説明

スタチンおよびスタチン中間体の合成のための酵素化学的方法

【課題】アトルバスタチン、LIPITOR(登録商標)、ロスバスタチン(CRESTOR(登録商標))、フルバスタチン(LESCOL(登録商標))、等のスタチン、関連化合物およびそれらの中間体を製造する方法を提供する。
【解決手段】新規なアルドラーゼおよび前記アルドラーゼをコードする核酸、たとえば、特定な配列からなる遺伝子配列の核酸、または特定な配列のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそれらの酵素的に活性な断片、およびそれらの使用。


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【特許請求の範囲】
【請求項1】
(a)配列番号5,配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27または配列番号29と、少なくとも70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%若しくはそれ以上、または100%の配列同一性を有する核酸配列を含む、アルドラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、単離、合成または組換え核酸またはそれらの酵素的に活性な断片;
(b)配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28または配列番号30の配列を有するポリペプチドまたはそれらの酵素的に活性な断片をコードする核酸配列を含む単離、合成または組換え核酸;
(c)配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27または配列番号29の配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含む、アルドラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離、合成または組換え核酸であって、前記ストリンジェントな条件が、0.2 x SSC中で約65℃にて約15分間の洗浄を含む洗浄工程を含む前記単離、合成または組換え核酸;
(d)シグナル配列を欠くポリペプチドをコードする、(a)、(b)または(c)に記載の核酸;
(e)さらに異種核酸配列または異種ペプチド若しくは異種ポリペプチドをコードする異種核酸配列を含む、(a)、(b)、(c)または(d)に記載の核酸;
(f)異種核酸配列が異種シグナル配列(シグナルペプチド)、異種プレプロドメイン、異種アルドラーゼシグナル配列(シグナルペプチド)または異種非-アルドラーゼシグナル配列(シグナルペプチド)をコードする核酸配列を含む、(e)に記載の核酸;
(g)異種ポリペプチドまたはペプチドが、シグナルペプチド(SP)、プレプロドメインまたは触媒ドメイン(CD)のアミノ末端、カルボキシ末端、または、アミノ末端とカルボキシ末端の両端にある、(e)または(f)記載の核酸;
(h)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)または(g)記載の核酸の配列に完全に相補的である核酸配列を含む、単離、合成または組換え核酸;
(i)アルドラーゼ活性が炭素-炭素結合形成を触媒する活性、アルドール縮合を触媒する活性、2-デオキシリボース-5-リン酸アルドラーゼ(DERA)活性、供与体としてのアセトアルデヒドと2(R)-ヒドロキシ-3-(ヒドロキシまたはメルカプト)-プロピオンアルデヒド誘導体との縮合により2-デオキシ糖を生成する触媒活性、供与体としてのアセトアルデヒドと2-置換アセトアルデヒド受容体との縮合により4-置換-3-ヒドロキシブタナール中間体を経て2,4,6-トリデオキシヘキソースを生じさせる触媒活性、基質として2つのアセトアルデヒドを用いてキラルアルデヒドを生じさせる触媒活性、キラルβ,δ-ジヒドロキシヘプタン酸側鎖のエナンチオ選択的構築活性、[R-(R*,R*)]-2-(4-フルオロフェニル)-b,d-ジヒドロキシ-5-(1-メチルエチル)-3-フェニル-4-(フェニルアミノ)-カルボニル]-1H-ピロール-1-ヘプタン酸(アトロバスタチン、あるいはLIPITORTM)、ロスバスタチン(CRESTORTM)またはフルバスタチン(LESCOLTM)の核のエナンチオ選択的構築活性、酸化段階により3R,5S-6-クロロ-2,4,6-トリデオキシ-エリスロ-ヘキソノラクトンの合成活性、熱安定性アルドラーゼ活性、または、熱耐性アルドラーゼ活性を有する、(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)または(g)記載の核酸。
【請求項2】
配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27または配列番号29を含む配列の少なくとも10、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24若しくは25の連続する塩基を含み、結合またはハイブリダイゼーションによってアルドラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を同定する、アルドラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を同定するための核酸プローブであって、前記ハイブリダイゼーションの条件が0.2 x SSC中で約65℃にて約15分間の洗浄を含む洗浄工程を含む、前記核酸プローブ。
【請求項3】
(a)請求項1記載の核酸を含む、ベクター、クローニングビヒクルまたは発現カセット;または、
(b)ウイルスベクター、プラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、フォスミド、バクテリオファージ若しくは人工染色体を含む、または、ウイルスベクター、プラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、フォスミド、バクテリオファージ若しくは人工染色体からなる、(a)記載のベクター、クローニングビヒクルまたは発現カセット。
【請求項4】
請求項1記載の核酸または請求項3記載のベクター、クローニングビヒクルまたは発現カセットを含む、形質転換細胞。
【請求項5】
請求項1記載の核酸または請求項3記載のベクター、クローニングビヒクルまたは発現カセットを含む、非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項6】
請求項1記載の核酸または請求項3記載のベクター、クローニングビヒクルまたは発現カセットを含む、トランスジェニック植物または種子。
【請求項7】
(i)配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28または配列番号30と少なくとも70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれより高い、または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アルドラーゼ活性を有する、単離、合成または組換えポリペプチド、またはそれらの酵素的に活性な断片;
(ii)請求項1記載の核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む、アルドラーゼ活性を有する、単離、合成または組換えポリペプチド;
(iii)シグナル配列を欠く、(i)または(ii)に記載のポリペプチド;
(iv)さらに異種核酸配列または異種ペプチド若しくは異種ポリペプチドをコードする異種核酸配列を含む、(i)、(ii)または(iii)に記載のポリペプチド;
(v)異種ペプチド若しくは異種ポリペプチドが、異種シグナル配列(シグナルペプチド)、異種プレプロドメイン、異種アルドラーゼシグナル配列(シグナルペプチド)または異種非-アルドラーゼシグナル配列(シグナルペプチド)を含む、(iv)記載のポリペプチド;
(vi)異種ペプチド若しくは異種ポリペプチドが、シグナルペプチド(SP)、プレプロドメインまたは触媒ドメイン(CD)のアミノ末端、カルボキシ末端、または、アミノ末端とカルボキシ末端の両端にある、(iv)または(v)に記載のポリペプチド;
(vii)アルドラーゼ活性が炭素-炭素結合形成を触媒する活性、アルドール縮合を触媒する活性、2-デオキシリボース-5-リン酸アルドラーゼ(DERA)活性、供与体としてのアセトアルデヒドと2(R)-ヒドロキシ-3-(ヒドロキシまたはメルカプト)-プロピオンアルデヒド誘導体との縮合により2-デオキシ糖を生成する触媒活性、供与体としてのアセトアルデヒドと2-置換アセトアルデヒド受容体との縮合により4-置換-3-ヒドロキシブタナール中間体を経て2,4,6-トリデオキシヘキソースを生じさせる触媒活性、基質として2つのアセトアルデヒドを用いてキラルアルデヒドを生じさせる触媒活性、キラルβ,δ-ジヒドロキシヘプタン酸側鎖のエナンチオ選択的構築活性、[R-(R*,R*)]-2-(4-フルオロフェニル)-b,d-ジヒドロキシ-5-(1-メチルエチル)-3-フェニル-4-(フェニルアミノ)-カルボニル]-1H-ピロール-1-ヘプタン酸(アトロバスタチン、あるいはLIPITORTM)、ロスバスタチン(CRESTORTM)またはフルバスタチン(LESCOLTM)の核のエナンチオ選択的構築活性、酸化段階により3R,5S-6-クロロ-2,4,6-トリデオキシ-エリスロ-ヘキソノラクトンの合成活性、熱安定性アルドラーゼ活性、または、熱耐性アルドラーゼ活性を有する、(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)または(vi)記載のポリペプチド。
【請求項8】
請求項7記載のポリペプチドを含む組成物。
【請求項9】
請求項7記載のポリペプチドに特異的に結合する、単離、合成または組換え抗体。
【請求項10】
以下の工程を含む、組換えポリペプチドを製造する方法:
(I) (a)請求項1記載の核酸を提供する工程;および
(b)(a)の核酸をポリペプチドの発現を許容する条件下で発現させ、それによって組換えポリペプチドを製造する工程;または
(II)(a)請求項1記載の核酸を含むベクターを提供する工程;および
(b)(a)のベクターを発現させる工程であって、前記発現が高活性プロモーター、二シストロン性ベクター、またはベクターの遺伝子増幅によって行われる、前記工程。
【請求項11】
以下の工程を含む、アルドラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸の変種を生成する方法:
(I) (a)請求項1記載の核酸の配列を含む鋳型核酸を提供する工程;および、
(b)前記鋳型配列における1以上のヌクレオチドを改変、欠失または付加、またはそれらの組合せにより、前記鋳型核酸の変種を作製する工程;
(II)(a)請求項1記載の核酸の配列を含む、アルドラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を提供する工程;および、
(b)工程(a)の核酸中の非優先コドンまたは低優先コドンを同定し、前記コドンを置換されるコドンと同じアミノ酸をコードする優先コドンまたは中性的に使用されるコドンに置換する工程;または、
(III)請求項7記載のポリペプチドまたは請求項1記載の核酸によってコードされるポリペプチドをグリコシル化する工程。
【請求項12】
以下の工程を含む、図7中で中間体IIとして記載した式を有する化合物を調製する方法:
(I) (a)アルドール供与基質を提供する工程;
(b)アルドール受容基質を提供する工程;
(c)請求項7記載のアルドラーゼポリペプチドを提供する工程;
(d)工程(a)のアルドール供与基質、工程(b)のアルドール受容基質、および工程(c)のアルドラーゼを、前記アルドラーゼが前記工程(a)および(b)の基質間の縮合反応を触媒し得る条件下で混合し、それによって図7中で中間体IIとして記載した式を有する化合物を製造する工程;
(II)(a)アルドール供与基質を提供する工程;
(b)アルドール受容基質を提供する工程;
(c)請求項7記載のアルドラーゼポリペプチドを提供する工程;
(d)工程(a)のアルドール供与基質、工程(b)のアルドール受容基質、および工程(c)のアルドラーゼを、前記アルドラーゼが前記工程(a)および(b)の基質間の縮合反応を触媒し得る条件下で混合する工程であって、少なくとも約30分間〜12時間にわたって、前記基質が添加されると速やかに消費されるような速度で前記基質が反応混合物へ供給される、前記工程。
【請求項13】
以下を含む、スタチンを製造する方法:
(a)スタチンがアトルバスタチン(LIPITORTM)である、図14に記載された方法;
(b)(i)請求項7記載のアルドラーゼポリペプチドの存在下でアセトアルデヒドをクロロアセトアルデヒドと反応させる工程;
(ii)(i)の生成物を参加して、3R,5S-6-クロロ-2,4,6-トリデオキシ-エリスロ-ヘキソノラクトンを製造する工程;
(iii)3R, 5S-6-クロロ-2,4,6-トリデオキシ-エリスロ-ヘキソノラクトンを(3R,5S)-3,5,6-トリヒドロキシヘキサン酸に転換する工程であって、場合により前記転換がNaCN、DMFおよび5%H2Oの存在下、または場合によりNaOHおよびH2Oの存在下で行われる前記工程;または
(c)スタチンがロスバスタチン(CRESTORTM)またはフルバスタチン(LESCOLTM)であって、図14または図17に記載された方法。
【請求項14】
以下を含む、3R,5S-6-クロロ-2,4,6-トリデオキシ-エリスロ-ヘキソノラクロン(図14中の化合物1)を製造する方法:
(a)クロロラクトールを次亜塩素酸ナトリウムでクロロラクトンに酸化すること;または、
(b)図15に記載した方法。
【請求項15】
NaCN、DMFおよび5%H2Oを使用することを含む、エポキシド(-(3R,5S-3-ヒドロキシ-4-オキシラニル酪酸)(図16中の構造物2)の製造方法。
【請求項16】
図16に記載された方法を含む、(3R,5S)-3,5,6-トリヒドロキシヘキサン酸の製造方法。

【図1】
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【図2】
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【図3】
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【図4】
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【図5】
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【図6】
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【図7】
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【図8】
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【図9】
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【図10】
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【図11】
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【図12】
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【図13】
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【図14】
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【図15】
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【図16】
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【図17】
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【図18】
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【図19】
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【図20】
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【図21】
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【公開番号】特開2011−78419(P2011−78419A)
【公開日】平成23年4月21日(2011.4.21)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2010−248439(P2010−248439)
【出願日】平成22年11月5日(2010.11.5)
【分割の表示】特願2004−568922(P2004−568922)の分割
【原出願日】平成15年8月19日(2003.8.19)
【出願人】(503089489)ヴェレニウム コーポレイション (31)
【Fターム(参考)】