スーパーオキシドの分析方法およびスーパーオキシドの分析キット

【課題】バックグラウンドの低減化が可能であり、スーパーオキシドに対する特異性の高い、高感度なスーパーオキシドの分析方法を提供する。
【解決手段】化学発光法によりスーパーオキシドを分析する方法であって、ニトロキシルラジカルの存在下で、発光試薬としてウミホタルルシフェリン系化合物を用いるスーパーオキシドの分析方法である。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化学発光法によりスーパーオキシドを分析するスーパーオキシドの分析方法およびスーパーオキシドの分析キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
活性酸素と疾患との関わりが解明されつつある。活性酸素は、普通の酸素分子よりも活性化された状態の酸素分子とその関連物質を指し、スーパーオキシド（Ｏ^・−）、ヒドロキシルラジカル（ＨＯ^・）、過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）、一重項酸素（^１Ｏ_２）等が知られている。活性酸素の中でもスーパーオキシドはその中心的な役割を演じており、スーパーオキシドを測定することは基礎医学のみならず臨床医学においても非常に重要である。
【０００３】
生物系で生成するスーパーオキシドは微量であるため、高感度で分析できる分析方法が望まれる。スーパーオキシドの分析方法としては、例えば、ウミホタルルシフェリン類縁体を発光試薬として用いる化学発光法が知られている（例えば、特許文献１、非特許文献１参照）。
【０００４】
ウミホタルルシフェリン類縁体を発光試薬として用いる化学発光法は、スーパーオキシドを高感度で分析できるが、感度を上げるために発光試薬の濃度を高くする必要がある。しかし、発光試薬の濃度を高くすると、発光試薬が系内の溶存酸素によりわずかに発光することでバックグラウンドが生じるため、発光試薬の濃度を高くするのにも限界がある。また、ウミホタルルシフェリン類縁体は、スーパーオキシド以外にも一重項酸素とも反応して発光するため、スーパーオキシドを特異的に分析することができない。さらに、医学領域等で生物試料において生成するスーパーオキシドを分析するためには、さらなる高感度化が求められている。特許文献１では、感度を高めるために発光試薬であるウミホタルルシフェリン類縁体の構造を変えているものの、バックグラウンド等の問題は依然解決されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平５−０６０６９７号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】ＮａｋａｎｏＭ．ら、「ＣｅｌｌｕｌａｒａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＮｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」，１８，ｐｐ．５６５−５７９（１９９８）．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、バックグラウンドの低減化が可能であり、スーパーオキシドに対する特異性の高い、高感度なスーパーオキシドの分析方法およびスーパーオキシドの分析キットである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、化学発光法によりスーパーオキシドを分析する方法であって、ニトロキシル基を有するラジカル化合物（以下、総称して「ニトロキシルラジカル」と呼ぶことがある）の存在下で、発光試薬としてウミホタルルシフェリン系化合物を用いるスーパーオキシドの分析方法である。
【０００９】
また、本発明は、化学発光法によりスーパーオキシドを分析するための分析キットであって、ウミホタルルシフェリン系化合物と、ニトロキシルラジカルと、を含むスーパーオキシドの分析キットである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明では、ニトロキシルラジカルの存在下で、発光試薬としてウミホタルルシフェリン系化合物を用いることにより、バックグラウンドの低減化が可能であり、スーパーオキシドに対する特異性の高い、高感度なスーパーオキシドの分析方法およびスーパーオキシドの分析キットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の実施例において、スーパーオキシド発生源としてキサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）とヒポキサンチンを、発光試薬としてＭＣＬＡを用いた測定サンプル（１）（ニトロキシルラジカルあり（ＴＥＭＰＯＬ（＋）））および（３）（ニトロキシルラジカルなし（ＴＥＭＰＯＬ（−）））の発光測定における時間に対する発光強度を示すグラフである。
【図２】本発明の実施例において、スーパーオキシド発生源としてキサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）とヒポキサンチンを、発光試薬としてＣＬＡを用いた測定サンプル（２）（ニトロキシルラジカルあり（ＴＥＭＰＯＬ（＋）））および（４）（ニトロキシルラジカルなし（ＴＥＭＰＯＬ（−）））の発光測定における時間に対する発光強度を示すグラフである。
【図３】本発明の実施例において、スーパーオキシド発生源としてキサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）とヒポキサンチンを、発光試薬としてＭＣＬＡを用いた測定サンプル（１）（ニトロキシルラジカル：ＴＥＭＰＯＬ）、測定サンプル（５）（ニトロキシルラジカル：ＴＥＭＰＯ）、測定サンプル（６）（ニトロキシルラジカル：ＰＲＯＸＹＬ−ＣＯＯＨ）、測定サンプル（７）（ニトロキシルラジカル：ＰＲＯＸＹＬ−ＣＯＮＨ２）および測定サンプル（３）（ニトロキシルラジカルなし（（−）））の発光測定における時間に対する発光強度を示すグラフである。
【図４】本発明の実施例において、スーパーオキシド発生源としてキサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）とヒポキサンチンを、発光試薬としてＭＣＬＡを用いた測定サンプル（１）（消去剤なし）および（８）（消去剤あり：ＳＯＤ）の発光測定における時間に対する発光強度を示すグラフである。
【図５】本発明の実施例において、スーパーオキシド発生源としてキサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）とヒポキサンチンを用いた測定サンプル（９）（０．００４ｕＸＯＤ、０．２３μｍｏｌ／ＬＭＣＬＡ＋０．１ｍｍｏｌ／ＬＴＥＭＰＯＬ）の発光測定における時間に対する発光強度を示すグラフである。
【図６】本発明の実施例において、スーパーオキシド発生源としてキサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）とヒポキサンチンを用いた測定サンプル（１０）（０．００４ｕＸＯＤ、２．７４μｍｏｌ／ＬＭＣＬＡ（ＴＥＭＰＯＬなし））の発光測定における時間に対する発光強度を示すグラフである。
【図７】本発明の実施例において、スーパーオキシド発生源としてキサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）とヒポキサンチンを用いた測定サンプル（１１）（０．０００１２５ｕＸＯＤ、０．２３μｍｏｌ／ＬＭＣＬＡ＋０．１ｍｍｏｌ／ＬＴＥＭＰＯＬ）の発光測定における時間に対する発光強度を示すグラフである。
【図８】本発明の実施例において、スーパーオキシド発生源としてキサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）とヒポキサンチンを用いた測定サンプル（１２）（０．０００１２５ｕＸＯＤ、０．９１μｍｏｌ／ＬＭＣＬＡ（ＴＥＭＰＯＬなし））の発光測定における時間に対する発光強度を示すグラフである。
【図９】本発明の実施例において、スーパーオキシド発生源としてキサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）とヒポキサンチンを用いた測定サンプル（１３）（ＸＯＤ：０．００４ｕ）、測定サンプル（１４）（ＸＯＤ：０．００２ｕ）、測定サンプル（１５）（ＸＯＤ：０．００１ｕ）、測定サンプル（１６）（ＸＯＤ：０．０００５ｕ）、測定サンプル（１７）（ＸＯＤ：０．０００２５ｕ）、測定サンプル（１８）（ＸＯＤ：０．０００１２５ｕ）、測定サンプル（１９）（ＸＯＤ：０．００００６２５ｕ）、測定サンプル（２０）（ＸＯＤ：０．００００３４３ｕ）、測定サンプル（２１）（ＸＯＤ：０．００００１７１ｕ）の発光測定における時間に対する発光強度を示すグラフである。
【図１０】図９におけるＸＯＤの量に対する発光強度の関係を示すグラフである。
【図１１】本発明の実施例において、スーパーオキシドの代わりに過酸化水素を用いた測定サンプル（２２）（ニトロキシルラジカルあり（ＴＥＭＰＯＬ（＋）））および（２３）（ニトロキシルラジカルなし（ＴＥＭＰＯＬ（−）））の発光測定における時間に対する発光強度を示すグラフである。
【図１２】本発明の実施例において、スーパーオキシドの代わりに一重項酸素を用いた測定サンプル（２４）（ニトロキシルラジカルあり（ＴＥＭＰＯＬ（＋）））および（２５）（ニトロキシルラジカルなし（ＴＥＭＰＯＬ（−）））の発光測定における時間に対する発光強度を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の実施の形態について以下説明する。本実施形態は本発明を実施する一例であって、本発明は本実施形態に限定されるものではない。
【００１３】
＜スーパーオキシドの分析方法＞
本実施形態に係るスーパーオキシドの分析方法は、化学発光法によりスーパーオキシドを分析する方法であって、ニトロキシルラジカルの存在下で、発光試薬としてウミホタルルシフェリン系化合物を用いる。
【００１４】
例えば、分析対象試料と、発光試薬としてウミホタルルシフェリン系化合物と、ニトロキシルラジカルと、必要に応じてｐＨ調整剤と、必要に応じて溶媒とを混合して、測定サンプルを調製し、その測定サンプルについて、ウミホタルルシフェリン系化合物と分析対象試料中のスーパーオキシドとの反応による発光を、発光測定装置を用いて測定すればよい。発光測定装置によって発光強度等を測定することにより、スーパーオキシドを容易に定量化することができる。
【００１５】
測定系にニトロキシルラジカルを存在させることにより、ウミホタルルシフェリン系化合物とスーパーオキシドとの反応が促進されるため、低濃度の発光試薬で強い発光強度を得ることができる。これにより、発光測定におけるバックグラウンドを低減化することができる。また、ニトロキシルラジカルを系内に存在させると、ウミホタルルシフェリン系化合物と通常反応する一重項酸素に対して、発光の増強がほとんど見られないことから、相対的にスーパーオキシドに対する特異性が向上する。したがって、従来以上に微量のスーパーオキシドの測定を行うことができ、医学領域等への貢献が期待される。
【００１６】
ウミホタルルシフェリン系化合物としては、スーパーオキシドと反応して発光するイミダゾピラジノン化合物であればよく、特に制限はないが、例えば、下記構造式（１）で示されるイミダゾピラジノン化合物である。
【００１７】
【化１】

（構造式（１）において、Ｒ_１〜Ｒ_４は、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数２〜２０のアルケニル基、炭素数２〜２０のアルキニル基、炭素数６〜２０のアリール基、炭素数７〜２０のアラルキル基、インドリル基であり、それらは置換基を有していてもよい炭素数１〜２０のアルキル基；置換基を有していてもよい炭素数１〜２０のアルコキシ基；ヒドロキシ基；炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数１〜２０のアルコキシ基を有していてもよいフェニル基で置換されていてもよい。）
【００１８】
これらのうち、容易に入手可能である等の点で、Ｒ_１がメチル基、Ｒ_３がフェニル基である下記構造式（２）で示される２−メチル−６−フェニル−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン（ＣＬＡ）、Ｒ_１がメチル基、Ｒ_３が４−メトキシフェニル基である下記構造式（３）で示される２−メチル−６−（４−メトキシフェニル）−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン（ＭＣＬＡ）が好ましい。その他に、３，７−ジヒドロ−６−［４−［２−［Ｎ’−（５−フルオレセニル）チオウレイド］エトキシ］フェニル］−２−メチルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−
オン（ＦＣＬＡＦｒｅｅＡｃｉｄ）、［２−［４−［４−［３，７−ジヒドロ−２−メチル−３−オキソイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−６−イル］フェノキシ］ブチルアミド］エチルアミノ］スルホローダミン（Ｒｅｄ−ＣＬＡ）等が挙げられる。
【００１９】
【化２】

【００２０】
ニトロキシルラジカルとしては、ニトロキシル基（＞Ｎ−Ｏ・）を有する化合物であればよく、特に制限はないが、例えば、下記構造式（４）で示されるピペリジン−１−オキシル化合物、下記構造式（５）で示されるピロリジン−１−オキシル化合物、下記構造式（６）で示されるピロリン−１−オキシル化合物、下記構造式（７）で示されるオキサゾリジン−１−オキシル化合物等が挙げられる。
【００２１】
【化３】

（構造式（４）〜（７）において、Ｒ_５〜Ｒ_８は、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数２〜２０のアルケニル基、炭素数２〜２０のアルキニル基、炭素数７〜２０のアラルキル基、もしくはインドリル基であり、それらは炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数１〜２０のアルコキシ基、ヒドロキシ基、カルボキシル基、アミノ基等で置換されていてもよい。また、Ｒ_５とＲ_６、Ｒ_７とＲ_８はそれぞれで炭素数３〜８のスピロ環を形成していてもよく、それらは炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数１〜２０のアルコキシ基、ヒドロキシ基、カルボキシル基、アミノ基等で置換されていてもよい。ただし、スピロ環に酸素、イオウ、窒素などのヘテロ原子を含んでいてもよい。一方、Ｒ_９は、水素原子、ヒドロキシ基、カルボキシル基、カルバモイル基、アミノ基、シアノ基、アセトアミド基、２−クロロアセトアミド基、２−ヨードアセトアミド基、イソチオシアナト基、炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数１〜２０のアルコキシ基、オキソ基、炭素数１〜２０のアルキル基によるモノ置換あるいはジ置換アミノ基、独立して炭素数１〜２０のアルキル基を３つ有するアンモニウム基であり、これらアルキル基はヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基等を有していてもよい。）
【００２２】
これらのうち、入手がしやすく、水溶性で、発光増強効果が高いことから、Ｒ_５〜Ｒ_８がメチル基で、Ｒ_９が水素原子である上記構造式（４）で示される２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル（ＴＥＭＰＯ）、Ｒ_５〜Ｒ_８がメチル基で、Ｒ_９がヒドロキシ基である上記構造式（４）で示される４−ヒドロキシ−２，２，６，６，−テトラメチルピペリジン−１−オキシル（ＴＥＭＰＯＬ）、Ｒ_５〜Ｒ_８がメチル基で、Ｒ_９がカルボキシル基である上記構造式（５）で示される３−カルボキシ−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル（ＰＲＯＸＹＬ−ＣＯＯＨ）、Ｒ_５〜Ｒ_８がメチル基で、Ｒ_９がカルバモイル基である上記構造式（５）で示される３−カルバモイル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル（ＰＲＯＸＹＬ−ＣＯＮＨ２）が好ましい。
【００２３】
溶媒としては、例えば、水や、メタノール、エタノール等のアルコール系溶媒等が挙げられる。これらのうち、生体試料のスーパーオキシドを測定するときは水が好ましい。また、水としては、蒸留水、イオン交換水等の純水、超純水等が用いられるが、金属イオン等の妨害物質の影響を除くために超純水が好ましい。
【００２４】
測定を行う際のｐＨは、例えばｐＨ４．０〜１０．０の範囲であり、生体試料のスーパーオキシドを測定するときはｐＨ６．５〜７．５の範囲が好ましい。
【００２５】
ｐＨの調整は、緩衝溶液等のｐＨ調整剤を添加することにより行えばよい。緩衝溶液としては、例えば、トリスヒドロキシメチルアミノメタン緩衝液、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン緩衝液、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸緩衝液などのグッドの緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液、リン酸カリウム緩衝液、イミダゾール緩衝液、バルビタール緩衝液、炭酸水素ナトリウム緩衝液等が挙げられ、これらを単独または混合物として用いることができる。また、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム等の塩を存在させてもよいが、ナトリウム、カリウムは０〜１６０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、カルシウム、マグネシウムは０〜２ｍｍｏｌの範囲が好ましい。
【００２６】
測定温度は、例えば、１０〜４０℃の範囲であり、生体試料のスーパーオキシドを測定するときは３７℃付近が好ましい。
【００２７】
ウミホタルルシフェリン系化合物の使用濃度は、測定サンプルのスーパーオキシド発生量に関わらず、０．００１〜１．０μｍｏｌ／Ｌの範囲、好ましくは０．１〜０．２５μｍｏｌ／Ｌの範囲である。この範囲外の場合には、発光量が低下したり、バックグラウンドが増加する場合がある。
【００２８】
ニトロキシルラジカルの使用濃度は、測定サンプルのスーパーオキシド発生量に関わらず、５〜５００μｍｏl／Ｌの範囲、好ましくは５０〜２００μｍｏl／Ｌの範囲である。この範囲外の場合には、発光量が低下する場合がある。
【００２９】
発光測定装置としては、ウミホタルルシフェリン系化合物と分析対象試料中のスーパーオキシドとの反応による発光を測定することができるものであればよく、特に制限はない。例えば、ダイナミックレンジが広く、直線性の高いシングルフォトンカウント方式等の発光測定装置等が挙げられる。
【００３０】
本実施形態に係るスーパーオキシドの分析方法は、生体内、生物試料等で生成されるスーパーオキシドの定量分析、抗酸化物質および抗酸化物質を含有する食品、飲料、医薬品（医薬部外品を含む）等の抗酸化能の評価等に用いることができる。
【００３１】
例えば、好中球・マクロファージからのスーパーオキシド生成の測定等の臨床医学分野における診断法、血管壁や臓器組織（ＮＡＤＰＨ酸化酵素やキサチテンオキシダーゼ）からのスーパーオキシド生成の測定等の基礎医学における病態メカニズム解析法、スーパーオキシド消去活性を示す抗酸化剤、抗酸化食品等の評価法等として、本実施形態に係るスーパーオキシドの分析方法を用いることができる。
【００３２】
＜スーパーオキシドの分析キット＞
本発明の実施形態に係るスーパーオキシドの分析キットは、化学発光法によりスーパーオキシドを分析するための分析キットであって、ウミホタルルシフェリン系化合物と、ニトロキシルラジカルと、必要に応じてｐＨ調整剤と、必要に応じて溶媒とを含む。また、本実施形態に係るスーパーオキシドの分析キットは、ウミホタルルシフェリン系化合物と溶媒と必要に応じてｐＨ調整剤とを含むウミホタルルシフェリン系化合物含有溶液と、ニトロキシルラジカルと溶媒と必要に応じてｐＨ調整剤とを含むニトロキシルラジカル含有溶液とを含むものであってもよい。
【００３３】
ウミホタルルシフェリン系化合物、ニトロキシルラジカル、ｐＨ調整剤、溶媒については、上記の通りである。
【００３４】
最終の測定サンプルにおけるウミホタルルシフェリン系化合物の濃度、ニトロキシルラジカルの濃度、ｐＨが上記範囲となるように、キットのウミホタルルシフェリン系化合物含有溶液におけるウミホタルルシフェリン系化合物の濃度やｐＨ、ニトロキシルラジカル含有溶液におけるニトロキシルラジカルの濃度やｐＨ、および各溶液の分注量を決めることが好ましい。また、最終測定サンプルの量がなるべく少なくなるように、各溶液の濃度および分注量を決めることが好ましい。
【００３５】
キットにおける各溶液は、ガラス容器や、ポリエチレン、ポリプロピレン等の樹脂容器等に収容することができる。
【００３６】
また、本実施形態に係るスーパーオキシドの分析キットと、発光測定装置とを組み合わせたスーパーオキシド分析システムとして提供してもよい。
【実施例】
【００３７】
以下、実施例および比較例を挙げ、本発明をより具体的に詳細に説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
【００３８】
＜実施例および比較例＞
［ニトロキシルラジカルの存在による発光強度の増加の確認］
ウミホタルルシフェリン系化合物として２−メチル−６−（４−メトキシフェニル）−イミダゾピラジノン（ＭＣＬＡ）の１３μｍｏｌ／Ｌ水溶液を１０μＬと、ニトロキシルラジカルである４−ヒドロキシ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル（ＴＥＭＰＯＬ）の２．５ｍｍｏｌ／Ｌ水溶液を２５μＬと、ｐＨ調整剤として４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．４）を５００μＬと、スーパーオキシド生成系（４．０×１０^−６ｍｏｌ・Ｌ^−１・ｍｉｎ^−１）としてヒポキサンチンの２ｍｍｏｌ／Ｌ水溶液を２５μＬおよびキサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）の０．４ｕ／ｍＬ水溶液を１０μＬとを混合して、測定サンプル（１）を調製した（実施例）。また、ウミホタルルシフェリン系化合物として２−メチル−６−フェニル−イミダゾピラジノン（ＣＬＡ）を使用した以外は同様にして、測定サンプル（２）を調製した（実施例）。
【００３９】
ニトロキシルラジカルの代わりにＨＥＰＥＳ緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．４）を加えた以外は測定サンプル（１）、測定サンプル（２）と同様にして、測定サンプル（３）、測定サンプル（４）（以上、比較例）をそれぞれ調製した。
【００４０】
（測定）
測定サンプル（１）〜（４）について、発光測定装置としてアロカ（株）製ＡｃｃｕＦＬＥＸＬｕｍｉ４００型を用いて、３７℃で低速反転による撹拌を行いながら発光測定を行った。時間に対する発光強度を図１（ＭＣＬＡ：測定サンプル（１），（３））および図２（ＣＬＡ：測定サンプル（２），（４））に示す。
【００４１】
図１，２からわかるように、ＭＣＬＡ、ＣＬＡいずれのウミホタルルシフェリン系化合物でもニトロキシルラジカル（ＴＥＭＰＯＬ）の存在下で発光強度が増加した。
【００４２】
［各種ニトロキシルラジカルによる発光強度増強効果の確認］
ニトロキシルラジカルとして、２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル（ＴＥＭＰＯ）、３−カルボキシ−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル（ＰＲＯＸＹＬ−ＣＯＯＨ）、３−カルバモイル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル（ＰＲＯＸＹＬ−ＣＯＮＨ２）を用いた以外は、測定サンプル（１）と同様にして、測定サンプル（５）、測定サンプル（６）、測定サンプル（７）をそれぞれ調製した。
【００４３】
上記と同様にして、測定サンプル（１）、測定サンプル（５）、測定サンプル（６）、測定サンプル（７）および測定サンプル（３）について発光測定を行った。時間に対する発光強度を図３に示す。
【００４４】
図３からわかるように、いずれのニトロキシルラジカルについても、発光強度の増強効果が得られた。
【００４５】
［増強された発光におけるスーパーオキシドの関与の確認］
スーパーオキシドの特異的消去剤としてスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）の２．６ｕ／ｍＬ水溶液を５０μＬ添加した以外は、測定サンプル（１）と同様にして、測定サンプル（８）を調製した。
【００４６】
上記と同様にして、測定サンプル（１）および測定サンプル（８）について発光測定を行った。時間に対する発光強度を図４に示す。
【００４７】
図４からわかるように、増強された発光は、スーパーオキシドによるものであることが確認された。
【００４８】
［発光試薬濃度の影響の確認］
ニトロキシルラジカルによる効果と、単に発光試薬（ＭＣＬＡ）の濃度を増やしたときとの違いを、スーパーオキシド生成酵素キサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）の量を変えて比較した。ＭＣＬＡの１３μｍｏｌ／Ｌの水溶液を１０μＬ、ＴＥＭＰＯＬの２．５ｍｍｏｌ／Ｌの水溶液を２５μＬ、ヒポキサンチンの２ｍｍｏｌ／Ｌの水溶液を２５μＬ、ＨＥＰＥＳ緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．４）を５００μＬを混合して、測定サンプル（９）および測定サンプル（１１）を調製した。ＭＣＬＡの１３μｍｏｌ／Ｌの水溶液を１２０μＬ用い、ＨＥＰＥＳ緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．４）を４１５μＬにして、ＴＥＭＰＯＬを添加しない以外は、測定サンプル（９）と同様にして測定サンプル（１０）を調製した。ＭＣＬＡの１３μｍｏｌ／Ｌの水溶液を４０μＬ用い、ＨＥＰＥＳ緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．４）を４９５μＬにして、ＴＥＭＰＯＬを添加しない以外は、測定サンプル（９）と同様にして測定サンプル（１２）を調製した。
【００４９】
上記と同様にして、測定サンプル（９）、測定サンプル（１０）について、発光測定を行った。スーパーオキシド生成酵素としてキサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）の０．４ｕ／ｍＬ水溶液を１０μＬ、測定開始から１００ｓｅｃ後に系内に添加した（ＸＯＤ：０．００４ｕ、スーパーオキシド生成量４．０×１０^−６ｍｏｌ・Ｌ^−１・ｍｉｎ^−１）。また、測定サンプル（１１）、測定サンプル（１２）について、発光測定を行った。スーパーオキシド生成酵素としてキサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）の０．０１２５ｕ／ｍＬ水溶液を１０μＬ、測定開始から１００ｓｅｃ後に系内に添加した（ＸＯＤ：０．０００１２５ｕ、スーパーオキシド生成量１．２５×１０^−７ｍｏｌ・Ｌ^−１・ｍｉｎ^−１）。時間に対する発光強度を図５〜８に示す。
【００５０】
図６からわかるように、ニトロキシルラジカル（ＴＥＭＰＯＬ）なしでも発光試薬の濃度を高くすればある程度は発光強度が高くなるが、バックグラウンドも上がってしまう。これは、図８のようなスーパーオキシドの微量分析では検出を妨げることになる。図７からわかるように、ニトロキシルラジカルの存在により、発光試薬の濃度の低減化が可能であり、バックグラウンドを低く抑えることができる。
【００５１】
［直線性の確認］
発光強度のスーパーオキシド発生量依存性を検証した。スーパーオキシド生成酵素キサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）の量を変えて、測定サンプル（１３）〜（２１）を調製した。加えたキサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）の量は、０．００４ｕ、０．００２ｕ、０．００１ｕ、０．０００５ｕ、０．０００２５ｕ、０．０００１２５ｕ、０．００００６２５ｕ、０．００００３４３ｕ、０．００００１７１ｕとした。
【００５２】
上記と同様にして、測定サンプル（１３）〜（２１）について、発光測定を行った。時間に対する発光強度を図９に示す。ＸＯＤの量に対する発光強度を図１０に示す。
【００５３】
図１０からわかるように、スーパーオキシド発生量と発光強度との間に良好な直線性が見られた。
【００５４】
［スーパーオキシド特異性の確認］
発光試薬と過酸化水素、一重項酸素との反応に対するニトロキシルラジカル存在の影響を検証した。ＭＣＬＡの４０μｍｏｌ／Ｌの水溶液を１０μＬ、ＴＥＭＰＯＬの２．５ｍｍｏｌ／Ｌの水溶液を２５μＬ、過酸化水素水０．９５ｍｏｌ／Ｌを２０μＬ、ＨＥＰＥＳ緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．４）を５００μＬを混合して、測定サンプル（２２）を調製した。ＴＥＭＰＯＬを添加しない以外は測定サンプル（２２）と同様にして、測定サンプル（２３）を調製した。
【００５５】
また、ＭＣＬＡの４０μｍｏl／Ｌの水溶液を１０μＬ、ＴＥＭＰＯＬの２．５ｍｍｏｌ／Ｌの水溶液を２５μＬ、一重項酸素発生剤として３−（１，４−ジヒドロ−１，４−エピジオキシ−１−ナフチル）プロピオン酸の２．５ｍｍｏｌ／Ｌ水溶液を１００μＬ、ＨＥＰＥＳ緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．４）を５００μＬを混合して、測定サンプル（２４）を調製した。ＴＥＭＰＯＬを添加しない以外は測定サンプル（２４）と同様にして、測定サンプル（２５）を調製した。
【００５６】
上記と同様にして、測定サンプル（２２）〜（２５）について、発光測定を行った。時間に対する発光強度を図１１，１２に示す。
【００５７】
図１１からわかるように、過酸化水素とＭＣＬＡとの反応ではもともと発光強度が低く、ニトロキシルラジカルの影響はほとんどなかった。また、図１２からわかるように、一重項酸素とＭＣＬＡとは反応して発光するが、ニトロキシルラジカルの存在により、むしろ発光が抑えられた。ニトロキシルラジカルを系内に存在させると、ウミホタルルシフェリン系化合物と通常反応する一重項酸素に対して、発光の増強がほとんど見られないことから、相対的にスーパーオキシドに対する特異性が向上することがわかった。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学発光法によりスーパーオキシドを分析する方法であって、
ニトロキシルラジカルの存在下で、発光試薬としてウミホタルルシフェリン系化合物を用いることを特徴とするスーパーオキシドの分析方法。
【請求項２】
化学発光法によりスーパーオキシドを分析するための分析キットであって、
ウミホタルルシフェリン系化合物と、
ニトロキシルラジカルと、
を含むことを特徴とするスーパーオキシドの分析キット。

【図１】