セカンドメッセンジャーを光制御するためのセルライン、システム、および方法
光活性化型分子のための種々の方法、デバイス、および組成物が提供される。そのような方法の１つは、細胞中でセカンドメッセンジャーを生成するために実施される。キメラ光応答性膜タンパク質（例えばロドプシン）を発現するためのヌクレオチド配列を１または複数の異種受容体サブユニット｛例えばアドレナリン受容体（アルファ１、ベータ２）｝で改変する。光に応答してセカンドメッセンジャーを産生させるために光応答性膜タンパク質を細胞中で発現させる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連特許文献
本願は、「セカンドメッセンジャーを光制御するためのセルライン、システム、および方法」という名称の２００８年５月２９日付で提出された米国仮特許出願第６１／０５７，１０８号の米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく利益を主張する。この基礎となる仮出願は全体が参照により本明細書に取り込まれる。
【０００２】
電子的に提出された資料の参照による組込み
２００９年４月２９日に作成された「STFD195PCT_ST25.txt」というファイル名の、１２，３４２バイトのＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイルである、本明細書と同時に提出されたコンピューターで読取り可能なヌクレオチド配列／アミノ酸配列リストは全体が参照により取り込まれる。
【０００３】
本発明は、一般的に、光刺激に応答してセカンドメッセンジャーを生成するシステムおよび手法に関し、より具体的には、それぞれ光に応答したセカンドメッセンジャー産生に関する、セルライン、ヌクレオチド配列、キメラタンパク質、およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
グアニンヌクレオチド結合タンパク質（Ｇタンパク質）は、不活性のグアノシン二リン酸（ＧＤＰ）状態と活性のグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）結合状態の間を行ったり来たりすると考えられている。これら２つの状態は細胞内でのセカンドメッセンジャーの放出と関連付けられている。放出されたセカンドメッセンジャーは、下流の細胞プロセスを制御するよう機能することができる。
【０００５】
セカンドメッセンジャーには、速やかに生成／放出されるシグナル伝達分子が含まれる。これらの分子は細胞内のエフェクタータンパク質を活性化することで細胞応答を発生させる。細胞シグナル伝達系の例としては、ホスホイノシトール系、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）系、およびアラキドン酸系が含まれる。
【０００６】
Ｇタンパク質の前記異なる状態間の変化は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、Ｇタンパク質結合型受容体（ＧＰＬＲ）、７回膜貫通ドメイン受容体（７ＴＭ受容体）、またはヘプタヘリカル受容体と呼ばれるタンパク質により引き起こすことができる。このタンパク質ファミリーは、種々の膜貫通型受容体を含む。これらの受容体は、細胞内へのシグナル伝達経路を活性化するにより外部刺激（例えば、光、神経伝達物質、匂い、またはホルモン）に応答する。具体的には、リガンドが結合し、伝達経路を活性化し、それによってＧタンパク質をもう一方の状態に変化させる。ＧＰＣＲ関連活性は多くの疾患に関連するので、ＧＰＣＲは多くの医薬品および治療の標的である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
市場の全薬物の３０％超がＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）を標的としており、それらの薬物の多くがセカンドメッセンジャーｃＡＭＰの産生または阻害に関連すると考えられる。ｃＡＭＰが直接関わる病理学的プロセスは数多く、例えば神経生理学的疾患、内分泌学的疾患、心疾患、代謝疾患、および免疫疾患が含まれる。複雑な哺乳動物行動の研究では、技術的限界が、細胞内シグナル伝達プロセスの時空間的に正確な制御の妨げとなっていた。化学物質に基づいてｃＡＭＰレベル等のセカンドメッセンジャーレベルを調節する現在の方法は、比較的ゆっくりと機能し、神経組織や心臓組織等の特定の組織に関連して身体が用いる速いタイムスケールの活性を研究するには問題である。これらの化学的方法はしばしば、（例えば、新規治療薬のスクリーニング中における）こうした速いタイムスケールを探索するための速度を有しない。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、セカンドメッセンジャーの生成に関連した上記の課題等の克服ならびに関連するイメージングデバイスおよびその実施に関する。本発明は数多くの実施形態および応用により例示される。その一部を以下に要約する。
【０００９】
本発明の一実施形態によれば、細胞中でセカンドメッセンジャーを生成する方法が提供される。キメラ光応答性膜タンパク質（例えばロドプシン）を発現するためのヌクレオチド配列を、１または複数の異種受容体サブユニット｛例えばアドレナリン受容体（アルファ１、ベータ２）｝で改変する。光に応答してセカンドメッセンジャーを産生させるために、この光応答性膜タンパク質を細胞中で発現させる。
【００１０】
本発明の一実施形態によれば、細胞内メッセンジャーに関連する推定治療レジメン（例えば、薬物または電気刺激、またはこれらのセカンドメッセンジャーを介して作用する任意のもの）の有効性を評価する方法が実施される。キメラ光応答性膜タンパク質（ロドプシン）を発現するためのヌクレオチド配列を１または複数の異種受容体サブユニット｛例えばアドレナリン受容体（アルファ１、ベータ２）｝で改変する。光に応答してセカンドメッセンジャーを産生させるために、光応答性膜タンパク質を細胞中で発現させる。タンパク質を光にさらす。治療効果を評価する。
【００１１】
本発明の一実施形態は、１または複数の異種受容体サブユニット｛例えばアドレナリン受容体（アルファ１、ベータ２）｝を有するキメラ光応答性膜タンパク質（ロドプシン）を発現する細胞に関する。
【００１２】
本発明の一実施形態は、１または複数の異種受容体サブユニット｛例えばアドレナリン受容体（アルファ１、ベータ２）｝を有するキメラ光応答性膜タンパク質（ロドプシン）を発現するためのヌクレオチド配列に関する。
【００１３】
上記の本発明の概要は、説明される本発明の全ての実施形態または実施例を記載することを意図したものではない。添付の図面および以下の詳細な説明によりこれらの実施形態をより具体的に例示する。
【００１４】
本発明は、以下の本発明の種々の実施形態の詳細な説明を添付の図面と合わせて考慮することでより完全に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１Ａは、本発明の例示的実施形態による、ｏｐｔｏＧｓおよびｏｐｔｏＧｑを示す模式図である。 図１Ｂは、本発明の例示的実施形態による、トランスフェクトされていない細胞またはｏｐｔｏＧｓもしくはｏｐｔｏＧｑでトランスフェクトされた細胞のｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、およびＩＰ１の酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を示す。 図１Ｃは、本発明の例示的実施形態による、ｏｐｔｏＧｓおよびｏｐｔｏＧｑのｍＣｈｅｒｒｙ融合タンパク質でトランスフェクトされた細胞のＣａイメージングを示す。
【図２】本発明の例示的実施形態による、ｏｐｔｏＧｓおよびｏｐｔｏＧｑのｍＣｈｅｒｒｙ融合タンパク質でトランスフェクトされた細胞のＣａイメージングを示す。
【図３】図３Ａは、本発明の例示的実施形態による、種々のコンストラクトを発現するＨＥＫ細胞のｃＡＭＰ、ＩＰ１、およびＩＰ３レベルを示す。 図３Ｂは、本発明の例示的実施形態による、レンチウイルス発現ベクター、ｏｐｔｏ−α１ＡＲ発現細胞のＧＡＤ免疫染色、および１０分間の光刺激後にｏｐｔｏＸＲ発現細胞（ｍＣｈｅｒｒｙ＋）中で観察されたｐＣＲＥＢの活性化を示す。
【図４】図４Ａは、本発明の例示的実施形態による、記載されているコンストラクトのための、形質導入された側坐核のオプトロードターゲティング、スパイク波形、およびベースライン発火率を示す。 図４Ｂは、本発明の例示的実施形態による、光刺激によるインビボオプトロード記録を示す。 図４Ｃは、本発明の例示的実施形態による、光によるスパイク誘発頻度のベースラインに対する変化を示す。 図４Ｄは、本発明の例示的実施形態による、発火率変化カイネティクスを示す。
【図５】図５Ａは、本発明の例示的実施形態による、形質導入された領域の定位ターゲティング、光ファイバーが植え込まれた自由行動下のマウス、場所嗜好性装置の模式図、ならびに自由に探索しているマウスの試験および軌跡を示す。 図５Ｂは、本発明の例示的実施形態による、対照およびｏｐｔｏ−α１ＡＲの嗜好性を示す。 図５Ｃは、本発明の例示的実施形態による、種々のオープンフィールド試験における総距離の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明には種々の修正例および変更形態が可能であるが、その詳細は図面において例示により示され、以下に詳細に記載する。しかし、記載された特定の実施形態に本発明を限定することを意図するものではないことが理解されるべきである。逆に、本発明の精神および範囲内の全ての修正例、均等物、および代替例が含まれることが意図される。
【００１７】
本発明は、種々の光学的システムおよび方法の現実的な応用を可能にする上で有用であると考えられ、本発明は、細胞内セカンドメッセンジャーレベルの光制御を扱うシステムおよび方法における使用に特に適していることが見出された。本発明はそのような応用に必ずしも限定されないが、この文脈を用いた種々の例の説明により本発明の種々の態様が理解されよう。
【００１８】
本発明のある実施形態は、細胞内でセカンドメッセンジャーを放出させることにより光刺激に応答するキメラ膜タンパク質に関する。特定の例では、キメラタンパク質は異種受容体サブユニットと光に反応して光異性化によりコンホメーションを受けるタンパク質とを組み合わせたものであり、したがって、光によって活性化される。ロドプシンまたはレチニリデンタンパク質は、異種受容体サブユニットを含むように改変され得る光応答性タンパク質の例示的グループを与える。
【００１９】
本発明の一実施形態によれば、７回膜貫通αヘリックスドメインを含むと考えられるタンパク質が、セカンドメッセンジャーに関連する異種受容体サブユニットを含むように改変される。細胞膜中で発現されると、このタンパク質はコンホーマル変化をすることにより光に応答する。コンホーマル変化は、セカンドメッセンジャーの放出／産生の引き金となる。
【００２０】
本発明のある実施形態は、細胞内でセカンドメッセンジャーの放出を引き起こすことにより光刺激に応答するキメラ膜タンパク質、をコードするヌクレオチド配列に関する。
【００２１】
本発明のある実施形態は、異種性キメラ膜タンパク質を発現する細胞に関する。このキメラ膜タンパク質は、細胞内でセカンドメッセンジャーの放出を引き起こすことにより光刺激に応答する。特定の実施形態では、キメラ膜タンパク質の発現はインビボで起こる。別の実施形態では、キメラ膜タンパク質の発現はインビトロで起こる。
【００２２】
適切な受容体サブユニットを含むようにグアニンヌクレオチド結合タンパク質共役受容体タンパク質（ＧＰＣＲ）を改変することで任意の好適なセカンドメッセンジャーを産生するよう、本発明の実施形態を実施することができる。
【００２３】
本発明の実施形態においては、種々の波長および強度の光に応答するタンパク質を使用することができる。
【００２４】
本発明のある実施形態は、本明細書に開示するように、目的のセカンドメッセンジャー活性の任意の下流効果を決定するためのキメラＧＰＣＲタンパク質の使用に関する。
【００２５】
本発明の実施形態は、限定されるものではないが、哺乳動物細胞、幹細胞、植物細胞、および酵母、大腸菌等の単細胞生物を含む種々の細胞型中におけるキメラＧＰＣＲタンパク質の発現に関する。
【００２６】
本発明の特定の実施形態は、可視化を容易にするために蛍光タンパク質を連結したキメラタンパク質の最適化された発現、および光により誘導されるセカンドメッセンジャー活性の下流効果を研究するための様式の最適化された使用に関する。
【００２７】
本発明の一実施形態は、本明細書に開示するように、特定の細胞集団中で発現させるためにその細胞集団へとキメラＧＰＣＲタンパク質を遺伝的にターゲティングすることに関する。標的細胞型中で選択的に発現される細胞型特異的プロモーターが存在する（例えば、ニューロンターゲティング用のシナプシン１；心組織用のトロポニンバリアント）。発現ベクター中でこれらのプロモーターをキメラＧＰＣＲタンパク質の上流に配置することで、目的の細胞型にタンパク質の発現をターゲティングすることができる。これには、Ｔｅｔ反応、ＥＲ反応、およびＣｒｅ／Ｌｏｘシステム等の誘導可能、反転可能、またはその他の形で制御可能なプロモーターシステムが含まれる。
【００２８】
本発明の例示的一実施形態によれば、目的の細胞型中で発現されると光に応答して環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）が産生される、遺伝的にコード可能なタンパク質が開発される。これは、例えば、限定されるものではないが、医薬品のスクリーニング等の細胞生理に対する下流効果を可視化するのに有用であり得る。その他の実施形態では、光に応答してセカンドメッセンジャーを放出させる異種性キメラＧＰＣＲを用いる。例示的なセカンドメッセンジャーには、ｃＡＭＰ、環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）、イノシトール三リン酸／イノシトール１，４，５−三リン酸／トリホスホイノシトール（ＩＰ３）、およびアラキドン酸が含まれる。
【００２９】
本発明の一実施形態によれば、細胞内メッセンジャーに関連する推定治療レジメン（例えば、薬物または電気刺激、またはこれらのセカンドメッセンジャーを介して作用する任意のもの）の効力を評価する方法が実施される。キメラ光応答性膜タンパク質（例えばロドプシン）を発現するためのヌクレオチド配列を、１または複数の異種受容体サブユニット｛例えばアドレナリン受容体（アルファ１、ベータ２）｝で改変する。光に応答してセカンドメッセンジャーを産生させるために、光応答性膜タンパク質を細胞中で発現させる。このタンパク質を光にさらし、治療効果を評価する。
【００３０】
光は、所望の刺激特性に従って与えることができる。一実施形態では、発現された膜タンパク質は数十ミリ秒以内に光に応答する。したがって、刺激プロファイルは、速く連続している一連の光パルスを含んでもよく、得られる効果は、例えばＣａ２＋感受性色素を用いてモニターすることができる。
【００３１】
一例では、細胞は最初に治療なしで刺激され得る。治療が施された後、細胞は再度刺激され得る。各試験の結果を比較することで治療の有効性を評価することができる。
【００３２】
治療には、例えば、限定されるものではないが、医薬品、細胞の修飾（遺伝的修飾その他）、細胞の物理的パラメータ（例えば温度変化または電気刺激）、または生体に適用される治療レジメンなどの、広範な異なる形での実施が含まれる。
【００３３】
一実施形態では、治療は、発現された膜タンパク質の光刺激である。そのような例においては、有効性は、例えば、治療されるべき障害に関連する症状をモニターすることで測定することができる。
【００３４】
別の実施形態では、治療レジメンは疾患または障害のモデル化の一部として実施される。例えば、疾患モデル（細胞または動物）を用いることができ、タンパク質が発現される前にバックグラウンド／ベースライン状態を評価し、治療レジメンを評価することができる。
【００３５】
実験結果は、ｃＡＭＰ誘導因子およびｃＡＭＰ標的陽イオンチャネルの両方で細胞をトランスフェクトし、得られた活性をＣａ２＋感受性色素を用いて可視化することで、光で惹起されるｃＡＭＰによる標的イオンチャネルの制御を可視化できることを示している。この、セカンドメッセンジャー活性の、遺伝的にコード可能な光活性化型調節物質一式は、新規治療薬のスクリーニングに有用であり得、また、ＡＤＨＤや心臓のチャネル病等の多くの疾患状態にｃＡＭＰが関与するので、それ自体が治療法である。このタンパク質は、種々の他のセカンドメッセンジャー（例えばＩＰ３）と共に使用されるように設計されてもよく、レチナール結合部位を設計するか吸収／作用スペクトルの異なるキメラロドプシンまたは錐体オプシンをキメラに選択することで光活性化のためのその他の色と共に使用されるように設計されてもよく、また、カルシウムシグナル伝達および／またはキナーゼ活性等のセカンドメッセンジャーの他の下流効果と共に使用されるように設計されてもよい。
【００３６】
図１Ａ、１Ｂ、および１Ｃは、開発されたセカンドメッセンジャーシグナル伝達の光活性化型誘導因子（「ｏｐｔｏＸＲ」）の２つの例であるｏｐｔｏＧｓおよびｏｐｔｏＧｑから得られた実験データを示す。これらの光活性化型誘導因子はロドプシン／ＧＰＣＲキメラ体である。ｏｐｔｏＧｑは、Ｇｑシグナル伝達の光応答性制御を可能にし、ｏｐｔｏＧｓは、Ｇｓシグナル伝達の光応答性制御を可能にする。
【００３７】
ｏｐｔｏＧｓおよびｏｐｔｏＧｑのどちらにおいても、暗所におけるベースラインｃＡＭＰレベルおよびＩＰ３レベルには無視できる差しかなく、ｃＧＭＰ等の他のセカンドメッセンジャーの経路とのクロスオーバーはないことが示されている。ｏｐｔｏＧｑの光刺激で観察されたｃＡＭＰレベルの増加は、ＩＰ３産生の予想される下流効果である。
【００３８】
図１Ａは、本発明の例示的実施形態による、ｏｐｔｏＧｓおよびｏｐｔｏＧｑの模式図である。各タンパク質について、ロドプシンの細胞内ループが、通常Ｇｓ（ベータ２）またはＧｑ（アルファ１）と共役しているアドレナリン作動性タンパク質のもので置換される。この遺伝コード配列は、ヒトおよびマウスの細胞での発現用に最適化されている。得られる配列の例には、ｏｐｔｏＧｓ：配列番号１および配列番号２；ならびにｏｐｔｏＧｑ：配列番号３および配列番号４が含まれる。
【００３９】
当業者に理解されるように、これらのタンパク質のアミノ酸配列は、実施形態を支持する非限定的な例として提示するものであり、塩基配列以外の点では同様の結果、互換可能な結果、または同等な結果をもたらす遺伝配列のバリエーション（例えば点突然変異体）も含まれる。
【００４０】
図１Ｂは、本発明の例示的な実施形態による、トランスフェクトなしまたはｏｐｔｏＧｓもしくはｏｐｔｏＧｑでトランスフェクトされた細胞のｃＡＭＰ（上）、ｃＧＭＰ（中）、およびＩＰ１（下：ＩＰ３の分解産物）の酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を示す。図１Ｂの結果は、示されているように、５０４ｎｍ光（２０ｎｍバンド幅）で１ヶ所につき１分間刺激するか暗所に維持した細胞から得た。
【００４１】
刺激は、環境調節倒立培養顕微鏡（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；ライカ社製ＤＭＩ６０００Ｂ）を用いて行った。ｃＡＭＰアッセイでは、アッセイの飽和したポジティブコントロールとして、一部の細胞を１０μＭのフォルスコリンで３０分間処理した。ｏｐｔｏＧｓは、光に応答してｃＡＭＰレベルを有意に増加させた。ｃＡＭＰのベースラインの有意な増加やｏｐｔｏＧｓによるｃＧＭＰレベルもしくはＩＰ３レベルの逸脱は見られなかった。ＯｐｔｏＧｑは、光に応答して、ｃＧＭＰレベルは有意に変化させず、ＩＰ３レベルを有意に増加させた。ＩＰ３産生を伴うｃＡＭＰレベルの増加は、細胞内Ｃａ２＋放出の結果であると考えられる。
【００４２】
図１Ｃは、本発明の例示的実施形態による、ｏｐｔｏＧｓおよびｏｐｔｏＧｑのｍＣｈｅｒｒｙ融合タンパク質でトランスフェクトした細胞のＣａイメージングを示す。ｃＡＭＰを検出するために、環状ヌクレオチド依存性Ｃａ２＋チャネルＣＮＧＡ２のｃＡＭＰ選択的変異体をｏｐｔｏＧｓに対し過剰量トランスフェクトした。ＩＰ３は、細胞内Ｃａ２＋ストアの放出を活性化し、信頼性の高いＧｑ活性化シグナルを与える。対照集団も、ｍＣｈｅｒｒｙ単独及び過剰量の前記変異体ＣＮＧＡ２でトランスフェクトした。細胞にｆｕｒａ−２を負荷し（２０〜２５分間インキュベート）、２秒毎に３４０ｎｍおよび３８０ｎｍを２ｍｓ照射した。ｏｐｔｏＧｓおよびｏｐｔｏＧｑのそれぞれでは、Ｃａシグナルを生じさせるのにこの照射だけで十分であったが、対照集団では有意なシグナルは検出されなかった。
【００４３】
図１は特定の実験設定で得られたデータを示しているが、本発明はこれに限定されるものではない。例えば、トランスフェクション以外の種々の送達技術が想定され、該送達技術としては、ウイルス形質導入、弾道的遺伝子導入（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ；遺伝子銃）、および自発的な核酸の取込みが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００４４】
基となるロドプシンは、アルファ２−アドレナリン受容体もしくはドーパミンＤ２受容体もしくはセロトニン５ＨＴ２Ａ受容体等のＧｉ共役受容体、またはドーパミンＤ１Ａ受容体もしくは代謝型グルタミン酸受容体等のその他のＧｓまたはＧｑ共役受容体等の、任意の好適な異種受容体サブユニットと共に使用されるように改変することができる。
【００４５】
例示的な一実施形態によれば、基となるロドプシンはウシＢｏｓ ｔａｕｒｕｓに由来するタンパク質である。
【００４６】
一実施形態によれば、前述した基となるロドプシン以外の基となるタンパク質を用いることもでき、前述した基となるロドプシン以外の基となるタンパク質には、錐体オプシン（赤色、緑色、または青色）、他の種のロドプシン、およびドーパミン受容体またはセロトニン受容体等のリガンド依存性受容体等の種々の７回膜貫通型タンパク質が含まれる。
【００４７】
種々の実施の態様は、哺乳動物におけるインビボでの適用に関する。これらの実施の態様は、限定されるものではないが、神経回路および疾患モデルの試験および確認を含む。
【００４８】
図３Ａおよび３Ｂは、セカンドメッセンジャーシグナル伝達の光活性化型誘導因子の２つの例であるｏｐｔｏＧｓ（ｏｐｔｏ−β２ＡＲ）およびｏｐｔｏＧｑ（ｏｐｔｏ−α１ＡＲ）のインビボでの適用から得られた実験データを示す。本発明の態様は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）に共通する構造−機能関係に影響を与えることで、受容体によって開始される生化学的シグナル伝達経路を高い時空間精度で動員および制御する、遺伝的にコードされた光学的ツール（「ｏｐｔｏＸＲ」）の多様なファミリーの使用および開発に関する。
【００４９】
図３Ａおよび３Ｂに示す結果は、ターゲティングされた別個のシグナル伝達経路を光に応答して選択的に動員する２つの特定のｏｐｔｏＸＲに関するものである。これら２つのｏｐｔｏＸＲは、インビボで側坐核中のスパイク発火に反対の影響を与え、側坐核中での正確に時間制御されたｏｐｔｏＸＲの光刺激だけで、自由行動をしているマウスに条件付け場所嗜好性を誘導するのに十分であった。このｏｐｔｏＸＲを用いた手法は、行動している哺乳動物における生化学的シグナル伝達の因果的影響に関する仮説を、ターゲティング可能で時間的に正確な様式で試験することを可能にする。
【００５０】
ＧＰＣＲ間で共有されている構造−機能関係を用いて、シグナルをエフェクターに共役させる新規な伝達ロジックを有する複数の異なるオプシン／ＧＰＣＲ２キメラを開発し、インビボで発現させ、哺乳動物中で細胞内シグナル伝達の光制御を実施した。種々の実施の態様に従い、１または複数のキメラオプシン受容体タンパク質が、インビボにおいて哺乳動物内で機能的であり、特定の細胞にターゲティング可能であり、正確に時間制御された光パルスに応答性であるように設計される。そのような手法により、高速な光刺激（およびタンパク質応答）を用いて、正確に決められ且つ行動上適切であるタイミングで細胞内の生化学的事象について試験し特徴解析することが可能となる。いくつかの非限定的で例示的な実施の態様には、規定された細胞型における、ある範囲の時間スケールにわたる、拍動性対強直性の調節、異なる調節系間の同調性、ならびにその他の基本的な生理学的および病理学的プロセスが含まれる。
【００５１】
哺乳動物での実施は成功した。例示的な一実施例では、最初にＧｑ共役ヒトα１ａアドレナリン受容体（α１ＡＲ）およびＧｓ共役ハムスターβ２アドレナリン受容体（β２ＡＲ）の保存された残基をＧｔ共役ウシロドプシンと整列させることで、ロドプシンの細胞内ループを特定のアドレナリン受容体の細胞内ループで置換した（図１Ａ）。構造モデルに基づいて、Ｇタンパク質との共役をＧｔから移すように細胞内領域の交換（カルボキシ末端ドメインを含む）を各受容体について設計し、各受容体を哺乳動物中でのインビボ発現用に最適化した。種々のリガンドにより活性化すると、天然の受容体は複数の集合（ｅｎｓｅｍｂｌｅ）状態を取ることができ、リガンドバイアスシグナル伝達現象においてカノニカル経路および非カノニカル経路を動員する。ｏｐｔｏＸＲは光を感知すると、生物学的環境に応じた様式で、１つの活性集合的状態を選択する可能性が高い。
【００５２】
キメラ（ｏｐｔｏ−α１ＡＲおよびｏｐｔｏβ２ＡＲ）をコードする遺伝子を蛍光タンパク質に融合させた。機能的ｏｐｔｏＸＲ発現の検証は、ｏｐｔｏ−α１ＡＲ単独（Ｇｑを介して［Ｃａ２＋］ｉを動員すると予想される）、またはｏｐｔｏ−β２ＡＲ（Ｇｓを介して環状ＡＭＰを動員すると予想される）とｃＡＭＰ依存性Ｃａ２＋チャネルＣＮＧＡ２−Ｃ４６０Ｗ／Ｅ５８３Ｍの両方でトランスフェクトしたＨＥＫ細胞中における［Ｃａ２＋］ｉ（細胞内カルシウム濃度）のイメージングにより達成された。［Ｃａ２＋］ｉのレシオメトリックイメージングにより、６０ｓの緑色光刺激（５０４±６ｎｍ、７ｍＷｍｍ−２）はいずれのｏｐｔｏＸＲの下流でも顕著な［Ｃａ２＋］ｉシグナルを誘導するのに十分であるが、対照条件では誘導しないことが示され（図２）、機能的に発現していることが明らかになった。各ｏｐｔｏＸＲに制御されるシグナル伝達の特異性を試験するために、形質導入されたＨＥＫ細胞に３ｍＷｍｍ−２、５０４±６ｎｍの光を６０ｓ照射し、その後、細胞を溶解し、イムノアッセイによりｃＧＭＰ、ｃＡＭＰ、およびＩＰ１（ＩＰ３の分解産物）のレベルを解析した。カノニカルパターンはｏｐｔｏ−β２ＡＲでその分子的デザインに対応して予想されるとおりといえた。何故なら、光刺激によりｏｐｔｏ−β２ＡＲ発現細胞中でｃＡＭＰが有意に産生され（図３Ａ、上）、これは野生型β２ＡＲの薬物刺激で得られるものに匹敵するとともに、ＩＰ３（図３Ａ、中段）、［Ｃａ２＋］ｉ（図２）や暗所での実質的な活性を動員しなかったからである。一方、光刺激は、ｏｐｔｏ−α１ＡＲ発現細胞でＩＰ３シグナル伝達の有意なアップレギュレーションを生じさせ（図３Ａ、中段）、これは野生型α１ＡＲの薬物刺激により誘導されるレベルに匹敵するものであった。［Ｃａ２＋］ｉの上昇（図２）と共に、これらのデータは、Ｇｑの動員について予想されるパターンを示しており、このパターンはｏｐｔｏ−β２ＡＲ発現細胞中では見られない（図３Ａ、上）。いずれのコンストラクトを発現している細胞の光刺激も、ｃＧＭＰレベルを調節することができず（図３Ａ、下）、このことは更に、キメラタンパク質のシグナル伝達特異性を示している。同様なアッセイから、ｏｐｔｏＸＲが、天然ロドプシンの作用スペクトルに近い作用スペクトルを維持しており、生物学的に好適な光束の範囲に渡りシグナルを統合することができ、ｐ４２／ｐ４４−ＭＡＰＫシグナル伝達に関して野生型受容体と同様の程度に非カノニカル経路を活性化できることが示された。
【００５３】
レチナール補因子の補充が必要かどうかも含め、インタクトな神経組織中におけるｏｐｔｏＸＲの能力を調べた。そのような試験の１つでは、（生化学的調節の標的をグリアおよび内皮細胞を初めとする他の潜在的Ｇｓ／Ｇｑ応答性細胞組織要素ではなく局所ニューロンにするため）シナプシンＩプロモーターの制御下にあるｏｐｔｏＸＲ融合遺伝子を有するレンチウイルスベクター（図３Ｂ、左上）を成獣マウスの側坐核中に定位的に注入した。この戦略により、側坐核中に細胞体樹状突起区画を有するニューロン（約９５％がＧＡＢＡ作動性中型有棘ニューロンであり、更なるサブタイプ特異性を有しない；図３Ｂ、左）が生化学的調節の標的とされ、またこれらのレンチウイルスは軸索を介して細胞に形質導入することはないため、通過繊維（ｆｉｂｅｒｓ ｏｆ ｐａｓｓａｇｅ）または求心性シナプス前終末は除外される。形質導入の２週間後、人工脳脊髄液中で側坐核の急性冠状スライスを調製し、１０分間光刺激し、すぐに固定しｃＡＭＰおよびＣａ２＋共役シグナル伝達カスケードの両方の生化学的統合因子（ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ）であるＳｅｒ１３３−リン酸化ＣＲＥＢ（ｐＣＲＥＢ）を染色した。外因性のレチノイドを補充しなくても、ｏｐｔｏＸＲ発現集団において有意に上昇したｐＣＲＥＢが観察されたが（図３Ｂ、右）、非照射組織では観察されなかった。
【００５４】
形質導入した側坐核にターゲティングされたオプトロードを用いて、マルチユニットインビボニューロン発火を記録することで、側坐核の居所的電気活性に対するｏｐｔｏＸＲ活性化の機能面での影響を決定した（図４Ａ）。どちらのコンストラクトにおいても暗所ではベースライン発火率に有意な差は見られなかった（図４Ａ、右下）。光刺激は、ｏｐｔｏ−β２ＡＲ発現側坐核においてネットワーク発火を減少させた（図４Ｂの左のトレースは影響のカイネティクスを示す。概要データが図４Ｃおよび図４Ｄにそれぞれ示される）。これは、Ｇｓを標的にした過去の薬理学的実験と一致していた。光刺激は、ｏｐｔｏ−α１ＡＲ発現側坐核（図４Ｂ、右；図４Ｃ、４Ｄ）において発火を増加させた。スパイク頻度のヒストグラムから、発火率へのｏｐｔｏＸＲの影響のカイネティクスは、シグナルの電気的開始よりも生化学的開始の方に一致することが示された（図４Ｄ）。これらの電気生理学的データと前出の生化学的検証とを組み合わせれば、細胞内カスケードの差動的光活性化型制御を可能にし且つネットワークの生理を調節するようにｏｐｔｏＸＲをインビボで機能的に発現させることができることが支持される。
【００５５】
一実施例では、光遺伝学を用いて、正確にタイミングを制御されたｏｐｔｏＸＲ刺激が自由行動中のマウスの行動を調節する能力を評価した。オペラント行動に用いられる時間的に正確な様式で側坐核ニューロン内の細胞内シグナル伝達を光制御するため、携帯型ソリッドステート光送達をｏｐｔｏＸＲのトランスジェニック発現と組み合わせた（図５Ａ）。共焦点分析により、発現が局所的な側坐核ニューロンに限定されていることが示され、特に、求心性繊維、側坐核に突き出た遠位領域、グリア、または周辺領域中で標識は全く観察されなかった。３日間のオペラント条件付け場所嗜好性アッセイの一部として、形質導入した側坐核に光刺激をターゲティングした（図５Ａ）。試験中毎日、動物に自由に場所嗜好性装置を探索させた（図５Ａ、下）。１日目は、動物は光刺激を受けずに自由に装置内を探索した。２日目に、指定した条件付けされた部屋に動物が自由に進入する毎に、形質導入した領域に位置を合わせたレーザーダイオード接続光ファイバーで光パルスを１０Ｈｚで送達して、強力な報酬の間のモノアミン作動性入力の適切な強度を模倣した。経路のトレースから、柔軟な光ファイバーを用いた手法により、全ての部屋を完全且つ妨害のなしに探索できることが示された（図５Ａ、下）。３日目に、動物は再度、光刺激を受けずに自由に装置内を探索し、条件付けた部屋で過ごした時間が２人の別の盲検評価者により定量された。特に、ｏｐｔｏ−α１ＡＲを発現している動物は、光刺激後に、装置の条件付けされた側への嗜好性が大きく上昇したことが示された（図５Ｂ）。この時間的に正確な生化学的調節の影響は、ｏｐｔｏ−α１ＡＲ動物の別個の２つのコホートで再現可能であった（ｎ＝５〜６、Ｐ＜０．０５、条件付けされた部屋中での時間の各コホートについてのスチューデントのｔ検定；全集団では、ｎ＝１１、Ｐ＜０．０１）。一方、その他のオプシン遺伝子ｏｐｔｏ−β２ＡＲおよびＣｈＲ２は、嗜好性の誘導についてさほど効果的ではないようであった。側坐核ニューロン中のｏｐｔｏ−α１ＡＲ刺激の影響は報酬関連行動に特異的であり、オープンフィールド試験で同じ動物のコホートに送達された同じ光刺激が移動距離または壁の近接に対する嗜好性には有意な影響を与えなかった（図５Ｃ）ことから、不安関連行動または自発運動活性の直接的調節にまでは及ばなかった。
【００５６】
上記実験に従った具体的かつ非限定的な実施例をここで記載する。記録電極（１ＭＶタングステン、Ａ−Ｍシステムズ社製）に接続した直径２００ｍｍのマルチモード光ファイバー（ソーラボ社製）からなり電極/ファイバーの先端間の距離が２００〜４００ｍｍであるオプトロードを、定位フレーム（デビッド・コフ社（Ｄａｖｉｄ Ｋｏｐｆ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）製）に固定されイソフルランで麻酔したマウスの形質導入された側坐核中に下ろして用い（電極の先端はブレグマの下４．８〜５．２ｍｍ）、インビボ記録および解析を行った。４７３ｎｍダイオードレーザー（クリスタレーザー社製）の光をファイバーを介して送達した。電気シグナルをバンドパスフィルターに通し、増幅し（０．３〜１ｋＨｚ、１８００ Ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｄｅ ＡＣ Ａｍｐｌｉｆｉｅｒ、Ａ−Ｍシステムズ社製）、ｐＣｌａｍｐ１０．０（モレキュラーデバイス社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）製）を用いて解析した。閾値によりスパイクを検出し、個々に点検して確認した。
【００５７】
光ファイバー（直径２００ｍｍ、ソーラボ社製）を４７３ｎｍの青色ダイオードレーザー（クリスタレーザー社製）に接続し、側坐核（先端から０〜１００ｍｍ）をターゲティングするカニューラに合わせ、この光ファイバーを介して光刺激を与え、行動分析を行った。ファンクションジェネレータ（Ａｇｉｌｅｎｔ ３３２２０Ａ）を用いてｏｐｔｏＸＲ用に５０ｍｓパルス幅の光を送達した。場所嗜好性は、自由に探索できるように部屋の間の壁を除去した標準装置（ＳＤインスツルメンツ社製）中で実施した。各部屋で過ごした時間量について、ＭＡＴＬＡＢ（マス・ワークス社（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ）社製）で特注の集計スクリプトを実行して、２人の独立した盲検評価者がビデオからデータを解析した。オープンフィールド試験では、４０３４０ｃｍの正方形のオープンフィールド中に動物を置き、場所嗜好性実験と同じパラメータを用いて光刺激を送達した。自動化されたソフトウェア（Ｖｉｅｗｐｏｉｎｔ）を用いて、その外側の環（フィールドの残りの部分）に対する、中央の１５３１５平方ｃｍでの合計時間および距離についてビデオを解析した。
【００５８】
表示されている場合、統計解析は、両側検定によるスチューデントのｔ検定（マイクロソフトエクセルで計算）または一元配置の分散分析とチューキーの事後検定（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）を用いて行った。まとめた棒グラフは全て、平均値±ｓ．ｅ．ｍで表し、有意性は以下のように表した：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【００５９】
本発明の種々の実施形態の驚くべき結果および有効性を支持する更なる詳細は、参照により全体を本明細書に援用するTemporally precise in vivo control of intracellular signalling, Raag D. Airan, et al., Nature 458, 1025-1029 (23 April 2009)中に見出すことができる。
【００６０】
以下の記載は、本発明の実施形態による具体的且つ非限定的な方法の詳細を提供する。この方法の多くのバリエーションが想定され、本発明の範囲内に含まれる。
【００６１】
ベクター構築
ｏｐｔｏ−α１ＡＲおよびｏｐｔｏ−β２ＡＲの哺乳動物コドン最適化配列（図１Ａ中のアミノ酸配列）を合成し、ｐｃＤＮＡ３．１にクローニングし、ＮｏｔＩ部位を用いてｍＣｈｅｒｒｙまたはＹＦＰ（スタートコドンを除去）のＮ末端に融合させた。ｏｐｔｏＸＲとｍＣｈｅｒｒｙ／ＹＦＰのリンカーは５’ＧＣＧＧＣＣＧＣＣ３’である。ｐＬｅｎｔｉ ＳｙｎａｐｓｉｎＩ ｈＣｈＲ２ ｍＣｈｅｒｒｙ ＷＰＲＥベクターのＡｇｅＩおよびＥｃｏＲＩ部位に各ｏｐｔｏＸＲ ｍＣｈｅｒｒｙの導入遺伝子をクローニングすることで、ＳｙｎａｐｓｉｎＩ ｏｐｔｏＸＲ ｍＣｈｅｒｒｙを含むレンチウイルスベクターを構築した。
【００６２】
レンチウイルスの作製
高タイターレンチウイルスを作製した。簡潔に述べると、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで培養されている４層のセルファクトリー（Ｎｕｎｃ社製）中に９０％のコンフルエンスでＨＥＫ２９３ＦＴ細胞をプレーティングした。６９０μｇの前述したレンチウイルスベクターおよび２種類のヘルパープラスミド（６９０μｇのｐΔＣＭＶＲ８．７４および４６０μｇのｐＭＤ２．Ｇ）で細胞をコトランスフェクトした。トランスフェクションの１５時間後に培地を交換した。トランスフェクションの２４時間後に、５ｍＭの酪酸ナトリウムを含む無血清ＵｌｔｒａＣＵＬＴＵＲＥ（キャンブレックス社（Ｃａｍｂｒｅｘ）製）２００〜２２０ｍＬで培地を交換した。トランスフェクション４０時間後、今やウイルスを含む培養液上清を１０００ｒｐｍで５分間スピンして細胞残渣を除去した後、０．４５μｍの低タンパク質結合フィルターフラスコを用いて濾過した。次いで、この清澄な上清を、ＳＷ２８ローター（ベックマン社製）を用いて５５，０００ｇで２時間超遠心し、ウイルスを沈殿させた。遠心分離後、上清を捨て、得られたウイルスペレットを合計１００μＬの冷（４℃）ＰＢＳに溶解した。再懸濁したウイルスを７０００ｒｐｍで５分間遠心分離して残りの細胞残渣およびウイルス残渣を除去した。アリコートを再使用時まで−８０℃で凍結した。
【００６３】
動物の外科手術および行動
スタンフォード大学の実験室用脊椎動物プロトコールに従い、１０〜１２週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６マウスを収容し、取り扱った。ウイルス溶液を以下のように右側坐核に導入した。動物をイソフルランで麻酔し、頭頂部の毛を刈り取った。イソフルラン麻酔下にいる間に動物の頭を定位フレーム（デビッド・コフ社）に固定した。頭皮を正中切開し、ブレグマの前側１．１０ｍｍ、側方１．４５ｍｍに直径約１ｍｍの開頭切開部を穿孔した。次いで、ウイルスを予め充填した３３ゲージのベベル針（ＮａｎｏＦｉｌ、ワールド・プレシジョン・インスツルメンツ社（Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）製）を側坐核中に下ろし（針の先端がブレグマの腹側４．７０〜４．８０ｍｍ）、自動シリンジポンプ（ＮａｎｏＦｉｌ、ワールド・プレシジョン・インスツルメンツ社製）を用いて１．０μＬのウイルスを１００ｎＬ／分で注入した。注入後、３〜５分間組織を弛緩させて流体を拡散させた後、針を引き抜いた。急性スライスまたはインビボ記録実験用の動物では、開頭部にデンタルセメント（ラングデンタル社（Ｌａｎｇ Ｄｅｎｔａｌ）製）を充填し、ＶｅｔＢｏｎｄ（３Ｍ社製）を用いて切開部を閉じた。行動分析用の動物では、カニューレ（Ｃ３１６Ｇ、ペデスタルの４．５ｍｍ下で切断；プラスチクスワン社（Ｐｌａｓｔｉｃｓ・Ｏｎｅ）製）をペデスタルが頭蓋に面一になるよう配置した。Ｍｅｔａｂｏｎｄ（パーケル社（Ｐａｒｋｅｌｌ）製）およびデンタルセメント（ラングデンタル社製）を用いてカニューレを固定した。ＶｅｔＢｏｎｄまたはセメントの乾燥後、動物をフレームから外し、その後の操作の前に少なくとも１週間回復させた。行動実験の対照動物にも実験動物と同じ操作（外科手術、カニューレの植込み、光刺激）を行い、ウイルスの代わりに溶媒（ＰＢＳ）のみを注入した。場所嗜好性実験には、部屋のどちらかの側（＞７０％または＜１０％）または中央の部屋（＞４０％）に対するベースライン嗜好性を示さなかった動物を実験に用いた。全動物の９０％超が、バイアスがかけられていないバランスのとれた場所嗜好性デザインのためのこれらの基準を満たした。
【００６４】
急性スライスの調製
動物をイソフルランで麻酔し、外科手術用のハサミ（ファイン・サイエンス・ツールズ社（Ｆｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｏｏｌｓ）製）を用いて断頭した。側坐核を含む２７５μｍ厚の冠状スライスを切り出し、６４ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＫＣｌ、１．２５ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、２５ｍＭのＮａＨＣＯ３、１０ｍＭのグルコース、１２０ｍＭのスクロース、０．５ｍＭのＣａＣｌ２、および７ｍＭのＭｇＣｌ２を含む切断溶液（９５％Ｏ２／５％ＣＯ２で平衡化）中に保存した。スライス後、スライスを切断溶液中にて３２〜３５℃で３０分間インキュベートし、その後実験まで室温でインキュベートした。エクスビボでのｏｐｔｏＸＲ刺激では、スライスを正立顕微鏡（ＢＸ５１Ｗ、オリンパス社製）のステージに乗せ、１２４ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＫＣｌ、１．２５ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、２６ｍＭのＮａＨＣＯ３、１０ｍＭのグルコース、２．４ｍＭのＣａＣｌ２、および１．３ｍＭのＭｇＣｌ２を含む人工脳脊髄液（９５％Ｏ２／５％ＣＯ２で平衡化）で灌流した。３００ＷのＬａｍｂｄａ ＤＧ−４（サッター社（Ｓｕｔｔｅｒ）製）の光を４７３ｎｍ±２０ｎｍのバンドパスフィルター（セムロック社（Ｓｅｍｒｏｃｋ）製）に通し、４倍の対物レンズ（０．２８ＮＡ）を用いて１０分間スライスに当て、その後すぐに、後の解析のために固定した。
【００６５】
シグナル伝達検証アッセイ
リポフェクタミン２０００（インビトロジェン社製）を用いて２４ウェルプレート中でＨＥＫ２９３ＦＴ細胞（インビトロジェン社製）をトランスフェクトし、トランスフェクションの４〜６時間後に無血清培地に交換した。Ｃａ２＋イメージングには、マトリゲルでコートされたカバーガラス上にプレーティングされた細胞に、１μＭのＡＴＲを含むタイロード中、５μｇ／ｍｌのｆｕｒａ−２ ＡＭを含むＦ−１２７プルロニック／ＤＭＳＯ（プローブ社（Ｐｒｏｂｅｓ）製）を３７℃、５％大気ＣＯ２にて２０〜２５分間負荷した。負荷後、３００ＷのＬａｍｂｄａ ＤＧ−４（サッター社製）を制御するＭｅｔａｆｌｕｏｒ（アクソン・インスツルメンツ社（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）製）を用いて、オリンパス社製ＢＸ５１Ｗ上で３４０ｎｍ／３８０ｎｍでカバーガラスをイメージ化した。イムノアッセイでは、トランスフェクションの１８〜２４時間後に、１μＭのＡＴＲおよび５０ｍＭのＬｉＣｌ（ＩＰ１の分解を防ぐため）を添加し、プレートを環境調節された顕微鏡（ライカ社製ＤＭＩ６０００；３７℃、５％大気ＣＯ２）に移した。５領域／ウェルをそれぞれ１分間光刺激した（サッター社製３００ＷのＬａｍｂｄａ ＤＧ−４；セムロック社製５０４／１２ｎｍバンドパスフィルター；１０×０．３０ＮＡ対物レンズ）；３ウェル／条件。インキュベート後（ｃＡＭＰ／ｃＧＭＰ：２０分間；ＩＰ１：１時間）、細胞を溶解し、ＨＴＲＦ（シスバイオ社（ＣｉｓＢｉｏ）製）およびＢｉｏｔｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ４リーダーで解析した。
【００６６】
免疫組織化学および共焦点分析
インビボ刺激後、刺激終了９０分後に、氷冷した４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）のＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）をマウスの心臓に灌流した。脳を取り出し、４％ＰＦＡ中で一晩固定し、その後、３０％スクロースのＰＢＳ溶液中で平衡化した。４０μｍ厚の冠状切片を凍結ミクロトーム上で切り出し、免疫組織化学用に処理するまで抗凍結剤中で４℃にて保存した。フリーフローティング切片をＰＢＳ中で洗浄した後、０．３％のＴｘ１００および３％の正常ロバ血清（ＮＤＳ）中で３０分間インキュベートした。急性スライス実験では、刺激直後に、２７５μｍ厚のスライスを、氷冷した４％ＰＦＡ中で１時間固定し、０．５％のＴｘ１００および３％のＮＤＳと共にインキュベートした。ＭＡＰＫアッセイでは、ＨＥＫ２９３細胞の刺激直後に、カバーガラスを１５分間固定し、０．６％のＨ２Ｏ２と共にインキュベートし、その後、０．１％のＴｘ１００を含む３％ＮＤＳで透過処理した。マウス抗ＧＡＤ６７ １：５００、マサチューセッツ州ビルリカのミリポア社製；ウサギ抗ｃｆｏｓ １：５００、カリフォルニア州サンディエゴのカルバイオケム社（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）製；ウサギ抗リン酸化ＣＲＥＢ Ｓｅｒ１３３ １：５００、ミリポア社製について、一次抗体のインキュベートを０．０１％のＴｘ１００および３％のＮＤＳ中で一晩行った。切片を洗浄し、ＦＩＴＣまたはＣｙ５（ペンシルベニア州ウェストグローブのジャクソン・ラボラトリー（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）製）にコンジュゲートした二次抗体（１：１０００）と共に室温で３時間インキュベートした。ＤＡＰＩ（１：５０，０００）と２０分間インキュベートした後、切片を洗浄し、ＰＶＤ−ＤＡＢＣＯと一緒に顕微鏡用スライドにマウントした。残りの一次抗体オーバーナイトインキュベート物（ウサギ抗リン酸化Ｅｒｋ１／２；抗リン酸化ＭＡＰＫ ｐ３８ １：５００、ウィスコンシン州マディソンのプロメガ社製；マウスモノクローナル抗ドーパミンＤ１受容体 １：５０、ケミコン社（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）製；ウサギポリクローナル抗ドーパミンＤ２受容体 １：５０、ミリポア社製；ヤギポリクローナル抗コリンアセチルトランスフェラーゼ １：２００、ミリポア社製）はその後、ビオチン化二次抗体（１：５００、ジャクソン・ラボラトリー製）とのインキュベート、アビジン−ビオチン−西洋ワサビペルオキシダーゼ処理（ＡＢＣキット、カリフォルニア州バーリンゲームのベクター・ラボ社（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）製）、およびＴＳＡ検出（コネティカット州シェルトンのパーキンエルマー社製）を、メーカーの取扱説明書に従い行った。
【００６７】
２０×／０．７０ＮＡまたは４０×／１．２５ＮＡの油浸対物レンズを用いてライカ社製ＴＣＳ ＳＰ５走査型レーザー顕微鏡上で共焦点蛍光画像を得た。１つの条件につき、カニューレ管の下５００μｍの領域内で４つの連続スタック画像を得た。ＤＡＰＩ染色で核を可視化し、Ｖｏｌｏｃｉｔｙ（インプロビジョン社（Ｉｍｐｒｏｖｉｓｉｏｎ）製）ソフトウェアを用いてｃｆｏｓまたはｐＣＲＥＢの免疫反応性の平均ピクセル強度を求めた。陽性またはｐＣＲＥＢ活性の細胞を強度閾値に基づき同定し、実験条件を隠して（ｂｌｉｎｄ）画像の取得および解析を行った。
【００６８】
【表１】
【００６９】
【表２】
【００７０】
【表３】
【００７１】
したがって、本発明の実施形態は、細胞内シグナル伝達の光遺伝学的制御に関し、行動中の哺乳動物内でインビボで作用し且つ非常に低い暗所活性を有しつつ、時間精度を得ることおよび天然受容体下流の複雑に絡み合った複数のシグナル伝達分子を動員するのに有用であり、したがって他の手法の個々のプラス面の多くを１つの技術中で統合するのに有用である。同様な実施形態では、無数の神経伝達物質および内分泌性ホルモン等のその他の調節物質により引き起こされる７回膜貫通依存性シグナル伝達経路の因果上の意義を直接探索する。別の実施形態では、興奮性の細胞を超えてｏｐｔｏＸＲ手法が用いられ、光ファイバーの深さのターゲティングと光遺伝学的にターゲティングされる光感受性とを多用途に統合することの利点を活かす。そのような実施形態の１つは、多様な非興奮性組織における時間的に正確な生化学的シグナル伝達の因果上の意義を探索することに関する。
【００７２】
本発明の実施形態は、種々のリガンドが集合（ｅｎｓｅｍｂｌｅ）受容体コンホメーション状態を安定化させることで代替的な伝達カスケードと共役した受容体の細胞内作用にバイアスをかけることができる、リガンドバイアスシグナル伝達現象の考察に関する。ｏｐｔｏＸＲは、薬理学的操作と同様なレベルで代替的なカスケードを誘導するように用いられる（例えばｏｐｔｏ−β２ＡＲは、野生型β２ＡＲへの天然リガンドの作用と同様な変化をＭＡＰＫ活性化に誘導することができる）。しかし個々のｏｐｔｏＸＲは、リガンドバイアスシグナル伝達に寄与するコンホメーション状態の全ての制御を常に可能にするとは限らない。レチナールを基にしたツールは、哺乳動物組織中に内因性発色団が存在し、暗所での活性が非常に低いため、特に有用であり得る。光遺伝学は、速い単一成分レチナール結合モジュールに連結された多様なエフェクターの形態を取ることができ、光学の有する時間的精度を利用できる。
【００７３】
本発明の実施形態は、微生物オプシンによる戦略を補完するｏｐｔｏＸＲによる方法を利用し、行動下の哺乳動物中で作動可能で、速く且つターゲティング可能な別次元の細胞制御を提供する。
【００７４】
本発明の別の実施形態によれば、異なる作用スペクトルを有する公知のオプシン遺伝子に基づいて波長をシフトさせたタイプのｏｐｔｏＸＲが使用される。そのようなｏｐｔｏＸＲは、生化学的および電気的制御の分離可能なチャネルを提供するのに特に有用であり得る。
【００７５】
本明細書に記載した特定のタンパク質配列のバリアントも本発明の実施形態に沿っている。一部のバリアントはこれらのタンパク質配列に約７５％超の相同性を有し、別のものは約８０％、８５％、または９０％超の相同性を有する。いくつかの実施形態では、相同性は約９３〜約９５、または約９８％と高い。本発明の組成物には、本明細書に記載したタンパク質配列および核酸配列が含まれ、記載した配列に約５０％を超える相同性を有するバリアントから１００％の相同性を有するバリアントまで含まれる。
【００７６】
本明細書に記載した種々の実施形態は、正常な作動および疾患状態の両方における神経回路の更に洗練されたインタロゲーションおよびリバースエンジニアリングのために速い回路読取り技術と統合され得る。
【００７７】
前述した種々の実施形態は単に例として記載したものであり、本発明を限定するものと解釈されるべきではない。前述の説明および例示に基づき、本明細書に例示および記載された例示的な実施形態および応用例に厳密に従わなくとも本発明に種々の修正および変更を加えることができることが当業者には容易に理解されよう。例えば、そのような変更には、産生されるセカンドメッセンジャーのバリエーションが含まれ得る。そのような修正および変更は、添付の特許請求の範囲に記載されている本発明の真の精神および範囲から逸脱しない。
【技術分野】
【０００１】
関連特許文献
本願は、「セカンドメッセンジャーを光制御するためのセルライン、システム、および方法」という名称の２００８年５月２９日付で提出された米国仮特許出願第６１／０５７，１０８号の米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく利益を主張する。この基礎となる仮出願は全体が参照により本明細書に取り込まれる。
【０００２】
電子的に提出された資料の参照による組込み
２００９年４月２９日に作成された「STFD195PCT_ST25.txt」というファイル名の、１２，３４２バイトのＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイルである、本明細書と同時に提出されたコンピューターで読取り可能なヌクレオチド配列／アミノ酸配列リストは全体が参照により取り込まれる。
【０００３】
本発明は、一般的に、光刺激に応答してセカンドメッセンジャーを生成するシステムおよび手法に関し、より具体的には、それぞれ光に応答したセカンドメッセンジャー産生に関する、セルライン、ヌクレオチド配列、キメラタンパク質、およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
グアニンヌクレオチド結合タンパク質（Ｇタンパク質）は、不活性のグアノシン二リン酸（ＧＤＰ）状態と活性のグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）結合状態の間を行ったり来たりすると考えられている。これら２つの状態は細胞内でのセカンドメッセンジャーの放出と関連付けられている。放出されたセカンドメッセンジャーは、下流の細胞プロセスを制御するよう機能することができる。
【０００５】
セカンドメッセンジャーには、速やかに生成／放出されるシグナル伝達分子が含まれる。これらの分子は細胞内のエフェクタータンパク質を活性化することで細胞応答を発生させる。細胞シグナル伝達系の例としては、ホスホイノシトール系、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）系、およびアラキドン酸系が含まれる。
【０００６】
Ｇタンパク質の前記異なる状態間の変化は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、Ｇタンパク質結合型受容体（ＧＰＬＲ）、７回膜貫通ドメイン受容体（７ＴＭ受容体）、またはヘプタヘリカル受容体と呼ばれるタンパク質により引き起こすことができる。このタンパク質ファミリーは、種々の膜貫通型受容体を含む。これらの受容体は、細胞内へのシグナル伝達経路を活性化するにより外部刺激（例えば、光、神経伝達物質、匂い、またはホルモン）に応答する。具体的には、リガンドが結合し、伝達経路を活性化し、それによってＧタンパク質をもう一方の状態に変化させる。ＧＰＣＲ関連活性は多くの疾患に関連するので、ＧＰＣＲは多くの医薬品および治療の標的である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
市場の全薬物の３０％超がＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）を標的としており、それらの薬物の多くがセカンドメッセンジャーｃＡＭＰの産生または阻害に関連すると考えられる。ｃＡＭＰが直接関わる病理学的プロセスは数多く、例えば神経生理学的疾患、内分泌学的疾患、心疾患、代謝疾患、および免疫疾患が含まれる。複雑な哺乳動物行動の研究では、技術的限界が、細胞内シグナル伝達プロセスの時空間的に正確な制御の妨げとなっていた。化学物質に基づいてｃＡＭＰレベル等のセカンドメッセンジャーレベルを調節する現在の方法は、比較的ゆっくりと機能し、神経組織や心臓組織等の特定の組織に関連して身体が用いる速いタイムスケールの活性を研究するには問題である。これらの化学的方法はしばしば、（例えば、新規治療薬のスクリーニング中における）こうした速いタイムスケールを探索するための速度を有しない。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、セカンドメッセンジャーの生成に関連した上記の課題等の克服ならびに関連するイメージングデバイスおよびその実施に関する。本発明は数多くの実施形態および応用により例示される。その一部を以下に要約する。
【０００９】
本発明の一実施形態によれば、細胞中でセカンドメッセンジャーを生成する方法が提供される。キメラ光応答性膜タンパク質（例えばロドプシン）を発現するためのヌクレオチド配列を、１または複数の異種受容体サブユニット｛例えばアドレナリン受容体（アルファ１、ベータ２）｝で改変する。光に応答してセカンドメッセンジャーを産生させるために、この光応答性膜タンパク質を細胞中で発現させる。
【００１０】
本発明の一実施形態によれば、細胞内メッセンジャーに関連する推定治療レジメン（例えば、薬物または電気刺激、またはこれらのセカンドメッセンジャーを介して作用する任意のもの）の有効性を評価する方法が実施される。キメラ光応答性膜タンパク質（ロドプシン）を発現するためのヌクレオチド配列を１または複数の異種受容体サブユニット｛例えばアドレナリン受容体（アルファ１、ベータ２）｝で改変する。光に応答してセカンドメッセンジャーを産生させるために、光応答性膜タンパク質を細胞中で発現させる。タンパク質を光にさらす。治療効果を評価する。
【００１１】
本発明の一実施形態は、１または複数の異種受容体サブユニット｛例えばアドレナリン受容体（アルファ１、ベータ２）｝を有するキメラ光応答性膜タンパク質（ロドプシン）を発現する細胞に関する。
【００１２】
本発明の一実施形態は、１または複数の異種受容体サブユニット｛例えばアドレナリン受容体（アルファ１、ベータ２）｝を有するキメラ光応答性膜タンパク質（ロドプシン）を発現するためのヌクレオチド配列に関する。
【００１３】
上記の本発明の概要は、説明される本発明の全ての実施形態または実施例を記載することを意図したものではない。添付の図面および以下の詳細な説明によりこれらの実施形態をより具体的に例示する。
【００１４】
本発明は、以下の本発明の種々の実施形態の詳細な説明を添付の図面と合わせて考慮することでより完全に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１Ａは、本発明の例示的実施形態による、ｏｐｔｏＧｓおよびｏｐｔｏＧｑを示す模式図である。 図１Ｂは、本発明の例示的実施形態による、トランスフェクトされていない細胞またはｏｐｔｏＧｓもしくはｏｐｔｏＧｑでトランスフェクトされた細胞のｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、およびＩＰ１の酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を示す。 図１Ｃは、本発明の例示的実施形態による、ｏｐｔｏＧｓおよびｏｐｔｏＧｑのｍＣｈｅｒｒｙ融合タンパク質でトランスフェクトされた細胞のＣａイメージングを示す。
【図２】本発明の例示的実施形態による、ｏｐｔｏＧｓおよびｏｐｔｏＧｑのｍＣｈｅｒｒｙ融合タンパク質でトランスフェクトされた細胞のＣａイメージングを示す。
【図３】図３Ａは、本発明の例示的実施形態による、種々のコンストラクトを発現するＨＥＫ細胞のｃＡＭＰ、ＩＰ１、およびＩＰ３レベルを示す。 図３Ｂは、本発明の例示的実施形態による、レンチウイルス発現ベクター、ｏｐｔｏ−α１ＡＲ発現細胞のＧＡＤ免疫染色、および１０分間の光刺激後にｏｐｔｏＸＲ発現細胞（ｍＣｈｅｒｒｙ＋）中で観察されたｐＣＲＥＢの活性化を示す。
【図４】図４Ａは、本発明の例示的実施形態による、記載されているコンストラクトのための、形質導入された側坐核のオプトロードターゲティング、スパイク波形、およびベースライン発火率を示す。 図４Ｂは、本発明の例示的実施形態による、光刺激によるインビボオプトロード記録を示す。 図４Ｃは、本発明の例示的実施形態による、光によるスパイク誘発頻度のベースラインに対する変化を示す。 図４Ｄは、本発明の例示的実施形態による、発火率変化カイネティクスを示す。
【図５】図５Ａは、本発明の例示的実施形態による、形質導入された領域の定位ターゲティング、光ファイバーが植え込まれた自由行動下のマウス、場所嗜好性装置の模式図、ならびに自由に探索しているマウスの試験および軌跡を示す。 図５Ｂは、本発明の例示的実施形態による、対照およびｏｐｔｏ−α１ＡＲの嗜好性を示す。 図５Ｃは、本発明の例示的実施形態による、種々のオープンフィールド試験における総距離の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明には種々の修正例および変更形態が可能であるが、その詳細は図面において例示により示され、以下に詳細に記載する。しかし、記載された特定の実施形態に本発明を限定することを意図するものではないことが理解されるべきである。逆に、本発明の精神および範囲内の全ての修正例、均等物、および代替例が含まれることが意図される。
【００１７】
本発明は、種々の光学的システムおよび方法の現実的な応用を可能にする上で有用であると考えられ、本発明は、細胞内セカンドメッセンジャーレベルの光制御を扱うシステムおよび方法における使用に特に適していることが見出された。本発明はそのような応用に必ずしも限定されないが、この文脈を用いた種々の例の説明により本発明の種々の態様が理解されよう。
【００１８】
本発明のある実施形態は、細胞内でセカンドメッセンジャーを放出させることにより光刺激に応答するキメラ膜タンパク質に関する。特定の例では、キメラタンパク質は異種受容体サブユニットと光に反応して光異性化によりコンホメーションを受けるタンパク質とを組み合わせたものであり、したがって、光によって活性化される。ロドプシンまたはレチニリデンタンパク質は、異種受容体サブユニットを含むように改変され得る光応答性タンパク質の例示的グループを与える。
【００１９】
本発明の一実施形態によれば、７回膜貫通αヘリックスドメインを含むと考えられるタンパク質が、セカンドメッセンジャーに関連する異種受容体サブユニットを含むように改変される。細胞膜中で発現されると、このタンパク質はコンホーマル変化をすることにより光に応答する。コンホーマル変化は、セカンドメッセンジャーの放出／産生の引き金となる。
【００２０】
本発明のある実施形態は、細胞内でセカンドメッセンジャーの放出を引き起こすことにより光刺激に応答するキメラ膜タンパク質、をコードするヌクレオチド配列に関する。
【００２１】
本発明のある実施形態は、異種性キメラ膜タンパク質を発現する細胞に関する。このキメラ膜タンパク質は、細胞内でセカンドメッセンジャーの放出を引き起こすことにより光刺激に応答する。特定の実施形態では、キメラ膜タンパク質の発現はインビボで起こる。別の実施形態では、キメラ膜タンパク質の発現はインビトロで起こる。
【００２２】
適切な受容体サブユニットを含むようにグアニンヌクレオチド結合タンパク質共役受容体タンパク質（ＧＰＣＲ）を改変することで任意の好適なセカンドメッセンジャーを産生するよう、本発明の実施形態を実施することができる。
【００２３】
本発明の実施形態においては、種々の波長および強度の光に応答するタンパク質を使用することができる。
【００２４】
本発明のある実施形態は、本明細書に開示するように、目的のセカンドメッセンジャー活性の任意の下流効果を決定するためのキメラＧＰＣＲタンパク質の使用に関する。
【００２５】
本発明の実施形態は、限定されるものではないが、哺乳動物細胞、幹細胞、植物細胞、および酵母、大腸菌等の単細胞生物を含む種々の細胞型中におけるキメラＧＰＣＲタンパク質の発現に関する。
【００２６】
本発明の特定の実施形態は、可視化を容易にするために蛍光タンパク質を連結したキメラタンパク質の最適化された発現、および光により誘導されるセカンドメッセンジャー活性の下流効果を研究するための様式の最適化された使用に関する。
【００２７】
本発明の一実施形態は、本明細書に開示するように、特定の細胞集団中で発現させるためにその細胞集団へとキメラＧＰＣＲタンパク質を遺伝的にターゲティングすることに関する。標的細胞型中で選択的に発現される細胞型特異的プロモーターが存在する（例えば、ニューロンターゲティング用のシナプシン１；心組織用のトロポニンバリアント）。発現ベクター中でこれらのプロモーターをキメラＧＰＣＲタンパク質の上流に配置することで、目的の細胞型にタンパク質の発現をターゲティングすることができる。これには、Ｔｅｔ反応、ＥＲ反応、およびＣｒｅ／Ｌｏｘシステム等の誘導可能、反転可能、またはその他の形で制御可能なプロモーターシステムが含まれる。
【００２８】
本発明の例示的一実施形態によれば、目的の細胞型中で発現されると光に応答して環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）が産生される、遺伝的にコード可能なタンパク質が開発される。これは、例えば、限定されるものではないが、医薬品のスクリーニング等の細胞生理に対する下流効果を可視化するのに有用であり得る。その他の実施形態では、光に応答してセカンドメッセンジャーを放出させる異種性キメラＧＰＣＲを用いる。例示的なセカンドメッセンジャーには、ｃＡＭＰ、環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）、イノシトール三リン酸／イノシトール１，４，５−三リン酸／トリホスホイノシトール（ＩＰ３）、およびアラキドン酸が含まれる。
【００２９】
本発明の一実施形態によれば、細胞内メッセンジャーに関連する推定治療レジメン（例えば、薬物または電気刺激、またはこれらのセカンドメッセンジャーを介して作用する任意のもの）の効力を評価する方法が実施される。キメラ光応答性膜タンパク質（例えばロドプシン）を発現するためのヌクレオチド配列を、１または複数の異種受容体サブユニット｛例えばアドレナリン受容体（アルファ１、ベータ２）｝で改変する。光に応答してセカンドメッセンジャーを産生させるために、光応答性膜タンパク質を細胞中で発現させる。このタンパク質を光にさらし、治療効果を評価する。
【００３０】
光は、所望の刺激特性に従って与えることができる。一実施形態では、発現された膜タンパク質は数十ミリ秒以内に光に応答する。したがって、刺激プロファイルは、速く連続している一連の光パルスを含んでもよく、得られる効果は、例えばＣａ２＋感受性色素を用いてモニターすることができる。
【００３１】
一例では、細胞は最初に治療なしで刺激され得る。治療が施された後、細胞は再度刺激され得る。各試験の結果を比較することで治療の有効性を評価することができる。
【００３２】
治療には、例えば、限定されるものではないが、医薬品、細胞の修飾（遺伝的修飾その他）、細胞の物理的パラメータ（例えば温度変化または電気刺激）、または生体に適用される治療レジメンなどの、広範な異なる形での実施が含まれる。
【００３３】
一実施形態では、治療は、発現された膜タンパク質の光刺激である。そのような例においては、有効性は、例えば、治療されるべき障害に関連する症状をモニターすることで測定することができる。
【００３４】
別の実施形態では、治療レジメンは疾患または障害のモデル化の一部として実施される。例えば、疾患モデル（細胞または動物）を用いることができ、タンパク質が発現される前にバックグラウンド／ベースライン状態を評価し、治療レジメンを評価することができる。
【００３５】
実験結果は、ｃＡＭＰ誘導因子およびｃＡＭＰ標的陽イオンチャネルの両方で細胞をトランスフェクトし、得られた活性をＣａ２＋感受性色素を用いて可視化することで、光で惹起されるｃＡＭＰによる標的イオンチャネルの制御を可視化できることを示している。この、セカンドメッセンジャー活性の、遺伝的にコード可能な光活性化型調節物質一式は、新規治療薬のスクリーニングに有用であり得、また、ＡＤＨＤや心臓のチャネル病等の多くの疾患状態にｃＡＭＰが関与するので、それ自体が治療法である。このタンパク質は、種々の他のセカンドメッセンジャー（例えばＩＰ３）と共に使用されるように設計されてもよく、レチナール結合部位を設計するか吸収／作用スペクトルの異なるキメラロドプシンまたは錐体オプシンをキメラに選択することで光活性化のためのその他の色と共に使用されるように設計されてもよく、また、カルシウムシグナル伝達および／またはキナーゼ活性等のセカンドメッセンジャーの他の下流効果と共に使用されるように設計されてもよい。
【００３６】
図１Ａ、１Ｂ、および１Ｃは、開発されたセカンドメッセンジャーシグナル伝達の光活性化型誘導因子（「ｏｐｔｏＸＲ」）の２つの例であるｏｐｔｏＧｓおよびｏｐｔｏＧｑから得られた実験データを示す。これらの光活性化型誘導因子はロドプシン／ＧＰＣＲキメラ体である。ｏｐｔｏＧｑは、Ｇｑシグナル伝達の光応答性制御を可能にし、ｏｐｔｏＧｓは、Ｇｓシグナル伝達の光応答性制御を可能にする。
【００３７】
ｏｐｔｏＧｓおよびｏｐｔｏＧｑのどちらにおいても、暗所におけるベースラインｃＡＭＰレベルおよびＩＰ３レベルには無視できる差しかなく、ｃＧＭＰ等の他のセカンドメッセンジャーの経路とのクロスオーバーはないことが示されている。ｏｐｔｏＧｑの光刺激で観察されたｃＡＭＰレベルの増加は、ＩＰ３産生の予想される下流効果である。
【００３８】
図１Ａは、本発明の例示的実施形態による、ｏｐｔｏＧｓおよびｏｐｔｏＧｑの模式図である。各タンパク質について、ロドプシンの細胞内ループが、通常Ｇｓ（ベータ２）またはＧｑ（アルファ１）と共役しているアドレナリン作動性タンパク質のもので置換される。この遺伝コード配列は、ヒトおよびマウスの細胞での発現用に最適化されている。得られる配列の例には、ｏｐｔｏＧｓ：配列番号１および配列番号２；ならびにｏｐｔｏＧｑ：配列番号３および配列番号４が含まれる。
【００３９】
当業者に理解されるように、これらのタンパク質のアミノ酸配列は、実施形態を支持する非限定的な例として提示するものであり、塩基配列以外の点では同様の結果、互換可能な結果、または同等な結果をもたらす遺伝配列のバリエーション（例えば点突然変異体）も含まれる。
【００４０】
図１Ｂは、本発明の例示的な実施形態による、トランスフェクトなしまたはｏｐｔｏＧｓもしくはｏｐｔｏＧｑでトランスフェクトされた細胞のｃＡＭＰ（上）、ｃＧＭＰ（中）、およびＩＰ１（下：ＩＰ３の分解産物）の酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を示す。図１Ｂの結果は、示されているように、５０４ｎｍ光（２０ｎｍバンド幅）で１ヶ所につき１分間刺激するか暗所に維持した細胞から得た。
【００４１】
刺激は、環境調節倒立培養顕微鏡（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；ライカ社製ＤＭＩ６０００Ｂ）を用いて行った。ｃＡＭＰアッセイでは、アッセイの飽和したポジティブコントロールとして、一部の細胞を１０μＭのフォルスコリンで３０分間処理した。ｏｐｔｏＧｓは、光に応答してｃＡＭＰレベルを有意に増加させた。ｃＡＭＰのベースラインの有意な増加やｏｐｔｏＧｓによるｃＧＭＰレベルもしくはＩＰ３レベルの逸脱は見られなかった。ＯｐｔｏＧｑは、光に応答して、ｃＧＭＰレベルは有意に変化させず、ＩＰ３レベルを有意に増加させた。ＩＰ３産生を伴うｃＡＭＰレベルの増加は、細胞内Ｃａ２＋放出の結果であると考えられる。
【００４２】
図１Ｃは、本発明の例示的実施形態による、ｏｐｔｏＧｓおよびｏｐｔｏＧｑのｍＣｈｅｒｒｙ融合タンパク質でトランスフェクトした細胞のＣａイメージングを示す。ｃＡＭＰを検出するために、環状ヌクレオチド依存性Ｃａ２＋チャネルＣＮＧＡ２のｃＡＭＰ選択的変異体をｏｐｔｏＧｓに対し過剰量トランスフェクトした。ＩＰ３は、細胞内Ｃａ２＋ストアの放出を活性化し、信頼性の高いＧｑ活性化シグナルを与える。対照集団も、ｍＣｈｅｒｒｙ単独及び過剰量の前記変異体ＣＮＧＡ２でトランスフェクトした。細胞にｆｕｒａ−２を負荷し（２０〜２５分間インキュベート）、２秒毎に３４０ｎｍおよび３８０ｎｍを２ｍｓ照射した。ｏｐｔｏＧｓおよびｏｐｔｏＧｑのそれぞれでは、Ｃａシグナルを生じさせるのにこの照射だけで十分であったが、対照集団では有意なシグナルは検出されなかった。
【００４３】
図１は特定の実験設定で得られたデータを示しているが、本発明はこれに限定されるものではない。例えば、トランスフェクション以外の種々の送達技術が想定され、該送達技術としては、ウイルス形質導入、弾道的遺伝子導入（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ；遺伝子銃）、および自発的な核酸の取込みが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００４４】
基となるロドプシンは、アルファ２−アドレナリン受容体もしくはドーパミンＤ２受容体もしくはセロトニン５ＨＴ２Ａ受容体等のＧｉ共役受容体、またはドーパミンＤ１Ａ受容体もしくは代謝型グルタミン酸受容体等のその他のＧｓまたはＧｑ共役受容体等の、任意の好適な異種受容体サブユニットと共に使用されるように改変することができる。
【００４５】
例示的な一実施形態によれば、基となるロドプシンはウシＢｏｓ ｔａｕｒｕｓに由来するタンパク質である。
【００４６】
一実施形態によれば、前述した基となるロドプシン以外の基となるタンパク質を用いることもでき、前述した基となるロドプシン以外の基となるタンパク質には、錐体オプシン（赤色、緑色、または青色）、他の種のロドプシン、およびドーパミン受容体またはセロトニン受容体等のリガンド依存性受容体等の種々の７回膜貫通型タンパク質が含まれる。
【００４７】
種々の実施の態様は、哺乳動物におけるインビボでの適用に関する。これらの実施の態様は、限定されるものではないが、神経回路および疾患モデルの試験および確認を含む。
【００４８】
図３Ａおよび３Ｂは、セカンドメッセンジャーシグナル伝達の光活性化型誘導因子の２つの例であるｏｐｔｏＧｓ（ｏｐｔｏ−β２ＡＲ）およびｏｐｔｏＧｑ（ｏｐｔｏ−α１ＡＲ）のインビボでの適用から得られた実験データを示す。本発明の態様は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）に共通する構造−機能関係に影響を与えることで、受容体によって開始される生化学的シグナル伝達経路を高い時空間精度で動員および制御する、遺伝的にコードされた光学的ツール（「ｏｐｔｏＸＲ」）の多様なファミリーの使用および開発に関する。
【００４９】
図３Ａおよび３Ｂに示す結果は、ターゲティングされた別個のシグナル伝達経路を光に応答して選択的に動員する２つの特定のｏｐｔｏＸＲに関するものである。これら２つのｏｐｔｏＸＲは、インビボで側坐核中のスパイク発火に反対の影響を与え、側坐核中での正確に時間制御されたｏｐｔｏＸＲの光刺激だけで、自由行動をしているマウスに条件付け場所嗜好性を誘導するのに十分であった。このｏｐｔｏＸＲを用いた手法は、行動している哺乳動物における生化学的シグナル伝達の因果的影響に関する仮説を、ターゲティング可能で時間的に正確な様式で試験することを可能にする。
【００５０】
ＧＰＣＲ間で共有されている構造−機能関係を用いて、シグナルをエフェクターに共役させる新規な伝達ロジックを有する複数の異なるオプシン／ＧＰＣＲ２キメラを開発し、インビボで発現させ、哺乳動物中で細胞内シグナル伝達の光制御を実施した。種々の実施の態様に従い、１または複数のキメラオプシン受容体タンパク質が、インビボにおいて哺乳動物内で機能的であり、特定の細胞にターゲティング可能であり、正確に時間制御された光パルスに応答性であるように設計される。そのような手法により、高速な光刺激（およびタンパク質応答）を用いて、正確に決められ且つ行動上適切であるタイミングで細胞内の生化学的事象について試験し特徴解析することが可能となる。いくつかの非限定的で例示的な実施の態様には、規定された細胞型における、ある範囲の時間スケールにわたる、拍動性対強直性の調節、異なる調節系間の同調性、ならびにその他の基本的な生理学的および病理学的プロセスが含まれる。
【００５１】
哺乳動物での実施は成功した。例示的な一実施例では、最初にＧｑ共役ヒトα１ａアドレナリン受容体（α１ＡＲ）およびＧｓ共役ハムスターβ２アドレナリン受容体（β２ＡＲ）の保存された残基をＧｔ共役ウシロドプシンと整列させることで、ロドプシンの細胞内ループを特定のアドレナリン受容体の細胞内ループで置換した（図１Ａ）。構造モデルに基づいて、Ｇタンパク質との共役をＧｔから移すように細胞内領域の交換（カルボキシ末端ドメインを含む）を各受容体について設計し、各受容体を哺乳動物中でのインビボ発現用に最適化した。種々のリガンドにより活性化すると、天然の受容体は複数の集合（ｅｎｓｅｍｂｌｅ）状態を取ることができ、リガンドバイアスシグナル伝達現象においてカノニカル経路および非カノニカル経路を動員する。ｏｐｔｏＸＲは光を感知すると、生物学的環境に応じた様式で、１つの活性集合的状態を選択する可能性が高い。
【００５２】
キメラ（ｏｐｔｏ−α１ＡＲおよびｏｐｔｏβ２ＡＲ）をコードする遺伝子を蛍光タンパク質に融合させた。機能的ｏｐｔｏＸＲ発現の検証は、ｏｐｔｏ−α１ＡＲ単独（Ｇｑを介して［Ｃａ２＋］ｉを動員すると予想される）、またはｏｐｔｏ−β２ＡＲ（Ｇｓを介して環状ＡＭＰを動員すると予想される）とｃＡＭＰ依存性Ｃａ２＋チャネルＣＮＧＡ２−Ｃ４６０Ｗ／Ｅ５８３Ｍの両方でトランスフェクトしたＨＥＫ細胞中における［Ｃａ２＋］ｉ（細胞内カルシウム濃度）のイメージングにより達成された。［Ｃａ２＋］ｉのレシオメトリックイメージングにより、６０ｓの緑色光刺激（５０４±６ｎｍ、７ｍＷｍｍ−２）はいずれのｏｐｔｏＸＲの下流でも顕著な［Ｃａ２＋］ｉシグナルを誘導するのに十分であるが、対照条件では誘導しないことが示され（図２）、機能的に発現していることが明らかになった。各ｏｐｔｏＸＲに制御されるシグナル伝達の特異性を試験するために、形質導入されたＨＥＫ細胞に３ｍＷｍｍ−２、５０４±６ｎｍの光を６０ｓ照射し、その後、細胞を溶解し、イムノアッセイによりｃＧＭＰ、ｃＡＭＰ、およびＩＰ１（ＩＰ３の分解産物）のレベルを解析した。カノニカルパターンはｏｐｔｏ−β２ＡＲでその分子的デザインに対応して予想されるとおりといえた。何故なら、光刺激によりｏｐｔｏ−β２ＡＲ発現細胞中でｃＡＭＰが有意に産生され（図３Ａ、上）、これは野生型β２ＡＲの薬物刺激で得られるものに匹敵するとともに、ＩＰ３（図３Ａ、中段）、［Ｃａ２＋］ｉ（図２）や暗所での実質的な活性を動員しなかったからである。一方、光刺激は、ｏｐｔｏ−α１ＡＲ発現細胞でＩＰ３シグナル伝達の有意なアップレギュレーションを生じさせ（図３Ａ、中段）、これは野生型α１ＡＲの薬物刺激により誘導されるレベルに匹敵するものであった。［Ｃａ２＋］ｉの上昇（図２）と共に、これらのデータは、Ｇｑの動員について予想されるパターンを示しており、このパターンはｏｐｔｏ−β２ＡＲ発現細胞中では見られない（図３Ａ、上）。いずれのコンストラクトを発現している細胞の光刺激も、ｃＧＭＰレベルを調節することができず（図３Ａ、下）、このことは更に、キメラタンパク質のシグナル伝達特異性を示している。同様なアッセイから、ｏｐｔｏＸＲが、天然ロドプシンの作用スペクトルに近い作用スペクトルを維持しており、生物学的に好適な光束の範囲に渡りシグナルを統合することができ、ｐ４２／ｐ４４−ＭＡＰＫシグナル伝達に関して野生型受容体と同様の程度に非カノニカル経路を活性化できることが示された。
【００５３】
レチナール補因子の補充が必要かどうかも含め、インタクトな神経組織中におけるｏｐｔｏＸＲの能力を調べた。そのような試験の１つでは、（生化学的調節の標的をグリアおよび内皮細胞を初めとする他の潜在的Ｇｓ／Ｇｑ応答性細胞組織要素ではなく局所ニューロンにするため）シナプシンＩプロモーターの制御下にあるｏｐｔｏＸＲ融合遺伝子を有するレンチウイルスベクター（図３Ｂ、左上）を成獣マウスの側坐核中に定位的に注入した。この戦略により、側坐核中に細胞体樹状突起区画を有するニューロン（約９５％がＧＡＢＡ作動性中型有棘ニューロンであり、更なるサブタイプ特異性を有しない；図３Ｂ、左）が生化学的調節の標的とされ、またこれらのレンチウイルスは軸索を介して細胞に形質導入することはないため、通過繊維（ｆｉｂｅｒｓ ｏｆ ｐａｓｓａｇｅ）または求心性シナプス前終末は除外される。形質導入の２週間後、人工脳脊髄液中で側坐核の急性冠状スライスを調製し、１０分間光刺激し、すぐに固定しｃＡＭＰおよびＣａ２＋共役シグナル伝達カスケードの両方の生化学的統合因子（ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ）であるＳｅｒ１３３−リン酸化ＣＲＥＢ（ｐＣＲＥＢ）を染色した。外因性のレチノイドを補充しなくても、ｏｐｔｏＸＲ発現集団において有意に上昇したｐＣＲＥＢが観察されたが（図３Ｂ、右）、非照射組織では観察されなかった。
【００５４】
形質導入した側坐核にターゲティングされたオプトロードを用いて、マルチユニットインビボニューロン発火を記録することで、側坐核の居所的電気活性に対するｏｐｔｏＸＲ活性化の機能面での影響を決定した（図４Ａ）。どちらのコンストラクトにおいても暗所ではベースライン発火率に有意な差は見られなかった（図４Ａ、右下）。光刺激は、ｏｐｔｏ−β２ＡＲ発現側坐核においてネットワーク発火を減少させた（図４Ｂの左のトレースは影響のカイネティクスを示す。概要データが図４Ｃおよび図４Ｄにそれぞれ示される）。これは、Ｇｓを標的にした過去の薬理学的実験と一致していた。光刺激は、ｏｐｔｏ−α１ＡＲ発現側坐核（図４Ｂ、右；図４Ｃ、４Ｄ）において発火を増加させた。スパイク頻度のヒストグラムから、発火率へのｏｐｔｏＸＲの影響のカイネティクスは、シグナルの電気的開始よりも生化学的開始の方に一致することが示された（図４Ｄ）。これらの電気生理学的データと前出の生化学的検証とを組み合わせれば、細胞内カスケードの差動的光活性化型制御を可能にし且つネットワークの生理を調節するようにｏｐｔｏＸＲをインビボで機能的に発現させることができることが支持される。
【００５５】
一実施例では、光遺伝学を用いて、正確にタイミングを制御されたｏｐｔｏＸＲ刺激が自由行動中のマウスの行動を調節する能力を評価した。オペラント行動に用いられる時間的に正確な様式で側坐核ニューロン内の細胞内シグナル伝達を光制御するため、携帯型ソリッドステート光送達をｏｐｔｏＸＲのトランスジェニック発現と組み合わせた（図５Ａ）。共焦点分析により、発現が局所的な側坐核ニューロンに限定されていることが示され、特に、求心性繊維、側坐核に突き出た遠位領域、グリア、または周辺領域中で標識は全く観察されなかった。３日間のオペラント条件付け場所嗜好性アッセイの一部として、形質導入した側坐核に光刺激をターゲティングした（図５Ａ）。試験中毎日、動物に自由に場所嗜好性装置を探索させた（図５Ａ、下）。１日目は、動物は光刺激を受けずに自由に装置内を探索した。２日目に、指定した条件付けされた部屋に動物が自由に進入する毎に、形質導入した領域に位置を合わせたレーザーダイオード接続光ファイバーで光パルスを１０Ｈｚで送達して、強力な報酬の間のモノアミン作動性入力の適切な強度を模倣した。経路のトレースから、柔軟な光ファイバーを用いた手法により、全ての部屋を完全且つ妨害のなしに探索できることが示された（図５Ａ、下）。３日目に、動物は再度、光刺激を受けずに自由に装置内を探索し、条件付けた部屋で過ごした時間が２人の別の盲検評価者により定量された。特に、ｏｐｔｏ−α１ＡＲを発現している動物は、光刺激後に、装置の条件付けされた側への嗜好性が大きく上昇したことが示された（図５Ｂ）。この時間的に正確な生化学的調節の影響は、ｏｐｔｏ−α１ＡＲ動物の別個の２つのコホートで再現可能であった（ｎ＝５〜６、Ｐ＜０．０５、条件付けされた部屋中での時間の各コホートについてのスチューデントのｔ検定；全集団では、ｎ＝１１、Ｐ＜０．０１）。一方、その他のオプシン遺伝子ｏｐｔｏ−β２ＡＲおよびＣｈＲ２は、嗜好性の誘導についてさほど効果的ではないようであった。側坐核ニューロン中のｏｐｔｏ−α１ＡＲ刺激の影響は報酬関連行動に特異的であり、オープンフィールド試験で同じ動物のコホートに送達された同じ光刺激が移動距離または壁の近接に対する嗜好性には有意な影響を与えなかった（図５Ｃ）ことから、不安関連行動または自発運動活性の直接的調節にまでは及ばなかった。
【００５６】
上記実験に従った具体的かつ非限定的な実施例をここで記載する。記録電極（１ＭＶタングステン、Ａ−Ｍシステムズ社製）に接続した直径２００ｍｍのマルチモード光ファイバー（ソーラボ社製）からなり電極/ファイバーの先端間の距離が２００〜４００ｍｍであるオプトロードを、定位フレーム（デビッド・コフ社（Ｄａｖｉｄ Ｋｏｐｆ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）製）に固定されイソフルランで麻酔したマウスの形質導入された側坐核中に下ろして用い（電極の先端はブレグマの下４．８〜５．２ｍｍ）、インビボ記録および解析を行った。４７３ｎｍダイオードレーザー（クリスタレーザー社製）の光をファイバーを介して送達した。電気シグナルをバンドパスフィルターに通し、増幅し（０．３〜１ｋＨｚ、１８００ Ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｄｅ ＡＣ Ａｍｐｌｉｆｉｅｒ、Ａ−Ｍシステムズ社製）、ｐＣｌａｍｐ１０．０（モレキュラーデバイス社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）製）を用いて解析した。閾値によりスパイクを検出し、個々に点検して確認した。
【００５７】
光ファイバー（直径２００ｍｍ、ソーラボ社製）を４７３ｎｍの青色ダイオードレーザー（クリスタレーザー社製）に接続し、側坐核（先端から０〜１００ｍｍ）をターゲティングするカニューラに合わせ、この光ファイバーを介して光刺激を与え、行動分析を行った。ファンクションジェネレータ（Ａｇｉｌｅｎｔ ３３２２０Ａ）を用いてｏｐｔｏＸＲ用に５０ｍｓパルス幅の光を送達した。場所嗜好性は、自由に探索できるように部屋の間の壁を除去した標準装置（ＳＤインスツルメンツ社製）中で実施した。各部屋で過ごした時間量について、ＭＡＴＬＡＢ（マス・ワークス社（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ）社製）で特注の集計スクリプトを実行して、２人の独立した盲検評価者がビデオからデータを解析した。オープンフィールド試験では、４０３４０ｃｍの正方形のオープンフィールド中に動物を置き、場所嗜好性実験と同じパラメータを用いて光刺激を送達した。自動化されたソフトウェア（Ｖｉｅｗｐｏｉｎｔ）を用いて、その外側の環（フィールドの残りの部分）に対する、中央の１５３１５平方ｃｍでの合計時間および距離についてビデオを解析した。
【００５８】
表示されている場合、統計解析は、両側検定によるスチューデントのｔ検定（マイクロソフトエクセルで計算）または一元配置の分散分析とチューキーの事後検定（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）を用いて行った。まとめた棒グラフは全て、平均値±ｓ．ｅ．ｍで表し、有意性は以下のように表した：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【００５９】
本発明の種々の実施形態の驚くべき結果および有効性を支持する更なる詳細は、参照により全体を本明細書に援用するTemporally precise in vivo control of intracellular signalling, Raag D. Airan, et al., Nature 458, 1025-1029 (23 April 2009)中に見出すことができる。
【００６０】
以下の記載は、本発明の実施形態による具体的且つ非限定的な方法の詳細を提供する。この方法の多くのバリエーションが想定され、本発明の範囲内に含まれる。
【００６１】
ベクター構築
ｏｐｔｏ−α１ＡＲおよびｏｐｔｏ−β２ＡＲの哺乳動物コドン最適化配列（図１Ａ中のアミノ酸配列）を合成し、ｐｃＤＮＡ３．１にクローニングし、ＮｏｔＩ部位を用いてｍＣｈｅｒｒｙまたはＹＦＰ（スタートコドンを除去）のＮ末端に融合させた。ｏｐｔｏＸＲとｍＣｈｅｒｒｙ／ＹＦＰのリンカーは５’ＧＣＧＧＣＣＧＣＣ３’である。ｐＬｅｎｔｉ ＳｙｎａｐｓｉｎＩ ｈＣｈＲ２ ｍＣｈｅｒｒｙ ＷＰＲＥベクターのＡｇｅＩおよびＥｃｏＲＩ部位に各ｏｐｔｏＸＲ ｍＣｈｅｒｒｙの導入遺伝子をクローニングすることで、ＳｙｎａｐｓｉｎＩ ｏｐｔｏＸＲ ｍＣｈｅｒｒｙを含むレンチウイルスベクターを構築した。
【００６２】
レンチウイルスの作製
高タイターレンチウイルスを作製した。簡潔に述べると、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで培養されている４層のセルファクトリー（Ｎｕｎｃ社製）中に９０％のコンフルエンスでＨＥＫ２９３ＦＴ細胞をプレーティングした。６９０μｇの前述したレンチウイルスベクターおよび２種類のヘルパープラスミド（６９０μｇのｐΔＣＭＶＲ８．７４および４６０μｇのｐＭＤ２．Ｇ）で細胞をコトランスフェクトした。トランスフェクションの１５時間後に培地を交換した。トランスフェクションの２４時間後に、５ｍＭの酪酸ナトリウムを含む無血清ＵｌｔｒａＣＵＬＴＵＲＥ（キャンブレックス社（Ｃａｍｂｒｅｘ）製）２００〜２２０ｍＬで培地を交換した。トランスフェクション４０時間後、今やウイルスを含む培養液上清を１０００ｒｐｍで５分間スピンして細胞残渣を除去した後、０．４５μｍの低タンパク質結合フィルターフラスコを用いて濾過した。次いで、この清澄な上清を、ＳＷ２８ローター（ベックマン社製）を用いて５５，０００ｇで２時間超遠心し、ウイルスを沈殿させた。遠心分離後、上清を捨て、得られたウイルスペレットを合計１００μＬの冷（４℃）ＰＢＳに溶解した。再懸濁したウイルスを７０００ｒｐｍで５分間遠心分離して残りの細胞残渣およびウイルス残渣を除去した。アリコートを再使用時まで−８０℃で凍結した。
【００６３】
動物の外科手術および行動
スタンフォード大学の実験室用脊椎動物プロトコールに従い、１０〜１２週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６マウスを収容し、取り扱った。ウイルス溶液を以下のように右側坐核に導入した。動物をイソフルランで麻酔し、頭頂部の毛を刈り取った。イソフルラン麻酔下にいる間に動物の頭を定位フレーム（デビッド・コフ社）に固定した。頭皮を正中切開し、ブレグマの前側１．１０ｍｍ、側方１．４５ｍｍに直径約１ｍｍの開頭切開部を穿孔した。次いで、ウイルスを予め充填した３３ゲージのベベル針（ＮａｎｏＦｉｌ、ワールド・プレシジョン・インスツルメンツ社（Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）製）を側坐核中に下ろし（針の先端がブレグマの腹側４．７０〜４．８０ｍｍ）、自動シリンジポンプ（ＮａｎｏＦｉｌ、ワールド・プレシジョン・インスツルメンツ社製）を用いて１．０μＬのウイルスを１００ｎＬ／分で注入した。注入後、３〜５分間組織を弛緩させて流体を拡散させた後、針を引き抜いた。急性スライスまたはインビボ記録実験用の動物では、開頭部にデンタルセメント（ラングデンタル社（Ｌａｎｇ Ｄｅｎｔａｌ）製）を充填し、ＶｅｔＢｏｎｄ（３Ｍ社製）を用いて切開部を閉じた。行動分析用の動物では、カニューレ（Ｃ３１６Ｇ、ペデスタルの４．５ｍｍ下で切断；プラスチクスワン社（Ｐｌａｓｔｉｃｓ・Ｏｎｅ）製）をペデスタルが頭蓋に面一になるよう配置した。Ｍｅｔａｂｏｎｄ（パーケル社（Ｐａｒｋｅｌｌ）製）およびデンタルセメント（ラングデンタル社製）を用いてカニューレを固定した。ＶｅｔＢｏｎｄまたはセメントの乾燥後、動物をフレームから外し、その後の操作の前に少なくとも１週間回復させた。行動実験の対照動物にも実験動物と同じ操作（外科手術、カニューレの植込み、光刺激）を行い、ウイルスの代わりに溶媒（ＰＢＳ）のみを注入した。場所嗜好性実験には、部屋のどちらかの側（＞７０％または＜１０％）または中央の部屋（＞４０％）に対するベースライン嗜好性を示さなかった動物を実験に用いた。全動物の９０％超が、バイアスがかけられていないバランスのとれた場所嗜好性デザインのためのこれらの基準を満たした。
【００６４】
急性スライスの調製
動物をイソフルランで麻酔し、外科手術用のハサミ（ファイン・サイエンス・ツールズ社（Ｆｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｏｏｌｓ）製）を用いて断頭した。側坐核を含む２７５μｍ厚の冠状スライスを切り出し、６４ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＫＣｌ、１．２５ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、２５ｍＭのＮａＨＣＯ３、１０ｍＭのグルコース、１２０ｍＭのスクロース、０．５ｍＭのＣａＣｌ２、および７ｍＭのＭｇＣｌ２を含む切断溶液（９５％Ｏ２／５％ＣＯ２で平衡化）中に保存した。スライス後、スライスを切断溶液中にて３２〜３５℃で３０分間インキュベートし、その後実験まで室温でインキュベートした。エクスビボでのｏｐｔｏＸＲ刺激では、スライスを正立顕微鏡（ＢＸ５１Ｗ、オリンパス社製）のステージに乗せ、１２４ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＫＣｌ、１．２５ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、２６ｍＭのＮａＨＣＯ３、１０ｍＭのグルコース、２．４ｍＭのＣａＣｌ２、および１．３ｍＭのＭｇＣｌ２を含む人工脳脊髄液（９５％Ｏ２／５％ＣＯ２で平衡化）で灌流した。３００ＷのＬａｍｂｄａ ＤＧ−４（サッター社（Ｓｕｔｔｅｒ）製）の光を４７３ｎｍ±２０ｎｍのバンドパスフィルター（セムロック社（Ｓｅｍｒｏｃｋ）製）に通し、４倍の対物レンズ（０．２８ＮＡ）を用いて１０分間スライスに当て、その後すぐに、後の解析のために固定した。
【００６５】
シグナル伝達検証アッセイ
リポフェクタミン２０００（インビトロジェン社製）を用いて２４ウェルプレート中でＨＥＫ２９３ＦＴ細胞（インビトロジェン社製）をトランスフェクトし、トランスフェクションの４〜６時間後に無血清培地に交換した。Ｃａ２＋イメージングには、マトリゲルでコートされたカバーガラス上にプレーティングされた細胞に、１μＭのＡＴＲを含むタイロード中、５μｇ／ｍｌのｆｕｒａ−２ ＡＭを含むＦ−１２７プルロニック／ＤＭＳＯ（プローブ社（Ｐｒｏｂｅｓ）製）を３７℃、５％大気ＣＯ２にて２０〜２５分間負荷した。負荷後、３００ＷのＬａｍｂｄａ ＤＧ−４（サッター社製）を制御するＭｅｔａｆｌｕｏｒ（アクソン・インスツルメンツ社（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）製）を用いて、オリンパス社製ＢＸ５１Ｗ上で３４０ｎｍ／３８０ｎｍでカバーガラスをイメージ化した。イムノアッセイでは、トランスフェクションの１８〜２４時間後に、１μＭのＡＴＲおよび５０ｍＭのＬｉＣｌ（ＩＰ１の分解を防ぐため）を添加し、プレートを環境調節された顕微鏡（ライカ社製ＤＭＩ６０００；３７℃、５％大気ＣＯ２）に移した。５領域／ウェルをそれぞれ１分間光刺激した（サッター社製３００ＷのＬａｍｂｄａ ＤＧ−４；セムロック社製５０４／１２ｎｍバンドパスフィルター；１０×０．３０ＮＡ対物レンズ）；３ウェル／条件。インキュベート後（ｃＡＭＰ／ｃＧＭＰ：２０分間；ＩＰ１：１時間）、細胞を溶解し、ＨＴＲＦ（シスバイオ社（ＣｉｓＢｉｏ）製）およびＢｉｏｔｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ４リーダーで解析した。
【００６６】
免疫組織化学および共焦点分析
インビボ刺激後、刺激終了９０分後に、氷冷した４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）のＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）をマウスの心臓に灌流した。脳を取り出し、４％ＰＦＡ中で一晩固定し、その後、３０％スクロースのＰＢＳ溶液中で平衡化した。４０μｍ厚の冠状切片を凍結ミクロトーム上で切り出し、免疫組織化学用に処理するまで抗凍結剤中で４℃にて保存した。フリーフローティング切片をＰＢＳ中で洗浄した後、０．３％のＴｘ１００および３％の正常ロバ血清（ＮＤＳ）中で３０分間インキュベートした。急性スライス実験では、刺激直後に、２７５μｍ厚のスライスを、氷冷した４％ＰＦＡ中で１時間固定し、０．５％のＴｘ１００および３％のＮＤＳと共にインキュベートした。ＭＡＰＫアッセイでは、ＨＥＫ２９３細胞の刺激直後に、カバーガラスを１５分間固定し、０．６％のＨ２Ｏ２と共にインキュベートし、その後、０．１％のＴｘ１００を含む３％ＮＤＳで透過処理した。マウス抗ＧＡＤ６７ １：５００、マサチューセッツ州ビルリカのミリポア社製；ウサギ抗ｃｆｏｓ １：５００、カリフォルニア州サンディエゴのカルバイオケム社（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）製；ウサギ抗リン酸化ＣＲＥＢ Ｓｅｒ１３３ １：５００、ミリポア社製について、一次抗体のインキュベートを０．０１％のＴｘ１００および３％のＮＤＳ中で一晩行った。切片を洗浄し、ＦＩＴＣまたはＣｙ５（ペンシルベニア州ウェストグローブのジャクソン・ラボラトリー（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）製）にコンジュゲートした二次抗体（１：１０００）と共に室温で３時間インキュベートした。ＤＡＰＩ（１：５０，０００）と２０分間インキュベートした後、切片を洗浄し、ＰＶＤ−ＤＡＢＣＯと一緒に顕微鏡用スライドにマウントした。残りの一次抗体オーバーナイトインキュベート物（ウサギ抗リン酸化Ｅｒｋ１／２；抗リン酸化ＭＡＰＫ ｐ３８ １：５００、ウィスコンシン州マディソンのプロメガ社製；マウスモノクローナル抗ドーパミンＤ１受容体 １：５０、ケミコン社（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）製；ウサギポリクローナル抗ドーパミンＤ２受容体 １：５０、ミリポア社製；ヤギポリクローナル抗コリンアセチルトランスフェラーゼ １：２００、ミリポア社製）はその後、ビオチン化二次抗体（１：５００、ジャクソン・ラボラトリー製）とのインキュベート、アビジン−ビオチン−西洋ワサビペルオキシダーゼ処理（ＡＢＣキット、カリフォルニア州バーリンゲームのベクター・ラボ社（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）製）、およびＴＳＡ検出（コネティカット州シェルトンのパーキンエルマー社製）を、メーカーの取扱説明書に従い行った。
【００６７】
２０×／０．７０ＮＡまたは４０×／１．２５ＮＡの油浸対物レンズを用いてライカ社製ＴＣＳ ＳＰ５走査型レーザー顕微鏡上で共焦点蛍光画像を得た。１つの条件につき、カニューレ管の下５００μｍの領域内で４つの連続スタック画像を得た。ＤＡＰＩ染色で核を可視化し、Ｖｏｌｏｃｉｔｙ（インプロビジョン社（Ｉｍｐｒｏｖｉｓｉｏｎ）製）ソフトウェアを用いてｃｆｏｓまたはｐＣＲＥＢの免疫反応性の平均ピクセル強度を求めた。陽性またはｐＣＲＥＢ活性の細胞を強度閾値に基づき同定し、実験条件を隠して（ｂｌｉｎｄ）画像の取得および解析を行った。
【００６８】
【表１】
【００６９】
【表２】
【００７０】
【表３】
【００７１】
したがって、本発明の実施形態は、細胞内シグナル伝達の光遺伝学的制御に関し、行動中の哺乳動物内でインビボで作用し且つ非常に低い暗所活性を有しつつ、時間精度を得ることおよび天然受容体下流の複雑に絡み合った複数のシグナル伝達分子を動員するのに有用であり、したがって他の手法の個々のプラス面の多くを１つの技術中で統合するのに有用である。同様な実施形態では、無数の神経伝達物質および内分泌性ホルモン等のその他の調節物質により引き起こされる７回膜貫通依存性シグナル伝達経路の因果上の意義を直接探索する。別の実施形態では、興奮性の細胞を超えてｏｐｔｏＸＲ手法が用いられ、光ファイバーの深さのターゲティングと光遺伝学的にターゲティングされる光感受性とを多用途に統合することの利点を活かす。そのような実施形態の１つは、多様な非興奮性組織における時間的に正確な生化学的シグナル伝達の因果上の意義を探索することに関する。
【００７２】
本発明の実施形態は、種々のリガンドが集合（ｅｎｓｅｍｂｌｅ）受容体コンホメーション状態を安定化させることで代替的な伝達カスケードと共役した受容体の細胞内作用にバイアスをかけることができる、リガンドバイアスシグナル伝達現象の考察に関する。ｏｐｔｏＸＲは、薬理学的操作と同様なレベルで代替的なカスケードを誘導するように用いられる（例えばｏｐｔｏ−β２ＡＲは、野生型β２ＡＲへの天然リガンドの作用と同様な変化をＭＡＰＫ活性化に誘導することができる）。しかし個々のｏｐｔｏＸＲは、リガンドバイアスシグナル伝達に寄与するコンホメーション状態の全ての制御を常に可能にするとは限らない。レチナールを基にしたツールは、哺乳動物組織中に内因性発色団が存在し、暗所での活性が非常に低いため、特に有用であり得る。光遺伝学は、速い単一成分レチナール結合モジュールに連結された多様なエフェクターの形態を取ることができ、光学の有する時間的精度を利用できる。
【００７３】
本発明の実施形態は、微生物オプシンによる戦略を補完するｏｐｔｏＸＲによる方法を利用し、行動下の哺乳動物中で作動可能で、速く且つターゲティング可能な別次元の細胞制御を提供する。
【００７４】
本発明の別の実施形態によれば、異なる作用スペクトルを有する公知のオプシン遺伝子に基づいて波長をシフトさせたタイプのｏｐｔｏＸＲが使用される。そのようなｏｐｔｏＸＲは、生化学的および電気的制御の分離可能なチャネルを提供するのに特に有用であり得る。
【００７５】
本明細書に記載した特定のタンパク質配列のバリアントも本発明の実施形態に沿っている。一部のバリアントはこれらのタンパク質配列に約７５％超の相同性を有し、別のものは約８０％、８５％、または９０％超の相同性を有する。いくつかの実施形態では、相同性は約９３〜約９５、または約９８％と高い。本発明の組成物には、本明細書に記載したタンパク質配列および核酸配列が含まれ、記載した配列に約５０％を超える相同性を有するバリアントから１００％の相同性を有するバリアントまで含まれる。
【００７６】
本明細書に記載した種々の実施形態は、正常な作動および疾患状態の両方における神経回路の更に洗練されたインタロゲーションおよびリバースエンジニアリングのために速い回路読取り技術と統合され得る。
【００７７】
前述した種々の実施形態は単に例として記載したものであり、本発明を限定するものと解釈されるべきではない。前述の説明および例示に基づき、本明細書に例示および記載された例示的な実施形態および応用例に厳密に従わなくとも本発明に種々の修正および変更を加えることができることが当業者には容易に理解されよう。例えば、そのような変更には、産生されるセカンドメッセンジャーのバリエーションが含まれ得る。そのような修正および変更は、添付の特許請求の範囲に記載されている本発明の真の精神および範囲から逸脱しない。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞中でセカンドメッセンジャーを生成する方法であって、
キメラ光応答性ロドプシン系膜タンパク質を発現するためのヌクレオチド配列を１または複数の異種受容体サブユニットで改変すること；および
光に応答してセカンドメッセンジャーを産生させるために、前記光応答性膜タンパク質を細胞中で発現させること、
を含む、方法。
【請求項２】
前記１または複数の異種受容体サブユニットがアドレナリン受容体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記キメラ光応答性ロドプシン系膜タンパク質が７回膜貫通型タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記セカンドメッセンジャーが、ｃＡＭＰ、環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）、イノシトール三リン酸／イノシトール１，４，５−三リン酸／トリホスホイノシトール（ＩＰ３）、およびアラキドン酸のいずれかである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記発現工程がインビボでなされる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記発現工程がインビトロでなされる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記発現した光応答性膜タンパク質を光刺激する工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
細胞内メッセンジャーに関連する推定治療レジメンの効力を評価する方法であって、
キメラ光応答性ロドプシン系膜タンパク質を発現するためのヌクレオチド配列を１または複数の異種受容体サブユニットで改変すること；
光に応答してセカンドメッセンジャーを産生させるために、前記光応答性膜タンパク質を細胞中で発現させること；
前記タンパク質を光にさらすこと；および
治療効果を評価すること、
を含む、方法。
【請求項９】
１または複数の異種受容体サブユニットを有するキメラ光応答性ロドプシン系膜タンパク質を発現する細胞。
【請求項１０】
前記１または複数の異種受容体サブユニットが、アルファ１およびベータ２の少なくとも一方のアドレナリン受容体である、請求項９に記載の細胞。
【請求項１１】
１または複数の異種受容体サブユニットを有するキメラ光応答性膜ロドプシン系タンパク質を発現するためのヌクレオチド配列。
【請求項１２】
配列番号１または配列番号３に示すヌクレオチド配列およびその点突然変異体。
【請求項１３】
配列番号２または配列番号４に示すアミノ酸およびその点突然変異体を発現する細胞。
【請求項１】
細胞中でセカンドメッセンジャーを生成する方法であって、
キメラ光応答性ロドプシン系膜タンパク質を発現するためのヌクレオチド配列を１または複数の異種受容体サブユニットで改変すること；および
光に応答してセカンドメッセンジャーを産生させるために、前記光応答性膜タンパク質を細胞中で発現させること、
を含む、方法。
【請求項２】
前記１または複数の異種受容体サブユニットがアドレナリン受容体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記キメラ光応答性ロドプシン系膜タンパク質が７回膜貫通型タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記セカンドメッセンジャーが、ｃＡＭＰ、環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）、イノシトール三リン酸／イノシトール１，４，５−三リン酸／トリホスホイノシトール（ＩＰ３）、およびアラキドン酸のいずれかである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記発現工程がインビボでなされる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記発現工程がインビトロでなされる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記発現した光応答性膜タンパク質を光刺激する工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
細胞内メッセンジャーに関連する推定治療レジメンの効力を評価する方法であって、
キメラ光応答性ロドプシン系膜タンパク質を発現するためのヌクレオチド配列を１または複数の異種受容体サブユニットで改変すること；
光に応答してセカンドメッセンジャーを産生させるために、前記光応答性膜タンパク質を細胞中で発現させること；
前記タンパク質を光にさらすこと；および
治療効果を評価すること、
を含む、方法。
【請求項９】
１または複数の異種受容体サブユニットを有するキメラ光応答性ロドプシン系膜タンパク質を発現する細胞。
【請求項１０】
前記１または複数の異種受容体サブユニットが、アルファ１およびベータ２の少なくとも一方のアドレナリン受容体である、請求項９に記載の細胞。
【請求項１１】
１または複数の異種受容体サブユニットを有するキメラ光応答性膜ロドプシン系タンパク質を発現するためのヌクレオチド配列。
【請求項１２】
配列番号１または配列番号３に示すヌクレオチド配列およびその点突然変異体。
【請求項１３】
配列番号２または配列番号４に示すアミノ酸およびその点突然変異体を発現する細胞。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２０１１−５２３８５１（Ｐ２０１１−５２３８５１Ａ）
【公表日】平成２３年８月２５日（２０１１．８．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５１１８４４（Ｐ２０１１−５１１８４４）
【出願日】平成２１年５月２９日（２００９．５．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４５６１１
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１４８９４６
【国際公開日】平成２１年１２月１０日（２００９．１２．１０）
【出願人】（５０３１１５２０５）ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティ (69)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年８月２５日（２０１１．８．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年５月２９日（２００９．５．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４５６１１
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１４８９４６
【国際公開日】平成２１年１２月１０日（２００９．１２．１０）
【出願人】（５０３１１５２０５）ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティ (69)
【Ｆターム（参考）】
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