スタヒロコッカス・アウレウスＯＲＦ０６５７Ｎを標的とする抗原結合タンパク質
本発明は、ＯＲＦ０６５７ｎ標的領域（配列番号１）に結合する抗原結合タンパク質に関する。ＯＲＦ０６５７ｎはスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）タンパク質である。ＯＲＦ０６５７ｎ標的領域はｍＡｂ ｌＧ３．ＢＤ４、ｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１、ｍＡｂ １３Ｃ７．ＢＣｌおよびｍＡｂ １３Ｇ１１．ＢＦ３結合部位により与えられる。致死モデルチャレンジにおいて、ｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１およびｍＡｂ １３Ｃ７．ＢＣ１はスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染に対する生存性の上昇をもたらした。また、ｍＡｂ ２Ｈ２のＩｇＧ１またはＩｇＧ２ｂ形態を使用するエクスビボモデルにおいて、およびｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１を使用する受動免疫マウス留置カテーテルモデルにおいて、防御が実証された。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＯＲＦ０６５７ｎを標的とする抗原結合タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
本出願の全体にわたって引用されている参考文献は、特許請求されている本発明の先行技術であると自認するものではない。
【０００３】
スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）は、多種多様な疾患および状態を引き起こす病原体である。スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）により引き起こされる疾患および状態の具体例には、菌血症、感染性心内膜炎、毛包炎、フルンケル、カルブンケル、膿痂疹、水疱性膿痂疹、蜂窩織炎、ボトリオミセス症、中毒性ショック症候群、熱傷様皮膚症候群、中枢神経系感染症、感染性および炎症性眼疾患、骨髄炎ならびに関節および骨の他の感染症、ならびに気道感染症が含まれる（Ｔｈｅ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｃｒｏｓｓｌｅｙ ａｎｄ Ａｒｃｈｅｒ（編），Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ Ｉｎｃ．１９９７）。
【０００４】
スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染およびスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の広がりを抑制するためには、免疫学に基づく方法が用いられうる。免疫学に基づく方法には受動免疫化および能動免疫化が含まれる。受動免疫化は、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を標的とする免疫グロブリンを使用する。能動免疫化はスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に対する免疫応答を誘導する。
【発明の開示】
【０００５】
発明の概要
本発明は、ＯＲＦ０６５７ｎ標的領域（配列番号１）に結合する抗原結合タンパク質に関する。ＯＲＦ０６５７ｎはスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）タンパク質である。ＯＲＦ０６５７ｎ標的領域はｍＡｂ ｌＧ３．ＢＤ４、ｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１、ｍＡｂ １３Ｃ７．ＢＣｌおよびｍＡｂ １３Ｇ１１．ＢＦ３結合部位により与えられる。致死モデルチャレンジにおいて、ｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１およびｍＡｂ １３Ｃ７．ＢＣ１はスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染に対する生存性の上昇をもたらした。また、ｍＡｂ ２Ｈ２のＩｇＧ１またはＩｇＧ２ｂ形態を使用するエクスビボモデルにおいて、およびｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１を使用する受動免疫マウス留置カテーテルモデルにおいても、防御が実証された。
【０００６】
ｍＡｂ １Ｇ３．ＢＤ４、ｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１、ｍＡｂ １３Ｃ７．ＢＣ１およびｍＡｂ １３Ｇ１１．ＢＦ３を産生するマウスハイブリドーマ細胞系は、ブダペスト条約に従い、２００５年９月３０日付けでＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， １０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０−２２０９に寄託された。該細胞系にはＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−７１２４（ｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１を産生する）、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−７１２５（ｍＡｂ １３Ｃ７．ＢＣ１を産生する）、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−７１２６（ｍＡｂ １Ｇ３．ＢＤ４を産生する）およびＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−７１２７（ｍＡｂ １３Ｇ１１．ＢＦ３を産生する）が付与された。
【０００７】
したがって、本発明の第１の態様は、第１可変領域および第２可変領域を含んでなる単離された抗原結合タンパク質に関する。第１および第２可変領域は、ｍＡｂ １Ｇ３．ＢＤ４標的領域、ｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１標的領域、ｍＡｂ １３Ｃ７．ＢＣ１標的領域およびｍＡｂ １３Ｇ１１．ＢＦ３標的領域よりなる群から選ばれる１以上の標的領域に結合する。
【０００８】
「単離（された）」に対する言及は、天然で見出されるものとは異なる形態を示す。そのような異なる形態は、例えば、天然で見出されるものとは異なる純度および／または天然で見出されない構造体でありうる。天然で見出されない構造体には、異なる領域が一緒になった組換え構造体、例えば、１以上のマウス相補性決定領域がヒトフレームワークスカフォールド上に挿入された又はヒト抗体の表面残基を模倣するためにマウス抗体の表面が修飾されたヒト化抗体、抗原結合タンパク質由来の１以上の相補性決定領域が別のフレームワークスカフォールド内に挿入されたハイブリッド抗体、ならびに軽可変ドメインおよび重可変ドメインをコードする遺伝子が互いにランダムに組合わされた天然ヒト配列に由来する抗体が含まれる。
【０００９】
単離されたタンパク質は、好ましくは、血清タンパク質を実質的に含有しない。血清タンパク質を実質的に含有しないタンパク質は、ほとんど又は全ての血清タンパク質を欠く環境中に存在する。
【００１０】
「可変領域」は重鎖または軽鎖からの抗体可変領域の構造を有する。抗体重鎖および軽鎖の可変領域は、フレームワーク上に間隔をあけて存在する３つの相補性決定領域を含有する。該相補性決定領域は主として、特定のエピトープの認識をもたらす。
【００１１】
標的領域は、ｍＡｂ １Ｇ３．ＢＤ４、ｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１、ｍＡｂ １３Ｃ７．ＢＣ１またはｍＡｂ １３Ｇ１１．ＢＦ３が結合するＯＲＦ０６５７ｎ領域（配列番号１）に関して定義される。例えば、ｍＡｂ ＩＧ３．ＢＤ４標的領域は、ｍＡｂ ＩＧ３．ＢＤ４が結合するＯＲＦ０６５７ｎ領域である。
【００１２】
特定された標的領域に結合するタンパク質は該標的領域への結合に関してｍＡｂ １Ｇ３．ＢＤ４、ｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１、ｍＡｂ １３Ｃ７．ＢＣ１またはｍＡｂ １３Ｇ１１．ＢＦ３と競合する。例えば、ＯＲＦ０６５７ｎに結合するｍＡｂ １Ｇ３．ＢＤ４と競合するタンパク質は、ｍＡｂ １Ｇ３．ＢＤ４標的領域に結合する。
【００１３】
モノクローナル抗体ｍＡｂ １Ｇ３．Ｂ３、ｍＡｂ ２Ｈ２．Ｂ８、ｍＡｂ １３Ｃ７．Ｄ１２またはｍＡｂ １３Ｇ１１．Ｃ１１のいずれかと競合するタンパク質は、過剰量および等量の該競合タンパク質およびモノクローナル抗体を使用した場合、ＯＲＦ０６５７ｎへの該モノクローナル抗体の結合を少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約５０％軽減する。
【００１４】
「タンパク質」に対する言及は連続的アミノ酸配列を示し、最小または最大サイズ限界を与えるものではない。該タンパク質中に存在する１以上のアミノ酸はグリコシル化またはジスルフィド結合形成のような翻訳後修飾を含有しうる。
【００１５】
好ましい抗原結合タンパク質はモノクローナル抗体である。「モノクローナル抗体」に対する言及は、同じ又は実質的に同じ相補性決定領域および結合特異性を有する一群の抗体を示す。該抗体における変異は、該抗体が同一構築物から製造された場合に生じるものである。
【００１６】
モノクローナル抗体は、例えば、特定のハイブリドーマから、および該抗体をコードする１以上の組換え遺伝子を含有する組換え細胞から製造されうる。該抗体は２以上の組換え遺伝子によりコードされることが可能であり、この場合、例えば、１つの遺伝子は重鎖をコードし、１つの遺伝子は軽鎖をコードする。
【００１７】
本発明のもう１つの態様は、抗体可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む組換え遺伝子を含有する核酸を記載する。該抗体可変領域は、ｍＡｂ ＩＧ３．ＢＤ４標的領域、ｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１標的領域、ｍＡｂ １３Ｃ７．ＢＣ１およびｍＡｂ １３Ｇ１１．ＢＦ３標的領域よりなる群から選ばれる標的領域に結合しうる。
【００１８】
組換え遺伝子は、適切な転写およびプロセシングのための調節要素（これは翻訳および翻訳後要素を含みうる）と共にタンパク質をコードする組換え核酸を含有する。該組換え核酸は、その配列および／または形態の点で、天然では見出されない。組換え核酸の具体例には、精製された核酸、天然で見出されるものとは異なる核酸を与える一緒になった２以上の核酸領域、互いに天然で付随している１以上の核酸領域（例えば、上流または下流領域）の非存在が含まれる。
【００１９】
本発明のもう１つの態様は、ｍＡｂ ＩＧ３．ＢＤ４標的領域、ｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１標的領域、ｍＡｂ １３Ｃ７．ＢＣ１およびｍＡｂ １３Ｇ１１．ＢＦ３標的領域よりなる群から選ばれる標的領域に結合する抗体可変領域をコードする１以上の組換え遺伝子を含んでなる組換え細胞を記載する。複数の組換え遺伝子が有用であり、例えば、この場合、１つの遺伝子は抗体重鎖またはそのフラグメント（Ｖｈ領域を含有するもの）をコードし、もう１つの核酸は抗体軽鎖またはそのフラグメント（Ｖｌ領域を含有するもの）をコードする。
【００２０】
本発明のもう１つの態様は、抗体可変領域を含むタンパク質の製造方法を含む。該方法は、（ａ）該タンパク質が発現される条件下、タンパク質をコードする組換え核酸を含む組換え細胞を増殖させ、（ｂ）該タンパク質を精製する段階を含む。
【００２１】
本発明のもう１つの態様は医薬組成物を記載する。該組成物は治療的有効量の抗原結合タンパク質および医薬上許容される担体を含有する。
【００２２】
治療的有効量は、有用な治療効果または予防効果をもたらすのに十分な量である。スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に感染した患者の場合、有効量は、以下の効果の１以上を達成するのに十分な量である：該患者におけるスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の増殖能の軽減、または該患者におけるスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の量の減少。スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に感染していない患者の場合、有効量は、以下の１以上を達成するのに十分な量である：スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染に対する感受性の軽減、または慢性疾患を招く持続感染を該感染細菌が確立する能力の軽減。
【００２３】
本発明のもう１つの態様は、溶液中または細胞上のＯＦＲ０６５７ｎ抗原の存在の検出方法を記載する。該方法は、本明細書に記載の結合タンパク質を該溶液または細胞に加え、該溶液または細胞中の該抗原への該結合タンパク質の結合能を測定することを含む。測定は定量的または定性的でありうる。
【００２４】
ＯＲＦ０６５７ｎ抗原に対する言及は、完全長ＯＲＦ０６５７ｎ、またはｍＡｂ １Ｇ３．Ｂ３、ｍＡｂ ２Ｈ２．Ｂ８、ｍＡｂ １３Ｃ７．Ｄ１２またはｍＡｂ １３Ｇ１１．Ｃ１１により認識されるエピトープを有するその誘導体を含む。誘導体の具体例には、トランケート化形態；および以下のアミノ酸改変の１以上を含有するＯＲＦ０６５７ｎの完全長またはトランケート化形態が含まれる：１以上の付加、１以上の置換および１以上の欠失。
【００２５】
本発明のもう１つの態様は、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染に対する患者の治療方法に関する。該方法は、本明細書に記載の抗原結合タンパク質の有効量を患者に投与する段階を含む。治療される患者はスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に感染していても感染していなくてもよい。好ましくは、患者はヒトである。
【００２６】
本発明のもう１つの態様は、ｍＡｂ １Ｇ３．Ｂ３、ｍＡｂ ２Ｈ２．Ｂ８、ｍＡｂ １３Ｃ７．Ｄ１２もしくはｍＡｂ １３Ｇ１１．Ｃ１１のいずれかである又はＯＲＦ０６５７ｎへの結合に関してｍＡｂ ＩＧ３．Ｂ３、ｍＡｂ ２Ｈ２．Ｂ８、ｍＡｂ １３Ｃ７．Ｄ１２もしくはｍＡｂ １３Ｇ１１．Ｃ１１のいずれかと競合するタンパク質を産生する細胞系を記載する。好ましい細胞系は、該タンパク質をコードする組換え核酸を含有する組換え細胞系およびハイブリドーマである。
【００２７】
「含む（含んでなる）」のような非限定的用語に対する言及は追加的な要素または段階を許容する。場合によっては、「１以上」のような表現は、追加的な要素または段階の可能性を強調するために非限定的用語と共に又はそれを伴わずに用いられる。
【００２８】
明示的に示されていない限り、単数表現は単数を示すと限定されるものではない。例えば、「細胞」は複数の細胞を除外するものではない。場合によっては、可能な複数の存在を強調するために、１以上のような表現が用いられる。
【００２９】
本発明の他の特徴および利点は、種々の実施例（具体例）を含む本明細書に記載の更なる説明から明らかである。記載されている実施例（具体例）は、本発明の実施に有用な種々の成分および方法を例示する。該実施例（具体例）は、特許請求されている本発明を限定するものではない。本開示に基づき、当業者は、本発明の実施に有用な他の成分および方法を特定し使用することが可能である。
【００３０】
発明の詳細な説明
ＯＲＦ０６５７ｎは、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の外膜に位置するスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）タンパク質である。ＯＲＦ０６５７ｎはスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の種々の株において良く保存されていることが判明している（Ａｎｄｅｒｓｏｎら，国際公開番号ＷＯ ２００５／００９３７９、国際公開日２００５年２月３日）。スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染に対する防御免疫応答を引き起こすために、種々のＯＲＦ０６５７ｎ誘導体が使用されうる（Ａｎｄｅｒｓｏｎら，国際公開番号ＷＯ ２００５／００９３７９、国際公開日２００５年２月３日）。
【００３１】
本明細書に記載の抗原結合タンパク質は、ＯＲＦ０６５７ｎを認識するそれらの能力により、例えば、ＯＲＦ０６５７ｎに基づく抗原の製造、特徴づけまたは研究における手段として使用されうる。適当なＯＲＦ０６５７ｎエピトープを認識する抗原結合タンパク質は、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染を治療するための物質としても使用されうる。
【００３２】
Ｉ．抗原結合タンパク質
抗原結合タンパク質は、エピトープへの特異的結合をもたらす抗体可変領域を含有する。該抗体可変領域は、例えば、完全抗体、抗体フラグメント、および抗体または抗体フラグメントの組換え誘導体において存在しうる。
【００３３】
抗体は、そのクラスによって異なる構造を有する。ＩｇＧに関して、種々の抗体領域が例示されうる（図１）。ＩｇＧ分子は４つのアミノ酸鎖（２つの、より長い重鎖、および２つの、より短い軽鎖）を含有する。重鎖および軽鎖はそれぞれ、定常領域および可変領域を含有する。該可変領域内には、抗原特異性をもたらす３つの超可変領域が存在する（例えば、Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇら，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．およびＳｐｅｋｔｒｕｍ Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，１９９９；およびＬｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ ＩＶ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｐｒｅｓｓ，１９９０を参照されたい）。
【００３４】
該超可変領域（相補性決定領域とも称される）は、より保存されたフランキング領域（フレームワーク領域とも称される）の間に介在している。フレームワーク領域および相補性決定領域に関連したアミノ酸は、Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１に記載されているとおりに番号付けされ、整列（アライン）されうる。
【００３５】
２つの重鎖カルボキシル領域は、Ｆｃ領域を形成するようジスルフィド結合により連結された定常領域である。Ｆｃ領域は、補体およびマクロファージの活性化のような抗体の生物活性をもたらすのに重要である。Ｆｃ領域を構成する２つの重鎖のそれぞれはヒンジ領域を介して異なるＦａｂ領域へと伸長している。
【００３６】
高等脊椎動物においては、２つのクラスの軽鎖および５つのクラスの重鎖が存在する。軽鎖はκまたはλである。重鎖は抗体クラスを定め、α、δ、ε、γまたはμである。例えば、ＩｇＧはγ重鎖を有する。種々のタイプの重鎖に関しては、ヒトγ１、γ２、γ３およびγ４のようなサブクラスも存在する。重鎖は、ヒンジおよびテイル（尾）領域に、特徴的なコンホメーションをもたらす（Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ ＩＶ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｐｒｅｓｓ，１９９０）。
【００３７】
抗体可変領域を含有する抗体フラグメントには、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦａｂ２領域が含まれる。各Ｆａｂ領域は、可変領域および定常領域から構成される軽鎖と、可変領域および定常領域を含有する重鎖領域とを含有する。軽鎖は定常領域を介してジスルフィド結合により重鎖に連結される。Ｆａｂ領域の軽鎖および重鎖可変領域は、抗原結合に関与するＦｖ領域を与える。
【００３８】
抗体可変領域は組換え誘導体中に存在しうる。組換え誘導体の具体例には、一本鎖抗体、ジアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）および小型抗体（ｍｉｎｉａｎｔｉｂｏｄｙ）が含まれる（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２６：３９−６０，２００４）。
【００３９】
該抗原結合タンパク質は、同じ又は異なるエピトープを認識する１以上の可変領域を含有しうる（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２６：３９−６０，２００４）。
【００４０】
ＩＩ．特定された標的領域に対する抗原結合タンパク質の作製
ｍＡｂ １Ｇ３．ＢＤ４標的領域、ｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１標的領域、ｍＡｂ １３Ｃ７．ＢＣ１標的領域またはｍＡｂ １３Ｇ１１．ＢＦ３標的領域に対する種々の抗原結合タンパク質が、それぞれのモノクローナル抗体から作製されうる。あるいは、結合タンパク質により認識されるエピトープを使用して、追加的な結合タンパク質を選択することが可能である。
【００４１】
ｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１標的領域はＯＲＦ０６５７ｎのアミノ酸約７６から３５７に位置するらしい。抗体を選択するための標的抗原として、ＯＲＦ０６５７ｎのアミノ酸７６から３５７を含有するポリペプチドまたは完全長ＯＲＦ０６５７ｎが使用されうる。作製される抗体の標的領域は決定可能である。
【００４２】
抗原を認識するタンパク質を選択するためには、種々の技術が利用可能である。そのような技術の具体例には、ファージ提示技術およびハイブリドーマ産生の利用が含まれる。ヒト抗体は、ゼノマウス（ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ）またはトランスクロモ（Ｔｒａｎｓ−Ｃｈｒｏｍｏ）マウスのようなキメラマウスを使用して製造されうる（Ａｚｚａｚｙら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５：４２５−４４５，２００２，Ｂｅｒｇｅｒら，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．３２４（１）：１４−４０，２００２）。
【００４３】
モノクローナル抗体ｍＡｂ １Ｇ３．ＢＤ４、ｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１、ｍＡｂ １３Ｃ７．ＢＣ１およびｍＡｂ １３Ｇ１１．ＢＦ３は、ＯＲＦ０６７５ｎを認識する可変領域を含有する。抗体可変領域に基づき、ＯＲＦ０６５７ｎを認識する追加的な結合タンパク質が製造されうる。追加的な結合タンパク質は、例えば、既存のモノクローナル抗体を修飾することにより、および可変領域配列情報を用いることにより製造されうる。タンパク質の構築および配列の操作は、組換え核酸技術を用いて行われうる。
【００４４】
モノクローナル抗体ｍＡｂ １Ｇ３．ＢＤ４、ｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１、ｍＡｂ １３Ｃ７．ＢＣ１およびｍＡｂ １３Ｇ１１．ＢＦ３はマウス抗体である。ヒトの治療用には、そのようなｍＡｂに基づく好ましい結合タンパク質は、該マウス領域を認識するヒト抗マウス抗体の潜在的生成を軽減するよう設計される。
【００４５】
ヒト抗マウス抗体の潜在的生成は、マウス抗体のヒト化、脱免疫化（ｄｅ−ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）およびキメラ抗体産生のような技術を用いて軽減されうる（例えば、Ｏ’Ｂｒｉｅｎら，Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ ＣＤＲ Ｇｒａｆｔｉｎｇ，ｐ８１−１００，Ｆｒｏｍ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．２０７：Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（ＷｅｌｓｃｈｏｆおよびＫｒａｕｓｓ編）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，２００３；Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２６：３９−６０，２００４；Ｇｏｎｚａｌｅｓら，Ｔｕｍｏｒ Ｂｉｏｌ．２６：３１−４３，２００５，Ｐｒｅｓｔａ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５８：６４０−６５６，２００６，Ｔｓｕｒｕｓｈｉｔａら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：６９−８３，２００５，Ｒｏｑｕｅら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２０：６３９−６５４，２００４を参照されたい）。
【００４６】
マウス抗体は、フレームワーク領域内への相補性決定領域のグラフティングまたはリサーフェシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）のような技術を用いてヒト化されうる。リサーフェシング（ベニアリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ；上張り）としても公知である）は、表面露出領域がヒト化されるよう可変領域を修飾することを含む。
【００４７】
相補性決定領域のグラフティングは、そのような領域またはそのような領域の一部を例えばマウス由来物から取り出し該領域をヒト可変領域フレームワーク内に挿入することを含む。グラフティングに使用するヒトフレームワークは、該領域が入手された可変領域（例えば、マウスのもの）に対する配列相同性に基づいて選択されうる。グラフティングされる相補性決定領域に関連する必須フレームワーク残基も新たなフレームワーク内に供給されるべきである。
【００４８】
脱免疫化（ｄｅ−ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）は、該抗体内に存在する潜在的な直鎖状Ｔ細胞エピトープを改変することを含む。該エピトープは、既知のヒトＨＬＡクラスＩおよび／またはクラスＩＩエピトープのバイオインフォマティクススキャンに基づいて特定されうる（Ｐｒｅｓｔａ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５８：６４０−６５６，２００６）。
【００４９】
キメラ抗体は、ヒト定常領域を、マウスのような異なる生物に由来する可変領域と共に含有する。該ヒト定常領域はＦｃ領域を供与する。
【００５０】
改変の追加的な例は、例えば一本鎖抗体、ジアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）および小型抗体（ｍｉｎｉａｎｔｉｂｏｄｙ）における可変領域を提供することを含む（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２６：３９−６０，２００４）。該抗原結合タンパク質は、同じ又は異なるエピトープを認識する１以上の可変領域を含有しうる（同誌）。本発明の追加的な実施形態は、ｍＡｂ １Ｇ３．ＢＤ４、ｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１、ｍＡｂ １３Ｃ７．ＢＣ１またはｍＡｂ １３Ｇ１１．ＢＦ３結合部位に対する一本鎖抗体、ジアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）および小型抗体（ｍｉｎｉａｎｔｉｂｏｄｙ）に関する。
【００５１】
ＩＩＩ．ｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１標的領域に対する結合タンパク質
後記の実施例に記載されているとおり、ｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１標的領域を更に詳細に特徴づけし、該可変領域のアミノ酸配列を決定した。特定されている標的領域および配列情報は、ｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１標的領域に対する種々の結合タンパク質の入手を促進する。
【００５２】
本発明の１つの実施形態においては、該結合タンパク質は、配列番号１のアミノ酸７６から３５７よりなるポリペプチドに結合する。好ましくは、該結合タンパク質は、ヒト抗体、ヒト化抗体、脱免疫化（ｄｅ−ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）抗体またはキメラ抗体である。好ましい抗体は、単離された抗体およびモノクローナル抗体である。
【００５３】
ｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１可変領域のアミノ酸配列を配列番号２０（Ｖｈ）および配列番号２１（Ｖｌ）に示す。Ｖｈ内の相補性決定領域（ＣＤＲ）はアミノ酸３６から４５，５０から６５および９８から１０７において特定された。Ｖｌ内のＣＤＲは配列番号２１のアミノ酸２４から３３、４９から５５および８８から９６において特定された。
【００５４】
Ｖｈ領域に関する他の実施形態においては、該結合タンパク質はｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１標的領域に結合し、そして、配列番号２０のアミノ酸３６から４５またはアミノ酸３６から４５とは１つのアミノ酸が異なる配列を含む又はそれよりなる又はそれより実質的になる第１ Ｖｈ ＣＤＲ；配列番号２０のアミノ酸５０から６５またはアミノ酸５０から６５とは１つのアミノ酸が異なる配列を含む又はそれよりなる又はそれより実質的になる第２ Ｖｈ ＣＤＲ；および配列番号２０のアミノ酸９８から１０７またはアミノ酸９８から１０７とは１つのアミノ酸が異なる配列を含む又はそれよりなる又はそれより実質的になる第３ Ｖｈ ＣＤＲを含む又はそれよりなる又はそれより実質的になる。
【００５５】
Ｖｌ領域に関する他の実施形態においては、該結合タンパク質はｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１標的領域に結合し、そして、配列番号２１のアミノ酸２４から３３またはアミノ酸２４から３３とは１つのアミノ酸が異なる配列を含む又はそれよりなる又はそれより実質的になる第１ ＶｌＣＤＲ；配列番号２１のアミノ酸４９から５５またはアミノ酸４９から５５とは１つのアミノ酸が異なる配列を含む又はそれよりなる又はそれより実質的になる第２ Ｖｌ ＣＤＲ；および配列番号２１のアミノ酸８８から９６またはアミノ酸８８から９６とは１つのアミノ酸が異なる配列を含む又はそれよりなる又はそれより実質的になる第３ Ｖｌ ＣＤＲを含む又はそれよりなる又はそれより実質的になる。
【００５６】
可変領域、ＣＤＲ領域または抗体配列に関する「より実質的になる」なる表現は、標的への結合を有意に低下させない１以上の追加的なアミノ酸の、可能な存在を示す。
【００５７】
アミノ酸の相違はアミノ酸の欠失、挿入または置換でありうる。活性を維持するようアミノ酸を置換する場合、該置換アミノ酸は、ほぼ同じ電荷、サイズ、極性および／または疎水性のような１以上の類似特性を有するべきである。
【００５８】
好ましくは、アミノ酸の置換は保存的置換である。保存的置換は、あるアミノ酸を、類似特性を有する別のアミノ酸で置換するものである。表１はアミノ酸のグループの一覧を示し、ここで、該グループの１つのアミノ酸は別のアミノ酸で保存的置換される。
【００５９】
【表１】
【００６０】
他の実施形態においては、該Ｖｈ領域は配列番号２０、ヒト化された配列番号２０または脱免疫化（ｄｅ−ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）された配列番号２０であり、および／または該Ｖｌ領域は配列番号２１、ヒト化された配列番号２１または脱免疫化（ｄｅ−ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）された配列番号２１である。
【００６１】
抗体に関する他の実施形態においては、該抗体は、（ａ）この第ＩＩＩ節において記載されているＶｈ領域、ならびにヒトヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３領域（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４からのもの）を含む重鎖、ならびに（ｂ）この第ＩＩＩ節において前記で記載されているＶｌ領域と、ヒトカッパＣＬまたはヒトラムダＣＬとを含む軽鎖を含む又はそれによりなる又はそれより実質的になる。他の実施形態においては、該抗体は、（ａ）この第ＩＩＩ節において記載されているＶｈ領域、ならびにヒトヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３領域（ＩｇＧ１またはＩｇＧ２からのもの）を含む重鎖、ならびに（ｂ）この第ＩＩＩ節において前記で記載されているＶｌ領域とヒトカッパＣＬとを含む軽鎖；ならびに配列番号２２のアミノ酸配列より実質的になる重鎖および／または配列番号２３のアミノ酸配列より実質的になる軽鎖を含む又はそれよりなる又はそれより実質的になる。
【００６２】
他の実施形態においては、本明細書に記載の抗原結合タンパク質は、標的抗原に対する少なくとも約１００ｎＭ、好ましくは少なくとも約３０ｎＭのアフィニティーＫＤをもたらすＶｈおよびＶｌ領域を有する。標的抗原への結合は、アミノ酸４２から４８６からのＯＲＦ０６５７ｎ断片を使用して、実施例１１に記載されているとおりに測定されうる。
【００６３】
他の実施形態のための好ましい結合タンパク質は抗体である。より好ましくは、該抗体は単離されている、またはモノクローナル抗体である。
【００６４】
ＩＶ．タンパク質の製造
抗原結合タンパク質は、好ましくは、組換え核酸技術またはハイブリドーマの使用により製造される。組換え核酸技術は、タンパク質合成のための核酸鋳型を構築することを含む。ハイブリドーマ技術は、該抗原結合タンパク質を製造するために不死化細胞系を使用することを含む。適当な組換え核酸およびハイブリドーマ技術は当技術分野でよく知られている（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，２００５，Ｈａｒｌｏｗら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８を参照されたい）。
【００６５】
抗原結合タンパク質をコードする組換え核酸は、実際に該コード化タンパク質の生産工場として働く宿主細胞内で発現されうる。該組換え核酸は、宿主細胞ゲノムから自律して又は宿主細胞ゲノムの一部として存在する該抗原結合タンパク質をコードする組換え遺伝子を与えうる。
【００６６】
組換え遺伝子は、タンパク質の発現のための調節要素と共に、タンパク質をコードする核酸を含有する。一般には、組換え遺伝子内に存在する調節要素には、転写プロモーター、リボソーム結合部位、ターミネーター、および場合によって存在するオペレーターが含まれる。真核細胞内でのプロセシングのための好ましい要素はポリアデニル化シグナルである。抗体に関連するイントロンも存在しうる。抗体または抗体フラグメントの製造のための発現カセットの具体例は当技術分野でよく知られている（例えば、Ｐｅｒｓｉｃら，Ｇｅｎｅ １８７：９−１８，１９９７，Ｂｏｅｌら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３９：１５３−１６６，２０００，Ｌｉａｎｇら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４７：１１９−１３０，２００１，Ｔｓｕｒｕｓｈｉｔａら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：６９−８３，２００５）。
【００６７】
遺伝暗号の縮重のため、特定のタンパク質をコードするために多数の異なるコード化核酸配列が用いられうる。ほとんど全てのアミノ酸は、異なる組合せのヌクレオチドトリプレット、すなわち「コドン」によりコードされているため、遺伝暗号の縮重が生じる。アミノ酸は、以下のとおりに、コドンによりコードされる。
Ａ＝Ａｌａ＝アラニン：コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、ＧＣＵ。
Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン：コドンＵＧＣ、ＵＧＵ。
Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸：コドンＧＡＣ、ＧＡＵ。
Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸：コドンＧＡＡ、ＧＡＧ。
Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン：コドンＵＵＣ、ＵＵＵ。
Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン：コドンＧＧＡ、ＧＧＣ、ＧＧＧ、ＧＧＵ。
Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン：コドンＣＡＣ、ＣＡＵ。
Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン：コドンＡＵＡ、ＡＵＣ、ＡＵＵ。
Ｋ＝Ｌｙｓ＝リシン：コドンＡＡＡ、ＡＡＧ。
Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン：コドンＵＵＡ、ＵＵＧ、ＣＵＡ、ＣＵＣ、ＣＵＧ、ＣＵＵ。
Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン：コドンＡＵＧ。
Ｎ＝Ａｓｎ＝アスパラギン：コドンＡＡＣ、ＡＡＵ。
Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン：コドンＣＣＡ、ＣＣＣ、ＣＣＧ、ＣＣＵ。
Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン：コドンＣＡＡ、ＣＡＧ。
Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン：コドンＡＧＡ、ＡＧＧ、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＣＧＵ。
Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン：コドンＡＧＣ、ＡＧＵ、ＵＣＡ、ＵＣＣ、ＵＣＧ、ＵＣＵ。Ｔ＝Ｔｈｒ＝トレオニン：コドンＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＧ、ＡＣＵ。
Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン：コドンＧＵＡ、ＧＵＣ、ＧＵＧ、ＧＵＵ。
Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン：コドンＵＧＧ。
Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン：コドンＵＡＣ、ＵＡＵ。
【００６８】
細胞内の組換え遺伝子の発現は、発現ベクターを使用して促進される。好ましくは、該発現ベクターは、組換え遺伝子に加えて、宿主細胞内での自律的複製のための複製起点、選択マーカー、限られた数の有用な制限酵素部位および潜在的な高コピー数をも含有する。抗体および抗体フラグメントの製造のための発現ベクターの具体例は当技術分野でよく知られている（例えば、Ｐｅｒｓｉｃら，Ｇｅｎｅ １８７：９−１８，１９９７，Ｂｏｅｌら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３９：１５３−１６６，２０００，Ｌｉａｎｇら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４７：１１９−１３０，２００１，Ｔｓｕｒｕｓｈｉｔａら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：６９−８３，２００５）。
【００６９】
所望により、当技術分野でよく知られた技術を用いて（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，２００５，Ｍａｒｋｓら，国際出願番号ＷＯ９５／１７５１６（国際公開日１９９５年６月２９日）を参照されたい）、抗体をコードする核酸を宿主染色体内に組込むことが可能である。
【００７０】
組換え抗原結合タンパク質の発現には、原核生物（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バシラス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ）およびストレプトマイセス属種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）（または放線菌属））および真核生物（例えば、酵母、バキュロウイルスおよび哺乳類）に由来する細胞系を含む多種多様な細胞系が使用されうる（Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇら，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｓｐｅｋｔｒｕｍ Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，１９９９，Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２６：３９−６０，２００４，Ｔｓｕｒｕｓｈｉｔａら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：６９−８３，２００５）
【００７１】
組換え抗原結合タンパク質の発現のための好ましい宿主は哺乳類翻訳後修飾をもたらす。翻訳後修飾には、化学的修飾、例えばグリコシル化およびジスルフィド結合形成が含まれる。もう１つのタイプの翻訳後修飾はシグナルペプチドの切断である。
【００７２】
適切なグリコシル化は抗体機能に重要でありうる（Ｙｏｏら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６１：１−２０，２００２，Ｌｉら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４（２）：２１０−２１５，２００６）。天然に存在する抗体は、重鎖に結合した少なくとも１つのＮ−結合炭水化物を含有する（Ｙｏｏら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６１：１−２０，２００２）。他のＮ−結合炭水化物およびＯ−結合炭水化物が存在することが可能であり、抗体機能に重要でありうる（同誌）。
【００７３】
効率的な翻訳後修飾を得るために、哺乳類宿主細胞および非哺乳類細胞を含む種々のタイプの宿主細胞が使用されうる。哺乳類宿主細胞の具体例には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＨｅＬａ、Ｃ６、ＰＣ１２、ヒト胎児腎（ＨＥＫ２９３）および骨髄腫細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない（Ｙｏｏら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６１：１−２０，２００２，Ｐｅｒｓｉｃら，Ｇｅｎｅ １８７：９−１８，１９９７）。非哺乳類細胞は、ヒトグリコシル化を模倣するよう改変されうる（Ｌｉら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４（２）：２１０−２１５，２００６）。糖操作（ｇＩｙｃｏｅｎｇｉｎｎｅｒｅｄ）されたピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）は、そのような改変された非哺乳類細胞の一例である（Ｌｉら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４（２）：２１０−２１５，２００６）。
【００７４】
好ましい組換え遺伝子は、ｍＡｂ ＩＧ３．ＢＤ４標的領域、ｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１標的領域、ｍＡｂ １３Ｃ７．ＢＣ１およびｍＡｂ １３Ｇ１１．ＢＦ３標的領域よりなる群から選ばれる標的領域に結合する抗体可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む。特定の組換え遺伝子は、一方の可変領域またはＶｈおよびＶｌの両方の領域を含有するタンパク質をコードしうる。該組換え遺伝子は抗体定常領域およびヒンジ領域をもコードしうる。所望により、１つの遺伝子が軽鎖をコードし第２の遺伝子が重鎖をコードする、組換え遺伝子の組合せを用いて、抗体が製造されうる。
【００７５】
他の実施形態は、前記第ＩＩ節または第ＩＩＩ節に記載のタンパク質をコードする核酸により提供される。そのような実施形態の具体例を以下に記載する。
【００７６】
Ｖｈコード領域に関する１つの実施形態においては、該ヌクレオチド配列は、配列番号２０のアミノ酸３６から４５またはアミノ酸３６から４５とは１つのアミノ酸が異なる配列を含む又はそれよりなる又はそれより実質的になる第１ Ｖｈ ＣＤＲ；配列番号２０のアミノ酸５０から６５またはアミノ酸５０から６５とは１つのアミノ酸が異なる配列を含む又はそれよりなる又はそれより実質的になる第２ Ｖｈ ＣＤＲ；および配列番号２０のアミノ酸９８から１０７またはアミノ酸９８から１０７とは１つのアミノ酸が異なる配列を含む又はそれよりなる又はそれより実質的になる第３ Ｖｈ ＣＤＲを含む又はそれよりなる又はそれより実質的になる可変領域をコードする。
【００７７】
Ｖｌコード領域に関する１つの実施形態においては、該ヌクレオチド配列は、配列番号２１のアミノ酸２４から３３またはアミノ酸２４から３３とは１つのアミノ酸が異なる配列を含む又はそれよりなる又はそれより実質的になる第１ ＶｌＣＤＲ；配列番号２１のアミノ酸４９から５５またはアミノ酸４９から５５とは１つのアミノ酸が異なる配列を含む又はそれよりなる又はそれより実質的になる第２ Ｖｌ ＣＤＲ；および配列番号２１のアミノ酸８８から９６またはアミノ酸８８から９６とは１つのアミノ酸が異なる配列を含む又はそれよりなる又はそれより実質的になる第３ Ｖｌ ＣＤＲを含む又はそれよりなる又はそれより実質的になる可変領域をコードする。
【００７８】
他の実施形態においては、該Ｖｈ領域は配列番号２０、ヒト化された配列番号２０または脱免疫化（ｄｅ−ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）された配列番号２０であり、および該Ｖｌ領域は配列番号２１、ヒト化された配列番号２１または脱免疫化（ｄｅ−ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）された配列番号２１である。
【００７９】
抗体重鎖および／または軽鎖に関する他の実施形態においては、該組換え遺伝子は、（ａ）前記第ＩＩＩ節に記載されているＶｈ領域、ヒトヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３領域（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４サブタイプからのもの）を含む重鎖、または（ｂ）前記第ＩＩＩ節に記載されているＶｌ領域と、ヒトカッパＣＬまたはラムダＣＬとを含む軽鎖を含む又はそれによりなる又はそれより実質的になるタンパク質の一方または両方をコードする。もう１つの実施形態においては、該重鎖は配列番号２２のアミノ酸配列より実質的になり、該軽鎖は配列番号２３のアミノ酸配列より実質的になる。
【００８０】
Ｖ．抗原結合タンパク質の用途
あるＯＲＦ０６５７ｎ領域を含有する抗原は、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染に対する防御免疫応答をもたらすために使用されうる（Ａｎｄｅｒｓｏｎら，国際公開番号ＷＯ２００５／００９３７９（国際公開日２００５年２月３日））。ＯＲＦ０６５７ｎ標的領域を認識する抗原結合タンパク質は、ＯＲＦ０６５７ｎ抗原およびワクチンの製造、特徴づけ又は研究を促進するために使用されうる。また、適当なエピトープを認識する抗原結合タンパク質は治療用途を有しうる。
【００８１】
ＯＲＦ０６５７ｎ関連抗原およびワクチンの製造、特徴づけ又は研究における種々の用途の具体例には以下のものが含まれる。
【００８２】
１）例えばウエスタンブロットによる、ＯＲＦ０６５７ｎ抗原の存在の特定。
【００８３】
２）例えばフローサイトメトリーによる、細胞表面上のＯＲＦ０６５７ｎ抗原の存在の特定。これは、例えば、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の複数の株に関する発現の測定、およびノックアウト突然変異体の確認において有用である。
【００８４】
３）受動防御実験。該抗体は、ＯＲＦ０６５７ｎタンパク質の特定の領域が防御をもたらすのかどうかを判定するために致死モデルにおいて使用されうる。
【００８５】
４）イムノアッセイ。該アッセイは、抗原の質、産物の生産性および安定性をモニターするために用いられうる。
【００８６】
５）抗原ワクチン産物の免疫原性をモニターするためのマウス効力アッセイにおける対照として。
【００８７】
６）血清学的アッセイにおいて、ＯＲＦ０６５７ｎ由来抗原でワクチン接種された患者に対する免疫応答を特定するために、モノクローナル抗体が競合様態で使用されうる。
【００８８】
標的タンパク質の製造、特徴づけ又は研究においてモノクローナル抗体のような抗原結合タンパク質を使用するための技術は当技術分野でよく知られている（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，２００５，Ｈａｒｌｏｗら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８，Ｈａｒｌｏｗら，Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９，Ｌｉｐｍａｎら，ＩＬＡＲ Ｊｏｕｒｎａｌ ４６：２５８−２６８，２００５を参照されたい）。
【００８９】
本発明の１つの実施形態においては、抗原結合タンパク質を使用して、溶液中の又はミクロスフェアに結合した又は細胞上のＯＲＦ０６５７ｎ抗原の存在を確認する。溶液または細胞に存在するタンパク質への該結合タンパク質の結合能は、ウエスタンブロット、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、フローサイトメトリーおよびルミネックス（Ｌｕｍｉｎｅｘ）イムノアッセイのような種々の技術を用いて測定されうる。
【００９０】
ＶＩ．治療
適当な標的領域に結合する抗原結合タンパク質を使用して、治療的および予防的治療が患者に対して行われうる。治療的治療は、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に感染した者に対して行われる。予防的治療は一般集団または一般集団の小集団に対して行われうる。一般集団の好ましい小集団としては、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染のリスクの高い者が挙げられる。
【００９１】
「患者」は、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に感染しうる哺乳動物を意味する。好ましくは、患者はヒトである。しかし、他のタイプの哺乳動物、例えばウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、ウマ、イヌ、ネコ、サル、ラットおよびマウスがスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に感染しうる。非ヒト患者の治療は、ペットおよび家畜を防御するのに、ならびに特定の治療の効力を評価するのに有用である。
【００９２】
スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染のリスクの高い者には、医療従事者、入院患者、低下した免疫系を有する患者、手術を受けている患者、カテーテルまたは血管装置のような異物インプラントを受け入れている患者、免疫低下を招く療法を受けている患者、および火傷または創傷のリスクの高い職業の者が含まれる（Ｔｈｅ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｃｒｏｓｓｌｅｙ ａｎｄ Ａｒｃｈｅｒ（編），Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ Ｉｎｃ．１９９７）。
【００９３】
１つの実施形態においては、手術または異物インプラントと共に、抗原結合タンパク質を患者に投与する。「手術または異物インプラント」に対する言及は、異物インプラントの付与を伴う又は伴わない手術、および手術を伴う又は伴わない異物インプラントの付与を含む。投与の時機は、予防的治療および／または治療的治療が達成されうよう計画されうる。投与は、好ましくは、手術または移植とほぼ同時に開始されうる。
【００９４】
医薬投与全般に関する指針は、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｅｎｎａｒｏ編，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，２０００；ならびにＭｏｄｅｒｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＢａｎｋｅｒおよびＲｈｏｄｅｓ編，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，１９９０に記載されている。
【００９５】
医薬上許容される担体は抗原結合タンパク質の保存および投与を促進する。タンパク質溶液製剤を安定化するために使用される物質には、炭水化物、アミノ酸および緩衝化塩が含まれる（Ｍｉｄｄａｕｇｈら，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １３７：３３−５８，１９９９）。
【００９６】
抗原結合タンパク質は静脈内、皮下、筋肉内または粘膜のような種々の経路により投与されうる。皮下および筋肉内投与は、例えば針または噴射式注射器を使用して行われうる。鼻腔内運搬のような粘膜運搬は、吸着部位における、より長い保持時間を得るために、増強物質または粘膜付着物質を使用することを含みうる（Ｍｉｄｄａｕｇｈら，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １３７：３３−５８，１９９９）。
【００９７】
適当な投与計画は、好ましくは、患者の年齢、体重、性別および医学的状態；投与経路；所望の効果；ならびに使用する個々の化合物を含む、当技術分野でよく知られた要因を考慮して決定される。有効用量範囲は約０．１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、または０．５ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇとなると予想される。投与頻度は該化合物の有効性および安定性によって異なりうる。投与頻度の具体例には、隔週、毎週、毎月および隔月が含まれる。
【００９８】
ＶＩＩ．実施例
以下に記載の実施例は本発明の種々の特徴を更に詳しく例示するものである。該実施例は本発明の実施のための有用な方法をも例示する。これらの実施例は、特許請求されている本発明を限定するものではない。
【００９９】
（実施例１）
ＯＲＦ０６５７ｎに対するモノクローナル抗体の作製
ＯＲＦ０６５７ｎ−Ｃ／ｅ（配列番号２）またはＯＲＦ０６５７ｎ−Ｈ／ｙ（配列番号３）を抗原として使用して、ＯＲＦ０６５７ｎ（配列番号１）に対するモノクローナル抗体を作製した。ＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリーにより該抗体を特定し、特徴づけした。
【０１００】
マウスおよび免疫化：４〜５週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスをＴａｃｏｎｉｃ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，Ｎ．Ｙ．）から購入した。アルミニウムヒドロキシホスファートアジュバント上で製剤化された、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）により産生されたＯＲＦ０６５７ｎ−Ｃ／ｅ抗原または酵母により発現されたＯＲＦ０６５７ｎ−Ｈ／ｙ抗原の２０μｇで、第０、７および２１日にマウスの筋肉内に免疫化した（Ａｎｄｅｒｓｏｎら，国際公開番号ＷＯ ２００５／００９３７９（国際公開日２００５年２月３日））。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の２０μｇのタンパク質の最終静脈内注射（ｉ．ｖ．）を、融合の３日前にマウスに実施した。マウスを犠死させ、細胞融合のために脾臓を摘出した。
【０１０１】
ＭＡｂの製造：脾臓から調製したリンパ球をマウス骨髄腫対応体ＳＰ２／０−Ａｇｌ４（ＡＴＣＣ １５８１）に、３：１の比のポリエチレングリコール１５００（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）により融合させた。２０％ ウシ胎児血清、ヒポキサンチン（１０−４Ｍ）、チミジン（１０−５Ｍ）を含有する高グルコース、ピルビン酸のダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）を含む９６ウェル平底マイクロタイタープレート内に該融合体をプレーティングし、２４時間後にアミノプテリン（４×１０−７Ｍ）を加えた。増殖（成長）中のハイブリドーマからの上清を、後記のとおり、ＯＲＦ０６５７ｎに対する反応性に関してＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。陽性ウェルを限界希釈によりクローニングし、ＥＬＩＳＡ反応性に関して再試験した。モノクローナル抗体を抗体イソタイプ決定キット（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）で分類した。
【０１０２】
ＥＬＩＳＡ：コスター（Ｃｏｓｔａｒ）培地結合性マイクロタイタープレートを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）により発現された、ＰＢＳ中の配列番号２の５０ナノグラム／ウェルで、２〜８℃で一晩コーティングした。該プレートをＰＢＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄し、１％ ウシ血清アルブミン、ＰＢＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０（アッセイ希釈剤）で少なくとも１時間ブロッキングした。該プレートを前記のとおりに洗浄し、該融合ウェルまたはクローン化ハイブリドーマからの上清を加え、室温で２時間インキュベートした。該プレートを前記のとおりに洗浄し、ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＨＲＰコンジュゲート（Ｚｙｍｅｄ）（アッセイ希釈剤中で１：８０００）を加え、室温で１時間インキュベートした。アッセイプレートをＴＭＢ基質で現像し、反応を２．０Ｎ Ｈ２ＳＯ４で停止させ、ＯＤ４５０ｎｍでプレートリーダーで読み取った。４５０ｎｍで１．０を超える光学濃度を有するウェルを陽性とみなした。
【０１０３】
フローサイトメトリー：鉄枯渇条件（ＲＰＭＩ中）下で継代されたスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の調製されたグリセロールストックを使用して、ＯＲＦ０６５７ｎ結合に関してｍＡｂを評価した。凍結グリセロールストック細胞を解凍し、ＰＢＳ；１％ ウシ血清アルブミン；０．１％ アジ化ナトリウム、０．２％ ブタＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）（ＰＡＡＧ）に、５×１０７ ＣＦＵ／５０μｌの濃度まで再懸濁させた。該細胞の５０μｌアリコートを反応ごとに１．５ｍｌエッペンドルフチューブ内に配置した。５０マイクロリットルの該ハイブリドーマ培養物を各反応チューブに加え、室温で１時間インキュベートした。１ｍＬのリン酸緩衝食塩水、１％ ウシ血清アルブミン、０．１％ アジ化ナトリウム（ＰＡＡ）を該チューブに加えることにより、該細胞を洗浄した。該細胞を遠心分離（５５００ｒｐｍ、５分間）によりペレット化した。上清を取り出し、該細胞を１００μＬの二次抗体（ＰＡＡＧ中で１：１００希釈されたＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ））と混合した。インキュベーションは暗所内で室温で１時間行った。インキュベーション後、１ｍＬのＰＡＡを該反応混合物に加え、該細胞をペレット化し（５５００ｒｐｍ、５分間）、上清を取り出した。該ペレットを１ｍＬのＰＢＳに再懸濁させ、ＦＡＣ分析のために１２×７５ｍｍチューブに移した。
【０１０４】
チューブを、細菌細胞に関してゲート化され該細胞関連ＦＩＴＣの量を測定するＢＤ−ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター装置上で測定に付した。スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の表面に結合することが判明している標準的な抗体を、各アッセイにおいて測定に付した。陰性対照を、細胞および該二次コンジュゲートの単独体として測定に付した。幾何平均値が３０より大きい場合に、ハイブリドーマウェルは陽性であるとみなした。
【０１０５】
２つの別々の融合体は１２個のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）のパネルを与えた。該ｍＡｂの全てはＥＬＩＳＡにおいて反応性であった（表２）。これらの１２個のｍＡｂのうちの１０個が細菌の表面に結合したことが、フローサイトメトリーにより実証された。該ｍＡｂの全ては、野生型タンパク質を使用するウエスタンブロット分析で陽性であった。
【０１０６】
【表２】
【０１０７】
（実施例２）
ｍＡｂのクラススイッチ
天然抗原に結合した単離されたｍＡｂの全てはＩｇＧ１イソタイプのものであった。シフト変異体の選択により、これらの抗体はＩｇＧ２ｂイソタイプにクラススイッチされた（Ｓｐｉｒａら，Ｊ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，７４：３０７−３１５，１９８５）。ＩｇＧ２ｂを使用して適当なイムノアッセイを開発し、該細胞系を高密度でプレーティングした。体細胞突然変異を選択し、富化させ、ついでクローニングした。スイッチしたｍＡｂの結合部位は依然として元のｍＡｂと同じであったが、ＩｇＧ２ｂサブタイプへのスイッチは、受動防御研究における、より好ましいイソタイプ（補体カスケードを開始させる）を与えた。
【０１０８】
【表３】
【０１０９】
（実施例３）
天然抗原を使用する結合阻害研究
ｍＡｂ標識キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を該製造業者の説明に従い使用して、精製抗体をアレクサフルオル（Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ）−４８８で標識した。ＲＰＭＩ増殖細菌細胞の表面をちょうど飽和させるｍＡｂの量を、標識ｍＡｂおよび未標識ｍＡｂの両方に関して測定した。表３（第１列）のｍＡｂのそれぞれを、標識体および未標識体として使用した。
【０１１０】
まず、５×１０７個の細胞を、該細胞の表面を飽和させる濃度の該未標識ｍＡｂと共にインキュベートすることにより、該阻害アッセイを行った。この反応を室温で１時間インキュベートした。このインキュベーションの後、該反応を１ｍｌのＰＡＡで洗浄し、ミクロ遠心機（Ｈｅｒｍｌｅ）において６，０００ＲＰＭで５分間遠心した。上清を除去して〜５０μｌに減少させ、該細胞を、該細胞の表面をちょうど飽和させる量の直接標識ｍＡｂを含有する１００μｌのＰＡＡＧに再懸濁させた。このインキュベーションの後、該反応を１ｍｌのＰＡＡで洗浄し、ミクロ遠心機（Ｈｅｒｍｌｅ）において６，０００ＲＰＭで５分間遠心した。上清を除去して〜５０μｌに減少させ、該細胞を１ｍｌのＰＢＳに再懸濁させ、ＦＡＣ分析のために１２×７５ｍｍチューブに移した。対照として、該未標識ｍＡｂを含有する別の反応を二次アレクサフルオル（Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ）−４８８コンジュゲート化ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒプローブ；ＰＡＡＧ中、１：４００）で測定して、このｍＡｂが該表面に結合することを確認した。該細胞と共に該標識ｍＡｂのみを含有する陽性対照についても実験を行った。該未標識ｍＡｂが、該標識ｍＡｂと同じエピトープに結合すれば、該細胞に関連した蛍光活性は全く無いか又は低いことになる。該未標識ｍＡｂが、該標識ｍＡｂとは異なるエピトープに結合すれば、該表面に関連した反応性のレベルは、該標識ｍＡｂのみの対照細胞と同等ということになる。
【０１１１】
阻害研究により、モノクローナル抗体のパネルは４つの反応性グループに分類された。
【０１１２】
【表４】
【０１１３】
（実施例４）
変性抗原および改変抗原での結合研究
結合を更に特徴づけるために、ＯＲＦ０６５７ｎ改変タンパク質を使用した。まず、ＯＲＦ０６５７ｎをコードする核酸を発現ベクターｐＥＴ−２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）内にクローニングし、Ｃ末端６×ｈｉｓタグと共に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で発現させた（配列番号２）。ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＸＬ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを該製造業者の説明に従い使用して、該クローン化遺伝子を含有する発現ベクターを突然変異誘発に付した。該遺伝子は、特異的な連続的アミノ酸変化を伴って突然変異した。得られたプラスミドを、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＸＬ１０−Ｇｏｌｄコンピテント細胞内に、該製造業者のプロトコールに従い形質転換した。ＱｉａｇｅｎのＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔを使用して、プラスミドを形質転換体から単離した。ＡＢＩの３１０ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒを使用して配列決定することにより、形質転換体をスクリーニングした。最大数の塩基変化を示す形質転換体からのプラスミドを発現宿主ＨＭＳ １７４（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）内に形質転換した。Ｎｏｖａｇｅｎの説明に従い、形質転換体を発現させた。
【０１１４】
異なるＯＲＦ０６５７ｎ改変タンパク質を使用して、ＯＲＦ０６５７ｎ ｍＡｂ（配列番号４〜１９）の多様性を確認した。これらのタンパク質を、標準的な方法を用いるドットブロットにおいて１０個の異なるｍＡｂでスクリーニングした。標準的な方法を用いるウエスタンブロットにより、陽性／陰性を確認した。このアプローチにより、抗体を、それらの結合プロファイルに従い分類した。該抗体のうちの７個は３つのグループに分類され、残りの３個の抗体（２Ｈ２．Ｂ８、８Ａ８．Ｅ１１．Ｈ３および１３Ｇ１１．Ｃ１１）は、互いに類似しているが同一ではないプロファイルを有していた（表５）。
【０１１５】
【表５】
【０１１６】
（実施例５）
ＢＡＩｃｏｒｅ研究
ＢＩＡｃｏｒｅ研究において、精製ＯＲＦ０６５７ｎ−Ｈ／ｙを抗原として使用する「フットプリント分析」によりｍＡｂを検査した。ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）によるリアルタイム生体分子相互作用分析を用いて、ペア様態結合実験を行った。ＢＩＡＣＯＲＥ（商標登録）は、カルボキシルメチルデキストランでコーティングされた（ＣＭ５）センサーチップの表面に直接照射される偏光の屈折率の変化をモニターすることにより質量変化を検出するために、ミクロフルイディクス技術および表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を組合せたものである。応答単位（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｕｎｉｔ）で測定される応答の変化は結合アナライト（すなわち、抗原または抗体）の量に相関されうる。
【０１１７】
抗スタヒロコッカス抗体（ｍＡｂ １３Ｃ７．Ｄ１２）を該ＣＭ５センサーチップの表面上に共有結合（固定化）させた。該固定化ｍＡｂを、まず、ＯＲＦ０６５７ｎタンパク質にさらし、ついでマトリックス形態で抗体のペアにさらした。ＯＲＦ０６５７ｎタンパク質＋抗体ペアの各サイクルの後、２０ｍＭ ＨＣｌを使用して、該センサーチップの表面を固定化ｍＡｂ １３Ｃ７．Ｄ１２へと再生させた。各抗体ペアの全ての組合せが分析されうるよう、マトリックス形態でＯＲＦ０６５７ｎタンパク質に対して８個の抗体を試験した。この実験で使用したｍＡｂペアに関するマトリックス設計を表６に要約する。
【０１１８】
【表６】
【０１１９】
各実施において最初に結合した（捕捉された）抗原の量を正規化するために、各試験抗体／抗原複合体に関する以下の比を計算する。
【０１２０】
【数１】
【０１２１】
各抗体に残存している利用可能なエピトープの割合（％）は、以下のとおりに、マッピングペアに関して計算されうる。
【０１２２】
【数２】
【０１２３】
図２は、ペア様態の結合研究における該モノクローナル抗体の反応性の概要を示すマトリックスを例示する。モノクローナル抗体のパネルは、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）法により、３つの反応性領域に分類された（表７を参照されたい）。
【０１２４】
【表７】
【０１２５】
（実施例６）
マウス敗血症モデルにおける受動免疫化での防御研究
モノクローナル抗体ｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１およびｍＡｂ １３Ｃ７．ＢＣ１を、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染に対する防御をもたらすそれらの能力に関して試験した。これらの抗体はＯＲＦ０６５７ｎタンパク質上の異なるエピトープを認識する。対照には、イソタイプが一致したｍＡｂおよびＰＢＳ単体が含まれた。
【０１２６】
細菌チャレンジの２０時間前に該ｍＡｂまたはＰＢＳを腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。ついでマウスをＬＤ８０−９０用量のスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ベッカー（Ｂｅｃｋｅｒ）でチャレンジ（ｉ．ｖ．）し、生存をモニターした。各実験を１０または２０匹のマウスの群で３回反復し、１０日間モニターした。未感染ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける該モノクローナル抗体に関する半減期は約８日間である。０．５ｍｇの用量が最適であることが判明した。それらの２つのモノクローナル抗体での実験の結果を図３Ａ〜Ｃ、４Ａ、４Ｂおよび５Ａ〜Ｃに示す。
【０１２７】
１つの実験においては、ｍＡｂ １３Ｃ７．ＢＣ１は対照と比べて第１０日における生存を有意に改善したが、その他の２つの反復実験においては、全体的な生存率は対照の場合に類似していた（図３Ａ〜３Ｃ）。しかし、対照と比べて、ｍＡｂ １３Ｃ７．ＢＣ１で治療されたマウスの、この１０日間以内の死亡までの時間における遅延が認められた。また、３つの実験のうちの２つにおいて、ｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１で治療されたマウスの死亡までの時間の遅延における類似した傾向が認められた（図５Ａ〜５Ｃ）。
【０１２８】
また、最近のスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）臨床分離株であるＵＫ５８を使用して、ｍＡｂ １３Ｃ７．ＢＣ１の効果を調べた（図４Ａおよび４Ｂ）。この株は患者の膿瘍部位から最低限度で継代された。２つの独立した実験において、結果はＵＫ５８チャレンジによる死亡までの時間における遅延を示している。
【０１２９】
抗体持続性研究は、該ＬＤ８０−９０モデルにおいては、死亡速度が速いため評価できない。したがって、亜致死チャレンジモデルを用いた。該亜致死モデルにおいては、使用したチャレンジ用量は、該ＬＤ８０−９０モデルで使用した用量の１０％である。該亜致死チャレンジモデルを４日間にわたってモニターした。２２匹のマウスの群に０．５ｍｇの用量のｍＡｂ １３Ｃ７．ＢＣ１またはイソタイプ対照ｍＡｂ（６Ｇ６）を、５×１０７ ＣＦＵのスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ベッカー（Ｂｅｃｋｅｒ）でのｉ．ｖ．細菌チャレンジの２０時間前に投与した。チャレンジの時点の血清中のｍＡｂレベルを測定するために、チャレンジの直前（Ｔ＝０）に、各群の２匹の動物を犠死させた。チャレンジの２、２４、４８、７２および９６時間後、各群の４匹のマウスを犠死させ、血清ｍＡｂレベルを測定した。
【０１３０】
この亜致死チャレンジ実験から、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染マウスにおけるｍＡｂ １３Ｃ７．ＢＣ１の半減期は約１日であると推定された。これとは対照的に、イソタイプ対照ｍＡｂの半減期は４日を超えると推定された（データ非表示）。これらのデータは、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）でチャレンジされたマウスにおけるｍＡｂ １３Ｃ７．ＢＣ１の特異的減少を示しており、これは、該致死モデルにおいてモニターされた１０日間のかなり前に枯渇すると思われる。
【０１３１】
図３Ａ〜Ｃ、４Ａ、４Ｂおよび５Ａ〜Ｃに例示されている８つの実験のうちの６つにおいて、該ｍＡｂを投与した群に関して約３日までの生存の改善が認められた。これらの結果は、そのようなｍＡｂがスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）チャレンジマウスの生存率に対して正の効果を及ぼすことを示している。
【０１３２】
（実施例７）
マウス留置カテーテルモデルにおける受動免疫化での防御研究
マウス留置カテーテルモデルをｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１と共に使用した。このモデルにおいて使用したスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株は臨床分離株ＭＣＬ８５３８であった。この株を選択したのは、マウス敗血症モデルにおいて使用した株であるスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ベッカー（Ｂｅｃｋｅｒ）と比べて、カテーテルの再現可能なコロニー形成を尚も達成しつつ、より少量の接種物の投与が可能だからである。
【０１３３】
ＩＣＲマウスは、頚静脈内に外科的に移植され縫合により適所に保持され該マウスの背側中央線上の出口から出るカテーテル（ＰＥ５０シリコーンゴム）を有していた。術後９〜１１日間、マウスを休ませた。チャレンジの２４時間前に、６００ｍｃｇのマウスモノクローナル抗体２Ｈ２．ＢＥ１１の１回のｉ．ｐ．注射投与によりマウスを受動免疫化した。第０日に、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＭＣＬ８５３８のｉ．ｖ．投与によりマウスをチャレンジした。接種物の用量は１００μｌの体積中、２〜８×１０５ ＣＦＵであった（実験１〜３）。この低用量は４日後に該カテーテルから自然に消失することが判明した。したがって、チャレンジの２４時間後に細菌に関してカテーテルを評価した。その時点で、マウスを犠死させ、カテーテルを回収した。ＴＳＡ上でカテーテル全体を培養することにより、カテーテル上の細菌の存在を評価した。該プレート上で増殖の徴候が認められたら、該カテーテルは培養陽性であると評価した。
【０１３４】
最初の３つの実験の２つにおいて、培養陰性カテーテルの数は、抗体２Ｈ２．ＢＥ１１で受動免疫化されたマウスにおいては、イソタイプ対照抗体の場合より有意に低かった。より大きな接種物用量を用いて、４番目の実験を行った。このより過酷なチャレンジにおいては、該用量は、カテーテルの１００％が再現可能に感染し対照マウスにおいてこの感染が自然には消失しない（７日間にわたるモニター）用量であると定められた。そのようなより大きな接種物サイズを用いる実験４においてもまた、２Ｈ２．ＢＥ１１に対する抗体を注射したマウスにおいては、イソタイプ対照の場合と比べて、有意に少数のカテーテルが感染したことが判明した。４つの実験の結果を表８に要約する。
【０１３５】
【表８】
【０１３６】
（実施例８）
抗ＯＲＦ０６５７ｎモノクローナル抗体２Ｈ２．Ｂ８（ＩｇＧ１）、２Ｈ２．ＢＥ１１（ＩｇＧ２ｂ）もしくは１３Ｃ７．ＩｇＧ２ｂまたはイソタイプ一致対照ｍＡｂを使用する、細菌のエクスビボ前オプソニン化
ＯＲＦ０６５７ｎのモノクローナル抗体がオプソニン性であるかどうかを試験するために、致死用量のスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）をモノクローナル抗体２Ｈ２．Ｂ８、２Ｈ２．ＢＥ１１もしくは１３Ｃ７．ＩｇＧ２ｂまたはイソタイプ一致対照モノクローナル抗体で前オプソニン化させる受動防御実験を行った。ついで前オプソニン化細菌をマウスにｉ．ｐ．投与した。これらの実験で使用した細菌はスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＲＮ４２２０（野生型）またはＲＮ４２２０．０６５７ｎであった。ＲＮ４２２０．０６５７ｎ細菌を、ＦＵＲボックスによる制御の非存在化でＯＲＦ０６５７ｎを発現するよう操作した。したがって、それは鉄の存在下で増殖可能であり、その表面上でＯＲＦ０６５７ｎ抗原を尚も発現することが可能であった。あるいは、ＲＮ４２２０（野生型）を、該細菌表面上での０６５７ｎの発現を誘導するために、低鉄培地ＲＰＭＩ内で２回継代した。
【０１３７】
６Ｂａｌｂ／ｃマウスに十分な細菌の量（６×ＬＤ１００）を、穏やかに振とうしながら、８００μｇのＩｇＧと共に４℃で１時間インキュベートした。ついで細菌をペレット化し、未結合ｍＡｂを除去した。抗体オプソニン化細菌を２．４ｍＬのＰＢＳに再懸濁させ、０．４ｍＬ（１×ＬＤ１００）を５匹のマウスのそれぞれに注射した。マウスの全群に同等のＣＦＵがもたらされること及び該ｍＡｂが該細菌を凝集させていないことが保証されるよう、チャレンジ後、ＴＳＡ上のプレーティングにより各接種物を定量した。チャレンジ後３日間、生存をモニターした。この手法が有効となるためには該標的抗原が該細菌の表面上に存在しなければならないため、オプソニン化前に該細菌上で０６５７ｎが発現されることが保証されるよう配慮した。ｍＡｂ ２Ｈ２．Ｂ８を使用するフローサイトメトリーにより、ＯＲＦ０６５７ｎの発現をモニターした。各マウスに注射したオプソニン化細菌の用量は２〜４×１０９ ＣＦＵ ＲＮ４２２０．０６５７ｎ／マウスまたは１〜２×１０９ ＣＦＵ ＲＮ４２２０（２×ＲＰＭＩ）／マウスであった。
【０１３８】
マウスは、イソタイプ一致対照ｍＡｂではなく２Ｈ２．Ｂ８または２Ｈ２．ＢＥ１１のいずれかで前オプソニン化された場合に、致死用量のＲＮ４２２０．０６５７ｎスタヒロコッカスによる死亡から防御された。該実験をＩｇＧ１イソタイプに関して２回、およびＩｇＧ２ｂイソタイプに関して３回反復したところ、同様の結果が得られた（表９Ａ）。
【０１３９】
【表９】
【０１４０】
マウスは、イソタイプ一致対照ｍＡｂではなくｍＡｂ ２Ｈ２．Ｂ８で前オプソニン化された場合に、致死用量のＲＮ４２２０（２×ＲＰＭＩ）スタヒロコッカスによる死亡から防御された。該実験を６回反復したところ、同様の結果が得られた（表９Ｂ）。
【０１４１】
【表１０】
【０１４２】
マウス抗０６５７ｎ ２Ｈ２は、この致死モデルにおける死亡の予防に非常に有効であった。１３Ｃ７ ｍＡｂは、（図３〜６に例示されている既に記載されているモデルの場合とは対照的に）このモデルでは有効でなかった。該抗０６５７ｎ ｍＡｂの全て（２Ｈ２．ＢＥ１１、２Ｈ２．Ｂ８および１３Ｃ７．ＩｇＧ２ｂ）がＲＮ４２２０に結合し（フローサイトメトリーを用いて実証されているとおり）、全てがインビトロＯＰＡアッセイにおいてオプソニン活性を有する。このモデルは、該マウスの腹膜における、生存を向上させるためのエピトープ特異性に関する追加的な要件を表している。
【０１４３】
（実施例８）
２Ｈ２ ｍＡｂで行ったエピトープマッピング研究
この実施例に記載する実験は、モノクローナル抗体２Ｈ２．ＢＥ１１がＯＲＦ０６５７ｎ内のコンホメーションエピトープを認識するという証拠を提供する。該実験は、２Ｈ２ ｍＡｂにより認識される三次元構造におけるコンホメーションエピトープを提示するのに要求されるＯＲＦ０６５７ｎ内の最小配列を位置決定した。また、該実験は、２Ｈ２ ｍＡｂがＯＲＦ０６５７ｎに結合すると小分子との反応から保護される特徴的なリシン残基をＯＲＦ０６５７ｎの最小配列内に特定した。
【０１４４】
ＯＲＦ０６５７ｎの配列内の典型的には９から１４アミノ酸長の直鎖状エピトープを２Ｈ２ ｍＡｂが認識する潜在能力を、エピトープ抽出を用いて、配列番号１のアミノ酸４２からアミノ酸４８６のＯＲＦ０６５７ｎ断片（「ＯＲＦ０６５７ｔ」）から調べた。詳細に説明すると、該エピトープ抽出実験のそれぞれについて、１０ｍｇの臭化シアン活性化セファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｃａｔ．Ｎｏ．１７ ０４３００１）への化学的架橋により３０μｇの２Ｈ２ ｍＡｂを固定化した。ＯＲＦ０６５７ｔのタンパク質分解消化物をＧｌｕＣ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｃａｔ．Ｎｏ．１１ ４２０ ３９９７ ００１）、Ａｓｐ−Ｎ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｃａｔ．Ｎｏ．１１ ０５４ ５８９ ００１）またはキモトリプシン（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｃａｔ．Ｎｏ．１１ ４１８ ４６７ ００１）で生成させ、リニアイオントラップ（ＬＴＱ−Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｉｎｃ）において１Ｄ／ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより特徴づけた。３つの独立した実験において、いずれかのプロテアーゼに由来する特徴づけられたタンパク質分解消化物８．４μｇを該固定化抗体と反応させた。未結合ペプチドを該抗体架橋ビーズから洗い落とした。潜在的結合ペプチドを低ｐＨで溶出し、１Ｄ／ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより特徴づけた。生じたタンパク質分解ペプチドはいずれも、２Ｈ２ ｍＡｂにより、高い効率および特異性では認識されなかった。このことは、２Ｈ２ ｍＡｂが直鎖状エピトープを認識しなかったことを明確に示している。
【０１４５】
２Ｈ２ ｍＡｂがＯＲＦ０６５７ｎの直鎖状配列を認識しなかったという知見は、限られた化学切断実験により裏付けられた。ＯＲＦ０６５７ｔをＣＮＢｒで化学的に２時間にわたって切断した。得られた切断産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、約４２ｋＤａ、３５ｋＤａ、２５ｋＤａ、１５ｋＤａおよび１０ｋＤａの分子量を有する５つの主要バンドを示した。２Ｈ２ ｍＡｂでのウエスタンブロット分析は、該４２ｋＤａバンドのみが２Ｈ２により認識されることを明らかに示した。すべてのバンドを該ＳＤＳ−ＰＡＧＥから切り出し、ゲル内消化を行い、タンデム質量分析により特定された得られたペプチドをＯＲＦ０６５７ｔ内の対応配列と合致させた。該主要バンドの分析の結果を表１０に示す。
【０１４６】
【表１１】
【０１４７】
〜４２ｋＤａの分子量を有する断片の重要性をエピトープ切断により確認した。詳細に説明すると、該エピトープ切断実験のそれぞれについて、５０ｍｇの臭化シアン活性化セファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｃａｔ．Ｎｏ．１７ ０４３０ ０１）への化学的架橋により、２１０μｇの２Ｈ２ ｍＡｂを固定化した。ついで５０μｇの無傷ＯＲＦ０６５７ｎを該固定化抗体に結合させ、未結合ＯＲＦ０６５７ｎをリン酸緩衝食塩水での十分な洗浄により洗い落とした。３つの独立した実験において、プロテアーゼＧｌｕ−Ｃ、トリプシン、ならびにＧｌｕＣ、ＡｓｐＮ、トリプシン、キモトリプシンおよびカルボキシ−ペプチダーゼＹの連続的組合せを、５時間または該連続的組合せのプロテアーゼ当たり１時間、加えた。該インキュベーション中に該プロテアーゼにより切り出されたペプチドを十分に洗い落とし、２Ｈ２ ｍＡｂに特異的に結合したＯＲＦ０６５７ｎ断片をＳＤＳローディングバッファーで遊離させた。
【０１４８】
２Ｈ２ ｍＡｂに特異的に結合した断片をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。該エピトープ切断実験の３つ全てが、該ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析において、４０〜４２ｋＤａの分子量を有する唯一のバンドを示した。２Ｈ２ ｍＡｂに結合するバンドがウエスタンブロット分析により確認された。該エピトープ切断実験をＧｌｕ−Ｃプロテアーゼに関して反復した。今回は、２Ｈ２ ｍＡｂに特異的に結合したＯＲＦ０６５７ｔの断片を酸性条件で遊離させ、リニアイオントラップ（ＬＴＱ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ）において１Ｄ／ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析した。溶出したサンプルは、８２〜８７分（４０％〜４５％アセトニトリル）に、予想強度を有するシグナル（全イオン係数）を示し、４２．６２８ｋＤａと推定される複数の電荷状態（［Ｍ＋６７ Ｈ］６７＋〜（［Ｍ＋３０ Ｈ］３０＋）を示した。この特定の質量に対応するＯＲＦ０６５７ｔの考えられうる断片は、４２．６ｋＤａの分子量を有するＯＲＦ０６５７ｔの配列［０１２から３８２］である。
【０１４９】
ＯＲＦ０６５７ｔのどのリシン残基が２Ｈ２ ｍＡｂの結合に際して化学反応から保護されるのかを決定するために、２Ｈ２ｍＡｂの存在下または非存在下の３つの異なる実験条件を用いて、スルホ−ＮＨＳ−アセタート（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃａｔ．Ｎｏ．２６７７７）を使用する化学的標識実験を行った。表１１を参照されたい。
【０１５０】
【表１２】
【０１５１】
各実験について、０または３モル過剰の２Ｈ２ ｍＡｂで生成した反応産物を３つのうちの１つのプロテアーゼと共にインキュベートして、２×９個の反応混合物を得た。実験１では、ＧｌｕＣ、ＡｓｐＮおよびトリプシンを使用した。実験２および３では、ＧｌｕＣ、ＡｓｐＮおよびキモトリプシンを使用した。ついで該タンパク質分解ペプチドを１Ｄ／ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析した。該反応のそれぞれについて、アセチル化および未アセチル化リシン残基の比率を、個々のペプチドの全イオン計数（ＴＩＣ）の曲線下面積に基づいて算出した。ついで、同一反応条件に関して、得られた比率を該ペア間（２Ｈ２ ｍＡｂの存在下または非存在下）で比較した。２Ｈ２ ｍＡｂへのＯＲＦ０６５７ｔの結合に際して最大の遮蔽を受ける、ＯＲＦ０６５７ｔ内のリシン残基を特定するために、全３個の反応条件で全体的な分析を行った。前記の化学的標識実験は、２Ｈ２ ｍＡｂの結合に際して最も保護されたものとして、Ｋ７６、Ｋ２５７および潜在的にＫ４４３を特定した。化学的標識に対する保護は直接結合によるものでありうる。しかし、そのような保護は、保護部位の近傍への結合、またはＯＲＦ０６５７ｎＩ内の長い領域にわたる構造変化によるものである可能性がある。
【０１５２】
要約すると、前記実験は、２Ｈ２ ｍＡｂにより認識される、ＯＲＦ０６５７ｔ内のエピトープが、コンホメーション性（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ）であるという、明らかな証拠を示している。２Ｈ２ ｍＡｂにより認識されるＯＲＦ０６５７ｔの断片は、ＯＲＦ０６７５ｔのアミノ酸１から１１５に位置するＮ末端、およびＯＲＦ０６５７ｔのアミノ酸３２３から３５７に位置するカルボキシル末端を有する。２Ｈ２ ｍＡｂの結合の際の化学的標識からの保護が、長い領域にわたる構造変化により影響されることは除外できないとしても、リシン７６およびリシン２７５の近傍の領域が直接的な抗体相互作用に関与している可能性が高い。
【０１５３】
（実施例９）
２Ｈ２ ｍＡｂ配列特定
一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）構築のための縮重プライマーＰＣＲ／重複伸長クローニング法（Ｋｒｅｂｂｅｒら，ＪＩＭ ２０１（１）：３５−５５，１９９７）を、ヒトカッパ軽鎖定常ドメインまたはｓｃＡｂ物質に融合された可溶性ｓｃＦｖのＢｉａｃｏｒｅによるハイスループットスクリーニングと組合せることにより、ハイブリドーマにより発現された２Ｈ２ ＩｇＧの可変軽（Ｖｌ）配列および可変重（Ｖｈ）配列の特定が達成された。これは、該縮重プライマー法により生じたＶｌフレームワーク１、４およびＶｈフレームワーク１、４における突然変異の精密な識別を可能にした。
【０１５４】
簡潔に説明すると、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｋｉｔ（商標）（Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．）の標準的な方法を用いて、ＲＮＡ物質を該ハイブリドーマ細胞系から精製した。ついで、この物質をｃＤＮＡに逆転写し、それを、該可変領域を増幅するためのＰＣＲにおける鋳型として使用した。ＶｌおよびＶｈ鎖のＰＣＲ増幅のための条件は、Ｋｒｅｂｂｅｒら，ＪＩＭ２０１（ｌ）：３５−５５，１９９７に記載されているプロトコールに基づくものであった。（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４リンカー（配列番号３２）が付加されて、ＶｈおよびＶｌが重なり合ってＶｌ−（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４−Ｖｈ ｓｃＦｖを与える、第３ＰＣＲ反応のためのドメインが得られるよう、プライマーを設計する。
【０１５５】
該可変鎖を個々に増幅するための第１セットのＰＣＲ反応を、５μｌのｃＤＮＡ反応物、それぞれ２μＭのＶｌおよびＶｈの増幅のためのフォワードおよびリバースプライマーセットならびに高忠実度ＰＣＲマスター混合物を含有する１００μｌの容量中で行った。該反応を９４℃で４分間変性させ、ついで９４℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、７２℃で１分間の３０サイクルに付し、７２℃で５分間の最終サイクルに付した。完全長ＰＣＲ産物をゲル精製した。
【０１５６】
増幅されたＶｈおよびＶｌ物質をｓｃＦｖへと合体させて完全長産物を構築するために、第３ＰＣＲ反応を行った。１００μｌの容量中で、それぞれ約２０ｎｇのＶｈおよびＶｌ ＤＮＡならびに高忠実度ＰＣＲマスター混合物を９４℃で５分間変性させ、ついで９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間および７２℃で３０秒間の３サイクル（プライマーの非存在下）に付した。修飾されたＰＣＲプライマー配列番号３３および配列番号３４を１μＭの最終濃度で加え、９４℃で３０秒間、６０℃で１分間および７２℃で１分間の３０サイクルを行い、ついで７２℃で７分間の加熱を行った。予想される完全長ｓｃＦｖ ＰＣＲ産物をゲル精製した。
【０１５７】
増幅されたｓｃＦｖ物質を、ｓｃＡｂの産生および配列分析のためにＭＰ１６可溶性発現ベクター内にクローニングした（Ｈａｙｈｕｒｓｔら，ＪＩＭ ２７６（１−２）：１８５−１９６，２００３）。ＭＰ１６ベクター内への定向性（ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ）クローニングのために、Ｓｆｉ１での１回の制限酵素消化を行った。ついで、存在する見掛け上完全長の可変重鎖および可変軽鎖を含有するクローンをＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞内でｓｃＡｂとして発現させ、標準的な浸透圧ショック法を用いてペリプラズムから回収した。簡潔に説明すると、９６ウェル形態において、２％ グルコースおよび１００μｇ／ｍｌ アンピシリンを含有する増殖培地内でクローンを３７℃で一晩増殖させた。２０μｌの該一晩培養物を、０．１％ グルコースおよび１００μｇ／ｍｌ アンピシリンを含有する新たな培地に移し、０．６のＯＤ６００に達するまで増殖させた。ＩＰＴＧを０．５ｍＭの最終濃度で加えることにより、ｓｃＡｂの発現のために該細胞を誘導し、１５０ｒｐｍで振とうしながら室温で一晩インキュベートした。Ｑｉａｇｅｎ Ｎｉ−ＮＴＡスーパーフロー（ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ）自動化法を用いて、該細胞からｓｃＡｂを精製した。
【０１５８】
ＯＲＦ０６５７ｔに対する結合活性に関して各ｓｃＡｂペリプラズム調製物を分析するために、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）装置（Ｕｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用した。標準的なＥＤＣ／ＮＨＳカップリングを用いて、約２５０共鳴単位の０６５７ｔ抗原をＣＭ５センサーチップの実験用フローセル表面に直接的に共有結合させた。タンパク質のカップリングを行うことなく、参照フローセル表面を活性化し不活性化した。ついで各調製物を該表面に通過させ、抗原へのｓｃＡｂの会合および解離を測定した。各実施ごとに、１０ｍＭ ＨＣｌを流速２０μｌ／分で２０秒間にわたり１回注入し、ついで２分間の安定化時間を設けることにより、該表面を再生させた。全てのサンプルを２通りに実施し、バッファーのみの実施を対照として用いた。９５個のクローンをスクリーニングした後、１個のクローンを、その結合活性に基づいて選択した。選択した最終的な２Ｈ２クローンは、元のハイブリドーマにより調製されたＩｇＧ物質に類似した、ＯＲＦ０６５７ｔに対するそのアフィニティー、および比較配列分析に基づくものであった。
【０１５９】
２Ｈ２ Ｖｈ（配列番号２０）およびＶｌ（配列番号２１）のアミノ酸配列は以下のとおりであった。
【０１６０】
【化１】
【０１６１】
下線部はＣＤＲである。ＣＤＲは、カバット（Ｋａｂａｔ）定義に基づいて特定された。コードしている核酸配列は配列番号２４（Ｖｈ）および配列番号２５（Ｖｌ）に示されている。
【０１６２】
（実施例１０）
２Ｈ２ ＩｇＧキメラの発現
２Ｈ２ ｍＡｂの可変領域を、実施例９に記載されているとおりにマウスハイブリドーマからクローニングした。該可変領域の配列をＰＣＲ増幅し、重鎖可変領域をコードするＤＮＡを、ＩｇＧ１定常領域をコードするＤＮＡにインフレームで融合させ、一方、軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを、カッパ定常領域をコードするＤＮＡにインフレームで融合させた。得られた抗体発現ベクターに関するクローニング方法を以下に説明する。
【０１６３】
該可変領域をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ反応は、高忠実度ＰＣＲマスター混合物、鋳型容量１μｌならびにフォワードおよびリバースプライマー（それぞれ１μｌ）を含有する２５μｌの容量中で行った。ＰＣＲ条件は９４℃で２分間の１サイクル、９４℃で１．５分間、６０℃で１．５分間、７２℃で１．５分間の２５サイクルおよび７２℃で７分間であり、反応産物を、取り出すまで４℃にし、ついでＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ法を用いて５’末端においてリーダー配列に及び３’末端において定常領域にインフレームでクローニングした。以下のプライマーを使用した。軽鎖フォワード，５’−ＡＣＡＧＡＴＧＣＣＡＧＡＴＧＣＧＡＴＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴ（配列番号２８）；軽鎖リバース，５’−ＴＧＣＡＧＣＣＡＣＣＧＴＡＣＧＴＴＴＴＡＴＴＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＴＣＣＣ（配列番号２９）；重鎖フォワード，５’−ＡＣＡＧＧＴＧＴＣＣＡＣＴＣＧＧＡＴＧＴＧＣＡＣＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＡ（配列番号３０）；および重鎖リバース，５’−ＧＣＣＣＴＴＧＧＴＧＧＡＴＧＣＣＧＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＧＡＧＡＧＴＧＧＴ（配列番号３１）。該クローンの全てのＤＮＡ配列は配列決定により確認された。
【０１６４】
ＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列を以下に示す。
【０１６５】
【化２】
【０１６６】
可変領域は下線で示されている。
【０１６７】
該抗体を２９３ＥＢＮＡ単層細胞内で発現させた。ＰＥ１に基づくトランスフェクション試薬を使用して、該プラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞をＯｐｔｉ−ＭＥＭ無血清培地内でインキュベートし、分泌した抗体を、プロテインＡ／Ｇアフィニティークロマトグラフィーを用いて培地から精製した。精製抗体の濃度をＯＤ２８０ｎｍにより決定し、純度をＬａｂＣｈｉｐ（商標）キャピラリー電気泳動により測定した。
【０１６８】
軽鎖および重鎖の両方の発現はヒトＣＭＶプロモーターおよびウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルにより駆動された（Ｓｈｉｖｅｒら，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７７２：１９８−２０８，１９９５）。前方のリーダー配列が培養培地内への抗体の分泌をもたらした。重鎖に関するリーダー配列はＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ（配列番号２６）であり、軽鎖に関するリーダー配列はＭＳＶＰＴＱＶＬＧＬＬＬＬＷＬＴＤＡＲＣ（配列番号２７）であった。該発現ベクターは、２９３ＥＢＮＡ細胞内での持続的発現のためのＥＢＶウイルスゲノム由来のｏｒｉＰ、ならびに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における複製起点およびカナマイシン選択マーカーのための細菌配列を含有する。
【０１６９】
該抗体を２９３ＥＢＮＡ単層細胞内で発現させた。ＰＥ１に基づくトランスフェクション試薬を使用して、該プラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞をＯｐｔｉ−ＭＥＭ無血清培地内でインキュベートし、分泌した抗体を、プロテインＡ／Ｇアフィニティークロマトグラフィーを用いて培地から精製した。精製抗体の濃度をＯＤ２８０ｎｍにより決定し、純度をＬａｂＣｈｉｐキャピラリー電気泳動により測定した。
【０１７０】
（実施例１１）
アフィニティー測定
ハイブリドーマ物質としての２Ｈ２ ｍＡｂ、ｓｃＡｂおよびキメラ抗体に関する比較分析を行った。２ｈ２ ｍＡｂ ＶｈおよびＶｌ領域をクローニングし、ＩｇＧキメラとして発現させた（実施例１０に記載されているとおり）。ｓｃＡｂを、ヒトカッパ鎖タグに融合したｓｃｆｖを産生するＭＰ１６ベクター（実施例９）内にクローニングした。以下に更に詳細に説明するとおり、該抗原アフィニティーは該構築物間で有意には異ならなかった。
【０１７１】
結合ドメインと抗原との間の１：１相互作用を測定するために、Ｂｉａｃｏｒｅの実験条件を、抗体フラグメントを測定するのか又は完全長ＩｇＧを測定するのかに応じて改変した。ＩｇＧの測定の場合には、ＩｇＧをリガンドとして表面上に捕捉し、ＯＲＦ０６５７ｔをアナライトとして通過させた。抗体フラグメントの分析の場合には、ＯＲＦ０６５７ｔを表面に結合させ、抗体フラグメントをアナライトとして通過させた。これは、ＯＲＦ０６５７ｔ抗原に対する元の２Ｈ２ ｍＡｂハイブリドーマ物質のアフィニティーが組換えクローニング後に有意な変化を何ら示さないことを示した（表１２）。Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００での表面プラズモン共鳴によりデータを収集し、各アナライトを複数の濃度（１濃度当たり二重の重複実験）で通過させた。一連の全濃度を同時フィットさせるＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）でデータを分析した。フィットパラメーターを表１２に示す。
【０１７２】
【表１３】
【０１７３】
（実施例１２）
ＯＲＦ０６５７ｎに基づく配列
配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）４から１９において強調して示されている（太字および下線で示されている）アミノ酸は、ＯＲＦ０６５７ｎから変化したアミノ酸を示す。
【０１７４】
【化３】
【０１７５】
他の実施形態も特許請求の範囲内に含まれる。本明細書中には幾つかの実施形態が示され記載されているが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく種々の改変が施されうる。
【図面の簡単な説明】
【０１７６】
【図１】図１はＩｇＧ分子の構造を例示する。「ＶＬ」は軽鎖可変領域を意味する。「ＶＨ」は重鎖可変領域を意味する。「ＣＬ」は軽鎖定常領域を意味する。「ＣＨ１」、「ＣＨ２」および「ＣＨ３」は重鎖定常領域である。点線はジスルフィド結合を示す。
【図２】図２は、ペア様態の結合研究における種々のモノクローナル抗体の反応性の概要を示すマトリックスを例示する。モノクローナル抗体のパネルは、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）法により、３つの反応性領域に分類された。
【図３Ａ】図３Ａ〜Ｃ：ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝２０）の群を、細菌チャレンジの２０時間前に、■，ｍＡｂ １３Ｃ７．ＢＣ１；□，ｍＡｂ ６Ｇ６．Ａ８（イソタイプ対照）；または○，ＰＢＳのｉ．ｐ．注射で治療した。マウスをｉ．ｖ．注射によりスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）でチャレンジし、生存をモニターした。図３Ａ−０．４９ｍｇのｍＡｂ １３Ｃ７．ＢＣ１；０．４５ｍｇのｍＡｂ ６Ｇ６．Ａ８；および９．８×１０８ ＣＦＵのスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ベッカー（Ｂｅｃｋｅｒ）。図３Ｂ−０．４９ｍｇのｍＡｂ １３Ｃ７．ＢＣ１；０．４５ｍｇのｍＡｂ ６Ｇ６．Ａ８；および９．６×１０８ ＣＦＵのスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ベッカー（Ｂｅｃｋｅｒ）。図３Ｃ−０．５０ｍｇのｍＡｂ１３Ｃ７．ＢＣ１；０．４５ｍｇのｍＡｂ ６Ｇ６；および９．９×１０８ ＣＦＵのスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ベッカー（Ｂｅｃｋｅｒ）。
【図３Ｂ】図３Ａ〜Ｃ：ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝２０）の群を、細菌チャレンジの２０時間前に、■，ｍＡｂ １３Ｃ７．ＢＣ１；□，ｍＡｂ ６Ｇ６．Ａ８（イソタイプ対照）；または○，ＰＢＳのｉ．ｐ．注射で治療した。マウスをｉ．ｖ．注射によりスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）でチャレンジし、生存をモニターした。図３Ａ−０．４９ｍｇのｍＡｂ １３Ｃ７．ＢＣ１；０．４５ｍｇのｍＡｂ ６Ｇ６．Ａ８；および９．８×１０８ ＣＦＵのスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ベッカー（Ｂｅｃｋｅｒ）。図３Ｂ−０．４９ｍｇのｍＡｂ １３Ｃ７．ＢＣ１；０．４５ｍｇのｍＡｂ ６Ｇ６．Ａ８；および９．６×１０８ ＣＦＵのスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ベッカー（Ｂｅｃｋｅｒ）。図３Ｃ−０．５０ｍｇのｍＡｂ１３Ｃ７．ＢＣ１；０．４５ｍｇのｍＡｂ ６Ｇ６；および９．９×１０８ ＣＦＵのスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ベッカー（Ｂｅｃｋｅｒ）。
【図３Ｃ】図３Ａ〜Ｃ：ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝２０）の群を、細菌チャレンジの２０時間前に、■，ｍＡｂ １３Ｃ７．ＢＣ１；□，ｍＡｂ ６Ｇ６．Ａ８（イソタイプ対照）；または○，ＰＢＳのｉ．ｐ．注射で治療した。マウスをｉ．ｖ．注射によりスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）でチャレンジし、生存をモニターした。図３Ａ−０．４９ｍｇのｍＡｂ １３Ｃ７．ＢＣ１；０．４５ｍｇのｍＡｂ ６Ｇ６．Ａ８；および９．８×１０８ ＣＦＵのスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ベッカー（Ｂｅｃｋｅｒ）。図３Ｂ−０．４９ｍｇのｍＡｂ １３Ｃ７．ＢＣ１；０．４５ｍｇのｍＡｂ ６Ｇ６．Ａ８；および９．６×１０８ ＣＦＵのスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ベッカー（Ｂｅｃｋｅｒ）。図３Ｃ−０．５０ｍｇのｍＡｂ１３Ｃ７．ＢＣ１；０．４５ｍｇのｍＡｂ ６Ｇ６；および９．９×１０８ ＣＦＵのスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ベッカー（Ｂｅｃｋｅｒ）。
【図４Ａ】図４Ａおよび４Ｂ：ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝２０）の群を、細菌チャレンジの２０時間前に、■，ｍＡｂ １３Ｃ７．ＢＣ１（０．５ｍｇ）；□，ｍＡｂ ６Ｇ６．Ａ８（イソタイプ対照）（０．５ｍｇ）；または○，ＰＢＳ（０．５ｍｌ）のｉ．ｐ．注射で治療した。マウスをｉ．ｖ．注射によりスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）でチャレンジし、生存をモニターした。図４Ａは、２．０９×１０８ ＣＦＵのスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＵＫ５８での結果を例示している。図４Ｂは、２．１５×１０８ スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＵＫ５８での結果を例示している。
【図４Ｂ】図４Ａおよび４Ｂ：ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝２０）の群を、細菌チャレンジの２０時間前に、■，ｍＡｂ １３Ｃ７．ＢＣ１（０．５ｍｇ）；□，ｍＡｂ ６Ｇ６．Ａ８（イソタイプ対照）（０．５ｍｇ）；または○，ＰＢＳ（０．５ｍｌ）のｉ．ｐ．注射で治療した。マウスをｉ．ｖ．注射によりスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）でチャレンジし、生存をモニターした。図４Ａは、２．０９×１０８ ＣＦＵのスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＵＫ５８での結果を例示している。図４Ｂは、２．１５×１０８ スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＵＫ５８での結果を例示している。
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｃ：ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝２０）の群を、細菌チャレンジの２０時間前に、■，ｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１；□，ｍＡｂ ６Ｇ６．Ａ８（イソタイプ対照）；○，ＰＢＳのｉ．ｐ．注射で治療した。マウスをｉ．ｖ．注射によりスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）でチャレンジし、生存をモニターした。図５Ａ−０．４３ｍｇのｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１；０．５ｍｇのｍＡｂ ６Ｇ６．Ａ８；および９．８×１０８ ＣＦＵのスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ベッカー（Ｂｅｃｋｅｒ）。図５Ｂ−０．４３ｍｇのｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１；０．５ｍｇのｍＡｂ ６Ｇ６．Ａ８；および８．３×１０８ ＣＦＵのスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ベッカー（Ｂｅｃｋｅｒ）。図５Ｃ−０．４３ｍｇのｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１；０．５ｍｇのｍＡｂ ６Ｇ６．Ａ８；および９．３×１０８ ＣＦＵのスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ベッカー（Ｂｅｃｋｅｒ）。
【図５Ｂ】図５Ａ〜５Ｃ：ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝２０）の群を、細菌チャレンジの２０時間前に、■，ｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１；□，ｍＡｂ ６Ｇ６．Ａ８（イソタイプ対照）；○，ＰＢＳのｉ．ｐ．注射で治療した。マウスをｉ．ｖ．注射によりスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）でチャレンジし、生存をモニターした。図５Ａ−０．４３ｍｇのｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１；０．５ｍｇのｍＡｂ ６Ｇ６．Ａ８；および９．８×１０８ ＣＦＵのスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ベッカー（Ｂｅｃｋｅｒ）。図５Ｂ−０．４３ｍｇのｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１；０．５ｍｇのｍＡｂ ６Ｇ６．Ａ８；および８．３×１０８ ＣＦＵのスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ベッカー（Ｂｅｃｋｅｒ）。図５Ｃ−０．４３ｍｇのｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１；０．５ｍｇのｍＡｂ ６Ｇ６．Ａ８；および９．３×１０８ ＣＦＵのスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ベッカー（Ｂｅｃｋｅｒ）。
【図５Ｃ】図５Ａ〜５Ｃ：ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝２０）の群を、細菌チャレンジの２０時間前に、■，ｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１；□，ｍＡｂ ６Ｇ６．Ａ８（イソタイプ対照）；○，ＰＢＳのｉ．ｐ．注射で治療した。マウスをｉ．ｖ．注射によりスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）でチャレンジし、生存をモニターした。図５Ａ−０．４３ｍｇのｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１；０．５ｍｇのｍＡｂ ６Ｇ６．Ａ８；および９．８×１０８ ＣＦＵのスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ベッカー（Ｂｅｃｋｅｒ）。図５Ｂ−０．４３ｍｇのｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１；０．５ｍｇのｍＡｂ ６Ｇ６．Ａ８；および８．３×１０８ ＣＦＵのスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ベッカー（Ｂｅｃｋｅｒ）。図５Ｃ−０．４３ｍｇのｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１；０．５ｍｇのｍＡｂ ６Ｇ６．Ａ８；および９．３×１０８ ＣＦＵのスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ベッカー（Ｂｅｃｋｅｒ）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＯＲＦ０６５７ｎを標的とする抗原結合タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
本出願の全体にわたって引用されている参考文献は、特許請求されている本発明の先行技術であると自認するものではない。
【０００３】
スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）は、多種多様な疾患および状態を引き起こす病原体である。スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）により引き起こされる疾患および状態の具体例には、菌血症、感染性心内膜炎、毛包炎、フルンケル、カルブンケル、膿痂疹、水疱性膿痂疹、蜂窩織炎、ボトリオミセス症、中毒性ショック症候群、熱傷様皮膚症候群、中枢神経系感染症、感染性および炎症性眼疾患、骨髄炎ならびに関節および骨の他の感染症、ならびに気道感染症が含まれる（Ｔｈｅ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｃｒｏｓｓｌｅｙ ａｎｄ Ａｒｃｈｅｒ（編），Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ Ｉｎｃ．１９９７）。
【０００４】
スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染およびスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の広がりを抑制するためには、免疫学に基づく方法が用いられうる。免疫学に基づく方法には受動免疫化および能動免疫化が含まれる。受動免疫化は、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を標的とする免疫グロブリンを使用する。能動免疫化はスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に対する免疫応答を誘導する。
【発明の開示】
【０００５】
発明の概要
本発明は、ＯＲＦ０６５７ｎ標的領域（配列番号１）に結合する抗原結合タンパク質に関する。ＯＲＦ０６５７ｎはスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）タンパク質である。ＯＲＦ０６５７ｎ標的領域はｍＡｂ ｌＧ３．ＢＤ４、ｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１、ｍＡｂ １３Ｃ７．ＢＣｌおよびｍＡｂ １３Ｇ１１．ＢＦ３結合部位により与えられる。致死モデルチャレンジにおいて、ｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１およびｍＡｂ １３Ｃ７．ＢＣ１はスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染に対する生存性の上昇をもたらした。また、ｍＡｂ ２Ｈ２のＩｇＧ１またはＩｇＧ２ｂ形態を使用するエクスビボモデルにおいて、およびｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１を使用する受動免疫マウス留置カテーテルモデルにおいても、防御が実証された。
【０００６】
ｍＡｂ １Ｇ３．ＢＤ４、ｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１、ｍＡｂ １３Ｃ７．ＢＣ１およびｍＡｂ １３Ｇ１１．ＢＦ３を産生するマウスハイブリドーマ細胞系は、ブダペスト条約に従い、２００５年９月３０日付けでＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， １０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０−２２０９に寄託された。該細胞系にはＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−７１２４（ｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１を産生する）、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−７１２５（ｍＡｂ １３Ｃ７．ＢＣ１を産生する）、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−７１２６（ｍＡｂ １Ｇ３．ＢＤ４を産生する）およびＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−７１２７（ｍＡｂ １３Ｇ１１．ＢＦ３を産生する）が付与された。
【０００７】
したがって、本発明の第１の態様は、第１可変領域および第２可変領域を含んでなる単離された抗原結合タンパク質に関する。第１および第２可変領域は、ｍＡｂ １Ｇ３．ＢＤ４標的領域、ｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１標的領域、ｍＡｂ １３Ｃ７．ＢＣ１標的領域およびｍＡｂ １３Ｇ１１．ＢＦ３標的領域よりなる群から選ばれる１以上の標的領域に結合する。
【０００８】
「単離（された）」に対する言及は、天然で見出されるものとは異なる形態を示す。そのような異なる形態は、例えば、天然で見出されるものとは異なる純度および／または天然で見出されない構造体でありうる。天然で見出されない構造体には、異なる領域が一緒になった組換え構造体、例えば、１以上のマウス相補性決定領域がヒトフレームワークスカフォールド上に挿入された又はヒト抗体の表面残基を模倣するためにマウス抗体の表面が修飾されたヒト化抗体、抗原結合タンパク質由来の１以上の相補性決定領域が別のフレームワークスカフォールド内に挿入されたハイブリッド抗体、ならびに軽可変ドメインおよび重可変ドメインをコードする遺伝子が互いにランダムに組合わされた天然ヒト配列に由来する抗体が含まれる。
【０００９】
単離されたタンパク質は、好ましくは、血清タンパク質を実質的に含有しない。血清タンパク質を実質的に含有しないタンパク質は、ほとんど又は全ての血清タンパク質を欠く環境中に存在する。
【００１０】
「可変領域」は重鎖または軽鎖からの抗体可変領域の構造を有する。抗体重鎖および軽鎖の可変領域は、フレームワーク上に間隔をあけて存在する３つの相補性決定領域を含有する。該相補性決定領域は主として、特定のエピトープの認識をもたらす。
【００１１】
標的領域は、ｍＡｂ １Ｇ３．ＢＤ４、ｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１、ｍＡｂ １３Ｃ７．ＢＣ１またはｍＡｂ １３Ｇ１１．ＢＦ３が結合するＯＲＦ０６５７ｎ領域（配列番号１）に関して定義される。例えば、ｍＡｂ ＩＧ３．ＢＤ４標的領域は、ｍＡｂ ＩＧ３．ＢＤ４が結合するＯＲＦ０６５７ｎ領域である。
【００１２】
特定された標的領域に結合するタンパク質は該標的領域への結合に関してｍＡｂ １Ｇ３．ＢＤ４、ｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１、ｍＡｂ １３Ｃ７．ＢＣ１またはｍＡｂ １３Ｇ１１．ＢＦ３と競合する。例えば、ＯＲＦ０６５７ｎに結合するｍＡｂ １Ｇ３．ＢＤ４と競合するタンパク質は、ｍＡｂ １Ｇ３．ＢＤ４標的領域に結合する。
【００１３】
モノクローナル抗体ｍＡｂ １Ｇ３．Ｂ３、ｍＡｂ ２Ｈ２．Ｂ８、ｍＡｂ １３Ｃ７．Ｄ１２またはｍＡｂ １３Ｇ１１．Ｃ１１のいずれかと競合するタンパク質は、過剰量および等量の該競合タンパク質およびモノクローナル抗体を使用した場合、ＯＲＦ０６５７ｎへの該モノクローナル抗体の結合を少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約５０％軽減する。
【００１４】
「タンパク質」に対する言及は連続的アミノ酸配列を示し、最小または最大サイズ限界を与えるものではない。該タンパク質中に存在する１以上のアミノ酸はグリコシル化またはジスルフィド結合形成のような翻訳後修飾を含有しうる。
【００１５】
好ましい抗原結合タンパク質はモノクローナル抗体である。「モノクローナル抗体」に対する言及は、同じ又は実質的に同じ相補性決定領域および結合特異性を有する一群の抗体を示す。該抗体における変異は、該抗体が同一構築物から製造された場合に生じるものである。
【００１６】
モノクローナル抗体は、例えば、特定のハイブリドーマから、および該抗体をコードする１以上の組換え遺伝子を含有する組換え細胞から製造されうる。該抗体は２以上の組換え遺伝子によりコードされることが可能であり、この場合、例えば、１つの遺伝子は重鎖をコードし、１つの遺伝子は軽鎖をコードする。
【００１７】
本発明のもう１つの態様は、抗体可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む組換え遺伝子を含有する核酸を記載する。該抗体可変領域は、ｍＡｂ ＩＧ３．ＢＤ４標的領域、ｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１標的領域、ｍＡｂ １３Ｃ７．ＢＣ１およびｍＡｂ １３Ｇ１１．ＢＦ３標的領域よりなる群から選ばれる標的領域に結合しうる。
【００１８】
組換え遺伝子は、適切な転写およびプロセシングのための調節要素（これは翻訳および翻訳後要素を含みうる）と共にタンパク質をコードする組換え核酸を含有する。該組換え核酸は、その配列および／または形態の点で、天然では見出されない。組換え核酸の具体例には、精製された核酸、天然で見出されるものとは異なる核酸を与える一緒になった２以上の核酸領域、互いに天然で付随している１以上の核酸領域（例えば、上流または下流領域）の非存在が含まれる。
【００１９】
本発明のもう１つの態様は、ｍＡｂ ＩＧ３．ＢＤ４標的領域、ｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１標的領域、ｍＡｂ １３Ｃ７．ＢＣ１およびｍＡｂ １３Ｇ１１．ＢＦ３標的領域よりなる群から選ばれる標的領域に結合する抗体可変領域をコードする１以上の組換え遺伝子を含んでなる組換え細胞を記載する。複数の組換え遺伝子が有用であり、例えば、この場合、１つの遺伝子は抗体重鎖またはそのフラグメント（Ｖｈ領域を含有するもの）をコードし、もう１つの核酸は抗体軽鎖またはそのフラグメント（Ｖｌ領域を含有するもの）をコードする。
【００２０】
本発明のもう１つの態様は、抗体可変領域を含むタンパク質の製造方法を含む。該方法は、（ａ）該タンパク質が発現される条件下、タンパク質をコードする組換え核酸を含む組換え細胞を増殖させ、（ｂ）該タンパク質を精製する段階を含む。
【００２１】
本発明のもう１つの態様は医薬組成物を記載する。該組成物は治療的有効量の抗原結合タンパク質および医薬上許容される担体を含有する。
【００２２】
治療的有効量は、有用な治療効果または予防効果をもたらすのに十分な量である。スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に感染した患者の場合、有効量は、以下の効果の１以上を達成するのに十分な量である：該患者におけるスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の増殖能の軽減、または該患者におけるスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の量の減少。スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に感染していない患者の場合、有効量は、以下の１以上を達成するのに十分な量である：スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染に対する感受性の軽減、または慢性疾患を招く持続感染を該感染細菌が確立する能力の軽減。
【００２３】
本発明のもう１つの態様は、溶液中または細胞上のＯＦＲ０６５７ｎ抗原の存在の検出方法を記載する。該方法は、本明細書に記載の結合タンパク質を該溶液または細胞に加え、該溶液または細胞中の該抗原への該結合タンパク質の結合能を測定することを含む。測定は定量的または定性的でありうる。
【００２４】
ＯＲＦ０６５７ｎ抗原に対する言及は、完全長ＯＲＦ０６５７ｎ、またはｍＡｂ １Ｇ３．Ｂ３、ｍＡｂ ２Ｈ２．Ｂ８、ｍＡｂ １３Ｃ７．Ｄ１２またはｍＡｂ １３Ｇ１１．Ｃ１１により認識されるエピトープを有するその誘導体を含む。誘導体の具体例には、トランケート化形態；および以下のアミノ酸改変の１以上を含有するＯＲＦ０６５７ｎの完全長またはトランケート化形態が含まれる：１以上の付加、１以上の置換および１以上の欠失。
【００２５】
本発明のもう１つの態様は、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染に対する患者の治療方法に関する。該方法は、本明細書に記載の抗原結合タンパク質の有効量を患者に投与する段階を含む。治療される患者はスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に感染していても感染していなくてもよい。好ましくは、患者はヒトである。
【００２６】
本発明のもう１つの態様は、ｍＡｂ １Ｇ３．Ｂ３、ｍＡｂ ２Ｈ２．Ｂ８、ｍＡｂ １３Ｃ７．Ｄ１２もしくはｍＡｂ １３Ｇ１１．Ｃ１１のいずれかである又はＯＲＦ０６５７ｎへの結合に関してｍＡｂ ＩＧ３．Ｂ３、ｍＡｂ ２Ｈ２．Ｂ８、ｍＡｂ １３Ｃ７．Ｄ１２もしくはｍＡｂ １３Ｇ１１．Ｃ１１のいずれかと競合するタンパク質を産生する細胞系を記載する。好ましい細胞系は、該タンパク質をコードする組換え核酸を含有する組換え細胞系およびハイブリドーマである。
【００２７】
「含む（含んでなる）」のような非限定的用語に対する言及は追加的な要素または段階を許容する。場合によっては、「１以上」のような表現は、追加的な要素または段階の可能性を強調するために非限定的用語と共に又はそれを伴わずに用いられる。
【００２８】
明示的に示されていない限り、単数表現は単数を示すと限定されるものではない。例えば、「細胞」は複数の細胞を除外するものではない。場合によっては、可能な複数の存在を強調するために、１以上のような表現が用いられる。
【００２９】
本発明の他の特徴および利点は、種々の実施例（具体例）を含む本明細書に記載の更なる説明から明らかである。記載されている実施例（具体例）は、本発明の実施に有用な種々の成分および方法を例示する。該実施例（具体例）は、特許請求されている本発明を限定するものではない。本開示に基づき、当業者は、本発明の実施に有用な他の成分および方法を特定し使用することが可能である。
【００３０】
発明の詳細な説明
ＯＲＦ０６５７ｎは、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の外膜に位置するスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）タンパク質である。ＯＲＦ０６５７ｎはスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の種々の株において良く保存されていることが判明している（Ａｎｄｅｒｓｏｎら，国際公開番号ＷＯ ２００５／００９３７９、国際公開日２００５年２月３日）。スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染に対する防御免疫応答を引き起こすために、種々のＯＲＦ０６５７ｎ誘導体が使用されうる（Ａｎｄｅｒｓｏｎら，国際公開番号ＷＯ ２００５／００９３７９、国際公開日２００５年２月３日）。
【００３１】
本明細書に記載の抗原結合タンパク質は、ＯＲＦ０６５７ｎを認識するそれらの能力により、例えば、ＯＲＦ０６５７ｎに基づく抗原の製造、特徴づけまたは研究における手段として使用されうる。適当なＯＲＦ０６５７ｎエピトープを認識する抗原結合タンパク質は、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染を治療するための物質としても使用されうる。
【００３２】
Ｉ．抗原結合タンパク質
抗原結合タンパク質は、エピトープへの特異的結合をもたらす抗体可変領域を含有する。該抗体可変領域は、例えば、完全抗体、抗体フラグメント、および抗体または抗体フラグメントの組換え誘導体において存在しうる。
【００３３】
抗体は、そのクラスによって異なる構造を有する。ＩｇＧに関して、種々の抗体領域が例示されうる（図１）。ＩｇＧ分子は４つのアミノ酸鎖（２つの、より長い重鎖、および２つの、より短い軽鎖）を含有する。重鎖および軽鎖はそれぞれ、定常領域および可変領域を含有する。該可変領域内には、抗原特異性をもたらす３つの超可変領域が存在する（例えば、Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇら，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．およびＳｐｅｋｔｒｕｍ Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，１９９９；およびＬｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ ＩＶ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｐｒｅｓｓ，１９９０を参照されたい）。
【００３４】
該超可変領域（相補性決定領域とも称される）は、より保存されたフランキング領域（フレームワーク領域とも称される）の間に介在している。フレームワーク領域および相補性決定領域に関連したアミノ酸は、Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１に記載されているとおりに番号付けされ、整列（アライン）されうる。
【００３５】
２つの重鎖カルボキシル領域は、Ｆｃ領域を形成するようジスルフィド結合により連結された定常領域である。Ｆｃ領域は、補体およびマクロファージの活性化のような抗体の生物活性をもたらすのに重要である。Ｆｃ領域を構成する２つの重鎖のそれぞれはヒンジ領域を介して異なるＦａｂ領域へと伸長している。
【００３６】
高等脊椎動物においては、２つのクラスの軽鎖および５つのクラスの重鎖が存在する。軽鎖はκまたはλである。重鎖は抗体クラスを定め、α、δ、ε、γまたはμである。例えば、ＩｇＧはγ重鎖を有する。種々のタイプの重鎖に関しては、ヒトγ１、γ２、γ３およびγ４のようなサブクラスも存在する。重鎖は、ヒンジおよびテイル（尾）領域に、特徴的なコンホメーションをもたらす（Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ ＩＶ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｐｒｅｓｓ，１９９０）。
【００３７】
抗体可変領域を含有する抗体フラグメントには、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦａｂ２領域が含まれる。各Ｆａｂ領域は、可変領域および定常領域から構成される軽鎖と、可変領域および定常領域を含有する重鎖領域とを含有する。軽鎖は定常領域を介してジスルフィド結合により重鎖に連結される。Ｆａｂ領域の軽鎖および重鎖可変領域は、抗原結合に関与するＦｖ領域を与える。
【００３８】
抗体可変領域は組換え誘導体中に存在しうる。組換え誘導体の具体例には、一本鎖抗体、ジアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）および小型抗体（ｍｉｎｉａｎｔｉｂｏｄｙ）が含まれる（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２６：３９−６０，２００４）。
【００３９】
該抗原結合タンパク質は、同じ又は異なるエピトープを認識する１以上の可変領域を含有しうる（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２６：３９−６０，２００４）。
【００４０】
ＩＩ．特定された標的領域に対する抗原結合タンパク質の作製
ｍＡｂ １Ｇ３．ＢＤ４標的領域、ｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１標的領域、ｍＡｂ １３Ｃ７．ＢＣ１標的領域またはｍＡｂ １３Ｇ１１．ＢＦ３標的領域に対する種々の抗原結合タンパク質が、それぞれのモノクローナル抗体から作製されうる。あるいは、結合タンパク質により認識されるエピトープを使用して、追加的な結合タンパク質を選択することが可能である。
【００４１】
ｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１標的領域はＯＲＦ０６５７ｎのアミノ酸約７６から３５７に位置するらしい。抗体を選択するための標的抗原として、ＯＲＦ０６５７ｎのアミノ酸７６から３５７を含有するポリペプチドまたは完全長ＯＲＦ０６５７ｎが使用されうる。作製される抗体の標的領域は決定可能である。
【００４２】
抗原を認識するタンパク質を選択するためには、種々の技術が利用可能である。そのような技術の具体例には、ファージ提示技術およびハイブリドーマ産生の利用が含まれる。ヒト抗体は、ゼノマウス（ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ）またはトランスクロモ（Ｔｒａｎｓ−Ｃｈｒｏｍｏ）マウスのようなキメラマウスを使用して製造されうる（Ａｚｚａｚｙら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５：４２５−４４５，２００２，Ｂｅｒｇｅｒら，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．３２４（１）：１４−４０，２００２）。
【００４３】
モノクローナル抗体ｍＡｂ １Ｇ３．ＢＤ４、ｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１、ｍＡｂ １３Ｃ７．ＢＣ１およびｍＡｂ １３Ｇ１１．ＢＦ３は、ＯＲＦ０６７５ｎを認識する可変領域を含有する。抗体可変領域に基づき、ＯＲＦ０６５７ｎを認識する追加的な結合タンパク質が製造されうる。追加的な結合タンパク質は、例えば、既存のモノクローナル抗体を修飾することにより、および可変領域配列情報を用いることにより製造されうる。タンパク質の構築および配列の操作は、組換え核酸技術を用いて行われうる。
【００４４】
モノクローナル抗体ｍＡｂ １Ｇ３．ＢＤ４、ｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１、ｍＡｂ １３Ｃ７．ＢＣ１およびｍＡｂ １３Ｇ１１．ＢＦ３はマウス抗体である。ヒトの治療用には、そのようなｍＡｂに基づく好ましい結合タンパク質は、該マウス領域を認識するヒト抗マウス抗体の潜在的生成を軽減するよう設計される。
【００４５】
ヒト抗マウス抗体の潜在的生成は、マウス抗体のヒト化、脱免疫化（ｄｅ−ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）およびキメラ抗体産生のような技術を用いて軽減されうる（例えば、Ｏ’Ｂｒｉｅｎら，Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ ＣＤＲ Ｇｒａｆｔｉｎｇ，ｐ８１−１００，Ｆｒｏｍ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．２０７：Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（ＷｅｌｓｃｈｏｆおよびＫｒａｕｓｓ編）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，２００３；Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２６：３９−６０，２００４；Ｇｏｎｚａｌｅｓら，Ｔｕｍｏｒ Ｂｉｏｌ．２６：３１−４３，２００５，Ｐｒｅｓｔａ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５８：６４０−６５６，２００６，Ｔｓｕｒｕｓｈｉｔａら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：６９−８３，２００５，Ｒｏｑｕｅら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２０：６３９−６５４，２００４を参照されたい）。
【００４６】
マウス抗体は、フレームワーク領域内への相補性決定領域のグラフティングまたはリサーフェシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）のような技術を用いてヒト化されうる。リサーフェシング（ベニアリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ；上張り）としても公知である）は、表面露出領域がヒト化されるよう可変領域を修飾することを含む。
【００４７】
相補性決定領域のグラフティングは、そのような領域またはそのような領域の一部を例えばマウス由来物から取り出し該領域をヒト可変領域フレームワーク内に挿入することを含む。グラフティングに使用するヒトフレームワークは、該領域が入手された可変領域（例えば、マウスのもの）に対する配列相同性に基づいて選択されうる。グラフティングされる相補性決定領域に関連する必須フレームワーク残基も新たなフレームワーク内に供給されるべきである。
【００４８】
脱免疫化（ｄｅ−ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）は、該抗体内に存在する潜在的な直鎖状Ｔ細胞エピトープを改変することを含む。該エピトープは、既知のヒトＨＬＡクラスＩおよび／またはクラスＩＩエピトープのバイオインフォマティクススキャンに基づいて特定されうる（Ｐｒｅｓｔａ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５８：６４０−６５６，２００６）。
【００４９】
キメラ抗体は、ヒト定常領域を、マウスのような異なる生物に由来する可変領域と共に含有する。該ヒト定常領域はＦｃ領域を供与する。
【００５０】
改変の追加的な例は、例えば一本鎖抗体、ジアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）および小型抗体（ｍｉｎｉａｎｔｉｂｏｄｙ）における可変領域を提供することを含む（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２６：３９−６０，２００４）。該抗原結合タンパク質は、同じ又は異なるエピトープを認識する１以上の可変領域を含有しうる（同誌）。本発明の追加的な実施形態は、ｍＡｂ １Ｇ３．ＢＤ４、ｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１、ｍＡｂ １３Ｃ７．ＢＣ１またはｍＡｂ １３Ｇ１１．ＢＦ３結合部位に対する一本鎖抗体、ジアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）および小型抗体（ｍｉｎｉａｎｔｉｂｏｄｙ）に関する。
【００５１】
ＩＩＩ．ｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１標的領域に対する結合タンパク質
後記の実施例に記載されているとおり、ｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１標的領域を更に詳細に特徴づけし、該可変領域のアミノ酸配列を決定した。特定されている標的領域および配列情報は、ｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１標的領域に対する種々の結合タンパク質の入手を促進する。
【００５２】
本発明の１つの実施形態においては、該結合タンパク質は、配列番号１のアミノ酸７６から３５７よりなるポリペプチドに結合する。好ましくは、該結合タンパク質は、ヒト抗体、ヒト化抗体、脱免疫化（ｄｅ−ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）抗体またはキメラ抗体である。好ましい抗体は、単離された抗体およびモノクローナル抗体である。
【００５３】
ｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１可変領域のアミノ酸配列を配列番号２０（Ｖｈ）および配列番号２１（Ｖｌ）に示す。Ｖｈ内の相補性決定領域（ＣＤＲ）はアミノ酸３６から４５，５０から６５および９８から１０７において特定された。Ｖｌ内のＣＤＲは配列番号２１のアミノ酸２４から３３、４９から５５および８８から９６において特定された。
【００５４】
Ｖｈ領域に関する他の実施形態においては、該結合タンパク質はｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１標的領域に結合し、そして、配列番号２０のアミノ酸３６から４５またはアミノ酸３６から４５とは１つのアミノ酸が異なる配列を含む又はそれよりなる又はそれより実質的になる第１ Ｖｈ ＣＤＲ；配列番号２０のアミノ酸５０から６５またはアミノ酸５０から６５とは１つのアミノ酸が異なる配列を含む又はそれよりなる又はそれより実質的になる第２ Ｖｈ ＣＤＲ；および配列番号２０のアミノ酸９８から１０７またはアミノ酸９８から１０７とは１つのアミノ酸が異なる配列を含む又はそれよりなる又はそれより実質的になる第３ Ｖｈ ＣＤＲを含む又はそれよりなる又はそれより実質的になる。
【００５５】
Ｖｌ領域に関する他の実施形態においては、該結合タンパク質はｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１標的領域に結合し、そして、配列番号２１のアミノ酸２４から３３またはアミノ酸２４から３３とは１つのアミノ酸が異なる配列を含む又はそれよりなる又はそれより実質的になる第１ ＶｌＣＤＲ；配列番号２１のアミノ酸４９から５５またはアミノ酸４９から５５とは１つのアミノ酸が異なる配列を含む又はそれよりなる又はそれより実質的になる第２ Ｖｌ ＣＤＲ；および配列番号２１のアミノ酸８８から９６またはアミノ酸８８から９６とは１つのアミノ酸が異なる配列を含む又はそれよりなる又はそれより実質的になる第３ Ｖｌ ＣＤＲを含む又はそれよりなる又はそれより実質的になる。
【００５６】
可変領域、ＣＤＲ領域または抗体配列に関する「より実質的になる」なる表現は、標的への結合を有意に低下させない１以上の追加的なアミノ酸の、可能な存在を示す。
【００５７】
アミノ酸の相違はアミノ酸の欠失、挿入または置換でありうる。活性を維持するようアミノ酸を置換する場合、該置換アミノ酸は、ほぼ同じ電荷、サイズ、極性および／または疎水性のような１以上の類似特性を有するべきである。
【００５８】
好ましくは、アミノ酸の置換は保存的置換である。保存的置換は、あるアミノ酸を、類似特性を有する別のアミノ酸で置換するものである。表１はアミノ酸のグループの一覧を示し、ここで、該グループの１つのアミノ酸は別のアミノ酸で保存的置換される。
【００５９】
【表１】
【００６０】
他の実施形態においては、該Ｖｈ領域は配列番号２０、ヒト化された配列番号２０または脱免疫化（ｄｅ−ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）された配列番号２０であり、および／または該Ｖｌ領域は配列番号２１、ヒト化された配列番号２１または脱免疫化（ｄｅ−ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）された配列番号２１である。
【００６１】
抗体に関する他の実施形態においては、該抗体は、（ａ）この第ＩＩＩ節において記載されているＶｈ領域、ならびにヒトヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３領域（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４からのもの）を含む重鎖、ならびに（ｂ）この第ＩＩＩ節において前記で記載されているＶｌ領域と、ヒトカッパＣＬまたはヒトラムダＣＬとを含む軽鎖を含む又はそれによりなる又はそれより実質的になる。他の実施形態においては、該抗体は、（ａ）この第ＩＩＩ節において記載されているＶｈ領域、ならびにヒトヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３領域（ＩｇＧ１またはＩｇＧ２からのもの）を含む重鎖、ならびに（ｂ）この第ＩＩＩ節において前記で記載されているＶｌ領域とヒトカッパＣＬとを含む軽鎖；ならびに配列番号２２のアミノ酸配列より実質的になる重鎖および／または配列番号２３のアミノ酸配列より実質的になる軽鎖を含む又はそれよりなる又はそれより実質的になる。
【００６２】
他の実施形態においては、本明細書に記載の抗原結合タンパク質は、標的抗原に対する少なくとも約１００ｎＭ、好ましくは少なくとも約３０ｎＭのアフィニティーＫＤをもたらすＶｈおよびＶｌ領域を有する。標的抗原への結合は、アミノ酸４２から４８６からのＯＲＦ０６５７ｎ断片を使用して、実施例１１に記載されているとおりに測定されうる。
【００６３】
他の実施形態のための好ましい結合タンパク質は抗体である。より好ましくは、該抗体は単離されている、またはモノクローナル抗体である。
【００６４】
ＩＶ．タンパク質の製造
抗原結合タンパク質は、好ましくは、組換え核酸技術またはハイブリドーマの使用により製造される。組換え核酸技術は、タンパク質合成のための核酸鋳型を構築することを含む。ハイブリドーマ技術は、該抗原結合タンパク質を製造するために不死化細胞系を使用することを含む。適当な組換え核酸およびハイブリドーマ技術は当技術分野でよく知られている（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，２００５，Ｈａｒｌｏｗら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８を参照されたい）。
【００６５】
抗原結合タンパク質をコードする組換え核酸は、実際に該コード化タンパク質の生産工場として働く宿主細胞内で発現されうる。該組換え核酸は、宿主細胞ゲノムから自律して又は宿主細胞ゲノムの一部として存在する該抗原結合タンパク質をコードする組換え遺伝子を与えうる。
【００６６】
組換え遺伝子は、タンパク質の発現のための調節要素と共に、タンパク質をコードする核酸を含有する。一般には、組換え遺伝子内に存在する調節要素には、転写プロモーター、リボソーム結合部位、ターミネーター、および場合によって存在するオペレーターが含まれる。真核細胞内でのプロセシングのための好ましい要素はポリアデニル化シグナルである。抗体に関連するイントロンも存在しうる。抗体または抗体フラグメントの製造のための発現カセットの具体例は当技術分野でよく知られている（例えば、Ｐｅｒｓｉｃら，Ｇｅｎｅ １８７：９−１８，１９９７，Ｂｏｅｌら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３９：１５３−１６６，２０００，Ｌｉａｎｇら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４７：１１９−１３０，２００１，Ｔｓｕｒｕｓｈｉｔａら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：６９−８３，２００５）。
【００６７】
遺伝暗号の縮重のため、特定のタンパク質をコードするために多数の異なるコード化核酸配列が用いられうる。ほとんど全てのアミノ酸は、異なる組合せのヌクレオチドトリプレット、すなわち「コドン」によりコードされているため、遺伝暗号の縮重が生じる。アミノ酸は、以下のとおりに、コドンによりコードされる。
Ａ＝Ａｌａ＝アラニン：コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、ＧＣＵ。
Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン：コドンＵＧＣ、ＵＧＵ。
Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸：コドンＧＡＣ、ＧＡＵ。
Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸：コドンＧＡＡ、ＧＡＧ。
Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン：コドンＵＵＣ、ＵＵＵ。
Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン：コドンＧＧＡ、ＧＧＣ、ＧＧＧ、ＧＧＵ。
Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン：コドンＣＡＣ、ＣＡＵ。
Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン：コドンＡＵＡ、ＡＵＣ、ＡＵＵ。
Ｋ＝Ｌｙｓ＝リシン：コドンＡＡＡ、ＡＡＧ。
Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン：コドンＵＵＡ、ＵＵＧ、ＣＵＡ、ＣＵＣ、ＣＵＧ、ＣＵＵ。
Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン：コドンＡＵＧ。
Ｎ＝Ａｓｎ＝アスパラギン：コドンＡＡＣ、ＡＡＵ。
Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン：コドンＣＣＡ、ＣＣＣ、ＣＣＧ、ＣＣＵ。
Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン：コドンＣＡＡ、ＣＡＧ。
Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン：コドンＡＧＡ、ＡＧＧ、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＣＧＵ。
Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン：コドンＡＧＣ、ＡＧＵ、ＵＣＡ、ＵＣＣ、ＵＣＧ、ＵＣＵ。Ｔ＝Ｔｈｒ＝トレオニン：コドンＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＧ、ＡＣＵ。
Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン：コドンＧＵＡ、ＧＵＣ、ＧＵＧ、ＧＵＵ。
Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン：コドンＵＧＧ。
Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン：コドンＵＡＣ、ＵＡＵ。
【００６８】
細胞内の組換え遺伝子の発現は、発現ベクターを使用して促進される。好ましくは、該発現ベクターは、組換え遺伝子に加えて、宿主細胞内での自律的複製のための複製起点、選択マーカー、限られた数の有用な制限酵素部位および潜在的な高コピー数をも含有する。抗体および抗体フラグメントの製造のための発現ベクターの具体例は当技術分野でよく知られている（例えば、Ｐｅｒｓｉｃら，Ｇｅｎｅ １８７：９−１８，１９９７，Ｂｏｅｌら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３９：１５３−１６６，２０００，Ｌｉａｎｇら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４７：１１９−１３０，２００１，Ｔｓｕｒｕｓｈｉｔａら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：６９−８３，２００５）。
【００６９】
所望により、当技術分野でよく知られた技術を用いて（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，２００５，Ｍａｒｋｓら，国際出願番号ＷＯ９５／１７５１６（国際公開日１９９５年６月２９日）を参照されたい）、抗体をコードする核酸を宿主染色体内に組込むことが可能である。
【００７０】
組換え抗原結合タンパク質の発現には、原核生物（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バシラス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ）およびストレプトマイセス属種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）（または放線菌属））および真核生物（例えば、酵母、バキュロウイルスおよび哺乳類）に由来する細胞系を含む多種多様な細胞系が使用されうる（Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇら，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｓｐｅｋｔｒｕｍ Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，１９９９，Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２６：３９−６０，２００４，Ｔｓｕｒｕｓｈｉｔａら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：６９−８３，２００５）
【００７１】
組換え抗原結合タンパク質の発現のための好ましい宿主は哺乳類翻訳後修飾をもたらす。翻訳後修飾には、化学的修飾、例えばグリコシル化およびジスルフィド結合形成が含まれる。もう１つのタイプの翻訳後修飾はシグナルペプチドの切断である。
【００７２】
適切なグリコシル化は抗体機能に重要でありうる（Ｙｏｏら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６１：１−２０，２００２，Ｌｉら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４（２）：２１０−２１５，２００６）。天然に存在する抗体は、重鎖に結合した少なくとも１つのＮ−結合炭水化物を含有する（Ｙｏｏら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６１：１−２０，２００２）。他のＮ−結合炭水化物およびＯ−結合炭水化物が存在することが可能であり、抗体機能に重要でありうる（同誌）。
【００７３】
効率的な翻訳後修飾を得るために、哺乳類宿主細胞および非哺乳類細胞を含む種々のタイプの宿主細胞が使用されうる。哺乳類宿主細胞の具体例には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＨｅＬａ、Ｃ６、ＰＣ１２、ヒト胎児腎（ＨＥＫ２９３）および骨髄腫細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない（Ｙｏｏら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６１：１−２０，２００２，Ｐｅｒｓｉｃら，Ｇｅｎｅ １８７：９−１８，１９９７）。非哺乳類細胞は、ヒトグリコシル化を模倣するよう改変されうる（Ｌｉら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４（２）：２１０−２１５，２００６）。糖操作（ｇＩｙｃｏｅｎｇｉｎｎｅｒｅｄ）されたピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）は、そのような改変された非哺乳類細胞の一例である（Ｌｉら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４（２）：２１０−２１５，２００６）。
【００７４】
好ましい組換え遺伝子は、ｍＡｂ ＩＧ３．ＢＤ４標的領域、ｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１標的領域、ｍＡｂ １３Ｃ７．ＢＣ１およびｍＡｂ １３Ｇ１１．ＢＦ３標的領域よりなる群から選ばれる標的領域に結合する抗体可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む。特定の組換え遺伝子は、一方の可変領域またはＶｈおよびＶｌの両方の領域を含有するタンパク質をコードしうる。該組換え遺伝子は抗体定常領域およびヒンジ領域をもコードしうる。所望により、１つの遺伝子が軽鎖をコードし第２の遺伝子が重鎖をコードする、組換え遺伝子の組合せを用いて、抗体が製造されうる。
【００７５】
他の実施形態は、前記第ＩＩ節または第ＩＩＩ節に記載のタンパク質をコードする核酸により提供される。そのような実施形態の具体例を以下に記載する。
【００７６】
Ｖｈコード領域に関する１つの実施形態においては、該ヌクレオチド配列は、配列番号２０のアミノ酸３６から４５またはアミノ酸３６から４５とは１つのアミノ酸が異なる配列を含む又はそれよりなる又はそれより実質的になる第１ Ｖｈ ＣＤＲ；配列番号２０のアミノ酸５０から６５またはアミノ酸５０から６５とは１つのアミノ酸が異なる配列を含む又はそれよりなる又はそれより実質的になる第２ Ｖｈ ＣＤＲ；および配列番号２０のアミノ酸９８から１０７またはアミノ酸９８から１０７とは１つのアミノ酸が異なる配列を含む又はそれよりなる又はそれより実質的になる第３ Ｖｈ ＣＤＲを含む又はそれよりなる又はそれより実質的になる可変領域をコードする。
【００７７】
Ｖｌコード領域に関する１つの実施形態においては、該ヌクレオチド配列は、配列番号２１のアミノ酸２４から３３またはアミノ酸２４から３３とは１つのアミノ酸が異なる配列を含む又はそれよりなる又はそれより実質的になる第１ ＶｌＣＤＲ；配列番号２１のアミノ酸４９から５５またはアミノ酸４９から５５とは１つのアミノ酸が異なる配列を含む又はそれよりなる又はそれより実質的になる第２ Ｖｌ ＣＤＲ；および配列番号２１のアミノ酸８８から９６またはアミノ酸８８から９６とは１つのアミノ酸が異なる配列を含む又はそれよりなる又はそれより実質的になる第３ Ｖｌ ＣＤＲを含む又はそれよりなる又はそれより実質的になる可変領域をコードする。
【００７８】
他の実施形態においては、該Ｖｈ領域は配列番号２０、ヒト化された配列番号２０または脱免疫化（ｄｅ−ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）された配列番号２０であり、および該Ｖｌ領域は配列番号２１、ヒト化された配列番号２１または脱免疫化（ｄｅ−ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）された配列番号２１である。
【００７９】
抗体重鎖および／または軽鎖に関する他の実施形態においては、該組換え遺伝子は、（ａ）前記第ＩＩＩ節に記載されているＶｈ領域、ヒトヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３領域（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４サブタイプからのもの）を含む重鎖、または（ｂ）前記第ＩＩＩ節に記載されているＶｌ領域と、ヒトカッパＣＬまたはラムダＣＬとを含む軽鎖を含む又はそれによりなる又はそれより実質的になるタンパク質の一方または両方をコードする。もう１つの実施形態においては、該重鎖は配列番号２２のアミノ酸配列より実質的になり、該軽鎖は配列番号２３のアミノ酸配列より実質的になる。
【００８０】
Ｖ．抗原結合タンパク質の用途
あるＯＲＦ０６５７ｎ領域を含有する抗原は、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染に対する防御免疫応答をもたらすために使用されうる（Ａｎｄｅｒｓｏｎら，国際公開番号ＷＯ２００５／００９３７９（国際公開日２００５年２月３日））。ＯＲＦ０６５７ｎ標的領域を認識する抗原結合タンパク質は、ＯＲＦ０６５７ｎ抗原およびワクチンの製造、特徴づけ又は研究を促進するために使用されうる。また、適当なエピトープを認識する抗原結合タンパク質は治療用途を有しうる。
【００８１】
ＯＲＦ０６５７ｎ関連抗原およびワクチンの製造、特徴づけ又は研究における種々の用途の具体例には以下のものが含まれる。
【００８２】
１）例えばウエスタンブロットによる、ＯＲＦ０６５７ｎ抗原の存在の特定。
【００８３】
２）例えばフローサイトメトリーによる、細胞表面上のＯＲＦ０６５７ｎ抗原の存在の特定。これは、例えば、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の複数の株に関する発現の測定、およびノックアウト突然変異体の確認において有用である。
【００８４】
３）受動防御実験。該抗体は、ＯＲＦ０６５７ｎタンパク質の特定の領域が防御をもたらすのかどうかを判定するために致死モデルにおいて使用されうる。
【００８５】
４）イムノアッセイ。該アッセイは、抗原の質、産物の生産性および安定性をモニターするために用いられうる。
【００８６】
５）抗原ワクチン産物の免疫原性をモニターするためのマウス効力アッセイにおける対照として。
【００８７】
６）血清学的アッセイにおいて、ＯＲＦ０６５７ｎ由来抗原でワクチン接種された患者に対する免疫応答を特定するために、モノクローナル抗体が競合様態で使用されうる。
【００８８】
標的タンパク質の製造、特徴づけ又は研究においてモノクローナル抗体のような抗原結合タンパク質を使用するための技術は当技術分野でよく知られている（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，２００５，Ｈａｒｌｏｗら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８，Ｈａｒｌｏｗら，Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９，Ｌｉｐｍａｎら，ＩＬＡＲ Ｊｏｕｒｎａｌ ４６：２５８−２６８，２００５を参照されたい）。
【００８９】
本発明の１つの実施形態においては、抗原結合タンパク質を使用して、溶液中の又はミクロスフェアに結合した又は細胞上のＯＲＦ０６５７ｎ抗原の存在を確認する。溶液または細胞に存在するタンパク質への該結合タンパク質の結合能は、ウエスタンブロット、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、フローサイトメトリーおよびルミネックス（Ｌｕｍｉｎｅｘ）イムノアッセイのような種々の技術を用いて測定されうる。
【００９０】
ＶＩ．治療
適当な標的領域に結合する抗原結合タンパク質を使用して、治療的および予防的治療が患者に対して行われうる。治療的治療は、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に感染した者に対して行われる。予防的治療は一般集団または一般集団の小集団に対して行われうる。一般集団の好ましい小集団としては、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染のリスクの高い者が挙げられる。
【００９１】
「患者」は、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に感染しうる哺乳動物を意味する。好ましくは、患者はヒトである。しかし、他のタイプの哺乳動物、例えばウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、ウマ、イヌ、ネコ、サル、ラットおよびマウスがスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に感染しうる。非ヒト患者の治療は、ペットおよび家畜を防御するのに、ならびに特定の治療の効力を評価するのに有用である。
【００９２】
スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染のリスクの高い者には、医療従事者、入院患者、低下した免疫系を有する患者、手術を受けている患者、カテーテルまたは血管装置のような異物インプラントを受け入れている患者、免疫低下を招く療法を受けている患者、および火傷または創傷のリスクの高い職業の者が含まれる（Ｔｈｅ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｃｒｏｓｓｌｅｙ ａｎｄ Ａｒｃｈｅｒ（編），Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ Ｉｎｃ．１９９７）。
【００９３】
１つの実施形態においては、手術または異物インプラントと共に、抗原結合タンパク質を患者に投与する。「手術または異物インプラント」に対する言及は、異物インプラントの付与を伴う又は伴わない手術、および手術を伴う又は伴わない異物インプラントの付与を含む。投与の時機は、予防的治療および／または治療的治療が達成されうよう計画されうる。投与は、好ましくは、手術または移植とほぼ同時に開始されうる。
【００９４】
医薬投与全般に関する指針は、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｅｎｎａｒｏ編，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，２０００；ならびにＭｏｄｅｒｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＢａｎｋｅｒおよびＲｈｏｄｅｓ編，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，１９９０に記載されている。
【００９５】
医薬上許容される担体は抗原結合タンパク質の保存および投与を促進する。タンパク質溶液製剤を安定化するために使用される物質には、炭水化物、アミノ酸および緩衝化塩が含まれる（Ｍｉｄｄａｕｇｈら，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １３７：３３−５８，１９９９）。
【００９６】
抗原結合タンパク質は静脈内、皮下、筋肉内または粘膜のような種々の経路により投与されうる。皮下および筋肉内投与は、例えば針または噴射式注射器を使用して行われうる。鼻腔内運搬のような粘膜運搬は、吸着部位における、より長い保持時間を得るために、増強物質または粘膜付着物質を使用することを含みうる（Ｍｉｄｄａｕｇｈら，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １３７：３３−５８，１９９９）。
【００９７】
適当な投与計画は、好ましくは、患者の年齢、体重、性別および医学的状態；投与経路；所望の効果；ならびに使用する個々の化合物を含む、当技術分野でよく知られた要因を考慮して決定される。有効用量範囲は約０．１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、または０．５ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇとなると予想される。投与頻度は該化合物の有効性および安定性によって異なりうる。投与頻度の具体例には、隔週、毎週、毎月および隔月が含まれる。
【００９８】
ＶＩＩ．実施例
以下に記載の実施例は本発明の種々の特徴を更に詳しく例示するものである。該実施例は本発明の実施のための有用な方法をも例示する。これらの実施例は、特許請求されている本発明を限定するものではない。
【００９９】
（実施例１）
ＯＲＦ０６５７ｎに対するモノクローナル抗体の作製
ＯＲＦ０６５７ｎ−Ｃ／ｅ（配列番号２）またはＯＲＦ０６５７ｎ−Ｈ／ｙ（配列番号３）を抗原として使用して、ＯＲＦ０６５７ｎ（配列番号１）に対するモノクローナル抗体を作製した。ＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリーにより該抗体を特定し、特徴づけした。
【０１００】
マウスおよび免疫化：４〜５週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスをＴａｃｏｎｉｃ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，Ｎ．Ｙ．）から購入した。アルミニウムヒドロキシホスファートアジュバント上で製剤化された、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）により産生されたＯＲＦ０６５７ｎ−Ｃ／ｅ抗原または酵母により発現されたＯＲＦ０６５７ｎ−Ｈ／ｙ抗原の２０μｇで、第０、７および２１日にマウスの筋肉内に免疫化した（Ａｎｄｅｒｓｏｎら，国際公開番号ＷＯ ２００５／００９３７９（国際公開日２００５年２月３日））。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の２０μｇのタンパク質の最終静脈内注射（ｉ．ｖ．）を、融合の３日前にマウスに実施した。マウスを犠死させ、細胞融合のために脾臓を摘出した。
【０１０１】
ＭＡｂの製造：脾臓から調製したリンパ球をマウス骨髄腫対応体ＳＰ２／０−Ａｇｌ４（ＡＴＣＣ １５８１）に、３：１の比のポリエチレングリコール１５００（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）により融合させた。２０％ ウシ胎児血清、ヒポキサンチン（１０−４Ｍ）、チミジン（１０−５Ｍ）を含有する高グルコース、ピルビン酸のダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）を含む９６ウェル平底マイクロタイタープレート内に該融合体をプレーティングし、２４時間後にアミノプテリン（４×１０−７Ｍ）を加えた。増殖（成長）中のハイブリドーマからの上清を、後記のとおり、ＯＲＦ０６５７ｎに対する反応性に関してＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。陽性ウェルを限界希釈によりクローニングし、ＥＬＩＳＡ反応性に関して再試験した。モノクローナル抗体を抗体イソタイプ決定キット（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）で分類した。
【０１０２】
ＥＬＩＳＡ：コスター（Ｃｏｓｔａｒ）培地結合性マイクロタイタープレートを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）により発現された、ＰＢＳ中の配列番号２の５０ナノグラム／ウェルで、２〜８℃で一晩コーティングした。該プレートをＰＢＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄し、１％ ウシ血清アルブミン、ＰＢＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０（アッセイ希釈剤）で少なくとも１時間ブロッキングした。該プレートを前記のとおりに洗浄し、該融合ウェルまたはクローン化ハイブリドーマからの上清を加え、室温で２時間インキュベートした。該プレートを前記のとおりに洗浄し、ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＨＲＰコンジュゲート（Ｚｙｍｅｄ）（アッセイ希釈剤中で１：８０００）を加え、室温で１時間インキュベートした。アッセイプレートをＴＭＢ基質で現像し、反応を２．０Ｎ Ｈ２ＳＯ４で停止させ、ＯＤ４５０ｎｍでプレートリーダーで読み取った。４５０ｎｍで１．０を超える光学濃度を有するウェルを陽性とみなした。
【０１０３】
フローサイトメトリー：鉄枯渇条件（ＲＰＭＩ中）下で継代されたスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の調製されたグリセロールストックを使用して、ＯＲＦ０６５７ｎ結合に関してｍＡｂを評価した。凍結グリセロールストック細胞を解凍し、ＰＢＳ；１％ ウシ血清アルブミン；０．１％ アジ化ナトリウム、０．２％ ブタＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）（ＰＡＡＧ）に、５×１０７ ＣＦＵ／５０μｌの濃度まで再懸濁させた。該細胞の５０μｌアリコートを反応ごとに１．５ｍｌエッペンドルフチューブ内に配置した。５０マイクロリットルの該ハイブリドーマ培養物を各反応チューブに加え、室温で１時間インキュベートした。１ｍＬのリン酸緩衝食塩水、１％ ウシ血清アルブミン、０．１％ アジ化ナトリウム（ＰＡＡ）を該チューブに加えることにより、該細胞を洗浄した。該細胞を遠心分離（５５００ｒｐｍ、５分間）によりペレット化した。上清を取り出し、該細胞を１００μＬの二次抗体（ＰＡＡＧ中で１：１００希釈されたＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ））と混合した。インキュベーションは暗所内で室温で１時間行った。インキュベーション後、１ｍＬのＰＡＡを該反応混合物に加え、該細胞をペレット化し（５５００ｒｐｍ、５分間）、上清を取り出した。該ペレットを１ｍＬのＰＢＳに再懸濁させ、ＦＡＣ分析のために１２×７５ｍｍチューブに移した。
【０１０４】
チューブを、細菌細胞に関してゲート化され該細胞関連ＦＩＴＣの量を測定するＢＤ−ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター装置上で測定に付した。スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の表面に結合することが判明している標準的な抗体を、各アッセイにおいて測定に付した。陰性対照を、細胞および該二次コンジュゲートの単独体として測定に付した。幾何平均値が３０より大きい場合に、ハイブリドーマウェルは陽性であるとみなした。
【０１０５】
２つの別々の融合体は１２個のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）のパネルを与えた。該ｍＡｂの全てはＥＬＩＳＡにおいて反応性であった（表２）。これらの１２個のｍＡｂのうちの１０個が細菌の表面に結合したことが、フローサイトメトリーにより実証された。該ｍＡｂの全ては、野生型タンパク質を使用するウエスタンブロット分析で陽性であった。
【０１０６】
【表２】
【０１０７】
（実施例２）
ｍＡｂのクラススイッチ
天然抗原に結合した単離されたｍＡｂの全てはＩｇＧ１イソタイプのものであった。シフト変異体の選択により、これらの抗体はＩｇＧ２ｂイソタイプにクラススイッチされた（Ｓｐｉｒａら，Ｊ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，７４：３０７−３１５，１９８５）。ＩｇＧ２ｂを使用して適当なイムノアッセイを開発し、該細胞系を高密度でプレーティングした。体細胞突然変異を選択し、富化させ、ついでクローニングした。スイッチしたｍＡｂの結合部位は依然として元のｍＡｂと同じであったが、ＩｇＧ２ｂサブタイプへのスイッチは、受動防御研究における、より好ましいイソタイプ（補体カスケードを開始させる）を与えた。
【０１０８】
【表３】
【０１０９】
（実施例３）
天然抗原を使用する結合阻害研究
ｍＡｂ標識キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を該製造業者の説明に従い使用して、精製抗体をアレクサフルオル（Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ）−４８８で標識した。ＲＰＭＩ増殖細菌細胞の表面をちょうど飽和させるｍＡｂの量を、標識ｍＡｂおよび未標識ｍＡｂの両方に関して測定した。表３（第１列）のｍＡｂのそれぞれを、標識体および未標識体として使用した。
【０１１０】
まず、５×１０７個の細胞を、該細胞の表面を飽和させる濃度の該未標識ｍＡｂと共にインキュベートすることにより、該阻害アッセイを行った。この反応を室温で１時間インキュベートした。このインキュベーションの後、該反応を１ｍｌのＰＡＡで洗浄し、ミクロ遠心機（Ｈｅｒｍｌｅ）において６，０００ＲＰＭで５分間遠心した。上清を除去して〜５０μｌに減少させ、該細胞を、該細胞の表面をちょうど飽和させる量の直接標識ｍＡｂを含有する１００μｌのＰＡＡＧに再懸濁させた。このインキュベーションの後、該反応を１ｍｌのＰＡＡで洗浄し、ミクロ遠心機（Ｈｅｒｍｌｅ）において６，０００ＲＰＭで５分間遠心した。上清を除去して〜５０μｌに減少させ、該細胞を１ｍｌのＰＢＳに再懸濁させ、ＦＡＣ分析のために１２×７５ｍｍチューブに移した。対照として、該未標識ｍＡｂを含有する別の反応を二次アレクサフルオル（Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ）−４８８コンジュゲート化ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒプローブ；ＰＡＡＧ中、１：４００）で測定して、このｍＡｂが該表面に結合することを確認した。該細胞と共に該標識ｍＡｂのみを含有する陽性対照についても実験を行った。該未標識ｍＡｂが、該標識ｍＡｂと同じエピトープに結合すれば、該細胞に関連した蛍光活性は全く無いか又は低いことになる。該未標識ｍＡｂが、該標識ｍＡｂとは異なるエピトープに結合すれば、該表面に関連した反応性のレベルは、該標識ｍＡｂのみの対照細胞と同等ということになる。
【０１１１】
阻害研究により、モノクローナル抗体のパネルは４つの反応性グループに分類された。
【０１１２】
【表４】
【０１１３】
（実施例４）
変性抗原および改変抗原での結合研究
結合を更に特徴づけるために、ＯＲＦ０６５７ｎ改変タンパク質を使用した。まず、ＯＲＦ０６５７ｎをコードする核酸を発現ベクターｐＥＴ−２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）内にクローニングし、Ｃ末端６×ｈｉｓタグと共に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で発現させた（配列番号２）。ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＸＬ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを該製造業者の説明に従い使用して、該クローン化遺伝子を含有する発現ベクターを突然変異誘発に付した。該遺伝子は、特異的な連続的アミノ酸変化を伴って突然変異した。得られたプラスミドを、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＸＬ１０−Ｇｏｌｄコンピテント細胞内に、該製造業者のプロトコールに従い形質転換した。ＱｉａｇｅｎのＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔを使用して、プラスミドを形質転換体から単離した。ＡＢＩの３１０ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒを使用して配列決定することにより、形質転換体をスクリーニングした。最大数の塩基変化を示す形質転換体からのプラスミドを発現宿主ＨＭＳ １７４（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）内に形質転換した。Ｎｏｖａｇｅｎの説明に従い、形質転換体を発現させた。
【０１１４】
異なるＯＲＦ０６５７ｎ改変タンパク質を使用して、ＯＲＦ０６５７ｎ ｍＡｂ（配列番号４〜１９）の多様性を確認した。これらのタンパク質を、標準的な方法を用いるドットブロットにおいて１０個の異なるｍＡｂでスクリーニングした。標準的な方法を用いるウエスタンブロットにより、陽性／陰性を確認した。このアプローチにより、抗体を、それらの結合プロファイルに従い分類した。該抗体のうちの７個は３つのグループに分類され、残りの３個の抗体（２Ｈ２．Ｂ８、８Ａ８．Ｅ１１．Ｈ３および１３Ｇ１１．Ｃ１１）は、互いに類似しているが同一ではないプロファイルを有していた（表５）。
【０１１５】
【表５】
【０１１６】
（実施例５）
ＢＡＩｃｏｒｅ研究
ＢＩＡｃｏｒｅ研究において、精製ＯＲＦ０６５７ｎ−Ｈ／ｙを抗原として使用する「フットプリント分析」によりｍＡｂを検査した。ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）によるリアルタイム生体分子相互作用分析を用いて、ペア様態結合実験を行った。ＢＩＡＣＯＲＥ（商標登録）は、カルボキシルメチルデキストランでコーティングされた（ＣＭ５）センサーチップの表面に直接照射される偏光の屈折率の変化をモニターすることにより質量変化を検出するために、ミクロフルイディクス技術および表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を組合せたものである。応答単位（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｕｎｉｔ）で測定される応答の変化は結合アナライト（すなわち、抗原または抗体）の量に相関されうる。
【０１１７】
抗スタヒロコッカス抗体（ｍＡｂ １３Ｃ７．Ｄ１２）を該ＣＭ５センサーチップの表面上に共有結合（固定化）させた。該固定化ｍＡｂを、まず、ＯＲＦ０６５７ｎタンパク質にさらし、ついでマトリックス形態で抗体のペアにさらした。ＯＲＦ０６５７ｎタンパク質＋抗体ペアの各サイクルの後、２０ｍＭ ＨＣｌを使用して、該センサーチップの表面を固定化ｍＡｂ １３Ｃ７．Ｄ１２へと再生させた。各抗体ペアの全ての組合せが分析されうるよう、マトリックス形態でＯＲＦ０６５７ｎタンパク質に対して８個の抗体を試験した。この実験で使用したｍＡｂペアに関するマトリックス設計を表６に要約する。
【０１１８】
【表６】
【０１１９】
各実施において最初に結合した（捕捉された）抗原の量を正規化するために、各試験抗体／抗原複合体に関する以下の比を計算する。
【０１２０】
【数１】
【０１２１】
各抗体に残存している利用可能なエピトープの割合（％）は、以下のとおりに、マッピングペアに関して計算されうる。
【０１２２】
【数２】
【０１２３】
図２は、ペア様態の結合研究における該モノクローナル抗体の反応性の概要を示すマトリックスを例示する。モノクローナル抗体のパネルは、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）法により、３つの反応性領域に分類された（表７を参照されたい）。
【０１２４】
【表７】
【０１２５】
（実施例６）
マウス敗血症モデルにおける受動免疫化での防御研究
モノクローナル抗体ｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１およびｍＡｂ １３Ｃ７．ＢＣ１を、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染に対する防御をもたらすそれらの能力に関して試験した。これらの抗体はＯＲＦ０６５７ｎタンパク質上の異なるエピトープを認識する。対照には、イソタイプが一致したｍＡｂおよびＰＢＳ単体が含まれた。
【０１２６】
細菌チャレンジの２０時間前に該ｍＡｂまたはＰＢＳを腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。ついでマウスをＬＤ８０−９０用量のスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ベッカー（Ｂｅｃｋｅｒ）でチャレンジ（ｉ．ｖ．）し、生存をモニターした。各実験を１０または２０匹のマウスの群で３回反復し、１０日間モニターした。未感染ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける該モノクローナル抗体に関する半減期は約８日間である。０．５ｍｇの用量が最適であることが判明した。それらの２つのモノクローナル抗体での実験の結果を図３Ａ〜Ｃ、４Ａ、４Ｂおよび５Ａ〜Ｃに示す。
【０１２７】
１つの実験においては、ｍＡｂ １３Ｃ７．ＢＣ１は対照と比べて第１０日における生存を有意に改善したが、その他の２つの反復実験においては、全体的な生存率は対照の場合に類似していた（図３Ａ〜３Ｃ）。しかし、対照と比べて、ｍＡｂ １３Ｃ７．ＢＣ１で治療されたマウスの、この１０日間以内の死亡までの時間における遅延が認められた。また、３つの実験のうちの２つにおいて、ｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１で治療されたマウスの死亡までの時間の遅延における類似した傾向が認められた（図５Ａ〜５Ｃ）。
【０１２８】
また、最近のスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）臨床分離株であるＵＫ５８を使用して、ｍＡｂ １３Ｃ７．ＢＣ１の効果を調べた（図４Ａおよび４Ｂ）。この株は患者の膿瘍部位から最低限度で継代された。２つの独立した実験において、結果はＵＫ５８チャレンジによる死亡までの時間における遅延を示している。
【０１２９】
抗体持続性研究は、該ＬＤ８０−９０モデルにおいては、死亡速度が速いため評価できない。したがって、亜致死チャレンジモデルを用いた。該亜致死モデルにおいては、使用したチャレンジ用量は、該ＬＤ８０−９０モデルで使用した用量の１０％である。該亜致死チャレンジモデルを４日間にわたってモニターした。２２匹のマウスの群に０．５ｍｇの用量のｍＡｂ １３Ｃ７．ＢＣ１またはイソタイプ対照ｍＡｂ（６Ｇ６）を、５×１０７ ＣＦＵのスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ベッカー（Ｂｅｃｋｅｒ）でのｉ．ｖ．細菌チャレンジの２０時間前に投与した。チャレンジの時点の血清中のｍＡｂレベルを測定するために、チャレンジの直前（Ｔ＝０）に、各群の２匹の動物を犠死させた。チャレンジの２、２４、４８、７２および９６時間後、各群の４匹のマウスを犠死させ、血清ｍＡｂレベルを測定した。
【０１３０】
この亜致死チャレンジ実験から、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染マウスにおけるｍＡｂ １３Ｃ７．ＢＣ１の半減期は約１日であると推定された。これとは対照的に、イソタイプ対照ｍＡｂの半減期は４日を超えると推定された（データ非表示）。これらのデータは、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）でチャレンジされたマウスにおけるｍＡｂ １３Ｃ７．ＢＣ１の特異的減少を示しており、これは、該致死モデルにおいてモニターされた１０日間のかなり前に枯渇すると思われる。
【０１３１】
図３Ａ〜Ｃ、４Ａ、４Ｂおよび５Ａ〜Ｃに例示されている８つの実験のうちの６つにおいて、該ｍＡｂを投与した群に関して約３日までの生存の改善が認められた。これらの結果は、そのようなｍＡｂがスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）チャレンジマウスの生存率に対して正の効果を及ぼすことを示している。
【０１３２】
（実施例７）
マウス留置カテーテルモデルにおける受動免疫化での防御研究
マウス留置カテーテルモデルをｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１と共に使用した。このモデルにおいて使用したスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株は臨床分離株ＭＣＬ８５３８であった。この株を選択したのは、マウス敗血症モデルにおいて使用した株であるスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ベッカー（Ｂｅｃｋｅｒ）と比べて、カテーテルの再現可能なコロニー形成を尚も達成しつつ、より少量の接種物の投与が可能だからである。
【０１３３】
ＩＣＲマウスは、頚静脈内に外科的に移植され縫合により適所に保持され該マウスの背側中央線上の出口から出るカテーテル（ＰＥ５０シリコーンゴム）を有していた。術後９〜１１日間、マウスを休ませた。チャレンジの２４時間前に、６００ｍｃｇのマウスモノクローナル抗体２Ｈ２．ＢＥ１１の１回のｉ．ｐ．注射投与によりマウスを受動免疫化した。第０日に、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＭＣＬ８５３８のｉ．ｖ．投与によりマウスをチャレンジした。接種物の用量は１００μｌの体積中、２〜８×１０５ ＣＦＵであった（実験１〜３）。この低用量は４日後に該カテーテルから自然に消失することが判明した。したがって、チャレンジの２４時間後に細菌に関してカテーテルを評価した。その時点で、マウスを犠死させ、カテーテルを回収した。ＴＳＡ上でカテーテル全体を培養することにより、カテーテル上の細菌の存在を評価した。該プレート上で増殖の徴候が認められたら、該カテーテルは培養陽性であると評価した。
【０１３４】
最初の３つの実験の２つにおいて、培養陰性カテーテルの数は、抗体２Ｈ２．ＢＥ１１で受動免疫化されたマウスにおいては、イソタイプ対照抗体の場合より有意に低かった。より大きな接種物用量を用いて、４番目の実験を行った。このより過酷なチャレンジにおいては、該用量は、カテーテルの１００％が再現可能に感染し対照マウスにおいてこの感染が自然には消失しない（７日間にわたるモニター）用量であると定められた。そのようなより大きな接種物サイズを用いる実験４においてもまた、２Ｈ２．ＢＥ１１に対する抗体を注射したマウスにおいては、イソタイプ対照の場合と比べて、有意に少数のカテーテルが感染したことが判明した。４つの実験の結果を表８に要約する。
【０１３５】
【表８】
【０１３６】
（実施例８）
抗ＯＲＦ０６５７ｎモノクローナル抗体２Ｈ２．Ｂ８（ＩｇＧ１）、２Ｈ２．ＢＥ１１（ＩｇＧ２ｂ）もしくは１３Ｃ７．ＩｇＧ２ｂまたはイソタイプ一致対照ｍＡｂを使用する、細菌のエクスビボ前オプソニン化
ＯＲＦ０６５７ｎのモノクローナル抗体がオプソニン性であるかどうかを試験するために、致死用量のスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）をモノクローナル抗体２Ｈ２．Ｂ８、２Ｈ２．ＢＥ１１もしくは１３Ｃ７．ＩｇＧ２ｂまたはイソタイプ一致対照モノクローナル抗体で前オプソニン化させる受動防御実験を行った。ついで前オプソニン化細菌をマウスにｉ．ｐ．投与した。これらの実験で使用した細菌はスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＲＮ４２２０（野生型）またはＲＮ４２２０．０６５７ｎであった。ＲＮ４２２０．０６５７ｎ細菌を、ＦＵＲボックスによる制御の非存在化でＯＲＦ０６５７ｎを発現するよう操作した。したがって、それは鉄の存在下で増殖可能であり、その表面上でＯＲＦ０６５７ｎ抗原を尚も発現することが可能であった。あるいは、ＲＮ４２２０（野生型）を、該細菌表面上での０６５７ｎの発現を誘導するために、低鉄培地ＲＰＭＩ内で２回継代した。
【０１３７】
６Ｂａｌｂ／ｃマウスに十分な細菌の量（６×ＬＤ１００）を、穏やかに振とうしながら、８００μｇのＩｇＧと共に４℃で１時間インキュベートした。ついで細菌をペレット化し、未結合ｍＡｂを除去した。抗体オプソニン化細菌を２．４ｍＬのＰＢＳに再懸濁させ、０．４ｍＬ（１×ＬＤ１００）を５匹のマウスのそれぞれに注射した。マウスの全群に同等のＣＦＵがもたらされること及び該ｍＡｂが該細菌を凝集させていないことが保証されるよう、チャレンジ後、ＴＳＡ上のプレーティングにより各接種物を定量した。チャレンジ後３日間、生存をモニターした。この手法が有効となるためには該標的抗原が該細菌の表面上に存在しなければならないため、オプソニン化前に該細菌上で０６５７ｎが発現されることが保証されるよう配慮した。ｍＡｂ ２Ｈ２．Ｂ８を使用するフローサイトメトリーにより、ＯＲＦ０６５７ｎの発現をモニターした。各マウスに注射したオプソニン化細菌の用量は２〜４×１０９ ＣＦＵ ＲＮ４２２０．０６５７ｎ／マウスまたは１〜２×１０９ ＣＦＵ ＲＮ４２２０（２×ＲＰＭＩ）／マウスであった。
【０１３８】
マウスは、イソタイプ一致対照ｍＡｂではなく２Ｈ２．Ｂ８または２Ｈ２．ＢＥ１１のいずれかで前オプソニン化された場合に、致死用量のＲＮ４２２０．０６５７ｎスタヒロコッカスによる死亡から防御された。該実験をＩｇＧ１イソタイプに関して２回、およびＩｇＧ２ｂイソタイプに関して３回反復したところ、同様の結果が得られた（表９Ａ）。
【０１３９】
【表９】
【０１４０】
マウスは、イソタイプ一致対照ｍＡｂではなくｍＡｂ ２Ｈ２．Ｂ８で前オプソニン化された場合に、致死用量のＲＮ４２２０（２×ＲＰＭＩ）スタヒロコッカスによる死亡から防御された。該実験を６回反復したところ、同様の結果が得られた（表９Ｂ）。
【０１４１】
【表１０】
【０１４２】
マウス抗０６５７ｎ ２Ｈ２は、この致死モデルにおける死亡の予防に非常に有効であった。１３Ｃ７ ｍＡｂは、（図３〜６に例示されている既に記載されているモデルの場合とは対照的に）このモデルでは有効でなかった。該抗０６５７ｎ ｍＡｂの全て（２Ｈ２．ＢＥ１１、２Ｈ２．Ｂ８および１３Ｃ７．ＩｇＧ２ｂ）がＲＮ４２２０に結合し（フローサイトメトリーを用いて実証されているとおり）、全てがインビトロＯＰＡアッセイにおいてオプソニン活性を有する。このモデルは、該マウスの腹膜における、生存を向上させるためのエピトープ特異性に関する追加的な要件を表している。
【０１４３】
（実施例８）
２Ｈ２ ｍＡｂで行ったエピトープマッピング研究
この実施例に記載する実験は、モノクローナル抗体２Ｈ２．ＢＥ１１がＯＲＦ０６５７ｎ内のコンホメーションエピトープを認識するという証拠を提供する。該実験は、２Ｈ２ ｍＡｂにより認識される三次元構造におけるコンホメーションエピトープを提示するのに要求されるＯＲＦ０６５７ｎ内の最小配列を位置決定した。また、該実験は、２Ｈ２ ｍＡｂがＯＲＦ０６５７ｎに結合すると小分子との反応から保護される特徴的なリシン残基をＯＲＦ０６５７ｎの最小配列内に特定した。
【０１４４】
ＯＲＦ０６５７ｎの配列内の典型的には９から１４アミノ酸長の直鎖状エピトープを２Ｈ２ ｍＡｂが認識する潜在能力を、エピトープ抽出を用いて、配列番号１のアミノ酸４２からアミノ酸４８６のＯＲＦ０６５７ｎ断片（「ＯＲＦ０６５７ｔ」）から調べた。詳細に説明すると、該エピトープ抽出実験のそれぞれについて、１０ｍｇの臭化シアン活性化セファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｃａｔ．Ｎｏ．１７ ０４３００１）への化学的架橋により３０μｇの２Ｈ２ ｍＡｂを固定化した。ＯＲＦ０６５７ｔのタンパク質分解消化物をＧｌｕＣ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｃａｔ．Ｎｏ．１１ ４２０ ３９９７ ００１）、Ａｓｐ−Ｎ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｃａｔ．Ｎｏ．１１ ０５４ ５８９ ００１）またはキモトリプシン（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｃａｔ．Ｎｏ．１１ ４１８ ４６７ ００１）で生成させ、リニアイオントラップ（ＬＴＱ−Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｉｎｃ）において１Ｄ／ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより特徴づけた。３つの独立した実験において、いずれかのプロテアーゼに由来する特徴づけられたタンパク質分解消化物８．４μｇを該固定化抗体と反応させた。未結合ペプチドを該抗体架橋ビーズから洗い落とした。潜在的結合ペプチドを低ｐＨで溶出し、１Ｄ／ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより特徴づけた。生じたタンパク質分解ペプチドはいずれも、２Ｈ２ ｍＡｂにより、高い効率および特異性では認識されなかった。このことは、２Ｈ２ ｍＡｂが直鎖状エピトープを認識しなかったことを明確に示している。
【０１４５】
２Ｈ２ ｍＡｂがＯＲＦ０６５７ｎの直鎖状配列を認識しなかったという知見は、限られた化学切断実験により裏付けられた。ＯＲＦ０６５７ｔをＣＮＢｒで化学的に２時間にわたって切断した。得られた切断産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、約４２ｋＤａ、３５ｋＤａ、２５ｋＤａ、１５ｋＤａおよび１０ｋＤａの分子量を有する５つの主要バンドを示した。２Ｈ２ ｍＡｂでのウエスタンブロット分析は、該４２ｋＤａバンドのみが２Ｈ２により認識されることを明らかに示した。すべてのバンドを該ＳＤＳ−ＰＡＧＥから切り出し、ゲル内消化を行い、タンデム質量分析により特定された得られたペプチドをＯＲＦ０６５７ｔ内の対応配列と合致させた。該主要バンドの分析の結果を表１０に示す。
【０１４６】
【表１１】
【０１４７】
〜４２ｋＤａの分子量を有する断片の重要性をエピトープ切断により確認した。詳細に説明すると、該エピトープ切断実験のそれぞれについて、５０ｍｇの臭化シアン活性化セファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｃａｔ．Ｎｏ．１７ ０４３０ ０１）への化学的架橋により、２１０μｇの２Ｈ２ ｍＡｂを固定化した。ついで５０μｇの無傷ＯＲＦ０６５７ｎを該固定化抗体に結合させ、未結合ＯＲＦ０６５７ｎをリン酸緩衝食塩水での十分な洗浄により洗い落とした。３つの独立した実験において、プロテアーゼＧｌｕ−Ｃ、トリプシン、ならびにＧｌｕＣ、ＡｓｐＮ、トリプシン、キモトリプシンおよびカルボキシ−ペプチダーゼＹの連続的組合せを、５時間または該連続的組合せのプロテアーゼ当たり１時間、加えた。該インキュベーション中に該プロテアーゼにより切り出されたペプチドを十分に洗い落とし、２Ｈ２ ｍＡｂに特異的に結合したＯＲＦ０６５７ｎ断片をＳＤＳローディングバッファーで遊離させた。
【０１４８】
２Ｈ２ ｍＡｂに特異的に結合した断片をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。該エピトープ切断実験の３つ全てが、該ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析において、４０〜４２ｋＤａの分子量を有する唯一のバンドを示した。２Ｈ２ ｍＡｂに結合するバンドがウエスタンブロット分析により確認された。該エピトープ切断実験をＧｌｕ−Ｃプロテアーゼに関して反復した。今回は、２Ｈ２ ｍＡｂに特異的に結合したＯＲＦ０６５７ｔの断片を酸性条件で遊離させ、リニアイオントラップ（ＬＴＱ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ）において１Ｄ／ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析した。溶出したサンプルは、８２〜８７分（４０％〜４５％アセトニトリル）に、予想強度を有するシグナル（全イオン係数）を示し、４２．６２８ｋＤａと推定される複数の電荷状態（［Ｍ＋６７ Ｈ］６７＋〜（［Ｍ＋３０ Ｈ］３０＋）を示した。この特定の質量に対応するＯＲＦ０６５７ｔの考えられうる断片は、４２．６ｋＤａの分子量を有するＯＲＦ０６５７ｔの配列［０１２から３８２］である。
【０１４９】
ＯＲＦ０６５７ｔのどのリシン残基が２Ｈ２ ｍＡｂの結合に際して化学反応から保護されるのかを決定するために、２Ｈ２ｍＡｂの存在下または非存在下の３つの異なる実験条件を用いて、スルホ−ＮＨＳ−アセタート（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃａｔ．Ｎｏ．２６７７７）を使用する化学的標識実験を行った。表１１を参照されたい。
【０１５０】
【表１２】
【０１５１】
各実験について、０または３モル過剰の２Ｈ２ ｍＡｂで生成した反応産物を３つのうちの１つのプロテアーゼと共にインキュベートして、２×９個の反応混合物を得た。実験１では、ＧｌｕＣ、ＡｓｐＮおよびトリプシンを使用した。実験２および３では、ＧｌｕＣ、ＡｓｐＮおよびキモトリプシンを使用した。ついで該タンパク質分解ペプチドを１Ｄ／ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析した。該反応のそれぞれについて、アセチル化および未アセチル化リシン残基の比率を、個々のペプチドの全イオン計数（ＴＩＣ）の曲線下面積に基づいて算出した。ついで、同一反応条件に関して、得られた比率を該ペア間（２Ｈ２ ｍＡｂの存在下または非存在下）で比較した。２Ｈ２ ｍＡｂへのＯＲＦ０６５７ｔの結合に際して最大の遮蔽を受ける、ＯＲＦ０６５７ｔ内のリシン残基を特定するために、全３個の反応条件で全体的な分析を行った。前記の化学的標識実験は、２Ｈ２ ｍＡｂの結合に際して最も保護されたものとして、Ｋ７６、Ｋ２５７および潜在的にＫ４４３を特定した。化学的標識に対する保護は直接結合によるものでありうる。しかし、そのような保護は、保護部位の近傍への結合、またはＯＲＦ０６５７ｎＩ内の長い領域にわたる構造変化によるものである可能性がある。
【０１５２】
要約すると、前記実験は、２Ｈ２ ｍＡｂにより認識される、ＯＲＦ０６５７ｔ内のエピトープが、コンホメーション性（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ）であるという、明らかな証拠を示している。２Ｈ２ ｍＡｂにより認識されるＯＲＦ０６５７ｔの断片は、ＯＲＦ０６７５ｔのアミノ酸１から１１５に位置するＮ末端、およびＯＲＦ０６５７ｔのアミノ酸３２３から３５７に位置するカルボキシル末端を有する。２Ｈ２ ｍＡｂの結合の際の化学的標識からの保護が、長い領域にわたる構造変化により影響されることは除外できないとしても、リシン７６およびリシン２７５の近傍の領域が直接的な抗体相互作用に関与している可能性が高い。
【０１５３】
（実施例９）
２Ｈ２ ｍＡｂ配列特定
一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）構築のための縮重プライマーＰＣＲ／重複伸長クローニング法（Ｋｒｅｂｂｅｒら，ＪＩＭ ２０１（１）：３５−５５，１９９７）を、ヒトカッパ軽鎖定常ドメインまたはｓｃＡｂ物質に融合された可溶性ｓｃＦｖのＢｉａｃｏｒｅによるハイスループットスクリーニングと組合せることにより、ハイブリドーマにより発現された２Ｈ２ ＩｇＧの可変軽（Ｖｌ）配列および可変重（Ｖｈ）配列の特定が達成された。これは、該縮重プライマー法により生じたＶｌフレームワーク１、４およびＶｈフレームワーク１、４における突然変異の精密な識別を可能にした。
【０１５４】
簡潔に説明すると、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｋｉｔ（商標）（Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．）の標準的な方法を用いて、ＲＮＡ物質を該ハイブリドーマ細胞系から精製した。ついで、この物質をｃＤＮＡに逆転写し、それを、該可変領域を増幅するためのＰＣＲにおける鋳型として使用した。ＶｌおよびＶｈ鎖のＰＣＲ増幅のための条件は、Ｋｒｅｂｂｅｒら，ＪＩＭ２０１（ｌ）：３５−５５，１９９７に記載されているプロトコールに基づくものであった。（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４リンカー（配列番号３２）が付加されて、ＶｈおよびＶｌが重なり合ってＶｌ−（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４−Ｖｈ ｓｃＦｖを与える、第３ＰＣＲ反応のためのドメインが得られるよう、プライマーを設計する。
【０１５５】
該可変鎖を個々に増幅するための第１セットのＰＣＲ反応を、５μｌのｃＤＮＡ反応物、それぞれ２μＭのＶｌおよびＶｈの増幅のためのフォワードおよびリバースプライマーセットならびに高忠実度ＰＣＲマスター混合物を含有する１００μｌの容量中で行った。該反応を９４℃で４分間変性させ、ついで９４℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、７２℃で１分間の３０サイクルに付し、７２℃で５分間の最終サイクルに付した。完全長ＰＣＲ産物をゲル精製した。
【０１５６】
増幅されたＶｈおよびＶｌ物質をｓｃＦｖへと合体させて完全長産物を構築するために、第３ＰＣＲ反応を行った。１００μｌの容量中で、それぞれ約２０ｎｇのＶｈおよびＶｌ ＤＮＡならびに高忠実度ＰＣＲマスター混合物を９４℃で５分間変性させ、ついで９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間および７２℃で３０秒間の３サイクル（プライマーの非存在下）に付した。修飾されたＰＣＲプライマー配列番号３３および配列番号３４を１μＭの最終濃度で加え、９４℃で３０秒間、６０℃で１分間および７２℃で１分間の３０サイクルを行い、ついで７２℃で７分間の加熱を行った。予想される完全長ｓｃＦｖ ＰＣＲ産物をゲル精製した。
【０１５７】
増幅されたｓｃＦｖ物質を、ｓｃＡｂの産生および配列分析のためにＭＰ１６可溶性発現ベクター内にクローニングした（Ｈａｙｈｕｒｓｔら，ＪＩＭ ２７６（１−２）：１８５−１９６，２００３）。ＭＰ１６ベクター内への定向性（ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ）クローニングのために、Ｓｆｉ１での１回の制限酵素消化を行った。ついで、存在する見掛け上完全長の可変重鎖および可変軽鎖を含有するクローンをＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞内でｓｃＡｂとして発現させ、標準的な浸透圧ショック法を用いてペリプラズムから回収した。簡潔に説明すると、９６ウェル形態において、２％ グルコースおよび１００μｇ／ｍｌ アンピシリンを含有する増殖培地内でクローンを３７℃で一晩増殖させた。２０μｌの該一晩培養物を、０．１％ グルコースおよび１００μｇ／ｍｌ アンピシリンを含有する新たな培地に移し、０．６のＯＤ６００に達するまで増殖させた。ＩＰＴＧを０．５ｍＭの最終濃度で加えることにより、ｓｃＡｂの発現のために該細胞を誘導し、１５０ｒｐｍで振とうしながら室温で一晩インキュベートした。Ｑｉａｇｅｎ Ｎｉ−ＮＴＡスーパーフロー（ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ）自動化法を用いて、該細胞からｓｃＡｂを精製した。
【０１５８】
ＯＲＦ０６５７ｔに対する結合活性に関して各ｓｃＡｂペリプラズム調製物を分析するために、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）装置（Ｕｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用した。標準的なＥＤＣ／ＮＨＳカップリングを用いて、約２５０共鳴単位の０６５７ｔ抗原をＣＭ５センサーチップの実験用フローセル表面に直接的に共有結合させた。タンパク質のカップリングを行うことなく、参照フローセル表面を活性化し不活性化した。ついで各調製物を該表面に通過させ、抗原へのｓｃＡｂの会合および解離を測定した。各実施ごとに、１０ｍＭ ＨＣｌを流速２０μｌ／分で２０秒間にわたり１回注入し、ついで２分間の安定化時間を設けることにより、該表面を再生させた。全てのサンプルを２通りに実施し、バッファーのみの実施を対照として用いた。９５個のクローンをスクリーニングした後、１個のクローンを、その結合活性に基づいて選択した。選択した最終的な２Ｈ２クローンは、元のハイブリドーマにより調製されたＩｇＧ物質に類似した、ＯＲＦ０６５７ｔに対するそのアフィニティー、および比較配列分析に基づくものであった。
【０１５９】
２Ｈ２ Ｖｈ（配列番号２０）およびＶｌ（配列番号２１）のアミノ酸配列は以下のとおりであった。
【０１６０】
【化１】
【０１６１】
下線部はＣＤＲである。ＣＤＲは、カバット（Ｋａｂａｔ）定義に基づいて特定された。コードしている核酸配列は配列番号２４（Ｖｈ）および配列番号２５（Ｖｌ）に示されている。
【０１６２】
（実施例１０）
２Ｈ２ ＩｇＧキメラの発現
２Ｈ２ ｍＡｂの可変領域を、実施例９に記載されているとおりにマウスハイブリドーマからクローニングした。該可変領域の配列をＰＣＲ増幅し、重鎖可変領域をコードするＤＮＡを、ＩｇＧ１定常領域をコードするＤＮＡにインフレームで融合させ、一方、軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを、カッパ定常領域をコードするＤＮＡにインフレームで融合させた。得られた抗体発現ベクターに関するクローニング方法を以下に説明する。
【０１６３】
該可変領域をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ反応は、高忠実度ＰＣＲマスター混合物、鋳型容量１μｌならびにフォワードおよびリバースプライマー（それぞれ１μｌ）を含有する２５μｌの容量中で行った。ＰＣＲ条件は９４℃で２分間の１サイクル、９４℃で１．５分間、６０℃で１．５分間、７２℃で１．５分間の２５サイクルおよび７２℃で７分間であり、反応産物を、取り出すまで４℃にし、ついでＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ法を用いて５’末端においてリーダー配列に及び３’末端において定常領域にインフレームでクローニングした。以下のプライマーを使用した。軽鎖フォワード，５’−ＡＣＡＧＡＴＧＣＣＡＧＡＴＧＣＧＡＴＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴ（配列番号２８）；軽鎖リバース，５’−ＴＧＣＡＧＣＣＡＣＣＧＴＡＣＧＴＴＴＴＡＴＴＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＴＣＣＣ（配列番号２９）；重鎖フォワード，５’−ＡＣＡＧＧＴＧＴＣＣＡＣＴＣＧＧＡＴＧＴＧＣＡＣＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＡ（配列番号３０）；および重鎖リバース，５’−ＧＣＣＣＴＴＧＧＴＧＧＡＴＧＣＣＧＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＧＡＧＡＧＴＧＧＴ（配列番号３１）。該クローンの全てのＤＮＡ配列は配列決定により確認された。
【０１６４】
ＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列を以下に示す。
【０１６５】
【化２】
【０１６６】
可変領域は下線で示されている。
【０１６７】
該抗体を２９３ＥＢＮＡ単層細胞内で発現させた。ＰＥ１に基づくトランスフェクション試薬を使用して、該プラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞をＯｐｔｉ−ＭＥＭ無血清培地内でインキュベートし、分泌した抗体を、プロテインＡ／Ｇアフィニティークロマトグラフィーを用いて培地から精製した。精製抗体の濃度をＯＤ２８０ｎｍにより決定し、純度をＬａｂＣｈｉｐ（商標）キャピラリー電気泳動により測定した。
【０１６８】
軽鎖および重鎖の両方の発現はヒトＣＭＶプロモーターおよびウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルにより駆動された（Ｓｈｉｖｅｒら，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７７２：１９８−２０８，１９９５）。前方のリーダー配列が培養培地内への抗体の分泌をもたらした。重鎖に関するリーダー配列はＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ（配列番号２６）であり、軽鎖に関するリーダー配列はＭＳＶＰＴＱＶＬＧＬＬＬＬＷＬＴＤＡＲＣ（配列番号２７）であった。該発現ベクターは、２９３ＥＢＮＡ細胞内での持続的発現のためのＥＢＶウイルスゲノム由来のｏｒｉＰ、ならびに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における複製起点およびカナマイシン選択マーカーのための細菌配列を含有する。
【０１６９】
該抗体を２９３ＥＢＮＡ単層細胞内で発現させた。ＰＥ１に基づくトランスフェクション試薬を使用して、該プラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞をＯｐｔｉ−ＭＥＭ無血清培地内でインキュベートし、分泌した抗体を、プロテインＡ／Ｇアフィニティークロマトグラフィーを用いて培地から精製した。精製抗体の濃度をＯＤ２８０ｎｍにより決定し、純度をＬａｂＣｈｉｐキャピラリー電気泳動により測定した。
【０１７０】
（実施例１１）
アフィニティー測定
ハイブリドーマ物質としての２Ｈ２ ｍＡｂ、ｓｃＡｂおよびキメラ抗体に関する比較分析を行った。２ｈ２ ｍＡｂ ＶｈおよびＶｌ領域をクローニングし、ＩｇＧキメラとして発現させた（実施例１０に記載されているとおり）。ｓｃＡｂを、ヒトカッパ鎖タグに融合したｓｃｆｖを産生するＭＰ１６ベクター（実施例９）内にクローニングした。以下に更に詳細に説明するとおり、該抗原アフィニティーは該構築物間で有意には異ならなかった。
【０１７１】
結合ドメインと抗原との間の１：１相互作用を測定するために、Ｂｉａｃｏｒｅの実験条件を、抗体フラグメントを測定するのか又は完全長ＩｇＧを測定するのかに応じて改変した。ＩｇＧの測定の場合には、ＩｇＧをリガンドとして表面上に捕捉し、ＯＲＦ０６５７ｔをアナライトとして通過させた。抗体フラグメントの分析の場合には、ＯＲＦ０６５７ｔを表面に結合させ、抗体フラグメントをアナライトとして通過させた。これは、ＯＲＦ０６５７ｔ抗原に対する元の２Ｈ２ ｍＡｂハイブリドーマ物質のアフィニティーが組換えクローニング後に有意な変化を何ら示さないことを示した（表１２）。Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００での表面プラズモン共鳴によりデータを収集し、各アナライトを複数の濃度（１濃度当たり二重の重複実験）で通過させた。一連の全濃度を同時フィットさせるＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）でデータを分析した。フィットパラメーターを表１２に示す。
【０１７２】
【表１３】
【０１７３】
（実施例１２）
ＯＲＦ０６５７ｎに基づく配列
配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）４から１９において強調して示されている（太字および下線で示されている）アミノ酸は、ＯＲＦ０６５７ｎから変化したアミノ酸を示す。
【０１７４】
【化３】
【０１７５】
他の実施形態も特許請求の範囲内に含まれる。本明細書中には幾つかの実施形態が示され記載されているが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく種々の改変が施されうる。
【図面の簡単な説明】
【０１７６】
【図１】図１はＩｇＧ分子の構造を例示する。「ＶＬ」は軽鎖可変領域を意味する。「ＶＨ」は重鎖可変領域を意味する。「ＣＬ」は軽鎖定常領域を意味する。「ＣＨ１」、「ＣＨ２」および「ＣＨ３」は重鎖定常領域である。点線はジスルフィド結合を示す。
【図２】図２は、ペア様態の結合研究における種々のモノクローナル抗体の反応性の概要を示すマトリックスを例示する。モノクローナル抗体のパネルは、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）法により、３つの反応性領域に分類された。
【図３Ａ】図３Ａ〜Ｃ：ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝２０）の群を、細菌チャレンジの２０時間前に、■，ｍＡｂ １３Ｃ７．ＢＣ１；□，ｍＡｂ ６Ｇ６．Ａ８（イソタイプ対照）；または○，ＰＢＳのｉ．ｐ．注射で治療した。マウスをｉ．ｖ．注射によりスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）でチャレンジし、生存をモニターした。図３Ａ−０．４９ｍｇのｍＡｂ １３Ｃ７．ＢＣ１；０．４５ｍｇのｍＡｂ ６Ｇ６．Ａ８；および９．８×１０８ ＣＦＵのスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ベッカー（Ｂｅｃｋｅｒ）。図３Ｂ−０．４９ｍｇのｍＡｂ １３Ｃ７．ＢＣ１；０．４５ｍｇのｍＡｂ ６Ｇ６．Ａ８；および９．６×１０８ ＣＦＵのスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ベッカー（Ｂｅｃｋｅｒ）。図３Ｃ−０．５０ｍｇのｍＡｂ１３Ｃ７．ＢＣ１；０．４５ｍｇのｍＡｂ ６Ｇ６；および９．９×１０８ ＣＦＵのスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ベッカー（Ｂｅｃｋｅｒ）。
【図３Ｂ】図３Ａ〜Ｃ：ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝２０）の群を、細菌チャレンジの２０時間前に、■，ｍＡｂ １３Ｃ７．ＢＣ１；□，ｍＡｂ ６Ｇ６．Ａ８（イソタイプ対照）；または○，ＰＢＳのｉ．ｐ．注射で治療した。マウスをｉ．ｖ．注射によりスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）でチャレンジし、生存をモニターした。図３Ａ−０．４９ｍｇのｍＡｂ １３Ｃ７．ＢＣ１；０．４５ｍｇのｍＡｂ ６Ｇ６．Ａ８；および９．８×１０８ ＣＦＵのスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ベッカー（Ｂｅｃｋｅｒ）。図３Ｂ−０．４９ｍｇのｍＡｂ １３Ｃ７．ＢＣ１；０．４５ｍｇのｍＡｂ ６Ｇ６．Ａ８；および９．６×１０８ ＣＦＵのスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ベッカー（Ｂｅｃｋｅｒ）。図３Ｃ−０．５０ｍｇのｍＡｂ１３Ｃ７．ＢＣ１；０．４５ｍｇのｍＡｂ ６Ｇ６；および９．９×１０８ ＣＦＵのスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ベッカー（Ｂｅｃｋｅｒ）。
【図３Ｃ】図３Ａ〜Ｃ：ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝２０）の群を、細菌チャレンジの２０時間前に、■，ｍＡｂ １３Ｃ７．ＢＣ１；□，ｍＡｂ ６Ｇ６．Ａ８（イソタイプ対照）；または○，ＰＢＳのｉ．ｐ．注射で治療した。マウスをｉ．ｖ．注射によりスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）でチャレンジし、生存をモニターした。図３Ａ−０．４９ｍｇのｍＡｂ １３Ｃ７．ＢＣ１；０．４５ｍｇのｍＡｂ ６Ｇ６．Ａ８；および９．８×１０８ ＣＦＵのスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ベッカー（Ｂｅｃｋｅｒ）。図３Ｂ−０．４９ｍｇのｍＡｂ １３Ｃ７．ＢＣ１；０．４５ｍｇのｍＡｂ ６Ｇ６．Ａ８；および９．６×１０８ ＣＦＵのスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ベッカー（Ｂｅｃｋｅｒ）。図３Ｃ−０．５０ｍｇのｍＡｂ１３Ｃ７．ＢＣ１；０．４５ｍｇのｍＡｂ ６Ｇ６；および９．９×１０８ ＣＦＵのスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ベッカー（Ｂｅｃｋｅｒ）。
【図４Ａ】図４Ａおよび４Ｂ：ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝２０）の群を、細菌チャレンジの２０時間前に、■，ｍＡｂ １３Ｃ７．ＢＣ１（０．５ｍｇ）；□，ｍＡｂ ６Ｇ６．Ａ８（イソタイプ対照）（０．５ｍｇ）；または○，ＰＢＳ（０．５ｍｌ）のｉ．ｐ．注射で治療した。マウスをｉ．ｖ．注射によりスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）でチャレンジし、生存をモニターした。図４Ａは、２．０９×１０８ ＣＦＵのスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＵＫ５８での結果を例示している。図４Ｂは、２．１５×１０８ スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＵＫ５８での結果を例示している。
【図４Ｂ】図４Ａおよび４Ｂ：ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝２０）の群を、細菌チャレンジの２０時間前に、■，ｍＡｂ １３Ｃ７．ＢＣ１（０．５ｍｇ）；□，ｍＡｂ ６Ｇ６．Ａ８（イソタイプ対照）（０．５ｍｇ）；または○，ＰＢＳ（０．５ｍｌ）のｉ．ｐ．注射で治療した。マウスをｉ．ｖ．注射によりスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）でチャレンジし、生存をモニターした。図４Ａは、２．０９×１０８ ＣＦＵのスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＵＫ５８での結果を例示している。図４Ｂは、２．１５×１０８ スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＵＫ５８での結果を例示している。
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｃ：ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝２０）の群を、細菌チャレンジの２０時間前に、■，ｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１；□，ｍＡｂ ６Ｇ６．Ａ８（イソタイプ対照）；○，ＰＢＳのｉ．ｐ．注射で治療した。マウスをｉ．ｖ．注射によりスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）でチャレンジし、生存をモニターした。図５Ａ−０．４３ｍｇのｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１；０．５ｍｇのｍＡｂ ６Ｇ６．Ａ８；および９．８×１０８ ＣＦＵのスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ベッカー（Ｂｅｃｋｅｒ）。図５Ｂ−０．４３ｍｇのｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１；０．５ｍｇのｍＡｂ ６Ｇ６．Ａ８；および８．３×１０８ ＣＦＵのスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ベッカー（Ｂｅｃｋｅｒ）。図５Ｃ−０．４３ｍｇのｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１；０．５ｍｇのｍＡｂ ６Ｇ６．Ａ８；および９．３×１０８ ＣＦＵのスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ベッカー（Ｂｅｃｋｅｒ）。
【図５Ｂ】図５Ａ〜５Ｃ：ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝２０）の群を、細菌チャレンジの２０時間前に、■，ｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１；□，ｍＡｂ ６Ｇ６．Ａ８（イソタイプ対照）；○，ＰＢＳのｉ．ｐ．注射で治療した。マウスをｉ．ｖ．注射によりスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）でチャレンジし、生存をモニターした。図５Ａ−０．４３ｍｇのｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１；０．５ｍｇのｍＡｂ ６Ｇ６．Ａ８；および９．８×１０８ ＣＦＵのスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ベッカー（Ｂｅｃｋｅｒ）。図５Ｂ−０．４３ｍｇのｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１；０．５ｍｇのｍＡｂ ６Ｇ６．Ａ８；および８．３×１０８ ＣＦＵのスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ベッカー（Ｂｅｃｋｅｒ）。図５Ｃ−０．４３ｍｇのｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１；０．５ｍｇのｍＡｂ ６Ｇ６．Ａ８；および９．３×１０８ ＣＦＵのスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ベッカー（Ｂｅｃｋｅｒ）。
【図５Ｃ】図５Ａ〜５Ｃ：ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝２０）の群を、細菌チャレンジの２０時間前に、■，ｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１；□，ｍＡｂ ６Ｇ６．Ａ８（イソタイプ対照）；○，ＰＢＳのｉ．ｐ．注射で治療した。マウスをｉ．ｖ．注射によりスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）でチャレンジし、生存をモニターした。図５Ａ−０．４３ｍｇのｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１；０．５ｍｇのｍＡｂ ６Ｇ６．Ａ８；および９．８×１０８ ＣＦＵのスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ベッカー（Ｂｅｃｋｅｒ）。図５Ｂ−０．４３ｍｇのｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１；０．５ｍｇのｍＡｂ ６Ｇ６．Ａ８；および８．３×１０８ ＣＦＵのスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ベッカー（Ｂｅｃｋｅｒ）。図５Ｃ−０．４３ｍｇのｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１；０．５ｍｇのｍＡｂ ６Ｇ６．Ａ８；および９．３×１０８ ＣＦＵのスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ベッカー（Ｂｅｃｋｅｒ）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｍＡｂ ＩＧ３．ＢＤ４標的領域、ｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１標的領域、ｍＡｂ １３Ｃ７．ＢＣ１およびｍＡｂ １３Ｇ１１．ＢＦ３標的領域よりなる群から選ばれる標的領域に結合する、第１可変領域および第２可変領域を含んでなる単離された抗原結合タンパク質。
【請求項２】
該標的領域が、ｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１標的領域であり、第１可変領域が、
配列番号２０のアミノ酸３６から４５またはアミノ酸３６から４５とは１つのアミノ酸が異なる配列を含む第１ Ｖｈ ＣＤＲ、
配列番号２０のアミノ酸５０から６５またはアミノ酸５０から６５とは１つのアミノ酸が異なる配列を含む第２ Ｖｈ ＣＤＲ、および
配列番号２０のアミノ酸９８から１０７またはアミノ酸９８から１０７とは１つのアミノ酸が異なる配列を含む第３ Ｖｈ ＣＤＲ
を含むＶｈ領域である、請求項１記載の結合タンパク質。
【請求項３】
第２可変領域が、
配列番号２１のアミノ酸２４から３３またはアミノ酸２４から３３とは１つのアミノ酸が異なる配列を含む第１ Ｖｌ ＣＤＲ、
配列番号２１のアミノ酸４９から５５またはアミノ酸４９から５５とは１つのアミノ酸が異なる配列を含む第２ Ｖｌ ＣＤＲ、および
配列番号２１のアミノ酸８８から９６またはアミノ酸８８から９６とは１つのアミノ酸が異なる配列を含む第３ Ｖｌ ＣＤＲ
を含むＶｌ領域である、請求項２記載の結合タンパク質。
【請求項４】
該結合タンパク質が抗体である、請求項３記載の結合タンパク質。
【請求項５】
該抗体がモノクローナル抗体である、請求項４記載の結合タンパク質。
【請求項６】
該Ｖｈ領域が、配列番号２０、ヒト化された配列番号２０または脱免疫化（ｄｅ−ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）された配列番号２０のいずれかであり、該Ｖｌ領域が、配列番号２１、ヒト化された配列番号２１または脱免疫化（ｄｅ−ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）された配列番号２１のいずれかである、請求項４記載の結合タンパク質。
【請求項７】
該結合タンパク質が、（ａ）該Ｖｈ領域、ならびにヒトヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３領域（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４サブタイプからのもの）を含む重鎖と、（ｂ）該Ｖｌ領域、およびヒトカッパＣＬまたはヒトラムダＣＬのいずれかを含む軽鎖とを含む抗体である、請求項６記載の結合タンパク質。
【請求項８】
該Ｖｈ領域が、配列番号２０のアミノ酸３６から４５よりなる第１ Ｖｈ ＣＤＲ、配列番号２０のアミノ酸５０から６５よりなる第２ Ｖｈ ＣＤＲ、および配列番号２０のアミノ酸９８から１０７よりなる第３ Ｖｈ ＣＤＲを含み、
該Ｖｌ領域が、配列番号２１のアミノ酸２４から３３よりなる第１ Ｖｌ ＣＤＲ、配列番号２１のアミノ酸４９から５５よりなる第２ Ｖｌ ＣＤＲ、および配列番号２１のアミノ酸８８から９６よりなる第３ Ｖｌ ＣＤＲを含む、請求項３記載の結合タンパク質。
【請求項９】
該結合タンパク質が抗体である、請求項８記載の結合タンパク質。
【請求項１０】
該抗体がモノクローナル抗体である、請求項９記載の結合タンパク質。
【請求項１１】
該Ｖｈ領域が、配列番号２０、ヒト化された配列番号２０または脱免疫化（ｄｅ−ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）された配列番号２０のいずれかであり、該Ｖｌ領域が、配列番号２１、ヒト化された配列番号２１または脱免疫化（ｄｅ−ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）された配列番号２１のいずれかである、請求項９記載の結合タンパク質。
【請求項１２】
該結合タンパク質が、（ａ）該Ｖｈ領域、ならびにヒトヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３領域（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４サブタイプからのもの）を含む重鎖と、（ｂ）該Ｖｌ領域、およびヒトカッパＣＬまたはヒトラムダＣＬのいずれかを含む軽鎖とを含む抗体である、請求項８記載の結合タンパク質。
【請求項１３】
該重鎖が配列番号２２のアミノ酸配列より実質的になり、該軽鎖が配列番号２３のアミノ酸配列より実質的になる、請求項１２記載の結合タンパク質。
【請求項１４】
ｍＡｂ ＩＧ３．ＢＤ４標的領域、ｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１標的領域、ｍＡｂ １３Ｃ７．ＢＣ１およびｍＡｂ １３Ｇ１１．ＢＦ３標的領域よりなる群から選ばれる標的領域に結合する抗体可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む組換え遺伝子を含んでなる核酸。
【請求項１５】
該標的領域が、ｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１標的領域であり、該可変領域が、
配列番号２０のアミノ酸３６から４５またはアミノ酸３６から４５とは１つのアミノ酸が異なる配列を含む第１ Ｖｈ ＣＤＲ、
配列番号２０のアミノ酸５０から６５またはアミノ酸５０から６５とは１つのアミノ酸が異なる配列を含む第２ Ｖｈ ＣＤＲ、および
配列番号２０のアミノ酸９８から１０７またはアミノ酸９８から１０７とは１つのアミノ酸が異なる配列を含む第３ Ｖｈ ＣＤＲ
を含むＶｈ領域である、請求項１４記載の核酸。
【請求項１６】
該Ｖｈ領域が、配列番号２０のアミノ酸３６から４５よりなる第１ Ｖｈ ＣＤＲ、配列番号２０のアミノ酸５０から６５よりなる第２ Ｖｈ ＣＤＲ、および配列番号２０のアミノ酸９８から１０７よりなる第３ Ｖｈ ＣＤＲを含む、請求項１５記載の核酸。
【請求項１７】
該可変領域が、配列番号２０、ヒト化された配列番号２０または脱免疫化（ｄｅ−ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）された配列番号２０のいずれかである、請求項１４記載の核酸。
【請求項１８】
該組換え遺伝子が、該Ｖｈ領域、ヒトヒンジ、ならびにＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３領域（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４サブタイプからのもの）を含む抗体重鎖をコードする、請求項１７記載の核酸。
【請求項１９】
該可変領域が、
配列番号２１のアミノ酸２４から３３またはアミノ酸２４から３３とは１つのアミノ酸が異なる配列を含む第１ Ｖｌ ＣＤＲ、
配列番号２１のアミノ酸４９から５５またはアミノ酸４９から５５とは１つのアミノ酸が異なる配列を含む第２ Ｖｌ ＣＤＲ、および
配列番号２１のアミノ酸８８から９６またはアミノ酸８８から９６とは１つのアミノ酸が異なる配列を含む第３ Ｖｌ ＣＤＲ
を含むＶｌ領域である、請求項１４記載の核酸。
【請求項２０】
該第１ Ｖｌ領域が、配列番号２１のアミノ酸２４から３３よりなる第１ Ｖｌ ＣＤＲ、配列番号２１のアミノ酸４９から５５よりなる第２ Ｖｌ ＣＤＲ、および配列番号２１のアミノ酸８８から９６よりなる第３ Ｖｌ ＣＤＲを含む、請求項１９記載の核酸。
【請求項２１】
該可変領域が、配列番号２１、ヒト化された配列番号２１または脱免疫化（ｄｅ−ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）された配列番号２１のいずれかである、請求項１４記載の核酸。
【請求項２２】
該組換え遺伝子が、該可変領域およびヒトカッパまたはラムダＣＬを含む抗体軽鎖をコードする、請求項１７記載の核酸。
【請求項２３】
請求項１４〜２２のいずれか１項記載の１以上の核酸を含んでなる組換え細胞。
【請求項２４】
該細胞が請求項１８記載の核酸および請求項２２記載の核酸の両方を含む、請求項２３記載の組換え細胞。
【請求項２５】
抗体可変領域を含むタンパク質の製造方法であって、
（ａ）該タンパク質が発現される条件下、請求項２３記載の組換え細胞を増殖させ、
（ｂ）該タンパク質を精製する段階を含んでなる製造方法。
【請求項２６】
抗体可変領域を含むタンパク質の製造方法であって、
（ａ）該タンパク質が発現される条件下、請求項２４記載の組換え細胞を増殖させ、
（ｂ）該タンパク質を精製する段階を含んでなる製造方法。
【請求項２７】
請求項１〜１３のいずれか１項記載の結合タンパク質と医薬上許容される担体とを含んでなる医薬組成物。
【請求項２８】
溶液中または細胞上のＯＦＲ０６５７ｎ抗原の存在の検出方法であって、（ａ）請求項１〜１３のいずれか１項記載の結合タンパク質を該溶液または該細胞に加え、（ｂ）該溶液中に存在する該抗原への又は該細胞への該結合タンパク質の結合能を測定する段階を含んでなる検出方法。
【請求項２９】
請求項１〜１３のいずれか１項記載の結合タンパク質の有効量を患者に投与する段階を含んでなる、患者におけるスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染に対する治療方法。
【請求項３０】
該抗原結合タンパク質を手術または異物インプラントと共に投与する、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
ｍＡｂ １Ｇ３．Ｂ３、ｍＡｂ ２Ｈ２．Ｂ８、ｍＡｂ １３Ｃ７．Ｄ１２またはｍＡｂ １３Ｇ１１．Ｃ１１のいずれかであるタンパク質、またはＯＲＦ０６５７ｎへの結合に関してｍＡｂ ＩＧ３．Ｂ３、ｍＡｂ ２Ｈ２．Ｂ８、ｍＡｂ １３Ｃ７．Ｄ１２またはｍＡｂ １３Ｇ１１．Ｃ１１のいずれかと競合するタンパク質を産生する細胞系。
【請求項３２】
該系がＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−７１２４、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−７１２５、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−７１２６またはＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−７１２７のいずれかである、請求項３１記載の細胞系。
【請求項１】
ｍＡｂ ＩＧ３．ＢＤ４標的領域、ｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１標的領域、ｍＡｂ １３Ｃ７．ＢＣ１およびｍＡｂ １３Ｇ１１．ＢＦ３標的領域よりなる群から選ばれる標的領域に結合する、第１可変領域および第２可変領域を含んでなる単離された抗原結合タンパク質。
【請求項２】
該標的領域が、ｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１標的領域であり、第１可変領域が、
配列番号２０のアミノ酸３６から４５またはアミノ酸３６から４５とは１つのアミノ酸が異なる配列を含む第１ Ｖｈ ＣＤＲ、
配列番号２０のアミノ酸５０から６５またはアミノ酸５０から６５とは１つのアミノ酸が異なる配列を含む第２ Ｖｈ ＣＤＲ、および
配列番号２０のアミノ酸９８から１０７またはアミノ酸９８から１０７とは１つのアミノ酸が異なる配列を含む第３ Ｖｈ ＣＤＲ
を含むＶｈ領域である、請求項１記載の結合タンパク質。
【請求項３】
第２可変領域が、
配列番号２１のアミノ酸２４から３３またはアミノ酸２４から３３とは１つのアミノ酸が異なる配列を含む第１ Ｖｌ ＣＤＲ、
配列番号２１のアミノ酸４９から５５またはアミノ酸４９から５５とは１つのアミノ酸が異なる配列を含む第２ Ｖｌ ＣＤＲ、および
配列番号２１のアミノ酸８８から９６またはアミノ酸８８から９６とは１つのアミノ酸が異なる配列を含む第３ Ｖｌ ＣＤＲ
を含むＶｌ領域である、請求項２記載の結合タンパク質。
【請求項４】
該結合タンパク質が抗体である、請求項３記載の結合タンパク質。
【請求項５】
該抗体がモノクローナル抗体である、請求項４記載の結合タンパク質。
【請求項６】
該Ｖｈ領域が、配列番号２０、ヒト化された配列番号２０または脱免疫化（ｄｅ−ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）された配列番号２０のいずれかであり、該Ｖｌ領域が、配列番号２１、ヒト化された配列番号２１または脱免疫化（ｄｅ−ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）された配列番号２１のいずれかである、請求項４記載の結合タンパク質。
【請求項７】
該結合タンパク質が、（ａ）該Ｖｈ領域、ならびにヒトヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３領域（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４サブタイプからのもの）を含む重鎖と、（ｂ）該Ｖｌ領域、およびヒトカッパＣＬまたはヒトラムダＣＬのいずれかを含む軽鎖とを含む抗体である、請求項６記載の結合タンパク質。
【請求項８】
該Ｖｈ領域が、配列番号２０のアミノ酸３６から４５よりなる第１ Ｖｈ ＣＤＲ、配列番号２０のアミノ酸５０から６５よりなる第２ Ｖｈ ＣＤＲ、および配列番号２０のアミノ酸９８から１０７よりなる第３ Ｖｈ ＣＤＲを含み、
該Ｖｌ領域が、配列番号２１のアミノ酸２４から３３よりなる第１ Ｖｌ ＣＤＲ、配列番号２１のアミノ酸４９から５５よりなる第２ Ｖｌ ＣＤＲ、および配列番号２１のアミノ酸８８から９６よりなる第３ Ｖｌ ＣＤＲを含む、請求項３記載の結合タンパク質。
【請求項９】
該結合タンパク質が抗体である、請求項８記載の結合タンパク質。
【請求項１０】
該抗体がモノクローナル抗体である、請求項９記載の結合タンパク質。
【請求項１１】
該Ｖｈ領域が、配列番号２０、ヒト化された配列番号２０または脱免疫化（ｄｅ−ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）された配列番号２０のいずれかであり、該Ｖｌ領域が、配列番号２１、ヒト化された配列番号２１または脱免疫化（ｄｅ−ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）された配列番号２１のいずれかである、請求項９記載の結合タンパク質。
【請求項１２】
該結合タンパク質が、（ａ）該Ｖｈ領域、ならびにヒトヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３領域（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４サブタイプからのもの）を含む重鎖と、（ｂ）該Ｖｌ領域、およびヒトカッパＣＬまたはヒトラムダＣＬのいずれかを含む軽鎖とを含む抗体である、請求項８記載の結合タンパク質。
【請求項１３】
該重鎖が配列番号２２のアミノ酸配列より実質的になり、該軽鎖が配列番号２３のアミノ酸配列より実質的になる、請求項１２記載の結合タンパク質。
【請求項１４】
ｍＡｂ ＩＧ３．ＢＤ４標的領域、ｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１標的領域、ｍＡｂ １３Ｃ７．ＢＣ１およびｍＡｂ １３Ｇ１１．ＢＦ３標的領域よりなる群から選ばれる標的領域に結合する抗体可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む組換え遺伝子を含んでなる核酸。
【請求項１５】
該標的領域が、ｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１標的領域であり、該可変領域が、
配列番号２０のアミノ酸３６から４５またはアミノ酸３６から４５とは１つのアミノ酸が異なる配列を含む第１ Ｖｈ ＣＤＲ、
配列番号２０のアミノ酸５０から６５またはアミノ酸５０から６５とは１つのアミノ酸が異なる配列を含む第２ Ｖｈ ＣＤＲ、および
配列番号２０のアミノ酸９８から１０７またはアミノ酸９８から１０７とは１つのアミノ酸が異なる配列を含む第３ Ｖｈ ＣＤＲ
を含むＶｈ領域である、請求項１４記載の核酸。
【請求項１６】
該Ｖｈ領域が、配列番号２０のアミノ酸３６から４５よりなる第１ Ｖｈ ＣＤＲ、配列番号２０のアミノ酸５０から６５よりなる第２ Ｖｈ ＣＤＲ、および配列番号２０のアミノ酸９８から１０７よりなる第３ Ｖｈ ＣＤＲを含む、請求項１５記載の核酸。
【請求項１７】
該可変領域が、配列番号２０、ヒト化された配列番号２０または脱免疫化（ｄｅ−ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）された配列番号２０のいずれかである、請求項１４記載の核酸。
【請求項１８】
該組換え遺伝子が、該Ｖｈ領域、ヒトヒンジ、ならびにＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３領域（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４サブタイプからのもの）を含む抗体重鎖をコードする、請求項１７記載の核酸。
【請求項１９】
該可変領域が、
配列番号２１のアミノ酸２４から３３またはアミノ酸２４から３３とは１つのアミノ酸が異なる配列を含む第１ Ｖｌ ＣＤＲ、
配列番号２１のアミノ酸４９から５５またはアミノ酸４９から５５とは１つのアミノ酸が異なる配列を含む第２ Ｖｌ ＣＤＲ、および
配列番号２１のアミノ酸８８から９６またはアミノ酸８８から９６とは１つのアミノ酸が異なる配列を含む第３ Ｖｌ ＣＤＲ
を含むＶｌ領域である、請求項１４記載の核酸。
【請求項２０】
該第１ Ｖｌ領域が、配列番号２１のアミノ酸２４から３３よりなる第１ Ｖｌ ＣＤＲ、配列番号２１のアミノ酸４９から５５よりなる第２ Ｖｌ ＣＤＲ、および配列番号２１のアミノ酸８８から９６よりなる第３ Ｖｌ ＣＤＲを含む、請求項１９記載の核酸。
【請求項２１】
該可変領域が、配列番号２１、ヒト化された配列番号２１または脱免疫化（ｄｅ−ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）された配列番号２１のいずれかである、請求項１４記載の核酸。
【請求項２２】
該組換え遺伝子が、該可変領域およびヒトカッパまたはラムダＣＬを含む抗体軽鎖をコードする、請求項１７記載の核酸。
【請求項２３】
請求項１４〜２２のいずれか１項記載の１以上の核酸を含んでなる組換え細胞。
【請求項２４】
該細胞が請求項１８記載の核酸および請求項２２記載の核酸の両方を含む、請求項２３記載の組換え細胞。
【請求項２５】
抗体可変領域を含むタンパク質の製造方法であって、
（ａ）該タンパク質が発現される条件下、請求項２３記載の組換え細胞を増殖させ、
（ｂ）該タンパク質を精製する段階を含んでなる製造方法。
【請求項２６】
抗体可変領域を含むタンパク質の製造方法であって、
（ａ）該タンパク質が発現される条件下、請求項２４記載の組換え細胞を増殖させ、
（ｂ）該タンパク質を精製する段階を含んでなる製造方法。
【請求項２７】
請求項１〜１３のいずれか１項記載の結合タンパク質と医薬上許容される担体とを含んでなる医薬組成物。
【請求項２８】
溶液中または細胞上のＯＦＲ０６５７ｎ抗原の存在の検出方法であって、（ａ）請求項１〜１３のいずれか１項記載の結合タンパク質を該溶液または該細胞に加え、（ｂ）該溶液中に存在する該抗原への又は該細胞への該結合タンパク質の結合能を測定する段階を含んでなる検出方法。
【請求項２９】
請求項１〜１３のいずれか１項記載の結合タンパク質の有効量を患者に投与する段階を含んでなる、患者におけるスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染に対する治療方法。
【請求項３０】
該抗原結合タンパク質を手術または異物インプラントと共に投与する、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
ｍＡｂ １Ｇ３．Ｂ３、ｍＡｂ ２Ｈ２．Ｂ８、ｍＡｂ １３Ｃ７．Ｄ１２またはｍＡｂ １３Ｇ１１．Ｃ１１のいずれかであるタンパク質、またはＯＲＦ０６５７ｎへの結合に関してｍＡｂ ＩＧ３．Ｂ３、ｍＡｂ ２Ｈ２．Ｂ８、ｍＡｂ １３Ｃ７．Ｄ１２またはｍＡｂ １３Ｇ１１．Ｃ１１のいずれかと競合するタンパク質を産生する細胞系。
【請求項３２】
該系がＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−７１２４、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−７１２５、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−７１２６またはＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−７１２７のいずれかである、請求項３１記載の細胞系。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【公表番号】特表２００９−５２４４２８（Ｐ２００９−５２４４２８Ａ）
【公表日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５５２３５１（Ｐ２００８−５５２３５１）
【出願日】平成１９年１月２３日（２００７．１．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００１６８７
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０８９４７０
【国際公開日】平成１９年８月９日（２００７．８．９）
【出願人】（３９００２３５２６）メルク エンド カムパニー インコーポレーテッド (924)
【氏名又は名称原語表記】ＭＥＲＣＫ ＆ ＣＯＭＰＡＮＹ ＩＮＣＯＰＯＲＡＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１月２３日（２００７．１．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００１６８７
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０８９４７０
【国際公開日】平成１９年８月９日（２００７．８．９）
【出願人】（３９００２３５２６）メルク エンド カムパニー インコーポレーテッド (924)
【氏名又は名称原語表記】ＭＥＲＣＫ ＆ ＣＯＭＰＡＮＹ ＩＮＣＯＰＯＲＡＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]