ジペプチドの製造法
本発明によれば、Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンリガ−ゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用いた、Ｄ−アラニル−Ｄ−アラニンおよびＤ−アラニル−Ｄ−セリン以外のジペプチドの製造法、およびＤ−アミノ酸を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物およびＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガ−ゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用いたＤ−アミノ酸を含むジペプチドの製造法が提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素的なジペプチドの製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｄ−アミノ酸を含むジペプチドの製造法としては、化学合成法、酵素法が知られている。化学合成法によるＤ−アミノ酸を含むジペプチドの合成では、官能基の保護・脱保護などの操作が必要であり、またラセミ体も合成されることから、化学合成法は経済的、効率的な方法とはいえない。また、化学合成法は大量の有機溶媒等を使うため環境衛生上も好ましい方法ではない。
酵素法によるＤ−アミノ酸を含むジペプチドの合成に関しては、蛋白質分解酵素（ペプチダ−ゼ）の逆反応を利用した方法（非特許文献１参照）、アミノアシルトランスフェラ−ゼを利用する方法（非特許文献２、３参照）、α−アミノ酸エステラ−ゼを利用する方法（非特許文献４参照）が知られている。
しかし、蛋白質分解酵素の逆反応を利用した方法では、基質となるアミノ酸の官能基の保護・脱保護が必要であり、Ｄ−アミノ酸を含むジペプチド形成反応の効率化およびジペプチド分解反応の阻止が困難といった問題点がある。アミノアシルトランスフェラ−ゼを利用する方法は、基質となるアミノ酸のエステル化が必要であることから、効率的な製造法とはいえない。また、α−アミノ酸エステラ−ゼを利用する方法は、基質となるアミノ酸のエステル化が必要であり、Ｄ−アミノ酸を含むジペプチド形成反応の効率化およびペプチド分解反応の阻止が困難といった問題点がある。
Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンリガ−ゼは、Ｄ−アラニン、またはＤ−アラニンおよびＤ−セリンを基質にして、Ｄ−アラニル−Ｄ−アラニンおよびＤ−アラニル−Ｄ−セリンを生成する活性を有していることが知られている（非特許文献５参照）が、該酵素がＤ−アラニル−Ｄ−アラニンおよびＤ−アラニル−Ｄ−セリン以外のＤ−アミノ酸を含むジペプチドを生成する活性を有していること、および該酵素を生産する能力を有する微生物の培養物を酵素源に用いたＤ−アラニル−Ｄ−アラニンおよびＤ−アラニル−Ｄ−セリン以外のＤ−アミノ酸を含むジペプチドの製造法については知られていない。
Ｄ−アミノ酸を生成する活性を有する蛋白質としては、５−置換−ＤＬ−ヒダントインからＤ−アミノ酸を生成する活性を有するヒダントイナーゼ（非特許文献６）、Ｎ−アシル−ＤＬ−アミノ酸からＤ−アミノ酸を生成する活性を有するＤ−アミノアシラーゼ（非特許文献７参照）、ＤＬ−アミノ酸アミドからＤ−アミノ酸を生成する活性を有するＤ−アミノ酸アミダーゼ（非特許文献８参照）、α−ケト酸からＤ−アミノ酸を生成する活性を有するＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（非特許文献９参照）およびＬ−α−アミノ酸からＤ−アミノ酸を生成する活性を有するアミノ酸ラセマーゼなどが知られている。低基質特異性アミノ酸ラセマーゼは、ＥＣ番号５．１．１．１０に分類される非常に基質特異性の低いラセマーゼであり、各種アミノ酸のラセミ体の工業的製造において有用性の高い酵素である。該酵素を生産する微生物としてはこれまで、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物（非特許文献１０および１１参照）、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物（非特許文献１２参照）が報告されている。しかしながらそれら微生物の活性はしばしば微弱であり、培養方法などや変異株の取得などの方法でこの欠点を十分に補うことは困難である。
低基質特異性アミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質については、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）ＩＦＯ１２９９６株由来の蛋白質について、活性部位のアミノ酸配列が報告されている（非特許文献１３参照）。また、該酵素をコードするＤＮＡを取得し、該ＤＮＡを大腸菌などの微生物に導入し、該酵素を活性のある蛋白質として発現させたとの報告もある（特許文献１参照）。
しかしながら、アミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質とＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ活性を有する蛋白質とを組み合わせて用いることにより、Ｌ−α−アミノ酸を含むアミノ酸からＤ−アミノ酸を含むジペプチドが生成することは知られていない。
【非特許文献１】Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃａｔ．Ｂ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ，６，３７９−３８６（１９９９）
【非特許文献２】Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３１，２４７−２５４（２００２）
【非特許文献３】Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，８９，１９５−３０６（２０００）
【非特許文献４】Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３０，１１９−１２６（２００１）
【非特許文献５】Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ，５，１９７−２０７（１９９８）
【非特許文献６】Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，２３，２１７３−２１８３（１９８１）
【非特許文献７】Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４４，１０８９−１０９５（１９８０）
【非特許文献８】Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１６２，４７０−４７４（１９８９）
【非特許文献９】ＦＥＢＳＬｅｔｔ．，５５，２６５−２６７（１９７５）
【非特許文献１０】ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．，１７Ｂ，６２９−６３６（１９７１）
【非特許文献１１】Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７５，４２１３−４２１７（１９９３）
【非特許文献１２】Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５１，１７３−１８０（１９８７）
【非特許文献１３】Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２３，５１９５−５２０１（１９８４）
【特許文献１】国際公開特許第０３−０７４６９０号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は、Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンリガ−ゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用いた、Ｄ−アラニル−Ｄ−アラニンおよびＤ−アラニル−Ｄ−セリン以外のジペプチドの製造法、およびＤ−アミノ酸を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物およびＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガ−ゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用いたＤ−アミノ酸を含むジペプチドの製造法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、以下の（１）〜（１８）に関する。
（１）Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンリガ−ゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、ＡＴＰ、並びにＤ−アミノ酸およびグリシンから選ばれる１種以上のアミノ酸（ただし、１種以上のアミノ酸が、Ｄ−アラニンのみである場合、並びにＤ−アラニンおよびＤ−セリンからなる場合を除く）を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドを生成、蓄積させ、該水性媒体中から該ジペプチドを採取することを特徴とするジペプチドの製造法。
（２）Ｄ−アミノ酸が、Ｄ−アミノ酸を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用いて製造されることを特徴とする上記（１）の製造法。
（３）Ｄ−アミノ酸を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物およびＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガ−ゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、ＡＴＰ、およびＤ−アミノ酸を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物によってＤ−アミノ酸に変換される物質を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＤ−アミノ酸を含むジペプチドを生成、蓄積させ、該水性媒体中から該ジペプチドを採取することを特徴とするＤ−アミノ酸を含むジペプチドの製造法。
（４）Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンリガ−ゼ活性を有する蛋白質が、以下の［１］〜［３］から選ばれる蛋白質である上記（１）〜（３）のいずれか１つの製造法。
［１］配列番号１〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［２］配列番号１〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガ−ゼ活性を有する蛋白質
［３］配列番号１〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガ−ゼ活性を有する蛋白質
（５）Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンリガ−ゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物が、Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンリガ−ゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる微生物である上記（１）〜（３）のいずれか１つの製造法。
（６）Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンリガ−ゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡが、以下の［１］〜［４］から選ばれるＤＮＡである上記（５）の製造法。
［１］配列番号１〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［２］配列番号６〜１０のいずれかで表される塩基配列を有するＤＮＡ
［３］配列番号６〜１０のいずれかで表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、かつＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガ−ゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［４］配列番号６〜１０のいずれかで表される塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガ−ゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（７）Ｄ−アミノ酸を生産する能力を有する微生物が、ヒダントイナーゼ、Ｄ−アミノアシラーゼ、Ｄ−アミノ酸アミダーゼ、Ｄ−アミノ酸トランスアミナーゼまたはアミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物である上記（２）または（３）の製造法。
（８）アミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質が、低基質特異性アミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質である上記（７）の製造法。
（９）低基質特異性アミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質が、以下の［１］〜［３］から選ばれる蛋白質である上記（８）の製造法。
［１］配列番号１１または１２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［２］配列番号１１または１２で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ低基質特異性アミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質
［３］配列番号１１または１２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ低基質特異性アミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質
（１０）Ｄ−アミノ酸を生産する能力を有する微生物が、ヒダンイトイナーゼ、Ｄ−アミノアシラーゼ、Ｄ−アミノ酸アミダーゼ、Ｄ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼまたはアミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる微生物である上記（２）および（３）の製造法。
（１１）アミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡが、低基質特異性アミノ酸ラセマーゼをコードするＤＮＡである上記（１０）の製造法。
（１２）低基質特異性アミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡが、以下の［１］〜［４］から選ばれるＤＮＡである上記（１１）の製造法。
［１］配列番号１１または１２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［２］配列番号１３または１４で表される塩基配列を有するＤＮＡ
［３］配列番号１３または１４で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、かつ低基質特異性アミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［４］配列番号１３または１４で表される塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつ低基質特異性アミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（１３）Ｄ−アミノ酸およびグリシンから選ばれる１種以上のアミノ酸が、Ｄ−アラニン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−グルタミン酸、グリシン、Ｄ−バリン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−プロリン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−セリン、Ｄ−スレオニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−チロシン、Ｄ−リジン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−アスパラギン酸およびＤ−オルニチンからなる群より選ばれるＤ−アミノ酸（ただし、１種以上のアミノ酸が、Ｄ−アラニンのみである場合、並びにＤ−アラニンおよびＤ−セリンからなる場合を除く）である上記（１）、（２）および（４）〜（６）のいずれか１つの製造法。
（１４）Ｄ−アミノ酸を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物によってＤ−アミノ酸に変換される物質が、１種以上の５−置換−ＤＬ−ヒダントイン、１種以上のＮ−アシル−ＤＬ−アミノ酸、１種以上のＤＬ−アミノ酸アミド、１種以上のα−ケト酸および１種以上のＤ−アミノ酸、または１種以上のＬ−α−アミノ酸を含む１種以上のアミノ酸である上記（３）〜（１２）のいずれか１つの製造法。
（１５）１種以上のＬ−α−アミノ酸を含む１種以上のアミノ酸が、Ｌ体またはＤ体のアラニン、グルタミン、グルタミン酸、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン、チロシン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸およびオルニチン、並びにグリシンからなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸を含む上記（１４）の製造法。
（１６）ジペプチドが、式（Ｉ）
Ｒ１−Ｒ２（Ｉ）
（式中、Ｒ１およびＲ２は同一または異なって、Ｄ体のアラニン、グルタミン、グルタミン酸、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン、チロシン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸若しくはオルニチン、或いはグリシンを表すが、同時にＤ−アラニンを表すこと、およびＲ１がＤ−アラニンである場合にＲ２がＤ−セリンを表すことはない）で表されるジペプチドである上記（１）、（２）および（４）〜（１２）のいずれか１つの製造法。
（１７）Ｄ−アミノ酸を含むジペプチドが、式（ＩＩ）
Ｒ３−Ｒ４（ＩＩ）
（式中、Ｒ３およびＲ４は同一または異なって、Ｌ体またはＤ体のアラニン、グルタミン、グルタミン酸、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン、チロシン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸若しくはオルニチン、或いはグリシンを表すが、同時にＬ体のアミノ酸またはグリシンを表すことはない）で表されるジペプチドである上記（３）〜（１２）のいずれか１つの製造法。
（１８）Ｄ−アミノ酸を含むジペプチドが、式（ＩＩＩ）
Ｒ５−Ｒ６（ＩＩＩ）
（式中、Ｒ５およびＲ６は同一または異なって、Ｄ−アラニン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−バリン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−プロリン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−セリン、Ｄ−スレオニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−チロシン、Ｄ−リジン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−オルニチンまたはグリシンを表すが、同時にグリシンを表すことはない）で表されるジペプチドである上記（３）〜（１２）のいずれか１つの製造法。
【発明の効果】
【０００５】
本発明によれば、Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンリガ−ゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用いた、Ｄ−アラニル−Ｄ−アラニンおよびＤ−アラニル−Ｄ−セリン以外のジペプチドの製造法、およびＤ−アミノ酸を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物およびＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガ−ゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用いたＤ−アミノ酸を含むジペプチドの製造法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
以下に本発明を詳細に説明する。
１．本発明の方法で用いられるＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物
本発明の方法で用いられるＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物は、Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物であれば、いずれの微生物であってもよい。
Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ（ｄｄｌともいう）活性は、多くの微生物が有しており、例えばエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する微生物［日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）に、ｄｄｌＢ遺伝子およびｄｄｌＡ遺伝子を有すると記載されている］、オセアノバシルス（Ｏｓｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物（ＤＤＢＪに、ｄｄｌＡ遺伝子を有すると記載されている）、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｏｃｙｓｔｉｓ）属に属する微生物（ＤＤＢＪに、ｄｄｌＡ遺伝子を有すると記載されている）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物［Ｎａｔｕｒｅ，３９０，２４９−２５６（１９９７）］、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物（ＮＣＢＩ ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＮＯ．ＡＰ００５２８２にＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼおよび該酵素をコードする遺伝子が含まれている）、シュードモナス属に属する微生物［Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４２，７９−８６（１９９６）］、ヘリコバクターに属する微生物［Ｎａｔｕｒｅ，３８８，５３９−５４７（１９９７）］、マイコバクテリウム属に属する微生物［Ｎａｔｕｒｅ，３９３，５３７−５４４（１９９８）］、アラビドプシス属に属する微生物［ＮＣＢＩ ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＮＯ．ＮＭ＿２０２５３０で表される蛋白質はＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼファミリーに属すると記載されている］、サーモトーガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）属に属する微生物（ＤＤＢＪに、Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼをコードする遺伝子を有すると記載されている）などをあげることができ、その他各種公的データベースを該酵素名で検索することにより、Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ活性を有する蛋白質を生産する微生物を得ることができる。
本発明に用いられるより好適な微生物としては、エシェリヒア属に属する微生物、オセアノバシルス属に属する微生物、シネコシスティス属に属する微生物、およびサーモトーガ属に属する微生物をあげることができる。
Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物としては、具体的には以下の［１］〜［３］、
［１］配列番号１〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物、
［２］配列番号１〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ低基質特異性アミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物、および
［３］配列番号１〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有し、かつＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物、
などをあげることができる。
具体的には、配列番号１または２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物であるエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ−１２株、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物であるオセアノバシルス・イヘイエンシス（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｈｅｙｅｎｓｉｓｕ）ＨＴＥ８３１株、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物であるシネコシスティス・エスピー（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．）ＰＣＣ６８０３株、配列番号５で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物であるサーモトーガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）ＡＴＣＣ４３５８９株などをあげることができる。
上記において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物は、該蛋白質を生産する能力を有する微生物であればいずれの微生物であってもよく、例えば該微生物としては、配列番号１〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ、より具体的には配列番号６〜１０のいずれかで表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列を有するＤＮＡの一部、または全部をプローブに用いたサザン解析により取得できる微生物などをあげることができる。上記のプローブに用いるＤＮＡの一部とは、例えば配列番号１〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる蛋白質の活性中心をコードするＤＮＡなどをあげることができる。
上記のサザン解析とは、上記したＤＮＡをプローブに用い、被検微生物の細胞から公知の方法で抽出した染色体ＤＮＡの制限酵素消化物などに対し、サザンハイブリダイゼーションを行い、ポジティブシグナルの有無を調べることである。具体的なサザン解析の手法としては、染色体ＤＮＡの制限酵素消化物を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／ｌのクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄し、洗浄後においてもプローブＤＮＡとハイブリダイズしているＤＮＡを検出する方法をあげることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラー・クローニング第３版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）等に記載されている方法に準じて行うことができる。ハイブリダイズ可能なＤＮＡを有する微生物としては、例えばエシェリヒア属、オセアノバシルス属、シネコシスティス属、またはサーモトーガ属に属する微生物などをあげることができる。
配列番号１〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、かつＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物としては、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３）］やＦＡＳＴＡ［Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０）］を用いて計算したときに、配列番号１〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物をあげることができる。該微生物としては例えばエシェリヒア属、オセアノバシルス属、シネコシスティス属、またはサーモトーガ属に属する微生物をあげることができる。
上記したＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸとよばれるプログラムが開発されており［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）］、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばＳｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とし、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３として塩基配列またはアミノ酸配列の相同性を計算することができる。またＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。
また、本発明の方法で用いられるＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物としては、上記したＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物に対し、通常の変異誘起処理方法、例えば、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンなどの変異剤での処理、ＵＶ照射、γ線照射による変異処理などを行い、Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ活性が親株より上昇した微生物を選択することにより得られる微生物などもあげることができる。Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼの活性は、常法に従い測定することができる。
また、本発明で用いられるＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物としては、Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼをコードするＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる形質転換された微生物をあげることができる。
Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡとしては、上記したＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物であるエシェリヒア属に属する微生物、オセアノバシルス属に属する微生物、シネコシスティス属に属する微生物、バチルス属に属する微生物、コリネバクテリウム属に属する微生物、シュードモナス属に属する微生物、ヘリコバクターに属する微生物、マイコバクテリウム属に属する微生物、アラビドプシス属に属する微生物、およびサーモトーガ属に属する微生物が有するＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼをコードする遺伝子（ｄｄｌ遺伝子）などをあげることができ、該遺伝子の具体的な塩基配列は各種公的データベースから取得することができる。また、本発明により好適に用いられるＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼをコードするＤＮＡとしては、エシェリヒア属、オセアノバシルス属、シネコシスティス属、またはサーモトーガ属に属する微生物由来のＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡをあげることができる。Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡとしては、具体的には以下の［１］〜［４］、
［１］配列番号１〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
［２］配列番号６〜１０のいずれかで表される塩基配列を有するＤＮＡ、
［３］配列番号６〜１０のいずれかで表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、かつＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、および
［４］配列番号６〜１０のいずれかで表される塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
などをあげることができる。
ここでいう「ハイブリダイズする」とは、特定の塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部にＤＮＡがハイブリダイズする工程である。したがって、該特定の塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部の塩基配列は、ノーザンまたはサザンブロット解析のプローブとして有用であるか、またはＰＣＲ解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できる長さのＤＮＡであってもよい。プローブとして用いるＤＮＡとしては、少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上のＤＮＡをあげることができるが、少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上のＤＮＡであってもよい。
ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えば当業者であれば本願明細書に従い、ハイブリダイゼーションの条件を決定することができる。該ハイブリダイゼーションの条件は、モレキュラー・クローニング第２版、第３版（２００１年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｇｙ，ＡＳＭ Ｐｒｅｓ（１９９４）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｍｅｔｈｏｄｓ ｍａｎｕａｌ，Ａｃａｄｅｍｉｃ ｐｒｅｓｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）に記載の他、多数の他の標準的な教科書に従っておこなうことができる。
上記のストリンジェントな条件とは、例えばＤＮＡを固定化したフィルターとプローブＤＮＡとを５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％の硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４２℃で一晩、インキュベートした後、例えば約６５℃の０．２×ＳＳＣ溶液中で該フィルターを洗浄する条件が好ましいが、より低いストリンジェント条件を用いることもできる。ストリンジェンな条件の変更は、ホルムアミドの濃度調整（ホルムアミドの濃度を下げるほど低ストリンジェントになる）、塩濃度および温度条件の変更により可能である。低ストリンジェント条件としては、例えば６×ＳＳＣＥ（２０×ＳＳＣＥは、３ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム、０．２ｍｏｌ／ｌのリン酸二水素ナトリウム、０．０２ｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、０．５％のＳＤＳ、３０％のホルムアミド、１００μｇ／ｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、３７℃で一晩インキュベートした後、５０℃の１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液を用いて洗浄する条件をあげることができる。また、さらに低いストリンジェントな条件としては、上記した低ストリンジェント条件において、高塩濃度（例えば５×ＳＳＣ）の溶液を用いてハイブリダイゼーションを行った後、洗浄する条件をあげることができる。
上記した様々な条件は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加、または変更することにより設定することもできる。上記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。
上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えば上記したＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等を用いて上記したパラメータ等に基づいて計算したときに、配列番号６〜１０のいずれかで表される塩基配列と少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
２．本発明の方法で用いられるＤ−アミノ酸を生産する能力を有する微生物
本発明の方法で用いられるＤ−アミノ酸を生産する能力を有する微生物は、該能力を有する微生物であればいずれでもよく、例えば５−置換−ＤＬ−ヒダントインからＤ−アミノ酸を生成する活性を有するヒダントイナーゼ［Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，２３，２１７３−２１８３（１９８１）］、Ｎ−アシル−ＤＬ−アミノ酸からＤ−アミノ酸を生成する活性を有するＤ−アミノアシラーゼ［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４４，１０８９−１０９５（１９８０）］、ＤＬ−アミノ酸アミドからＤ−アミノ酸を生成する活性を有するＤ−アミノ酸アミダーゼ［Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１６２，４７０−４７４（１９８９）］、α−ケト酸からＤ−アミノ酸を生成する活性を有するＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ［ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，５５，２６５−２６７（１９７５）］またはＬ−ａ−アミノ酸からＤ−アミノ酸を生成する活性を有するアミノ酸ラセマーゼを生産する能力を有する微生物をあげることができ、より好ましくはアミノ酸ラセマーゼを生産する能力を有する微生物、さらに好ましくは、低基質性アミノ酸ラセマーゼを生産する能力を有する微生物をあげることができる。
アミノ酸ラセマーゼを生産する能力を有する微生物としては、例えばエシェリヒア属に属する微生物［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７，１４５３−１４７４（１９９７）］、バチルス属に属する微生物［Ｎａｔｕｒｅ，３９０，２４９−２５６（１９９７）］、シュードモナス属に属する微生物［Ｎａｔｕｒｅ，４０６，９５９−９６４（２０００）］、オセアノバシルス属に属する微生物［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３０，３９２７−３９３５（２００２）］など、低基質特異性アミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物として、例えばシュードモナス属に属する微生物（ＷＯ０３／０７４６９０）などをあげることができ、本発明には低基質特異性アミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物がより好適に用いられる。
低基質特異性アミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物としては、具体的には以下の［１］〜［３］、
［１］配列番号１１または１２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物、
［２］配列番号１１または１２で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ低基質特異性アミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物、および
［３］配列番号１１または１２で表されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有し、かつ低基質特異性アミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物、
などをあげることができる。
具体的には、配列番号１１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物である、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）ＡＴＣＣ４７９５４、配列番号１２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物である、シュードモナス・プチダＩＦＯ１２９９６をあげることができる。
上記において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ低基質特異性アミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物は、該蛋白質を生産する能力を有する微生物であればいずれの微生物であってもよく、例えば該微生物としては、配列番号１１または１２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ、より具体的には配列番号１３または１４で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列を有するＤＮＡの一部、または全部をプローブに用いたサザン解析により取得できる微生物などをあげることができる。上記のプローブに用いるＤＮＡの一部とは、例えば配列番号１１または１２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質の活性中心をコードするＤＮＡをあげることができる。
上記のサザン解析とは、上記したＤＮＡをプローブに用いる以外は、上記１のサザン解析と同じであり、その具体的手法も上記１と同様である。
ハイブリダイズ可能なＤＮＡを有する微生物としては、例えばシュードモナス属に属する微生物などをあげることができる。
配列番号１１または１２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、かつ低基質特異性アミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物としては、上記したＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡを用いて計算したときに、配列番号１１または１２で表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ低基質特異性アミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物をあげることができる。該微生物としてはシュードモナス属に属する微生物をあげることができる。
また、本発明の方法で用いられるＤ−アミノ酸を生産する能力を有する微生物としては、上記したアミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質などを生産する能力を有する微生物に対し、通常の変異誘起処理方法（ア・ショート・コース・イン・バクテリアル・ジェネティクス）、例えば、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンなどの変異剤での処理、ＵＶ照射、γ線照射による変異処理などを行い、アミノ酸ラセマーゼ活性などが親株より上昇した微生物を選択することにより得られる微生物などもあげることができる。Ｄ−アミノ酸を生産する能力、例えばアミノ酸ラセマーゼの活性は、常法に従い測定することができる。
また、本発明で用いられるＤ−アミノ酸を生産する能力を有する微生物としては、ヒダントイナーゼ、Ｄ−アミノアシラーゼ、Ｄ−アミノ酸アミダーゼ、Ｄ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ、またはアミノ酸ラセマーゼをコードするＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる形質転換された微生物をあげることができる。
ヒダントイナーゼをコードするＤＮＡとしては、例えば特開２００２−３３０７８５記載のＤＮＡなど、Ｄ−アミノアシラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡとしては、例えばＢｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５９，２１１５（１９９５）および特開２００１−２７５６８８号記載のＤＮＡなど、Ｄ−アミノ酸アミダーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡとしては、例えばＡｐｐｌｉｅｄ ＆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，６０，８８８−９５（１９９４）に記載のＤＮＡなど、Ｄ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡとしては、例えばＪ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８５，２４１８−２４３１（２００３）、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１３５０，３８−４０（１９９７）に記載のＤＮＡなど、アミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡとしてはエシェリヒア属に属する微生物由来のＤＮＡ［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７，１４５３−１４７４（１９９７）］、バチルス属に属する微生物由来のＤＮＡ［Ｎａｔｕｒｅ，３９０，２４９−２５６（１９９７）］、シュードモナス属に属する微生物由来のＤＮＡ［Ｎａｔｕｒｅ，４０６，９５９−９６４（２０００）］、オセアノバシルス属に属する微生物由来のＤＮＡ［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３０，３９２７−３９３５（２００２）］などが知られており、低基質特異性アミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡとしてはシュードモナス属に属する微生物由来のＤＮＡ（ＷＯ０３／０７４６９０）などをあげることができる他、各種ＤＮＡデータベースを該酵素名等を用いて検索することによりアミノ酸ラセマーゼをコードするＤＮＡの塩基配列を取得することができる。
本発明により好適に用いられる低基質特異性アミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡとしては、具体的には以下の［１］〜［４］、
［１］配列番号１１または１２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
［２］配列番号１３または１４で表される塩基配列を有するＤＮＡ、
［３］配列番号１３または１４で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、かつアミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、および
［４］配列番号１３または１４で表される塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつアミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
などをあげることができる。
上記の「ハイブリダイズする」および「ストリンジェントな条件」の意味は、上記１と同様であり、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ」の具体的な取得方法も上記１と同様である。
上記したストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的には、上記したＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等を用いて上記したパラメータ等に基づいて計算したときに、配列番号１３または１４で表される塩基配列と少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
３．本発明の製造法に用いられるＤＮＡの調製
本発明の製造法に用いられるＤＮＡ、例えばアミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、およびＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼをコードするＤＮＡは、以下のようにして調製することができる。
アミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡは、公的なＤＮＡのデータベース、例えばＧｅｎＢａｎｋなどにアミノ酸ラセマーゼをコードする遺伝子として登録されている塩基配列、または配列番号１３若しくは１４で表される塩基配列に基づき設計することができるプローブを用いた、微生物、好ましくはシュードモナス属に属する微生物の染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション、あるいは上記した公知のアミノ酸ラセマーゼをコードする遺伝子または配列番号１３若しくは１４で表される塩基配列に基づき設計することができるプライマーＤＮＡを用いた、微生物、好ましくはシュードモナス属に属する微生物の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ［ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９０）］により取得することができる。
Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼをコードするＤＮＡは、公的なＤＮＡのデータベース、例えばＧｅｎＢａｎｋなどにＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼをコードする遺伝子として登録されている塩基配列、または配列番号６〜１０のいずれかで表される塩基配列に基づき設計することができるプローブを用いた、微生物、好ましくはエシェリヒア属、オセアノバシルス属、シネコシスティス属、もしくはサーモトーガ属に属する微生物の染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション、あるいは上記した公知のＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼをコードする遺伝子または配列番号６〜１０のいずれかで表される塩基配列に基づき設計することができるプライマーＤＮＡを用いた、微生物、好ましくはエシェリヒア属、オセアノバシルス属、シネコシスティス属、もしくはサーモトーガ属に属する微生物の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより取得することができる。
また、各種の遺伝子配列データベースに対して公知のアミノ酸ラセマーゼをコードする遺伝子または配列番号１３若しくは１４、または公知のＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼをコードする遺伝子若しくは配列番号６〜１０のいずれかで表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列と６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性を有する配列を検索し、該検索によって得られた塩基配列に基づき、該塩基配列を有する生物の染色体ＤＮＡ、ｃＤＮＡライブラリー等から上記した方法によりアミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、またはＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを取得することもできる。
該ＤＮＡをそのまま、あるいは適当な制限酵素などで切断し、常法によりベクターに組み込み、得られた組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入した後、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキシ法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７）］あるいは３７３Ａ・ＤＮＡシークエンサー（パーキン・エルマー社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
塩基配列を決定した結果、取得されたＤＮＡが部分長であった場合は、該部分長ＤＮＡをプローブに用いた、染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション法等により、全長ＤＮＡを取得することができる。
更に、決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、パーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成装置等を用いて化学合成することにより目的とするＤＮＡを調製することもできる。
上記のようにして取得されるアミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号１３または１４で表される塩基配列を有するＤＮＡをあげることができ、Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼをコードするＤＮＡとしては、たとえば配列番号６〜１０のいずれかで表される塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。
４．本発明に用いられるＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる微生物の調製
本発明に用いられるＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる微生物、例えばアミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる微生物、Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる微生物は、上記３で得られるＤＮＡを常法にて宿主細胞に導入することで取得できる。該微生物は、アミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡおよびＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡのいずれか１つを有している微生物であってもよいし、２つのＤＮＡを同時に有する微生物であっても本発明の方法に用いることができる。
上記３で取得したＤＮＡをもとにして、必要に応じて、蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。また、該蛋白質をコードする部分の塩基配列を、宿主の発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換することにより、該蛋白質の生産率を向上させた微生物を調製することができる。
該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換え体ＤＮＡを作製する。
該組換え体ＤＮＡを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、本発明の蛋白質を生産する形質転換体を得ることができる。
宿主細胞としては、目的とする遺伝子を発現できる微生物であればいずれも用いることができる。
発現ベクターとしては、微生物内において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、本発明のＤＮＡまたは本発明の製造法に用いられるＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、アミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、またはＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ（以下、アミノ酸ラセマーゼまたはＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼをコードするＤＮＡと略す）を有する組換え体ＤＮＡは、原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明のＤＮＡまたは本発明の製造法に用いられるＤＮＡ、転写終結配列より構成された組換え体ＤＮＡであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
発現ベクターとしては、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリンガーマンハイム社製）、ｐＨｅｌｉｘ１（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）、ｐＫＫ２３３−２（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（プロメガ社製）、ｐＱＥ−８（キアゲン社製）、ｐＥＴ−３、ｐＥＴ−３０ Ｘａ／ＬＩＣ（いずれもノバジェン社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）］、ｐＬＳＡ１［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）］、ｐＧＥＬ１［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ（−）（ストラタジーン社製）、ｐＴｒＳ３０［エシェリヒア・コリ ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０７）より調製］、ｐＴｒＳ３２［エシェリヒア・コリ ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０８）より調製］、ｐＰＡＣ３１（ＷＯ９８／１２３４３）、ｐＵＣ１９［Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）］、ｐＳＴＶ２８（タカラバイオ社製）、ｐＵＣ１１８（タカラバイオ社製）、ｐＰＡ１（特開昭６３−２３３７９８）、ｐＪＢ８６１［Ｐｌａｓｍｉｄ，３８，３５−５１（１９９７）］等を例示することができる。
プロモーターとしては、エシェリヒア・コリ等の宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター、Ｐｍプロモーター等をあげることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔＩプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
またコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物中で発現させるためのＰ５４−６プロモーター［Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５３，６７４−６７９（２０００）］なども用いることができる。
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
アミノ酸ラセマーゼ、またはＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼをコードするＤＮＡを発現ベクターに結合させた組換え体ＤＮＡにおいては、転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
このような組換え体ＤＮＡとしては、例えば後述するｐＪＢａｒ１およびｐＥＤｄｌＢをあげることができる。
原核生物としては、エシェリヒア属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、バチルス属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ミクロバクテリウム属（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アリシクロバチルス属（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アナベナ（Ａｎａｂｅｎａ）属、アナシスティス（Ａｎａｃｙｓｔｉｓ）属、アスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）属、クロマチウム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ）属、エルビニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、フォルミディウム（Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ）属、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）属、ロドシュードモナス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ロドスピリウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属、セネデスムス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、シネコッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｃｕｓ）属、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属等に属する微生物、例えば、エシェリヒア・コリＸＬ１−Ｂｌｕｅ、エシェリヒア・コリ ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、エシェリヒア・コリ ＤＨ１、エシェリヒア・コリ ＤＨ５α、エシェリヒア・コリ ＭＣ１０００、エシェリヒア・コリ ＫＹ３２７６、エシェリヒア・コリ Ｗ１４８５、エシェリヒア・コリ ＪＭ１０９、エシェリヒア・コリ ＨＢ１０１、エシェリヒア・コリ Ｎｏ．４９、エシェリヒア・コリ Ｗ３１１０、エシェリヒア・コリ ＮＹ４９、エシェリヒア・コリ ＭＰ３４７、エシェリヒア・コリ ＮＭ５２２、エシェリヒア・コリ ＢＬ２１（ＤＥ３）、バチルス・サチリス ＡＴＣＣ３３７１２、バチルス・メガテリウム、バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＦＥＲＭ ＢＰ−６０３０、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、ブレビバクテリウム・イマリオフィルム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ）ＡＴＣＣ１４０６８、ブレビバクテリウム・サッカロリティカム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１４０６６、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）ＡＴＣＣ１４０６７、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＡＴＣＣ１３８６９、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３０３２、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４２９７、コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）ＡＴＣＣ１３８７０、ミクロバクテリウム・アンモニアフィルム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ）ＡＴＣＣ１５３５４、セラチア・フィカリア（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ）、セラチア・フォンチコラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ）、セラチア・リケファシエンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）Ｄ−０１１０、アグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、アグロバクテリウム・リゾジーン（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）、アグロバクテリウム・ルビ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｕｂｉ）、アナベナ・シリンドリカ（Ａｎａｂａｅｎａ ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａ）、アナベナ・ドリオルム（Ａｎａｂａｅｎａ ｄｏｌｉｏｌｕｍ）、アナベナ・フロスアクア（Ａｎａｂａｅｎａ ｆｌｏｓ−ａｑｕａｅ）、アースロバクター・オーレッセンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ａｕｒｅｓｃｅｎｓ）、アースロバクター・シトレウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｉｔｒｅｕｓ）、アースロバクター・グロブフォルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｆｏｒｍｉｓ）、アースロバクター・ヒドロカーボグルタミカス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｇｌｕｔａｍｉｃｕｓ）、アースロバクター・ミソレンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｍｙｓｏｒｅｎｓ）、アースロバクター・ニコチアナ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ）、アースロバクター・パラフィネウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｒａｆｆｉｎｅｕｓ）、アースロバクター・プロトフォルミエ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐｒｏｔｏｐｈｏｒｍｉａｅ）、アースロバクター・ロセオパラフィナス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｒｏｓｅｏｐａｒａｆｆｉｎｕｓ）、アースロバクター・スルフレウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｌｆｕｒｅｕｓ）、アースロバクター・ウレアファシエンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）、クロマチウム・ブデリ（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｂｕｄｅｒｉ）、クロマチウム・テピダム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｔｅｐｉｄｕｍ）、クロマチウム・ビノサム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ）、クロマチウム・ワーミンギ（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｗａｒｍｉｎｇｉｉ）、クロマチウム・フルビアタティレ（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｆｌｕｖｉａｔｉｌｅ）、エルビニア・ウレドバラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｕｒｅｄｏｖｏｒａ）、エルビニア・カロトバラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）、エルビニア・アナス（Ｅｒｗｉｎｉａ ａｎａｎａｓ）、エルビニア・ヘリコラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）、エルビニア・パンクタタ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｐｕｎｃｔａｔａ）、エルビニア・テレウス（Ｅｒｗｉｎｉａ ｔｅｒｒｅｕｓ）、メチロバクテリウム・ロデシアナム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｏｄｅｓｉａｎｕｍ）、メチロバクテリウム・エクソトルクエンス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）、フォルミディウム・エスピー（Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ ｓｐ．）ＡＴＣＣ２９４０９、ロドバクター・カプスラタス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、ロドシュードモナス・ブラスチカ（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｌａｓｔｉｃａ）、ロドシュードモナス・マリナ（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍａｒｉｎａ）、ロドシュードモナス・パルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）、ロドスピリウム・リブラム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ）、ロドスピリウム・サレキシゲンス（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓａｌｅｘｉｇｅｎｓ）、ロドスピリウム・サリナラム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓａｌｉｎａｒｕｍ）、ストレプトマイセス・アンボファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ）、ストレプトマイセス・オーレオファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）、ストレプトマイセス・アウレウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｕｒｅｕｓ）、ストレプトマイセス・フンジシディカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ）、ストレプトマイセス・グリセオクロモゲナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ、ストレプトマイセス・オリボグリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｌｉｖｏｇｒｉｓｅｕｓ）、ストレプトマイセス・ラメウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒａｍｅｕｓ）、ストレプトマイセス・タナシエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔａｎａｓｈｉｅｎｓｉｓ）、ストレプトマイセス・ビナセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｎａｃｅｕｓ）、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）等をあげることができる。
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４）、エレクトロポレーション法［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６，６１２７（１９８８）］等をあげることができる。
５．本発明の方法で基質として用いられるアミノ酸
本発明の方法で基質として用いられるＤ−アミノ酸およびグリシンから選ばれる１種以上のアミノ酸は、１種以上のアミノ酸が、Ｄ−アラニンのみである場合、並びにＤ−アラニンおよびＤ−セリンからなる場合を除き、Ｄ−アミノ酸およびグリシンから選ばれる１種以上のアミノ酸であればいずれのアミノ酸でもよく、好ましくはＤ−アラニン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−グルタミン酸、グリシン、Ｄ−バリン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−プロリン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−セリン、Ｄ−スレオニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−チロシン、Ｄ−リジン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−オルニチンおよびその誘導体からなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸をあげることができ、好ましくは、Ｄ−アラニン、グリシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−プロリン、Ｄ−セリン、Ｄ−スレオニン、Ｄ−システインおよびＤ−リジンから選ばれる１種以上のアミノ酸をあげることができる。上記Ｄ−アミノ酸は、いずれの方法で入手できるＤ−アミノ酸であってもよく、市販のＤ−アミノ酸、または化学合成法若しくはＤ−アミノ酸を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用いて製造したＤ−アミノ酸であってもよい。
本発明で基質として用いられるＤ−アミノ酸を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物によってＤ−アミノ酸に変換される物質は、該微生物の培養物または該培養物の処理物によって、Ｄ−アミノ酸に変換される物質であればいずれでもよく、例えばＤ−アミノ酸を生産する能力を有する微生物としてヒダントイナーゼを生産する能力を有する微生物を用いる場合は、１種以上の５−置換−ＤＬ−ヒダントインなど、Ｄ−アミノアシラーゼを生産する能力を有する微生物を用いる場合は、１種以上のＮ−アシル−ＤＬ−アミノ酸など、Ｄ−アミノ酸アミダーゼを生産する能力を有する微生物を用いる場合は、１種以上のＤＬ−アミノ酸アミドなど、Ｄ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼを生産する能力を有する微生物を用いる場合は、１種以上のα−ケト酸および１種以上のＤ−アミノ酸など、アミノ酸ラセマーゼを生産する能力を有する微生物を用いる場合は、１種以上のＬ−α−アミノ酸などをあげることができる。
上記Ｌ−α−アミノ酸は、アミノ酸ラセマーゼの基質となる限りにおいて、天然物、非天然物またはそれらの誘導体であってもよい。
また、低基質特性アミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物を用いる場合の基質としては、１種以上のＬ−α−アミノ酸を含む１種以上のアミノ酸をあげることができる。
１種以上のＬ−α−アミノ酸を含む１種以上のアミノ酸は、１種以上のＬ−α−アミノ酸を含む１種以上のアミノ酸であれば、いずれのアミノ酸のいずれの組み合わせであってもよく、好ましくはＬ−α−アミノ酸およびグリシンから選ばれる、１種以上のＬ−α−アミノ酸を含む１種または２種のアミノ酸をあげることができる。
該Ｌ−α−アミノ酸としては、例えばＬ−α−アラニン、Ｌ−α−グルタミン、Ｌ−α−グルタミン酸、Ｌ−α−バリン、Ｌ−α−ロイシン、Ｌ−α−イソロイシン、Ｌ−α−プロリン、Ｌ−α−フェニルアラニン、Ｌ−α−トリプトファン、Ｌ−α−メチオニン、Ｌ−α−セリン、Ｌ−α−スレオニン、Ｌ−α−システイン、Ｌ−α−アスパラギン、Ｌ−α−チロシン、Ｌ−α−リジン、Ｌ−α−アルギニン、Ｌ−α−ヒスチジン、Ｌ−α−アスパラギン酸、Ｌ−α−オルニチンおよびそれらの誘導体をあげることができる。
上記したＬ−α−アミノ酸と組み合わせて用いることができるアミノ酸としては、アミノ酸であればいずれでもよい。
該アミノ酸としては、例えばＬ体またはＤ体のアラニン、グルタミン、グルタミン酸、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン、チロシン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸およびオルニチン、並びグリシンから選ばれるアミノ酸をあげるが、これらのアミノ酸の誘導体であってもよい。
上記したアミノ酸の誘導体としては、例えばヒドロキシアミノ酸（β−ヒドロキシグルタミン、β−ヒドロキシグルタミン酸、γ−ヒドロキシグルタミン酸、α−ヒドロキシグリシン、β−ヒドロキシバリン、γ−ヒドロキシバリン、β−ヒドロキシロイシン、γ−ヒドロキシロイシン、δ−ヒドロキシロイシン、β−ヒドロキシイソロイシン、γ−ヒドロキシイソロイシン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン、β−ヒドロキシフェニルアラニン、３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン、２，４，５−トリヒドロキシフェニルアラニン、β−ヒドロキシトリプトファン、５−ヒドロキシトリプトファン、α−ヒドロキシメチオニン、β−ヒドロキシセリン、γ−ヒドロキシスレオニン、Ｓ−ヒドロキシシステイン、β−ヒドロキシアスパラギン、β−ヒドロキシチロシン、β−ヒドロキシリジン、γ−ヒドロキシリジン、δ−ヒドロキシリジン、Ｎ−ヒドロキシリジン、β−ヒドロキシアルギニン、δ−ヒドロキシアルギニン、Ｎ−ヒドロキシアルギニン、β−ヒドロキシヒスチジン、β−ヒドロキシアスパラギン酸、β−ヒドロキシオルニチン、γ−ヒドロキシオルニチン、Ｎ−ヒドロキシオルニチン）、Ｎ−メチルアミノ酸（Ｎ−メチル−アラニン、Ｎ−メチル−グルタミン、Ｎ−メチル−グルタミン酸、Ｎ−メチル−グリシン、Ｎ−メチル−バリン、Ｎ−メチル−ロイシン、Ｎ−メチル−イソロイシン、Ｎ−メチル−プロリン、Ｎ−メチル−フェニルアラニン、Ｎ−メチル−トリプトファン、Ｎ−メチル−メチオニン、Ｎ−メチル−セリン、Ｎ−メチル−スレオニン、Ｎ−メチル−システイン、Ｎ−メチル−アスパラギン、Ｎ−メチル−チロシン、Ｎ−メチル−リジン、Ｎ−メチル−アルギニン、Ｎ−メチル−ヒスチジン、Ｎ−メチル−アスパラギン酸、Ｎ−メチル−オルニチン）などをあげることができる。
６．本発明の製造法
本発明の製造法は、（１）Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンリガ−ゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、ＡＴＰ、並びにＤ−アミノ酸およびグリシンから選ばれる１種以上のアミノ酸（ただし、１種以上のアミノ酸が、Ｄ−アラニンのみである場合、並びにＤ−アラニンおよびＤ−セリンからなる場合を除く）を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドを生成、蓄積させ、該水性媒体中から該ジペプチドを採取することを特徴とするジペプチドの製造法、および（２）Ｄ−アミノ酸を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物およびＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガ−ゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、ＡＴＰおよびＤ−アミノ酸を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物によってＤ−アミノ酸に変換される物質を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＤ−アミノ酸を含むジペプチドを生成、蓄積させ、該水性媒体中から該ジペプチドを採取することを特徴とするＤ−アミノ酸を含むジペプチドの製造法に関する。
本発明の方法で用いる酵素源は、Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンリガ−ゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物、Ｄ−アミノ酸を生産する能力を有する微生物、またはＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガ−ゼ活性を有する蛋白質を生産する能力およびＤ−アミノ酸を生産する能力の２つの能力を同時に有する微生物を培地に培養することで取得することができる。
該微生物を培養する培地としては、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該微生物の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、該微生物が資化し得るものであればよく、グルコ−ス、フラクト−ス、スクロ−ス、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノ−ル、プロパノ−ル等のアルコ−ル類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸または有機酸のアンモニウム塩、含窒素化合物、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コ−ンスチ−プリカ−、カゼイン加水分解物、大豆粕、大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化物等を用いることができる。
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は１５〜６０℃がよく、培養時間は、通常５時間〜７日間である。培養中ｐＨは４〜１０に保持する。ｐＨの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を、Ｐｍプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはｍ−トリック酸（ｍ−ｔｏｌｉｃ ａｃｉｄ）を培地に添加してもよい。
培養物の処理物としては、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物および該菌体の固定化物などの生菌体を含む処理物、ならびに該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、該菌体の蛋白質分画物、および該菌体より抽出、精製して得られる酵素標品などをあげることができる。
上記（１）および（２）の方法で用いられるＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ活性を有する微生物の培養物または該培養物の処理物は、１種または２種のＤ−アミノ酸から３０℃で１分間に１ｍｍｏｌのＤ−アミノ酸を含むジペプチドを生成することのできる活性を１単位（Ｕ）として、１ｍＵ／ｌ〜１０００Ｕ／ｌであり、好ましくは１０ｍＵ／ｌ〜１００Ｕ／ｌの濃度で用いる。
上記（２）の方法で用いられるＤ−アミノ酸を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物は、３０℃で１分間に１ｍｍｏｌのＤ−アミノ酸を生成することのできる活性を１単位（Ｕ）として、１ｍＵ／ｌ〜１０００Ｕ／ｌであり、好ましくは１０ｍＵ／１〜１００Ｕ／ｌの濃度で用いることができる。
基質として用いられるＤ−アミノ酸およびグリシンから選ばれる１種以上のアミノ酸、またはＤ−アミノ酸を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物によってＤ−アミノ酸に変換される物質は、全量として１〜５００ｇ／ｌの濃度で用いる。
上記（１）および（２）の方法で用いられる水性媒体としては、水、りん酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ほう酸塩、クエン酸塩、トリスなどの緩衝液、メタノ−ル、エタノ−ルなどのアルコ−ル類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類、アセトアミドなどのアミド類などをあげることができる。また、酵素源として用いた微生物の培養液を水性媒体として用いることができる。
上記（１）および（２）の方法では、必要に応じて界面活性剤あるいは有機溶媒を添加してもよい。界面活性剤としては、ポリオキシエチレン・オクタデシルアミン（例えばナイミ−ンＳ−２１５、日本油脂社製）などの非イオン界面活性剤、セチルトリメチルアンモニウム・ブロマイドやアルキルジメチル・ベンジルアンモニウムクロライド（例えばカチオンＦ２−４０Ｅ、日本油脂社製）などのカチオン系界面活性剤、ラウロイル・ザルコシネ−トなどのアニオン系界面活性剤、アルキルジメチルアミン（例えば三級アミンＦＢ、日本油脂社製）などの三級アミン類など、ジペプチドの生成反応を妨げないものであればいずれでもよく、１種または数種を混合して使用することもできる。界面活性剤は、通常０．１〜５０ｇ／ｌの濃度で用いられる。有機溶媒としては、キシレン、トルエン、脂肪族アルコ−ル、アセトン、酢酸エチルなどが挙げられ、通常０．１〜５０ｍｌ／ｌの濃度で用いられる。
上記（１）および（２）の反応は、水性媒体中、ｐＨ５〜１０、好ましくはｐＨ６〜９、２０〜６０℃の条件で１〜９６時間行う。
上記（１）の方法で製造されるジペプチドとしては、上記式（Ｉ）（式中、Ｒ１およびＲ２は同一或いは異なって、Ｄ体のアラニン、グルタミン、グルタミン酸、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン、チロシン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸若しくはオルニチン、またはグリシンを表し、好ましくはＤ体のアラニン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、セリン、スレオニン、システイン若しくはリジン、またはグリシンを表すが、同時にＤ−アラニンを表すこと、およびＲ１がＤ−アラニンである場合にＲ２がＤ−セリンを表すことはない）で表されるジペプチドをあげることができる。
また、上記（２）の方法で製造されるジペプチドとしては、上記式（ＩＩ）（式中、Ｒ３およびＲ４は同一或いは異なって、Ｌ体またはＤ体のアラニン、グルタミン、グルタミン酸、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン、チロシン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸若しくはオルニチン、またはグリシンを表し、好ましくはアラニン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、セリン、スレオニン、システイン若しくはリジン、またはグリシン表すが、同時にＬ体のアミノ酸またはグリシンを表すことはない）で表されるジペプチド、より好ましくは、上記式（ＩＩＩ）（式中、Ｒ５およびＲ６は同一または異なって、Ｄ−アラニン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−バリン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−プロリン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−セリン、Ｄ−スレオニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−チロシン、Ｄ−リジン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−オルニチンまたはグリシンを表し、さらに好ましくはＤ−アラニン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−プロリン、Ｄ−セリン、Ｄ−スレオニン、Ｄ−システイン若しくはＤ−リジンまたはグリシン表すが、同時にグリシンを表すことはない）で表されるジペプチドをあげることができる。
水性媒体中に生成したジペプチドの採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の単離および精製方法によって行うことができる。
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
なお、以下の実施例においてジペプチドおよびアミノ酸の分析、定量は以下に示す高速液体クロマトグラフィ−（ＨＰＬＣ）を用いる方法により行った。
ジペプチドおよびアミノ酸は、（２，３−ジニトロ−５−フルオロフェニル）−Ｌ−アラニンアミドナトリウム（Ｎａ−ＦＤＡＡ）を用いて誘導体化した後にＨＰＬＣで分析した。ＦＤＡＡを用いた誘導体化は、純水で希釈した試料１００μｌに、５０μｌの０．５％のＮａ−ＦＤＡＡアセトン溶液と４０μｌの０．５ｍｏｌ／ｌの炭酸ナトリウム水溶液を加えて攪拌した後、４０℃で６０分間静置することにより行った。
次に、４０μｌの１ｍｏｌ／ｌの塩酸と７７０μｌのメタノールを加えて攪拌したものを、ＦＤＡＡ化試料とした。
該ＦＤＡＡ化試料を、ＷＨ−Ｃ１８Ａカラム（日立サイエンスシステムズ、４×１５０ｍｍ）を用いて分析、定量した。ＨＰＬＣ分析の条件には、下記の条件を用いた。
移動相には、５０ｍｍｏｌ／ｌのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ２．７、リン酸でｐＨ調整）とアセトニトリルおよびメタノ−ルの混合比が１８：１：１の移動相Ａ、５０ｍｍｏｌ／ｌのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ２．７、リン酸でｐＨ調整）とアセトニトリルおよびメタノ−ルの混合比が１２：７：１の移動相Ｂ、アセトニトリルとテトラヒドロフランおよびメタノールの混合比が３：１：１の移動相Ｃを用いた。移動相の流速は０．５ｍｌ／ｍｉｎ、移動相Ａと移動相Ｂおよび移動相Ｃの混合比は、０〜２４分は１００：０：０、２４〜５０分は５５：４５：０、５０〜６０分は０：１００：０、６０〜６２分は０：０：１００、６２〜８０分は１００：０：０に変化させた。カラム温度は４０℃、３４０ｎｍの紫外吸収を測定した。
【実施例１】
【０００７】
エシェリヒア・コリＪＭ１０９株由来のＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ遺伝子ｄｄｌＢを発現する形質転換体の造成
エシェリヒア・コリＪＭ１０９株をＬＢ培地［トリプトンペプトン（ディフコ社製）１０ｇ／ｌ、酵母エキス（ディフコ社製）１０ｇ／ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／ｌ］を用いて３０℃で２４時間培養し、培養物を遠心分離して菌体を得た。
該菌体から、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーに記載の方法により、該微生物の染色体ＤＮＡを単離精製した。
エシェリヒア・コリＫ−１２株のＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ遺伝子ｄｄｌＢの塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＮＣ＿０００９１３）に基づき、パーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成機を用いて、配列番号１５および１６で表される塩基配列を有するＤＮＡを合成した。該ＤＮＡをプライマーセットとして用い、エシェリヒア・コリＪＭ１０９株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲは染色体ＤＮＡ０．１μｇ、プライマー各０．５μｍｏｌ／ｌ、ＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）２．５ｕｎｉｔｓ、ＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液５μｌ、ｄｅｏｘｙＮＴＰ各２００μｍｏｌ／ｌを含む反応液５０μｌを用い、９５℃で３分間保温した後、９５℃で３０秒間、４５℃で３０秒間、７２℃で１分間の工程を２５回繰り返し、最後に７２℃で５分間保温することにより行った。
該反応液と等量のＴＥ［１０ｍｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）］飽和フェノール／クロロホルム（１ｖｏｌ／１ｖｏｌ）を添加し、混合した。
該混合液を遠心分離後、得られた上層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離して得られたＤＮＡをＴＥに溶解した。
該ＤＮＡを制限酵素ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、アガロースゲル電気泳動により約０．９ｋｂのＤＮＡ断片を分離し、ゲルから回収してＴＥに溶解した。取得した約０．９ｋｂのＤＮＡ断片、および上記と同様の方法で取得したＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化ｐＥＴ２１ａ（＋）ベクター（ノバジェン社製）を、ライゲーションキット（タカラバイオ社製）を用いて、１６℃で１時間反応させることにより連結した。
該反応液を用いてエシェリヒア・コリＪＭ１０９株を前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体をアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地（ＬＢ培地にアガーを１５ｇ／ｌ含有する）に塗布後、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーからモレキュラー・バイオロジー第３版に記載の方法に従ってプラスミドを抽出し、制限酵素を用いてその構造を解析し、配列番号６で表される塩基配列を有する、ｄｄｌＢ遺伝子を発現するプラスミドｐＥＤｄｌＢを取得したことを確認した。ｐＥＤｄｌＢを保有するエシェリヒア・コリＪＭ１０９株を、エシェリヒア・コリＪＭ１０９／ｐＥＤｄｌＢと命名した。
【実施例２】
【０００８】
エシェリヒア・コリＪＭ１０９株由来のＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ遺伝子ｄｄｌＢを発現する形質転換体の造成（２）
配列番号１７および１８で表される塩基配列を有するＤＮＡを合成した。該ＤＮＡをプライマーセットとして用い、実施例１で調製したエシェリヒア・コリＪＭ１０９株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲは染色体ＤＮＡ ０．１μｇ、プライマー各０．５μｍｏｌ／ｌ、ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績社製）２．５ｕｎｉｔｓ、ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液５μｌ、ｄｅｏｘｙＮＴＰ各２００μｍｏｌ／ｌを含む反応液５０μｌを用い、９４℃で２分間保温した後、９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、６８℃で９０秒間の工程を２５回繰り返し、最後に６８℃で４分間保温することにより行った。
該反応液と等量のＴＥを添加し、混合した後、遠心分離し、得られた上層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離して得られたＤＮＡをＴＥに溶解した。
ノバジェン社製のＸａ／ＬＩＣ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔｓのプロトコールに従い、該溶解液中のＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片をｐＥＴ−３０ Ｘａ／ＬＩＣベクター（ノバジェン社製）に挿入連結した。
該反応液を用いてエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）株を前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体をカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーからモレキュラー・バイオロジー第３版に記載の方法に従ってプラスミドを抽出し、制限酵素を用いてその構造を解析し、ｄｄｌＢ遺伝子を発現するプラスミドｐＥｃ−ｄｄｌＢが取得されていることを確認した。ｐＥｃ−ｄｄｌＢを保有するエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）をエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥｃ−ｄｄｌＢと命名した。
【実施例３】
【０００９】
エシェリヒア・コリＪＭ１０９株由来のＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ遺伝子ｄｄｌＡを発現する形質転換体の造成
実施例１と同様にエシェリヒア・コリＫ−１２株のＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ遺伝子ｄｄｌＡの塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＮＣ＿０００９１３）に基づき、配列番号１９および２０で表される塩基配列を有するＤＮＡを合成した。該ＤＮＡをプライマーセットとして用い、実施例２で調製したエシェリヒア・コリＪＭ１０９株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲは染色体ＤＮＡ ０．１μｇ、プライマー各０．５μｍｏｌ／ｌ、ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績社製）２．５ｕｎｉｔｓ、ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液５μｌ、ｄｅｏｘｙＮＴＰ各２００μｍｏｌ／ｌを含む反応液５０μｌを用い、９４℃で２分間保温した後、９４℃で３０秒間、４５℃で３０秒間、６８℃で９０秒間の工程を２５回繰り返し、最後に６８℃で４分間保温することにより行った。
実施例２と同様の方法により、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片をｐＥＴ−３０ Ｘａ／ＬＩＣベクターと連結して組換え体ＤＮＡを構築し、該組換え体ＤＮＡを用いてエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換することにより、配列番号７で表される塩基配列を有する、ｄｄｌＡ遺伝子を発現するプラスミドｐＥｃ−ｄｄｌＡを取得した。ｐＥｃ−ｄｄｌＡを保有するエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）株をエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥｃ−ｄｄｌＡと命名した。
【実施例４】
【００１０】
オセアノバシルス・イヘイエンシスＨＴＥ８３１株由来のＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ遺伝子を発現する形質転換体の造成
オセアノバシルス・イヘイエンシス（Ｏｓｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｈｅｙｅｎｓｉｓ）ＨＴＥ８３１株（独立行政法人 理化学研究所より購入）をＭｏｄｉｆｉｅｄ Ｈｏｒｉｋｏｓｈｉ−１ ｍｅｄｉｕｍ［グルコース １０ｇ／ｌ、ポリペプトン（日本新薬社製）５ｇ／ｌ、酵母エキス（ディフコ社製）５ｇ／ｌ、塩化ナトリウム １０ｇ／ｌ、リン酸水素二カリウム １ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム・７水和物 ０．２ｇ／ｌ、ｐＨ９．０］を用いて３０℃で２４時間培養した後、公知の方法に従い染色体ＤＮＡを調製した。
オセアノバシルス・イヘイエンシスＨＴＥ８３１株のＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ遺伝子ｄｄｌの塩基配列（ＤＤＢＪのデータベース、ｈｔｔｐ：／／ｇｉｂ．ｇｅｎｅｓ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｓｉｎｇｌｅ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ？ｓｐｉｄ＝Ｏｉｈｅ＿ＨＴＥ８３１に記載）に基づき、配列番号２１および２２で表される塩基配列を有するＤＮＡを合成した。該ＤＮＡをプライマーセットとして用い、上記で調製したオセアノバシルス・イヘイエンシスＨＴＥ８３１株の染色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行った。ＰＣＲは染色体ＤＮＡ ０．１μｇ、プライマー各０．５μｍｏｌ／ｌ、ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ ２．５ｕｎｉｔｓ、ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液５μｌ、ｄｅｏｘｙＮＴＰ各２００μｍｏｌ／ｌを含む反応液５０μｌを用い、９４℃で２分間保温した後、９４℃で３０秒間、４５℃で３０秒間、６８℃で９０秒間の工程を２５回繰り返し、最後に６８℃で４分間保温することにより行った。
実施例３と同様の方法でＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片をｐＥＴ−３０ Ｘａ／ＬＩＣベクターに連結して組換え体ＤＮＡを構築し、該組換え体ＤＮＡを用いてエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換して、配列番号７で表される塩基配列を有する、ｄｄｌ遺伝子を発現するプラスミドｐＯｉ−ｄｄｌＡを取得した。ｐＯｉ−ｄｄｌＡを保有するエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）株をエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＯｉ−ｄｄｌＡと命名した。
【実施例５】
【００１１】
シネコシスティス・エスピー（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．）ＰＰＣ６８０３株由来のＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ遺伝子を発現する形質転換体の造成
実施例２と同様にシネコシスティス・エスピーＰＰＣ６８０６株のＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ遺伝子ｄｄｌの塩基配列［日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）のデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｇｉｂ．ｇｅｎｅｓ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｓｉｎｇｌｅ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ？ｓｐｉｄ＝Ｓｙｎｅ＿ＰＣＣ６８０３）に記載］に基づき、配列番号２３および２４で表される塩基配列を有するＤＮＡを合成した。該ＤＮＡをプライマーセットとして用い、シネコシスティス・エスピーＰＰＣ６８０６株の染色体ＤＮＡ（かずさＤＮＡ研究所より分譲）を鋳型にしてＰＣＲを行った。ＰＣＲは染色体ＤＮＡ ０．１μｇ、プライマー各０．５μｍｏｌ／ｌ、ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ ２．５ｕｎｉｔｓ、ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液５μｌ、ｄｅｏｘｙＮＴＰ各２００μｍｏｌ／ｌを含む反応液５０μｌを用い、９４℃で２分間保温した後、９４℃で３０秒間、４７℃で３０秒間、６８℃で９０秒間の工程を２５回繰り返し、最後に６８℃で４分間保温することにより行った。
実施例２と同様の方法でＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片をｐＥＴ−３０ Ｘａ／ＬＩＣベクターに連結して組換え体ＤＮＡを構築し、該組換え体ＤＮＡを用いてエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換して、配列番号９で表される塩基配列を有する、ｄｄｌＡ遺伝子を発現するプラスミドｐＳｓ−ｄｄｌＡを取得した。ｐＳｓ−ｄｄｌＡを保有するエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）をエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＳｓ−ｄｄｌＡと命名した。
【実施例６】
【００１２】
シュウドモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）ＩＦＯ１２９９６株由来の低基質特異性アミノ酸ラセマーゼ遺伝子を発現する形質転換体の造成
シュウドモナス・プチダＩＦＯ１２９９６株を普通ブイヨン培地（極東製薬工業）を用いて３０℃で２４時間培養し、培養物を遠心分離して菌体を得た。
該菌体から、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーに記載の方法により、該微生物の染色体ＤＮＡを単離精製した。
シュウドモナス・プチダの低基質特異性アミノ酸ラセマーゼ遺伝子の塩基配列（ＷＯ０３／０７４６９０）に基づき、パーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成機を用いて、配列番号２５および２６で表される塩基配列を有するＤＮＡを合成した。該ＤＮＡをプライマーセットとして用い、シュードモナス・プチダＩＦＯ１２９９６株の染色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行った。ＰＣＲは染色体ＤＮＡ ０．１μｇ、プライマー各０．５μｍｏｌ／ｌ、ＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ２．５ｕｎｉｔｓ、ＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液５μｌ、ｄｅｏｘｙＮＴＰ各２００μｍｏｌ／ｌを含む反応液５０μｌを用い、９５℃で３分間保温した後、９５℃で９０秒間、６０℃で６０秒間、７２℃で９０秒間の工程を２５回繰り返し、最後に７２℃で４分間インキュベートすることにより行った。
該反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルムを添加し、混合した後遠心分離し、得られた上層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離して得られたＤＮＡを２０μｌのＴＥに溶解した。
得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化した後、アガロースゲル電気泳動により約１．２ｋｂのＤＮＡ断片を分離、回収してＴＥに溶解した。同様にＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化したｐＳＴＶ２８ベクター（タカラバイオ社製）を調製し、制限酵素で消化した該約１．２ｋｂのＤＮＡ断片とｐＳＴＶ２８ベクターとをライゲーションキットを用いて、１６℃で１時間、連結した。
該反応液を用いてエシェリヒア・コリＪＭ１０９株を前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体を２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーからモレキュラー・バイオロジー第３版に記載の方法に従ってプラスミドを抽出し、制限酵素を用いてその構造を解析し、配列番号１３で表される塩基配列で表されるＤＮＡを有するプラスミドｐＳＴＢＡＲが取得されていることを確認した。
次に、シュウドモナス・プチダの低基質特異性アミノ酸ラセマーゼ遺伝子の塩基配列（ＷＯ０３／０７４６９０）に基づき、配列番号２７および２８で表される塩基配列を有するＤＮＡを合成した。該ＤＮＡをプライマーセットとして用い、上記で取得したｐＳＴＢＡＲを鋳型にしてＰＣＲを行った。ＰＣＲはプラスミドＤＮＡ ０．１μｇ、プライマー各０．５μｍｏｌ／ｌ、ＥｘＴａｑＤＮＡポリメラーゼ２．５ｕｎｉｔｓ、ＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液５μｌ、ｄｅｏｘｙＮＴＰ各２００μｍｏｌ／ｌを含む反応液５０μｌを用い、９５℃で３分間保温した後、９５℃で３０秒間、５８℃で３０秒間、７２℃で９０秒間の工程を２５回繰り返し、最後に７２℃で４分間保温することにより行った。
該反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルムを添加し、混合した後遠心分離し、得られた上層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離して得られたＤＮＡを２０μｌのＴＥに溶解した。
得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＡｆｌＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで部分消化した後、アガロースゲル電気泳動により約１．２ｋｂのＤＮＡ断片を回収してＴＥに溶解した。該溶液５μｌと、ＡｆｌＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化したｐＪＢ８６１ベクター［Ｐｌａｓｍｉｄ，３８，３５−５１（１９９７）］とを、ライゲーションキットを用いて、１６℃で１時間、連結した。
該反応液を用いてエシェリヒア・コリＪＭ１０９株を前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体を５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーからモレキュラー・バイオロジー第３版に記載の方法に従ってプラスミドを抽出し、制限酵素を用いてその構造を解析し、配列番号１３で表される塩基配列を有する、低基質特異性アミノ酸ラセマーゼ遺伝子を発現するプラスミドｐＪＢａｒ１が取得できたことを確認した。ｐＪＢａｒ１を保有するエシェリヒア・コリＪＭ１０９株をエシェリヒア・コリＪＭ１０９／ｐＪＢａｒ１と命名した。
【実施例７】
【００１３】
Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼの調製
実施例１で調製したプラスミドｐＥＤｄｌＢ用いてエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）株を前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーの中から、ｐＥＤｄｌＢを保有するエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）株を取得し、エシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＤｄｌＢと命名した。
エシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＤｄｌＢ株を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地を用いて３７℃で培養し、ＯＤ（６６０ｎｍ）が０．１になった時点でＩＰＴＧを０．１ｍｍｏｌ／ｌになるように添加して、さらに２時間培養した。培養物を遠心分離して得られた菌体を、０．１ｍｏｌ／ｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁後、超音波破砕し、遠心分離して得た上澄みをＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼを含む粗酵素液とした。
【実施例８】
【００１４】
Ｄ−アラニンを基質としたＤ−アラニル−Ｄ−アラニンの製造
実施例７で調製したＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼを含む粗酵素液を蛋白質量として０．４ｍｇ／ｍｌ、１２．５ｍｍｏｌ／ｌのＤ−アラニン、１０ｍｍｏｌ／ｌのＡＴＰ、１０ｍｍｏｌ／ｌの塩化マグネシウム、１０ｍｍｏｌ／ｌの塩化カリウムを含む０．１ｍｏｌ／ｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）からなる反応液０．４ｍｌを調製して、３７℃で５時間反応を行った。反応液をＨＰＬＣにて分析した結果、反応液中に４．７ｍｍｏｌ／ｌのＤ−アラニル−Ｄ−アラニンを検出した。
【実施例９】
【００１５】
Ｄ−セリンを基質としたＤ−セリル−Ｄ−セリンの製造
実施例７で調製したＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼを含む粗酵素液を蛋白質量として０．４ｍｇ／ｍｌ、１２．５ｍｍｏｌ／ｌのＤ−セリン、１０ｍｍｏｌ／ｌのＡＴＰ、１０ｍｍｏｌ／ｌの塩化マグネシウム、１０ｍｍｏｌ／ｌの塩化カリウムを含む０．１ｍｏｌ／ｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）からなる反応液０．４ｍｌを調製して、３７℃で５時間反応を行った。反応液をＨＰＬＣにて分析した結果、反応液中に４ｍｍｏｌ／ｌのＤ−セリル−Ｄ−セリンを検出した。
【実施例１０】
【００１６】
Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼを用いたグリシル−グリシンの製造
実施例７で調製したＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼを含む粗酵素液を蛋白質量として０．５ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｍｏｌ／ｌのグリシン、２０ｍｍｏｌ／ｌのＡＴＰ、２０ｍｍｏｌ／ｌの塩化マグネシウム、１０ｍｍｏｌ／ｌ塩化カリウムを含む０．１ｍｏｌ／ｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）からなる反応液０．１ｍｌを調製して、３７℃で２４時間反応を行った。反応液をＨＰＬＣにて分析した結果、反応液中に４ｍｍｏｌ／ｌのグリシル−グリシンを検出した。
【実施例１１】
【００１７】
Ｄ−システインを基質に用いたＤ−システイニル−Ｄ−システインの製造
実施例７で調製したＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼを含む粗酵素液を蛋白質量として０．５ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｍｏｌ／ｌのＤ−システイン、２０ｍｍｏｌ／ｌのＡＴＰ、２０ｍｍｏｌ／ｌの塩化マグネシウム、１０ｍｍｏｌ／ｌ塩化カリウムを含む０．１ｍｏｌ／ｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）からなる反応液０．１ｍｌを調製して、３７℃で２４時間反応を行った。反応液をＨＰＬＣにて分析した結果、反応液中に３ｍｍｏｌ／ｌのＤ−システイニル−Ｄ−システインを検出した。
【実施例１２】
【００１８】
Ｄ−スレオニンを基質に用いたＤ−スレオニル−Ｄ−スレオニンの製造
実施例７で調製したＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼを含む粗酵素液を蛋白質量として０．５ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｍｏｌ／ｌのＤ−スレオニン、２０ｍｍｏｌ／ｌのＡＴＰ、２０ｍｍｏｌ／ｌの塩化マグネシウム、１０ｍｍｏｌ／ｌ塩化カリウムを含む０．１ｍｏｌ／ｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）からなる反応液０．１ｍｌを調製して、３７℃で２４時間反応を行った。反応液をＨＰＬＣにて分析した結果、反応液中に１ｍｍｏｌ／ｌのＤ−スレオニル−Ｄニスレオニンを検出した。
【実施例１３】
【００１９】
Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼおよび低基質特異性アミノ酸ラセマーゼの調製
実施例６で調製したプラスミドｐＪＢａｒ１を用いて実施例６で作成したエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＤｄｌＢ株を前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーからｐＥＤｄｌＢおよびｐＪＢａｒ１の２つのプラスミドＤＮＡを保有する形質転換体を選択し、該形質転換体をエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＪＢａｒ１，ｐＥＤｄｌＢと命名した。
エシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＪＢａｒ１，ｐＥＤｄｌＢ株を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンと５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地にて３７℃で培養し、ＯＤ（６６０ｎｍ）が０．１になった時点でＩＰＴＧを０．１ｍｍｏｌ／ｌ、ｍ−トリック酸（ｍ−ｔｏｌｉｃ ａｃｉｄ）を３ｍｍｏｌ／ｌになるように添加して、さらに２時間培養を続けた。培養物を遠心分離して得られた菌体を０．１ｍｏｌ／ｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁後、超音波破砕し、遠心分離して得られた上澄みをＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼとアミノ酸ラセマーゼを含む粗酵素液とした。
【実施例１４】
【００２０】
Ｌ−アラニンを基質に用いたＤ−アラニル−Ｄ−アラニンの製造
実施例１３で調製したＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼとアミノ酸ラセマーゼを含む粗酵素液を蛋白質量として０．４ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｍｏｌ／ｌのＬ−アラニン、１０ｍｍｏｌ／ｌのＡＴＰ、１０ｍｍｏｌ／ｌの塩化マグネシウム、１０ｍｍｏｌ／ｌ塩化カリウムを含む０．１ｍｏｌ／ｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）からなる反応液０．４ｍｌを調製して、３７℃で３時間反応を行った。反応液をＨＰＬＣにて分析した結果、反応液中に６．８ｍｍｏｌ／ｌのＤ−アラニル−Ｄ−アラニンを検出した。
【実施例１５】
【００２１】
Ｌ−セリンを基質に用いたＤ−セリル−Ｄ−セリンの製造
実施例１３で調製したＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼとアミノ酸ラセマーゼを含む粗酵素液を蛋白質量として０．４ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｍｏｌ／ｌのＬ−セリン、１０ｍｍｏｌ／ｌのＡＴＰ、１０ｍｍｏｌ／ｌの塩化マグネシウム、１０ｍｍｏｌ／ｌ塩化カリウムを含む０．１ｍｏｌ／ｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）からなる反応液０．４ｍｌを調製して、３７℃で３時間反応を行った。反応液をＨＰＬＣにて分析した結果、反応液中に３ｍｍｏｌ／ｌのＤ−セリル−Ｄ−セリンを検出した。
【実施例１６】
【００２２】
Ｌ−アラニンおよびＬ−セリンを基質に用いたＤ−アラニル−Ｄ−セリンの製造
実施例１３で調製したＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼとアミノ酸ラセマーゼを含む粗酵素液を蛋白質量として０．４ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｍｏｌ／ｌのＬ−アラニン、１０ｍｍｏｌ／ｌのＬ−セリン、１０ｍｍｏｌ／ｌのＡＴＰ、１０ｍｍｏｌ／ｌの塩化マグネシウム、１０ｍｍｏｌ／ｌ塩化カリウムを含む０．１ｍｏｌ／ｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）からなる反応液０．４ｍｌを調製して、３７℃で３時間反応を行った。反応液をＨＰＬＣにて分析した結果、反応液中に４．５ｍｍｏｌ／ｌのＤ−アラニル−Ｄ−セリンと２ｍｍｏｌ／ｌのＤ−アラニル−Ｄ−アラニンを検出した。
【実施例１７】
【００２３】
サーモトーガ・マリティマＡＴＣＣ４３５８９株由来のＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ遺伝子を発現する形質転換体の造成
実施例２と同様にサーモトーガ・マリティマＡＴＣＣ４３５８９株のＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ遺伝子の塩基配列［日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）のデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｇｉｂ．ｇｅｎｅｓ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｃｏｍｍｏｎ／ｉｎｆｏ．ｐｈｐ？ｓｐｉｄ＝Ｔｍａｒ＿ＭＳＢ８＆ｆｔｉｄ＝２６７）に記載］に基づき、配列番号２９および３０で表される塩基配列を有するＤＮＡを合成した。該ＤＮＡをプライマーセットとして用い、サーモトーガ・マリティマＡＴＣＣ４３５８９株の染色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行った。ＰＣＲは染色体ＤＮＡ０．１μｇ、プライマー各０．５μｍｏｌ／ｌ、ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ２．５ｕｎｉｔｓ、ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液５μｌ、ｄｅｏｘｙＮＴＰ各２００μｍｏｌ／ｌを含む反応液５０μｌを用い、９４℃で２分間保温した後、９４℃で３０秒間、４７℃で３０秒間、６８℃で９０秒間の工程を２５回繰り返し、最後に６８℃で４分間保温することにより行った。
実施例２と同様の方法でＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片をｐＥＴ−３０ Ｘａ／ＬＩＣベクターに連結して組換え体ＤＮＡを構築し、該組換え体ＤＮＡを用いてエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換して、配列番号１０で表される塩基配列を有する、Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ遺伝子を発現するプラスミドｐＴｍＤｄｌを取得した。ｐＴｍＤｄｌを保有するエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）をエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴｍＤｄｌと命名した。
【実施例１８】
【００２４】
サーモトーガ・マリティマＡＴＣＣ４３５８９株のＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼを用いたＤ−アミノ酸含有ジペプチドの製造
実施例７と同様の方法で、エシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴｍＤｄｌからサーモトーガ・マリティマＡＴＣＣ４３５８９株由来のＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼを含む粗酵素液を調製した。この粗酵素液を蛋白質量として０．５ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｍｏｌ／ｌのＤ−アラニン、２０ｍｍｏｌ／ｌのＡＴＰ、２０ｍｍｏｌ／ｌの塩化マグネシウム、１０ｍｍｏｌ／ｌ塩化カリウムを含む０．１ｍｏｌ／ｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）からなる反応液０．１ｍｌを調製して、３７℃で５時間反応を行った。反応液をＨＰＬＣにて分析した結果、反応液中に１１ｍｍｏｌ／ｌのＤ−アラニル−Ｄ−アラニンを検出した。同様に、Ｄ−アラニンの代わりにＤ−セリンを用いた場合は９ｍｍｏｌ／ｌのＤ−セリル−Ｄ−セリン、Ｄ−システインを用いた場合は９ｍｍｏｌ／ｌのＤ−システイニル−Ｄ−システイン、Ｄ−スレオニンを用いた場合は４ｍｍｏｌ／ｌのＤ−スレオニル−Ｄ−スレオニン、グリシンを用いた場合は８ｍｍｏｌ／ｌのグリシル−グリシンを検出した。
【産業上の利用可能性】
【００２５】
本発明により、種々のＤ−アミノ酸を含むジペプチドを効率よく製造することができる。
【配列表フリーテキスト】
配列番号１５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素的なジペプチドの製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｄ−アミノ酸を含むジペプチドの製造法としては、化学合成法、酵素法が知られている。化学合成法によるＤ−アミノ酸を含むジペプチドの合成では、官能基の保護・脱保護などの操作が必要であり、またラセミ体も合成されることから、化学合成法は経済的、効率的な方法とはいえない。また、化学合成法は大量の有機溶媒等を使うため環境衛生上も好ましい方法ではない。
酵素法によるＤ−アミノ酸を含むジペプチドの合成に関しては、蛋白質分解酵素（ペプチダ−ゼ）の逆反応を利用した方法（非特許文献１参照）、アミノアシルトランスフェラ−ゼを利用する方法（非特許文献２、３参照）、α−アミノ酸エステラ−ゼを利用する方法（非特許文献４参照）が知られている。
しかし、蛋白質分解酵素の逆反応を利用した方法では、基質となるアミノ酸の官能基の保護・脱保護が必要であり、Ｄ−アミノ酸を含むジペプチド形成反応の効率化およびジペプチド分解反応の阻止が困難といった問題点がある。アミノアシルトランスフェラ−ゼを利用する方法は、基質となるアミノ酸のエステル化が必要であることから、効率的な製造法とはいえない。また、α−アミノ酸エステラ−ゼを利用する方法は、基質となるアミノ酸のエステル化が必要であり、Ｄ−アミノ酸を含むジペプチド形成反応の効率化およびペプチド分解反応の阻止が困難といった問題点がある。
Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンリガ−ゼは、Ｄ−アラニン、またはＤ−アラニンおよびＤ−セリンを基質にして、Ｄ−アラニル−Ｄ−アラニンおよびＤ−アラニル−Ｄ−セリンを生成する活性を有していることが知られている（非特許文献５参照）が、該酵素がＤ−アラニル−Ｄ−アラニンおよびＤ−アラニル−Ｄ−セリン以外のＤ−アミノ酸を含むジペプチドを生成する活性を有していること、および該酵素を生産する能力を有する微生物の培養物を酵素源に用いたＤ−アラニル−Ｄ−アラニンおよびＤ−アラニル−Ｄ−セリン以外のＤ−アミノ酸を含むジペプチドの製造法については知られていない。
Ｄ−アミノ酸を生成する活性を有する蛋白質としては、５−置換−ＤＬ−ヒダントインからＤ−アミノ酸を生成する活性を有するヒダントイナーゼ（非特許文献６）、Ｎ−アシル−ＤＬ−アミノ酸からＤ−アミノ酸を生成する活性を有するＤ−アミノアシラーゼ（非特許文献７参照）、ＤＬ−アミノ酸アミドからＤ−アミノ酸を生成する活性を有するＤ−アミノ酸アミダーゼ（非特許文献８参照）、α−ケト酸からＤ−アミノ酸を生成する活性を有するＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（非特許文献９参照）およびＬ−α−アミノ酸からＤ−アミノ酸を生成する活性を有するアミノ酸ラセマーゼなどが知られている。低基質特異性アミノ酸ラセマーゼは、ＥＣ番号５．１．１．１０に分類される非常に基質特異性の低いラセマーゼであり、各種アミノ酸のラセミ体の工業的製造において有用性の高い酵素である。該酵素を生産する微生物としてはこれまで、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物（非特許文献１０および１１参照）、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物（非特許文献１２参照）が報告されている。しかしながらそれら微生物の活性はしばしば微弱であり、培養方法などや変異株の取得などの方法でこの欠点を十分に補うことは困難である。
低基質特異性アミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質については、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）ＩＦＯ１２９９６株由来の蛋白質について、活性部位のアミノ酸配列が報告されている（非特許文献１３参照）。また、該酵素をコードするＤＮＡを取得し、該ＤＮＡを大腸菌などの微生物に導入し、該酵素を活性のある蛋白質として発現させたとの報告もある（特許文献１参照）。
しかしながら、アミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質とＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ活性を有する蛋白質とを組み合わせて用いることにより、Ｌ−α−アミノ酸を含むアミノ酸からＤ−アミノ酸を含むジペプチドが生成することは知られていない。
【非特許文献１】Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃａｔ．Ｂ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ，６，３７９−３８６（１９９９）
【非特許文献２】Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３１，２４７−２５４（２００２）
【非特許文献３】Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，８９，１９５−３０６（２０００）
【非特許文献４】Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３０，１１９−１２６（２００１）
【非特許文献５】Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ，５，１９７−２０７（１９９８）
【非特許文献６】Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，２３，２１７３−２１８３（１９８１）
【非特許文献７】Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４４，１０８９−１０９５（１９８０）
【非特許文献８】Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１６２，４７０−４７４（１９８９）
【非特許文献９】ＦＥＢＳＬｅｔｔ．，５５，２６５−２６７（１９７５）
【非特許文献１０】ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．，１７Ｂ，６２９−６３６（１９７１）
【非特許文献１１】Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７５，４２１３−４２１７（１９９３）
【非特許文献１２】Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５１，１７３−１８０（１９８７）
【非特許文献１３】Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２３，５１９５−５２０１（１９８４）
【特許文献１】国際公開特許第０３−０７４６９０号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は、Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンリガ−ゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用いた、Ｄ−アラニル−Ｄ−アラニンおよびＤ−アラニル−Ｄ−セリン以外のジペプチドの製造法、およびＤ−アミノ酸を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物およびＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガ−ゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用いたＤ−アミノ酸を含むジペプチドの製造法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、以下の（１）〜（１８）に関する。
（１）Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンリガ−ゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、ＡＴＰ、並びにＤ−アミノ酸およびグリシンから選ばれる１種以上のアミノ酸（ただし、１種以上のアミノ酸が、Ｄ−アラニンのみである場合、並びにＤ−アラニンおよびＤ−セリンからなる場合を除く）を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドを生成、蓄積させ、該水性媒体中から該ジペプチドを採取することを特徴とするジペプチドの製造法。
（２）Ｄ−アミノ酸が、Ｄ−アミノ酸を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用いて製造されることを特徴とする上記（１）の製造法。
（３）Ｄ−アミノ酸を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物およびＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガ−ゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、ＡＴＰ、およびＤ−アミノ酸を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物によってＤ−アミノ酸に変換される物質を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＤ−アミノ酸を含むジペプチドを生成、蓄積させ、該水性媒体中から該ジペプチドを採取することを特徴とするＤ−アミノ酸を含むジペプチドの製造法。
（４）Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンリガ−ゼ活性を有する蛋白質が、以下の［１］〜［３］から選ばれる蛋白質である上記（１）〜（３）のいずれか１つの製造法。
［１］配列番号１〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［２］配列番号１〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガ−ゼ活性を有する蛋白質
［３］配列番号１〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガ−ゼ活性を有する蛋白質
（５）Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンリガ−ゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物が、Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンリガ−ゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる微生物である上記（１）〜（３）のいずれか１つの製造法。
（６）Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンリガ−ゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡが、以下の［１］〜［４］から選ばれるＤＮＡである上記（５）の製造法。
［１］配列番号１〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［２］配列番号６〜１０のいずれかで表される塩基配列を有するＤＮＡ
［３］配列番号６〜１０のいずれかで表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、かつＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガ−ゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［４］配列番号６〜１０のいずれかで表される塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガ−ゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（７）Ｄ−アミノ酸を生産する能力を有する微生物が、ヒダントイナーゼ、Ｄ−アミノアシラーゼ、Ｄ−アミノ酸アミダーゼ、Ｄ−アミノ酸トランスアミナーゼまたはアミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物である上記（２）または（３）の製造法。
（８）アミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質が、低基質特異性アミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質である上記（７）の製造法。
（９）低基質特異性アミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質が、以下の［１］〜［３］から選ばれる蛋白質である上記（８）の製造法。
［１］配列番号１１または１２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［２］配列番号１１または１２で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ低基質特異性アミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質
［３］配列番号１１または１２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ低基質特異性アミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質
（１０）Ｄ−アミノ酸を生産する能力を有する微生物が、ヒダンイトイナーゼ、Ｄ−アミノアシラーゼ、Ｄ−アミノ酸アミダーゼ、Ｄ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼまたはアミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる微生物である上記（２）および（３）の製造法。
（１１）アミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡが、低基質特異性アミノ酸ラセマーゼをコードするＤＮＡである上記（１０）の製造法。
（１２）低基質特異性アミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡが、以下の［１］〜［４］から選ばれるＤＮＡである上記（１１）の製造法。
［１］配列番号１１または１２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［２］配列番号１３または１４で表される塩基配列を有するＤＮＡ
［３］配列番号１３または１４で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、かつ低基質特異性アミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［４］配列番号１３または１４で表される塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつ低基質特異性アミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（１３）Ｄ−アミノ酸およびグリシンから選ばれる１種以上のアミノ酸が、Ｄ−アラニン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−グルタミン酸、グリシン、Ｄ−バリン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−プロリン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−セリン、Ｄ−スレオニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−チロシン、Ｄ−リジン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−アスパラギン酸およびＤ−オルニチンからなる群より選ばれるＤ−アミノ酸（ただし、１種以上のアミノ酸が、Ｄ−アラニンのみである場合、並びにＤ−アラニンおよびＤ−セリンからなる場合を除く）である上記（１）、（２）および（４）〜（６）のいずれか１つの製造法。
（１４）Ｄ−アミノ酸を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物によってＤ−アミノ酸に変換される物質が、１種以上の５−置換−ＤＬ−ヒダントイン、１種以上のＮ−アシル−ＤＬ−アミノ酸、１種以上のＤＬ−アミノ酸アミド、１種以上のα−ケト酸および１種以上のＤ−アミノ酸、または１種以上のＬ−α−アミノ酸を含む１種以上のアミノ酸である上記（３）〜（１２）のいずれか１つの製造法。
（１５）１種以上のＬ−α−アミノ酸を含む１種以上のアミノ酸が、Ｌ体またはＤ体のアラニン、グルタミン、グルタミン酸、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン、チロシン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸およびオルニチン、並びにグリシンからなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸を含む上記（１４）の製造法。
（１６）ジペプチドが、式（Ｉ）
Ｒ１−Ｒ２（Ｉ）
（式中、Ｒ１およびＲ２は同一または異なって、Ｄ体のアラニン、グルタミン、グルタミン酸、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン、チロシン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸若しくはオルニチン、或いはグリシンを表すが、同時にＤ−アラニンを表すこと、およびＲ１がＤ−アラニンである場合にＲ２がＤ−セリンを表すことはない）で表されるジペプチドである上記（１）、（２）および（４）〜（１２）のいずれか１つの製造法。
（１７）Ｄ−アミノ酸を含むジペプチドが、式（ＩＩ）
Ｒ３−Ｒ４（ＩＩ）
（式中、Ｒ３およびＲ４は同一または異なって、Ｌ体またはＤ体のアラニン、グルタミン、グルタミン酸、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン、チロシン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸若しくはオルニチン、或いはグリシンを表すが、同時にＬ体のアミノ酸またはグリシンを表すことはない）で表されるジペプチドである上記（３）〜（１２）のいずれか１つの製造法。
（１８）Ｄ−アミノ酸を含むジペプチドが、式（ＩＩＩ）
Ｒ５−Ｒ６（ＩＩＩ）
（式中、Ｒ５およびＲ６は同一または異なって、Ｄ−アラニン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−バリン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−プロリン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−セリン、Ｄ−スレオニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−チロシン、Ｄ−リジン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−オルニチンまたはグリシンを表すが、同時にグリシンを表すことはない）で表されるジペプチドである上記（３）〜（１２）のいずれか１つの製造法。
【発明の効果】
【０００５】
本発明によれば、Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンリガ−ゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用いた、Ｄ−アラニル−Ｄ−アラニンおよびＤ−アラニル−Ｄ−セリン以外のジペプチドの製造法、およびＤ−アミノ酸を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物およびＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガ−ゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用いたＤ−アミノ酸を含むジペプチドの製造法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
以下に本発明を詳細に説明する。
１．本発明の方法で用いられるＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物
本発明の方法で用いられるＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物は、Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物であれば、いずれの微生物であってもよい。
Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ（ｄｄｌともいう）活性は、多くの微生物が有しており、例えばエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する微生物［日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）に、ｄｄｌＢ遺伝子およびｄｄｌＡ遺伝子を有すると記載されている］、オセアノバシルス（Ｏｓｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物（ＤＤＢＪに、ｄｄｌＡ遺伝子を有すると記載されている）、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｏｃｙｓｔｉｓ）属に属する微生物（ＤＤＢＪに、ｄｄｌＡ遺伝子を有すると記載されている）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物［Ｎａｔｕｒｅ，３９０，２４９−２５６（１９９７）］、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物（ＮＣＢＩ ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＮＯ．ＡＰ００５２８２にＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼおよび該酵素をコードする遺伝子が含まれている）、シュードモナス属に属する微生物［Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４２，７９−８６（１９９６）］、ヘリコバクターに属する微生物［Ｎａｔｕｒｅ，３８８，５３９−５４７（１９９７）］、マイコバクテリウム属に属する微生物［Ｎａｔｕｒｅ，３９３，５３７−５４４（１９９８）］、アラビドプシス属に属する微生物［ＮＣＢＩ ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＮＯ．ＮＭ＿２０２５３０で表される蛋白質はＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼファミリーに属すると記載されている］、サーモトーガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）属に属する微生物（ＤＤＢＪに、Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼをコードする遺伝子を有すると記載されている）などをあげることができ、その他各種公的データベースを該酵素名で検索することにより、Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ活性を有する蛋白質を生産する微生物を得ることができる。
本発明に用いられるより好適な微生物としては、エシェリヒア属に属する微生物、オセアノバシルス属に属する微生物、シネコシスティス属に属する微生物、およびサーモトーガ属に属する微生物をあげることができる。
Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物としては、具体的には以下の［１］〜［３］、
［１］配列番号１〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物、
［２］配列番号１〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ低基質特異性アミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物、および
［３］配列番号１〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有し、かつＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物、
などをあげることができる。
具体的には、配列番号１または２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物であるエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ−１２株、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物であるオセアノバシルス・イヘイエンシス（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｈｅｙｅｎｓｉｓｕ）ＨＴＥ８３１株、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物であるシネコシスティス・エスピー（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．）ＰＣＣ６８０３株、配列番号５で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物であるサーモトーガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）ＡＴＣＣ４３５８９株などをあげることができる。
上記において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物は、該蛋白質を生産する能力を有する微生物であればいずれの微生物であってもよく、例えば該微生物としては、配列番号１〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ、より具体的には配列番号６〜１０のいずれかで表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列を有するＤＮＡの一部、または全部をプローブに用いたサザン解析により取得できる微生物などをあげることができる。上記のプローブに用いるＤＮＡの一部とは、例えば配列番号１〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる蛋白質の活性中心をコードするＤＮＡなどをあげることができる。
上記のサザン解析とは、上記したＤＮＡをプローブに用い、被検微生物の細胞から公知の方法で抽出した染色体ＤＮＡの制限酵素消化物などに対し、サザンハイブリダイゼーションを行い、ポジティブシグナルの有無を調べることである。具体的なサザン解析の手法としては、染色体ＤＮＡの制限酵素消化物を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／ｌのクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄し、洗浄後においてもプローブＤＮＡとハイブリダイズしているＤＮＡを検出する方法をあげることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラー・クローニング第３版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）等に記載されている方法に準じて行うことができる。ハイブリダイズ可能なＤＮＡを有する微生物としては、例えばエシェリヒア属、オセアノバシルス属、シネコシスティス属、またはサーモトーガ属に属する微生物などをあげることができる。
配列番号１〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、かつＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物としては、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３）］やＦＡＳＴＡ［Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０）］を用いて計算したときに、配列番号１〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物をあげることができる。該微生物としては例えばエシェリヒア属、オセアノバシルス属、シネコシスティス属、またはサーモトーガ属に属する微生物をあげることができる。
上記したＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸとよばれるプログラムが開発されており［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）］、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばＳｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とし、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３として塩基配列またはアミノ酸配列の相同性を計算することができる。またＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。
また、本発明の方法で用いられるＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物としては、上記したＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物に対し、通常の変異誘起処理方法、例えば、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンなどの変異剤での処理、ＵＶ照射、γ線照射による変異処理などを行い、Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ活性が親株より上昇した微生物を選択することにより得られる微生物などもあげることができる。Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼの活性は、常法に従い測定することができる。
また、本発明で用いられるＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物としては、Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼをコードするＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる形質転換された微生物をあげることができる。
Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡとしては、上記したＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物であるエシェリヒア属に属する微生物、オセアノバシルス属に属する微生物、シネコシスティス属に属する微生物、バチルス属に属する微生物、コリネバクテリウム属に属する微生物、シュードモナス属に属する微生物、ヘリコバクターに属する微生物、マイコバクテリウム属に属する微生物、アラビドプシス属に属する微生物、およびサーモトーガ属に属する微生物が有するＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼをコードする遺伝子（ｄｄｌ遺伝子）などをあげることができ、該遺伝子の具体的な塩基配列は各種公的データベースから取得することができる。また、本発明により好適に用いられるＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼをコードするＤＮＡとしては、エシェリヒア属、オセアノバシルス属、シネコシスティス属、またはサーモトーガ属に属する微生物由来のＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡをあげることができる。Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡとしては、具体的には以下の［１］〜［４］、
［１］配列番号１〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
［２］配列番号６〜１０のいずれかで表される塩基配列を有するＤＮＡ、
［３］配列番号６〜１０のいずれかで表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、かつＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、および
［４］配列番号６〜１０のいずれかで表される塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
などをあげることができる。
ここでいう「ハイブリダイズする」とは、特定の塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部にＤＮＡがハイブリダイズする工程である。したがって、該特定の塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部の塩基配列は、ノーザンまたはサザンブロット解析のプローブとして有用であるか、またはＰＣＲ解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できる長さのＤＮＡであってもよい。プローブとして用いるＤＮＡとしては、少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上のＤＮＡをあげることができるが、少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上のＤＮＡであってもよい。
ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えば当業者であれば本願明細書に従い、ハイブリダイゼーションの条件を決定することができる。該ハイブリダイゼーションの条件は、モレキュラー・クローニング第２版、第３版（２００１年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｇｙ，ＡＳＭ Ｐｒｅｓ（１９９４）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｍｅｔｈｏｄｓ ｍａｎｕａｌ，Ａｃａｄｅｍｉｃ ｐｒｅｓｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）に記載の他、多数の他の標準的な教科書に従っておこなうことができる。
上記のストリンジェントな条件とは、例えばＤＮＡを固定化したフィルターとプローブＤＮＡとを５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％の硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４２℃で一晩、インキュベートした後、例えば約６５℃の０．２×ＳＳＣ溶液中で該フィルターを洗浄する条件が好ましいが、より低いストリンジェント条件を用いることもできる。ストリンジェンな条件の変更は、ホルムアミドの濃度調整（ホルムアミドの濃度を下げるほど低ストリンジェントになる）、塩濃度および温度条件の変更により可能である。低ストリンジェント条件としては、例えば６×ＳＳＣＥ（２０×ＳＳＣＥは、３ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム、０．２ｍｏｌ／ｌのリン酸二水素ナトリウム、０．０２ｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、０．５％のＳＤＳ、３０％のホルムアミド、１００μｇ／ｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、３７℃で一晩インキュベートした後、５０℃の１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液を用いて洗浄する条件をあげることができる。また、さらに低いストリンジェントな条件としては、上記した低ストリンジェント条件において、高塩濃度（例えば５×ＳＳＣ）の溶液を用いてハイブリダイゼーションを行った後、洗浄する条件をあげることができる。
上記した様々な条件は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加、または変更することにより設定することもできる。上記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。
上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えば上記したＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等を用いて上記したパラメータ等に基づいて計算したときに、配列番号６〜１０のいずれかで表される塩基配列と少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
２．本発明の方法で用いられるＤ−アミノ酸を生産する能力を有する微生物
本発明の方法で用いられるＤ−アミノ酸を生産する能力を有する微生物は、該能力を有する微生物であればいずれでもよく、例えば５−置換−ＤＬ−ヒダントインからＤ−アミノ酸を生成する活性を有するヒダントイナーゼ［Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，２３，２１７３−２１８３（１９８１）］、Ｎ−アシル−ＤＬ−アミノ酸からＤ−アミノ酸を生成する活性を有するＤ−アミノアシラーゼ［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４４，１０８９−１０９５（１９８０）］、ＤＬ−アミノ酸アミドからＤ−アミノ酸を生成する活性を有するＤ−アミノ酸アミダーゼ［Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１６２，４７０−４７４（１９８９）］、α−ケト酸からＤ−アミノ酸を生成する活性を有するＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ［ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，５５，２６５−２６７（１９７５）］またはＬ−ａ−アミノ酸からＤ−アミノ酸を生成する活性を有するアミノ酸ラセマーゼを生産する能力を有する微生物をあげることができ、より好ましくはアミノ酸ラセマーゼを生産する能力を有する微生物、さらに好ましくは、低基質性アミノ酸ラセマーゼを生産する能力を有する微生物をあげることができる。
アミノ酸ラセマーゼを生産する能力を有する微生物としては、例えばエシェリヒア属に属する微生物［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７，１４５３−１４７４（１９９７）］、バチルス属に属する微生物［Ｎａｔｕｒｅ，３９０，２４９−２５６（１９９７）］、シュードモナス属に属する微生物［Ｎａｔｕｒｅ，４０６，９５９−９６４（２０００）］、オセアノバシルス属に属する微生物［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３０，３９２７−３９３５（２００２）］など、低基質特異性アミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物として、例えばシュードモナス属に属する微生物（ＷＯ０３／０７４６９０）などをあげることができ、本発明には低基質特異性アミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物がより好適に用いられる。
低基質特異性アミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物としては、具体的には以下の［１］〜［３］、
［１］配列番号１１または１２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物、
［２］配列番号１１または１２で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ低基質特異性アミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物、および
［３］配列番号１１または１２で表されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有し、かつ低基質特異性アミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物、
などをあげることができる。
具体的には、配列番号１１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物である、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）ＡＴＣＣ４７９５４、配列番号１２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物である、シュードモナス・プチダＩＦＯ１２９９６をあげることができる。
上記において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ低基質特異性アミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物は、該蛋白質を生産する能力を有する微生物であればいずれの微生物であってもよく、例えば該微生物としては、配列番号１１または１２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ、より具体的には配列番号１３または１４で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列を有するＤＮＡの一部、または全部をプローブに用いたサザン解析により取得できる微生物などをあげることができる。上記のプローブに用いるＤＮＡの一部とは、例えば配列番号１１または１２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質の活性中心をコードするＤＮＡをあげることができる。
上記のサザン解析とは、上記したＤＮＡをプローブに用いる以外は、上記１のサザン解析と同じであり、その具体的手法も上記１と同様である。
ハイブリダイズ可能なＤＮＡを有する微生物としては、例えばシュードモナス属に属する微生物などをあげることができる。
配列番号１１または１２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、かつ低基質特異性アミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物としては、上記したＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡを用いて計算したときに、配列番号１１または１２で表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ低基質特異性アミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物をあげることができる。該微生物としてはシュードモナス属に属する微生物をあげることができる。
また、本発明の方法で用いられるＤ−アミノ酸を生産する能力を有する微生物としては、上記したアミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質などを生産する能力を有する微生物に対し、通常の変異誘起処理方法（ア・ショート・コース・イン・バクテリアル・ジェネティクス）、例えば、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンなどの変異剤での処理、ＵＶ照射、γ線照射による変異処理などを行い、アミノ酸ラセマーゼ活性などが親株より上昇した微生物を選択することにより得られる微生物などもあげることができる。Ｄ−アミノ酸を生産する能力、例えばアミノ酸ラセマーゼの活性は、常法に従い測定することができる。
また、本発明で用いられるＤ−アミノ酸を生産する能力を有する微生物としては、ヒダントイナーゼ、Ｄ−アミノアシラーゼ、Ｄ−アミノ酸アミダーゼ、Ｄ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ、またはアミノ酸ラセマーゼをコードするＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる形質転換された微生物をあげることができる。
ヒダントイナーゼをコードするＤＮＡとしては、例えば特開２００２−３３０７８５記載のＤＮＡなど、Ｄ−アミノアシラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡとしては、例えばＢｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５９，２１１５（１９９５）および特開２００１−２７５６８８号記載のＤＮＡなど、Ｄ−アミノ酸アミダーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡとしては、例えばＡｐｐｌｉｅｄ ＆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，６０，８８８−９５（１９９４）に記載のＤＮＡなど、Ｄ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡとしては、例えばＪ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８５，２４１８−２４３１（２００３）、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１３５０，３８−４０（１９９７）に記載のＤＮＡなど、アミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡとしてはエシェリヒア属に属する微生物由来のＤＮＡ［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７，１４５３−１４７４（１９９７）］、バチルス属に属する微生物由来のＤＮＡ［Ｎａｔｕｒｅ，３９０，２４９−２５６（１９９７）］、シュードモナス属に属する微生物由来のＤＮＡ［Ｎａｔｕｒｅ，４０６，９５９−９６４（２０００）］、オセアノバシルス属に属する微生物由来のＤＮＡ［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３０，３９２７−３９３５（２００２）］などが知られており、低基質特異性アミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡとしてはシュードモナス属に属する微生物由来のＤＮＡ（ＷＯ０３／０７４６９０）などをあげることができる他、各種ＤＮＡデータベースを該酵素名等を用いて検索することによりアミノ酸ラセマーゼをコードするＤＮＡの塩基配列を取得することができる。
本発明により好適に用いられる低基質特異性アミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡとしては、具体的には以下の［１］〜［４］、
［１］配列番号１１または１２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
［２］配列番号１３または１４で表される塩基配列を有するＤＮＡ、
［３］配列番号１３または１４で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、かつアミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、および
［４］配列番号１３または１４で表される塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつアミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
などをあげることができる。
上記の「ハイブリダイズする」および「ストリンジェントな条件」の意味は、上記１と同様であり、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ」の具体的な取得方法も上記１と同様である。
上記したストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的には、上記したＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等を用いて上記したパラメータ等に基づいて計算したときに、配列番号１３または１４で表される塩基配列と少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
３．本発明の製造法に用いられるＤＮＡの調製
本発明の製造法に用いられるＤＮＡ、例えばアミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、およびＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼをコードするＤＮＡは、以下のようにして調製することができる。
アミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡは、公的なＤＮＡのデータベース、例えばＧｅｎＢａｎｋなどにアミノ酸ラセマーゼをコードする遺伝子として登録されている塩基配列、または配列番号１３若しくは１４で表される塩基配列に基づき設計することができるプローブを用いた、微生物、好ましくはシュードモナス属に属する微生物の染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション、あるいは上記した公知のアミノ酸ラセマーゼをコードする遺伝子または配列番号１３若しくは１４で表される塩基配列に基づき設計することができるプライマーＤＮＡを用いた、微生物、好ましくはシュードモナス属に属する微生物の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ［ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９０）］により取得することができる。
Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼをコードするＤＮＡは、公的なＤＮＡのデータベース、例えばＧｅｎＢａｎｋなどにＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼをコードする遺伝子として登録されている塩基配列、または配列番号６〜１０のいずれかで表される塩基配列に基づき設計することができるプローブを用いた、微生物、好ましくはエシェリヒア属、オセアノバシルス属、シネコシスティス属、もしくはサーモトーガ属に属する微生物の染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション、あるいは上記した公知のＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼをコードする遺伝子または配列番号６〜１０のいずれかで表される塩基配列に基づき設計することができるプライマーＤＮＡを用いた、微生物、好ましくはエシェリヒア属、オセアノバシルス属、シネコシスティス属、もしくはサーモトーガ属に属する微生物の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより取得することができる。
また、各種の遺伝子配列データベースに対して公知のアミノ酸ラセマーゼをコードする遺伝子または配列番号１３若しくは１４、または公知のＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼをコードする遺伝子若しくは配列番号６〜１０のいずれかで表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列と６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性を有する配列を検索し、該検索によって得られた塩基配列に基づき、該塩基配列を有する生物の染色体ＤＮＡ、ｃＤＮＡライブラリー等から上記した方法によりアミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、またはＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを取得することもできる。
該ＤＮＡをそのまま、あるいは適当な制限酵素などで切断し、常法によりベクターに組み込み、得られた組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入した後、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキシ法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７）］あるいは３７３Ａ・ＤＮＡシークエンサー（パーキン・エルマー社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
塩基配列を決定した結果、取得されたＤＮＡが部分長であった場合は、該部分長ＤＮＡをプローブに用いた、染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション法等により、全長ＤＮＡを取得することができる。
更に、決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、パーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成装置等を用いて化学合成することにより目的とするＤＮＡを調製することもできる。
上記のようにして取得されるアミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号１３または１４で表される塩基配列を有するＤＮＡをあげることができ、Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼをコードするＤＮＡとしては、たとえば配列番号６〜１０のいずれかで表される塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。
４．本発明に用いられるＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる微生物の調製
本発明に用いられるＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる微生物、例えばアミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる微生物、Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる微生物は、上記３で得られるＤＮＡを常法にて宿主細胞に導入することで取得できる。該微生物は、アミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡおよびＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡのいずれか１つを有している微生物であってもよいし、２つのＤＮＡを同時に有する微生物であっても本発明の方法に用いることができる。
上記３で取得したＤＮＡをもとにして、必要に応じて、蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。また、該蛋白質をコードする部分の塩基配列を、宿主の発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換することにより、該蛋白質の生産率を向上させた微生物を調製することができる。
該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換え体ＤＮＡを作製する。
該組換え体ＤＮＡを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、本発明の蛋白質を生産する形質転換体を得ることができる。
宿主細胞としては、目的とする遺伝子を発現できる微生物であればいずれも用いることができる。
発現ベクターとしては、微生物内において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、本発明のＤＮＡまたは本発明の製造法に用いられるＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、アミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、またはＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ（以下、アミノ酸ラセマーゼまたはＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼをコードするＤＮＡと略す）を有する組換え体ＤＮＡは、原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明のＤＮＡまたは本発明の製造法に用いられるＤＮＡ、転写終結配列より構成された組換え体ＤＮＡであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
発現ベクターとしては、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリンガーマンハイム社製）、ｐＨｅｌｉｘ１（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）、ｐＫＫ２３３−２（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（プロメガ社製）、ｐＱＥ−８（キアゲン社製）、ｐＥＴ−３、ｐＥＴ−３０ Ｘａ／ＬＩＣ（いずれもノバジェン社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）］、ｐＬＳＡ１［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）］、ｐＧＥＬ１［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ（−）（ストラタジーン社製）、ｐＴｒＳ３０［エシェリヒア・コリ ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０７）より調製］、ｐＴｒＳ３２［エシェリヒア・コリ ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０８）より調製］、ｐＰＡＣ３１（ＷＯ９８／１２３４３）、ｐＵＣ１９［Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）］、ｐＳＴＶ２８（タカラバイオ社製）、ｐＵＣ１１８（タカラバイオ社製）、ｐＰＡ１（特開昭６３−２３３７９８）、ｐＪＢ８６１［Ｐｌａｓｍｉｄ，３８，３５−５１（１９９７）］等を例示することができる。
プロモーターとしては、エシェリヒア・コリ等の宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター、Ｐｍプロモーター等をあげることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔＩプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
またコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物中で発現させるためのＰ５４−６プロモーター［Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５３，６７４−６７９（２０００）］なども用いることができる。
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
アミノ酸ラセマーゼ、またはＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼをコードするＤＮＡを発現ベクターに結合させた組換え体ＤＮＡにおいては、転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
このような組換え体ＤＮＡとしては、例えば後述するｐＪＢａｒ１およびｐＥＤｄｌＢをあげることができる。
原核生物としては、エシェリヒア属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、バチルス属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ミクロバクテリウム属（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アリシクロバチルス属（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アナベナ（Ａｎａｂｅｎａ）属、アナシスティス（Ａｎａｃｙｓｔｉｓ）属、アスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）属、クロマチウム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ）属、エルビニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、フォルミディウム（Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ）属、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）属、ロドシュードモナス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ロドスピリウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属、セネデスムス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、シネコッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｃｕｓ）属、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属等に属する微生物、例えば、エシェリヒア・コリＸＬ１−Ｂｌｕｅ、エシェリヒア・コリ ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、エシェリヒア・コリ ＤＨ１、エシェリヒア・コリ ＤＨ５α、エシェリヒア・コリ ＭＣ１０００、エシェリヒア・コリ ＫＹ３２７６、エシェリヒア・コリ Ｗ１４８５、エシェリヒア・コリ ＪＭ１０９、エシェリヒア・コリ ＨＢ１０１、エシェリヒア・コリ Ｎｏ．４９、エシェリヒア・コリ Ｗ３１１０、エシェリヒア・コリ ＮＹ４９、エシェリヒア・コリ ＭＰ３４７、エシェリヒア・コリ ＮＭ５２２、エシェリヒア・コリ ＢＬ２１（ＤＥ３）、バチルス・サチリス ＡＴＣＣ３３７１２、バチルス・メガテリウム、バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＦＥＲＭ ＢＰ−６０３０、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、ブレビバクテリウム・イマリオフィルム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ）ＡＴＣＣ１４０６８、ブレビバクテリウム・サッカロリティカム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１４０６６、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）ＡＴＣＣ１４０６７、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＡＴＣＣ１３８６９、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３０３２、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４２９７、コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）ＡＴＣＣ１３８７０、ミクロバクテリウム・アンモニアフィルム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ）ＡＴＣＣ１５３５４、セラチア・フィカリア（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ）、セラチア・フォンチコラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ）、セラチア・リケファシエンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）Ｄ−０１１０、アグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、アグロバクテリウム・リゾジーン（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）、アグロバクテリウム・ルビ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｕｂｉ）、アナベナ・シリンドリカ（Ａｎａｂａｅｎａ ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａ）、アナベナ・ドリオルム（Ａｎａｂａｅｎａ ｄｏｌｉｏｌｕｍ）、アナベナ・フロスアクア（Ａｎａｂａｅｎａ ｆｌｏｓ−ａｑｕａｅ）、アースロバクター・オーレッセンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ａｕｒｅｓｃｅｎｓ）、アースロバクター・シトレウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｉｔｒｅｕｓ）、アースロバクター・グロブフォルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｆｏｒｍｉｓ）、アースロバクター・ヒドロカーボグルタミカス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｇｌｕｔａｍｉｃｕｓ）、アースロバクター・ミソレンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｍｙｓｏｒｅｎｓ）、アースロバクター・ニコチアナ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ）、アースロバクター・パラフィネウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｒａｆｆｉｎｅｕｓ）、アースロバクター・プロトフォルミエ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐｒｏｔｏｐｈｏｒｍｉａｅ）、アースロバクター・ロセオパラフィナス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｒｏｓｅｏｐａｒａｆｆｉｎｕｓ）、アースロバクター・スルフレウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｌｆｕｒｅｕｓ）、アースロバクター・ウレアファシエンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）、クロマチウム・ブデリ（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｂｕｄｅｒｉ）、クロマチウム・テピダム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｔｅｐｉｄｕｍ）、クロマチウム・ビノサム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ）、クロマチウム・ワーミンギ（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｗａｒｍｉｎｇｉｉ）、クロマチウム・フルビアタティレ（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｆｌｕｖｉａｔｉｌｅ）、エルビニア・ウレドバラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｕｒｅｄｏｖｏｒａ）、エルビニア・カロトバラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）、エルビニア・アナス（Ｅｒｗｉｎｉａ ａｎａｎａｓ）、エルビニア・ヘリコラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）、エルビニア・パンクタタ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｐｕｎｃｔａｔａ）、エルビニア・テレウス（Ｅｒｗｉｎｉａ ｔｅｒｒｅｕｓ）、メチロバクテリウム・ロデシアナム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｏｄｅｓｉａｎｕｍ）、メチロバクテリウム・エクソトルクエンス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）、フォルミディウム・エスピー（Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ ｓｐ．）ＡＴＣＣ２９４０９、ロドバクター・カプスラタス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、ロドシュードモナス・ブラスチカ（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｌａｓｔｉｃａ）、ロドシュードモナス・マリナ（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍａｒｉｎａ）、ロドシュードモナス・パルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）、ロドスピリウム・リブラム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ）、ロドスピリウム・サレキシゲンス（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓａｌｅｘｉｇｅｎｓ）、ロドスピリウム・サリナラム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓａｌｉｎａｒｕｍ）、ストレプトマイセス・アンボファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ）、ストレプトマイセス・オーレオファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）、ストレプトマイセス・アウレウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｕｒｅｕｓ）、ストレプトマイセス・フンジシディカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ）、ストレプトマイセス・グリセオクロモゲナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ、ストレプトマイセス・オリボグリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｌｉｖｏｇｒｉｓｅｕｓ）、ストレプトマイセス・ラメウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒａｍｅｕｓ）、ストレプトマイセス・タナシエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔａｎａｓｈｉｅｎｓｉｓ）、ストレプトマイセス・ビナセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｎａｃｅｕｓ）、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）等をあげることができる。
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４）、エレクトロポレーション法［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６，６１２７（１９８８）］等をあげることができる。
５．本発明の方法で基質として用いられるアミノ酸
本発明の方法で基質として用いられるＤ−アミノ酸およびグリシンから選ばれる１種以上のアミノ酸は、１種以上のアミノ酸が、Ｄ−アラニンのみである場合、並びにＤ−アラニンおよびＤ−セリンからなる場合を除き、Ｄ−アミノ酸およびグリシンから選ばれる１種以上のアミノ酸であればいずれのアミノ酸でもよく、好ましくはＤ−アラニン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−グルタミン酸、グリシン、Ｄ−バリン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−プロリン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−セリン、Ｄ−スレオニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−チロシン、Ｄ−リジン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−オルニチンおよびその誘導体からなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸をあげることができ、好ましくは、Ｄ−アラニン、グリシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−プロリン、Ｄ−セリン、Ｄ−スレオニン、Ｄ−システインおよびＤ−リジンから選ばれる１種以上のアミノ酸をあげることができる。上記Ｄ−アミノ酸は、いずれの方法で入手できるＤ−アミノ酸であってもよく、市販のＤ−アミノ酸、または化学合成法若しくはＤ−アミノ酸を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用いて製造したＤ−アミノ酸であってもよい。
本発明で基質として用いられるＤ−アミノ酸を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物によってＤ−アミノ酸に変換される物質は、該微生物の培養物または該培養物の処理物によって、Ｄ−アミノ酸に変換される物質であればいずれでもよく、例えばＤ−アミノ酸を生産する能力を有する微生物としてヒダントイナーゼを生産する能力を有する微生物を用いる場合は、１種以上の５−置換−ＤＬ−ヒダントインなど、Ｄ−アミノアシラーゼを生産する能力を有する微生物を用いる場合は、１種以上のＮ−アシル−ＤＬ−アミノ酸など、Ｄ−アミノ酸アミダーゼを生産する能力を有する微生物を用いる場合は、１種以上のＤＬ−アミノ酸アミドなど、Ｄ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼを生産する能力を有する微生物を用いる場合は、１種以上のα−ケト酸および１種以上のＤ−アミノ酸など、アミノ酸ラセマーゼを生産する能力を有する微生物を用いる場合は、１種以上のＬ−α−アミノ酸などをあげることができる。
上記Ｌ−α−アミノ酸は、アミノ酸ラセマーゼの基質となる限りにおいて、天然物、非天然物またはそれらの誘導体であってもよい。
また、低基質特性アミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物を用いる場合の基質としては、１種以上のＬ−α−アミノ酸を含む１種以上のアミノ酸をあげることができる。
１種以上のＬ−α−アミノ酸を含む１種以上のアミノ酸は、１種以上のＬ−α−アミノ酸を含む１種以上のアミノ酸であれば、いずれのアミノ酸のいずれの組み合わせであってもよく、好ましくはＬ−α−アミノ酸およびグリシンから選ばれる、１種以上のＬ−α−アミノ酸を含む１種または２種のアミノ酸をあげることができる。
該Ｌ−α−アミノ酸としては、例えばＬ−α−アラニン、Ｌ−α−グルタミン、Ｌ−α−グルタミン酸、Ｌ−α−バリン、Ｌ−α−ロイシン、Ｌ−α−イソロイシン、Ｌ−α−プロリン、Ｌ−α−フェニルアラニン、Ｌ−α−トリプトファン、Ｌ−α−メチオニン、Ｌ−α−セリン、Ｌ−α−スレオニン、Ｌ−α−システイン、Ｌ−α−アスパラギン、Ｌ−α−チロシン、Ｌ−α−リジン、Ｌ−α−アルギニン、Ｌ−α−ヒスチジン、Ｌ−α−アスパラギン酸、Ｌ−α−オルニチンおよびそれらの誘導体をあげることができる。
上記したＬ−α−アミノ酸と組み合わせて用いることができるアミノ酸としては、アミノ酸であればいずれでもよい。
該アミノ酸としては、例えばＬ体またはＤ体のアラニン、グルタミン、グルタミン酸、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン、チロシン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸およびオルニチン、並びグリシンから選ばれるアミノ酸をあげるが、これらのアミノ酸の誘導体であってもよい。
上記したアミノ酸の誘導体としては、例えばヒドロキシアミノ酸（β−ヒドロキシグルタミン、β−ヒドロキシグルタミン酸、γ−ヒドロキシグルタミン酸、α−ヒドロキシグリシン、β−ヒドロキシバリン、γ−ヒドロキシバリン、β−ヒドロキシロイシン、γ−ヒドロキシロイシン、δ−ヒドロキシロイシン、β−ヒドロキシイソロイシン、γ−ヒドロキシイソロイシン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン、β−ヒドロキシフェニルアラニン、３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン、２，４，５−トリヒドロキシフェニルアラニン、β−ヒドロキシトリプトファン、５−ヒドロキシトリプトファン、α−ヒドロキシメチオニン、β−ヒドロキシセリン、γ−ヒドロキシスレオニン、Ｓ−ヒドロキシシステイン、β−ヒドロキシアスパラギン、β−ヒドロキシチロシン、β−ヒドロキシリジン、γ−ヒドロキシリジン、δ−ヒドロキシリジン、Ｎ−ヒドロキシリジン、β−ヒドロキシアルギニン、δ−ヒドロキシアルギニン、Ｎ−ヒドロキシアルギニン、β−ヒドロキシヒスチジン、β−ヒドロキシアスパラギン酸、β−ヒドロキシオルニチン、γ−ヒドロキシオルニチン、Ｎ−ヒドロキシオルニチン）、Ｎ−メチルアミノ酸（Ｎ−メチル−アラニン、Ｎ−メチル−グルタミン、Ｎ−メチル−グルタミン酸、Ｎ−メチル−グリシン、Ｎ−メチル−バリン、Ｎ−メチル−ロイシン、Ｎ−メチル−イソロイシン、Ｎ−メチル−プロリン、Ｎ−メチル−フェニルアラニン、Ｎ−メチル−トリプトファン、Ｎ−メチル−メチオニン、Ｎ−メチル−セリン、Ｎ−メチル−スレオニン、Ｎ−メチル−システイン、Ｎ−メチル−アスパラギン、Ｎ−メチル−チロシン、Ｎ−メチル−リジン、Ｎ−メチル−アルギニン、Ｎ−メチル−ヒスチジン、Ｎ−メチル−アスパラギン酸、Ｎ−メチル−オルニチン）などをあげることができる。
６．本発明の製造法
本発明の製造法は、（１）Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンリガ−ゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、ＡＴＰ、並びにＤ−アミノ酸およびグリシンから選ばれる１種以上のアミノ酸（ただし、１種以上のアミノ酸が、Ｄ−アラニンのみである場合、並びにＤ−アラニンおよびＤ−セリンからなる場合を除く）を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドを生成、蓄積させ、該水性媒体中から該ジペプチドを採取することを特徴とするジペプチドの製造法、および（２）Ｄ−アミノ酸を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物およびＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガ−ゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、ＡＴＰおよびＤ−アミノ酸を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物によってＤ−アミノ酸に変換される物質を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＤ−アミノ酸を含むジペプチドを生成、蓄積させ、該水性媒体中から該ジペプチドを採取することを特徴とするＤ−アミノ酸を含むジペプチドの製造法に関する。
本発明の方法で用いる酵素源は、Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンリガ−ゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物、Ｄ−アミノ酸を生産する能力を有する微生物、またはＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガ−ゼ活性を有する蛋白質を生産する能力およびＤ−アミノ酸を生産する能力の２つの能力を同時に有する微生物を培地に培養することで取得することができる。
該微生物を培養する培地としては、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該微生物の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、該微生物が資化し得るものであればよく、グルコ−ス、フラクト−ス、スクロ−ス、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノ−ル、プロパノ−ル等のアルコ−ル類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸または有機酸のアンモニウム塩、含窒素化合物、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コ−ンスチ−プリカ−、カゼイン加水分解物、大豆粕、大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化物等を用いることができる。
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は１５〜６０℃がよく、培養時間は、通常５時間〜７日間である。培養中ｐＨは４〜１０に保持する。ｐＨの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を、Ｐｍプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはｍ−トリック酸（ｍ−ｔｏｌｉｃ ａｃｉｄ）を培地に添加してもよい。
培養物の処理物としては、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物および該菌体の固定化物などの生菌体を含む処理物、ならびに該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、該菌体の蛋白質分画物、および該菌体より抽出、精製して得られる酵素標品などをあげることができる。
上記（１）および（２）の方法で用いられるＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ活性を有する微生物の培養物または該培養物の処理物は、１種または２種のＤ−アミノ酸から３０℃で１分間に１ｍｍｏｌのＤ−アミノ酸を含むジペプチドを生成することのできる活性を１単位（Ｕ）として、１ｍＵ／ｌ〜１０００Ｕ／ｌであり、好ましくは１０ｍＵ／ｌ〜１００Ｕ／ｌの濃度で用いる。
上記（２）の方法で用いられるＤ−アミノ酸を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物は、３０℃で１分間に１ｍｍｏｌのＤ−アミノ酸を生成することのできる活性を１単位（Ｕ）として、１ｍＵ／ｌ〜１０００Ｕ／ｌであり、好ましくは１０ｍＵ／１〜１００Ｕ／ｌの濃度で用いることができる。
基質として用いられるＤ−アミノ酸およびグリシンから選ばれる１種以上のアミノ酸、またはＤ−アミノ酸を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物によってＤ−アミノ酸に変換される物質は、全量として１〜５００ｇ／ｌの濃度で用いる。
上記（１）および（２）の方法で用いられる水性媒体としては、水、りん酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ほう酸塩、クエン酸塩、トリスなどの緩衝液、メタノ−ル、エタノ−ルなどのアルコ−ル類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類、アセトアミドなどのアミド類などをあげることができる。また、酵素源として用いた微生物の培養液を水性媒体として用いることができる。
上記（１）および（２）の方法では、必要に応じて界面活性剤あるいは有機溶媒を添加してもよい。界面活性剤としては、ポリオキシエチレン・オクタデシルアミン（例えばナイミ−ンＳ−２１５、日本油脂社製）などの非イオン界面活性剤、セチルトリメチルアンモニウム・ブロマイドやアルキルジメチル・ベンジルアンモニウムクロライド（例えばカチオンＦ２−４０Ｅ、日本油脂社製）などのカチオン系界面活性剤、ラウロイル・ザルコシネ−トなどのアニオン系界面活性剤、アルキルジメチルアミン（例えば三級アミンＦＢ、日本油脂社製）などの三級アミン類など、ジペプチドの生成反応を妨げないものであればいずれでもよく、１種または数種を混合して使用することもできる。界面活性剤は、通常０．１〜５０ｇ／ｌの濃度で用いられる。有機溶媒としては、キシレン、トルエン、脂肪族アルコ−ル、アセトン、酢酸エチルなどが挙げられ、通常０．１〜５０ｍｌ／ｌの濃度で用いられる。
上記（１）および（２）の反応は、水性媒体中、ｐＨ５〜１０、好ましくはｐＨ６〜９、２０〜６０℃の条件で１〜９６時間行う。
上記（１）の方法で製造されるジペプチドとしては、上記式（Ｉ）（式中、Ｒ１およびＲ２は同一或いは異なって、Ｄ体のアラニン、グルタミン、グルタミン酸、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン、チロシン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸若しくはオルニチン、またはグリシンを表し、好ましくはＤ体のアラニン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、セリン、スレオニン、システイン若しくはリジン、またはグリシンを表すが、同時にＤ−アラニンを表すこと、およびＲ１がＤ−アラニンである場合にＲ２がＤ−セリンを表すことはない）で表されるジペプチドをあげることができる。
また、上記（２）の方法で製造されるジペプチドとしては、上記式（ＩＩ）（式中、Ｒ３およびＲ４は同一或いは異なって、Ｌ体またはＤ体のアラニン、グルタミン、グルタミン酸、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン、チロシン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸若しくはオルニチン、またはグリシンを表し、好ましくはアラニン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、セリン、スレオニン、システイン若しくはリジン、またはグリシン表すが、同時にＬ体のアミノ酸またはグリシンを表すことはない）で表されるジペプチド、より好ましくは、上記式（ＩＩＩ）（式中、Ｒ５およびＲ６は同一または異なって、Ｄ−アラニン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−バリン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−プロリン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−セリン、Ｄ−スレオニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−チロシン、Ｄ−リジン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−オルニチンまたはグリシンを表し、さらに好ましくはＤ−アラニン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−プロリン、Ｄ−セリン、Ｄ−スレオニン、Ｄ−システイン若しくはＤ−リジンまたはグリシン表すが、同時にグリシンを表すことはない）で表されるジペプチドをあげることができる。
水性媒体中に生成したジペプチドの採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の単離および精製方法によって行うことができる。
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
なお、以下の実施例においてジペプチドおよびアミノ酸の分析、定量は以下に示す高速液体クロマトグラフィ−（ＨＰＬＣ）を用いる方法により行った。
ジペプチドおよびアミノ酸は、（２，３−ジニトロ−５−フルオロフェニル）−Ｌ−アラニンアミドナトリウム（Ｎａ−ＦＤＡＡ）を用いて誘導体化した後にＨＰＬＣで分析した。ＦＤＡＡを用いた誘導体化は、純水で希釈した試料１００μｌに、５０μｌの０．５％のＮａ−ＦＤＡＡアセトン溶液と４０μｌの０．５ｍｏｌ／ｌの炭酸ナトリウム水溶液を加えて攪拌した後、４０℃で６０分間静置することにより行った。
次に、４０μｌの１ｍｏｌ／ｌの塩酸と７７０μｌのメタノールを加えて攪拌したものを、ＦＤＡＡ化試料とした。
該ＦＤＡＡ化試料を、ＷＨ−Ｃ１８Ａカラム（日立サイエンスシステムズ、４×１５０ｍｍ）を用いて分析、定量した。ＨＰＬＣ分析の条件には、下記の条件を用いた。
移動相には、５０ｍｍｏｌ／ｌのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ２．７、リン酸でｐＨ調整）とアセトニトリルおよびメタノ−ルの混合比が１８：１：１の移動相Ａ、５０ｍｍｏｌ／ｌのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ２．７、リン酸でｐＨ調整）とアセトニトリルおよびメタノ−ルの混合比が１２：７：１の移動相Ｂ、アセトニトリルとテトラヒドロフランおよびメタノールの混合比が３：１：１の移動相Ｃを用いた。移動相の流速は０．５ｍｌ／ｍｉｎ、移動相Ａと移動相Ｂおよび移動相Ｃの混合比は、０〜２４分は１００：０：０、２４〜５０分は５５：４５：０、５０〜６０分は０：１００：０、６０〜６２分は０：０：１００、６２〜８０分は１００：０：０に変化させた。カラム温度は４０℃、３４０ｎｍの紫外吸収を測定した。
【実施例１】
【０００７】
エシェリヒア・コリＪＭ１０９株由来のＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ遺伝子ｄｄｌＢを発現する形質転換体の造成
エシェリヒア・コリＪＭ１０９株をＬＢ培地［トリプトンペプトン（ディフコ社製）１０ｇ／ｌ、酵母エキス（ディフコ社製）１０ｇ／ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／ｌ］を用いて３０℃で２４時間培養し、培養物を遠心分離して菌体を得た。
該菌体から、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーに記載の方法により、該微生物の染色体ＤＮＡを単離精製した。
エシェリヒア・コリＫ−１２株のＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ遺伝子ｄｄｌＢの塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＮＣ＿０００９１３）に基づき、パーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成機を用いて、配列番号１５および１６で表される塩基配列を有するＤＮＡを合成した。該ＤＮＡをプライマーセットとして用い、エシェリヒア・コリＪＭ１０９株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲは染色体ＤＮＡ０．１μｇ、プライマー各０．５μｍｏｌ／ｌ、ＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）２．５ｕｎｉｔｓ、ＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液５μｌ、ｄｅｏｘｙＮＴＰ各２００μｍｏｌ／ｌを含む反応液５０μｌを用い、９５℃で３分間保温した後、９５℃で３０秒間、４５℃で３０秒間、７２℃で１分間の工程を２５回繰り返し、最後に７２℃で５分間保温することにより行った。
該反応液と等量のＴＥ［１０ｍｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）］飽和フェノール／クロロホルム（１ｖｏｌ／１ｖｏｌ）を添加し、混合した。
該混合液を遠心分離後、得られた上層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離して得られたＤＮＡをＴＥに溶解した。
該ＤＮＡを制限酵素ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、アガロースゲル電気泳動により約０．９ｋｂのＤＮＡ断片を分離し、ゲルから回収してＴＥに溶解した。取得した約０．９ｋｂのＤＮＡ断片、および上記と同様の方法で取得したＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化ｐＥＴ２１ａ（＋）ベクター（ノバジェン社製）を、ライゲーションキット（タカラバイオ社製）を用いて、１６℃で１時間反応させることにより連結した。
該反応液を用いてエシェリヒア・コリＪＭ１０９株を前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体をアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地（ＬＢ培地にアガーを１５ｇ／ｌ含有する）に塗布後、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーからモレキュラー・バイオロジー第３版に記載の方法に従ってプラスミドを抽出し、制限酵素を用いてその構造を解析し、配列番号６で表される塩基配列を有する、ｄｄｌＢ遺伝子を発現するプラスミドｐＥＤｄｌＢを取得したことを確認した。ｐＥＤｄｌＢを保有するエシェリヒア・コリＪＭ１０９株を、エシェリヒア・コリＪＭ１０９／ｐＥＤｄｌＢと命名した。
【実施例２】
【０００８】
エシェリヒア・コリＪＭ１０９株由来のＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ遺伝子ｄｄｌＢを発現する形質転換体の造成（２）
配列番号１７および１８で表される塩基配列を有するＤＮＡを合成した。該ＤＮＡをプライマーセットとして用い、実施例１で調製したエシェリヒア・コリＪＭ１０９株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲは染色体ＤＮＡ ０．１μｇ、プライマー各０．５μｍｏｌ／ｌ、ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績社製）２．５ｕｎｉｔｓ、ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液５μｌ、ｄｅｏｘｙＮＴＰ各２００μｍｏｌ／ｌを含む反応液５０μｌを用い、９４℃で２分間保温した後、９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、６８℃で９０秒間の工程を２５回繰り返し、最後に６８℃で４分間保温することにより行った。
該反応液と等量のＴＥを添加し、混合した後、遠心分離し、得られた上層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離して得られたＤＮＡをＴＥに溶解した。
ノバジェン社製のＸａ／ＬＩＣ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔｓのプロトコールに従い、該溶解液中のＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片をｐＥＴ−３０ Ｘａ／ＬＩＣベクター（ノバジェン社製）に挿入連結した。
該反応液を用いてエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）株を前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体をカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーからモレキュラー・バイオロジー第３版に記載の方法に従ってプラスミドを抽出し、制限酵素を用いてその構造を解析し、ｄｄｌＢ遺伝子を発現するプラスミドｐＥｃ−ｄｄｌＢが取得されていることを確認した。ｐＥｃ−ｄｄｌＢを保有するエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）をエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥｃ−ｄｄｌＢと命名した。
【実施例３】
【０００９】
エシェリヒア・コリＪＭ１０９株由来のＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ遺伝子ｄｄｌＡを発現する形質転換体の造成
実施例１と同様にエシェリヒア・コリＫ−１２株のＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ遺伝子ｄｄｌＡの塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＮＣ＿０００９１３）に基づき、配列番号１９および２０で表される塩基配列を有するＤＮＡを合成した。該ＤＮＡをプライマーセットとして用い、実施例２で調製したエシェリヒア・コリＪＭ１０９株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲは染色体ＤＮＡ ０．１μｇ、プライマー各０．５μｍｏｌ／ｌ、ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績社製）２．５ｕｎｉｔｓ、ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液５μｌ、ｄｅｏｘｙＮＴＰ各２００μｍｏｌ／ｌを含む反応液５０μｌを用い、９４℃で２分間保温した後、９４℃で３０秒間、４５℃で３０秒間、６８℃で９０秒間の工程を２５回繰り返し、最後に６８℃で４分間保温することにより行った。
実施例２と同様の方法により、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片をｐＥＴ−３０ Ｘａ／ＬＩＣベクターと連結して組換え体ＤＮＡを構築し、該組換え体ＤＮＡを用いてエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換することにより、配列番号７で表される塩基配列を有する、ｄｄｌＡ遺伝子を発現するプラスミドｐＥｃ−ｄｄｌＡを取得した。ｐＥｃ−ｄｄｌＡを保有するエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）株をエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥｃ−ｄｄｌＡと命名した。
【実施例４】
【００１０】
オセアノバシルス・イヘイエンシスＨＴＥ８３１株由来のＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ遺伝子を発現する形質転換体の造成
オセアノバシルス・イヘイエンシス（Ｏｓｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｈｅｙｅｎｓｉｓ）ＨＴＥ８３１株（独立行政法人 理化学研究所より購入）をＭｏｄｉｆｉｅｄ Ｈｏｒｉｋｏｓｈｉ−１ ｍｅｄｉｕｍ［グルコース １０ｇ／ｌ、ポリペプトン（日本新薬社製）５ｇ／ｌ、酵母エキス（ディフコ社製）５ｇ／ｌ、塩化ナトリウム １０ｇ／ｌ、リン酸水素二カリウム １ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム・７水和物 ０．２ｇ／ｌ、ｐＨ９．０］を用いて３０℃で２４時間培養した後、公知の方法に従い染色体ＤＮＡを調製した。
オセアノバシルス・イヘイエンシスＨＴＥ８３１株のＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ遺伝子ｄｄｌの塩基配列（ＤＤＢＪのデータベース、ｈｔｔｐ：／／ｇｉｂ．ｇｅｎｅｓ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｓｉｎｇｌｅ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ？ｓｐｉｄ＝Ｏｉｈｅ＿ＨＴＥ８３１に記載）に基づき、配列番号２１および２２で表される塩基配列を有するＤＮＡを合成した。該ＤＮＡをプライマーセットとして用い、上記で調製したオセアノバシルス・イヘイエンシスＨＴＥ８３１株の染色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行った。ＰＣＲは染色体ＤＮＡ ０．１μｇ、プライマー各０．５μｍｏｌ／ｌ、ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ ２．５ｕｎｉｔｓ、ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液５μｌ、ｄｅｏｘｙＮＴＰ各２００μｍｏｌ／ｌを含む反応液５０μｌを用い、９４℃で２分間保温した後、９４℃で３０秒間、４５℃で３０秒間、６８℃で９０秒間の工程を２５回繰り返し、最後に６８℃で４分間保温することにより行った。
実施例３と同様の方法でＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片をｐＥＴ−３０ Ｘａ／ＬＩＣベクターに連結して組換え体ＤＮＡを構築し、該組換え体ＤＮＡを用いてエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換して、配列番号７で表される塩基配列を有する、ｄｄｌ遺伝子を発現するプラスミドｐＯｉ−ｄｄｌＡを取得した。ｐＯｉ−ｄｄｌＡを保有するエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）株をエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＯｉ−ｄｄｌＡと命名した。
【実施例５】
【００１１】
シネコシスティス・エスピー（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．）ＰＰＣ６８０３株由来のＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ遺伝子を発現する形質転換体の造成
実施例２と同様にシネコシスティス・エスピーＰＰＣ６８０６株のＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ遺伝子ｄｄｌの塩基配列［日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）のデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｇｉｂ．ｇｅｎｅｓ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｓｉｎｇｌｅ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ？ｓｐｉｄ＝Ｓｙｎｅ＿ＰＣＣ６８０３）に記載］に基づき、配列番号２３および２４で表される塩基配列を有するＤＮＡを合成した。該ＤＮＡをプライマーセットとして用い、シネコシスティス・エスピーＰＰＣ６８０６株の染色体ＤＮＡ（かずさＤＮＡ研究所より分譲）を鋳型にしてＰＣＲを行った。ＰＣＲは染色体ＤＮＡ ０．１μｇ、プライマー各０．５μｍｏｌ／ｌ、ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ ２．５ｕｎｉｔｓ、ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液５μｌ、ｄｅｏｘｙＮＴＰ各２００μｍｏｌ／ｌを含む反応液５０μｌを用い、９４℃で２分間保温した後、９４℃で３０秒間、４７℃で３０秒間、６８℃で９０秒間の工程を２５回繰り返し、最後に６８℃で４分間保温することにより行った。
実施例２と同様の方法でＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片をｐＥＴ−３０ Ｘａ／ＬＩＣベクターに連結して組換え体ＤＮＡを構築し、該組換え体ＤＮＡを用いてエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換して、配列番号９で表される塩基配列を有する、ｄｄｌＡ遺伝子を発現するプラスミドｐＳｓ−ｄｄｌＡを取得した。ｐＳｓ−ｄｄｌＡを保有するエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）をエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＳｓ−ｄｄｌＡと命名した。
【実施例６】
【００１２】
シュウドモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）ＩＦＯ１２９９６株由来の低基質特異性アミノ酸ラセマーゼ遺伝子を発現する形質転換体の造成
シュウドモナス・プチダＩＦＯ１２９９６株を普通ブイヨン培地（極東製薬工業）を用いて３０℃で２４時間培養し、培養物を遠心分離して菌体を得た。
該菌体から、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーに記載の方法により、該微生物の染色体ＤＮＡを単離精製した。
シュウドモナス・プチダの低基質特異性アミノ酸ラセマーゼ遺伝子の塩基配列（ＷＯ０３／０７４６９０）に基づき、パーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成機を用いて、配列番号２５および２６で表される塩基配列を有するＤＮＡを合成した。該ＤＮＡをプライマーセットとして用い、シュードモナス・プチダＩＦＯ１２９９６株の染色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行った。ＰＣＲは染色体ＤＮＡ ０．１μｇ、プライマー各０．５μｍｏｌ／ｌ、ＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ２．５ｕｎｉｔｓ、ＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液５μｌ、ｄｅｏｘｙＮＴＰ各２００μｍｏｌ／ｌを含む反応液５０μｌを用い、９５℃で３分間保温した後、９５℃で９０秒間、６０℃で６０秒間、７２℃で９０秒間の工程を２５回繰り返し、最後に７２℃で４分間インキュベートすることにより行った。
該反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルムを添加し、混合した後遠心分離し、得られた上層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離して得られたＤＮＡを２０μｌのＴＥに溶解した。
得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化した後、アガロースゲル電気泳動により約１．２ｋｂのＤＮＡ断片を分離、回収してＴＥに溶解した。同様にＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化したｐＳＴＶ２８ベクター（タカラバイオ社製）を調製し、制限酵素で消化した該約１．２ｋｂのＤＮＡ断片とｐＳＴＶ２８ベクターとをライゲーションキットを用いて、１６℃で１時間、連結した。
該反応液を用いてエシェリヒア・コリＪＭ１０９株を前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体を２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーからモレキュラー・バイオロジー第３版に記載の方法に従ってプラスミドを抽出し、制限酵素を用いてその構造を解析し、配列番号１３で表される塩基配列で表されるＤＮＡを有するプラスミドｐＳＴＢＡＲが取得されていることを確認した。
次に、シュウドモナス・プチダの低基質特異性アミノ酸ラセマーゼ遺伝子の塩基配列（ＷＯ０３／０７４６９０）に基づき、配列番号２７および２８で表される塩基配列を有するＤＮＡを合成した。該ＤＮＡをプライマーセットとして用い、上記で取得したｐＳＴＢＡＲを鋳型にしてＰＣＲを行った。ＰＣＲはプラスミドＤＮＡ ０．１μｇ、プライマー各０．５μｍｏｌ／ｌ、ＥｘＴａｑＤＮＡポリメラーゼ２．５ｕｎｉｔｓ、ＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液５μｌ、ｄｅｏｘｙＮＴＰ各２００μｍｏｌ／ｌを含む反応液５０μｌを用い、９５℃で３分間保温した後、９５℃で３０秒間、５８℃で３０秒間、７２℃で９０秒間の工程を２５回繰り返し、最後に７２℃で４分間保温することにより行った。
該反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルムを添加し、混合した後遠心分離し、得られた上層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離して得られたＤＮＡを２０μｌのＴＥに溶解した。
得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＡｆｌＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで部分消化した後、アガロースゲル電気泳動により約１．２ｋｂのＤＮＡ断片を回収してＴＥに溶解した。該溶液５μｌと、ＡｆｌＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化したｐＪＢ８６１ベクター［Ｐｌａｓｍｉｄ，３８，３５−５１（１９９７）］とを、ライゲーションキットを用いて、１６℃で１時間、連結した。
該反応液を用いてエシェリヒア・コリＪＭ１０９株を前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体を５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーからモレキュラー・バイオロジー第３版に記載の方法に従ってプラスミドを抽出し、制限酵素を用いてその構造を解析し、配列番号１３で表される塩基配列を有する、低基質特異性アミノ酸ラセマーゼ遺伝子を発現するプラスミドｐＪＢａｒ１が取得できたことを確認した。ｐＪＢａｒ１を保有するエシェリヒア・コリＪＭ１０９株をエシェリヒア・コリＪＭ１０９／ｐＪＢａｒ１と命名した。
【実施例７】
【００１３】
Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼの調製
実施例１で調製したプラスミドｐＥＤｄｌＢ用いてエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）株を前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーの中から、ｐＥＤｄｌＢを保有するエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）株を取得し、エシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＤｄｌＢと命名した。
エシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＤｄｌＢ株を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地を用いて３７℃で培養し、ＯＤ（６６０ｎｍ）が０．１になった時点でＩＰＴＧを０．１ｍｍｏｌ／ｌになるように添加して、さらに２時間培養した。培養物を遠心分離して得られた菌体を、０．１ｍｏｌ／ｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁後、超音波破砕し、遠心分離して得た上澄みをＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼを含む粗酵素液とした。
【実施例８】
【００１４】
Ｄ−アラニンを基質としたＤ−アラニル−Ｄ−アラニンの製造
実施例７で調製したＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼを含む粗酵素液を蛋白質量として０．４ｍｇ／ｍｌ、１２．５ｍｍｏｌ／ｌのＤ−アラニン、１０ｍｍｏｌ／ｌのＡＴＰ、１０ｍｍｏｌ／ｌの塩化マグネシウム、１０ｍｍｏｌ／ｌの塩化カリウムを含む０．１ｍｏｌ／ｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）からなる反応液０．４ｍｌを調製して、３７℃で５時間反応を行った。反応液をＨＰＬＣにて分析した結果、反応液中に４．７ｍｍｏｌ／ｌのＤ−アラニル−Ｄ−アラニンを検出した。
【実施例９】
【００１５】
Ｄ−セリンを基質としたＤ−セリル−Ｄ−セリンの製造
実施例７で調製したＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼを含む粗酵素液を蛋白質量として０．４ｍｇ／ｍｌ、１２．５ｍｍｏｌ／ｌのＤ−セリン、１０ｍｍｏｌ／ｌのＡＴＰ、１０ｍｍｏｌ／ｌの塩化マグネシウム、１０ｍｍｏｌ／ｌの塩化カリウムを含む０．１ｍｏｌ／ｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）からなる反応液０．４ｍｌを調製して、３７℃で５時間反応を行った。反応液をＨＰＬＣにて分析した結果、反応液中に４ｍｍｏｌ／ｌのＤ−セリル−Ｄ−セリンを検出した。
【実施例１０】
【００１６】
Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼを用いたグリシル−グリシンの製造
実施例７で調製したＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼを含む粗酵素液を蛋白質量として０．５ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｍｏｌ／ｌのグリシン、２０ｍｍｏｌ／ｌのＡＴＰ、２０ｍｍｏｌ／ｌの塩化マグネシウム、１０ｍｍｏｌ／ｌ塩化カリウムを含む０．１ｍｏｌ／ｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）からなる反応液０．１ｍｌを調製して、３７℃で２４時間反応を行った。反応液をＨＰＬＣにて分析した結果、反応液中に４ｍｍｏｌ／ｌのグリシル−グリシンを検出した。
【実施例１１】
【００１７】
Ｄ−システインを基質に用いたＤ−システイニル−Ｄ−システインの製造
実施例７で調製したＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼを含む粗酵素液を蛋白質量として０．５ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｍｏｌ／ｌのＤ−システイン、２０ｍｍｏｌ／ｌのＡＴＰ、２０ｍｍｏｌ／ｌの塩化マグネシウム、１０ｍｍｏｌ／ｌ塩化カリウムを含む０．１ｍｏｌ／ｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）からなる反応液０．１ｍｌを調製して、３７℃で２４時間反応を行った。反応液をＨＰＬＣにて分析した結果、反応液中に３ｍｍｏｌ／ｌのＤ−システイニル−Ｄ−システインを検出した。
【実施例１２】
【００１８】
Ｄ−スレオニンを基質に用いたＤ−スレオニル−Ｄ−スレオニンの製造
実施例７で調製したＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼを含む粗酵素液を蛋白質量として０．５ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｍｏｌ／ｌのＤ−スレオニン、２０ｍｍｏｌ／ｌのＡＴＰ、２０ｍｍｏｌ／ｌの塩化マグネシウム、１０ｍｍｏｌ／ｌ塩化カリウムを含む０．１ｍｏｌ／ｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）からなる反応液０．１ｍｌを調製して、３７℃で２４時間反応を行った。反応液をＨＰＬＣにて分析した結果、反応液中に１ｍｍｏｌ／ｌのＤ−スレオニル−Ｄニスレオニンを検出した。
【実施例１３】
【００１９】
Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼおよび低基質特異性アミノ酸ラセマーゼの調製
実施例６で調製したプラスミドｐＪＢａｒ１を用いて実施例６で作成したエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＤｄｌＢ株を前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーからｐＥＤｄｌＢおよびｐＪＢａｒ１の２つのプラスミドＤＮＡを保有する形質転換体を選択し、該形質転換体をエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＪＢａｒ１，ｐＥＤｄｌＢと命名した。
エシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＪＢａｒ１，ｐＥＤｄｌＢ株を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンと５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地にて３７℃で培養し、ＯＤ（６６０ｎｍ）が０．１になった時点でＩＰＴＧを０．１ｍｍｏｌ／ｌ、ｍ−トリック酸（ｍ−ｔｏｌｉｃ ａｃｉｄ）を３ｍｍｏｌ／ｌになるように添加して、さらに２時間培養を続けた。培養物を遠心分離して得られた菌体を０．１ｍｏｌ／ｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁後、超音波破砕し、遠心分離して得られた上澄みをＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼとアミノ酸ラセマーゼを含む粗酵素液とした。
【実施例１４】
【００２０】
Ｌ−アラニンを基質に用いたＤ−アラニル−Ｄ−アラニンの製造
実施例１３で調製したＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼとアミノ酸ラセマーゼを含む粗酵素液を蛋白質量として０．４ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｍｏｌ／ｌのＬ−アラニン、１０ｍｍｏｌ／ｌのＡＴＰ、１０ｍｍｏｌ／ｌの塩化マグネシウム、１０ｍｍｏｌ／ｌ塩化カリウムを含む０．１ｍｏｌ／ｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）からなる反応液０．４ｍｌを調製して、３７℃で３時間反応を行った。反応液をＨＰＬＣにて分析した結果、反応液中に６．８ｍｍｏｌ／ｌのＤ−アラニル−Ｄ−アラニンを検出した。
【実施例１５】
【００２１】
Ｌ−セリンを基質に用いたＤ−セリル−Ｄ−セリンの製造
実施例１３で調製したＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼとアミノ酸ラセマーゼを含む粗酵素液を蛋白質量として０．４ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｍｏｌ／ｌのＬ−セリン、１０ｍｍｏｌ／ｌのＡＴＰ、１０ｍｍｏｌ／ｌの塩化マグネシウム、１０ｍｍｏｌ／ｌ塩化カリウムを含む０．１ｍｏｌ／ｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）からなる反応液０．４ｍｌを調製して、３７℃で３時間反応を行った。反応液をＨＰＬＣにて分析した結果、反応液中に３ｍｍｏｌ／ｌのＤ−セリル−Ｄ−セリンを検出した。
【実施例１６】
【００２２】
Ｌ−アラニンおよびＬ−セリンを基質に用いたＤ−アラニル−Ｄ−セリンの製造
実施例１３で調製したＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼとアミノ酸ラセマーゼを含む粗酵素液を蛋白質量として０．４ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｍｏｌ／ｌのＬ−アラニン、１０ｍｍｏｌ／ｌのＬ−セリン、１０ｍｍｏｌ／ｌのＡＴＰ、１０ｍｍｏｌ／ｌの塩化マグネシウム、１０ｍｍｏｌ／ｌ塩化カリウムを含む０．１ｍｏｌ／ｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）からなる反応液０．４ｍｌを調製して、３７℃で３時間反応を行った。反応液をＨＰＬＣにて分析した結果、反応液中に４．５ｍｍｏｌ／ｌのＤ−アラニル−Ｄ−セリンと２ｍｍｏｌ／ｌのＤ−アラニル−Ｄ−アラニンを検出した。
【実施例１７】
【００２３】
サーモトーガ・マリティマＡＴＣＣ４３５８９株由来のＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ遺伝子を発現する形質転換体の造成
実施例２と同様にサーモトーガ・マリティマＡＴＣＣ４３５８９株のＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ遺伝子の塩基配列［日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）のデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｇｉｂ．ｇｅｎｅｓ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｃｏｍｍｏｎ／ｉｎｆｏ．ｐｈｐ？ｓｐｉｄ＝Ｔｍａｒ＿ＭＳＢ８＆ｆｔｉｄ＝２６７）に記載］に基づき、配列番号２９および３０で表される塩基配列を有するＤＮＡを合成した。該ＤＮＡをプライマーセットとして用い、サーモトーガ・マリティマＡＴＣＣ４３５８９株の染色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行った。ＰＣＲは染色体ＤＮＡ０．１μｇ、プライマー各０．５μｍｏｌ／ｌ、ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ２．５ｕｎｉｔｓ、ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液５μｌ、ｄｅｏｘｙＮＴＰ各２００μｍｏｌ／ｌを含む反応液５０μｌを用い、９４℃で２分間保温した後、９４℃で３０秒間、４７℃で３０秒間、６８℃で９０秒間の工程を２５回繰り返し、最後に６８℃で４分間保温することにより行った。
実施例２と同様の方法でＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片をｐＥＴ−３０ Ｘａ／ＬＩＣベクターに連結して組換え体ＤＮＡを構築し、該組換え体ＤＮＡを用いてエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換して、配列番号１０で表される塩基配列を有する、Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼ遺伝子を発現するプラスミドｐＴｍＤｄｌを取得した。ｐＴｍＤｄｌを保有するエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）をエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴｍＤｄｌと命名した。
【実施例１８】
【００２４】
サーモトーガ・マリティマＡＴＣＣ４３５８９株のＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼを用いたＤ−アミノ酸含有ジペプチドの製造
実施例７と同様の方法で、エシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴｍＤｄｌからサーモトーガ・マリティマＡＴＣＣ４３５８９株由来のＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガーゼを含む粗酵素液を調製した。この粗酵素液を蛋白質量として０．５ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｍｏｌ／ｌのＤ−アラニン、２０ｍｍｏｌ／ｌのＡＴＰ、２０ｍｍｏｌ／ｌの塩化マグネシウム、１０ｍｍｏｌ／ｌ塩化カリウムを含む０．１ｍｏｌ／ｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）からなる反応液０．１ｍｌを調製して、３７℃で５時間反応を行った。反応液をＨＰＬＣにて分析した結果、反応液中に１１ｍｍｏｌ／ｌのＤ−アラニル−Ｄ−アラニンを検出した。同様に、Ｄ−アラニンの代わりにＤ−セリンを用いた場合は９ｍｍｏｌ／ｌのＤ−セリル−Ｄ−セリン、Ｄ−システインを用いた場合は９ｍｍｏｌ／ｌのＤ−システイニル−Ｄ−システイン、Ｄ−スレオニンを用いた場合は４ｍｍｏｌ／ｌのＤ−スレオニル−Ｄ−スレオニン、グリシンを用いた場合は８ｍｍｏｌ／ｌのグリシル−グリシンを検出した。
【産業上の利用可能性】
【００２５】
本発明により、種々のＤ−アミノ酸を含むジペプチドを効率よく製造することができる。
【配列表フリーテキスト】
配列番号１５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンリガ−ゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、ＡＴＰ、並びにＤ−アミノ酸およびグリシンから選ばれる１種以上のアミノ酸（ただし、１種以上のアミノ酸が、Ｄ−アラニンのみである場合、並びにＤ−アラニンおよびＤ−セリンからなる場合を除く）を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドを生成、蓄積させ、該水性媒体中から該ジペプチドを採取することを特徴とするジペプチドの製造法。
【請求項２】
Ｄ−アミノ酸が、Ｄ−アミノ酸を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用いて製造されることを特徴とする請求項１記載の製造法。
【請求項３】
Ｄ−アミノ酸を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物およびＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガ−ゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、ＡＴＰ、およびＤ−アミノ酸を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物によってＤ−アミノ酸に変換される物質を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＤ−アミノ酸を含むジペプチドを生成、蓄積させ、該水性媒体中から該ジペプチドを採取することを特徴とするＤ−アミノ酸を含むジペプチドの製造法。
【請求項４】
Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンリガ−ゼ活性を有する蛋白質が、以下の［１］〜［３］から選ばれる蛋白質である請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造法。
［１］配列番号１〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［２］配列番号１〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガ−ゼ活性を有する蛋白質
［３］配列番号１〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガ−ゼ活性を有する蛋白質
【請求項５】
Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンリガ−ゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物が、Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンリガ−ゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる微生物である請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項６】
Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンリガ−ゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡが、以下の［１］〜［４］から選ばれるＤＮＡである請求項５記載の製造法。
［１］配列番号１〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［２］配列番号６〜１０のいずれかで表される塩基配列を有するＤＮＡ
［３］配列番号６〜１０のいずれかで表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、かつＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガ−ゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［４］配列番号６〜１０のいずれかで表される塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガ−ゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
【請求項７】
Ｄ−アミノ酸を生産する能力を有する微生物が、ヒダントイナーゼ、Ｄ−アミノアシラーゼ、Ｄ−アミノ酸アミダーゼ、Ｄ−アミノ酸トランスアミナーゼまたはアミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物である請求項２または３記載の製造法。
【請求項８】
アミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質が、低基質特異性アミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質である請求項７記載の製造法。
【請求項９】
低基質特異性アミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質が、以下の［１］〜［３］から選ばれる蛋白質である請求項８記載の製造法。
［１］配列番号１１または１２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［２］配列番号１１または１２で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ低基質特異性アミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質
［３］配列番号１１または１２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ低基質特異性アミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質
【請求項１０】
Ｄ−アミノ酸を生産する能力を有する微生物が、ヒダンイトイナーゼ、Ｄ−アミノアシラーゼ、Ｄ−アミノ酸アミダーゼ、Ｄ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼまたはアミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる微生物である請求項２および３記載の製造法。
【請求項１１】
アミノ酸ラセマ−ゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡが、低基質特異性アミノ酸ラセマーゼをコードするＤＮＡである請求項１０記載の製造法。
【請求項１２】
低基質特異性アミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡが、以下の［１］〜［４］から選ばれるＤＮＡである請求項１１記載の製造法。
［１］配列番号１１または１２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［２］配列番号１３または１４で表される塩基配列を有するＤＮＡ
［３］配列番号１３または１４で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、かつ低基質特異性アミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［４］配列番号１３または１４で表される塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつ低基質特異性アミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
【請求項１３】
Ｄ−アミノ酸およびグリシンから選ばれる１種以上のアミノ酸が、Ｄ−アラニン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−グルタミン酸、グリシン、Ｄ−バリン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−プロリン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−セリン、Ｄ−スレオニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−チロシン、Ｄ−リジン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−アスパラギン酸およびＤ−オルニチンからなる群より選ばれるＤ−アミノ酸（ただし、１種以上のアミノ酸が、Ｄ−アラニンのみである場合、並びにＤ−アラニンおよびＤ−セリンからなる場合を除く）である請求項１、２および４〜６のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項１４】
Ｄ−アミノ酸を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物によってＤ−アミノ酸に変換される物質が、１種以上の５−置換−ＤＬ−ヒダントイン、１種以上のＮ−アシル−ＤＬ−アミノ酸、１種以上のＤＬ−アミノ酸アミド、１種以上のα−ケト酸および１種以上のＤ−アミノ酸、または１種以上のＬ−α−アミノ酸を含む１種以上のアミノ酸である請求項３〜１２のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項１５】
１種以上のＬ−α−アミノ酸を含む１種以上のアミノ酸が、Ｌ体またはＤ体のアラニン、グルタミン、グルタミン酸、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン、チロシン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸およびオルニチン、並びにグリシンからなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸を含む請求項１４記載の製造法。
【請求項１６】
ジペプチドが、式（Ｉ）
Ｒ１−Ｒ２（Ｉ）
（式中、Ｒ１およびＲ２は同一または異なって、Ｄ体のアラニン、グルタミン、グルタミン酸、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン、チロシン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸若しくはオルニチン、或いはグリシンを表すが、同時にＤ−アラニンを表すこと、およびＲ１がＤ−アラニンである場合にＲ２がＤ−セリンを表すことはない）で表されるジペプチドである請求項１、２および４〜１２のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項１７】
Ｄ−アミノ酸を含むジペプチドが、式（ＩＩ）
Ｒ３−Ｒ４（ＩＩ）
（式中、Ｒ３およびＲ４は同一または異なって、Ｌ体またはＤ体のアラニン、グルタミン、グルタミン酸、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン、チロシン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸若しくはオルニチン、或いはグリシンを表すが、同時にＬ体のアミノ酸またはグリシンを表すことはない）で表されるジペプチドである請求項３〜１２のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項１８】
Ｄ−アミノ酸を含むジペプチドが、式（ＩＩＩ）
Ｒ５−Ｒ６（ＩＩＩ）
（式中、Ｒ５およびＲ６は同一または異なって、Ｄ−アラニン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−バリン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−プロリン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−セリン、Ｄ−スレオニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−チロシン、Ｄ−リジン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−オルニチンまたはグリシンを表すが、同時にグリシンを表すことはない）で表されるジペプチドである請求項３〜１２のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項１】
Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンリガ−ゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、ＡＴＰ、並びにＤ−アミノ酸およびグリシンから選ばれる１種以上のアミノ酸（ただし、１種以上のアミノ酸が、Ｄ−アラニンのみである場合、並びにＤ−アラニンおよびＤ−セリンからなる場合を除く）を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドを生成、蓄積させ、該水性媒体中から該ジペプチドを採取することを特徴とするジペプチドの製造法。
【請求項２】
Ｄ−アミノ酸が、Ｄ−アミノ酸を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用いて製造されることを特徴とする請求項１記載の製造法。
【請求項３】
Ｄ−アミノ酸を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物およびＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガ−ゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、ＡＴＰ、およびＤ−アミノ酸を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物によってＤ−アミノ酸に変換される物質を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＤ−アミノ酸を含むジペプチドを生成、蓄積させ、該水性媒体中から該ジペプチドを採取することを特徴とするＤ−アミノ酸を含むジペプチドの製造法。
【請求項４】
Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンリガ−ゼ活性を有する蛋白質が、以下の［１］〜［３］から選ばれる蛋白質である請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造法。
［１］配列番号１〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［２］配列番号１〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガ−ゼ活性を有する蛋白質
［３］配列番号１〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガ−ゼ活性を有する蛋白質
【請求項５】
Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンリガ−ゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物が、Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンリガ−ゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる微生物である請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項６】
Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンリガ−ゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡが、以下の［１］〜［４］から選ばれるＤＮＡである請求項５記載の製造法。
［１］配列番号１〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［２］配列番号６〜１０のいずれかで表される塩基配列を有するＤＮＡ
［３］配列番号６〜１０のいずれかで表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、かつＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガ−ゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［４］配列番号６〜１０のいずれかで表される塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつＤ−アラニン−Ｄ−アラニンリガ−ゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
【請求項７】
Ｄ−アミノ酸を生産する能力を有する微生物が、ヒダントイナーゼ、Ｄ−アミノアシラーゼ、Ｄ−アミノ酸アミダーゼ、Ｄ−アミノ酸トランスアミナーゼまたはアミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物である請求項２または３記載の製造法。
【請求項８】
アミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質が、低基質特異性アミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質である請求項７記載の製造法。
【請求項９】
低基質特異性アミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質が、以下の［１］〜［３］から選ばれる蛋白質である請求項８記載の製造法。
［１］配列番号１１または１２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［２］配列番号１１または１２で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ低基質特異性アミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質
［３］配列番号１１または１２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ低基質特異性アミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質
【請求項１０】
Ｄ−アミノ酸を生産する能力を有する微生物が、ヒダンイトイナーゼ、Ｄ−アミノアシラーゼ、Ｄ−アミノ酸アミダーゼ、Ｄ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼまたはアミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる微生物である請求項２および３記載の製造法。
【請求項１１】
アミノ酸ラセマ−ゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡが、低基質特異性アミノ酸ラセマーゼをコードするＤＮＡである請求項１０記載の製造法。
【請求項１２】
低基質特異性アミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡが、以下の［１］〜［４］から選ばれるＤＮＡである請求項１１記載の製造法。
［１］配列番号１１または１２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［２］配列番号１３または１４で表される塩基配列を有するＤＮＡ
［３］配列番号１３または１４で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、かつ低基質特異性アミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［４］配列番号１３または１４で表される塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつ低基質特異性アミノ酸ラセマーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
【請求項１３】
Ｄ−アミノ酸およびグリシンから選ばれる１種以上のアミノ酸が、Ｄ−アラニン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−グルタミン酸、グリシン、Ｄ−バリン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−プロリン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−セリン、Ｄ−スレオニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−チロシン、Ｄ−リジン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−アスパラギン酸およびＤ−オルニチンからなる群より選ばれるＤ−アミノ酸（ただし、１種以上のアミノ酸が、Ｄ−アラニンのみである場合、並びにＤ−アラニンおよびＤ−セリンからなる場合を除く）である請求項１、２および４〜６のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項１４】
Ｄ−アミノ酸を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物によってＤ−アミノ酸に変換される物質が、１種以上の５−置換−ＤＬ−ヒダントイン、１種以上のＮ−アシル−ＤＬ−アミノ酸、１種以上のＤＬ−アミノ酸アミド、１種以上のα−ケト酸および１種以上のＤ−アミノ酸、または１種以上のＬ−α−アミノ酸を含む１種以上のアミノ酸である請求項３〜１２のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項１５】
１種以上のＬ−α−アミノ酸を含む１種以上のアミノ酸が、Ｌ体またはＤ体のアラニン、グルタミン、グルタミン酸、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン、チロシン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸およびオルニチン、並びにグリシンからなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸を含む請求項１４記載の製造法。
【請求項１６】
ジペプチドが、式（Ｉ）
Ｒ１−Ｒ２（Ｉ）
（式中、Ｒ１およびＲ２は同一または異なって、Ｄ体のアラニン、グルタミン、グルタミン酸、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン、チロシン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸若しくはオルニチン、或いはグリシンを表すが、同時にＤ−アラニンを表すこと、およびＲ１がＤ−アラニンである場合にＲ２がＤ−セリンを表すことはない）で表されるジペプチドである請求項１、２および４〜１２のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項１７】
Ｄ−アミノ酸を含むジペプチドが、式（ＩＩ）
Ｒ３−Ｒ４（ＩＩ）
（式中、Ｒ３およびＲ４は同一または異なって、Ｌ体またはＤ体のアラニン、グルタミン、グルタミン酸、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン、チロシン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸若しくはオルニチン、或いはグリシンを表すが、同時にＬ体のアミノ酸またはグリシンを表すことはない）で表されるジペプチドである請求項３〜１２のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項１８】
Ｄ−アミノ酸を含むジペプチドが、式（ＩＩＩ）
Ｒ５−Ｒ６（ＩＩＩ）
（式中、Ｒ５およびＲ６は同一または異なって、Ｄ−アラニン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−バリン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−プロリン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−セリン、Ｄ−スレオニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−チロシン、Ｄ−リジン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−オルニチンまたはグリシンを表すが、同時にグリシンを表すことはない）で表されるジペプチドである請求項３〜１２のいずれか１項に記載の製造法。
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０９３０５６
【国際公開日】平成１７年１０月６日（２００５．１０．６）
【発行日】平成１９年８月１６日（２００７．８．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５１１４１５（Ｐ２００６−５１１４１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００５／００３７１８
【国際出願日】平成１７年３月４日（２００５．３．４）
【出願人】（０００００１０２９）協和醗酵工業株式会社 (276)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年１０月６日（２００５．１０．６）
【発行日】平成１９年８月１６日（２００７．８．１６）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００５／００３７１８
【国際出願日】平成１７年３月４日（２００５．３．４）
【出願人】（０００００１０２９）協和醗酵工業株式会社 (276)
【Ｆターム（参考）】
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