ジペプチドを生産する微生物および該微生物を用いたジペプチドの製造法
本発明によれば、１種以上のペプチダーゼおよび１種以上のペプチド取り込み活性を有する蛋白質の活性が低下または喪失し、かつジペプチドを生産する能力を有する微生物、３種以上のペプチダーゼの活性が低下または喪失し、かつジペプチドを生産する能力を有する微生物、および該微生物を用いたジペプチドの製造法が提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、ジペプチドを生産する微生物および該微生物を用いたジペプチドの製造法に関する。
【背景技術】
ジペプチドは、食品、医薬品、化粧品等として重要な化合物である。
ジペプチドの製造法としては、天然物からの抽出法、化学合成法、酵素法が知られている。天然物からの抽出法は、生産できるジペプチドの種類が限られている上、天然物中に含まれる目的のジペプチドの含量が低く生産性が悪い。化学合成法によるジペプチドの合成では、官能基の保護・脱保護などの操作が必要であり、またラセミ体も合成されることから、化学合成法は経済的、効率的な方法とはいえない。また、化学合成法は大量の有機溶媒等を使うため環境衛生上も好ましい方法ではない。
酵素法によるジペプチドの合成に関しては、タンパク質分解酵素（プロテアーゼ）の逆反応を利用した方法［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１１９，７０７−７２０（１９３７）］、耐熱性アミノアシルｔ−ＲＮＡ合成酵素を利用する方法（特開昭５８−１４６５３９号公報、特開昭５８−２０９９９１号公報、特開昭５８−２０９９９２号公報、特開昭５９−１０６２９８号公報）、非リボゾームペプチドシンセターゼ（以下、ＮＲＰＳと称す）を利用する方法［Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，７，３７３−３８４（２０００）、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，４９８，４２−４５（２００１）、米国特許第５７９５３８号、米国特許第５６５２１１６号］、Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａリガーゼを利用する方法［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５，１０４６４−１０４７１（１９９６）］、バシリシン合成酵素を利用する方法［Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２，２０１−２０８（１９８７）、Ｅｎｚｙｍｅ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，２９，４００−４０６（２００１）］、Ｌ−アミノ酸アミドハイドロラーゼまたはプロリンイミノペプチダーゼを利用する方法（国際公開第ＷＯ０３／０１０３０７号パンフレット）が知られている。
しかし、タンパク分解酵素の逆反応を利用した方法では、基質となるアミノ酸の官能基の保護・脱保護が必要であり、ペプチド形成反応の効率化およびペプチド分解反応の阻止が困難といった問題点がある。耐熱性アミノアシルｔ−ＲＮＡ合成酵素を利用する方法には、酵素の発現、副生物の生成反応の阻止が困難という問題点がある。
一方、ＮＲＰＳ、Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａリガーゼおよびバシリシン合成酵素を利用する方法は、上記したような問題点はなく、特定の配列のジペプチドを製造することができる方法であるが、ＡＴＰなどのエネルギー供給源を必要とする反応であるため、効率的な方法ではない。
Ｌ−アミノ酸アミドハイドロラーゼまたはプロリンイミノペプチダーゼを利用する方法では、該酵素を生産する微生物の培養物、該培養物より分離した微生物菌体、該微生物菌体の処理物を用いてジペプチドを製造することができる旨記載されているが、該製造法によるジペプチドの生産量は十分なものではない。
生細胞は、不要になった蛋白質を構成アミノ酸にまで分解し、生じたアミノ酸を必要な蛋白質の合成に用いる代謝を営んでいる。該機能は細胞の生存、増殖に必須であるため、生物には多種のプロテアーゼやペプチダーゼが存在することが知られている。
例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）には少なくとも７種のジペプチダーゼが存在する他、他のプロテアーゼやペプチダーゼによっても分解されるジペプチドがあることが知られている［ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．Ｒｅｖ．，６３，２６５−２７６（１９８９）］。また、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、バチルス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の染色体ＤＮＡ上にはペプチダーゼ遺伝子と同定されている遺伝子が、それぞれ２５以上、１４以上、２０以上存在している。
しかしながら、ジペプチドを生産する微生物に、ペプチダーゼの欠損を導入することによりジペプチドの生産量が上昇することについては知られていない。
また、生細胞には複数のペプチド取込みシステムが備わっていることが知られている。
例えばエシェリヒア・コリにはジペプチドを取り込む３つのシステムがあることが報告されている［Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，５，４８９−５０４（１９９８）、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１４５，２８９１−２９０１（１９９９）］。ゲノムＤＮＡ情報からも、エシェリヒア属、バチルス属、コリネバクテリウム属およびサッカロマイセス属に属する微生物にはいずれも３種類あるいはそれ以上のペプチド取込みシステムが存在することが確認されている。
しかしながら、細胞内で合成されたジペプチドが細胞外に排出されるか否かは知られておらず、ましてジペプチドを生産する微生物に、ペプチドの取込みに関与する蛋白質の欠損を導入することにより、ジペプチドの生産量が上昇することは知られていない。
【発明の開示】
本発明の目的は、ジペプチドを生産する微生物および該微生物を用いたジペプチド製造法を提供することにある。
本発明は、以下の（１）〜（２１）に関する。
（１） １種以上のペプチダーゼおよび１種以上のペプチド取り込み活性を有する蛋白質（以下、ペプチド取込み蛋白質ともいう）の活性が低下または喪失し、かつジペプチドを生産する能力を有する微生物。
（２） ３種以上のペプチダーゼの活性が低下または喪失し、かつジペプチドを生産する能力を有する微生物。
（３） ペプチダーゼが、配列番号１〜４のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、または配列番号１〜４のいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつペプチダーゼ活性を有する蛋白質である上記（１）または（２）の微生物。
（４） ペプチド取込み蛋白質が、配列番号５〜９のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、または配列番号５〜９のいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、かつペプチド取り込み活性を有する蛋白質である上記（１）または（３）の微生物。
（５） ジペプチドを生産する能力を有する微生物が、以下の［１］〜［４］のいずれかに記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物である上記（１）〜（４）のいずれか１つの微生物。
［１］配列番号１９〜２５および６８のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［２］配列番号１９〜２５および６８のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつジペプチドの合成活性を有する蛋白質
［３］配列番号１９〜２５および６８のいずれかで表されるアミノ酸配列と６５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつジペプチドの合成活性を有する蛋白質
［４］配列番号３３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつジペプチドの合成活性を有する蛋白質
（６） ジペプチドを生産する能力を有する微生物が、以下の［１］〜［４］のいずれかに記載のＤＮＡを有する微生物である上記（１）〜（４）のいずれか１つの微生物。
［１］上記（５）の［１］〜［４］のいずれかに記載の蛋白質をコードするＤＮＡ
［２］配列番号２６〜３２、６４および６５のいずれかで表される塩基配列を有するＤＮＡ
［３］配列番号２６〜３２、６４および６５のいずれかで表される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつジペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［４］配列番号３４で表される塩基配列と８０％以上の相同性を有する塩基配列を有し、かつジペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（７） ジペプチドを生産する能力を有する微生物が、上記（６）の［１］〜［４］のいずれかに記載のＤＮＡとベクターＤＮＡが連結した組換え体ＤＮＡを有する微生物である上記（１）〜（６）のいずれか１つの微生物。
（８） 微生物が、エシェリヒア属、バチルス属、コリネバクテリウム属またはサッカロマイセス属に属する微生物である上記（１）〜（７）のいずれか１つの微生物。
（９） ジペプチドを生産する能力を有する微生物が、Ｌ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸からジペプチドを生成する能力を有する微生物である上記（１）〜（４）のいずれか１つの微生物。
（１０） Ｌ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸からジペプチドを生成する能力を有する微生物が、プロリンイミノペプチダーゼを生産する微生物である上記（９）の微生物。
（１１） Ｌ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸からジペプチドを生成する能力を有する微生物が、プロリンイミノペプチダーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡとベクターＤＮＡが連結した組換え体ＤＮＡを有する微生物である上記（９）または（１０）の微生物。
（１２） 微生物が、エシェリヒア属、バチルス属、コリネバクテリウム属またはサッカロマイセス属に属する微生物である上記（９）〜（１１）のいずれか１つの微生物。
（１３） ジペプチドを生産する能力を有する微生物が、Ｌ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸からジペプチドを生成する能力を有する微生物である上記（１）〜（４）のいずれか１つの微生物。
（１４） Ｌ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸からジペプチドを生成する能力を有する微生物が、Ｌ−アミノ酸アミドハイドロラーゼ活性を有する蛋白質を生産する微生物である上記（１３）の微生物。
（１５） Ｌ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸からジペプチドを生成する能力を有する微生物が、Ｌ−アミノ酸アミドハイドロラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡとベクターＤＮＡが連結した組換え体ＤＮＡを有する微生物である上記（１３）の微生物。
（１６） 微生物が、エシェリヒア属、バチルス属、コリネバクテリウム属またはサッカロマイセス属に属する微生物である上記（１３）〜（１５）のいずれか１つの微生物。
（１７） 上記（１）〜（８）のいずれか１つの微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、１種以上のアミノ酸を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドを生成、蓄積させ、該媒体から、該ジペプチドを採取するジペプチドの製造法。
（１８） ジペプチドが下式（Ｉ）
Ｒ１−Ｒ２ （Ｉ）
（式中、Ｒ１およびＲ２は同一または異なってアミノ酸を表す）で表されるジペプチドである上記（１７）の製造法。
（１９） 上記（９）〜（１２）のいずれか１つの微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、Ｌ−アミノ酸エステルおよびＬ−アミノ酸を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドを生成、蓄積させ、該媒体から該ジペプチドを採取するジペプチドの製造法。
（２０） 上記（１３）〜（１６）のいずれか１つの微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、Ｌ−アミノ酸アミドおよびＬ−アミノ酸を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドを生成、蓄積させ、該媒体から該ジペプチドを採取するジペプチドの製造法。
（２１） 培養物の処理物が、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、または該菌体の固定化物であることを特徴とする上記（１７）〜（２０）のいずれか１つの製造法。
以下に本発明を詳細に説明する。
１．本発明の微生物
本発明の微生物は、１種以上のペプチダーゼおよび１種以上のペプチド取り込み活性を有する蛋白質（以下、ペプチド取込み蛋白質と略す）の活性が低下または喪失し、かつジペプチドを生産する能力を有する微生物、または３種以上のペプチダーゼの活性が低下または喪失し、かつジペプチドを生産する能力を有する微生物である。
１種以上のペプチダーゼおよび１種以上のペプチド取込み蛋白質の活性が低下または喪失している微生物としては、該微生物が正常に生育できる限りにおいて、任意の１種以上のペプチダーゼおよび任意の１種以上のペプチド取込み蛋白質の活性が低下または喪失している微生物をあげることができ、好ましくは１種以上９種以下、より好ましくは１種以上７種以下、さらに好ましくは１種以上４種以下のペプチダーゼの活性が低下または喪失しており、かつ好ましくは１種以上５種以下、より好ましくは１種以上３種以下、さらに好ましくは１種以上２種以下、特に好ましくは１種のペプチド取込み蛋白質の活性が低下または喪失している微生物をあげることができる。
該微生物としては、より具体的には、該微生物のゲノムＤＮＡ上に存在するペプチダーゼをコードする遺伝子（以下、ペプチダーゼ遺伝子と略す）およびペプチド取込み蛋白質をコードする遺伝子（以下、ペプチド取込み蛋白質遺伝子）のうち、１種以上のペプチダーゼ遺伝子の塩基配列および１種以上のペプチド取込み蛋白質遺伝子の塩基配列において、該塩基配列の全部または一部が欠失しているため、または該塩基配列中に塩基の置換または付加があるために該ペプチダーゼおよび該ペプチド取込み蛋白質の活性が低下または喪失している微生物をあげることができる。
ペプチダーゼの活性が低下しているとは、上記した塩基の欠失、置換または付加がないペプチダーゼに比べ、ペプチド分解活性が低くなっていることを意味する。
微生物のペプチド分解活性は、基質となるペプチドと微生物菌体とを水性媒体中に共存せしめ、ペプチド分解反応を行った後、残存しているペプチド量を公知の方法、例えばＨＰＬＣなどを用いた分析法によって定量することにより測定することができる。
上記ペプチダーゼとしては、ペプチド分解活性を有する蛋白質であればいずれでもよく、好ましくはジペプチド分解活性が高い蛋白質、より好ましくはジペプチダーゼをあげることができる。
より具体的なペプチダーゼとしては、例えばエシェリヒア・コリに存在する、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するＰｅｐＡ、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するＰｅｐＢ、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するＰｅｐＤ、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するＰｅｐＮ、ＰｅｐＰ［ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．（以下、ＧｅｎＢａｎｋと略す）ＡＡＣ７５９４６］、ＰｅｐＱ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ７６８５０）、ＰｅｐＥ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ７６９９１）、ＰｅｐＴ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ７４２１１）、Ｄｃｐ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ７４６１１）およびＩａｄＡ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ７７２８４）など、バチルス・サチリスに存在するＡｍｐＳ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＦ０１２２８５）、ＰｅｐＴ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｘ９９３３９）、ＹｂａＣ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｚ９９１０４）、ＹｃｄＤ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｚ９９１０５）、ＹｊｂＧ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｚ９９１１０）、ＹｋｖＹ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｚ９９１１１）、ＹｑｊＥ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｚ９９１１６）、ＹｗａＤ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｚ９９１２３）など、コリネバクテリウム・グルタミカムに存在するＢＡＢ９７７３２、ＢＡＢ９７８５８、ＢＡＢ９８０８０、ＢＡＢ９８８８０、ＢＡＢ９８８９２、ＢＡＢ９９０１３、ＢＡＢ９９５９８およびＢＡＢ９９８１９（いずれも日本ＤＮＡデータバンクの登録番号）で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質など、サッカロマイセス・セレビシエに存在するＯＣＴ１（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＣ＿００１１４３）、ＳＰＣ２（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＣ＿００３１４３）、ＳＰＹ２［Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｇｅｎｏｍｅ ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｙｅａｓｔｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ／）ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．Ｌ０００２８７５］およびＹＩＭ１（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＣ＿００１１４５）などをあげることができ、ジペプチダーゼとしては、配列番号１〜４で表されるアミノ酸配列を有するＰｅｐＡ、ＰｅｐＢ、ＰｅｐＤおよびＰｅｐＮ、並びにＰｅｐＱ、ＰｅｐＥ、ＩａｄＡをあげることができる。また、配列番号１〜４のいずれかのアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有し、かつペプチダーゼ活性を有する蛋白質もジペプチド分解活性が高い蛋白質としてあげることができる。
アミノ酸配列や塩基配列の相同性は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３）］やＦＡＳＴＡ［Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０）］を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸとよばれるプログラムが開発されている［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）］。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターは例えばＳｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。
また、ペプチド取込み蛋白質の活性が低下しているとは、上記した塩基の欠損、置換または挿入がないＤＮＡにコードされるペプチド取込み蛋白質に比べ、ペプチド取り込み活性が低くなっていることを意味する。
微生物のペプチド取り込み活性は、基質となるペプチドと微生物菌体とを水性媒体中に共存せしめ、ペプチド取り込み反応を行った後、水性媒体中に残存しているペプチド量を公知の方法、例えばＨＰＬＣなどを用いた分析法によって定量することにより測定することができる。
上記ペプチド取り込み蛋白質としては、染色体ＤＮＡ上でオペロンを形成する遺伝子にコードされている蛋白質であり、細胞膜上で複合体を形成してジペプチド取り込み活性を発現する蛋白質、および単独の蛋白質としてペプチド取り込み活性を有する蛋白質など、微生物のペプチド取り込みに関与している蛋白質であればいずれでもよく、好ましくはペプチド取り込み活性が高い蛋白質をあげることができる。
より具体的なペプチド取り込み蛋白質としては、例えばエシェリヒア・コリに存在する配列番号５で表されるアミノ酸配列を有するＤｐｐＡ、配列番号６で表されるアミノ酸配列を有するＤｐｐＢ、配列番号７で表されるアミノ酸配列を有するＤｐｐＣ、配列番号８で表されるアミノ酸配列を有するＤｐｐＤ、配列番号９で表されるアミノ酸配列を有するＤｐｐＦ、ＯｐｐＡ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ７６５６９）、ＯｐｐＢ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ７６５６８）、ＯｐｐＣ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ７６５６７）、ＯｐｐＤ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ７６５６６）、ＯｐｐＦ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ７６５６５）、ＹｄｄＯ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ７４５５６）、ＹｄｄＰ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ７４５５７）、ＹｄｄＱ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ７４５５８）、ＹｄｄＲ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ７４５５９）、ＹｄｄＳ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ７４５６０）、ＹｂｉＫ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ７３９１５）、ＭｐｐＡ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ７４４１１）、ＳａｐＡ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ７４３７６）、ＳａｐＢ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ７４３７５）、ＳａｐＣ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ７４３７４）、ＳａｐＤ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ７４３７３）、およびＳａｐＦ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ７４３７２）など、バチルス・サチリスに存在するＤｐｐＡ（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＡ４０００２）、ＤｐｐＢ（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＡ４０００３）、ＤｐｐＣ（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＡ４０００４）、ＤｐｐＤ（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＡ４０００５）、ＤｐｐＥ（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＡ４０００６）、ＯｐｐＡ（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＡ３９７８７）、ＯｐｐＢ（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＡ３９７８８）、ＯｐｐＣ（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＡ３９７８９）、ＯｐｐＤ（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＡ３９７９０）、ＯｐｐＦ（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＡ３９７９１）、ＡｐｐＡ（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＡ６２３５８）、ＡｐｐＢ（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＡ６２３５９）、ＡｐｐＣ（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＡ６２３６０）、ＡｐｐＤ（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＡ６２３５６）、ＡｐｐＦ（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＡ６２３５７）、ＹｃｌＦ（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＢ１２１７５）およびＹｋｆＤ（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＢ１３１５７）など、コリネバクテリウム・グルタミカムに存在するＢＡＢ９９０４８、ＢＡＢ９９３８３、ＢＡＢ９９３８４、ＢＡＢ９９３８５、ＢＡＢ９９７１３、ＢＡＢ９９７１４、ＢＡＢ９９７１５、ＢＡＢ９９８３０、ＢＡＢ９９８３１、ＢＡＢ９９８３２（いずれも日本ＤＮＡデータバンクの登録番号）で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質など、サッカロマイセス・セレビシエに存在するＯＰＴ１（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿０１２３２３）、ＯＰＴ２（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿０１５５２０）およびＰＴＲ２（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＡ８２１７２）などをあげることができ、また、ペプチド取り込み活性が高い蛋白質としては、配列番号５〜９で表されるアミノ酸配列を有するＤｐｐＡ、ＤｐｐＢ、ＤｐｐＣ、ＤｐｐＤ、ＤｐｐＦおよびそれらいずれかのアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有する蛋白質もペプチド取り込み活性が高いペプチド取り込み蛋白質としてあげることができる。
アミノ酸配列の相同性は、上記したＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡ等のプログラムを用いて決定することができる。
３種以上のペプチダーゼの活性が低下または喪失している微生物としては、該微生物が正常に生育できる限りにおいて、任意の３種以上のペプチダーゼの活性が低下または喪失している微生物をあげることができ、好ましくは３種以上９種以下、より好ましくは３種以上６種以下、さらに好ましくは３種または４種のペプチダーゼの活性が低下または喪失している微生物をあげることができる。
具体的なペプチダーゼとしては、上記したエシェリヒア・コリ、バチルス・サチリス、コリネバクテリウム・グルタミカムおよびサッカロマイセス・セレビシエに存在するペプチダーゼおよびジペプチダーゼをあげることができる。また、配列番号１〜４のいずれかのアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつペプチダーゼ活性を有する蛋白質もジペプチド分解活性が高い蛋白質としてあげることができる。
アミノ酸配列の相同性は、上記したＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等のプログラムを用いて決定することができる。
ジペプチドを生産する能力を有する微生物としては、ジペプチドを生産する能力を有する微生物であれば特に限定されず、例えば、１種以上のアミノ酸を縮合、連結することによりジペプチドを合成する活性を有する蛋白質を生産する微生物、Ｌ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸からジペプチドを合成する活性を有する蛋白質を生産する微生物、Ｌ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸からジペプチドを合成する活性を有する蛋白質を生産する微生物などをあげることができる。
１種以上のアミノ酸を縮合、連結することによりジペプチドを合成する活性を有する蛋白質を生産する微生物としては、ＮＲＰＳ、Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａリガーゼ、バシリシン合成酵素からなる群より選ばれる蛋白質を生産する微生物をあげることができる。
ＮＲＰＳを生産する微生物としては、バチルス属をはじめとする原核生物、ペニシリウム属をはじめとする真核生物、ＢａｃＡ、ＢａｃＢおよびＢａｃＣ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＦ００７８６５）を生産する微生物、ＴｙｃＡ、ＴｙｃＢおよびＴｙｃＣ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＦ００４８３５）を生産する微生物、ＰｃｂＡＢ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｍ５７４２５）を生産する微生物、およびＢａｃＡ、ＢａｃＢ、ＢａｃＣ、ＴｙｃＡ、ＴｙｃＢ、ＴｙｃＣ、ＰｃｂＡＢから選ばれるいずれかの蛋白質のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有し、かつＮＲＰＳの活性を有する蛋白質を生産する微生物などをあげることができる。
Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａリガーゼを生産する微生物としては、ペプチドグリカンを形成する原核微生物、ＤｄｌＡ（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．Ｍ５８４６７）を生産する微生物、ＤｄｌＢ（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＡＥ０００１１８）を生産する微生物、ＤｄｌＣ（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．Ｄ８８１５１）を生産する微生物、およびＤｄｌＡ、ＤｄｌＢ、ＤｄｌＣから選ばれるいずれかのアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつＤ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａリガーゼ活性を有する蛋白質を生産する微生物などをあげることができる。
アミノ酸配列の相同性は、上記したＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等のプログラムを用いて決定することができる。
バシリシン合成酵素を生産する微生物としでは、バチルス属に属する微生物、好ましくはバチルス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・コグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・リケチノフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、および以下の［１］〜［４］、
［１］配列番号１９〜２５および６８のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
［２］配列番号１９〜２５および６８のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつジペプチドの合成活性を有する蛋白質、
［３］配列番号１９〜２５および６８のいずれかで表されるアミノ酸配列と６５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつジペプチドの合成活性を有する蛋白質、または
［４］配列番号３３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつジペプチドの合成活性を有する蛋白質、
から選ばれる蛋白質を生産する微生物をあげることができる。
Ｌ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸からジペプチドを合成する活性を有する蛋白質を生産する微生物としては、プロリンイミノペプチダーゼを生産する微生物をあげることができ、具体的にはバチルス属、コリネバクテリウム属またはシュードモナス属に属する微生物などをあげることができる。具体的には、バチルス・サチリスＡＴＣＣ６６３３、バチルス・コアギュランスＥＫ０１［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７４，７９１９（１９９２）］、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３２８６、シュードモナス・プチダＡＪ−２４０２（ＦＥＲＭ ＢＰ−８１０１）、シュードモナス・プチダＡＴＣＣ１２６３３、シュードモナス・プチダＡＪ２０４８（ＦＥＲＭ ＢＰ−８１２３）（以上、ＷＯ ０３／０１０３０７に記載の微生物）などをあげることができる。また、アースロバクター・ニコチアナ［ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，７８，１９１（１９９９）］、エッシェリヒア・コリ（特開平２−１１３８８７）、フラボバクテリウム・メニコンゴセプチティカム［Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，３３６，３５（１９９６）］、ハフニア・アルベイ［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１９，４６８（１９９６）］、ラクトバチルス・デブルキー［Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４０，５２７（１９９４）］、バチルス・コアギュランス［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７４，７９１９（１９９４）］、アエロモナス・ソブリア［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１６，８１８（１９９４）］、キサントモナス・キャンペストリス（特開平９−１２１８６０）、ナイセリア・ゴノレーヤー［Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，９，１２０３（１９９３）］、プロピオニバクテリウム・フリュデンリチー［Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６４，４７３６（１９９８）］、セラチア・マルエッセンス［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２２，６０１（１９９７）］、コリネバクテリウム・バリアビリス［Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，９０，４４９（２００１）］、サーモプラズマ・アシドフィラム［ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，３９８，１０１（１９９６）］、シュードモナス・アルギノーサ［Ｎａｔｕｒｅ，４０６，９５９（２０００）］などもプロリンイミノペプチダーゼを生産する微生物としてあげることができる。
さらに、プロリンイミノペプチダーゼを生産する微生物としては、以下の［１］〜［３］から選ばれる蛋白質、
［１］ＷＯ ０３／０１０３０７、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，７８，１９１（１９９９）、特開平２−１１３８８７、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，３３６，３５（１９９６）、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１９，４６８（１９９６）、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４０，５２７（１９９４）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７４，７９１９（１９９４）、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１６，８１８（１９９４）、特開平９−１２１８６０、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，９，１２０３（１９９３）、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６４．，４７３６（１９９８）、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２２，６０１（１９９７）、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，３９８，１０１（１９９６）、Ｎａｔｕｒｅ，４０６，９５９（２０００）のいずれかに記載のプロリンイミノペプチダーゼ、
［２］上記［１］のいずれかのプロリンイミノペプチダーゼのアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつプロリンイミノペプチダーゼ活性を有する蛋白質、
［３］上記［１］のいずれかのプロリンイミノペプチダーゼのアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつプロリンイミノペプチダーゼ活性を有する蛋白質、
を生産する能力を有する微生物をあげることができる。
Ｌ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸からジペプチドを合成する活性を有する蛋白質を生産する微生物としては、Ｌ−アミノ酸アミドハイドロラーゼを生産する微生物をあげることができ、具体的にはバチルス属、コリネバクテリウム属、エルビニア属、ロドコッカス属、クリセオバクテリウム属、ミクロコッカス属、シュードモナス属、クリプトコッカス属、トリコスポロン属、ロドスポリジウム属、スポロボロマイセス属、トレメラ属、トルラスポラ属、ステリグマトマイセス属、またはロドトルラ属に属する微生物、好ましくはバチルス属、コリネバクテリウム属またはシュードモナス属に属する微生物、より好ましくはバチルス・メガテリウムＡＪ３２８４（ＦＥＲＭ ＢＰ−８０９０）、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３２８６、ミクロコッカス・ルテウスＡＴＣＣ９３４１、シュードモナス・サッカロフィラＡＴＣＣ１５９４６（以上、ＷＯ０３／０１０１８７に記載の微生物）などをあげることができる。
また、Ｌ−アミノ酸アミドハイドロラーゼ活性を有する蛋白質を生産する微生物としては、以下の［１］または［２］記載の蛋白質、
［１］ＷＯ０３／０１０１８７記載のＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼのアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼ活性を有する蛋白質
［２］ＷＯ０３／０１０１８７記載のＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼのアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物、
をあげることができる。
上記において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、ジペプチド合成活性を有する蛋白質は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）（以下、モレキュラー・クローニング第２版と略す）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号１９〜２５および６８で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、プロリンイミノペプチダーゼ活性を有する蛋白質およびＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼ活性を有する蛋白質のいずれかの蛋白質をコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより、取得することができる。
欠失、置換または付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換または付加できる程度の数であり、１個から数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
配列番号１９〜２５および６８で表されるアミノ酸配列、プロリンイミノペプチダーゼ活性を有する蛋白質およびＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼ活性を有する蛋白質のアミノ酸配列のいずれかにおいて１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたとは、同一配列中の任意の位置において、１または複数のアミノ酸の欠失、置換または付加があってもよい。
欠失、置換または付加は同時に生じてもよく、置換または付加されるアミノ酸は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アルギニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−システインなどがあげられる。
以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸、２−アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
また、上記した１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加が導入される位置は、該変異が導入されたアミノ酸配列を有する蛋白質がジペプチド合成活性を有する限り、特に限定されず、例えば配列番号１９〜２５および６８で表されるアミノ酸配列を比較したとき、該アミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸配列において保存されていないアミノ酸残基をあげることができる。
また、上記した１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質であり、かつジペプチド合成活性を有する蛋白質としては、配列番号１９〜２５および６８のいずれかで表されるアミノ酸配列との相同性が、通常は６５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％の相同性を有する蛋白質、プロリンイミノペプチダーゼのアミノ酸配列またはＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼのアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列との相同性が、通常は８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有する蛋白質をあげることができる。
アミノ酸配列や塩基配列の相同性は、上記したＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡ等のプログラムを用いて決定することができる。
配列番号３３で表されるアミノ酸配列は、配列番号１９〜２５で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質の間で保存されている領域であり、かつ各種微生物のＡｌａ−Ａｌａリガーゼ活性を有する蛋白質のコンセンサス配列に対応する領域である。
配列番号３３で表されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する蛋白質であり、かつジペプチド合成活性を有する蛋白質を生産する微生物もまたジペプチドを生産する微生物である。
配列番号３３で表されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する蛋白質が、ジペプチド合成活性を有する蛋白質であるためには、該蛋白質のアミノ酸配列と配列番号１９〜２５で表されるいずれかのアミノ酸配列との相同性が、少なくとも８０％以上、通常は９０％以上、特に９５％以上の相同性を有していることが好ましい。
アミノ酸配列の相同性は、上記したＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等のプログラムを用いて決定することができる。
また、１種以上のアミノ酸を縮合、連結することによりジペプチドを合成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、Ｌ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸からジペプチドを合成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、またはＬ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸からジペプチドを合成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡとベクターＤＮＡを連結して得られる組換え体ＤＮＡを有する微生物もまた本発明の微生物である。
該微生物としては、エシェリヒア属、バチルス属、コリネバクテリウム属またはサッカロマイセス属に属する微生物をあげることができる。
１種以上のアミノ酸を縮合、連結することによりジペプチドを合成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡとしては、ＮＲＰＳ、Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａリガーゼまたはバシリシン合成酵素をコードするＤＮＡなどをあげることができる。
ＮＲＰＳをコードするＤＮＡとしてはＢａｃＡ、ＢａｃＢ、ＢａｃＣ、ＴｙｃＡ、ＴｙｃＢ、ＴｙｃＣおよびＰｃｂＡＢからなる群より選ばれる蛋白質をコードするＤＮＡをあげることができる。
Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−ＡｌａリガーゼをコードするＤＮＡとしてはＤｄｌＡ、ＤｄｌＢおよびＤｄｌＣからなる群より選ばれる蛋白質をコードするＤＮＡをあげることができる。
バシリシン合成酵素をコードするＤＮＡとしては、以下の［１］〜［４］記載の蛋白質をコードするＤＮＡ、
［１］配列番号１９〜２５および６８のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
［２］配列番号１９〜２５および６８のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつジペプチドの合成活性を有する蛋白質、
［３］配列番号１９〜２５および６８のいずれかで表されるアミノ酸配列と６５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつジペプチドの合成活性を有する蛋白質、
［４］配列番号３３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつジペプチドの合成活性を有する蛋白質、
および、以下の［５］〜［７］記載のＤＮＡ、
［５］配列番号２６〜３２、６４および６５のいずれかで表される塩基配列を有するＤＮＡ、
［６］配列番号２６〜３２、６４および６５のいずれかで表される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつジペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
［７］配列番号３４で表される塩基配列と８０％以上の相同性を有する塩基配列を有するＤＮＡであり、かつジペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
をあげることができる。
Ｌ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸からジペプチドを合成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡとしては、以下の［１］〜［３］記載の蛋白質をコードするＤＮＡ、
［１］ＷＯ ０３／０１０３０７、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，７８，１９１（１９９９）、特開平２−１１３８８７、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，３３６，３５（１９９６）、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１９，４６８（１９９６）、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４０，５２７（１９９４）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７４，７９１９（１９９４）、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１６，８１８（１９９４）、特開平９−１２１８６０、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，９，１２０３（１９９３）、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６４，４７３６（１９９８）、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２２，６０１（１９９７）、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，３９８，１０１（１９９６）、Ｎａｔｕｒｅ，４０６，９５９（２０００）のいずれかに記載のプロリンイミノペプチダーゼ、
［２］上記［１］のいずれかのプロリンイミノペプチダーゼのアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつプロリンイミノペプチダーゼ活性を有する蛋白質、
［３］上記［１］のいずれかのプロリンイミノペプチダーゼのアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつプロリンイミノペプチダーゼ活性を有する蛋白質、
および以下の［４］または［５］記載のＤＮＡ、
［４］ＷＯ ０３／０１０３０７、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，７８，１９１（１９９９）、特開平２−１１３８８７、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，３３６，３５（１９９６）、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１９，４６８（１９９６）、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４０，５２７（１９９４）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７４，７９１９（１９９４）、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１６，８１８（１９９４）、特開平９−１２１８６０、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，９，１２０３（１９９３）、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６４，４７３６（１９９８）、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２２，６０１（１９９７）、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，３９８，１０１（１９９６）、Ｎａｔｕｒｅ，４０６，９５９（２０００）のいずれかに記載の塩基配列を有するプロリンイミノペプチダーゼをコードするＤＮＡ、
［５］上記［４］のいずれかのプロリンイミノペプチダーゼをコードするＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつプロリンイミノペプチダーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
をあげることができる。
Ｌ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸からジペプチドを合成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡとしては、以下の［１］または［２］記載の蛋白質をコードするＤＮＡ、
［１］ＷＯ０３／０１０１８７記載のＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼのアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼ活性を有する蛋白質、
［２］ＷＯ０３／０１０１８７記載のＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼのアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼ活性を有する蛋白質、
および以下の［３］または［４］記載のＤＮＡ、
［３］ＷＯ０３／０１０１８７記載の塩基配列を有するＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼをコードするＤＮＡ、
［４］ＷＯ０３／０１０１８７記載の塩基配列からなるＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼをコードするＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
をあげることができる。
上記のストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとは、上記のいずれかのＤＮＡの一部、または全部をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ｍｏｌ／ｌ、好ましくは０．９ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度、好ましくは０．１倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム、および１５ｍｍｏｌ／ｌのクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）等に起載されている方法に準じて行うことができる。ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的には、上記したＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡ等のプログラムを用いて、上記パラメーターに基づいて計算したときに、上記したいずれかのＤＮＡの塩基配列と少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
上記したＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが、ジペプチドの合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡであることは、該ＤＮＡを発現する組換えＤＮＡを作製し、該組換えＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる微生物を酵素源に用い、１）該酵素源および１種以上のアミノ酸を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドが生成、蓄積するか否かをＨＰＬＣ等により分析する方法、２）該酵素源、Ｌ−アミノ酸エステルおよびＬ−アミノ酸を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドが生成、蓄積するか否かをＨＰＬＣ等により分析する方法、３）該酵素源、Ｌ−アミノ酸アミドおよびＬ−アミノ酸を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドが生成、蓄積するか否かをＨＰＬＣ等により分析する方法、によって確認することができる。
塩基配列の相同性は、上記したＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡ等のプログラムを用いて決定することができる。
２．本発明の微生物の製造法
本発明の微生物は、１）１種以上のペプチダーゼおよび１種以上のペプチド取り込み活性を有する蛋白質の機能が低下または喪失した微生物、または３種以上のペプチダーゼの機能が低下または喪失した微生物に、ジペプチド生産能を付与する方法、または２）ジペプチドを生産する能力を有する微生物の、ａ）１種以上のペプチダーゼおよび１種以上のペプチド取り込み蛋白質、またはｂ）３種以上のペプチダーゼ、の機能を低下または喪失させる方法のいずれの方法によっても取得することができる。
（１）１種以上のペプチダーゼおよび１種以上のペプチド取り込み蛋白質の機能が低下または喪失した微生物、または３種以上のペプチダーゼの機能が低下または喪失した微生物に、ジペプチド生産能を付与する方法
（ｉ）ペプチダーゼ、ペプチド取り込み蛋白質の活性が低下または喪失した微生物の製造
ペプチダーゼ、ペプチド取り込み蛋白質の活性が低下または喪失した微生物は、該微生物を取得できる方法であれば、その取得方法に制限はないが、例えば以下に示す微生物の染色体ＤＮＡのペプチダーゼ遺伝子やペプチド取り込み蛋白質遺伝子に塩基の欠失、置換または付加を導入する方法により取得することができる。
微生物の染色体ＤＮＡの遺伝子に塩基の欠失、置換または付加を導入する方法としては、相同組換えを利用した方法をあげることができる。一般的な相同組換えを利用した方法としては、塩基の欠失、置換または付加が導入された変異遺伝子を、塩基の欠失等を導入したい宿主細胞内では自立複製できない薬剤耐性遺伝子を有するプラスミドＤＮＡと連結して作製できる相同組換え用プラスミドを用いる方法をあげることができる。
該相同組換え用プラスミドを常法により宿主細胞に導入した後、薬剤耐性を指標にして相同組換えによって染色体ＤＮＡ上に該相同組換え用プラスミドが組込まれた形質転換株を選択する。得られた形質転換株を該薬剤を含有しない培地で数時間〜１日間培養した後、該薬剤含有寒天培地、および該薬剤非含有寒天培地に塗布し、前者の培地で生育せず、後者の培地で生育できる株を選択することで、染色体ＤＮＡ上において２回目の相同組換えが生じた株を取得することができる。染色体ＤＮＡ上の欠失等を導入した遺伝子が存在する領域の塩基配列を決定することで、染色体ＤＮＡ上の目的遺伝子に塩基の欠失、置換または付加が導入されたことを確認することができる。
上記方法により、染色体ＤＮＡ上の目的遺伝子に塩基の欠失、置換または付加を導入することができる微生物としては、エシェリヒア属、バチルス属、コリネバクテリウム属、またはサッカロマイセス属に属する微生物をあげることができる。
また、複数の遺伝子に効率よく塩基の欠失、置換または付加を導入する相同組換えを利用した方法としては、直鎖ＤＮＡを用いた方法をあげることができる。
具体的には、塩基の欠失、置換または付加を導入したい遺伝子を含有する直鎖ＤＮＡを細胞内に取り込ませ、染色体ＤＮＡと導入した直鎖ＤＮＡとの間で相同組換えを起こさせる方法である。本方法は、直鎖ＤＮＡを効率よく取り込む微生物であれば、いずれの微生物にも適用でき、好ましい微生物としてはエシェリヒア属またはバチルス属に属する微生物、より好ましくはエシェリヒア・コリ、さらに好ましくはλファージ由来の組換えタンパク質群（Ｒｅｄ組換え系）を発現しているシェリヒア・コリをあげることができる。
λＲｅｄ組換え系を発現しているエシェリヒア・コリとしては、λＲｅｄ組換え系遺伝子を有するプラスミドＤＮＡであるｐＫＤ４６［エシェリヒア・コリ ジェネティック ストック センター（米国エール大学）より入手可能］を保有するエシェリヒア・コリＪＭ１０１株等をあげることができる。
相同組換えに用いられるＤＮＡとしては、
（ａ）塩基の欠失、置換または付加の導入対象である染色体ＤＮＡ上の領域の両外側に存在するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相同性を有するＤＮＡを、薬剤耐性遺伝子の両端に有する直鎖ＤＮＡ、
（ｂ）塩基の欠失、置換または付加の導入対象である染色体ＤＮＡ上の領域の両外側に存在するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相同性を有するＤＮＡを直接連結した直鎖ＤＮＡ、
（ｃ）塩基の欠失、置換または付加の導入対象である染色体ＤＮＡ上の領域の両外側に存在するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相同性を有するＤＮＡを、薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子の両端に有する直鎖ＤＮＡ、
（ｄ）上記（ａ）の直鎖ＤＮＡにおいて、薬剤耐性遺伝子と染色体ＤＮＡ上の領域の両外側に存在するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相同性を有するＤＮＡの間に、さらに酵母由来のＦｌｐ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８２，５８７５（１９８５）］が認識する塩基配列を有するＤＮＡ、
をあげることができる。
薬剤耐性遺伝子としては、宿主微生物が感受性を示す薬剤に対し、薬剤耐性を付与する薬剤耐性遺伝子であれば、いずれの薬剤耐性遺伝子も使用することができる。宿主微生物にエシェリヒア・コリを用いた場合は、薬剤耐性遺伝子としては、例えば、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子およびアンピシリン耐性遺伝子等をあげることができる。
ネガティブセレクションに用いることができる遺伝子とは、宿主微生物で該遺伝子を発現させたとき、一定培養条件下においては、該微生物に致死的である遺伝子のことをいい、該遺伝子としては例えば、バチルス属に属する微生物由来のｓａｃＢ遺伝子［Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５９，１３６１−１３６６（１９９３）］、およびエシェリヒア属に属する微生物由来のｒｐｓＬ遺伝子［Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，７２，９９−１０４（２００１）］等をあげることができる。
上記の直鎖ＤＮＡの両末端に存在する、染色体ＤＮＡ上の置換または欠失の導入対象となる領域の両端の外側に位置するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相同性を有するＤＮＡは、直鎖ＤＮＡにおいて、染色体ＤＮＡ上の方向と同じ方向に配置され、その長さは１０ｂｐ〜１００ｂｐ程度が好ましく、２０ｂｐ〜５０ｂｐ程度がより好ましく、３０〜４０ｂｐ程度がさらに好ましい。
酵母由来のＦｌｐ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅが認識する塩基配列とは、該蛋白質が認識し、相同組換えを触媒する塩基配列であれば、特に限定されないが、好ましくは配列番号３９で表される塩基配列を有するＤＮＡ、および該ＤＮＡにおいて１個〜数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列を有し、かつ酵母由来のＦｌｐ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅが認識し、相同組換えを触媒する塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。
相同性を有するＤＮＡとは、上記直鎖ＤＮＡが、染色体ＤＮＡ上の目的とする領域において、相同組換えが起こる程度の同一性を有するＤＮＡのことであり、具体的な相同性としては、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは１００％の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
上記塩基配列の相同性は、上記したＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等のプログラムを用いて決定することができる。
上記直鎖ＤＮＡ断片は、ＰＣＲにより作製することができる。また上記直鎖ＤＮＡを含むＤＮＡをプラスミド上にて構築した後、制限酵素処理にて目的の直鎖ＤＮＡを得ることもできる。
微生物の染色体ＤＮＡに塩基の欠失、置換または付加を導入する方法としては、以下の方法１〜４があげられる。
方法１：上記（ａ）または（ｄ）の直鎖ＤＮＡを宿主微生物に導入し、薬剤耐性を指標に該直鎖ＤＮＡが染色体ＤＮＡ上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択する方法。
方法２：上記方法１により取得された形質転換株に、塩基の欠失、置換または付加の導入対象である染色体ＤＮＡ上の領域の両外側に存在するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相同性を有するＤＮＡを直接連結したＤＮＡを導入し、該方法により染色体ＤＮＡ上に挿入された薬剤遺伝子を削除することにより、微生物の染色体ＤＮＡ上の領域を置換または欠失させる方法。
方法３：
［１］上記（ｃ）の直鎖ＤＮＡを宿主微生物に導入し、薬剤耐性を指標に該直鎖ＤＮＡが染色体ＤＮＡ上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択する、
［２］染色体ＤＮＡ上の置換または欠失の対象領域の両端の外側に位置するＤＮＡと相同性を有するＤＮＡを、染色体ＤＮＡ上における方向と同一の方向で連結したＤＮＡを合成し、上記［１］で得られた形質転換株に導入する、
［３］ネガティブセレクションに用いることができる遺伝子が発現する条件下において、上記［２］の操作を行った形質転換株を培養し、該培養において生育可能な株を、薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子が染色体ＤＮＡ上から削除された株として選択する方法。
方法４：
［１］上記（ｄ）の直鎖ＤＮＡを宿主微生物に導入し、薬剤耐性を指標に該直鎖ＤＮＡが染色体ＤＮＡ上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択する、
［２］上記［１］で得られた形質転換株にＦｌｐ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ遺伝子発現プラスミドを導入し、該遺伝子を発現させた後、上記［１］で用いた薬剤に感受性である株を取得する方法。
上記方法で用いられる、直鎖ＤＮＡを宿主微生物に導入する方法としては、該微生物へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４）、エレクトロポレーション法［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６，６１２７（１９８８）］等をあげることができる。
方法２または方法３［２］で用いられるＤＮＡにおいて、該ＤＮＡの中央部付近に、染色体ＤＮＡ上に挿入したい任意の遺伝子を組み込こんだＤＮＡを用いることにより、薬剤耐性遺伝子等を削除するのと同時に、任意の遺伝子を染色体ＤＮＡ上に挿入することができる。
上記方法２〜４では、最終的に得られる形質転換株の染色体ＤＮＡ上には薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子等の外来遺伝子を残さない方法であるため、該方法を用いることにより、同一の薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子を用いて、方法２、方法３［１］〜［３］、および方法４［１］［２］の操作を繰り返すことにより、容易に染色体ＤＮＡ上の位置の異なる２以上の領域に塩基の欠失、置換または付加を有する微生物を製造することができる。
（ｉｉ）ジペプチドを生産する能力を付与する方法
上記（ｉ）で用いた微生物に、ジペプチドを生産する能力を付与する方法としては、例えば以下の方法をあげることができる。
（ａ）ジペプチドを合成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡの調製
上記したジペプチドを合成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡは、該ＤＮＡの塩基配列情報を利用し、以下に記載する方法により取得することができる。
例えば、バシリシン合成酵素をコードするＤＮＡを取得する方法としては、配列番号２６〜３２、６４および６５のいずれかで表される塩基配列に基づき設計することができるプローブを用いた、バチルス属に属する微生物の染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション法、または配列番号２６〜３２、６４および６５のいずれかで表される塩基配列に基づき設計することができるプライマーＤＮＡを用いた、バチルス属に属する微生物の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ［ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９０）］等をあげることができる。
また、各種の遺伝子配列データベースに対して配列番号１９〜２５、３３および６８のいずれかで表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列と６５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有する配列を検索し、該検索によって得られた塩基配列に基づき、該塩基配列を有する生物の染色体ＤＮＡ、ｃＤＮＡライブラリー等から上記した方法によりジペプチドを合成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを取得することもできる。
取得したＤＮＡをそのまま、あるいは適当な制限酵素などで切断後、常法によりベクターに組み込み、組換え体ＤＮＡを取得し、該組換え体ＤＮＡをエシェリヒア・コリに導入して得られる形質転換体からプラスミドＤＮＡを抽出して、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキシ法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７）］あるいは３７３Ａ・ＤＮＡシークエンサー（パーキン・エルマー社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
塩基配列を決定した結果、取得されたＤＮＡが部分長であった場合は、該部分長ＤＮＡをプローブに用いた、染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション法により、全長ＤＮＡを取得することができる。
更に、決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、パーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成装置等を用いて化学合成することにより目的とするＤＮＡを調製することもできる。
上記のようにして取得されるＤＮＡとして、例えば、配列番号２６〜３２、６４および６５で表される塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。
該ＤＮＡを組み込むベクターとしては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ（＋）（ストラタジーン社製）、ｐＤＩＲＥＣＴ［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，６０６９（１９９０）］、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ａｍｐ ＳＫ（＋）（ストラタジーン社製）、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（ノバジェン社製）、ｐＣＲ ＩＩ（インビトロジェン社製）およびｐＣＲ−ＴＲＡＰ（ジーンハンター社製）などをあげることができる。
エシェリヒア・コリとしては、例えば、エシェリヒア・コリＸＬ１−Ｂｌｕｅ、エシェリヒア・コリＸＬ２−Ｂｌｕｅ、エシェリヒア・コリＤＨ１、エシェリヒア・コリＭＣ１０００、エシェリヒア・コリＫＹ３２７６、エシェリヒア・コリＷ１４８５、エシェリヒア・コリＪＭ１０１、エシェリヒア・コリＪＭ１０９、エシェリヒア・コリＨＢ１０１、エシェリヒア・コリＮｏ．４９、エシェリヒア・コリＷ３１１０、エシェリヒア・コリＮＹ４９、エシェリヒア・コリＭＰ３４７、エシェリヒア・コリＮＭ５２２、エシェリヒア・コリＭＥ８４１５等をあげることができる。
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４）、エレクトロポレーション法［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６，６１２７（１９８８）］等をあげることができる。
上記方法によって得られるジペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを保有する微生物としては、後述する配列番号１９で表される配列を有するＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡを保有する微生物であるエシェリヒア・コリＮＭ５２２／ｐＰＥ４３をあげることができる。
（ｂ）ジペプチド合成活性を有する蛋白質の生産
ジペプチド合成活性を有する蛋白質は、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された方法等を用い、例えば以下の方法により、上記（ａ）の方法により取得したＤＮＡを宿主細胞中で発現させて、生産することができる。
上記（ａ）の方法により取得したＤＮＡをもとにして、必要に応じて、ジペプチド合成活性を有する蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。また、該蛋白質をコードする部分の塩基配列を、宿主の発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換することにより、該蛋白質の生産率を向上させることができる。
該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換え体ＤＮＡを作製する。
該組換え体ＤＮＡを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、ジペプチド合成活性を有する蛋白質を生産する形質転換体を得ることができる。
宿主細胞としては、細菌および酵母等、目的とする遺伝子を発現できる微生物であればいずれも用いることができる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、ジペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、ジペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡは、原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リポソーム結合配列、ジペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、転写終結配列より構成された組換え体ＤＮＡであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
発現ベクターとしては、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリンガーマンハイム社製）、ｐＨｅｌｉｘ１（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）、ｐＫＫ２３３−２（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（プロメガ社製）、ｐＱＥ−８（キアゲン社製）、ｐＥＴ−３（ノバジェン社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）］、ｐＬＳＡ１［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）］、ｐＧＥＬ１［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ（−）（ストラタジーン社製）、ｐＴｒＳ３０［エシェリヒア・コリＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＮ ＢＰ−５４０７）より調製］、ｐＴｒＳ３２［エシェリヒア・コリＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０８）より調製］、ｐＰＡＣ３１（ＷＯ９８／１２３４３）、ｐＵＣ１９［Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）］、ｐＳＴＶ２８（宝酒造社製）、ｐＵＣ１１８（宝酒造桂製）、ｐＰＡ１（特開昭６３−２３３７９８）等を例示することができる。
プロモーターとしては、エシェリヒア・コリ等の宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、エシェリヒア・コリやファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等をあげることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔ Ｉプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
プロモーターとしては、バチルス属細菌中で発現させるためのｘｙｌＡプロモーター［Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３５，５９４−５９９（１９９１）］やコリネバクテリウム属細菌中で発現させるためのＰ５４−６プロモーター［Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５３，６７４−６７９（２０００）］なども用いることができる。
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８核酸）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
ジペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを発現ベクターに結合させた組換え体ＤＮＡにおいては、転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
このような組換え体ＤＮＡとしては、例えば後述するｐＰＥ４３をあげることができる。
宿主細胞として用いる原核生物としては、エシェリヒア属、バチルス属、またはコリネバクテリウム属などに属する微生物、例えば、エシェリヒア・コリＸＬ１−Ｂｌｕｅ、エシェリヒア・コリＸＬ２−Ｂｌｕｅ、エシェリヒア・コリＤＨ１、エシェリヒア・コリＤＨ５α、エシェリヒア・コリＭＣ１０００、エシェリヒア・コリＫＹ３２７６、エシェリヒア・コリＷ１４８５、エシェリヒア・コリＪＭ１０１、エシェリヒア・コリＪＭ１０９、エシェリヒア・コリＨＢ１０１、エシェリヒア・コリＮｏ．４９、エシェリヒア・コリＷ３１１０、エシェリヒア・コリＮＹ４９、エシェリヒア・コリＭＰ３４７、エシェリヒア・コリＮＭ５２２、バチルス・サチリスＡＴＣＣ３３７１２、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＦＥＲＭ ＢＰ−６０３０、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕａｎｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４２９７等をあげることができる。
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４）、エレクトロポレーション法［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６，６１２７（１９８８）］等をあげることができる。
サッカロマイセス属に属する菌株を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等を用いることができる。
プロモーターとしては、サッカロマイセス属に属する菌株中で機能するものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ １プロモーター、ｇａｌ １０プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ １プロモーター等のプロモーターをあげることができる。
宿主細胞としては、サッカロマイセス属等に属する菌株をあげることができ、具体的には、サッカロマイセス・セレビシエ等をあげることができる。
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０）］、スフェロプラスト法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８１，４８８９（１９８４）］、酢酸リチウム法［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）］等をあげることができる。
（２）ジペプチドを生産する能力を有する微生物の、ａ）１個以上のペプチダーゼおよび１個以上のペプチド取り込み系蛋白質、またはｂ）３個以上のペプチダーゼ、の機能を低下または喪失させる方法
任意の微生物を宿主細胞に用いて、上記（１）の（ｉｉ）の方法を実施することにより、ジペプチドを生産する能力を有する微生物を製造することができるので、該微生物を用いて、上記（１）の（ｉ）の方法を実施することにより、１個以上のペプチダーゼと１個以上のペプチド取り込み系蛋白質、または３個以上のペプチダーゼの機能が低下または喪失した微生物であり、かつジペプチドを生産する能力を有する微生物を製造することができる。
また、本来の性質としてジペプチドを生産する能力を有する微生物は、該微生物に対し、上記（１）の（ｉ）の方法を実施することにより、本発明の微生物を製造することができる。
上記微生物としては、エシェリヒア属、バチルス属、コリネバクテリウム属またはサッカロマイセス属に属する微生物などをあげることができ、より好ましくはエシェリヒア・コリ、バチルス・サチリス、コリネバクチリウム・グルタミカムおよびサッカロマイセス・セレビシエなどをあげることができる。
３．本発明のジペプチドの製造法
本発明の製造法としては、
（ｉ）本発明の微生物の培養物または培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、および１種以上のアミノ酸を水性媒体中に存在せしめ、該媒体中にジペプチドを生成、蓄積させ、該媒体から該ジペプチドを採取する該ジペプチドの製造法、
（ｉｉ）本発明の微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、Ｌ−アミノ酸エステルおよびＬ−アミノ酸を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドを生成、蓄積させ、該媒体から該ジペプチドを採取するジペプチドの製造法、および
（ｉｉｉ）本発明の微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、Ｌ−アミノ酸アミドおよびＬ−アミノ酸を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドを生成、蓄積させ、該媒体から該ジペプチドを採取するジペプチドの製造法、
などをあげることができる。
上記（ｉ）の製造法において、基質に用いられる１種以上のアミノ酸、好ましくは１種または２種のアミノ酸としては、アミノ酸、好ましくはＬ−アミノ酸、グリシン（Ｇｌｙ）およびβ−アラニン（βＡｌａ）からなる群より選ばれるアミノ酸であれば、いずれのアミノ酸をいずれの組み合わせで用いてもよい。Ｌ−アミノ酸としては、例えばＬ−アラニン（Ｌ−Ａｌａ）、Ｌ−グルタミン（Ｌ−Ｇｌｎ）、Ｌ−グルタミン酸（Ｌ−Ｇｌｕ）、Ｌ−バリン（Ｌ−Ｖａｌ）、Ｌ−ロイシン（Ｌ−Ｌｅｕ）、Ｌ−イソロイシン（Ｌ−Ｉｌｅ）、Ｌ−プロリン（Ｌ−Ｐｒｏ）、Ｌ−フェニルアラニン（Ｌ−Ｐｈｅ）、Ｌ−トリプトファン（Ｌ−Ｔｒｐ）、Ｌ−メチオニン（Ｌ−Ｍｅｔ）、Ｌ−セリン（Ｌ−Ｓｅｒ）、Ｌ−スレオニン（Ｌ−Ｔｈｒ）、Ｌ−システイン（Ｌ−Ｃｙｓ）、Ｌ−アスパラギン（Ｌ−Ａｓｎ）、Ｌ−チロシン（Ｌ−Ｔｙｒ）、Ｌ−リジン（Ｌ−Ｌｙｓ）、Ｌ−アルギニン（Ｌ−Ａｒｇ）、Ｌ−ヒスチジン（Ｌ−Ｈｉｓ）、Ｌ−アスパラギン酸（Ｌ−Ａｓｐ）、Ｌ−α−アミノ酪酸（Ｌ−α−ＡＢ）、Ｌ−アザセリン（Ｌ−Ａｚａｓｅｒｉｎｅ）、Ｌ−テアニン（Ｌ−ｔｈｅａｎｉｎｅ）、Ｌ−４−ヒドロキシプロリン（Ｌ−４−ＨＹＰ）、Ｌ−３−ヒドロキシプロリン（Ｌ−３−ＨＹＰ）、Ｌ−オルニチン（Ｌ−Ｏｒｎ）、Ｌ−シトルリン（Ｌ−Ｃｉｔ）およびＬ−６−ジアゾ−５−オキソノルロイシン（Ｌ−６−ｄｉａｚｏ−５−ｏｘｏ−ｎｏｒｌｅｕｃｉｎｅ）などをあげることができる。
上記（ｉ）の製造法に用いられる、より好ましいアミノ酸としては、Ｌ−Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒおよびβ−Ａｌａから選ばれる１種のアミノ酸とＬ−Ａｌａ、Ｌ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｖａｌ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ｉｌｅ、Ｌ−Ｐｒｏ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ａｓｎ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−Ｈｉｓ、Ｌ−Ａｓｐ、Ｌ−α−ＡＢ、β−Ａｌａ、Ｌ−Ａｚａｓｅｒｉｎｅ、Ｌ−ｔｈｅａｎｉｎｅ、Ｌ−４−ＨＹＰ、Ｌ−３−ＨＹＰ、Ｌ−Ｏｒｎ、Ｌ−ＣｉｔおよびＬ−６−ｄｉａｚｏ−５−ｏｘｏ−ｎｏｒｌｅｕｃｉｎｅから選ばれる１種のアミノ酸の組み合わせ、Ｌ−ＧｌｎとＬ−Ｐｈｅの組み合わせ、およびＬ−α−ＡＢとＬ−Ｇｌｎ、Ｌ−ＡｒｇまたはＬ−α−ＡＢの組み合わせ、さらに好ましくはＬ−ＡｌａとＬ−Ａｌａ、Ｌ−Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｖａｌ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ｉｌｅ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ａｓｎ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−Ｈｉｓ、Ｌ−α−ＡＢ、Ｌ−Ａｚａｓｅｒｉｎｅ、Ｌ−ＣｉｔおよびＬ−ｔｈｅａｎｉｎｅから選ばれる１種のアミノ酸の組み合わせ、ＧｌｙとＬ−Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−α−ＡＢおよびＬ−Ｃｉｔから選ばれる１種のアミノ酸の組み合わせ、Ｌ−ＭｅｔとＬ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−ＬｙｓおよびＬ−Ｈｉｓから選ばれる１種のアミノ酸の組み合わせ、Ｌ−ＳｅｒとＬ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−ＨｉｓおよびＬ−α−ＡＢから選ばれる１種のアミノ酸の組み合わせ、Ｌ−ＴｈｒとＬ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−ＴｈｒおよびＬ−α−ＡＢから選ばれる１種のアミノ酸の組み合わせ、Ｌ−ＧｌｎとＬ−Ｐｈｅの組み合わせ、β−ＡｌａとＬ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−ＨｉｓおよびＬ−Ｃｉｔから選ばれる１種のアミノ酸の組み合わせ、およびＬ−α−ＡＢとＬ−Ｇｌｎ、Ｌ−ＡｒｇまたはＬ−α−ＡＢの組み合わせをあげることができる。
上記（ｉ）の製造法において、基質として用いるアミノ酸は、０．１〜５００ｇ／Ｌ、好ましくは０．２〜２００ｇ／Ｌの濃度になるように水性媒体中に初発または反応途中に添加する。
上記（ｉ）の製造法で製造されるジペプチドとしては、下式（Ｉ）
Ｒ１−Ｒ２ （Ｉ）
（式中、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なってアミノ酸を表す）で表されるジペプチドをあげることができ、好ましくは、上記式（Ｉ）においてＲ１およびＲ２が同時にまたは異なって、Ｌ−Ａｌａ、Ｌ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｖａｌ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ｉｌｅ、Ｌ−Ｐｒｏ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ａｓｎ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−Ｈｉｓ、Ｌ−Ａｓｐ、Ｌ−α−ＡＢ、β−Ａｌａ、Ｌ−Ａｚａｓｅｒｉｎｅ、Ｌ−ｔｈｅａｎｉｎｅ、Ｌ−４−ＨＹＰ、Ｌ−３−ＨＹＰ、Ｌ−ＯｒｎおよびＬ−６−ｄｉａｚｏ−５−ｏｘｏ−ｎｏｒｌｅｕｃｉｎｅから選ばれるアミノ酸であるジペプチドをあげることができ、より好ましくはＲ１がＬ−Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒまたはβ−Ａｌａの場合は、Ｒ２がＬ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｖａｌ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ｉｌｅ、Ｌ−Ｐｒｏ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ａｓｎ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−Ｈｉｓ、Ｌ−Ａｓｐ、Ｌ−α−ＡＢ、β−Ａｌａ、Ｌ−Ａｚａｓｅｒｉｎｅ、Ｌ−ｔｈｅａｎｉｎｅ、Ｌ−４−ＨＹＰ、Ｌ−３−ＨＹＰ、Ｌ−ＯｒｎまたはＬ−６−ｄｉａｚｏ−５−ｏｘｏ−ｎｏｒｌｅｕｃｉｎｅであるジペプチドをあげることができ、さらに好ましくは、Ｒ１がＬ−Ａｌａの場合は、Ｒ２はＬ−Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｖａｌ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ｉｌｅ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ａｓｎ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−Ｈｉｓ、Ｌ−α−ＡＢ、Ｌ−ＡｚａｓｅｒｉｎｅまたはＬ−ｔｈｅａｎｉｎｅであるジペプチド、Ｒ１がＧｌｙの場合は、Ｒ２はＬ−Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−ＡｒｇまたはＬ−α−ＡＢであるジペプチド、Ｒ１がＬ−Ｍｅｔの場合は、Ｒ２はＬ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−ＬｙｓまたはＬ−Ｈｉｓであるジペプチド、Ｒ１がＬ−Ｓｅｒの場合は、Ｒ２はＬ−Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−ＨｉｓまたはＬ−α−ＡＢであるジペプチド、Ｒ１がＬ−Ｔｈｒの場合は、Ｒ２はＬ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ｇｌｙ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−ＴｈｒまたはＬ−α−ＡＢであるジペプチド、Ｒ１がＬ−Ｇｌｎの場合は、Ｒ２はＬ−ＰｈｅまたはＬ−α−ＡＢであるジペプチド、Ｒ１がＬ−Ｐｈｅの場合は、Ｒ２はＬ−Ｇｌｎであるジペプチド、Ｒ１がＬ−Ｔｒｐの場合は、Ｒ２はＧｌｙであるジペプチド、Ｒ１がＬ−Ｃｙｓの場合は、Ｒ２はＬ−Ａｌａ、Ｌ−Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、またはＬ−Ｍｅｔであるジペプチド、Ｒ１がＬ−Ｌｙｓの場合は、Ｒ２はＬ−Ａｌａ、ＧｌｙまたはＬ−Ｍｅｔであるジペプチド、Ｒ１がＬ−Ａｒｇの場合は、Ｒ２はＬ−α−ＡＢであるジペプチド、Ｒ１がＬ−Ｈｉｓである場合は、Ｒ２はＬ−Ｍｅｔであるジペプチド、およびＲ１がＬ−α−ＡＢの場合は、Ｒ２はＬ−Ａｌａ、Ｌ−Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−ＡｒｇまたはＬ−α−ＡＢであるジペプチドをあげることができる。
また上記製造法においては、必要に応じて、ＡＴＰの供給源として、本発明の微生物が代謝してＡＴＰを生産し得る化合物、例えばグルコースのような糖類、エタノールのようなアルコール類、酢酸のような有機酸類なとを水性媒体中に加えることができる。
上記（ｉｉ）の製造法において、基質に用いられるＬ−アミノ酸エステルおよびＬ−アミノ酸としては、本発明の微生物が基質に用いてジペプチドを生成することができるＬ−アミノ酸エステルおよびＬ−アミノ酸であれば、いずれのＬ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸をいずれの組み合わせで用いてもよく、好ましくはＬ−アミノ酸エステルが、Ｌ−アラニンエステル、グリシンエステル、Ｌ−バリンエステル、Ｌ−イソロイシンエステル、Ｌ−メチオニンエステル、Ｌ−フェニルアラニンエステル、Ｌ−セリンエステル、Ｌ−スレオニンエステル、Ｌ−グルタミンエステル、Ｌ−チロシンエステル、Ｌ−アルギニンエステル、Ｌ−アスパラギン酸−α−エステル、Ｌ−アスパラギン酸−β−エステル、Ｌ−ロイシンエステル、Ｌ−アスパラギンエステル、Ｌ−リジンエステル、Ｌ−アスパラギン酸−α，β−ジメチルエステルおよびＬ−グルタミン−γ−エステルからなる群より選ばれるＬ−アミノ酸エステルであり、Ｌ−アミノ酸がＬ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ａｌａ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｐｒｏ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−ＨｉｓおよびＬ−Ｇｌｕからなる群より選ばれるＬ−アミノ酸をあげることができる。
上記（ｉｉ）の製造法において、基質として用いるＬ−アミノ酸エステルおよびＬ−アミノ酸は、０．１〜５００ｇ／Ｌ、好ましくは０．２〜２００ｇ／Ｌの濃度になるように水性媒体中に初発または反応途中に添加する。
上記（ｉｉｉ）の製造法において、基質に用いられるＬ−アミノ酸アミドおよびＬ−アミノ酸としては、本発明の微生物が基質に用いてジペプチドを生成することができるＬ−アミノ酸アミドおよびＬ−アミノ酸であれば、いずれのＬ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸をいずれの組み合わせで用いてもよく、好ましくはＬ−アミノ酸アミドが、Ｌ−アラニンアミド、グリシンアミドおよびＬ−アスパラギン酸アミドからなる群より選ばれるＬ−アミノ酸アミドであり、Ｌ−アミノ酸がＬ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ａｌａ、Ｌ−Ｖａｌ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ｉｌｅ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｐｒｏ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−ＨｉｓおよびＬ−Ｇｌｕからなる群より選ばれるＬ−アミノ酸をあげることができる。
上記（ｉｉｉ）の製造法において、基質として用いるＬ−アミノ酸アミドおよびＬ−アミノ酸は、０．１〜５００ｇ／Ｌ、好ましくは０．２〜２００ｇ／Ｌの濃度になるように水性媒体中に初発または反応途中に添加する。
本発明の製造法で用いられる水性媒体としては、ジペプチドの生成反応を阻害しない限り、いかなる成分、組成の水性媒体であってもよく、例えば、水、りん酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ほう酸塩、クエン酸塩、トリスなどの緩衝液などをあげることができる。また、メタノール、エタノールなどのアルコール類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類、アセトアミドなどのアミド類を含有していてもよい。
ジペプチドの生成反応は水性媒体中、ｐＨ５〜１１、好ましくはｐＨ６〜１０、２０〜６０℃、好ましくは２５〜４５℃の条件で２〜１５０時間、好ましくは６〜１２０時間行う。
さらに必要に応じて、水性媒体中に界面活性剤あるいは有機溶媒を添加してもよい。
界面活性剤としては、ポリオキシエチレン・オクタデシルアミン（例えばナイミーンＳ−２１５、日本油脂社製）などの非イオン界面活性剤、セチルトリメチルアンモニウム・ブロマイドやアルキルジメチル・ベンジルアンモニウムクロライド（例えばカチオンＦ２−４０Ｅ、日本油脂社製）などのカチオン系界面活性剤、ラウロイル・ザルコシネートなどのアニオン系界面活性剤、アルキルジメチルアミン（例えば三級アミンＦＢ、日本油脂社製）などの三級アミン類など、ジペプチドの生成を促進するものであればいずれでもよく、１種または数種を混合して使用することもできる。界面活性剤は、通常０．１〜５０ｇ／ｌの濃度で用いられる。有機溶剤としては、キシレン、トルエン、脂肪族アルコール、アセトン、酢酸エチルなどがあげられ、通常０．１〜５０ｍｌ／ｌの濃度で用いられる。
培養物の処理物としては、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、および該菌体の固定化物などをあげることができる。また、本発明の培養物の処理物には、上記菌体を界面活性剤処理、超音波処理、機械的摩砕処理、溶媒処理または酵素処理等して得られる処理物から、不溶物等を除いて得られる蛋白質の粗抽出物も含まれる。
培養物または該培養物の処理物を酵素源として用いる場合、該酵素源の量は、当該酵素源の比活性等により異なるが、例えば、基質であるアミノ酸、Ｌ−アミノ酸エステルまたはＬ−アミノ酸アミド１ｍｇあたり５〜１０００ｍｇ、好ましくは１０〜４００ｍｇ添加する。
水性媒体中に生成、蓄積したジペプチドの採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法あるいは、有機溶媒による抽出、結晶化、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等により行うことができる。
その他、上記（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の製造法は、ＷＯ ０３／０１０１８９またはＷＯ ０３／０１０１８７の記載に準じて行うことができる。
以下に、本発明の実験例を示す。
実験例１ バチルス・サチリス由来のｙｗｆＥ遺伝子発現プラスミドの造成
バチルス・サチリスのｙｗｆＥ遺伝子断片を以下のようにして取得した。
パーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成機を用いて、配列番号３５および配列番号３６で表される塩基配列を有するＤＮＡ（以下、それぞれプライマーＡ、プライマーＢと呼ぶ）を合成した。プライマーＡは、ｙｗｆＥ遺伝子の開始コドン（ａｔｇ）をＮｃｏＩ認識配列（ｃｃａｔｇｇ）に置換した領域を含む塩基配列である。プライマーＢは、ｙｗｆＥの終止コドンをＢａｍＨＩ認識配列（ｇｇａｔｃｃ）に置換した領域を含む塩基配列である。
バチルス・サチリスの染色体ＤＮＡを鋳型とし、上記プライマーＡおよびプライマーＢをプライマーセットとして用いたＰＣＲを行った。ＰＣＲは、０．１μｇの染色体ＤＮＡ、０．５μｍｏｌ／Ｌの各プライマー、２．５ｕｎｉｔｓのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、４μＬのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液、２００μｍｏｌ／Ｌの各ｄＮＴＰを含む反応液４０μＬを調製し、９４℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で３分間の工程を３０回繰り返すことにより行った。
該反応液の１／１０量をアガロース電気泳動し、ｙｗｆＥ遺伝子断片に相当する約１．４ｋｂの断片が増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルム溶液を添加し、混合した。該混合液を遠心分離後、得られた上層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離しＤＮＡの沈殿を得た。該ＤＮＡの沈殿を２０μＬのＴＥに溶解した。
該溶解液５μＬを用い、増幅したＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンＩＩキット（ＢＩＯ １０１社製）により、ｙｗｆＥ遺伝子を含む１．４ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
Ｃ末端Ｈｉｓタグ付加型組換え体発現ベクターｐＱＥ６０（キアゲン社製）０．２μｇを制限酵素ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、上記と同様の方法により３．４ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
上記で得られたｙｗｆＥ遺伝子を含む１．４ｋｂのＤＮＡ断片と３．４ｋｂのＤＮＡ断片をライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて、１６℃で１６時間反応させ連結した。
該連結反応液を用いてエシェリヒア・コリＮＭ５２２株（ストラタジーン社製）をカルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）〕によって形質転換し、該形質転換体を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーから公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、Ｃ末Ｈｉｓタグ付加型ｙｗｆＥ遺伝子発現ベクターであるｐＱＥ６０ｙｗｆＥを得た。該ベクターの構造を制限酵素消化により確認した（図１）。
実験例２ ｙｗｆＥ遺伝子産物の取得
ｐＱＥ６０ｙｗｆＥを保有するエシェリヒア・コリＮＭ５２２／ｐＱＥ６０ｙｗｆＥ株を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む８ｍｌのＬＢ培地の入った太型試験管に接種し２８℃で１７時間培養した。該培養液を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５０ｍｌのＬＢ培地の入った２５０ｍｌ容三角フラスコに接種し３０℃で３時間培養した後、終濃度が１ｍｍｏｌ／Ｌになるようにイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、さらに３０℃で４時間培養した。該培養液を遠心分離し湿菌体を取得した。該湿菌体から、ＨｉｓＴｒａｐ（Ｈｉｓタグ付加タンパク精製キット、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｓｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて、説明書に従いＨｉｓタグ付加組換え型酵素を精製した。
実験例３ Ｈｉｓタグ付加組換え型酵素を用いたジペプチドの生産（１）
（ｉ）実験例２で取得した精製したＨｉｓタグ付加組換え型酵素０．０４ｍｇ、１００ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、６０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化マグネシウム、６０ｍｍｏｌ／ＬのＡＴＰ、３０ｍｍｏｌ／ＬのＬ−Ａｌａ、３０ｍｍｏｌ／ＬのＬ−Ｇｌｎからなる０．１ｍｌの反応液を調製し、３７℃で１６時間反応を行った。
反応終了後、反応生成物をジニトロフェノール化法で誘導体化した後にＨＰＬＣ法により分析した。ＨＰＬＣ法による分析は、分離カラムに関東化学社製のＬｉｃｈｒｏｓｏｒｂ−ＲＰ−１８カラムを用い、溶離液として１％（ｖ／ｖ）リン酸、２５％（ｖ／ｖ）アセトニトリルを用い、０．７ｍｌ／分の流動速度で行った。反応液中に３．７ｇ／ＬのＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｎと０．３ｇ／ＬのＬ−アラニル−Ｌ−アラニン（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ）が生成蓄積していることを確認した。
（ｉｉ）酵素を０．０１ｍｇ、Ｌ−Ｇｌｎの代わりにＬ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−ＬｅｕまたはＬ−Ｖａｌを含有する以外は、上記（ｉ）の反応液の組成と同じ反応液を調製し、上記（ｉ）の反応条件で反応させた。
反応終了後、上記（ｉ）と同様の方法により反応生成物を分析し、反応液中にそれぞれ、７．０／ＬのＬ−アラニル−Ｌ−フェニルアラニン（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｈｅ）のみ、７．０ｇ／ＬのＬ−アラニル−Ｌ−メチオニン（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｍｅｔ）および０．０３ｇ／ＬのＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ、５．０ｇ／ＬのＬ−アラニル−Ｌ−ロイシン（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｌｅｕ）および０．２ｇ／ＬのＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ、または１．６ｇ／ＬのＬ−アラニル−Ｌ−バリン（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｖａｌ）および０．３ｇ／ＬのＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａが生成蓄積していることを確認した。
（ｉｉｉ）酵素を０．０１ｍｇ、Ｌ−Ａｌａの代わりにＧｌｙ、Ｌ−Ｇｌｎの代わりにＬ−ＰｈｅまたはＬ−Ｍｅｔを含有する以外は、上記（ｉ）の反応液の組成と同じ反応液を調製し、上記（ｉ）の反応条件で反応させた。
反応終了後、上記（ｉ）と同様の方法により反応生成物を分析し、反応液中にそれぞれ５．２ｇ／Ｌのグリシル−Ｌ−フェニルアラニン（Ｇｌｙ−Ｌ−Ｐｈｅ）または１．１ｇ／Ｌのグリシル−Ｌ−メチオニン（Ｇｌｙ−Ｌ−Ｍｅｔ）が生成蓄積していることを確認した。
上記反応液組成からＡＴＰを除くとジペプチドは全く生成されなかった。
以上の結果から、ｙｗｆＥ遺伝子産物は、ＡＴＰ存在下において、Ｌ−ＡｌａとＬ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−ＬｅｕまたはＬ−Ｖａｌとから、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−ＧｌｎおよびＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−ＭｅｔおよびＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−ＬｅｕおよびＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ、またはＬ−Ａｌａ−Ｌ−ＶａｌおよびＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａを生成する活性、ＧｌｙとＬ−ＰｈｅまたはＬ−ＭｅｔとからＧｌｙ−Ｌ−ＰｈｅまたはＧｌｙ−Ｌ−Ｍｅｔを生成する活性を有することが明らかになった。
実験例４ Ｈｉｓタグ付加組換え型酵素を用いたジペプチドの生産（２）
実験例２で得られた精製したＨｉｓタグ付加組換え型酵素０．０４ｍｇ、１００ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、６０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化マグネシウム、６０ｍｍｏｌ／ＬのＡＴＰからなる０．１ｍｌの反応液を調製し、表１の第１行目と最左列のアミノ酸の組み合わせからなる各種Ｌ−アミノ酸、Ｇｌｙまたはβ−Ａｌａをそれぞれ３０ｍｍｏｌ／Ｌずつになるように反応液に添加し、３７℃で１６時間反応を行った。反応終了後、反応生成物をＨＰＬＣ分析したところ、第１表に示すジペプチドが生成していることが確認された。
第１表の第１行目と最左列に記載の２種類（もしくは１種類）のＬ−アミノ酸、Ｇｌｙまたはβ−Ａｌａを基質として反応した場合に生成したジペプチドを枠内に記載した。○は配列は未確定だがジペプチドが生成したこと、×はジペプチドの生成が確認されなかったこと、および空欄は未実施を示す。
実験例５ Ｈｉｓタグ付加組換え型酵素発現株を用いたジペプチドの生産
実験例１で得られたエシェリヒア・コリＮＭ５２２／ｐＱＥ６０ｙｗｆＥ株を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む８ｍｌのＬＢ培地の入った太型試験管に接種し、２８℃で１７時間培養した。該培養液を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５０ｍｌのＬＢ培地の入った２５０ｍｌ容三角フラスコに接種し３０℃で３時間培養した後、終濃度が１ｍｍｏｌ／ＬになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３０℃で４時間培養した。該培養準を遠心分離し湿菌体を取得した。
２００ｇ／Ｌの湿菌体、５０ｇ／Ｌのグルコース、５ｇ／Ｌのフィチン酸（３３％の濃水酸化ナトリウム溶液を用いて中性になるよう希釈）、１５ｇ／Ｌのリン酸二水素カリウム、５ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム・７水和物、４ｇ／ＬのナイミーンＳ−２１５、１０ｍｌ／Ｌのキシレン、２００ｍｍｏｌ／ＬのＬ−Ａｌａ、２００ｍｍｏｌ／ＬのＬ−Ｇｌｎからなる２０ｍｌの反応液（ｐＨ７．２）を５０ｍｌ容量のビーカーに入れ、３２℃、９００ｒｐｍの条件下で２時間反応を行った。反応中は２ｍｏｌ／Ｌの水酸化カリウムを用いて反応液のｐＨを７．２に保った。
反応生成物を実験例３記載の方法と同様の方法で分析したところ、２５ｍｇ／ＬのＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｎの蓄積が確認された。
実験例６ バチルス属に属する各種微生物からｙｗｆＥ遺伝子に相当する遺伝子のクローニングとその解析
配列番号２６で表される塩基配列に基づき、バチルス・サチリスＡＴＣＣ１５２４５、ＡＴＣＣ６６３３、ＩＡＭ１２１３、ＩＡＭ１１０７、ＩＡＭ１２１４、ＡＴＣＣ９４６６、ＩＡＭ１０３３、ＡＴＣＣ２１５５５、バチルス・アミロリケファシエンスＩＦＯ３０２２、およびバチルス・プミルスＮＲＲＬ Ｂ−１２０２５に存在するｙｗｆＥ遺伝子に相当する遺伝子を以下のようにして取得した。
まず、バチルス・サチルスＡＴＣＣ１５２４５、ＡＴＣＣ６６３３、ＩＡＭ１２１３、ＩＡＭ１１０７、ＩＡＭ１２１４、ＡＴＣＣ９４６６、ＩＡＭ１０３３、ＡＴＣＣ２１５５５、バチルス・アミノリケファシエンスＩＦＯ３０２２、およびバチルス・プミルスＮＲＲＬ Ｂ−１２０２５をそれぞれＬＢ培地に植菌し３０℃で一晩静置培養した。培養後、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーに記載の飽和フェノールを用いる方法により、該微生物の染色体ＤＮＡをそれぞれ単離精製した。
パーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成機を用いて、配列番号３７および３８で表される塩基配列を有するＤＮＡ（以下、それぞれプライマーＣ、プライマーＤと呼ぶ）を合成した。プライマーＣは、バチルス・サチリス１６８株の染色体ＤＮＡのｙｗｆＥ遺伝子の開始コドンより上流を含む領域の配列である。プライマーＤは、ｙｗｆＥ遺伝子の終止コドンより下流を含む配列と相補的な配列である。
バチルス・サチルスＡＴＣＣ１５２４５、ＡＴＣＣ６６３３、ＩＡＭ１２１３、ＩＡＭ１１０７、ＩＡＭ１２１４、ＡＴＣＣ９４６６、ＩＡＭ１０３３、ＡＴＣＣ２１５５５、またはバチルス・アミノリケファシエンスＩＦＯ３０２２の染色体ＤＮＡを鋳型とし、上記プライマーＣおよびプライマーＤをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、０．１μｇの染色体ＤＮＡ、０．５μｍｏｌ／Ｌの各プライマー、２．５ｕｎｉｔｓのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、４μＬのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液、２００μｍｏｌ／Ｌの各ｄＮＴＰを含む反応液４０μＬを調製し、９４℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で３分間の工程を３０回繰り返すことにより行った。
該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、ｙｗｆＥ遺伝子断片に相当する約１．４ｋｂの断片が増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルム溶液を添加し、混合した。該溶液を遠心分離して得られた上層に、２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離して得られたＤＮＡの沈殿を２０μＬのＴＥに溶解した。
上記で得られた各菌株染色体ＤＮＡ由来の１．４ｋｂ断片とｐＣＲ−ｂｌｕｎｔ（インビトロジェン社製）を、ライゲーションキットを用いて、１６℃で１６時間反応を行い連結した。
該反応液を用いてエシェリヒア・コリＮＭ５２２株をカルシウムイオンを用いる方法によって形質転換した後、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布して、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、制限酵素を用いてそれぞれの構造を解析することにより、ｙｗｆＥ遺伝子に相当する遺伝子を含むプラスミドであるｐＹＷＦＥ１（ＡＴＣＣ１５２４５株由来、配列番号６５で表される塩基配列を有するＤＮＡ）、ｐＹＷＦＥ２（ＡＴＣＣ６６３３株由来、配列番号２７で表される塩基配列を有するＤＮＡ）、ｐＹＷＦＥ３（ＩＡＭ１２１３株由来、配列番号２８で表される塩基配列を有するＤＮＡ）、ｐＹＷＦＥ４（ＩＡＭ１１０７株由来、配列番号２９で表される塩基配列を有するＤＮＡ）、ｐＹＷＦＥ５（ＩＡＭ１２１４株由来、配列番号３０で表される塩基配列を有するＤＮＡ）、ｐＹＷＦＥ６（ＡＴＣＣ９４６６株由来、配列番号２６で表される塩基配列を有するＤＮＡ）、ｐＹＷＦＥ７（ＩＡＭ１０３３株由来、配列番号６５で表される塩基配列を有するＤＮＡ）、ｐＹＷＦＥ８（ＡＴＣＣ２１５５５株由来、配列番号３１で表される塩基配列を有するＤＮＡ）、ｐＹＷＦＥ９（ＩＦＯ３０２２株由来、配列番号３２で表される塩基配列を有するＤＮＡ）が取得されていることを確認した。
一方、バチルス・プミルスＮＲＲＬ Ｂ−１２０２５由来のｙｗｆＥ遺伝子に相当する遺伝子（配列番号６４で表される塩基配列を有するＤＮＡ）は以下のように取得した。
上記で調製したＮＲＲＬ Ｂ−１２０２５株の染色体ＤＮＡを鋳型にし、配列番号６６および６７で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは、０．１μｇの染色体ＤＮＡ、０．５μｍｏｌ／Ｌの各プライマー、２．５ｕｎｉｔｓのＺ−ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社製）、５μＬのＺ−ｔａｑポリメラーゼ用×１０緩衝液（タカラバイオ社製）、２００μｍｏｌ／Ｌの各ｄＮＴＰを含む反応液５０μＬを調製し、９８℃で５秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間の工程を３０回繰り返すことにより行った。
該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、約０．８ｋｂの断片が増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルム溶液を添加し、混合した。該混合液を遠心分離して得られた上層に、２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離して得られたＤＮＡの沈殿を２０μＬのＴＥに溶解した。
上記で得られた各菌株染色体ＤＮＡ由来の０．８ｋｂ断片とｐＧＥＭ Ｔ−ｅａｓｙ（プロメガ社製）を、ライゲーションキットを用いて、１６℃で１６時間反応を行い連結した。
該反応液を用いてエシェリヒア・コリＤＨ５α株をカルシウムイオンを用いる方法によって形質転換した後、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布して、３０℃で一晩培養した。
上記で得られた形質転換体からプラスミドを抽出して、約０．８ｋｂの挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を決定したところ、配列番号６４で表される塩基配列中の塩基番号３５８〜１１６０番からなる塩基配列が確認された。
次に該プラスミドをＥｃｏＲＩで切断した後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した。該ＤＮＡ断片をジーンクリーンＩＩキットを用いて精製した。約０．５μｇの該精製ＤＮＡ断片を、ＤＩＧ−ハイプライムＤＮＡラベリング＆デテクション スターターキットＩ（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）を用いて、ＤＩＧラベル化した。ＤＩＧラベル化は、該キット添付の説明書に従って行った。
上記で得られたＤＩＧラベル化ＤＮＡを用いて、ＮＲＲＬ Ｂ−１２０２５株の染色体ＤＮＡのサザン解析を行った。
ＮＲＲＬ Ｂ−１２０２５株の染色体ＤＮＡをＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＫｐｎＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｃＩ、ＳａｌＩおよびＳｐｈＩを用いてそれぞれ完全消化し、アガロース電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、常法に従いナイロンメンブレンプラスチャージ（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）に転移させた。
ＵＶを照射することにより、該ナイロン膜にＤＮＡ断片を固定した後、上記プローブＤＮＡおよび該ナイロン膜を用いてサザンハイブリダイゼーションを行った。
ハイブリダイゼーションは、該プローブＤＮＡと該ナイロン膜を６５℃で１６時間接触させ、その後該ナイロン膜を、０．１％ＳＤＳおよび２×ＳＳＣからなる溶液を用い、室温で５分間、２回洗浄し、さらに０．１％ＳＤＳおよび０．５×ＳＳＣからなる溶液を用い、６５℃で１５分間、２回洗浄することで行い、その他の操作、条件およびハイブリダイズしたＤＮＡの検出は、上記したＤＩＧ−ハイプライムＤＮＡラベリング＆デテクション スターターキットＩに添付されている説明書に準じて行った。
その結果、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｓｔＩの完全消化断片の３．５ｋｂｐ付近に発色が見られた。
次に、ＮＲＲＬ Ｂ−１２０２５株の染色体ＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｓｔＩを用いてそれぞれ全消化し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した。それぞれの制限酵素消化ＤＮＡから３−４ｋｂｐの断片をジーンクリーンＩＩキットを用いて精製し、ライゲーションキットを用いて自己環化させた。
上記で決定した０．８ｋｂのＤＮＡ断片の塩基配列に基づき、配列番号７１および７２で表される塩基配列を設計、合成し、上記で取得した環化ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、１０ｎｇの環化ＤＮＡ、０．５μｍｏｌ／Ｌの各プライマー、２．５ｕｎｉｔｓのｐｙｒｏｂｅｓｔポリメラーゼ（タカラバイオ社製）、５μＬのｐｙｒｏｂｅｓｔポリメラーゼ用×１０緩衝液（タカラバイオ社製）、２００μｍｏｌ／Ｌの各ｄＮＴＰを含む反応液５０μＬを調製し、９８℃で５秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３分３０秒間の工程を３０回繰り返すことにより行った。
該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、約３．０ｋｂの断片が増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルム溶液を添加し、混合した。該混合液を遠心分離して得られた上層に、２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離して得られたＤＮＡの沈殿を２０μＬのＴＥに溶解した。
上記で得られたＤＮＡ断片とＺｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）とをライゲーションキットを用いて連結した。
該反応液を用いてエシェリヒア・コリＮＭ５２２株をカルシウムイオンを用いる方法によって形質転換した後、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布して、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、制限酵素を用いてその構造を解析することにより、ｙｗｆＥ遺伝子に相当する遺伝子を含むプラスミドであるｐＹＷＦＥ１０（ＮＲＲＬ Ｂ−１２０２５株由来、配列番号６４で表される塩基配列を有するＤＮＡ）が得られていることを確認した。
上記で得られたｐＹＷＦＥ１〜ｐＹＷＦＥ１０に含まれるｙｗｆＥ遺伝子に相当する各遺伝子の塩基配列を塩基配列分析装置３７３Ａ・ＤＮＡシークエンサーを用いて決定した。
ｐＹＷＦＥ１、ｐＹＷＦＥ６およびｐＹＷＦＥ７に含まれる遺伝子にコードされる蛋白質のアミノ酸配列は、ｙｗｆＥ遺伝子にコードされる蛋白質のアミノ酸配列と同一であったが、ｐＹＷＦＥ２、ｐＹＷＦＥ３、ｐＹＷＦＥ４、ｐＹＷＦＥ５、ｐＹＷＦＥ８、ｐＹＷＦＥ９およびｐＹＷＦＥ１０に含まれる遺伝子にコードされる蛋白質のアミノ酸配列は、ｙｗｆＥ遺伝子にコードされる蛋白質のアミノ酸配列と異なっていた。
ｐＹＷＦＥ２、ｐＹＷＦＥ３、ｐＹＷＦＥ４、ｐＹＷＦＥ５、ｐＹＷＦＥ８、ｐＹＷＦＥ９、ｐＹＷＦＥ１０およびｐＹＷＦＥ１とｐＹＷＦＥ７に含まれるｙｗｆＥ遺伝子に相当する遺伝子にコードされる蛋白質のアミノ酸配列を配列番号２０〜２５、６８および１９に、該遺伝子の塩基配列を配列番号２７〜３２、６５および２６にそれぞれ示した。
実験例７ Ｃ末端Ｈｉｓタグ付加型組換え型ジペプチド合成酵素の精製
バチルス・サチルスＡＴＣＣ１５２４５、ＡＴＣＣ６６３３、ＩＡＭ１２１３、ＩＡＭ１１０７、ＩＡＭ１２１４、ＡＴＣＣ９４６６、ＩＡＭ１０３３、ＡＴＣＣ２１５５５、またはバチルス・アミノリケファシエンスＩＦＯ３０２２の染色体ＤＮＡを鋳型とし、実験例１記載のプライマーＡおよびプライマーＢをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、０．１μｇの染色体ＤＮＡ、０．５μｍｏｌ／Ｌの各プライマー、２．５ｕｎｉｔｓのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、４μＬのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液、２００μｍｏｌ／Ｌの各ｄＮＴＰを含む反応液４０μＬを調製し、９４℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で３分間の工程を３０回繰り返すことにより行った。
バチルス・プミルスＮＲＲＬ Ｂ−１２０２５の染色体ＤＮＡを鋳型とした場合は、配列番号６９および７０で表される塩基配列を有するＤＮＡをプライマーセットとして用い、上記と同様の条件でＰＣＲを行った。
該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、ｙｗｆＥ断片に相当する約１．４ｋｂのＤＮＡ断片がそれぞれ増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルム溶液を添加し、混合した。該混合液を遠心分離して得られた上層に、２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離して得られたＤＮＡの沈殿を２０μＬのＴＥに溶解した。
該溶解液のそれぞれ５μＬを用い、増幅したＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンＩＩキットを用いて、ｙｗｆＥ遺伝子に相当する遺伝子を含む１．４ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
次にＣ末端Ｈｉｓタグ付加型組換え体発現ベクターｐＱＥ６０ ０．２μｇを制限酵素ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、上記と同様の方法により３．４ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
上記で得られたバチルス・サチルス１６８株のｙｗｆＥ遺伝子に相当する遺伝子を含む１．４ｋｂのＤＮＡ断片、および３．４ｋｂのＤＮＡ断片をライゲーションキットを用いて、１６℃で１６時間反応を行いそれぞれ連結した。該反応液を用いて大腸菌ＮＭ５２２株をカルシウムイオンを用いる方法により形質転換した後、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布して、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、制限酵素を用いてそれらの構造を解析することにより、Ｃ末Ｈｉｓタグ付加型遺伝子発現ベクターであるｐＱＥ６０ｙｗｆＥ１（ＡＴＣＣ１５２４５由来の遺伝子を含有するベクター）、ｐＱＥ６０ｙｗｆＥ２（ＡＴＣＣ６６３３由来の遺伝子を含有するベクター）、ｐＱＥ６０ｙｗｆＥ３（ＩＡＭ１２１３由来の遺伝子を含有するベクター）、ｐＱＥ６０ｙｗｆＥ４（ＩＡＭ１１０７由来の遺伝子を含有するベクター）、ｐＱＥ６０ｙｗｆＥ５（ＩＡＭ１２１４由来の遺伝子を含有するベクター）、ｐＱＥ６０ｙｗｆＥ６（ＡＴＣＣ９４６６由来の遺伝子を含有するベクター）、ｐＱＥ６０ｙｗｆＥ（ＩＡＭ１０３３由来の遺伝子を含有するベクター）、ｐＱＥ６０ｙｗｆＥ８（ＡＴＣＣ２１５５５由来の遺伝子を含有するベクター）、ｐＱＥ６０ｙｗｆＥ９（ＩＦＯ３０２２由来の遺伝子を含有するベクター）、およびｐＱＥ６０ｙｗｆＥ１０（ＮＲＲＬ Ｂ−１２０２５由来の遺伝子を含有するベクター）が取得されていることを確認した。
上記で得られたエシェリヒア・コリＮＭ５２２／ｐＱＥ６０ｙｗｆＥ１〜ＮＭ５２２／ｐＱＥ６０ｙｗｆＥ１０株を、それぞれ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む８ｍｌのＬＢ培地の入った太型試験管に接種し、２８℃で１７時間培養した。該培養液を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５０ｍｌのＬＢ培地の入った２５０ｍｌ容の三角フラスコに接種し３０℃で３時間培養した後、終濃度が１ｍｍｏｌ／ＬになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３０℃で４時間培養した。該培養液を遠心分離して得られた湿菌体から、ＨｉｓＴｒａｐをその使用説明書に従って用いて、Ｈｉｓタグ付加組換え型酵素を精製した。
実験例８ 精製酵素を用いたジペプチドの生産
実験例７で得られた組換え型酵素０．０４ｍｇ、１００ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、６０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化マグネシウム、６０ｍｍｏｌ／ＬのＡＴＰ、３０ｍｍｏｌ／ＬのＬ−Ａｌａおよび３０ｍｍｏｌ／ＬのＬ−Ｇｌｎからなる０．１ｍｌの反応液を調製し、３７℃で１６時間反応を行った。
反応終了後、実験例３記載の方法により反応液を分析した結果、それぞれ、３．０〜３．５ｇ／ＬのＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｎおよび０．２５〜０．３ｇ／ＬのＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａが生成蓄積していることが確認された。
また、上記反応液組成からＡＴＰを除くとＬ−Ａｌａ−Ｌ−ＧｌｎおよびＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａは全く生成されなかった。
以上の結果から、実験例７で得られた遺伝子の産物は、いずれもＡＴＰ存在下でＬ−ＡｌａとＬ−ＧｌｎとからＬ−Ａｌａ−Ｌ−ＧｌｎおよびＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａを生成する活性を有することが明らかになった。
実験例９ ｙｗｆＥ遺伝子の発現を強化した大腸菌の造成
パーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成機を用いて、配列番号６０〜６３に記載の配列をそれぞれ有するＤＮＡ（以下、それぞれプライマーＥ、プライマーＦ、プライマーＧ、プライマーＨ）を合成した。配列番号６０の配列は、プラスミドｐＱＥ６０ｙｗｆＥのｙｗｆＥのリボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ配列を含む領域について５’にＸｈｏＩ認識配列を含む配列を付加したものである。配列番号６１の配列は、ｙｗｆＥの終止コドンを含む配列と相補的な配列の５’にＢａｍＨＩ認識配列を含む配列を付加したものである。また配列番号６２の配列は、ｔｒｐプロモーターを含む発現ベクターｐＴｒＳ３０のｔｒｐプロモーター領域の配列について５’にＥｃｏＲＩ認識配列を含む配列を付加したものである。配列番号６３の配列は、ｔｒｐプロモーターを含む発現ベクターｐＴｒＳ３０のｔｒｐプロモーター領域の配列と相補的な配列の５’にＸｈｏＩ認識配列を含む配列を付加したものである。
プラスミドｐＱＥ６０ｙｗｆＥを鋳覯とし、ｙｗｆＥ断片の増幅には上記のプライマーＥおよびプライマーＦを、ｔｒｐプロモーター領域の断片の増幅にはプライマーＧおよびプライマーＨをそれぞれプライマーセットとして用いたＰＣＲを行った。ＰＣＲは、１０ｎｇのｐＱＥ６０ｙｗｆＥ、０．５μｍｏｌ／ｌの各プライマー、２．５ｕｎｉｔｓのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、４μｌのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液、２００μｍｏｌ／ｌの各ｄＮＴＰを含む４０μｌの反応液を調製し、９４℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で３分間の工程を３０回繰り返すことにより行った。
該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、プライマーＥおよびプライマーＦを用いたＰＣＲではｙｗｆＥ遺伝子断片に相当する約１．４ｋｂ、プライマーＧおよびプライマーＨを用いた反応ではｔｒｐプロモーター領域の断片に相当する約０．３ｋｂの断片がそれぞれ増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルム溶液を添加し、混合した。該溶液を遠心分離後、得られた上層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離して得られたＤＮＡを２０μｌのＴＥに溶解した。
上記で得られたそれぞれのＤＮＡ溶液５μｌを用い、プライマーＥおよびプライマーＦで増幅したＤＮＡを制限酵素ＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩで、またプライマーＧおよびプライマーＨで増幅したＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンＩＩキットにより、それぞれｙｗｆＥ遺伝子を含む１．４ｋｂおよびｔｒｐプロモーター領域を含む０．３ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
０．２μｇのｔｒｐプロモーターを含む発現ベクターｐＴｒＳ３０を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に４．５ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
上記で得られたｙｗｆＥ遺伝子を含む１．４ｋｂ断片、ｔｒｐプロモーター領域を含む０．３ｋｂ断片および４．５ｋｂの断片をライゲーションキットを用いて、１６℃で１６時間、連結反応を行った。
該反応液を用いて大腸菌ＮＭ５２２株をカルシウムイオンを用いる方法に従って形質転換し、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、ｔｒｐプロモーター下流にｙｗｆＥ遺伝子を含む発現ベクターであるｐＰＥ５６を得た。該ベクターの構造を制限酵素消化により確認した（図２）。
【図面の簡単な説明】
第１図は、Ｈｉｓタグ付加型ｙｗｆＥ遺伝子発現ベクターであるｐＱＥ６０ｙｗｆＥの構築過程を示す図である。
第２図は、ｙｗｆＥ遺伝子発現強化型ベクターであるｐＰＥ５６の構築過程を示す図である。
各図中の符号の意味は以下のとおりである。
ＰＴ５；Ｔ５プロモーター
Ｐｔｒｐ；トリプトファンプロモーター
以下に本発明の実施例を示すが、下記実施例は本発明の範囲を制限するものではない。
【発明を実施するための最良の形態】
実施例１ ｐｅｐＤ遺伝子、ｐｅｐＮ遺伝子、ｐｅｐＢ遺伝子、ｐｅｐＡ遺伝子およびｄｐｐオペロン欠損株の作製
エシェリヒア・コリ染色体ＤＮＡ上の特定遺伝子が欠損した菌株は、ラムダファージの相同組換え系を利用した方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，６６４１−６６４５（２０００）］に従って作製した。
以下に記載のプラスミドｐＫＤ４６、ｐＫＤ３およびｐＣＰ２０は、エシェリヒア・コリ ジェネティック ストック センター（米国エール大学）から該プラスミドを保持するエシェリヒア・コリ株を入手し、該大腸菌から抽出したものを用いた。
（１）遺伝子欠損用ＤＮＡ断片のクローニング
エシェリヒア・コリＫ１２株の染色体ＤＮＡ上に存在する配列番号１０で表される塩基配列を有するｐｅｐＤ遺伝子、配列番号１１で表される塩基配列を有するｐｅｐＮ遺伝子、配列番号１２で表される塩基配列を有するｐｅｐＢ遺伝子、配列番号１３で表される塩基配列を有するｐｅｐＡ遺伝子および配列番号１４で表される塩基配列を有するｄｐｐＡ遺伝子、配列番号１５で表される塩基配列を有するｄｐｐＢ遺伝子、配列番号１６で表される塩基配列を有するｄｐｐＣ遺伝子、配列番号１７で表される塩基配列を有するｄｐｐＤ遺伝子および配列番号１８で表される塩基配列を有するｄｐｐＦ遺伝子を欠損させることを目的に、パーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成機を用い、エシェリヒア・コリＫ１２株の染色体ＤＮＡ上における各々の欠損標的遺伝子の上流および下流に位置する３６ｂｐからなる塩基配列と相同な塩基配列、および配列番号３９で表される酵母由来Ｆｌｐ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅが認識する塩基配列を有するＤＮＡを合成した。ただし、ｄｐｐＡ遺伝子、ｄｐｐＢ遺伝子、ｄｐｐＣ遺伝子、ｄｐｐＤ遺伝子およびｄｐｐＦ遺伝子は、オペロンを形成しているので、該オペロンの上流および下流に位置する塩基配列と相同な塩基配列を有するＤＮＡを合成した。
すなわち、ｐｅｐＤ遺伝子欠損用ＤＮＡ断片増幅用プライマーセットとして配列番号４０および４１、ｐｅｐＮ遺伝子欠損用ＤＮＡ断片増幅用プライマーセットとして配列番号４２および４３、ｐｅｐＡ遺伝子欠損用ＤＮＡ断片増幅用プライマーセットとして配列番号４４および４５、ｐｅｐＢ遺伝子欠損用ＤＮＡ断片増幅用プライマーセットとして配列番号４６および４７、ｄｐｐオペロン欠損用ＤＮＡ断片増幅用プライマーセットとして配列番号４８および４９で表される塩基配列からなるＤＮＡをそれぞれ合成した。
次に、上記合成ＤＮＡをプライマーセットとして用い、ｐＫＤ３ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲは１０ｎｇのプラスミドＤＮＡ、０．５μｍｏｌ／ｌの各プライマー、２．５ｕｎｉｔｓのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）、４μｌのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液（ストラタジーン社製）、２００μｍｏｌ／ｌの各ｄｅｏｘｙＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびＴＴＰ）を含む４０μｌの反応液を用い、９４℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で３分間の工程を３０回繰り返すことにより行った。
それぞれの反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、目的の断片が増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ〔１０ｍｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ〕飽和フェノール／クロロホルム（１ｖｏｌ／１ｖｏｌ）を添加し、混合した。
該混合液を遠心分離後、得られた上層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃で３０分間放置した。該溶液を遠心分離し、ｐｅｐＤ遺伝子、ｐｅｐＮ遺伝子、ｐｅｐＢ遺伝子、ｐｅｐＡ遺伝子およびｄｐｐオペロン欠損用クロラムフェニコール耐性遺伝子含有ＤＮＡ断片を取得した。
（２）ｐｅｐＤ遺伝子欠損エシェリヒア・コリＪＭ１０１の作製
大腸菌ＪＭ１０１株をｐＫＤ４６で形質転換し、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３０℃で培養することで選択した。
プラスミドｐＫＤ４６上にはλＲｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ遺伝子が挿入されており、またその発現はＬ−アラビノースにより誘導されるよう設計されている。よって、Ｌ−アラビノース存在下で生育させた大腸菌を、直鎖状ＤＮＡを用いて形質転換すると、高頻度で相同組換えが起こる。またｐＫＤ４６は温度感受性の複製起点を有するために、４２℃で生育させることにより、プラスミドを容易に脱落させることができる。
１０ｍｍｏｌ／ｌのＬ−アラビノースと５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加して培養して得られた大腸菌ＪＭ１０１／ｐＫＤ４６に、電気パルス法により上記で取得したｐｅｐＤ遺伝子欠損用クロラムフェニコール耐性遺伝子含有ＤＮＡ断片を導入し、大腸菌ＪＭ１０１の染色体ＤＮＡ上にｐｅｐＤ遺伝子欠損用クロラムフェニコール耐性遺伝子含有ＤＮＡ断片が相同組換えにより組込まれた形質転換株を２５ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地（バクトトリプトン１０ｇ／ｌ、バクトイーストエキストラクト５ｇ／ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／ｌ、寒天１５ｇ／ｌ）に塗布し、３０℃で培養することで選択した。
選択したクロラムフェニコール耐性株を、２５ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地に植菌し、４２℃で１４時間培養した後、単コロニー分離した。得られた各コロニーを２５ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地、及び１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地にレプリカし、３７℃で培養し、クロラムフェニコール耐性かつアンピシリン感受性を示すコロニーを選択することにより、ｐＫＤ４６脱落株を取得した。
次に上記で得られたｐＫＤ４６脱落株をｐＣＰ２０を用いて形質転換し、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上で選択することにより、ｐＣＰ２０を保持するｐＫＤ４６脱落株を取得した。
プラスミドｐＣＰ２０には酵母由来Ｆｌｐ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ遺伝子が挿入されており、該遺伝子の発現は４２℃で誘導されるよう設計されている。
また、上記で作製したｐｅｐＤ遺伝子、ｐｅｐＮ遺伝子、ｐｅｐＢ遺伝子、ｐｅｐＡ遺伝子及びｄｐｐオペロン欠損用クロラムフェニコール耐性遺伝子含有ＤＮＡ断片の、クロラムフェニコール耐性遺伝子の両端にはＦｌｐ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅが認識する塩基配列が存在するため、Ｆｌｐ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅが触媒する相同組換えにより容易に該耐性遺伝子を脱落させることができる。
さらに、ｐＣＰ２０は温度感受性の複製起点を有しているため、ｐＣＰ２０保持株を４２℃で生育させることにより、Ｆｌｐ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅの発現とｐＣＰ２０の脱落を同時に誘導することができる。
上記で取得したｐＣＰ２０保有ｐＫＤ４６脱落株を薬剤無添加のＬＢ寒天培地に植菌し、４２℃で１４時間培養した後、単コロニー分離した。得られた各コロニーを薬剤無添加ＬＢ寒天培地、２５ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地および１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地にレプリカして、３０℃で培養し、クロラムフェニコール感受性かつアンピシリン感受性を示すコロニーを選択した。
上記で選択した各株からそれぞれ染色体ＤＮＡを常法（生物工学実験書、日本生物工学会編９７〜９８ページ、培風館、１９９２年）に従って調製した。欠損の標的遺伝子であるｐｅｐＤ遺伝子の内部塩基配列に基づいて設計した配列番号５０および５１で表される塩基配列を有するＤＮＡをプライマーセットとして用い、染色体ＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲを行った。ＰＣＲは、０．１μｇの染色体ＤＮＡ、０．５μｍｏｌ／ｌの各プライマー、２．５ｕｎｉｔｓのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、４μｌのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液、２００μｍｏｌ／ｌの各ｄｅｏｘｙＮＴＰを含む４０μｌの反応液を用い、９４℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で３分間からなる工程を３０回繰り返すことにより行った。
上記ＰＣＲにおいて、増幅ＤＮＡ断片が検出されなかった株をｐｅｐＤ遺伝子欠損株とし、エシェリヒア・コリＪＰＤ１株と名づけた。
（３）エシェリヒア・コリＪＭ１０１の染色体ＤＮＡ上のｐｅｐＤ遺伝子およびｐｅｐＮ遺伝子が欠損した株の作製
上記（２）で得られたエシェリヒア・コリＪＰＤ１株をｐＫＤ４６で形質転換し、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３０℃で培養することにより選択した。得られた形質転換株（エシェリヒア・コリＪＰＤ１／ｐＫＤ４６）に、電気パルス法によりｐｅｐＮ遺伝子欠損用クロラムフェニコール耐性遺伝子含有ＤＮＡ断片を導入し、エシェリヒア・コリＪＰＤ１／ｐＫＤ４６の染色体ＤＮＡ上にｐｅｐＮ遺伝子欠損用クロラムフェニコール耐性遺伝子含有ＤＮＡ断片が相同組換えにより組込まれた形質転換株を取得した。
次に、上記（２）と同様の操作を行うことにより、染色体ＤＮＡ上からクロラムフェニコール耐性遺伝子が欠落した株を取得し、該株をエシェリヒア・コリＪＰＤＮ２と名づけた。
（４）エシェリヒア・コリＪＭ１０１の染色体ＤＮＡ上のｐｅｐＮ遺伝子、ｐｅｐＡ遺伝子、ｐｅｐＢ遺伝子またはｄｐｐオペロンが欠損した株、および多重遺伝子欠損株の作製
ｐｅｐＮ遺伝子、ｐｅｐＡ遺伝子、ｐｅｐＢ遺伝子またはｄｐｐオペロンの欠損株は、上記（１）で作製した各遺伝子またはオペロン欠損用クロラムフェニコール耐性遺伝子含有ＤＮＡ断片を用い、上記（２）と同様の方法により作製した。
上記方法により各々の遺伝子欠損株が取得されたことは、各々の欠損遺伝子の内部塩基配列に基づき設計、合成した配列番号５２〜５９で表される塩基配列を有するＤＮＡをプライマーセットとして用い、上記（２）と同様のＰＣＲにより確認した。ここで、配列番号５２および５３で表される塩基配列からなるＤＮＡはｐｅｐＮ遺伝子欠損確認用、配列番号５４および５５で表される塩基配列からなるＤＮＡはｐｅｐＡ遺伝子欠損確認用、配列番号５６および５７で表される塩基配列からなるＤＮＡはｐｅｐＢ遺伝子欠損確認用、配列番号５８および５９で表される塩基配列からなるＤＮＡはｄｐｐオペロン欠損確認用プライマーセットである。
上記方法で取得されたｄｐｐオペロン欠損株をエシェリヒア・コリＪＤＰＰ１株、ｐｅｐＮ遺伝子欠損株をエシェリヒア・コリＪＰＮ１株、ｐｅｐＡ遺伝子欠損株をエシェリヒア・コリＪＰＡ１株、ｐｅｐＢ遺伝子欠損株をエシェリヒア・コリＪＰＢ７株と名付けた。
また、上記（３）の方法に準じて、ｐｅｐＤ遺伝子、ｐｅｐＮ遺伝子、ｐｅｐＡ遺伝子、ｐｅｐＢ遺伝子およびｄｐｐオペロンからなる群より選ばれる２以上の遺伝子またはオペロンの多重欠損株を作製した。多重欠損株が取得できたことの確認は、上記（２）と同様のＰＣＲにより確認した。前記方法で取得されたｐｅｐＤ遺伝子およびｄｐｐオペロンが欠損した二重遺伝子欠損株をエシェリヒア・コリＪＰＤＰ４９株、ｐｅｐＢ遺伝子、ｐｅｐＤ遺伝子およびｐｅｐＮ遺伝子が欠損した三重遺伝子欠損株をエシェリヒア・コリＪＰＤＮＢ４３株、ｐｅｐＤ遺伝子、ｐｅｐＮ遺伝子およびｄｐｐオペロンが欠損した三重遺伝子欠損株をエシェリヒア・コリＪＰＮＤＤＰ３６株、ｐｅｐＡ遺伝子、ｐｅｐＤ遺伝子、ｐｅｐＮ遺伝子およびｄｐｐオペロンが欠損した四重遺伝子欠損株をエシェリヒア・コリＪＰＮＤＡＰ５株、ｐｅｐＢ遺伝子、ｐｅｐＤ遺伝子、ｐｅｐＮ遺伝子およびｄｐｐオペロンが欠損した四重遺伝子欠損株をエシェリヒア・コリＪＰＮＤＢＰ７株と名づけた。第２表は、各遺伝子欠損株における欠損遺伝子名を示す。
実施例２ ペプチダーゼおよびペプチド取り込み活性が喪失した大腸菌株を用いたＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン（以下、ＡｌａＧｌｎと称す）及びＬ−アラニル−Ｌ−アラニン（以下、ＡｌａＡｌａと称す）の生産性の評価。
実施例１で得られた各種ペプチダーゼ遺伝子およびジペプチド取り込み蛋白質をコードするオペロンの欠損株を、実験例８で造成したプラスミドｐＰＥ５６を用いて形質転換し、アンピシリン耐性を示す形質転換株を取得した。
得られた形質転換株を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む８ｍｌのＬＢ培地の入った試験管に接種し、２８℃で１７時間培養した。該培養液を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む８ｍｌの生産培地（リン酸水素二カリウム １６ｇ／ｌ、リン酸二水素カリウム １４ｇ／ｌ、硫酸アンモニウム ５ｇ／Ｌ、クエン酸（無水） １ｇ／ｌ、カザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ社製） ０．５ｇ／ｌ、Ｌ−Ｐｒｏ １ｇ／ｌ、Ｌ−Ａｌａ ２．５ｇ／ｌ、Ｌ−Ｇｌｎ ２．５ｇ／ｌ、グルコース １０ｇ／ｌ、ビタミンＢ１ １０ｍｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・７水和物 ２５ｍｇ／ｌ、硫酸鉄７水和物 ５０ｍｇ／ｌ、１０ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨ７．２に調整。Ｌ−Ｇｌｎは１０倍濃縮液をフィルターろ過滅菌後、グルコース、ビタミンＢ１、硫酸マグネシウム・７水和物、硫酸鉄・７水和物は別個に蒸煮後添加）を試験管に１％接種し、３０℃で２４時間培養した。該培養液を遠心分離し培養上清を取得した。
培養上清中の生産物をＦ−ｍｏｃ化法で誘導体化した後にＨＰＬＣ法により分析した。ＨＰＬＣ法による分析は、分離カラムにＯＤＳ−ＨＧ５（野村化学社製）を用い、溶離液としてＡ液（酢酸 ６ｍｌ／ｌ、２０％（ｖ／ｖ）アセト二トリル、トリエチルアミンにてｐＨ４．８に調整）およびＢ液（酢酸 ６ｍｌ／ｌ、７０％（ｖ／ｖ）アセト二トリル、トリエチルアミンにてｐＨ４．８調整）を用い、０〜５分まではＡ液：Ｂ液＝８：２、５〜２０分までは、２０分目でＡ液：Ｂ液＝１：１になるようにリニアーグラジエントをかける条件で分析を行った。分析結果を第３表に示す。
第３表から、２種以下のペプチダーゼ遺伝子が欠損した微生物、１種のペプチド取り込み蛋白質遺伝子のみが欠損した微生物では、ジペプチドの生成、蓄積量は低いが、１種以上のペプチダーゼ遺伝子および１種のペプチド取り込み蛋白質遺伝子が欠損した微生物、または３種以上のペプチダーゼ遺伝子が欠損した微生物では、ジペプチドの生成、蓄積量が大幅に増加していることがわかった。
実施例３ ペプチダーゼおよびペプチド取り込み蛋白質の活性が喪失した大腸菌株を用いたＬ−アラニル−Ｌ−バリン（以下、ＡｌａＶａｌと称す）の生産性の評価
実施例２と同様に、各種ペプチダーゼ遺伝子およびペプチド取り込み蛋白質をコードするオペロンの欠損大腸菌株を、ｐＰＥ５６を用いて形質転換した。得られた形質転換株を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む８ｍｌのＬＢ培地の入った試験管に接種し、２８℃で１７時間培養した。該培養液を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む８ｍｌの生産培地（リン酸水素二カリウム １６ｇ／ｌ、リン酸二水素カリウム １４ｇ／ｌ、硫酸アンモニウム ５ｇ／ｌ、クエン酸（無水） １ｇ／ｌ、カザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ社製） ０．５ｇ／ｌ、Ｌ−Ｐｒｏ １ｇ／ｌ、Ｌ−Ａｌａ ２．５ｇ／ｌ、Ｌ−Ｖａｌ ２．５ｇ／ｌ、グルコース １０ｇ／ｌ、ビタミンＢ１ １０ｍｇ／ｌ、硫酸マグネシウム・７水和物 ２５ｍｇ／ｌ、硫酸鉄・７水和物 ５０ｍｇ／ｌ、１０ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム溶液でｐＨ７．２に調整。グルコース、ビタミンＢ１、硫酸マグネシウム・７水和物、硫酸鉄・７水和物は別個に蒸煮後に添加）が入った試験管に１％接種し、３０℃で２４時間培養した。該培養液を遠心分離し培養上清を取得した。
培養上清中の生成物を、実施例２記載の方法により分析した。結果を第４表に示す。
第４表から、２種以下のペプチダーゼ遺伝子が欠損した微生物、および１種のペプチド取り込み蛋白質遺伝子のみが欠損した微生物はジペプチドを生産しないが、３種以上のペプチダーゼ遺伝子が欠損した微生物、または１種以上のペプチダーゼ遺伝子および１種のペプチド取り込み蛋白質遺伝子が欠損した微生物は、ジペプチドを生産することがわかった。
実施例４ ペプチダーゼおよびペプチド取り込み蛋白質の活性が喪失した大腸菌株を用いたグリシル−Ｌ−グルタミン（以下、ＧｌｙＧｌｎと称す）の生産性の評価
実施例２と同様に各種ペプチダーゼ遺伝子およびペプチド取り込み蛋白質をコードするオペロンの欠損株を、ｐＰＥ５６を用いて形質転換した。得られた形質転換株を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む８ｍｌのＬＢ培地の入った試験管に接種し、２８℃で１７時間培養した。
該培養液を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む８ｍｌの生産培地（リン酸水素二カリウム １６ｇ／ｌ、リン酸二水素カリウム １４ｇ／ｌ、硫酸アンモニウム ５ｇ／Ｌ、クエン酸（無水） １ｇ／ｌ、カザミノ酸（ディフコ社製） ０．５ｇ／ｌ、Ｌ−Ｐｒｏ、１ｇ／ｌ、Ｇｌｙ ２．５ｇ／ｌ、Ｌ−Ｇｌｎ ２．５ｇ／ｌ、グルコース １０ｇ／ｌ、ビタミンＢ１ １０ｍｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・７水和物 ２５ｍｇ／ｌ、硫酸鉄７水和物 ５０ｍｇ／ｌ、１０ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨ７．２に調整。Ｌ−Ｇｌｎは１０倍濃縮液をフィルターろ過滅菌後、グルコース、ビタミンＢ１、硫酸マグネシウム・７水和物、硫酸鉄・７水和物は別個に蒸煮後添加）が入った試験管に１％接種し、３０℃で２４時間培養した。該培養液を遠心分離し培養上清を取得した。
培養上清中の生成物を、実施例２記載の方法より分析した。結果を第５表に示す。
第５表から、２種以下のペプチダーゼ遺伝子が欠損した微生物、および１種のペプチド取り込み蛋白質遺伝子のみが欠損した微生物は、ジペプチドを生産しなかったが、３種以上のペプチダーゼ遺伝子が欠損した微生物、および２種以上のペプチダーゼ遺伝子および１種のペプチド取り込み蛋白質遺伝子が欠損のした微生物は、ジペプチドを生産することがわかった。
【産業上の利用可能性】
本発明により、ジペプチドを生産する微生物および該微生物を用いたジペプチドの製造法を提供することができる。
【配列表フリーテキスト】
配列番号３５−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号３６−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号３７−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号３８−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号３９−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号４０−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号４１−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号４２−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号４３−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号４４−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号４５−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号４６−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号４７−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号４８−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号４９−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号５０−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号５１−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号５２−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号５３−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号５４−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号５５−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号５６−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号５７−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号５８−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号５９−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号６０−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号６１−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号６２−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号６３−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号６６−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号６７−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号６９−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号７０−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号７１−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号７２−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
【図１】
【図２】
【技術分野】
本発明は、ジペプチドを生産する微生物および該微生物を用いたジペプチドの製造法に関する。
【背景技術】
ジペプチドは、食品、医薬品、化粧品等として重要な化合物である。
ジペプチドの製造法としては、天然物からの抽出法、化学合成法、酵素法が知られている。天然物からの抽出法は、生産できるジペプチドの種類が限られている上、天然物中に含まれる目的のジペプチドの含量が低く生産性が悪い。化学合成法によるジペプチドの合成では、官能基の保護・脱保護などの操作が必要であり、またラセミ体も合成されることから、化学合成法は経済的、効率的な方法とはいえない。また、化学合成法は大量の有機溶媒等を使うため環境衛生上も好ましい方法ではない。
酵素法によるジペプチドの合成に関しては、タンパク質分解酵素（プロテアーゼ）の逆反応を利用した方法［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１１９，７０７−７２０（１９３７）］、耐熱性アミノアシルｔ−ＲＮＡ合成酵素を利用する方法（特開昭５８−１４６５３９号公報、特開昭５８−２０９９９１号公報、特開昭５８−２０９９９２号公報、特開昭５９−１０６２９８号公報）、非リボゾームペプチドシンセターゼ（以下、ＮＲＰＳと称す）を利用する方法［Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，７，３７３−３８４（２０００）、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，４９８，４２−４５（２００１）、米国特許第５７９５３８号、米国特許第５６５２１１６号］、Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａリガーゼを利用する方法［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５，１０４６４−１０４７１（１９９６）］、バシリシン合成酵素を利用する方法［Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２，２０１−２０８（１９８７）、Ｅｎｚｙｍｅ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，２９，４００−４０６（２００１）］、Ｌ−アミノ酸アミドハイドロラーゼまたはプロリンイミノペプチダーゼを利用する方法（国際公開第ＷＯ０３／０１０３０７号パンフレット）が知られている。
しかし、タンパク分解酵素の逆反応を利用した方法では、基質となるアミノ酸の官能基の保護・脱保護が必要であり、ペプチド形成反応の効率化およびペプチド分解反応の阻止が困難といった問題点がある。耐熱性アミノアシルｔ−ＲＮＡ合成酵素を利用する方法には、酵素の発現、副生物の生成反応の阻止が困難という問題点がある。
一方、ＮＲＰＳ、Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａリガーゼおよびバシリシン合成酵素を利用する方法は、上記したような問題点はなく、特定の配列のジペプチドを製造することができる方法であるが、ＡＴＰなどのエネルギー供給源を必要とする反応であるため、効率的な方法ではない。
Ｌ−アミノ酸アミドハイドロラーゼまたはプロリンイミノペプチダーゼを利用する方法では、該酵素を生産する微生物の培養物、該培養物より分離した微生物菌体、該微生物菌体の処理物を用いてジペプチドを製造することができる旨記載されているが、該製造法によるジペプチドの生産量は十分なものではない。
生細胞は、不要になった蛋白質を構成アミノ酸にまで分解し、生じたアミノ酸を必要な蛋白質の合成に用いる代謝を営んでいる。該機能は細胞の生存、増殖に必須であるため、生物には多種のプロテアーゼやペプチダーゼが存在することが知られている。
例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）には少なくとも７種のジペプチダーゼが存在する他、他のプロテアーゼやペプチダーゼによっても分解されるジペプチドがあることが知られている［ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．Ｒｅｖ．，６３，２６５−２７６（１９８９）］。また、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、バチルス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の染色体ＤＮＡ上にはペプチダーゼ遺伝子と同定されている遺伝子が、それぞれ２５以上、１４以上、２０以上存在している。
しかしながら、ジペプチドを生産する微生物に、ペプチダーゼの欠損を導入することによりジペプチドの生産量が上昇することについては知られていない。
また、生細胞には複数のペプチド取込みシステムが備わっていることが知られている。
例えばエシェリヒア・コリにはジペプチドを取り込む３つのシステムがあることが報告されている［Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，５，４８９−５０４（１９９８）、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１４５，２８９１−２９０１（１９９９）］。ゲノムＤＮＡ情報からも、エシェリヒア属、バチルス属、コリネバクテリウム属およびサッカロマイセス属に属する微生物にはいずれも３種類あるいはそれ以上のペプチド取込みシステムが存在することが確認されている。
しかしながら、細胞内で合成されたジペプチドが細胞外に排出されるか否かは知られておらず、ましてジペプチドを生産する微生物に、ペプチドの取込みに関与する蛋白質の欠損を導入することにより、ジペプチドの生産量が上昇することは知られていない。
【発明の開示】
本発明の目的は、ジペプチドを生産する微生物および該微生物を用いたジペプチド製造法を提供することにある。
本発明は、以下の（１）〜（２１）に関する。
（１） １種以上のペプチダーゼおよび１種以上のペプチド取り込み活性を有する蛋白質（以下、ペプチド取込み蛋白質ともいう）の活性が低下または喪失し、かつジペプチドを生産する能力を有する微生物。
（２） ３種以上のペプチダーゼの活性が低下または喪失し、かつジペプチドを生産する能力を有する微生物。
（３） ペプチダーゼが、配列番号１〜４のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、または配列番号１〜４のいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつペプチダーゼ活性を有する蛋白質である上記（１）または（２）の微生物。
（４） ペプチド取込み蛋白質が、配列番号５〜９のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、または配列番号５〜９のいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、かつペプチド取り込み活性を有する蛋白質である上記（１）または（３）の微生物。
（５） ジペプチドを生産する能力を有する微生物が、以下の［１］〜［４］のいずれかに記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物である上記（１）〜（４）のいずれか１つの微生物。
［１］配列番号１９〜２５および６８のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［２］配列番号１９〜２５および６８のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつジペプチドの合成活性を有する蛋白質
［３］配列番号１９〜２５および６８のいずれかで表されるアミノ酸配列と６５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつジペプチドの合成活性を有する蛋白質
［４］配列番号３３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつジペプチドの合成活性を有する蛋白質
（６） ジペプチドを生産する能力を有する微生物が、以下の［１］〜［４］のいずれかに記載のＤＮＡを有する微生物である上記（１）〜（４）のいずれか１つの微生物。
［１］上記（５）の［１］〜［４］のいずれかに記載の蛋白質をコードするＤＮＡ
［２］配列番号２６〜３２、６４および６５のいずれかで表される塩基配列を有するＤＮＡ
［３］配列番号２６〜３２、６４および６５のいずれかで表される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつジペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［４］配列番号３４で表される塩基配列と８０％以上の相同性を有する塩基配列を有し、かつジペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（７） ジペプチドを生産する能力を有する微生物が、上記（６）の［１］〜［４］のいずれかに記載のＤＮＡとベクターＤＮＡが連結した組換え体ＤＮＡを有する微生物である上記（１）〜（６）のいずれか１つの微生物。
（８） 微生物が、エシェリヒア属、バチルス属、コリネバクテリウム属またはサッカロマイセス属に属する微生物である上記（１）〜（７）のいずれか１つの微生物。
（９） ジペプチドを生産する能力を有する微生物が、Ｌ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸からジペプチドを生成する能力を有する微生物である上記（１）〜（４）のいずれか１つの微生物。
（１０） Ｌ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸からジペプチドを生成する能力を有する微生物が、プロリンイミノペプチダーゼを生産する微生物である上記（９）の微生物。
（１１） Ｌ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸からジペプチドを生成する能力を有する微生物が、プロリンイミノペプチダーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡとベクターＤＮＡが連結した組換え体ＤＮＡを有する微生物である上記（９）または（１０）の微生物。
（１２） 微生物が、エシェリヒア属、バチルス属、コリネバクテリウム属またはサッカロマイセス属に属する微生物である上記（９）〜（１１）のいずれか１つの微生物。
（１３） ジペプチドを生産する能力を有する微生物が、Ｌ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸からジペプチドを生成する能力を有する微生物である上記（１）〜（４）のいずれか１つの微生物。
（１４） Ｌ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸からジペプチドを生成する能力を有する微生物が、Ｌ−アミノ酸アミドハイドロラーゼ活性を有する蛋白質を生産する微生物である上記（１３）の微生物。
（１５） Ｌ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸からジペプチドを生成する能力を有する微生物が、Ｌ−アミノ酸アミドハイドロラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡとベクターＤＮＡが連結した組換え体ＤＮＡを有する微生物である上記（１３）の微生物。
（１６） 微生物が、エシェリヒア属、バチルス属、コリネバクテリウム属またはサッカロマイセス属に属する微生物である上記（１３）〜（１５）のいずれか１つの微生物。
（１７） 上記（１）〜（８）のいずれか１つの微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、１種以上のアミノ酸を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドを生成、蓄積させ、該媒体から、該ジペプチドを採取するジペプチドの製造法。
（１８） ジペプチドが下式（Ｉ）
Ｒ１−Ｒ２ （Ｉ）
（式中、Ｒ１およびＲ２は同一または異なってアミノ酸を表す）で表されるジペプチドである上記（１７）の製造法。
（１９） 上記（９）〜（１２）のいずれか１つの微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、Ｌ−アミノ酸エステルおよびＬ−アミノ酸を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドを生成、蓄積させ、該媒体から該ジペプチドを採取するジペプチドの製造法。
（２０） 上記（１３）〜（１６）のいずれか１つの微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、Ｌ−アミノ酸アミドおよびＬ−アミノ酸を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドを生成、蓄積させ、該媒体から該ジペプチドを採取するジペプチドの製造法。
（２１） 培養物の処理物が、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、または該菌体の固定化物であることを特徴とする上記（１７）〜（２０）のいずれか１つの製造法。
以下に本発明を詳細に説明する。
１．本発明の微生物
本発明の微生物は、１種以上のペプチダーゼおよび１種以上のペプチド取り込み活性を有する蛋白質（以下、ペプチド取込み蛋白質と略す）の活性が低下または喪失し、かつジペプチドを生産する能力を有する微生物、または３種以上のペプチダーゼの活性が低下または喪失し、かつジペプチドを生産する能力を有する微生物である。
１種以上のペプチダーゼおよび１種以上のペプチド取込み蛋白質の活性が低下または喪失している微生物としては、該微生物が正常に生育できる限りにおいて、任意の１種以上のペプチダーゼおよび任意の１種以上のペプチド取込み蛋白質の活性が低下または喪失している微生物をあげることができ、好ましくは１種以上９種以下、より好ましくは１種以上７種以下、さらに好ましくは１種以上４種以下のペプチダーゼの活性が低下または喪失しており、かつ好ましくは１種以上５種以下、より好ましくは１種以上３種以下、さらに好ましくは１種以上２種以下、特に好ましくは１種のペプチド取込み蛋白質の活性が低下または喪失している微生物をあげることができる。
該微生物としては、より具体的には、該微生物のゲノムＤＮＡ上に存在するペプチダーゼをコードする遺伝子（以下、ペプチダーゼ遺伝子と略す）およびペプチド取込み蛋白質をコードする遺伝子（以下、ペプチド取込み蛋白質遺伝子）のうち、１種以上のペプチダーゼ遺伝子の塩基配列および１種以上のペプチド取込み蛋白質遺伝子の塩基配列において、該塩基配列の全部または一部が欠失しているため、または該塩基配列中に塩基の置換または付加があるために該ペプチダーゼおよび該ペプチド取込み蛋白質の活性が低下または喪失している微生物をあげることができる。
ペプチダーゼの活性が低下しているとは、上記した塩基の欠失、置換または付加がないペプチダーゼに比べ、ペプチド分解活性が低くなっていることを意味する。
微生物のペプチド分解活性は、基質となるペプチドと微生物菌体とを水性媒体中に共存せしめ、ペプチド分解反応を行った後、残存しているペプチド量を公知の方法、例えばＨＰＬＣなどを用いた分析法によって定量することにより測定することができる。
上記ペプチダーゼとしては、ペプチド分解活性を有する蛋白質であればいずれでもよく、好ましくはジペプチド分解活性が高い蛋白質、より好ましくはジペプチダーゼをあげることができる。
より具体的なペプチダーゼとしては、例えばエシェリヒア・コリに存在する、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するＰｅｐＡ、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するＰｅｐＢ、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するＰｅｐＤ、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するＰｅｐＮ、ＰｅｐＰ［ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．（以下、ＧｅｎＢａｎｋと略す）ＡＡＣ７５９４６］、ＰｅｐＱ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ７６８５０）、ＰｅｐＥ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ７６９９１）、ＰｅｐＴ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ７４２１１）、Ｄｃｐ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ７４６１１）およびＩａｄＡ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ７７２８４）など、バチルス・サチリスに存在するＡｍｐＳ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＦ０１２２８５）、ＰｅｐＴ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｘ９９３３９）、ＹｂａＣ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｚ９９１０４）、ＹｃｄＤ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｚ９９１０５）、ＹｊｂＧ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｚ９９１１０）、ＹｋｖＹ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｚ９９１１１）、ＹｑｊＥ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｚ９９１１６）、ＹｗａＤ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｚ９９１２３）など、コリネバクテリウム・グルタミカムに存在するＢＡＢ９７７３２、ＢＡＢ９７８５８、ＢＡＢ９８０８０、ＢＡＢ９８８８０、ＢＡＢ９８８９２、ＢＡＢ９９０１３、ＢＡＢ９９５９８およびＢＡＢ９９８１９（いずれも日本ＤＮＡデータバンクの登録番号）で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質など、サッカロマイセス・セレビシエに存在するＯＣＴ１（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＣ＿００１１４３）、ＳＰＣ２（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＣ＿００３１４３）、ＳＰＹ２［Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｇｅｎｏｍｅ ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｙｅａｓｔｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ／）ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．Ｌ０００２８７５］およびＹＩＭ１（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＣ＿００１１４５）などをあげることができ、ジペプチダーゼとしては、配列番号１〜４で表されるアミノ酸配列を有するＰｅｐＡ、ＰｅｐＢ、ＰｅｐＤおよびＰｅｐＮ、並びにＰｅｐＱ、ＰｅｐＥ、ＩａｄＡをあげることができる。また、配列番号１〜４のいずれかのアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有し、かつペプチダーゼ活性を有する蛋白質もジペプチド分解活性が高い蛋白質としてあげることができる。
アミノ酸配列や塩基配列の相同性は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３）］やＦＡＳＴＡ［Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０）］を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸとよばれるプログラムが開発されている［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）］。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターは例えばＳｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。
また、ペプチド取込み蛋白質の活性が低下しているとは、上記した塩基の欠損、置換または挿入がないＤＮＡにコードされるペプチド取込み蛋白質に比べ、ペプチド取り込み活性が低くなっていることを意味する。
微生物のペプチド取り込み活性は、基質となるペプチドと微生物菌体とを水性媒体中に共存せしめ、ペプチド取り込み反応を行った後、水性媒体中に残存しているペプチド量を公知の方法、例えばＨＰＬＣなどを用いた分析法によって定量することにより測定することができる。
上記ペプチド取り込み蛋白質としては、染色体ＤＮＡ上でオペロンを形成する遺伝子にコードされている蛋白質であり、細胞膜上で複合体を形成してジペプチド取り込み活性を発現する蛋白質、および単独の蛋白質としてペプチド取り込み活性を有する蛋白質など、微生物のペプチド取り込みに関与している蛋白質であればいずれでもよく、好ましくはペプチド取り込み活性が高い蛋白質をあげることができる。
より具体的なペプチド取り込み蛋白質としては、例えばエシェリヒア・コリに存在する配列番号５で表されるアミノ酸配列を有するＤｐｐＡ、配列番号６で表されるアミノ酸配列を有するＤｐｐＢ、配列番号７で表されるアミノ酸配列を有するＤｐｐＣ、配列番号８で表されるアミノ酸配列を有するＤｐｐＤ、配列番号９で表されるアミノ酸配列を有するＤｐｐＦ、ＯｐｐＡ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ７６５６９）、ＯｐｐＢ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ７６５６８）、ＯｐｐＣ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ７６５６７）、ＯｐｐＤ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ７６５６６）、ＯｐｐＦ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ７６５６５）、ＹｄｄＯ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ７４５５６）、ＹｄｄＰ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ７４５５７）、ＹｄｄＱ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ７４５５８）、ＹｄｄＲ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ７４５５９）、ＹｄｄＳ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ７４５６０）、ＹｂｉＫ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ７３９１５）、ＭｐｐＡ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ７４４１１）、ＳａｐＡ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ７４３７６）、ＳａｐＢ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ７４３７５）、ＳａｐＣ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ７４３７４）、ＳａｐＤ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ７４３７３）、およびＳａｐＦ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ７４３７２）など、バチルス・サチリスに存在するＤｐｐＡ（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＡ４０００２）、ＤｐｐＢ（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＡ４０００３）、ＤｐｐＣ（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＡ４０００４）、ＤｐｐＤ（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＡ４０００５）、ＤｐｐＥ（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＡ４０００６）、ＯｐｐＡ（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＡ３９７８７）、ＯｐｐＢ（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＡ３９７８８）、ＯｐｐＣ（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＡ３９７８９）、ＯｐｐＤ（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＡ３９７９０）、ＯｐｐＦ（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＡ３９７９１）、ＡｐｐＡ（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＡ６２３５８）、ＡｐｐＢ（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＡ６２３５９）、ＡｐｐＣ（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＡ６２３６０）、ＡｐｐＤ（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＡ６２３５６）、ＡｐｐＦ（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＡ６２３５７）、ＹｃｌＦ（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＢ１２１７５）およびＹｋｆＤ（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＢ１３１５７）など、コリネバクテリウム・グルタミカムに存在するＢＡＢ９９０４８、ＢＡＢ９９３８３、ＢＡＢ９９３８４、ＢＡＢ９９３８５、ＢＡＢ９９７１３、ＢＡＢ９９７１４、ＢＡＢ９９７１５、ＢＡＢ９９８３０、ＢＡＢ９９８３１、ＢＡＢ９９８３２（いずれも日本ＤＮＡデータバンクの登録番号）で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質など、サッカロマイセス・セレビシエに存在するＯＰＴ１（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿０１２３２３）、ＯＰＴ２（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿０１５５２０）およびＰＴＲ２（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＡ８２１７２）などをあげることができ、また、ペプチド取り込み活性が高い蛋白質としては、配列番号５〜９で表されるアミノ酸配列を有するＤｐｐＡ、ＤｐｐＢ、ＤｐｐＣ、ＤｐｐＤ、ＤｐｐＦおよびそれらいずれかのアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有する蛋白質もペプチド取り込み活性が高いペプチド取り込み蛋白質としてあげることができる。
アミノ酸配列の相同性は、上記したＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡ等のプログラムを用いて決定することができる。
３種以上のペプチダーゼの活性が低下または喪失している微生物としては、該微生物が正常に生育できる限りにおいて、任意の３種以上のペプチダーゼの活性が低下または喪失している微生物をあげることができ、好ましくは３種以上９種以下、より好ましくは３種以上６種以下、さらに好ましくは３種または４種のペプチダーゼの活性が低下または喪失している微生物をあげることができる。
具体的なペプチダーゼとしては、上記したエシェリヒア・コリ、バチルス・サチリス、コリネバクテリウム・グルタミカムおよびサッカロマイセス・セレビシエに存在するペプチダーゼおよびジペプチダーゼをあげることができる。また、配列番号１〜４のいずれかのアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつペプチダーゼ活性を有する蛋白質もジペプチド分解活性が高い蛋白質としてあげることができる。
アミノ酸配列の相同性は、上記したＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等のプログラムを用いて決定することができる。
ジペプチドを生産する能力を有する微生物としては、ジペプチドを生産する能力を有する微生物であれば特に限定されず、例えば、１種以上のアミノ酸を縮合、連結することによりジペプチドを合成する活性を有する蛋白質を生産する微生物、Ｌ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸からジペプチドを合成する活性を有する蛋白質を生産する微生物、Ｌ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸からジペプチドを合成する活性を有する蛋白質を生産する微生物などをあげることができる。
１種以上のアミノ酸を縮合、連結することによりジペプチドを合成する活性を有する蛋白質を生産する微生物としては、ＮＲＰＳ、Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａリガーゼ、バシリシン合成酵素からなる群より選ばれる蛋白質を生産する微生物をあげることができる。
ＮＲＰＳを生産する微生物としては、バチルス属をはじめとする原核生物、ペニシリウム属をはじめとする真核生物、ＢａｃＡ、ＢａｃＢおよびＢａｃＣ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＦ００７８６５）を生産する微生物、ＴｙｃＡ、ＴｙｃＢおよびＴｙｃＣ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＦ００４８３５）を生産する微生物、ＰｃｂＡＢ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｍ５７４２５）を生産する微生物、およびＢａｃＡ、ＢａｃＢ、ＢａｃＣ、ＴｙｃＡ、ＴｙｃＢ、ＴｙｃＣ、ＰｃｂＡＢから選ばれるいずれかの蛋白質のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有し、かつＮＲＰＳの活性を有する蛋白質を生産する微生物などをあげることができる。
Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａリガーゼを生産する微生物としては、ペプチドグリカンを形成する原核微生物、ＤｄｌＡ（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．Ｍ５８４６７）を生産する微生物、ＤｄｌＢ（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＡＥ０００１１８）を生産する微生物、ＤｄｌＣ（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．Ｄ８８１５１）を生産する微生物、およびＤｄｌＡ、ＤｄｌＢ、ＤｄｌＣから選ばれるいずれかのアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつＤ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａリガーゼ活性を有する蛋白質を生産する微生物などをあげることができる。
アミノ酸配列の相同性は、上記したＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等のプログラムを用いて決定することができる。
バシリシン合成酵素を生産する微生物としでは、バチルス属に属する微生物、好ましくはバチルス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・コグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・リケチノフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、および以下の［１］〜［４］、
［１］配列番号１９〜２５および６８のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
［２］配列番号１９〜２５および６８のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつジペプチドの合成活性を有する蛋白質、
［３］配列番号１９〜２５および６８のいずれかで表されるアミノ酸配列と６５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつジペプチドの合成活性を有する蛋白質、または
［４］配列番号３３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつジペプチドの合成活性を有する蛋白質、
から選ばれる蛋白質を生産する微生物をあげることができる。
Ｌ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸からジペプチドを合成する活性を有する蛋白質を生産する微生物としては、プロリンイミノペプチダーゼを生産する微生物をあげることができ、具体的にはバチルス属、コリネバクテリウム属またはシュードモナス属に属する微生物などをあげることができる。具体的には、バチルス・サチリスＡＴＣＣ６６３３、バチルス・コアギュランスＥＫ０１［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７４，７９１９（１９９２）］、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３２８６、シュードモナス・プチダＡＪ−２４０２（ＦＥＲＭ ＢＰ−８１０１）、シュードモナス・プチダＡＴＣＣ１２６３３、シュードモナス・プチダＡＪ２０４８（ＦＥＲＭ ＢＰ−８１２３）（以上、ＷＯ ０３／０１０３０７に記載の微生物）などをあげることができる。また、アースロバクター・ニコチアナ［ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，７８，１９１（１９９９）］、エッシェリヒア・コリ（特開平２−１１３８８７）、フラボバクテリウム・メニコンゴセプチティカム［Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，３３６，３５（１９９６）］、ハフニア・アルベイ［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１９，４６８（１９９６）］、ラクトバチルス・デブルキー［Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４０，５２７（１９９４）］、バチルス・コアギュランス［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７４，７９１９（１９９４）］、アエロモナス・ソブリア［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１６，８１８（１９９４）］、キサントモナス・キャンペストリス（特開平９−１２１８６０）、ナイセリア・ゴノレーヤー［Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，９，１２０３（１９９３）］、プロピオニバクテリウム・フリュデンリチー［Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６４，４７３６（１９９８）］、セラチア・マルエッセンス［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２２，６０１（１９９７）］、コリネバクテリウム・バリアビリス［Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，９０，４４９（２００１）］、サーモプラズマ・アシドフィラム［ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，３９８，１０１（１９９６）］、シュードモナス・アルギノーサ［Ｎａｔｕｒｅ，４０６，９５９（２０００）］などもプロリンイミノペプチダーゼを生産する微生物としてあげることができる。
さらに、プロリンイミノペプチダーゼを生産する微生物としては、以下の［１］〜［３］から選ばれる蛋白質、
［１］ＷＯ ０３／０１０３０７、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，７８，１９１（１９９９）、特開平２−１１３８８７、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，３３６，３５（１９９６）、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１９，４６８（１９９６）、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４０，５２７（１９９４）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７４，７９１９（１９９４）、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１６，８１８（１９９４）、特開平９−１２１８６０、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，９，１２０３（１９９３）、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６４．，４７３６（１９９８）、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２２，６０１（１９９７）、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，３９８，１０１（１９９６）、Ｎａｔｕｒｅ，４０６，９５９（２０００）のいずれかに記載のプロリンイミノペプチダーゼ、
［２］上記［１］のいずれかのプロリンイミノペプチダーゼのアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつプロリンイミノペプチダーゼ活性を有する蛋白質、
［３］上記［１］のいずれかのプロリンイミノペプチダーゼのアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつプロリンイミノペプチダーゼ活性を有する蛋白質、
を生産する能力を有する微生物をあげることができる。
Ｌ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸からジペプチドを合成する活性を有する蛋白質を生産する微生物としては、Ｌ−アミノ酸アミドハイドロラーゼを生産する微生物をあげることができ、具体的にはバチルス属、コリネバクテリウム属、エルビニア属、ロドコッカス属、クリセオバクテリウム属、ミクロコッカス属、シュードモナス属、クリプトコッカス属、トリコスポロン属、ロドスポリジウム属、スポロボロマイセス属、トレメラ属、トルラスポラ属、ステリグマトマイセス属、またはロドトルラ属に属する微生物、好ましくはバチルス属、コリネバクテリウム属またはシュードモナス属に属する微生物、より好ましくはバチルス・メガテリウムＡＪ３２８４（ＦＥＲＭ ＢＰ−８０９０）、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３２８６、ミクロコッカス・ルテウスＡＴＣＣ９３４１、シュードモナス・サッカロフィラＡＴＣＣ１５９４６（以上、ＷＯ０３／０１０１８７に記載の微生物）などをあげることができる。
また、Ｌ−アミノ酸アミドハイドロラーゼ活性を有する蛋白質を生産する微生物としては、以下の［１］または［２］記載の蛋白質、
［１］ＷＯ０３／０１０１８７記載のＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼのアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼ活性を有する蛋白質
［２］ＷＯ０３／０１０１８７記載のＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼのアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物、
をあげることができる。
上記において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、ジペプチド合成活性を有する蛋白質は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）（以下、モレキュラー・クローニング第２版と略す）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号１９〜２５および６８で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、プロリンイミノペプチダーゼ活性を有する蛋白質およびＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼ活性を有する蛋白質のいずれかの蛋白質をコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより、取得することができる。
欠失、置換または付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換または付加できる程度の数であり、１個から数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
配列番号１９〜２５および６８で表されるアミノ酸配列、プロリンイミノペプチダーゼ活性を有する蛋白質およびＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼ活性を有する蛋白質のアミノ酸配列のいずれかにおいて１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたとは、同一配列中の任意の位置において、１または複数のアミノ酸の欠失、置換または付加があってもよい。
欠失、置換または付加は同時に生じてもよく、置換または付加されるアミノ酸は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アルギニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−システインなどがあげられる。
以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸、２−アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
また、上記した１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加が導入される位置は、該変異が導入されたアミノ酸配列を有する蛋白質がジペプチド合成活性を有する限り、特に限定されず、例えば配列番号１９〜２５および６８で表されるアミノ酸配列を比較したとき、該アミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸配列において保存されていないアミノ酸残基をあげることができる。
また、上記した１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質であり、かつジペプチド合成活性を有する蛋白質としては、配列番号１９〜２５および６８のいずれかで表されるアミノ酸配列との相同性が、通常は６５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％の相同性を有する蛋白質、プロリンイミノペプチダーゼのアミノ酸配列またはＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼのアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列との相同性が、通常は８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有する蛋白質をあげることができる。
アミノ酸配列や塩基配列の相同性は、上記したＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡ等のプログラムを用いて決定することができる。
配列番号３３で表されるアミノ酸配列は、配列番号１９〜２５で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質の間で保存されている領域であり、かつ各種微生物のＡｌａ−Ａｌａリガーゼ活性を有する蛋白質のコンセンサス配列に対応する領域である。
配列番号３３で表されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する蛋白質であり、かつジペプチド合成活性を有する蛋白質を生産する微生物もまたジペプチドを生産する微生物である。
配列番号３３で表されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する蛋白質が、ジペプチド合成活性を有する蛋白質であるためには、該蛋白質のアミノ酸配列と配列番号１９〜２５で表されるいずれかのアミノ酸配列との相同性が、少なくとも８０％以上、通常は９０％以上、特に９５％以上の相同性を有していることが好ましい。
アミノ酸配列の相同性は、上記したＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等のプログラムを用いて決定することができる。
また、１種以上のアミノ酸を縮合、連結することによりジペプチドを合成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、Ｌ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸からジペプチドを合成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、またはＬ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸からジペプチドを合成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡとベクターＤＮＡを連結して得られる組換え体ＤＮＡを有する微生物もまた本発明の微生物である。
該微生物としては、エシェリヒア属、バチルス属、コリネバクテリウム属またはサッカロマイセス属に属する微生物をあげることができる。
１種以上のアミノ酸を縮合、連結することによりジペプチドを合成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡとしては、ＮＲＰＳ、Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａリガーゼまたはバシリシン合成酵素をコードするＤＮＡなどをあげることができる。
ＮＲＰＳをコードするＤＮＡとしてはＢａｃＡ、ＢａｃＢ、ＢａｃＣ、ＴｙｃＡ、ＴｙｃＢ、ＴｙｃＣおよびＰｃｂＡＢからなる群より選ばれる蛋白質をコードするＤＮＡをあげることができる。
Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−ＡｌａリガーゼをコードするＤＮＡとしてはＤｄｌＡ、ＤｄｌＢおよびＤｄｌＣからなる群より選ばれる蛋白質をコードするＤＮＡをあげることができる。
バシリシン合成酵素をコードするＤＮＡとしては、以下の［１］〜［４］記載の蛋白質をコードするＤＮＡ、
［１］配列番号１９〜２５および６８のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
［２］配列番号１９〜２５および６８のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつジペプチドの合成活性を有する蛋白質、
［３］配列番号１９〜２５および６８のいずれかで表されるアミノ酸配列と６５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつジペプチドの合成活性を有する蛋白質、
［４］配列番号３３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつジペプチドの合成活性を有する蛋白質、
および、以下の［５］〜［７］記載のＤＮＡ、
［５］配列番号２６〜３２、６４および６５のいずれかで表される塩基配列を有するＤＮＡ、
［６］配列番号２６〜３２、６４および６５のいずれかで表される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつジペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
［７］配列番号３４で表される塩基配列と８０％以上の相同性を有する塩基配列を有するＤＮＡであり、かつジペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
をあげることができる。
Ｌ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸からジペプチドを合成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡとしては、以下の［１］〜［３］記載の蛋白質をコードするＤＮＡ、
［１］ＷＯ ０３／０１０３０７、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，７８，１９１（１９９９）、特開平２−１１３８８７、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，３３６，３５（１９９６）、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１９，４６８（１９９６）、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４０，５２７（１９９４）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７４，７９１９（１９９４）、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１６，８１８（１９９４）、特開平９−１２１８６０、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，９，１２０３（１９９３）、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６４，４７３６（１９９８）、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２２，６０１（１９９７）、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，３９８，１０１（１９９６）、Ｎａｔｕｒｅ，４０６，９５９（２０００）のいずれかに記載のプロリンイミノペプチダーゼ、
［２］上記［１］のいずれかのプロリンイミノペプチダーゼのアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつプロリンイミノペプチダーゼ活性を有する蛋白質、
［３］上記［１］のいずれかのプロリンイミノペプチダーゼのアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつプロリンイミノペプチダーゼ活性を有する蛋白質、
および以下の［４］または［５］記載のＤＮＡ、
［４］ＷＯ ０３／０１０３０７、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，７８，１９１（１９９９）、特開平２−１１３８８７、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，３３６，３５（１９９６）、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１９，４６８（１９９６）、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４０，５２７（１９９４）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７４，７９１９（１９９４）、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１６，８１８（１９９４）、特開平９−１２１８６０、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，９，１２０３（１９９３）、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６４，４７３６（１９９８）、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２２，６０１（１９９７）、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，３９８，１０１（１９９６）、Ｎａｔｕｒｅ，４０６，９５９（２０００）のいずれかに記載の塩基配列を有するプロリンイミノペプチダーゼをコードするＤＮＡ、
［５］上記［４］のいずれかのプロリンイミノペプチダーゼをコードするＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつプロリンイミノペプチダーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
をあげることができる。
Ｌ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸からジペプチドを合成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡとしては、以下の［１］または［２］記載の蛋白質をコードするＤＮＡ、
［１］ＷＯ０３／０１０１８７記載のＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼのアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼ活性を有する蛋白質、
［２］ＷＯ０３／０１０１８７記載のＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼのアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼ活性を有する蛋白質、
および以下の［３］または［４］記載のＤＮＡ、
［３］ＷＯ０３／０１０１８７記載の塩基配列を有するＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼをコードするＤＮＡ、
［４］ＷＯ０３／０１０１８７記載の塩基配列からなるＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼをコードするＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
をあげることができる。
上記のストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとは、上記のいずれかのＤＮＡの一部、または全部をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ｍｏｌ／ｌ、好ましくは０．９ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度、好ましくは０．１倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム、および１５ｍｍｏｌ／ｌのクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）等に起載されている方法に準じて行うことができる。ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的には、上記したＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡ等のプログラムを用いて、上記パラメーターに基づいて計算したときに、上記したいずれかのＤＮＡの塩基配列と少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
上記したＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが、ジペプチドの合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡであることは、該ＤＮＡを発現する組換えＤＮＡを作製し、該組換えＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる微生物を酵素源に用い、１）該酵素源および１種以上のアミノ酸を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドが生成、蓄積するか否かをＨＰＬＣ等により分析する方法、２）該酵素源、Ｌ−アミノ酸エステルおよびＬ−アミノ酸を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドが生成、蓄積するか否かをＨＰＬＣ等により分析する方法、３）該酵素源、Ｌ−アミノ酸アミドおよびＬ−アミノ酸を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドが生成、蓄積するか否かをＨＰＬＣ等により分析する方法、によって確認することができる。
塩基配列の相同性は、上記したＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡ等のプログラムを用いて決定することができる。
２．本発明の微生物の製造法
本発明の微生物は、１）１種以上のペプチダーゼおよび１種以上のペプチド取り込み活性を有する蛋白質の機能が低下または喪失した微生物、または３種以上のペプチダーゼの機能が低下または喪失した微生物に、ジペプチド生産能を付与する方法、または２）ジペプチドを生産する能力を有する微生物の、ａ）１種以上のペプチダーゼおよび１種以上のペプチド取り込み蛋白質、またはｂ）３種以上のペプチダーゼ、の機能を低下または喪失させる方法のいずれの方法によっても取得することができる。
（１）１種以上のペプチダーゼおよび１種以上のペプチド取り込み蛋白質の機能が低下または喪失した微生物、または３種以上のペプチダーゼの機能が低下または喪失した微生物に、ジペプチド生産能を付与する方法
（ｉ）ペプチダーゼ、ペプチド取り込み蛋白質の活性が低下または喪失した微生物の製造
ペプチダーゼ、ペプチド取り込み蛋白質の活性が低下または喪失した微生物は、該微生物を取得できる方法であれば、その取得方法に制限はないが、例えば以下に示す微生物の染色体ＤＮＡのペプチダーゼ遺伝子やペプチド取り込み蛋白質遺伝子に塩基の欠失、置換または付加を導入する方法により取得することができる。
微生物の染色体ＤＮＡの遺伝子に塩基の欠失、置換または付加を導入する方法としては、相同組換えを利用した方法をあげることができる。一般的な相同組換えを利用した方法としては、塩基の欠失、置換または付加が導入された変異遺伝子を、塩基の欠失等を導入したい宿主細胞内では自立複製できない薬剤耐性遺伝子を有するプラスミドＤＮＡと連結して作製できる相同組換え用プラスミドを用いる方法をあげることができる。
該相同組換え用プラスミドを常法により宿主細胞に導入した後、薬剤耐性を指標にして相同組換えによって染色体ＤＮＡ上に該相同組換え用プラスミドが組込まれた形質転換株を選択する。得られた形質転換株を該薬剤を含有しない培地で数時間〜１日間培養した後、該薬剤含有寒天培地、および該薬剤非含有寒天培地に塗布し、前者の培地で生育せず、後者の培地で生育できる株を選択することで、染色体ＤＮＡ上において２回目の相同組換えが生じた株を取得することができる。染色体ＤＮＡ上の欠失等を導入した遺伝子が存在する領域の塩基配列を決定することで、染色体ＤＮＡ上の目的遺伝子に塩基の欠失、置換または付加が導入されたことを確認することができる。
上記方法により、染色体ＤＮＡ上の目的遺伝子に塩基の欠失、置換または付加を導入することができる微生物としては、エシェリヒア属、バチルス属、コリネバクテリウム属、またはサッカロマイセス属に属する微生物をあげることができる。
また、複数の遺伝子に効率よく塩基の欠失、置換または付加を導入する相同組換えを利用した方法としては、直鎖ＤＮＡを用いた方法をあげることができる。
具体的には、塩基の欠失、置換または付加を導入したい遺伝子を含有する直鎖ＤＮＡを細胞内に取り込ませ、染色体ＤＮＡと導入した直鎖ＤＮＡとの間で相同組換えを起こさせる方法である。本方法は、直鎖ＤＮＡを効率よく取り込む微生物であれば、いずれの微生物にも適用でき、好ましい微生物としてはエシェリヒア属またはバチルス属に属する微生物、より好ましくはエシェリヒア・コリ、さらに好ましくはλファージ由来の組換えタンパク質群（Ｒｅｄ組換え系）を発現しているシェリヒア・コリをあげることができる。
λＲｅｄ組換え系を発現しているエシェリヒア・コリとしては、λＲｅｄ組換え系遺伝子を有するプラスミドＤＮＡであるｐＫＤ４６［エシェリヒア・コリ ジェネティック ストック センター（米国エール大学）より入手可能］を保有するエシェリヒア・コリＪＭ１０１株等をあげることができる。
相同組換えに用いられるＤＮＡとしては、
（ａ）塩基の欠失、置換または付加の導入対象である染色体ＤＮＡ上の領域の両外側に存在するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相同性を有するＤＮＡを、薬剤耐性遺伝子の両端に有する直鎖ＤＮＡ、
（ｂ）塩基の欠失、置換または付加の導入対象である染色体ＤＮＡ上の領域の両外側に存在するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相同性を有するＤＮＡを直接連結した直鎖ＤＮＡ、
（ｃ）塩基の欠失、置換または付加の導入対象である染色体ＤＮＡ上の領域の両外側に存在するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相同性を有するＤＮＡを、薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子の両端に有する直鎖ＤＮＡ、
（ｄ）上記（ａ）の直鎖ＤＮＡにおいて、薬剤耐性遺伝子と染色体ＤＮＡ上の領域の両外側に存在するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相同性を有するＤＮＡの間に、さらに酵母由来のＦｌｐ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８２，５８７５（１９８５）］が認識する塩基配列を有するＤＮＡ、
をあげることができる。
薬剤耐性遺伝子としては、宿主微生物が感受性を示す薬剤に対し、薬剤耐性を付与する薬剤耐性遺伝子であれば、いずれの薬剤耐性遺伝子も使用することができる。宿主微生物にエシェリヒア・コリを用いた場合は、薬剤耐性遺伝子としては、例えば、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子およびアンピシリン耐性遺伝子等をあげることができる。
ネガティブセレクションに用いることができる遺伝子とは、宿主微生物で該遺伝子を発現させたとき、一定培養条件下においては、該微生物に致死的である遺伝子のことをいい、該遺伝子としては例えば、バチルス属に属する微生物由来のｓａｃＢ遺伝子［Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５９，１３６１−１３６６（１９９３）］、およびエシェリヒア属に属する微生物由来のｒｐｓＬ遺伝子［Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，７２，９９−１０４（２００１）］等をあげることができる。
上記の直鎖ＤＮＡの両末端に存在する、染色体ＤＮＡ上の置換または欠失の導入対象となる領域の両端の外側に位置するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相同性を有するＤＮＡは、直鎖ＤＮＡにおいて、染色体ＤＮＡ上の方向と同じ方向に配置され、その長さは１０ｂｐ〜１００ｂｐ程度が好ましく、２０ｂｐ〜５０ｂｐ程度がより好ましく、３０〜４０ｂｐ程度がさらに好ましい。
酵母由来のＦｌｐ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅが認識する塩基配列とは、該蛋白質が認識し、相同組換えを触媒する塩基配列であれば、特に限定されないが、好ましくは配列番号３９で表される塩基配列を有するＤＮＡ、および該ＤＮＡにおいて１個〜数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列を有し、かつ酵母由来のＦｌｐ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅが認識し、相同組換えを触媒する塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。
相同性を有するＤＮＡとは、上記直鎖ＤＮＡが、染色体ＤＮＡ上の目的とする領域において、相同組換えが起こる程度の同一性を有するＤＮＡのことであり、具体的な相同性としては、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは１００％の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
上記塩基配列の相同性は、上記したＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等のプログラムを用いて決定することができる。
上記直鎖ＤＮＡ断片は、ＰＣＲにより作製することができる。また上記直鎖ＤＮＡを含むＤＮＡをプラスミド上にて構築した後、制限酵素処理にて目的の直鎖ＤＮＡを得ることもできる。
微生物の染色体ＤＮＡに塩基の欠失、置換または付加を導入する方法としては、以下の方法１〜４があげられる。
方法１：上記（ａ）または（ｄ）の直鎖ＤＮＡを宿主微生物に導入し、薬剤耐性を指標に該直鎖ＤＮＡが染色体ＤＮＡ上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択する方法。
方法２：上記方法１により取得された形質転換株に、塩基の欠失、置換または付加の導入対象である染色体ＤＮＡ上の領域の両外側に存在するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相同性を有するＤＮＡを直接連結したＤＮＡを導入し、該方法により染色体ＤＮＡ上に挿入された薬剤遺伝子を削除することにより、微生物の染色体ＤＮＡ上の領域を置換または欠失させる方法。
方法３：
［１］上記（ｃ）の直鎖ＤＮＡを宿主微生物に導入し、薬剤耐性を指標に該直鎖ＤＮＡが染色体ＤＮＡ上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択する、
［２］染色体ＤＮＡ上の置換または欠失の対象領域の両端の外側に位置するＤＮＡと相同性を有するＤＮＡを、染色体ＤＮＡ上における方向と同一の方向で連結したＤＮＡを合成し、上記［１］で得られた形質転換株に導入する、
［３］ネガティブセレクションに用いることができる遺伝子が発現する条件下において、上記［２］の操作を行った形質転換株を培養し、該培養において生育可能な株を、薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子が染色体ＤＮＡ上から削除された株として選択する方法。
方法４：
［１］上記（ｄ）の直鎖ＤＮＡを宿主微生物に導入し、薬剤耐性を指標に該直鎖ＤＮＡが染色体ＤＮＡ上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択する、
［２］上記［１］で得られた形質転換株にＦｌｐ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ遺伝子発現プラスミドを導入し、該遺伝子を発現させた後、上記［１］で用いた薬剤に感受性である株を取得する方法。
上記方法で用いられる、直鎖ＤＮＡを宿主微生物に導入する方法としては、該微生物へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４）、エレクトロポレーション法［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６，６１２７（１９８８）］等をあげることができる。
方法２または方法３［２］で用いられるＤＮＡにおいて、該ＤＮＡの中央部付近に、染色体ＤＮＡ上に挿入したい任意の遺伝子を組み込こんだＤＮＡを用いることにより、薬剤耐性遺伝子等を削除するのと同時に、任意の遺伝子を染色体ＤＮＡ上に挿入することができる。
上記方法２〜４では、最終的に得られる形質転換株の染色体ＤＮＡ上には薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子等の外来遺伝子を残さない方法であるため、該方法を用いることにより、同一の薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子を用いて、方法２、方法３［１］〜［３］、および方法４［１］［２］の操作を繰り返すことにより、容易に染色体ＤＮＡ上の位置の異なる２以上の領域に塩基の欠失、置換または付加を有する微生物を製造することができる。
（ｉｉ）ジペプチドを生産する能力を付与する方法
上記（ｉ）で用いた微生物に、ジペプチドを生産する能力を付与する方法としては、例えば以下の方法をあげることができる。
（ａ）ジペプチドを合成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡの調製
上記したジペプチドを合成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡは、該ＤＮＡの塩基配列情報を利用し、以下に記載する方法により取得することができる。
例えば、バシリシン合成酵素をコードするＤＮＡを取得する方法としては、配列番号２６〜３２、６４および６５のいずれかで表される塩基配列に基づき設計することができるプローブを用いた、バチルス属に属する微生物の染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション法、または配列番号２６〜３２、６４および６５のいずれかで表される塩基配列に基づき設計することができるプライマーＤＮＡを用いた、バチルス属に属する微生物の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ［ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９０）］等をあげることができる。
また、各種の遺伝子配列データベースに対して配列番号１９〜２５、３３および６８のいずれかで表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列と６５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有する配列を検索し、該検索によって得られた塩基配列に基づき、該塩基配列を有する生物の染色体ＤＮＡ、ｃＤＮＡライブラリー等から上記した方法によりジペプチドを合成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを取得することもできる。
取得したＤＮＡをそのまま、あるいは適当な制限酵素などで切断後、常法によりベクターに組み込み、組換え体ＤＮＡを取得し、該組換え体ＤＮＡをエシェリヒア・コリに導入して得られる形質転換体からプラスミドＤＮＡを抽出して、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキシ法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７）］あるいは３７３Ａ・ＤＮＡシークエンサー（パーキン・エルマー社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
塩基配列を決定した結果、取得されたＤＮＡが部分長であった場合は、該部分長ＤＮＡをプローブに用いた、染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション法により、全長ＤＮＡを取得することができる。
更に、決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、パーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成装置等を用いて化学合成することにより目的とするＤＮＡを調製することもできる。
上記のようにして取得されるＤＮＡとして、例えば、配列番号２６〜３２、６４および６５で表される塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。
該ＤＮＡを組み込むベクターとしては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ（＋）（ストラタジーン社製）、ｐＤＩＲＥＣＴ［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，６０６９（１９９０）］、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ａｍｐ ＳＫ（＋）（ストラタジーン社製）、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（ノバジェン社製）、ｐＣＲ ＩＩ（インビトロジェン社製）およびｐＣＲ−ＴＲＡＰ（ジーンハンター社製）などをあげることができる。
エシェリヒア・コリとしては、例えば、エシェリヒア・コリＸＬ１−Ｂｌｕｅ、エシェリヒア・コリＸＬ２−Ｂｌｕｅ、エシェリヒア・コリＤＨ１、エシェリヒア・コリＭＣ１０００、エシェリヒア・コリＫＹ３２７６、エシェリヒア・コリＷ１４８５、エシェリヒア・コリＪＭ１０１、エシェリヒア・コリＪＭ１０９、エシェリヒア・コリＨＢ１０１、エシェリヒア・コリＮｏ．４９、エシェリヒア・コリＷ３１１０、エシェリヒア・コリＮＹ４９、エシェリヒア・コリＭＰ３４７、エシェリヒア・コリＮＭ５２２、エシェリヒア・コリＭＥ８４１５等をあげることができる。
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４）、エレクトロポレーション法［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６，６１２７（１９８８）］等をあげることができる。
上記方法によって得られるジペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを保有する微生物としては、後述する配列番号１９で表される配列を有するＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡを保有する微生物であるエシェリヒア・コリＮＭ５２２／ｐＰＥ４３をあげることができる。
（ｂ）ジペプチド合成活性を有する蛋白質の生産
ジペプチド合成活性を有する蛋白質は、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された方法等を用い、例えば以下の方法により、上記（ａ）の方法により取得したＤＮＡを宿主細胞中で発現させて、生産することができる。
上記（ａ）の方法により取得したＤＮＡをもとにして、必要に応じて、ジペプチド合成活性を有する蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。また、該蛋白質をコードする部分の塩基配列を、宿主の発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換することにより、該蛋白質の生産率を向上させることができる。
該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換え体ＤＮＡを作製する。
該組換え体ＤＮＡを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、ジペプチド合成活性を有する蛋白質を生産する形質転換体を得ることができる。
宿主細胞としては、細菌および酵母等、目的とする遺伝子を発現できる微生物であればいずれも用いることができる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、ジペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、ジペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡは、原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リポソーム結合配列、ジペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、転写終結配列より構成された組換え体ＤＮＡであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
発現ベクターとしては、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリンガーマンハイム社製）、ｐＨｅｌｉｘ１（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）、ｐＫＫ２３３−２（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（プロメガ社製）、ｐＱＥ−８（キアゲン社製）、ｐＥＴ−３（ノバジェン社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）］、ｐＬＳＡ１［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）］、ｐＧＥＬ１［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ（−）（ストラタジーン社製）、ｐＴｒＳ３０［エシェリヒア・コリＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＮ ＢＰ−５４０７）より調製］、ｐＴｒＳ３２［エシェリヒア・コリＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０８）より調製］、ｐＰＡＣ３１（ＷＯ９８／１２３４３）、ｐＵＣ１９［Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）］、ｐＳＴＶ２８（宝酒造社製）、ｐＵＣ１１８（宝酒造桂製）、ｐＰＡ１（特開昭６３−２３３７９８）等を例示することができる。
プロモーターとしては、エシェリヒア・コリ等の宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、エシェリヒア・コリやファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等をあげることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔ Ｉプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
プロモーターとしては、バチルス属細菌中で発現させるためのｘｙｌＡプロモーター［Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３５，５９４−５９９（１９９１）］やコリネバクテリウム属細菌中で発現させるためのＰ５４−６プロモーター［Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５３，６７４−６７９（２０００）］なども用いることができる。
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８核酸）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
ジペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを発現ベクターに結合させた組換え体ＤＮＡにおいては、転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
このような組換え体ＤＮＡとしては、例えば後述するｐＰＥ４３をあげることができる。
宿主細胞として用いる原核生物としては、エシェリヒア属、バチルス属、またはコリネバクテリウム属などに属する微生物、例えば、エシェリヒア・コリＸＬ１−Ｂｌｕｅ、エシェリヒア・コリＸＬ２−Ｂｌｕｅ、エシェリヒア・コリＤＨ１、エシェリヒア・コリＤＨ５α、エシェリヒア・コリＭＣ１０００、エシェリヒア・コリＫＹ３２７６、エシェリヒア・コリＷ１４８５、エシェリヒア・コリＪＭ１０１、エシェリヒア・コリＪＭ１０９、エシェリヒア・コリＨＢ１０１、エシェリヒア・コリＮｏ．４９、エシェリヒア・コリＷ３１１０、エシェリヒア・コリＮＹ４９、エシェリヒア・コリＭＰ３４７、エシェリヒア・コリＮＭ５２２、バチルス・サチリスＡＴＣＣ３３７１２、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＦＥＲＭ ＢＰ−６０３０、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕａｎｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４２９７等をあげることができる。
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４）、エレクトロポレーション法［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６，６１２７（１９８８）］等をあげることができる。
サッカロマイセス属に属する菌株を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等を用いることができる。
プロモーターとしては、サッカロマイセス属に属する菌株中で機能するものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ １プロモーター、ｇａｌ １０プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ １プロモーター等のプロモーターをあげることができる。
宿主細胞としては、サッカロマイセス属等に属する菌株をあげることができ、具体的には、サッカロマイセス・セレビシエ等をあげることができる。
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０）］、スフェロプラスト法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８１，４８８９（１９８４）］、酢酸リチウム法［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）］等をあげることができる。
（２）ジペプチドを生産する能力を有する微生物の、ａ）１個以上のペプチダーゼおよび１個以上のペプチド取り込み系蛋白質、またはｂ）３個以上のペプチダーゼ、の機能を低下または喪失させる方法
任意の微生物を宿主細胞に用いて、上記（１）の（ｉｉ）の方法を実施することにより、ジペプチドを生産する能力を有する微生物を製造することができるので、該微生物を用いて、上記（１）の（ｉ）の方法を実施することにより、１個以上のペプチダーゼと１個以上のペプチド取り込み系蛋白質、または３個以上のペプチダーゼの機能が低下または喪失した微生物であり、かつジペプチドを生産する能力を有する微生物を製造することができる。
また、本来の性質としてジペプチドを生産する能力を有する微生物は、該微生物に対し、上記（１）の（ｉ）の方法を実施することにより、本発明の微生物を製造することができる。
上記微生物としては、エシェリヒア属、バチルス属、コリネバクテリウム属またはサッカロマイセス属に属する微生物などをあげることができ、より好ましくはエシェリヒア・コリ、バチルス・サチリス、コリネバクチリウム・グルタミカムおよびサッカロマイセス・セレビシエなどをあげることができる。
３．本発明のジペプチドの製造法
本発明の製造法としては、
（ｉ）本発明の微生物の培養物または培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、および１種以上のアミノ酸を水性媒体中に存在せしめ、該媒体中にジペプチドを生成、蓄積させ、該媒体から該ジペプチドを採取する該ジペプチドの製造法、
（ｉｉ）本発明の微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、Ｌ−アミノ酸エステルおよびＬ−アミノ酸を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドを生成、蓄積させ、該媒体から該ジペプチドを採取するジペプチドの製造法、および
（ｉｉｉ）本発明の微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、Ｌ−アミノ酸アミドおよびＬ−アミノ酸を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドを生成、蓄積させ、該媒体から該ジペプチドを採取するジペプチドの製造法、
などをあげることができる。
上記（ｉ）の製造法において、基質に用いられる１種以上のアミノ酸、好ましくは１種または２種のアミノ酸としては、アミノ酸、好ましくはＬ−アミノ酸、グリシン（Ｇｌｙ）およびβ−アラニン（βＡｌａ）からなる群より選ばれるアミノ酸であれば、いずれのアミノ酸をいずれの組み合わせで用いてもよい。Ｌ−アミノ酸としては、例えばＬ−アラニン（Ｌ−Ａｌａ）、Ｌ−グルタミン（Ｌ−Ｇｌｎ）、Ｌ−グルタミン酸（Ｌ−Ｇｌｕ）、Ｌ−バリン（Ｌ−Ｖａｌ）、Ｌ−ロイシン（Ｌ−Ｌｅｕ）、Ｌ−イソロイシン（Ｌ−Ｉｌｅ）、Ｌ−プロリン（Ｌ−Ｐｒｏ）、Ｌ−フェニルアラニン（Ｌ−Ｐｈｅ）、Ｌ−トリプトファン（Ｌ−Ｔｒｐ）、Ｌ−メチオニン（Ｌ−Ｍｅｔ）、Ｌ−セリン（Ｌ−Ｓｅｒ）、Ｌ−スレオニン（Ｌ−Ｔｈｒ）、Ｌ−システイン（Ｌ−Ｃｙｓ）、Ｌ−アスパラギン（Ｌ−Ａｓｎ）、Ｌ−チロシン（Ｌ−Ｔｙｒ）、Ｌ−リジン（Ｌ−Ｌｙｓ）、Ｌ−アルギニン（Ｌ−Ａｒｇ）、Ｌ−ヒスチジン（Ｌ−Ｈｉｓ）、Ｌ−アスパラギン酸（Ｌ−Ａｓｐ）、Ｌ−α−アミノ酪酸（Ｌ−α−ＡＢ）、Ｌ−アザセリン（Ｌ−Ａｚａｓｅｒｉｎｅ）、Ｌ−テアニン（Ｌ−ｔｈｅａｎｉｎｅ）、Ｌ−４−ヒドロキシプロリン（Ｌ−４−ＨＹＰ）、Ｌ−３−ヒドロキシプロリン（Ｌ−３−ＨＹＰ）、Ｌ−オルニチン（Ｌ−Ｏｒｎ）、Ｌ−シトルリン（Ｌ−Ｃｉｔ）およびＬ−６−ジアゾ−５−オキソノルロイシン（Ｌ−６−ｄｉａｚｏ−５−ｏｘｏ−ｎｏｒｌｅｕｃｉｎｅ）などをあげることができる。
上記（ｉ）の製造法に用いられる、より好ましいアミノ酸としては、Ｌ−Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒおよびβ−Ａｌａから選ばれる１種のアミノ酸とＬ−Ａｌａ、Ｌ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｖａｌ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ｉｌｅ、Ｌ−Ｐｒｏ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ａｓｎ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−Ｈｉｓ、Ｌ−Ａｓｐ、Ｌ−α−ＡＢ、β−Ａｌａ、Ｌ−Ａｚａｓｅｒｉｎｅ、Ｌ−ｔｈｅａｎｉｎｅ、Ｌ−４−ＨＹＰ、Ｌ−３−ＨＹＰ、Ｌ−Ｏｒｎ、Ｌ−ＣｉｔおよびＬ−６−ｄｉａｚｏ−５−ｏｘｏ−ｎｏｒｌｅｕｃｉｎｅから選ばれる１種のアミノ酸の組み合わせ、Ｌ−ＧｌｎとＬ−Ｐｈｅの組み合わせ、およびＬ−α−ＡＢとＬ−Ｇｌｎ、Ｌ−ＡｒｇまたはＬ−α−ＡＢの組み合わせ、さらに好ましくはＬ−ＡｌａとＬ−Ａｌａ、Ｌ−Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｖａｌ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ｉｌｅ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ａｓｎ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−Ｈｉｓ、Ｌ−α−ＡＢ、Ｌ−Ａｚａｓｅｒｉｎｅ、Ｌ−ＣｉｔおよびＬ−ｔｈｅａｎｉｎｅから選ばれる１種のアミノ酸の組み合わせ、ＧｌｙとＬ−Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−α−ＡＢおよびＬ−Ｃｉｔから選ばれる１種のアミノ酸の組み合わせ、Ｌ−ＭｅｔとＬ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−ＬｙｓおよびＬ−Ｈｉｓから選ばれる１種のアミノ酸の組み合わせ、Ｌ−ＳｅｒとＬ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−ＨｉｓおよびＬ−α−ＡＢから選ばれる１種のアミノ酸の組み合わせ、Ｌ−ＴｈｒとＬ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−ＴｈｒおよびＬ−α−ＡＢから選ばれる１種のアミノ酸の組み合わせ、Ｌ−ＧｌｎとＬ−Ｐｈｅの組み合わせ、β−ＡｌａとＬ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−ＨｉｓおよびＬ−Ｃｉｔから選ばれる１種のアミノ酸の組み合わせ、およびＬ−α−ＡＢとＬ−Ｇｌｎ、Ｌ−ＡｒｇまたはＬ−α−ＡＢの組み合わせをあげることができる。
上記（ｉ）の製造法において、基質として用いるアミノ酸は、０．１〜５００ｇ／Ｌ、好ましくは０．２〜２００ｇ／Ｌの濃度になるように水性媒体中に初発または反応途中に添加する。
上記（ｉ）の製造法で製造されるジペプチドとしては、下式（Ｉ）
Ｒ１−Ｒ２ （Ｉ）
（式中、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なってアミノ酸を表す）で表されるジペプチドをあげることができ、好ましくは、上記式（Ｉ）においてＲ１およびＲ２が同時にまたは異なって、Ｌ−Ａｌａ、Ｌ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｖａｌ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ｉｌｅ、Ｌ−Ｐｒｏ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ａｓｎ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−Ｈｉｓ、Ｌ−Ａｓｐ、Ｌ−α−ＡＢ、β−Ａｌａ、Ｌ−Ａｚａｓｅｒｉｎｅ、Ｌ−ｔｈｅａｎｉｎｅ、Ｌ−４−ＨＹＰ、Ｌ−３−ＨＹＰ、Ｌ−ＯｒｎおよびＬ−６−ｄｉａｚｏ−５−ｏｘｏ−ｎｏｒｌｅｕｃｉｎｅから選ばれるアミノ酸であるジペプチドをあげることができ、より好ましくはＲ１がＬ−Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒまたはβ−Ａｌａの場合は、Ｒ２がＬ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｖａｌ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ｉｌｅ、Ｌ−Ｐｒｏ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ａｓｎ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−Ｈｉｓ、Ｌ−Ａｓｐ、Ｌ−α−ＡＢ、β−Ａｌａ、Ｌ−Ａｚａｓｅｒｉｎｅ、Ｌ−ｔｈｅａｎｉｎｅ、Ｌ−４−ＨＹＰ、Ｌ−３−ＨＹＰ、Ｌ−ＯｒｎまたはＬ−６−ｄｉａｚｏ−５−ｏｘｏ−ｎｏｒｌｅｕｃｉｎｅであるジペプチドをあげることができ、さらに好ましくは、Ｒ１がＬ−Ａｌａの場合は、Ｒ２はＬ−Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｖａｌ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ｉｌｅ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ａｓｎ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−Ｈｉｓ、Ｌ−α−ＡＢ、Ｌ−ＡｚａｓｅｒｉｎｅまたはＬ−ｔｈｅａｎｉｎｅであるジペプチド、Ｒ１がＧｌｙの場合は、Ｒ２はＬ−Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−ＡｒｇまたはＬ−α−ＡＢであるジペプチド、Ｒ１がＬ−Ｍｅｔの場合は、Ｒ２はＬ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−ＬｙｓまたはＬ−Ｈｉｓであるジペプチド、Ｒ１がＬ−Ｓｅｒの場合は、Ｒ２はＬ−Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−ＨｉｓまたはＬ−α−ＡＢであるジペプチド、Ｒ１がＬ−Ｔｈｒの場合は、Ｒ２はＬ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ｇｌｙ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−ＴｈｒまたはＬ−α−ＡＢであるジペプチド、Ｒ１がＬ−Ｇｌｎの場合は、Ｒ２はＬ−ＰｈｅまたはＬ−α−ＡＢであるジペプチド、Ｒ１がＬ−Ｐｈｅの場合は、Ｒ２はＬ−Ｇｌｎであるジペプチド、Ｒ１がＬ−Ｔｒｐの場合は、Ｒ２はＧｌｙであるジペプチド、Ｒ１がＬ−Ｃｙｓの場合は、Ｒ２はＬ−Ａｌａ、Ｌ−Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、またはＬ−Ｍｅｔであるジペプチド、Ｒ１がＬ−Ｌｙｓの場合は、Ｒ２はＬ−Ａｌａ、ＧｌｙまたはＬ−Ｍｅｔであるジペプチド、Ｒ１がＬ−Ａｒｇの場合は、Ｒ２はＬ−α−ＡＢであるジペプチド、Ｒ１がＬ−Ｈｉｓである場合は、Ｒ２はＬ−Ｍｅｔであるジペプチド、およびＲ１がＬ−α−ＡＢの場合は、Ｒ２はＬ−Ａｌａ、Ｌ−Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−ＡｒｇまたはＬ−α−ＡＢであるジペプチドをあげることができる。
また上記製造法においては、必要に応じて、ＡＴＰの供給源として、本発明の微生物が代謝してＡＴＰを生産し得る化合物、例えばグルコースのような糖類、エタノールのようなアルコール類、酢酸のような有機酸類なとを水性媒体中に加えることができる。
上記（ｉｉ）の製造法において、基質に用いられるＬ−アミノ酸エステルおよびＬ−アミノ酸としては、本発明の微生物が基質に用いてジペプチドを生成することができるＬ−アミノ酸エステルおよびＬ−アミノ酸であれば、いずれのＬ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸をいずれの組み合わせで用いてもよく、好ましくはＬ−アミノ酸エステルが、Ｌ−アラニンエステル、グリシンエステル、Ｌ−バリンエステル、Ｌ−イソロイシンエステル、Ｌ−メチオニンエステル、Ｌ−フェニルアラニンエステル、Ｌ−セリンエステル、Ｌ−スレオニンエステル、Ｌ−グルタミンエステル、Ｌ−チロシンエステル、Ｌ−アルギニンエステル、Ｌ−アスパラギン酸−α−エステル、Ｌ−アスパラギン酸−β−エステル、Ｌ−ロイシンエステル、Ｌ−アスパラギンエステル、Ｌ−リジンエステル、Ｌ−アスパラギン酸−α，β−ジメチルエステルおよびＬ−グルタミン−γ−エステルからなる群より選ばれるＬ−アミノ酸エステルであり、Ｌ−アミノ酸がＬ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ａｌａ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｐｒｏ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−ＨｉｓおよびＬ−Ｇｌｕからなる群より選ばれるＬ−アミノ酸をあげることができる。
上記（ｉｉ）の製造法において、基質として用いるＬ−アミノ酸エステルおよびＬ−アミノ酸は、０．１〜５００ｇ／Ｌ、好ましくは０．２〜２００ｇ／Ｌの濃度になるように水性媒体中に初発または反応途中に添加する。
上記（ｉｉｉ）の製造法において、基質に用いられるＬ−アミノ酸アミドおよびＬ−アミノ酸としては、本発明の微生物が基質に用いてジペプチドを生成することができるＬ−アミノ酸アミドおよびＬ−アミノ酸であれば、いずれのＬ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸をいずれの組み合わせで用いてもよく、好ましくはＬ−アミノ酸アミドが、Ｌ−アラニンアミド、グリシンアミドおよびＬ−アスパラギン酸アミドからなる群より選ばれるＬ−アミノ酸アミドであり、Ｌ−アミノ酸がＬ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ａｌａ、Ｌ−Ｖａｌ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ｉｌｅ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｐｒｏ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−ＨｉｓおよびＬ−Ｇｌｕからなる群より選ばれるＬ−アミノ酸をあげることができる。
上記（ｉｉｉ）の製造法において、基質として用いるＬ−アミノ酸アミドおよびＬ−アミノ酸は、０．１〜５００ｇ／Ｌ、好ましくは０．２〜２００ｇ／Ｌの濃度になるように水性媒体中に初発または反応途中に添加する。
本発明の製造法で用いられる水性媒体としては、ジペプチドの生成反応を阻害しない限り、いかなる成分、組成の水性媒体であってもよく、例えば、水、りん酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ほう酸塩、クエン酸塩、トリスなどの緩衝液などをあげることができる。また、メタノール、エタノールなどのアルコール類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類、アセトアミドなどのアミド類を含有していてもよい。
ジペプチドの生成反応は水性媒体中、ｐＨ５〜１１、好ましくはｐＨ６〜１０、２０〜６０℃、好ましくは２５〜４５℃の条件で２〜１５０時間、好ましくは６〜１２０時間行う。
さらに必要に応じて、水性媒体中に界面活性剤あるいは有機溶媒を添加してもよい。
界面活性剤としては、ポリオキシエチレン・オクタデシルアミン（例えばナイミーンＳ−２１５、日本油脂社製）などの非イオン界面活性剤、セチルトリメチルアンモニウム・ブロマイドやアルキルジメチル・ベンジルアンモニウムクロライド（例えばカチオンＦ２−４０Ｅ、日本油脂社製）などのカチオン系界面活性剤、ラウロイル・ザルコシネートなどのアニオン系界面活性剤、アルキルジメチルアミン（例えば三級アミンＦＢ、日本油脂社製）などの三級アミン類など、ジペプチドの生成を促進するものであればいずれでもよく、１種または数種を混合して使用することもできる。界面活性剤は、通常０．１〜５０ｇ／ｌの濃度で用いられる。有機溶剤としては、キシレン、トルエン、脂肪族アルコール、アセトン、酢酸エチルなどがあげられ、通常０．１〜５０ｍｌ／ｌの濃度で用いられる。
培養物の処理物としては、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、および該菌体の固定化物などをあげることができる。また、本発明の培養物の処理物には、上記菌体を界面活性剤処理、超音波処理、機械的摩砕処理、溶媒処理または酵素処理等して得られる処理物から、不溶物等を除いて得られる蛋白質の粗抽出物も含まれる。
培養物または該培養物の処理物を酵素源として用いる場合、該酵素源の量は、当該酵素源の比活性等により異なるが、例えば、基質であるアミノ酸、Ｌ−アミノ酸エステルまたはＬ−アミノ酸アミド１ｍｇあたり５〜１０００ｍｇ、好ましくは１０〜４００ｍｇ添加する。
水性媒体中に生成、蓄積したジペプチドの採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法あるいは、有機溶媒による抽出、結晶化、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等により行うことができる。
その他、上記（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の製造法は、ＷＯ ０３／０１０１８９またはＷＯ ０３／０１０１８７の記載に準じて行うことができる。
以下に、本発明の実験例を示す。
実験例１ バチルス・サチリス由来のｙｗｆＥ遺伝子発現プラスミドの造成
バチルス・サチリスのｙｗｆＥ遺伝子断片を以下のようにして取得した。
パーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成機を用いて、配列番号３５および配列番号３６で表される塩基配列を有するＤＮＡ（以下、それぞれプライマーＡ、プライマーＢと呼ぶ）を合成した。プライマーＡは、ｙｗｆＥ遺伝子の開始コドン（ａｔｇ）をＮｃｏＩ認識配列（ｃｃａｔｇｇ）に置換した領域を含む塩基配列である。プライマーＢは、ｙｗｆＥの終止コドンをＢａｍＨＩ認識配列（ｇｇａｔｃｃ）に置換した領域を含む塩基配列である。
バチルス・サチリスの染色体ＤＮＡを鋳型とし、上記プライマーＡおよびプライマーＢをプライマーセットとして用いたＰＣＲを行った。ＰＣＲは、０．１μｇの染色体ＤＮＡ、０．５μｍｏｌ／Ｌの各プライマー、２．５ｕｎｉｔｓのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、４μＬのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液、２００μｍｏｌ／Ｌの各ｄＮＴＰを含む反応液４０μＬを調製し、９４℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で３分間の工程を３０回繰り返すことにより行った。
該反応液の１／１０量をアガロース電気泳動し、ｙｗｆＥ遺伝子断片に相当する約１．４ｋｂの断片が増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルム溶液を添加し、混合した。該混合液を遠心分離後、得られた上層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離しＤＮＡの沈殿を得た。該ＤＮＡの沈殿を２０μＬのＴＥに溶解した。
該溶解液５μＬを用い、増幅したＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンＩＩキット（ＢＩＯ １０１社製）により、ｙｗｆＥ遺伝子を含む１．４ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
Ｃ末端Ｈｉｓタグ付加型組換え体発現ベクターｐＱＥ６０（キアゲン社製）０．２μｇを制限酵素ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、上記と同様の方法により３．４ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
上記で得られたｙｗｆＥ遺伝子を含む１．４ｋｂのＤＮＡ断片と３．４ｋｂのＤＮＡ断片をライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて、１６℃で１６時間反応させ連結した。
該連結反応液を用いてエシェリヒア・コリＮＭ５２２株（ストラタジーン社製）をカルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）〕によって形質転換し、該形質転換体を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーから公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、Ｃ末Ｈｉｓタグ付加型ｙｗｆＥ遺伝子発現ベクターであるｐＱＥ６０ｙｗｆＥを得た。該ベクターの構造を制限酵素消化により確認した（図１）。
実験例２ ｙｗｆＥ遺伝子産物の取得
ｐＱＥ６０ｙｗｆＥを保有するエシェリヒア・コリＮＭ５２２／ｐＱＥ６０ｙｗｆＥ株を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む８ｍｌのＬＢ培地の入った太型試験管に接種し２８℃で１７時間培養した。該培養液を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５０ｍｌのＬＢ培地の入った２５０ｍｌ容三角フラスコに接種し３０℃で３時間培養した後、終濃度が１ｍｍｏｌ／Ｌになるようにイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、さらに３０℃で４時間培養した。該培養液を遠心分離し湿菌体を取得した。該湿菌体から、ＨｉｓＴｒａｐ（Ｈｉｓタグ付加タンパク精製キット、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｓｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて、説明書に従いＨｉｓタグ付加組換え型酵素を精製した。
実験例３ Ｈｉｓタグ付加組換え型酵素を用いたジペプチドの生産（１）
（ｉ）実験例２で取得した精製したＨｉｓタグ付加組換え型酵素０．０４ｍｇ、１００ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、６０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化マグネシウム、６０ｍｍｏｌ／ＬのＡＴＰ、３０ｍｍｏｌ／ＬのＬ−Ａｌａ、３０ｍｍｏｌ／ＬのＬ−Ｇｌｎからなる０．１ｍｌの反応液を調製し、３７℃で１６時間反応を行った。
反応終了後、反応生成物をジニトロフェノール化法で誘導体化した後にＨＰＬＣ法により分析した。ＨＰＬＣ法による分析は、分離カラムに関東化学社製のＬｉｃｈｒｏｓｏｒｂ−ＲＰ−１８カラムを用い、溶離液として１％（ｖ／ｖ）リン酸、２５％（ｖ／ｖ）アセトニトリルを用い、０．７ｍｌ／分の流動速度で行った。反応液中に３．７ｇ／ＬのＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｎと０．３ｇ／ＬのＬ−アラニル−Ｌ−アラニン（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ）が生成蓄積していることを確認した。
（ｉｉ）酵素を０．０１ｍｇ、Ｌ−Ｇｌｎの代わりにＬ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−ＬｅｕまたはＬ−Ｖａｌを含有する以外は、上記（ｉ）の反応液の組成と同じ反応液を調製し、上記（ｉ）の反応条件で反応させた。
反応終了後、上記（ｉ）と同様の方法により反応生成物を分析し、反応液中にそれぞれ、７．０／ＬのＬ−アラニル−Ｌ−フェニルアラニン（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｈｅ）のみ、７．０ｇ／ＬのＬ−アラニル−Ｌ−メチオニン（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｍｅｔ）および０．０３ｇ／ＬのＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ、５．０ｇ／ＬのＬ−アラニル−Ｌ−ロイシン（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｌｅｕ）および０．２ｇ／ＬのＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ、または１．６ｇ／ＬのＬ−アラニル−Ｌ−バリン（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｖａｌ）および０．３ｇ／ＬのＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａが生成蓄積していることを確認した。
（ｉｉｉ）酵素を０．０１ｍｇ、Ｌ−Ａｌａの代わりにＧｌｙ、Ｌ−Ｇｌｎの代わりにＬ−ＰｈｅまたはＬ−Ｍｅｔを含有する以外は、上記（ｉ）の反応液の組成と同じ反応液を調製し、上記（ｉ）の反応条件で反応させた。
反応終了後、上記（ｉ）と同様の方法により反応生成物を分析し、反応液中にそれぞれ５．２ｇ／Ｌのグリシル−Ｌ−フェニルアラニン（Ｇｌｙ−Ｌ−Ｐｈｅ）または１．１ｇ／Ｌのグリシル−Ｌ−メチオニン（Ｇｌｙ−Ｌ−Ｍｅｔ）が生成蓄積していることを確認した。
上記反応液組成からＡＴＰを除くとジペプチドは全く生成されなかった。
以上の結果から、ｙｗｆＥ遺伝子産物は、ＡＴＰ存在下において、Ｌ−ＡｌａとＬ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−ＬｅｕまたはＬ−Ｖａｌとから、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−ＧｌｎおよびＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−ＭｅｔおよびＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−ＬｅｕおよびＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ、またはＬ−Ａｌａ−Ｌ−ＶａｌおよびＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａを生成する活性、ＧｌｙとＬ−ＰｈｅまたはＬ−ＭｅｔとからＧｌｙ−Ｌ−ＰｈｅまたはＧｌｙ−Ｌ−Ｍｅｔを生成する活性を有することが明らかになった。
実験例４ Ｈｉｓタグ付加組換え型酵素を用いたジペプチドの生産（２）
実験例２で得られた精製したＨｉｓタグ付加組換え型酵素０．０４ｍｇ、１００ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、６０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化マグネシウム、６０ｍｍｏｌ／ＬのＡＴＰからなる０．１ｍｌの反応液を調製し、表１の第１行目と最左列のアミノ酸の組み合わせからなる各種Ｌ−アミノ酸、Ｇｌｙまたはβ−Ａｌａをそれぞれ３０ｍｍｏｌ／Ｌずつになるように反応液に添加し、３７℃で１６時間反応を行った。反応終了後、反応生成物をＨＰＬＣ分析したところ、第１表に示すジペプチドが生成していることが確認された。
第１表の第１行目と最左列に記載の２種類（もしくは１種類）のＬ−アミノ酸、Ｇｌｙまたはβ−Ａｌａを基質として反応した場合に生成したジペプチドを枠内に記載した。○は配列は未確定だがジペプチドが生成したこと、×はジペプチドの生成が確認されなかったこと、および空欄は未実施を示す。
実験例５ Ｈｉｓタグ付加組換え型酵素発現株を用いたジペプチドの生産
実験例１で得られたエシェリヒア・コリＮＭ５２２／ｐＱＥ６０ｙｗｆＥ株を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む８ｍｌのＬＢ培地の入った太型試験管に接種し、２８℃で１７時間培養した。該培養液を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５０ｍｌのＬＢ培地の入った２５０ｍｌ容三角フラスコに接種し３０℃で３時間培養した後、終濃度が１ｍｍｏｌ／ＬになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３０℃で４時間培養した。該培養準を遠心分離し湿菌体を取得した。
２００ｇ／Ｌの湿菌体、５０ｇ／Ｌのグルコース、５ｇ／Ｌのフィチン酸（３３％の濃水酸化ナトリウム溶液を用いて中性になるよう希釈）、１５ｇ／Ｌのリン酸二水素カリウム、５ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム・７水和物、４ｇ／ＬのナイミーンＳ−２１５、１０ｍｌ／Ｌのキシレン、２００ｍｍｏｌ／ＬのＬ−Ａｌａ、２００ｍｍｏｌ／ＬのＬ−Ｇｌｎからなる２０ｍｌの反応液（ｐＨ７．２）を５０ｍｌ容量のビーカーに入れ、３２℃、９００ｒｐｍの条件下で２時間反応を行った。反応中は２ｍｏｌ／Ｌの水酸化カリウムを用いて反応液のｐＨを７．２に保った。
反応生成物を実験例３記載の方法と同様の方法で分析したところ、２５ｍｇ／ＬのＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｎの蓄積が確認された。
実験例６ バチルス属に属する各種微生物からｙｗｆＥ遺伝子に相当する遺伝子のクローニングとその解析
配列番号２６で表される塩基配列に基づき、バチルス・サチリスＡＴＣＣ１５２４５、ＡＴＣＣ６６３３、ＩＡＭ１２１３、ＩＡＭ１１０７、ＩＡＭ１２１４、ＡＴＣＣ９４６６、ＩＡＭ１０３３、ＡＴＣＣ２１５５５、バチルス・アミロリケファシエンスＩＦＯ３０２２、およびバチルス・プミルスＮＲＲＬ Ｂ−１２０２５に存在するｙｗｆＥ遺伝子に相当する遺伝子を以下のようにして取得した。
まず、バチルス・サチルスＡＴＣＣ１５２４５、ＡＴＣＣ６６３３、ＩＡＭ１２１３、ＩＡＭ１１０７、ＩＡＭ１２１４、ＡＴＣＣ９４６６、ＩＡＭ１０３３、ＡＴＣＣ２１５５５、バチルス・アミノリケファシエンスＩＦＯ３０２２、およびバチルス・プミルスＮＲＲＬ Ｂ−１２０２５をそれぞれＬＢ培地に植菌し３０℃で一晩静置培養した。培養後、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーに記載の飽和フェノールを用いる方法により、該微生物の染色体ＤＮＡをそれぞれ単離精製した。
パーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成機を用いて、配列番号３７および３８で表される塩基配列を有するＤＮＡ（以下、それぞれプライマーＣ、プライマーＤと呼ぶ）を合成した。プライマーＣは、バチルス・サチリス１６８株の染色体ＤＮＡのｙｗｆＥ遺伝子の開始コドンより上流を含む領域の配列である。プライマーＤは、ｙｗｆＥ遺伝子の終止コドンより下流を含む配列と相補的な配列である。
バチルス・サチルスＡＴＣＣ１５２４５、ＡＴＣＣ６６３３、ＩＡＭ１２１３、ＩＡＭ１１０７、ＩＡＭ１２１４、ＡＴＣＣ９４６６、ＩＡＭ１０３３、ＡＴＣＣ２１５５５、またはバチルス・アミノリケファシエンスＩＦＯ３０２２の染色体ＤＮＡを鋳型とし、上記プライマーＣおよびプライマーＤをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、０．１μｇの染色体ＤＮＡ、０．５μｍｏｌ／Ｌの各プライマー、２．５ｕｎｉｔｓのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、４μＬのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液、２００μｍｏｌ／Ｌの各ｄＮＴＰを含む反応液４０μＬを調製し、９４℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で３分間の工程を３０回繰り返すことにより行った。
該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、ｙｗｆＥ遺伝子断片に相当する約１．４ｋｂの断片が増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルム溶液を添加し、混合した。該溶液を遠心分離して得られた上層に、２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離して得られたＤＮＡの沈殿を２０μＬのＴＥに溶解した。
上記で得られた各菌株染色体ＤＮＡ由来の１．４ｋｂ断片とｐＣＲ−ｂｌｕｎｔ（インビトロジェン社製）を、ライゲーションキットを用いて、１６℃で１６時間反応を行い連結した。
該反応液を用いてエシェリヒア・コリＮＭ５２２株をカルシウムイオンを用いる方法によって形質転換した後、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布して、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、制限酵素を用いてそれぞれの構造を解析することにより、ｙｗｆＥ遺伝子に相当する遺伝子を含むプラスミドであるｐＹＷＦＥ１（ＡＴＣＣ１５２４５株由来、配列番号６５で表される塩基配列を有するＤＮＡ）、ｐＹＷＦＥ２（ＡＴＣＣ６６３３株由来、配列番号２７で表される塩基配列を有するＤＮＡ）、ｐＹＷＦＥ３（ＩＡＭ１２１３株由来、配列番号２８で表される塩基配列を有するＤＮＡ）、ｐＹＷＦＥ４（ＩＡＭ１１０７株由来、配列番号２９で表される塩基配列を有するＤＮＡ）、ｐＹＷＦＥ５（ＩＡＭ１２１４株由来、配列番号３０で表される塩基配列を有するＤＮＡ）、ｐＹＷＦＥ６（ＡＴＣＣ９４６６株由来、配列番号２６で表される塩基配列を有するＤＮＡ）、ｐＹＷＦＥ７（ＩＡＭ１０３３株由来、配列番号６５で表される塩基配列を有するＤＮＡ）、ｐＹＷＦＥ８（ＡＴＣＣ２１５５５株由来、配列番号３１で表される塩基配列を有するＤＮＡ）、ｐＹＷＦＥ９（ＩＦＯ３０２２株由来、配列番号３２で表される塩基配列を有するＤＮＡ）が取得されていることを確認した。
一方、バチルス・プミルスＮＲＲＬ Ｂ−１２０２５由来のｙｗｆＥ遺伝子に相当する遺伝子（配列番号６４で表される塩基配列を有するＤＮＡ）は以下のように取得した。
上記で調製したＮＲＲＬ Ｂ−１２０２５株の染色体ＤＮＡを鋳型にし、配列番号６６および６７で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは、０．１μｇの染色体ＤＮＡ、０．５μｍｏｌ／Ｌの各プライマー、２．５ｕｎｉｔｓのＺ−ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社製）、５μＬのＺ−ｔａｑポリメラーゼ用×１０緩衝液（タカラバイオ社製）、２００μｍｏｌ／Ｌの各ｄＮＴＰを含む反応液５０μＬを調製し、９８℃で５秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間の工程を３０回繰り返すことにより行った。
該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、約０．８ｋｂの断片が増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルム溶液を添加し、混合した。該混合液を遠心分離して得られた上層に、２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離して得られたＤＮＡの沈殿を２０μＬのＴＥに溶解した。
上記で得られた各菌株染色体ＤＮＡ由来の０．８ｋｂ断片とｐＧＥＭ Ｔ−ｅａｓｙ（プロメガ社製）を、ライゲーションキットを用いて、１６℃で１６時間反応を行い連結した。
該反応液を用いてエシェリヒア・コリＤＨ５α株をカルシウムイオンを用いる方法によって形質転換した後、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布して、３０℃で一晩培養した。
上記で得られた形質転換体からプラスミドを抽出して、約０．８ｋｂの挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を決定したところ、配列番号６４で表される塩基配列中の塩基番号３５８〜１１６０番からなる塩基配列が確認された。
次に該プラスミドをＥｃｏＲＩで切断した後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した。該ＤＮＡ断片をジーンクリーンＩＩキットを用いて精製した。約０．５μｇの該精製ＤＮＡ断片を、ＤＩＧ−ハイプライムＤＮＡラベリング＆デテクション スターターキットＩ（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）を用いて、ＤＩＧラベル化した。ＤＩＧラベル化は、該キット添付の説明書に従って行った。
上記で得られたＤＩＧラベル化ＤＮＡを用いて、ＮＲＲＬ Ｂ−１２０２５株の染色体ＤＮＡのサザン解析を行った。
ＮＲＲＬ Ｂ−１２０２５株の染色体ＤＮＡをＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＫｐｎＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｃＩ、ＳａｌＩおよびＳｐｈＩを用いてそれぞれ完全消化し、アガロース電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、常法に従いナイロンメンブレンプラスチャージ（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）に転移させた。
ＵＶを照射することにより、該ナイロン膜にＤＮＡ断片を固定した後、上記プローブＤＮＡおよび該ナイロン膜を用いてサザンハイブリダイゼーションを行った。
ハイブリダイゼーションは、該プローブＤＮＡと該ナイロン膜を６５℃で１６時間接触させ、その後該ナイロン膜を、０．１％ＳＤＳおよび２×ＳＳＣからなる溶液を用い、室温で５分間、２回洗浄し、さらに０．１％ＳＤＳおよび０．５×ＳＳＣからなる溶液を用い、６５℃で１５分間、２回洗浄することで行い、その他の操作、条件およびハイブリダイズしたＤＮＡの検出は、上記したＤＩＧ−ハイプライムＤＮＡラベリング＆デテクション スターターキットＩに添付されている説明書に準じて行った。
その結果、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｓｔＩの完全消化断片の３．５ｋｂｐ付近に発色が見られた。
次に、ＮＲＲＬ Ｂ−１２０２５株の染色体ＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｓｔＩを用いてそれぞれ全消化し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した。それぞれの制限酵素消化ＤＮＡから３−４ｋｂｐの断片をジーンクリーンＩＩキットを用いて精製し、ライゲーションキットを用いて自己環化させた。
上記で決定した０．８ｋｂのＤＮＡ断片の塩基配列に基づき、配列番号７１および７２で表される塩基配列を設計、合成し、上記で取得した環化ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、１０ｎｇの環化ＤＮＡ、０．５μｍｏｌ／Ｌの各プライマー、２．５ｕｎｉｔｓのｐｙｒｏｂｅｓｔポリメラーゼ（タカラバイオ社製）、５μＬのｐｙｒｏｂｅｓｔポリメラーゼ用×１０緩衝液（タカラバイオ社製）、２００μｍｏｌ／Ｌの各ｄＮＴＰを含む反応液５０μＬを調製し、９８℃で５秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３分３０秒間の工程を３０回繰り返すことにより行った。
該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、約３．０ｋｂの断片が増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルム溶液を添加し、混合した。該混合液を遠心分離して得られた上層に、２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離して得られたＤＮＡの沈殿を２０μＬのＴＥに溶解した。
上記で得られたＤＮＡ断片とＺｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）とをライゲーションキットを用いて連結した。
該反応液を用いてエシェリヒア・コリＮＭ５２２株をカルシウムイオンを用いる方法によって形質転換した後、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布して、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、制限酵素を用いてその構造を解析することにより、ｙｗｆＥ遺伝子に相当する遺伝子を含むプラスミドであるｐＹＷＦＥ１０（ＮＲＲＬ Ｂ−１２０２５株由来、配列番号６４で表される塩基配列を有するＤＮＡ）が得られていることを確認した。
上記で得られたｐＹＷＦＥ１〜ｐＹＷＦＥ１０に含まれるｙｗｆＥ遺伝子に相当する各遺伝子の塩基配列を塩基配列分析装置３７３Ａ・ＤＮＡシークエンサーを用いて決定した。
ｐＹＷＦＥ１、ｐＹＷＦＥ６およびｐＹＷＦＥ７に含まれる遺伝子にコードされる蛋白質のアミノ酸配列は、ｙｗｆＥ遺伝子にコードされる蛋白質のアミノ酸配列と同一であったが、ｐＹＷＦＥ２、ｐＹＷＦＥ３、ｐＹＷＦＥ４、ｐＹＷＦＥ５、ｐＹＷＦＥ８、ｐＹＷＦＥ９およびｐＹＷＦＥ１０に含まれる遺伝子にコードされる蛋白質のアミノ酸配列は、ｙｗｆＥ遺伝子にコードされる蛋白質のアミノ酸配列と異なっていた。
ｐＹＷＦＥ２、ｐＹＷＦＥ３、ｐＹＷＦＥ４、ｐＹＷＦＥ５、ｐＹＷＦＥ８、ｐＹＷＦＥ９、ｐＹＷＦＥ１０およびｐＹＷＦＥ１とｐＹＷＦＥ７に含まれるｙｗｆＥ遺伝子に相当する遺伝子にコードされる蛋白質のアミノ酸配列を配列番号２０〜２５、６８および１９に、該遺伝子の塩基配列を配列番号２７〜３２、６５および２６にそれぞれ示した。
実験例７ Ｃ末端Ｈｉｓタグ付加型組換え型ジペプチド合成酵素の精製
バチルス・サチルスＡＴＣＣ１５２４５、ＡＴＣＣ６６３３、ＩＡＭ１２１３、ＩＡＭ１１０７、ＩＡＭ１２１４、ＡＴＣＣ９４６６、ＩＡＭ１０３３、ＡＴＣＣ２１５５５、またはバチルス・アミノリケファシエンスＩＦＯ３０２２の染色体ＤＮＡを鋳型とし、実験例１記載のプライマーＡおよびプライマーＢをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、０．１μｇの染色体ＤＮＡ、０．５μｍｏｌ／Ｌの各プライマー、２．５ｕｎｉｔｓのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、４μＬのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液、２００μｍｏｌ／Ｌの各ｄＮＴＰを含む反応液４０μＬを調製し、９４℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で３分間の工程を３０回繰り返すことにより行った。
バチルス・プミルスＮＲＲＬ Ｂ−１２０２５の染色体ＤＮＡを鋳型とした場合は、配列番号６９および７０で表される塩基配列を有するＤＮＡをプライマーセットとして用い、上記と同様の条件でＰＣＲを行った。
該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、ｙｗｆＥ断片に相当する約１．４ｋｂのＤＮＡ断片がそれぞれ増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルム溶液を添加し、混合した。該混合液を遠心分離して得られた上層に、２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離して得られたＤＮＡの沈殿を２０μＬのＴＥに溶解した。
該溶解液のそれぞれ５μＬを用い、増幅したＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンＩＩキットを用いて、ｙｗｆＥ遺伝子に相当する遺伝子を含む１．４ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
次にＣ末端Ｈｉｓタグ付加型組換え体発現ベクターｐＱＥ６０ ０．２μｇを制限酵素ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、上記と同様の方法により３．４ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
上記で得られたバチルス・サチルス１６８株のｙｗｆＥ遺伝子に相当する遺伝子を含む１．４ｋｂのＤＮＡ断片、および３．４ｋｂのＤＮＡ断片をライゲーションキットを用いて、１６℃で１６時間反応を行いそれぞれ連結した。該反応液を用いて大腸菌ＮＭ５２２株をカルシウムイオンを用いる方法により形質転換した後、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布して、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、制限酵素を用いてそれらの構造を解析することにより、Ｃ末Ｈｉｓタグ付加型遺伝子発現ベクターであるｐＱＥ６０ｙｗｆＥ１（ＡＴＣＣ１５２４５由来の遺伝子を含有するベクター）、ｐＱＥ６０ｙｗｆＥ２（ＡＴＣＣ６６３３由来の遺伝子を含有するベクター）、ｐＱＥ６０ｙｗｆＥ３（ＩＡＭ１２１３由来の遺伝子を含有するベクター）、ｐＱＥ６０ｙｗｆＥ４（ＩＡＭ１１０７由来の遺伝子を含有するベクター）、ｐＱＥ６０ｙｗｆＥ５（ＩＡＭ１２１４由来の遺伝子を含有するベクター）、ｐＱＥ６０ｙｗｆＥ６（ＡＴＣＣ９４６６由来の遺伝子を含有するベクター）、ｐＱＥ６０ｙｗｆＥ（ＩＡＭ１０３３由来の遺伝子を含有するベクター）、ｐＱＥ６０ｙｗｆＥ８（ＡＴＣＣ２１５５５由来の遺伝子を含有するベクター）、ｐＱＥ６０ｙｗｆＥ９（ＩＦＯ３０２２由来の遺伝子を含有するベクター）、およびｐＱＥ６０ｙｗｆＥ１０（ＮＲＲＬ Ｂ−１２０２５由来の遺伝子を含有するベクター）が取得されていることを確認した。
上記で得られたエシェリヒア・コリＮＭ５２２／ｐＱＥ６０ｙｗｆＥ１〜ＮＭ５２２／ｐＱＥ６０ｙｗｆＥ１０株を、それぞれ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む８ｍｌのＬＢ培地の入った太型試験管に接種し、２８℃で１７時間培養した。該培養液を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５０ｍｌのＬＢ培地の入った２５０ｍｌ容の三角フラスコに接種し３０℃で３時間培養した後、終濃度が１ｍｍｏｌ／ＬになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３０℃で４時間培養した。該培養液を遠心分離して得られた湿菌体から、ＨｉｓＴｒａｐをその使用説明書に従って用いて、Ｈｉｓタグ付加組換え型酵素を精製した。
実験例８ 精製酵素を用いたジペプチドの生産
実験例７で得られた組換え型酵素０．０４ｍｇ、１００ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、６０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化マグネシウム、６０ｍｍｏｌ／ＬのＡＴＰ、３０ｍｍｏｌ／ＬのＬ−Ａｌａおよび３０ｍｍｏｌ／ＬのＬ−Ｇｌｎからなる０．１ｍｌの反応液を調製し、３７℃で１６時間反応を行った。
反応終了後、実験例３記載の方法により反応液を分析した結果、それぞれ、３．０〜３．５ｇ／ＬのＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｎおよび０．２５〜０．３ｇ／ＬのＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａが生成蓄積していることが確認された。
また、上記反応液組成からＡＴＰを除くとＬ−Ａｌａ−Ｌ−ＧｌｎおよびＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａは全く生成されなかった。
以上の結果から、実験例７で得られた遺伝子の産物は、いずれもＡＴＰ存在下でＬ−ＡｌａとＬ−ＧｌｎとからＬ−Ａｌａ−Ｌ−ＧｌｎおよびＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａを生成する活性を有することが明らかになった。
実験例９ ｙｗｆＥ遺伝子の発現を強化した大腸菌の造成
パーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成機を用いて、配列番号６０〜６３に記載の配列をそれぞれ有するＤＮＡ（以下、それぞれプライマーＥ、プライマーＦ、プライマーＧ、プライマーＨ）を合成した。配列番号６０の配列は、プラスミドｐＱＥ６０ｙｗｆＥのｙｗｆＥのリボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ配列を含む領域について５’にＸｈｏＩ認識配列を含む配列を付加したものである。配列番号６１の配列は、ｙｗｆＥの終止コドンを含む配列と相補的な配列の５’にＢａｍＨＩ認識配列を含む配列を付加したものである。また配列番号６２の配列は、ｔｒｐプロモーターを含む発現ベクターｐＴｒＳ３０のｔｒｐプロモーター領域の配列について５’にＥｃｏＲＩ認識配列を含む配列を付加したものである。配列番号６３の配列は、ｔｒｐプロモーターを含む発現ベクターｐＴｒＳ３０のｔｒｐプロモーター領域の配列と相補的な配列の５’にＸｈｏＩ認識配列を含む配列を付加したものである。
プラスミドｐＱＥ６０ｙｗｆＥを鋳覯とし、ｙｗｆＥ断片の増幅には上記のプライマーＥおよびプライマーＦを、ｔｒｐプロモーター領域の断片の増幅にはプライマーＧおよびプライマーＨをそれぞれプライマーセットとして用いたＰＣＲを行った。ＰＣＲは、１０ｎｇのｐＱＥ６０ｙｗｆＥ、０．５μｍｏｌ／ｌの各プライマー、２．５ｕｎｉｔｓのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、４μｌのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液、２００μｍｏｌ／ｌの各ｄＮＴＰを含む４０μｌの反応液を調製し、９４℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で３分間の工程を３０回繰り返すことにより行った。
該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、プライマーＥおよびプライマーＦを用いたＰＣＲではｙｗｆＥ遺伝子断片に相当する約１．４ｋｂ、プライマーＧおよびプライマーＨを用いた反応ではｔｒｐプロモーター領域の断片に相当する約０．３ｋｂの断片がそれぞれ増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルム溶液を添加し、混合した。該溶液を遠心分離後、得られた上層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離して得られたＤＮＡを２０μｌのＴＥに溶解した。
上記で得られたそれぞれのＤＮＡ溶液５μｌを用い、プライマーＥおよびプライマーＦで増幅したＤＮＡを制限酵素ＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩで、またプライマーＧおよびプライマーＨで増幅したＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンＩＩキットにより、それぞれｙｗｆＥ遺伝子を含む１．４ｋｂおよびｔｒｐプロモーター領域を含む０．３ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
０．２μｇのｔｒｐプロモーターを含む発現ベクターｐＴｒＳ３０を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に４．５ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
上記で得られたｙｗｆＥ遺伝子を含む１．４ｋｂ断片、ｔｒｐプロモーター領域を含む０．３ｋｂ断片および４．５ｋｂの断片をライゲーションキットを用いて、１６℃で１６時間、連結反応を行った。
該反応液を用いて大腸菌ＮＭ５２２株をカルシウムイオンを用いる方法に従って形質転換し、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、ｔｒｐプロモーター下流にｙｗｆＥ遺伝子を含む発現ベクターであるｐＰＥ５６を得た。該ベクターの構造を制限酵素消化により確認した（図２）。
【図面の簡単な説明】
第１図は、Ｈｉｓタグ付加型ｙｗｆＥ遺伝子発現ベクターであるｐＱＥ６０ｙｗｆＥの構築過程を示す図である。
第２図は、ｙｗｆＥ遺伝子発現強化型ベクターであるｐＰＥ５６の構築過程を示す図である。
各図中の符号の意味は以下のとおりである。
ＰＴ５；Ｔ５プロモーター
Ｐｔｒｐ；トリプトファンプロモーター
以下に本発明の実施例を示すが、下記実施例は本発明の範囲を制限するものではない。
【発明を実施するための最良の形態】
実施例１ ｐｅｐＤ遺伝子、ｐｅｐＮ遺伝子、ｐｅｐＢ遺伝子、ｐｅｐＡ遺伝子およびｄｐｐオペロン欠損株の作製
エシェリヒア・コリ染色体ＤＮＡ上の特定遺伝子が欠損した菌株は、ラムダファージの相同組換え系を利用した方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，６６４１−６６４５（２０００）］に従って作製した。
以下に記載のプラスミドｐＫＤ４６、ｐＫＤ３およびｐＣＰ２０は、エシェリヒア・コリ ジェネティック ストック センター（米国エール大学）から該プラスミドを保持するエシェリヒア・コリ株を入手し、該大腸菌から抽出したものを用いた。
（１）遺伝子欠損用ＤＮＡ断片のクローニング
エシェリヒア・コリＫ１２株の染色体ＤＮＡ上に存在する配列番号１０で表される塩基配列を有するｐｅｐＤ遺伝子、配列番号１１で表される塩基配列を有するｐｅｐＮ遺伝子、配列番号１２で表される塩基配列を有するｐｅｐＢ遺伝子、配列番号１３で表される塩基配列を有するｐｅｐＡ遺伝子および配列番号１４で表される塩基配列を有するｄｐｐＡ遺伝子、配列番号１５で表される塩基配列を有するｄｐｐＢ遺伝子、配列番号１６で表される塩基配列を有するｄｐｐＣ遺伝子、配列番号１７で表される塩基配列を有するｄｐｐＤ遺伝子および配列番号１８で表される塩基配列を有するｄｐｐＦ遺伝子を欠損させることを目的に、パーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成機を用い、エシェリヒア・コリＫ１２株の染色体ＤＮＡ上における各々の欠損標的遺伝子の上流および下流に位置する３６ｂｐからなる塩基配列と相同な塩基配列、および配列番号３９で表される酵母由来Ｆｌｐ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅが認識する塩基配列を有するＤＮＡを合成した。ただし、ｄｐｐＡ遺伝子、ｄｐｐＢ遺伝子、ｄｐｐＣ遺伝子、ｄｐｐＤ遺伝子およびｄｐｐＦ遺伝子は、オペロンを形成しているので、該オペロンの上流および下流に位置する塩基配列と相同な塩基配列を有するＤＮＡを合成した。
すなわち、ｐｅｐＤ遺伝子欠損用ＤＮＡ断片増幅用プライマーセットとして配列番号４０および４１、ｐｅｐＮ遺伝子欠損用ＤＮＡ断片増幅用プライマーセットとして配列番号４２および４３、ｐｅｐＡ遺伝子欠損用ＤＮＡ断片増幅用プライマーセットとして配列番号４４および４５、ｐｅｐＢ遺伝子欠損用ＤＮＡ断片増幅用プライマーセットとして配列番号４６および４７、ｄｐｐオペロン欠損用ＤＮＡ断片増幅用プライマーセットとして配列番号４８および４９で表される塩基配列からなるＤＮＡをそれぞれ合成した。
次に、上記合成ＤＮＡをプライマーセットとして用い、ｐＫＤ３ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲは１０ｎｇのプラスミドＤＮＡ、０．５μｍｏｌ／ｌの各プライマー、２．５ｕｎｉｔｓのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）、４μｌのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液（ストラタジーン社製）、２００μｍｏｌ／ｌの各ｄｅｏｘｙＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびＴＴＰ）を含む４０μｌの反応液を用い、９４℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で３分間の工程を３０回繰り返すことにより行った。
それぞれの反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、目的の断片が増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ〔１０ｍｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ〕飽和フェノール／クロロホルム（１ｖｏｌ／１ｖｏｌ）を添加し、混合した。
該混合液を遠心分離後、得られた上層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃で３０分間放置した。該溶液を遠心分離し、ｐｅｐＤ遺伝子、ｐｅｐＮ遺伝子、ｐｅｐＢ遺伝子、ｐｅｐＡ遺伝子およびｄｐｐオペロン欠損用クロラムフェニコール耐性遺伝子含有ＤＮＡ断片を取得した。
（２）ｐｅｐＤ遺伝子欠損エシェリヒア・コリＪＭ１０１の作製
大腸菌ＪＭ１０１株をｐＫＤ４６で形質転換し、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３０℃で培養することで選択した。
プラスミドｐＫＤ４６上にはλＲｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ遺伝子が挿入されており、またその発現はＬ−アラビノースにより誘導されるよう設計されている。よって、Ｌ−アラビノース存在下で生育させた大腸菌を、直鎖状ＤＮＡを用いて形質転換すると、高頻度で相同組換えが起こる。またｐＫＤ４６は温度感受性の複製起点を有するために、４２℃で生育させることにより、プラスミドを容易に脱落させることができる。
１０ｍｍｏｌ／ｌのＬ−アラビノースと５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加して培養して得られた大腸菌ＪＭ１０１／ｐＫＤ４６に、電気パルス法により上記で取得したｐｅｐＤ遺伝子欠損用クロラムフェニコール耐性遺伝子含有ＤＮＡ断片を導入し、大腸菌ＪＭ１０１の染色体ＤＮＡ上にｐｅｐＤ遺伝子欠損用クロラムフェニコール耐性遺伝子含有ＤＮＡ断片が相同組換えにより組込まれた形質転換株を２５ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地（バクトトリプトン１０ｇ／ｌ、バクトイーストエキストラクト５ｇ／ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／ｌ、寒天１５ｇ／ｌ）に塗布し、３０℃で培養することで選択した。
選択したクロラムフェニコール耐性株を、２５ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地に植菌し、４２℃で１４時間培養した後、単コロニー分離した。得られた各コロニーを２５ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地、及び１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地にレプリカし、３７℃で培養し、クロラムフェニコール耐性かつアンピシリン感受性を示すコロニーを選択することにより、ｐＫＤ４６脱落株を取得した。
次に上記で得られたｐＫＤ４６脱落株をｐＣＰ２０を用いて形質転換し、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上で選択することにより、ｐＣＰ２０を保持するｐＫＤ４６脱落株を取得した。
プラスミドｐＣＰ２０には酵母由来Ｆｌｐ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ遺伝子が挿入されており、該遺伝子の発現は４２℃で誘導されるよう設計されている。
また、上記で作製したｐｅｐＤ遺伝子、ｐｅｐＮ遺伝子、ｐｅｐＢ遺伝子、ｐｅｐＡ遺伝子及びｄｐｐオペロン欠損用クロラムフェニコール耐性遺伝子含有ＤＮＡ断片の、クロラムフェニコール耐性遺伝子の両端にはＦｌｐ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅが認識する塩基配列が存在するため、Ｆｌｐ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅが触媒する相同組換えにより容易に該耐性遺伝子を脱落させることができる。
さらに、ｐＣＰ２０は温度感受性の複製起点を有しているため、ｐＣＰ２０保持株を４２℃で生育させることにより、Ｆｌｐ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅの発現とｐＣＰ２０の脱落を同時に誘導することができる。
上記で取得したｐＣＰ２０保有ｐＫＤ４６脱落株を薬剤無添加のＬＢ寒天培地に植菌し、４２℃で１４時間培養した後、単コロニー分離した。得られた各コロニーを薬剤無添加ＬＢ寒天培地、２５ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地および１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地にレプリカして、３０℃で培養し、クロラムフェニコール感受性かつアンピシリン感受性を示すコロニーを選択した。
上記で選択した各株からそれぞれ染色体ＤＮＡを常法（生物工学実験書、日本生物工学会編９７〜９８ページ、培風館、１９９２年）に従って調製した。欠損の標的遺伝子であるｐｅｐＤ遺伝子の内部塩基配列に基づいて設計した配列番号５０および５１で表される塩基配列を有するＤＮＡをプライマーセットとして用い、染色体ＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲを行った。ＰＣＲは、０．１μｇの染色体ＤＮＡ、０．５μｍｏｌ／ｌの各プライマー、２．５ｕｎｉｔｓのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、４μｌのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液、２００μｍｏｌ／ｌの各ｄｅｏｘｙＮＴＰを含む４０μｌの反応液を用い、９４℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で３分間からなる工程を３０回繰り返すことにより行った。
上記ＰＣＲにおいて、増幅ＤＮＡ断片が検出されなかった株をｐｅｐＤ遺伝子欠損株とし、エシェリヒア・コリＪＰＤ１株と名づけた。
（３）エシェリヒア・コリＪＭ１０１の染色体ＤＮＡ上のｐｅｐＤ遺伝子およびｐｅｐＮ遺伝子が欠損した株の作製
上記（２）で得られたエシェリヒア・コリＪＰＤ１株をｐＫＤ４６で形質転換し、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３０℃で培養することにより選択した。得られた形質転換株（エシェリヒア・コリＪＰＤ１／ｐＫＤ４６）に、電気パルス法によりｐｅｐＮ遺伝子欠損用クロラムフェニコール耐性遺伝子含有ＤＮＡ断片を導入し、エシェリヒア・コリＪＰＤ１／ｐＫＤ４６の染色体ＤＮＡ上にｐｅｐＮ遺伝子欠損用クロラムフェニコール耐性遺伝子含有ＤＮＡ断片が相同組換えにより組込まれた形質転換株を取得した。
次に、上記（２）と同様の操作を行うことにより、染色体ＤＮＡ上からクロラムフェニコール耐性遺伝子が欠落した株を取得し、該株をエシェリヒア・コリＪＰＤＮ２と名づけた。
（４）エシェリヒア・コリＪＭ１０１の染色体ＤＮＡ上のｐｅｐＮ遺伝子、ｐｅｐＡ遺伝子、ｐｅｐＢ遺伝子またはｄｐｐオペロンが欠損した株、および多重遺伝子欠損株の作製
ｐｅｐＮ遺伝子、ｐｅｐＡ遺伝子、ｐｅｐＢ遺伝子またはｄｐｐオペロンの欠損株は、上記（１）で作製した各遺伝子またはオペロン欠損用クロラムフェニコール耐性遺伝子含有ＤＮＡ断片を用い、上記（２）と同様の方法により作製した。
上記方法により各々の遺伝子欠損株が取得されたことは、各々の欠損遺伝子の内部塩基配列に基づき設計、合成した配列番号５２〜５９で表される塩基配列を有するＤＮＡをプライマーセットとして用い、上記（２）と同様のＰＣＲにより確認した。ここで、配列番号５２および５３で表される塩基配列からなるＤＮＡはｐｅｐＮ遺伝子欠損確認用、配列番号５４および５５で表される塩基配列からなるＤＮＡはｐｅｐＡ遺伝子欠損確認用、配列番号５６および５７で表される塩基配列からなるＤＮＡはｐｅｐＢ遺伝子欠損確認用、配列番号５８および５９で表される塩基配列からなるＤＮＡはｄｐｐオペロン欠損確認用プライマーセットである。
上記方法で取得されたｄｐｐオペロン欠損株をエシェリヒア・コリＪＤＰＰ１株、ｐｅｐＮ遺伝子欠損株をエシェリヒア・コリＪＰＮ１株、ｐｅｐＡ遺伝子欠損株をエシェリヒア・コリＪＰＡ１株、ｐｅｐＢ遺伝子欠損株をエシェリヒア・コリＪＰＢ７株と名付けた。
また、上記（３）の方法に準じて、ｐｅｐＤ遺伝子、ｐｅｐＮ遺伝子、ｐｅｐＡ遺伝子、ｐｅｐＢ遺伝子およびｄｐｐオペロンからなる群より選ばれる２以上の遺伝子またはオペロンの多重欠損株を作製した。多重欠損株が取得できたことの確認は、上記（２）と同様のＰＣＲにより確認した。前記方法で取得されたｐｅｐＤ遺伝子およびｄｐｐオペロンが欠損した二重遺伝子欠損株をエシェリヒア・コリＪＰＤＰ４９株、ｐｅｐＢ遺伝子、ｐｅｐＤ遺伝子およびｐｅｐＮ遺伝子が欠損した三重遺伝子欠損株をエシェリヒア・コリＪＰＤＮＢ４３株、ｐｅｐＤ遺伝子、ｐｅｐＮ遺伝子およびｄｐｐオペロンが欠損した三重遺伝子欠損株をエシェリヒア・コリＪＰＮＤＤＰ３６株、ｐｅｐＡ遺伝子、ｐｅｐＤ遺伝子、ｐｅｐＮ遺伝子およびｄｐｐオペロンが欠損した四重遺伝子欠損株をエシェリヒア・コリＪＰＮＤＡＰ５株、ｐｅｐＢ遺伝子、ｐｅｐＤ遺伝子、ｐｅｐＮ遺伝子およびｄｐｐオペロンが欠損した四重遺伝子欠損株をエシェリヒア・コリＪＰＮＤＢＰ７株と名づけた。第２表は、各遺伝子欠損株における欠損遺伝子名を示す。
実施例２ ペプチダーゼおよびペプチド取り込み活性が喪失した大腸菌株を用いたＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン（以下、ＡｌａＧｌｎと称す）及びＬ−アラニル−Ｌ−アラニン（以下、ＡｌａＡｌａと称す）の生産性の評価。
実施例１で得られた各種ペプチダーゼ遺伝子およびジペプチド取り込み蛋白質をコードするオペロンの欠損株を、実験例８で造成したプラスミドｐＰＥ５６を用いて形質転換し、アンピシリン耐性を示す形質転換株を取得した。
得られた形質転換株を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む８ｍｌのＬＢ培地の入った試験管に接種し、２８℃で１７時間培養した。該培養液を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む８ｍｌの生産培地（リン酸水素二カリウム １６ｇ／ｌ、リン酸二水素カリウム １４ｇ／ｌ、硫酸アンモニウム ５ｇ／Ｌ、クエン酸（無水） １ｇ／ｌ、カザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ社製） ０．５ｇ／ｌ、Ｌ−Ｐｒｏ １ｇ／ｌ、Ｌ−Ａｌａ ２．５ｇ／ｌ、Ｌ−Ｇｌｎ ２．５ｇ／ｌ、グルコース １０ｇ／ｌ、ビタミンＢ１ １０ｍｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・７水和物 ２５ｍｇ／ｌ、硫酸鉄７水和物 ５０ｍｇ／ｌ、１０ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨ７．２に調整。Ｌ−Ｇｌｎは１０倍濃縮液をフィルターろ過滅菌後、グルコース、ビタミンＢ１、硫酸マグネシウム・７水和物、硫酸鉄・７水和物は別個に蒸煮後添加）を試験管に１％接種し、３０℃で２４時間培養した。該培養液を遠心分離し培養上清を取得した。
培養上清中の生産物をＦ−ｍｏｃ化法で誘導体化した後にＨＰＬＣ法により分析した。ＨＰＬＣ法による分析は、分離カラムにＯＤＳ−ＨＧ５（野村化学社製）を用い、溶離液としてＡ液（酢酸 ６ｍｌ／ｌ、２０％（ｖ／ｖ）アセト二トリル、トリエチルアミンにてｐＨ４．８に調整）およびＢ液（酢酸 ６ｍｌ／ｌ、７０％（ｖ／ｖ）アセト二トリル、トリエチルアミンにてｐＨ４．８調整）を用い、０〜５分まではＡ液：Ｂ液＝８：２、５〜２０分までは、２０分目でＡ液：Ｂ液＝１：１になるようにリニアーグラジエントをかける条件で分析を行った。分析結果を第３表に示す。
第３表から、２種以下のペプチダーゼ遺伝子が欠損した微生物、１種のペプチド取り込み蛋白質遺伝子のみが欠損した微生物では、ジペプチドの生成、蓄積量は低いが、１種以上のペプチダーゼ遺伝子および１種のペプチド取り込み蛋白質遺伝子が欠損した微生物、または３種以上のペプチダーゼ遺伝子が欠損した微生物では、ジペプチドの生成、蓄積量が大幅に増加していることがわかった。
実施例３ ペプチダーゼおよびペプチド取り込み蛋白質の活性が喪失した大腸菌株を用いたＬ−アラニル−Ｌ−バリン（以下、ＡｌａＶａｌと称す）の生産性の評価
実施例２と同様に、各種ペプチダーゼ遺伝子およびペプチド取り込み蛋白質をコードするオペロンの欠損大腸菌株を、ｐＰＥ５６を用いて形質転換した。得られた形質転換株を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む８ｍｌのＬＢ培地の入った試験管に接種し、２８℃で１７時間培養した。該培養液を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む８ｍｌの生産培地（リン酸水素二カリウム １６ｇ／ｌ、リン酸二水素カリウム １４ｇ／ｌ、硫酸アンモニウム ５ｇ／ｌ、クエン酸（無水） １ｇ／ｌ、カザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ社製） ０．５ｇ／ｌ、Ｌ−Ｐｒｏ １ｇ／ｌ、Ｌ−Ａｌａ ２．５ｇ／ｌ、Ｌ−Ｖａｌ ２．５ｇ／ｌ、グルコース １０ｇ／ｌ、ビタミンＢ１ １０ｍｇ／ｌ、硫酸マグネシウム・７水和物 ２５ｍｇ／ｌ、硫酸鉄・７水和物 ５０ｍｇ／ｌ、１０ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム溶液でｐＨ７．２に調整。グルコース、ビタミンＢ１、硫酸マグネシウム・７水和物、硫酸鉄・７水和物は別個に蒸煮後に添加）が入った試験管に１％接種し、３０℃で２４時間培養した。該培養液を遠心分離し培養上清を取得した。
培養上清中の生成物を、実施例２記載の方法により分析した。結果を第４表に示す。
第４表から、２種以下のペプチダーゼ遺伝子が欠損した微生物、および１種のペプチド取り込み蛋白質遺伝子のみが欠損した微生物はジペプチドを生産しないが、３種以上のペプチダーゼ遺伝子が欠損した微生物、または１種以上のペプチダーゼ遺伝子および１種のペプチド取り込み蛋白質遺伝子が欠損した微生物は、ジペプチドを生産することがわかった。
実施例４ ペプチダーゼおよびペプチド取り込み蛋白質の活性が喪失した大腸菌株を用いたグリシル−Ｌ−グルタミン（以下、ＧｌｙＧｌｎと称す）の生産性の評価
実施例２と同様に各種ペプチダーゼ遺伝子およびペプチド取り込み蛋白質をコードするオペロンの欠損株を、ｐＰＥ５６を用いて形質転換した。得られた形質転換株を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む８ｍｌのＬＢ培地の入った試験管に接種し、２８℃で１７時間培養した。
該培養液を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む８ｍｌの生産培地（リン酸水素二カリウム １６ｇ／ｌ、リン酸二水素カリウム １４ｇ／ｌ、硫酸アンモニウム ５ｇ／Ｌ、クエン酸（無水） １ｇ／ｌ、カザミノ酸（ディフコ社製） ０．５ｇ／ｌ、Ｌ−Ｐｒｏ、１ｇ／ｌ、Ｇｌｙ ２．５ｇ／ｌ、Ｌ−Ｇｌｎ ２．５ｇ／ｌ、グルコース １０ｇ／ｌ、ビタミンＢ１ １０ｍｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・７水和物 ２５ｍｇ／ｌ、硫酸鉄７水和物 ５０ｍｇ／ｌ、１０ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨ７．２に調整。Ｌ−Ｇｌｎは１０倍濃縮液をフィルターろ過滅菌後、グルコース、ビタミンＢ１、硫酸マグネシウム・７水和物、硫酸鉄・７水和物は別個に蒸煮後添加）が入った試験管に１％接種し、３０℃で２４時間培養した。該培養液を遠心分離し培養上清を取得した。
培養上清中の生成物を、実施例２記載の方法より分析した。結果を第５表に示す。
第５表から、２種以下のペプチダーゼ遺伝子が欠損した微生物、および１種のペプチド取り込み蛋白質遺伝子のみが欠損した微生物は、ジペプチドを生産しなかったが、３種以上のペプチダーゼ遺伝子が欠損した微生物、および２種以上のペプチダーゼ遺伝子および１種のペプチド取り込み蛋白質遺伝子が欠損のした微生物は、ジペプチドを生産することがわかった。
【産業上の利用可能性】
本発明により、ジペプチドを生産する微生物および該微生物を用いたジペプチドの製造法を提供することができる。
【配列表フリーテキスト】
配列番号３５−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号３６−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号３７−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号３８−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号３９−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号４０−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号４１−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号４２−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号４３−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号４４−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号４５−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号４６−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号４７−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号４８−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号４９−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号５０−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号５１−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号５２−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号５３−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号５４−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号５５−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号５６−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号５７−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号５８−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号５９−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号６０−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号６１−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号６２−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号６３−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号６６−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号６７−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号６９−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号７０−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号７１−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号７２−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
【図１】
【図２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１種以上のペプチダーゼおよび１種以上のペプチド取り込み活性を有する蛋白質（以下、ペプチド取込み蛋白質ともいう）の活性が低下または喪失し、かつジペプチドを生産する能力を有する微生物。
【請求項２】
３種以上のペプチダーゼの活性が低下または喪失し、かつジペプチドを生産する能力を有する微生物。
【請求項３】
ペプチダーゼが、配列番号１〜４のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、または配列番号１〜４のいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつペプチダーゼ活性を有する蛋白質である請求項１または２記載の微生物。
【請求項４】
ペプチド取込み蛋白質が、配列番号５〜９のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、または配列番号５〜９のいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、かつペプチド取り込み活性を有する蛋白質である請求項１または３記載の微生物。
【請求項５】
ジペプチドを生産する能力を有する微生物が、以下の［１］〜１４］のいずれかに記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物である請求項１〜４のいずれか１項に記載の微生物。
［１］配列番号１９〜２５および６８のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［２］配列番号１９〜２５および６８のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつジペプチドの合成活性を有する蛋白質
［３］配列番号１９〜２５および６８のいずれかで表されるアミノ酸配列と６５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつジペプチドの合成活性を有する蛋白質
［４］配列番号３３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつジペプチドの合成活性を有する蛋白質
【請求項６】
ジペプチドを生産する能力を有する微生物が、以下の［１］〜［４］のいずれかに記載のＤＮＡを有する微生物である請求項１〜４のいずれか１項に記載の微生物。
［１］請求項５の［１］〜［４］のいずれかに記載の蛋白質をコード−するＤＮＡ
［２］配列番号２６〜３２、６４および６５のいずれかで表される塩基配列を有するＤＮＡ
［３］配列番号２６〜３２、６４および６５のいずれかで表される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつジペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［４］配列番号３４で表される塩基配列と８０％以上の相同性を有する塩基配列を有し、かつジペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
【請求項７】
ジペプチドを生産する能力を有する微生物が、請求項６の［１］〜［４］のいずれかに記載のＤＮＡとベクターＤＮＡが連結した組換え体ＤＮＡを有する微生物である請求項１〜６のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項８】
微生物が、エシェリヒア属、バチルス属、コリネバクテリウム属またはサッカロマイセス属に属する微生物である請求項１〜７のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項９】
ジペプチドを生産する能力を有する微生物が、Ｌ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸からジペプチドを生成する能力を有する微生物である請求項１〜４のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項１０】
Ｌ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸からジペプチドを生成する能力を有する微生物が、プロリンイミノペプチダーゼを生産する微生物である請求項９記載の微生物。
【請求項１１】
Ｌ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸からジペプチドを生成する能力を有する微生物が、プロリンイミノペプチダーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡとベクターＤＮＡが連結した組換え体ＤＮＡを有する微生物である請求項９または１０記載の微生物。
【請求項１２】
微生物が、エシェリヒア属、バチルス属、コリネバクテリウム属またはサッカロマイセス属に属する微生物である請求項９〜１１のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項１３】
ジペプチドを生産する能力を有する微生物が、Ｌ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸からジペプチドを生成する能力を有する微生物である請求項１〜４のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項１４】
Ｌ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸からジペプチドを生成する能力を有する微生物が、Ｌ−アミノ酸アミドハイドロラーゼ活性を有する蛋白質を生産する微生物である請求項１３記載の微生物。
【請求項１５】
Ｌ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸からジペプチドを生成する能力を有する微生物が、Ｌ−アミノ酸アミドハイドロラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡとベクターＤＮＡが連結した組換え体ＤＮＡを有する微生物である請求項１３記載の微生物。
【請求項１６】
微生物が、エシェリヒア属、バチルス属、コリネバクテリウム属またはサッカロマイセス属に属する微生物である請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項１７】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、１種以上のアミノ酸を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドを生成、蓄積させ、該媒体から該ジペプチドを採取するジペプチドの製造法。
【請求項１８】
ジペプチドが式（Ｉ）
Ｒ１−Ｒ２ （Ｉ）
（式中、Ｒ１およびＲ２は同一または異なってアミノ酸を表す）で表されるジペプチドである請求項１７記載の製造法。
【請求項１９】
請求項９〜１２のいずれか１項に記載の微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、Ｌ−アミノ酸エステルおよびＬ−アミノ酸を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドを生成、蓄積させ、該媒体から該ジペプチドを採取するジペプチドの製造法。
【請求項２０】
請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、Ｌ−アミノ酸アミドおよびＬ−アミノ酸を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドを生成、蓄積させ、該媒体から該ジペプチドを採取するジペプチドの製造法。
【請求項２１】
培養物の処理物が、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、または該菌体の固定化物であることを特徴とする請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項１】
１種以上のペプチダーゼおよび１種以上のペプチド取り込み活性を有する蛋白質（以下、ペプチド取込み蛋白質ともいう）の活性が低下または喪失し、かつジペプチドを生産する能力を有する微生物。
【請求項２】
３種以上のペプチダーゼの活性が低下または喪失し、かつジペプチドを生産する能力を有する微生物。
【請求項３】
ペプチダーゼが、配列番号１〜４のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、または配列番号１〜４のいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつペプチダーゼ活性を有する蛋白質である請求項１または２記載の微生物。
【請求項４】
ペプチド取込み蛋白質が、配列番号５〜９のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、または配列番号５〜９のいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、かつペプチド取り込み活性を有する蛋白質である請求項１または３記載の微生物。
【請求項５】
ジペプチドを生産する能力を有する微生物が、以下の［１］〜１４］のいずれかに記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物である請求項１〜４のいずれか１項に記載の微生物。
［１］配列番号１９〜２５および６８のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［２］配列番号１９〜２５および６８のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつジペプチドの合成活性を有する蛋白質
［３］配列番号１９〜２５および６８のいずれかで表されるアミノ酸配列と６５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつジペプチドの合成活性を有する蛋白質
［４］配列番号３３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつジペプチドの合成活性を有する蛋白質
【請求項６】
ジペプチドを生産する能力を有する微生物が、以下の［１］〜［４］のいずれかに記載のＤＮＡを有する微生物である請求項１〜４のいずれか１項に記載の微生物。
［１］請求項５の［１］〜［４］のいずれかに記載の蛋白質をコード−するＤＮＡ
［２］配列番号２６〜３２、６４および６５のいずれかで表される塩基配列を有するＤＮＡ
［３］配列番号２６〜３２、６４および６５のいずれかで表される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつジペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［４］配列番号３４で表される塩基配列と８０％以上の相同性を有する塩基配列を有し、かつジペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
【請求項７】
ジペプチドを生産する能力を有する微生物が、請求項６の［１］〜［４］のいずれかに記載のＤＮＡとベクターＤＮＡが連結した組換え体ＤＮＡを有する微生物である請求項１〜６のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項８】
微生物が、エシェリヒア属、バチルス属、コリネバクテリウム属またはサッカロマイセス属に属する微生物である請求項１〜７のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項９】
ジペプチドを生産する能力を有する微生物が、Ｌ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸からジペプチドを生成する能力を有する微生物である請求項１〜４のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項１０】
Ｌ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸からジペプチドを生成する能力を有する微生物が、プロリンイミノペプチダーゼを生産する微生物である請求項９記載の微生物。
【請求項１１】
Ｌ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸からジペプチドを生成する能力を有する微生物が、プロリンイミノペプチダーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡとベクターＤＮＡが連結した組換え体ＤＮＡを有する微生物である請求項９または１０記載の微生物。
【請求項１２】
微生物が、エシェリヒア属、バチルス属、コリネバクテリウム属またはサッカロマイセス属に属する微生物である請求項９〜１１のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項１３】
ジペプチドを生産する能力を有する微生物が、Ｌ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸からジペプチドを生成する能力を有する微生物である請求項１〜４のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項１４】
Ｌ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸からジペプチドを生成する能力を有する微生物が、Ｌ−アミノ酸アミドハイドロラーゼ活性を有する蛋白質を生産する微生物である請求項１３記載の微生物。
【請求項１５】
Ｌ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸からジペプチドを生成する能力を有する微生物が、Ｌ−アミノ酸アミドハイドロラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡとベクターＤＮＡが連結した組換え体ＤＮＡを有する微生物である請求項１３記載の微生物。
【請求項１６】
微生物が、エシェリヒア属、バチルス属、コリネバクテリウム属またはサッカロマイセス属に属する微生物である請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項１７】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、１種以上のアミノ酸を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドを生成、蓄積させ、該媒体から該ジペプチドを採取するジペプチドの製造法。
【請求項１８】
ジペプチドが式（Ｉ）
Ｒ１−Ｒ２ （Ｉ）
（式中、Ｒ１およびＲ２は同一または異なってアミノ酸を表す）で表されるジペプチドである請求項１７記載の製造法。
【請求項１９】
請求項９〜１２のいずれか１項に記載の微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、Ｌ−アミノ酸エステルおよびＬ−アミノ酸を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドを生成、蓄積させ、該媒体から該ジペプチドを採取するジペプチドの製造法。
【請求項２０】
請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、Ｌ−アミノ酸アミドおよびＬ−アミノ酸を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドを生成、蓄積させ、該媒体から該ジペプチドを採取するジペプチドの製造法。
【請求項２１】
培養物の処理物が、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、または該菌体の固定化物であることを特徴とする請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の製造法。
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０４５００６
【国際公開日】平成１７年５月１９日（２００５．５．１９）
【発行日】平成１９年５月１７日（２００７．５．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１５３６４（Ｐ２００５−５１５３６４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１６７１０
【国際出願日】平成１６年１１月４日（２００４．１１．４）
【出願人】（０００００１０２９）協和醗酵工業株式会社 (276)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年５月１９日（２００５．５．１９）
【発行日】平成１９年５月１７日（２００７．５．１７）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１６７１０
【国際出願日】平成１６年１１月４日（２００４．１１．４）
【出願人】（０００００１０２９）協和醗酵工業株式会社 (276)
【Ｆターム（参考）】
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