スフィンゴミエリナーゼ活性の定量法
【課題】 スフィンゴミエリナーゼ活性の定量法を提供する。
【解決手段】 スフィンゴミエリナーゼ含有検体に下記式（１）の化合物を作用させ、反応生成物下記式（３）の化合物を作用させ、生成する下記式（５）の吸光度を測定することによるスフィンゴミエリナーゼ活性の定量法。
【化１】
（式中、Ｒ1およびＲ2は同一または異なって、不飽和結合を有することもある炭素数が１〜２０のアルキル基などを意味し、Ｒ3は水素原子などを意味する。）
【解決手段】 スフィンゴミエリナーゼ含有検体に下記式（１）の化合物を作用させ、反応生成物下記式（３）の化合物を作用させ、生成する下記式（５）の吸光度を測定することによるスフィンゴミエリナーゼ活性の定量法。
【化１】
（式中、Ｒ1およびＲ2は同一または異なって、不飽和結合を有することもある炭素数が１〜２０のアルキル基などを意味し、Ｒ3は水素原子などを意味する。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、加水分解酵素であるスフィンゴミエリナーゼ活性の定量法に関する。
【背景技術】
【０００２】
スフィンゴ脂質が細胞内において様々な情報伝達に関与していることが明らかになっている。最近の研究では、特にセラミドやスフィンゴシン−１−リン酸に焦点が当てられ、それぞれの受容体の探索や、情報伝達経路に関する研究が盛んに行われている。例えば、セラミドは、加水分解酵素であるスフィンゴミエリナーゼが活性化された結果、細胞膜の主要な構成成分であるスフィンゴミエリンから代謝、生産され、細胞内に多く蓄積するとアポトーシスを誘導することが知られている。このときスフィンゴミエリナーゼは外部からのストレスにより活性化されるＴＮＦ−βやその他ある種の刺激により活性化される。また、最近の研究では、セラミドの脳における疾病への関与が明らかにされ、スフィンゴミエリナーゼの阻害剤がこの治療薬として効果があると期待されている。また、これに関連して、スフィンゴミエリナーゼ活性の定量の重要性が増加している。
【０００３】
これまで一般的に、スフィンゴミエリナーゼの活性測定には、蛍光や放射性原子により標識化されたスフィンゴミエリン（非特許文献１および２参照）や、２−ヘキサデカノイルアミノ−４−ニトロフェニルホスホコリン（ＨＰＮ）のように加水分解産物が強い吸光度を持つ合成基質が利用されている（非特許文献３参照）。これらの基質を用いたアッセイでは酵素活性を測定するため、一度、酵素反応を停止した後に生成物を定量する必要があり、加水分解の経時変化をリアルタイムに測定することはできなかった。
【０００４】
【非特許文献１】J. Lipid. Res., 43, 815 (2002)
【非特許文献２】Methods Enzymol., 311, 164 (1999)
【非特許文献３】N. Engl. J. Med., 293, 632 (1975)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、スフィンゴミエリナーゼによる加水分解反応をリアルタイムに測定し、スフィンゴミエリナーゼ活性の定量法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、下記一般式（１）で示されるスフィンゴミエリン硫黄置換体などを用いるスフィンゴミエリナーゼ活性の定量法に関する。
【化１】
（式中、Ｒ1およびＲ2は同一または異なって、不飽和結合を有することもある炭素数が１〜２０のアルキル基を意味する。）
【０００７】
更に詳しくは、スフィンゴミエリナーゼ含有検体に上記式（１）で表されるスフィンゴミエリン硫黄置換体を加え、該スフィンゴミエリナーゼにより加水分解され、遊離する下記一般式（２）
【化２】
（式中、Ｒ1およびＲ2は前掲と同じ。）で表されるチオールに、下記一般式（３）
【化３】
（式中、Ｒ3は水素原子、低級アルキル基、低級アルケニル基またはハロゲン原子を意味し、Ｒ1およびＲ2は前掲と同じ。）で表される５，５−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸類）を加え、該チオール（２）と特異的に反応させ、下記一般式（４）
【化４】
（式中、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は前掲と同じ。）で表される化合物を生成せしめ、そしてそれに伴い遊離する下記一般式（５）
【化５】
（式中、Ｒ3は前掲と同じ。）で表される２−ニトロ−５−チオ安息香酸類の吸光度を測定することを特徴とする該スフィンゴミエリナーゼ活性の定量法に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、スフィンゴミエリナーゼによる上記式（１）で示されるスフィンゴミエリン硫黄置換体の加水分解反応を経時的に、連続して測定することによりスフィンゴミエリナーゼ活性の定量を行うことが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明をスキームで示すと以下の通りである。
【００１０】
スキーム
【化６】
（式中、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は前掲と同じ。）
【００１１】
その原理は、スフィンゴミエリン硫黄置換体（１）がスフィンゴミエリナーゼにより加水分解され、遊離するチオール化合物（２）を５，５−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸類）（３）と特異的に反応させ、ジチオ体（４）と、それに伴う２−ニトロ−５−チオ安息香酸類（５）を生成させる。この２−ニトロ−５−チオ安息香酸類（５）の吸収極大を電子吸光計により吸光度の変化を観測することでスフィンゴミエリナーゼ活性の定量を可能にした。
【００１２】
本発明に用いられるスフィンゴミエリン硫黄置換体は、例えば特願２００２−３４４９１４に記載された以下に示す方法によって合成することができる。
【化７】
（式中、Ｒ1およびＲ2は前掲と同じ。）
【実施例】
【００１３】
酵素スフィンゴミエリナーゼは、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）菌由来のものを用いた。
スフィンゴミエリナーゼ溶液は、市販品を２Ｍ尿素で溶解後、０.２Ｍ塩化ナトリウム水溶液に対して透析し，生じた沈殿物を遠心分離により取り除いて調製した。
【００１４】
スフィンゴミエリン硫黄置換体溶液、塩化マグネシウム溶液、ＴＥＳ−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７.５）、およびＴｒｉｔｏｎＸ−１００溶液は塩化ナトリウムを用いてイオン強度を０.２に調整した。
【００１５】
以下、本発明につき実施例を挙げて説明する。
【００１６】
比較例１
必要量の上記各種溶液、１０μＬの８３ｍＭ５，５−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）のメタノール溶液、および０.２Ｍ塩化ナトリウム水溶液を加え、合わせて全量を０.９９５ｍｌにし、５分間超音波処理を行うことで下記式（７）で示したスフィンゴミエリン硫黄置換体溶液とＴｒｉｔｏｎＸ−１００の混合比を１：１０にした混合ミセル状態の基質溶液を調製した。この溶液を石英製のキュベットに移し、３７℃に保温したセルホルダーに入れ、４１２ｎｍにおける吸光度の経時変化を測定して、吸光度の変化が起こらないことを確認した。
【化８】
【００１７】
実施例１
必要量の上記各種溶液、１０μＬの８３ｍＭ５，５−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）のメタノール溶液，および，０.２Ｍ塩化ナトリウム水溶液を加え、合わせて全量を０.９９５ｍｌにし、５分間超音波処理を行うことで上記式（７）で示したスフィンゴミエリン硫黄置換体溶液とＴｒｉｔｏｎＸ−１００の混合比を１：１０にした混合ミセル状態の基質溶液を調製した。次に５μＬのスフィンゴミエリナーゼ溶液を加えて酵素反応を開始し、反応生成物のチオール基と５，５−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）とが瞬時に反応することで生じる２−ニトロ−５−チオ安息香酸（ＴＮＢ）の４１２ｎｍにおける吸光度の経時変化を測定することで、スフィンゴミエリナーゼの加水分解反応を調べた。なお、反応溶液中の塩化マグネシウム、ＴＥＳ−水酸化ナトリウム緩衝液 （ｐＨ７.５）、および５，５−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）の最終濃度はそれぞれ １０ｍＭ、５０ｍＭ、および０.８３ｍＭとした。図１は種々の基質濃度における吸光度の経時変化を示す。図中の１〜７のグラフには，それぞれスフィンゴミエリン硫黄置換体（７）の濃度を１.４、１.２、１.０、０.８、０.６、０.４、および０.２ｍＭにした時の結果を示す。
【００１８】
図１のように、上記式（７）で示したスフィンゴミエリン硫黄置換体の濃度に比例して、２−ニトロ−５−チオ安息香酸（ＴＮＢ）の吸光度が高く観測され、定量が可能である結果を示した。
【産業上の利用可能性】
【００１９】
本発明は、スフィンゴミエリン硫黄置換体がスフィンゴシンと同様にスフィンゴミエリナーゼによって加水分解されることに基づいており、更に同様の用途は、スフィンゴシン１−リン酸の硫黄類縁体がスフィンゴシンと同様の基質として認識されるならば、スフィンゴシンキナーゼの定量試薬としても利用できることになる。いずれの場合も、アッセイ系の確立に有効なだけでなく、スフィンゴミエリナーゼやスフィンゴシン１−リン酸キナーゼの診断薬となることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】各濃度の２−ニトロ−５−チオ安息香酸（ＴＮＢ）の４１２ｎｍにおける経時的吸光度を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、加水分解酵素であるスフィンゴミエリナーゼ活性の定量法に関する。
【背景技術】
【０００２】
スフィンゴ脂質が細胞内において様々な情報伝達に関与していることが明らかになっている。最近の研究では、特にセラミドやスフィンゴシン−１−リン酸に焦点が当てられ、それぞれの受容体の探索や、情報伝達経路に関する研究が盛んに行われている。例えば、セラミドは、加水分解酵素であるスフィンゴミエリナーゼが活性化された結果、細胞膜の主要な構成成分であるスフィンゴミエリンから代謝、生産され、細胞内に多く蓄積するとアポトーシスを誘導することが知られている。このときスフィンゴミエリナーゼは外部からのストレスにより活性化されるＴＮＦ−βやその他ある種の刺激により活性化される。また、最近の研究では、セラミドの脳における疾病への関与が明らかにされ、スフィンゴミエリナーゼの阻害剤がこの治療薬として効果があると期待されている。また、これに関連して、スフィンゴミエリナーゼ活性の定量の重要性が増加している。
【０００３】
これまで一般的に、スフィンゴミエリナーゼの活性測定には、蛍光や放射性原子により標識化されたスフィンゴミエリン（非特許文献１および２参照）や、２−ヘキサデカノイルアミノ−４−ニトロフェニルホスホコリン（ＨＰＮ）のように加水分解産物が強い吸光度を持つ合成基質が利用されている（非特許文献３参照）。これらの基質を用いたアッセイでは酵素活性を測定するため、一度、酵素反応を停止した後に生成物を定量する必要があり、加水分解の経時変化をリアルタイムに測定することはできなかった。
【０００４】
【非特許文献１】J. Lipid. Res., 43, 815 (2002)
【非特許文献２】Methods Enzymol., 311, 164 (1999)
【非特許文献３】N. Engl. J. Med., 293, 632 (1975)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、スフィンゴミエリナーゼによる加水分解反応をリアルタイムに測定し、スフィンゴミエリナーゼ活性の定量法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、下記一般式（１）で示されるスフィンゴミエリン硫黄置換体などを用いるスフィンゴミエリナーゼ活性の定量法に関する。
【化１】
（式中、Ｒ1およびＲ2は同一または異なって、不飽和結合を有することもある炭素数が１〜２０のアルキル基を意味する。）
【０００７】
更に詳しくは、スフィンゴミエリナーゼ含有検体に上記式（１）で表されるスフィンゴミエリン硫黄置換体を加え、該スフィンゴミエリナーゼにより加水分解され、遊離する下記一般式（２）
【化２】
（式中、Ｒ1およびＲ2は前掲と同じ。）で表されるチオールに、下記一般式（３）
【化３】
（式中、Ｒ3は水素原子、低級アルキル基、低級アルケニル基またはハロゲン原子を意味し、Ｒ1およびＲ2は前掲と同じ。）で表される５，５−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸類）を加え、該チオール（２）と特異的に反応させ、下記一般式（４）
【化４】
（式中、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は前掲と同じ。）で表される化合物を生成せしめ、そしてそれに伴い遊離する下記一般式（５）
【化５】
（式中、Ｒ3は前掲と同じ。）で表される２−ニトロ−５−チオ安息香酸類の吸光度を測定することを特徴とする該スフィンゴミエリナーゼ活性の定量法に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、スフィンゴミエリナーゼによる上記式（１）で示されるスフィンゴミエリン硫黄置換体の加水分解反応を経時的に、連続して測定することによりスフィンゴミエリナーゼ活性の定量を行うことが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明をスキームで示すと以下の通りである。
【００１０】
スキーム
【化６】
（式中、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は前掲と同じ。）
【００１１】
その原理は、スフィンゴミエリン硫黄置換体（１）がスフィンゴミエリナーゼにより加水分解され、遊離するチオール化合物（２）を５，５−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸類）（３）と特異的に反応させ、ジチオ体（４）と、それに伴う２−ニトロ−５−チオ安息香酸類（５）を生成させる。この２−ニトロ−５−チオ安息香酸類（５）の吸収極大を電子吸光計により吸光度の変化を観測することでスフィンゴミエリナーゼ活性の定量を可能にした。
【００１２】
本発明に用いられるスフィンゴミエリン硫黄置換体は、例えば特願２００２−３４４９１４に記載された以下に示す方法によって合成することができる。
【化７】
（式中、Ｒ1およびＲ2は前掲と同じ。）
【実施例】
【００１３】
酵素スフィンゴミエリナーゼは、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）菌由来のものを用いた。
スフィンゴミエリナーゼ溶液は、市販品を２Ｍ尿素で溶解後、０.２Ｍ塩化ナトリウム水溶液に対して透析し，生じた沈殿物を遠心分離により取り除いて調製した。
【００１４】
スフィンゴミエリン硫黄置換体溶液、塩化マグネシウム溶液、ＴＥＳ−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７.５）、およびＴｒｉｔｏｎＸ−１００溶液は塩化ナトリウムを用いてイオン強度を０.２に調整した。
【００１５】
以下、本発明につき実施例を挙げて説明する。
【００１６】
比較例１
必要量の上記各種溶液、１０μＬの８３ｍＭ５，５−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）のメタノール溶液、および０.２Ｍ塩化ナトリウム水溶液を加え、合わせて全量を０.９９５ｍｌにし、５分間超音波処理を行うことで下記式（７）で示したスフィンゴミエリン硫黄置換体溶液とＴｒｉｔｏｎＸ−１００の混合比を１：１０にした混合ミセル状態の基質溶液を調製した。この溶液を石英製のキュベットに移し、３７℃に保温したセルホルダーに入れ、４１２ｎｍにおける吸光度の経時変化を測定して、吸光度の変化が起こらないことを確認した。
【化８】
【００１７】
実施例１
必要量の上記各種溶液、１０μＬの８３ｍＭ５，５−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）のメタノール溶液，および，０.２Ｍ塩化ナトリウム水溶液を加え、合わせて全量を０.９９５ｍｌにし、５分間超音波処理を行うことで上記式（７）で示したスフィンゴミエリン硫黄置換体溶液とＴｒｉｔｏｎＸ−１００の混合比を１：１０にした混合ミセル状態の基質溶液を調製した。次に５μＬのスフィンゴミエリナーゼ溶液を加えて酵素反応を開始し、反応生成物のチオール基と５，５−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）とが瞬時に反応することで生じる２−ニトロ−５−チオ安息香酸（ＴＮＢ）の４１２ｎｍにおける吸光度の経時変化を測定することで、スフィンゴミエリナーゼの加水分解反応を調べた。なお、反応溶液中の塩化マグネシウム、ＴＥＳ−水酸化ナトリウム緩衝液 （ｐＨ７.５）、および５，５−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）の最終濃度はそれぞれ １０ｍＭ、５０ｍＭ、および０.８３ｍＭとした。図１は種々の基質濃度における吸光度の経時変化を示す。図中の１〜７のグラフには，それぞれスフィンゴミエリン硫黄置換体（７）の濃度を１.４、１.２、１.０、０.８、０.６、０.４、および０.２ｍＭにした時の結果を示す。
【００１８】
図１のように、上記式（７）で示したスフィンゴミエリン硫黄置換体の濃度に比例して、２−ニトロ−５−チオ安息香酸（ＴＮＢ）の吸光度が高く観測され、定量が可能である結果を示した。
【産業上の利用可能性】
【００１９】
本発明は、スフィンゴミエリン硫黄置換体がスフィンゴシンと同様にスフィンゴミエリナーゼによって加水分解されることに基づいており、更に同様の用途は、スフィンゴシン１−リン酸の硫黄類縁体がスフィンゴシンと同様の基質として認識されるならば、スフィンゴシンキナーゼの定量試薬としても利用できることになる。いずれの場合も、アッセイ系の確立に有効なだけでなく、スフィンゴミエリナーゼやスフィンゴシン１−リン酸キナーゼの診断薬となることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】各濃度の２−ニトロ−５−チオ安息香酸（ＴＮＢ）の４１２ｎｍにおける経時的吸光度を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）スフィンゴミエリナーゼ含有検体に下記一般式（１）
【化１】
（式中、Ｒ1およびＲ2は同一または異なって、不飽和結合を有することもある炭素数が１〜２０のアルキル基を意味する。）で表されるスフィンゴミエリン硫黄置換体を加え、該スフィンゴミエリナーゼにより加水分解され、遊離する下記一般式（２）
【化２】
（式中、Ｒ1およびＲ2は前掲と同じ。）で表されるチオールに、下記一般式（３）
【化３】
（式中、Ｒ3は水素原子、低級アルキル基、低級アルケニル基またはハロゲン原子を意味し、Ｒ1およびＲ2は前掲と同じ。）で表される５，５−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸類）を加え、該チオール（２）と特異的に反応させ、下記一般式（４）
【化４】
（式中、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は前掲と同じ。）で表される化合物を生成せしめ、そしてそれに伴い遊離する下記一般式（５）
【化５】
（式中、Ｒ3は前掲と同じ。）で表される２−ニトロ−５−チオ安息香酸類の吸光度を測定することを特徴とする該スフィンゴミエリナーゼ活性の定量法。
【請求項２】
請求項１において、Ｒ3が水素原子である請求項１のスフィンゴミエリナーゼ活性の定量方法。
【請求項１】
（１）スフィンゴミエリナーゼ含有検体に下記一般式（１）
【化１】
（式中、Ｒ1およびＲ2は同一または異なって、不飽和結合を有することもある炭素数が１〜２０のアルキル基を意味する。）で表されるスフィンゴミエリン硫黄置換体を加え、該スフィンゴミエリナーゼにより加水分解され、遊離する下記一般式（２）
【化２】
（式中、Ｒ1およびＲ2は前掲と同じ。）で表されるチオールに、下記一般式（３）
【化３】
（式中、Ｒ3は水素原子、低級アルキル基、低級アルケニル基またはハロゲン原子を意味し、Ｒ1およびＲ2は前掲と同じ。）で表される５，５−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸類）を加え、該チオール（２）と特異的に反応させ、下記一般式（４）
【化４】
（式中、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は前掲と同じ。）で表される化合物を生成せしめ、そしてそれに伴い遊離する下記一般式（５）
【化５】
（式中、Ｒ3は前掲と同じ。）で表される２−ニトロ−５−チオ安息香酸類の吸光度を測定することを特徴とする該スフィンゴミエリナーゼ活性の定量法。
【請求項２】
請求項１において、Ｒ3が水素原子である請求項１のスフィンゴミエリナーゼ活性の定量方法。
【図１】
【公開番号】特開２００６−１４６０６（Ｐ２００６−１４６０６Ａ）
【公開日】平成１８年１月１９日（２００６．１．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−１９２８０９（Ｐ２００４−１９２８０９）
【出願日】平成１６年６月３０日（２００４．６．３０）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１６年３月１１日 社団法人日本化学会発行の「日本化学会第８４春季年会 講演予稿集２」に発表
【出願人】（０００１０８９９３）ダイソー株式会社 (229)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１月１９日（２００６．１．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年６月３０日（２００４．６．３０）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１６年３月１１日 社団法人日本化学会発行の「日本化学会第８４春季年会 講演予稿集２」に発表
【出願人】（０００１０８９９３）ダイソー株式会社 (229)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]