して変化をみてもよい。かかる濃度またはその変化を測定することで、シート形成細胞のシート化状態を判定することができる。本明細書において「シート化状態」は「シート化の進捗度合い」とも表され、シート状細胞培養物の形成度合いを表すものである。
【００２３】
本発明に用いられるシート化培養においては、通常の培養と比較して高密度でシート形成細胞を播種し、実質的に細胞は分裂、増殖せずに培養容器に接着し、シート状細胞培養物を形成することとなる。通常の培養であれば、播種した細胞のほぼ全てが培養容器に接着し、増殖を開始してシートを形成するため、播種した細胞はほぼすべて接着し、シート形成において液体培地中に浮遊細胞が存在することはほとんどない。しかし、本発明に用いられるシート化培養においては、シート状細胞培養物の形成は、シート形成細胞が培養容器に接着してシート状細胞培養物の一部を構成することで進行するため、液体培地中に播種された細胞のうち、浮遊細胞が少なくなれば、すなわち非接着細胞濃度が小さくなれば、シート化が進行しているといえる。したがって、シート化状態は非接着細胞率から一義的に決定され得る。シート化状態としては、これに限定するものではないが、例えば、完成状態を１００％としたときの完成度を百分率で表したものなどでもよいし、所定の値以上の完成度のものを「合格」とするものであってもよい。
【００２４】
シート状細胞培養物の製造において、シート化培養を行う時間が短すぎるとシートの形成が不十分となるために好ましくない。逆にシート化培養を行う時間が長すぎると、高い細胞密度の中に長時間置かれることで細胞に負荷がかかり、例えば分化が起こったり、細胞死を起こしてしまうことが考えられるため、やはり好ましくない。シート化培養の培養時間は、好ましくは１６〜４８時間である。本発明の方法は、特にシート状細胞培養物の製造において、シート状細胞培養物形成の進捗度合いを確認し、最適なタイミングでシート化培養を終了することにより、品質の高いシート状細胞培養物を提供することを可能にする。したがって本発明には、シート形成細胞をシート化培養する工程、および液体培地中の非接着細胞濃度またはその変化を測定することにより、シート状細胞培養物の形成を判定する工程を含む、シート状細胞培養物の製造方法が包含される。
【００２５】
本発明の別の側面は、上記方法を実行するためのシステムを包含する。かかるシステムとしては、シート形成細胞をシート化培養する培養容器を収納する収納部、液体培地中の非接着細胞濃度を測定するための測定部、および前記測定部で測定された測定値を解析して非接着細胞率を算出する解析部を含む、シート形成細胞のシート化状態を判定するための前記システムが含まれる。
【００２６】
本発明のシステムは、液体培地中のシート形成細胞の濃度（非接着細胞濃度）を測定するための測定部を含む。かかる非接着細胞濃度には、上述の通り文字通りの意味での液体培地中の細胞濃度のみならず、それと同等と見なせるものも包含され得、したがって液体培地中の細胞濃度を直接予測可能なデータであればいかなる形式で表されてもよく、測定部が有する測定装置に依存して変化し得る。したがって非接着細胞濃度は、これに限定するものではないが例えば、画像データであってもよいし数値データであってもよい。例えば測定装置が撮像装置である場合は、非接着細胞濃度は画像データとして取得されるし、例えば測定装置が吸光度計または濁度計である場合には、非接着細胞濃度は透過光強度または濁度という数値データとして取得されることになる。測定部は、前記非接着細胞濃度のデータが得られる測定装置を含むものであればいかなるものであってもよく、これに限定するものではないが例えば撮像装置、透過光検出器、色相色差計などが挙げられ、データの汎用性や処理の多様性、試料への非侵襲性などの観点から、測定部が撮像部を含み、非接着細胞濃度が画像データとして取得されることが好ましい。
【００２７】
本発明のシステムは、上記非接着細胞濃度を解析し、非接着細胞率を算出する解析部を含む。本明細書において「非接着細胞率」とは、全播種細胞のうちどの程度の細胞が液体培地中に存在しているかを表す割合を意味する。具体的には、これに限定するものではないが例えば、全播種細胞中の非接着細胞の割合、顕微鏡観察した際の一視野における全細胞数に対する非接着細胞の割合または視野中に占める非接着細胞の占有面積、液体培地を攪拌して採取した際に採取サンプル中に含まれる浮遊細胞の数などが挙げられる。解析部で行われる解析は、得られる非接着細胞濃度のデータの形式によって変化し得る。これに限定するものではないが、例えば得られた画像データを処理して非接着細胞領域の占有面積を求めてもよいし、得られた画像データにおいて一視野中の非接着細胞数を計数してもよいし、得られた透過光強度データの経時変化から非接着細胞率の検量線を描いてもよい。当業者であれば、公知の方法を用いて、得られたデータから非接着細胞率を算出することができる。
【００２８】
上述の通り、本発明に用いられるシート化培養においては、通常の培養と比較して高密度でシート形成細胞を播種し、実質的に細胞は分裂、増殖せずに培養容器に接着し、シート状細胞培養物を形成することとなるため、通常の培養であれば指標とはなり得ない非接着細胞率を指標として、シート化状態を判定することが可能である。当然非接着細胞濃度もある程度の指標にはなるが、播種濃度に依存しない指標である非接着細胞率を指標とすることが好ましい。シート化状態の評価はいかなる方法で行ってもよい。例えば２５％、２０％、１５％、１０％、５％など、所定の閾値を設定し、非接着細胞率が該閾値以下の場合にシート形成が完了したと判断してもよいし、非接着細胞率を基にシート形成の進捗度合いを数値で表現してもよい。
【００２９】
前記非接着細胞濃度は、解析部によって解析される前に、解析部内の記録媒体に記録され得る。したがって解析部は、記録部を有していてもよい。記録部としては、例えば磁気テープ、磁気ディスク、光ディスク、光磁気ディスク、フラッシュメモリなど、電気的に記録されるものであってもよいし、例えば紙、写真など、物理的に記録されるものであってもよい。
【００３０】
上記閾値の設定値は、播種するシート形成細胞の数などに依存して変化し得、使用の形態に応じて入力される任意の値であってもよいし、あらかじめ上記記録部に記録された値でもよい。したがって解析部は入力部を備えていてよい。入力部の形態は、例えばキーボード、センサー（該センサーは測定部の測定装置と同一のものであってもよい）、タッチパネルなど、当業者に知られたあらゆる入力部が用いられ得る。最も好ましくは、設定値は０、すなわち播種した細胞が全て接着した状態である。設定値は、測定部によって測定される値や所望のシート形成度合いに依存して変化するため、設定値は使用の際に任意に入力され得る。設定値の入力部は、上記入力部と共通であってもよいし、異なっていてもよい。
【００３１】
解析部において、好ましくは測定部で測定された接着状態および／または解析部による接着率および／または解析結果が、情報として外部に出力される。したがって解析部は、該情報の出力部を備えていてよい。情報の出力手段としては、例えば外部モニター、ランプ、ブザー、予め登録された携帯電話やインターネットメールアドレスへの送信など、剥離完了の情報を操作する人間に知らせるものであってもよいし、プリンタなど、記録部に出力されるものであってもよい。
【００３２】
収納部は、培養容器の周辺環境を制御し得る制御部を有していてよい。周辺環境とは、これに限定されるものではないが、例えば温度、圧力、湿度、ＣＯ２濃度などが挙げられる。したがって制御部は、制御すべき設定を入力する入力部や、設定値を記録しておく記録部、現在の周辺環境の状態を測定する測定部、測定部にて測定した情報などを出力する出力部などを有していてよい。また、かかる制御部は、解析部とＣＰＵ、入力部、出力部および／または記録部を共有していてもよい。
【００３３】
また、本発明の一態様において、収納部は、培養容器周辺を細胞培養に適した環境に保つことが可能である。したがって、かかる態様における収納部は、細胞培養インキュベーターとして機能することができる。この態様において、収納部をインキュベーターとして用いてシート化培養し、インキュベートと平行して本発明の判定を実行することが可能である。
【００３４】
本発明の一態様において、測定部は撮像部を含み、したがって非接着細胞濃度のデータは画像データとして得られる。本発明のシート化培養においては、通常の培養と比較して高密度でシート形成細胞を播種するため、通常培養の接着細胞とは異なり、接着細胞が黒いドット状になることが新たに見出された。接着細胞が黒いドット状に見える理由として、通常の培養においては播種細胞密度が低いため、接着面積を伸展させるように接着することができるが、本願のシート化培養においては播種細胞密度が高いため、細胞が接着面を伸展させることが困難なことに加え、細胞密度が高いことがと考えられる。
【００３５】
したがって、シート化培養の場合には、色相または階調値の違いによって、視野内の接着細胞領域と非接着細胞領域とを容易に識別することが可能である。例えば、画像全体を、非接着細胞を示す領域とそれ以外の領域に区分けし、画像全体のうち非接着細胞を示す領域がどの程度の割合で存在するかを求めることで、非接着細胞率を算出可能である。
【００３６】
本態様の一例として、例えば画像データを白（階調値０）および黒（階調値２５５）のモノクロ二階調化処理、すなわち２５６階調グレースケール処理し、所定の階調値以下の階調値を有する画素の割合を計測することで、上記非接着細胞率を求めることが可能である。閾値となる所定の階調値は、得られる画像データの明度によって変化し得、これに限定するものではないが例えば５０以下、１００以下、１２８以下、１５０以下、２００以下などであってよい。
【００３７】
本発明の別の態様において、測定部が、液体培地を攪拌する攪拌部をさらに含む。本明細書において、「攪拌」とは、液体培地を流動させることにより、細胞分布を変化させ得る任意の行為を意味する。本発明のシート化培養において、培養容器は静置された状態であるため、非接着細胞も培養容器の下に滞留することになる。したがって液体培地から直接細胞濃度を計測するためには、一度攪拌することで、非接着細胞の分布を均一化することが好ましい。攪拌は、細胞に損傷を与えない行為が好ましく、典型的には、振動を与える、スターラーで攪拌する、ピペッティングするなどが挙げられる。本態様の攪拌部としては、これに限定するものではないが、例えば振動機、ロータリーシェーカー、マグネティックスターラー、ピペットなどが挙げられる。細胞への損傷の少なさ、簡便性などの観点から、振動による攪拌が好ましい。攪拌は、任意に設定された所定の時間行われる。
【００３８】
本態様のシステムは、さらに攪拌を制御するための攪拌制御部を有してもよい。攪拌制御部により、攪拌の時間、強度、攪拌方法などを制御する。かかる攪拌制御部は、解析部と一体であってもよく、したがって本態様において、解析部は攪拌制御部を兼ねてもよい。解析部の有する入力部はかかる制御のための設定値の入力部を兼ねていてもよい。
【００３９】
本発明の一態様において、測定部が、液体培地の一部を採取する採取部を含む。攪拌して非接着細胞が均一化されると、該採取部が液体培地の一部を採取する。採取された液体培地は、測定の後容器に戻されてもよいし、廃棄されてもよい。
採取された液体培地は、試料として非接着細胞濃度を測定される。測定は非接着細胞濃度を求められるものであれば何でもよく、あらゆる公知の方法を用いることができる。具体的には、これに限定するものではないが、例えば吸光度測定、非接着細胞数の計数などが挙げられる。非接着細胞濃度を直接的かつ正確に計測できるという観点から、好ましくは非接着細胞濃度の測定は、非接着細胞数の計数である。
【００４０】
以下に本発明の具体的な態様を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの具体例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４１】
例１：非接着細胞の観察
ヒト全血から得た血清を、２０％ｗ／ｖとなるようにＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Invitrogen製）に加え、フィルターユニット（ナルジェヌンクインターナショナル社製、孔サイズ０．２μｍ）にてろ過してシート形成培地とした。このシート形成培地１０ｍＬに６×１０７個の骨格筋芽細胞を懸濁し、１０ｃｍ温度応答性培養皿（セルシード製）に播種し、３７℃、５％ＣＯ２濃度の条件で、１２〜２６時間培養した。細胞播種直後、１．５時間後、３時間後、４．５時間後、６時間後にそれぞれ細胞を倒立型リサーチ顕微鏡で観察し、撮像した。結果を図１に示す。
【００４２】
図１から明らかなように、非接着細胞は白いドット状に観察され、経時的に減少していく。この白いドット状に見える部分を、画像解析装置を用いてカウントすることで、非接着細胞濃度を測定する。さらに、二値化画像を用いて白い部分の総面積を解析することで、非接着細胞の占有面積を観察することも可能である。
【００４３】
例２：採取部および細胞数測定装置を有するシステム
図２には、本発明の一態様における処理のフローチャートを例示し、図３にはかかる態様のシステムのブロック図を示す。この例において、測定部はサンプリング装置および細胞数測定装置を含んでいる。
本態様では、シート化培養を任意の所定の時間行う。その後、サンプリング回数を参照し、設定値以上であった場合、異常終了のインジケータを点灯させ、培養を終了する。設定値以下であった場合、所定の時間振動させ、液体培地を攪拌する。攪拌終了後、液体培地をサンプリングし、細胞数測定装置でサンプル中の細胞数を計数する。このとき、参照したサンプリング回数値に１を加える。採取するサンプルの量は任意に設定してよく、変化し得る。細胞数が設定値以下である、すなわち非接着細胞濃度が所定の値以下であった場合、培養を停止してシート状細胞培養物の剥離工程へと進む。細胞数が設定値以上であった場合は、設定された時間追加培養を行う。追加培養終了後、再度サンプリング回数の参照工程へと戻る。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明によれば、シート化培養されたシート状細胞培養物が正しく形成されているか否かを、正確、簡便かつ迅速に判定することが可能となる。したがって、医療などの現場において適切な培養物の選択が簡便となり、迅速に治療に適用することが可能となる。さらに、シート状細胞培養物が形成され、剥離すべきタイミングを正確に判断することが出来るため、シートを確実に形成するために過剰に培養する必要がなくなり、過剰な培養に起因する品質の低下、例えば骨格筋芽細胞における望まない分化の進行など、を防ぐことが出来る。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シート形成細胞のシート化培養において、液体培地中の非接着細胞濃度またはその変化を測定することにより、シート状細胞培養物のシート化状態を判定する方法。
【請求項２】
シート形成細胞をシート化培養する工程、および液体培地中の非接着細胞濃度またはその変化を測定することにより、シート状細胞培養物の形成を判定する工程を含む、シート状細胞培養物の製造方法。
【請求項３】
シート形成細胞をシート化培養する培養容器を収納する収納部、液体培地中の非接着細胞濃度またはその変化を測定するための測定部、および前記測定部で測定された測定値を解析して非接着細胞率を算出する解析部を含む、シート形成細胞のシート化状態を判定するためのシステム。
【請求項４】
測定部が、撮像部を含む、請求項３に記載のシステム。
【請求項５】
解析が、撮像部からの画像データにおいて所定の階調値以下の階調値を有する画素の割合を算出することを含む、請求項４に記載のシステム。
【請求項６】
測定部が、液体培地を攪拌するための攪拌部を含む、請求項３に記載のシステム。
【請求項７】
測定部が、液体培地の一部を採取する採取部を含む、請求項３または６に記載のシステム。
【請求項８】
非接着細胞濃度の測定が、非接着細胞数の計数である、請求項３、６または７に記載のシステム。
【請求項１】
シート形成細胞のシート化培養において、液体培地中の非接着細胞濃度またはその変化を測定することにより、シート状細胞培養物のシート化状態を判定する方法。
【請求項２】
シート形成細胞をシート化培養する工程、および液体培地中の非接着細胞濃度またはその変化を測定することにより、シート状細胞培養物の形成を判定する工程を含む、シート状細胞培養物の製造方法。
【請求項３】
シート形成細胞をシート化培養する培養容器を収納する収納部、液体培地中の非接着細胞濃度またはその変化を測定するための測定部、および前記測定部で測定された測定値を解析して非接着細胞率を算出する解析部を含む、シート形成細胞のシート化状態を判定するためのシステム。
【請求項４】
測定部が、撮像部を含む、請求項３に記載のシステム。
【請求項５】
解析が、撮像部からの画像データにおいて所定の階調値以下の階調値を有する画素の割合を算出することを含む、請求項４に記載のシステム。
【請求項６】
測定部が、液体培地を攪拌するための攪拌部を含む、請求項３に記載のシステム。
【請求項７】
測定部が、液体培地の一部を採取する採取部を含む、請求項３または６に記載のシステム。
【請求項８】
非接着細胞濃度の測定が、非接着細胞数の計数である、請求項３、６または７に記載のシステム。
【図２】
【図１】
【図３】
【図１】
【図３】
【公開番号】特開２０１２−１５２１８８（Ｐ２０１２−１５２１８８Ａ）
【公開日】平成２４年８月１６日（２０１２．８．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１６３８２（Ｐ２０１１−１６３８２）
【出願日】平成２３年１月２８日（２０１１．１．２８）
【出願人】（０００１０９５４３）テルモ株式会社 (2,232)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年８月１６日（２０１２．８．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１月２８日（２０１１．１．２８）
【出願人】（０００１０９５４３）テルモ株式会社 (2,232)
【Ｆターム（参考）】
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