スベリヒユ由来の組成物および血中グルコースレベルを調節するために該組成物を使用する方法
スベリヒユからの高血糖防止作用物質を含む組成物が提供される。また、かかる高血糖作用物質を単離する方法及びその使用方法が提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スベリヒユ（Ｐｏｒｔｕｌａｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ Ｌ．）から得られる組成物、および、より具体的には、血中グルコースレベルを調節するために該組成物を使用する方法に関連する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は、患者の健康、生活の質、および平均余命、ならびに保険医療システムに対して大きな影響を有する重大な慢性的代謝性障害である。米国では、糖尿病は主要な死因の６番目である［Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｄｉａｂｅｔｅｓ ａｎｄ ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ ａｎｄ ｋｉｄｎｅｙ ｄｉｓｅａｓｅｓ（１９９５）、Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ、Ｂｅｔｈｅｄａ、ＭＤ：ＮＩＤＤＭ ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ番号９６−３９２６］。
【０００３】
糖尿病はＩ型糖尿病（以前ではインスリン依存性糖尿病またはＩＤＤＭとして知られている）およびＩＩ型糖尿病（以前ではインスリン非依存性糖尿病またはＮＩＤＤＭとして知られている）の２つの大きなカテゴリーに分けられる。糖尿病の全体的な罹患率は人口の約６％であり、そのうちの９０％がＩＩ型である［Ｄｉａｂｅｔｅｓ（１９９６）、Ｖｉｔａｌ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ、Ａｌｅｘａｎｄｒｉａ，ＶＡ：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ］。糖尿病の処置および治療は国家の保険医療支出のかなりの部分に相当し、年間１０５０億ドルを超えている。
【０００４】
ＩＩ型糖尿病は、炭水化物および脂肪の代謝が乱れた症候群である。最も顕著な臨床的特徴は、１２６ｍｇ／ｄｌを超える空腹時血漿グルコースレベルによって明らかにされる高血糖症、または、６．９％を超えるグリコシル化ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）である。ほとんどのＩＩ型糖尿病患者において、発症は成人期においてであり、最も一般には、４０歳を超える肥満者においてである。高血圧、高脂血症、高インスリン症およびアテローム性動脈硬化が糖尿病に付随することが多い。
【０００５】
ＩＩ型糖尿病の早期段階は、インスリン標的組織（すなわち、肝臓、骨格筋および脂肪細胞）におけるインスリン抵抗性によって特徴づけられる。これらの組織におけるインスリン抵抗性は、肝臓による過度なグルコース産生および末梢組織（特に、筋肉）による損なわれたグルコース利用に関連する。これらの事象は代謝恒常性を徐々に衰えさせるが、早期段階における明白な糖尿病を直接的には生じさせない場合がある。インスリン抵抗性を代償するための増大したインスリン分泌により、基礎状態での血中グルコースレベルが正常範囲内で維持され得るが、患者は、食事性炭水化物負荷試験および経口ブドウ糖負荷試験に対する損なわれた応答を示す場合がある。インスリン分泌の慢性的な過剰刺激は小島β細胞の予備力を徐々に低下させ、最終的には使い果たす。絶対的なインスリン不足の状態が結果として生じ、そして、明白な糖尿病を生じさせる［ＤｅＦｒｏｎｚｏ（１９８８）、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、３７：６６７〜６８７；Ｓｅｅｌｙ（１９９３）、Ｉｎｓｕｌｉｎ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｉｓｏｒｄｅｒ（Ｍｏｌｌｅｒ Ｄ．編、Ｌｏｎｄｏｎ、Ｅｎｇｌａｎｄ：Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ．）、１８７〜２５２］。損なわれたグルコース耐性からＩＩ型糖尿病への移行率は、遺伝的背景、肥満、体脂肪分布、ほとんど運動しない生活様式、加齢、および付随する医学的状態によって大きく影響される［Ｃｌａｒｋ（１９９８）、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ｃａｒｅ、２１：Ｃ３２〜Ｃ３４］。
【０００６】
慢性的および重度の高血糖症を有するＩＩ型糖尿病患者の生活の質はひどく影響を受ける。典型的な症状には、疲労感および無気力が含まれ、これらは重症になることがあり、成人では作業能力の低下をもたらし、中高年では転倒の増大をもたらす。急性の合併症には、代謝上の様々な問題および感染が含まれる。長期間の合併症には、マクロ血管合併症（例えば、高血圧、異常脂質血症、心筋梗塞、卒中）、ミクロ血管合併症（例えば、網膜症、腎障害、糖尿病神経障害、下痢、神経因性膀胱、損なわれた心臓血管反射、性的機能不全）、および、足の障害がある。
【０００７】
ＩＩ型糖尿病の従来の処置は生活様式の管理に集中している。運動に加えて、体重管理および医学的栄養療法、経口グルコース低下薬、ならびにインスリン注射が従来の治療法である。薬理学的処置が、空腹時グルコースレベルが１４０ｍｇ／ｄｌを超えるか、または、食事後グルコースレベルが１６０ｍｇ／ｄｌを超えるか、または、ＨｂＡ１ｃが８％を超えるときには指示される。
【０００８】
ＩＩ型糖尿病を処置するための一般に利用されている経口薬剤には、第一世代および第二世代のスルホニルウレア剤（これらは膵臓β細胞からのインスリン分泌を高める）、薬用植物のガレガソウ（Ｇａｌｅｇａ Ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）から最初に得られたビグアニド剤（例えば、メトホルミン（登録商標））（これは、肝臓のグルコース産生を阻害し、かつ、筋肉のグルコース取り込みを増大させることによって血漿グルコースを低下させる）、α−グルコシダーゼ阻害剤（例えば、アスコルベート）（これは、炭水化物の消化を妨害し、かつ、グルコースの胃腸吸収を遅らせることによって食後のグルコースレベルを低下させる）、チアゾリジンジオン剤（例えば、トログリタゾン（登録商標）、ロシグリタゾン（登録商標）およびピオグリタゾン（登録商標））（これらは筋肉および肝臓におけるインスリン感受性を改善する）、ならびにメグリチニド剤（例えば、レパグリニド（登録商標））（これはインスリン分泌を増強する）が含まれる。
【０００９】
上記の経口血糖降下薬に対する初期の応答は申し分のないものであるが、これらの薬物は、処置された患者の著しい割合でその有効性を失い、また、処置には、通常、有害な副作用（例えば、体重増加、低血糖症、胃腸障害、肝臓毒性および高ＬＤＬコレステロールなど）が伴う［Ｄｅｙ（２００２）、Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗ、７：４５〜５８、および、それにおける参考文献］。これらの理由のために、血糖コントロールが経口薬物治療法の最大用量において次善であるときには、インスリンが通常、経口薬剤に加えられる。しかしながら、体重増加および低血糖症がインスリン治療の共通する副作用である。
【００１０】
従来の治療法に付随するこれらの重大な制限を考慮して、糖尿病を処置するための代わりの方法（例えば、高血糖防止活性を有する漢方薬など）が患者および保険医療専門家によってますます探し求められている。今日までに、糖尿病に対する４００を超える伝統的な植物処置が報告されている［Ｂａｉｌｅｙ（１９８９）、Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ、１２：５５３〜５６４］。だが、そのうちのほんの少数が、それらの効力を評価するために科学的評価および医学的評価を受けているに過ぎない。糖尿病を処置するための最も一般的に使用される薬草には、下記が含まれる：チョウセンニンジン（Ｇｉｎｓｅｎｇ）種、例えば、オタネニンジンおよびアメリカニンジンなどの種、これらは、著しい血糖降下作用を有することが報告されている；ツルレイシ（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）（ニガウリ）、これは、糖尿病に対する治療薬として民間療法で広く使用されている；フェヌグリーク（Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ ｆｏｅｎｕｍ ｇｒａｅｃｕｍ）（Ｆｅｎｕｇｒｅｅｋ）、これは、特にインドでは、糖尿病に対する治療薬として使用されている；ギムネマ・シルベスター（Ｇｙｍｎｅｍａ ｓｙｌｖｅｓｔｒｅ）；タマネギ（Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ）およびニンニク（Ａｌｌｉｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）、これらは、生のタマネギ片およびニンニク片に存在する揮発油に由来する血糖低下効果を有する；プテロカルプス・マルスピウム（Ｐｔｅｒｏｃａｒｐｕｓ ｍａｒｓｕｐｉｕｍ）および他のエピカテキン含有植物；アロエベラ（Ａｌｏｅ ｖｅｒａ）およびその他。
【００１１】
スベリヒユは、Ｐｕｒｓｌａｎｅ、ＶｅｒｄｏｌａｇａおよびＰｕｒｓｌｅｙとしてもまた知られており、世界のほとんどの地域で栽培される食用の多肉性の「草」である。
【００１２】
スベリヒユは、多くの生物学的に活性な化合物、ならびに、多くの栄養素を含有しており、これらには、アルカロイド、ω−３脂肪酸、クマリン類、フラボノイドおよびアントラキノングリコシドが含まれる（２）。
【００１３】
この植物は、広範囲の様々な病気に対する治療薬として、特に寄生虫に対する処置として、また、消化器系障害に対する治療薬として伝統的に使用されている。加えて、抗炎症活性および抗真菌活性がスベリヒユには伴っている。世界中からの未確認の報告では、多くの病気および状態に対する治療薬としてスベリヒユの使用が明らかにされた（３）。
【００１４】
スベリヒユは高血糖症に対する治療薬として以前に報告されている。ＥｓｋａｎｄｅｒおよびＨ．Ｗｏｎ Ｊｕｎ（４）は、血液中のグルコースレベルを低下させることにおけるスベリヒユ（植物全体）の効力を示した。ＰＣＴ国際特許出願公開００／００２１１は、血液中の糖レベルを低下させるための、スベリヒユから抽出されたヒドロコロイドの使用を教示する。
【００１５】
本発明を実施に移しているとき、本発明者らは、スベリヒユの極性抽出物および非極性抽出物が、その必要性のある対象において血中グルコースレベルを生物学的に安全な様式で調節するために効率よく使用できることを発見した。
【発明の開示】
【００１６】
本発明の１つの態様によれば、スベリヒユ（Ｐｏｒｔｕｌａｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ Ｌ．）から高血糖防止作用物質を単離する方法が提供され、この場合、この方法は、極性成分をスベリヒユから抽出し、それにより、スベリヒユから高血糖防止作用物質を単離することを含む。
【００１７】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、抽出は、極性が増大する溶媒グラジエントを用いることによって行われる。
【００１８】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、抽出はエタノール−水抽出によって行われる。
【００１９】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、極性が増大する溶媒は、ヘキサン、酢酸エチル、ジクロロメタン、メタノールおよび水である。
【００２０】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、極性が増大する溶媒は、ヘキサン：ジクロロメタン：酢酸エチル（１：１：１）およびメタノール：エタノール：水（１：１：１）である。
【００２１】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、この方法はさらに、極性成分を抽出物から精製することを含む。
【００２２】
本発明の別の態様によれば、スベリヒユから高血糖防止作用物質を単離する方法が提供され、この場合、この方法は、非極性成分をスベリヒユから抽出し、それにより、スベリヒユから高血糖防止作用物質を精製することを含む。
【００２３】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、抽出は、非極性溶媒を使用して行われる。
【００２４】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、抽出はエタノール−水抽出によって行われる。
【００２５】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、非極性溶媒は、ヘキサン、ジクロロメタンおよび酢酸エチルからなる群から選択される。
【００２６】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、この方法はさらに、非極性成分を抽出物から精製することを含む。
【００２７】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、非極性成分を抽出物から精製することは薄層クロマトグラフィーによって行われる。
【００２８】
本発明のなお別の態様によれば、スベリヒユのエタノール−水抽出物を含む組成物が提供される。
【００２９】
本発明のさらに別の態様によれば、スベリヒユの極性画分抽出物を含む組成物が提供される。
【００３０】
本発明のさらなる態様によれば、血中グルコースレベルを低下させるための、スベリヒユの極性抽出物を含む組成物の使用が提供される。
【００３１】
本発明のなおさらなる態様によれば、スベリヒユの非極性画分抽出物を含む組成物が提供される。
【００３２】
本発明のさらにさらなる態様によれば、血中グルコースレベルを低下させるための、スベリヒユの非極性抽出物を含む組成物の使用が提供される。
【００３３】
本発明のさらなる態様によれば、血中グルコースレベルを低下させるための、スベリヒユのエタノール−水抽出物を含む組成物の使用が提供される。
【００３４】
本発明のなおさらなる態様によれば、スベリヒユの極性画分抽出物を含む組成物の治療効果的な量と、医薬的に許容され得るキャリアまたは希釈剤とを含む、血中グルコースレベルを低下させるための医薬組成物が提供される。
【００３５】
本発明のさらにさらなる態様によれば、スベリヒユの非極性画分抽出物を含む組成物の治療効果的な量と、医薬的に許容され得るキャリアまたは希釈剤とを含む、血中グルコースレベルを低下させるための医薬組成物が提供される。
【００３６】
本発明のさらにさらなる態様によれば、スベリヒユのエタノール−水抽出物を含む組成物の治療効果的な量と、医薬的に許容され得るキャリアまたは希釈剤とを含む、血中グルコースレベルを低下させるための医薬組成物が提供される。
【００３７】
本発明のさらにさらなる態様によれば、対象における高血糖関連疾患を処置する方法が提供され、この場合、この方法は、スベリヒユのエタノール−水抽出物を含む組成物の治療効果的な量をその必要性のある対象に投与し、それにより、対象における高血糖関連疾患を処置することを含む。
【００３８】
本発明のさらにさらなる態様によれば、対象における高血糖関連疾患を処置する方法が提供され、この場合、この方法は、スベリヒユの極性画分抽出物を含む組成物の治療効果的な量をその必要性のある対象に投与し、それにより、対象における高血糖関連疾患を処置することを含む。
【００３９】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、極性抽出物は血液中のグルコースレベルを低下させることができる。
【００４０】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、極性画分抽出物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．０〜０．４５の範囲にＲｆ値を有する。
【００４１】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、極性画分抽出物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．０〜０．３２の範囲にＲｆ値を有する。
【００４２】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、極性画分抽出物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１７〜０．４１の範囲にＲｆ値を有する。
【００４３】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、スベリヒユの極性画分抽出物は、メタノールを使用してソックスレー抽出によって抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．０、０．３１、０．３４、０．３６、０．３９および０．４５からなる群から選択されるＲｆ値を有する。
【００４４】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、スベリヒユの極性画分抽出物は、水を使用してソックスレー抽出によって抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．０のＲｆ値を有する。
【００４５】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、スベリヒユの極性画分抽出物は、メタノールを用いて抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．０、０．１５、０．３０および０．３２からなる群から選択されるＲｆ値を有する。
【００４６】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、スベリヒユの極性画分抽出物は、メタノール：エタノール：水を１：１：１の比率で用いて抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１７、０．２７、０．３０、０．３４、０．３９および０．４１からなる群から選択されるＲｆ値を有する。
【００４７】
本発明のさらにさらなる態様によれば、対象における高血糖関連疾患を処置する方法が提供され、この場合、この方法は、スベリヒユの非極性画分抽出物を含む組成物の治療効果的な量をその必要性のある対象に投与し、それにより、対象における高血糖関連疾患を処置することを含む。
【００４８】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、スベリヒユの非極性画分抽出物はヒドロコロイドを含まない。
【００４９】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、高血糖関連疾患は、糖尿病、クッシング病、クッシング症候群、摂食障害、損なわれたグルコース耐性、腎糸球体微小血管障害、びまん性糸球体硬化症、結節性糸球体硬化症、尿路感染症、急性腎盂腎炎、壊死性乳頭炎、気腫性腎盂腎炎、グリコーゲンネフローゼ（アルマンニ−エブシュタイン病変）、網膜症、非増殖性網膜症、毛細血管瘤、網膜浮腫滲出物、出血、増殖性網膜症、小血管の増殖、出血性線維症、網膜剥離、白内障、レンズの浸透圧変化による一過性の屈折異常、虹彩における血管の増殖による緑内障、網膜感染症、脳血管のアテローム硬化性疾患、神経障害、皮膚感染症、冠状動脈のアテローム性動脈硬化、心筋梗塞、末梢のアテローム性動脈硬化：四肢虚血、壊疽、増大した胎児死亡率、増大した感染感受性、および、遅れた創傷治癒からなる群から選択される。
【００５０】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、非極性画分抽出物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１１〜０．８９の範囲にＲｆ値を有する。
【００５１】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、非極性画分抽出物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１１〜０．８８の範囲にＲｆ値を有する。
【００５２】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、非極性画分抽出物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１７〜０．９１の範囲にＲｆ値を有する。
【００５３】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、スベリヒユの非極性画分抽出物は、ヘキサンを使用してソックスレー抽出によって抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．３６、０．４５、０．５２、０．７１および０．８８からなる群から選択されるＲｆ値を有する。
【００５４】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、スベリヒユの非極性画分抽出物は、酢酸エチルを使用してソックスレー抽出によって抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１１、０．１８、０．３１、０．３６、０．４５、０．５２および０．７１からなる群から選択されるＲｆ値を有する。
【００５５】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、スベリヒユの非極性画分抽出物は、ヘキサンを用いて抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．３、０．３２、０．４１、０．４７および０．８９からなる群から選択されるＲｆ値を有する。
【００５６】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、スベリヒユの非極性画分抽出物は、酢酸エチルを用いて抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１５、０．３６、０．４７、０．７３および０．８９からなる群から選択されるＲｆ値を有する。
【００５７】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、スベリヒユの非極性画分抽出物は、ヘキサン：ＤＣＭ：酢酸エチルを１：１：１の割合で用いて抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１７、０．３０、０．３６、０．４１、０．６８および０．９１からなる群から選択されるＲｆ値を有する。
【００５８】
本発明のさらにさらなる態様によれば、血液中のグルコースレベルを調節するための作用物質を特定する方法が提供され、この場合、この方法は、（ａ）スベリヒユの抽出物を分画化し、それにより、複数の画分を得ること；および（ｂ）血液中のグルコースレベルを調節することができる少なくとも１つの画分を前記複数の画分から特定し、それにより、血液中のグルコースレベルを調節するための作用物質を特定することを含む。
【００５９】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、分画化は、極性が増大する溶媒グラジエントを用いて行われる。
【００６０】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、工程（ｂ）は、（ｉ）腸を介したグルコース吸収および／または（ｉｉ）細胞内へのグルコース輸送に対する画分の影響を調べることによって行われる。
【００６１】
本発明は、スベリヒユに由来する新規な組成物、および、血中グルコースレベルを調節するために該組成物を使用する方法を提供することによって、現在知られている形態の欠点に対処することに成功している。
【００６２】
本明細書で使用される技術用語と科学用語はすべて、特に断らない限り、本発明の属する技術分野の当業者が共通して理解しているのと同じ意味を持っている。本明細書に記載されているのと類似の又は均等の方法と材料は本発明を実施又は試験するのに使用できるが、適切な方法と材料は以下に述べる。争いが生じた場合、定義を含めて本特許明細書が基準である。さらに、本明細書の材料、方法及び実施例は例示することだけを目的とし本発明を限定するものではない。
【００６３】
図面の説明
本明細書では本発明を単に例示し図面を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の好ましい実施態様を例示考察することだけを目的としており、本発明の原理や概念の側面の最も有用でかつ容易に理解される説明であると考えられるものを提供するために提示していることを強調するものである。この点について、本発明を基本的に理解するのに必要である以上に詳細に本発明の構造の詳細は示さないが、図面について行う説明によって本発明のいくつもの形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
【００６４】
図１は血中グルコースレベルが試験開始時に３００ｍｇ／ｄｌを超えるインスリン非依存性糖尿病患者（図１ａ）、および、血中グルコースレベルが試験開始時に３００ｍｇ／ｄｌ未満であるインスリン非依存性糖尿病患者（図１ｂ）における血中グルコースレベルに対するスベリヒユ抽出物の影響を示すグラフである。
図２はＭＴＴアッセイを使用して測定されたときの、ＨｅｐＧ２細胞の生存性に対するスベリヒユ抽出物の増大する濃度の影響を示す棒グラフである；すべての測定を三連で行った。測定をスベリヒユの同じ抽出物に対して行った。
図３はＭＴＴアッセイを使用して測定されたときの、ＨｅｐＧ２およびＴＨＰ１の同時培養物の生存性に対するスベリヒユ抽出物の増大する濃度の影響を示す棒グラフである；細胞生存性を処理細胞および非処理細胞の吸収パーセントとして測定した。すべての測定を三連で行った。
図４はＭＴＴアッセイを使用して測定されたときの、ＬＰＳにより刺激されたＨｅｐＧ２およびＴＨＰ１の同時培養物の生存性に対するスベリヒユ抽出物の増大する濃度の影響を示す棒グラフである。
図５はＬＤＨアッセイを使用して測定されたときの、ＨｅｐＧ２細胞からの総ＬＤＨ放出（細胞を完全に破壊した後でのＬＤＨ濃度、培地中へのＬＤＨの放出最大量）の百分率としてのＬＤＨ放出に対するスベリヒユ抽出物の増大する濃度の影響を示す棒グラフである；すべての測定を三連で行った。
図６はＬＤＨアッセイを使用して測定されたときの、ＨｅｐＧ２細胞およびＴＨＰ１細胞の同時培養物からのＬＤＨ放出の百分率に対するスベリヒユ抽出物の増大する濃度の影響を示す棒グラフである；すべての測定を三連で行った。
図７はＬＤＨアッセイによる、ＬＰＳ刺激されたＨｅｐＧ２およびＴＨＰ１の同時培養物からのＬＤＨ放出の百分率に対するスベリヒユ抽出物の増大する濃度の影響を示す棒グラフである。
図８はアルブミン分泌アッセイを使用して測定されたときの、ＨｅｐＧ２細胞におけるアルブミン産生に対するスベリヒユ抽出物の増大する濃度の影響を示す棒グラフである；結果が、コントロールの非処置細胞からの総アルブミン分泌の百分率として示される。
図９はＭＤＡアッセイを使用したときの、ヒツジ肝臓ホモジネートにおける１０μＭのＦｅＳＯ４により誘導される脂質過酸化に対するスベリヒユのアルコール・水抽出物の増大する濃度の影響を示す棒グラフである（ｎ＝３）；Ｘ軸は、１０μＭの硫酸鉄を含有する細胞ホモジネートの溶液における薬草抽出物の濃度を（ｍｇ／ｍｌで）示す。すべての測定を三連で行った。
図１０は時間の関数としての、ヒツジ腸を介するグルコース吸収に対するスベリヒユ抽出物の影響を示す線グラフである；ｐ１およびｐ２は、同じ条件のもとで行われた２つの異なる実験である。
図１１は酵母細胞におけるグルコース取り込みに対するスベリヒユ抽出物の影響を示す線グラフである。グラフは４つの別個の実験を示し、その平均値を示す。測定を植物抽出物添加後６０分で行った。グルコース取り込みの増大（％で表される）が植物抽出物の増大する量の存在下で示されることに留意すること。
図１２は活性成分を植物から精製するための段階毎の手順を例示する流れ図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６５】
本発明は、血中グルコースレベルを調節するために使用することができるスベリヒユ由来の組成物に関する。具体的には、本発明の高血糖防止組成物は、高血糖関連疾患（例えば、ＩＩ型糖尿病など）を処置することのために血中グルコースレベルを低下させるために使用することができる。本発明の低血糖防止組成物は、低血糖関連疾患（例えば、小島細胞過形成など）を処置することのために血中グルコースレベルを増大させるために使用することができる。
【００６６】
本発明の原理および操作は、図面および添付された説明を参照してより良く理解することができる。
【００６７】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明に示される細部または実施例によって例示される細部に限定されないことを理解しなければならない。本発明は、他の実施形態が可能であり、または様々な方法で実施することができ、または様々な方法で実施される。また、本明細書中で用いられる表現および用語は説明のためであり、従って限定として見なされるべきではないことを理解しなければならない。
【００６８】
ＩＩ型糖尿病は慢性的な代謝性疾患であり、患者の健康、生活の質、および平均余命に対する大きな影響を有する。グルコース恒常性を改善するために不可欠ではあるが、生活様式管理対策（すなわち、運動、食事および体重管理）は不十分である場合があり、このことは従来の薬物治療（例えば、経口グルコース低下剤（すなわち、血糖低下剤）など）を多くの患者については必要にしている。
【００６９】
しかしながら、現在利用可能な経口投与される抗糖尿病薬は、処置された患者の著しい割合でその有効性を失っており、また、加えて、処置には、通常、様々な有害な副作用、例えば、体重増加、低血糖、胃腸障害、肝臓毒性、高ＬＤＬコレステロールおよび大きな費用などが付随する。これらの理由のために、インスリンが、通常、最大経口送達投薬量で経口薬剤に加えられる。これらの理由のために、医学分野界は、ＩＩ型糖尿病患者を処置するために使用することができる新しい高血糖防止作用物質を絶えず捜し求めている。
【００７０】
スベリヒユは、Ｐｕｒｓｌａｎｅ、ＶｅｒｄｏｌａｇａおよびＰｕｒｓｌｅｙとしてもまた知られており、広範囲の様々な病気に対する治療薬として、特に寄生虫感染および消化器系障害に対する治療薬として伝統的に使用されている。スベリヒユはまた、高血糖症に対する治療薬としても報告されている。（ｉ）ＰＣＴ国際特許出願公開００／００２１１は、血液中の糖レベルを低下させるためのスベリヒユ由来のヒドロコロイドの使用を教示する。（ｉｉ）ＥｓｋａｎｄｅｒおよびＨ．Ｗｏｎ Ｊｕｎ（４）は、糖尿病の処置のために、エジプトの民間療法で使用される数多くの薬草（スベリヒユを含む）をスクリーニングして、それらの血糖低下効果および血中インスリン増加効果を確認した。水に懸濁された乾燥粉砕薬草からなる動物飼料として作製された粗薬草抽出物がアロキサン糖尿病ラットに投与された。ＥｓｋａｎｄｅｒおよびＨ．Ｗｏｎ Ｊｕｎ（４）は、スベリヒユが、処置されたラットの血中グルコースレベルを低下させることにおいて効果的であることを示した。しかしながら、この動物飼料には、植物の固体粒子、ならびに、水抽出物が含まれたので、この活性を何らかの特定の植物成分に帰属することができなかった。
【００７１】
本発明を実施に移しているとき、本発明者らは、スベリヒユのエタノール−水抽出物が、糖尿病被験者において血中グルコースレベルを生物学的に安全な様式で低下させるために効率よく使用され得ることを発見した。さらに本発明を実施に移しているとき、本発明者らは、スベリヒユから抽出された極性画分および非極性画分がこの高血糖防止作用に関係することを発見した。
【００７２】
下記の実施例の節において例示されるように、様々な異常に高いグルコースレベル（すなわち、３００ｍｇ／ｄｌ超または３００ｍｇ／ｄｌ未満）を有するヒト糖尿病被験者に対するスベリヒユのエタノール−水抽出物の投与は被験者の血中グルコースレベルを正常にまで有意に低下させた（実施例の節の実施例２を参照のこと）。この抗糖尿病作用を媒介する活性な成分を単離する試みにおいて、この植物の逐次極性抽出が行われた（実施例の節の実施例１を参照のこと）。興味深いことに、スベリヒユ由来の極性成分および非極性成分の両方により、異なる作用機構によるものではあるが、血中グルコースレベルを低下させることを説明することができた。すなわち、スベリヒユ由来の極性抽出物が、細胞膜を介した細胞内へのグルコース輸送を増大させたが、非極性抽出物は腸のグルコース吸収を低下させた。
【００７３】
従って、今回のこれらの発見は、スベリヒユ由来の非極性抽出物および極性抽出物が、（同じ植物のエタノール−水抽出物と同様に）、グルコース代謝の異なる段階に対して作用することを示している（本質的には、それぞれ、小腸を介したグルコース吸収の阻害、および、細胞へのグルコース輸送の促進）。このことから、血中グルコースレベルを低下させることにおけるそれらの個々の使用または混合使用が示唆される。
【００７４】
本発明の組成物は、インビトロ細胞生存性アッセイ（すなわち、ＭＴＴ）および細胞機能アッセイ（例えば、アルブミン分泌アッセイおよび乳酸デヒドロゲナーゼアッセイ、実施例３を参照のこと）によって明らかにされるように、生物学的に安全な様式で作用することが示された。このことは本発明の組成物の使用を臨床的に実行可能にしている。
【００７５】
従って、本発明の１つの態様によれば、スベリヒユのエタノール−水抽出物を含む組成物が提供される。
【００７６】
好ましくは、本発明のこの態様の組成物におけるエタノール−水の比率は８０％−２０％である。
【００７７】
本発明のこの態様の組成物は、細胞内へのグルコース輸送を増大させ、および／または、腸を介したグルコース吸収を低下させることによって血液中のグルコースレベルを低下させることができる。
【００７８】
上記で述べられたように、本発明者らは、活性な成分（すなわち、血中グルコースレベルを低下させることができる活性な成分）をスベリヒユから単離することができた。
【００７９】
従って、本発明の別の態様によれば、スベリヒユの組織（例えば、葉、茎、根または植物全体）の極性画分抽出物を含む組成物が提供される。
【００８０】
本明細書中で使用される表現「スベリヒユの組織」は、完全なスベリヒユ植物またはその一部分（例えば、葉、根、茎および滲出物など）を示す。
【００８１】
本明細書中で使用される「極性画分抽出物」は、極性成分から構成され、かつ、極性溶媒（例えば、アルコールなど）を使用して得られるスベリヒユ抽出物を示す。本発明のスベリヒユ抽出物は、好ましくは、固体の植物粒子を含まない。
【００８２】
用語「極性」は、双極子モーメントを形成する負極および正極を有する極性の官能基を有する化合物（例えば、アミド、酸、アルコール、ケトン、アルデヒド、アミン）を示す。極性画分抽出物には、植物組織の表面に見出される化合物（すなわち、滲出物）、または、植物組織内ではあるが、植物細胞（アポプラスト）の外側に見出される化合物、または、植物の細胞の内部に見出される化合物（細胞質性、液胞性またはオルガネラ捕捉）が含まれ得る。
【００８３】
極性画分抽出のために好適な溶媒の例には、水およびアルコール（例えば、メタノール、エタノールおよびイソプロピルアルコールなど）が含まれるが、これらに限定されない。植物組織全体を、組織の破壊を必要とすることなく、そのような溶媒に浸すことができる。だが、組織のそのような物理的操作は、極性成分の抽出を実質的に改善するので好ましい。本発明とともに利用され得る組織破壊技術の例には、凍結組織の粉砕、および、ホモジナイザーを使用する均質化が含まれる。植物組織の抽出を改善するための他の前処理方法が下記に記載される。
【００８４】
下記の実施例の節において例示されるように、本発明の教示に従って得られる極性画分抽出物は血液中のグルコースレベルを正常なレベル［すなわち、１１５ｍｇ／ｄｌ未満の正常な空腹時血中（すなわち、血漿）グルコースレベル］に低下させることができる。実施例の節の実施例４において例示されるように、極性抽出物に対して行われた分析では、極性抽出物は、細胞内へのグルコース輸送を増大させることができる成分を含むことが明らかにされた。
【００８５】
本発明のこの態様の組成物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒混合物を使用するアルミニウムシート上でのシリカゲル６０Ｆ２５４［２０×２０ｃｍ（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）］での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、保持因子（Ｒｆ、溶媒先端が移動した距離によって除される、化合物が移動した距離）の値が０．０〜０．５０の範囲（より好ましくは０．０〜０．４５の範囲、さらに一層より好ましくは０．０〜０．３２の範囲、なおさらに一層より好ましくは０．１７〜０．４１の範囲）にある成分を含む。
【００８６】
スベリヒユの極性画分抽出物は、メタノールを使用してソックスレー抽出によって抽出することができ（下記の実施例１を参照のこと）、そのような場合、極性画分抽出物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．０、０．３１、０．３４、０．３６、０．３９および０．４５のＲｆ値を有する成分を含む。
【００８７】
本発明のスベリヒユの極性画分抽出物は、水を使用してソックスレー抽出によって抽出することができ、そのような場合、極性画分抽出物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．０のＲｆ値を有する成分を含む。
【００８８】
本発明のスベリヒユの極性画分抽出物は、メタノールを用いて抽出することができ、そのような場合、極性画分抽出物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．０、０．１５、０．３０および０．３２のＲｆ値を有する成分を含む。
【００８９】
最後に、スベリヒユの極性画分抽出物は、メタノール：エタノール：水を１：１：１の比率で用いて抽出することができ、そのような場合、極性画分抽出物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１７、０．２７、０．３０、０．３４、０．３９および０．４１のＲｆ値を有する成分を含む。
【００９０】
下記の実施例の節の実施例１において示されるように、スベリヒユから得られる非極性抽出物は小腸からのグルコース吸収を低下させることができ、そのため、血液中のグルコース濃度を低下させるために使用することができる。
【００９１】
従って、本発明のさらに別の態様によれば、スベリヒユの非極性画分抽出物を含む組成物が提供される。
【００９２】
本明細書中で使用される「非極性画分抽出物」は、非極性成分から構成され、かつ、非極性溶媒を使用して得られるスベリヒユ抽出物を示す。
【００９３】
用語「非極性」は、正極または負極が形成されないように電荷の分離を有しない非極性の官能基（例えば、アルキル、シアノ、エステルおよび他の非イオン性基）を有する化合物を示す。非極性成分を抽出するために使用され得る非極性溶媒の例には、ヘキサン、シクロヘキサン、酢酸エチルおよびトルエンが含まれるが、これらに限定されない。
【００９４】
非極性画分抽出物には、植物組織の表面に見出される化合物（すなわち、滲出物）、または、植物組織内ではあるが、植物細胞（アポプラスト）の外側に見出される化合物、または、植物の細胞の内部に見出される化合物（細胞質性、液胞性またはオルガネラ捕捉）が含まれ得る。
【００９５】
本発明のこの態様の非極性画分抽出物は、血液中のグルコースレベルを好ましくは正常なレベル［例えば、少なくとも７５ｍｇ／ｄｌ］に低下させることができ、このことは、高血糖防止作用物質（すなわち、血中糖レベルを低下させることができる作用物質）としてのその使用を示唆している。下記の実施例の節の実施例１において例示されるように、本発明の非極性画分抽出物は、小腸を介したグルコース吸収を低下させ、そのため、高血糖防止作用物質として使用することができる。
【００９６】
本発明のこの態様の組成物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用するアルミニウムプレート上でのシリカゲル６０Ｆ２５４［２０×２０ｃｍ（製造：Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）］での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、Ｒｆ値が０．１１〜０．９５の範囲（より好ましくは０．１１〜０．８９の範囲、さらに一層より好ましくは０．１１〜０．８８の範囲、なおさらに一層より好ましくは０．１７〜０．９１の範囲）にある成分を含む。
【００９７】
好ましくは、スベリヒユの非極性画分抽出物は、ヘキサンを使用してソックスレー抽出（下記参照）によって抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．３６、０．４５、０．５２、０．７１または０．８８のＲｆ値を有する成分を含む。
【００９８】
本発明のスベリヒユの非極性画分抽出物は、酢酸エチルを使用してソックスレー抽出によって抽出することができ、そのような場合、非極性画分抽出物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１１、０．１８、０．３１、０．３６、０．４５、０．５２または０．７１のＲｆ値を有する成分を含む。
【００９９】
本発明のスベリヒユの非極性画分抽出物は、ヘキサンを用いて抽出することができ、そのよう場合、非極性画分抽出物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．３、０．３２、０．４１、０．４７または０．８９のＲｆ値を有する成分を含む。
【０１００】
本発明のスベリヒユの非極性画分抽出物は、酢酸エチルを用いて抽出することができ、そのような場合、非極性画分抽出物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１５、０．３６、０．４７、０．７３または０．８９のＲｆ値を有する成分を含む。
【０１０１】
最後に、スベリヒユの非極性画分抽出物は、ヘキサン：ジクロロメタン（ＤＣＭ）：酢酸エチルを１：１：１の割合で用いて抽出することができ、そのような場合、非極性画分抽出物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１７、０．３０、０．３６、０．４１、０．６８または０．９１のＲｆ値を有する成分を含む。
【０１０２】
本発明の高血糖防止作用物質（すなわち、極性画分抽出物および非極性画分抽出物）は、好ましくは、ヒドロコロイド（水溶液においてゲルを形成する物質）を含まない。
【０１０３】
本発明の高血糖防止作用物質は、極性成分を植物から抽出することによってスベリヒユから単離することができる。
【０１０４】
活性な成分を植物から単離する様々な方法がこの分野では広く知られている。植物材料からの活性な成分の一般的な単離手順が図１２の流れ図に記載される［Ｗｉｎｋ（１９９９）、Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ｅｘｐｌｏｉｔａｔｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）もまた参照のこと］。
【０１０５】
典型的には、目的とする植物組織が得られる。植物のオルガネラもまた、極性成分の供給源として使用され得ることが理解される。例えば、植物の液胞を、極性成分を抽出するために使用することができる。植物のプロトプラストを液胞の供給源として単離する様々な方法がこの分野では広く知られている［例えば、Ｇｕｙ，Ｍ．他、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、６４：６１〜６４（１９７９）を参照のこと］。
【０１０６】
このようにして得られた植物組織は新鮮物または乾燥物であり得る。好ましくは、乾燥物が、さらなる大規模抽出を簡略化するために使用される。従って、植物組織は、使用前のその貯蔵を長くすることができる、乾燥（実施例の節の実施例１もまた参照のこと）および粉砕などの前処理に供することができる。
【０１０７】
植物材料は、その後、本明細書中に記載される極性成分（有効成分）を単離するために抽出に供される。
【０１０８】
本明細書中で使用される用語「抽出」は、極性溶媒対非極性溶媒における溶解性などの特徴における化学的および／または物理的な差に基づいて混合物を分離する手法を示す。数多くの抽出手法がこの分野では知られている。
【０１０９】
本発明のこの態様によるスベリヒユからの極性画分の抽出は、好ましくは、極性が増大する溶媒を順次使用して行われる。本質的には、乾燥させた植物材料が、別個の溶媒（例えば、ヘキサン、その後、酢酸エチルおよびクロロホルム）によって、あるいは、そのような溶媒の混合物を使用することによって非極性抽出に供される。その後、同じ植物材料は極性抽出に供される。そのような逐次抽出工程は、活性な成分を単離する分離度を改善する。
【０１１０】
例えば、極性が増大する溶媒グラジエント（例えば、ヘキサン、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、エタノールおよび水）を用いることによって行われる極性成分のソックスレー抽出が下記の実施例の節の実施例１に示される。この方法は、好ましくは、熱安定性の化合物に関して使用される。
【０１１１】
その後、活性な成分（例えば、極性成分）が、この分野で広く知られている精製方法を使用して抽出物から精製される。例えば、抽出物を、極性が増大する溶媒を用いてシリカゲル（ＴＬＣ、薄層クロマトグラフィー）プレートで分離することができる。サンプルは、好ましくは、プレートに直ちに付けられ、酸化を最小限に抑えるために間を置かずに処理される。だが、抽出物の乾燥もまた行うことができる（下記の実施例の節の実施例１を参照のこと）。活性な成分がＵＶ光のもとで可視化される。可視化はまた、プレートに発色剤（例えば、リンモリブデン酸のエタノール溶液）を噴霧し、加熱して色の変化を生じさせることによって行うことができる。このＴＬＣ法は効率的であり、迅速であり、かつ、感度および簡便性と低コストとを併せ持つ。
【０１１２】
粉末化された植物材料からの活性な成分の効率的な抽出はまた、促進溶媒抽出（ＡＳＥ）によって、すなわち、高い温度および圧力での高められた可溶化速度論を利用する手法［Ｏｂａｎａ Ａｎａｌｙｓｔ．（１９９７）、１２２（３）：２１７〜２０］によって行うことができる。
【０１１３】
活性な成分は、様々な生物学的アッセイを使用して定量することができる。好適な生物学的読み取りの選択は活性な成分の所望する機能に依存する。従って、血中グルコースレベルを調節する化合物を特定するために、実施例４に記載されるアッセイのいずれかを使用することができる。有効成分が、本明細書中下記においてさらに記載されるようなケモインフォマティクスを使用して化学的に特定される。
【０１１４】
例えば、ＵＶフォトダイオードアレイ検出器に連結されたＨＰＬＣ（ＬＣ／ＤＡＤ−ＵＶ）および質量分析法に連結されたＨＰＬＣ（ＬＣ／ＭＳまたはＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）は、単離前の抽出物における活性な成分についての構造的情報を提供することができる［Ｏｕｔｔａｒａ、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００４）、６５（８）：１１４５〜５１を参照のこと］。ハイフンで結ばれた技術（例えば、ＬＣ／ＵＶ、ＬＣ／ＭＳおよびＬＣ／ＭＳ／ＮＭＲ［Ｍａｚｚａ、Ｊ ＡＯＡＣ Ｉｎｔ．２００４（Ｊａｎ−Ｆｅｂ）、８７（１）：１２９〜４５；Ｗｏｌｆｅｎｄｅｒ、Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ．、２００３（Ｊｕｎ ６）、１０００（１−２）：４３７〜５５］など）を使用する化学的スクリーニングは、微量の植物材料を用いて、既知の植物成分の構造的情報を提供することができる。このことは、粗植物抽出物から直接、新規な化合物と、既知の化合物とを区別することを可能にする。
【０１１５】
あるいは、所望の活性（例えば、高血糖防止活性）をバイオアッセイ（例えば、小腸を介するグルコース輸送）で示す植物抽出物を、ＬＣ／ＵＶ／ＭＳを使用する分析によって化学的にスクリーニングすることができる。分離を、広いアセトニトリルグラジエントまたはメタノールグラジエントを用いた逆相ＲＰ−Ｃ１８カラムで行うことができる。ＵＶスペクトルが記録され、分子量情報が、サーモスプレー、連続流高速原子衝撃、大気圧化学的イオン化またはエレクトロスプレーイオン化を用いたＭＳによって得られる。フラグメントの情報がタンデムＭＳ／ＭＳ実験または多段ＭＳｎ実験によって得られ、一方で、ＬＣ／ＮＭＲが、化合物の正体を確認するために使用される。
【０１１６】
一体化された、情報が多い検出システム（例えば、クロマトグラフィー−紫外−核磁気共鳴−質量分析（ＬＣ−ＵＶ−ＮＭＲ−ＭＳ）など）、ならびに、他のゲノミクス法およびプロテオミクス法を、植物由来の目的とする活性な成分を特定するために使用することができる。
【０１１７】
植物（すなわち、スベリヒユ）からの非極性成分の単離を、上記で記載された方法を使用して行うことができ、非極性溶媒は、非極性成分を抽出する最初の工程で使用されるだけである。
【０１１８】
本明細書中上記で述べられたように、本発明の高血糖防止作用物質（すなわち、極性抽出物、非極性抽出物、エタノール−水抽出物）を、血液中のグルコースレベルを調節するために使用することができる。
【０１１９】
従って、本発明では、対象における高血糖関連疾患を処置する方法が意図される。
【０１２０】
本明細書中で使用される表現「高血糖関連疾患」は、その発症および／または進行について高血糖症に依存する疾患を示す。本明細書中で使用される用語「高血糖（症）」は、血液中の異常に高いグルコース濃度（すなわち、１１５ｍｇ／ｄｌを超える）を示す。高血糖に関係づけられる疾患および障害の例には、糖尿病、クッシング病、クッシング症候群、摂食障害（例えば、神経性食欲不振、食欲不振、過食症）、損なわれたグルコース耐性（ＩＧＴ）、腎糸球体微小血管障害、びまん性糸球体硬化症、結節性糸球体硬化症（キンメルスティール−ウィルソン病）、尿路感染症、急性腎盂腎炎、壊死性乳頭炎、気腫性腎盂腎炎、グリコーゲンネフローゼ（アルマンニ−エブシュタイン病変）、網膜症、非増殖性網膜症、毛細血管瘤、網膜浮腫滲出物、出血、増殖性網膜症、小血管の増殖、出血性線維症、網膜剥離、白内障、レンズの浸透圧変化による一過性の屈折異常、虹彩における血管の増殖による緑内障、網膜感染症、脳血管のアテローム硬化性疾患（卒中）、末梢神経障害（末梢の感覚神経および運動神経、頭蓋神経、自律神経）、皮膚感染症（カルブンケルを生じさせる毛包炎）、糖尿病性リポイド類壊死症（微小血管障害に起因する）、黄色腫（高脂血症に対して二次的）、冠状動脈のアテローム性動脈硬化（心筋梗塞）、末梢のアテローム性動脈硬化（四肢虚血）、壊疽、増大した胎児死亡率（胎盤疾患、新生児呼吸窮迫症候群、感染症）、増大した感染感受性、および、遅れた創傷治癒が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２１】
本明細書中で使用される用語「処置する」は、本発明の疾患の有害な影響を防止すること、治療すること、逆転させること、弱めること、緩和すること、最小限に抑えること、抑制すること、または停止させることを示す。
【０１２２】
本明細書中で使用される用語「その必要のある対象」は、本発明の疾患に罹患しているか、または、本発明の疾患に罹りやすい哺乳動物対象（例えば、ヒト）を示す。
【０１２３】
本発明のこの態様による方法は、対象（本明細書中下記においてさらに記載される）に治療効果的な量の本発明の組成物（すなわち、上記に記載されるスベリヒユの極性抽出物、非極性抽出物またはエタノール−水抽出物）を投与し、それにより、対象における高血糖関連疾患を処置することによって行われる。本発明の組成物のそれぞれ（すなわち、極性抽出物および非極性抽出物）がグルコース代謝の異なる段階、および、そのようなものとして、グルコース代謝の補体阻害を阻害するように作用するので、その混合投与が、治療効力を改善するために好ましいことが理解される。従って、これらの組成物は対象に同時に（一緒に）、または連続して投与することができる。
【０１２４】
本発明の組成物（すなわち、高血糖防止作用物質）は、対象に、それ自体で、または、組成物が医薬的に許容され得るキャリアと混合される医薬組成物の一部として投与することができる。
【０１２５】
本明細書中で使用される「医薬組成物」は、本明細書中に記載される有効成分の１つまたは複数と、他の化学的成分（例えば、生理学的に好適なキャリアおよび賦形剤）との調製物を示す。医薬組成物の目的は、生物に対する化合物の投与を容易にすることである。
【０１２６】
本明細書中において、用語「有効成分（活性成分）」は、生物学的効果を説明することができる調製物を示す。
【０１２７】
以降、表現「生理学的に許容され得るキャリア」および表現「医薬的に許容され得るキャリア」は交換可能に使用することができ、生物に対する著しい刺激を生じさせず、かつ、投与された調合物の生物学的活性および生物学的性質を阻害しないキャリアまたは希釈剤を示す。佐剤がこれらの表現に含まれる。医薬的に許容され得るキャリアに含まれる成分の１つが、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、すなわち、有機媒体および水性媒体の両方において広範囲の溶解性を有する生体適合性ポリマーであり得る（Ｍｕｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７９））。
【０１２８】
本明細書中において、用語「賦形剤」は、有効成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性な物質を示す。賦形剤の非限定的な例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖およびタイプのデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールが含まれる。
【０１２９】
薬物の配合および投与のための様々な技術が“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、最新版）（これは参考として本明細書中に組み込まれる）に見出され得る。
【０１３０】
好適な投与経路には、例えば、局所的送達、膣内送達、経尿道送達、経口送達、直腸送達、経粘膜送達、経皮送達（特に経鼻送達）、腸管送達または非経口送達（これには、筋肉内注射、皮下注射および髄内注射、ならびに、クモ膜下注射、直接的な脳室内注射、静脈内注射、腹腔内注射、鼻内注射または眼内注射が含まれる）が含まれ得る。あるいは、例えば患者の身体の特定領域中への調製物の直接注射によって調製物を系統的な方法によりむしろ局所的な方法で投与してもよい。
【０１３１】
本発明の医薬組成物は、この分野で十分に知られている様々なプロセスによって、例えば、混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、研和、乳化、カプセル化、包括化または凍結乾燥の従来のプロセスによって製造することができる。
【０１３２】
本発明に従って使用するための医薬組成物は有効成分を医薬として使用可能な製剤にする加工を容易にする賦形剤及び補助剤を含む一つ以上の医薬的に許容され得るキャリアを使用して従来のように配合されてもよい。適切な配合は選択された投与経路に依存する。
【０１３３】
注射の場合、本発明の活性成分は、水溶液において、好ましくは生理学的に適合し得る緩衝液（例えば、ハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理学的な生理的食塩水緩衝液など）において配合することができる。経粘膜投与の場合、浸透剤が配合において使用される。そのような浸透剤はこの分野では一般に知られている。好ましくは、本発明の化合物は経口的に投与される。経口投与の場合、化合物は、活性な化合物を、この分野で十分に知られている薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせることによって容易に配合することができる。そのようなキャリアにより、本発明の化合物は、患者によって経口摂取される錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー剤、懸濁物などとして配合することが可能になる。経口使用される薬学的調製物は、錠剤または糖衣錠コアを得るために、固体の賦形剤を使用し、得られた混合物を場合により粉砕し、そして所望する場合には好適な補助剤を添加した後、顆粒の混合物を加工して作製することができる。好適な賦形剤は、具体的には、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む糖などの充填剤；セルロース調製物、例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボメチルセルロースなど；および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの生理学的に受容可能なポリマーである。所望する場合には、架橋型ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩（アルギン酸ナトリウムなど）などの崩壊剤を加えることができる。
【０１３４】
糖衣錠コアには、好適なコーティングが施される。この目的のために、高濃度の糖溶液を使用することができ、この場合、糖溶液は、場合により、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液および好適な有機溶媒または溶媒混合物を含有し得る。色素または顔料が、活性な化合物の量を明らかにするために、または活性な化合物の量の種々の組合せを特徴づけるために、錠剤または糖衣錠コーティングに添加され得る。
【０１３５】
経口使用され得る医薬組成物には、ゼラチンから作製されたプッシュ・フィット型カプセル、ならびにゼラチンおよび可塑剤（グリセロールまたはソルビトールなど）から作製された軟密閉カプセルが含まれる。プッシュ・フィット型カプセルは、充填剤（ラクトースなど）、結合剤（デンプンなど）、滑剤（タルクまたはステアリン酸マグネシウムなど）および場合により安定化剤と混合された有効成分を含有し得る。軟カプセルでは、活性な化合物を好適な液体（脂肪油、流動パラフィンまたは液状のポリエチレングリコールなど）に溶解または懸濁させることができる。さらに、安定化剤を加えることができる。経口投与される配合物はすべて、選ばれた投与経路に好適な投薬形態でなければならない。
【０１３６】
口内投与の場合、組成物は、従来の様式で配合された錠剤またはトローチの形態を取ることができる。
【０１３７】
鼻腔吸入による投与の場合、本発明に従って使用される有効成分は、好適な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンまたは二酸化炭素）の使用により加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー提示物の形態で都合よく送達される。加圧されたエアロゾルの場合、投薬量単位は、計量された量を送達するためのバルブを提供することによって決定され得る。吸入器または吹き入れ器で使用される、例えば、ゼラチン製のカプセルおよびカートリッジで、化合物と好適な粉末基剤（ラクトースまたはデンプンなど）との粉末混合物を含有するカプセルおよびカートリッジを配合することができる。
【０１３８】
本明細書で記述される調製物は非経口投与、例えばボーラス注射または連続点滴のために配合されることができる。注射のための配合は、単位用量形態（例えばアンプルまたは多用量コンテナ）で提供されることができ、これらには所望により保存剤が添加されている。組成物は懸濁物、溶液または油性もしくは水性ビヒクル中のエマルションであることができ、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤の如き配合剤を含むことができる。
【０１３９】
非経口投与される医薬組成物には、水溶性形態における活性な調製物の水溶液が含まれる。さらに、活性な化合物の懸濁物を、適切なオイル状のまたは水ベースの注射用懸濁物として調製することができる。好適な親油性の溶媒またはビヒクルには、脂肪油（ゴマ油など）、または合成脂肪酸エステル（オレイン酸エチルなど）、トリグリセリドまたはリポソームが含まれる。水性の注射用懸濁物は、懸濁物の粘度を増大させる物質、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランなどを含有し得る。場合により、懸濁物はまた、高濃度の溶液の調製を可能にするために化合物の溶解性を増大させる好適な安定化剤または薬剤を含有し得る。
【０１４０】
あるいは、有効成分は、使用前に好適なビヒクル（例えば、滅菌されたパイロジェン非含有水）を用いて構成される粉末形態にする。
【０１４１】
本発明の調製物はまた、例えば、カカオ脂または他のグリセリドなどの従来の座薬基剤を使用して、座薬または停留浣腸剤などの直腸用組成物に配合することができる。
【０１４２】
本発明に関連した使用のために好適な医薬組成物には、有効成分が、意図された目的を達成するために効果的な量で含有される組成物が含まれる。より具体的には、治療効果がある量は、処置されている対象の疾患の症状を防止、軽減または改善するために、あるいは、処置されている対象の生存を延ばすために効果的な有効成分の量を意味する。
【０１４３】
治療効果がある量の決定は十分に当業者の範囲内である。
【０１４４】
本発明の方法に使用される調製物に対して、治療的に有効な量又は用量は最初にインビトロ分析から分析されることができる。例えば、用量は動物モデルで配合されることができ、かかる情報は人間に有用な用量をより正確に決定するために使用されることができる。
【０１４５】
本明細書中に記載される有効成分の毒性および治療効力は、インビトロ、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手法によって明らかにすることができる。これらのインビトロアッセイおよび細胞培養アッセイならびに動物研究から得られたデータは、ヒトへの使用のための投薬量範囲を定める際に使用することができる。投薬量は、用いられる投薬形態物および利用される投与経路に依存して変化し得る。正確な配合、投与経路および投薬量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選ぶことができる（例えば、Ｆｉｎｇｌ他、１９７５、“Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”（第１章、１頁）を参照のこと）。
【０１４６】
処置される状態の重篤度および応答性に依存して、投薬は単回投与または多回投与が可能であり、処置の経過が、数日から数週間まで、あるいは、治癒が達成されるまで、または、疾患状態の縮小が達成されるまで続く。
【０１４７】
投与される組成物の量は、当然のことではあるが、処置されている対象、苦痛の重篤度、投与様式、主治医の判断などに依存する。
【０１４８】
適合し得る医薬用キャリアに配合された本発明の調製物を含む医薬組成物はまた、適応状態の処置のために調製し、適切な容器に入れ、表示することができる。
【０１４９】
本発明の医薬組成物は、所望される場合には、活性成分を含有する一つ以上の単位投薬形態物を含有し得る、ＦＤＡ承認キットなどのパックまたはディスペンサーデバイスで提供され得る。パックは、例えば、金属箔またはプラスチック箔を含むことができ、例えば、ブリスターパックなどである。パックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための説明書が添付され得る。パックまたはディスペンサーにはまた、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府当局により定められた形式で容器に付けられた通知が伴い得る。この場合、そのような通知は、組成物の形態またはヒトもしくは動物への投与の当局による承認を反映する。そのような通知は、例えば、処方薬物についての米国食品医薬品局により承認されたラベル書きであり得るか、または承認された製品添付文書であり得る。
【０１５０】
本発明の上記の治療法は、この分野で知られている他の処置様式と併用され得ることが理解される。例えば、本発明の高血糖防止作用物質は、糖尿病を処置する方法において様々な天然物質または合成物質と組み合わせることができる。そのような物質の例には、ギムネマ・シルベスタ、フェヌグリーク、ニガウリ、α−リポ酸、バナナ葉、ヤコウ（ｙａｃｏｕ）根、ツルレイシ、オリーブ葉抽出物、プテロカルプス・マルスピウム、サラシア・レチクラータ（ｓａｌａｃｉａ ｒｅｔｉｃｕｌａｔｅ）、ニンニク、サンザシ、コロソール酸、ウルソール酸、Ｄ−ピニトール、アロエ・ベラ、ピコリン酸クロム、ホスファチジルコリン、ω−３脂肪酸、レジスタントデンプン、ニチニチソウ（ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ ｒｏｓｅｕｓ）、カシューナットノキ（ａｎａｃａｒｄｉｕｍ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ）、ムラサキフトモモ（ｓｙｚｙｇｉｕｍ ｃｕｍｉｎｉ）、ユーカリ（ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｌｏｂｕｌｅｓ）、シロバナハウチワマメ（ｌｕｐｉｎｕｓ ａｌｂｕｓ）、タマネギ、ニンニク、キンレイジュ（ｔｅｃｏｍａ ｓｔａｎｓ）、セイヨウイラクサ（ｕｒｔｉｃａ ｄｉｏｉｃａ）、セイヨウタンポポ（ｔａｒａｘａｃｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ）、オオヒメクグ（ｋｙｌｌｉｎｇａ ｍｏｎｏｃｅｐｈａｌａ）、アンマロク（ｐｈｙｌｌａｎｔｈｕｓ ｅｍｂｌｉｃａ）、キダチミカンソウ（ｐｈｙｌｌａｎｔｈｕｓ ｎｉｒｕｒｉ）、インドセンダン（ａｚａｄｉｒａｃｈｔａ ｉｎｄｉｃａ）、モルブス・アルバ（ｍｏｒｂｕｓ ａｌｂａ）、ポテリウム・アンシストロイデス（ｐｏｔｅｒｉｕｍ ａｎｃｉｓｔｒｏｉｄｅｓ）、ニンジン（ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）、インスリン、ならびに、他の経口投与される薬剤、例えば、スルホニルウレア剤、ビグアニド剤、α−グルコシダーゼ阻害剤、チアゾリジンジオン剤およびメグリトニド剤などが含まれるが、これらに限定されない。糖尿病を処置する方法において使用される物質のこれらの組合せは、それぞれの成分（すなわち、スベリヒユ抽出物、および、スベリヒユ抽出物が投与のために組み合わせられる物質）に起因すると考えられる利益をもたらす。
【０１５１】
本発明の組成物はまた、栄養学的添加物として、例えば、スポーツ栄養補給を改善するためなどの栄養学的添加物として使用され得ることが理解される。それによれば、本発明の組成物は単独で使用することができ、あるいは、下記の天然に存在する（例えば、植物由来の）物質または化学化合物のいずれか１つの効果的な用量と組み合わせることができる：クレアチン、クレアチン一水和物、クレアチン塩（例えば、クエン酸クレアチン、ピルビン酸クレアチンなど）、クレアチン誘導体およびその塩、ホスホクレアチン、カフェイン、α−リポ酸、グルコサミン、コンドロイチン、加水分解コラーゲン、メチルスルホニル−メタン、乳清タンパク質、Ｌ−グルタミン、ホスファチジルコリン、コリン、コリン塩、ホスファチジルセリン、β−ヒドロキシ−β−メチルブチラート、ピルバート、Ｌ−カルニチン、Ｄ−リボース、アミノ酸（通常型アミノ酸）、分岐鎖アミノ酸、Ｓ−アデノシルメチオニン、タウリン、共役リノール酸、α−リポ酸、α−リポ酸塩、ならびにグリセリン。様々な化合物の塩を参照することにおいて、本発明では、化合物および任意の好適な塩形成対イオン（例えば、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、ハロゲンイオン、有機カチオン、有機イオン、錯イオン、および、この分野で知られている任意の他の対イオンなど）が意図される。
【０１５２】
本発明の組成物はまた、体重を調節するために（すなわち、体重管理のために）使用され得ることがさらに理解される。この場合、効果的な用量の本発明の組成物が下記の天然に存在する物質（例えば、植物由来の物質）または化学化合物のいずれか１つの効果的な用量と組み合わせられる：ピルビン酸、Ｌ−カルニチン、ヒドロキシクエン酸、エフェドリン、カフェインおよび共役リノール酸（ＣＬＡ）。栄養補給（例えば、スポーツ栄養補給など）を改善するための方法において使用される物質のこれらの組合せはまた、それぞれの成分（すなわち、スベリヒユ抽出物、および、スベリヒユ抽出物が投与のために組み合わせられる物質）に起因すると考えられる利益をもたらす。
【０１５３】
本発明の組成物は治療用キットまたは栄養補給キットに包装することができる。
【０１５４】
例えば、本発明の組成物は、適切な緩衝剤および保存剤とともに１つまたは複数の容器に詰めることができ、また、治療的処置を導くために使用することができる。
【０１５５】
従って、組成物（例えば、スベリヒユのエタノール−水画分抽出物、極性画分抽出物および非極性画分抽出物）を１つの容器において混合することができ、または、個々の容器に入れることができる。好ましくは、容器はラベルを含む。好適な容器には、例えば、ビン、バイアル、シリンジおよび試験管が含まれる。容器は、様々な材料から、例えば、ガラスまたはプラスチックなどから形成され得る。
【０１５６】
加えて、他の添加剤（例えば、安定化剤、緩衝剤および阻止剤など）もまた加えることができる。
【０１５７】
キットはまた、検査された対象が、異常な血中グルコースレベルに関連する状態、障害または疾患に罹患しているかどうか、あるいは、異常な血中グルコースレベルに関連する状態、障害または疾患を発症する危険性があるかどうかを明らかにするための説明書を含むことができる。
【０１５８】
本発明の追加の目的、利点及び新規な特徴は、下記実施例を考察すれば、当業技術者には明らかになるであろう。なおこれら実施例は本発明を限定するものではない。さらに、先に詳述されかつ本願の特許請求の範囲の項に特許請求されている本発明の各種実施態様と側面は各々、下記実施例の実験によって支持されている。
【実施例】
【０１５９】
上記説明とともに、以下の実施例を参照して本発明を例示する。なおこれら実施例によって本発明は限定されない。
【０１６０】
本願で使用される用語と、本発明で利用される実験方法には、分子生化学、微生物学及び組み換えＤＮＡの技法が広く含まれている。これらの技法は文献に詳細に説明されている［例えば以下の諸文献を参照されたい。「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら１９８９年；Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｒ．Ｍ．編１９９４年「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻；Ａｕｓｕｂｅｌら著１９８９年「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，米国メリーランド州バルチモア；Ｐｅｒｂａｌ著「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，米国ニューヨーク１９８８年；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ、米国ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら編「Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ」１〜４巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク１９９８年；米国特許の４６６６８２８号、４６８３２０２号、４８０１５３１号、５１９２６５９号及び５２７２０５７号に記載される方法；Ｃｅｌｌｉｓ， Ｊ．Ｅ．編「Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｉ〜ＩＩＩ巻１９９４年；Ｃｏｌｉｇａｎ， Ｊ．Ｅ．編「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻１９９４年；Ｓｔｉｔｅｓら編「Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ、米国コネティカット州ノーウォーク１９９４年；ＭｉｓｈｅｌｌとＳｈｉｉｇｉ編「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、米国ニューヨーク１９８０年；また利用可能な免疫検定法は、例えば以下の特許と科学文献に広範囲にわたって記載されている。米国特許の３７９１９３２号、３８３９１５３号、３８５０７５２号、３８５０５７８号、３８５３９８７号、３８６７５１７号、３８７９２６２号、３９０１６５４号、３９３５０７４号、３９８４５３３号、３９９６３４５号、４０３４０７４号、４０９８８７６号、４８７９２１９号、５０１１７７１号及び５２８１５２１号；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」１９８４年；Ｈａｍｅｓ， Ｂ．Ｄ．及びＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」１９８５年；Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．及びＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」１９８４年；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， Ｒ．Ｉ．編「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」１９８６年；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ １９８６年；Ｐｅｒｂａｌ， Ｂ．著「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」１９８４年及び「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ１９９０年；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ」、ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ、１９９６年；なおこれらの文献類は、あたかも本願に完全に記載されているように援用するものである］。その外の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。本明細書に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。本明細書に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。
【０１６１】
実施例１
スベリヒユ（Ｐｏｒｔｕｌａｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ Ｌ．）由来の生物活性成分の精製、単離および特定
最初の実験では、スベリヒユの抽出を、非極性から極性まで変化する溶媒を使用して段階的に行った。２つの主要な予備的手法を開発し、効力について比較した。それにより得られた結果を、その後、標準的な抽出手順の開発において利用した。
【０１６２】
実施例１ａ
反復ソックスレー抽出
実験手順
材料。溶媒をＦｒｕｔａｒｏｍ Ｌｔｄ．（Ｈａｉｆａ、イスラエル）またはＪ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ（Ｄｅｖｅｎｔｅｒ、オランダ）から購入し、溶媒は、別途指定されない限り、分析規格であった。Ｄ−グルコース一水和物をＲｉｅｄｅｌ−ｄｅ Ｈａｅｎ（Ｓｅｅｌｚｅ、ドイツ）から購入した。さらなる研究用化学薬品をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、米国）から購入した。
【０１６３】
ソックスレー抽出。２０ｇの乾燥スベリヒユ粉砕物を標準的なソックスレー抽出用円筒ろ紙に入れ、粉砕物を、下記においてさらに記載されるように２５０ｍｌの溶媒を用いて抽出した。抽出を５回行い、それぞれ、極性が増大する下記の５つの異なる溶媒の１つを使用した：ヘキサン、酢酸エチル、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、メタノールおよび水。抽出を溶媒の還流下で完全な２サイクルにわたって続けた（すなわち、２回、円筒ろ紙を溶媒で満たし、空にした）。抽出後、溶媒を真空ロタベイパーでエバポレーションし、乾燥した抽出物を集め、重量測定した。残留する植物材料を６５℃において乾燥器で乾燥し、その後、さらに抽出した。乾燥抽出物を集め、薄層クロマトグラフィーによって分析した［（ＴＬＣ）、シリカプレート、アルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４、ジクロロメタン（ＤＣＭ）−ヘキサン−メタノール（１：１：０．２）にて］。ＴＬＣプレートを、ＵＶによって、また、ＩＰＡにおける５％リンモリブデン酸による染色によって可視化した。
【０１６４】
腸を介したグルコース吸収。下記の実施例４を参照のこと。
【０１６５】
細胞内へのグルコース輸送。実施例４を参照のこと。
【０１６６】
結果
抽出収量。下記の表１には、５つの溶媒のそれぞれを使用したスベリヒユの反復ソックスレー抽出の結果、ならびに残渣が示され、併せて、各抽出部の対応する重量（グラム単位）、植物材料の総量の抽出された百分率、および、物理的特徴に関する所見が列挙される。
【表１】
【０１６７】
ＴＬＣ分析。下記の表２には、５つの反復ソックスレー抽出物のそれぞれのＴＬＣ分析の結果が列挙される。ＵＶおよび／または染色によって視認され得るすべてのスポットがＲｆ値として報告される。
【表２】
【０１６８】
得られたＴＬＣパターンの分析では、最も強い強度のスポット（０．４５および０．３６）が、５つの画分のうちの４つで、ある程度現れたことが示された。これらのスポットの強度はＤＣＭ抽出物において最も強いようであった。だが、ＤＣＭは、ＴＬＣプレートに塗布する前に蒸発してしまっているかもしれない非常に揮発性の溶媒であり、それにより、より小さい、より濃縮されたスポットをもたらすので、このことは惑わせるかもしれない。このＴＬＣ分析で得られた分離は、多くの化合物が極性および非極性の両方の性質を有するようであり、従って、脂肪酸、ステロイドおよびアミンなどの分子については当てはまるように、両方の条件のもとで抽出され得ることを示していた。
【０１６９】
生物学的活性の分析。抽出物を、２つの標準的なバイオアッセイを使用して、すなわち、腸を介するグルコース吸収（この場合、腸を介するグルコースの吸収に対する抽出物の影響が、実施例４に記載されるように測定される）、および、細胞内へのグルコース輸送（この場合、血流から細胞内部へのグルコースの輸送に対する影響が、実施例４において同様に記載されるように測定される）を使用して生物学的活性について分析した。下記の表３には、５つの抽出物のそれぞれのバイオアッセイの結果が列挙される。
【表３】
【０１７０】
実施例１ｂ
室温（ＲＴ）法によるスベリヒユ活性成分の抽出
材料および実験手順
ＲＴ抽出。１００ｇｒの乾燥スベリヒユ粉砕物を１ｌの溶媒とともにガラスビーカーに入れ、ＲＴで２４時間（ｈｒ）撹拌した。抽出を、極性が増大する下記の５つの異なる溶媒の１つを使用して並行して５回行った：ヘキサン、酢酸エチル、ＤＣＭ、メタノールおよび水。抽出後、植物材料をろ過して除き、ろ液の溶媒を真空ロタベイパーでエバポレーションし、乾燥した抽出物を集め、重量測定した。残留する植物材料を６５℃において乾燥器で乾燥し、その後、さらに抽出した。乾燥抽出物を集め、実施例１ａにおいて記載されたようにＴＬＣによって分析した。
【０１７１】
腸を介したグルコース吸収。下記の実施例４を参照のこと。
【０１７２】
細胞内へのグルコース輸送。実施例４を参照のこと。
【０１７３】
結果
抽出収量。下記の表４には、５つの溶媒のそれぞれを使用したＲＴ抽出の結果、ならびに残渣が示され、併せて、各抽出部の対応する重量（グラム単位）、植物材料の総量の抽出された百分率、および、物理的特徴に関する所見が列挙される。
【表４】
【０１７４】
ＴＬＣ分析。表５には、５つのＲＴ抽出物のそれぞれのＴＬＣ分析の結果が列挙される。ＵＶおよび／または染色によって視認され得るすべてのスポットがＲｆ値として報告される。
【表５】
【０１７５】
ＴＬＣパターンの分析では、明確な分離が、より高い領域（０．８９〜０．４７）におけるスポットと、より低い領域（０．３０〜０．０）におけるスポットとの間で示された。非極性から極性への移行は、スポットが０〜１の全範囲全体に存在するソックスレー抽出における場合よりも顕著であるようであった。
【０１７６】
これらの結果は、非極性物質のほとんどがヘキサンによって除かれたこと、および、極性物質が、メタノールまたは水を使用して抽出されたことを示している。ＴＬＣプレートの中間領域における大きな画分は、極性および非極性の両方の特徴を有する分子の存在を示している。
【０１７７】
生物学的活性の分析。抽出物を、実施例４において同様に記載されるように、２つの標準的なバイオアッセイ（腸を介するグルコース吸収、および、細胞内へのグルコース輸送）を使用して生物学的活性について分析した。表６には、５つの抽出物のそれぞれのバイオアッセイの結果が列挙される。
【表６】
【０１７８】
実施例１ｃ
反復ソックスレー抽出法およびＲＴ抽出法の比較
これら２つの予備的な抽出法を下記の基準に基づいて比較した：抽出効率、すなわち、各溶媒を使用して抽出された植物材料の割合、および、溶媒における抽出された物質の濃度（ｇ／ｍｌの単位で）；抽出の清浄度、すなわち、抽出時における材料の分解を示すＴＬＣにおける筋の形成；ＴＬＣにより検出される両手順での各溶媒により抽出された物質；および、抽出物の生物活性。
【０１７９】
抽出効率。両方の抽出手法から得られた全データは類似しており（上記の表１〜表５を参照のこと）、また、一般的には、両手法の異なる溶媒が同一のＴＬＣスポットを生じさせた。このことは、類似する成分がおそらくは抽出されたことを示している。反復ソックスレー抽出はＲＴ抽出よりも大きい収量で物質をもたらした（極性溶媒を使用したときにはそれぞれ１９％対１２％、また、非極性溶媒を使用したときにはそれぞれ５％対１．２％）。このことが、ソックスレー抽出の方が効率が大きいこと、または、望ましくない植物物質の抽出を示しているかどうかは、現在、調査中である。
【０１８０】
抽出の清浄度。ＲＴ抽出は、ＴＬＣプレート上での筋のあるスポットおよび細長いスポット（これらは過度な加熱の結果としての分解産物を示す）が観測された反復ソックスレー抽出よりも清浄であることが見出された。
【０１８１】
ＴＬＣ比較。一般に、両方の抽出手法は、類似する主要なＴＬＣスポットを類似する強度で与えた。反復ソックスレー法の方が多くのスポットを与えた。これは、様々な物質がより大きく濃縮された結果であり得るか、または、分解の結果であり得る。
【０１８２】
生物活性。検出された生物活性は極性−非極性分割の全面に明らかに分布していた。細胞内へのグルコース輸送は極性画分（メタノールおよび水）に明らかに関連し、活性が非極性画分では見出されなかった一方で、腸壁を介したグルコース吸収は非極性成分に関連していた；グルコース吸収は非極性画分によって明らかに減少した。
【０１８３】
考察
上記の抽出手法により、それぞれがグルコース代謝の異なる部分において活性である２つの別個の植物画分の存在が示された。非極性抽出物画分は、腸を介した低下したグルコース吸収活性を示し、一方、極性画分は、細胞への増強されたグルコース輸送を示した。これらの画分は、有効成分を解明する過程での一段階である。
【０１８４】
明らかに少なくとも２つ、おそらくは３つの異なる因子が、スベリヒユ抽出物の観測された生物学的活性に関係している。
【０１８５】
これらの抽出手法は、抽出を２工程（すなわち、非極性溶媒を使用する工程、および、極性溶媒を使用する工程）に削減することによって簡略化することができる。加えて、ＲＴ抽出の収率は少し低いが、この方法は、生じ得る分解が回避され得るので好ましい。重要な化合物が反復ソックスレー法によってさらに抽出されるかどうかはまだ検討されていない。逐次抽出手法は、活性な成分の単離を最大限にするために用いられるはずであり、本質的には、非極性抽出が最初に行わなければならず、その後、極性抽出が行われることに留意すること。
【０１８６】
実施例１ｄ−標準的な２段階法によるスベリヒユの抽出
材料および実験手順
標準的な２段階抽出。２００ｇの乾燥スベリヒユ粉砕物を２ｌの溶媒混合物とともにガラスビーカーに入れ、ＲＴで２４ｈｒ撹拌した。抽出を、下記の２つの異なる溶媒混合物を用いて順次行った：非極性：ヘキサン−ＤＣＭ−酢酸エチル（１：１：１）、および、極性：メタノール−エタノール−水（１：１：１）。抽出後、植物材料をろ過して除き、ろ液の溶媒を真空ロタベイパーでエバポレーションし、乾燥した抽出物を集め、重量測定した。残留する植物材料を６５℃において乾燥器で乾燥し、その後、さらに抽出した。乾燥抽出物を集め、実施例１ａにおいて記載されたようにＴＬＣによって分析した。
【０１８７】
腸を介したグルコース吸収。下記の実施例４を参照のこと。
【０１８８】
細胞内へのグルコース輸送。実施例４を参照のこと。
【０１８９】
結果
抽出収量。下記の表７には、この標準的な２段階抽出の各画分（非極性、極性または残渣）の重量（グラム単位）、植物材料の総量の抽出された対応する百分率、ならびに、物理的特徴に関する所見が示される。
【表７】
【０１９０】
ＴＬＣ分析。表８には、ＵＶ下および染色によって視認され得るすべてのスポットのＲｆ値として報告されるＴＬＣ分析の結果が示される。
【表８】
【０１９１】
３つのＴＬＣスポット（０．４１、０．３０および０．１７）が両方の抽出手法に共通していた。さらなる分析が、何らかの相関する生物学的活性を示すためには必要である。
【０１９２】
生物学的活性の分析。抽出物を、実施例４に記載されるように、２つの標準的なバイオアッセイ（腸を介するグルコース吸収、および、細胞へのグルコース輸送）を使用して生物学的活性について分析した。表９には、これら２つのバイオアッセイを使用して測定されたスベリヒユ抽出物の非極性画分および極性画分の生物学的活性がまとめられている。
【表９】
【０１９３】
考察
スベリヒユの生物活性成分の特定および精製を目指した標準的な抽出手法を開発した。この２段階手法は、非極性抽出、その後の極性抽出からなり、極性画分および非極性画分の両方ならびに生物活性成分の良好な初期分離をもたらした。スベリヒユのこの２段階抽出は、生物活性因子のさらなる精製および特定のための良好な基礎を形成している。
【０１９４】
実施例２
ヒト糖尿病患者の血中グルコースレベルに対するスベリヒユ抽出物の影響
材料および実験手順
試験被験者。ヒト被験者に対する試験をＮａｚａｒｅｔｈ地区（イスラエル）の医師および生化学実験室との協力で行った。２群の非インスリン性（２型）糖尿病患者を、血液中のグルコースレベルに対するスベリヒユ抽出物の影響について評価した。患者は、血中グルコースの初期レベルに基づいて２つの群の一方に割り振られた。試験開始時に、第１群の患者における血中グルコースレベルは３００ｍｇ／ｄｌを超えており、一方、第２群の血中グルコースレベルは３００ｍｇ／ｄｌ未満であった。下記の表１０には、試験開始時の血中グルコースレベルが３００ｍｇ／ｄｌを超えている患者の特徴および臨床履歴が示される。
【表１０】
【０１９５】
下記の表１１には、試験開始時の血中グルコースが３００ｍｇ／ｄｌ未満である患者の特徴および臨床履歴が示される。
【表１１】
【０１９６】
患者に投与されるスベリヒユ抽出物の調製。エタノール−水（８０％−２０％）のスベリヒユ抽出物を、ＴＣＰ結合剤（β−リン酸三カルシウム）を用いて作製した。抽出を、粉砕乾燥植物材料およびエタノール−水（８０−２０）を１０−９０（ｗ／ｗ）の比率で使用して４０℃で４時間行った。溶液をろ過し、抽出物を、ＴＣＰ（商業的に使用されている結合剤物質）の存在下、０℃で真空乾燥した。
製造物の最終組成は２５％の抽出物および７５％の結合剤物質であった。抽出の収率は８重量％〜９重量％であった。
【０１９７】
血中グルコースレベルの測定。グルコースを、毎週、１２ｈｒの絶食の後、市販のグルコメーターを使用して測定した。
【０１９８】
結果
スベリヒユのエタノール・水抽出物（標準的な植物ゼラチンカプセルに封入された乾燥粉末）を、何らかの他の薬物治療の非存在下、４５０ｍｇ／日（１００ｍｇの活性な抽出物）の投薬量で投与した。図１ａおよび図１ｂのグラフは、血中グルコースが３００ｍｇ／ｄｌを超えるインスリン非依存性糖尿病患者、および、血中グルコースが３００ｍｇ／ｄｌ未満であるインスリン非依存性糖尿病患者に対するスベリヒユ抽出物の影響をそれぞれ示している。スベリヒユ抽出物は、初期の血中グルコースレベルにもかかわらず、両群のすべての患者においてグルコース血中レベルを正常化することができたことがグラフから明らかである。血中グルコースレベルは、空腹時血中グルコースが１２６ｍｇ／ｄｌ（７．０ｍｍｏｌ／Ｌ）以上であるとき、２時間の経口ブドウ糖負荷試験結果が２００ｍｇ／ｄｌ（１１．１ｍｍｏｌ／Ｌ）以上であるときには、アメリカ糖尿病学会（ＡＤＡ）の基準に従って糖尿病であると見なされることに留意すること。
【０１９９】
考察
両群の２型糖尿病患者において、血中グルコースレベルの顕著な低下が観測された。試験開始時の血中グルコースが３００ｍｇ／ｄｌ未満である糖尿病患者は２週間後〜３週間後において正常な血中グルコースレベルを維持した。正常な血中グルコースレベルが、３００ｍｇ／ｄｌを超える初期レベルを有する糖尿病患者群では４週間後〜５週間後において得られた。
【０２００】
実施例３
本発明のスベリヒユ抽出物のインビトロでの毒性作用試験
スベリヒユのインビトロでの生物安全性を多数のインビトロ毒性学アッセイによって検討した。細胞生存性および細胞傷害性（ＭＴＴアッセイおよびＬＤＨ放出アッセイ）、肝細胞における分化した機能の発現（アルブミン分泌アッセイ）、ならびに、脂質過酸化（酸化ストレスの主要な指標）（ＭＤＡアッセイ）に対するスベリヒユ抽出物の影響を調べた。ヒト肝細胞株（ＨｅｐＧ２）、肝細胞および単球細胞株（ＴＨＰ１）の同時培養物（これは生理学的な細胞環境を模倣する）、リポ多糖（ＬＰＳ）（マクロファージおよび肝細胞の知られている活性化因子）により刺激された細胞、ならびに、ヒツジ肝臓の組織ホモジネートを様々な濃度のスベリヒユ抽出物とインキュベーションし、アッセイした。毒性学の測定を伴う標準的手法。２タイプ以上の細胞が調べられる。単球細胞は白血球である。
【０２０１】
材料および実験手順
植物抽出物。植物抽出物を上記の実施例２に記載されるように作製したが、結合剤を使用しなかっただけである。簡単に記載すると、１００ｇの乾燥植物を、標準的な還流装置において４０℃で４時間、９００ｍｌのエタノール−水混合物（８０−２０）により抽出した。抽出物をろ過して、植物残渣を除き、エタノールを５０℃における真空中でエバポレーションし、水を乾燥機における４０℃での乾燥によって除いた。抽出物（粘着性の粉末化物）をそのまま使用し、使用しないときには冷蔵保存した。
【０２０２】
細胞培養。スベリヒユ抽出物の潜在的な毒性を、ヒトヘパトプラストーマ細胞株ＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ−８０６５）および単球細胞株ＴＨＰ１（ＡＴＣＣ寄託番号ＴＩＢ−２０２）を使用する細胞培養系で評価した。ＨｅｐＧ２細胞株は正常な肝細胞の分化した実質機能を保持しているが、無限に成長することができ、従って長期間の研究を可能にする。ＴＨＰ１細胞およびＨｅｐＧ２細胞を、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の不活性化ウシ胎児血清、１％の非必須アミノ酸、１％のグルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリンおよび１０μｇ／ｍＬのストレプトマイシンが補充された高グルコース含有量（４．５ｇ／Ｌ）のダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で成長させた。細胞を９５％Ｏ２−５％ＣＯ２の加湿された雰囲気において３７℃で維持した。培地のｐＨを７．４にモニターした。細胞培地を１週間に２回交換した。７０％〜８０％のコンフルエンスで、細胞を、０．０５％トリプシンおよび０．０２％ＥＤＴＡを使用して５分間トリプシン処理し、２００ｇで１０分間遠心分離し、培養培地に再懸濁し、マイクロタイターディッシュに置床した。接種後２４時間で、細胞を新しい無血清培地において様々な濃度の植物抽出にさらした。
【０２０３】
ＭＴＴアッセイ。２×１０４個の細胞を９６ウエルマイクロタイターディッシュの各ウエルにおいて１００μｌの培養培地［すなわち、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の不活性化ウシ胎児血清、１％の非必須アミノ酸、１％のグルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリンおよび１０μｇ／ｍＬのストレプトマイシンが補充された高グルコース含有量（４．５ｇ／Ｌ）のダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）］に接種した。接種後２４時間で、細胞を植物の水抽出物の様々な濃度と３７℃で２４時間インキュベーションした。植物抽出物を各ウエルから除いた後、細胞をリン酸塩緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。その後、細胞を、ＭＴＴ（０．５ｍｇ／ｍｌ）が各ウエルに添加された無血清ＤＭＥＭ（１０μｌ）においてインキュベーションし、さらに４時間インキュベーションした。各ウエルに１００μＬのＭＴＴ溶液を加えた（０．５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴを含む）。その後、培地を除き、細胞を１００μｌの酸性イソプロパノール（０．０８Ｎ ＨＣｌ）と１５分間（ｍｉｎ）インキュベーションして、ホルマザン血漿を溶解させた。ＭＴＴホルマザンの吸光度を酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）読み取り装置で５７０ｎｍにおいて測定した。生存性を、非処理細胞に対する処理細胞の吸光度の百分率として表される比率として定義した。
【０２０４】
乳酸デヒドロゲナーゼアッセイ。１００μｌのＤＭＥＭ培地（上記参照）における２×１０４個の細胞を９６ウエルマイクロタイターディッシュの各ウエルに接種した。接種後２４時間で、細胞を増大する濃度の植物抽出物（０．００１ｍｇ／ｍｌ〜０．５ｍｇ／ｍｌ）にさらした。２４時間のインキュベーションの後、上清を各ウエルから注意深く吸引した。その後、細胞単層を細胞溶解液（１００μｌ）により室温で３０分間処理し、得られた溶解物を、マイクロピペットを使用して集めた。ＬＤＨ活性を、ＣｙｔｏＴｏｘ９６非放射性細胞傷害性アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＷＩ、米国）を製造者の説明書に従って使用して上清および細胞溶解物の両方の画分で測定した。
【０２０５】
ＬＤＨアッセイは、下記の化学反応によって要約される、赤色のホルマザン生成物へのテトラゾリウム塩の変換に基づいている：
【０２０６】
赤い色の強度はＬＤＨ活性に比例する。吸光度を９６ウエルプレートＥＬＩＳＡ読み取り装置で４９０ｎｍにおいて測定した。細胞から放出されたＬＤＨの割合を、下記の式を使用して求めた：
ＬＤＨ放出＝（上清の吸光度）／（上清＋溶解物の吸光度）×１００。
【０２０７】
アルブミン分泌アッセイ。細胞から分泌されたアルブミンの定量を下記のように行った。１００μｌの培養上清を９６ウエルマイクロタイターディッシュにおいて３７℃で１時間または４℃で一晩インキュベーションした。洗浄工程の後、非特異的結合部位を、０．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳにおいてＲＴで１時間ブロッキング処理した。２回目の洗浄工程の後、ペルオキシダーゼコンジュゲート化ヤギ抗ラットアルブミン抗体を、１％のＢＳＡを含有するＰＢＳにおいて加え、ＲＴで２時間インキュベーションした。その後、マイクロタイターディッシュを洗浄し、基質（１００ｍＭの酢酸Ｎａ、５０ｍＭのリン酸Ｎａおよび９×１０−３％のＨ２Ｏ２における０．５ｍｇ／ｍｌの２，２−アジノ−ジ−３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）を加えた。すべての洗浄工程を、ＰＢＳを使用してＲＴで行った。吸収をＥＬＩＳＡ読み取り装置で４０５ｎｍにおいて測定した。バックグラウンド値を細胞上清の非存在下で測定し、実験値から引いた。すべてのＥＬＩＳＡ測定を二連で行った。
【０２０８】
ＭＤＡアッセイ（６）。チオバルビツール酸反応性基質についてのＭＤＡ脂質過酸化アッセイを使用する脂質過酸化の測定は、反応が試薬とＭＤＡとの間で生じるときにピンク色を与えるＴＢＡＲＳ（チオバルビツール酸）試薬を加えることによってもたらされるＭＤＡ（マロンジアルデヒド）の回収に基づいている（Ｄｉａｎｅ Ｗ．Ｍｏｒｅｌ、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、ｖｏｌ．４、Ｎｏ．４、１９８４）。
【０２０９】
ＴＢＡＲＳ試薬の調製。ＴＢＡＲＳ溶液（作業用試薬）（これは０．１２ＭのＴＢＡを含有する；ｐＨ＝７．０）を、０．３７５ｇのＴＢＡ、２．５ｍｌの濃ＨＣｌおよび１５ｍｌの１００％ＴＣＡ（トリクロロ酢酸）の混合物に水を加えて、１００ｍｌの最終体積にすることによって調製した。この溶液を、ＴＢＡが溶解するまで約４０℃に加熱した。
【０２１０】
１０ｍＭのＭＤＡを含有するＭＤＡ標準溶液を下記のように調製した。８２μｌのＭＤＡを３．５ｍｌの濃ＨＣｌに加え、生理的食塩水（０．９％のＮａＣｌ）の添加によって５０ｍｌの最終体積にした。１００μＭのＭＤＡを含有するＭＤＡ作業用標準溶液を、ＭＤＡ標準溶液を生理的食塩水で１：１００希釈することによって調製した。
【０２１１】
ＭＤＡ標準曲線の調製。試験管を下記の表１２に従って準備した。
【表１２】
【０２１２】
各試験管に１ｍｌのＴＢＡＲＳ作業用試薬を加え、混合物を激しく撹拌した。１００℃で２０分間インキュベーションした後、混合物を２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清のＯ．Ｄ．を水ブランクに対して５２２ｎｍで読み取った。
【０２１３】
植物抽出物のＭＤＡアッセイ。２ｍｇ／ｍｌの植物抽出物溶液を調製し、その後、第１欄に示される濃度で新しい試験管に下記の表１３に従って希釈した。
【表１３】
【０２１４】
試験管を、時々振とうしながら、水浴において３７℃で３０分間インキュベーションした。３５００ｒｐｍ（２９００ｘｇ）での１０分間の遠心分離の後、０．５ｍｌの上清を新しい試験管に移した。１ｍｌのＴＢＡＲＳ作業用溶液を加えた後、混合物を激しく撹拌し、１００℃で２０分間加熱し、その後、２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清のＯ．Ｄ．を水ブランクに対して５２２ｎｍで読み取った。ＭＤＡの量を下記の式に従って標準曲線から計算した：
【０２１５】
結果
スベリヒユ抽出物は、ＭＴＴアッセイによって測定されたとき、インビトロ細胞成長に影響を及ぼさない。テトラゾリウム色素のＭＴＴは、細胞の生存性および／または代謝状態を評価するために広く使用されている。この比色法アッセイは、生細胞におけるミトコンドリアのコハク酸デヒドロゲナーゼによる赤色ホルマザン誘導体への黄色テトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）の変換に基づいている。
【０２１６】
ＨｅｐＧ２。エタノール−水によるスベリヒユ抽出物の生物安全性を評価するために、ＨｅｐＧ２細胞を増大する濃度のスベリヒユ抽出物と２４時間インキュベーションした。植物抽出物を各ウエルから除いた後、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＭＴＴアッセイを、実施例３の材料および実験手順に記載されるように行った。図２において認められるように、スベリヒユ由来の抽出物は、試験された濃度のいずれにおいても明白な負の影響を示さなかった。
【０２１７】
ＨｅｐＧ２およびＴＨＰ１の同時培養物。エタノール−水によるスベリヒユ抽出物の生物安全性をさらに評価するために、ＨｅｐＧ２細胞および単球細胞株ＴＨＰ１の同時培養物に対する増大する濃度の抽出物の影響を、２４時間のインキュベーションの後で、上記に記載されるように行われたＭＴＴアッセイを使用して調べた。図３において認められるように、スベリヒユ由来の抽出物は、試験されたすべての濃度で何らかの負の影響の徴候を全く示さなかった。１００μｇ／ｍｌ（試験された最大濃度）まで、抽出物は細胞生存性に対する影響を全く示さなかった。
【０２１８】
リポ多糖（ＬＰＳ）により処理されたＨｅｐＧ２およびＴＨＰ１の同時培養物。ＬＰＳにより活性化された細胞に対する植物抽出物の影響を評価するために、ＨｅｐＧ２細胞（２×１０４個）およびＴＨＰ１細胞（５×１０３個）の同時培養物を９６ウエルディッシュの各ウエルにおいて１００μｌの培地に接種した。接種後２４時間で、細胞を、１０μｇ／μｌのＬＰＳの非存在下および存在下、３７℃で２４時間、エタノール−水によるスベリヒユ抽出物の増大する濃度とインキュベーションした。上清を各ウエルから注意深く吸引した後、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＭＴＴアッセイを、実施例３の材料および実験手順に記載されるように行った。図４には、ＬＰＳおよび増大する濃度のスベリヒユ抽出物との一晩の同時インキュベーションの後でのＨｅｐＧ２およびＴＨＰ１の同時培養物におけるＭＴＴアッセイの結果がまとめられている。ＭＴＴ試験は、細胞生存性の低下を、試験された最大レベル（すなわち、５００μｇｒ／ｍｌ）まで示さなかった。
【０２１９】
スベリヒユ抽出物は膜の一体性に影響を及ぼさない。膜の一体性を、乳酸のピルビン酸への変換を触媒する乳酸デヒドロゲナーゼ活性（ＬＤＨ）の測定によって評価することができる。このＬＤＨアッセイでは、もっぱら細胞質ゾルに存在する酵素（ＬＤＨ）の細胞外培地への漏出が測定される。細胞が破壊されたとき、ＬＤＨ活性が上昇する。細胞培養培地におけるＬＤＨの存在は、細胞の死または細胞膜における漏出のいずれかに起因する細胞膜に対する損傷を示している。
【０２２０】
ＨｅｐＧ２細胞。ＨｅｐＧ２細胞を増大する濃度のスベリヒユ抽出物と２４時間インキュベーションし、ＬＤＨアッセイを、実施例３の材料および実験手順に記載されるように行った。図５には、ＬＤＨ漏出が、エタノール−水によるスベリヒユ抽出の増大する濃度との一晩のインキュベーションの後でのＨｅｐＧ２細胞からの総量（すなわち、細胞破壊後のＬＤＨの総量）の百分率としてまとめられている。図６では、エタノール−水によるスベリヒユ抽出物の様々な濃度との一晩のインキュベーションの後でのＨｅｐＧ２−ＴＨＰ１細胞同時培養物からのＬＤＨ漏出の百分率がまとめられている。従って、ＨｅｐＧ２−ＴＨＰ１細胞とのスベリヒユ抽出物の２４時間のインキュベーションは培養培地におけるＬＤＨレベルの著しい変化を誘導しなかった。
【０２２１】
ＨｅｐＧ２およびＴＨＰ１のＬＰＳ処理された同時培養物。図７には、１０μｇ／ｍｌのＬＰＳおよび増大する濃度のスベリヒユ抽出物との一晩のインキュベーションの後でのＨｅｐＧ２およびＴＨＰ１の同時培養細胞からのＬＤＨ漏出の百分率がまとめられている。ＨｅｐＧ２細胞単独に関して観測されたように、ＬＰＳ処理されたＨｅｐＧ２およびＴＨＰ１の同時培養物の培地におけるＬＤＨレベルは、エタノール−水によるスベリヒユ抽出物とのインキュベーションの後で著しく増大していなかった。
【０２２２】
スベリヒユ抽出物は細胞機能に影響を及ぼさない。タンパク質の細胞タイプ特異的発現に対するスベリヒユ抽出物の影響を、分化した機能を調べるための手段として検討した。肝臓特異的な機能の発現を、実施例３の材料および実験手順に記載されるようにアルブミン分泌アッセイを使用してＨｅｐＧ２細胞によるアルブミン分泌を測定することによって評価した。図８は、増大する濃度のスベリヒユ抽出物との一晩のインキュベーションの後でのＨｅｐＧ２細胞におけるアルブミン産生を示す。細胞培養培地におけるアルブミンのレベルは、スベリヒユ抽出物とのインキュベーションによって変化しないことが見出された。
【０２２３】
スベリヒユ抽出物は酸化ストレスを誘導しない。チオバルビツール酸反応性物質（ＴＢＡＲＳ）を測定する感度は、ＭＤＡアッセイを、脂質の過酸化（酸化ストレスの主要な指標）をスクリーニングおよびモニターリングするための優れた方法にしている（１〜３）。この迅速かつ使いやすい手法は、薬物、食品製造物、ならびに、ヒトおよび動物の生物学的組織をはじめとする多くのタイプのサンプルとの使用のために研究者によって改変されている（４〜７）。ＭＤＡアッセイは、疾患状態におけるフリーラジカル活性に関する重要な情報を提供しており、いくつかの化合物の抗酸化活性の測定のために使用されている。
【０２２４】
ＭＤＡ放出をヒツジ肝臓ホモジネートにおけるスベリヒユ抽出物の濃度の関数として測定した。図９は、ヒツジ肝臓ホモジネートにおける１０μＭのＦｅＳＯ４により誘導される脂質過酸化に対する、スベリヒユのアルコール−水抽出物の増大する濃度の結果を示す。フリーラジカル濃度の変化が認められなかった。このことは、抽出物が過酸化プロセスに対して作用を有しないことを示している。
【０２２５】
考察
ＭＴＴアッセイ、ＬＤＨ放出アッセイ、アルブミン分泌アッセイおよびＭＤＡアッセイは、スベリヒユのエタノール−水抽出物が、１０００μｇ／ｍｌの抽出物濃度まで、毒性作用を全く生じさせず、あるいは、測定されたすべてのパラメーターにおける分化した機能に対する影響も、また、フリーラジカルの濃度に対する影響も何ら生じさせなかったので、スベリヒユのエタノール−水抽出物は生物学的に安全であることを示している。
【０２２６】
実施例４
スベリヒユ抽出物のインビトロでの効力の試験
上記実施例２の予備実験では、スベリヒユ抽出物が糖尿病患者の血流におけるグルコースレベルを減少させたことが明らかにされた。２型糖尿病の複雑性は、ヒト被験者において観測される効力（この場合、グルコースレベルの減少は、それがどのようにして達成されるかに関しては何ら示さない全体的な作用である）を再現する１つの全般的なインビトロアッセイを開発することを不可能にしている。従って、グルコースの輸送ならびに吸収に対するスベリヒユ抽出物の作用をできる限り忠実に模倣することが重要である。培地（血液）から細胞膜を介して細胞内へのグルコースの輸送を測定するいくつかの標準的なアッセイを利用することができる。加えて、小腸の壁を介した血流内へのグルコース吸収のインビトロ測定（これはグルコース代謝の最初の段階の目安を提供する）を、動物の腸組織を介した吸収を使用してモデル化することができる。２つのアッセイを、グルコースの吸収および輸送に対するスベリヒユ抽出物の影響を明らかにするために行った。
【０２２７】
実施例４ａは腸を介したグルコース吸収に対するスベリヒユ抽出物の影響を記載する。
【０２２８】
材料および実験手順
腸を介したグルコース吸収に対するスベリヒユ抽出物の影響の測定。長さ１０ｃｍのヒツジ小腸を、１００ｍｇ／ｍｌのＤ−グルコースおよび関連した量のスベリヒユ抽出物を含有するクレブス溶液を保持する容器に一方の側でつなぎ、回収容器に反対側でつなぎ、その結果、クレブス溶液が腸を通って流れるようにした。系内への溶液の流束は５０ｍｌ／ｈｒ〜５５ｍｌ／ｈｒであった。腸を、ＤＤＷを含有する恒温浴において３７℃でインキュベーションした。糖が、腸を介して吸収し、壁を通って水浴に輸送される。浴からのサンプルを１５分毎に採取し、サンプルのグルコース濃度を、グルコース濃度を測定するための一般的な方法であるＤＮＳ法（これは本明細書中下記に記載される）に従って調べた。
【０２２９】
ＤＮＳ試薬の調製。７．４９ｇの３，５−ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）および１４ｇのＮａＯＨを１１のＤＤＷに加え、混合した。溶解したとき、２１６ｇのロッシェル塩（酒石酸ＮａＫ）、５．３７ｇのフェノールおよび５．８６ｇのメタ重硫酸ナトリウムを加え、混合した。
【０２３０】
ＤＮＳ法。３ｍｌのＤＮＳ試薬を１ｍｌのサンプルに加え、混合物を沸騰水（１００℃）中で５分間インキュベーションし、その後、室温に達するまで氷に移した。Ｏ．Ｄ．を、分光光度計を使用して６４０ｎｍで測定し、結果を、０ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、０．４ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｇ／ｍｌ、０．８ｍｇ／ｍｌおよび１．０ｍｇ／ｍｌの濃度でのデキストロースの標準曲線から計算した。
【０２３１】
結果
図１０は、ヒツジの腸を介したグルコース吸収に対するスベリヒユ抽出物の影響を示す。測定値を、そのタンパク質含有量を示す腸サンプルの重量について正規化した。スベリヒユ抽出物が、腸を介したグルコースの輸送を部分的に阻害したことがグラフから明白である。このことは、血流におけるグルコースレベルの減少が生じることを示している。
【０２３２】
実施例４ｂは酵母細胞内へのグルコースの輸送に対するスベリヒユ抽出物の影響を記載する。
【０２３３】
酵母細胞内へのグルコース輸送の測定（これは、長年にわたって使用されている方法である）では、グルコース濃度に対する直接的な応答である、活性の指標としての酵母細胞によるＣＯ２の発生が利用される。
【０２３４】
材料および実験手順
グルコース輸送アッセイ。２．５ｍｌのパン酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のストック溶液（４０ｍｇ／ｍｌ）、および、増大する量（０．０５ｍｇ／ｍｌから０．５ｍｇ／ｍｌまで）のスベリヒユ抽出物のストック溶液（１ｍｇ／ｍｌの標準的なエタノール−水（８０：２０）抽出物、その体積は合計で２４ｍｌに調節された）を１００ｍｌの血清ボトルに加えた。血清ボトルを窒素下で維持し、ガス発生を測定するために目盛り付きマノメーターにつないだ。実験はまた、スベリヒユ抽出物を含まない酵母溶液からなるブランクを用いても行われた。
【０２３５】
血清ボトルを恒温振とう器浴において３７℃で振とうした。ＣＯ２の発生が直ちに始まるが、系が平衡に達したときすぐに止まる。その時点で０．１５ｇ／ｍｌのグルコースの１ｍｌを加え、放出されたＣＯ２の量を、１ｈｒの期間にわたって５分毎に時間の関数として測定し、記録した。１ｈｒ後、実験を停止した。記録されたＣＯ２の量を、１ｇＣＯ２＝２．０４ｇグルコースの変換に基づいてグルコースのｍｇに変換した。スベリヒユ抽出物の存在下および非存在下で消費されたグルコースの量をグラフに経時的に示した。
【０２３６】
結果
測定された数の酵母細胞を制御された条件のもとで維持し、特定量のグルコースを与え、ＣＯ２の発生を測定した。実験を二連で行い、それにより、スベリヒユ抽出物を、第２の実験ではグルコースに加えて加えた。発生したＣＯ２の量の変化は、細胞内へのグルコース輸送に対するスベリヒユ抽出物の影響の尺度である。
【０２３７】
スベリヒユ抽出物が酵母細胞のＣＯ２産出を増大させたことが、酵母細胞におけるグルコース取り込みに対するスベリヒユ抽出物の影響をまとめる図１１から明白である。このことは、増大した活性が、スベリヒユ抽出物によって生じた細胞内へのグルコース輸送の増大に起因することを示している。
【０２３８】
考察
上記のインビトロ実験は、ヒト糖尿病被験者に対する予備的試験と同様に、スベリヒユ抽出物が生物学的に安全であり、かつ、血流中のグルコースレベルの減少において効果的であることを明らかにしている。
【０２３９】
インビトロ実験は、抽出物が、小腸を介したグルコースの吸収だけでなく、細胞内へのグルコースの輸送に影響を及ぼすことを示している。このことは、少なくとも２つの有効成分が存在することを示し得る。抽出物の精製および活性成分の単離は、抽出物の機構のより詳細な研究を可能にする。
【０２４０】
明確にするため別個の実施態様で説明されている本発明の特定の特徴は単一の実施態様に組み合わせて提供することもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施態様で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで提供することもできる。
【０２４１】
本発明はその特定の実施態様によって説明してきたが、多くの別法、変更及び変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更及び変形すべてを包含するものである。本願で挙げた刊行物、特許、特許願及びＧｅｎＢａｎｋアセッション番号はすべて、個々の刊行物、特許、特許願及びＧｅｎＢａｎｋアセッション番号が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用又は確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。
【０２４２】
【図面の簡単な説明】
【０２４３】
【図１】血中グルコースレベルが試験開始時に３００ｍｇ／ｄｌを超えるインスリン非依存性糖尿病患者（図１ａ）、および、血中グルコースレベルが試験開始時に３００ｍｇ／ｄｌ未満であるインスリン非依存性糖尿病患者（図１ｂ）における血中グルコースレベルに対するスベリヒユ抽出物の影響を示すグラフである。
【図２】ＭＴＴアッセイを使用して測定されたときの、ＨｅｐＧ２細胞の生存性に対するスベリヒユ抽出物の増大する濃度の影響を示す棒グラフである。
【図３】ＭＴＴアッセイを使用して測定されたときの、ＨｅｐＧ２およびＴＨＰ１の同時培養物の生存性に対するスベリヒユ抽出物の増大する濃度の影響を示す棒グラフである。
【図４】ＭＴＴアッセイを使用して測定されたときの、ＬＰＳにより刺激されたＨｅｐＧ２およびＴＨＰ１の同時培養物の生存性に対するスベリヒユ抽出物の増大する濃度の影響を示す棒グラフである。
【図５】ＬＤＨアッセイを使用して測定されたときの、ＨｅｐＧ２細胞からの総ＬＤＨ放出（細胞を完全に破壊した後でのＬＤＨ濃度、培地中へのＬＤＨの放出最大量）の百分率としてのＬＤＨ放出に対するスベリヒユ抽出物の増大する濃度の影響を示す棒グラフである。
【図６】ＬＤＨアッセイを使用して測定されたときの、ＨｅｐＧ２細胞およびＴＨＰ１細胞の同時培養物からのＬＤＨ放出の百分率に対するスベリヒユ抽出物の増大する濃度の影響を示す棒グラフである。
【図７】ＬＤＨアッセイによる、ＬＰＳ刺激されたＨｅｐＧ２およびＴＨＰ１の同時培養物からのＬＤＨ放出の百分率に対するスベリヒユ抽出物の増大する濃度の影響を示す棒グラフである。
【図８】アルブミン分泌アッセイを使用して測定されたときの、ＨｅｐＧ２細胞におけるアルブミン産生に対するスベリヒユ抽出物の増大する濃度の影響を示す棒グラフである。
【図９】ＭＤＡアッセイを使用したときの、ヒツジ肝臓ホモジネートにおける１０μＭのＦｅＳＯ４により誘導される脂質過酸化に対するスベリヒユのアルコール・水抽出物の増大する濃度の影響を示す棒グラフである（ｎ＝３）。
【図１０】時間の関数としての、ヒツジ腸を介するグルコース吸収に対するスベリヒユ抽出物の影響を示す線グラフである。
【図１１】酵母細胞におけるグルコース取り込みに対するスベリヒユ抽出物の影響を示す線グラフである。
【図１２】活性成分を植物から精製するための段階毎の手順を例示する流れ図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スベリヒユ（Ｐｏｒｔｕｌａｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ Ｌ．）から得られる組成物、および、より具体的には、血中グルコースレベルを調節するために該組成物を使用する方法に関連する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は、患者の健康、生活の質、および平均余命、ならびに保険医療システムに対して大きな影響を有する重大な慢性的代謝性障害である。米国では、糖尿病は主要な死因の６番目である［Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｄｉａｂｅｔｅｓ ａｎｄ ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ ａｎｄ ｋｉｄｎｅｙ ｄｉｓｅａｓｅｓ（１９９５）、Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ、Ｂｅｔｈｅｄａ、ＭＤ：ＮＩＤＤＭ ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ番号９６−３９２６］。
【０００３】
糖尿病はＩ型糖尿病（以前ではインスリン依存性糖尿病またはＩＤＤＭとして知られている）およびＩＩ型糖尿病（以前ではインスリン非依存性糖尿病またはＮＩＤＤＭとして知られている）の２つの大きなカテゴリーに分けられる。糖尿病の全体的な罹患率は人口の約６％であり、そのうちの９０％がＩＩ型である［Ｄｉａｂｅｔｅｓ（１９９６）、Ｖｉｔａｌ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ、Ａｌｅｘａｎｄｒｉａ，ＶＡ：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ］。糖尿病の処置および治療は国家の保険医療支出のかなりの部分に相当し、年間１０５０億ドルを超えている。
【０００４】
ＩＩ型糖尿病は、炭水化物および脂肪の代謝が乱れた症候群である。最も顕著な臨床的特徴は、１２６ｍｇ／ｄｌを超える空腹時血漿グルコースレベルによって明らかにされる高血糖症、または、６．９％を超えるグリコシル化ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）である。ほとんどのＩＩ型糖尿病患者において、発症は成人期においてであり、最も一般には、４０歳を超える肥満者においてである。高血圧、高脂血症、高インスリン症およびアテローム性動脈硬化が糖尿病に付随することが多い。
【０００５】
ＩＩ型糖尿病の早期段階は、インスリン標的組織（すなわち、肝臓、骨格筋および脂肪細胞）におけるインスリン抵抗性によって特徴づけられる。これらの組織におけるインスリン抵抗性は、肝臓による過度なグルコース産生および末梢組織（特に、筋肉）による損なわれたグルコース利用に関連する。これらの事象は代謝恒常性を徐々に衰えさせるが、早期段階における明白な糖尿病を直接的には生じさせない場合がある。インスリン抵抗性を代償するための増大したインスリン分泌により、基礎状態での血中グルコースレベルが正常範囲内で維持され得るが、患者は、食事性炭水化物負荷試験および経口ブドウ糖負荷試験に対する損なわれた応答を示す場合がある。インスリン分泌の慢性的な過剰刺激は小島β細胞の予備力を徐々に低下させ、最終的には使い果たす。絶対的なインスリン不足の状態が結果として生じ、そして、明白な糖尿病を生じさせる［ＤｅＦｒｏｎｚｏ（１９８８）、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、３７：６６７〜６８７；Ｓｅｅｌｙ（１９９３）、Ｉｎｓｕｌｉｎ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｉｓｏｒｄｅｒ（Ｍｏｌｌｅｒ Ｄ．編、Ｌｏｎｄｏｎ、Ｅｎｇｌａｎｄ：Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ．）、１８７〜２５２］。損なわれたグルコース耐性からＩＩ型糖尿病への移行率は、遺伝的背景、肥満、体脂肪分布、ほとんど運動しない生活様式、加齢、および付随する医学的状態によって大きく影響される［Ｃｌａｒｋ（１９９８）、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ｃａｒｅ、２１：Ｃ３２〜Ｃ３４］。
【０００６】
慢性的および重度の高血糖症を有するＩＩ型糖尿病患者の生活の質はひどく影響を受ける。典型的な症状には、疲労感および無気力が含まれ、これらは重症になることがあり、成人では作業能力の低下をもたらし、中高年では転倒の増大をもたらす。急性の合併症には、代謝上の様々な問題および感染が含まれる。長期間の合併症には、マクロ血管合併症（例えば、高血圧、異常脂質血症、心筋梗塞、卒中）、ミクロ血管合併症（例えば、網膜症、腎障害、糖尿病神経障害、下痢、神経因性膀胱、損なわれた心臓血管反射、性的機能不全）、および、足の障害がある。
【０００７】
ＩＩ型糖尿病の従来の処置は生活様式の管理に集中している。運動に加えて、体重管理および医学的栄養療法、経口グルコース低下薬、ならびにインスリン注射が従来の治療法である。薬理学的処置が、空腹時グルコースレベルが１４０ｍｇ／ｄｌを超えるか、または、食事後グルコースレベルが１６０ｍｇ／ｄｌを超えるか、または、ＨｂＡ１ｃが８％を超えるときには指示される。
【０００８】
ＩＩ型糖尿病を処置するための一般に利用されている経口薬剤には、第一世代および第二世代のスルホニルウレア剤（これらは膵臓β細胞からのインスリン分泌を高める）、薬用植物のガレガソウ（Ｇａｌｅｇａ Ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）から最初に得られたビグアニド剤（例えば、メトホルミン（登録商標））（これは、肝臓のグルコース産生を阻害し、かつ、筋肉のグルコース取り込みを増大させることによって血漿グルコースを低下させる）、α−グルコシダーゼ阻害剤（例えば、アスコルベート）（これは、炭水化物の消化を妨害し、かつ、グルコースの胃腸吸収を遅らせることによって食後のグルコースレベルを低下させる）、チアゾリジンジオン剤（例えば、トログリタゾン（登録商標）、ロシグリタゾン（登録商標）およびピオグリタゾン（登録商標））（これらは筋肉および肝臓におけるインスリン感受性を改善する）、ならびにメグリチニド剤（例えば、レパグリニド（登録商標））（これはインスリン分泌を増強する）が含まれる。
【０００９】
上記の経口血糖降下薬に対する初期の応答は申し分のないものであるが、これらの薬物は、処置された患者の著しい割合でその有効性を失い、また、処置には、通常、有害な副作用（例えば、体重増加、低血糖症、胃腸障害、肝臓毒性および高ＬＤＬコレステロールなど）が伴う［Ｄｅｙ（２００２）、Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗ、７：４５〜５８、および、それにおける参考文献］。これらの理由のために、血糖コントロールが経口薬物治療法の最大用量において次善であるときには、インスリンが通常、経口薬剤に加えられる。しかしながら、体重増加および低血糖症がインスリン治療の共通する副作用である。
【００１０】
従来の治療法に付随するこれらの重大な制限を考慮して、糖尿病を処置するための代わりの方法（例えば、高血糖防止活性を有する漢方薬など）が患者および保険医療専門家によってますます探し求められている。今日までに、糖尿病に対する４００を超える伝統的な植物処置が報告されている［Ｂａｉｌｅｙ（１９８９）、Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ、１２：５５３〜５６４］。だが、そのうちのほんの少数が、それらの効力を評価するために科学的評価および医学的評価を受けているに過ぎない。糖尿病を処置するための最も一般的に使用される薬草には、下記が含まれる：チョウセンニンジン（Ｇｉｎｓｅｎｇ）種、例えば、オタネニンジンおよびアメリカニンジンなどの種、これらは、著しい血糖降下作用を有することが報告されている；ツルレイシ（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）（ニガウリ）、これは、糖尿病に対する治療薬として民間療法で広く使用されている；フェヌグリーク（Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ ｆｏｅｎｕｍ ｇｒａｅｃｕｍ）（Ｆｅｎｕｇｒｅｅｋ）、これは、特にインドでは、糖尿病に対する治療薬として使用されている；ギムネマ・シルベスター（Ｇｙｍｎｅｍａ ｓｙｌｖｅｓｔｒｅ）；タマネギ（Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ）およびニンニク（Ａｌｌｉｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）、これらは、生のタマネギ片およびニンニク片に存在する揮発油に由来する血糖低下効果を有する；プテロカルプス・マルスピウム（Ｐｔｅｒｏｃａｒｐｕｓ ｍａｒｓｕｐｉｕｍ）および他のエピカテキン含有植物；アロエベラ（Ａｌｏｅ ｖｅｒａ）およびその他。
【００１１】
スベリヒユは、Ｐｕｒｓｌａｎｅ、ＶｅｒｄｏｌａｇａおよびＰｕｒｓｌｅｙとしてもまた知られており、世界のほとんどの地域で栽培される食用の多肉性の「草」である。
【００１２】
スベリヒユは、多くの生物学的に活性な化合物、ならびに、多くの栄養素を含有しており、これらには、アルカロイド、ω−３脂肪酸、クマリン類、フラボノイドおよびアントラキノングリコシドが含まれる（２）。
【００１３】
この植物は、広範囲の様々な病気に対する治療薬として、特に寄生虫に対する処置として、また、消化器系障害に対する治療薬として伝統的に使用されている。加えて、抗炎症活性および抗真菌活性がスベリヒユには伴っている。世界中からの未確認の報告では、多くの病気および状態に対する治療薬としてスベリヒユの使用が明らかにされた（３）。
【００１４】
スベリヒユは高血糖症に対する治療薬として以前に報告されている。ＥｓｋａｎｄｅｒおよびＨ．Ｗｏｎ Ｊｕｎ（４）は、血液中のグルコースレベルを低下させることにおけるスベリヒユ（植物全体）の効力を示した。ＰＣＴ国際特許出願公開００／００２１１は、血液中の糖レベルを低下させるための、スベリヒユから抽出されたヒドロコロイドの使用を教示する。
【００１５】
本発明を実施に移しているとき、本発明者らは、スベリヒユの極性抽出物および非極性抽出物が、その必要性のある対象において血中グルコースレベルを生物学的に安全な様式で調節するために効率よく使用できることを発見した。
【発明の開示】
【００１６】
本発明の１つの態様によれば、スベリヒユ（Ｐｏｒｔｕｌａｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ Ｌ．）から高血糖防止作用物質を単離する方法が提供され、この場合、この方法は、極性成分をスベリヒユから抽出し、それにより、スベリヒユから高血糖防止作用物質を単離することを含む。
【００１７】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、抽出は、極性が増大する溶媒グラジエントを用いることによって行われる。
【００１８】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、抽出はエタノール−水抽出によって行われる。
【００１９】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、極性が増大する溶媒は、ヘキサン、酢酸エチル、ジクロロメタン、メタノールおよび水である。
【００２０】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、極性が増大する溶媒は、ヘキサン：ジクロロメタン：酢酸エチル（１：１：１）およびメタノール：エタノール：水（１：１：１）である。
【００２１】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、この方法はさらに、極性成分を抽出物から精製することを含む。
【００２２】
本発明の別の態様によれば、スベリヒユから高血糖防止作用物質を単離する方法が提供され、この場合、この方法は、非極性成分をスベリヒユから抽出し、それにより、スベリヒユから高血糖防止作用物質を精製することを含む。
【００２３】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、抽出は、非極性溶媒を使用して行われる。
【００２４】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、抽出はエタノール−水抽出によって行われる。
【００２５】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、非極性溶媒は、ヘキサン、ジクロロメタンおよび酢酸エチルからなる群から選択される。
【００２６】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、この方法はさらに、非極性成分を抽出物から精製することを含む。
【００２７】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、非極性成分を抽出物から精製することは薄層クロマトグラフィーによって行われる。
【００２８】
本発明のなお別の態様によれば、スベリヒユのエタノール−水抽出物を含む組成物が提供される。
【００２９】
本発明のさらに別の態様によれば、スベリヒユの極性画分抽出物を含む組成物が提供される。
【００３０】
本発明のさらなる態様によれば、血中グルコースレベルを低下させるための、スベリヒユの極性抽出物を含む組成物の使用が提供される。
【００３１】
本発明のなおさらなる態様によれば、スベリヒユの非極性画分抽出物を含む組成物が提供される。
【００３２】
本発明のさらにさらなる態様によれば、血中グルコースレベルを低下させるための、スベリヒユの非極性抽出物を含む組成物の使用が提供される。
【００３３】
本発明のさらなる態様によれば、血中グルコースレベルを低下させるための、スベリヒユのエタノール−水抽出物を含む組成物の使用が提供される。
【００３４】
本発明のなおさらなる態様によれば、スベリヒユの極性画分抽出物を含む組成物の治療効果的な量と、医薬的に許容され得るキャリアまたは希釈剤とを含む、血中グルコースレベルを低下させるための医薬組成物が提供される。
【００３５】
本発明のさらにさらなる態様によれば、スベリヒユの非極性画分抽出物を含む組成物の治療効果的な量と、医薬的に許容され得るキャリアまたは希釈剤とを含む、血中グルコースレベルを低下させるための医薬組成物が提供される。
【００３６】
本発明のさらにさらなる態様によれば、スベリヒユのエタノール−水抽出物を含む組成物の治療効果的な量と、医薬的に許容され得るキャリアまたは希釈剤とを含む、血中グルコースレベルを低下させるための医薬組成物が提供される。
【００３７】
本発明のさらにさらなる態様によれば、対象における高血糖関連疾患を処置する方法が提供され、この場合、この方法は、スベリヒユのエタノール−水抽出物を含む組成物の治療効果的な量をその必要性のある対象に投与し、それにより、対象における高血糖関連疾患を処置することを含む。
【００３８】
本発明のさらにさらなる態様によれば、対象における高血糖関連疾患を処置する方法が提供され、この場合、この方法は、スベリヒユの極性画分抽出物を含む組成物の治療効果的な量をその必要性のある対象に投与し、それにより、対象における高血糖関連疾患を処置することを含む。
【００３９】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、極性抽出物は血液中のグルコースレベルを低下させることができる。
【００４０】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、極性画分抽出物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．０〜０．４５の範囲にＲｆ値を有する。
【００４１】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、極性画分抽出物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．０〜０．３２の範囲にＲｆ値を有する。
【００４２】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、極性画分抽出物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１７〜０．４１の範囲にＲｆ値を有する。
【００４３】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、スベリヒユの極性画分抽出物は、メタノールを使用してソックスレー抽出によって抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．０、０．３１、０．３４、０．３６、０．３９および０．４５からなる群から選択されるＲｆ値を有する。
【００４４】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、スベリヒユの極性画分抽出物は、水を使用してソックスレー抽出によって抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．０のＲｆ値を有する。
【００４５】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、スベリヒユの極性画分抽出物は、メタノールを用いて抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．０、０．１５、０．３０および０．３２からなる群から選択されるＲｆ値を有する。
【００４６】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、スベリヒユの極性画分抽出物は、メタノール：エタノール：水を１：１：１の比率で用いて抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１７、０．２７、０．３０、０．３４、０．３９および０．４１からなる群から選択されるＲｆ値を有する。
【００４７】
本発明のさらにさらなる態様によれば、対象における高血糖関連疾患を処置する方法が提供され、この場合、この方法は、スベリヒユの非極性画分抽出物を含む組成物の治療効果的な量をその必要性のある対象に投与し、それにより、対象における高血糖関連疾患を処置することを含む。
【００４８】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、スベリヒユの非極性画分抽出物はヒドロコロイドを含まない。
【００４９】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、高血糖関連疾患は、糖尿病、クッシング病、クッシング症候群、摂食障害、損なわれたグルコース耐性、腎糸球体微小血管障害、びまん性糸球体硬化症、結節性糸球体硬化症、尿路感染症、急性腎盂腎炎、壊死性乳頭炎、気腫性腎盂腎炎、グリコーゲンネフローゼ（アルマンニ−エブシュタイン病変）、網膜症、非増殖性網膜症、毛細血管瘤、網膜浮腫滲出物、出血、増殖性網膜症、小血管の増殖、出血性線維症、網膜剥離、白内障、レンズの浸透圧変化による一過性の屈折異常、虹彩における血管の増殖による緑内障、網膜感染症、脳血管のアテローム硬化性疾患、神経障害、皮膚感染症、冠状動脈のアテローム性動脈硬化、心筋梗塞、末梢のアテローム性動脈硬化：四肢虚血、壊疽、増大した胎児死亡率、増大した感染感受性、および、遅れた創傷治癒からなる群から選択される。
【００５０】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、非極性画分抽出物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１１〜０．８９の範囲にＲｆ値を有する。
【００５１】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、非極性画分抽出物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１１〜０．８８の範囲にＲｆ値を有する。
【００５２】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、非極性画分抽出物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１７〜０．９１の範囲にＲｆ値を有する。
【００５３】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、スベリヒユの非極性画分抽出物は、ヘキサンを使用してソックスレー抽出によって抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．３６、０．４５、０．５２、０．７１および０．８８からなる群から選択されるＲｆ値を有する。
【００５４】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、スベリヒユの非極性画分抽出物は、酢酸エチルを使用してソックスレー抽出によって抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１１、０．１８、０．３１、０．３６、０．４５、０．５２および０．７１からなる群から選択されるＲｆ値を有する。
【００５５】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、スベリヒユの非極性画分抽出物は、ヘキサンを用いて抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．３、０．３２、０．４１、０．４７および０．８９からなる群から選択されるＲｆ値を有する。
【００５６】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、スベリヒユの非極性画分抽出物は、酢酸エチルを用いて抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１５、０．３６、０．４７、０．７３および０．８９からなる群から選択されるＲｆ値を有する。
【００５７】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、スベリヒユの非極性画分抽出物は、ヘキサン：ＤＣＭ：酢酸エチルを１：１：１の割合で用いて抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１７、０．３０、０．３６、０．４１、０．６８および０．９１からなる群から選択されるＲｆ値を有する。
【００５８】
本発明のさらにさらなる態様によれば、血液中のグルコースレベルを調節するための作用物質を特定する方法が提供され、この場合、この方法は、（ａ）スベリヒユの抽出物を分画化し、それにより、複数の画分を得ること；および（ｂ）血液中のグルコースレベルを調節することができる少なくとも１つの画分を前記複数の画分から特定し、それにより、血液中のグルコースレベルを調節するための作用物質を特定することを含む。
【００５９】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、分画化は、極性が増大する溶媒グラジエントを用いて行われる。
【００６０】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、工程（ｂ）は、（ｉ）腸を介したグルコース吸収および／または（ｉｉ）細胞内へのグルコース輸送に対する画分の影響を調べることによって行われる。
【００６１】
本発明は、スベリヒユに由来する新規な組成物、および、血中グルコースレベルを調節するために該組成物を使用する方法を提供することによって、現在知られている形態の欠点に対処することに成功している。
【００６２】
本明細書で使用される技術用語と科学用語はすべて、特に断らない限り、本発明の属する技術分野の当業者が共通して理解しているのと同じ意味を持っている。本明細書に記載されているのと類似の又は均等の方法と材料は本発明を実施又は試験するのに使用できるが、適切な方法と材料は以下に述べる。争いが生じた場合、定義を含めて本特許明細書が基準である。さらに、本明細書の材料、方法及び実施例は例示することだけを目的とし本発明を限定するものではない。
【００６３】
図面の説明
本明細書では本発明を単に例示し図面を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の好ましい実施態様を例示考察することだけを目的としており、本発明の原理や概念の側面の最も有用でかつ容易に理解される説明であると考えられるものを提供するために提示していることを強調するものである。この点について、本発明を基本的に理解するのに必要である以上に詳細に本発明の構造の詳細は示さないが、図面について行う説明によって本発明のいくつもの形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
【００６４】
図１は血中グルコースレベルが試験開始時に３００ｍｇ／ｄｌを超えるインスリン非依存性糖尿病患者（図１ａ）、および、血中グルコースレベルが試験開始時に３００ｍｇ／ｄｌ未満であるインスリン非依存性糖尿病患者（図１ｂ）における血中グルコースレベルに対するスベリヒユ抽出物の影響を示すグラフである。
図２はＭＴＴアッセイを使用して測定されたときの、ＨｅｐＧ２細胞の生存性に対するスベリヒユ抽出物の増大する濃度の影響を示す棒グラフである；すべての測定を三連で行った。測定をスベリヒユの同じ抽出物に対して行った。
図３はＭＴＴアッセイを使用して測定されたときの、ＨｅｐＧ２およびＴＨＰ１の同時培養物の生存性に対するスベリヒユ抽出物の増大する濃度の影響を示す棒グラフである；細胞生存性を処理細胞および非処理細胞の吸収パーセントとして測定した。すべての測定を三連で行った。
図４はＭＴＴアッセイを使用して測定されたときの、ＬＰＳにより刺激されたＨｅｐＧ２およびＴＨＰ１の同時培養物の生存性に対するスベリヒユ抽出物の増大する濃度の影響を示す棒グラフである。
図５はＬＤＨアッセイを使用して測定されたときの、ＨｅｐＧ２細胞からの総ＬＤＨ放出（細胞を完全に破壊した後でのＬＤＨ濃度、培地中へのＬＤＨの放出最大量）の百分率としてのＬＤＨ放出に対するスベリヒユ抽出物の増大する濃度の影響を示す棒グラフである；すべての測定を三連で行った。
図６はＬＤＨアッセイを使用して測定されたときの、ＨｅｐＧ２細胞およびＴＨＰ１細胞の同時培養物からのＬＤＨ放出の百分率に対するスベリヒユ抽出物の増大する濃度の影響を示す棒グラフである；すべての測定を三連で行った。
図７はＬＤＨアッセイによる、ＬＰＳ刺激されたＨｅｐＧ２およびＴＨＰ１の同時培養物からのＬＤＨ放出の百分率に対するスベリヒユ抽出物の増大する濃度の影響を示す棒グラフである。
図８はアルブミン分泌アッセイを使用して測定されたときの、ＨｅｐＧ２細胞におけるアルブミン産生に対するスベリヒユ抽出物の増大する濃度の影響を示す棒グラフである；結果が、コントロールの非処置細胞からの総アルブミン分泌の百分率として示される。
図９はＭＤＡアッセイを使用したときの、ヒツジ肝臓ホモジネートにおける１０μＭのＦｅＳＯ４により誘導される脂質過酸化に対するスベリヒユのアルコール・水抽出物の増大する濃度の影響を示す棒グラフである（ｎ＝３）；Ｘ軸は、１０μＭの硫酸鉄を含有する細胞ホモジネートの溶液における薬草抽出物の濃度を（ｍｇ／ｍｌで）示す。すべての測定を三連で行った。
図１０は時間の関数としての、ヒツジ腸を介するグルコース吸収に対するスベリヒユ抽出物の影響を示す線グラフである；ｐ１およびｐ２は、同じ条件のもとで行われた２つの異なる実験である。
図１１は酵母細胞におけるグルコース取り込みに対するスベリヒユ抽出物の影響を示す線グラフである。グラフは４つの別個の実験を示し、その平均値を示す。測定を植物抽出物添加後６０分で行った。グルコース取り込みの増大（％で表される）が植物抽出物の増大する量の存在下で示されることに留意すること。
図１２は活性成分を植物から精製するための段階毎の手順を例示する流れ図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６５】
本発明は、血中グルコースレベルを調節するために使用することができるスベリヒユ由来の組成物に関する。具体的には、本発明の高血糖防止組成物は、高血糖関連疾患（例えば、ＩＩ型糖尿病など）を処置することのために血中グルコースレベルを低下させるために使用することができる。本発明の低血糖防止組成物は、低血糖関連疾患（例えば、小島細胞過形成など）を処置することのために血中グルコースレベルを増大させるために使用することができる。
【００６６】
本発明の原理および操作は、図面および添付された説明を参照してより良く理解することができる。
【００６７】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明に示される細部または実施例によって例示される細部に限定されないことを理解しなければならない。本発明は、他の実施形態が可能であり、または様々な方法で実施することができ、または様々な方法で実施される。また、本明細書中で用いられる表現および用語は説明のためであり、従って限定として見なされるべきではないことを理解しなければならない。
【００６８】
ＩＩ型糖尿病は慢性的な代謝性疾患であり、患者の健康、生活の質、および平均余命に対する大きな影響を有する。グルコース恒常性を改善するために不可欠ではあるが、生活様式管理対策（すなわち、運動、食事および体重管理）は不十分である場合があり、このことは従来の薬物治療（例えば、経口グルコース低下剤（すなわち、血糖低下剤）など）を多くの患者については必要にしている。
【００６９】
しかしながら、現在利用可能な経口投与される抗糖尿病薬は、処置された患者の著しい割合でその有効性を失っており、また、加えて、処置には、通常、様々な有害な副作用、例えば、体重増加、低血糖、胃腸障害、肝臓毒性、高ＬＤＬコレステロールおよび大きな費用などが付随する。これらの理由のために、インスリンが、通常、最大経口送達投薬量で経口薬剤に加えられる。これらの理由のために、医学分野界は、ＩＩ型糖尿病患者を処置するために使用することができる新しい高血糖防止作用物質を絶えず捜し求めている。
【００７０】
スベリヒユは、Ｐｕｒｓｌａｎｅ、ＶｅｒｄｏｌａｇａおよびＰｕｒｓｌｅｙとしてもまた知られており、広範囲の様々な病気に対する治療薬として、特に寄生虫感染および消化器系障害に対する治療薬として伝統的に使用されている。スベリヒユはまた、高血糖症に対する治療薬としても報告されている。（ｉ）ＰＣＴ国際特許出願公開００／００２１１は、血液中の糖レベルを低下させるためのスベリヒユ由来のヒドロコロイドの使用を教示する。（ｉｉ）ＥｓｋａｎｄｅｒおよびＨ．Ｗｏｎ Ｊｕｎ（４）は、糖尿病の処置のために、エジプトの民間療法で使用される数多くの薬草（スベリヒユを含む）をスクリーニングして、それらの血糖低下効果および血中インスリン増加効果を確認した。水に懸濁された乾燥粉砕薬草からなる動物飼料として作製された粗薬草抽出物がアロキサン糖尿病ラットに投与された。ＥｓｋａｎｄｅｒおよびＨ．Ｗｏｎ Ｊｕｎ（４）は、スベリヒユが、処置されたラットの血中グルコースレベルを低下させることにおいて効果的であることを示した。しかしながら、この動物飼料には、植物の固体粒子、ならびに、水抽出物が含まれたので、この活性を何らかの特定の植物成分に帰属することができなかった。
【００７１】
本発明を実施に移しているとき、本発明者らは、スベリヒユのエタノール−水抽出物が、糖尿病被験者において血中グルコースレベルを生物学的に安全な様式で低下させるために効率よく使用され得ることを発見した。さらに本発明を実施に移しているとき、本発明者らは、スベリヒユから抽出された極性画分および非極性画分がこの高血糖防止作用に関係することを発見した。
【００７２】
下記の実施例の節において例示されるように、様々な異常に高いグルコースレベル（すなわち、３００ｍｇ／ｄｌ超または３００ｍｇ／ｄｌ未満）を有するヒト糖尿病被験者に対するスベリヒユのエタノール−水抽出物の投与は被験者の血中グルコースレベルを正常にまで有意に低下させた（実施例の節の実施例２を参照のこと）。この抗糖尿病作用を媒介する活性な成分を単離する試みにおいて、この植物の逐次極性抽出が行われた（実施例の節の実施例１を参照のこと）。興味深いことに、スベリヒユ由来の極性成分および非極性成分の両方により、異なる作用機構によるものではあるが、血中グルコースレベルを低下させることを説明することができた。すなわち、スベリヒユ由来の極性抽出物が、細胞膜を介した細胞内へのグルコース輸送を増大させたが、非極性抽出物は腸のグルコース吸収を低下させた。
【００７３】
従って、今回のこれらの発見は、スベリヒユ由来の非極性抽出物および極性抽出物が、（同じ植物のエタノール−水抽出物と同様に）、グルコース代謝の異なる段階に対して作用することを示している（本質的には、それぞれ、小腸を介したグルコース吸収の阻害、および、細胞へのグルコース輸送の促進）。このことから、血中グルコースレベルを低下させることにおけるそれらの個々の使用または混合使用が示唆される。
【００７４】
本発明の組成物は、インビトロ細胞生存性アッセイ（すなわち、ＭＴＴ）および細胞機能アッセイ（例えば、アルブミン分泌アッセイおよび乳酸デヒドロゲナーゼアッセイ、実施例３を参照のこと）によって明らかにされるように、生物学的に安全な様式で作用することが示された。このことは本発明の組成物の使用を臨床的に実行可能にしている。
【００７５】
従って、本発明の１つの態様によれば、スベリヒユのエタノール−水抽出物を含む組成物が提供される。
【００７６】
好ましくは、本発明のこの態様の組成物におけるエタノール−水の比率は８０％−２０％である。
【００７７】
本発明のこの態様の組成物は、細胞内へのグルコース輸送を増大させ、および／または、腸を介したグルコース吸収を低下させることによって血液中のグルコースレベルを低下させることができる。
【００７８】
上記で述べられたように、本発明者らは、活性な成分（すなわち、血中グルコースレベルを低下させることができる活性な成分）をスベリヒユから単離することができた。
【００７９】
従って、本発明の別の態様によれば、スベリヒユの組織（例えば、葉、茎、根または植物全体）の極性画分抽出物を含む組成物が提供される。
【００８０】
本明細書中で使用される表現「スベリヒユの組織」は、完全なスベリヒユ植物またはその一部分（例えば、葉、根、茎および滲出物など）を示す。
【００８１】
本明細書中で使用される「極性画分抽出物」は、極性成分から構成され、かつ、極性溶媒（例えば、アルコールなど）を使用して得られるスベリヒユ抽出物を示す。本発明のスベリヒユ抽出物は、好ましくは、固体の植物粒子を含まない。
【００８２】
用語「極性」は、双極子モーメントを形成する負極および正極を有する極性の官能基を有する化合物（例えば、アミド、酸、アルコール、ケトン、アルデヒド、アミン）を示す。極性画分抽出物には、植物組織の表面に見出される化合物（すなわち、滲出物）、または、植物組織内ではあるが、植物細胞（アポプラスト）の外側に見出される化合物、または、植物の細胞の内部に見出される化合物（細胞質性、液胞性またはオルガネラ捕捉）が含まれ得る。
【００８３】
極性画分抽出のために好適な溶媒の例には、水およびアルコール（例えば、メタノール、エタノールおよびイソプロピルアルコールなど）が含まれるが、これらに限定されない。植物組織全体を、組織の破壊を必要とすることなく、そのような溶媒に浸すことができる。だが、組織のそのような物理的操作は、極性成分の抽出を実質的に改善するので好ましい。本発明とともに利用され得る組織破壊技術の例には、凍結組織の粉砕、および、ホモジナイザーを使用する均質化が含まれる。植物組織の抽出を改善するための他の前処理方法が下記に記載される。
【００８４】
下記の実施例の節において例示されるように、本発明の教示に従って得られる極性画分抽出物は血液中のグルコースレベルを正常なレベル［すなわち、１１５ｍｇ／ｄｌ未満の正常な空腹時血中（すなわち、血漿）グルコースレベル］に低下させることができる。実施例の節の実施例４において例示されるように、極性抽出物に対して行われた分析では、極性抽出物は、細胞内へのグルコース輸送を増大させることができる成分を含むことが明らかにされた。
【００８５】
本発明のこの態様の組成物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒混合物を使用するアルミニウムシート上でのシリカゲル６０Ｆ２５４［２０×２０ｃｍ（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）］での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、保持因子（Ｒｆ、溶媒先端が移動した距離によって除される、化合物が移動した距離）の値が０．０〜０．５０の範囲（より好ましくは０．０〜０．４５の範囲、さらに一層より好ましくは０．０〜０．３２の範囲、なおさらに一層より好ましくは０．１７〜０．４１の範囲）にある成分を含む。
【００８６】
スベリヒユの極性画分抽出物は、メタノールを使用してソックスレー抽出によって抽出することができ（下記の実施例１を参照のこと）、そのような場合、極性画分抽出物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．０、０．３１、０．３４、０．３６、０．３９および０．４５のＲｆ値を有する成分を含む。
【００８７】
本発明のスベリヒユの極性画分抽出物は、水を使用してソックスレー抽出によって抽出することができ、そのような場合、極性画分抽出物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．０のＲｆ値を有する成分を含む。
【００８８】
本発明のスベリヒユの極性画分抽出物は、メタノールを用いて抽出することができ、そのような場合、極性画分抽出物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．０、０．１５、０．３０および０．３２のＲｆ値を有する成分を含む。
【００８９】
最後に、スベリヒユの極性画分抽出物は、メタノール：エタノール：水を１：１：１の比率で用いて抽出することができ、そのような場合、極性画分抽出物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１７、０．２７、０．３０、０．３４、０．３９および０．４１のＲｆ値を有する成分を含む。
【００９０】
下記の実施例の節の実施例１において示されるように、スベリヒユから得られる非極性抽出物は小腸からのグルコース吸収を低下させることができ、そのため、血液中のグルコース濃度を低下させるために使用することができる。
【００９１】
従って、本発明のさらに別の態様によれば、スベリヒユの非極性画分抽出物を含む組成物が提供される。
【００９２】
本明細書中で使用される「非極性画分抽出物」は、非極性成分から構成され、かつ、非極性溶媒を使用して得られるスベリヒユ抽出物を示す。
【００９３】
用語「非極性」は、正極または負極が形成されないように電荷の分離を有しない非極性の官能基（例えば、アルキル、シアノ、エステルおよび他の非イオン性基）を有する化合物を示す。非極性成分を抽出するために使用され得る非極性溶媒の例には、ヘキサン、シクロヘキサン、酢酸エチルおよびトルエンが含まれるが、これらに限定されない。
【００９４】
非極性画分抽出物には、植物組織の表面に見出される化合物（すなわち、滲出物）、または、植物組織内ではあるが、植物細胞（アポプラスト）の外側に見出される化合物、または、植物の細胞の内部に見出される化合物（細胞質性、液胞性またはオルガネラ捕捉）が含まれ得る。
【００９５】
本発明のこの態様の非極性画分抽出物は、血液中のグルコースレベルを好ましくは正常なレベル［例えば、少なくとも７５ｍｇ／ｄｌ］に低下させることができ、このことは、高血糖防止作用物質（すなわち、血中糖レベルを低下させることができる作用物質）としてのその使用を示唆している。下記の実施例の節の実施例１において例示されるように、本発明の非極性画分抽出物は、小腸を介したグルコース吸収を低下させ、そのため、高血糖防止作用物質として使用することができる。
【００９６】
本発明のこの態様の組成物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用するアルミニウムプレート上でのシリカゲル６０Ｆ２５４［２０×２０ｃｍ（製造：Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）］での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、Ｒｆ値が０．１１〜０．９５の範囲（より好ましくは０．１１〜０．８９の範囲、さらに一層より好ましくは０．１１〜０．８８の範囲、なおさらに一層より好ましくは０．１７〜０．９１の範囲）にある成分を含む。
【００９７】
好ましくは、スベリヒユの非極性画分抽出物は、ヘキサンを使用してソックスレー抽出（下記参照）によって抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．３６、０．４５、０．５２、０．７１または０．８８のＲｆ値を有する成分を含む。
【００９８】
本発明のスベリヒユの非極性画分抽出物は、酢酸エチルを使用してソックスレー抽出によって抽出することができ、そのような場合、非極性画分抽出物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１１、０．１８、０．３１、０．３６、０．４５、０．５２または０．７１のＲｆ値を有する成分を含む。
【００９９】
本発明のスベリヒユの非極性画分抽出物は、ヘキサンを用いて抽出することができ、そのよう場合、非極性画分抽出物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．３、０．３２、０．４１、０．４７または０．８９のＲｆ値を有する成分を含む。
【０１００】
本発明のスベリヒユの非極性画分抽出物は、酢酸エチルを用いて抽出することができ、そのような場合、非極性画分抽出物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１５、０．３６、０．４７、０．７３または０．８９のＲｆ値を有する成分を含む。
【０１０１】
最後に、スベリヒユの非極性画分抽出物は、ヘキサン：ジクロロメタン（ＤＣＭ）：酢酸エチルを１：１：１の割合で用いて抽出することができ、そのような場合、非極性画分抽出物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１７、０．３０、０．３６、０．４１、０．６８または０．９１のＲｆ値を有する成分を含む。
【０１０２】
本発明の高血糖防止作用物質（すなわち、極性画分抽出物および非極性画分抽出物）は、好ましくは、ヒドロコロイド（水溶液においてゲルを形成する物質）を含まない。
【０１０３】
本発明の高血糖防止作用物質は、極性成分を植物から抽出することによってスベリヒユから単離することができる。
【０１０４】
活性な成分を植物から単離する様々な方法がこの分野では広く知られている。植物材料からの活性な成分の一般的な単離手順が図１２の流れ図に記載される［Ｗｉｎｋ（１９９９）、Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ｅｘｐｌｏｉｔａｔｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）もまた参照のこと］。
【０１０５】
典型的には、目的とする植物組織が得られる。植物のオルガネラもまた、極性成分の供給源として使用され得ることが理解される。例えば、植物の液胞を、極性成分を抽出するために使用することができる。植物のプロトプラストを液胞の供給源として単離する様々な方法がこの分野では広く知られている［例えば、Ｇｕｙ，Ｍ．他、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、６４：６１〜６４（１９７９）を参照のこと］。
【０１０６】
このようにして得られた植物組織は新鮮物または乾燥物であり得る。好ましくは、乾燥物が、さらなる大規模抽出を簡略化するために使用される。従って、植物組織は、使用前のその貯蔵を長くすることができる、乾燥（実施例の節の実施例１もまた参照のこと）および粉砕などの前処理に供することができる。
【０１０７】
植物材料は、その後、本明細書中に記載される極性成分（有効成分）を単離するために抽出に供される。
【０１０８】
本明細書中で使用される用語「抽出」は、極性溶媒対非極性溶媒における溶解性などの特徴における化学的および／または物理的な差に基づいて混合物を分離する手法を示す。数多くの抽出手法がこの分野では知られている。
【０１０９】
本発明のこの態様によるスベリヒユからの極性画分の抽出は、好ましくは、極性が増大する溶媒を順次使用して行われる。本質的には、乾燥させた植物材料が、別個の溶媒（例えば、ヘキサン、その後、酢酸エチルおよびクロロホルム）によって、あるいは、そのような溶媒の混合物を使用することによって非極性抽出に供される。その後、同じ植物材料は極性抽出に供される。そのような逐次抽出工程は、活性な成分を単離する分離度を改善する。
【０１１０】
例えば、極性が増大する溶媒グラジエント（例えば、ヘキサン、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、エタノールおよび水）を用いることによって行われる極性成分のソックスレー抽出が下記の実施例の節の実施例１に示される。この方法は、好ましくは、熱安定性の化合物に関して使用される。
【０１１１】
その後、活性な成分（例えば、極性成分）が、この分野で広く知られている精製方法を使用して抽出物から精製される。例えば、抽出物を、極性が増大する溶媒を用いてシリカゲル（ＴＬＣ、薄層クロマトグラフィー）プレートで分離することができる。サンプルは、好ましくは、プレートに直ちに付けられ、酸化を最小限に抑えるために間を置かずに処理される。だが、抽出物の乾燥もまた行うことができる（下記の実施例の節の実施例１を参照のこと）。活性な成分がＵＶ光のもとで可視化される。可視化はまた、プレートに発色剤（例えば、リンモリブデン酸のエタノール溶液）を噴霧し、加熱して色の変化を生じさせることによって行うことができる。このＴＬＣ法は効率的であり、迅速であり、かつ、感度および簡便性と低コストとを併せ持つ。
【０１１２】
粉末化された植物材料からの活性な成分の効率的な抽出はまた、促進溶媒抽出（ＡＳＥ）によって、すなわち、高い温度および圧力での高められた可溶化速度論を利用する手法［Ｏｂａｎａ Ａｎａｌｙｓｔ．（１９９７）、１２２（３）：２１７〜２０］によって行うことができる。
【０１１３】
活性な成分は、様々な生物学的アッセイを使用して定量することができる。好適な生物学的読み取りの選択は活性な成分の所望する機能に依存する。従って、血中グルコースレベルを調節する化合物を特定するために、実施例４に記載されるアッセイのいずれかを使用することができる。有効成分が、本明細書中下記においてさらに記載されるようなケモインフォマティクスを使用して化学的に特定される。
【０１１４】
例えば、ＵＶフォトダイオードアレイ検出器に連結されたＨＰＬＣ（ＬＣ／ＤＡＤ−ＵＶ）および質量分析法に連結されたＨＰＬＣ（ＬＣ／ＭＳまたはＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）は、単離前の抽出物における活性な成分についての構造的情報を提供することができる［Ｏｕｔｔａｒａ、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００４）、６５（８）：１１４５〜５１を参照のこと］。ハイフンで結ばれた技術（例えば、ＬＣ／ＵＶ、ＬＣ／ＭＳおよびＬＣ／ＭＳ／ＮＭＲ［Ｍａｚｚａ、Ｊ ＡＯＡＣ Ｉｎｔ．２００４（Ｊａｎ−Ｆｅｂ）、８７（１）：１２９〜４５；Ｗｏｌｆｅｎｄｅｒ、Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ．、２００３（Ｊｕｎ ６）、１０００（１−２）：４３７〜５５］など）を使用する化学的スクリーニングは、微量の植物材料を用いて、既知の植物成分の構造的情報を提供することができる。このことは、粗植物抽出物から直接、新規な化合物と、既知の化合物とを区別することを可能にする。
【０１１５】
あるいは、所望の活性（例えば、高血糖防止活性）をバイオアッセイ（例えば、小腸を介するグルコース輸送）で示す植物抽出物を、ＬＣ／ＵＶ／ＭＳを使用する分析によって化学的にスクリーニングすることができる。分離を、広いアセトニトリルグラジエントまたはメタノールグラジエントを用いた逆相ＲＰ−Ｃ１８カラムで行うことができる。ＵＶスペクトルが記録され、分子量情報が、サーモスプレー、連続流高速原子衝撃、大気圧化学的イオン化またはエレクトロスプレーイオン化を用いたＭＳによって得られる。フラグメントの情報がタンデムＭＳ／ＭＳ実験または多段ＭＳｎ実験によって得られ、一方で、ＬＣ／ＮＭＲが、化合物の正体を確認するために使用される。
【０１１６】
一体化された、情報が多い検出システム（例えば、クロマトグラフィー−紫外−核磁気共鳴−質量分析（ＬＣ−ＵＶ−ＮＭＲ−ＭＳ）など）、ならびに、他のゲノミクス法およびプロテオミクス法を、植物由来の目的とする活性な成分を特定するために使用することができる。
【０１１７】
植物（すなわち、スベリヒユ）からの非極性成分の単離を、上記で記載された方法を使用して行うことができ、非極性溶媒は、非極性成分を抽出する最初の工程で使用されるだけである。
【０１１８】
本明細書中上記で述べられたように、本発明の高血糖防止作用物質（すなわち、極性抽出物、非極性抽出物、エタノール−水抽出物）を、血液中のグルコースレベルを調節するために使用することができる。
【０１１９】
従って、本発明では、対象における高血糖関連疾患を処置する方法が意図される。
【０１２０】
本明細書中で使用される表現「高血糖関連疾患」は、その発症および／または進行について高血糖症に依存する疾患を示す。本明細書中で使用される用語「高血糖（症）」は、血液中の異常に高いグルコース濃度（すなわち、１１５ｍｇ／ｄｌを超える）を示す。高血糖に関係づけられる疾患および障害の例には、糖尿病、クッシング病、クッシング症候群、摂食障害（例えば、神経性食欲不振、食欲不振、過食症）、損なわれたグルコース耐性（ＩＧＴ）、腎糸球体微小血管障害、びまん性糸球体硬化症、結節性糸球体硬化症（キンメルスティール−ウィルソン病）、尿路感染症、急性腎盂腎炎、壊死性乳頭炎、気腫性腎盂腎炎、グリコーゲンネフローゼ（アルマンニ−エブシュタイン病変）、網膜症、非増殖性網膜症、毛細血管瘤、網膜浮腫滲出物、出血、増殖性網膜症、小血管の増殖、出血性線維症、網膜剥離、白内障、レンズの浸透圧変化による一過性の屈折異常、虹彩における血管の増殖による緑内障、網膜感染症、脳血管のアテローム硬化性疾患（卒中）、末梢神経障害（末梢の感覚神経および運動神経、頭蓋神経、自律神経）、皮膚感染症（カルブンケルを生じさせる毛包炎）、糖尿病性リポイド類壊死症（微小血管障害に起因する）、黄色腫（高脂血症に対して二次的）、冠状動脈のアテローム性動脈硬化（心筋梗塞）、末梢のアテローム性動脈硬化（四肢虚血）、壊疽、増大した胎児死亡率（胎盤疾患、新生児呼吸窮迫症候群、感染症）、増大した感染感受性、および、遅れた創傷治癒が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２１】
本明細書中で使用される用語「処置する」は、本発明の疾患の有害な影響を防止すること、治療すること、逆転させること、弱めること、緩和すること、最小限に抑えること、抑制すること、または停止させることを示す。
【０１２２】
本明細書中で使用される用語「その必要のある対象」は、本発明の疾患に罹患しているか、または、本発明の疾患に罹りやすい哺乳動物対象（例えば、ヒト）を示す。
【０１２３】
本発明のこの態様による方法は、対象（本明細書中下記においてさらに記載される）に治療効果的な量の本発明の組成物（すなわち、上記に記載されるスベリヒユの極性抽出物、非極性抽出物またはエタノール−水抽出物）を投与し、それにより、対象における高血糖関連疾患を処置することによって行われる。本発明の組成物のそれぞれ（すなわち、極性抽出物および非極性抽出物）がグルコース代謝の異なる段階、および、そのようなものとして、グルコース代謝の補体阻害を阻害するように作用するので、その混合投与が、治療効力を改善するために好ましいことが理解される。従って、これらの組成物は対象に同時に（一緒に）、または連続して投与することができる。
【０１２４】
本発明の組成物（すなわち、高血糖防止作用物質）は、対象に、それ自体で、または、組成物が医薬的に許容され得るキャリアと混合される医薬組成物の一部として投与することができる。
【０１２５】
本明細書中で使用される「医薬組成物」は、本明細書中に記載される有効成分の１つまたは複数と、他の化学的成分（例えば、生理学的に好適なキャリアおよび賦形剤）との調製物を示す。医薬組成物の目的は、生物に対する化合物の投与を容易にすることである。
【０１２６】
本明細書中において、用語「有効成分（活性成分）」は、生物学的効果を説明することができる調製物を示す。
【０１２７】
以降、表現「生理学的に許容され得るキャリア」および表現「医薬的に許容され得るキャリア」は交換可能に使用することができ、生物に対する著しい刺激を生じさせず、かつ、投与された調合物の生物学的活性および生物学的性質を阻害しないキャリアまたは希釈剤を示す。佐剤がこれらの表現に含まれる。医薬的に許容され得るキャリアに含まれる成分の１つが、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、すなわち、有機媒体および水性媒体の両方において広範囲の溶解性を有する生体適合性ポリマーであり得る（Ｍｕｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７９））。
【０１２８】
本明細書中において、用語「賦形剤」は、有効成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性な物質を示す。賦形剤の非限定的な例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖およびタイプのデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールが含まれる。
【０１２９】
薬物の配合および投与のための様々な技術が“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、最新版）（これは参考として本明細書中に組み込まれる）に見出され得る。
【０１３０】
好適な投与経路には、例えば、局所的送達、膣内送達、経尿道送達、経口送達、直腸送達、経粘膜送達、経皮送達（特に経鼻送達）、腸管送達または非経口送達（これには、筋肉内注射、皮下注射および髄内注射、ならびに、クモ膜下注射、直接的な脳室内注射、静脈内注射、腹腔内注射、鼻内注射または眼内注射が含まれる）が含まれ得る。あるいは、例えば患者の身体の特定領域中への調製物の直接注射によって調製物を系統的な方法によりむしろ局所的な方法で投与してもよい。
【０１３１】
本発明の医薬組成物は、この分野で十分に知られている様々なプロセスによって、例えば、混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、研和、乳化、カプセル化、包括化または凍結乾燥の従来のプロセスによって製造することができる。
【０１３２】
本発明に従って使用するための医薬組成物は有効成分を医薬として使用可能な製剤にする加工を容易にする賦形剤及び補助剤を含む一つ以上の医薬的に許容され得るキャリアを使用して従来のように配合されてもよい。適切な配合は選択された投与経路に依存する。
【０１３３】
注射の場合、本発明の活性成分は、水溶液において、好ましくは生理学的に適合し得る緩衝液（例えば、ハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理学的な生理的食塩水緩衝液など）において配合することができる。経粘膜投与の場合、浸透剤が配合において使用される。そのような浸透剤はこの分野では一般に知られている。好ましくは、本発明の化合物は経口的に投与される。経口投与の場合、化合物は、活性な化合物を、この分野で十分に知られている薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせることによって容易に配合することができる。そのようなキャリアにより、本発明の化合物は、患者によって経口摂取される錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー剤、懸濁物などとして配合することが可能になる。経口使用される薬学的調製物は、錠剤または糖衣錠コアを得るために、固体の賦形剤を使用し、得られた混合物を場合により粉砕し、そして所望する場合には好適な補助剤を添加した後、顆粒の混合物を加工して作製することができる。好適な賦形剤は、具体的には、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む糖などの充填剤；セルロース調製物、例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボメチルセルロースなど；および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの生理学的に受容可能なポリマーである。所望する場合には、架橋型ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩（アルギン酸ナトリウムなど）などの崩壊剤を加えることができる。
【０１３４】
糖衣錠コアには、好適なコーティングが施される。この目的のために、高濃度の糖溶液を使用することができ、この場合、糖溶液は、場合により、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液および好適な有機溶媒または溶媒混合物を含有し得る。色素または顔料が、活性な化合物の量を明らかにするために、または活性な化合物の量の種々の組合せを特徴づけるために、錠剤または糖衣錠コーティングに添加され得る。
【０１３５】
経口使用され得る医薬組成物には、ゼラチンから作製されたプッシュ・フィット型カプセル、ならびにゼラチンおよび可塑剤（グリセロールまたはソルビトールなど）から作製された軟密閉カプセルが含まれる。プッシュ・フィット型カプセルは、充填剤（ラクトースなど）、結合剤（デンプンなど）、滑剤（タルクまたはステアリン酸マグネシウムなど）および場合により安定化剤と混合された有効成分を含有し得る。軟カプセルでは、活性な化合物を好適な液体（脂肪油、流動パラフィンまたは液状のポリエチレングリコールなど）に溶解または懸濁させることができる。さらに、安定化剤を加えることができる。経口投与される配合物はすべて、選ばれた投与経路に好適な投薬形態でなければならない。
【０１３６】
口内投与の場合、組成物は、従来の様式で配合された錠剤またはトローチの形態を取ることができる。
【０１３７】
鼻腔吸入による投与の場合、本発明に従って使用される有効成分は、好適な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンまたは二酸化炭素）の使用により加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー提示物の形態で都合よく送達される。加圧されたエアロゾルの場合、投薬量単位は、計量された量を送達するためのバルブを提供することによって決定され得る。吸入器または吹き入れ器で使用される、例えば、ゼラチン製のカプセルおよびカートリッジで、化合物と好適な粉末基剤（ラクトースまたはデンプンなど）との粉末混合物を含有するカプセルおよびカートリッジを配合することができる。
【０１３８】
本明細書で記述される調製物は非経口投与、例えばボーラス注射または連続点滴のために配合されることができる。注射のための配合は、単位用量形態（例えばアンプルまたは多用量コンテナ）で提供されることができ、これらには所望により保存剤が添加されている。組成物は懸濁物、溶液または油性もしくは水性ビヒクル中のエマルションであることができ、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤の如き配合剤を含むことができる。
【０１３９】
非経口投与される医薬組成物には、水溶性形態における活性な調製物の水溶液が含まれる。さらに、活性な化合物の懸濁物を、適切なオイル状のまたは水ベースの注射用懸濁物として調製することができる。好適な親油性の溶媒またはビヒクルには、脂肪油（ゴマ油など）、または合成脂肪酸エステル（オレイン酸エチルなど）、トリグリセリドまたはリポソームが含まれる。水性の注射用懸濁物は、懸濁物の粘度を増大させる物質、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランなどを含有し得る。場合により、懸濁物はまた、高濃度の溶液の調製を可能にするために化合物の溶解性を増大させる好適な安定化剤または薬剤を含有し得る。
【０１４０】
あるいは、有効成分は、使用前に好適なビヒクル（例えば、滅菌されたパイロジェン非含有水）を用いて構成される粉末形態にする。
【０１４１】
本発明の調製物はまた、例えば、カカオ脂または他のグリセリドなどの従来の座薬基剤を使用して、座薬または停留浣腸剤などの直腸用組成物に配合することができる。
【０１４２】
本発明に関連した使用のために好適な医薬組成物には、有効成分が、意図された目的を達成するために効果的な量で含有される組成物が含まれる。より具体的には、治療効果がある量は、処置されている対象の疾患の症状を防止、軽減または改善するために、あるいは、処置されている対象の生存を延ばすために効果的な有効成分の量を意味する。
【０１４３】
治療効果がある量の決定は十分に当業者の範囲内である。
【０１４４】
本発明の方法に使用される調製物に対して、治療的に有効な量又は用量は最初にインビトロ分析から分析されることができる。例えば、用量は動物モデルで配合されることができ、かかる情報は人間に有用な用量をより正確に決定するために使用されることができる。
【０１４５】
本明細書中に記載される有効成分の毒性および治療効力は、インビトロ、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手法によって明らかにすることができる。これらのインビトロアッセイおよび細胞培養アッセイならびに動物研究から得られたデータは、ヒトへの使用のための投薬量範囲を定める際に使用することができる。投薬量は、用いられる投薬形態物および利用される投与経路に依存して変化し得る。正確な配合、投与経路および投薬量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選ぶことができる（例えば、Ｆｉｎｇｌ他、１９７５、“Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”（第１章、１頁）を参照のこと）。
【０１４６】
処置される状態の重篤度および応答性に依存して、投薬は単回投与または多回投与が可能であり、処置の経過が、数日から数週間まで、あるいは、治癒が達成されるまで、または、疾患状態の縮小が達成されるまで続く。
【０１４７】
投与される組成物の量は、当然のことではあるが、処置されている対象、苦痛の重篤度、投与様式、主治医の判断などに依存する。
【０１４８】
適合し得る医薬用キャリアに配合された本発明の調製物を含む医薬組成物はまた、適応状態の処置のために調製し、適切な容器に入れ、表示することができる。
【０１４９】
本発明の医薬組成物は、所望される場合には、活性成分を含有する一つ以上の単位投薬形態物を含有し得る、ＦＤＡ承認キットなどのパックまたはディスペンサーデバイスで提供され得る。パックは、例えば、金属箔またはプラスチック箔を含むことができ、例えば、ブリスターパックなどである。パックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための説明書が添付され得る。パックまたはディスペンサーにはまた、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府当局により定められた形式で容器に付けられた通知が伴い得る。この場合、そのような通知は、組成物の形態またはヒトもしくは動物への投与の当局による承認を反映する。そのような通知は、例えば、処方薬物についての米国食品医薬品局により承認されたラベル書きであり得るか、または承認された製品添付文書であり得る。
【０１５０】
本発明の上記の治療法は、この分野で知られている他の処置様式と併用され得ることが理解される。例えば、本発明の高血糖防止作用物質は、糖尿病を処置する方法において様々な天然物質または合成物質と組み合わせることができる。そのような物質の例には、ギムネマ・シルベスタ、フェヌグリーク、ニガウリ、α−リポ酸、バナナ葉、ヤコウ（ｙａｃｏｕ）根、ツルレイシ、オリーブ葉抽出物、プテロカルプス・マルスピウム、サラシア・レチクラータ（ｓａｌａｃｉａ ｒｅｔｉｃｕｌａｔｅ）、ニンニク、サンザシ、コロソール酸、ウルソール酸、Ｄ−ピニトール、アロエ・ベラ、ピコリン酸クロム、ホスファチジルコリン、ω−３脂肪酸、レジスタントデンプン、ニチニチソウ（ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ ｒｏｓｅｕｓ）、カシューナットノキ（ａｎａｃａｒｄｉｕｍ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ）、ムラサキフトモモ（ｓｙｚｙｇｉｕｍ ｃｕｍｉｎｉ）、ユーカリ（ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｌｏｂｕｌｅｓ）、シロバナハウチワマメ（ｌｕｐｉｎｕｓ ａｌｂｕｓ）、タマネギ、ニンニク、キンレイジュ（ｔｅｃｏｍａ ｓｔａｎｓ）、セイヨウイラクサ（ｕｒｔｉｃａ ｄｉｏｉｃａ）、セイヨウタンポポ（ｔａｒａｘａｃｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ）、オオヒメクグ（ｋｙｌｌｉｎｇａ ｍｏｎｏｃｅｐｈａｌａ）、アンマロク（ｐｈｙｌｌａｎｔｈｕｓ ｅｍｂｌｉｃａ）、キダチミカンソウ（ｐｈｙｌｌａｎｔｈｕｓ ｎｉｒｕｒｉ）、インドセンダン（ａｚａｄｉｒａｃｈｔａ ｉｎｄｉｃａ）、モルブス・アルバ（ｍｏｒｂｕｓ ａｌｂａ）、ポテリウム・アンシストロイデス（ｐｏｔｅｒｉｕｍ ａｎｃｉｓｔｒｏｉｄｅｓ）、ニンジン（ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）、インスリン、ならびに、他の経口投与される薬剤、例えば、スルホニルウレア剤、ビグアニド剤、α−グルコシダーゼ阻害剤、チアゾリジンジオン剤およびメグリトニド剤などが含まれるが、これらに限定されない。糖尿病を処置する方法において使用される物質のこれらの組合せは、それぞれの成分（すなわち、スベリヒユ抽出物、および、スベリヒユ抽出物が投与のために組み合わせられる物質）に起因すると考えられる利益をもたらす。
【０１５１】
本発明の組成物はまた、栄養学的添加物として、例えば、スポーツ栄養補給を改善するためなどの栄養学的添加物として使用され得ることが理解される。それによれば、本発明の組成物は単独で使用することができ、あるいは、下記の天然に存在する（例えば、植物由来の）物質または化学化合物のいずれか１つの効果的な用量と組み合わせることができる：クレアチン、クレアチン一水和物、クレアチン塩（例えば、クエン酸クレアチン、ピルビン酸クレアチンなど）、クレアチン誘導体およびその塩、ホスホクレアチン、カフェイン、α−リポ酸、グルコサミン、コンドロイチン、加水分解コラーゲン、メチルスルホニル−メタン、乳清タンパク質、Ｌ−グルタミン、ホスファチジルコリン、コリン、コリン塩、ホスファチジルセリン、β−ヒドロキシ−β−メチルブチラート、ピルバート、Ｌ−カルニチン、Ｄ−リボース、アミノ酸（通常型アミノ酸）、分岐鎖アミノ酸、Ｓ−アデノシルメチオニン、タウリン、共役リノール酸、α−リポ酸、α−リポ酸塩、ならびにグリセリン。様々な化合物の塩を参照することにおいて、本発明では、化合物および任意の好適な塩形成対イオン（例えば、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、ハロゲンイオン、有機カチオン、有機イオン、錯イオン、および、この分野で知られている任意の他の対イオンなど）が意図される。
【０１５２】
本発明の組成物はまた、体重を調節するために（すなわち、体重管理のために）使用され得ることがさらに理解される。この場合、効果的な用量の本発明の組成物が下記の天然に存在する物質（例えば、植物由来の物質）または化学化合物のいずれか１つの効果的な用量と組み合わせられる：ピルビン酸、Ｌ−カルニチン、ヒドロキシクエン酸、エフェドリン、カフェインおよび共役リノール酸（ＣＬＡ）。栄養補給（例えば、スポーツ栄養補給など）を改善するための方法において使用される物質のこれらの組合せはまた、それぞれの成分（すなわち、スベリヒユ抽出物、および、スベリヒユ抽出物が投与のために組み合わせられる物質）に起因すると考えられる利益をもたらす。
【０１５３】
本発明の組成物は治療用キットまたは栄養補給キットに包装することができる。
【０１５４】
例えば、本発明の組成物は、適切な緩衝剤および保存剤とともに１つまたは複数の容器に詰めることができ、また、治療的処置を導くために使用することができる。
【０１５５】
従って、組成物（例えば、スベリヒユのエタノール−水画分抽出物、極性画分抽出物および非極性画分抽出物）を１つの容器において混合することができ、または、個々の容器に入れることができる。好ましくは、容器はラベルを含む。好適な容器には、例えば、ビン、バイアル、シリンジおよび試験管が含まれる。容器は、様々な材料から、例えば、ガラスまたはプラスチックなどから形成され得る。
【０１５６】
加えて、他の添加剤（例えば、安定化剤、緩衝剤および阻止剤など）もまた加えることができる。
【０１５７】
キットはまた、検査された対象が、異常な血中グルコースレベルに関連する状態、障害または疾患に罹患しているかどうか、あるいは、異常な血中グルコースレベルに関連する状態、障害または疾患を発症する危険性があるかどうかを明らかにするための説明書を含むことができる。
【０１５８】
本発明の追加の目的、利点及び新規な特徴は、下記実施例を考察すれば、当業技術者には明らかになるであろう。なおこれら実施例は本発明を限定するものではない。さらに、先に詳述されかつ本願の特許請求の範囲の項に特許請求されている本発明の各種実施態様と側面は各々、下記実施例の実験によって支持されている。
【実施例】
【０１５９】
上記説明とともに、以下の実施例を参照して本発明を例示する。なおこれら実施例によって本発明は限定されない。
【０１６０】
本願で使用される用語と、本発明で利用される実験方法には、分子生化学、微生物学及び組み換えＤＮＡの技法が広く含まれている。これらの技法は文献に詳細に説明されている［例えば以下の諸文献を参照されたい。「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら１９８９年；Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｒ．Ｍ．編１９９４年「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻；Ａｕｓｕｂｅｌら著１９８９年「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，米国メリーランド州バルチモア；Ｐｅｒｂａｌ著「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，米国ニューヨーク１９８８年；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ、米国ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら編「Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ」１〜４巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク１９９８年；米国特許の４６６６８２８号、４６８３２０２号、４８０１５３１号、５１９２６５９号及び５２７２０５７号に記載される方法；Ｃｅｌｌｉｓ， Ｊ．Ｅ．編「Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｉ〜ＩＩＩ巻１９９４年；Ｃｏｌｉｇａｎ， Ｊ．Ｅ．編「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻１９９４年；Ｓｔｉｔｅｓら編「Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ、米国コネティカット州ノーウォーク１９９４年；ＭｉｓｈｅｌｌとＳｈｉｉｇｉ編「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、米国ニューヨーク１９８０年；また利用可能な免疫検定法は、例えば以下の特許と科学文献に広範囲にわたって記載されている。米国特許の３７９１９３２号、３８３９１５３号、３８５０７５２号、３８５０５７８号、３８５３９８７号、３８６７５１７号、３８７９２６２号、３９０１６５４号、３９３５０７４号、３９８４５３３号、３９９６３４５号、４０３４０７４号、４０９８８７６号、４８７９２１９号、５０１１７７１号及び５２８１５２１号；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」１９８４年；Ｈａｍｅｓ， Ｂ．Ｄ．及びＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」１９８５年；Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．及びＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」１９８４年；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， Ｒ．Ｉ．編「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」１９８６年；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ １９８６年；Ｐｅｒｂａｌ， Ｂ．著「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」１９８４年及び「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ１９９０年；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ」、ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ、１９９６年；なおこれらの文献類は、あたかも本願に完全に記載されているように援用するものである］。その外の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。本明細書に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。本明細書に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。
【０１６１】
実施例１
スベリヒユ（Ｐｏｒｔｕｌａｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ Ｌ．）由来の生物活性成分の精製、単離および特定
最初の実験では、スベリヒユの抽出を、非極性から極性まで変化する溶媒を使用して段階的に行った。２つの主要な予備的手法を開発し、効力について比較した。それにより得られた結果を、その後、標準的な抽出手順の開発において利用した。
【０１６２】
実施例１ａ
反復ソックスレー抽出
実験手順
材料。溶媒をＦｒｕｔａｒｏｍ Ｌｔｄ．（Ｈａｉｆａ、イスラエル）またはＪ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ（Ｄｅｖｅｎｔｅｒ、オランダ）から購入し、溶媒は、別途指定されない限り、分析規格であった。Ｄ−グルコース一水和物をＲｉｅｄｅｌ−ｄｅ Ｈａｅｎ（Ｓｅｅｌｚｅ、ドイツ）から購入した。さらなる研究用化学薬品をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、米国）から購入した。
【０１６３】
ソックスレー抽出。２０ｇの乾燥スベリヒユ粉砕物を標準的なソックスレー抽出用円筒ろ紙に入れ、粉砕物を、下記においてさらに記載されるように２５０ｍｌの溶媒を用いて抽出した。抽出を５回行い、それぞれ、極性が増大する下記の５つの異なる溶媒の１つを使用した：ヘキサン、酢酸エチル、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、メタノールおよび水。抽出を溶媒の還流下で完全な２サイクルにわたって続けた（すなわち、２回、円筒ろ紙を溶媒で満たし、空にした）。抽出後、溶媒を真空ロタベイパーでエバポレーションし、乾燥した抽出物を集め、重量測定した。残留する植物材料を６５℃において乾燥器で乾燥し、その後、さらに抽出した。乾燥抽出物を集め、薄層クロマトグラフィーによって分析した［（ＴＬＣ）、シリカプレート、アルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４、ジクロロメタン（ＤＣＭ）−ヘキサン−メタノール（１：１：０．２）にて］。ＴＬＣプレートを、ＵＶによって、また、ＩＰＡにおける５％リンモリブデン酸による染色によって可視化した。
【０１６４】
腸を介したグルコース吸収。下記の実施例４を参照のこと。
【０１６５】
細胞内へのグルコース輸送。実施例４を参照のこと。
【０１６６】
結果
抽出収量。下記の表１には、５つの溶媒のそれぞれを使用したスベリヒユの反復ソックスレー抽出の結果、ならびに残渣が示され、併せて、各抽出部の対応する重量（グラム単位）、植物材料の総量の抽出された百分率、および、物理的特徴に関する所見が列挙される。
【表１】
【０１６７】
ＴＬＣ分析。下記の表２には、５つの反復ソックスレー抽出物のそれぞれのＴＬＣ分析の結果が列挙される。ＵＶおよび／または染色によって視認され得るすべてのスポットがＲｆ値として報告される。
【表２】
【０１６８】
得られたＴＬＣパターンの分析では、最も強い強度のスポット（０．４５および０．３６）が、５つの画分のうちの４つで、ある程度現れたことが示された。これらのスポットの強度はＤＣＭ抽出物において最も強いようであった。だが、ＤＣＭは、ＴＬＣプレートに塗布する前に蒸発してしまっているかもしれない非常に揮発性の溶媒であり、それにより、より小さい、より濃縮されたスポットをもたらすので、このことは惑わせるかもしれない。このＴＬＣ分析で得られた分離は、多くの化合物が極性および非極性の両方の性質を有するようであり、従って、脂肪酸、ステロイドおよびアミンなどの分子については当てはまるように、両方の条件のもとで抽出され得ることを示していた。
【０１６９】
生物学的活性の分析。抽出物を、２つの標準的なバイオアッセイを使用して、すなわち、腸を介するグルコース吸収（この場合、腸を介するグルコースの吸収に対する抽出物の影響が、実施例４に記載されるように測定される）、および、細胞内へのグルコース輸送（この場合、血流から細胞内部へのグルコースの輸送に対する影響が、実施例４において同様に記載されるように測定される）を使用して生物学的活性について分析した。下記の表３には、５つの抽出物のそれぞれのバイオアッセイの結果が列挙される。
【表３】
【０１７０】
実施例１ｂ
室温（ＲＴ）法によるスベリヒユ活性成分の抽出
材料および実験手順
ＲＴ抽出。１００ｇｒの乾燥スベリヒユ粉砕物を１ｌの溶媒とともにガラスビーカーに入れ、ＲＴで２４時間（ｈｒ）撹拌した。抽出を、極性が増大する下記の５つの異なる溶媒の１つを使用して並行して５回行った：ヘキサン、酢酸エチル、ＤＣＭ、メタノールおよび水。抽出後、植物材料をろ過して除き、ろ液の溶媒を真空ロタベイパーでエバポレーションし、乾燥した抽出物を集め、重量測定した。残留する植物材料を６５℃において乾燥器で乾燥し、その後、さらに抽出した。乾燥抽出物を集め、実施例１ａにおいて記載されたようにＴＬＣによって分析した。
【０１７１】
腸を介したグルコース吸収。下記の実施例４を参照のこと。
【０１７２】
細胞内へのグルコース輸送。実施例４を参照のこと。
【０１７３】
結果
抽出収量。下記の表４には、５つの溶媒のそれぞれを使用したＲＴ抽出の結果、ならびに残渣が示され、併せて、各抽出部の対応する重量（グラム単位）、植物材料の総量の抽出された百分率、および、物理的特徴に関する所見が列挙される。
【表４】
【０１７４】
ＴＬＣ分析。表５には、５つのＲＴ抽出物のそれぞれのＴＬＣ分析の結果が列挙される。ＵＶおよび／または染色によって視認され得るすべてのスポットがＲｆ値として報告される。
【表５】
【０１７５】
ＴＬＣパターンの分析では、明確な分離が、より高い領域（０．８９〜０．４７）におけるスポットと、より低い領域（０．３０〜０．０）におけるスポットとの間で示された。非極性から極性への移行は、スポットが０〜１の全範囲全体に存在するソックスレー抽出における場合よりも顕著であるようであった。
【０１７６】
これらの結果は、非極性物質のほとんどがヘキサンによって除かれたこと、および、極性物質が、メタノールまたは水を使用して抽出されたことを示している。ＴＬＣプレートの中間領域における大きな画分は、極性および非極性の両方の特徴を有する分子の存在を示している。
【０１７７】
生物学的活性の分析。抽出物を、実施例４において同様に記載されるように、２つの標準的なバイオアッセイ（腸を介するグルコース吸収、および、細胞内へのグルコース輸送）を使用して生物学的活性について分析した。表６には、５つの抽出物のそれぞれのバイオアッセイの結果が列挙される。
【表６】
【０１７８】
実施例１ｃ
反復ソックスレー抽出法およびＲＴ抽出法の比較
これら２つの予備的な抽出法を下記の基準に基づいて比較した：抽出効率、すなわち、各溶媒を使用して抽出された植物材料の割合、および、溶媒における抽出された物質の濃度（ｇ／ｍｌの単位で）；抽出の清浄度、すなわち、抽出時における材料の分解を示すＴＬＣにおける筋の形成；ＴＬＣにより検出される両手順での各溶媒により抽出された物質；および、抽出物の生物活性。
【０１７９】
抽出効率。両方の抽出手法から得られた全データは類似しており（上記の表１〜表５を参照のこと）、また、一般的には、両手法の異なる溶媒が同一のＴＬＣスポットを生じさせた。このことは、類似する成分がおそらくは抽出されたことを示している。反復ソックスレー抽出はＲＴ抽出よりも大きい収量で物質をもたらした（極性溶媒を使用したときにはそれぞれ１９％対１２％、また、非極性溶媒を使用したときにはそれぞれ５％対１．２％）。このことが、ソックスレー抽出の方が効率が大きいこと、または、望ましくない植物物質の抽出を示しているかどうかは、現在、調査中である。
【０１８０】
抽出の清浄度。ＲＴ抽出は、ＴＬＣプレート上での筋のあるスポットおよび細長いスポット（これらは過度な加熱の結果としての分解産物を示す）が観測された反復ソックスレー抽出よりも清浄であることが見出された。
【０１８１】
ＴＬＣ比較。一般に、両方の抽出手法は、類似する主要なＴＬＣスポットを類似する強度で与えた。反復ソックスレー法の方が多くのスポットを与えた。これは、様々な物質がより大きく濃縮された結果であり得るか、または、分解の結果であり得る。
【０１８２】
生物活性。検出された生物活性は極性−非極性分割の全面に明らかに分布していた。細胞内へのグルコース輸送は極性画分（メタノールおよび水）に明らかに関連し、活性が非極性画分では見出されなかった一方で、腸壁を介したグルコース吸収は非極性成分に関連していた；グルコース吸収は非極性画分によって明らかに減少した。
【０１８３】
考察
上記の抽出手法により、それぞれがグルコース代謝の異なる部分において活性である２つの別個の植物画分の存在が示された。非極性抽出物画分は、腸を介した低下したグルコース吸収活性を示し、一方、極性画分は、細胞への増強されたグルコース輸送を示した。これらの画分は、有効成分を解明する過程での一段階である。
【０１８４】
明らかに少なくとも２つ、おそらくは３つの異なる因子が、スベリヒユ抽出物の観測された生物学的活性に関係している。
【０１８５】
これらの抽出手法は、抽出を２工程（すなわち、非極性溶媒を使用する工程、および、極性溶媒を使用する工程）に削減することによって簡略化することができる。加えて、ＲＴ抽出の収率は少し低いが、この方法は、生じ得る分解が回避され得るので好ましい。重要な化合物が反復ソックスレー法によってさらに抽出されるかどうかはまだ検討されていない。逐次抽出手法は、活性な成分の単離を最大限にするために用いられるはずであり、本質的には、非極性抽出が最初に行わなければならず、その後、極性抽出が行われることに留意すること。
【０１８６】
実施例１ｄ−標準的な２段階法によるスベリヒユの抽出
材料および実験手順
標準的な２段階抽出。２００ｇの乾燥スベリヒユ粉砕物を２ｌの溶媒混合物とともにガラスビーカーに入れ、ＲＴで２４ｈｒ撹拌した。抽出を、下記の２つの異なる溶媒混合物を用いて順次行った：非極性：ヘキサン−ＤＣＭ−酢酸エチル（１：１：１）、および、極性：メタノール−エタノール−水（１：１：１）。抽出後、植物材料をろ過して除き、ろ液の溶媒を真空ロタベイパーでエバポレーションし、乾燥した抽出物を集め、重量測定した。残留する植物材料を６５℃において乾燥器で乾燥し、その後、さらに抽出した。乾燥抽出物を集め、実施例１ａにおいて記載されたようにＴＬＣによって分析した。
【０１８７】
腸を介したグルコース吸収。下記の実施例４を参照のこと。
【０１８８】
細胞内へのグルコース輸送。実施例４を参照のこと。
【０１８９】
結果
抽出収量。下記の表７には、この標準的な２段階抽出の各画分（非極性、極性または残渣）の重量（グラム単位）、植物材料の総量の抽出された対応する百分率、ならびに、物理的特徴に関する所見が示される。
【表７】
【０１９０】
ＴＬＣ分析。表８には、ＵＶ下および染色によって視認され得るすべてのスポットのＲｆ値として報告されるＴＬＣ分析の結果が示される。
【表８】
【０１９１】
３つのＴＬＣスポット（０．４１、０．３０および０．１７）が両方の抽出手法に共通していた。さらなる分析が、何らかの相関する生物学的活性を示すためには必要である。
【０１９２】
生物学的活性の分析。抽出物を、実施例４に記載されるように、２つの標準的なバイオアッセイ（腸を介するグルコース吸収、および、細胞へのグルコース輸送）を使用して生物学的活性について分析した。表９には、これら２つのバイオアッセイを使用して測定されたスベリヒユ抽出物の非極性画分および極性画分の生物学的活性がまとめられている。
【表９】
【０１９３】
考察
スベリヒユの生物活性成分の特定および精製を目指した標準的な抽出手法を開発した。この２段階手法は、非極性抽出、その後の極性抽出からなり、極性画分および非極性画分の両方ならびに生物活性成分の良好な初期分離をもたらした。スベリヒユのこの２段階抽出は、生物活性因子のさらなる精製および特定のための良好な基礎を形成している。
【０１９４】
実施例２
ヒト糖尿病患者の血中グルコースレベルに対するスベリヒユ抽出物の影響
材料および実験手順
試験被験者。ヒト被験者に対する試験をＮａｚａｒｅｔｈ地区（イスラエル）の医師および生化学実験室との協力で行った。２群の非インスリン性（２型）糖尿病患者を、血液中のグルコースレベルに対するスベリヒユ抽出物の影響について評価した。患者は、血中グルコースの初期レベルに基づいて２つの群の一方に割り振られた。試験開始時に、第１群の患者における血中グルコースレベルは３００ｍｇ／ｄｌを超えており、一方、第２群の血中グルコースレベルは３００ｍｇ／ｄｌ未満であった。下記の表１０には、試験開始時の血中グルコースレベルが３００ｍｇ／ｄｌを超えている患者の特徴および臨床履歴が示される。
【表１０】
【０１９５】
下記の表１１には、試験開始時の血中グルコースが３００ｍｇ／ｄｌ未満である患者の特徴および臨床履歴が示される。
【表１１】
【０１９６】
患者に投与されるスベリヒユ抽出物の調製。エタノール−水（８０％−２０％）のスベリヒユ抽出物を、ＴＣＰ結合剤（β−リン酸三カルシウム）を用いて作製した。抽出を、粉砕乾燥植物材料およびエタノール−水（８０−２０）を１０−９０（ｗ／ｗ）の比率で使用して４０℃で４時間行った。溶液をろ過し、抽出物を、ＴＣＰ（商業的に使用されている結合剤物質）の存在下、０℃で真空乾燥した。
製造物の最終組成は２５％の抽出物および７５％の結合剤物質であった。抽出の収率は８重量％〜９重量％であった。
【０１９７】
血中グルコースレベルの測定。グルコースを、毎週、１２ｈｒの絶食の後、市販のグルコメーターを使用して測定した。
【０１９８】
結果
スベリヒユのエタノール・水抽出物（標準的な植物ゼラチンカプセルに封入された乾燥粉末）を、何らかの他の薬物治療の非存在下、４５０ｍｇ／日（１００ｍｇの活性な抽出物）の投薬量で投与した。図１ａおよび図１ｂのグラフは、血中グルコースが３００ｍｇ／ｄｌを超えるインスリン非依存性糖尿病患者、および、血中グルコースが３００ｍｇ／ｄｌ未満であるインスリン非依存性糖尿病患者に対するスベリヒユ抽出物の影響をそれぞれ示している。スベリヒユ抽出物は、初期の血中グルコースレベルにもかかわらず、両群のすべての患者においてグルコース血中レベルを正常化することができたことがグラフから明らかである。血中グルコースレベルは、空腹時血中グルコースが１２６ｍｇ／ｄｌ（７．０ｍｍｏｌ／Ｌ）以上であるとき、２時間の経口ブドウ糖負荷試験結果が２００ｍｇ／ｄｌ（１１．１ｍｍｏｌ／Ｌ）以上であるときには、アメリカ糖尿病学会（ＡＤＡ）の基準に従って糖尿病であると見なされることに留意すること。
【０１９９】
考察
両群の２型糖尿病患者において、血中グルコースレベルの顕著な低下が観測された。試験開始時の血中グルコースが３００ｍｇ／ｄｌ未満である糖尿病患者は２週間後〜３週間後において正常な血中グルコースレベルを維持した。正常な血中グルコースレベルが、３００ｍｇ／ｄｌを超える初期レベルを有する糖尿病患者群では４週間後〜５週間後において得られた。
【０２００】
実施例３
本発明のスベリヒユ抽出物のインビトロでの毒性作用試験
スベリヒユのインビトロでの生物安全性を多数のインビトロ毒性学アッセイによって検討した。細胞生存性および細胞傷害性（ＭＴＴアッセイおよびＬＤＨ放出アッセイ）、肝細胞における分化した機能の発現（アルブミン分泌アッセイ）、ならびに、脂質過酸化（酸化ストレスの主要な指標）（ＭＤＡアッセイ）に対するスベリヒユ抽出物の影響を調べた。ヒト肝細胞株（ＨｅｐＧ２）、肝細胞および単球細胞株（ＴＨＰ１）の同時培養物（これは生理学的な細胞環境を模倣する）、リポ多糖（ＬＰＳ）（マクロファージおよび肝細胞の知られている活性化因子）により刺激された細胞、ならびに、ヒツジ肝臓の組織ホモジネートを様々な濃度のスベリヒユ抽出物とインキュベーションし、アッセイした。毒性学の測定を伴う標準的手法。２タイプ以上の細胞が調べられる。単球細胞は白血球である。
【０２０１】
材料および実験手順
植物抽出物。植物抽出物を上記の実施例２に記載されるように作製したが、結合剤を使用しなかっただけである。簡単に記載すると、１００ｇの乾燥植物を、標準的な還流装置において４０℃で４時間、９００ｍｌのエタノール−水混合物（８０−２０）により抽出した。抽出物をろ過して、植物残渣を除き、エタノールを５０℃における真空中でエバポレーションし、水を乾燥機における４０℃での乾燥によって除いた。抽出物（粘着性の粉末化物）をそのまま使用し、使用しないときには冷蔵保存した。
【０２０２】
細胞培養。スベリヒユ抽出物の潜在的な毒性を、ヒトヘパトプラストーマ細胞株ＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ−８０６５）および単球細胞株ＴＨＰ１（ＡＴＣＣ寄託番号ＴＩＢ−２０２）を使用する細胞培養系で評価した。ＨｅｐＧ２細胞株は正常な肝細胞の分化した実質機能を保持しているが、無限に成長することができ、従って長期間の研究を可能にする。ＴＨＰ１細胞およびＨｅｐＧ２細胞を、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の不活性化ウシ胎児血清、１％の非必須アミノ酸、１％のグルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリンおよび１０μｇ／ｍＬのストレプトマイシンが補充された高グルコース含有量（４．５ｇ／Ｌ）のダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で成長させた。細胞を９５％Ｏ２−５％ＣＯ２の加湿された雰囲気において３７℃で維持した。培地のｐＨを７．４にモニターした。細胞培地を１週間に２回交換した。７０％〜８０％のコンフルエンスで、細胞を、０．０５％トリプシンおよび０．０２％ＥＤＴＡを使用して５分間トリプシン処理し、２００ｇで１０分間遠心分離し、培養培地に再懸濁し、マイクロタイターディッシュに置床した。接種後２４時間で、細胞を新しい無血清培地において様々な濃度の植物抽出にさらした。
【０２０３】
ＭＴＴアッセイ。２×１０４個の細胞を９６ウエルマイクロタイターディッシュの各ウエルにおいて１００μｌの培養培地［すなわち、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の不活性化ウシ胎児血清、１％の非必須アミノ酸、１％のグルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリンおよび１０μｇ／ｍＬのストレプトマイシンが補充された高グルコース含有量（４．５ｇ／Ｌ）のダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）］に接種した。接種後２４時間で、細胞を植物の水抽出物の様々な濃度と３７℃で２４時間インキュベーションした。植物抽出物を各ウエルから除いた後、細胞をリン酸塩緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。その後、細胞を、ＭＴＴ（０．５ｍｇ／ｍｌ）が各ウエルに添加された無血清ＤＭＥＭ（１０μｌ）においてインキュベーションし、さらに４時間インキュベーションした。各ウエルに１００μＬのＭＴＴ溶液を加えた（０．５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴを含む）。その後、培地を除き、細胞を１００μｌの酸性イソプロパノール（０．０８Ｎ ＨＣｌ）と１５分間（ｍｉｎ）インキュベーションして、ホルマザン血漿を溶解させた。ＭＴＴホルマザンの吸光度を酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）読み取り装置で５７０ｎｍにおいて測定した。生存性を、非処理細胞に対する処理細胞の吸光度の百分率として表される比率として定義した。
【０２０４】
乳酸デヒドロゲナーゼアッセイ。１００μｌのＤＭＥＭ培地（上記参照）における２×１０４個の細胞を９６ウエルマイクロタイターディッシュの各ウエルに接種した。接種後２４時間で、細胞を増大する濃度の植物抽出物（０．００１ｍｇ／ｍｌ〜０．５ｍｇ／ｍｌ）にさらした。２４時間のインキュベーションの後、上清を各ウエルから注意深く吸引した。その後、細胞単層を細胞溶解液（１００μｌ）により室温で３０分間処理し、得られた溶解物を、マイクロピペットを使用して集めた。ＬＤＨ活性を、ＣｙｔｏＴｏｘ９６非放射性細胞傷害性アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＷＩ、米国）を製造者の説明書に従って使用して上清および細胞溶解物の両方の画分で測定した。
【０２０５】
ＬＤＨアッセイは、下記の化学反応によって要約される、赤色のホルマザン生成物へのテトラゾリウム塩の変換に基づいている：
【０２０６】
赤い色の強度はＬＤＨ活性に比例する。吸光度を９６ウエルプレートＥＬＩＳＡ読み取り装置で４９０ｎｍにおいて測定した。細胞から放出されたＬＤＨの割合を、下記の式を使用して求めた：
ＬＤＨ放出＝（上清の吸光度）／（上清＋溶解物の吸光度）×１００。
【０２０７】
アルブミン分泌アッセイ。細胞から分泌されたアルブミンの定量を下記のように行った。１００μｌの培養上清を９６ウエルマイクロタイターディッシュにおいて３７℃で１時間または４℃で一晩インキュベーションした。洗浄工程の後、非特異的結合部位を、０．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳにおいてＲＴで１時間ブロッキング処理した。２回目の洗浄工程の後、ペルオキシダーゼコンジュゲート化ヤギ抗ラットアルブミン抗体を、１％のＢＳＡを含有するＰＢＳにおいて加え、ＲＴで２時間インキュベーションした。その後、マイクロタイターディッシュを洗浄し、基質（１００ｍＭの酢酸Ｎａ、５０ｍＭのリン酸Ｎａおよび９×１０−３％のＨ２Ｏ２における０．５ｍｇ／ｍｌの２，２−アジノ−ジ−３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）を加えた。すべての洗浄工程を、ＰＢＳを使用してＲＴで行った。吸収をＥＬＩＳＡ読み取り装置で４０５ｎｍにおいて測定した。バックグラウンド値を細胞上清の非存在下で測定し、実験値から引いた。すべてのＥＬＩＳＡ測定を二連で行った。
【０２０８】
ＭＤＡアッセイ（６）。チオバルビツール酸反応性基質についてのＭＤＡ脂質過酸化アッセイを使用する脂質過酸化の測定は、反応が試薬とＭＤＡとの間で生じるときにピンク色を与えるＴＢＡＲＳ（チオバルビツール酸）試薬を加えることによってもたらされるＭＤＡ（マロンジアルデヒド）の回収に基づいている（Ｄｉａｎｅ Ｗ．Ｍｏｒｅｌ、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、ｖｏｌ．４、Ｎｏ．４、１９８４）。
【０２０９】
ＴＢＡＲＳ試薬の調製。ＴＢＡＲＳ溶液（作業用試薬）（これは０．１２ＭのＴＢＡを含有する；ｐＨ＝７．０）を、０．３７５ｇのＴＢＡ、２．５ｍｌの濃ＨＣｌおよび１５ｍｌの１００％ＴＣＡ（トリクロロ酢酸）の混合物に水を加えて、１００ｍｌの最終体積にすることによって調製した。この溶液を、ＴＢＡが溶解するまで約４０℃に加熱した。
【０２１０】
１０ｍＭのＭＤＡを含有するＭＤＡ標準溶液を下記のように調製した。８２μｌのＭＤＡを３．５ｍｌの濃ＨＣｌに加え、生理的食塩水（０．９％のＮａＣｌ）の添加によって５０ｍｌの最終体積にした。１００μＭのＭＤＡを含有するＭＤＡ作業用標準溶液を、ＭＤＡ標準溶液を生理的食塩水で１：１００希釈することによって調製した。
【０２１１】
ＭＤＡ標準曲線の調製。試験管を下記の表１２に従って準備した。
【表１２】
【０２１２】
各試験管に１ｍｌのＴＢＡＲＳ作業用試薬を加え、混合物を激しく撹拌した。１００℃で２０分間インキュベーションした後、混合物を２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清のＯ．Ｄ．を水ブランクに対して５２２ｎｍで読み取った。
【０２１３】
植物抽出物のＭＤＡアッセイ。２ｍｇ／ｍｌの植物抽出物溶液を調製し、その後、第１欄に示される濃度で新しい試験管に下記の表１３に従って希釈した。
【表１３】
【０２１４】
試験管を、時々振とうしながら、水浴において３７℃で３０分間インキュベーションした。３５００ｒｐｍ（２９００ｘｇ）での１０分間の遠心分離の後、０．５ｍｌの上清を新しい試験管に移した。１ｍｌのＴＢＡＲＳ作業用溶液を加えた後、混合物を激しく撹拌し、１００℃で２０分間加熱し、その後、２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清のＯ．Ｄ．を水ブランクに対して５２２ｎｍで読み取った。ＭＤＡの量を下記の式に従って標準曲線から計算した：
【０２１５】
結果
スベリヒユ抽出物は、ＭＴＴアッセイによって測定されたとき、インビトロ細胞成長に影響を及ぼさない。テトラゾリウム色素のＭＴＴは、細胞の生存性および／または代謝状態を評価するために広く使用されている。この比色法アッセイは、生細胞におけるミトコンドリアのコハク酸デヒドロゲナーゼによる赤色ホルマザン誘導体への黄色テトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）の変換に基づいている。
【０２１６】
ＨｅｐＧ２。エタノール−水によるスベリヒユ抽出物の生物安全性を評価するために、ＨｅｐＧ２細胞を増大する濃度のスベリヒユ抽出物と２４時間インキュベーションした。植物抽出物を各ウエルから除いた後、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＭＴＴアッセイを、実施例３の材料および実験手順に記載されるように行った。図２において認められるように、スベリヒユ由来の抽出物は、試験された濃度のいずれにおいても明白な負の影響を示さなかった。
【０２１７】
ＨｅｐＧ２およびＴＨＰ１の同時培養物。エタノール−水によるスベリヒユ抽出物の生物安全性をさらに評価するために、ＨｅｐＧ２細胞および単球細胞株ＴＨＰ１の同時培養物に対する増大する濃度の抽出物の影響を、２４時間のインキュベーションの後で、上記に記載されるように行われたＭＴＴアッセイを使用して調べた。図３において認められるように、スベリヒユ由来の抽出物は、試験されたすべての濃度で何らかの負の影響の徴候を全く示さなかった。１００μｇ／ｍｌ（試験された最大濃度）まで、抽出物は細胞生存性に対する影響を全く示さなかった。
【０２１８】
リポ多糖（ＬＰＳ）により処理されたＨｅｐＧ２およびＴＨＰ１の同時培養物。ＬＰＳにより活性化された細胞に対する植物抽出物の影響を評価するために、ＨｅｐＧ２細胞（２×１０４個）およびＴＨＰ１細胞（５×１０３個）の同時培養物を９６ウエルディッシュの各ウエルにおいて１００μｌの培地に接種した。接種後２４時間で、細胞を、１０μｇ／μｌのＬＰＳの非存在下および存在下、３７℃で２４時間、エタノール−水によるスベリヒユ抽出物の増大する濃度とインキュベーションした。上清を各ウエルから注意深く吸引した後、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＭＴＴアッセイを、実施例３の材料および実験手順に記載されるように行った。図４には、ＬＰＳおよび増大する濃度のスベリヒユ抽出物との一晩の同時インキュベーションの後でのＨｅｐＧ２およびＴＨＰ１の同時培養物におけるＭＴＴアッセイの結果がまとめられている。ＭＴＴ試験は、細胞生存性の低下を、試験された最大レベル（すなわち、５００μｇｒ／ｍｌ）まで示さなかった。
【０２１９】
スベリヒユ抽出物は膜の一体性に影響を及ぼさない。膜の一体性を、乳酸のピルビン酸への変換を触媒する乳酸デヒドロゲナーゼ活性（ＬＤＨ）の測定によって評価することができる。このＬＤＨアッセイでは、もっぱら細胞質ゾルに存在する酵素（ＬＤＨ）の細胞外培地への漏出が測定される。細胞が破壊されたとき、ＬＤＨ活性が上昇する。細胞培養培地におけるＬＤＨの存在は、細胞の死または細胞膜における漏出のいずれかに起因する細胞膜に対する損傷を示している。
【０２２０】
ＨｅｐＧ２細胞。ＨｅｐＧ２細胞を増大する濃度のスベリヒユ抽出物と２４時間インキュベーションし、ＬＤＨアッセイを、実施例３の材料および実験手順に記載されるように行った。図５には、ＬＤＨ漏出が、エタノール−水によるスベリヒユ抽出の増大する濃度との一晩のインキュベーションの後でのＨｅｐＧ２細胞からの総量（すなわち、細胞破壊後のＬＤＨの総量）の百分率としてまとめられている。図６では、エタノール−水によるスベリヒユ抽出物の様々な濃度との一晩のインキュベーションの後でのＨｅｐＧ２−ＴＨＰ１細胞同時培養物からのＬＤＨ漏出の百分率がまとめられている。従って、ＨｅｐＧ２−ＴＨＰ１細胞とのスベリヒユ抽出物の２４時間のインキュベーションは培養培地におけるＬＤＨレベルの著しい変化を誘導しなかった。
【０２２１】
ＨｅｐＧ２およびＴＨＰ１のＬＰＳ処理された同時培養物。図７には、１０μｇ／ｍｌのＬＰＳおよび増大する濃度のスベリヒユ抽出物との一晩のインキュベーションの後でのＨｅｐＧ２およびＴＨＰ１の同時培養細胞からのＬＤＨ漏出の百分率がまとめられている。ＨｅｐＧ２細胞単独に関して観測されたように、ＬＰＳ処理されたＨｅｐＧ２およびＴＨＰ１の同時培養物の培地におけるＬＤＨレベルは、エタノール−水によるスベリヒユ抽出物とのインキュベーションの後で著しく増大していなかった。
【０２２２】
スベリヒユ抽出物は細胞機能に影響を及ぼさない。タンパク質の細胞タイプ特異的発現に対するスベリヒユ抽出物の影響を、分化した機能を調べるための手段として検討した。肝臓特異的な機能の発現を、実施例３の材料および実験手順に記載されるようにアルブミン分泌アッセイを使用してＨｅｐＧ２細胞によるアルブミン分泌を測定することによって評価した。図８は、増大する濃度のスベリヒユ抽出物との一晩のインキュベーションの後でのＨｅｐＧ２細胞におけるアルブミン産生を示す。細胞培養培地におけるアルブミンのレベルは、スベリヒユ抽出物とのインキュベーションによって変化しないことが見出された。
【０２２３】
スベリヒユ抽出物は酸化ストレスを誘導しない。チオバルビツール酸反応性物質（ＴＢＡＲＳ）を測定する感度は、ＭＤＡアッセイを、脂質の過酸化（酸化ストレスの主要な指標）をスクリーニングおよびモニターリングするための優れた方法にしている（１〜３）。この迅速かつ使いやすい手法は、薬物、食品製造物、ならびに、ヒトおよび動物の生物学的組織をはじめとする多くのタイプのサンプルとの使用のために研究者によって改変されている（４〜７）。ＭＤＡアッセイは、疾患状態におけるフリーラジカル活性に関する重要な情報を提供しており、いくつかの化合物の抗酸化活性の測定のために使用されている。
【０２２４】
ＭＤＡ放出をヒツジ肝臓ホモジネートにおけるスベリヒユ抽出物の濃度の関数として測定した。図９は、ヒツジ肝臓ホモジネートにおける１０μＭのＦｅＳＯ４により誘導される脂質過酸化に対する、スベリヒユのアルコール−水抽出物の増大する濃度の結果を示す。フリーラジカル濃度の変化が認められなかった。このことは、抽出物が過酸化プロセスに対して作用を有しないことを示している。
【０２２５】
考察
ＭＴＴアッセイ、ＬＤＨ放出アッセイ、アルブミン分泌アッセイおよびＭＤＡアッセイは、スベリヒユのエタノール−水抽出物が、１０００μｇ／ｍｌの抽出物濃度まで、毒性作用を全く生じさせず、あるいは、測定されたすべてのパラメーターにおける分化した機能に対する影響も、また、フリーラジカルの濃度に対する影響も何ら生じさせなかったので、スベリヒユのエタノール−水抽出物は生物学的に安全であることを示している。
【０２２６】
実施例４
スベリヒユ抽出物のインビトロでの効力の試験
上記実施例２の予備実験では、スベリヒユ抽出物が糖尿病患者の血流におけるグルコースレベルを減少させたことが明らかにされた。２型糖尿病の複雑性は、ヒト被験者において観測される効力（この場合、グルコースレベルの減少は、それがどのようにして達成されるかに関しては何ら示さない全体的な作用である）を再現する１つの全般的なインビトロアッセイを開発することを不可能にしている。従って、グルコースの輸送ならびに吸収に対するスベリヒユ抽出物の作用をできる限り忠実に模倣することが重要である。培地（血液）から細胞膜を介して細胞内へのグルコースの輸送を測定するいくつかの標準的なアッセイを利用することができる。加えて、小腸の壁を介した血流内へのグルコース吸収のインビトロ測定（これはグルコース代謝の最初の段階の目安を提供する）を、動物の腸組織を介した吸収を使用してモデル化することができる。２つのアッセイを、グルコースの吸収および輸送に対するスベリヒユ抽出物の影響を明らかにするために行った。
【０２２７】
実施例４ａは腸を介したグルコース吸収に対するスベリヒユ抽出物の影響を記載する。
【０２２８】
材料および実験手順
腸を介したグルコース吸収に対するスベリヒユ抽出物の影響の測定。長さ１０ｃｍのヒツジ小腸を、１００ｍｇ／ｍｌのＤ−グルコースおよび関連した量のスベリヒユ抽出物を含有するクレブス溶液を保持する容器に一方の側でつなぎ、回収容器に反対側でつなぎ、その結果、クレブス溶液が腸を通って流れるようにした。系内への溶液の流束は５０ｍｌ／ｈｒ〜５５ｍｌ／ｈｒであった。腸を、ＤＤＷを含有する恒温浴において３７℃でインキュベーションした。糖が、腸を介して吸収し、壁を通って水浴に輸送される。浴からのサンプルを１５分毎に採取し、サンプルのグルコース濃度を、グルコース濃度を測定するための一般的な方法であるＤＮＳ法（これは本明細書中下記に記載される）に従って調べた。
【０２２９】
ＤＮＳ試薬の調製。７．４９ｇの３，５−ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）および１４ｇのＮａＯＨを１１のＤＤＷに加え、混合した。溶解したとき、２１６ｇのロッシェル塩（酒石酸ＮａＫ）、５．３７ｇのフェノールおよび５．８６ｇのメタ重硫酸ナトリウムを加え、混合した。
【０２３０】
ＤＮＳ法。３ｍｌのＤＮＳ試薬を１ｍｌのサンプルに加え、混合物を沸騰水（１００℃）中で５分間インキュベーションし、その後、室温に達するまで氷に移した。Ｏ．Ｄ．を、分光光度計を使用して６４０ｎｍで測定し、結果を、０ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、０．４ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｇ／ｍｌ、０．８ｍｇ／ｍｌおよび１．０ｍｇ／ｍｌの濃度でのデキストロースの標準曲線から計算した。
【０２３１】
結果
図１０は、ヒツジの腸を介したグルコース吸収に対するスベリヒユ抽出物の影響を示す。測定値を、そのタンパク質含有量を示す腸サンプルの重量について正規化した。スベリヒユ抽出物が、腸を介したグルコースの輸送を部分的に阻害したことがグラフから明白である。このことは、血流におけるグルコースレベルの減少が生じることを示している。
【０２３２】
実施例４ｂは酵母細胞内へのグルコースの輸送に対するスベリヒユ抽出物の影響を記載する。
【０２３３】
酵母細胞内へのグルコース輸送の測定（これは、長年にわたって使用されている方法である）では、グルコース濃度に対する直接的な応答である、活性の指標としての酵母細胞によるＣＯ２の発生が利用される。
【０２３４】
材料および実験手順
グルコース輸送アッセイ。２．５ｍｌのパン酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のストック溶液（４０ｍｇ／ｍｌ）、および、増大する量（０．０５ｍｇ／ｍｌから０．５ｍｇ／ｍｌまで）のスベリヒユ抽出物のストック溶液（１ｍｇ／ｍｌの標準的なエタノール−水（８０：２０）抽出物、その体積は合計で２４ｍｌに調節された）を１００ｍｌの血清ボトルに加えた。血清ボトルを窒素下で維持し、ガス発生を測定するために目盛り付きマノメーターにつないだ。実験はまた、スベリヒユ抽出物を含まない酵母溶液からなるブランクを用いても行われた。
【０２３５】
血清ボトルを恒温振とう器浴において３７℃で振とうした。ＣＯ２の発生が直ちに始まるが、系が平衡に達したときすぐに止まる。その時点で０．１５ｇ／ｍｌのグルコースの１ｍｌを加え、放出されたＣＯ２の量を、１ｈｒの期間にわたって５分毎に時間の関数として測定し、記録した。１ｈｒ後、実験を停止した。記録されたＣＯ２の量を、１ｇＣＯ２＝２．０４ｇグルコースの変換に基づいてグルコースのｍｇに変換した。スベリヒユ抽出物の存在下および非存在下で消費されたグルコースの量をグラフに経時的に示した。
【０２３６】
結果
測定された数の酵母細胞を制御された条件のもとで維持し、特定量のグルコースを与え、ＣＯ２の発生を測定した。実験を二連で行い、それにより、スベリヒユ抽出物を、第２の実験ではグルコースに加えて加えた。発生したＣＯ２の量の変化は、細胞内へのグルコース輸送に対するスベリヒユ抽出物の影響の尺度である。
【０２３７】
スベリヒユ抽出物が酵母細胞のＣＯ２産出を増大させたことが、酵母細胞におけるグルコース取り込みに対するスベリヒユ抽出物の影響をまとめる図１１から明白である。このことは、増大した活性が、スベリヒユ抽出物によって生じた細胞内へのグルコース輸送の増大に起因することを示している。
【０２３８】
考察
上記のインビトロ実験は、ヒト糖尿病被験者に対する予備的試験と同様に、スベリヒユ抽出物が生物学的に安全であり、かつ、血流中のグルコースレベルの減少において効果的であることを明らかにしている。
【０２３９】
インビトロ実験は、抽出物が、小腸を介したグルコースの吸収だけでなく、細胞内へのグルコースの輸送に影響を及ぼすことを示している。このことは、少なくとも２つの有効成分が存在することを示し得る。抽出物の精製および活性成分の単離は、抽出物の機構のより詳細な研究を可能にする。
【０２４０】
明確にするため別個の実施態様で説明されている本発明の特定の特徴は単一の実施態様に組み合わせて提供することもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施態様で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで提供することもできる。
【０２４１】
本発明はその特定の実施態様によって説明してきたが、多くの別法、変更及び変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更及び変形すべてを包含するものである。本願で挙げた刊行物、特許、特許願及びＧｅｎＢａｎｋアセッション番号はすべて、個々の刊行物、特許、特許願及びＧｅｎＢａｎｋアセッション番号が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用又は確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。
【０２４２】
【図面の簡単な説明】
【０２４３】
【図１】血中グルコースレベルが試験開始時に３００ｍｇ／ｄｌを超えるインスリン非依存性糖尿病患者（図１ａ）、および、血中グルコースレベルが試験開始時に３００ｍｇ／ｄｌ未満であるインスリン非依存性糖尿病患者（図１ｂ）における血中グルコースレベルに対するスベリヒユ抽出物の影響を示すグラフである。
【図２】ＭＴＴアッセイを使用して測定されたときの、ＨｅｐＧ２細胞の生存性に対するスベリヒユ抽出物の増大する濃度の影響を示す棒グラフである。
【図３】ＭＴＴアッセイを使用して測定されたときの、ＨｅｐＧ２およびＴＨＰ１の同時培養物の生存性に対するスベリヒユ抽出物の増大する濃度の影響を示す棒グラフである。
【図４】ＭＴＴアッセイを使用して測定されたときの、ＬＰＳにより刺激されたＨｅｐＧ２およびＴＨＰ１の同時培養物の生存性に対するスベリヒユ抽出物の増大する濃度の影響を示す棒グラフである。
【図５】ＬＤＨアッセイを使用して測定されたときの、ＨｅｐＧ２細胞からの総ＬＤＨ放出（細胞を完全に破壊した後でのＬＤＨ濃度、培地中へのＬＤＨの放出最大量）の百分率としてのＬＤＨ放出に対するスベリヒユ抽出物の増大する濃度の影響を示す棒グラフである。
【図６】ＬＤＨアッセイを使用して測定されたときの、ＨｅｐＧ２細胞およびＴＨＰ１細胞の同時培養物からのＬＤＨ放出の百分率に対するスベリヒユ抽出物の増大する濃度の影響を示す棒グラフである。
【図７】ＬＤＨアッセイによる、ＬＰＳ刺激されたＨｅｐＧ２およびＴＨＰ１の同時培養物からのＬＤＨ放出の百分率に対するスベリヒユ抽出物の増大する濃度の影響を示す棒グラフである。
【図８】アルブミン分泌アッセイを使用して測定されたときの、ＨｅｐＧ２細胞におけるアルブミン産生に対するスベリヒユ抽出物の増大する濃度の影響を示す棒グラフである。
【図９】ＭＤＡアッセイを使用したときの、ヒツジ肝臓ホモジネートにおける１０μＭのＦｅＳＯ４により誘導される脂質過酸化に対するスベリヒユのアルコール・水抽出物の増大する濃度の影響を示す棒グラフである（ｎ＝３）。
【図１０】時間の関数としての、ヒツジ腸を介するグルコース吸収に対するスベリヒユ抽出物の影響を示す線グラフである。
【図１１】酵母細胞におけるグルコース取り込みに対するスベリヒユ抽出物の影響を示す線グラフである。
【図１２】活性成分を植物から精製するための段階毎の手順を例示する流れ図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
スベリヒユ（Ｐｏｒｔｕｌａｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ Ｌ．）から高血糖防止作用物質を単離する方法であって、極性成分をスベリヒユから抽出し、それによりスベリヒユから高血糖防止作用物質を単離することを含む方法。
【請求項２】
前記抽出は、極性が増大する溶媒グラジエントを用いることによって行われる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抽出はエタノール−水抽出によって行われる請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記極性が増大する溶媒は、ヘキサン、酢酸エチル、ジクロロメタン、メタノールおよび水である請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記極性が増大する溶媒は、ヘキサン：ジクロロメタン：酢酸エチル（１：１：１）およびメタノール：エタノール：水（１：１：１）である請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記極性成分を前記抽出物から精製することをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記極性成分を前記抽出物から精製することは薄層クロマトグラフィーによって行なわれる請求項６に記載の方法。
【請求項８】
スベリヒユから高血糖防止作用物質を単離する方法であって、非極性成分をスベリヒユから抽出し、それによりスベリヒユから高血糖防止作用物質を精製することを含む方法。
【請求項９】
前記抽出は、非極性溶媒を使用して行われる請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記抽出はエタノール−水抽出によって行われる請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記非極性溶媒は、ヘキサン、ジクロロメタンおよび酢酸エチルからなる群から選択される請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記非極性成分を前記抽出物から精製することをさらに含む請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記非極性成分を前記抽出物から精製することは薄層クロマトグラフィーによって行われる請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
スベリヒユのエタノール−水抽出物を含む組成物。
【請求項１５】
前記エタノール−水の比は８０％−２０％である請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記スベリヒユのエタノール−水抽出物は、血中グルコースレベルを低下させることができる請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
前記スベリヒユのエタノール−水抽出物は、細胞内へのグルコース輸送を増加させかつ／または腸を介したグルコース吸収を減少させることができる請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
スベリヒユの極性画分抽出物を含む組成物。
【請求項１９】
前記極性抽出物は血液中のグルコースレベルを低下させることができる請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記極性抽出物は細胞内へのグルコース輸送を増加させることができる請求項１８に記載の組成物。
【請求項２１】
前記組成物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．０〜０．４５の範囲にＲｆ値を有する請求項１８に記載の組成物。
【請求項２２】
前記組成物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．０〜０．３２の範囲にＲｆ値を有する請求項１８に記載の組成物。
【請求項２３】
前記組成物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１７〜０．４１の範囲にＲｆ値を有する請求項１８に記載の組成物。
【請求項２４】
前記スベリヒユの極性画分抽出物は、メタノールを使用してソックスレー抽出によって抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．０、０．３１、０．３４、０．３６、０．３９および０．４５からなる群から選択されるＲｆ値を有する請求項１８に記載の組成物。
【請求項２５】
前記スベリヒユの極性画分抽出物は、水を使用してソックスレー抽出によって抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．０のＲｆ値を有する請求項１８に記載の組成物。
【請求項２６】
前記スベリヒユの極性画分抽出物は、メタノールを用いて抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．０、０．１５、０．３０および０．３２からなる群から選択されるＲｆ値を有する請求項１８に記載の組成物。
【請求項２７】
前記スベリヒユの極性画分抽出物は、メタノール：エタノール：水を１：１：１の比率で用いて抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１７、０．２７、０．３０、０．３４、０．３９および０．４１からなる群から選択されるＲｆ値を有する請求項１８に記載の組成物。
【請求項２８】
血中グルコースレベルを低下させるための、スベリヒユの極性抽出物を含む組成物の使用。
【請求項２９】
前記極性抽出物は細胞内へのグルコース輸送を増加させることができる請求項２８に記載の使用。
【請求項３０】
前記組成物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．０〜０．４５の範囲にＲｆ値を有する請求項２８に記載の使用。
【請求項３１】
前記組成物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．０〜０．３２の範囲にＲｆ値を有する請求項２８に記載の使用。
【請求項３２】
前記組成物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１７〜０．４１の範囲にＲｆ値を有する請求項２８に記載の使用。
【請求項３３】
前記スベリヒユの極性画分抽出物は、メタノールを使用してソックスレー抽出によって抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．０、０．３１、０．３４、０．３６、０．３９および０．４５からなる群から選択されるＲｆ値を有する請求項２８に記載の使用。。
【請求項３４】
前記スベリヒユの極性画分抽出物は、水を使用してソックスレー抽出によって抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．０のＲｆ値を有する請求項２８に記載の使用。。
【請求項３５】
前記スベリヒユの極性画分抽出物は、メタノールを用いて抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．０、０．１５、０．３０および０．３２からなる群から選択されるＲｆ値を有する請求項２８に記載の使用。
【請求項３６】
前記スベリヒユの極性画分抽出物は、メタノール：エタノール：水を１：１：１の比率で用いて抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１７、０．２７、０．３０、０．３４、０．３９および０．４１からなる群から選択されるＲｆ値を有する請求項１８に記載の使用。
【請求項３７】
スベリヒユの非極性画分抽出物を含む組成物。
【請求項３８】
前記スベリヒユの非極性画分抽出物はヒドロコロイドを含まない請求項３７に記載の組成物。
【請求項３９】
前記非極性抽出物は血中グルコースレベルを減少させることができる請求項３７に記載の組成物。
【請求項４０】
前記非極性抽出物は腸を介したグルコース吸収を減少させることができる請求項３７に記載の組成物。
【請求項４１】
前記組成物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１１〜０．８９の範囲にＲｆ値を有する請求項３７に記載の組成物。
【請求項４２】
前記組成物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１１〜０．８８の範囲にＲｆ値を有する請求項３７に記載の組成物。
【請求項４３】
前記組成物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１７〜０．９１の範囲にＲｆ値を有する請求項３７に記載の組成物。
【請求項４４】
前記スベリヒユの非極性画分抽出物は、ヘキサンを使用してソックスレー抽出によって抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．３６、０．４５、０．５２、０．７１および０．８８からなる群から選択されるＲｆ値を有する請求項３７に記載の組成物。
【請求項４５】
前記スベリヒユの非極性画分抽出物は、酢酸エチルを使用してソックスレー抽出によって抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１１、０．１８、０．３１、０．３６、０．４５、０．５２および０．７１からなる群から選択されるＲｆ値を有する請求項３７に記載の組成物。
【請求項４６】
前記スベリヒユの非極性画分抽出物は、ヘキサンを使用して抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．３、０．３２、０．４１、０．４７および０．８９からなる群から選択されるＲｆ値を有する請求項３７に記載の組成物。
【請求項４７】
前記スベリヒユの非極性画分抽出物は、酢酸エチルを使用して抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１５、０．３６、０．４７、０．７３および０．８９からなる群から選択されるＲｆ値を有する請求項３７に記載の組成物。
【請求項４８】
前記スベリヒユの非極性画分抽出物は、ヘキサン：ＤＣＭ：酢酸エチルを１：１：１の比率で用いて抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１７、０．３０、０．３６、０．４１、０．６８および０．９１からなる群から選択されるＲｆ値を有する請求項３７に記載の組成物。
【請求項４９】
血中グルコースレベルを低下させるための、スベリヒユの非極性抽出物を含む組成物の使用。
【請求項５０】
前記組成物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１１〜０．８９の範囲にＲｆ値を有する請求項４９に記載の使用。
【請求項５１】
前記組成物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１１〜０．８８の範囲にＲｆ値を有する請求項４９に記載の使用。
【請求項５２】
前記組成物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１７〜０．９１の範囲にＲｆ値を有する請求項４９に記載の使用。
【請求項５３】
前記スベリヒユの非極性画分抽出物は、ヘキサンを使用してソックスレー抽出によって抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．３６、０．４５、０．５２、０．７１および０．８８からなる群から選択されるＲｆ値を有する請求項４９に記載の使用。
【請求項５４】
前記スベリヒユの非極性画分抽出物は、酢酸エチルを使用してソックスレー抽出によって抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１１、０．１８、０．３１、０．３６、０．４５、０．５２および０．７１からなる群から選択されるＲｆ値を有する請求項４９に記載の使用。
【請求項５５】
前記スベリヒユの非極性画分抽出物は、ヘキサンを使用して抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．３、０．３２、０．４１、０．４７および０．８９からなる群から選択されるＲｆ値を有する請求項４９に記載の使用。
【請求項５６】
前記スベリヒユの非極性画分抽出物は、酢酸エチルを使用して抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１５、０．３６、０．４７、０．７３および０．８９からなる群から選択されるＲｆ値を有する請求項４９に記載の使用。
【請求項５７】
前記スベリヒユの非極性画分抽出物は、ヘキサン：ＤＣＭ：酢酸エチルを１：１：１の比率で用いて抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１７、０．３０、０．３６、０．４１、０．６８および０．９１からなる群から選択されるＲｆ値を有する請求項４９に記載の使用。
【請求項５８】
血中グルコースレベルを低下させるための、スベリヒユのエタノール−水抽出物を含む組成物の使用。
【請求項５９】
スベリヒユの極性画分抽出物を含む組成物の治療効果的な量と、医薬的に許容され得るキャリアまたは希釈剤とを含む、血中グルコースレベルを低下させるための医薬組成物。
【請求項６０】
前記極性画分抽出物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．０〜０．４５の範囲にＲｆ値を有する請求項５９に記載の医薬組成物。
【請求項６１】
前記極性画分抽出物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．０〜０．３２の範囲にＲｆ値を有する請求項５９に記載の医薬組成物。
【請求項６２】
前記極性画分抽出物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１７〜０．４１の範囲にＲｆ値を有する請求項５９に記載の医薬組成物。
【請求項６３】
前記スベリヒユの極性画分抽出物は、メタノールを使用してソックスレー抽出によって抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．０、０．３１、０．３４、０．３６、０．３９および０．４５からなる群から選択されるＲｆ値を有する請求項５９に記載の医薬組成物。
【請求項６４】
前記スベリヒユの極性画分抽出物は、水を使用してソックスレー抽出によって抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．０のＲｆ値を有する請求項５９に記載の医薬組成物。
【請求項６５】
前記スベリヒユの極性画分抽出物は、メタノールを用いて抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．０、０．１５、０．３０および０．３２からなる群から選択されるＲｆ値を有する請求項５９に記載の医薬組成物。
【請求項６６】
前記スベリヒユの極性画分抽出物は、メタノール：エタノール：水を１：１：１の比率で用いて抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１７、０．２７、０．３０、０．３４、０．３９および０．４１からなる群から選択されるＲｆ値を有する請求項５９に記載の医薬組成物。
【請求項６７】
スベリヒユの非極性画分抽出物を含む組成物の治療効果的な量と、医薬的に許容され得るキャリアまたは希釈剤とを含む、血中グルコースレベルを低下させるための医薬組成物。
【請求項６８】
前記スベリヒユの非極性画分抽出物はヒドロコロイドを含まない請求項６７に記載の医薬組成物。
【請求項６９】
前記非極性画分抽出物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１１〜０．８９の範囲にＲｆ値を有する請求項６７に記載の医薬組成物。
【請求項７０】
前記非極性画分抽出物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１１〜０．８８の範囲にＲｆ値を有する請求項６７に記載の医薬組成物。
【請求項７１】
前記非極性画分抽出物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１７〜０．９１の範囲にＲｆ値を有する請求項６７に記載の医薬組成物。
【請求項７２】
前記スベリヒユの非極性画分抽出物は、ヘキサンを使用してソックスレー抽出によって抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．３６、０．４５、０．５２、０．７１および０．８８からなる群から選択されるＲｆ値を有する請求項６７に記載の医薬組成物。
【請求項７３】
前記スベリヒユの非極性画分抽出物は、酢酸エチルを使用してソックスレー抽出によって抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１１、０．１８、０．３１、０．３６、０．４５、０．５２および０．７１からなる群から選択されるＲｆ値を有する請求項６７に記載の医薬組成物。
【請求項７４】
前記スベリヒユの非極性画分抽出物は、ヘキサンを使用して抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．３、０．３２、０．４１、０．４７および０．８９からなる群から選択されるＲｆ値を有する請求項６７に記載の医薬組成物。
【請求項７５】
前記スベリヒユの非極性画分抽出物は、酢酸エチルを使用して抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１５、０．３６、０．４７、０．７３および０．８９からなる群から選択されるＲｆ値を有する請求項６７に記載の医薬組成物。
【請求項７６】
前記スベリヒユの非極性画分抽出物は、ヘキサン：ＤＣＭ：酢酸エチルを１：１：１の比率で用いて抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１７、０．３０、０．３６、０．４１、０．６８および０．９１からなる群から選択されるＲｆ値を有する請求項６７に記載の医薬組成物。
【請求項７７】
スベリヒユのエタノール−水抽出物を含む組成物の治療効果的な量と、医薬的に許容され得るキャリアまたは希釈剤とを含む、血中グルコースレベルを低下させるための医薬組成物。
【請求項７８】
対象における高血糖関連疾患を処置する方法であって、スベリヒユのエタノール−水抽出物を含む組成物の治療効果的な量をその必要性のある対象に投与し、それにより対象における高血糖関連疾患を処置することを含む方法。
【請求項７９】
対象における高血糖関連疾患を処置する方法であって、スベリヒユの極性画分抽出物を含む組成物の治療効果的な量をその必要性のある対象に投与し、それにより対象における高血糖関連疾患を処置することを含む方法。
【請求項８０】
高血糖関連疾患は、糖尿病、クッシング病、クッシング症候群、摂食障害、損なわれたグルコース耐性、腎糸球体微小血管障害、びまん性糸球体硬化症、結節性糸球体硬化症、尿路感染症、急性腎盂腎炎、壊死性乳頭炎、気腫性腎盂腎炎、グリコーゲンネフローゼ（アルマンニ−エブシュタイン病変）、網膜症、非増殖性網膜症、毛細血管瘤、網膜浮腫滲出物、出血、増殖性網膜症、小血管の増殖、出血性線維症、網膜剥離、白内障、レンズの浸透圧変化による一過性の屈折異常、虹彩における血管の増殖による緑内障、網膜感染症、脳血管のアテローム硬化性疾患、神経障害、皮膚感染症、冠状動脈のアテローム性動脈硬化、心筋梗塞、末梢のアテローム性動脈硬化：四肢虚血、壊疽、増大した胎児死亡率、増大した感染感受性、および、遅れた創傷治癒からなる群から選択される請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記極性抽出物は血中グルコースレベルを減少させることができる請求項７９に記載の方法。
【請求項８２】
前記極性画分抽出物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．０〜０．４５の範囲にＲｆ値を有する請求項７９に記載の方法。
【請求項８３】
前記極性画分抽出物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．０〜０．３２の範囲にＲｆ値を有する請求項７９に記載の方法。
【請求項８４】
前記極性画分抽出物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１７〜０．４１の範囲にＲｆ値を有する請求項７９に記載の方法。
【請求項８５】
前記スベリヒユの極性画分抽出物は、メタノールを使用してソックスレー抽出によって抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．０、０．３１、０．３４、０．３６、０．３９および０．４５からなる群から選択されるＲｆ値を有する請求項７９に記載の方法。
【請求項８６】
前記スベリヒユの極性画分抽出物は、水を使用してソックスレー抽出によって抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．０のＲｆ値を有する請求項７９に記載の方法。
【請求項８７】
前記スベリヒユの極性画分抽出物は、メタノールを用いて抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．０、０．１５、０．３０および０．３２からなる群から選択されるＲｆ値を有する請求項７９に記載の方法。
【請求項８８】
前記スベリヒユの極性画分抽出物は、メタノール：エタノール：水を１：１：１の比率で用いて抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１７、０．２７、０．３０、０．３４、０．３９および０．４１からなる群から選択されるＲｆ値を有する請求項７９に記載の方法。
【請求項８９】
対象における高血糖関連疾患を処置する方法であって、スベリヒユの非極性画分抽出物を含む組成物の治療効果的な量をその必要性のある対象に投与し、それにより対象における高血糖関連疾患を処置することを含む方法。
【請求項９０】
前記スベリヒユの非極性画分抽出物はヒドロコロイドを含まない請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
高血糖関連疾患は、糖尿病、クッシング病、クッシング症候群、摂食障害、損なわれたグルコース耐性、腎糸球体微小血管障害、びまん性糸球体硬化症、結節性糸球体硬化症、尿路感染症、急性腎盂腎炎、壊死性乳頭炎、気腫性腎盂腎炎、グリコーゲンネフローゼ（アルマンニ−エブシュタイン病変）、網膜症、非増殖性網膜症、毛細血管瘤、網膜浮腫滲出物、出血、増殖性網膜症、小血管の増殖、出血性線維症、網膜剥離、白内障、レンズの浸透圧変化による一過性の屈折異常、虹彩における血管の増殖による緑内障、網膜感染症、脳血管のアテローム硬化性疾患、神経障害、皮膚感染症、冠状動脈のアテローム性動脈硬化、心筋梗塞、末梢のアテローム性動脈硬化：四肢虚血、壊疽、増大した胎児死亡率、増大した感染感受性、および、遅れた創傷治癒からなる群から選択される請求項８９に記載の方法。
【請求項９２】
前記非極性画分抽出物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１１〜０．８９の範囲にＲｆ値を有する請求項８９に記載の方法。
【請求項９３】
前記非極性画分抽出物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１１〜０．８８の範囲にＲｆ値を有する請求項８９に記載の方法。
【請求項９４】
前記非極性画分抽出物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１７〜０．９１の範囲にＲｆ値を有する請求項８９に記載の方法。
【請求項９５】
前記スベリヒユの非極性画分抽出物は、ヘキサンを使用してソックスレー抽出によって抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．３６、０．４５、０．５２、０．７１および０．８８からなる群から選択されるＲｆ値を有する請求項８９に記載の方法。
【請求項９６】
前記スベリヒユの非極性画分抽出物は、酢酸エチルを使用してソックスレー抽出によって抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１１、０．１８、０．３１、０．３６、０．４５、０．５２および０．７１からなる群から選択されるＲｆ値を有する請求項８９に記載の方法。
【請求項９７】
前記スベリヒユの非極性画分抽出物は、ヘキサンを用いて抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．３、０．３２、０．４１、０．４７および０．８９からなる群から選択されるＲｆ値を有する請求項８９に記載の方法。
【請求項９８】
前記スベリヒユの非極性画分抽出物は、酢酸エチルを用いて抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１５、０．３６、０．４７、０．７３および０．８９からなる群から選択されるＲｆ値を有する請求項８９に記載の方法。
【請求項９９】
前記スベリヒユの非極性画分抽出物は、ヘキサン：ＤＣＭ：酢酸エチルを１：１：１の割合で用いて抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１７、０．３０、０．３６、０．４１、０．６８および０．９１からなる群から選択されるＲｆ値を有する請求項８９に記載の方法。
【請求項１００】
血液中のグルコースレベルを調節するための作用物質を特定する方法であって
（ａ）スベリヒユの抽出物を分画化し、それにより複数の画分を得ること；および
（ｂ）血液中のグルコースレベルを調節することができる少なくとも１つの画分を前記複数の画分から特定し、それにより血液中のグルコースレベルを調節するための作用物質を特定すること
を含む方法。
【請求項１０１】
前記分画化は、極性が増大する溶媒グラジエントを用いて行われる請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
工程（ｂ）は、（ｉ）腸を介したグルコース吸収および／または（ｉｉ）細胞内へのグルコース輸送に対する前記画分の影響を調べることによって行われる請求項１０１に記載の方法。
【請求項１】
スベリヒユ（Ｐｏｒｔｕｌａｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ Ｌ．）から高血糖防止作用物質を単離する方法であって、極性成分をスベリヒユから抽出し、それによりスベリヒユから高血糖防止作用物質を単離することを含む方法。
【請求項２】
前記抽出は、極性が増大する溶媒グラジエントを用いることによって行われる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抽出はエタノール−水抽出によって行われる請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記極性が増大する溶媒は、ヘキサン、酢酸エチル、ジクロロメタン、メタノールおよび水である請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記極性が増大する溶媒は、ヘキサン：ジクロロメタン：酢酸エチル（１：１：１）およびメタノール：エタノール：水（１：１：１）である請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記極性成分を前記抽出物から精製することをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記極性成分を前記抽出物から精製することは薄層クロマトグラフィーによって行なわれる請求項６に記載の方法。
【請求項８】
スベリヒユから高血糖防止作用物質を単離する方法であって、非極性成分をスベリヒユから抽出し、それによりスベリヒユから高血糖防止作用物質を精製することを含む方法。
【請求項９】
前記抽出は、非極性溶媒を使用して行われる請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記抽出はエタノール−水抽出によって行われる請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記非極性溶媒は、ヘキサン、ジクロロメタンおよび酢酸エチルからなる群から選択される請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記非極性成分を前記抽出物から精製することをさらに含む請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記非極性成分を前記抽出物から精製することは薄層クロマトグラフィーによって行われる請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
スベリヒユのエタノール−水抽出物を含む組成物。
【請求項１５】
前記エタノール−水の比は８０％−２０％である請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記スベリヒユのエタノール−水抽出物は、血中グルコースレベルを低下させることができる請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
前記スベリヒユのエタノール−水抽出物は、細胞内へのグルコース輸送を増加させかつ／または腸を介したグルコース吸収を減少させることができる請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
スベリヒユの極性画分抽出物を含む組成物。
【請求項１９】
前記極性抽出物は血液中のグルコースレベルを低下させることができる請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記極性抽出物は細胞内へのグルコース輸送を増加させることができる請求項１８に記載の組成物。
【請求項２１】
前記組成物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．０〜０．４５の範囲にＲｆ値を有する請求項１８に記載の組成物。
【請求項２２】
前記組成物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．０〜０．３２の範囲にＲｆ値を有する請求項１８に記載の組成物。
【請求項２３】
前記組成物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１７〜０．４１の範囲にＲｆ値を有する請求項１８に記載の組成物。
【請求項２４】
前記スベリヒユの極性画分抽出物は、メタノールを使用してソックスレー抽出によって抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．０、０．３１、０．３４、０．３６、０．３９および０．４５からなる群から選択されるＲｆ値を有する請求項１８に記載の組成物。
【請求項２５】
前記スベリヒユの極性画分抽出物は、水を使用してソックスレー抽出によって抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．０のＲｆ値を有する請求項１８に記載の組成物。
【請求項２６】
前記スベリヒユの極性画分抽出物は、メタノールを用いて抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．０、０．１５、０．３０および０．３２からなる群から選択されるＲｆ値を有する請求項１８に記載の組成物。
【請求項２７】
前記スベリヒユの極性画分抽出物は、メタノール：エタノール：水を１：１：１の比率で用いて抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１７、０．２７、０．３０、０．３４、０．３９および０．４１からなる群から選択されるＲｆ値を有する請求項１８に記載の組成物。
【請求項２８】
血中グルコースレベルを低下させるための、スベリヒユの極性抽出物を含む組成物の使用。
【請求項２９】
前記極性抽出物は細胞内へのグルコース輸送を増加させることができる請求項２８に記載の使用。
【請求項３０】
前記組成物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．０〜０．４５の範囲にＲｆ値を有する請求項２８に記載の使用。
【請求項３１】
前記組成物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．０〜０．３２の範囲にＲｆ値を有する請求項２８に記載の使用。
【請求項３２】
前記組成物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１７〜０．４１の範囲にＲｆ値を有する請求項２８に記載の使用。
【請求項３３】
前記スベリヒユの極性画分抽出物は、メタノールを使用してソックスレー抽出によって抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．０、０．３１、０．３４、０．３６、０．３９および０．４５からなる群から選択されるＲｆ値を有する請求項２８に記載の使用。。
【請求項３４】
前記スベリヒユの極性画分抽出物は、水を使用してソックスレー抽出によって抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．０のＲｆ値を有する請求項２８に記載の使用。。
【請求項３５】
前記スベリヒユの極性画分抽出物は、メタノールを用いて抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．０、０．１５、０．３０および０．３２からなる群から選択されるＲｆ値を有する請求項２８に記載の使用。
【請求項３６】
前記スベリヒユの極性画分抽出物は、メタノール：エタノール：水を１：１：１の比率で用いて抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１７、０．２７、０．３０、０．３４、０．３９および０．４１からなる群から選択されるＲｆ値を有する請求項１８に記載の使用。
【請求項３７】
スベリヒユの非極性画分抽出物を含む組成物。
【請求項３８】
前記スベリヒユの非極性画分抽出物はヒドロコロイドを含まない請求項３７に記載の組成物。
【請求項３９】
前記非極性抽出物は血中グルコースレベルを減少させることができる請求項３７に記載の組成物。
【請求項４０】
前記非極性抽出物は腸を介したグルコース吸収を減少させることができる請求項３７に記載の組成物。
【請求項４１】
前記組成物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１１〜０．８９の範囲にＲｆ値を有する請求項３７に記載の組成物。
【請求項４２】
前記組成物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１１〜０．８８の範囲にＲｆ値を有する請求項３７に記載の組成物。
【請求項４３】
前記組成物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１７〜０．９１の範囲にＲｆ値を有する請求項３７に記載の組成物。
【請求項４４】
前記スベリヒユの非極性画分抽出物は、ヘキサンを使用してソックスレー抽出によって抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．３６、０．４５、０．５２、０．７１および０．８８からなる群から選択されるＲｆ値を有する請求項３７に記載の組成物。
【請求項４５】
前記スベリヒユの非極性画分抽出物は、酢酸エチルを使用してソックスレー抽出によって抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１１、０．１８、０．３１、０．３６、０．４５、０．５２および０．７１からなる群から選択されるＲｆ値を有する請求項３７に記載の組成物。
【請求項４６】
前記スベリヒユの非極性画分抽出物は、ヘキサンを使用して抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．３、０．３２、０．４１、０．４７および０．８９からなる群から選択されるＲｆ値を有する請求項３７に記載の組成物。
【請求項４７】
前記スベリヒユの非極性画分抽出物は、酢酸エチルを使用して抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１５、０．３６、０．４７、０．７３および０．８９からなる群から選択されるＲｆ値を有する請求項３７に記載の組成物。
【請求項４８】
前記スベリヒユの非極性画分抽出物は、ヘキサン：ＤＣＭ：酢酸エチルを１：１：１の比率で用いて抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１７、０．３０、０．３６、０．４１、０．６８および０．９１からなる群から選択されるＲｆ値を有する請求項３７に記載の組成物。
【請求項４９】
血中グルコースレベルを低下させるための、スベリヒユの非極性抽出物を含む組成物の使用。
【請求項５０】
前記組成物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１１〜０．８９の範囲にＲｆ値を有する請求項４９に記載の使用。
【請求項５１】
前記組成物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１１〜０．８８の範囲にＲｆ値を有する請求項４９に記載の使用。
【請求項５２】
前記組成物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１７〜０．９１の範囲にＲｆ値を有する請求項４９に記載の使用。
【請求項５３】
前記スベリヒユの非極性画分抽出物は、ヘキサンを使用してソックスレー抽出によって抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．３６、０．４５、０．５２、０．７１および０．８８からなる群から選択されるＲｆ値を有する請求項４９に記載の使用。
【請求項５４】
前記スベリヒユの非極性画分抽出物は、酢酸エチルを使用してソックスレー抽出によって抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１１、０．１８、０．３１、０．３６、０．４５、０．５２および０．７１からなる群から選択されるＲｆ値を有する請求項４９に記載の使用。
【請求項５５】
前記スベリヒユの非極性画分抽出物は、ヘキサンを使用して抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．３、０．３２、０．４１、０．４７および０．８９からなる群から選択されるＲｆ値を有する請求項４９に記載の使用。
【請求項５６】
前記スベリヒユの非極性画分抽出物は、酢酸エチルを使用して抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１５、０．３６、０．４７、０．７３および０．８９からなる群から選択されるＲｆ値を有する請求項４９に記載の使用。
【請求項５７】
前記スベリヒユの非極性画分抽出物は、ヘキサン：ＤＣＭ：酢酸エチルを１：１：１の比率で用いて抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１７、０．３０、０．３６、０．４１、０．６８および０．９１からなる群から選択されるＲｆ値を有する請求項４９に記載の使用。
【請求項５８】
血中グルコースレベルを低下させるための、スベリヒユのエタノール−水抽出物を含む組成物の使用。
【請求項５９】
スベリヒユの極性画分抽出物を含む組成物の治療効果的な量と、医薬的に許容され得るキャリアまたは希釈剤とを含む、血中グルコースレベルを低下させるための医薬組成物。
【請求項６０】
前記極性画分抽出物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．０〜０．４５の範囲にＲｆ値を有する請求項５９に記載の医薬組成物。
【請求項６１】
前記極性画分抽出物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．０〜０．３２の範囲にＲｆ値を有する請求項５９に記載の医薬組成物。
【請求項６２】
前記極性画分抽出物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１７〜０．４１の範囲にＲｆ値を有する請求項５９に記載の医薬組成物。
【請求項６３】
前記スベリヒユの極性画分抽出物は、メタノールを使用してソックスレー抽出によって抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．０、０．３１、０．３４、０．３６、０．３９および０．４５からなる群から選択されるＲｆ値を有する請求項５９に記載の医薬組成物。
【請求項６４】
前記スベリヒユの極性画分抽出物は、水を使用してソックスレー抽出によって抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．０のＲｆ値を有する請求項５９に記載の医薬組成物。
【請求項６５】
前記スベリヒユの極性画分抽出物は、メタノールを用いて抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．０、０．１５、０．３０および０．３２からなる群から選択されるＲｆ値を有する請求項５９に記載の医薬組成物。
【請求項６６】
前記スベリヒユの極性画分抽出物は、メタノール：エタノール：水を１：１：１の比率で用いて抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１７、０．２７、０．３０、０．３４、０．３９および０．４１からなる群から選択されるＲｆ値を有する請求項５９に記載の医薬組成物。
【請求項６７】
スベリヒユの非極性画分抽出物を含む組成物の治療効果的な量と、医薬的に許容され得るキャリアまたは希釈剤とを含む、血中グルコースレベルを低下させるための医薬組成物。
【請求項６８】
前記スベリヒユの非極性画分抽出物はヒドロコロイドを含まない請求項６７に記載の医薬組成物。
【請求項６９】
前記非極性画分抽出物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１１〜０．８９の範囲にＲｆ値を有する請求項６７に記載の医薬組成物。
【請求項７０】
前記非極性画分抽出物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１１〜０．８８の範囲にＲｆ値を有する請求項６７に記載の医薬組成物。
【請求項７１】
前記非極性画分抽出物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１７〜０．９１の範囲にＲｆ値を有する請求項６７に記載の医薬組成物。
【請求項７２】
前記スベリヒユの非極性画分抽出物は、ヘキサンを使用してソックスレー抽出によって抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．３６、０．４５、０．５２、０．７１および０．８８からなる群から選択されるＲｆ値を有する請求項６７に記載の医薬組成物。
【請求項７３】
前記スベリヒユの非極性画分抽出物は、酢酸エチルを使用してソックスレー抽出によって抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１１、０．１８、０．３１、０．３６、０．４５、０．５２および０．７１からなる群から選択されるＲｆ値を有する請求項６７に記載の医薬組成物。
【請求項７４】
前記スベリヒユの非極性画分抽出物は、ヘキサンを使用して抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．３、０．３２、０．４１、０．４７および０．８９からなる群から選択されるＲｆ値を有する請求項６７に記載の医薬組成物。
【請求項７５】
前記スベリヒユの非極性画分抽出物は、酢酸エチルを使用して抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１５、０．３６、０．４７、０．７３および０．８９からなる群から選択されるＲｆ値を有する請求項６７に記載の医薬組成物。
【請求項７６】
前記スベリヒユの非極性画分抽出物は、ヘキサン：ＤＣＭ：酢酸エチルを１：１：１の比率で用いて抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１７、０．３０、０．３６、０．４１、０．６８および０．９１からなる群から選択されるＲｆ値を有する請求項６７に記載の医薬組成物。
【請求項７７】
スベリヒユのエタノール−水抽出物を含む組成物の治療効果的な量と、医薬的に許容され得るキャリアまたは希釈剤とを含む、血中グルコースレベルを低下させるための医薬組成物。
【請求項７８】
対象における高血糖関連疾患を処置する方法であって、スベリヒユのエタノール−水抽出物を含む組成物の治療効果的な量をその必要性のある対象に投与し、それにより対象における高血糖関連疾患を処置することを含む方法。
【請求項７９】
対象における高血糖関連疾患を処置する方法であって、スベリヒユの極性画分抽出物を含む組成物の治療効果的な量をその必要性のある対象に投与し、それにより対象における高血糖関連疾患を処置することを含む方法。
【請求項８０】
高血糖関連疾患は、糖尿病、クッシング病、クッシング症候群、摂食障害、損なわれたグルコース耐性、腎糸球体微小血管障害、びまん性糸球体硬化症、結節性糸球体硬化症、尿路感染症、急性腎盂腎炎、壊死性乳頭炎、気腫性腎盂腎炎、グリコーゲンネフローゼ（アルマンニ−エブシュタイン病変）、網膜症、非増殖性網膜症、毛細血管瘤、網膜浮腫滲出物、出血、増殖性網膜症、小血管の増殖、出血性線維症、網膜剥離、白内障、レンズの浸透圧変化による一過性の屈折異常、虹彩における血管の増殖による緑内障、網膜感染症、脳血管のアテローム硬化性疾患、神経障害、皮膚感染症、冠状動脈のアテローム性動脈硬化、心筋梗塞、末梢のアテローム性動脈硬化：四肢虚血、壊疽、増大した胎児死亡率、増大した感染感受性、および、遅れた創傷治癒からなる群から選択される請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記極性抽出物は血中グルコースレベルを減少させることができる請求項７９に記載の方法。
【請求項８２】
前記極性画分抽出物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．０〜０．４５の範囲にＲｆ値を有する請求項７９に記載の方法。
【請求項８３】
前記極性画分抽出物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．０〜０．３２の範囲にＲｆ値を有する請求項７９に記載の方法。
【請求項８４】
前記極性画分抽出物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１７〜０．４１の範囲にＲｆ値を有する請求項７９に記載の方法。
【請求項８５】
前記スベリヒユの極性画分抽出物は、メタノールを使用してソックスレー抽出によって抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．０、０．３１、０．３４、０．３６、０．３９および０．４５からなる群から選択されるＲｆ値を有する請求項７９に記載の方法。
【請求項８６】
前記スベリヒユの極性画分抽出物は、水を使用してソックスレー抽出によって抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．０のＲｆ値を有する請求項７９に記載の方法。
【請求項８７】
前記スベリヒユの極性画分抽出物は、メタノールを用いて抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．０、０．１５、０．３０および０．３２からなる群から選択されるＲｆ値を有する請求項７９に記載の方法。
【請求項８８】
前記スベリヒユの極性画分抽出物は、メタノール：エタノール：水を１：１：１の比率で用いて抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１７、０．２７、０．３０、０．３４、０．３９および０．４１からなる群から選択されるＲｆ値を有する請求項７９に記載の方法。
【請求項８９】
対象における高血糖関連疾患を処置する方法であって、スベリヒユの非極性画分抽出物を含む組成物の治療効果的な量をその必要性のある対象に投与し、それにより対象における高血糖関連疾患を処置することを含む方法。
【請求項９０】
前記スベリヒユの非極性画分抽出物はヒドロコロイドを含まない請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
高血糖関連疾患は、糖尿病、クッシング病、クッシング症候群、摂食障害、損なわれたグルコース耐性、腎糸球体微小血管障害、びまん性糸球体硬化症、結節性糸球体硬化症、尿路感染症、急性腎盂腎炎、壊死性乳頭炎、気腫性腎盂腎炎、グリコーゲンネフローゼ（アルマンニ−エブシュタイン病変）、網膜症、非増殖性網膜症、毛細血管瘤、網膜浮腫滲出物、出血、増殖性網膜症、小血管の増殖、出血性線維症、網膜剥離、白内障、レンズの浸透圧変化による一過性の屈折異常、虹彩における血管の増殖による緑内障、網膜感染症、脳血管のアテローム硬化性疾患、神経障害、皮膚感染症、冠状動脈のアテローム性動脈硬化、心筋梗塞、末梢のアテローム性動脈硬化：四肢虚血、壊疽、増大した胎児死亡率、増大した感染感受性、および、遅れた創傷治癒からなる群から選択される請求項８９に記載の方法。
【請求項９２】
前記非極性画分抽出物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１１〜０．８９の範囲にＲｆ値を有する請求項８９に記載の方法。
【請求項９３】
前記非極性画分抽出物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１１〜０．８８の範囲にＲｆ値を有する請求項８９に記載の方法。
【請求項９４】
前記非極性画分抽出物は、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１７〜０．９１の範囲にＲｆ値を有する請求項８９に記載の方法。
【請求項９５】
前記スベリヒユの非極性画分抽出物は、ヘキサンを使用してソックスレー抽出によって抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．３６、０．４５、０．５２、０．７１および０．８８からなる群から選択されるＲｆ値を有する請求項８９に記載の方法。
【請求項９６】
前記スベリヒユの非極性画分抽出物は、酢酸エチルを使用してソックスレー抽出によって抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１１、０．１８、０．３１、０．３６、０．４５、０．５２および０．７１からなる群から選択されるＲｆ値を有する請求項８９に記載の方法。
【請求項９７】
前記スベリヒユの非極性画分抽出物は、ヘキサンを用いて抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．３、０．３２、０．４１、０．４７および０．８９からなる群から選択されるＲｆ値を有する請求項８９に記載の方法。
【請求項９８】
前記スベリヒユの非極性画分抽出物は、酢酸エチルを用いて抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１５、０．３６、０．４７、０．７３および０．８９からなる群から選択されるＲｆ値を有する請求項８９に記載の方法。
【請求項９９】
前記スベリヒユの非極性画分抽出物は、ヘキサン：ＤＣＭ：酢酸エチルを１：１：１の割合で用いて抽出され、かつ、ジクロロメタン：ヘキサン：メタノールの１：１：０．２の割合での溶媒を使用してアルミニウム上でのシリカゲル６０Ｆ２５４での薄層クロマトグラフィー分画化に供されたとき、０．１７、０．３０、０．３６、０．４１、０．６８および０．９１からなる群から選択されるＲｆ値を有する請求項８９に記載の方法。
【請求項１００】
血液中のグルコースレベルを調節するための作用物質を特定する方法であって
（ａ）スベリヒユの抽出物を分画化し、それにより複数の画分を得ること；および
（ｂ）血液中のグルコースレベルを調節することができる少なくとも１つの画分を前記複数の画分から特定し、それにより血液中のグルコースレベルを調節するための作用物質を特定すること
を含む方法。
【請求項１０１】
前記分画化は、極性が増大する溶媒グラジエントを用いて行われる請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
工程（ｂ）は、（ｉ）腸を介したグルコース吸収および／または（ｉｉ）細胞内へのグルコース輸送に対する前記画分の影響を調べることによって行われる請求項１０１に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公表番号】特表２００７−５１５４７５（Ｐ２００７−５１５４７５Ａ）
【公表日】平成１９年６月１４日（２００７．６．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５４６４７３（Ｐ２００６−５４６４７３）
【出願日】平成１６年１２月２２日（２００４．１２．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＬ２００４／００１１５５
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０６０３４９
【国際公開日】平成１７年７月７日（２００５．７．７）
【出願人】（５０６２１５１５７）ディ−ハーブ リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年６月１４日（２００７．６．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１２月２２日（２００４．１２．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＬ２００４／００１１５５
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０６０３４９
【国際公開日】平成１７年７月７日（２００５．７．７）
【出願人】（５０６２１５１５７）ディ−ハーブ リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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