ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）−デキストランを放射標識するための組成物
本発明は、テクネチウム−９９ｍでジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）−デキストランを放射標識し、ＤＴＰＡ−デキストランコールドキットを安定化するための組成物に関する。本組成物は、９９ｍＴｃ過テクネチウム酸を還元するための塩化第一スズイオン、第二スズイオンを第一スズイオンに還元して還元環境を維持するためのアスコルビン酸、放射化学的収率に干渉せずに嵩を増やして凍結乾燥組成物を安定化するためのα，α−トレハロース、および強酸性条件下でテクネチウム−９９ｍをトランスキレートして高い放射化学的純度でのＤＴＰＡ−デキストランの放射標識を促進するグリシンを含む。更に、本発明はこの組成物の製造方法および使用方法に関する。９９ｍＴｃ過テクネチウム酸により凍結乾燥組成物を再構成することで、ｐＨ３〜４の組成物中で放射標識された９９ｍＴｃ−ＤＴＰＡ−デキストランが得られる。本発明は、希釈剤バイアルを含み、この希釈剤を使用することで、ｐＨが穏やかな酸性ｐＨにシフトし、注射時の痛みが少なくなり、医師は効力を調整し易くなる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍学分野、より具体的には癌検出剤の放射標識に関する。
【背景技術】
【０００２】
メラノーマおよび乳癌を診断するための一般的な方法としてセンチネルリンパ節生検が急速に普及してきている（Vera, D. R. et al. (2001) J. Nucl. Med. 42, 951-959）。この技術はまだ標準化されておらず、通常、９９ｍＴｃコロイドおよび青色色素を使用する。コロイドイメージング剤中および本発明中で用いられる放射性同位体９９ｍテクネチウムは複数の望ましい特性を有する。すなわち、入手が用意であり、比較的低コストであり、イメージングの質が優れており、半減期が６時間と短い。この放射性トレーサーは手術前にセンチネルリンパ節の位置を確認するために使用され、その後、手術中にセンチネルリンパ節の切開部を正確に特定するために使用される。青色色素は、リンパ管およびリンパ節から迅速に排除され、センチネルリンパ節として選択される放射活性リンパ節を視覚的に確認するために使用される。この生検手技は個々の医師で異なるため、一貫性のある一連の技能を有する医師を養成することが難しく、そのため、これらの生検は幅広い偽陰性率が報告されている（すなわち０〜１２％、上記のVera, D. R.参照）。
【０００３】
このセンチネルリンパ節生検技術を標準化するためにはもう１つのハードルがあり、それはセンチネルリンパ節の検出またはセンチネルリンパ節に取り込ませるために特別に設計された青色色素または９９ｍＴｃ標識薬剤が存在しないことである。現在、ＦＤＡ（米国食品医薬品局）は、センチネルリンパ節診断用の如何なる色素または９９ｍＴｃ標識薬剤も承認していない。そのため、以下の放射性医薬品が適応外（ｏｆｆ−ｌａｂｅｌ）で使用されている：９９ｍＴｃ硫黄コロイド、ろ過した９９ｍＴｃ硫黄コロイド、９９ｍＴｃ三硫化アンチモン、および９９ｍＴｃ標識アルブミンマイクロコロイドの複数の標品（注：コロイドは粘着性の非標的化粒子である）。これらの薬剤はいずれも、注射部位における迅速なクリアランスまたはセンチネルリンパ節への取込みが多いという理想的な特性を示さない（Hoh, C. K., et al. (2003) Nucl. Med. Biol. 30, 457-464）。
【０００４】
したがって、最適なセンチネルリンパ節検出の目標を満たすように設計された（すなわち、注射部位におけるクリアランスが迅速であり遠位リンパ節への蓄積が少ない）核イメージング診断キットの開発は、乳癌およびメラノーマの処置において満たされていない医学的ニーズである。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、放射標識後の放射化学的純度が高く、１個の凍結乾燥バイアルおよび液体希釈剤バイアルを含む「インスタント」キットとして使い易い、ＤＴＰＡ等の二官能性キレート剤とコンジュゲートされたデキストランを含む組成物を提供する。本発明はまた、診断用イメージング剤としての取扱いおよび投与を容易にして医薬用途または臨床用途を促進するのに十分な再構成後の安定性および長期保存安定性を提供する。
【０００６】
９９ｍＴｃ過テクネチウム酸ナトリウムを添加すると、本発明は、デキストラン分子上の複数のアミノ末端化された鎖（ｌｅａｓｈ）に５個のカルボン酸アーム（ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｒｍ）の１個によるアミド結合を介してコンジュゲートされている二官能性リガンドＤＴＰＡが高い放射化学的純度を示す（すなわち、９０％を超える９９ｍＴｃ−ＤＴＰＡ−デキストラン純度）。フリーのＤＴＰＡは脱プロトン化されたカルボン酸基５個全てを配位させ、八座リガンドとして例えば１１１インジウム等の重金属イオンに結合していることが明らかであるが（更に３個の窒素原子を含む−H. R. Maecke, et al. (1989) J. Nucl. Med. 30, 1235-1239参照）、七座リガンドＤＴＰＡは、結合の熱力学的安定性が低く、９９ｍＴｃイオンへの結合が競合され易く、放射化学的純度が低くなり得る。
【０００７】
ｐＨを約２〜４に下げ、非競合的な構成要素をスクリーニングして理想的なトランスキレート剤としてグリシン（ｐＨバッファーとしても働く）を同定し、以下の事実を利用することで、高い放射化学的純度の９９ｍＴｃ−ＤＴＰＡ−デキストランが得られた：（１）９９ｍＴｃへの競合リガンドの分布が会合速度定数により決まることおよび（２）ＤＴＰＡ−デキストラン錯体からの９９ｍＴｃの解離速度定数が非常に遅く、ｐＨ依存性であること。したがって、より強く放射性同位体に結合するＤＴＰＡ−デキストランに放射性同位体を移すグリシンへの強酸性条件下での一時的結合およびこの「インスタント」キットのｐＨをキットの希釈剤を用いて穏やかな酸性条件にシフトさせた後にテクネチウム−９９ｍが保持される（解離速度定数が遅いため）ことで、ＤＴＰＡ−デキストランの高効率の放射標識が向上する。
【０００８】
本発明は更に、注射時に痛みを生じさせる強い酸性条件（すなわち約３〜４のｐＨ）から十分に耐えられる穏やかな酸性条件（すなわちｐＨ＞約５）にｐＨをシフトさせることで患者の快適さを可能にするリン酸緩衝生理食塩水希釈剤を提供する（M. Stranz and E. S. Kastango (2002) Int. J. Pharm. Compound. 6(3), 216-220）。
【０００９】
本開示は更に、過剰な第一スズイオンまたは第二スズイオンを含む放射標識ＤＴＰＡ−デキストラン標品を更に安定化する例えばＬ−アスコルビン酸等の還元剤を提供し、これにより、ＳｎコロイドまたはＳｎ４＋等のその他の放射化学的不純物の形成が防止される。本発明はまた、製剤中にＬ−アスコルビン酸を含めることで、薬剤物質およびその構成要素の酸化分解ならびに放射標識された薬品の自己放射線分解を防ぐ。
【００１０】
更に、本発明は、不定形（ａｍｏｒｐｈｏｕｓ）の二糖凍結乾燥ケーキの形態のＤＴＰＡ−デキストランにとって安定且つ審美的に満足な環境を提供し、９９ｍＴｃ過テクネチウム酸ナトリウムによる迅速な再構成および緩衝生理食塩水希釈剤の添加による使用し易い透明な非微粒子液体の生成を可能にする。本発明はまた、凍結乾燥バイアルに医薬品グレードの窒素ガスをバックフィル（ｂａｃｋｆｉｌｌ）することで不活性ガスのヘッドスペースを提供し、本発明の保存寿命期間中にわたり、第一スズイオンを更に安定化して９９ｍＴｃ過テクネチウム酸ナトリウム（または９９ｍＴｃＯ４−）を還元する能力を余分に提供する。
【００１１】
したがって、本発明の方法は、１個の凍結乾燥バイアルをｐＨ緩衝希釈剤で更に再構成して最終的な溶液ｐＨをシフトさせて少なくとも６時間安定であり且つ患者の快適さを向上させる溶液を得る、高い放射化学的純度のＤＴＰＡ−デキストランの９９ｍＴｃ（ＩＩＩ）（およびおそらく９９ｍＴｃ（ＩＶ））錯体を調製する改良された方法であり（Russell, CD. (1980) J. Nucl. Med. 21, 354-360；Russell, CD. and Speiser, A.G. (1982) Int. J. Appl. Radiat. Isot. 33, 903-906）。このＤＴＰＡ−デキストランの凍結乾燥コールドキット製剤は、窒素環境下で固体白色凍結乾燥ケーキ形態の９９ｍＴｃ過テクネチウム酸ナトリウムの還元に必要な塩化第一スズを安定化し、長期間の保存安定性を有する、「インスタント」キットである。このキットは、強酸性条件下における９９ｍＴｃ過テクネチウム酸のＳｎ２＋還元により高い放射化学的純度を得、リン酸緩衝生理食塩水で希釈して再構成後の溶液ｐＨを中性側にシフトさせた後の９９ｍテクネチウム−ＤＴＰＡ−デキストラン錯体の放射化学的収率９０％超を維持する。
【００１２】
本発明のプロセス、組成物、およびキットの性質および利点を更に深く理解するために、添付の図面と関連付けて以下の詳細な説明を参照すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】再構成された９９ｍテクネチウム標識Ｌｙｍｐｈｏｓｅｅｋ（登録商標；オハイオ州ダブリンのネオプローブ・コーポレーションの登録商標；米国特許第６，４０９，９９０号）リガンド薬品（９９ｍＴｃ−ＤＴＰＡ−マンノシル−デキストラン）の典型的なサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）溶出プロフィールを示す図である。
【図２】凍結乾燥Ｌｙｍｐｈｏｓｅｅｋリガンド薬品のプラセボを用いた、１０ミリキュリーの９９ｍＴｃ過テクネチウム酸で放射標識された９９ｍテクネチウム標識ＤＴＰＡ標準の典型的な溶出プロフィールを示す図である。
【図３】最初のパイロット製剤の３つの賦形剤（シトラート、マンニトール、およびＬ−システイン）が顕著な９９ｍＴｃ標識ピークを示すことを示す図である。
【図４】最初の薬品製剤と液体の薬剤物質製剤パイロットの比較を示す図である。
【図５】リン酸ナトリウムｐＨバッファーならびに種々の組合せのトランスキレート剤（シトラート）、還元剤（アスコルビン酸）、および増量剤（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）８０００）を含む液体ＤＴＰＡ−マンノシル−デキストラン薬剤物質プラセボ製剤パイロットの、ＳＥＣ放射化学的純度測定法によって測定されるＳＥＣ放射化学的溶出プロフィールを縦に並べて示した図である。
【図６】リン酸ナトリウムｐＨバッファーを含む対応する液体ＤＴＰＡ−マンノシル−デキストラン薬剤物質プラセボ製剤パイロットのＳＥＣ放射化学的溶出プロフィールを縦に並べて示した図である。
【図７Ａ】ｐＨ４の２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ＡＣＥ）、タルトラート、およびＰＥＧ８０００を含むＤＴＰＡ−マンノシル−デキストラン薬剤物質およびプラセボの液体製剤パイロットのＳＥＣ放射化学的溶出プロフィールを縦に並べて示した図である。
【図７Ｂ】ｐＨ４の２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ＡＣＥ）、タルトラート、およびＰＥＧ８０００を含むＤＴＰＡ−マンノシル−デキストラン薬剤物質およびプラセボの液体製剤パイロットのＳＥＣ放射化学的溶出プロフィールを縦に並べて示した図である。
【図８】ｐＨ４および６の２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーを含むＤＴＰＡ−マンノシル−デキストラン薬剤物質およびプラセボの液体製剤パイロットのＳＥＣ放射化学的溶出プロフィールを縦に並べて示した図である。
【図９Ａ】第一級アミンを有する還元糖および両性イオンアミノ酸、すなわちグルコサミンナトリウム（ＧｌｃＮＨ）およびグリシン（Ｇｌｙ）を用いたスクリーニング実験を示す図である。
【図９Ｂ】第一級アミンを有する還元糖および両性イオンアミノ酸、すなわちグルコサミンナトリウム（ＧｌｃＮＨ）およびグリシン（Ｇｌｙ）を用いたスクリーニング実験を示す図である。
【図１０Ａ】２つの終濃度での賦形剤グリシンおよびアスコルビン酸ナトリウムの範囲に関する実験を示す図である。Ｇｌｙ１およびＧｌｙ２はそれぞれ０．５および２．０ｍｇグリシン／ｍＬであり、ＡＡ１およびＡＡ２はそれぞれ１．５および０．３８ｍｇ／ｍＬアスコルビン酸ナトリウムである。
【図１０Ｂ】２つの終濃度での賦形剤グリシンおよびアスコルビン酸ナトリウムの範囲に関する実験を示す図である。Ｇｌｙ１およびＧｌｙ２はそれぞれ０．５および２．０ｍｇグリシン／ｍＬであり、ＡＡ１およびＡＡ２はそれぞれ１．５および０．３８ｍｇ／ｍＬアスコルビン酸ナトリウムである。
【図１１】ｐＨ５〜４の２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーならびにグリシン、アスコルビン酸ナトリウム、およびα，α−トレハロースを含む液体薬剤物質製剤パイロットのＳＥＣ放射化学的溶出プロフィールを縦に並べて示した図である。
【図１２】１２．５ｍＣｉの９９ｍＴｃ過テクネチウム酸を添加したＤＭＤ薬剤物質製剤（２５μＭのＤＴＰＡ−マンノシル−デキストラン（０．５ｍｇ／ｍＬ）、ｐＨバッファー、０．５ｍｇ／ｍＬのグリシン、０．５ｍｇ／ｍＬのアスコルビン酸ナトリウム、２％（ｗ／ｖ）α，α−トレハロース、３８．５ｍｍの塩化ナトリウム、および７５μｇ／ｍＬのＳｎＣＬ２・２Ｈ２Ｏを含む）のＳＥＣ放射化学的溶出プロフィールを縦に並べて示した図である。ｐＨバッファーは、（上のパネルから順に）ｐＨ４の酢酸バッファー、ｐＨ３のリン酸バッファー、およびｐＨ２のリン酸バッファーである。
【図１３】以下の賦形剤を含むｐＨ３、２、および４のＤＭＤ薬剤物質製剤のＳＥＣ放射化学的溶出プロフィールを縦に並べて示した図である：２５μＭのＤＴＰＡ−マンノシル−デキストラン（０．５ｍｇ／ｍＬ）、０．５ｍｇ／ｍＬのグリシン、０．５ｍｇ／ｍＬのアスコルビン酸ナトリウム、２％（ｗ／ｖ）のα，α−トレハロース、および７５μｇ／ｍＬのＳｎＣＬ２・２Ｈ２Ｏ（およびｐＨ４では１０ｍＭ酢酸ナトリウム）。 図面は後述する実施例中で更に詳細に説明される。
【発明の具体的説明】
【００１４】
センチネルリンパ節診断用の商業的「インスタント」キットの開発の鍵は、センチネルリンパ節の最適な検出に必要な特性を有するイメージング剤の合理的設計である。そのような特性とは、小さい分子直径および高い受容体親和性であり、これにより、注射部位でのクリアランス速度が速く且つ遠位リンパ節への蓄積が少ない放射性医薬品が得られる（前述のVera, D. R.）。本発明では、使用される薬剤物質は、放射標識を送達するためにデキストランプラットフォームを使用する。このデキストラン骨格は、医薬品グレードであり、非常に親水性が高く、電荷がなく、柔軟な、平均分子量約９５００のポリマーである。これらの物理的性質は全て、膜壁を横切る移動を減らし、注射部位における迅速なクリアランスを促進する。デキストランポリマーは、ＤＴＰＡ基に結合しているアミン末端化テザーにコンジュゲートされ、分子に高い受容体親和性を付与し、９９ｍテクネチウムと錯体を形成する。９９ｍＴｃ−ＤＴＰＡ−マンノシル−デキストランは信号密度が高く、バックグラウンドに対する信号の比率が大きいため、センチネルリンパ節をよりよく検出することが可能になる。
【００１５】
別のアミン末端化テザーにコンジュゲートされるマンノシル基を添加することで、ＤＴＰＡ−マンノシル−デキストランに結合特異性が付与され、代替物な非標的化イメージング剤と差別化される。ＤＴＰＡ−マンノシル−デキストランはインビトロでマンノース末端化糖タンパク質受容体に強く結合する（前述のVera, D. R.）。ウサギの体内分布研究により、９９ｍＴｃ−ＤＴＰＡ−マンノシル−デキストランはリンパ管中に拡散し、センチネルリンパ節に流入し、センチネルリンパ節中に存在するマクロファージおよび樹状細胞中のマンノース結合糖タンパク質受容体に結合することが示されている（前述のHoh, C. K.；Fiete, D. and Baenziger, J. U. (1997) J. Biol. Chem. 272(23), 14629-14637；Ramakrishna, V. et al. (2004) J. Immunol. 172, 2845-2852）。したがって、９９ｍＴｃ−ＤＰＴＡ−マンノシル−デキストランは、センチネルリンパ節検出のための優れた標的化９９ｍＴｃ標識診断薬である（前述のHoh, C. K.）。９９ｍＴｃ−ＤＴＰＡ−マンノシル−デキストランの臨床前および第Ｉ相試験では、複数回の液体移動および複数のバイアルを用いた放射標識手順を用いたが、この投薬形態は商業的使用には望ましくないものであった。
【００１６】
この重要な核イメージング剤を商業化するために、組成物（製剤）およびこのＬｙｍｐｈｏｓｅｅｋ（登録商標）リガンド薬品組成物の製造方法を開発した。これも本発明の対象である。９９ｍテクネチウム標識核イメージング「インスタント」キットの開発は、高い放射化学的効率と非特異的９９ｍＴｃ標識材料（すなわち、９９ｍＴｃコロイドまたは９９ｍＴｃ標識製剤賦形剤）の形成との微妙なバランスである。また、還元型９９ｍテクネチウムが９９ｍＴｃＯ４−に再度酸化されるのを防ぐ必要がある。そこで、不活性窒素環境下で第一スズイオンを安定化するために凍結乾燥製剤を開発した。
【００１７】
本発明では、組成物は、新たに同定したトランスキレート剤のグリシンを強酸性条件下で使用することでこの微妙なバランスを達成している。トランスキレート剤とは、還元型９９ｍテクネチウムに一時的に結合し、より強いキレート剤またはリガンドへのこの放射性同位体の移動を容易化する、弱いキレート剤である。還元型９９ｍテクネチウムのリガンドは、５個のカルボン酸基の１個でデキストランのアミン末端化テザーに結合した七座二官能性リガンドである、誘導体化されたジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）である。このリガンドは当業者に周知である。これは、ペプチドおよびタンパク質を放射標識するための「インスタント」キットに含められてきた（Hansen et al.に付与された米国特許第５，３２８，６７９号；ＺａｍｏｒａおよびＭａｒｅｋに付与された米国特許第６，６８５，９１２（Ｂ２）号；およびＷｉｎｃｈｅｌｌに付与された米国特許第４，３６４，９２０号）。これらの米国特許では、ＤＴＰＡは、通常その炭素骨格を介して共有結合された無水物の形態の、ペプチドおよびタンパク質にコンジュゲートされた二官能性キレート剤である。
【００１８】
これらの特許は、当該技術分野で公知の幅広いトランスキレート剤、例えばシトラート、タルトラート、ホスファート、ホスホナート、グルコヘプトナート、およびアスコルビン酸を記載している。しかし、これらのトランスキレート剤は穏やかな酸性から中性のｐＨの製剤中で幅広く使用されており、活性成分の放射標識に高効率で干渉し得る。トランスキレート剤としてアスコルビン酸を使用するための最適ｐＨはｐＨ４．５〜６．２である（Liang et al. (1987) Nucl. Med. Biol. 14, 555-562）。これは、アスコルビン酸のカルボン酸基のｐＫａがｐＨ４．１０であることに由来する（ＣＲＣ：Handbook of Chemistry and Physics, 75th Edition, David R. Lide, Ph.D. (CRC Press, London)）。グリシンのカルボン酸基のｐＫａは２．３４である。グリシンのカルボン酸基は強酸性条件下でも機能的なままである（例えば、ｐＨ２では部分的に脱プロトン化されており、ｐＨ４では完全に脱プロトン化されている）。本発明の好ましい実施形態では、アスコルビン酸は完全に脱プロトン化されている。したがって、本組成物は、グリシンを最適なトランスキレート剤として用いつつ、アスコルビン酸の潜在的干渉を減らし、この酸化防止剤の有益な特性を利用する。
【００１９】
共有結合されたＤＴＰＡが還元型９９ｍテクネチウムに結合する時、酸性条件下における主要な酸化状態はおそらく９９ｍＴｃ（ＩＩＩ）であり、これは、実効電荷がゼロの安定な錯体を生じると考えられる（Russell, C.D. (1980) J. Nucl. Med. 21, 354-360）。ｐＨ２の液体組成物は、ＤＴＰＡ−デキストランを放射標識し、希釈剤を添加するとより高いｐＨへとシフトする。しかし、２．７以下のｐＨでは、ＤＴＰＡ基が完全に脱プロトン化され、ｐＨ２の凍結乾燥製剤は完全に崩壊すると考えられる（Hnatowich, D.J. et al. (1995) J. Nucl. Med. 36, 2306-2314）。したがって、好ましい実施形態では、高い放射化学的効率を可能にするように組成物をｐＨ約３〜約４にし、一方、再構成された「インスタント」キットをリン酸緩衝生理食塩水希釈剤で希釈することでｐＨは患者に十分耐えられるであろう約５以上のｐＨにシフトされる。本願中の全ての成分はＵＳＰグレード（米国薬局方）であることが望ましい。また、「ｑ．ｓ．」は、「十分な量」という標準的な薬学的意味である。
【実施例】
【００２０】
実施例１
９９ｍＴｃ標識ＤＴＰＡ−マンノシル−デキストランおよびＤＴＰＡの溶出プロフィール
図１は、再構成した９９ｍテクネチウム標識Ｌｙｍｐｈｏｓｅｅｋリガンド薬品（９９ｍＴｃ−ＤＴＰＡ−マンノシル−デキストラン）、ロットＮＭＫ００１の、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて放射活性（ＮａＩ、１０００ｃｐｓ／ボルトに設定）検出器により測定した、典型的な溶出プロフィールを示す図である。このＳＥＣ放射化学的純度測定法の条件は以下の通りである：ＴＳＫゲルカラム（トーソー・バイオサイエンス社（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）製、Ｇ３０００ＰＷＸＬ（７．８×３０ｃｍ、６μｍ、カラム温度２５±５℃））を、均一濃度の移動相として５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．２）および３００ｍＭ塩化ナトリウムと共に用いる。凍結乾燥バイアルを、１０ミリキュリーの９９ｍＴｃ過テクネチウム酸０．８ｃｃで再構成し、混合し、周囲室温で少なくとも１０分間放射標識し、その後、０．２ｃｃのリン酸緩衝生理食塩水でサンプルを部分的に中和する。冷蔵した薬品サンプル１５μＬを注入し、０．６ｍＬ／分、実行時間４０分でクロマトグラフィーにかけた。９９ｍＴｃ−ＤＴＰＡ−マンノシル−デキストラン（９９ｍＴｃ−ＤＭＤ）ピークの保持時間は約１２〜１２．５分であり、９〜１５分にまたがり、約１５〜１５．５分の放射活性ピークに溶出する９９ｍＴｃ標識された賦形剤によるテーリングの肩が見られる。
【００２１】
この溶出プロフィールは、同じカラムおよび移動相を用い、屈折率検出器を用いる効力測定方法のものと非常に類似している（ＵＶ／ＶＩＳの吸収がないため）。９９ｍＴｃ−ＤＴＰＡ−マンノシル−デキストランの溶出ピークが広いのは、デキストランポリマーの不均一性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｇｉｔｙ）によるものであり、デキストラン上のアミノ末端化された鎖（ｌｅａｓｈ）へのマンノシルおよびＤＴＰＡ基の結合の不均一性により更に悪化されている（Vera, D. R. et al. (2001) J. Nucl. Med. 42, 951-959）。ＤＴＰＡ−マンノシル−デキストラン製剤の目標は、バルク液体薬剤物質製剤中において９５％を超える放射化学的純度および再構成された凍結乾燥薬品中において９０％を超える放射化学的純度を達成することである。
【００２２】
図２は、１０ミリキュリーの９９ｍＴｃ過テクネチウム酸で放射標識された９９ｍテクネチウム標識ＤＴＰＡ標準の典型的な溶出プロフィールを示す図であり、凍結乾燥Ｌｙｍｐｈｏｓｅｅｋリガンド薬品プラセボ（すなわち、４．５ｍＭのＬ−グリシン（ｐＨ３）、２．５ｍＭのＬ（＋）−アスコルビン酸ナトリウム、２％（ｗ／ｖ）α，α−トレハロース、および７５μｇ／ｍＬの塩化第一スズ二水和物）を用い、上記のＳＥＣ放射化学的純度測定法を用いる放射活性（ＮａＩ）検出器により測定した。９９ｍＴｃ−ＤＴＰＡピークの保持時間は約１５分であり、１４〜１６分に溶出し、これは９９ｍＴｃで標識された低分子量賦形剤のほとんど全ての保持時間とほぼ同じである（データ示さず）。
【００２３】
実施例２
最初のパイロット製剤：干渉する賦形剤の研究
図３中、一番上の放射化学的溶出プロフィールは、１０ミリキュリーの９９ｍＴｃ過テクネチウム酸で再構成してＳＥＣ放射化学的純度測定法にかけた最初の凍結乾燥製剤パイロット（５μＭ（０．１ｍｇ／ｍＬ）のＤＴＰＡ−マンノシル−デキストラン、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ５．６）、５．７ｍＭのＬ−システインナトリウム、２％（ｗ／ｖ）Ｄ−マンニト−ル、および７５μｇ／ｍＬの塩化第一スズ（二水和物））を示している（この最初の凍結乾燥薬品製剤パイロットはＳＥＣ放射化学的純度測定法を展開する直前に用意した）。この溶出プロフィールは、９９ｍＴｃ−ＤＭＤピークの放射化学的純度が約２５％未満であることを明らかに示している。
【００２４】
パイロット製剤中で干渉している可能性のある賦形剤を突き止めるために、以下のスクリーニング法（添加順）を用いた：（１）薬剤物質のプラセボ製剤では、キャップの付いた１．５ｍＬのプラスチック製試験管に５０μＬの脱ガスした生理食塩水を添加し；薬剤物質製剤では、１．２ｍｇ／ｍＬのＤＴＰＡ−マンノシル−デキストランを含む脱ガスした生理食塩水５０μＬを添加してＤＭＤの終濃度を０．３ｍｇ／ｍＬとし；（２）各種賦形剤を試験するために、４倍濃縮した脱ガス溶液を５０μＬ添加し；（３）９９ｍＴｃ過テクネチウム酸を還元するために、３００μｇ／ｍＬの塩化第一スズ（二水和物）を含む０．０１Ｎの脱ガスした塩酸５０μＬを添加し、ＳｎＣＬ２を添加した直後に、（４）還元型９９ｍＴｃ過テクネチウム酸で製剤を放射標識するために、５０ミリキュリーの９９ｍＴｃ過テクネチウム酸を５０μＬ添加して９９ｍＴｃ過テクネチウム酸の終濃度を１２．５ｍＣｉとした（注：溶液は窒素ガスを少なくとも１時間通気して脱ガスした）。その後、混合して周囲温度で少なくとも１０分間静置した後、キャップの付いたＨＰＬＣオートサンプラーバイアルに移してＳＥＣ放射化学的純度測定法を行った。
【００２５】
図３は、最初のパイロット製剤の３つの賦形剤が顕著な９９ｍＴｃ標識ピークを示すことを示している。一番上の放射化学的溶出プロフィールから下に向かって、２番目の溶出プロフィールは、ＲＴ約１４．５分に顕著な９９ｍＴｃ−シトラートのピークを示し、これにより、一番上のパターンにおけるＲＴ約１４．５分の９９ｍＴｃ標識干渉のかなりの部分が説明され得る。シトラートはｐＨ５〜６におけるＤＴＰＡの公知のトランスキレート剤である（Hnatowich, D. J., Chapter 8, pg. 175, Cancer Imaging with Radiolabeled Antibodies (Goldenberg, D. M., ed., 1990: Kluwer Academic Publishers, Boston/Dordrecht/London)）が、本製剤中で使用するには強すぎるようである。３番目の放射化学的溶出プロフィールでは、Ｄ−マンニトールは９９ｍＴｃと競合するようであり、ＲＴ約１６分に溶出している。この予想外の干渉は、この天然産物中に存在する不純物によるものであり得る。４番目および５番目の放射化学的溶出プロフィールでは、２つの異なるＬ−システイン濃度、すなわち、終濃度でそれぞれ０．２５および１ｍｇ／ｍＬのＬ−システインを使用した。４番目の溶出プロフィールはいくらかの干渉結合を示しているが、５番目の１ｍｇ／ｍＬのＬ−システインの溶出プロフィールはシステインが９９ｍＴｃに結合してシトラートのトランスキレート化に干渉することを明確に示しており、保持時間２１〜２３分に溶出している。６番目の放射化学的溶出プロフィールは、シトラート製剤に１ｍｇ／ｍＬのＬ（＋）−アスコルビン酸ナトリウム二水和物を添加したものであり、アスコルビン酸は９９ｍＴｃ−シトラートに干渉しないようである。
【００２６】
図４は、最初の薬品製剤と液体の薬剤物質製剤パイロットを比較した図である。一番上の放射化学的溶出プロフィールは、最初の薬品製剤のものであり、２番目のプロフィールは、１２．５ｍＣｉの９９ｍＴｃ−過テクネチウム酸を還元するためにＳｎＣＬ２を添加した、クエン酸ナトリウムを含む生理食塩水のものである。３番目および４番目の放射化学的溶出プロフィールでは、ＤＴＰＡ−マンノシル−デキストラン薬剤物質は部分的に放射標識されており、約１４．５分に顕著な９９ｍＴｃ−シトラートの溶出が見られる。したがって、クエン酸ナトリウムの使用は、ｐＨバッファー／トランスキレート剤として好ましい選択肢ではない。
【００２７】
実施例３
ＤＴＰＡ−マンノシル−デキストランの放射標識向上のためのｐＨバッファー、トランスキレート剤、増量賦形剤のスクリーニング
図５は、ＳＥＣ放射化学的純度測定法により測定される、リン酸ナトリウムｐＨバッファーならびに種々の組合せのトランスキレート剤、還元剤、および増量剤を含むＤＴＰＡ−マンノシル−デキストラン薬剤物質の液体プラセボ製剤パイロットの放射化学的溶出プロフィールを縦に並べて示した図である。一番上の放射化学的溶出プロフィールは、ｐＨ４の２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーおよび１．５ｍｇ／ｍＬのアスコルビン酸ナトリウムを用いた場合の小さな９９ｍＴｃ標識干渉ピークを示している。２番目〜６番目の溶出プロフィールは、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ４）、７５μｇ／ｍＬのＳｎＣＬ２・２Ｈ２Ｏ、および１２．５ｍＣｉの９９ｍＴｃ過テクネチウム酸と以下の各潜在的賦形剤を示すものである：１ｍｇ／ｍＬのクエン酸ナトリウム；１％のＰＥＧ８０００；１ｍｇ／ｍＬのクエン酸ナトリウムおよび１．５ｍｇ／ｍＬのアスコルビン酸ナトリウム；１．５ｍｇ／ｍＬのアスコルビン酸ナトリウムおよび１％のＰＥＧ８０００；ならびに１．５ｍｇ／ｍＬのアスコルビン酸ナトリウム、１ｍｇ／ｍＬのクエン酸ナトリウム、および１％のＰＥＧ８０００。これらは全て、顕著な９９ｍＴｃ標識干渉ピークを示しており、９９ｍＴｃ−ＰＥＧ８０００はＲＴ約１４分という早い時間に溶出し、９９ｍＴｃ−シトラートはより低分子量側の保持時間約１５分に溶出している。
【００２８】
図６には、リン酸ナトリウムｐＨバッファーを含む対応するＤＴＰＡ−マンノシル−デキストラン薬剤物質の液体プラセボ製剤パイロットの放射化学的溶出プロフィールが縦に並べて示されている。図６中の０．３ｍｇ／ｍＬすなわち１５ｍＭのＤＭＤを含むＤＴＰＡ−マンノシル−デキストラン製剤では、放射化学的溶出プロフィールは、薬物物質の少し顕著な放射標識を示している。上から３番目のプロフィールはバックグランドレベルの９９ｍＴｃ−ＤＭＤを示しており、ホスファートおよびＰＥＧ８０００が満足のゆくトランスキレート剤として機能しないことを示している。５分の１のｐＨバッファー強度では、シトラートは薬剤物資の放射標識効率が低くなり、これらの製剤中でまだ干渉している。更に、ＰＥＧ８０００は、明らかにそのヒドロキシル基で薬剤物質の収率に干渉しており、増量剤として好ましくない。リン酸ナトリウムは凍結乾燥に理想的なｐＨバッファーではないので、一般的に安全とみなされている（ＧＲＡＳ）別のｐＨバッファーをスクリーニングした。
【００２９】
図７Ａおよび７Ｂでは、ＤＴＰＡ−マンノシル−デキストラン薬剤物質およびプラセボの、ｐＨ４の２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーを含む液体製剤パイロットの放射化学的溶出プロフィールが分散されて縦に並べられている。図７Ａ中、一番上の放射化学的溶出プロフィールは、潜在的トランスキレート剤である酒石酸ナトリウム１．５ｍｇ／ｍＬを含む薬剤物質製剤のものであり、薬剤物質の放射標識の向上および９９ｍＴｃ−タルトラートの顕著な干渉ピークを示している（対応するプラセボ製剤については４番目の溶出プロフィール参照）。図７Ａ中の２番目および３番目の溶出プロフィールはアスコルビン酸ナトリウムおよびＰＥＧ８０００の存在下でほとんど差を示さない。図７Ｂ中、放射化学的溶出プロフィールは、アスコルビン酸ナトリウムおよびＰＥＧ８０００の組合せとタルトラートを用いた薬剤物質製剤では薬剤物質の放射標識効率が下がることを示している。最後に、ＤＴＰＡ標準は、ｐＨ４で酢酸ナトリウムおよびアスコルビン酸ナトリウムと一緒の場合、小さなテーリングエッジの肩を有する。したがって、酢酸ｐＨバッファー中での潜在的トランスキレート剤としての酒石酸ナトリウムの選択は満足なものではない。
【００３０】
図８中には、ＤＴＰＡ−マンノシル−デキストラン薬剤物質およびプラセボのｐＨ４および６の２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーを含む液体製剤パイロットの放射化学的溶出プロフィールも分散されて縦に並べられている。一番上および２番目の放射化学的溶出プロフィールは、ｐＨ６において１．５ｍｇ／ｍＬのアスコルビン酸ナトリウムの存在が薬剤物質の放射化学的純度を高めることを示しているが、３番目および４番目のプロフィールは、アスコルビン酸が、それぞれＲＴ約１３．５分および約１５分における９９ｍＴｃ−アスコルビン酸の顕著な干渉ピークおよび小さな干渉ピークに寄与し得ることを示している。５番目の溶出プロフィールは、放射化学的純度がｐＨ感受性であり、アスコルビン酸ナトリウム存在下のｐＨ４では薬剤物質が主に放射標識されることを示している。５番目のプロフィールは、薬剤物質ピークのテーリングエッジ（ｔｒａｉｌｉｎｇ ａｄｇｅ）のわずかな肩およびＲＴ約１６分の小さな９９ｍＴｃ標識ピークに観察されるように、９９ｍＴｃ−ＤＭＤピークと共溶出するいくつかの干渉材料を含み得る。
【００３１】
図９Ａおよび９Ｂでは、第一級アミンを有する還元糖および両性イオンアミノ酸、すなわちグルコサミンナトリウムおよびグリシンを用いたスクリーニング実験を行った。これは、９９ｍテクネチウムがアミンおよびアミドの窒素、カルボキシラートの酸素、ならびにチオラートおよびチオエーテルの硫黄（チオラートの硫黄に強い選択性）と安定な錯体を形成するため（Giblin, M. F. et al. (1998) PNAS USA 95, 12814-12818）、これらの賦形剤が９９ｍテクネチウムと一時的な相互作用をいくらか有するであろうという根拠のある推測に基づき行われた。図９Ａは、アスコルビン酸ナトリウム（１．５ｍｇ／ｍＬ）の非存在下および存在下でｐＨ４の２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーと１．５ｍｇ／ｍＬのグルコサミンナトリウムおよびグリシンのいずれかとを含むＤＴＰＡ−マンノシル−デキストラン薬剤物質の液体プラセボ製剤パイロットを示す。これらの賦形剤は、３番目のグルコサミンナトリウムだけの溶出プロフィールがバックグラウンドの放射活性より大きい以外は、ＲＴ約１５分に小さな９９ｍＴｃ標識ピークを有するバックグランドレベルの放射活性を示す。図９Ｂ中、ｐＨ４の２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーと１．５ｍｇ／ｍＬのグルコサミンナトリウムまたはグリシンとを含む液体薬剤物質製剤パイロットの放射化学的溶出プロフィールはほぼ同じであり、トランスキレート剤として９９ｍＴｃ−ＤＭＤピーク（ＲＴ１２．４分）を効率的に放射標識する能力を示している。グルコサミンナトリウムはＧＲＡＳ賦形剤ではないので、以降の製剤では探求しなかった。グリシンが潜在的な非干渉トランスキレート剤として同定された。
【００３２】
グリシンおよびアスコルビン酸ナトリウムは、薬剤物質の放射化学的純度の向上と両立するようであるので、これらの賦形剤の範囲を調べた。グリシンおよびアスコルビン酸ナトリウムを２つの終濃度で評価した。Ｇｌｙ１およびＧｌｙ２は、それぞれ０．５および２．０ｍｇ／ｍＬであり、ＡＡ１およびＡＡ２は、それぞれ１．５および０．３８ｍｇ／ｍＬである。グリシンの＃１および＃２の薬剤物質製剤（すなわち、１５μＭのＤＴＰＡ−マンノシル−デキストラン、２０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４）、７５ｇ／ｍＬのＳｎＣＬ２・２Ｈ２Ｏ、および１２．５ｍＣｉの９９ｍｍＴｃ過テクネチウム酸）では、ＳＥＣ放射化学的純度測定法により測定されるＧｌｙ１およびＧｌｙ２の２つの放射標識実験の平均はそれぞれ９０．７および８８．７％９９ｍＴｃ−ＤＭＤである。Ｇｌｙ１存在下において、ＡＡ１およびＡＡ２薬剤物質製剤の２つの放射標識実験の平均はそれぞれ８０．３および９０．３％９９ｍＴｃ−ＤＭＤ純度である（図１０Ａおよび１０Ｂ参照）。
【００３３】
凍結乾燥に適した増量剤のスクリーニングを、トランスキレート剤としてグリシン、酸化防止剤／還元剤としてアスコルビン酸ナトリウムを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４〜５）の製剤中で行った。ＰＥＧ２０００およびポリビニルピロリドン等の重合体賦形剤がＤＴＰＡ−マンノシル−デキストランの放射標識効率に干渉することが判明した（データ示さず）。最終的に、薬剤物質液体製剤の潜在的な非干渉性増量剤としてα，α−トレハロース（２％ｗ／ｖ）が同定された。図１１中、ｐＨ５〜４の２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーならびにグリシンおよびアスコルビン酸ナトリウムを含む薬剤物質液体製剤パイロットの放射化学的溶出プロフィールは、９９ｍＴｃ−ＤＭＤの放射化学的純度に対して２％のα，α−トレハロースは干渉があったとしてもほとんどないことを示している。更に、酢酸ナトリウム製剤（１５μＭのＤＴＰＡ−マンノシル−デキストラン、２０ｍＭの酢酸ナトリウム、１ｍｇ／ｍＬのグリシン、１ｍｇ／ｍＬのアスコルビン酸ナトリウム、２％（ｗ／ｖ）のα，α−トレハロース、３８．５ｍＭの塩化ナトリウム、７５μｇ／ｍＬのＳｎＣＬ２・２Ｈ２Ｏ、および１２．５ｍＣｉの９９ｍＴｃ過テクネチウム酸）は顕著なｐＨ感受性があり、ｐＨ５．０、４．５、および４．０でそれぞれ８６．８、８８．４、および９３．８％の９９ｍＴｃ−ＤＭＤ純度を示している。これにより、凍結乾燥薬品キット製剤中での潜在的使用に適した賦形剤を同定するためのスクリーニングプロセスが完了した。次のステップは、製剤を最適化し、凍結乾燥キット形態の実現可能性を実証し、再構成手順を構築することである。
【００３４】
実施例４
凍結乾燥ＤＴＰＡ−マンノシル−デキストラン薬品の放射標識向上のための製剤の最適化
低ｐＨで９９ｍＴｃ−ＤＭＤの放射化学的純度が向上する酢酸バッファー製剤の明白なｐＨ感受性を研究する必要があった。最初のｐＨ実験ではｐＨ２および３の１０ｍＭリン酸ナトリウムならびに対照としてｐＨ４の２０ｍＭ酢酸ナトリウムを用いた。図１２は、１２．５ｍＣｉの９９ｍＴｃ過テクネチウム酸を添加したＤＭＤ薬剤物質製剤（２５μＭのＤＴＰＡ−マンノシル−デキストラン（０．５ｍｇ／ｍＬ）、ｐＨバッファー、０．５ｍｇ／ｍＬのグリシン、０．５ｍｇ／ｍＬのアスコルビン酸ナトリウム、２％（ｗ／ｖ）のα，α−トレハロース、３８．５ｍＭの塩化ナトリウム、および７５μｇ／ｍＬのＳｎＣＬ２・２Ｈ２Ｏを含む）の放射化学的溶出プロフィールを縦に並べて示した図である。一番上の溶出プロフィールはｐＨ４の酢酸製剤を示しており、これはＳＥＣ放射化学的純度測定法による測定で９９ｍＴｃ−ＤＭＤ純度が９６．９％である。この製剤は、本発明者らの薬剤物質液体製剤の目標を満たす（すなわち、９５％を超える９９ｍＴｃ−ＤＭＤ純度）。残念ながら、ｐＨ３および２の１０ｍＭリン酸ナトリウム製剤はＲＴ約１４．０分に顕著な９９ｍＴｃ標識干渉ピークを有する（図１２参照）。その後、グリシン／塩酸が潜在的な非干渉トランスキレート剤としてだけでなく好適な酸性ｐＨバッファーとしても機能することを突き止めた。図１３は、以下の賦形剤を含むｐＨ３、２、および４のＤＭＤ薬剤物質製剤の放射化学的溶出プロフィールを縦に並べて示した図である：２５μＭのＤＴＰＡ−マンノシル−デキストラン（０．５ｍｇ／ｍＬ）、０．５ｍｇ／ｍＬのグリシン、０．５ｍｇ／ｍＬのアスコルビン酸ナトリウム、２％（ｗ／ｖ）のα，α−トレハロース、および７５μｇ／ｍＬのＳｎＣＬ２・２Ｈ２Ｏ（およびｐＨ４では１０ｍＭ酢酸ナトリウム）。幸運にも、酸性ｐＨバッファーおよびトランスキレート剤として塩酸グリシンを用いたことで、ｐＨ３およびｐＨ２の薬剤物質製剤がそれぞれ９７．６％および９７．１％の９９ｍＴｃ−ＤＭＤ純度を示し、これは薬剤物質製剤の所望の目標を満たす（図１３参照）。図１３中ではｐＨ４の酢酸製剤が薬剤物質製剤の目標を満たさなかったが（９５％超に対して９３．６％の９９ｍＴＣ−ＤＭＤ純度）、これは、製剤の調製における日毎の変動、溶液の不完全な脱ガス、塩化第一スズ二水和物の不十分な混合等によるものであり得る。ｐＨ４の製剤中で酢酸バッファーに加えて塩酸グリシンバッファーを用いてもよい。
【００３５】
クラスＩの３ｍＬ容ガラス製バイアルに、滅菌ろ過した本ｐＨ実験物１．０５ｍＬを分注した。これらのバイアルの首に栓を置き、バイアルをＶｉｒＴｉｓ凍結乾燥器の棚上に置いて凍結乾燥させた。凍結乾燥サイクル完了後、バイアルに窒素ガスをバックフィルし、栓をした。その後、栓をしたバイアルにアルミニウムシールを圧着（ｃｒｉｍｐ）した。目視検査で、酢酸（ｐＨ４）およびグリシン（ｐＨ３）の薬品製剤バイアルの凍結乾燥ケーキは、不定形（ａｍｏｒｐｈｏｕｓ）構造を維持しており、低残留水分にまで乾燥されているようであった。一方、グリシン（ｐＨ２）の薬品製剤バイアルは完全に崩壊していた（すなわち構造がなかった）。本発明の好ましい実施形態はｐＨ３の薬品製剤（すなわち、１２．５〜２５μＭのＤＴＰＡ−マンノシル−デキストラン（０．２５〜０．５ｍｇ／ｍＬ）、０．５ｍｇ／ｍＬのグリシン（ｐＨ３）、０．５ｍｇ／ｍＬのアスコルビン酸ナトリウム、２％（ｗ／ｖ）のα，α−トレハロース、および７５μｇ／ｍＬのＳｎＣＬ２・２Ｈ２Ｏ）である。
【００３６】
実施例５
凍結乾燥ＤＴＰＡ−マンノシル−デキストラン薬品の放射標識における使いやすさ向上のための、リン酸緩衝生理食塩水希釈剤の使用を含む、再構成手順の構築
Ｌｙｍｐｈｏｓｅｅｋリガンド薬品製剤は最終ｐＨが約３であり、非経口薬に推奨されるｐＨ（Stranz, M. and Kastango, E. S. (2002) Int. J. Pharm. Compound. 6(3), 216-220）よりも低いため、９９ｍＴｃ過テクネチウム酸を用いた再構成後に、より痛みが少なく害の少ないｐＨ（例えばｐＨ５〜９）へとｐＨを中和する希釈剤を使用することに決定した。０．９％塩化ナトリウムまたは等張生理食塩水を用いてモリブデン−９９ジェネレータから９９ｍＴｃ過テクネチウム酸ナトリウムを溶出させる。輸液看護学会（Ｉｎｆｕｓｉｏｎ Ｎｕｒｓｉｎｇ Ｓｏｃｉｅｔｙ）の推奨を満たして１ｍＬの９９ｍＴｃ過テクネチウム酸ナトリウムで再構成した後に５００ｍＯｓｍ＼Ｌ未満になるようにＬｙｍｐｈｏｓｅｅｋリガンド薬品を処方する。ヒトの非経口薬との使用に適した希釈剤としてグリア・ラボラトリーズ社（Ｇｒｅｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の注射用緩衝生理食塩水を同定した。この希釈剤の配合は、０．１０７％のリン酸ナトリウム（七水和物）、０．０３６％のリン酸カリウム（望ましくはＵＳＰ−ＮＦ、米国薬局方−国民医薬品集）、０．５％の塩化ナトリウム、および０．４％のフェノールである。凍結乾燥させたＬｙｍｐｈｏｓｅｅｋリガンド薬品のバイアルを１０〜５０ｍＣｉの９９ｍＴｃ過テクネチウム酸ナトリウム０．７ｃｃを用いて周囲室温で少なくとも１０分間再構成し、断続的に混合し、その後、０．３ｃｃの注射用緩衝生理食塩水で希釈することが推奨される。Ｌｙｍｐｈｏｓｅｅｋ（登録商標）リガンド薬品は、再構成後少なくとも１２時間安定性を有するが、再構成された薬品は６時間以内の投与が推奨される（データ示さず）。したがって、中和された９９ｍＴｃ標識Ｌｙｍｐｈｏｓｅｅｋリガンド薬品は内皮注射で患者に十分に耐えられると考えられる。
【００３７】
種々の実施形態を参照してプロセス、組成物、およびキットを説明したが、本開示の範囲および本質から逸脱することなく、種々の変更および要素の同等物による代替が可能であると当業者には理解されよう。更に、本開示の本質的範囲から逸脱することなく、特定の状況または材料を本開示の教示に適応させるために多くの改変が可能である。したがって、本開示は、開示されている特定の実施形態に限定されず、添付の特許請求の範囲に含まれる全ての実施形態を含むことが意図される。本願中では、特に断りのない限り、米国の測定系を使用している。また、本明細書中で参照した全ての引用文献を明示的に参照により本明細書に援用する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍学分野、より具体的には癌検出剤の放射標識に関する。
【背景技術】
【０００２】
メラノーマおよび乳癌を診断するための一般的な方法としてセンチネルリンパ節生検が急速に普及してきている（Vera, D. R. et al. (2001) J. Nucl. Med. 42, 951-959）。この技術はまだ標準化されておらず、通常、９９ｍＴｃコロイドおよび青色色素を使用する。コロイドイメージング剤中および本発明中で用いられる放射性同位体９９ｍテクネチウムは複数の望ましい特性を有する。すなわち、入手が用意であり、比較的低コストであり、イメージングの質が優れており、半減期が６時間と短い。この放射性トレーサーは手術前にセンチネルリンパ節の位置を確認するために使用され、その後、手術中にセンチネルリンパ節の切開部を正確に特定するために使用される。青色色素は、リンパ管およびリンパ節から迅速に排除され、センチネルリンパ節として選択される放射活性リンパ節を視覚的に確認するために使用される。この生検手技は個々の医師で異なるため、一貫性のある一連の技能を有する医師を養成することが難しく、そのため、これらの生検は幅広い偽陰性率が報告されている（すなわち０〜１２％、上記のVera, D. R.参照）。
【０００３】
このセンチネルリンパ節生検技術を標準化するためにはもう１つのハードルがあり、それはセンチネルリンパ節の検出またはセンチネルリンパ節に取り込ませるために特別に設計された青色色素または９９ｍＴｃ標識薬剤が存在しないことである。現在、ＦＤＡ（米国食品医薬品局）は、センチネルリンパ節診断用の如何なる色素または９９ｍＴｃ標識薬剤も承認していない。そのため、以下の放射性医薬品が適応外（ｏｆｆ−ｌａｂｅｌ）で使用されている：９９ｍＴｃ硫黄コロイド、ろ過した９９ｍＴｃ硫黄コロイド、９９ｍＴｃ三硫化アンチモン、および９９ｍＴｃ標識アルブミンマイクロコロイドの複数の標品（注：コロイドは粘着性の非標的化粒子である）。これらの薬剤はいずれも、注射部位における迅速なクリアランスまたはセンチネルリンパ節への取込みが多いという理想的な特性を示さない（Hoh, C. K., et al. (2003) Nucl. Med. Biol. 30, 457-464）。
【０００４】
したがって、最適なセンチネルリンパ節検出の目標を満たすように設計された（すなわち、注射部位におけるクリアランスが迅速であり遠位リンパ節への蓄積が少ない）核イメージング診断キットの開発は、乳癌およびメラノーマの処置において満たされていない医学的ニーズである。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、放射標識後の放射化学的純度が高く、１個の凍結乾燥バイアルおよび液体希釈剤バイアルを含む「インスタント」キットとして使い易い、ＤＴＰＡ等の二官能性キレート剤とコンジュゲートされたデキストランを含む組成物を提供する。本発明はまた、診断用イメージング剤としての取扱いおよび投与を容易にして医薬用途または臨床用途を促進するのに十分な再構成後の安定性および長期保存安定性を提供する。
【０００６】
９９ｍＴｃ過テクネチウム酸ナトリウムを添加すると、本発明は、デキストラン分子上の複数のアミノ末端化された鎖（ｌｅａｓｈ）に５個のカルボン酸アーム（ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｒｍ）の１個によるアミド結合を介してコンジュゲートされている二官能性リガンドＤＴＰＡが高い放射化学的純度を示す（すなわち、９０％を超える９９ｍＴｃ−ＤＴＰＡ−デキストラン純度）。フリーのＤＴＰＡは脱プロトン化されたカルボン酸基５個全てを配位させ、八座リガンドとして例えば１１１インジウム等の重金属イオンに結合していることが明らかであるが（更に３個の窒素原子を含む−H. R. Maecke, et al. (1989) J. Nucl. Med. 30, 1235-1239参照）、七座リガンドＤＴＰＡは、結合の熱力学的安定性が低く、９９ｍＴｃイオンへの結合が競合され易く、放射化学的純度が低くなり得る。
【０００７】
ｐＨを約２〜４に下げ、非競合的な構成要素をスクリーニングして理想的なトランスキレート剤としてグリシン（ｐＨバッファーとしても働く）を同定し、以下の事実を利用することで、高い放射化学的純度の９９ｍＴｃ−ＤＴＰＡ−デキストランが得られた：（１）９９ｍＴｃへの競合リガンドの分布が会合速度定数により決まることおよび（２）ＤＴＰＡ−デキストラン錯体からの９９ｍＴｃの解離速度定数が非常に遅く、ｐＨ依存性であること。したがって、より強く放射性同位体に結合するＤＴＰＡ−デキストランに放射性同位体を移すグリシンへの強酸性条件下での一時的結合およびこの「インスタント」キットのｐＨをキットの希釈剤を用いて穏やかな酸性条件にシフトさせた後にテクネチウム−９９ｍが保持される（解離速度定数が遅いため）ことで、ＤＴＰＡ−デキストランの高効率の放射標識が向上する。
【０００８】
本発明は更に、注射時に痛みを生じさせる強い酸性条件（すなわち約３〜４のｐＨ）から十分に耐えられる穏やかな酸性条件（すなわちｐＨ＞約５）にｐＨをシフトさせることで患者の快適さを可能にするリン酸緩衝生理食塩水希釈剤を提供する（M. Stranz and E. S. Kastango (2002) Int. J. Pharm. Compound. 6(3), 216-220）。
【０００９】
本開示は更に、過剰な第一スズイオンまたは第二スズイオンを含む放射標識ＤＴＰＡ−デキストラン標品を更に安定化する例えばＬ−アスコルビン酸等の還元剤を提供し、これにより、ＳｎコロイドまたはＳｎ４＋等のその他の放射化学的不純物の形成が防止される。本発明はまた、製剤中にＬ−アスコルビン酸を含めることで、薬剤物質およびその構成要素の酸化分解ならびに放射標識された薬品の自己放射線分解を防ぐ。
【００１０】
更に、本発明は、不定形（ａｍｏｒｐｈｏｕｓ）の二糖凍結乾燥ケーキの形態のＤＴＰＡ−デキストランにとって安定且つ審美的に満足な環境を提供し、９９ｍＴｃ過テクネチウム酸ナトリウムによる迅速な再構成および緩衝生理食塩水希釈剤の添加による使用し易い透明な非微粒子液体の生成を可能にする。本発明はまた、凍結乾燥バイアルに医薬品グレードの窒素ガスをバックフィル（ｂａｃｋｆｉｌｌ）することで不活性ガスのヘッドスペースを提供し、本発明の保存寿命期間中にわたり、第一スズイオンを更に安定化して９９ｍＴｃ過テクネチウム酸ナトリウム（または９９ｍＴｃＯ４−）を還元する能力を余分に提供する。
【００１１】
したがって、本発明の方法は、１個の凍結乾燥バイアルをｐＨ緩衝希釈剤で更に再構成して最終的な溶液ｐＨをシフトさせて少なくとも６時間安定であり且つ患者の快適さを向上させる溶液を得る、高い放射化学的純度のＤＴＰＡ−デキストランの９９ｍＴｃ（ＩＩＩ）（およびおそらく９９ｍＴｃ（ＩＶ））錯体を調製する改良された方法であり（Russell, CD. (1980) J. Nucl. Med. 21, 354-360；Russell, CD. and Speiser, A.G. (1982) Int. J. Appl. Radiat. Isot. 33, 903-906）。このＤＴＰＡ−デキストランの凍結乾燥コールドキット製剤は、窒素環境下で固体白色凍結乾燥ケーキ形態の９９ｍＴｃ過テクネチウム酸ナトリウムの還元に必要な塩化第一スズを安定化し、長期間の保存安定性を有する、「インスタント」キットである。このキットは、強酸性条件下における９９ｍＴｃ過テクネチウム酸のＳｎ２＋還元により高い放射化学的純度を得、リン酸緩衝生理食塩水で希釈して再構成後の溶液ｐＨを中性側にシフトさせた後の９９ｍテクネチウム−ＤＴＰＡ−デキストラン錯体の放射化学的収率９０％超を維持する。
【００１２】
本発明のプロセス、組成物、およびキットの性質および利点を更に深く理解するために、添付の図面と関連付けて以下の詳細な説明を参照すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】再構成された９９ｍテクネチウム標識Ｌｙｍｐｈｏｓｅｅｋ（登録商標；オハイオ州ダブリンのネオプローブ・コーポレーションの登録商標；米国特許第６，４０９，９９０号）リガンド薬品（９９ｍＴｃ−ＤＴＰＡ−マンノシル−デキストラン）の典型的なサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）溶出プロフィールを示す図である。
【図２】凍結乾燥Ｌｙｍｐｈｏｓｅｅｋリガンド薬品のプラセボを用いた、１０ミリキュリーの９９ｍＴｃ過テクネチウム酸で放射標識された９９ｍテクネチウム標識ＤＴＰＡ標準の典型的な溶出プロフィールを示す図である。
【図３】最初のパイロット製剤の３つの賦形剤（シトラート、マンニトール、およびＬ−システイン）が顕著な９９ｍＴｃ標識ピークを示すことを示す図である。
【図４】最初の薬品製剤と液体の薬剤物質製剤パイロットの比較を示す図である。
【図５】リン酸ナトリウムｐＨバッファーならびに種々の組合せのトランスキレート剤（シトラート）、還元剤（アスコルビン酸）、および増量剤（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）８０００）を含む液体ＤＴＰＡ−マンノシル−デキストラン薬剤物質プラセボ製剤パイロットの、ＳＥＣ放射化学的純度測定法によって測定されるＳＥＣ放射化学的溶出プロフィールを縦に並べて示した図である。
【図６】リン酸ナトリウムｐＨバッファーを含む対応する液体ＤＴＰＡ−マンノシル−デキストラン薬剤物質プラセボ製剤パイロットのＳＥＣ放射化学的溶出プロフィールを縦に並べて示した図である。
【図７Ａ】ｐＨ４の２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ＡＣＥ）、タルトラート、およびＰＥＧ８０００を含むＤＴＰＡ−マンノシル−デキストラン薬剤物質およびプラセボの液体製剤パイロットのＳＥＣ放射化学的溶出プロフィールを縦に並べて示した図である。
【図７Ｂ】ｐＨ４の２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ＡＣＥ）、タルトラート、およびＰＥＧ８０００を含むＤＴＰＡ−マンノシル−デキストラン薬剤物質およびプラセボの液体製剤パイロットのＳＥＣ放射化学的溶出プロフィールを縦に並べて示した図である。
【図８】ｐＨ４および６の２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーを含むＤＴＰＡ−マンノシル−デキストラン薬剤物質およびプラセボの液体製剤パイロットのＳＥＣ放射化学的溶出プロフィールを縦に並べて示した図である。
【図９Ａ】第一級アミンを有する還元糖および両性イオンアミノ酸、すなわちグルコサミンナトリウム（ＧｌｃＮＨ）およびグリシン（Ｇｌｙ）を用いたスクリーニング実験を示す図である。
【図９Ｂ】第一級アミンを有する還元糖および両性イオンアミノ酸、すなわちグルコサミンナトリウム（ＧｌｃＮＨ）およびグリシン（Ｇｌｙ）を用いたスクリーニング実験を示す図である。
【図１０Ａ】２つの終濃度での賦形剤グリシンおよびアスコルビン酸ナトリウムの範囲に関する実験を示す図である。Ｇｌｙ１およびＧｌｙ２はそれぞれ０．５および２．０ｍｇグリシン／ｍＬであり、ＡＡ１およびＡＡ２はそれぞれ１．５および０．３８ｍｇ／ｍＬアスコルビン酸ナトリウムである。
【図１０Ｂ】２つの終濃度での賦形剤グリシンおよびアスコルビン酸ナトリウムの範囲に関する実験を示す図である。Ｇｌｙ１およびＧｌｙ２はそれぞれ０．５および２．０ｍｇグリシン／ｍＬであり、ＡＡ１およびＡＡ２はそれぞれ１．５および０．３８ｍｇ／ｍＬアスコルビン酸ナトリウムである。
【図１１】ｐＨ５〜４の２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーならびにグリシン、アスコルビン酸ナトリウム、およびα，α−トレハロースを含む液体薬剤物質製剤パイロットのＳＥＣ放射化学的溶出プロフィールを縦に並べて示した図である。
【図１２】１２．５ｍＣｉの９９ｍＴｃ過テクネチウム酸を添加したＤＭＤ薬剤物質製剤（２５μＭのＤＴＰＡ−マンノシル−デキストラン（０．５ｍｇ／ｍＬ）、ｐＨバッファー、０．５ｍｇ／ｍＬのグリシン、０．５ｍｇ／ｍＬのアスコルビン酸ナトリウム、２％（ｗ／ｖ）α，α−トレハロース、３８．５ｍｍの塩化ナトリウム、および７５μｇ／ｍＬのＳｎＣＬ２・２Ｈ２Ｏを含む）のＳＥＣ放射化学的溶出プロフィールを縦に並べて示した図である。ｐＨバッファーは、（上のパネルから順に）ｐＨ４の酢酸バッファー、ｐＨ３のリン酸バッファー、およびｐＨ２のリン酸バッファーである。
【図１３】以下の賦形剤を含むｐＨ３、２、および４のＤＭＤ薬剤物質製剤のＳＥＣ放射化学的溶出プロフィールを縦に並べて示した図である：２５μＭのＤＴＰＡ−マンノシル−デキストラン（０．５ｍｇ／ｍＬ）、０．５ｍｇ／ｍＬのグリシン、０．５ｍｇ／ｍＬのアスコルビン酸ナトリウム、２％（ｗ／ｖ）のα，α−トレハロース、および７５μｇ／ｍＬのＳｎＣＬ２・２Ｈ２Ｏ（およびｐＨ４では１０ｍＭ酢酸ナトリウム）。 図面は後述する実施例中で更に詳細に説明される。
【発明の具体的説明】
【００１４】
センチネルリンパ節診断用の商業的「インスタント」キットの開発の鍵は、センチネルリンパ節の最適な検出に必要な特性を有するイメージング剤の合理的設計である。そのような特性とは、小さい分子直径および高い受容体親和性であり、これにより、注射部位でのクリアランス速度が速く且つ遠位リンパ節への蓄積が少ない放射性医薬品が得られる（前述のVera, D. R.）。本発明では、使用される薬剤物質は、放射標識を送達するためにデキストランプラットフォームを使用する。このデキストラン骨格は、医薬品グレードであり、非常に親水性が高く、電荷がなく、柔軟な、平均分子量約９５００のポリマーである。これらの物理的性質は全て、膜壁を横切る移動を減らし、注射部位における迅速なクリアランスを促進する。デキストランポリマーは、ＤＴＰＡ基に結合しているアミン末端化テザーにコンジュゲートされ、分子に高い受容体親和性を付与し、９９ｍテクネチウムと錯体を形成する。９９ｍＴｃ−ＤＴＰＡ−マンノシル−デキストランは信号密度が高く、バックグラウンドに対する信号の比率が大きいため、センチネルリンパ節をよりよく検出することが可能になる。
【００１５】
別のアミン末端化テザーにコンジュゲートされるマンノシル基を添加することで、ＤＴＰＡ−マンノシル−デキストランに結合特異性が付与され、代替物な非標的化イメージング剤と差別化される。ＤＴＰＡ−マンノシル−デキストランはインビトロでマンノース末端化糖タンパク質受容体に強く結合する（前述のVera, D. R.）。ウサギの体内分布研究により、９９ｍＴｃ−ＤＴＰＡ−マンノシル−デキストランはリンパ管中に拡散し、センチネルリンパ節に流入し、センチネルリンパ節中に存在するマクロファージおよび樹状細胞中のマンノース結合糖タンパク質受容体に結合することが示されている（前述のHoh, C. K.；Fiete, D. and Baenziger, J. U. (1997) J. Biol. Chem. 272(23), 14629-14637；Ramakrishna, V. et al. (2004) J. Immunol. 172, 2845-2852）。したがって、９９ｍＴｃ−ＤＰＴＡ−マンノシル−デキストランは、センチネルリンパ節検出のための優れた標的化９９ｍＴｃ標識診断薬である（前述のHoh, C. K.）。９９ｍＴｃ−ＤＴＰＡ−マンノシル−デキストランの臨床前および第Ｉ相試験では、複数回の液体移動および複数のバイアルを用いた放射標識手順を用いたが、この投薬形態は商業的使用には望ましくないものであった。
【００１６】
この重要な核イメージング剤を商業化するために、組成物（製剤）およびこのＬｙｍｐｈｏｓｅｅｋ（登録商標）リガンド薬品組成物の製造方法を開発した。これも本発明の対象である。９９ｍテクネチウム標識核イメージング「インスタント」キットの開発は、高い放射化学的効率と非特異的９９ｍＴｃ標識材料（すなわち、９９ｍＴｃコロイドまたは９９ｍＴｃ標識製剤賦形剤）の形成との微妙なバランスである。また、還元型９９ｍテクネチウムが９９ｍＴｃＯ４−に再度酸化されるのを防ぐ必要がある。そこで、不活性窒素環境下で第一スズイオンを安定化するために凍結乾燥製剤を開発した。
【００１７】
本発明では、組成物は、新たに同定したトランスキレート剤のグリシンを強酸性条件下で使用することでこの微妙なバランスを達成している。トランスキレート剤とは、還元型９９ｍテクネチウムに一時的に結合し、より強いキレート剤またはリガンドへのこの放射性同位体の移動を容易化する、弱いキレート剤である。還元型９９ｍテクネチウムのリガンドは、５個のカルボン酸基の１個でデキストランのアミン末端化テザーに結合した七座二官能性リガンドである、誘導体化されたジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）である。このリガンドは当業者に周知である。これは、ペプチドおよびタンパク質を放射標識するための「インスタント」キットに含められてきた（Hansen et al.に付与された米国特許第５，３２８，６７９号；ＺａｍｏｒａおよびＭａｒｅｋに付与された米国特許第６，６８５，９１２（Ｂ２）号；およびＷｉｎｃｈｅｌｌに付与された米国特許第４，３６４，９２０号）。これらの米国特許では、ＤＴＰＡは、通常その炭素骨格を介して共有結合された無水物の形態の、ペプチドおよびタンパク質にコンジュゲートされた二官能性キレート剤である。
【００１８】
これらの特許は、当該技術分野で公知の幅広いトランスキレート剤、例えばシトラート、タルトラート、ホスファート、ホスホナート、グルコヘプトナート、およびアスコルビン酸を記載している。しかし、これらのトランスキレート剤は穏やかな酸性から中性のｐＨの製剤中で幅広く使用されており、活性成分の放射標識に高効率で干渉し得る。トランスキレート剤としてアスコルビン酸を使用するための最適ｐＨはｐＨ４．５〜６．２である（Liang et al. (1987) Nucl. Med. Biol. 14, 555-562）。これは、アスコルビン酸のカルボン酸基のｐＫａがｐＨ４．１０であることに由来する（ＣＲＣ：Handbook of Chemistry and Physics, 75th Edition, David R. Lide, Ph.D. (CRC Press, London)）。グリシンのカルボン酸基のｐＫａは２．３４である。グリシンのカルボン酸基は強酸性条件下でも機能的なままである（例えば、ｐＨ２では部分的に脱プロトン化されており、ｐＨ４では完全に脱プロトン化されている）。本発明の好ましい実施形態では、アスコルビン酸は完全に脱プロトン化されている。したがって、本組成物は、グリシンを最適なトランスキレート剤として用いつつ、アスコルビン酸の潜在的干渉を減らし、この酸化防止剤の有益な特性を利用する。
【００１９】
共有結合されたＤＴＰＡが還元型９９ｍテクネチウムに結合する時、酸性条件下における主要な酸化状態はおそらく９９ｍＴｃ（ＩＩＩ）であり、これは、実効電荷がゼロの安定な錯体を生じると考えられる（Russell, C.D. (1980) J. Nucl. Med. 21, 354-360）。ｐＨ２の液体組成物は、ＤＴＰＡ−デキストランを放射標識し、希釈剤を添加するとより高いｐＨへとシフトする。しかし、２．７以下のｐＨでは、ＤＴＰＡ基が完全に脱プロトン化され、ｐＨ２の凍結乾燥製剤は完全に崩壊すると考えられる（Hnatowich, D.J. et al. (1995) J. Nucl. Med. 36, 2306-2314）。したがって、好ましい実施形態では、高い放射化学的効率を可能にするように組成物をｐＨ約３〜約４にし、一方、再構成された「インスタント」キットをリン酸緩衝生理食塩水希釈剤で希釈することでｐＨは患者に十分耐えられるであろう約５以上のｐＨにシフトされる。本願中の全ての成分はＵＳＰグレード（米国薬局方）であることが望ましい。また、「ｑ．ｓ．」は、「十分な量」という標準的な薬学的意味である。
【実施例】
【００２０】
実施例１
９９ｍＴｃ標識ＤＴＰＡ−マンノシル−デキストランおよびＤＴＰＡの溶出プロフィール
図１は、再構成した９９ｍテクネチウム標識Ｌｙｍｐｈｏｓｅｅｋリガンド薬品（９９ｍＴｃ−ＤＴＰＡ−マンノシル−デキストラン）、ロットＮＭＫ００１の、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて放射活性（ＮａＩ、１０００ｃｐｓ／ボルトに設定）検出器により測定した、典型的な溶出プロフィールを示す図である。このＳＥＣ放射化学的純度測定法の条件は以下の通りである：ＴＳＫゲルカラム（トーソー・バイオサイエンス社（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）製、Ｇ３０００ＰＷＸＬ（７．８×３０ｃｍ、６μｍ、カラム温度２５±５℃））を、均一濃度の移動相として５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．２）および３００ｍＭ塩化ナトリウムと共に用いる。凍結乾燥バイアルを、１０ミリキュリーの９９ｍＴｃ過テクネチウム酸０．８ｃｃで再構成し、混合し、周囲室温で少なくとも１０分間放射標識し、その後、０．２ｃｃのリン酸緩衝生理食塩水でサンプルを部分的に中和する。冷蔵した薬品サンプル１５μＬを注入し、０．６ｍＬ／分、実行時間４０分でクロマトグラフィーにかけた。９９ｍＴｃ−ＤＴＰＡ−マンノシル−デキストラン（９９ｍＴｃ−ＤＭＤ）ピークの保持時間は約１２〜１２．５分であり、９〜１５分にまたがり、約１５〜１５．５分の放射活性ピークに溶出する９９ｍＴｃ標識された賦形剤によるテーリングの肩が見られる。
【００２１】
この溶出プロフィールは、同じカラムおよび移動相を用い、屈折率検出器を用いる効力測定方法のものと非常に類似している（ＵＶ／ＶＩＳの吸収がないため）。９９ｍＴｃ−ＤＴＰＡ−マンノシル−デキストランの溶出ピークが広いのは、デキストランポリマーの不均一性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｇｉｔｙ）によるものであり、デキストラン上のアミノ末端化された鎖（ｌｅａｓｈ）へのマンノシルおよびＤＴＰＡ基の結合の不均一性により更に悪化されている（Vera, D. R. et al. (2001) J. Nucl. Med. 42, 951-959）。ＤＴＰＡ−マンノシル−デキストラン製剤の目標は、バルク液体薬剤物質製剤中において９５％を超える放射化学的純度および再構成された凍結乾燥薬品中において９０％を超える放射化学的純度を達成することである。
【００２２】
図２は、１０ミリキュリーの９９ｍＴｃ過テクネチウム酸で放射標識された９９ｍテクネチウム標識ＤＴＰＡ標準の典型的な溶出プロフィールを示す図であり、凍結乾燥Ｌｙｍｐｈｏｓｅｅｋリガンド薬品プラセボ（すなわち、４．５ｍＭのＬ−グリシン（ｐＨ３）、２．５ｍＭのＬ（＋）−アスコルビン酸ナトリウム、２％（ｗ／ｖ）α，α−トレハロース、および７５μｇ／ｍＬの塩化第一スズ二水和物）を用い、上記のＳＥＣ放射化学的純度測定法を用いる放射活性（ＮａＩ）検出器により測定した。９９ｍＴｃ−ＤＴＰＡピークの保持時間は約１５分であり、１４〜１６分に溶出し、これは９９ｍＴｃで標識された低分子量賦形剤のほとんど全ての保持時間とほぼ同じである（データ示さず）。
【００２３】
実施例２
最初のパイロット製剤：干渉する賦形剤の研究
図３中、一番上の放射化学的溶出プロフィールは、１０ミリキュリーの９９ｍＴｃ過テクネチウム酸で再構成してＳＥＣ放射化学的純度測定法にかけた最初の凍結乾燥製剤パイロット（５μＭ（０．１ｍｇ／ｍＬ）のＤＴＰＡ−マンノシル−デキストラン、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ５．６）、５．７ｍＭのＬ−システインナトリウム、２％（ｗ／ｖ）Ｄ−マンニト−ル、および７５μｇ／ｍＬの塩化第一スズ（二水和物））を示している（この最初の凍結乾燥薬品製剤パイロットはＳＥＣ放射化学的純度測定法を展開する直前に用意した）。この溶出プロフィールは、９９ｍＴｃ−ＤＭＤピークの放射化学的純度が約２５％未満であることを明らかに示している。
【００２４】
パイロット製剤中で干渉している可能性のある賦形剤を突き止めるために、以下のスクリーニング法（添加順）を用いた：（１）薬剤物質のプラセボ製剤では、キャップの付いた１．５ｍＬのプラスチック製試験管に５０μＬの脱ガスした生理食塩水を添加し；薬剤物質製剤では、１．２ｍｇ／ｍＬのＤＴＰＡ−マンノシル−デキストランを含む脱ガスした生理食塩水５０μＬを添加してＤＭＤの終濃度を０．３ｍｇ／ｍＬとし；（２）各種賦形剤を試験するために、４倍濃縮した脱ガス溶液を５０μＬ添加し；（３）９９ｍＴｃ過テクネチウム酸を還元するために、３００μｇ／ｍＬの塩化第一スズ（二水和物）を含む０．０１Ｎの脱ガスした塩酸５０μＬを添加し、ＳｎＣＬ２を添加した直後に、（４）還元型９９ｍＴｃ過テクネチウム酸で製剤を放射標識するために、５０ミリキュリーの９９ｍＴｃ過テクネチウム酸を５０μＬ添加して９９ｍＴｃ過テクネチウム酸の終濃度を１２．５ｍＣｉとした（注：溶液は窒素ガスを少なくとも１時間通気して脱ガスした）。その後、混合して周囲温度で少なくとも１０分間静置した後、キャップの付いたＨＰＬＣオートサンプラーバイアルに移してＳＥＣ放射化学的純度測定法を行った。
【００２５】
図３は、最初のパイロット製剤の３つの賦形剤が顕著な９９ｍＴｃ標識ピークを示すことを示している。一番上の放射化学的溶出プロフィールから下に向かって、２番目の溶出プロフィールは、ＲＴ約１４．５分に顕著な９９ｍＴｃ−シトラートのピークを示し、これにより、一番上のパターンにおけるＲＴ約１４．５分の９９ｍＴｃ標識干渉のかなりの部分が説明され得る。シトラートはｐＨ５〜６におけるＤＴＰＡの公知のトランスキレート剤である（Hnatowich, D. J., Chapter 8, pg. 175, Cancer Imaging with Radiolabeled Antibodies (Goldenberg, D. M., ed., 1990: Kluwer Academic Publishers, Boston/Dordrecht/London)）が、本製剤中で使用するには強すぎるようである。３番目の放射化学的溶出プロフィールでは、Ｄ−マンニトールは９９ｍＴｃと競合するようであり、ＲＴ約１６分に溶出している。この予想外の干渉は、この天然産物中に存在する不純物によるものであり得る。４番目および５番目の放射化学的溶出プロフィールでは、２つの異なるＬ−システイン濃度、すなわち、終濃度でそれぞれ０．２５および１ｍｇ／ｍＬのＬ−システインを使用した。４番目の溶出プロフィールはいくらかの干渉結合を示しているが、５番目の１ｍｇ／ｍＬのＬ−システインの溶出プロフィールはシステインが９９ｍＴｃに結合してシトラートのトランスキレート化に干渉することを明確に示しており、保持時間２１〜２３分に溶出している。６番目の放射化学的溶出プロフィールは、シトラート製剤に１ｍｇ／ｍＬのＬ（＋）−アスコルビン酸ナトリウム二水和物を添加したものであり、アスコルビン酸は９９ｍＴｃ−シトラートに干渉しないようである。
【００２６】
図４は、最初の薬品製剤と液体の薬剤物質製剤パイロットを比較した図である。一番上の放射化学的溶出プロフィールは、最初の薬品製剤のものであり、２番目のプロフィールは、１２．５ｍＣｉの９９ｍＴｃ−過テクネチウム酸を還元するためにＳｎＣＬ２を添加した、クエン酸ナトリウムを含む生理食塩水のものである。３番目および４番目の放射化学的溶出プロフィールでは、ＤＴＰＡ−マンノシル−デキストラン薬剤物質は部分的に放射標識されており、約１４．５分に顕著な９９ｍＴｃ−シトラートの溶出が見られる。したがって、クエン酸ナトリウムの使用は、ｐＨバッファー／トランスキレート剤として好ましい選択肢ではない。
【００２７】
実施例３
ＤＴＰＡ−マンノシル−デキストランの放射標識向上のためのｐＨバッファー、トランスキレート剤、増量賦形剤のスクリーニング
図５は、ＳＥＣ放射化学的純度測定法により測定される、リン酸ナトリウムｐＨバッファーならびに種々の組合せのトランスキレート剤、還元剤、および増量剤を含むＤＴＰＡ−マンノシル−デキストラン薬剤物質の液体プラセボ製剤パイロットの放射化学的溶出プロフィールを縦に並べて示した図である。一番上の放射化学的溶出プロフィールは、ｐＨ４の２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーおよび１．５ｍｇ／ｍＬのアスコルビン酸ナトリウムを用いた場合の小さな９９ｍＴｃ標識干渉ピークを示している。２番目〜６番目の溶出プロフィールは、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ４）、７５μｇ／ｍＬのＳｎＣＬ２・２Ｈ２Ｏ、および１２．５ｍＣｉの９９ｍＴｃ過テクネチウム酸と以下の各潜在的賦形剤を示すものである：１ｍｇ／ｍＬのクエン酸ナトリウム；１％のＰＥＧ８０００；１ｍｇ／ｍＬのクエン酸ナトリウムおよび１．５ｍｇ／ｍＬのアスコルビン酸ナトリウム；１．５ｍｇ／ｍＬのアスコルビン酸ナトリウムおよび１％のＰＥＧ８０００；ならびに１．５ｍｇ／ｍＬのアスコルビン酸ナトリウム、１ｍｇ／ｍＬのクエン酸ナトリウム、および１％のＰＥＧ８０００。これらは全て、顕著な９９ｍＴｃ標識干渉ピークを示しており、９９ｍＴｃ−ＰＥＧ８０００はＲＴ約１４分という早い時間に溶出し、９９ｍＴｃ−シトラートはより低分子量側の保持時間約１５分に溶出している。
【００２８】
図６には、リン酸ナトリウムｐＨバッファーを含む対応するＤＴＰＡ−マンノシル−デキストラン薬剤物質の液体プラセボ製剤パイロットの放射化学的溶出プロフィールが縦に並べて示されている。図６中の０．３ｍｇ／ｍＬすなわち１５ｍＭのＤＭＤを含むＤＴＰＡ−マンノシル−デキストラン製剤では、放射化学的溶出プロフィールは、薬物物質の少し顕著な放射標識を示している。上から３番目のプロフィールはバックグランドレベルの９９ｍＴｃ−ＤＭＤを示しており、ホスファートおよびＰＥＧ８０００が満足のゆくトランスキレート剤として機能しないことを示している。５分の１のｐＨバッファー強度では、シトラートは薬剤物資の放射標識効率が低くなり、これらの製剤中でまだ干渉している。更に、ＰＥＧ８０００は、明らかにそのヒドロキシル基で薬剤物質の収率に干渉しており、増量剤として好ましくない。リン酸ナトリウムは凍結乾燥に理想的なｐＨバッファーではないので、一般的に安全とみなされている（ＧＲＡＳ）別のｐＨバッファーをスクリーニングした。
【００２９】
図７Ａおよび７Ｂでは、ＤＴＰＡ−マンノシル−デキストラン薬剤物質およびプラセボの、ｐＨ４の２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーを含む液体製剤パイロットの放射化学的溶出プロフィールが分散されて縦に並べられている。図７Ａ中、一番上の放射化学的溶出プロフィールは、潜在的トランスキレート剤である酒石酸ナトリウム１．５ｍｇ／ｍＬを含む薬剤物質製剤のものであり、薬剤物質の放射標識の向上および９９ｍＴｃ−タルトラートの顕著な干渉ピークを示している（対応するプラセボ製剤については４番目の溶出プロフィール参照）。図７Ａ中の２番目および３番目の溶出プロフィールはアスコルビン酸ナトリウムおよびＰＥＧ８０００の存在下でほとんど差を示さない。図７Ｂ中、放射化学的溶出プロフィールは、アスコルビン酸ナトリウムおよびＰＥＧ８０００の組合せとタルトラートを用いた薬剤物質製剤では薬剤物質の放射標識効率が下がることを示している。最後に、ＤＴＰＡ標準は、ｐＨ４で酢酸ナトリウムおよびアスコルビン酸ナトリウムと一緒の場合、小さなテーリングエッジの肩を有する。したがって、酢酸ｐＨバッファー中での潜在的トランスキレート剤としての酒石酸ナトリウムの選択は満足なものではない。
【００３０】
図８中には、ＤＴＰＡ−マンノシル−デキストラン薬剤物質およびプラセボのｐＨ４および６の２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーを含む液体製剤パイロットの放射化学的溶出プロフィールも分散されて縦に並べられている。一番上および２番目の放射化学的溶出プロフィールは、ｐＨ６において１．５ｍｇ／ｍＬのアスコルビン酸ナトリウムの存在が薬剤物質の放射化学的純度を高めることを示しているが、３番目および４番目のプロフィールは、アスコルビン酸が、それぞれＲＴ約１３．５分および約１５分における９９ｍＴｃ−アスコルビン酸の顕著な干渉ピークおよび小さな干渉ピークに寄与し得ることを示している。５番目の溶出プロフィールは、放射化学的純度がｐＨ感受性であり、アスコルビン酸ナトリウム存在下のｐＨ４では薬剤物質が主に放射標識されることを示している。５番目のプロフィールは、薬剤物質ピークのテーリングエッジ（ｔｒａｉｌｉｎｇ ａｄｇｅ）のわずかな肩およびＲＴ約１６分の小さな９９ｍＴｃ標識ピークに観察されるように、９９ｍＴｃ−ＤＭＤピークと共溶出するいくつかの干渉材料を含み得る。
【００３１】
図９Ａおよび９Ｂでは、第一級アミンを有する還元糖および両性イオンアミノ酸、すなわちグルコサミンナトリウムおよびグリシンを用いたスクリーニング実験を行った。これは、９９ｍテクネチウムがアミンおよびアミドの窒素、カルボキシラートの酸素、ならびにチオラートおよびチオエーテルの硫黄（チオラートの硫黄に強い選択性）と安定な錯体を形成するため（Giblin, M. F. et al. (1998) PNAS USA 95, 12814-12818）、これらの賦形剤が９９ｍテクネチウムと一時的な相互作用をいくらか有するであろうという根拠のある推測に基づき行われた。図９Ａは、アスコルビン酸ナトリウム（１．５ｍｇ／ｍＬ）の非存在下および存在下でｐＨ４の２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーと１．５ｍｇ／ｍＬのグルコサミンナトリウムおよびグリシンのいずれかとを含むＤＴＰＡ−マンノシル−デキストラン薬剤物質の液体プラセボ製剤パイロットを示す。これらの賦形剤は、３番目のグルコサミンナトリウムだけの溶出プロフィールがバックグラウンドの放射活性より大きい以外は、ＲＴ約１５分に小さな９９ｍＴｃ標識ピークを有するバックグランドレベルの放射活性を示す。図９Ｂ中、ｐＨ４の２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーと１．５ｍｇ／ｍＬのグルコサミンナトリウムまたはグリシンとを含む液体薬剤物質製剤パイロットの放射化学的溶出プロフィールはほぼ同じであり、トランスキレート剤として９９ｍＴｃ−ＤＭＤピーク（ＲＴ１２．４分）を効率的に放射標識する能力を示している。グルコサミンナトリウムはＧＲＡＳ賦形剤ではないので、以降の製剤では探求しなかった。グリシンが潜在的な非干渉トランスキレート剤として同定された。
【００３２】
グリシンおよびアスコルビン酸ナトリウムは、薬剤物質の放射化学的純度の向上と両立するようであるので、これらの賦形剤の範囲を調べた。グリシンおよびアスコルビン酸ナトリウムを２つの終濃度で評価した。Ｇｌｙ１およびＧｌｙ２は、それぞれ０．５および２．０ｍｇ／ｍＬであり、ＡＡ１およびＡＡ２は、それぞれ１．５および０．３８ｍｇ／ｍＬである。グリシンの＃１および＃２の薬剤物質製剤（すなわち、１５μＭのＤＴＰＡ−マンノシル−デキストラン、２０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４）、７５ｇ／ｍＬのＳｎＣＬ２・２Ｈ２Ｏ、および１２．５ｍＣｉの９９ｍｍＴｃ過テクネチウム酸）では、ＳＥＣ放射化学的純度測定法により測定されるＧｌｙ１およびＧｌｙ２の２つの放射標識実験の平均はそれぞれ９０．７および８８．７％９９ｍＴｃ−ＤＭＤである。Ｇｌｙ１存在下において、ＡＡ１およびＡＡ２薬剤物質製剤の２つの放射標識実験の平均はそれぞれ８０．３および９０．３％９９ｍＴｃ−ＤＭＤ純度である（図１０Ａおよび１０Ｂ参照）。
【００３３】
凍結乾燥に適した増量剤のスクリーニングを、トランスキレート剤としてグリシン、酸化防止剤／還元剤としてアスコルビン酸ナトリウムを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４〜５）の製剤中で行った。ＰＥＧ２０００およびポリビニルピロリドン等の重合体賦形剤がＤＴＰＡ−マンノシル−デキストランの放射標識効率に干渉することが判明した（データ示さず）。最終的に、薬剤物質液体製剤の潜在的な非干渉性増量剤としてα，α−トレハロース（２％ｗ／ｖ）が同定された。図１１中、ｐＨ５〜４の２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーならびにグリシンおよびアスコルビン酸ナトリウムを含む薬剤物質液体製剤パイロットの放射化学的溶出プロフィールは、９９ｍＴｃ−ＤＭＤの放射化学的純度に対して２％のα，α−トレハロースは干渉があったとしてもほとんどないことを示している。更に、酢酸ナトリウム製剤（１５μＭのＤＴＰＡ−マンノシル−デキストラン、２０ｍＭの酢酸ナトリウム、１ｍｇ／ｍＬのグリシン、１ｍｇ／ｍＬのアスコルビン酸ナトリウム、２％（ｗ／ｖ）のα，α−トレハロース、３８．５ｍＭの塩化ナトリウム、７５μｇ／ｍＬのＳｎＣＬ２・２Ｈ２Ｏ、および１２．５ｍＣｉの９９ｍＴｃ過テクネチウム酸）は顕著なｐＨ感受性があり、ｐＨ５．０、４．５、および４．０でそれぞれ８６．８、８８．４、および９３．８％の９９ｍＴｃ−ＤＭＤ純度を示している。これにより、凍結乾燥薬品キット製剤中での潜在的使用に適した賦形剤を同定するためのスクリーニングプロセスが完了した。次のステップは、製剤を最適化し、凍結乾燥キット形態の実現可能性を実証し、再構成手順を構築することである。
【００３４】
実施例４
凍結乾燥ＤＴＰＡ−マンノシル−デキストラン薬品の放射標識向上のための製剤の最適化
低ｐＨで９９ｍＴｃ−ＤＭＤの放射化学的純度が向上する酢酸バッファー製剤の明白なｐＨ感受性を研究する必要があった。最初のｐＨ実験ではｐＨ２および３の１０ｍＭリン酸ナトリウムならびに対照としてｐＨ４の２０ｍＭ酢酸ナトリウムを用いた。図１２は、１２．５ｍＣｉの９９ｍＴｃ過テクネチウム酸を添加したＤＭＤ薬剤物質製剤（２５μＭのＤＴＰＡ−マンノシル−デキストラン（０．５ｍｇ／ｍＬ）、ｐＨバッファー、０．５ｍｇ／ｍＬのグリシン、０．５ｍｇ／ｍＬのアスコルビン酸ナトリウム、２％（ｗ／ｖ）のα，α−トレハロース、３８．５ｍＭの塩化ナトリウム、および７５μｇ／ｍＬのＳｎＣＬ２・２Ｈ２Ｏを含む）の放射化学的溶出プロフィールを縦に並べて示した図である。一番上の溶出プロフィールはｐＨ４の酢酸製剤を示しており、これはＳＥＣ放射化学的純度測定法による測定で９９ｍＴｃ−ＤＭＤ純度が９６．９％である。この製剤は、本発明者らの薬剤物質液体製剤の目標を満たす（すなわち、９５％を超える９９ｍＴｃ−ＤＭＤ純度）。残念ながら、ｐＨ３および２の１０ｍＭリン酸ナトリウム製剤はＲＴ約１４．０分に顕著な９９ｍＴｃ標識干渉ピークを有する（図１２参照）。その後、グリシン／塩酸が潜在的な非干渉トランスキレート剤としてだけでなく好適な酸性ｐＨバッファーとしても機能することを突き止めた。図１３は、以下の賦形剤を含むｐＨ３、２、および４のＤＭＤ薬剤物質製剤の放射化学的溶出プロフィールを縦に並べて示した図である：２５μＭのＤＴＰＡ−マンノシル−デキストラン（０．５ｍｇ／ｍＬ）、０．５ｍｇ／ｍＬのグリシン、０．５ｍｇ／ｍＬのアスコルビン酸ナトリウム、２％（ｗ／ｖ）のα，α−トレハロース、および７５μｇ／ｍＬのＳｎＣＬ２・２Ｈ２Ｏ（およびｐＨ４では１０ｍＭ酢酸ナトリウム）。幸運にも、酸性ｐＨバッファーおよびトランスキレート剤として塩酸グリシンを用いたことで、ｐＨ３およびｐＨ２の薬剤物質製剤がそれぞれ９７．６％および９７．１％の９９ｍＴｃ−ＤＭＤ純度を示し、これは薬剤物質製剤の所望の目標を満たす（図１３参照）。図１３中ではｐＨ４の酢酸製剤が薬剤物質製剤の目標を満たさなかったが（９５％超に対して９３．６％の９９ｍＴＣ−ＤＭＤ純度）、これは、製剤の調製における日毎の変動、溶液の不完全な脱ガス、塩化第一スズ二水和物の不十分な混合等によるものであり得る。ｐＨ４の製剤中で酢酸バッファーに加えて塩酸グリシンバッファーを用いてもよい。
【００３５】
クラスＩの３ｍＬ容ガラス製バイアルに、滅菌ろ過した本ｐＨ実験物１．０５ｍＬを分注した。これらのバイアルの首に栓を置き、バイアルをＶｉｒＴｉｓ凍結乾燥器の棚上に置いて凍結乾燥させた。凍結乾燥サイクル完了後、バイアルに窒素ガスをバックフィルし、栓をした。その後、栓をしたバイアルにアルミニウムシールを圧着（ｃｒｉｍｐ）した。目視検査で、酢酸（ｐＨ４）およびグリシン（ｐＨ３）の薬品製剤バイアルの凍結乾燥ケーキは、不定形（ａｍｏｒｐｈｏｕｓ）構造を維持しており、低残留水分にまで乾燥されているようであった。一方、グリシン（ｐＨ２）の薬品製剤バイアルは完全に崩壊していた（すなわち構造がなかった）。本発明の好ましい実施形態はｐＨ３の薬品製剤（すなわち、１２．５〜２５μＭのＤＴＰＡ−マンノシル−デキストラン（０．２５〜０．５ｍｇ／ｍＬ）、０．５ｍｇ／ｍＬのグリシン（ｐＨ３）、０．５ｍｇ／ｍＬのアスコルビン酸ナトリウム、２％（ｗ／ｖ）のα，α−トレハロース、および７５μｇ／ｍＬのＳｎＣＬ２・２Ｈ２Ｏ）である。
【００３６】
実施例５
凍結乾燥ＤＴＰＡ−マンノシル−デキストラン薬品の放射標識における使いやすさ向上のための、リン酸緩衝生理食塩水希釈剤の使用を含む、再構成手順の構築
Ｌｙｍｐｈｏｓｅｅｋリガンド薬品製剤は最終ｐＨが約３であり、非経口薬に推奨されるｐＨ（Stranz, M. and Kastango, E. S. (2002) Int. J. Pharm. Compound. 6(3), 216-220）よりも低いため、９９ｍＴｃ過テクネチウム酸を用いた再構成後に、より痛みが少なく害の少ないｐＨ（例えばｐＨ５〜９）へとｐＨを中和する希釈剤を使用することに決定した。０．９％塩化ナトリウムまたは等張生理食塩水を用いてモリブデン−９９ジェネレータから９９ｍＴｃ過テクネチウム酸ナトリウムを溶出させる。輸液看護学会（Ｉｎｆｕｓｉｏｎ Ｎｕｒｓｉｎｇ Ｓｏｃｉｅｔｙ）の推奨を満たして１ｍＬの９９ｍＴｃ過テクネチウム酸ナトリウムで再構成した後に５００ｍＯｓｍ＼Ｌ未満になるようにＬｙｍｐｈｏｓｅｅｋリガンド薬品を処方する。ヒトの非経口薬との使用に適した希釈剤としてグリア・ラボラトリーズ社（Ｇｒｅｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の注射用緩衝生理食塩水を同定した。この希釈剤の配合は、０．１０７％のリン酸ナトリウム（七水和物）、０．０３６％のリン酸カリウム（望ましくはＵＳＰ−ＮＦ、米国薬局方−国民医薬品集）、０．５％の塩化ナトリウム、および０．４％のフェノールである。凍結乾燥させたＬｙｍｐｈｏｓｅｅｋリガンド薬品のバイアルを１０〜５０ｍＣｉの９９ｍＴｃ過テクネチウム酸ナトリウム０．７ｃｃを用いて周囲室温で少なくとも１０分間再構成し、断続的に混合し、その後、０．３ｃｃの注射用緩衝生理食塩水で希釈することが推奨される。Ｌｙｍｐｈｏｓｅｅｋ（登録商標）リガンド薬品は、再構成後少なくとも１２時間安定性を有するが、再構成された薬品は６時間以内の投与が推奨される（データ示さず）。したがって、中和された９９ｍＴｃ標識Ｌｙｍｐｈｏｓｅｅｋリガンド薬品は内皮注射で患者に十分に耐えられると考えられる。
【００３７】
種々の実施形態を参照してプロセス、組成物、およびキットを説明したが、本開示の範囲および本質から逸脱することなく、種々の変更および要素の同等物による代替が可能であると当業者には理解されよう。更に、本開示の本質的範囲から逸脱することなく、特定の状況または材料を本開示の教示に適応させるために多くの改変が可能である。したがって、本開示は、開示されている特定の実施形態に限定されず、添付の特許請求の範囲に含まれる全ての実施形態を含むことが意図される。本願中では、特に断りのない限り、米国の測定系を使用している。また、本明細書中で参照した全ての引用文献を明示的に参照により本明細書に援用する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）−デキストランをテクネチウム−９９で放射標識するための組成物であって、
（ａ）０．５０ｍｇ／バイアル以下の濃度のＤＴＰＡ−デキストラン、
（ｂ）２％（ｗ／ｖ）以下の濃度の非還元性二糖の群から選択される糖、
（ｃ）濃度が約０．５ｍｇ／バイアルである、非スルフヒドリル酸化防止剤、
（ｄ）第一スズ塩の二水和物形態の濃度が７５マイクログラム／バイアル以下である、第一スズ塩、
（ｅ）約０．５ｍｇ／バイアル以下の濃度のｐＨバッファーの群から選択される、ｐＨバッファー、および
（ｆ）不活性ガスで脱ガスおよび脱気された注射用蒸留水（ＷＦＩ）
を含んでなる、組成物。
【請求項２】
前記ＤＴＰＡ−デキストランが、複数のＤＴＰＡ基を含み、該ＤＴＰＡ基が約２：１〜１２：１のモル範囲でデキストランに接合されてなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＤＴＰＡ−デキストランが、平均分子量が約５，０００〜２０，０００ダルトンのデキストランを含んでなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＤＴＰＡ−デキストランが、ＤＴＰＡ−マンノシル−デキストランであり、該ＤＴＰＡ−マンノシル−デキストランが、接合されたマンノース基をＤＴＰＡ−デキストランに対して約２：１〜１２：１のモル比の範囲で含んでなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記非還元性二糖が、α，α−トレハロース二水和物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記非スルフヒドリル酸化防止剤が、Ｌ（＋）−アスコルビン酸のナトリウム塩である、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記第一スズ塩が、塩化第一スズ二水和物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記ｐＨバッファーおよびトランスキレート剤が、グリシンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記脱気されたＷＦＩに用いられる前記不活性ガスが、窒素である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
長期保存のためにＤＴＰＡ−デキストランのコールドキットを安定化する方法であって、
（ａ）目標体積の約９０％の脱ガスおよび脱気された注射用蒸留水を含む容器に、
（ｉ）２％（ｗ／ｖ）以下の濃度の非還元性二糖の群から選択される糖、
（ｉｉ）約０．５ｍｇ／バイアル以下の濃度のｐＨバッファーの群から選択されるｐＨバッファー
を含んでなる水性組成物を添加し、
（ｂ）濃度が約０．５ｍｇ／バイアルの非スルフヒドリル酸化防止剤を添加し、
（ｃ）不活性ガスの散布を維持しながら、６Ｎの塩酸を用いて溶液のｐＨを目標ｐＨである３．２±０．２に調整し、
（ｄ）第一スズ塩の二水和物の形態の濃度が７５マイクログラム／バイアル以下の第一スズ塩を添加し、
（ｅ）０．５０ｍｇ／バイアル以下の濃度のＤＴＰＡ−デキストランを添加し、
（ｆ）不活性ガスの散布を維持しながら、６Ｎの塩酸を用いて溶液のｐＨを目標ｐＨである３．２±０．２に調整し、
（ｇ）脱ガスおよび脱気された注射用蒸留水を用いて製剤の体積を目標体積の１００％に調整し、
（ｈ）０．２２ミクロンのフィルターを用いて前記水性組成物をろ過し、１．０ｍＬ±１０％の前記水性組成物をガラス製バイアルに充填し、前記バイアルの首に栓を置き、
（ｉ）工程ａにおいて、凍結乾燥により、生成物の水分の大部分を除去し、残留水分を約１％未満の水分量にまで低下させ、
（ｊ）工程ｂにおいて、前記バイアルに栓をする前に、前記凍結乾燥生成物に約１１．５ｐ．ｓ．ｉ．まで不活性ガスをバックフィルし、
（ｋ）工程ｃにおいて、前記凍結乾燥生成物バイアルをアルミニウムシールで圧着し、
（ｌ）工程ｄにおいて、前記圧着シールした凍結乾燥生成物バイアルを２〜８℃または２５℃で保存すること
を含んでなる、方法。
【請求項１１】
前記非還元性二糖が、α，α−トレハロース二水和物である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ｐＨバッファー兼トランスキレート剤が、グリシンである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記非スルフヒドリル酸化防止剤が、Ｌ（＋）−アスコルビン酸のナトリウム塩である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記第一スズ塩が、塩化第一スズ二水和物である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＤＴＰＡ−デキストランが、複数のＤＴＰＡ基を含み、該ＤＴＰＡ基が、約２：１〜１２：１のモル比でデキストランに接合されてなる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＤＴＰＡ−デキストランが、平均分子量が約５，０００〜約２０，０００ダルトンのデキストランを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＤＴＰＡ−マンノシル−デキストランが、接合されたマンノース基をＤＴＰＡ−デキストランに対して約２：１〜１２：１のモル比の範囲で含んでなる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
診断用の放射性医薬品として使用するために９９ｍＴｃ過テクネチウム酸ナトリウム溶液および希釈剤を用いてＤＴＰＡ−デキストランコールドキットを放射標識し、患者の快適さのために最終溶液ｐＨを調整する方法であって、
（ａ）水性過テクネチウム酸ナトリウム（Ｔｃ９９ｍ）組成物であって、
（ｉ）体積０．７ｍＬ中、１ｍｍｏｌのＤＴＰＡ−デキストラン当たり約１００キュリーを超える過テクネチウム酸ナトリウム（Ｔｃ９９ｍ）、
（ｉｉ）最終体積１．０ｍＬ中の用量０．２ｍＬ中、Ｔｃ９９ｍ線量範囲約０．３〜５．０ミリキュリーのＴｃ９９ｍの許容
を含んでなる水性過テクネチウム酸ナトリウム（Ｔｃ９９ｍ）組成物を添加し、
（ｂ）水性の緩衝生理食塩水希釈剤組成物であって、
（ｉ）０．５％（ｗ／ｖ）のＵＳＰの塩化ナトリウム、
（ｉｉ）０．１０７％のリン酸ナトリウム七水和物、
（ｉｉｉ）０．０３６％のリン酸カリウム、
（ｉｖ）０．４％のフェノール、
（ｖ）最終体積までの十分な量（ｑ．ｓ．）の注射用蒸留水（ｗｆｉ）の添加、および
（ｖｉ）必要に応じてｐｈを約７．０に調整するために濃水酸化ナトリウムまたは塩酸の添加
を含んでなる水性の緩衝生理食塩水希釈剤組成物を０．３ｍｌの体積で添加すること
を含んでなる、方法。
【請求項１】
ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）−デキストランをテクネチウム−９９で放射標識するための組成物であって、
（ａ）０．５０ｍｇ／バイアル以下の濃度のＤＴＰＡ−デキストラン、
（ｂ）２％（ｗ／ｖ）以下の濃度の非還元性二糖の群から選択される糖、
（ｃ）濃度が約０．５ｍｇ／バイアルである、非スルフヒドリル酸化防止剤、
（ｄ）第一スズ塩の二水和物形態の濃度が７５マイクログラム／バイアル以下である、第一スズ塩、
（ｅ）約０．５ｍｇ／バイアル以下の濃度のｐＨバッファーの群から選択される、ｐＨバッファー、および
（ｆ）不活性ガスで脱ガスおよび脱気された注射用蒸留水（ＷＦＩ）
を含んでなる、組成物。
【請求項２】
前記ＤＴＰＡ−デキストランが、複数のＤＴＰＡ基を含み、該ＤＴＰＡ基が約２：１〜１２：１のモル範囲でデキストランに接合されてなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＤＴＰＡ−デキストランが、平均分子量が約５，０００〜２０，０００ダルトンのデキストランを含んでなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＤＴＰＡ−デキストランが、ＤＴＰＡ−マンノシル−デキストランであり、該ＤＴＰＡ−マンノシル−デキストランが、接合されたマンノース基をＤＴＰＡ−デキストランに対して約２：１〜１２：１のモル比の範囲で含んでなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記非還元性二糖が、α，α−トレハロース二水和物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記非スルフヒドリル酸化防止剤が、Ｌ（＋）−アスコルビン酸のナトリウム塩である、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記第一スズ塩が、塩化第一スズ二水和物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記ｐＨバッファーおよびトランスキレート剤が、グリシンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記脱気されたＷＦＩに用いられる前記不活性ガスが、窒素である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
長期保存のためにＤＴＰＡ−デキストランのコールドキットを安定化する方法であって、
（ａ）目標体積の約９０％の脱ガスおよび脱気された注射用蒸留水を含む容器に、
（ｉ）２％（ｗ／ｖ）以下の濃度の非還元性二糖の群から選択される糖、
（ｉｉ）約０．５ｍｇ／バイアル以下の濃度のｐＨバッファーの群から選択されるｐＨバッファー
を含んでなる水性組成物を添加し、
（ｂ）濃度が約０．５ｍｇ／バイアルの非スルフヒドリル酸化防止剤を添加し、
（ｃ）不活性ガスの散布を維持しながら、６Ｎの塩酸を用いて溶液のｐＨを目標ｐＨである３．２±０．２に調整し、
（ｄ）第一スズ塩の二水和物の形態の濃度が７５マイクログラム／バイアル以下の第一スズ塩を添加し、
（ｅ）０．５０ｍｇ／バイアル以下の濃度のＤＴＰＡ−デキストランを添加し、
（ｆ）不活性ガスの散布を維持しながら、６Ｎの塩酸を用いて溶液のｐＨを目標ｐＨである３．２±０．２に調整し、
（ｇ）脱ガスおよび脱気された注射用蒸留水を用いて製剤の体積を目標体積の１００％に調整し、
（ｈ）０．２２ミクロンのフィルターを用いて前記水性組成物をろ過し、１．０ｍＬ±１０％の前記水性組成物をガラス製バイアルに充填し、前記バイアルの首に栓を置き、
（ｉ）工程ａにおいて、凍結乾燥により、生成物の水分の大部分を除去し、残留水分を約１％未満の水分量にまで低下させ、
（ｊ）工程ｂにおいて、前記バイアルに栓をする前に、前記凍結乾燥生成物に約１１．５ｐ．ｓ．ｉ．まで不活性ガスをバックフィルし、
（ｋ）工程ｃにおいて、前記凍結乾燥生成物バイアルをアルミニウムシールで圧着し、
（ｌ）工程ｄにおいて、前記圧着シールした凍結乾燥生成物バイアルを２〜８℃または２５℃で保存すること
を含んでなる、方法。
【請求項１１】
前記非還元性二糖が、α，α−トレハロース二水和物である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ｐＨバッファー兼トランスキレート剤が、グリシンである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記非スルフヒドリル酸化防止剤が、Ｌ（＋）−アスコルビン酸のナトリウム塩である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記第一スズ塩が、塩化第一スズ二水和物である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＤＴＰＡ−デキストランが、複数のＤＴＰＡ基を含み、該ＤＴＰＡ基が、約２：１〜１２：１のモル比でデキストランに接合されてなる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＤＴＰＡ−デキストランが、平均分子量が約５，０００〜約２０，０００ダルトンのデキストランを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＤＴＰＡ−マンノシル−デキストランが、接合されたマンノース基をＤＴＰＡ−デキストランに対して約２：１〜１２：１のモル比の範囲で含んでなる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
診断用の放射性医薬品として使用するために９９ｍＴｃ過テクネチウム酸ナトリウム溶液および希釈剤を用いてＤＴＰＡ−デキストランコールドキットを放射標識し、患者の快適さのために最終溶液ｐＨを調整する方法であって、
（ａ）水性過テクネチウム酸ナトリウム（Ｔｃ９９ｍ）組成物であって、
（ｉ）体積０．７ｍＬ中、１ｍｍｏｌのＤＴＰＡ−デキストラン当たり約１００キュリーを超える過テクネチウム酸ナトリウム（Ｔｃ９９ｍ）、
（ｉｉ）最終体積１．０ｍＬ中の用量０．２ｍＬ中、Ｔｃ９９ｍ線量範囲約０．３〜５．０ミリキュリーのＴｃ９９ｍの許容
を含んでなる水性過テクネチウム酸ナトリウム（Ｔｃ９９ｍ）組成物を添加し、
（ｂ）水性の緩衝生理食塩水希釈剤組成物であって、
（ｉ）０．５％（ｗ／ｖ）のＵＳＰの塩化ナトリウム、
（ｉｉ）０．１０７％のリン酸ナトリウム七水和物、
（ｉｉｉ）０．０３６％のリン酸カリウム、
（ｉｖ）０．４％のフェノール、
（ｖ）最終体積までの十分な量（ｑ．ｓ．）の注射用蒸留水（ｗｆｉ）の添加、および
（ｖｉ）必要に応じてｐｈを約７．０に調整するために濃水酸化ナトリウムまたは塩酸の添加
を含んでなる水性の緩衝生理食塩水希釈剤組成物を０．３ｍｌの体積で添加すること
を含んでなる、方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公表番号】特表２０１２−５１６３２８（Ｐ２０１２−５１６３２８Ａ）
【公表日】平成２４年７月１９日（２０１２．７．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５４７９７３（Ｐ２０１１−５４７９７３）
【出願日】平成２２年１月２８日（２０１０．１．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０００２２２
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０８７９５９
【国際公開日】平成２２年８月５日（２０１０．８．５）
【出願人】（５９４０１２４８３）ネオプローブ コーポレイション (1)
【氏名又は名称原語表記】ＮＥＯＰＲＯＢＥ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年７月１９日（２０１２．７．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１月２８日（２０１０．１．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０００２２２
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０８７９５９
【国際公開日】平成２２年８月５日（２０１０．８．５）
【出願人】（５９４０１２４８３）ネオプローブ コーポレイション (1)
【氏名又は名称原語表記】ＮＥＯＰＲＯＢＥ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【Ｆターム（参考）】
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