ストレス抑制剤
【課題】 本発明は、乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９の新たな用途を提供することを目的とする。
【解決手段】 本発明によれば、乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９を有効成分とし、サイトカイン産生調節作用、感染防御作用、肥育作用又は下痢抑制作用に基づくストレス抑制剤が提供される。本発明によれば、さらに乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９を有効成分とする、サイトカイン産生調節剤、感染防御剤、肥育剤及び下痢抑制剤が提供される。
【解決手段】 本発明によれば、乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９を有効成分とし、サイトカイン産生調節作用、感染防御作用、肥育作用又は下痢抑制作用に基づくストレス抑制剤が提供される。本発明によれば、さらに乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９を有効成分とする、サイトカイン産生調節剤、感染防御剤、肥育剤及び下痢抑制剤が提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ストレス抑制剤に関し、より詳しくは、サイトカイン産生調節作用、感染防御作用、肥育作用又は下痢抑制作用に基づくストレス抑制剤に関する。本発明は、さらに、サイトカイン産生調節剤、感染防御剤、肥育剤及び下痢抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸菌は発酵により糖類から乳酸を生じる菌の総称であり、代表的なものとして、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）に属するものが知られている。これらの乳酸菌は、発酵食品の製造に用いられる他、消化管内の細菌叢を改善して宿主に有益な作用をもたらすプロバイオティクスとしての用途も注目されている。
【０００３】
近年、例えばもろみ濃縮液等のアルコール発酵にて副生する残渣に良好に生育し得る乳酸菌として、乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９が見出され、その病原菌に対する免疫増強作用が注目されている（特許文献１）。しかし、特許文献１では、マウスの死亡率による乳酸菌投与の優位性は明確になっているものの、人畜等での作用効果が実証されていないため、実用化に向けての課題が残っている。
【０００４】
免疫系は、組織の障害や、ウイルスや細菌等の病原性微生物、あるいは酸化ストレスから宿主を防御するための、種々の生体防御機構を備えている。免疫系は、病原性微生物等の外部刺激に対して、様々なサイトカイン、ケモカインを産生し、食細胞の動員、貧食作用の促進、リンパ球活性化、ＮＫ細胞の活性化等の応答を起こす。このようなサイトカインとしては、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、抗腫瘍性壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）等が挙げられる。
【０００５】
病原性微生物に対する感染防御反応においては、感染後数時間以内に働く自然免疫と、感染後数日から働く適応免疫がある。自然免疫は、抗原非特異的な反応であり、単球、マクロファージ、好中球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞等が関与している。また、適応免疫はＴリンパ球とＢリンパ球によって誘導される、抗原特異的な反応で、持続性を持つ。自然免疫で、特に誘導型自然免疫と呼ばれる応答では、病原性微生物の産物の刺激により、ＩＬ−１、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＦＮ−γを始めとした、様々なサイトカイン、ケモカインが産生される。これにより、食細胞の動員、貧食作用の促進、リンパ球活性化、ＮＫ細胞の活性化等の局所的な生態防御反応が起こることが分かっている。
【０００６】
これらサイトカインのうち、ＩＬ−１、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１８、ＩＦＮ−γ等炎症性サイトカインとも呼ばれるサイトカインが過剰産生されることによって、急性期応答と呼ばれる炎症、発熱、潰瘍、浮腫、アレルギー、関節炎等を引き起こし、さらには全身性ショック、播種性血管内凝固症候群等の害を及ぼすことも知られている（非特許文献１）。また、これらの炎症性サイトカインは様々なストレスによっても産生されることが明らかとなっている（非特許文献２）。マウスにおいては、拘束ストレスによってＩＦＮ−γの産生が増加することも知られている（非特許文献３）。
【０００７】
しかし、乳酸菌を主要成分として人や家畜への投与試験を行い、サイトカイン産生抑制効果を調べた報告はこれまで知られていない。
【０００８】
【特許文献１】特開２００５−２１１５６号公報
【非特許文献１】Ｊａｎｅｗａｙ，Ｃ．Ａ．Ｊｒ，笹川健彦訳、「免疫生物学」（原著第５版）、２００３
【非特許文献２】Ｍａｅｓ，Ｍ．ら、「Ｉｎ ｈｕｍａｎｓ，ｓｅｒｕｍ ｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｌｅｖｅｌｓ ｐｒｅｄｉｃｔ ｔｈｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｏｆ ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｔｏ ｐｓｙｃｈｏｌｏｇｉｃ ｓｔｒｅｓｓ」、Ｂｉｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ．、Ｖｏｌ．４７、ｐｐ９１０−９２０（２０００）
【非特許文献３】吉光仁美ら、「拘束ストレスによるアトピー性皮膚炎悪化の分子機構」、日本獣医学会第１４４回大会講演要旨集、ｐｐ５３（２００７）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９は、付加価値が低く廃棄物として処理されていたアルコール発酵後の蒸留残渣の有効利用に役立つことから、その用途の拡大が期待されている。そこで、本発明は、乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９の新たな用途を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９の新規用途について検討を重ねたところ、乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９が、サイトカイン産生調節作用、感染防御作用、肥育作用及び下痢抑制作用を発揮し、これらに基づきストレス負荷を抑制できることを見出した。これまで、ストレス変動をモニタリングし、かつ当該モニタリング結果より、明確かつ有用なストレス抑制効果を実証した、ストレス抑制剤は、見出せていなかった。本発明者らは、多くの個体で乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９を投与し、経時的に炎症性サイトカインを測定することにより、群ごとのストレス変動を明確にモニタリングし、その結果、新たにストレス抑制による効果として、有用な、サイトカイン産生調節作用、感染防御作用、肥育効果、下痢抑制効果を見出した。例えば、乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９を子豚に投与することによって、ストレス状態にある離乳期では、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６等の炎症性サイトカインの過剰な産生を抑制し、また、大腸菌リポポリサッカライド（ＬＰＳ）で模擬感染させた子豚において、感染防御機能を発揮すると共に、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６等の炎症性サイトカインの急激な増加を抑制し、これによって過剰な炎症反応を抑制することを見出した。本発明者らはまた、乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９による子豚に対する肥育作用及び下痢抑制作用も見出した。本発明のストレス抑制剤は、さらに、ストレスが起因となる家畜死廃率に対する低下効果も示している。
【００１１】
すなわち、本発明は、乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９を有効成分とし、サイトカイン産生調節作用、感染防御作用、肥育作用又は下痢抑制作用に基づくストレス抑制剤を提供するものである。本発明のストレス抑制剤によれば、離乳や環境変化によるストレスがかかった場合において、サイトカイン産生調節作用、感染防御作用、肥育作用又は下痢抑制作用を通じて、ストレス負荷を抑制することができる。
【００１２】
本発明はまた、乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９を有効成分とする、サイトカイン産生調節剤、感染防御剤、肥育剤及び下痢抑制剤を提供する。
【００１３】
乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９は、各種ストレスが負荷された場合において、サイトカインの過剰な産生を抑制する機能を有する。なお、ここのサイトカイン産生抑制効果は、乳酸菌と腸管免疫系との穏やかな相互作用によるものであり、急激な免疫抑制や病的な反応を示すものではない。本発明は、実際に生体への投与試験を行い、乳酸菌によるサイトカイン産生抑制効果を検証した初めての発明である。また、乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９を投与することにより、宿主の非特異的生体防御反応を高めつつ、過度なサイトカインの産生を抑制するため、病原の感染を防御するとともに、疾病等による損耗を最小限に抑えることが可能になる。また、肥育期における豚等の家畜の体重増加率を向上させることができ、発育促進作用を発揮し、これにより家畜の平均出荷日齢が短縮される。さらに、家畜の下痢発生率、及び死廃率（事故率と淘汰率との合計）を低減させることができる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９の新規用途が提供される。具体的には、乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９を有効成分とし、サイトカイン産生調節作用、感染防御作用、肥育作用又は下痢抑制作用に基づくストレス抑制剤が提供される。本発明によれば、さらに乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９を有効成分とする、サイトカイン産生調節剤、感染防御剤、肥育剤及び下痢抑制剤が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
【００１６】
本発明のストレス抑制剤は、乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９を有効成分とし、サイトカイン産生調節作用、感染防御作用、肥育作用又は下痢抑制作用に基づいてストレスを抑制するものである。
【００１７】
ここでストレスとは、ストレスを引き起こす外部刺激であるストレッサーにより生じた生体の非特異的反応を意味し、ストレッサーとしては、温度、圧力、浸透圧、紫外線、放射線、音、電磁波等の物理的ストレッサー、薬物、有害物質、飢餓、酸化、酸素欠乏等の化学的ストレッサー、細菌やウイルスの侵入等の生物学的ストレッサー、精神的苦痛、精神的緊張等の精神的ストレッサーが挙げられる。
【００１８】
ストレス抑制とは、ストレッサーにより生じた生体の非特異的反応を抑制することを意味し、生体の非特異的反応としては、生体内のコルチゾールやＣ反応性蛋白質、炎症性サイトカインの上昇がみられ、症状として食欲減退、消化不良、不眠、体調不良などが表れる。特に家畜の場合は、沈静化、軟便、下痢、発育不良、肥育不良などとして表れる。そのため、結果としてストレッサー存在下では、外的刺激に対する抵抗力が落ち、感染症などが起こりやすくなる。一方、ストレスを抑制することで、これら症状を緩和することが期待できる。
【００１９】
本発明におけるストレス抑制の一形態としては、例えば離乳や環境変化等の物理的又は精神的ストレッサーや、病原感染等の生物学的ストレッサーを受けた場合に起こる、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６等のサイトカインの過剰な産生を抑制し、病原感染を効果的に防御すると共に、過剰な炎症反応を抑え、疾病等による損耗を最小限に抑えることによってストレスを抑制する形態が挙げられる。この形態は、サイトカイン産生調節作用、感染防御作用に基づくストレス抑制に該当する。本発明におけるストレス抑制の別の形態としては、家畜等の肥育を促進することによって、物理的、化学的、生物的又は精神的ストレッサーに対する耐性を向上させ、それによりストレスを抑制する形態である。さらに他の形態では、家畜等の下痢発生率及び死廃率を低減させることによって、家畜等の健康な発育を促進し、その結果ストレッサーに対する耐性を向上させる形態である。
【００２０】
乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９は、ラクトバチルス・パラカセイ・サブスピシズ・パラカセイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｐａｒａｃａｓｅｉ）に属し、独立行政法人産業技術総合研究所・特許生物寄託センターに、ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９として寄託されている乳酸菌である。
【００２１】
乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９は、ラクトバチルス・パラカセイ・サブスピシズ・パラカセイの標準株であるＬ．ｐａｒａｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｐａｒａｃａｓｅｉ ＮＢＲＣ １５８８９とは多くの糖質では類似の資化パターンを示すが、いくつかの糖質では発酵性が異なる。即ち、ＡＰＩ５０ＣＨ（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ社製）システムを用いた糖発酵性試験では、ＮＢＲＣ １５８８９は、糖基質がソルボース及びイヌリンである場合、微陽性を示し、糖基質がソルビトール及びグルコン酸塩である場合、陽性を示すことに対して、ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９は、糖基質がソルボース、ソルビトール及びイヌリンである場合陰性を示し、糖基質がグルコン酸塩である場合のみ、微陽性を示す。乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９は、ＡＰＩ５０ＣＨ（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ社製）システムを用いた糖発酵性試験、または抽出したゲノムＤＮＡを用いた、１６ＳｒＤＮＡ遺伝子解析により、遺伝子配列を調べることによって、同定することができる。
【００２２】
乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９の培養は、一般的な乳酸菌培養用培地及び条件で行われていれば特に限定されない。例えば、天然培地、合成培地又は半合成培地等を用いることができる。培地としては、窒素源および炭素源を含有するものであればよく、また、各種無機質を添加してもよい。培地のｐＨは４．０〜８．０が好ましく、より好ましくは５．０〜７．０である。培養温度は１０．０〜４５．０℃が好ましく、より好ましくは２０．０〜４０．０℃である。培養時間は２４〜９６時間程度であり、通気又は嫌気培養してもよい。具体的には、例えば、ＭＲＳ培地（Ｄｉｆｃｏ ＭＲＳ ｂｒｏｔｈ）を用いて、３７℃にて、静置培養することができる。また、ＭＲＳ培地に１．５％の寒天を添加し、ガスパック嫌気培養システム（三菱ガス化学株式会社製）を用いて、３７℃で培養することもできる。凍結乾燥保存菌を使用する場合、菌に生理食塩水、またはＭＲＳ培地を加えて復元し、ＭＲＳ寒天平板培地に塗抹し、３７．０℃で培養した後、液体培地又は寒天培地に継代培養することによって培養することができる。
【００２３】
乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９は、温度耐性及びアルコール耐性を有する。また、一般的な乳酸菌培養用培地の他、アルコール発酵・蒸留残液の２．５〜３．０倍濃縮液（もろみ濃縮液）に良好に生育することができる。もろみ濃縮液を使用することで、乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９を培養できると共に、このような残液を有効利用することもできる。このようなもろみ濃縮液として、例えば、サトウキビ窄汁液の蔗糖採取後の糖蜜をアルコール発酵させ、蒸留した後の残液の濃縮液が好ましく用いられる。また、もろみ濃縮液の２〜８倍蒸留水希釈液（希釈倍率は容積比とする）を使用することが好ましく、２倍蒸留水希釈液が特に好ましい。
【００２４】
本発明のストレス抑制剤に含まれる乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９は、生菌であってもよく、加熱処理やＵＶ、ホルマリン処理等により不活性化した菌であってもよく、特に生菌が好ましい。乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９は、乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９による発酵生産物とともに存在していてもよい。すなわち、本発明のストレス抑制剤は、乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９による発酵生産物を含有していてもよい。
【００２５】
本発明のストレス抑制剤は、液剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、散剤、丸剤、細粒剤、トローチ錠等の経口剤、直腸投与剤等の局所投与剤とすることができる。また、胃酸による影響を低減するために、腸溶剤とすることも好ましい。本発明のストレス抑制剤は、乳酸菌のみからなるものであってよく、また、薬学的に許容できる添加剤又は担体、例えば、賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤化剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、矯味矯臭剤、安定化剤等を含んでよく、必要があれば、他の乳酸菌を含有してもよい。
【００２６】
本発明のストレス抑制剤は、例えば、以下のように製造することができる。まず、乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９を適切な培地によって増殖培養し、次に、培養した乳酸菌を自然沈降又は遠心分離等によって回収する。続いて、回収した乳酸菌は、１×１０１０〜２×１０１１ＣＦＵ／ｇとなるように培養上清で希釈、調整する。これをそのまま液状で用いる他、スキムミルク、乳糖等の保護剤を添加した後、凍結乾燥法、スプレードライ法、噴霧造粒法、または打錠法により粉状もしくは錠剤状に加工する。具体的には、等量の２０％スキムミルク液と混合し、噴霧造粒法で粉状に加工することが好ましい。これを４℃にて保存する。このような方法で製造されるストレス抑制剤は、５×１０８ＣＦＵ／ｇ以上の生菌数を示し、４℃で保存することによって３６０日間、１×１０８ＣＦＵ／ｇ以上の生菌数を維持することができる。
【００２７】
本発明のストレス抑制剤は、サイトカイン産生調節作用、感染防御作用、肥育作用又は下痢抑制作用に基づくストレス抑制作用を有するため、ストレス低減を必要とする治療又は病気の予防に使用することができる。例えば、環境変化や細菌侵入、心労等に代表される物理的や、化学的、生物学的及び精神的なストレッサーを受けた場合、使用することができる。
【００２８】
本発明のストレス抑制剤の投与量は、投与対象、個々の症状や年齢、体重等に応じて、適宜に決定することが好ましい。例えば、豚の場合、一日の投与量は１．０×１０７〜５．０×１０９ＣＦＵ／頭であることが好ましい。本発明のストレス抑制剤を豚に投与した場合、ストレスを抑制でき、病原に感染しても過剰な炎症性サイトカインを産生することなく、病原を防御することができ、また、肥育効果、下痢抑制効果も期待できる。
【００２９】
本発明のストレス抑制剤を含有させることにより、家畜用飼料添加剤が提供される。家畜用飼料添加剤は、乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９を有効成分とするストレス抑制剤のみからなるものであってよく、他の一般的な飼料添加剤、例えば、ミネラル、ビタミン、アミノ酸、食物繊維等を含んでもよい。この家畜用飼料添加剤は、固形、液体又はゲル等の半固形とすることができる。保存性の観点から、固形又は半固形が好ましい。
【００３０】
家畜用飼料添加剤の使用量は家畜の種類（豚、牛、綿羊、山羊、鶏、鴨、ガチョウ、鶉、犬、猫等）や体重に応じて適宜決定でき、豚の場合、一日の投与量は、乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９の量が１．０×１０７〜５．０×１０９ＣＦＵ／頭となるようにすることが好ましい。また、豚の離乳期若しくは肥育期によって、又は環境変化によって適宜に増減することが好ましい。本発明の家畜用飼料添加剤を豚用飼料に添加し、豚を飼育した場合、豚のストレスを抑制でき、病原に感染して過剰な炎症性サイトカインを産生することなく、病原防御することができ、また、肥育効果及び下痢抑制効果も期待できる。
【００３１】
本発明のストレス抑制剤を含有させることにより、機能性食品や特定保健用食品をも提供できる。食品の形態としては、ヨーグルト、ドリンクヨーグルト、ジュース、コーヒー、スポーツ飲料、牛乳、豆乳、酒類等の各種飲料や、プリン、ゼリー、ケーキ、冷菓等の菓子類、チーズ、バター等の乳製品等が挙げられる。このような食品に含まれる乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９の量は、ストレスを抑制することができる量であればよい。
【００３２】
本発明の食品を一定の期間摂取すると、例えば、心労、肉体疲労や環境変化等の各種ストレッサーを受けた場合、病原感染しても、炎症性サイトカインの過剰な産生を抑制でき、それによって病原感染を効果的に防御できると共に、過剰な炎症反応を抑えて、ストレスを抑制することができ、ストレスに強い健康な身体とすることができる。
【００３３】
乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９を有効成分とすることで、サイトカイン産生調節剤、感染防御剤、肥育剤及び下痢抑制剤が提供される。
【００３４】
サイトカイン産生調節剤は、炎症性サイトカインの過剰な産生を抑制し、疾病等による損耗を最小限に抑えることができるため、特に、ストレス等、炎症性サイトカインの過剰分泌に関連する疾患に適用することができる。サイトカイン産生調節剤の投与量は、個々の症状や年齢、体重等に応じて、適宜に決定することが好ましい。例えば、豚の場合、一日の投与量は１．０×１０７〜５．０×１０９ＣＦＵ／頭が好ましい。
【００３５】
感染防御剤は、病原感染を効果的に防御すると共に、炎症性サイトカインの過剰な産生を抑制することができるため、特に、微生物、ウイルス、寄生虫等の感染症による、発熱、下痢等の疾患に適用することができる。感染防御剤の投与量は、個々の症状や年齢、体重等に応じて、適宜に決定することが好ましい。例えば、豚の場合、一日の投与量は１．０×１０７〜５．０×１０９ＣＦＵ／頭であることが好ましい。
【００３６】
肥育剤は、炎症性サイトカインの過剰産生を抑制し、病原感染を効果的に防御すると共に、肥育効果を発揮するため、特に、豚、牛、綿羊、山羊、鶏、鴨、ガチョウ、鶉、犬、猫等の飼育に適用することができる。肥育剤の投与量は、必要に応じて、適宜に決定することが好ましい。例えば、豚の場合、一日の投与量は１．０×１０７〜５．０×１０９ＣＦＵ／頭であることが好ましい。
【００３７】
下痢抑制剤は、炎症性サイトカインの過剰産生を抑制し、病原感染を効果的に防御すると共に、下痢抑制効果を発揮するため、特に、豚、牛、綿羊、山羊、鶏、鴨、ガチョウ、鶉、犬、猫等の飼育に適用することができる。下痢抑制剤の投与量は、必要に応じて、適宜に決定することが好ましい。例えば、豚の場合、一日の投与量は１．０×１０７〜５．０×１０９ＣＦＵ／頭であることが好ましい。
【００３８】
以下、本発明の好適な実施例についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３９】
（製造例１）乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９粉状製剤の製造
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９をもろみ濃縮液（蒸留水希釈液）培地によって増殖培養し、培養した乳酸菌を遠心分離によって回収した。続いて、回収した乳酸菌は、１．０×１０１０〜１．０×１０１１ＣＦＵ／ｇとなるように、培養上清で希釈した。これを等量の２０％スキムミルク液と混合し、噴霧造粒法で粉状製剤に加工した。得られた乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９粉状製剤は、生菌として３．０×１０８〜３．０×１０９ＣＦＵ／ｇの乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９を含むものであった。上記製剤を試験まで４℃にて保存し、４℃で３６０日間保存した場合、１．０×１０８〜３．０×１０８ＣＦＵ／ｇ以上の生菌数を維持した。
【００４０】
（実施例１）乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９によるサイトカイン産生調節作用
哺乳期の子豚に乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９を投与し、乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９による離乳期におけるサイトカイン産生調節作用について試験した。
【００４１】
実施例１〜３において、同じ母豚から１回の分娩で生まれた子豚を１腹とし、１腹が８頭以上の場合の子豚のみを供試豚として採用した。１群を３腹とし、子豚を非投与群（ｎ＝３３）、強制投与群（ｎ＝２７）、及び自由摂取群（ｎ＝２９）に分け、分娩ごとに順次試験を行った。また、各群の子豚の品種は、非投与群ではＷ種（ｎ＝１０）又はＷＬＤ種（ｎ＝２１）、強制投与群ではＷ種（ｎ＝４）又はＷＬＤ種（ｎ＝２２）、自由摂取群ではＷ種（ｎ＝１２）又はＬＤ種（ｎ＝１６）であった。なお、Ｗ種は大ヨークシャー種を、Ｌ種はランドレース種を、Ｄ種はデュロック種を、ＬＤ種は二元交雑種を、そして、ＷＬＤ種は三元交雑種を示す。
【００４２】
試験期間は、哺乳初期（２２日間）及び哺乳後期（１４±２日間）の３６±２日間であった。各群の子豚を４週齢（２８日）まで分娩豚舎で飼育し、離乳後、母豚のみを移動させた。飼育は、哺乳初期には母乳＋代用乳飼育、哺乳後期には母乳＋人工乳飼育で行った。代用乳及び人工乳としては、それぞれモアアップ バースデーミルク（伊藤忠飼料株式会社製）及びモアアップ エツケ（伊藤忠飼料株式会社製）を用い、共に他の乳酸菌が添加されていないものであった。
【００４３】
製造例１で得られた乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９製剤を、強制投与群及び自由摂取群共に、生菌として、哺乳初期に１．０×１０９ＣＦＵ／頭／日、哺乳後期に３．０×１０９ＣＦＵ／頭／日になるよう投与した。強制投与群に対しては、乳酸菌製剤を温湯に希釈し、哺乳初期１日１回３ｍＬずつ、哺乳後期は１日１回９ｍＬずつ経口投与した。自由摂取群に対しては、朝夕２回に分け、人工乳に混ぜて給与した。
【００４４】
試験期間中、毎週子豚の体重を測定し、臨床症状も随時記録した。飼育期間の３６±２日間中、非投与群で２頭、強制投与群で１頭、自由摂取群で１頭の事故死豚が出たため、これらは試験から除外した。なお、事故死とは、母豚による圧死、虚弱死、寒冷死、病死等による子豚や肥育豚の死を意味する。群ごとの体重変化を図１に示す。図１から、非投与群（ｎ＝３１）、強制投与群（ｎ＝２６）及び自由摂取群（ｎ＝２８）の中、自由摂取群の体重増加が最も大きかったが、有意差は認められなかった。
【００４５】
サイトカイン産生量は、子豚血漿試料を用いて、サンドイッチＥＬＩＳＡ法で測定した。ＴＮＦ−αの測定には、固定化抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体とビオチン標識抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体を利用したＳｗｉｎｅ ＴＮＦ−α ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ社製）を使用した。ＩＦＮ−γの測定には、固定化抗ＩＦＮ−γモノクローナル抗体とビオチン標識抗ＩＦＮ−γモノクローナル抗体を利用したＳｗｉｎｅ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｇａｍｍｍａ（ｓｗＩＦＮ−γ）ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ社製）を使用した。ＩＬ−６の測定には、固定化抗ＩＬ−６ポリクローナル抗体とホースラディッシュパーオキシダーゼ標識抗ＩＬ−６ポリクローナル抗体を利用したＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ（商標）、Ｐｏｒｃｉｎｅ ＩＬ−６ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用した。その後、マイクロプレートリーダー（テカン社製）で検出、測定を行った。なお、採血は、子豚離乳２日前、２日後及び９日後にそれぞれ頚静脈より行った。採取された血液をヘパリン処理し、１０ｍＬのヘパリン血を得た。ヘパリン処理血を３ｍＬずつ３本に分けた後、うちの２本に、Ｃａｒｓｔｅｎｓｅｎら（Ｃａｒｓｔｅｎｓｅｎ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２００５）．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ ｉｎ ｐｉｇｌｅｔｓ ａｒｏｕｎｄ ｗｅａｎｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ａｎ ｅｘ ｖｉｖｏ ｗｈｏｌｅ ｂｌｏｏｄ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ． Ｖｅｔ． Ｉｍｍｕｎｏ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．１０５，ｐｐ５９−６６）の方法を参考にリポポリサッカライド（ＬＰＳ；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ０５５：Ｂ５、ＳＩＧＭＡ社製）を５０μｇ／（ｍＬ血液）の濃度で添加した。３９℃で、２時間又は２０時間インキュベート後、１０，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し、得られた上清をＬＰＳ刺激あり（ＬＰＳ２時間又はＬＰＳ２０時間）の血漿試料とした。残りの１本は、ＬＰＳを添加せず、速やかに遠心分離し、得られた上清をＬＰＳ刺激なし（ＬＰＳ０時間）の試料とした。試料は全て−８０℃にて保存した。
【００４６】
サイトカインの分析は、まず、ＬＰＳ刺激の有無及びＬＰＳの処理時間による影響を調べるために、各群にオスとメス２頭ずつを用いて予備試験を行った。その結果、ＴＮＦ−αの場合、ＬＰＳ２０時間よりもＬＰＳ２時間の方が高い値を示した。また、ＬＰＳ０時間ではほとんどが検出限界以下であった。ＩＬ−６の場合も、ＬＰＳ０時間ではほとんど検出されなかったが、ＬＰＳ２時間よりもＬＰＳ２０時間で１０倍近く高い値を示した。ＩＦＮ−γの場合、ＬＰＳ刺激の有無に関わらず、ほとんどが検出限界以下であった。以上より、ＬＰＳ刺激なしでは、これらのサイトカインは産生しないことが分かった。このことから、本試験では、ＴＮＦ−αをＬＰＳ２時間の試料、ＩＬ−６をＬＰＳ２０時間の試料を用いて分析を行ったが、ＩＦＮ−γについては分析を行わなかった。
【００４７】
サイトカインごとに得られた約３００サンプルのデータのうち、ＥＬＩＳＡで不具合が生じた試料、及びＴＮＦ−αとＩＬ−６との両方で明らかに高い数値を示した試料は、解析から除外した。データの解析は独立２群に対して二標本ｔ検定によって群間の比較を行った。Ｆ検定によりデータの分散が等分散とみなせない場合はＷｅｌｃｈ法を適用した。統計的有意差はｐ＜０．０５の場合を有意差ありとした。
【００４８】
非投与群（ｎ＝２６）、強制投与群（ｎ＝２３）、及び自由摂取群（ｎ＝２５）の解析結果を図２に示す。図２から、ＴＮＦ−αは、強制投与群で離乳２日後において、自由摂取群で離乳２日後及び９日後において、非投与群に比べて有意に低い値を示した。一方、離乳９日後において、強制投与群の値が非投与群よりも高かった。また、ＩＬ−６は、いずれの試験日においても、強制投与群及び自由摂取群では非投与群に比べて有意に低い値を示し、特に自由摂取群の方が高い有意差を示した。
【００４９】
非投与群では、ＴＮＦ−αが試験期間を通して全体的に高い値を示した。これは、子豚が離乳ストレッサーを強く受けたためだと考えられる。一方、乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９の投与によって、ＴＮＦ−αが有意に減少したことから、乳酸菌投与が離乳ストレッサーによるストレスを低減させたことが示唆された。
【００５０】
強制投与群が離乳９日後で上昇した理由については、強制投与によるストレスや他のストレス、又は何らかの病原体の感染によるものではないかと考えられる。また、ＩＬ−６についても、非投与群で離乳２日後にＩＬ−６が上昇せず、いずれの試験日においても高い値を示したことは、子豚には離乳によるストレス以外にも何らかのストレスがかかっていたことが考えられる。今回の試験期間は６月１２日から８月１７日の間であることを考えれば、暑さに弱い豚にとって高温ストレッサーを受けた可能性があった。
【００５１】
非投与群の値が高く、また標準偏差が大きいのに対して、強制投与群、自由摂取群は数値が有意に低く、標準偏差も小さい値を示したことから、乳酸菌投与によって、離乳ストレス以外の何らかの環境によるストレスに対しても効果があり、試験群の子豚の健康状態を安定して維持することが示唆された。また、自由摂取群の方が強制投与群よりも効果が高く、増体も他の群より良好だったことから、自由摂取群は強制投与によるストレスを受けないため、豚への負荷が少ないことが推測された。
【００５２】
（実施例２）乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９による感染防御作用
哺乳期の子豚に乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９を投与し、乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９による離乳期における感染防御作用について試験した。
【００５３】
実施例１と同様に乳酸菌投与を行った。５週間の投与試験終了後の二元又は三元交雑種の子豚を用いて試験を行った。非投与群、強制投与群及び自由摂取群は、各２腹から、オス、メス各６頭ずつ選び、体重が均等になるように２群に分け、一方をＬＰＳ接種区、もう一方をＬＰＳ非接種区とした。
【００５４】
乳酸菌投与試験が終了した５週目の子豚に対して、ＬＰＳ接種前の採血を行った。その後、Ｎａｋａｊｉｍａら（Ｎａｋａｊｉｍａ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２０００）．Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｅｎｄｏｔｏｘｅｍｉｃ ｌｅｓｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｌｉｖｅｒ ａｎｄ ｋｉｄｎｅｙｓ ｏｆ ｐｉｇｌｅｔｓ． Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ．６２，ｐｐ６２１−６２６）の方法を参考に、ＬＰＳ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ０５５：Ｂ５、ＳＩＧＭＡ社製）２．５ｍｇを１０ｍＬのＰＢＳに溶解し、投与量が２０μｇ／ｋｇになるよう耳静脈に接種し、模擬感染を行った。非接種区にはＰＢＳのみを接種した。その後、１．５、３、６、１２、２４時間後に、頚静脈から採血し、ヘパリン処理後、実施例１と同様に遠心分離し、得られた血漿試料を−２０℃で保存した。
【００５５】
血漿中のＴＮＦ−α、ＩＬ−６及びＩＦＮ−γについて、ＬＰＳ接種による経時的な変化を、実施例１に記載の方法に従ってＥＬＩＳＡで測定した。また、ＬＰＳ接種による臨床症状についても記録した。
【００５６】
試験に用いた子豚の平均体重は、非投与群、強制投与群及び自由摂取群でそれぞれ、１２．４ｋｇ、９．７ｋｇ、及び１１．１ｋｇであった。試験期間中、臨床症状を示した子豚は認めなかった。サイトカインごとに得られた約２２０サンプルの分析を行った。そのうち、ＥＬＩＳＡで明らかに異常な数値を示した試料は、解析から除外した。データの解析は独立２群に対して二標本ｔ検定によって群間の比較を行った。統計的有意差はｐ＜０．０５の場合を有意差ありとした。
【００５７】
解析の結果を図３に示す。図３から、ＬＰＳの接種によって、子豚血漿中のＴＮＦ−α、ＩＬ−６、及びＩＦＮ−γは急激に上昇し、１．５時間又は３時間でピークを迎えた後、６時間後には試験前の値にまで減少したことが分かった。ＴＮＦ−αは、１．５時間で最大値を示し、非投与群及び強制投与群において１０μｇ／ｍＬ以上の高い値を示したのに対し、自由投与群は、１．５時間でＴＮＦ−αの上昇が認められたものの、他群に比し有意に低い値を示した（図３の（Ａ））。
【００５８】
ＩＬ−６の産生も、ＬＰＳ接種後、一過性の増加と減少を示したが、強制投与群及び自由摂取群では１．５時間でピークを迎えたのに対し、非投与群はさらに増加して、３時間でピークを示した後減少に転じ、３時間目において非投与群と自由摂取群とにおいて有意差が認められた（ｐ＜０．０５）（図３の（Ｂ））。
【００５９】
また、ＩＦＮ−γはＬＰＳ接種によって誘導されることが確認され、３時間目において強制投与群及び自由摂取群では、非投与群に対して有意に低い値を示した（図３の（Ｃ））。
【００６０】
ＰＢＳのみを接種したＬＰＳ非接種区では、これらのサイトカインの産生はほとんど認められなかった。
【００６１】
以上の結果より、ＬＰＳ接種による模擬感染の刺激によって、まず、ＴＮＦ−αが急激に産生され、その後、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γが続けて産生され、６時間以内に免疫応答が終了することが分かった。これらのサイトカインは、炎症性サイトカインとして、感染防御に働く一方、発熱や全身性ショックといった、過剰な炎症を体内に引き起こすことが知られている。今回の試験によって、乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９は、これらのサイトカインの急激な産生を抑制したことから、感染防御として産生されるサイトカイン量を調節し、過剰な炎症を抑制していることが示唆された。
【００６２】
（実施例３）乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９による肥育作用
肥育期の子豚に乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９を投与し、その肥育作用について試験した。
【００６３】
子豚を非投与群（ｎ＝３０）、強制投与群（ｎ＝３３）及び自由摂取群（ｎ＝２８）に分け、１群を３腹とした。メスの品種はＷ又はＬＷであり、オスの品種はＤ又はＷであった。子豚を４週（２８日）まで分娩豚舎で飼育し、離乳後、母豚のみ移動させた。
【００６４】
試験期間は３０ｋｇに到達した豚に対し、出荷（１１０ｋｇ）までの８３〜９７日間であった。肥育期間を３０〜５０ｋｇ期（Ｉ期）、５０〜９０ｋｇ期（ＩＩ期）、９０〜１１０ｋｇ期（ＩＩＩ期）の３期に分け、製造例１で得られた乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９製剤を、生菌として、Ｉ期では１．０×１０９ＣＦＵ／頭／日、ＩＩ期では２．０×１０９ＣＦＵ／頭／日、ＩＩＩ期では３．０×１０９ＣＦＵ／頭／日、新産肉能力検定用飼料（ＴＤＮ７４．５％以上、ＣＰ１４．５％以上、株式会社杉治商会製）に混ぜ、自由摂取させた。
【００６５】
試験期間中、毎週子豚の体重を測定し、臨床症状についても随時記録した。豚の発育状況を表１及び図４の（Ａ）に示す。肥育期間中、非投与群において、下痢を起こすブタが４頭中２頭観察され、１頭は４回下痢症状を示し、計７日間下痢治療のために複合生菌剤を投与した他、もう１頭は、下痢症状と発熱症状同時に示し、アンピシリン、スリピリンによる治療を行った。しかし、投与群ではこのような症状を示す豚は認められなかった。表１から、出荷日齢は、非投与群で１５９．８日、投与群で１５６．３日であり、また、出荷時体重は、非投与群で１１１．４ｋｇ、投与群で１１３．４ｋｇであった。有意差はなかったものの、投与群では約３日（２．２％）早く、体重が２ｋｇ（１．８％）重く、出荷されたことが分かった。
【００６６】
【表１】
【００６７】
肥育期間中の１日の平均増体量を表２及び図４の（Ｂ）に示す。表２から、３０ｋｇからの１日平均体重増加（増体量）は、肥育前期及び肥育後期では共に、投与群で高い傾向が認められた。特に、肥育後期において、非投与群の１日の平均増体量が９１８．４ｇであったのに対し、投与群では１０３０．６ｇであり、投与群は非投与群に比べて１２．２％多く増加したことが分かった。
【００６８】
【表２】
【００６９】
以上の結果から、乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９の投与による肥育効果があることが証明された。特に肥育後期の増体率に効果があることが明らかとなった。乳酸菌自体は、肥育を促す高カロリーな栄養成分はなく、また、今回与えた乳酸菌の添加量が餌に対して１％以下であることから、乳酸菌の投与によるストレス抑制作用が、豚の健康な発育に貢献したと考えられる。
【００７０】
（実施例４）哺乳期及び離乳期の子豚への乳酸菌投与試験
乳酸菌製剤の投与による、哺乳期及び離乳期の子豚の事故率（事故死率）低減作用、下痢抑制作用、肥育作用について検討した。
【００７１】
試験は、母豚約４００頭の中規模養豚農家（千葉県）にて実施した。同じ母豚から１回の分娩で生まれた子豚を１腹とし、６日間以内に産まれた１腹が７頭以上の場合の子豚のみを供試豚として採用した。群構成は、哺乳期は腹ごとに、非投与群８腹（ｎ＝８１）、投与群７腹（ｎ＝７９）、その後、離乳期は群分けにより１５頭×４部屋に分け、非投与群（ｎ＝６０）、投与群（ｎ＝６０）で行った。子豚の品種は全てＬＷＤ種３元交雑種であった。なお、Ｌ種はランドレース種、Ｗ種は大ヨークシャー種、Ｄ種はデュロック種を示す。
【００７２】
試験期間は哺乳期後期（生後１４日目から４０日目までの２７日間）及び離乳期（生後４１日目から８８日目までの４８日間）に分けて行った。分娩後子豚は腹ごとに分娩舎で飼育し、離乳（２８日目）後、母豚のみを移動させた。４１日目に離乳舎へ移動し、１５頭ずつ４部屋に体重がほぼ同じになるよう群分けを行った。生後１３日目までは母乳で飼育し、１４日目からは母乳と市販の人工乳ＰＨ ５（日清丸紅飼料株式会社製）、２８日目から人工乳のみ、４１日目からは配合飼料カスタマーＬ（日清丸紅飼料株式会社製）に切り替え飼育した。子豚は常に自由飲水、不断給与で飼育した。
【００７３】
製造例１で得られた乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９製剤を、哺乳期は人工乳に１重量％添加し、離乳期は配合飼料に０．１重量％添加し、自由摂取とした。
【００７４】
子豚は、分娩時、離乳時、及び肥育舎移動時の３回体重を測定した。また、臨床症状は随時記録した。哺乳期に下痢が確認された時は、その子豚のいる豚房にスタローサンＦ（共立製薬社製）を適量撒き、床の乾燥と汚濁防止処理をすることで飼養環境を改善した。また、離乳期に何らかの臨床症状を示した子豚には、抗生物質（アンピシリン、カナマイシン）の注射により治療とした。さらに、試験終了時に各部屋から３頭ずつ、各群１２頭から採血し、実施例１と同様にサイトカイン産生量を測定した。
【００７５】
試験期間中の群ごとの事故率（圧死をのぞく）は図５に示す。試験期間７５日間中、圧死以外の事故率は哺乳期において、非投与群（ｎ＝７５）で３．９％、投与群（ｎ＝７５）で１．３％、離乳期において、非投与群（ｎ＝６０）で１．７％、投与群（ｎ＝６０）で０％であった。投与群では非投与群に比べて、哺乳期の事故率が１／３に減少し、離乳期においても低い傾向がみられた。圧死以外の事故死は、虚弱や病気感染によるものが多いと考えられるため、投与群の圧死以外の事故率が減少したことは、子豚が健康に発育していたことが示唆された。
【００７６】
哺乳後期における腹ごとの下痢発生率は表３に示す。下痢は哺乳期のみに確認された。１回でも下痢を発生した下痢発生率は、非投与群で７５．５％だったのに対し、投与群では２５．３％であり、投与群の下痢発生率は非投与群の約１／３に減少した。
【００７７】
【表３】
【００７８】
群ごとの体重変化は図６に示す。哺乳期では、非投与群（ｎ＝７５）及び投与群（ｎ＝７５）の体重増加には大きな差は認められなかったが、離乳期では、投与群（ｎ＝６０）は非投与群（ｎ＝６０）に対して、５．０％の体重増加が認められた。
【００７９】
以上の結果から、乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９の投与により、下痢の発生を抑制し、子豚の事故率を低減させる効果があることが示唆された。また、離乳期では投与群の体重が増加したのは、下痢の発生抑制効果により、子豚が健康に成長したためと推測された。
【００８０】
試験終了時のサイトカイン分析の結果は図７に示す。図７より、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６ともに、投与群で減少している傾向が認められた。このことは、実施例１と同様に、炎症性サイトカインの過剰産生を抑制することでストレスを低減し、子豚の健康状態を安定して維持していることが示唆された。
【００８１】
（実施例５）肥育豚への乳酸菌投与試験
乳酸菌製剤の投与による、肥育豚の死廃率（事故率と発育不良による淘汰率との合計）低減作用について検討した。
【００８２】
試験は、母豚約４００頭の中規模養豚農家（千葉県）にて実施した。肥育豚は、実施例４と同様に、群分けにより１４〜１５頭×４部屋に分け、非投与群（ｎ＝５８）、投与群（ｎ＝５９）で行った。試験豚は試験開始前に体重を測定しばらつきがないことを確認した。豚の品種は全てＬＷＤ種３元交雑種であった。なお、Ｌ種はランドレース種、Ｗ種は大ヨークシャー種、Ｄ種はデュロック種を示す。
【００８３】
試験期間は肥育期（３０ｋｇ到達時から出荷まで）の５７日間行った。試験期間中は抗生物質を含まない配合飼料で飼育し、肥育前期（３０ｋｇから７０ｋｇ）はステップＢ（ＪＡ東日本くみあい飼料株式会社）、肥育後期（７０ｋｇから出荷まで）はＩＰ加茂Ｃ（ＪＡ東日本くみあい飼料株式会社）を使用した。肥育豚は常に自由飲水、不断給与で飼育した。試験中、豚丹毒とオーエスキー病のワクチンを接種した。
【００８４】
製造例１で得られた乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９製剤を、投与群の配合飼料に０．１重量％添加した。
【００８５】
試験期間中、肥育豚の臨床症状は随時記録し、事故死数、及び生育不良による移動頭数（淘汰数）も記録した。さらに、試験期間中に何らかの臨床症状を示した豚には、抗生物質等により治療を行った。試験開始後すぐ、投与群及び非投与群の両群に豚胸膜肺炎の感染が認められ、全頭に抗生物質（フロロコール）を飼料添加により５日間経口投与した他、必要な場合は注射による抗生物質治療を行った。
【００８６】
試験終了までの死廃率（事故率と淘汰率との合計）の結果は図８に示す。試験終了までの事故率は、非投与群で５頭（８．６％）、投与群で３頭（５．１％）であり、淘汰率は、非投与群で２頭（３．５％）、投与群で１頭（１．７％）であった。死廃率は、非投与群で１２．１％、投与群で６．８％であり、投与群の死廃率は、非投与群に比べて４３．８％減少したことが分かった。このことは、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９が、感染防御効果を発揮すると共に、病原感染等による炎症性サイトカインの過剰産生を抑制し、安定的に健康状態を保つことができることが示唆された。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】哺乳期の子豚に対する乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９の投与による、離乳期における体重増加への影響を示す図である。
【図２】哺乳期の子豚に対する乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９の投与による、離乳期におけるサイトカインの産生への影響を示す図である。なお、ＡはＴＮＦ−αの産生への影響を示す図であり、ＢはＩＬ−６の産生への影響を示す図である。
【図３】哺乳期の子豚に対する乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９の投与による、離乳期における模擬感染した場合のサイトカインの産生への影響を示す図である。なお、ＡはＴＮＦ−αの産生への影響を示す図であり、ＢはＩＬ−６の産生への影響を示す図であり、ＣはＩＦＮ−γの産生への影響を示す図である。
【図４】肥育期の子豚における乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９の投与による肥育状態への影響を示す図である。なお、Ａは肥育期間中の発育状況を示す図であり、Ｂは肥育期間中の１日の平均増体量を示す図である。
【図５】哺乳期及び離乳期の子豚における乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９の投与による事故率（圧死をのぞく）への影響を示す図である。
【図６】哺乳期及び離乳期の子豚における乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９の投与による体重変化への影響を示す図である。
【図７】哺乳期及び離乳期の子豚に対する乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９の投与による、試験終了時のＴＮＦ−α及びＩＬ−６の産生への影響を示す図である。
【図８】肥育期の子豚における乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９の投与による死廃率への影響を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ストレス抑制剤に関し、より詳しくは、サイトカイン産生調節作用、感染防御作用、肥育作用又は下痢抑制作用に基づくストレス抑制剤に関する。本発明は、さらに、サイトカイン産生調節剤、感染防御剤、肥育剤及び下痢抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸菌は発酵により糖類から乳酸を生じる菌の総称であり、代表的なものとして、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）に属するものが知られている。これらの乳酸菌は、発酵食品の製造に用いられる他、消化管内の細菌叢を改善して宿主に有益な作用をもたらすプロバイオティクスとしての用途も注目されている。
【０００３】
近年、例えばもろみ濃縮液等のアルコール発酵にて副生する残渣に良好に生育し得る乳酸菌として、乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９が見出され、その病原菌に対する免疫増強作用が注目されている（特許文献１）。しかし、特許文献１では、マウスの死亡率による乳酸菌投与の優位性は明確になっているものの、人畜等での作用効果が実証されていないため、実用化に向けての課題が残っている。
【０００４】
免疫系は、組織の障害や、ウイルスや細菌等の病原性微生物、あるいは酸化ストレスから宿主を防御するための、種々の生体防御機構を備えている。免疫系は、病原性微生物等の外部刺激に対して、様々なサイトカイン、ケモカインを産生し、食細胞の動員、貧食作用の促進、リンパ球活性化、ＮＫ細胞の活性化等の応答を起こす。このようなサイトカインとしては、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、抗腫瘍性壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）等が挙げられる。
【０００５】
病原性微生物に対する感染防御反応においては、感染後数時間以内に働く自然免疫と、感染後数日から働く適応免疫がある。自然免疫は、抗原非特異的な反応であり、単球、マクロファージ、好中球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞等が関与している。また、適応免疫はＴリンパ球とＢリンパ球によって誘導される、抗原特異的な反応で、持続性を持つ。自然免疫で、特に誘導型自然免疫と呼ばれる応答では、病原性微生物の産物の刺激により、ＩＬ−１、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＦＮ−γを始めとした、様々なサイトカイン、ケモカインが産生される。これにより、食細胞の動員、貧食作用の促進、リンパ球活性化、ＮＫ細胞の活性化等の局所的な生態防御反応が起こることが分かっている。
【０００６】
これらサイトカインのうち、ＩＬ−１、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１８、ＩＦＮ−γ等炎症性サイトカインとも呼ばれるサイトカインが過剰産生されることによって、急性期応答と呼ばれる炎症、発熱、潰瘍、浮腫、アレルギー、関節炎等を引き起こし、さらには全身性ショック、播種性血管内凝固症候群等の害を及ぼすことも知られている（非特許文献１）。また、これらの炎症性サイトカインは様々なストレスによっても産生されることが明らかとなっている（非特許文献２）。マウスにおいては、拘束ストレスによってＩＦＮ−γの産生が増加することも知られている（非特許文献３）。
【０００７】
しかし、乳酸菌を主要成分として人や家畜への投与試験を行い、サイトカイン産生抑制効果を調べた報告はこれまで知られていない。
【０００８】
【特許文献１】特開２００５−２１１５６号公報
【非特許文献１】Ｊａｎｅｗａｙ，Ｃ．Ａ．Ｊｒ，笹川健彦訳、「免疫生物学」（原著第５版）、２００３
【非特許文献２】Ｍａｅｓ，Ｍ．ら、「Ｉｎ ｈｕｍａｎｓ，ｓｅｒｕｍ ｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｌｅｖｅｌｓ ｐｒｅｄｉｃｔ ｔｈｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｏｆ ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｔｏ ｐｓｙｃｈｏｌｏｇｉｃ ｓｔｒｅｓｓ」、Ｂｉｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ．、Ｖｏｌ．４７、ｐｐ９１０−９２０（２０００）
【非特許文献３】吉光仁美ら、「拘束ストレスによるアトピー性皮膚炎悪化の分子機構」、日本獣医学会第１４４回大会講演要旨集、ｐｐ５３（２００７）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９は、付加価値が低く廃棄物として処理されていたアルコール発酵後の蒸留残渣の有効利用に役立つことから、その用途の拡大が期待されている。そこで、本発明は、乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９の新たな用途を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９の新規用途について検討を重ねたところ、乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９が、サイトカイン産生調節作用、感染防御作用、肥育作用及び下痢抑制作用を発揮し、これらに基づきストレス負荷を抑制できることを見出した。これまで、ストレス変動をモニタリングし、かつ当該モニタリング結果より、明確かつ有用なストレス抑制効果を実証した、ストレス抑制剤は、見出せていなかった。本発明者らは、多くの個体で乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９を投与し、経時的に炎症性サイトカインを測定することにより、群ごとのストレス変動を明確にモニタリングし、その結果、新たにストレス抑制による効果として、有用な、サイトカイン産生調節作用、感染防御作用、肥育効果、下痢抑制効果を見出した。例えば、乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９を子豚に投与することによって、ストレス状態にある離乳期では、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６等の炎症性サイトカインの過剰な産生を抑制し、また、大腸菌リポポリサッカライド（ＬＰＳ）で模擬感染させた子豚において、感染防御機能を発揮すると共に、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６等の炎症性サイトカインの急激な増加を抑制し、これによって過剰な炎症反応を抑制することを見出した。本発明者らはまた、乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９による子豚に対する肥育作用及び下痢抑制作用も見出した。本発明のストレス抑制剤は、さらに、ストレスが起因となる家畜死廃率に対する低下効果も示している。
【００１１】
すなわち、本発明は、乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９を有効成分とし、サイトカイン産生調節作用、感染防御作用、肥育作用又は下痢抑制作用に基づくストレス抑制剤を提供するものである。本発明のストレス抑制剤によれば、離乳や環境変化によるストレスがかかった場合において、サイトカイン産生調節作用、感染防御作用、肥育作用又は下痢抑制作用を通じて、ストレス負荷を抑制することができる。
【００１２】
本発明はまた、乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９を有効成分とする、サイトカイン産生調節剤、感染防御剤、肥育剤及び下痢抑制剤を提供する。
【００１３】
乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９は、各種ストレスが負荷された場合において、サイトカインの過剰な産生を抑制する機能を有する。なお、ここのサイトカイン産生抑制効果は、乳酸菌と腸管免疫系との穏やかな相互作用によるものであり、急激な免疫抑制や病的な反応を示すものではない。本発明は、実際に生体への投与試験を行い、乳酸菌によるサイトカイン産生抑制効果を検証した初めての発明である。また、乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９を投与することにより、宿主の非特異的生体防御反応を高めつつ、過度なサイトカインの産生を抑制するため、病原の感染を防御するとともに、疾病等による損耗を最小限に抑えることが可能になる。また、肥育期における豚等の家畜の体重増加率を向上させることができ、発育促進作用を発揮し、これにより家畜の平均出荷日齢が短縮される。さらに、家畜の下痢発生率、及び死廃率（事故率と淘汰率との合計）を低減させることができる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９の新規用途が提供される。具体的には、乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９を有効成分とし、サイトカイン産生調節作用、感染防御作用、肥育作用又は下痢抑制作用に基づくストレス抑制剤が提供される。本発明によれば、さらに乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９を有効成分とする、サイトカイン産生調節剤、感染防御剤、肥育剤及び下痢抑制剤が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
【００１６】
本発明のストレス抑制剤は、乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９を有効成分とし、サイトカイン産生調節作用、感染防御作用、肥育作用又は下痢抑制作用に基づいてストレスを抑制するものである。
【００１７】
ここでストレスとは、ストレスを引き起こす外部刺激であるストレッサーにより生じた生体の非特異的反応を意味し、ストレッサーとしては、温度、圧力、浸透圧、紫外線、放射線、音、電磁波等の物理的ストレッサー、薬物、有害物質、飢餓、酸化、酸素欠乏等の化学的ストレッサー、細菌やウイルスの侵入等の生物学的ストレッサー、精神的苦痛、精神的緊張等の精神的ストレッサーが挙げられる。
【００１８】
ストレス抑制とは、ストレッサーにより生じた生体の非特異的反応を抑制することを意味し、生体の非特異的反応としては、生体内のコルチゾールやＣ反応性蛋白質、炎症性サイトカインの上昇がみられ、症状として食欲減退、消化不良、不眠、体調不良などが表れる。特に家畜の場合は、沈静化、軟便、下痢、発育不良、肥育不良などとして表れる。そのため、結果としてストレッサー存在下では、外的刺激に対する抵抗力が落ち、感染症などが起こりやすくなる。一方、ストレスを抑制することで、これら症状を緩和することが期待できる。
【００１９】
本発明におけるストレス抑制の一形態としては、例えば離乳や環境変化等の物理的又は精神的ストレッサーや、病原感染等の生物学的ストレッサーを受けた場合に起こる、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６等のサイトカインの過剰な産生を抑制し、病原感染を効果的に防御すると共に、過剰な炎症反応を抑え、疾病等による損耗を最小限に抑えることによってストレスを抑制する形態が挙げられる。この形態は、サイトカイン産生調節作用、感染防御作用に基づくストレス抑制に該当する。本発明におけるストレス抑制の別の形態としては、家畜等の肥育を促進することによって、物理的、化学的、生物的又は精神的ストレッサーに対する耐性を向上させ、それによりストレスを抑制する形態である。さらに他の形態では、家畜等の下痢発生率及び死廃率を低減させることによって、家畜等の健康な発育を促進し、その結果ストレッサーに対する耐性を向上させる形態である。
【００２０】
乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９は、ラクトバチルス・パラカセイ・サブスピシズ・パラカセイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｐａｒａｃａｓｅｉ）に属し、独立行政法人産業技術総合研究所・特許生物寄託センターに、ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９として寄託されている乳酸菌である。
【００２１】
乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９は、ラクトバチルス・パラカセイ・サブスピシズ・パラカセイの標準株であるＬ．ｐａｒａｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｐａｒａｃａｓｅｉ ＮＢＲＣ １５８８９とは多くの糖質では類似の資化パターンを示すが、いくつかの糖質では発酵性が異なる。即ち、ＡＰＩ５０ＣＨ（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ社製）システムを用いた糖発酵性試験では、ＮＢＲＣ １５８８９は、糖基質がソルボース及びイヌリンである場合、微陽性を示し、糖基質がソルビトール及びグルコン酸塩である場合、陽性を示すことに対して、ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９は、糖基質がソルボース、ソルビトール及びイヌリンである場合陰性を示し、糖基質がグルコン酸塩である場合のみ、微陽性を示す。乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９は、ＡＰＩ５０ＣＨ（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ社製）システムを用いた糖発酵性試験、または抽出したゲノムＤＮＡを用いた、１６ＳｒＤＮＡ遺伝子解析により、遺伝子配列を調べることによって、同定することができる。
【００２２】
乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９の培養は、一般的な乳酸菌培養用培地及び条件で行われていれば特に限定されない。例えば、天然培地、合成培地又は半合成培地等を用いることができる。培地としては、窒素源および炭素源を含有するものであればよく、また、各種無機質を添加してもよい。培地のｐＨは４．０〜８．０が好ましく、より好ましくは５．０〜７．０である。培養温度は１０．０〜４５．０℃が好ましく、より好ましくは２０．０〜４０．０℃である。培養時間は２４〜９６時間程度であり、通気又は嫌気培養してもよい。具体的には、例えば、ＭＲＳ培地（Ｄｉｆｃｏ ＭＲＳ ｂｒｏｔｈ）を用いて、３７℃にて、静置培養することができる。また、ＭＲＳ培地に１．５％の寒天を添加し、ガスパック嫌気培養システム（三菱ガス化学株式会社製）を用いて、３７℃で培養することもできる。凍結乾燥保存菌を使用する場合、菌に生理食塩水、またはＭＲＳ培地を加えて復元し、ＭＲＳ寒天平板培地に塗抹し、３７．０℃で培養した後、液体培地又は寒天培地に継代培養することによって培養することができる。
【００２３】
乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９は、温度耐性及びアルコール耐性を有する。また、一般的な乳酸菌培養用培地の他、アルコール発酵・蒸留残液の２．５〜３．０倍濃縮液（もろみ濃縮液）に良好に生育することができる。もろみ濃縮液を使用することで、乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９を培養できると共に、このような残液を有効利用することもできる。このようなもろみ濃縮液として、例えば、サトウキビ窄汁液の蔗糖採取後の糖蜜をアルコール発酵させ、蒸留した後の残液の濃縮液が好ましく用いられる。また、もろみ濃縮液の２〜８倍蒸留水希釈液（希釈倍率は容積比とする）を使用することが好ましく、２倍蒸留水希釈液が特に好ましい。
【００２４】
本発明のストレス抑制剤に含まれる乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９は、生菌であってもよく、加熱処理やＵＶ、ホルマリン処理等により不活性化した菌であってもよく、特に生菌が好ましい。乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９は、乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９による発酵生産物とともに存在していてもよい。すなわち、本発明のストレス抑制剤は、乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９による発酵生産物を含有していてもよい。
【００２５】
本発明のストレス抑制剤は、液剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、散剤、丸剤、細粒剤、トローチ錠等の経口剤、直腸投与剤等の局所投与剤とすることができる。また、胃酸による影響を低減するために、腸溶剤とすることも好ましい。本発明のストレス抑制剤は、乳酸菌のみからなるものであってよく、また、薬学的に許容できる添加剤又は担体、例えば、賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤化剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、矯味矯臭剤、安定化剤等を含んでよく、必要があれば、他の乳酸菌を含有してもよい。
【００２６】
本発明のストレス抑制剤は、例えば、以下のように製造することができる。まず、乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９を適切な培地によって増殖培養し、次に、培養した乳酸菌を自然沈降又は遠心分離等によって回収する。続いて、回収した乳酸菌は、１×１０１０〜２×１０１１ＣＦＵ／ｇとなるように培養上清で希釈、調整する。これをそのまま液状で用いる他、スキムミルク、乳糖等の保護剤を添加した後、凍結乾燥法、スプレードライ法、噴霧造粒法、または打錠法により粉状もしくは錠剤状に加工する。具体的には、等量の２０％スキムミルク液と混合し、噴霧造粒法で粉状に加工することが好ましい。これを４℃にて保存する。このような方法で製造されるストレス抑制剤は、５×１０８ＣＦＵ／ｇ以上の生菌数を示し、４℃で保存することによって３６０日間、１×１０８ＣＦＵ／ｇ以上の生菌数を維持することができる。
【００２７】
本発明のストレス抑制剤は、サイトカイン産生調節作用、感染防御作用、肥育作用又は下痢抑制作用に基づくストレス抑制作用を有するため、ストレス低減を必要とする治療又は病気の予防に使用することができる。例えば、環境変化や細菌侵入、心労等に代表される物理的や、化学的、生物学的及び精神的なストレッサーを受けた場合、使用することができる。
【００２８】
本発明のストレス抑制剤の投与量は、投与対象、個々の症状や年齢、体重等に応じて、適宜に決定することが好ましい。例えば、豚の場合、一日の投与量は１．０×１０７〜５．０×１０９ＣＦＵ／頭であることが好ましい。本発明のストレス抑制剤を豚に投与した場合、ストレスを抑制でき、病原に感染しても過剰な炎症性サイトカインを産生することなく、病原を防御することができ、また、肥育効果、下痢抑制効果も期待できる。
【００２９】
本発明のストレス抑制剤を含有させることにより、家畜用飼料添加剤が提供される。家畜用飼料添加剤は、乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９を有効成分とするストレス抑制剤のみからなるものであってよく、他の一般的な飼料添加剤、例えば、ミネラル、ビタミン、アミノ酸、食物繊維等を含んでもよい。この家畜用飼料添加剤は、固形、液体又はゲル等の半固形とすることができる。保存性の観点から、固形又は半固形が好ましい。
【００３０】
家畜用飼料添加剤の使用量は家畜の種類（豚、牛、綿羊、山羊、鶏、鴨、ガチョウ、鶉、犬、猫等）や体重に応じて適宜決定でき、豚の場合、一日の投与量は、乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９の量が１．０×１０７〜５．０×１０９ＣＦＵ／頭となるようにすることが好ましい。また、豚の離乳期若しくは肥育期によって、又は環境変化によって適宜に増減することが好ましい。本発明の家畜用飼料添加剤を豚用飼料に添加し、豚を飼育した場合、豚のストレスを抑制でき、病原に感染して過剰な炎症性サイトカインを産生することなく、病原防御することができ、また、肥育効果及び下痢抑制効果も期待できる。
【００３１】
本発明のストレス抑制剤を含有させることにより、機能性食品や特定保健用食品をも提供できる。食品の形態としては、ヨーグルト、ドリンクヨーグルト、ジュース、コーヒー、スポーツ飲料、牛乳、豆乳、酒類等の各種飲料や、プリン、ゼリー、ケーキ、冷菓等の菓子類、チーズ、バター等の乳製品等が挙げられる。このような食品に含まれる乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９の量は、ストレスを抑制することができる量であればよい。
【００３２】
本発明の食品を一定の期間摂取すると、例えば、心労、肉体疲労や環境変化等の各種ストレッサーを受けた場合、病原感染しても、炎症性サイトカインの過剰な産生を抑制でき、それによって病原感染を効果的に防御できると共に、過剰な炎症反応を抑えて、ストレスを抑制することができ、ストレスに強い健康な身体とすることができる。
【００３３】
乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９を有効成分とすることで、サイトカイン産生調節剤、感染防御剤、肥育剤及び下痢抑制剤が提供される。
【００３４】
サイトカイン産生調節剤は、炎症性サイトカインの過剰な産生を抑制し、疾病等による損耗を最小限に抑えることができるため、特に、ストレス等、炎症性サイトカインの過剰分泌に関連する疾患に適用することができる。サイトカイン産生調節剤の投与量は、個々の症状や年齢、体重等に応じて、適宜に決定することが好ましい。例えば、豚の場合、一日の投与量は１．０×１０７〜５．０×１０９ＣＦＵ／頭が好ましい。
【００３５】
感染防御剤は、病原感染を効果的に防御すると共に、炎症性サイトカインの過剰な産生を抑制することができるため、特に、微生物、ウイルス、寄生虫等の感染症による、発熱、下痢等の疾患に適用することができる。感染防御剤の投与量は、個々の症状や年齢、体重等に応じて、適宜に決定することが好ましい。例えば、豚の場合、一日の投与量は１．０×１０７〜５．０×１０９ＣＦＵ／頭であることが好ましい。
【００３６】
肥育剤は、炎症性サイトカインの過剰産生を抑制し、病原感染を効果的に防御すると共に、肥育効果を発揮するため、特に、豚、牛、綿羊、山羊、鶏、鴨、ガチョウ、鶉、犬、猫等の飼育に適用することができる。肥育剤の投与量は、必要に応じて、適宜に決定することが好ましい。例えば、豚の場合、一日の投与量は１．０×１０７〜５．０×１０９ＣＦＵ／頭であることが好ましい。
【００３７】
下痢抑制剤は、炎症性サイトカインの過剰産生を抑制し、病原感染を効果的に防御すると共に、下痢抑制効果を発揮するため、特に、豚、牛、綿羊、山羊、鶏、鴨、ガチョウ、鶉、犬、猫等の飼育に適用することができる。下痢抑制剤の投与量は、必要に応じて、適宜に決定することが好ましい。例えば、豚の場合、一日の投与量は１．０×１０７〜５．０×１０９ＣＦＵ／頭であることが好ましい。
【００３８】
以下、本発明の好適な実施例についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３９】
（製造例１）乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９粉状製剤の製造
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９をもろみ濃縮液（蒸留水希釈液）培地によって増殖培養し、培養した乳酸菌を遠心分離によって回収した。続いて、回収した乳酸菌は、１．０×１０１０〜１．０×１０１１ＣＦＵ／ｇとなるように、培養上清で希釈した。これを等量の２０％スキムミルク液と混合し、噴霧造粒法で粉状製剤に加工した。得られた乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９粉状製剤は、生菌として３．０×１０８〜３．０×１０９ＣＦＵ／ｇの乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９を含むものであった。上記製剤を試験まで４℃にて保存し、４℃で３６０日間保存した場合、１．０×１０８〜３．０×１０８ＣＦＵ／ｇ以上の生菌数を維持した。
【００４０】
（実施例１）乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９によるサイトカイン産生調節作用
哺乳期の子豚に乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９を投与し、乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９による離乳期におけるサイトカイン産生調節作用について試験した。
【００４１】
実施例１〜３において、同じ母豚から１回の分娩で生まれた子豚を１腹とし、１腹が８頭以上の場合の子豚のみを供試豚として採用した。１群を３腹とし、子豚を非投与群（ｎ＝３３）、強制投与群（ｎ＝２７）、及び自由摂取群（ｎ＝２９）に分け、分娩ごとに順次試験を行った。また、各群の子豚の品種は、非投与群ではＷ種（ｎ＝１０）又はＷＬＤ種（ｎ＝２１）、強制投与群ではＷ種（ｎ＝４）又はＷＬＤ種（ｎ＝２２）、自由摂取群ではＷ種（ｎ＝１２）又はＬＤ種（ｎ＝１６）であった。なお、Ｗ種は大ヨークシャー種を、Ｌ種はランドレース種を、Ｄ種はデュロック種を、ＬＤ種は二元交雑種を、そして、ＷＬＤ種は三元交雑種を示す。
【００４２】
試験期間は、哺乳初期（２２日間）及び哺乳後期（１４±２日間）の３６±２日間であった。各群の子豚を４週齢（２８日）まで分娩豚舎で飼育し、離乳後、母豚のみを移動させた。飼育は、哺乳初期には母乳＋代用乳飼育、哺乳後期には母乳＋人工乳飼育で行った。代用乳及び人工乳としては、それぞれモアアップ バースデーミルク（伊藤忠飼料株式会社製）及びモアアップ エツケ（伊藤忠飼料株式会社製）を用い、共に他の乳酸菌が添加されていないものであった。
【００４３】
製造例１で得られた乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９製剤を、強制投与群及び自由摂取群共に、生菌として、哺乳初期に１．０×１０９ＣＦＵ／頭／日、哺乳後期に３．０×１０９ＣＦＵ／頭／日になるよう投与した。強制投与群に対しては、乳酸菌製剤を温湯に希釈し、哺乳初期１日１回３ｍＬずつ、哺乳後期は１日１回９ｍＬずつ経口投与した。自由摂取群に対しては、朝夕２回に分け、人工乳に混ぜて給与した。
【００４４】
試験期間中、毎週子豚の体重を測定し、臨床症状も随時記録した。飼育期間の３６±２日間中、非投与群で２頭、強制投与群で１頭、自由摂取群で１頭の事故死豚が出たため、これらは試験から除外した。なお、事故死とは、母豚による圧死、虚弱死、寒冷死、病死等による子豚や肥育豚の死を意味する。群ごとの体重変化を図１に示す。図１から、非投与群（ｎ＝３１）、強制投与群（ｎ＝２６）及び自由摂取群（ｎ＝２８）の中、自由摂取群の体重増加が最も大きかったが、有意差は認められなかった。
【００４５】
サイトカイン産生量は、子豚血漿試料を用いて、サンドイッチＥＬＩＳＡ法で測定した。ＴＮＦ−αの測定には、固定化抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体とビオチン標識抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体を利用したＳｗｉｎｅ ＴＮＦ−α ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ社製）を使用した。ＩＦＮ−γの測定には、固定化抗ＩＦＮ−γモノクローナル抗体とビオチン標識抗ＩＦＮ−γモノクローナル抗体を利用したＳｗｉｎｅ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｇａｍｍｍａ（ｓｗＩＦＮ−γ）ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ社製）を使用した。ＩＬ−６の測定には、固定化抗ＩＬ−６ポリクローナル抗体とホースラディッシュパーオキシダーゼ標識抗ＩＬ−６ポリクローナル抗体を利用したＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ（商標）、Ｐｏｒｃｉｎｅ ＩＬ−６ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用した。その後、マイクロプレートリーダー（テカン社製）で検出、測定を行った。なお、採血は、子豚離乳２日前、２日後及び９日後にそれぞれ頚静脈より行った。採取された血液をヘパリン処理し、１０ｍＬのヘパリン血を得た。ヘパリン処理血を３ｍＬずつ３本に分けた後、うちの２本に、Ｃａｒｓｔｅｎｓｅｎら（Ｃａｒｓｔｅｎｓｅｎ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２００５）．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ ｉｎ ｐｉｇｌｅｔｓ ａｒｏｕｎｄ ｗｅａｎｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ａｎ ｅｘ ｖｉｖｏ ｗｈｏｌｅ ｂｌｏｏｄ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ． Ｖｅｔ． Ｉｍｍｕｎｏ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．１０５，ｐｐ５９−６６）の方法を参考にリポポリサッカライド（ＬＰＳ；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ０５５：Ｂ５、ＳＩＧＭＡ社製）を５０μｇ／（ｍＬ血液）の濃度で添加した。３９℃で、２時間又は２０時間インキュベート後、１０，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し、得られた上清をＬＰＳ刺激あり（ＬＰＳ２時間又はＬＰＳ２０時間）の血漿試料とした。残りの１本は、ＬＰＳを添加せず、速やかに遠心分離し、得られた上清をＬＰＳ刺激なし（ＬＰＳ０時間）の試料とした。試料は全て−８０℃にて保存した。
【００４６】
サイトカインの分析は、まず、ＬＰＳ刺激の有無及びＬＰＳの処理時間による影響を調べるために、各群にオスとメス２頭ずつを用いて予備試験を行った。その結果、ＴＮＦ−αの場合、ＬＰＳ２０時間よりもＬＰＳ２時間の方が高い値を示した。また、ＬＰＳ０時間ではほとんどが検出限界以下であった。ＩＬ−６の場合も、ＬＰＳ０時間ではほとんど検出されなかったが、ＬＰＳ２時間よりもＬＰＳ２０時間で１０倍近く高い値を示した。ＩＦＮ−γの場合、ＬＰＳ刺激の有無に関わらず、ほとんどが検出限界以下であった。以上より、ＬＰＳ刺激なしでは、これらのサイトカインは産生しないことが分かった。このことから、本試験では、ＴＮＦ−αをＬＰＳ２時間の試料、ＩＬ−６をＬＰＳ２０時間の試料を用いて分析を行ったが、ＩＦＮ−γについては分析を行わなかった。
【００４７】
サイトカインごとに得られた約３００サンプルのデータのうち、ＥＬＩＳＡで不具合が生じた試料、及びＴＮＦ−αとＩＬ−６との両方で明らかに高い数値を示した試料は、解析から除外した。データの解析は独立２群に対して二標本ｔ検定によって群間の比較を行った。Ｆ検定によりデータの分散が等分散とみなせない場合はＷｅｌｃｈ法を適用した。統計的有意差はｐ＜０．０５の場合を有意差ありとした。
【００４８】
非投与群（ｎ＝２６）、強制投与群（ｎ＝２３）、及び自由摂取群（ｎ＝２５）の解析結果を図２に示す。図２から、ＴＮＦ−αは、強制投与群で離乳２日後において、自由摂取群で離乳２日後及び９日後において、非投与群に比べて有意に低い値を示した。一方、離乳９日後において、強制投与群の値が非投与群よりも高かった。また、ＩＬ−６は、いずれの試験日においても、強制投与群及び自由摂取群では非投与群に比べて有意に低い値を示し、特に自由摂取群の方が高い有意差を示した。
【００４９】
非投与群では、ＴＮＦ−αが試験期間を通して全体的に高い値を示した。これは、子豚が離乳ストレッサーを強く受けたためだと考えられる。一方、乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９の投与によって、ＴＮＦ−αが有意に減少したことから、乳酸菌投与が離乳ストレッサーによるストレスを低減させたことが示唆された。
【００５０】
強制投与群が離乳９日後で上昇した理由については、強制投与によるストレスや他のストレス、又は何らかの病原体の感染によるものではないかと考えられる。また、ＩＬ−６についても、非投与群で離乳２日後にＩＬ−６が上昇せず、いずれの試験日においても高い値を示したことは、子豚には離乳によるストレス以外にも何らかのストレスがかかっていたことが考えられる。今回の試験期間は６月１２日から８月１７日の間であることを考えれば、暑さに弱い豚にとって高温ストレッサーを受けた可能性があった。
【００５１】
非投与群の値が高く、また標準偏差が大きいのに対して、強制投与群、自由摂取群は数値が有意に低く、標準偏差も小さい値を示したことから、乳酸菌投与によって、離乳ストレス以外の何らかの環境によるストレスに対しても効果があり、試験群の子豚の健康状態を安定して維持することが示唆された。また、自由摂取群の方が強制投与群よりも効果が高く、増体も他の群より良好だったことから、自由摂取群は強制投与によるストレスを受けないため、豚への負荷が少ないことが推測された。
【００５２】
（実施例２）乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９による感染防御作用
哺乳期の子豚に乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９を投与し、乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９による離乳期における感染防御作用について試験した。
【００５３】
実施例１と同様に乳酸菌投与を行った。５週間の投与試験終了後の二元又は三元交雑種の子豚を用いて試験を行った。非投与群、強制投与群及び自由摂取群は、各２腹から、オス、メス各６頭ずつ選び、体重が均等になるように２群に分け、一方をＬＰＳ接種区、もう一方をＬＰＳ非接種区とした。
【００５４】
乳酸菌投与試験が終了した５週目の子豚に対して、ＬＰＳ接種前の採血を行った。その後、Ｎａｋａｊｉｍａら（Ｎａｋａｊｉｍａ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２０００）．Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｅｎｄｏｔｏｘｅｍｉｃ ｌｅｓｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｌｉｖｅｒ ａｎｄ ｋｉｄｎｅｙｓ ｏｆ ｐｉｇｌｅｔｓ． Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ．６２，ｐｐ６２１−６２６）の方法を参考に、ＬＰＳ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ０５５：Ｂ５、ＳＩＧＭＡ社製）２．５ｍｇを１０ｍＬのＰＢＳに溶解し、投与量が２０μｇ／ｋｇになるよう耳静脈に接種し、模擬感染を行った。非接種区にはＰＢＳのみを接種した。その後、１．５、３、６、１２、２４時間後に、頚静脈から採血し、ヘパリン処理後、実施例１と同様に遠心分離し、得られた血漿試料を−２０℃で保存した。
【００５５】
血漿中のＴＮＦ−α、ＩＬ−６及びＩＦＮ−γについて、ＬＰＳ接種による経時的な変化を、実施例１に記載の方法に従ってＥＬＩＳＡで測定した。また、ＬＰＳ接種による臨床症状についても記録した。
【００５６】
試験に用いた子豚の平均体重は、非投与群、強制投与群及び自由摂取群でそれぞれ、１２．４ｋｇ、９．７ｋｇ、及び１１．１ｋｇであった。試験期間中、臨床症状を示した子豚は認めなかった。サイトカインごとに得られた約２２０サンプルの分析を行った。そのうち、ＥＬＩＳＡで明らかに異常な数値を示した試料は、解析から除外した。データの解析は独立２群に対して二標本ｔ検定によって群間の比較を行った。統計的有意差はｐ＜０．０５の場合を有意差ありとした。
【００５７】
解析の結果を図３に示す。図３から、ＬＰＳの接種によって、子豚血漿中のＴＮＦ−α、ＩＬ−６、及びＩＦＮ−γは急激に上昇し、１．５時間又は３時間でピークを迎えた後、６時間後には試験前の値にまで減少したことが分かった。ＴＮＦ−αは、１．５時間で最大値を示し、非投与群及び強制投与群において１０μｇ／ｍＬ以上の高い値を示したのに対し、自由投与群は、１．５時間でＴＮＦ−αの上昇が認められたものの、他群に比し有意に低い値を示した（図３の（Ａ））。
【００５８】
ＩＬ−６の産生も、ＬＰＳ接種後、一過性の増加と減少を示したが、強制投与群及び自由摂取群では１．５時間でピークを迎えたのに対し、非投与群はさらに増加して、３時間でピークを示した後減少に転じ、３時間目において非投与群と自由摂取群とにおいて有意差が認められた（ｐ＜０．０５）（図３の（Ｂ））。
【００５９】
また、ＩＦＮ−γはＬＰＳ接種によって誘導されることが確認され、３時間目において強制投与群及び自由摂取群では、非投与群に対して有意に低い値を示した（図３の（Ｃ））。
【００６０】
ＰＢＳのみを接種したＬＰＳ非接種区では、これらのサイトカインの産生はほとんど認められなかった。
【００６１】
以上の結果より、ＬＰＳ接種による模擬感染の刺激によって、まず、ＴＮＦ−αが急激に産生され、その後、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γが続けて産生され、６時間以内に免疫応答が終了することが分かった。これらのサイトカインは、炎症性サイトカインとして、感染防御に働く一方、発熱や全身性ショックといった、過剰な炎症を体内に引き起こすことが知られている。今回の試験によって、乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９は、これらのサイトカインの急激な産生を抑制したことから、感染防御として産生されるサイトカイン量を調節し、過剰な炎症を抑制していることが示唆された。
【００６２】
（実施例３）乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９による肥育作用
肥育期の子豚に乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９を投与し、その肥育作用について試験した。
【００６３】
子豚を非投与群（ｎ＝３０）、強制投与群（ｎ＝３３）及び自由摂取群（ｎ＝２８）に分け、１群を３腹とした。メスの品種はＷ又はＬＷであり、オスの品種はＤ又はＷであった。子豚を４週（２８日）まで分娩豚舎で飼育し、離乳後、母豚のみ移動させた。
【００６４】
試験期間は３０ｋｇに到達した豚に対し、出荷（１１０ｋｇ）までの８３〜９７日間であった。肥育期間を３０〜５０ｋｇ期（Ｉ期）、５０〜９０ｋｇ期（ＩＩ期）、９０〜１１０ｋｇ期（ＩＩＩ期）の３期に分け、製造例１で得られた乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９製剤を、生菌として、Ｉ期では１．０×１０９ＣＦＵ／頭／日、ＩＩ期では２．０×１０９ＣＦＵ／頭／日、ＩＩＩ期では３．０×１０９ＣＦＵ／頭／日、新産肉能力検定用飼料（ＴＤＮ７４．５％以上、ＣＰ１４．５％以上、株式会社杉治商会製）に混ぜ、自由摂取させた。
【００６５】
試験期間中、毎週子豚の体重を測定し、臨床症状についても随時記録した。豚の発育状況を表１及び図４の（Ａ）に示す。肥育期間中、非投与群において、下痢を起こすブタが４頭中２頭観察され、１頭は４回下痢症状を示し、計７日間下痢治療のために複合生菌剤を投与した他、もう１頭は、下痢症状と発熱症状同時に示し、アンピシリン、スリピリンによる治療を行った。しかし、投与群ではこのような症状を示す豚は認められなかった。表１から、出荷日齢は、非投与群で１５９．８日、投与群で１５６．３日であり、また、出荷時体重は、非投与群で１１１．４ｋｇ、投与群で１１３．４ｋｇであった。有意差はなかったものの、投与群では約３日（２．２％）早く、体重が２ｋｇ（１．８％）重く、出荷されたことが分かった。
【００６６】
【表１】
【００６７】
肥育期間中の１日の平均増体量を表２及び図４の（Ｂ）に示す。表２から、３０ｋｇからの１日平均体重増加（増体量）は、肥育前期及び肥育後期では共に、投与群で高い傾向が認められた。特に、肥育後期において、非投与群の１日の平均増体量が９１８．４ｇであったのに対し、投与群では１０３０．６ｇであり、投与群は非投与群に比べて１２．２％多く増加したことが分かった。
【００６８】
【表２】
【００６９】
以上の結果から、乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９の投与による肥育効果があることが証明された。特に肥育後期の増体率に効果があることが明らかとなった。乳酸菌自体は、肥育を促す高カロリーな栄養成分はなく、また、今回与えた乳酸菌の添加量が餌に対して１％以下であることから、乳酸菌の投与によるストレス抑制作用が、豚の健康な発育に貢献したと考えられる。
【００７０】
（実施例４）哺乳期及び離乳期の子豚への乳酸菌投与試験
乳酸菌製剤の投与による、哺乳期及び離乳期の子豚の事故率（事故死率）低減作用、下痢抑制作用、肥育作用について検討した。
【００７１】
試験は、母豚約４００頭の中規模養豚農家（千葉県）にて実施した。同じ母豚から１回の分娩で生まれた子豚を１腹とし、６日間以内に産まれた１腹が７頭以上の場合の子豚のみを供試豚として採用した。群構成は、哺乳期は腹ごとに、非投与群８腹（ｎ＝８１）、投与群７腹（ｎ＝７９）、その後、離乳期は群分けにより１５頭×４部屋に分け、非投与群（ｎ＝６０）、投与群（ｎ＝６０）で行った。子豚の品種は全てＬＷＤ種３元交雑種であった。なお、Ｌ種はランドレース種、Ｗ種は大ヨークシャー種、Ｄ種はデュロック種を示す。
【００７２】
試験期間は哺乳期後期（生後１４日目から４０日目までの２７日間）及び離乳期（生後４１日目から８８日目までの４８日間）に分けて行った。分娩後子豚は腹ごとに分娩舎で飼育し、離乳（２８日目）後、母豚のみを移動させた。４１日目に離乳舎へ移動し、１５頭ずつ４部屋に体重がほぼ同じになるよう群分けを行った。生後１３日目までは母乳で飼育し、１４日目からは母乳と市販の人工乳ＰＨ ５（日清丸紅飼料株式会社製）、２８日目から人工乳のみ、４１日目からは配合飼料カスタマーＬ（日清丸紅飼料株式会社製）に切り替え飼育した。子豚は常に自由飲水、不断給与で飼育した。
【００７３】
製造例１で得られた乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９製剤を、哺乳期は人工乳に１重量％添加し、離乳期は配合飼料に０．１重量％添加し、自由摂取とした。
【００７４】
子豚は、分娩時、離乳時、及び肥育舎移動時の３回体重を測定した。また、臨床症状は随時記録した。哺乳期に下痢が確認された時は、その子豚のいる豚房にスタローサンＦ（共立製薬社製）を適量撒き、床の乾燥と汚濁防止処理をすることで飼養環境を改善した。また、離乳期に何らかの臨床症状を示した子豚には、抗生物質（アンピシリン、カナマイシン）の注射により治療とした。さらに、試験終了時に各部屋から３頭ずつ、各群１２頭から採血し、実施例１と同様にサイトカイン産生量を測定した。
【００７５】
試験期間中の群ごとの事故率（圧死をのぞく）は図５に示す。試験期間７５日間中、圧死以外の事故率は哺乳期において、非投与群（ｎ＝７５）で３．９％、投与群（ｎ＝７５）で１．３％、離乳期において、非投与群（ｎ＝６０）で１．７％、投与群（ｎ＝６０）で０％であった。投与群では非投与群に比べて、哺乳期の事故率が１／３に減少し、離乳期においても低い傾向がみられた。圧死以外の事故死は、虚弱や病気感染によるものが多いと考えられるため、投与群の圧死以外の事故率が減少したことは、子豚が健康に発育していたことが示唆された。
【００７６】
哺乳後期における腹ごとの下痢発生率は表３に示す。下痢は哺乳期のみに確認された。１回でも下痢を発生した下痢発生率は、非投与群で７５．５％だったのに対し、投与群では２５．３％であり、投与群の下痢発生率は非投与群の約１／３に減少した。
【００７７】
【表３】
【００７８】
群ごとの体重変化は図６に示す。哺乳期では、非投与群（ｎ＝７５）及び投与群（ｎ＝７５）の体重増加には大きな差は認められなかったが、離乳期では、投与群（ｎ＝６０）は非投与群（ｎ＝６０）に対して、５．０％の体重増加が認められた。
【００７９】
以上の結果から、乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９の投与により、下痢の発生を抑制し、子豚の事故率を低減させる効果があることが示唆された。また、離乳期では投与群の体重が増加したのは、下痢の発生抑制効果により、子豚が健康に成長したためと推測された。
【００８０】
試験終了時のサイトカイン分析の結果は図７に示す。図７より、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６ともに、投与群で減少している傾向が認められた。このことは、実施例１と同様に、炎症性サイトカインの過剰産生を抑制することでストレスを低減し、子豚の健康状態を安定して維持していることが示唆された。
【００８１】
（実施例５）肥育豚への乳酸菌投与試験
乳酸菌製剤の投与による、肥育豚の死廃率（事故率と発育不良による淘汰率との合計）低減作用について検討した。
【００８２】
試験は、母豚約４００頭の中規模養豚農家（千葉県）にて実施した。肥育豚は、実施例４と同様に、群分けにより１４〜１５頭×４部屋に分け、非投与群（ｎ＝５８）、投与群（ｎ＝５９）で行った。試験豚は試験開始前に体重を測定しばらつきがないことを確認した。豚の品種は全てＬＷＤ種３元交雑種であった。なお、Ｌ種はランドレース種、Ｗ種は大ヨークシャー種、Ｄ種はデュロック種を示す。
【００８３】
試験期間は肥育期（３０ｋｇ到達時から出荷まで）の５７日間行った。試験期間中は抗生物質を含まない配合飼料で飼育し、肥育前期（３０ｋｇから７０ｋｇ）はステップＢ（ＪＡ東日本くみあい飼料株式会社）、肥育後期（７０ｋｇから出荷まで）はＩＰ加茂Ｃ（ＪＡ東日本くみあい飼料株式会社）を使用した。肥育豚は常に自由飲水、不断給与で飼育した。試験中、豚丹毒とオーエスキー病のワクチンを接種した。
【００８４】
製造例１で得られた乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９製剤を、投与群の配合飼料に０．１重量％添加した。
【００８５】
試験期間中、肥育豚の臨床症状は随時記録し、事故死数、及び生育不良による移動頭数（淘汰数）も記録した。さらに、試験期間中に何らかの臨床症状を示した豚には、抗生物質等により治療を行った。試験開始後すぐ、投与群及び非投与群の両群に豚胸膜肺炎の感染が認められ、全頭に抗生物質（フロロコール）を飼料添加により５日間経口投与した他、必要な場合は注射による抗生物質治療を行った。
【００８６】
試験終了までの死廃率（事故率と淘汰率との合計）の結果は図８に示す。試験終了までの事故率は、非投与群で５頭（８．６％）、投与群で３頭（５．１％）であり、淘汰率は、非投与群で２頭（３．５％）、投与群で１頭（１．７％）であった。死廃率は、非投与群で１２．１％、投与群で６．８％であり、投与群の死廃率は、非投与群に比べて４３．８％減少したことが分かった。このことは、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９が、感染防御効果を発揮すると共に、病原感染等による炎症性サイトカインの過剰産生を抑制し、安定的に健康状態を保つことができることが示唆された。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】哺乳期の子豚に対する乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９の投与による、離乳期における体重増加への影響を示す図である。
【図２】哺乳期の子豚に対する乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９の投与による、離乳期におけるサイトカインの産生への影響を示す図である。なお、ＡはＴＮＦ−αの産生への影響を示す図であり、ＢはＩＬ−６の産生への影響を示す図である。
【図３】哺乳期の子豚に対する乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９の投与による、離乳期における模擬感染した場合のサイトカインの産生への影響を示す図である。なお、ＡはＴＮＦ−αの産生への影響を示す図であり、ＢはＩＬ−６の産生への影響を示す図であり、ＣはＩＦＮ−γの産生への影響を示す図である。
【図４】肥育期の子豚における乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９の投与による肥育状態への影響を示す図である。なお、Ａは肥育期間中の発育状況を示す図であり、Ｂは肥育期間中の１日の平均増体量を示す図である。
【図５】哺乳期及び離乳期の子豚における乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９の投与による事故率（圧死をのぞく）への影響を示す図である。
【図６】哺乳期及び離乳期の子豚における乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９の投与による体重変化への影響を示す図である。
【図７】哺乳期及び離乳期の子豚に対する乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９の投与による、試験終了時のＴＮＦ−α及びＩＬ−６の産生への影響を示す図である。
【図８】肥育期の子豚における乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９の投与による死廃率への影響を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９を有効成分とし、サイトカイン産生調節作用、感染防御作用、肥育作用又は下痢抑制作用に基づくストレス抑制剤。
【請求項２】
前記サイトカイン産生調節作用は、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ又はＩＬ−６の産生抑制作用である請求項１記載のストレス抑制剤。
【請求項３】
請求項１又は２記載のストレス抑制剤を含む家畜用飼料添加剤。
【請求項４】
乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９を有効成分とするサイトカイン産生調節剤。
【請求項５】
ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ又はＩＬ−６の産生抑制剤である請求項４記載のサイトカイン産生調節剤。
【請求項６】
乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９を有効成分とする感染防御剤。
【請求項７】
乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９を有効成分とする肥育剤。
【請求項８】
乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９を有効成分とする下痢抑制剤。
【請求項１】
乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９を有効成分とし、サイトカイン産生調節作用、感染防御作用、肥育作用又は下痢抑制作用に基づくストレス抑制剤。
【請求項２】
前記サイトカイン産生調節作用は、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ又はＩＬ−６の産生抑制作用である請求項１記載のストレス抑制剤。
【請求項３】
請求項１又は２記載のストレス抑制剤を含む家畜用飼料添加剤。
【請求項４】
乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９を有効成分とするサイトカイン産生調節剤。
【請求項５】
ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ又はＩＬ−６の産生抑制剤である請求項４記載のサイトカイン産生調節剤。
【請求項６】
乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９を有効成分とする感染防御剤。
【請求項７】
乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９を有効成分とする肥育剤。
【請求項８】
乳酸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９を有効成分とする下痢抑制剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２００９−１０２２９２（Ｐ２００９−１０２２９２Ａ）
【公開日】平成２１年５月１４日（２００９．５．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１１５６５６（Ｐ２００８−１１５６５６）
【出願日】平成２０年４月２５日（２００８．４．２５）
【出願人】（５９１０１４７１０）千葉県 (49)
【出願人】（０００００２０７１）チッソ株式会社 (658)
【出願人】（５０６１４８８２２）日本アルコール産業株式会社 (6)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年５月１４日（２００９．５．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年４月２５日（２００８．４．２５）
【出願人】（５９１０１４７１０）千葉県 (49)
【出願人】（０００００２０７１）チッソ株式会社 (658)
【出願人】（５０６１４８８２２）日本アルコール産業株式会社 (6)
【Ｆターム（参考）】
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