セラミドキナーゼ様タンパク質
配列番号１から９のポリヌクレオチドによってコード化されるセラミド様タンパク質およびその使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、タンパク質のような有機化合物、たとえばセラミドキナーゼ様タンパク質に関する。
【０００２】
スフィンゴ脂質は、細胞膜の主要な構成要素の１つであると考えられている。近年の証拠で、それらの構造的な役割を越えて、それらが生物活性脂質として作用し得ること、そしてシグナル伝達に影響を及ぼし得ることが、グリセロリン脂質によって生じること連想させる方法で、示されている。
スフィンゴ脂質代謝の生理学的活性は、たとえばアポトーシスの誘導および細胞増殖の刺激を含み、スフィンゴ脂質を代謝する酵素が様々な疾患の誘導に加わっていると予期されることが示唆される。
【０００３】
たとえば；
−細胞機構を制御するセラミドは、上記酵素反応における調節物質であると示唆されている、たとえばHannun, Y.A. et al, TIBS 20, 73−77 (1995)参照；
【０００４】
−Spiegel, S. et al, Curr.Opin.Cell.Biol. ８, 159-167 (1996)およびMathias S. et al, Science 259, 619-622 (1993)は、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βのような炎症性サイトカインの第２のメッセンジャーとして働くこと、そしてホスホリパーゼＡ２のようなアラキドン酸経路を活性化すること；したがって、セラミドは、炎症性障害において悪化因子として考えられ得ることが報告されている；
【０００５】
−セラミドは、ＨＩＶ感染患者においてアポトーシスおよび脳細胞のＨＩＶ感染に関連するＣＤ４＋Ｔ細胞の減少を悪化させる、たとえばColine M.G. et al, Proc.Assoc.Am.Physicians 109, 146-153 (1997)およびWilt S. et al, Ann. Neurol. 37, 381-394 (1995)参照；
【０００６】
−Begum N. et al, Eur.J.Biochem, 238, 214-220 (1996)およびHotamsligil, G.S. et al, Science, 271, 665-668 (1996)において、ＴＮＦ−αが２型糖尿病において引き金としてインシュリン耐性を引き起こし得ること、そしてセラミドが肥満におけるＴＮＦ−αの下方制御に関与することが報告された；
【０００７】
−Beuttler B. et al, J.Cardiovasc.Pharmacol. 25, S1-S8 (1995)において、セラミドがリポポリサッカリドによって引き起こされる敗血症の誘因であることが開示されている；
【０００８】
−Schissel, S.L. et al in J.Clin.Invest., 1455-1464 (1996)によると、セラミドの上昇は、アテローム性動脈硬化症の誘因であるＬＤＬの凝集反応におけるスフィンゴミエリナーゼを活性化する；
【０００９】
−Michael J.M. et al, Cancer Res., 57, 3600-3605 (1997)、Bose R. et al, Cell, 82, 405-414 (1995)およびJaffrezou, J.P. et al, EMBO J., 15, 2417-2424 (1996)から、セラミドが放射線療法および化学療法においてがん細胞のアポトーシスを促進することが知られている；
【００１０】
−Itoh M. et al, Clinical Cancer Res. 8, 415-23 (2003)によって、セラミド制御が白血病細胞の薬剤耐性に関与すること：セラミドレベルの減少が白血病において化学耐性状態と関係することが示されている。
【００１１】
また、セラミドキナーゼの作用により、たとえばＮ−ヘキサノニル−、Ｎ−オクタノイル−、Ｎ−パルミトイル−Ｄ−エリスロ−スフィンゴシンのようなＮ−アシル化−Ｄ−エリスロ−スフィンゴシンを含む、様々なセラミド誘導体の１位での、たとえばヒドロキシル基のリン酸化により、セラミドから生産されるセラミド−１−リン酸（Ｃｅｒ−１−Ｐ）は、生理学的活性を示し、たとえば；
【００１２】
−カルシウム刺激によりセラミドキナーゼによって生産される−Ｃｅｒ−１−Ｐは、脳シナプスから神経伝達物質の放出を調節し（たとえばBajjalieh S.M. et al,J.Biol.Chem.264, 14354-14360 (1989)参照）、したがって、セラミドキナーゼの作用の調節は、たとえばアルツハイマー病を含む様々な神経性疾患の処置において価値があると期待される；
【００１３】
−Ｃｅｒ−１−Ｐは、Gomez−Munoz A. et al, J. Lipid Res. 45, 99-105により証明されるように、おそらく酸スフィンゴミエリナーゼの阻害を介して、様々な正常のセラミド活性を阻害すると信じられており（たとえばDressler K.A. et al, J.Biol.Chem. 265, 14917-14921 (1990)参照）、したがって、Ｃｅｒ−１−Ｐは、様々な障害、たとえば慢性関節炎、ＨＩＶ−感染、インシュリン耐性が引き金となって起こる２型糖尿病、敗血症およびアテローム性動脈硬化症を含む、たとえば炎症性障害を、調節、たとえば抑制すると期待される；すなわち、セラミドキナーゼの活性化により、かかる疾患が処置され得ると信じられている；
【００１４】
−Ｃｅｒ−１−Ｐは、主として細胞内で作用し、そこで小胞移動を容易にすると信じられている。それは食作用に関係し、したがって、炎症プロセスで重要な役割を果たし得る（Hinkovska−Galcheva V.T. et al, J. Biol. Chem 273, 33203-9 (1998)）；
【００１５】
−外から加えられたＣｅｒ−１−Ｐのマイトジェン活性も示されている（Gomez−Munoz A. et al Biochem J 325, 435-40 (1997)）。したがって、このスフィンゴ脂質代謝は、限るものではないが、がんおよび乾癬を含む細胞増殖性障害に関係し得る。
【００１６】
−Ｃｅｒ−１−Ｐは、Pettus, B.J. et al, J. Biol. Chem. 278, 38206-13 (2003)によって、サイトカイン−およびカルシウムイオノフォア−誘導アラキドン酸放出を仲介すると報告されており、そしてこのグループはさらにＣ−１−Ｐが細胞質性ＰＬＡ２を直接活性化し得ることを示し（Pettus, B.J. et al, J. Biol. Chem 279, 11320-6, 2004）、そしてこれは炎症性障害におけるＣｅｒ−１−Ｐの可能性のある役割のさらなる証拠である；
【００１７】
−Ｃｅｒ−１−Ｐレベルはまた、Tuson M. et al, Am.J.Hum.Genet. 74:128-38 (2004)によって示唆されたとおり、視覚系の病態生理学（たとえば網膜色素変性感受性）に関係し得る。
【００１８】
我々は、本発明においてセラミドキナーゼ様タンパク質をコード化するポリヌクレオチド（遺伝子）を発見した。
【００１９】
ある局面において本発明は、配列番号１配列の単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００２０】
我々はまた、配列番号１配列のポリヌクレオチドの５’または３’非翻訳領域をそれぞれ構成する、配列番号２配列のポリヌクレオチドおよび配列番号３配列のポリヌクレオチドを見出した。配列番号１、配列番号２および配列番号３配列のポリヌクレオチドの合計は、配列番号４配列のポリヌクレオチドの３２０３ｂｐのｃＤＮＡを提供する。
【００２１】
他の局面において本発明は
−配列番号２、
−配列番号３、または
−配列番号４
配列の単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００２２】
我々はまた、たとえば配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８および配列番号９配列のポリヌクレオチドの、配列番号１配列のポリヌクレオチドの様々な変異体を見出し、我々は、それは配列番号１配列のポリヌクレオチドのスプライス変異体であると見出した。
【００２３】
他の局面において本発明は、
−配列番号５、
−配列番号６、
−配列番号７、
−配列番号８、または
−配列番号９
配列の単離されたポリヌクレオチドのような、配列番号１配列のポリヌクレオチドのスプライス変異体である、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００２４】
単離されたポリヌクレオチドとは、該ポリヌクレオチドがその天然の環境から単離されていることを意味する。
【００２５】
我々は、配列番号１配列の遺伝子またはポリヌクレオチドが、セラミドキナーゼ様タンパク質をコード化するためのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を提供すること、たとえば配列番号１配列のポリヌクレオチドのスプライス変異体がかかるタンパク質の一部をコード化することを見出した。我々はさらに、本発明に記載のセラミドキナーゼ様タンパク質がセラミドキナーゼの機能を有することを推定した。
【００２６】
他の局面において本発明は、
−配列番号１、
−配列番号５、
−配列番号６、
−配列番号７、
−配列番号８、または
−配列番号９
配列のポリヌクレオチドによってコード化されるセラミドキナーゼ様タンパク質、たとえば、それぞれが配列番号１配列のポリヌクレオチドによってコード化されるセラミドキナーゼ様タンパク質の一部である、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８および配列番号９のポリヌクレオチドによってコード化されるセラミドキナーゼ様タンパク質を提供する。
【００２７】
我々は、
−配列番号１配列のポリヌクレオチドが配列番号１０配列のポリペプチドをコード化する、
−配列番号５配列のポリヌクレオチドが配列番号１１配列のポリペプチドをコード化する、
−配列番号６配列のポリヌクレオチドが配列番号１２配列のポリペプチドをコード化する、
−配列番号７配列のポリヌクレオチドが配列番号１３配列のポリペプチドをコード化する、
−配列番号８配列のポリヌクレオチドが配列番号１４配列のポリペプチドをコード化する、および
−配列番号９配列のポリヌクレオチドが配列番号１５配列のポリペプチドをコード化する
ことを見出した。
【００２８】
他の局面において本発明は、
−配列番号１０、
−配列番号１１、
−配列番号１２、
−配列番号１３、
−配列番号１４、または
−配列番号１５
配列の単離されたポリペプチドを提供する。
【００２９】
本発明のポリヌクレオチドは、本明細書中で「本発明（に記載）の遺伝子」と表す。セラミド自体またはセラミドの代謝物をリン酸化することができる、本発明の遺伝子によってコード化されるセラミドキナーゼ様タンパク質は、本明細書中で「本発明（に記載）のセラミドキナーゼ様タンパク質」と表す。
【００３０】
本発明の遺伝子は、配列番号１の核酸配列、およびたとえばその対立遺伝子変異体、ならびにそれらの相補配列；およびたとえば、本発明の遺伝子の核酸配列とたとえばストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドをたとえば含む、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８または配列番号９配列のポリヌクレオチドのような、そのスプライス変異体を含む。たとえば、本発明の遺伝子のヌクレオチド配列は、たとえば遺伝子コードの冗長（縮重）の結果として、本発明の遺伝子の配列とは異なるが、また、たとえば同じ生物学的活性を有する本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質、たとえばその一部をコード化するか、またはたとえば、少なくとも８０％、たとえば８０％から１００％、たとえば９０％、たとえば９５％、たとえば９７％たとえば９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、本発明のアミノ酸のセラミドキナーゼ様タンパク質をコード化する；該同一性は、ｎａ＝ｘａ−（ｘａ．ｙ）（ここで、ｎａはアミノ酸変化の数であり、ｘａは該対応するアミノ酸配列のアミノ酸の全数であり、そしてｙは１００で割ったパーセント同一性である）により計算され、かつ同じ生物学的活性を有する；本発明の遺伝子の対立遺伝子変異体またはスプライス変異体で生産された本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質を含む。
【００３１】
「同一性」は、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の同一性の指標であり、そしてたとえば常套の方法による技術によって、たとえば商業的に入手可能なたとえばコンピュータープログラムによって、計算され得る。「ストリンジェント条件」は、本発明の遺伝子のヌクレオチド配列とハイブリダイズする対応するポリヌクレオチドとの間に、少なくとも８０％、たとえば９０％、たとえば９５％、９７％または９９％の同一性が存在するときのみ、ハイブリダイゼーションが起こるであろうことを含む。
【００３２】
本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質は、本発明の、たとえば配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４または配列番号１５配列のポリペプチドのような、セラミドキナーゼ様タンパク質の一部を含む、たとえば配列番号１０の遺伝子によってコード化されるアミノ酸配列を有する、および、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列と、少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、ポリペプチドを含む。
【００３３】
本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質は、「成熟」ポリペプチドの形態であり得、またはより大きなポリペプチド、たとえば融合タンパク質の一部であり得；たとえば、それは、分泌またはリーダー配列、プロ配列、多ヒスチジン残基のような精製を補助する配列、または本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質のポリペプチドへの組み換え生産の間の安定性のための付加的配列を含む、付加的アミノ酸配列を含むのに有利であり得る。
【００３４】
本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質はまた、本発明のポリヌクレオチドのスプライス変異体によってコード化されるような本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質のポリペプチドのポリペプチドフラグメントを含む。かかるポリペプチドフラグメントは、本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質のポリペプチドのアミノ酸配列の全部ではなく一部と、全体として同じであるアミノ酸配列を有するポリペプチドであることを意味する。かかるポリペプチドフラグメントは、「独立（free-standing）」であり得、またはかかるポリペプチドフラグメントが一部または領域、最も好ましくは単一連続領域として形成する、大きなポリペプチドの一部であり得る。最も好ましくは、かかるポリペプチドフラグメントが対応する本発明のセラミドキナーゼの生物学的活性を、少なくとも一部は保持している。
【００３５】
本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質のポリペプチドはまた、本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質の定義されたポリペプチド（フラグメント）配列の変異体を含む。好ましい変異体は、保存的アミノ酸置換によって指示対象から変化しているもの、たとえば残基が生物学的機能において類似の特徴の他のものによって置換されている変異体である。
【００３６】
「ポリヌクレオチド」は、他に記載がない限り、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを含み、これは、未修飾ＲＮＡまたはＤＮＡであり得、または修飾ＲＮＡまたはＤＮＡであり得、１本鎖および２本鎖ＲＮＡならびに１本鎖および２本鎖領域の混合物であるＲＮＡを制限なく含む。「ポリペプチド」は、他に記載がない限り、ペプチド結合によって互いに結合したアミノ酸を含む、任意のペプチドまたはタンパク質を含む。単離されたポリペプチドは、該ポリペプチドがその天然の環境から単離されていることを意味する。
【００３７】
本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質を、常套の方法と同様に、たとえば本発明の遺伝子を含む脳細胞のｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡライブラリーからの標準的クローニングを使用して、得ることができる。
【００３８】
本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質をコード化するポリヌクレオチドを、脳ｃＤＮＡライブラリーから得る。我々は、コンピューター内で（in silico）同定された全推定オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をカバーするようにプライマーを設計し、そしてＯＲＦを増幅するため、ポリメラーゼ連鎖反応に該プライマーを使用した。我々は、予期する大きさを有するフラグメントを得、そして我々は予期した配列を確認し、さらに我々が様々なスプライス変異体を検出することを可能にするクローニングおよびシークエンシングを行った。既知のセラミドキナーゼ（受託番号ＡＢ０７９０６６）との配列比較により、我々は、たとえば相同性の考慮により、本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質が、ジアシルグリセロールキナーゼドメイン含有酵素スーパーファミリーのセラミドキナーゼサブファミリーの新規メンバーであると結論づけた。
【００３９】
本発明の遺伝子を、本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質の組み換え生産のために使用し得る。配列番号１のポリヌクレオチドは、成熟した本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質のための配列をコード化するため、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、そしてたとえば、所望により、他のコード配列、たとえばリーダーまたは分泌配列、プレ−またはプロ−またはプレプロ−タンパク質配列、または他の融合ペプチド部分をコード化するものを含み得る。
【００４０】
たとえば、本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質を含む縮合ポリペプチドの精製を容易にし得るマーカー配列を、コード化することができる。該マーカー配列は、適当なマーカー配列、たとえば常套のマーカー配列、たとえばｐＱＥベクター（Qiagen, Inc.）において提供され、Gentz et al, Proc Natl Acad Sci USA (1989)86:821-824に記載されているヘキサヒスチジンペプチド、またはＨＡタグを含み得る。本発明に記載の任意のポリヌクレオチドはまた、非コード５’および３’配列（たとえば配列番号４配列のポリヌクレオチド）、たとえば転写、非転写配列、スプライスおよびポリアデニル化シグナル、リボソーム結合部位およびｍＲＮＡを安定化する配列を含み得る。
【００４１】
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドを発現することを意図した宿主細胞を、遺伝子操作（形質転換、形質移入）するために使用し得るベクターへと、導入し得る。
【００４２】
他の局面において本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含んでなるベクターを提供する。
【００４３】
本発明の遺伝子を含むベクターを、適当に、たとえば常套の方法にしたがって、生産することができる。適当なベクターを、適当に、たとえば常套の方法にしたがって、得ることができる。本発明の遺伝子を含むベクターは、たとえば適合性の宿主細胞のような宿主細胞において、組み換え的に本発明の遺伝子によってコード化される本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質を生産することができる発現系を得るのに有用であり得る。たとえば、本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質の組み換え生産のために、宿主細胞を、宿主細胞へと本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質を発現するための発現系、またはたとえばその一部を導入するため、たとえば本発明の遺伝子を含むベクターの使用によって遺伝子操作することができる。無細胞翻訳系はまた、たとえば本発明に記載のポリヌクレオチドを含むＤＮＡ作成物に由来するＲＮＡを使用して、たとえば常套の方法と同様に、本発明の遺伝子を生産するために使用することができる。
【００４４】
他の局面において本発明は、該発現系またはその一部が適合性の宿主細胞中に存在するとき、該発現系またはその一部が該本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質を生産することができる、たとえば予め単離された、本発明のポリヌクレオチド、たとえばＤＮＡまたはＲＮＡを含む発現系を提供する。
【００４５】
他の局面において本発明は；
−本発明に記載の発現系を含んでなる宿主細胞；
−本発明に記載のセラミドキナーゼ様タンパク質を生産する方法であって、本発明に記載の発現系を含む単離された宿主細胞を本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質の生産に十分な条件下で培地中で培養すること、および該培地から本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質を回収、たとえば単離することを含んでなる方法；
−本発明に記載のセラミドキナーゼ様タンパク質を生産する組み換え宿主細胞の生産方法であって、宿主細胞が適当な培養条件下で本発明に記載のセラミドキナーゼ様タンパク質を生産するように、本発明に記載の発現系で宿主細胞を形質導入または形質移入することを含んでなる方法；ならびに
−宿主細胞が適当な培養条件下で本発明に記載のセラミドキナーゼ様タンパク質を生産するように、本発明に記載の発現系で宿主細胞を形質導入または形質移入することによって生産された組み換え宿主細胞
を提供する。
【００４６】
宿主細胞へのポリヌクレオチドの導入は、適切に、たとえば常套の方法と同様に、たとえばDavis et al, BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1986); Sambrook et al, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)に記載のように、たとえばリン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン介在トランスフェクション、ベクター導入（transvection）、マイクロインジェクション、陽イオン脂質介在トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質伝達、スクレイプローディング（scrape loading）、バリスティック・イントロダクション（ballistic introduction）または感染により、なされ得る。宿主細胞は容易に見出され得る。適当な宿主細胞の例は、たとえば、連鎖球菌（streptococci）、ブドウ球菌（staphylococci）、大腸菌（E. coli）、ストレプトマイセス属（Streptomyces）および枯草菌（Bacillus subtilis）細胞のような細菌細胞；酵母細胞およびコウジカビ属（Aspergillus）細胞のような真菌細胞；ショウジョウバエ（Drosophila）Ｓ２およびシロイチモンジョトウ（Spodoptera）Ｓｆ９細胞のような昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、ＣＣＬ３９、３Ｔ３、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞のような単離された動物細胞；ならびに植物細胞を含む。
【００４７】
適当な発現系は、たとえば染色体性、エピソーム性およびウイルス由来系、たとえば細菌性プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、イーストエピソーム、挿入因子、イースト染色体因子、ならびにバキュロウイルス、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、ワクチンウイルス、アデノウイルス、禽ジフテリア（fowl pox）ウイルス、仮性狂犬病（pseudorabies）ウイルスおよびレトロウイルスのようなウイルスに由来するベクター、ならびにそれらの組合せに由来するベクター、たとえばプラスミドおよびバクテリオファージ遺伝因子、たとえばコスミドおよびファージミドに由来するものを含む。発現系は、発現を制御ならびに発生させる調節領域を含み得る。一般的に、宿主においてポリペプチドを生産させるために維持、繁殖または発現させるのに適した任意の系またはベクターを使用し得る。適当なヌクレオチド配列を、適当に、たとえば常套の方法と同様に、たとえばSambrook et al, MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL （supra）に記載のとおりに、発現系へと挿入し得る。
【００４８】
本発明に記載のセラミドキナーゼ様タンパク質を、組み換えＴ細胞培養物から適当に、たとえば常套の方法と同様に、たとえば界面活性剤抽出、超遠心分離、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、たとえば高速液体クロマトグラフィーを含む方法で、回収（単離）し得る。本発明に記載のセラミドキナーゼ様タンパク質が単離およびまたは精製の間に変性するとき、活性コンホメーションの再生、たとえば変性ポリペプチドの再折りたたみが、適当に、たとえば常套の方法と同様に行われ得る。
【００４９】
本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質は、いくつかの局面において、様々な疾患、たとえば神経性障害、炎症性障害、たとえば乾癬、ＨＩＶ感染、たとえばインシュリン耐性が引き金となって起こる２型糖尿病、肥満、敗血症、アテローム性動脈硬化症、がん、およびたとえば網膜色素変性症を含む疾患に対する医薬的標的を提供する。たとえば、セラミドキナーゼの活性化により、かかる疾患が処置され得ることは合理的である。処置は、処置および予防を含む。セラミドキナーゼはまた、試料においてセラミドの量を検出および／または定量するための方法において有用であり得る。本発明の遺伝子のスプライス変異体は、全長セラミドキナーゼ様タンパク質のスクリーニングに、およびたとえば診断用試薬として有用であり得る。配列番号６において報告されたもののような、スプライス変異体は、酵素ドメインを有するが、基質特異的または細胞内局在の基礎をなす制御領域が存在し得るＣ末端が失われた欠失酵素を生産するであろう。あるいは、本発明のヌクレオチドのかかるより短い形態は、アッセイ開発により好適であり得る。たとえば配列番号７のスプライス変異体は、より短いであろうし、キナーゼ活性が欠け得、そして優性ネガティブ変異体として作用することができた。
【００５０】
たとえば、本発明の遺伝子（スプライス変異体のようなフラグメント）または本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質（フラグメント）を、研究試薬として、ならびに動物およびヒトの疾患の処置および診断の発見用ツールとして使用し得る。
【００５１】
他の局面において本発明は、診断用試薬としての本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは抗体の使用を提供する。
【００５２】
機能障害と関係する本発明の遺伝子の変異形態の検出は、たとえば診断アッセイにおいて、対応する遺伝子またはその変異形の発現の減少、過剰発現または変化した発現の結果である、疾患または疾患に対する感受性の診断に加え得るかまたは診断を定義し得る、診断ツールを提供するであろう。対応する遺伝子において変異を有する個体は、ＤＮＡレベルで、たとえば常套の方法と同様に検出され得る。これは、たとえば付加的エキソンに隣接する繰り返しＤＮＡ配列（付随ＤＮＡ）の２つの伸長を有する、配列番号６のスプライス変異体によって説明され得る。
【００５３】
診断用核酸を、対象の細胞、たとえば血液、尿、唾液、組織生検または剖検材料から得ることができる。該ゲノムＤＮＡを、直接検出のために使用することができ、あるいは、分析の前にＰＣＲまたは他の増幅技術を使用して酵素的に増幅することができる。ＲＮＡまたはｃＤＮＡをまた、同様に分析において使用することができる。欠失および挿入を、正常遺伝子型との比較において増幅産物の大きさの変化によって検出することができる。点変異は、増幅ＤＮＡが本発明の標識遺伝子ヌクレオチド配列とハイブリダイズすることによって同定され得る。好ましくは、マッチした配列をＲＮａｓｅ分解によってもしくは融解温度の差によってミスマッチ２本鎖と区別し得る。ＤＮＡ配列差はまた、分解剤を含むまたは含まないゲル中でのＤＮＡフラグメントの電気泳動移動度の変化によって、またはたとえば Myers et al, Science (1985) 230:1242に記載のとおりに直接ＤＮＡシーケンシングすることによって、検出し得る。特定の位置における配列の変化はまた、ヌクレアーゼ保護アッセイ、たとえばＲＮａｓｅおよびＳ１保護、またはたとえばCotton et al, Proc Natl Acad Sci USA (1985) 85: 4397-4401に記載の化学的切断法によって、明らかとなり得る。本発明の遺伝子ヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドプローブのアレイまたはそのフラグメントを、たとえば遺伝子変異の効果的なスクリーニングを行うために構築し得る。たとえば、アレイ技術法を、たとえばM. Chee et al, Science, Vol 274, pp 610-613,1996に記載の、遺伝子発現、遺伝子結合、および遺伝的変異性を含む分子遺伝学における様々な問題を解決するために使用し得る。
【００５４】
診断アッセイは、たとえば炎症性障害、たとえば慢性関節炎、乾癬を含む、たとえば神経性障害、ＨＩＶ−感染、インシュリン耐性が引き金となって起こる２型糖尿病、肥満、敗血症、アテローム性動脈硬化症（artheroscleorosis）、がんを含む、およびたとえば網膜色素変性症を含む、セラミドキナーゼ様タンパク質の作用が介在する疾患を診断するかまたは感受性を決定するための方法を提供する。
【００５５】
かかる疾患を、たとえば常套の方法と同様に、たとえば、
−本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質、
−セラミド−１−リン酸のようなかかるセラミドキナーゼ様タンパク質の２次代謝物、または関連脂質代謝物−リン酸
−本発明の、遺伝子ｍＲＮＡ
の異常に上昇または減少したレベルを対象由来の試料から測定することを含む方法によって、診断し得る。
【００５６】
上昇したまたは減少した発現レベルは、ＲＮＡレベルで、たとえばポリヌクレオチドの定量のための常套の方法と同様に、たとえばＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮａｓｅ保護、ノーザンブロッティングおよび他のハイブリダイゼーション法を含む方法で、決定され得る。本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質のようなタンパク質のレベルを決定するために、または宿主に由来する試料におけるかかるセラミドキナーゼ様タンパク質の２次代謝物を測定するために使用し得るアッセイ技術は、適当に、たとえば常套の方法と同様に、行い得る。かかるアッセイ技術は、ラジオイムノアッセイ、競合的結合アッセイ、ウェスタンブロット分析、ＥＬＩＳＡ、およびたとえば蛍光法、質量分析、クロマトグラフィーを含む、２次代謝物、たとえばセラミド−１−リン酸の量を検出するための方法を含む。
【００５７】
他の局面において本発明は、たとえば炎症性障害、たとえば慢性関節炎、乾癬を含む、たとえば神経性障害、ＨＩＶ−感染、インシュリン耐性が引き金となって起こる２型糖尿病、肥満、敗血症、アテローム性動脈硬化症（artheroscleorosis）、がんを含む、およびたとえば網膜色素変性症を含む、疾患または疾患に対する感受性の診断キットであって、主な要素として；
ａ）たとえばその対立遺伝子変異体またはそのフラグメントを含む、本発明の遺伝子（ポリヌクレオチド）；またはそのスプライス変異体、または
ｂ）（ａ）のものと相補的なヌクレオチド配列、または
ｃ）本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質、または
ｄ）本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質に対する抗体
を含んでなる診断キット、
たとえば（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）が実質的要素を構成し得て、たとえば
−試料の適当な環境、
−試験される試料においてａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）のいずれかの効果を測定するための適当な方法
を含む、任意のかかるキット
を提供する。
【００５８】
本発明の遺伝子はまた、染色体同定のために有用であり得る。該配列は特異的に標的化され、そして特定の位置で個々のヒト染色体にハイブリダイズできる。本発明に記載の染色体への対応する配列のマッピングは、それらの配列と遺伝子関連疾患を関係づける重要な最初のステップである。一度配列が正確な染色体の位置にマッピングされると、染色体上の配列の物理的な位置を遺伝子マップデータと相関させ得る。関連するデータはたとえばV. McKusick, Mendelian Inheritance in Man （Johns Hopkins University Welch Medical Libraryを通じてオンラインで入手可能）にたとえば開示されている。遺伝子と、同じ染色体領域にマッピングされた疾患の間の関係は、連鎖解析（物理的に隣接する遺伝子の共同遺伝）によって同定され得る。罹患したおよび罹患しなかった個体の間のｃＤＮＡまたは遺伝子における差も決定することができる。罹患した個体の一部または全てに変異が観察されるが、正常個体のいずれにも観察されないとき、該変異は該疾患の原因因子である可能性がある。
【００５９】
本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質、またはそのフラグメント、または本発明のポリペプチドを発現する細胞はまた、本発明のセラミドキナーゼポリペプチドについて免疫特異的な抗体を生産するための免疫原として使用され得る。「免疫特異的」との用語は、該抗体が、他の関連ポリペプチドへのそれらの親和性よりも該ポリペプチドに実質的により大きな親和性を有することを意味する。かかるポリペプチドに対して発生する抗体は、たとえば該ポリペプチドまたはエピトープ担持フラグメントアナログまたは細胞を動物に、好ましくはヒト以外に、ルーチンプロトコルを使用して投与することによって得られ得る。モノクローナル抗体の製造のために、たとえば連続細胞株培養によって生産される抗体を提供する適当な技術は、たとえばハイブリドーマ技術（Kohler, G. and Milstein, C., Nature (1975) 256:495-497)、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Kozbor et al, Immunology Today (1983) 4:72)およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術(Cole et al, MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp. 77-96, Alan R. Liss, Inc., 1985)を含む技術を使用し得る。１本鎖抗体の生産のための技術(たとえば U.S. Pat. No. 4,946,778)はまた、本発明に記載のポリペプチドに対する１本鎖抗体を生産するために採用され得る。また、トランスジェニックマウス、または他の哺乳類を含む他の生物は、ヒト化抗体を発現させるために使用され得る。上記抗体は、たとえば本発明に記載のポリペプチドを発現するクローンの単離または同定において、またはアフィニティークロマトグラフィーによる本発明に記載のポリペプチド（フラグメント）の精製のために、使用され得る。
【００６０】
他の局面において本発明は、本発明のセラミドキナーゼ様ポリペプチドに対する抗体を提供する。
【００６１】
本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質は、たとえば上記のような多くの病因を含む多くの生物学的機能に関与し得る。したがって、
−たとえば２次代謝物を生産するための本発明のセラミドキナーゼ、
−セラミドキナーゼ発現を刺激するための本発明の遺伝子の発現
を刺激する（アゴニスト）かまたは、
−たとえば２次代謝物の生産を減少または阻害するための本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質の活性
−本発明の遺伝子の発現
を減少または阻害する（アンタゴニスト）
化合物／薬剤を見出すことが望まれる。
【００６２】
したがって、本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質またはたとえばColigan et al, Current Protocols in Immunology 1(2):Chapter 5 (1991)に記載のその機能的模倣物は、アゴニストまたはアンタゴニストの本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質のポリペプチドのレセプター部分への、たとえば細胞、無細胞調製物、化学ライブラリーおよび天然産物混合物中で、たとえばスクリーニングアッセイ中での結合を評価するために使用され得る。
かかるアゴニストおよびアンタゴニストを、疾患、たとえば炎症性障害、たとえば慢性関節炎、乾癬を含む、たとえば神経性障害、ＨＩＶ−感染、インシュリン耐性が引き金となって起こる２型糖尿病、肥満、敗血症、アテローム性動脈硬化症（artheroscleorosis）、がんを含む、およびたとえば網膜色素変性症の処置において使用し得る。
【００６３】
スクリーニング方法は、セラミドキナーゼが発現される適当な細胞の生産を含み得る。適当な細胞は、たとえば哺乳類、酵母、ショウジョウバエ由来の細胞を含む。本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質を発現する細胞（または発現キナーゼを含む細胞膜）は、結合、または機能的応答の刺激もしくは阻害を観察するために、候補化合物と接触させ得る。
【００６４】
スクリーニングアッセイは候補化合物の結合を試験するために使用され得、ここで、該レセプターを有する細胞への接着は、候補化合物と直接または間接に関係する標識の手段により、または標識された競合物質との競合を含むアッセイにおいて検出され得る。活性化の阻害剤は、既知のアゴニストの存在下において、および不存在下において、アッセイされ得る。スクリーニングアッセイは、混合物を形成するために候補化合物と本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質を含む溶液を混合するステップ、混合物における該セラミドキナーゼ様タンパク質の活性を測定するステップ、および混合物の活性を標準の活性と比較するステップを含み得る。本発明の遺伝子（ｃＤＮＡ）、本発明に記載のセラミドキナーゼ様タンパク質のポリペプチドおよび本発明のかかるポリペプチドに対する抗体はまた、候補化合物の、細胞中の該遺伝子（ｍＲＮＡ）および該ポリペプチドの生産における効果を検出するためのスクリーニングアッセイを提供するために使用され得る。たとえばＥＬＩＳＡは、該ポリペプチドの細胞関連レベルを決定するために、たとえば常套の方法にしたがってモノクローナルまたはポリクローナル抗体を使用して構成され得、そしてＥＬＩＳＡは、該ポリペプチドの生産または活性を上昇または阻害し得る薬剤（アゴニストまたはアンタゴニスト）を好適に操作された細胞または組織から発見するために使用され得る。スクリーニングのためのアッセイは、たとえば常套の方法にしたがって行われ得る。
【００６５】
可能性のある本発明の遺伝子のアゴニスト（アンタゴニスト）の例は、抗体、またはある場合において、オリゴヌクレオチドまたは該遺伝子のリガンド（該遺伝子のポリペプチドと結合したアゴニスト（アンタゴニスト））と密接に関係したタンパク質、たとえば該リガンドのフラグメント、または本発明の遺伝子産物と結合するが応答を誘導しない小分子、または該レセプターの活性が阻害されるような本発明の遺伝子の変異形態の産物を含む。
【００６６】
可能性のある本発明に記載のアゴニスト（アンタゴニスト）の例は、たとえばオリゴヌクレオチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、模倣物、小分子、たとえば低分子量化合物（ＬＭＷ’ｓ）を含む、本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質のポリペプチドと結合する化合物を含む。
【００６７】
したがって他の局面において、本発明は、セラミドキナーゼ様タンパク質のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストを同定するためのスクリーニングアッセイを提供し、このアッセイは、主な要素として
ａ）本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質のポリペプチド、または
ｂ）ポリペプチドａ）を発現する組み換え細胞、または
ｃ）ａ）に記載のポリペプチドを発現する細胞膜、または
ｄ）ポリペプチドａ）に対する抗体；
およびたとえば候補化合物と接触させるための手段；
およびたとえば候補化合物のａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）のいずれかに対する効果を測定するための手段、たとえば候補化合物の存在下および不存在下におけるａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）のいずれかの活性の比較によって；
たとえば、候補化合物の存在下で、ポリペプチドａ）の生産およびまたは生物学的活性に減少または増加が存在するかどうかを決定するための手段；
を含み、
【００６８】
そして他の局面において、
本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質の生産および／または生物学的活性を上昇または減少させる、たとえばリガンド、レセプター、抗体またはＬＭＷ’ｓを含む、アゴニストまたはアンタゴニストを同定する方法であって、
Ａ）
ａ）本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質のポリペプチド、または
ｂ）ポリペプチドａ）を発現する組み換え細胞、または
ｃ）ポリペプチドａ）を発現する細胞膜、または
ｄ）ポリペプチドａ）に対する抗体
を、候補化合物と接触させること、
Ｂ）ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）のいずれかにおける候補化合物の効果を測定すること；
たとえば候補化合物の存在下および不存在下におけるａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）のいずれかの活性の比較によって、
たとえば、候補化合物の存在下で、ポリペプチドａ）の生産およびまたは生物学的活性に減少または増加が存在するかどうかを決定すること；
Ｃ）ステップＢ）で測定されたアゴニストまたはアンタゴニストを選択すること、
たとえば、アゴニスト／アンタゴニスト効果がステップＢ）で明確に測定された適当な候補化合物を選択すること
を含む方法
を提供する。
【００６９】
任意のかかるスクリーニングアッセイにおいて、ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）が実質的な要素を構成し得ることは、理解されるであろう。候補化合物は、ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）のいずれかに対する効果は未知であるが、期待され得る化合物（ライブラリー）を含み得る。化合物（ライブラリー）は、上記で本発明に記載のポリペプチドに対するアゴニスト（アンタゴニスト）として列記された化合物を含む。アゴニスト（アンタゴニスト）は、上記のａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）のいずれかに対する効果がスクリーニングアッセイにおいて、またはアゴニスト（アンタゴニスト）を同定する方法において見出された候補化合物である。アゴニスト（アンタゴニスト）は本発明に記載のポリペプチドの生産およびまたは生物学的活性を減少または上昇させ得る。
【００７０】
他の局面において本発明は、該アゴニストまたはアンタゴニストが本発明のアゴニストまたはアンタゴニストを同定する方法によって提供できることを特徴とする、本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニスト、好ましくはアンタゴニストを提供する。
【００７１】
本発明に記載のポリペプチドのアゴニスト（アンタゴニスト）を、疾患、たとえば炎症性障害、たとえば慢性関節炎、乾癬を含む、たとえば神経性障害、ＨＩＶ−感染、インシュリン耐性が引き金となって起こる２型糖尿病、肥満、敗血症、アテローム性動脈硬化症（artheroscleorosis）、がんを含む、およびたとえば網膜色素変性症の処置において使用し得る。したがって、本発明に記載のポリペプチドのアゴニスト（アンタゴニスト）は、医薬として有用であり得る。
【００７２】
他の局面において本発明は、たとえば疾患、たとえば炎症性障害、たとえば慢性関節炎、乾癬を含む、たとえば神経性障害、ＨＩＶ−感染、インシュリン耐性が引き金となって起こる２型糖尿病、肥満、敗血症、アテローム性動脈硬化症（artheroscleorosis）、がんを含む、およびたとえば網膜色素変性症の処置において医薬として使用するための、本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニスト、
ならびに他の局面において、
たとえば本発明のアゴニストまたはアンタゴニストが好適である疾患の処置のための、医薬として使用するための、本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質可溶形態
を提供する。
【００７３】
本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質のアゴニストまたはアンタゴニストを、医薬組成物の形態で投与することができる。
【００７４】
他の局面において本発明は、
−該アンタゴニストまたはアゴニストが本発明のアゴニストまたはアンタゴニストを同定する方法によって提供できることを特徴とする、有効成分としての本発明のアゴニストまたはアンタゴニストを、薬学的に許容される賦形剤と組合せて含む医薬組成物；
−本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質の可溶形を有効成分として、薬学的に許容される賦形剤と組合せて含む医薬組成物
を提供する。
【００７５】
かかる医薬組成物を、適当に、常套の方法に、たとえばしたがって、たとえば準じて、たとえばステップＡ）、Ｂ）およびＣ）の方法によって得られたアゴニスト（アンタゴニスト）を賦形剤と混合することにより、およびたとえばさらに得られた混合物を適当な投与形の医薬組成物を得るために処理することにより、生産することができる。
【００７６】
さらなる局面において本発明は、かかる処置を必要とする対象に、セラミドキナーゼ様タンパク質が介在する異常な状態を処置する方法、
たとえば炎症性障害、たとえば慢性関節炎、乾癬、たとえば神経性障害、ＨＩＶ−感染、インシュリン耐性が引き金となって起こる２型糖尿病、肥満、敗血症、アテローム性動脈硬化症（artheroscleorosis）、がんを含む、およびたとえば網膜色素変性症の処置方法であって、上記ステップＡ）、Ｂ）およびＣ）の方法によって提供され得る本発明のアゴニストまたはアンタゴニストの治療上有効量を、たとえば薬学的に許容される賦形剤と組合せて投与することを含んでなる方法；
またはたとえば薬学的に許容される賦形剤と組合せて、たとえば医薬組成物の形態で、たとえば、本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質の可溶形態の治療上有効量を投与することを含んでなる方法；
を提供する。
【００７７】
本発明の医薬組成物を、任意の常套の経路、たとえば経鼻、頬側、直腸、経口を含む、たとえば経腸投与；たとえば静脈内、筋肉内、皮下を含む、非経腸投与；またはたとえば皮膚上、鼻腔内、気管内を含む、局所的投与によって、たとえば被覆または非被覆錠剤、カプセル剤、（注射可能な）溶液、固溶体、懸濁液、分散液、固体分散液の形態で；たとえばアンプル、バイアルの形態で、クリーム、ゲル、ペースト、吸入粉末、泡、チンキ、リップスティック、ドロップ、スプレーの形態で、または座薬の形態で、投与し得る。
【００７８】
本発明の医薬組成物の好ましい全身投与の形態は、注射、典型的には静脈内注射を含む。皮下、筋肉内、または腹腔内のような他の注射経路を使用することができる。全身投与の他の手段は、たとえば胆汁塩またはフシジン酸または他の界面活性剤のような浸透剤を使用した経粘膜および経皮投与を含む。さらに、経腸またはカプセル化製剤に適当に製剤したときは、経口投与も可能であり得る。本発明に記載の組成物の投与はまた、局所および／または局部であり得る。
【００７９】
かかる処置のために、適当な投与量は、もちろん、たとえば、使用される本発明の化合物の化学的性質および薬物動態データ、個々の宿主、投与の形態、処置される症状の性質および重さ、ならびに本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質のポリペプチドまたは本発明のアゴニスト（アンタゴニスト）のどちらが有効成分として使用されるかに依存して変化するであろう。しかし、一般的に、大型の哺乳類、たとえばヒトにおいて満足のいく結果のために、必要な日投与量は、約０．１ｍｇから約１５００ｍｇ（約１０μｇ／体重ｋｇから２０ｍｇ／体重ｋｇ）の範囲である。しかし、必要な投与量の変化は、利用できる化合物の多様性および様々な投与経路における有効性の違いの観点から予期され得る。たとえば、経口投与は、静脈内注射による投与量よりも高い投与量が要求されることが予期されるであろう。これらの投与レベルにおける変化は、適当に、たとえば最適化のための標準的経験的慣例によって調整され得る。
【００８０】
処置において使用されるポリペプチドはまた、たとえばかかる処置を必要とする対象内で、たとえば上記のとおり、しばしば「遺伝子治療」と呼ばれる処置モダリティーにおいて、内生的に生産され得る。したがって、たとえば、対象由来の細胞をＤＮＡまたはＲＮＡのようなポリヌクレオチドでエクスビボで操作し、たとえばレトロウイルスプラスミドベクターを使用することによって、本発明に記載のポリペプチドをコード化することができる。操作された細胞を、かかる処置を必要とする対象に導入することができる。
【００８１】
以下の実施例において、全ての温度は摂氏度であり、未補正である。
使用した略語
ＰＣＲ ポリメラーゼ連鎖反応
ＯＲＦ オープンリーディングフレーム
【実施例】
【００８２】
実施例１
ヒトセラミドキナーゼと相同性を有するｃＤＮＡクローンについての調査は、ＮＣＢＩデータベースの２つのクローン、ＢＣ０２０４６５およびＸＭ＿０８７１５３からの部分的な情報に基づく。それらのアセンブリは、セラミドキナーゼ様タンパク質をコードするための推定ＯＲＦが検出されるポリヌクレオチドを生産できることを予期させる。該配列は、ヒト染色体２から十分に回収される。
【００８３】
実施例２
相同性
配列相同性は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムおよびＧＡＰ ＧＣＧソフトウェアを使用して調査される。本明細書中に記載のＯＲＦが、セラミドキナーゼとヌクレオチドレベルで４５．６６２％相同性、およびアミノ酸レベルで３３．８７１％類似性（２４．７９８％相同性）を有することを決定した（受託番号ＡＢ０７９０６６、およびJ Biol Chem, 2002, vol 277, 23294-300参照）。セラミドキナーゼのように、本発明のＯＲＦ（遺伝子）の推定アミノ酸配列は、ＤＡＧＫ様ドメインを示す。興味深いことに、様々な種のセラミドキナーゼにおいて十分保存されており、スフィンゴシンキナーゼコンセンサス配列において見出されないタンパク質配列の伸長はまた、本発明のＯＲＦから推測されるタンパク質配列において存在する。したがって、本発明のＯＲＦによってコード化されるタンパク質が「セラミドキナーゼ様タンパク質」であることが、合理的に予期される。
ＢＬＡＳＴ調査はまた、本発明のＯＲＦがラットおよびマウスにおけるオルトログを有する可能性を示す。
【００８４】
実施例３
クローニング
以下のオリゴヌクレオチドはＯＲＦを増幅するために設計されている：
５’ｃｃａｇｃｃｔｇｃｇａｃｔｃｃｇｃｃａｔｇｃｃｃ３’および５’ｔｔａｃｔｔｔｇｇａａｔｃａｔｔｔｃｔｔｃｃａｔｇｃｔｔｃｃｔｃｃ３’。
２５μｌのＰＣＲ反応を、２．５μｌヒト脳ｃＤＮＡ（Marathon brain cDNA library, Clontech）、４００ｍＭの上記オリゴヌクレオチドのそれぞれ、Ａｄｖａｎｔａｇｅ２ＰＣＲポリメラーゼ（Clontech）で、以下の増幅パラメーター：
９４°にて５分、９４°にて３０秒を５サイクル、６５°にて３０秒、６８°にて３分３０秒、９４°にて３０秒を２５サイクル、５８°にて３０秒、６８°にて３分３０秒、次いで最終伸長ステップとして６８°にて５分
を使用して行う。これは、ＭＪ ＰＴＣ−２００熱循環器で実現する。結果を１％アガロースゲル（SeaPlaque GTG agarose, Cambrex）で分析する。３つの分離したバンドが、１．６−２．４ｋｂ範囲に観察される。それらを切り出し、それらのＤＮＡ内容物を抽出する（MinEluteゲル抽出キット, Qiagen）。ＤＮＡを、Ａ付加後（A-addition kit, Qiagen）直接ｐＣＲ４−ＴＯＰＯ（Invitrogen）においてクローニングするか、またはＣＡＣＣ配列をＤＮＡフラグメントの５’末端で付加するよう設計された後のＰＣＲの後にｐＥＮＴＲ／ＳＤ／Ｄ−ＴＯＰＯ（Invitrogen）においてクローニングする。この付加的ＰＣＲを以下のプライマー：
５’ｃａｃｃａｔｇｃｃｃｔｇｇａｇｇａｇｇｃｇｃａｇｇ３’および５’ｔｔａｃｔｔｔｇｇａａｔｃａｔｔｔｃｔｔｃｃａｔｇｃｔｔｃｃｔｃｃ３’
で、次のサイクルパラメーター：
９４°にて２分、５回：９４°にて１０秒、７２°にて４分、５回：９４°にて１０秒、６９°にて４分、２３回：９４°にて１０秒、６７°にて４分、次いで最終伸長ステップとして５分、７２°
にしたがって行う。増幅ＤＮＡを１％アガロースゲルで回収し、さらに上記のとおりに精製する。
【００８５】
ＴＯＰＯクローニング反応を製造業者（Invitrogen）の指示書にしたがって行う。２μｌの各ＴＯＰＯ反応混合物を使用して、製造業者（Invitrogen）の指示書にしたがって５０μｌのＴＯＰ１０大腸菌を形質転換する。組み換えクローンをＬＢ＋カナマイシンで選択する。プラスミドをＱｉａｇｅｎのミニプレップ法にしたがって製造する。
【００８６】
実施例４
発現
発現調査を、ヒトRAPID−SCAN Gene Expression panel （OriGene）および以下のオリゴヌクレオチド；
５’ａｃａｔｔｇｃａｃａｔｔａｔａａｔｇｇｇｇｃａｔｇｔａｃａｇｃｔｇｇｔｃｇ３’および５’ｇｔｔａｃｔｔｔｇｇａａｔｃａｔｔｔｃｔｔｃｃａｔｇｃｔｔｃｃｔｃｃ３’を、上記ＰＣＲプログラム２番で使用したＰＣＲによって行う。発現は組織特異性であることが判明し、副腎、腎臓、睾丸および肺では強い量の、胎児肝臓、胎児脳、脳、脾臓、前立腺、骨髄および胃では中程度の量の、筋肉、甲状腺、膵臓およびＰＢＬでは少量の、ならびに皮膚、小腸、心臓、結腸、胎盤、唾液、卵巣および子宮では検出されないレベルである。他のＰＣＲベース実験は、セラミドキナーゼ様ｍＲＮＡはまた気管および脊髄において発現されることを見出した。タグ化融合タンパク質のインビトロ翻訳後の放射線標識ポリペプチドの検出は、ウェスタンブロットによって行い得る。
【００８７】
実施例５
細胞内分画
Ｃ末端フラグタグを有するセラミドキナーゼ様タンパク質の発現後の細胞分画において、該タンパク質を細胞質ゾルから、ならびに細胞膜周辺分画で、また、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００不溶性物質として回収することができる。
【００８８】
実施例６
細胞内局在化
ＣＯＳ−１細胞において発現されたＧＦＰタグ化組み換えタンパク質を使用して、該セラミドキナーゼ様タンパク質は細胞質および核内で見出され、とりわけそれは核小体へと局在化し得た。
【００８９】
実施例７
ＣＯＳ−１細胞中の組み換え過剰発現タンパク質を使用して、セラミドキナーゼ様タンパク質がリン酸分子を主にスレオニン残基に含むことを見出す。
【００９０】
実施例８
様々な基質、たとえばジアシルグリセロール、スフィンゴシン、Ｃ２−、Ｃ６−、Ｃ８−、Ｃ１６−、Ｃ１８−セラミドのアッセイは、セラミドキナーゼ様タンパク質の活性を示さない。また、一時的にセラミドキナーゼ様タンパク質および３２Ｐで標識したパルスを発現するＣＯＳ−１細胞内で、特異的リン脂質は検出することができない。おそらく、本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質は、これに限るものではないがコファクターの補助のような活性を示すために、特定の条件が必要である可能性がある。
【００９１】
配列表:
配列番号１のポリヌクレオチド
ATGCCCTGGAGGAGGCGCAGGAACCGGGTGAGTGCCCTGGAGGGCGGCCGGGAGGAAGAGGCGCCCCCGGAGGCTGCCGCTGTGCCTCCGGCGCTGTTAACGTCCCCGCAGCAGACGGAGGCGGCGGCCGAGCGGATTCTGCTCCGGGGCATCTTCGAGATCGGGAGGGACAGTTGTGACGTGGTGCTGAGCGAGCGAGCACTGCGGTGGCGGCCCATTCAGCCCGAGCGCCCGGCGGGTGATTCTAAGTATGACTTGCTATGTAAAGAAGAATTTATTGAACTCAAAGACATATTCTCTGTGAAACTGAAACGGCGTTGTTCTGTTAAACAGCAGAGAAGTGGTACTTTATTAGGTATCACACTCTTCATCTGCTTGAAAAAGGAACAAAATAAACTAAAGAATTCTACACTTGATCTTATTAATTTAAGTGAAGACCACTGTGACATATGGTTTAGACAGTTCAAGAAAATATTGGCAGGCTTTCCAAACAGACCGAAGTCATTAAAAATACTCCTTAACCCCCAAAGTCACAAAAAAGAAGCTACCCAGGTTTATTATGAGAAGGTTGAACCTCTGTTGAAGCTTGCAGGAATAAAAACTGATGTAACAATAATGGAATATGAAGGGCACGCTCTGTCACTGCTTAAGGAATGTGAACTCCAGGGATTTGATGGTGTTGTCTGTGTTGGTGGAGATGGATCTGCTAGCGAAGTAGCCCATGCTTTGCTTCTGAGAGCTCAGAAGAATGCTGGGATGGAAACAGACCGAATCCTGACTCCTGTCAGAGCACAGCTTCCACTTGGCTTAATACCAGCAGGATCTACCAATGTATTGGCACATTCTCTTCATGGAGTTCCTCATGTGATAACTGCAACATTGCACATTATAATGGGGCATGTACAGCTGGTCGACGTCTGCACCTTCAGCACCGCTGGCAAGCTTCTTCGCTTTGGGTTCTCAGCCATGTTTGGCTTTGGTGGAAGAACTTTGGCTCTGGCAGAAAAATATCGATGGATGTCCCCTAACCAACGGAGAGATTTTGCTGTTGTTAAGGCACTGGCAAAACTTAAGGCAGAAGACTGTGAAATATCATTTTTACCATTTAACAGCTCTGATGATGTGCAAGAAAGGAGGGCACAGGGATCTCCCAAATCTGACTGTAATGATCAATGGCAAATGATCCAGGGTCAGTTCTTGAATGTCAGCATTATGGCAATTCCTTGCCTGTGTTCAGTGGCACCTAGAGGCTTGGCACCTAATACCAGATTAAATAATGGAAGTATGGCTCTTATAATTGCCCGAAACACTTCTCGGCCAGAATTTATAAAACACCTGAAAAGATATGCCAGTGTAAAAAATCAGTTCAATTTTCCATTTGTTGAGACTTACACTGTTGAGGAAGTAAAAGTTCATCCAAGGAATAATACTGGTGGATATAATCCAGAGGAGGAGGAGGATGAAACTGCTTCAGAAAATTGTTTCCCTTGGAATGTAGATGGTGATTTAATGGAAGTTGCATCAGAGGTCCATATTAGATTGCATCCAAGACTTATCAGTCTTTATGGAGGAAGCATGGAAGAAATGATTCCAAAGTAA
配列番号２のポリヌクレオチド
CCAGCCTGCGACTCCGCC
配列番号３のポリヌクレオチド
CATGTAATTGTTTCTAAAAGAAATGTACAAACTAGAATTTTAATATAAAGAAATGTGGCCATGCTTTAAACCTGTGGTCCCCACCCTTTTTGGGACCAGTTTCATGGAAGACAATTTTTCTGTGGATGGGGGAATGGTTTCAGGATGAACTGTTCCACCTCAGATCATCGGGCATTAGATTCTCTTGAGGAACATGGCACTCTAGATCCCTCACATACCAGTTCACCATATGGTTCGCACTTCTATGAGAATCTAATGCTGCTGCTGATCTGACAGGGGGAGGAACTCAGTAATGCTCCATTGCTCTAACCTCCTGCTGTGTGGCCAAACGGATATCCTAATAGAAATTGATGTTACTAACAATTAGCCTCTAGGGCTTTAAAAGTCAAGATGAAATATCAAAGTCAAGATGAAATATCAATTCAAATTCTGTTTTTAGATATCAATTCAAATTCTTTTTTTTACAATGTGTTTATTGGACACACAAAAAAACTTTGCAACCATCATAATACATCAATATTTAACCTAGATAATTCTGAAATAATTTGGATTCTTTCATTTTCAGGATTTGAGCTCATCAATTATGTTAAATTTCCTATATTCTGTTACAAATATAATACAGATTTCATAAGTCTGCCTTGATTCACTGCTCCCTAATCCAGAGCAGTTAAATTTCAAAATCACATAGTTATATAGCCTACCTGCCAAAAAAGAATAACCCATCCCTGTCTTCTTAAAGTGGTAGGGTTTTAAAATTCATGATACAAGTAACAAAGTAAGTTGATAACAAATACTATTTTGAACTGGACAAAATCTAGCCCAATATGTAATTGTGTTCCCCTTGTATCTGAGAGGCCTGTGTTGGACAACCATAGTACTCTGCTTTCACTGTGCTCAAATAACCTGAAATATATAGTTGTTTCTGAGTAGTTCTGAGTAGGAAAGAACCAAATGTAAATTTCCTTAGAGACCATCCTGGAGAAGACAGTTCTAAATCGGGGCTTGATTTTTCATCTATGATCCTAGATGTTCTCCTGAAAGAATGACTAGCCTTTTTATAACGATACAAAGTTTTTTAAAAATACATAAATGTCATAAAGTTTATTCCTGTGTATACACACTCTGGGTTCAGGAGGTTTTGTGCTTACATTTCACTACTCAAATGCCTTCGCAAATTTCAGAACATTCCTCACCATCACTGCAGGCCTGTGAACAGATAACTTTCATCAATTAGGATGGCTGGCTAGTGGCAGGGACTTCATATAAAGAAATCTTTCCCAGAATTGTTTTTCCACATTGCCTTCTAATTTGATCACTCCCTATAACAGATGTTCAAAATTCGGCCACAGCTCTCTTATGAAGACAGAGTCAGATAAAATGATATTCTGCAATTATCTAGATCATAAGCATAAAATAAATATTACAAAAATGATTGTATTTAAAGAAATTTTTTAAAATCCAGAAAGTCATTTAAAATAGAACCTCATATAGTATGAACAAACTATAAAAATATTTTACATTTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCGGCCGCTGAATTCTAGACCTGCCCGGGCGGCCGCTCGA
配列番号４のポリヌクレオチド
CCAGCCTGCGACTCCGCCATGCCCTGGAGGAGGCGCAGGAACCGGGTGAGTGCCCTGGAGGGCGGCCGGGAGGAAGAGGCGCCCCCGGAGGCTGCCGCTGTGCCTCCGGCGCTGTTAACGTCCCCGCAGCAGACGGAGGCGGCGGCCGAGCGGATTCTGCTCCGGGGCATCTTCGAGATCGGGAGGGACAGTTGTGACGTGGTGCTGAGCGAGCGAGCACTGCGGTGGCGGCCCATTCAGCCCGAGCGCCCGGCGGGTGATTCTAAGTATGACTTGCTATGTAAAGAAGAATTTATTGAACTCAAAGACATATTCTCTGTGAAACTGAAACGGCGTTGTTCTGTTAAACAGCAGAGAAGTGGTACTTTATTAGGTATCACACTCTTCATCTGCTTGAAAAAGGAACAAAATAAACTAAAGAATTCTACACTTGATCTTATTAATTTAAGTGAAGACCACTGTGACATATGGTTTAGACAGTTCAAGAAAATATTGGCAGGCTTTCCAAACAGACCGAAGTCATTAAAAATACTCCTTAACCCCCAAAGTCACAAAAAAGAAGCTACCCAGGTTTATTATGAGAAGGTTGAACCTCTGTTGAAGCTTGCAGGAATAAAAACTGATGTAACAATAATGGAATATGAAGGGCACGCTCTGTCACTGCTTAAGGAATGTGAACTCCAGGGATTTGATGGTGTTGTCTGTGTTGGTGGAGATGGATCTGCTAGCGAAGTAGCCCATGCTTTGCTTCTGAGAGCTCAGAAGAATGCTGGGATGGAAACAGACCGAATCCTGACTCCTGTCAGAGCACAGCTTCCACTTGGCTTAATACCAGCAGGATCTACCAATGTATTGGCACATTCTCTTCATGGAGTTCCTCATGTGATAACTGCAACATTGCACATTATAATGGGGCATGTACAGCTGGTCGACGTCTGCACCTTCAGCACCGCTGGCAAGCTTCTTCGCTTTGGGTTCTCAGCCATGTTTGGCTTTGGTGGAAGAACTTTGGCTCTGGCAGAAAAATATCGATGGATGTCCCCTAACCAACGGAGAGATTTTGCTGTTGTTAAGGCACTGGCAAAACTTAAGGCAGAAGACTGTGAAATATCATTTTTACCATTTAACAGCTCTGATGATGTGCAAGAAAGGAGGGCACAGGGATCTCCCAAATCTGACTGTAATGATCAATGGCAAATGATCCAGGGTCAGTTCTTGAATGTCAGCATTATGGCAATTCCTTGCCTGTGTTCAGTGGCACCTAGAGGCTTGGCACCTAATACCAGATTAAATAATGGAAGTATGGCTCTTATAATTGCCCGAAACACTTCTCGGCCAGAATTTATAAAACACCTGAAAAGATATGCCAGTGTAAAAAATCAGTTCAATTTTCCATTTGTTGAGACTTACACTGTTGAGGAAGTAAAAGTTCATCCAAGGAATAATACTGGTGGATATAATCCAGAGGAGGAGGAGGATGAAACTGCTTCAGAAAATTGTTTCCCTTGGAATGTAGATGGTGATTTAATGGAAGTTGCATCAGAGGTCCATATTAGATTGCATCCAAGACTTATCAGTCTTTATGGAGGAAGCATGGAAGAAATGATTCCAAAGTAACATGTAATTGTTTCTAAAAGAAATGTACAAACTAGAATTTTAATATAAAGAAATGTGGCCATGCTTTAAACCTGTGGTCCCCACCCTTTTTGGGACCAGTTTCATGGAAGACAATTTTTCTGTGGATGGGGGAATGGTTTCAGGATGAACTGTTCCACCTCAGATCATCGGGCATTAGATTCTCTTGAGGAACATGGCACTCTAGATCCCTCACATACCAGTTCACCATATGGTTCGCACTTCTATGAGAATCTAATGCTGCTGCTGATCTGACAGGGGGAGGAACTCAGTAATGCTCCATTGCTCTAACCTCCTGCTGTGTGGCCAAACGGATATCCTAATAGAAATTGATGTTACTAACAATTAGCCTCTAGGGCTTTAAAAGTCAAGATGAAATATCAAAGTCAAGATGAAATATCAATTCAAATTCTGTTTTTAGATATCAATTCAAATTCTTTTTTTTACAATGTGTTTATTGGACACACAAAAAAACTTTGCAACCATCATAATACATCAATATTTAACCTAGATAATTCTGAAATAATTTGGATTCTTTCATTTTCAGGATTTGAGCTCATCAATTATGTTAAATTTCCTATATTCTGTTACAAATATAATACAGATTTCATAAGTCTGCCTTGATTCACTGCTCCCTAATCCAGAGCAGTTAAATTTCAAAATCACATAGTTATATAGCCTACCTGCCAAAAAAGAATAACCCATCCCTGTCTTCTTAAAGTGGTAGGGTTTTAAAATTCATGATACAAGTAACAAAGTAAGTTGATAACAAATACTATTTTGAACTGGACAAAATCTAGCCCAATATGTAATTGTGTTCCCCTTGTATCTGAGAGGCCTGTGTTGGACAACCATAGTACTCTGCTTTCACTGTGCTCAAATAACCTGAAATATATAGTTGTTTCTGAGTAGTTCTGAGTAGGAAAGAACCAAATGTAAATTTCCTTAGAGACCATCCTGGAGAAGACAGTTCTAAATCGGGGCTTGATTTTTCATCTATGATCCTAGATGTTCTCCTGAAAGAATGACTAGCCTTTTTATAACGATACAAAGTTTTTTAAAAATACATAAATGTCATAAAGTTTATTCCTGTGTATACACACTCTGGGTTCAGGAGGTTTTGTGCTTACATTTCACTACTCAAATGCCTTCGCAAATTTCAGAACATTCCTCACCATCACTGCAGGCCTGTGAACAGATAACTTTCATCAATTAGGATGGCTGGCTAGTGGCAGGGACTTCATATAAAGAAATCTTTCCCAGAATTGTTTTTCCACATTGCCTTCTAATTTGATCACTCCCTATAACAGATGTTCAAAATTCGGCCACAGCTCTCTTATGAAGACAGAGTCAGATAAAATGATATTCTGCAATTATCTAGATCATAAGCATAAAATAAATATTACAAAAATGATTGTATTTAAAGAAATTTTTTAAAATCCAGAAAGTCATTTAAAATAGAACCTCATATAGTATGAACAAACTATAAAAATATTTTACATTTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCGGCCGCTGAATTCTAGACCTGCCCGGGCGGCCGCTCGA
配列番号５のポリヌクレオチド
CGCCCGGGCAGGTCTAGAATTCAGCGGCCGCTGAATTCTAGGGGGAGGAGGGGAGAACGGGGAGCGCACAGCCTGGACGCGTGCGCAGGCGTCAGGCGCATAGACCTGCTAGCCCCTCAGCTAGCGGCCCCGCCCGCGCTTAGCATCACTAACTGGGCTATATAACCTGAGCGCCCGCGCGGCCACGACACGAGGAATTCGCCCACGCAGGAGGCGCGGCGTCCGGAGGCCCCAGGGTTATGAGACTATCACTGCTCAGGACCTACTAACAACAAAGGTGATTCTAAGTATGACTTGCTATGTAAAGAAGAATTTATTGAACTCAAAGACATATTCTCTGTGAAACTGAAACGGCGTTGTTCTGTTAAACAGCAGAGAAGTGGTACTTTATTAGGTATCACACTCTTCATCTGCTTGAAAAAGGAACAAAATAAACTAAAGAATTCTACACTTGATCTTATTAATTTAAGTGAAGACCACTGTGACATATGGTTTAGACAGTTCAAGAAAATATTGGCAGGCTTTCCAAACAGACCGAAGTCATTAAAAATACTCCTTAACCCCCAAAGTCACAAAAAAGAAGCTACCCAGGTTTATTATGAGAAGGTTGAACCTCTGTTGAAGCTTGCAGGAATAAAAACTGATGTAACAATAATGGAATATGAAGGGCACGCTCTGTCACTGCTTAAGGAATGTGAACTCCAGGGATTTGATGGTGTTGTCTGTGTTGGTGGAGATGGATCTGCTAGCGAAGTAGCCCATGCTTTGCTTCTGAGAGCTCAGAAGAATGCTGGGATGGAAACAGACCGAATCCTGACTCCTGTCAGAGCACAGCTTCCACTTGGCTTAATACCAGCAGGATCTACCAATGTATTGGCACATTCTCTTCATGGAGTTCCTCATGTGATAACTGCAACATTGCACATTATAATGGGGCATGTACAGCTGGTCGACGTCTGCACCTTCAGCACCGCTGGCAAGCTTCTTCGCTTTGGGTTCTCAGCCATGTTTGGCTTTGGTGGAAGAACTTTGGCTCTGGCAGAAAAATATCGATGGATGTCCCCTAACCAACGGAGAGATTTTGCTGTTGTTAAGGCACTGGCAAAACTTAAGGCAGAAGACTGTGAAATATCATTTTTACCATTTAACAGCTCTGATGATGTGCAAGAAAGGAGGGCACAGGGATCTCCCAAATCTGACTGTAATGATCAATGGCAAATGATCCAGGGTCAGTTCTTGAATGTCAGCATTATGGCAATTCCTTGCCTGTGTTCAGTGGCACCTAGAGGCTTGGCACCTAATACCAGATTAAATAATGGAAGTATGGCTCTTATAATTGCCCGAAACACTTCTCGGCCAGAATTTATAAAACACCT
配列番号６のポリヌクレオチド
ATGCCCTGGAGGAGGCGCAGGAACCGGGTGAGTGCCCTGGAGGGCGGCCGGGAGGAAGAGGCGCCCCCGGAGGCTGCCGCTGTGCCTCCGGCGCTGTTAACGTCCCCGCAGCAGACGGAGGCGGCGGCCGAGCGGATTCTGCTCCGGGGCATCTTCGAGATCGGGAGGGACAGTTGTGACGTGGTGCTGAGCGAGCGAGCACTGCGGTGGCGGCCCATTCAGCCCGAGCGCCCGGCGGGTGATTCTAAGTATGACTTGCTATGTAAAGAAGAATTTATTGAACTCAAAGACATATTCTCTGTGAAACTGAAACGGCGTTGTTCTGTTAAACAGCAGAGAAGTGGTACTTTATTAGGTATCACACTCTTCATCTGCTTGAAAAAGGAACAAAATAAACTAAAGAATTCTACACTTGATCTTATTAATTTAAGTGAAGACCACTGTGACATATGGTTTAGACAGTTCAAGAAAATATTGGCAGGCTTTCCAAACAGACCGAAGTCATTAAAAATACTCCTTAACCCCCAAAGTCACAAAAAAGAAGCTACCCAGGTTTATTATGAGAAGGTTGAACCTCTGTTGAAGCTTGCAGGAATAAAAACTGATGTAACAATAATGGAATATGAAGAGCACGCTCTGTCACTGCTTAAGGAATGTGAACTCCAGGGATTTGATGGTGTTGTCTGTGTTGGTGGAGATGGATCTGCTAGCGAAGTAGCCCATGCTTTGCTTCTGAGAGCTCAGAAGAATGCTGGGATGGAAACAGACCGAATCCTGACTCCTGTCAGAGCACAGCTTCCACTTGGCTTAATACCAGCAGGATCTACCAATGTATTGGCACATTCTCTTCATGGAGTTCCTCATGTGATAACTGCAACATTGCACATTATAATGGGGCATGTACAGCTGGTCGACGTCTGCACCTTCAGCACCGCTGGCAAGCTTCTTCGCTTTGGGTTCTCAGCCATGTTTGGCTTTGGTGGAAGAACTTTGGCTCTGGCAGAAAAATATCGATGGATGTCCCCTAACCAACGGAGAGATTTTGCTGTTGTTAAGGCACTGGCAAAACTTAAGGCAGAAGACTGTGAAATATCATTTTTACCATTTAACAGCTCTGATGATGTGCAAGAAAGGTAGGTAAAAACCCAATGTAATACAGATAACCTGTATCTTTAAAGCATAAAACATTCTGACAAACAATTGATCAGACTTAGGATCTTTGGTTATTTTTCTAACATAGTAGTAAAGAATATAGAATCACAGACTCTTACAGGTCCTAGTAAGCAAACAACTACTCACTCAGCCTTTTTCTCTTTTTCCTTCCTTCTTTCCTCCCTTCCTTCCCCCTGTCTCTCCCTCCCTCCTTCCGTTCTCTTTTTCCCTTCCCTTCCCCTTTCTTTCCTTTCCTTTGTTTTTTTCCCTTTCTTTCCTTTTCCCTTTCCCTTTTCTTTTGAGTGCCTACTATATGCCAGGCACTTTGAATACAACAATGCACCAAAAAATTAACAAAACACACAGTTTTGTCCCTCGTGATAATTTTGGTCTAGTGTGTAATACAAATATTAAAGCCATATTAAAGAAGGGTTATAGTCTTTAAAGAAATAGTACATTATTATTCCTTATAATACTAGTTTACCTTTAAATGAATCAACACATTATGTTGGCAGCAACAAAATTGTACACGTTTTTACTTACTATCTAATTGAAGAAAGTATTTAACATATATAATGATGAGTTCTCTAATTTTCTCATATTTAATAGATTTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTCTGTGTGTCTGTGCGCGCGTTATCTGTTTTATGTCTTTGTTTTGTTTTCTTTCTTTTAGGAGGGCACAGGGATCTCCCAAATCTGGTGAGTCGAAAAGTATCTCCTTGAGAACTGTGCCAGGTTCTGTTGACATTTTGTTCTGGTGAGGGAAAATAACCAATCACTTTCATTACCTTTAGACTGTAATGATCAATGGCAAATGATCCAGGGTCAGTTCTTGAATGTCAGCATTATGGCAATTCCTTGCCTGTGTTCAGTGGCACCTAGAGGCTTGGCACCTAATACCAGATTAAATAATGGAAGTATGGCTCTTATAATTGCCCGAAACACTTCTCGGCCAGAATTTATAAAACACCTGAAAAGATATGCCAGTGTAAAAAATCAGTTCAATTTTCCATTTGTTGAGACTTACACTGTTGAGGAAGTAAAAGTTCATCCAAGGAATAATACTGGTGGATATAATCCAGAGGAGGAGGAGGATGAAACTGCTTCAGAAAATTGTTTCCCTTGGAATGTAGATGGTGATTTAATGGAAGTTGCATCAGAGGTCCATATTAGATTGCATCCAAGACTTATCAGTCTTTATGGAGGAAGCATGGAAGAAATGATTCCAAAGTAA
配列番号７のポリヌクレオチド
ATGCCCTGGAGGAGGCGCAGGAACCGGGTGAGTGCCCTGGAGGGCGGCCGGGAGGAAGAGGCGCCCCCGGAGGCTGCCGCTGTGCCTCCGGCGCTGTTAACGTCCCCGCAGCAGACGGAGGCGGCGGCCGAGCGGATTCTGCTCCGGGGCATCTTCGAGATCGGGAGGGACAGTTGTGACGTGGTGCTGAGCGAGCGAGCACTGCGGTGGCGGCCCATTCAGCCCGAGCGCCCGGCGGGTGATTCTAAGTATGACTTGCTATGTAAAGAAGAATTTATTGAACTCAAAGACATATTCTCTGTGAAACTGAAACGGCGTTGTTCTGTTAAACAGCAGAGAAGTGGTACTTTATTAGGTATCACACTCTTCATCTGCTTGAAAAAGGAACAAAATAAACTAAAGAATTCTACACTTGATCTTATTAATTTAAGTGAAGACCACTGTGACATATGGTTTAGACAGTTCAAGAAAATATTGGCAGGCTTTCCAAACAGACCGAAGTCATTAAAAATACTCCTTAACCCCCAAAGTCGCAAAAAAGAAGCTACCCAGGTTTATTATGAGAAGGTTGAACCTCTGTTGAAGCTTGCAGGAATAAAAACTGATGTAACAATGTTGTCTGTGTTGGTGGAGATGGATCTGCTAGCGAAGTAGCCCATGCTTTGCTTCTGAGAGCTCAGAAGAATGCTGGGATGGAAACAGACCGAATCCTGACTCCTGTCAGAGCACAGCTTCCACTTGGCTTAATACCAGCAGGATCTACCAATGTATTGGCACATTCTCTTCATGGAGTTCCTCATGTGATAACTGCAACATTGCACATTATAATGGGGCATGTACAGCTGGTCGACGTCTGCACCTTCAGCACCGCTGGCAAGCTTCTTCGCTTTGGGTTCTCAGCCATGTTTGGCTTTGGTGGAAGAACTTTGGCTCTGGCAGAAAAATATCGATGGATGTCCCCTAACCAACGGAGAGATTTTGCTGTTGTTAAGGCACTGGCAAAACTTAAGGCAGAAGACTGTGAAATATCATTTTTACCATTTAACAGCTCTGATGATGKGCAAGAAAGGAGGGCACAGGGATCTCCCAAATCTGACTGTAATGATCAATGGCAAATGATCCAGGGTCAGTTCTTGAATGTCAGCATTATGGCAATTCCTTGCCTGTGTTCAGTGGCACCTAGAGGCTTGGCACCTAATACCAGATTAAATAATGGAAGTATGGCTCTTATAATTGCCCGAAACACTTCTCGGCCAGAATTTATAAAACACCTGAAAAGATATGCCAGTGTAAAAAATCAGTTCAATTTTCCATTTGTTGAGACTTACACTGTTGAGGAAGTAAAAGTTCATCCAAGGAATAATACTGGTGGATATAATCCAGAGGAGGAGGAGGATGAAACTGCTTCAGAAAATTGTTTCCCTTGGAATGTAGATGGTGATTTAATGGAAGTTGCATCAGAGGTCCATATTAGATTGCATCCAAGACTTATCAGTCTTTATGGAGGAAGCATGGAAGAAATGATTGCAAAGAA
配列番号８のポリヌクレオチド
CCAGCCTGCGACTCCGCCATGCCCTGGAGGAGGCGCAGGAACCGGGTGAGTGCCCTGGAGGGCGGCCGGGAGGAAGAGGCGCCCCCGGAGGCTGCCGCTGTGCCTCCGGCGCTGTTAACGTCCCCGCAGCAGACGGAGGCGGCGGCCGAGCGGATTCTGCTCCGGGGCATCTTTGAGATCGGGAGGGACAGTTGTGACGTGGTGCTGAGCGAGCGAGCACTGCGGTGGCGGCCCATTCAGCCCGAGCGCCCGGCGGGTGATTCTAAGTATGACTTGCTATGTAAAGAAGAATTTATTGAACTCAAAGACATATTCTCTGTGAAACTGAAACGGCGTTGTTCTGTTAAACAGCAGAGAAGTGGTACTTTATTAGGTATCACACTCTTCATCTGCTTGAAAAAGGACCAAAATAAACTAAAGATTCTACACTTGATCTTATTAATTAAGTGAAGACCCACTGTGACATATGGTTAGACAGTTCAAGAAAATATTGGCAGTGTTGTCTGTGTTGGTGGAGATGGATCTGCTAGCGAAGTAGCCCATGCTTTGCTTCTGAGAGCTCAGAAGAATGCTGGGATGGAAACAGACCGAATCCTGACTCCTGTCAGAGCACAGCTTCCACTTGGCTTAATACCAGCAGGATCTACCAATGTATTGGCACATTCTCTTCATGGAGTTCCTCATGTGATAACTGCAACATTGCACATTATAATGGGGCATGTACAGCTGGTCGACGTCTGCACCTTCAGCACCGCTGGCAAGCTTCTTCGCTTTGGGTTCTCAGCCATGTTTGGCTTTGGTGGAAGAACTTTGGCTCTGGCAGAAAAATATCGATGGATGTCCCCTAACCAACGGAGAGATTTTGCTGTTGTTAAGGCACTGGCAAAACTTAAGGCAGAAGACTGTGAAATATCATTTTTACCATTTAACAGCTCTGATGATGTGCAAGAAAGACTGTAATGATCAATGGCAAATGATCCAGGGTCAGTTCTTGAATGTCAGCATTATGGCAATTCCTTGCCTGTGTTCAGTGGCACCTAGAGGCTTGGCACCTAATACCAGATTAAATAATGGAAGTATGGCTCTTATAATTGCCCGAAACACTTCTCGGCCAGAATTTATAAAACACCTGAAAAGATATGCCAGTGTAAAAAATCAGTTCAATTTTCCATTTGTTGAGACTTACACTGTTGAGGAAGTAAAAGTTCATCCAAGGAATAATACTGGTGGATATAATCCAGAGGAGGAGGAGGATGAAACTGCTTCAGAAAATTGTTTCCCTTGGAATGTAGATGGTGATTTAATGGAAGTTGCATCAGAGGTCCATATTAGATTGCATCCAAGACTTATCAGTCTTTATGGAGGAAGCATGGAAGAAATGATTCCAAAGTAA
配列番号９のポリヌクレオチド
ATGCCCTGGAGGAGGCGCAGGAACCGGGTGAGTGCCCTGGAGGGCGGCCGGGAGGAAGAGGCGCCCCCGGAGGCTGCCGCTGTGCCTCCGGCGCTGTTAACGTCCCCGCAGCAGACGGAGGCGGCGGCCGAGCGGATTCTGCTCCGGGGCATCTTCGAGATCGGGAGGGACAGTTGTGACGTGGTGCTGAGCGAGCGAGCACTGCGGTGGCGGCCCATTCAGCCCGAGCGCCCGGCGGGTGATTCTAAGTATGACTTGCTATGTAAAGAAGAATTTATTGAACTCAAAGACATATTCTCTGTGAAACTGAAACGGCGTTGTTCTGTTAAACAGCAGAGAAGTGGTACTTTATTAGGTATCACACTCTTCATCTGCTTGAAAAAGGAACAAAATAAACTAAAGAATTCTACACTTGATCTTATTAATTTAAGTGAAGACCACTGTGACATATGGTTTAGACAGTTCAAGAAAATATTGGCAGGCTTTCCAAACAGACCGAAGTCATTAAAAATACTCCTTAACCCCCAAAGTCACAAAAAAGAAGCTACCCAGGTTTATTATGAGAAGGTTGAACCTCTGTTGAAGCTTGCAGGAATAAAAACTGATGTAACAATAATGGAATATGAAGGGCACGCTCTGTCACTGCTTAAGGAATGTGAACTCCAGGGATTTGATGGTGTTGTCTGTGTTGGTGGAGATGGATCTGCTAGCGAAGTAGCCCATGCTTTGCTTCTGAGAGCTCAGAAGAATGCTGGGATGGAAACAGACCGAATCCTGACTCCTGTCAGAGCACAGCTTCCACTTGGCTTAATACCAGCAGGATCTACCAATGTATTGGCACATTCTCTTCATGGAGTTCCTCATGTGATAACTGCAACATTGCACATTATAATGGGGCATGTACAGCTGGTCGACGTCTGCACCTTCAGCACCGCTGGCAAGCTTCTTCGCTTTGGGTTCTCAGCCATGTTTGGCTTTGGTGGAAGAACTTTGGCTCTGGCAGAAAAATATCGATGGATGTCCCCTAACCAACGGAGAGATTTTGCTGTTGTTAAGGCACTGGCAAAACTTAAGGCAGAAGACTGTGAAATATCATTTTTACCATTTAACAGCTCTGATGATGTGCAAGAAAGGAGGGCACAGGGATCTCCCAAATCTGAAATATTTAATTTCAGATTAAATAATGGAAGTATGGCTCTTATAATTGCCCGAAACACTTCTCGGCCAGAATTTATAAAACACCTGAAAAGATATGCCAGTGTAAAAAATCAGTTCAATTTTCCATTTGTTGAGACTTACACTGTTGAGGAAGTAAAAGTTCATCCAAGGAATAATACTGGTGGATATAATCCAGAGGAGGAGGAGGATGAAACTGCTTCAGAAAATTGTTTCCCTTGGAATGTAGATGGTGACTTAATGGAAGTTGCATCAGAGGTCCATATTAGATTGCATCCAAGACTTATCAGTCTTTATGGAGGAAGCATGGAAGAAATGATTCCAAAGTAA
配列番号１０のポリペプチド（配列番号１のポリヌクレオチドに対応）
MPWRRRRNRVSALEGGREEEAPPEAAAVPPALLTSPQQTEAAAERILLRGIFEIGRDSCDVVLSERALRWRPIQPERPAGDSKYDLLCKEEFIELKDIFSVKLKRRCSVKQQRSGTLLGITLFICLKKEQNKLKNSTLDLINLSEDHCDIWFRQFKKILAGFPNRPKSLKILLNPQSHKKEATQVYYEKVEPLLKLAGIKTDVTIMEYEGHALSLLKECELQGFDGVVCVGGDGSASEVAHALLLRAQKNAGMETDRILTPVRAQLPLGLIPAGSTNVLAHSLHGVPHVITATLHIIMGHVQLVDVCTFSTAGKLLRFGFSAMFGFGGRTLALAEKYRWMSPNQRRDFAVVKALAKLKAEDCEISFLPFNSSDDVQERRAQGSPKSDCNDQWQMIQGQFLNVSIMAIPCLCSVAPRGLAPNTRLNNGSMALIIARNTSRPEFIKHLKRYASVKNQFNFPFVETYTVEEVKVHPRNNTGGYNPEEEEDETASENCFPWNVDGDLMEVASEVHIRLHPRLISLYGGSMEEMIPK
配列番号１１のポリペプチド（配列番号５のポリヌクレオチドに対応）
MEYEGHALSLLKECELQGFDGVVCVGGDGSASEVAHALLLRAQKNAGMETDRILTPVRAQLPLGLIPAGSTNVLAHSLHGVPHVITATLHIIMGHVQLVDVCTFSTAGKLLRFGFSAMFGFGGRTLALAEKYRWMSPNQRRDFAVVKALAKLKAEDCEISFLPFNSSDDVQERRAQGSPKSDCNDQWQMIQGQFLNVSIMAIPCLCSVAPRGLAPNTRLNNGSMALIIARNTSRPEFIKH
配列番号１２のポリペプチド（配列番号６のポリヌクレオチドに対応）
MPWRRRRNRVSALEGGREEEAPPEAAAVPPALLTSPQQTEAAAERILLRGIFEIGRDSCDVVLSERALRWRPIQPERPAGDSKYDLLCKEEFIELKDIFSVKLKRRCSVKQQRSGTLLGITLFICLKKEQNKLKNSTLDLINLSEDHCDIWFRQFKKILAGFPNRPKSLKILLNPQSHKKEATQVYYEKVEPLLKLAGIKTDVTIMEYEGHALSLLKECELQGFDGVVCVGGDGSASEVAHALLLRAQKNAGMETDRILTPVRAQLPLGLIPAGSTNVLAHSLHGVPHVITATLHIIMGHVQLVDVCTFSTAGKLLRFGFSAMFGFGGRTLALAEKYRWMSPNQRRDFAVVKALAKLKAEDCEISFLLPFNSSDDVQER
配列番号１３のポリペプチド（配列番号７のポリヌクレオチドに対応）
MPWRRRRNRVSALEGGREEEAPPEAAAVPPALLTSPQQTEAAAERILLRGIFEIGRDSCDVVLSERALRWRPIQPERPAGDSKYDLLCKEEFIELKDIFSVKLKRRCSVKQQRSGTLLGITLFICLKKEQNKLKNSTLDLINLSEDHCDIWFRQFKKILAGFPNRPKSLKILLNPQSHKKEATQVYYEKVEPLLKLAGIKTDVTMSVLVEMDLLAK
配列番号１４のポリペプチド（配列番号８のポリヌクレオチドに対応）
MPWRRRRNRVSALEGGREEEAPPEAAAVPPALLTSPQQTEAAAERILLRGIFEIGRDSCDVVLSERALRWRPIQPERPAGDSKYDLLCKEEFIELKDIFSVKLKRRCSVKQQRSGTLLGITLFICLKKDQNKLKILHLILLLIK
配列番号１５のポリペプチド（配列番号９のポリヌクレオチドに対応）
MPWRRRRNRVSALEGGREEEAPPEAAAVPPALLTSPQQTEAAAERILLRGIFEIGRDSCDVVLSERALRWRPIQPERPAGDSKYDLLCKEEFIELKDIFSVKLKRRCSVKQQRSGTLLGITLFICLKKEQNKLKNSTLDLINLSEDHCDIWFRQFKKILAGFPNRPKSLKILLNPQSHKKEATQVYYEKVEPLLKLAGIKTDVTIMEYEGHALSLLKECELQGFDGVVCVGGDGSASEVAHALLLRAQKNAGMETDRILTPVRAQLPLGLIPAGSTNVLAHSLHGVPHVITATLHIIMGHVQLVDVCTFSTAGKLLRFGFSAMFGFGGRTLALAEKYRWMSPNQRRDFAVVKALAKLKAEDCEISFLPFNSSDDVQERRAQGSPKSEIFNFRLNNGSMALIIARNTSRPEFIKHLKRYASVKNQFNFPFVETYTVEEVKVHPRNNTGGYNPEEEEDETASENCFPWNVDGDLMEVASEVHIRLHPRLISLYGGSMEEMIPK
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、タンパク質のような有機化合物、たとえばセラミドキナーゼ様タンパク質に関する。
【０００２】
スフィンゴ脂質は、細胞膜の主要な構成要素の１つであると考えられている。近年の証拠で、それらの構造的な役割を越えて、それらが生物活性脂質として作用し得ること、そしてシグナル伝達に影響を及ぼし得ることが、グリセロリン脂質によって生じること連想させる方法で、示されている。
スフィンゴ脂質代謝の生理学的活性は、たとえばアポトーシスの誘導および細胞増殖の刺激を含み、スフィンゴ脂質を代謝する酵素が様々な疾患の誘導に加わっていると予期されることが示唆される。
【０００３】
たとえば；
−細胞機構を制御するセラミドは、上記酵素反応における調節物質であると示唆されている、たとえばHannun, Y.A. et al, TIBS 20, 73−77 (1995)参照；
【０００４】
−Spiegel, S. et al, Curr.Opin.Cell.Biol. ８, 159-167 (1996)およびMathias S. et al, Science 259, 619-622 (1993)は、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βのような炎症性サイトカインの第２のメッセンジャーとして働くこと、そしてホスホリパーゼＡ２のようなアラキドン酸経路を活性化すること；したがって、セラミドは、炎症性障害において悪化因子として考えられ得ることが報告されている；
【０００５】
−セラミドは、ＨＩＶ感染患者においてアポトーシスおよび脳細胞のＨＩＶ感染に関連するＣＤ４＋Ｔ細胞の減少を悪化させる、たとえばColine M.G. et al, Proc.Assoc.Am.Physicians 109, 146-153 (1997)およびWilt S. et al, Ann. Neurol. 37, 381-394 (1995)参照；
【０００６】
−Begum N. et al, Eur.J.Biochem, 238, 214-220 (1996)およびHotamsligil, G.S. et al, Science, 271, 665-668 (1996)において、ＴＮＦ−αが２型糖尿病において引き金としてインシュリン耐性を引き起こし得ること、そしてセラミドが肥満におけるＴＮＦ−αの下方制御に関与することが報告された；
【０００７】
−Beuttler B. et al, J.Cardiovasc.Pharmacol. 25, S1-S8 (1995)において、セラミドがリポポリサッカリドによって引き起こされる敗血症の誘因であることが開示されている；
【０００８】
−Schissel, S.L. et al in J.Clin.Invest., 1455-1464 (1996)によると、セラミドの上昇は、アテローム性動脈硬化症の誘因であるＬＤＬの凝集反応におけるスフィンゴミエリナーゼを活性化する；
【０００９】
−Michael J.M. et al, Cancer Res., 57, 3600-3605 (1997)、Bose R. et al, Cell, 82, 405-414 (1995)およびJaffrezou, J.P. et al, EMBO J., 15, 2417-2424 (1996)から、セラミドが放射線療法および化学療法においてがん細胞のアポトーシスを促進することが知られている；
【００１０】
−Itoh M. et al, Clinical Cancer Res. 8, 415-23 (2003)によって、セラミド制御が白血病細胞の薬剤耐性に関与すること：セラミドレベルの減少が白血病において化学耐性状態と関係することが示されている。
【００１１】
また、セラミドキナーゼの作用により、たとえばＮ−ヘキサノニル−、Ｎ−オクタノイル−、Ｎ−パルミトイル−Ｄ−エリスロ−スフィンゴシンのようなＮ−アシル化−Ｄ−エリスロ−スフィンゴシンを含む、様々なセラミド誘導体の１位での、たとえばヒドロキシル基のリン酸化により、セラミドから生産されるセラミド−１−リン酸（Ｃｅｒ−１−Ｐ）は、生理学的活性を示し、たとえば；
【００１２】
−カルシウム刺激によりセラミドキナーゼによって生産される−Ｃｅｒ−１−Ｐは、脳シナプスから神経伝達物質の放出を調節し（たとえばBajjalieh S.M. et al,J.Biol.Chem.264, 14354-14360 (1989)参照）、したがって、セラミドキナーゼの作用の調節は、たとえばアルツハイマー病を含む様々な神経性疾患の処置において価値があると期待される；
【００１３】
−Ｃｅｒ−１−Ｐは、Gomez−Munoz A. et al, J. Lipid Res. 45, 99-105により証明されるように、おそらく酸スフィンゴミエリナーゼの阻害を介して、様々な正常のセラミド活性を阻害すると信じられており（たとえばDressler K.A. et al, J.Biol.Chem. 265, 14917-14921 (1990)参照）、したがって、Ｃｅｒ−１−Ｐは、様々な障害、たとえば慢性関節炎、ＨＩＶ−感染、インシュリン耐性が引き金となって起こる２型糖尿病、敗血症およびアテローム性動脈硬化症を含む、たとえば炎症性障害を、調節、たとえば抑制すると期待される；すなわち、セラミドキナーゼの活性化により、かかる疾患が処置され得ると信じられている；
【００１４】
−Ｃｅｒ−１−Ｐは、主として細胞内で作用し、そこで小胞移動を容易にすると信じられている。それは食作用に関係し、したがって、炎症プロセスで重要な役割を果たし得る（Hinkovska−Galcheva V.T. et al, J. Biol. Chem 273, 33203-9 (1998)）；
【００１５】
−外から加えられたＣｅｒ−１−Ｐのマイトジェン活性も示されている（Gomez−Munoz A. et al Biochem J 325, 435-40 (1997)）。したがって、このスフィンゴ脂質代謝は、限るものではないが、がんおよび乾癬を含む細胞増殖性障害に関係し得る。
【００１６】
−Ｃｅｒ−１−Ｐは、Pettus, B.J. et al, J. Biol. Chem. 278, 38206-13 (2003)によって、サイトカイン−およびカルシウムイオノフォア−誘導アラキドン酸放出を仲介すると報告されており、そしてこのグループはさらにＣ−１−Ｐが細胞質性ＰＬＡ２を直接活性化し得ることを示し（Pettus, B.J. et al, J. Biol. Chem 279, 11320-6, 2004）、そしてこれは炎症性障害におけるＣｅｒ−１−Ｐの可能性のある役割のさらなる証拠である；
【００１７】
−Ｃｅｒ−１−Ｐレベルはまた、Tuson M. et al, Am.J.Hum.Genet. 74:128-38 (2004)によって示唆されたとおり、視覚系の病態生理学（たとえば網膜色素変性感受性）に関係し得る。
【００１８】
我々は、本発明においてセラミドキナーゼ様タンパク質をコード化するポリヌクレオチド（遺伝子）を発見した。
【００１９】
ある局面において本発明は、配列番号１配列の単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００２０】
我々はまた、配列番号１配列のポリヌクレオチドの５’または３’非翻訳領域をそれぞれ構成する、配列番号２配列のポリヌクレオチドおよび配列番号３配列のポリヌクレオチドを見出した。配列番号１、配列番号２および配列番号３配列のポリヌクレオチドの合計は、配列番号４配列のポリヌクレオチドの３２０３ｂｐのｃＤＮＡを提供する。
【００２１】
他の局面において本発明は
−配列番号２、
−配列番号３、または
−配列番号４
配列の単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００２２】
我々はまた、たとえば配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８および配列番号９配列のポリヌクレオチドの、配列番号１配列のポリヌクレオチドの様々な変異体を見出し、我々は、それは配列番号１配列のポリヌクレオチドのスプライス変異体であると見出した。
【００２３】
他の局面において本発明は、
−配列番号５、
−配列番号６、
−配列番号７、
−配列番号８、または
−配列番号９
配列の単離されたポリヌクレオチドのような、配列番号１配列のポリヌクレオチドのスプライス変異体である、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００２４】
単離されたポリヌクレオチドとは、該ポリヌクレオチドがその天然の環境から単離されていることを意味する。
【００２５】
我々は、配列番号１配列の遺伝子またはポリヌクレオチドが、セラミドキナーゼ様タンパク質をコード化するためのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を提供すること、たとえば配列番号１配列のポリヌクレオチドのスプライス変異体がかかるタンパク質の一部をコード化することを見出した。我々はさらに、本発明に記載のセラミドキナーゼ様タンパク質がセラミドキナーゼの機能を有することを推定した。
【００２６】
他の局面において本発明は、
−配列番号１、
−配列番号５、
−配列番号６、
−配列番号７、
−配列番号８、または
−配列番号９
配列のポリヌクレオチドによってコード化されるセラミドキナーゼ様タンパク質、たとえば、それぞれが配列番号１配列のポリヌクレオチドによってコード化されるセラミドキナーゼ様タンパク質の一部である、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８および配列番号９のポリヌクレオチドによってコード化されるセラミドキナーゼ様タンパク質を提供する。
【００２７】
我々は、
−配列番号１配列のポリヌクレオチドが配列番号１０配列のポリペプチドをコード化する、
−配列番号５配列のポリヌクレオチドが配列番号１１配列のポリペプチドをコード化する、
−配列番号６配列のポリヌクレオチドが配列番号１２配列のポリペプチドをコード化する、
−配列番号７配列のポリヌクレオチドが配列番号１３配列のポリペプチドをコード化する、
−配列番号８配列のポリヌクレオチドが配列番号１４配列のポリペプチドをコード化する、および
−配列番号９配列のポリヌクレオチドが配列番号１５配列のポリペプチドをコード化する
ことを見出した。
【００２８】
他の局面において本発明は、
−配列番号１０、
−配列番号１１、
−配列番号１２、
−配列番号１３、
−配列番号１４、または
−配列番号１５
配列の単離されたポリペプチドを提供する。
【００２９】
本発明のポリヌクレオチドは、本明細書中で「本発明（に記載）の遺伝子」と表す。セラミド自体またはセラミドの代謝物をリン酸化することができる、本発明の遺伝子によってコード化されるセラミドキナーゼ様タンパク質は、本明細書中で「本発明（に記載）のセラミドキナーゼ様タンパク質」と表す。
【００３０】
本発明の遺伝子は、配列番号１の核酸配列、およびたとえばその対立遺伝子変異体、ならびにそれらの相補配列；およびたとえば、本発明の遺伝子の核酸配列とたとえばストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドをたとえば含む、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８または配列番号９配列のポリヌクレオチドのような、そのスプライス変異体を含む。たとえば、本発明の遺伝子のヌクレオチド配列は、たとえば遺伝子コードの冗長（縮重）の結果として、本発明の遺伝子の配列とは異なるが、また、たとえば同じ生物学的活性を有する本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質、たとえばその一部をコード化するか、またはたとえば、少なくとも８０％、たとえば８０％から１００％、たとえば９０％、たとえば９５％、たとえば９７％たとえば９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、本発明のアミノ酸のセラミドキナーゼ様タンパク質をコード化する；該同一性は、ｎａ＝ｘａ−（ｘａ．ｙ）（ここで、ｎａはアミノ酸変化の数であり、ｘａは該対応するアミノ酸配列のアミノ酸の全数であり、そしてｙは１００で割ったパーセント同一性である）により計算され、かつ同じ生物学的活性を有する；本発明の遺伝子の対立遺伝子変異体またはスプライス変異体で生産された本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質を含む。
【００３１】
「同一性」は、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の同一性の指標であり、そしてたとえば常套の方法による技術によって、たとえば商業的に入手可能なたとえばコンピュータープログラムによって、計算され得る。「ストリンジェント条件」は、本発明の遺伝子のヌクレオチド配列とハイブリダイズする対応するポリヌクレオチドとの間に、少なくとも８０％、たとえば９０％、たとえば９５％、９７％または９９％の同一性が存在するときのみ、ハイブリダイゼーションが起こるであろうことを含む。
【００３２】
本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質は、本発明の、たとえば配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４または配列番号１５配列のポリペプチドのような、セラミドキナーゼ様タンパク質の一部を含む、たとえば配列番号１０の遺伝子によってコード化されるアミノ酸配列を有する、および、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列と、少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、ポリペプチドを含む。
【００３３】
本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質は、「成熟」ポリペプチドの形態であり得、またはより大きなポリペプチド、たとえば融合タンパク質の一部であり得；たとえば、それは、分泌またはリーダー配列、プロ配列、多ヒスチジン残基のような精製を補助する配列、または本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質のポリペプチドへの組み換え生産の間の安定性のための付加的配列を含む、付加的アミノ酸配列を含むのに有利であり得る。
【００３４】
本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質はまた、本発明のポリヌクレオチドのスプライス変異体によってコード化されるような本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質のポリペプチドのポリペプチドフラグメントを含む。かかるポリペプチドフラグメントは、本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質のポリペプチドのアミノ酸配列の全部ではなく一部と、全体として同じであるアミノ酸配列を有するポリペプチドであることを意味する。かかるポリペプチドフラグメントは、「独立（free-standing）」であり得、またはかかるポリペプチドフラグメントが一部または領域、最も好ましくは単一連続領域として形成する、大きなポリペプチドの一部であり得る。最も好ましくは、かかるポリペプチドフラグメントが対応する本発明のセラミドキナーゼの生物学的活性を、少なくとも一部は保持している。
【００３５】
本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質のポリペプチドはまた、本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質の定義されたポリペプチド（フラグメント）配列の変異体を含む。好ましい変異体は、保存的アミノ酸置換によって指示対象から変化しているもの、たとえば残基が生物学的機能において類似の特徴の他のものによって置換されている変異体である。
【００３６】
「ポリヌクレオチド」は、他に記載がない限り、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを含み、これは、未修飾ＲＮＡまたはＤＮＡであり得、または修飾ＲＮＡまたはＤＮＡであり得、１本鎖および２本鎖ＲＮＡならびに１本鎖および２本鎖領域の混合物であるＲＮＡを制限なく含む。「ポリペプチド」は、他に記載がない限り、ペプチド結合によって互いに結合したアミノ酸を含む、任意のペプチドまたはタンパク質を含む。単離されたポリペプチドは、該ポリペプチドがその天然の環境から単離されていることを意味する。
【００３７】
本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質を、常套の方法と同様に、たとえば本発明の遺伝子を含む脳細胞のｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡライブラリーからの標準的クローニングを使用して、得ることができる。
【００３８】
本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質をコード化するポリヌクレオチドを、脳ｃＤＮＡライブラリーから得る。我々は、コンピューター内で（in silico）同定された全推定オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をカバーするようにプライマーを設計し、そしてＯＲＦを増幅するため、ポリメラーゼ連鎖反応に該プライマーを使用した。我々は、予期する大きさを有するフラグメントを得、そして我々は予期した配列を確認し、さらに我々が様々なスプライス変異体を検出することを可能にするクローニングおよびシークエンシングを行った。既知のセラミドキナーゼ（受託番号ＡＢ０７９０６６）との配列比較により、我々は、たとえば相同性の考慮により、本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質が、ジアシルグリセロールキナーゼドメイン含有酵素スーパーファミリーのセラミドキナーゼサブファミリーの新規メンバーであると結論づけた。
【００３９】
本発明の遺伝子を、本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質の組み換え生産のために使用し得る。配列番号１のポリヌクレオチドは、成熟した本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質のための配列をコード化するため、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、そしてたとえば、所望により、他のコード配列、たとえばリーダーまたは分泌配列、プレ−またはプロ−またはプレプロ−タンパク質配列、または他の融合ペプチド部分をコード化するものを含み得る。
【００４０】
たとえば、本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質を含む縮合ポリペプチドの精製を容易にし得るマーカー配列を、コード化することができる。該マーカー配列は、適当なマーカー配列、たとえば常套のマーカー配列、たとえばｐＱＥベクター（Qiagen, Inc.）において提供され、Gentz et al, Proc Natl Acad Sci USA (1989)86:821-824に記載されているヘキサヒスチジンペプチド、またはＨＡタグを含み得る。本発明に記載の任意のポリヌクレオチドはまた、非コード５’および３’配列（たとえば配列番号４配列のポリヌクレオチド）、たとえば転写、非転写配列、スプライスおよびポリアデニル化シグナル、リボソーム結合部位およびｍＲＮＡを安定化する配列を含み得る。
【００４１】
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドを発現することを意図した宿主細胞を、遺伝子操作（形質転換、形質移入）するために使用し得るベクターへと、導入し得る。
【００４２】
他の局面において本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含んでなるベクターを提供する。
【００４３】
本発明の遺伝子を含むベクターを、適当に、たとえば常套の方法にしたがって、生産することができる。適当なベクターを、適当に、たとえば常套の方法にしたがって、得ることができる。本発明の遺伝子を含むベクターは、たとえば適合性の宿主細胞のような宿主細胞において、組み換え的に本発明の遺伝子によってコード化される本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質を生産することができる発現系を得るのに有用であり得る。たとえば、本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質の組み換え生産のために、宿主細胞を、宿主細胞へと本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質を発現するための発現系、またはたとえばその一部を導入するため、たとえば本発明の遺伝子を含むベクターの使用によって遺伝子操作することができる。無細胞翻訳系はまた、たとえば本発明に記載のポリヌクレオチドを含むＤＮＡ作成物に由来するＲＮＡを使用して、たとえば常套の方法と同様に、本発明の遺伝子を生産するために使用することができる。
【００４４】
他の局面において本発明は、該発現系またはその一部が適合性の宿主細胞中に存在するとき、該発現系またはその一部が該本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質を生産することができる、たとえば予め単離された、本発明のポリヌクレオチド、たとえばＤＮＡまたはＲＮＡを含む発現系を提供する。
【００４５】
他の局面において本発明は；
−本発明に記載の発現系を含んでなる宿主細胞；
−本発明に記載のセラミドキナーゼ様タンパク質を生産する方法であって、本発明に記載の発現系を含む単離された宿主細胞を本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質の生産に十分な条件下で培地中で培養すること、および該培地から本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質を回収、たとえば単離することを含んでなる方法；
−本発明に記載のセラミドキナーゼ様タンパク質を生産する組み換え宿主細胞の生産方法であって、宿主細胞が適当な培養条件下で本発明に記載のセラミドキナーゼ様タンパク質を生産するように、本発明に記載の発現系で宿主細胞を形質導入または形質移入することを含んでなる方法；ならびに
−宿主細胞が適当な培養条件下で本発明に記載のセラミドキナーゼ様タンパク質を生産するように、本発明に記載の発現系で宿主細胞を形質導入または形質移入することによって生産された組み換え宿主細胞
を提供する。
【００４６】
宿主細胞へのポリヌクレオチドの導入は、適切に、たとえば常套の方法と同様に、たとえばDavis et al, BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1986); Sambrook et al, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)に記載のように、たとえばリン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン介在トランスフェクション、ベクター導入（transvection）、マイクロインジェクション、陽イオン脂質介在トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質伝達、スクレイプローディング（scrape loading）、バリスティック・イントロダクション（ballistic introduction）または感染により、なされ得る。宿主細胞は容易に見出され得る。適当な宿主細胞の例は、たとえば、連鎖球菌（streptococci）、ブドウ球菌（staphylococci）、大腸菌（E. coli）、ストレプトマイセス属（Streptomyces）および枯草菌（Bacillus subtilis）細胞のような細菌細胞；酵母細胞およびコウジカビ属（Aspergillus）細胞のような真菌細胞；ショウジョウバエ（Drosophila）Ｓ２およびシロイチモンジョトウ（Spodoptera）Ｓｆ９細胞のような昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、ＣＣＬ３９、３Ｔ３、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞のような単離された動物細胞；ならびに植物細胞を含む。
【００４７】
適当な発現系は、たとえば染色体性、エピソーム性およびウイルス由来系、たとえば細菌性プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、イーストエピソーム、挿入因子、イースト染色体因子、ならびにバキュロウイルス、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、ワクチンウイルス、アデノウイルス、禽ジフテリア（fowl pox）ウイルス、仮性狂犬病（pseudorabies）ウイルスおよびレトロウイルスのようなウイルスに由来するベクター、ならびにそれらの組合せに由来するベクター、たとえばプラスミドおよびバクテリオファージ遺伝因子、たとえばコスミドおよびファージミドに由来するものを含む。発現系は、発現を制御ならびに発生させる調節領域を含み得る。一般的に、宿主においてポリペプチドを生産させるために維持、繁殖または発現させるのに適した任意の系またはベクターを使用し得る。適当なヌクレオチド配列を、適当に、たとえば常套の方法と同様に、たとえばSambrook et al, MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL （supra）に記載のとおりに、発現系へと挿入し得る。
【００４８】
本発明に記載のセラミドキナーゼ様タンパク質を、組み換えＴ細胞培養物から適当に、たとえば常套の方法と同様に、たとえば界面活性剤抽出、超遠心分離、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、たとえば高速液体クロマトグラフィーを含む方法で、回収（単離）し得る。本発明に記載のセラミドキナーゼ様タンパク質が単離およびまたは精製の間に変性するとき、活性コンホメーションの再生、たとえば変性ポリペプチドの再折りたたみが、適当に、たとえば常套の方法と同様に行われ得る。
【００４９】
本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質は、いくつかの局面において、様々な疾患、たとえば神経性障害、炎症性障害、たとえば乾癬、ＨＩＶ感染、たとえばインシュリン耐性が引き金となって起こる２型糖尿病、肥満、敗血症、アテローム性動脈硬化症、がん、およびたとえば網膜色素変性症を含む疾患に対する医薬的標的を提供する。たとえば、セラミドキナーゼの活性化により、かかる疾患が処置され得ることは合理的である。処置は、処置および予防を含む。セラミドキナーゼはまた、試料においてセラミドの量を検出および／または定量するための方法において有用であり得る。本発明の遺伝子のスプライス変異体は、全長セラミドキナーゼ様タンパク質のスクリーニングに、およびたとえば診断用試薬として有用であり得る。配列番号６において報告されたもののような、スプライス変異体は、酵素ドメインを有するが、基質特異的または細胞内局在の基礎をなす制御領域が存在し得るＣ末端が失われた欠失酵素を生産するであろう。あるいは、本発明のヌクレオチドのかかるより短い形態は、アッセイ開発により好適であり得る。たとえば配列番号７のスプライス変異体は、より短いであろうし、キナーゼ活性が欠け得、そして優性ネガティブ変異体として作用することができた。
【００５０】
たとえば、本発明の遺伝子（スプライス変異体のようなフラグメント）または本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質（フラグメント）を、研究試薬として、ならびに動物およびヒトの疾患の処置および診断の発見用ツールとして使用し得る。
【００５１】
他の局面において本発明は、診断用試薬としての本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは抗体の使用を提供する。
【００５２】
機能障害と関係する本発明の遺伝子の変異形態の検出は、たとえば診断アッセイにおいて、対応する遺伝子またはその変異形の発現の減少、過剰発現または変化した発現の結果である、疾患または疾患に対する感受性の診断に加え得るかまたは診断を定義し得る、診断ツールを提供するであろう。対応する遺伝子において変異を有する個体は、ＤＮＡレベルで、たとえば常套の方法と同様に検出され得る。これは、たとえば付加的エキソンに隣接する繰り返しＤＮＡ配列（付随ＤＮＡ）の２つの伸長を有する、配列番号６のスプライス変異体によって説明され得る。
【００５３】
診断用核酸を、対象の細胞、たとえば血液、尿、唾液、組織生検または剖検材料から得ることができる。該ゲノムＤＮＡを、直接検出のために使用することができ、あるいは、分析の前にＰＣＲまたは他の増幅技術を使用して酵素的に増幅することができる。ＲＮＡまたはｃＤＮＡをまた、同様に分析において使用することができる。欠失および挿入を、正常遺伝子型との比較において増幅産物の大きさの変化によって検出することができる。点変異は、増幅ＤＮＡが本発明の標識遺伝子ヌクレオチド配列とハイブリダイズすることによって同定され得る。好ましくは、マッチした配列をＲＮａｓｅ分解によってもしくは融解温度の差によってミスマッチ２本鎖と区別し得る。ＤＮＡ配列差はまた、分解剤を含むまたは含まないゲル中でのＤＮＡフラグメントの電気泳動移動度の変化によって、またはたとえば Myers et al, Science (1985) 230:1242に記載のとおりに直接ＤＮＡシーケンシングすることによって、検出し得る。特定の位置における配列の変化はまた、ヌクレアーゼ保護アッセイ、たとえばＲＮａｓｅおよびＳ１保護、またはたとえばCotton et al, Proc Natl Acad Sci USA (1985) 85: 4397-4401に記載の化学的切断法によって、明らかとなり得る。本発明の遺伝子ヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドプローブのアレイまたはそのフラグメントを、たとえば遺伝子変異の効果的なスクリーニングを行うために構築し得る。たとえば、アレイ技術法を、たとえばM. Chee et al, Science, Vol 274, pp 610-613,1996に記載の、遺伝子発現、遺伝子結合、および遺伝的変異性を含む分子遺伝学における様々な問題を解決するために使用し得る。
【００５４】
診断アッセイは、たとえば炎症性障害、たとえば慢性関節炎、乾癬を含む、たとえば神経性障害、ＨＩＶ−感染、インシュリン耐性が引き金となって起こる２型糖尿病、肥満、敗血症、アテローム性動脈硬化症（artheroscleorosis）、がんを含む、およびたとえば網膜色素変性症を含む、セラミドキナーゼ様タンパク質の作用が介在する疾患を診断するかまたは感受性を決定するための方法を提供する。
【００５５】
かかる疾患を、たとえば常套の方法と同様に、たとえば、
−本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質、
−セラミド−１−リン酸のようなかかるセラミドキナーゼ様タンパク質の２次代謝物、または関連脂質代謝物−リン酸
−本発明の、遺伝子ｍＲＮＡ
の異常に上昇または減少したレベルを対象由来の試料から測定することを含む方法によって、診断し得る。
【００５６】
上昇したまたは減少した発現レベルは、ＲＮＡレベルで、たとえばポリヌクレオチドの定量のための常套の方法と同様に、たとえばＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮａｓｅ保護、ノーザンブロッティングおよび他のハイブリダイゼーション法を含む方法で、決定され得る。本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質のようなタンパク質のレベルを決定するために、または宿主に由来する試料におけるかかるセラミドキナーゼ様タンパク質の２次代謝物を測定するために使用し得るアッセイ技術は、適当に、たとえば常套の方法と同様に、行い得る。かかるアッセイ技術は、ラジオイムノアッセイ、競合的結合アッセイ、ウェスタンブロット分析、ＥＬＩＳＡ、およびたとえば蛍光法、質量分析、クロマトグラフィーを含む、２次代謝物、たとえばセラミド−１−リン酸の量を検出するための方法を含む。
【００５７】
他の局面において本発明は、たとえば炎症性障害、たとえば慢性関節炎、乾癬を含む、たとえば神経性障害、ＨＩＶ−感染、インシュリン耐性が引き金となって起こる２型糖尿病、肥満、敗血症、アテローム性動脈硬化症（artheroscleorosis）、がんを含む、およびたとえば網膜色素変性症を含む、疾患または疾患に対する感受性の診断キットであって、主な要素として；
ａ）たとえばその対立遺伝子変異体またはそのフラグメントを含む、本発明の遺伝子（ポリヌクレオチド）；またはそのスプライス変異体、または
ｂ）（ａ）のものと相補的なヌクレオチド配列、または
ｃ）本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質、または
ｄ）本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質に対する抗体
を含んでなる診断キット、
たとえば（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）が実質的要素を構成し得て、たとえば
−試料の適当な環境、
−試験される試料においてａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）のいずれかの効果を測定するための適当な方法
を含む、任意のかかるキット
を提供する。
【００５８】
本発明の遺伝子はまた、染色体同定のために有用であり得る。該配列は特異的に標的化され、そして特定の位置で個々のヒト染色体にハイブリダイズできる。本発明に記載の染色体への対応する配列のマッピングは、それらの配列と遺伝子関連疾患を関係づける重要な最初のステップである。一度配列が正確な染色体の位置にマッピングされると、染色体上の配列の物理的な位置を遺伝子マップデータと相関させ得る。関連するデータはたとえばV. McKusick, Mendelian Inheritance in Man （Johns Hopkins University Welch Medical Libraryを通じてオンラインで入手可能）にたとえば開示されている。遺伝子と、同じ染色体領域にマッピングされた疾患の間の関係は、連鎖解析（物理的に隣接する遺伝子の共同遺伝）によって同定され得る。罹患したおよび罹患しなかった個体の間のｃＤＮＡまたは遺伝子における差も決定することができる。罹患した個体の一部または全てに変異が観察されるが、正常個体のいずれにも観察されないとき、該変異は該疾患の原因因子である可能性がある。
【００５９】
本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質、またはそのフラグメント、または本発明のポリペプチドを発現する細胞はまた、本発明のセラミドキナーゼポリペプチドについて免疫特異的な抗体を生産するための免疫原として使用され得る。「免疫特異的」との用語は、該抗体が、他の関連ポリペプチドへのそれらの親和性よりも該ポリペプチドに実質的により大きな親和性を有することを意味する。かかるポリペプチドに対して発生する抗体は、たとえば該ポリペプチドまたはエピトープ担持フラグメントアナログまたは細胞を動物に、好ましくはヒト以外に、ルーチンプロトコルを使用して投与することによって得られ得る。モノクローナル抗体の製造のために、たとえば連続細胞株培養によって生産される抗体を提供する適当な技術は、たとえばハイブリドーマ技術（Kohler, G. and Milstein, C., Nature (1975) 256:495-497)、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Kozbor et al, Immunology Today (1983) 4:72)およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術(Cole et al, MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp. 77-96, Alan R. Liss, Inc., 1985)を含む技術を使用し得る。１本鎖抗体の生産のための技術(たとえば U.S. Pat. No. 4,946,778)はまた、本発明に記載のポリペプチドに対する１本鎖抗体を生産するために採用され得る。また、トランスジェニックマウス、または他の哺乳類を含む他の生物は、ヒト化抗体を発現させるために使用され得る。上記抗体は、たとえば本発明に記載のポリペプチドを発現するクローンの単離または同定において、またはアフィニティークロマトグラフィーによる本発明に記載のポリペプチド（フラグメント）の精製のために、使用され得る。
【００６０】
他の局面において本発明は、本発明のセラミドキナーゼ様ポリペプチドに対する抗体を提供する。
【００６１】
本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質は、たとえば上記のような多くの病因を含む多くの生物学的機能に関与し得る。したがって、
−たとえば２次代謝物を生産するための本発明のセラミドキナーゼ、
−セラミドキナーゼ発現を刺激するための本発明の遺伝子の発現
を刺激する（アゴニスト）かまたは、
−たとえば２次代謝物の生産を減少または阻害するための本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質の活性
−本発明の遺伝子の発現
を減少または阻害する（アンタゴニスト）
化合物／薬剤を見出すことが望まれる。
【００６２】
したがって、本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質またはたとえばColigan et al, Current Protocols in Immunology 1(2):Chapter 5 (1991)に記載のその機能的模倣物は、アゴニストまたはアンタゴニストの本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質のポリペプチドのレセプター部分への、たとえば細胞、無細胞調製物、化学ライブラリーおよび天然産物混合物中で、たとえばスクリーニングアッセイ中での結合を評価するために使用され得る。
かかるアゴニストおよびアンタゴニストを、疾患、たとえば炎症性障害、たとえば慢性関節炎、乾癬を含む、たとえば神経性障害、ＨＩＶ−感染、インシュリン耐性が引き金となって起こる２型糖尿病、肥満、敗血症、アテローム性動脈硬化症（artheroscleorosis）、がんを含む、およびたとえば網膜色素変性症の処置において使用し得る。
【００６３】
スクリーニング方法は、セラミドキナーゼが発現される適当な細胞の生産を含み得る。適当な細胞は、たとえば哺乳類、酵母、ショウジョウバエ由来の細胞を含む。本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質を発現する細胞（または発現キナーゼを含む細胞膜）は、結合、または機能的応答の刺激もしくは阻害を観察するために、候補化合物と接触させ得る。
【００６４】
スクリーニングアッセイは候補化合物の結合を試験するために使用され得、ここで、該レセプターを有する細胞への接着は、候補化合物と直接または間接に関係する標識の手段により、または標識された競合物質との競合を含むアッセイにおいて検出され得る。活性化の阻害剤は、既知のアゴニストの存在下において、および不存在下において、アッセイされ得る。スクリーニングアッセイは、混合物を形成するために候補化合物と本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質を含む溶液を混合するステップ、混合物における該セラミドキナーゼ様タンパク質の活性を測定するステップ、および混合物の活性を標準の活性と比較するステップを含み得る。本発明の遺伝子（ｃＤＮＡ）、本発明に記載のセラミドキナーゼ様タンパク質のポリペプチドおよび本発明のかかるポリペプチドに対する抗体はまた、候補化合物の、細胞中の該遺伝子（ｍＲＮＡ）および該ポリペプチドの生産における効果を検出するためのスクリーニングアッセイを提供するために使用され得る。たとえばＥＬＩＳＡは、該ポリペプチドの細胞関連レベルを決定するために、たとえば常套の方法にしたがってモノクローナルまたはポリクローナル抗体を使用して構成され得、そしてＥＬＩＳＡは、該ポリペプチドの生産または活性を上昇または阻害し得る薬剤（アゴニストまたはアンタゴニスト）を好適に操作された細胞または組織から発見するために使用され得る。スクリーニングのためのアッセイは、たとえば常套の方法にしたがって行われ得る。
【００６５】
可能性のある本発明の遺伝子のアゴニスト（アンタゴニスト）の例は、抗体、またはある場合において、オリゴヌクレオチドまたは該遺伝子のリガンド（該遺伝子のポリペプチドと結合したアゴニスト（アンタゴニスト））と密接に関係したタンパク質、たとえば該リガンドのフラグメント、または本発明の遺伝子産物と結合するが応答を誘導しない小分子、または該レセプターの活性が阻害されるような本発明の遺伝子の変異形態の産物を含む。
【００６６】
可能性のある本発明に記載のアゴニスト（アンタゴニスト）の例は、たとえばオリゴヌクレオチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、模倣物、小分子、たとえば低分子量化合物（ＬＭＷ’ｓ）を含む、本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質のポリペプチドと結合する化合物を含む。
【００６７】
したがって他の局面において、本発明は、セラミドキナーゼ様タンパク質のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストを同定するためのスクリーニングアッセイを提供し、このアッセイは、主な要素として
ａ）本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質のポリペプチド、または
ｂ）ポリペプチドａ）を発現する組み換え細胞、または
ｃ）ａ）に記載のポリペプチドを発現する細胞膜、または
ｄ）ポリペプチドａ）に対する抗体；
およびたとえば候補化合物と接触させるための手段；
およびたとえば候補化合物のａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）のいずれかに対する効果を測定するための手段、たとえば候補化合物の存在下および不存在下におけるａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）のいずれかの活性の比較によって；
たとえば、候補化合物の存在下で、ポリペプチドａ）の生産およびまたは生物学的活性に減少または増加が存在するかどうかを決定するための手段；
を含み、
【００６８】
そして他の局面において、
本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質の生産および／または生物学的活性を上昇または減少させる、たとえばリガンド、レセプター、抗体またはＬＭＷ’ｓを含む、アゴニストまたはアンタゴニストを同定する方法であって、
Ａ）
ａ）本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質のポリペプチド、または
ｂ）ポリペプチドａ）を発現する組み換え細胞、または
ｃ）ポリペプチドａ）を発現する細胞膜、または
ｄ）ポリペプチドａ）に対する抗体
を、候補化合物と接触させること、
Ｂ）ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）のいずれかにおける候補化合物の効果を測定すること；
たとえば候補化合物の存在下および不存在下におけるａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）のいずれかの活性の比較によって、
たとえば、候補化合物の存在下で、ポリペプチドａ）の生産およびまたは生物学的活性に減少または増加が存在するかどうかを決定すること；
Ｃ）ステップＢ）で測定されたアゴニストまたはアンタゴニストを選択すること、
たとえば、アゴニスト／アンタゴニスト効果がステップＢ）で明確に測定された適当な候補化合物を選択すること
を含む方法
を提供する。
【００６９】
任意のかかるスクリーニングアッセイにおいて、ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）が実質的な要素を構成し得ることは、理解されるであろう。候補化合物は、ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）のいずれかに対する効果は未知であるが、期待され得る化合物（ライブラリー）を含み得る。化合物（ライブラリー）は、上記で本発明に記載のポリペプチドに対するアゴニスト（アンタゴニスト）として列記された化合物を含む。アゴニスト（アンタゴニスト）は、上記のａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）のいずれかに対する効果がスクリーニングアッセイにおいて、またはアゴニスト（アンタゴニスト）を同定する方法において見出された候補化合物である。アゴニスト（アンタゴニスト）は本発明に記載のポリペプチドの生産およびまたは生物学的活性を減少または上昇させ得る。
【００７０】
他の局面において本発明は、該アゴニストまたはアンタゴニストが本発明のアゴニストまたはアンタゴニストを同定する方法によって提供できることを特徴とする、本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニスト、好ましくはアンタゴニストを提供する。
【００７１】
本発明に記載のポリペプチドのアゴニスト（アンタゴニスト）を、疾患、たとえば炎症性障害、たとえば慢性関節炎、乾癬を含む、たとえば神経性障害、ＨＩＶ−感染、インシュリン耐性が引き金となって起こる２型糖尿病、肥満、敗血症、アテローム性動脈硬化症（artheroscleorosis）、がんを含む、およびたとえば網膜色素変性症の処置において使用し得る。したがって、本発明に記載のポリペプチドのアゴニスト（アンタゴニスト）は、医薬として有用であり得る。
【００７２】
他の局面において本発明は、たとえば疾患、たとえば炎症性障害、たとえば慢性関節炎、乾癬を含む、たとえば神経性障害、ＨＩＶ−感染、インシュリン耐性が引き金となって起こる２型糖尿病、肥満、敗血症、アテローム性動脈硬化症（artheroscleorosis）、がんを含む、およびたとえば網膜色素変性症の処置において医薬として使用するための、本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニスト、
ならびに他の局面において、
たとえば本発明のアゴニストまたはアンタゴニストが好適である疾患の処置のための、医薬として使用するための、本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質可溶形態
を提供する。
【００７３】
本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質のアゴニストまたはアンタゴニストを、医薬組成物の形態で投与することができる。
【００７４】
他の局面において本発明は、
−該アンタゴニストまたはアゴニストが本発明のアゴニストまたはアンタゴニストを同定する方法によって提供できることを特徴とする、有効成分としての本発明のアゴニストまたはアンタゴニストを、薬学的に許容される賦形剤と組合せて含む医薬組成物；
−本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質の可溶形を有効成分として、薬学的に許容される賦形剤と組合せて含む医薬組成物
を提供する。
【００７５】
かかる医薬組成物を、適当に、常套の方法に、たとえばしたがって、たとえば準じて、たとえばステップＡ）、Ｂ）およびＣ）の方法によって得られたアゴニスト（アンタゴニスト）を賦形剤と混合することにより、およびたとえばさらに得られた混合物を適当な投与形の医薬組成物を得るために処理することにより、生産することができる。
【００７６】
さらなる局面において本発明は、かかる処置を必要とする対象に、セラミドキナーゼ様タンパク質が介在する異常な状態を処置する方法、
たとえば炎症性障害、たとえば慢性関節炎、乾癬、たとえば神経性障害、ＨＩＶ−感染、インシュリン耐性が引き金となって起こる２型糖尿病、肥満、敗血症、アテローム性動脈硬化症（artheroscleorosis）、がんを含む、およびたとえば網膜色素変性症の処置方法であって、上記ステップＡ）、Ｂ）およびＣ）の方法によって提供され得る本発明のアゴニストまたはアンタゴニストの治療上有効量を、たとえば薬学的に許容される賦形剤と組合せて投与することを含んでなる方法；
またはたとえば薬学的に許容される賦形剤と組合せて、たとえば医薬組成物の形態で、たとえば、本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質の可溶形態の治療上有効量を投与することを含んでなる方法；
を提供する。
【００７７】
本発明の医薬組成物を、任意の常套の経路、たとえば経鼻、頬側、直腸、経口を含む、たとえば経腸投与；たとえば静脈内、筋肉内、皮下を含む、非経腸投与；またはたとえば皮膚上、鼻腔内、気管内を含む、局所的投与によって、たとえば被覆または非被覆錠剤、カプセル剤、（注射可能な）溶液、固溶体、懸濁液、分散液、固体分散液の形態で；たとえばアンプル、バイアルの形態で、クリーム、ゲル、ペースト、吸入粉末、泡、チンキ、リップスティック、ドロップ、スプレーの形態で、または座薬の形態で、投与し得る。
【００７８】
本発明の医薬組成物の好ましい全身投与の形態は、注射、典型的には静脈内注射を含む。皮下、筋肉内、または腹腔内のような他の注射経路を使用することができる。全身投与の他の手段は、たとえば胆汁塩またはフシジン酸または他の界面活性剤のような浸透剤を使用した経粘膜および経皮投与を含む。さらに、経腸またはカプセル化製剤に適当に製剤したときは、経口投与も可能であり得る。本発明に記載の組成物の投与はまた、局所および／または局部であり得る。
【００７９】
かかる処置のために、適当な投与量は、もちろん、たとえば、使用される本発明の化合物の化学的性質および薬物動態データ、個々の宿主、投与の形態、処置される症状の性質および重さ、ならびに本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質のポリペプチドまたは本発明のアゴニスト（アンタゴニスト）のどちらが有効成分として使用されるかに依存して変化するであろう。しかし、一般的に、大型の哺乳類、たとえばヒトにおいて満足のいく結果のために、必要な日投与量は、約０．１ｍｇから約１５００ｍｇ（約１０μｇ／体重ｋｇから２０ｍｇ／体重ｋｇ）の範囲である。しかし、必要な投与量の変化は、利用できる化合物の多様性および様々な投与経路における有効性の違いの観点から予期され得る。たとえば、経口投与は、静脈内注射による投与量よりも高い投与量が要求されることが予期されるであろう。これらの投与レベルにおける変化は、適当に、たとえば最適化のための標準的経験的慣例によって調整され得る。
【００８０】
処置において使用されるポリペプチドはまた、たとえばかかる処置を必要とする対象内で、たとえば上記のとおり、しばしば「遺伝子治療」と呼ばれる処置モダリティーにおいて、内生的に生産され得る。したがって、たとえば、対象由来の細胞をＤＮＡまたはＲＮＡのようなポリヌクレオチドでエクスビボで操作し、たとえばレトロウイルスプラスミドベクターを使用することによって、本発明に記載のポリペプチドをコード化することができる。操作された細胞を、かかる処置を必要とする対象に導入することができる。
【００８１】
以下の実施例において、全ての温度は摂氏度であり、未補正である。
使用した略語
ＰＣＲ ポリメラーゼ連鎖反応
ＯＲＦ オープンリーディングフレーム
【実施例】
【００８２】
実施例１
ヒトセラミドキナーゼと相同性を有するｃＤＮＡクローンについての調査は、ＮＣＢＩデータベースの２つのクローン、ＢＣ０２０４６５およびＸＭ＿０８７１５３からの部分的な情報に基づく。それらのアセンブリは、セラミドキナーゼ様タンパク質をコードするための推定ＯＲＦが検出されるポリヌクレオチドを生産できることを予期させる。該配列は、ヒト染色体２から十分に回収される。
【００８３】
実施例２
相同性
配列相同性は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムおよびＧＡＰ ＧＣＧソフトウェアを使用して調査される。本明細書中に記載のＯＲＦが、セラミドキナーゼとヌクレオチドレベルで４５．６６２％相同性、およびアミノ酸レベルで３３．８７１％類似性（２４．７９８％相同性）を有することを決定した（受託番号ＡＢ０７９０６６、およびJ Biol Chem, 2002, vol 277, 23294-300参照）。セラミドキナーゼのように、本発明のＯＲＦ（遺伝子）の推定アミノ酸配列は、ＤＡＧＫ様ドメインを示す。興味深いことに、様々な種のセラミドキナーゼにおいて十分保存されており、スフィンゴシンキナーゼコンセンサス配列において見出されないタンパク質配列の伸長はまた、本発明のＯＲＦから推測されるタンパク質配列において存在する。したがって、本発明のＯＲＦによってコード化されるタンパク質が「セラミドキナーゼ様タンパク質」であることが、合理的に予期される。
ＢＬＡＳＴ調査はまた、本発明のＯＲＦがラットおよびマウスにおけるオルトログを有する可能性を示す。
【００８４】
実施例３
クローニング
以下のオリゴヌクレオチドはＯＲＦを増幅するために設計されている：
５’ｃｃａｇｃｃｔｇｃｇａｃｔｃｃｇｃｃａｔｇｃｃｃ３’および５’ｔｔａｃｔｔｔｇｇａａｔｃａｔｔｔｃｔｔｃｃａｔｇｃｔｔｃｃｔｃｃ３’。
２５μｌのＰＣＲ反応を、２．５μｌヒト脳ｃＤＮＡ（Marathon brain cDNA library, Clontech）、４００ｍＭの上記オリゴヌクレオチドのそれぞれ、Ａｄｖａｎｔａｇｅ２ＰＣＲポリメラーゼ（Clontech）で、以下の増幅パラメーター：
９４°にて５分、９４°にて３０秒を５サイクル、６５°にて３０秒、６８°にて３分３０秒、９４°にて３０秒を２５サイクル、５８°にて３０秒、６８°にて３分３０秒、次いで最終伸長ステップとして６８°にて５分
を使用して行う。これは、ＭＪ ＰＴＣ−２００熱循環器で実現する。結果を１％アガロースゲル（SeaPlaque GTG agarose, Cambrex）で分析する。３つの分離したバンドが、１．６−２．４ｋｂ範囲に観察される。それらを切り出し、それらのＤＮＡ内容物を抽出する（MinEluteゲル抽出キット, Qiagen）。ＤＮＡを、Ａ付加後（A-addition kit, Qiagen）直接ｐＣＲ４−ＴＯＰＯ（Invitrogen）においてクローニングするか、またはＣＡＣＣ配列をＤＮＡフラグメントの５’末端で付加するよう設計された後のＰＣＲの後にｐＥＮＴＲ／ＳＤ／Ｄ−ＴＯＰＯ（Invitrogen）においてクローニングする。この付加的ＰＣＲを以下のプライマー：
５’ｃａｃｃａｔｇｃｃｃｔｇｇａｇｇａｇｇｃｇｃａｇｇ３’および５’ｔｔａｃｔｔｔｇｇａａｔｃａｔｔｔｃｔｔｃｃａｔｇｃｔｔｃｃｔｃｃ３’
で、次のサイクルパラメーター：
９４°にて２分、５回：９４°にて１０秒、７２°にて４分、５回：９４°にて１０秒、６９°にて４分、２３回：９４°にて１０秒、６７°にて４分、次いで最終伸長ステップとして５分、７２°
にしたがって行う。増幅ＤＮＡを１％アガロースゲルで回収し、さらに上記のとおりに精製する。
【００８５】
ＴＯＰＯクローニング反応を製造業者（Invitrogen）の指示書にしたがって行う。２μｌの各ＴＯＰＯ反応混合物を使用して、製造業者（Invitrogen）の指示書にしたがって５０μｌのＴＯＰ１０大腸菌を形質転換する。組み換えクローンをＬＢ＋カナマイシンで選択する。プラスミドをＱｉａｇｅｎのミニプレップ法にしたがって製造する。
【００８６】
実施例４
発現
発現調査を、ヒトRAPID−SCAN Gene Expression panel （OriGene）および以下のオリゴヌクレオチド；
５’ａｃａｔｔｇｃａｃａｔｔａｔａａｔｇｇｇｇｃａｔｇｔａｃａｇｃｔｇｇｔｃｇ３’および５’ｇｔｔａｃｔｔｔｇｇａａｔｃａｔｔｔｃｔｔｃｃａｔｇｃｔｔｃｃｔｃｃ３’を、上記ＰＣＲプログラム２番で使用したＰＣＲによって行う。発現は組織特異性であることが判明し、副腎、腎臓、睾丸および肺では強い量の、胎児肝臓、胎児脳、脳、脾臓、前立腺、骨髄および胃では中程度の量の、筋肉、甲状腺、膵臓およびＰＢＬでは少量の、ならびに皮膚、小腸、心臓、結腸、胎盤、唾液、卵巣および子宮では検出されないレベルである。他のＰＣＲベース実験は、セラミドキナーゼ様ｍＲＮＡはまた気管および脊髄において発現されることを見出した。タグ化融合タンパク質のインビトロ翻訳後の放射線標識ポリペプチドの検出は、ウェスタンブロットによって行い得る。
【００８７】
実施例５
細胞内分画
Ｃ末端フラグタグを有するセラミドキナーゼ様タンパク質の発現後の細胞分画において、該タンパク質を細胞質ゾルから、ならびに細胞膜周辺分画で、また、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００不溶性物質として回収することができる。
【００８８】
実施例６
細胞内局在化
ＣＯＳ−１細胞において発現されたＧＦＰタグ化組み換えタンパク質を使用して、該セラミドキナーゼ様タンパク質は細胞質および核内で見出され、とりわけそれは核小体へと局在化し得た。
【００８９】
実施例７
ＣＯＳ−１細胞中の組み換え過剰発現タンパク質を使用して、セラミドキナーゼ様タンパク質がリン酸分子を主にスレオニン残基に含むことを見出す。
【００９０】
実施例８
様々な基質、たとえばジアシルグリセロール、スフィンゴシン、Ｃ２−、Ｃ６−、Ｃ８−、Ｃ１６−、Ｃ１８−セラミドのアッセイは、セラミドキナーゼ様タンパク質の活性を示さない。また、一時的にセラミドキナーゼ様タンパク質および３２Ｐで標識したパルスを発現するＣＯＳ−１細胞内で、特異的リン脂質は検出することができない。おそらく、本発明のセラミドキナーゼ様タンパク質は、これに限るものではないがコファクターの補助のような活性を示すために、特定の条件が必要である可能性がある。
【００９１】
配列表:
配列番号１のポリヌクレオチド
ATGCCCTGGAGGAGGCGCAGGAACCGGGTGAGTGCCCTGGAGGGCGGCCGGGAGGAAGAGGCGCCCCCGGAGGCTGCCGCTGTGCCTCCGGCGCTGTTAACGTCCCCGCAGCAGACGGAGGCGGCGGCCGAGCGGATTCTGCTCCGGGGCATCTTCGAGATCGGGAGGGACAGTTGTGACGTGGTGCTGAGCGAGCGAGCACTGCGGTGGCGGCCCATTCAGCCCGAGCGCCCGGCGGGTGATTCTAAGTATGACTTGCTATGTAAAGAAGAATTTATTGAACTCAAAGACATATTCTCTGTGAAACTGAAACGGCGTTGTTCTGTTAAACAGCAGAGAAGTGGTACTTTATTAGGTATCACACTCTTCATCTGCTTGAAAAAGGAACAAAATAAACTAAAGAATTCTACACTTGATCTTATTAATTTAAGTGAAGACCACTGTGACATATGGTTTAGACAGTTCAAGAAAATATTGGCAGGCTTTCCAAACAGACCGAAGTCATTAAAAATACTCCTTAACCCCCAAAGTCACAAAAAAGAAGCTACCCAGGTTTATTATGAGAAGGTTGAACCTCTGTTGAAGCTTGCAGGAATAAAAACTGATGTAACAATAATGGAATATGAAGGGCACGCTCTGTCACTGCTTAAGGAATGTGAACTCCAGGGATTTGATGGTGTTGTCTGTGTTGGTGGAGATGGATCTGCTAGCGAAGTAGCCCATGCTTTGCTTCTGAGAGCTCAGAAGAATGCTGGGATGGAAACAGACCGAATCCTGACTCCTGTCAGAGCACAGCTTCCACTTGGCTTAATACCAGCAGGATCTACCAATGTATTGGCACATTCTCTTCATGGAGTTCCTCATGTGATAACTGCAACATTGCACATTATAATGGGGCATGTACAGCTGGTCGACGTCTGCACCTTCAGCACCGCTGGCAAGCTTCTTCGCTTTGGGTTCTCAGCCATGTTTGGCTTTGGTGGAAGAACTTTGGCTCTGGCAGAAAAATATCGATGGATGTCCCCTAACCAACGGAGAGATTTTGCTGTTGTTAAGGCACTGGCAAAACTTAAGGCAGAAGACTGTGAAATATCATTTTTACCATTTAACAGCTCTGATGATGTGCAAGAAAGGAGGGCACAGGGATCTCCCAAATCTGACTGTAATGATCAATGGCAAATGATCCAGGGTCAGTTCTTGAATGTCAGCATTATGGCAATTCCTTGCCTGTGTTCAGTGGCACCTAGAGGCTTGGCACCTAATACCAGATTAAATAATGGAAGTATGGCTCTTATAATTGCCCGAAACACTTCTCGGCCAGAATTTATAAAACACCTGAAAAGATATGCCAGTGTAAAAAATCAGTTCAATTTTCCATTTGTTGAGACTTACACTGTTGAGGAAGTAAAAGTTCATCCAAGGAATAATACTGGTGGATATAATCCAGAGGAGGAGGAGGATGAAACTGCTTCAGAAAATTGTTTCCCTTGGAATGTAGATGGTGATTTAATGGAAGTTGCATCAGAGGTCCATATTAGATTGCATCCAAGACTTATCAGTCTTTATGGAGGAAGCATGGAAGAAATGATTCCAAAGTAA
配列番号２のポリヌクレオチド
CCAGCCTGCGACTCCGCC
配列番号３のポリヌクレオチド
CATGTAATTGTTTCTAAAAGAAATGTACAAACTAGAATTTTAATATAAAGAAATGTGGCCATGCTTTAAACCTGTGGTCCCCACCCTTTTTGGGACCAGTTTCATGGAAGACAATTTTTCTGTGGATGGGGGAATGGTTTCAGGATGAACTGTTCCACCTCAGATCATCGGGCATTAGATTCTCTTGAGGAACATGGCACTCTAGATCCCTCACATACCAGTTCACCATATGGTTCGCACTTCTATGAGAATCTAATGCTGCTGCTGATCTGACAGGGGGAGGAACTCAGTAATGCTCCATTGCTCTAACCTCCTGCTGTGTGGCCAAACGGATATCCTAATAGAAATTGATGTTACTAACAATTAGCCTCTAGGGCTTTAAAAGTCAAGATGAAATATCAAAGTCAAGATGAAATATCAATTCAAATTCTGTTTTTAGATATCAATTCAAATTCTTTTTTTTACAATGTGTTTATTGGACACACAAAAAAACTTTGCAACCATCATAATACATCAATATTTAACCTAGATAATTCTGAAATAATTTGGATTCTTTCATTTTCAGGATTTGAGCTCATCAATTATGTTAAATTTCCTATATTCTGTTACAAATATAATACAGATTTCATAAGTCTGCCTTGATTCACTGCTCCCTAATCCAGAGCAGTTAAATTTCAAAATCACATAGTTATATAGCCTACCTGCCAAAAAAGAATAACCCATCCCTGTCTTCTTAAAGTGGTAGGGTTTTAAAATTCATGATACAAGTAACAAAGTAAGTTGATAACAAATACTATTTTGAACTGGACAAAATCTAGCCCAATATGTAATTGTGTTCCCCTTGTATCTGAGAGGCCTGTGTTGGACAACCATAGTACTCTGCTTTCACTGTGCTCAAATAACCTGAAATATATAGTTGTTTCTGAGTAGTTCTGAGTAGGAAAGAACCAAATGTAAATTTCCTTAGAGACCATCCTGGAGAAGACAGTTCTAAATCGGGGCTTGATTTTTCATCTATGATCCTAGATGTTCTCCTGAAAGAATGACTAGCCTTTTTATAACGATACAAAGTTTTTTAAAAATACATAAATGTCATAAAGTTTATTCCTGTGTATACACACTCTGGGTTCAGGAGGTTTTGTGCTTACATTTCACTACTCAAATGCCTTCGCAAATTTCAGAACATTCCTCACCATCACTGCAGGCCTGTGAACAGATAACTTTCATCAATTAGGATGGCTGGCTAGTGGCAGGGACTTCATATAAAGAAATCTTTCCCAGAATTGTTTTTCCACATTGCCTTCTAATTTGATCACTCCCTATAACAGATGTTCAAAATTCGGCCACAGCTCTCTTATGAAGACAGAGTCAGATAAAATGATATTCTGCAATTATCTAGATCATAAGCATAAAATAAATATTACAAAAATGATTGTATTTAAAGAAATTTTTTAAAATCCAGAAAGTCATTTAAAATAGAACCTCATATAGTATGAACAAACTATAAAAATATTTTACATTTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCGGCCGCTGAATTCTAGACCTGCCCGGGCGGCCGCTCGA
配列番号４のポリヌクレオチド
CCAGCCTGCGACTCCGCCATGCCCTGGAGGAGGCGCAGGAACCGGGTGAGTGCCCTGGAGGGCGGCCGGGAGGAAGAGGCGCCCCCGGAGGCTGCCGCTGTGCCTCCGGCGCTGTTAACGTCCCCGCAGCAGACGGAGGCGGCGGCCGAGCGGATTCTGCTCCGGGGCATCTTCGAGATCGGGAGGGACAGTTGTGACGTGGTGCTGAGCGAGCGAGCACTGCGGTGGCGGCCCATTCAGCCCGAGCGCCCGGCGGGTGATTCTAAGTATGACTTGCTATGTAAAGAAGAATTTATTGAACTCAAAGACATATTCTCTGTGAAACTGAAACGGCGTTGTTCTGTTAAACAGCAGAGAAGTGGTACTTTATTAGGTATCACACTCTTCATCTGCTTGAAAAAGGAACAAAATAAACTAAAGAATTCTACACTTGATCTTATTAATTTAAGTGAAGACCACTGTGACATATGGTTTAGACAGTTCAAGAAAATATTGGCAGGCTTTCCAAACAGACCGAAGTCATTAAAAATACTCCTTAACCCCCAAAGTCACAAAAAAGAAGCTACCCAGGTTTATTATGAGAAGGTTGAACCTCTGTTGAAGCTTGCAGGAATAAAAACTGATGTAACAATAATGGAATATGAAGGGCACGCTCTGTCACTGCTTAAGGAATGTGAACTCCAGGGATTTGATGGTGTTGTCTGTGTTGGTGGAGATGGATCTGCTAGCGAAGTAGCCCATGCTTTGCTTCTGAGAGCTCAGAAGAATGCTGGGATGGAAACAGACCGAATCCTGACTCCTGTCAGAGCACAGCTTCCACTTGGCTTAATACCAGCAGGATCTACCAATGTATTGGCACATTCTCTTCATGGAGTTCCTCATGTGATAACTGCAACATTGCACATTATAATGGGGCATGTACAGCTGGTCGACGTCTGCACCTTCAGCACCGCTGGCAAGCTTCTTCGCTTTGGGTTCTCAGCCATGTTTGGCTTTGGTGGAAGAACTTTGGCTCTGGCAGAAAAATATCGATGGATGTCCCCTAACCAACGGAGAGATTTTGCTGTTGTTAAGGCACTGGCAAAACTTAAGGCAGAAGACTGTGAAATATCATTTTTACCATTTAACAGCTCTGATGATGTGCAAGAAAGGAGGGCACAGGGATCTCCCAAATCTGACTGTAATGATCAATGGCAAATGATCCAGGGTCAGTTCTTGAATGTCAGCATTATGGCAATTCCTTGCCTGTGTTCAGTGGCACCTAGAGGCTTGGCACCTAATACCAGATTAAATAATGGAAGTATGGCTCTTATAATTGCCCGAAACACTTCTCGGCCAGAATTTATAAAACACCTGAAAAGATATGCCAGTGTAAAAAATCAGTTCAATTTTCCATTTGTTGAGACTTACACTGTTGAGGAAGTAAAAGTTCATCCAAGGAATAATACTGGTGGATATAATCCAGAGGAGGAGGAGGATGAAACTGCTTCAGAAAATTGTTTCCCTTGGAATGTAGATGGTGATTTAATGGAAGTTGCATCAGAGGTCCATATTAGATTGCATCCAAGACTTATCAGTCTTTATGGAGGAAGCATGGAAGAAATGATTCCAAAGTAACATGTAATTGTTTCTAAAAGAAATGTACAAACTAGAATTTTAATATAAAGAAATGTGGCCATGCTTTAAACCTGTGGTCCCCACCCTTTTTGGGACCAGTTTCATGGAAGACAATTTTTCTGTGGATGGGGGAATGGTTTCAGGATGAACTGTTCCACCTCAGATCATCGGGCATTAGATTCTCTTGAGGAACATGGCACTCTAGATCCCTCACATACCAGTTCACCATATGGTTCGCACTTCTATGAGAATCTAATGCTGCTGCTGATCTGACAGGGGGAGGAACTCAGTAATGCTCCATTGCTCTAACCTCCTGCTGTGTGGCCAAACGGATATCCTAATAGAAATTGATGTTACTAACAATTAGCCTCTAGGGCTTTAAAAGTCAAGATGAAATATCAAAGTCAAGATGAAATATCAATTCAAATTCTGTTTTTAGATATCAATTCAAATTCTTTTTTTTACAATGTGTTTATTGGACACACAAAAAAACTTTGCAACCATCATAATACATCAATATTTAACCTAGATAATTCTGAAATAATTTGGATTCTTTCATTTTCAGGATTTGAGCTCATCAATTATGTTAAATTTCCTATATTCTGTTACAAATATAATACAGATTTCATAAGTCTGCCTTGATTCACTGCTCCCTAATCCAGAGCAGTTAAATTTCAAAATCACATAGTTATATAGCCTACCTGCCAAAAAAGAATAACCCATCCCTGTCTTCTTAAAGTGGTAGGGTTTTAAAATTCATGATACAAGTAACAAAGTAAGTTGATAACAAATACTATTTTGAACTGGACAAAATCTAGCCCAATATGTAATTGTGTTCCCCTTGTATCTGAGAGGCCTGTGTTGGACAACCATAGTACTCTGCTTTCACTGTGCTCAAATAACCTGAAATATATAGTTGTTTCTGAGTAGTTCTGAGTAGGAAAGAACCAAATGTAAATTTCCTTAGAGACCATCCTGGAGAAGACAGTTCTAAATCGGGGCTTGATTTTTCATCTATGATCCTAGATGTTCTCCTGAAAGAATGACTAGCCTTTTTATAACGATACAAAGTTTTTTAAAAATACATAAATGTCATAAAGTTTATTCCTGTGTATACACACTCTGGGTTCAGGAGGTTTTGTGCTTACATTTCACTACTCAAATGCCTTCGCAAATTTCAGAACATTCCTCACCATCACTGCAGGCCTGTGAACAGATAACTTTCATCAATTAGGATGGCTGGCTAGTGGCAGGGACTTCATATAAAGAAATCTTTCCCAGAATTGTTTTTCCACATTGCCTTCTAATTTGATCACTCCCTATAACAGATGTTCAAAATTCGGCCACAGCTCTCTTATGAAGACAGAGTCAGATAAAATGATATTCTGCAATTATCTAGATCATAAGCATAAAATAAATATTACAAAAATGATTGTATTTAAAGAAATTTTTTAAAATCCAGAAAGTCATTTAAAATAGAACCTCATATAGTATGAACAAACTATAAAAATATTTTACATTTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCGGCCGCTGAATTCTAGACCTGCCCGGGCGGCCGCTCGA
配列番号５のポリヌクレオチド
CGCCCGGGCAGGTCTAGAATTCAGCGGCCGCTGAATTCTAGGGGGAGGAGGGGAGAACGGGGAGCGCACAGCCTGGACGCGTGCGCAGGCGTCAGGCGCATAGACCTGCTAGCCCCTCAGCTAGCGGCCCCGCCCGCGCTTAGCATCACTAACTGGGCTATATAACCTGAGCGCCCGCGCGGCCACGACACGAGGAATTCGCCCACGCAGGAGGCGCGGCGTCCGGAGGCCCCAGGGTTATGAGACTATCACTGCTCAGGACCTACTAACAACAAAGGTGATTCTAAGTATGACTTGCTATGTAAAGAAGAATTTATTGAACTCAAAGACATATTCTCTGTGAAACTGAAACGGCGTTGTTCTGTTAAACAGCAGAGAAGTGGTACTTTATTAGGTATCACACTCTTCATCTGCTTGAAAAAGGAACAAAATAAACTAAAGAATTCTACACTTGATCTTATTAATTTAAGTGAAGACCACTGTGACATATGGTTTAGACAGTTCAAGAAAATATTGGCAGGCTTTCCAAACAGACCGAAGTCATTAAAAATACTCCTTAACCCCCAAAGTCACAAAAAAGAAGCTACCCAGGTTTATTATGAGAAGGTTGAACCTCTGTTGAAGCTTGCAGGAATAAAAACTGATGTAACAATAATGGAATATGAAGGGCACGCTCTGTCACTGCTTAAGGAATGTGAACTCCAGGGATTTGATGGTGTTGTCTGTGTTGGTGGAGATGGATCTGCTAGCGAAGTAGCCCATGCTTTGCTTCTGAGAGCTCAGAAGAATGCTGGGATGGAAACAGACCGAATCCTGACTCCTGTCAGAGCACAGCTTCCACTTGGCTTAATACCAGCAGGATCTACCAATGTATTGGCACATTCTCTTCATGGAGTTCCTCATGTGATAACTGCAACATTGCACATTATAATGGGGCATGTACAGCTGGTCGACGTCTGCACCTTCAGCACCGCTGGCAAGCTTCTTCGCTTTGGGTTCTCAGCCATGTTTGGCTTTGGTGGAAGAACTTTGGCTCTGGCAGAAAAATATCGATGGATGTCCCCTAACCAACGGAGAGATTTTGCTGTTGTTAAGGCACTGGCAAAACTTAAGGCAGAAGACTGTGAAATATCATTTTTACCATTTAACAGCTCTGATGATGTGCAAGAAAGGAGGGCACAGGGATCTCCCAAATCTGACTGTAATGATCAATGGCAAATGATCCAGGGTCAGTTCTTGAATGTCAGCATTATGGCAATTCCTTGCCTGTGTTCAGTGGCACCTAGAGGCTTGGCACCTAATACCAGATTAAATAATGGAAGTATGGCTCTTATAATTGCCCGAAACACTTCTCGGCCAGAATTTATAAAACACCT
配列番号６のポリヌクレオチド
ATGCCCTGGAGGAGGCGCAGGAACCGGGTGAGTGCCCTGGAGGGCGGCCGGGAGGAAGAGGCGCCCCCGGAGGCTGCCGCTGTGCCTCCGGCGCTGTTAACGTCCCCGCAGCAGACGGAGGCGGCGGCCGAGCGGATTCTGCTCCGGGGCATCTTCGAGATCGGGAGGGACAGTTGTGACGTGGTGCTGAGCGAGCGAGCACTGCGGTGGCGGCCCATTCAGCCCGAGCGCCCGGCGGGTGATTCTAAGTATGACTTGCTATGTAAAGAAGAATTTATTGAACTCAAAGACATATTCTCTGTGAAACTGAAACGGCGTTGTTCTGTTAAACAGCAGAGAAGTGGTACTTTATTAGGTATCACACTCTTCATCTGCTTGAAAAAGGAACAAAATAAACTAAAGAATTCTACACTTGATCTTATTAATTTAAGTGAAGACCACTGTGACATATGGTTTAGACAGTTCAAGAAAATATTGGCAGGCTTTCCAAACAGACCGAAGTCATTAAAAATACTCCTTAACCCCCAAAGTCACAAAAAAGAAGCTACCCAGGTTTATTATGAGAAGGTTGAACCTCTGTTGAAGCTTGCAGGAATAAAAACTGATGTAACAATAATGGAATATGAAGAGCACGCTCTGTCACTGCTTAAGGAATGTGAACTCCAGGGATTTGATGGTGTTGTCTGTGTTGGTGGAGATGGATCTGCTAGCGAAGTAGCCCATGCTTTGCTTCTGAGAGCTCAGAAGAATGCTGGGATGGAAACAGACCGAATCCTGACTCCTGTCAGAGCACAGCTTCCACTTGGCTTAATACCAGCAGGATCTACCAATGTATTGGCACATTCTCTTCATGGAGTTCCTCATGTGATAACTGCAACATTGCACATTATAATGGGGCATGTACAGCTGGTCGACGTCTGCACCTTCAGCACCGCTGGCAAGCTTCTTCGCTTTGGGTTCTCAGCCATGTTTGGCTTTGGTGGAAGAACTTTGGCTCTGGCAGAAAAATATCGATGGATGTCCCCTAACCAACGGAGAGATTTTGCTGTTGTTAAGGCACTGGCAAAACTTAAGGCAGAAGACTGTGAAATATCATTTTTACCATTTAACAGCTCTGATGATGTGCAAGAAAGGTAGGTAAAAACCCAATGTAATACAGATAACCTGTATCTTTAAAGCATAAAACATTCTGACAAACAATTGATCAGACTTAGGATCTTTGGTTATTTTTCTAACATAGTAGTAAAGAATATAGAATCACAGACTCTTACAGGTCCTAGTAAGCAAACAACTACTCACTCAGCCTTTTTCTCTTTTTCCTTCCTTCTTTCCTCCCTTCCTTCCCCCTGTCTCTCCCTCCCTCCTTCCGTTCTCTTTTTCCCTTCCCTTCCCCTTTCTTTCCTTTCCTTTGTTTTTTTCCCTTTCTTTCCTTTTCCCTTTCCCTTTTCTTTTGAGTGCCTACTATATGCCAGGCACTTTGAATACAACAATGCACCAAAAAATTAACAAAACACACAGTTTTGTCCCTCGTGATAATTTTGGTCTAGTGTGTAATACAAATATTAAAGCCATATTAAAGAAGGGTTATAGTCTTTAAAGAAATAGTACATTATTATTCCTTATAATACTAGTTTACCTTTAAATGAATCAACACATTATGTTGGCAGCAACAAAATTGTACACGTTTTTACTTACTATCTAATTGAAGAAAGTATTTAACATATATAATGATGAGTTCTCTAATTTTCTCATATTTAATAGATTTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTCTGTGTGTCTGTGCGCGCGTTATCTGTTTTATGTCTTTGTTTTGTTTTCTTTCTTTTAGGAGGGCACAGGGATCTCCCAAATCTGGTGAGTCGAAAAGTATCTCCTTGAGAACTGTGCCAGGTTCTGTTGACATTTTGTTCTGGTGAGGGAAAATAACCAATCACTTTCATTACCTTTAGACTGTAATGATCAATGGCAAATGATCCAGGGTCAGTTCTTGAATGTCAGCATTATGGCAATTCCTTGCCTGTGTTCAGTGGCACCTAGAGGCTTGGCACCTAATACCAGATTAAATAATGGAAGTATGGCTCTTATAATTGCCCGAAACACTTCTCGGCCAGAATTTATAAAACACCTGAAAAGATATGCCAGTGTAAAAAATCAGTTCAATTTTCCATTTGTTGAGACTTACACTGTTGAGGAAGTAAAAGTTCATCCAAGGAATAATACTGGTGGATATAATCCAGAGGAGGAGGAGGATGAAACTGCTTCAGAAAATTGTTTCCCTTGGAATGTAGATGGTGATTTAATGGAAGTTGCATCAGAGGTCCATATTAGATTGCATCCAAGACTTATCAGTCTTTATGGAGGAAGCATGGAAGAAATGATTCCAAAGTAA
配列番号７のポリヌクレオチド
ATGCCCTGGAGGAGGCGCAGGAACCGGGTGAGTGCCCTGGAGGGCGGCCGGGAGGAAGAGGCGCCCCCGGAGGCTGCCGCTGTGCCTCCGGCGCTGTTAACGTCCCCGCAGCAGACGGAGGCGGCGGCCGAGCGGATTCTGCTCCGGGGCATCTTCGAGATCGGGAGGGACAGTTGTGACGTGGTGCTGAGCGAGCGAGCACTGCGGTGGCGGCCCATTCAGCCCGAGCGCCCGGCGGGTGATTCTAAGTATGACTTGCTATGTAAAGAAGAATTTATTGAACTCAAAGACATATTCTCTGTGAAACTGAAACGGCGTTGTTCTGTTAAACAGCAGAGAAGTGGTACTTTATTAGGTATCACACTCTTCATCTGCTTGAAAAAGGAACAAAATAAACTAAAGAATTCTACACTTGATCTTATTAATTTAAGTGAAGACCACTGTGACATATGGTTTAGACAGTTCAAGAAAATATTGGCAGGCTTTCCAAACAGACCGAAGTCATTAAAAATACTCCTTAACCCCCAAAGTCGCAAAAAAGAAGCTACCCAGGTTTATTATGAGAAGGTTGAACCTCTGTTGAAGCTTGCAGGAATAAAAACTGATGTAACAATGTTGTCTGTGTTGGTGGAGATGGATCTGCTAGCGAAGTAGCCCATGCTTTGCTTCTGAGAGCTCAGAAGAATGCTGGGATGGAAACAGACCGAATCCTGACTCCTGTCAGAGCACAGCTTCCACTTGGCTTAATACCAGCAGGATCTACCAATGTATTGGCACATTCTCTTCATGGAGTTCCTCATGTGATAACTGCAACATTGCACATTATAATGGGGCATGTACAGCTGGTCGACGTCTGCACCTTCAGCACCGCTGGCAAGCTTCTTCGCTTTGGGTTCTCAGCCATGTTTGGCTTTGGTGGAAGAACTTTGGCTCTGGCAGAAAAATATCGATGGATGTCCCCTAACCAACGGAGAGATTTTGCTGTTGTTAAGGCACTGGCAAAACTTAAGGCAGAAGACTGTGAAATATCATTTTTACCATTTAACAGCTCTGATGATGKGCAAGAAAGGAGGGCACAGGGATCTCCCAAATCTGACTGTAATGATCAATGGCAAATGATCCAGGGTCAGTTCTTGAATGTCAGCATTATGGCAATTCCTTGCCTGTGTTCAGTGGCACCTAGAGGCTTGGCACCTAATACCAGATTAAATAATGGAAGTATGGCTCTTATAATTGCCCGAAACACTTCTCGGCCAGAATTTATAAAACACCTGAAAAGATATGCCAGTGTAAAAAATCAGTTCAATTTTCCATTTGTTGAGACTTACACTGTTGAGGAAGTAAAAGTTCATCCAAGGAATAATACTGGTGGATATAATCCAGAGGAGGAGGAGGATGAAACTGCTTCAGAAAATTGTTTCCCTTGGAATGTAGATGGTGATTTAATGGAAGTTGCATCAGAGGTCCATATTAGATTGCATCCAAGACTTATCAGTCTTTATGGAGGAAGCATGGAAGAAATGATTGCAAAGAA
配列番号８のポリヌクレオチド
CCAGCCTGCGACTCCGCCATGCCCTGGAGGAGGCGCAGGAACCGGGTGAGTGCCCTGGAGGGCGGCCGGGAGGAAGAGGCGCCCCCGGAGGCTGCCGCTGTGCCTCCGGCGCTGTTAACGTCCCCGCAGCAGACGGAGGCGGCGGCCGAGCGGATTCTGCTCCGGGGCATCTTTGAGATCGGGAGGGACAGTTGTGACGTGGTGCTGAGCGAGCGAGCACTGCGGTGGCGGCCCATTCAGCCCGAGCGCCCGGCGGGTGATTCTAAGTATGACTTGCTATGTAAAGAAGAATTTATTGAACTCAAAGACATATTCTCTGTGAAACTGAAACGGCGTTGTTCTGTTAAACAGCAGAGAAGTGGTACTTTATTAGGTATCACACTCTTCATCTGCTTGAAAAAGGACCAAAATAAACTAAAGATTCTACACTTGATCTTATTAATTAAGTGAAGACCCACTGTGACATATGGTTAGACAGTTCAAGAAAATATTGGCAGTGTTGTCTGTGTTGGTGGAGATGGATCTGCTAGCGAAGTAGCCCATGCTTTGCTTCTGAGAGCTCAGAAGAATGCTGGGATGGAAACAGACCGAATCCTGACTCCTGTCAGAGCACAGCTTCCACTTGGCTTAATACCAGCAGGATCTACCAATGTATTGGCACATTCTCTTCATGGAGTTCCTCATGTGATAACTGCAACATTGCACATTATAATGGGGCATGTACAGCTGGTCGACGTCTGCACCTTCAGCACCGCTGGCAAGCTTCTTCGCTTTGGGTTCTCAGCCATGTTTGGCTTTGGTGGAAGAACTTTGGCTCTGGCAGAAAAATATCGATGGATGTCCCCTAACCAACGGAGAGATTTTGCTGTTGTTAAGGCACTGGCAAAACTTAAGGCAGAAGACTGTGAAATATCATTTTTACCATTTAACAGCTCTGATGATGTGCAAGAAAGACTGTAATGATCAATGGCAAATGATCCAGGGTCAGTTCTTGAATGTCAGCATTATGGCAATTCCTTGCCTGTGTTCAGTGGCACCTAGAGGCTTGGCACCTAATACCAGATTAAATAATGGAAGTATGGCTCTTATAATTGCCCGAAACACTTCTCGGCCAGAATTTATAAAACACCTGAAAAGATATGCCAGTGTAAAAAATCAGTTCAATTTTCCATTTGTTGAGACTTACACTGTTGAGGAAGTAAAAGTTCATCCAAGGAATAATACTGGTGGATATAATCCAGAGGAGGAGGAGGATGAAACTGCTTCAGAAAATTGTTTCCCTTGGAATGTAGATGGTGATTTAATGGAAGTTGCATCAGAGGTCCATATTAGATTGCATCCAAGACTTATCAGTCTTTATGGAGGAAGCATGGAAGAAATGATTCCAAAGTAA
配列番号９のポリヌクレオチド
ATGCCCTGGAGGAGGCGCAGGAACCGGGTGAGTGCCCTGGAGGGCGGCCGGGAGGAAGAGGCGCCCCCGGAGGCTGCCGCTGTGCCTCCGGCGCTGTTAACGTCCCCGCAGCAGACGGAGGCGGCGGCCGAGCGGATTCTGCTCCGGGGCATCTTCGAGATCGGGAGGGACAGTTGTGACGTGGTGCTGAGCGAGCGAGCACTGCGGTGGCGGCCCATTCAGCCCGAGCGCCCGGCGGGTGATTCTAAGTATGACTTGCTATGTAAAGAAGAATTTATTGAACTCAAAGACATATTCTCTGTGAAACTGAAACGGCGTTGTTCTGTTAAACAGCAGAGAAGTGGTACTTTATTAGGTATCACACTCTTCATCTGCTTGAAAAAGGAACAAAATAAACTAAAGAATTCTACACTTGATCTTATTAATTTAAGTGAAGACCACTGTGACATATGGTTTAGACAGTTCAAGAAAATATTGGCAGGCTTTCCAAACAGACCGAAGTCATTAAAAATACTCCTTAACCCCCAAAGTCACAAAAAAGAAGCTACCCAGGTTTATTATGAGAAGGTTGAACCTCTGTTGAAGCTTGCAGGAATAAAAACTGATGTAACAATAATGGAATATGAAGGGCACGCTCTGTCACTGCTTAAGGAATGTGAACTCCAGGGATTTGATGGTGTTGTCTGTGTTGGTGGAGATGGATCTGCTAGCGAAGTAGCCCATGCTTTGCTTCTGAGAGCTCAGAAGAATGCTGGGATGGAAACAGACCGAATCCTGACTCCTGTCAGAGCACAGCTTCCACTTGGCTTAATACCAGCAGGATCTACCAATGTATTGGCACATTCTCTTCATGGAGTTCCTCATGTGATAACTGCAACATTGCACATTATAATGGGGCATGTACAGCTGGTCGACGTCTGCACCTTCAGCACCGCTGGCAAGCTTCTTCGCTTTGGGTTCTCAGCCATGTTTGGCTTTGGTGGAAGAACTTTGGCTCTGGCAGAAAAATATCGATGGATGTCCCCTAACCAACGGAGAGATTTTGCTGTTGTTAAGGCACTGGCAAAACTTAAGGCAGAAGACTGTGAAATATCATTTTTACCATTTAACAGCTCTGATGATGTGCAAGAAAGGAGGGCACAGGGATCTCCCAAATCTGAAATATTTAATTTCAGATTAAATAATGGAAGTATGGCTCTTATAATTGCCCGAAACACTTCTCGGCCAGAATTTATAAAACACCTGAAAAGATATGCCAGTGTAAAAAATCAGTTCAATTTTCCATTTGTTGAGACTTACACTGTTGAGGAAGTAAAAGTTCATCCAAGGAATAATACTGGTGGATATAATCCAGAGGAGGAGGAGGATGAAACTGCTTCAGAAAATTGTTTCCCTTGGAATGTAGATGGTGACTTAATGGAAGTTGCATCAGAGGTCCATATTAGATTGCATCCAAGACTTATCAGTCTTTATGGAGGAAGCATGGAAGAAATGATTCCAAAGTAA
配列番号１０のポリペプチド（配列番号１のポリヌクレオチドに対応）
MPWRRRRNRVSALEGGREEEAPPEAAAVPPALLTSPQQTEAAAERILLRGIFEIGRDSCDVVLSERALRWRPIQPERPAGDSKYDLLCKEEFIELKDIFSVKLKRRCSVKQQRSGTLLGITLFICLKKEQNKLKNSTLDLINLSEDHCDIWFRQFKKILAGFPNRPKSLKILLNPQSHKKEATQVYYEKVEPLLKLAGIKTDVTIMEYEGHALSLLKECELQGFDGVVCVGGDGSASEVAHALLLRAQKNAGMETDRILTPVRAQLPLGLIPAGSTNVLAHSLHGVPHVITATLHIIMGHVQLVDVCTFSTAGKLLRFGFSAMFGFGGRTLALAEKYRWMSPNQRRDFAVVKALAKLKAEDCEISFLPFNSSDDVQERRAQGSPKSDCNDQWQMIQGQFLNVSIMAIPCLCSVAPRGLAPNTRLNNGSMALIIARNTSRPEFIKHLKRYASVKNQFNFPFVETYTVEEVKVHPRNNTGGYNPEEEEDETASENCFPWNVDGDLMEVASEVHIRLHPRLISLYGGSMEEMIPK
配列番号１１のポリペプチド（配列番号５のポリヌクレオチドに対応）
MEYEGHALSLLKECELQGFDGVVCVGGDGSASEVAHALLLRAQKNAGMETDRILTPVRAQLPLGLIPAGSTNVLAHSLHGVPHVITATLHIIMGHVQLVDVCTFSTAGKLLRFGFSAMFGFGGRTLALAEKYRWMSPNQRRDFAVVKALAKLKAEDCEISFLPFNSSDDVQERRAQGSPKSDCNDQWQMIQGQFLNVSIMAIPCLCSVAPRGLAPNTRLNNGSMALIIARNTSRPEFIKH
配列番号１２のポリペプチド（配列番号６のポリヌクレオチドに対応）
MPWRRRRNRVSALEGGREEEAPPEAAAVPPALLTSPQQTEAAAERILLRGIFEIGRDSCDVVLSERALRWRPIQPERPAGDSKYDLLCKEEFIELKDIFSVKLKRRCSVKQQRSGTLLGITLFICLKKEQNKLKNSTLDLINLSEDHCDIWFRQFKKILAGFPNRPKSLKILLNPQSHKKEATQVYYEKVEPLLKLAGIKTDVTIMEYEGHALSLLKECELQGFDGVVCVGGDGSASEVAHALLLRAQKNAGMETDRILTPVRAQLPLGLIPAGSTNVLAHSLHGVPHVITATLHIIMGHVQLVDVCTFSTAGKLLRFGFSAMFGFGGRTLALAEKYRWMSPNQRRDFAVVKALAKLKAEDCEISFLLPFNSSDDVQER
配列番号１３のポリペプチド（配列番号７のポリヌクレオチドに対応）
MPWRRRRNRVSALEGGREEEAPPEAAAVPPALLTSPQQTEAAAERILLRGIFEIGRDSCDVVLSERALRWRPIQPERPAGDSKYDLLCKEEFIELKDIFSVKLKRRCSVKQQRSGTLLGITLFICLKKEQNKLKNSTLDLINLSEDHCDIWFRQFKKILAGFPNRPKSLKILLNPQSHKKEATQVYYEKVEPLLKLAGIKTDVTMSVLVEMDLLAK
配列番号１４のポリペプチド（配列番号８のポリヌクレオチドに対応）
MPWRRRRNRVSALEGGREEEAPPEAAAVPPALLTSPQQTEAAAERILLRGIFEIGRDSCDVVLSERALRWRPIQPERPAGDSKYDLLCKEEFIELKDIFSVKLKRRCSVKQQRSGTLLGITLFICLKKDQNKLKILHLILLLIK
配列番号１５のポリペプチド（配列番号９のポリヌクレオチドに対応）
MPWRRRRNRVSALEGGREEEAPPEAAAVPPALLTSPQQTEAAAERILLRGIFEIGRDSCDVVLSERALRWRPIQPERPAGDSKYDLLCKEEFIELKDIFSVKLKRRCSVKQQRSGTLLGITLFICLKKEQNKLKNSTLDLINLSEDHCDIWFRQFKKILAGFPNRPKSLKILLNPQSHKKEATQVYYEKVEPLLKLAGIKTDVTIMEYEGHALSLLKECELQGFDGVVCVGGDGSASEVAHALLLRAQKNAGMETDRILTPVRAQLPLGLIPAGSTNVLAHSLHGVPHVITATLHIIMGHVQLVDVCTFSTAGKLLRFGFSAMFGFGGRTLALAEKYRWMSPNQRRDFAVVKALAKLKAEDCEISFLPFNSSDDVQERRAQGSPKSEIFNFRLNNGSMALIIARNTSRPEFIKHLKRYASVKNQFNFPFVETYTVEEVKVHPRNNTGGYNPEEEEDETASENCFPWNVDGDLMEVASEVHIRLHPRLISLYGGSMEEMIPK
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４配列の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号１配列のものである、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号２または配列番号３配列のものである、請求項１または２に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
−配列番号５、
−配列番号６、
−配列番号７、
−配列番号８、または
−配列番号９
配列のものである、請求項１から３のいずれかに記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
セラミドキナーゼ様タンパク質をコード化する請求項１から４のいずれかに記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
−配列番号１０、
−配列番号１１、
−配列番号１２、
−配列番号１３、
−配列番号１４、または
−配列番号１５
配列のものである、単離されたポリペプチド。
【請求項７】
請求項１から５のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコード化される単離されたセラミドキナーゼ様タンパク質。
【請求項８】
請求項１から５のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含んでなるベクター。
【請求項９】
発現系またはその一部が適合性の宿主細胞中に存在するとき、該発現系またはその一部がセラミドキナーゼ様タンパク質を生産することができる、請求項１から５のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含んでなる発現系。
【請求項１０】
請求項９に記載の発現系を含んでなる宿主細胞。
【請求項１１】
請求項６または７のいずれかに記載のセラミドキナーゼ様ポリペプチドに対する抗体。
【請求項１２】
請求項１から５のいずれかのポリヌクレオチド、請求項６または７のいずれかのポリペプチド、または請求項１１の抗体の、診断用試薬としての使用。
【請求項１３】
主な要素として
ａ）請求項１から５のいずれかに記載のポリヌクレオチド、
ｂ）ａ）のものと相補的なヌクレオチド配列、
ｃ）請求項６または７のいずれかに記載のセラミドキナーゼ様タンパク質、または
ｄ）請求項１１に記載のセラミドキナーゼ様タンパク質に対する抗体
を含む、疾患または疾患に対する感受性についての診断キット。
【請求項１４】
請求項６または７のいずれかに記載のセラミドキナーゼ様タンパク質のポリペプチドの、生産および／または生物学的活性を増加または減少させるアゴニストまたはアンタゴニストを同定する方法であって、
Ａ）
ａ）請求項６または７のいずれかに記載のセラミドキナーゼ様タンパク質のポリペプチド、
ｂ）ポリペプチドａ）を発現する組み換え細胞、
ｃ）ポリペプチドａ）を発現する細胞膜、または
ｄ）ポリペプチドａ）に対する抗体
を、候補化合物と接触させること
Ｂ）ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）のいずれかに対する候補化合物の効果を測定すること；および
Ｃ）ステップＢで測定したアゴニストまたはアンタゴニストを選択すること
を含んでなる方法。
【請求項１５】
該アゴニストまたはアンタゴニストが請求項１４に記載の方法によって提供されることを特徴とする、請求項６または７のいずれかに記載のセラミドキナーゼ様タンパク質のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニスト。
【請求項１６】
医薬として使用するための請求項１５に記載のアゴニストまたはアンタゴニスト。
【請求項１７】
セラミドキナーゼ様タンパク質が介在する異常な状態の処置法であって、治療上有効量の請求項１５に記載のアゴニストまたはアンタゴニストをかかる処置を必要とする対象に投与することを含んでなる方法。
【請求項１】
配列番号４配列の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号１配列のものである、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号２または配列番号３配列のものである、請求項１または２に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
−配列番号５、
−配列番号６、
−配列番号７、
−配列番号８、または
−配列番号９
配列のものである、請求項１から３のいずれかに記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
セラミドキナーゼ様タンパク質をコード化する請求項１から４のいずれかに記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
−配列番号１０、
−配列番号１１、
−配列番号１２、
−配列番号１３、
−配列番号１４、または
−配列番号１５
配列のものである、単離されたポリペプチド。
【請求項７】
請求項１から５のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコード化される単離されたセラミドキナーゼ様タンパク質。
【請求項８】
請求項１から５のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含んでなるベクター。
【請求項９】
発現系またはその一部が適合性の宿主細胞中に存在するとき、該発現系またはその一部がセラミドキナーゼ様タンパク質を生産することができる、請求項１から５のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含んでなる発現系。
【請求項１０】
請求項９に記載の発現系を含んでなる宿主細胞。
【請求項１１】
請求項６または７のいずれかに記載のセラミドキナーゼ様ポリペプチドに対する抗体。
【請求項１２】
請求項１から５のいずれかのポリヌクレオチド、請求項６または７のいずれかのポリペプチド、または請求項１１の抗体の、診断用試薬としての使用。
【請求項１３】
主な要素として
ａ）請求項１から５のいずれかに記載のポリヌクレオチド、
ｂ）ａ）のものと相補的なヌクレオチド配列、
ｃ）請求項６または７のいずれかに記載のセラミドキナーゼ様タンパク質、または
ｄ）請求項１１に記載のセラミドキナーゼ様タンパク質に対する抗体
を含む、疾患または疾患に対する感受性についての診断キット。
【請求項１４】
請求項６または７のいずれかに記載のセラミドキナーゼ様タンパク質のポリペプチドの、生産および／または生物学的活性を増加または減少させるアゴニストまたはアンタゴニストを同定する方法であって、
Ａ）
ａ）請求項６または７のいずれかに記載のセラミドキナーゼ様タンパク質のポリペプチド、
ｂ）ポリペプチドａ）を発現する組み換え細胞、
ｃ）ポリペプチドａ）を発現する細胞膜、または
ｄ）ポリペプチドａ）に対する抗体
を、候補化合物と接触させること
Ｂ）ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）のいずれかに対する候補化合物の効果を測定すること；および
Ｃ）ステップＢで測定したアゴニストまたはアンタゴニストを選択すること
を含んでなる方法。
【請求項１５】
該アゴニストまたはアンタゴニストが請求項１４に記載の方法によって提供されることを特徴とする、請求項６または７のいずれかに記載のセラミドキナーゼ様タンパク質のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニスト。
【請求項１６】
医薬として使用するための請求項１５に記載のアゴニストまたはアンタゴニスト。
【請求項１７】
セラミドキナーゼ様タンパク質が介在する異常な状態の処置法であって、治療上有効量の請求項１５に記載のアゴニストまたはアンタゴニストをかかる処置を必要とする対象に投与することを含んでなる方法。
【公表番号】特表２００７−５０３８４２（Ｐ２００７−５０３８４２Ａ）
【公表日】平成１９年３月１日（２００７．３．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５２９６８１（Ｐ２００６−５２９６８１）
【出願日】平成１６年４月７日（２００４．４．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００３７４０
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１０６５０９
【国際公開日】平成１６年１２月９日（２００４．１２．９）
【出願人】（５９７０１１４６３）ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト (942)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年３月１日（２００７．３．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年４月７日（２００４．４．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００３７４０
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１０６５０９
【国際公開日】平成１６年１２月９日（２００４．１２．９）
【出願人】（５９７０１１４６３）ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト (942)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]