セラミド合成促進剤及びそれを含有する皮膚外用剤
【課題】副作用が少なく、且つ安全性の高いセラミド合成促進剤及びそれを含有する皮膚外用剤を提供する。
【解決手段】ブクリョウの菌核から抽出物を取得し、これを有効成分とするセラミド合成促進剤を得、さらにこのセラミド合成促進剤を皮膚外用剤に配合してセラミド合成促進用皮膚外用剤。使用されるブクリョウは枯死したマツに生じるサルノコシカケ科の菌核であり、ブクリョウ抽出物はその外層を除いた菌核から抽出することができる。
【解決手段】ブクリョウの菌核から抽出物を取得し、これを有効成分とするセラミド合成促進剤を得、さらにこのセラミド合成促進剤を皮膚外用剤に配合してセラミド合成促進用皮膚外用剤。使用されるブクリョウは枯死したマツに生じるサルノコシカケ科の菌核であり、ブクリョウ抽出物はその外層を除いた菌核から抽出することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セラミド合成促進剤及びそれを含有する皮膚外用剤に関する。詳しくは、本発明は、ブクリョウ抽出物を有効成分とし、経皮吸収性、安全性等に優れたセラミド合成促進剤及びそれを含有する皮膚外用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
セラミドは表皮角化細胞で合成・蓄積され、細胞の分化に伴い放出されて角層の細胞間脂質の主要成分となる。セラミドはバリア機能や水分保持機能において重要な役割を担っており、これが減少すると乾燥肌や荒れ肌、老人性乾皮症の原因のひとつとなる。
【０００３】
従来は、セラミドの減少した皮膚に対してセラミドを含有した皮膚外用剤などの塗布が行われてきた。しかし、セラミドは皮膚への浸透性や、安全性の問題から十分な効果が得られていない。なお、種々の天然物の抽出成分がセラミド合成促進作用を有することが知られている（特許文献１，２，３参照）。
【０００４】
一方、ブクリョウ抽出物が細胞賦活作用や抗炎症作用を有することは知られており、化粧料等の外用剤へ配合して使用することが提案されている。しかしながら、ブクリョウ抽出物が特定のセラミド合成促進作用を有することは知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００２−３７０９９８
【特許文献２】特開２００６−１１１５６０
【特許文献３】特開２００５−１９４２４０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、経皮吸収性に優れ、副作用が少なく、且つ安全性の高いセラミド合成促進剤及びそれを含有する皮膚外用剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、ブクリョウ抽出物が、ＬＡＳＳ３、ＬＡＳＳ４と言ったセラミド合成酵素遺伝子の発現促進作用に優れること、特にＬＡＳＳ３の発現を促進する作用に優れること、及び同時に生体に対しては安全であることを見いだし、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下に示すセラミド産生促進剤及び皮膚外用剤に関する。
（１）ブクリョウ抽出物を有効成分とする、セラミド合成促進剤。
（２）（１）記載のセラミド合成促進剤を含有することを特徴とする、セラミド合成促進用皮膚外用剤。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、ブクリョウ抽出物を有効成分とするセラミド合成促進剤はセラミド合成促進作用に加え、セラミド分解酵素抑制作用などに優れ、副作用が少なく、且つ経皮吸収性及び人体への安全性が高い。よって、セラミド合成促進用皮膚外用剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の実施例１の結果を示すグラフである。
【図２】本発明の実施例２の結果を示すグラフである。
【図３】本発明の実施例３の結果を示すグラフである。
【図４】本発明の実施例４の結果を示すグラフである。
【図５】本発明の実施例５，比較例１の結果を示すグラフである。
【図６】本発明の実施例６，比較例２の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
（１）ブクリョウ抽出物
本発明に使用されるブクリョウは枯死したマツに生じるサルノコシカケ科の菌核であり、ブクリョウ抽出物はその外層を除いた菌核から抽出することができる。抽出物は、水、エタノール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等の親水性有機溶剤、又はこれらの混合物に浸漬し、得られた液をろ過して得られる。溶剤の温度及び浸漬時間は特に制限されない。このようにして得られるブクリョウ抽出物の形態は、粉末状、ゲル状、ペースト状などいずれであってもよい。
【００１２】
（２）セラミド合成促進剤
上記ブクリョウ抽出物は、そのままセラミド合成促進剤として利用することができる。特に、前記セラミド合成酵素としてＬＡＳＳ３に対し、優れた産生促進作用を有する。そして、セラミドの減少により引き起こされるとされる乾燥肌や荒れ肌、老人性乾皮症を抑制又は予防する作用が期待される。
【００１３】
（３）皮膚外用剤
本発明のセラミド合成促進剤はそのまま、あるいは皮膚外用剤へ配合して使用することができる。
皮膚外用剤中のブクリョウ抽出物の配合量は、特に限定されるものではないが、乾燥固形物重量で、総量を基準として０．０００１〜１０．０重量％が好ましく、更に好ましくは０．０００５〜５．０重量％、特に好ましくは０．０１〜５重量％である。該配合量が０．０００１重量％未満であると、本発明の効果が充分に得られない。
【００１４】
本発明の皮膚外用剤は、例えばローション類、乳液類、クリーム類、軟膏類、パック類等の剤型とすることができる。
また、本発明の皮膚外用剤には、上記セラミド合成促進制剤に加え、本発明の効果を損なわない範囲で必要に応じて医薬品類、医薬部外品類、化粧品類などの製剤に使用される成分や添加剤、例えば色素（着色剤）、防腐剤、界面活性剤、香料、顔料等を任意成分として適宜配合することができる。
【００１５】
そのような任意成分としては、例えば、マカデミアナッツ油、アボガド油、トウモロコシ油、オリーブ油、ナタネ油、ゴマ油、ヒマシ油、サフラワー油、綿実油、ホホバ油、ヤシ油、パーム油、液状ラノリン、硬化ヤシ油、硬化油、モクロウ、硬化ヒマシ油、ミツロウ、キャンデリラロウ、カルナウバロウ、イボタロウ、ラノリン、還元ラノリン、硬質ラノリン、ホホバロウ、鉱物油（ミネラルオイル）等のオイル、ワックス類、流動パラフィン、スクワラン、プリスタン、オゾケライト、パラフィン、セレシン、ワセリン、マイクロクリスタリンワックス等の炭化水素類；
【００１６】
イソオクタン酸セチル、ミリスチン酸イソプロピル、イソステアリン酸ヘキシルデシル、アジピン酸ジイソプロピル、セバチン酸ジ−２−エチルヘキシル、乳酸セチル、リンゴ酸ジイソステアリル、ジ−２−エチルヘキサン酸エチレングリコール、ジカプリン酸ネオペンチルグリコール、ジ−２−ヘプチルウンデカン酸グリセリン、トリ−２−エチルヘキサン酸グリセリン、トリ−２−エチルヘキサン酸トリメチロールプロパン、トリイソステアリン酸トリメチロールプロパン、テトラ−２−エチルヘキサン酸ペンタンエリトリット、水添ココグリセリル、ステアリン酸ポリグリセリル、パラオキシ安息香酸メチル（メチルパラベン）等のエステル類；
【００１７】
ジメチルポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサン、ジフェニルポリシロキサン等の鎖状ポリシロキサン、オクタメチルシクロテトラシロキサン、デカメチルシクロペンタシロキサン、ドデカメチルシクロヘキサンシロキサン等の環状ポリシロキサン、アミノ変性ポリシロキサン、ポリエーテル変性ポリシロキサン、アルキル変性ポリシロキサン、フッ素変性ポリシロキサン等の変性ポリシロキサン等のシリコーン油等の油剤類；
【００１８】
脂肪酸セッケン（ラウリン酸ナトリウム、パルミチン酸ナトリウム等）、ラウリル硫酸カリウム、アルキル硫酸トリエタノールアミンエーテル等のアニオン界面活性剤類、塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム、ラウリルアミンオキサイド等のカチオン界面活性剤類、イミダゾリン系両性界面活性剤（２−ココイル−２−イミダゾリニウムヒドロキサイド−１−カルボキシエチロキシ２ナトリウム塩等）、ベタイン系界面活性剤（アルキルベタイン、アミドベタイン、スルホベタイン等）、アシルメチルタウリン等の両性界面活性剤類、ソルビタン脂肪酸エステル類（ソルビタンモノステアレート、セスキオレイン酸ソルビタン等）、グリセリン脂肪酸類（モノステアリン酸グリセリン等）、プロピレングリコール脂肪酸エステル類（モノステアリン酸プロピレングリコール等）、硬化ヒマシ油誘導体、グリセリンアルキルエーテル、ショ糖脂肪酸エステル、アルキルグルコシド等の非イオン界面活性剤類等の界面活性剤類；
【００１９】
ポリエチレングリコール、１，３−ブチレングリコール、グリセリン等の多価アルコール類；
ステアリン酸等の高級脂肪酸類；
ピロリドンカルボン酸ナトリウム、乳酸、乳酸ナトリウム等の保湿成分類；
【００２０】
グアガム、クインスシード、カラギーナン、ガラクタン、アラビアガム、ペクチン、マンナン、デンプン、カードラン、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、メチルヒドロキシプロピルセルロース、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、グリコーゲン、ヘパラン硫酸、ヒアルロン酸ナトリウム、トラガントガム、ケラタン硫酸、コンドロイチン、ムコイチン硫酸、ヒドロキシエチルグアガム、カルボキシメチルグアガム、デキストラン、ケラト硫酸、ローカストビーンガム、サクシノグルカン、カロニン酸、キチン、キトサン、カルボキシメチルキチン、寒天、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー（カルボマー）、ポリアクリル酸ナトリウム等のポリアクリル酸及び／又はその塩、ポリエチレングリコール、ベントナイト、微粒子セルロースゲル等の増粘剤；
【００２１】
表面を処理されていても良い、マイカ、タルク、カオリン、合成雲母、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、無水ケイ酸（シリカ）、酸化アルミニウム、硫酸バリウム等の粉体類； 表面を処理されていても良い、ベンガラ、黄酸化鉄、黒酸化鉄、酸化コバルト、群青、紺青、酸化チタン、酸化亜鉛の無機顔料類；表面を処理されていても良い、雲母チタン、魚燐箔、オキシ塩化ビスマス等のパール剤類；レーキ化されていても良い赤色２０２号、赤色２２８号、赤色２２６号、黄色４号、青色４０４号、黄色５号、赤色５０５号、赤色２３０号、赤色２２３号、橙色２０１号、赤色２１３号、黄色２０４号、黄色２０３号、青色１号、緑色２０１号、紫色２０１号、赤色２０４号等の有機色素類；ポリエチレン末、ポリメタクリル酸メチル、ナイロン粉末、オルガノポリシロキサンエラストマー等の有機粉体類；
【００２２】
パラアミノ安息香酸系紫外線吸収剤、アントラニル酸系紫外線吸収剤、サリチル酸系紫外線吸収剤、桂皮酸系紫外線吸収剤、ベンゾフェノン系紫外線吸収剤、糖系紫外線吸収剤、２−（２’−ヒドロキシ−５’−ｔ−オクチルフェニル)ベンゾトリアゾール、４−メトキシ−４’−ｔ−ブチルジベンゾイルメタン等の紫外線吸収剤類；
【００２３】
エタノール、イソプロパノール等の低級アルコール類；
ビタミンＡ又はその誘導体、ビタミンＢ６塩酸塩、ビタミンＢ６トリパルミテート、ビタミンＢ６ジオクタノエート、ビタミンＢ２又はその誘導体、ビタミンＢ１２、ビタミンＢ１５又はその誘導体等のビタミンＢ類、α−トコフェロール、β−トコフェロール、γ−トコフェロール、ビタミンＥアセテート等のビタミンＥ類、ビタミンＤ類、ビタミンＨ、パントテン酸、パンテチン、ピロロキノリンキノン等のビタミン類；などが好ましく例示できる。
【実施例】
【００２４】
以下に、本発明を実施例に基づいてさらに詳しく説明する。ただし本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、以下の調製例及び実施例中％とあるのは、特に指定がない場合ｗ／ｗ％である。
【００２５】
＜製造例１＞（ブクリョウ抽出液含有サンプルの製造）
市販ブクリョウ抽出液（丸善製薬社製；固形分（蒸発残量）＝０．４％；溶媒＝水：１，３−ブチレングリコール＝５０：５０（重量比））を凍結乾燥後、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に再溶解し、１０％ブクリョウ溶液を作成した。これを各試験に使用する細胞培養用培地で希釈して、以下のような０．０５％，０．０１％、０．００２％および０．０００４％ブクリョウ抽出液含有サンプルとした。
・０．０５％ブクリョウ抽出液含有サンプル（ブクリョウ抽出物濃度；５００ｎｇ／ｌ）
・０．０１％ブクリョウ抽出液含有サンプル（ブクリョウ抽出物濃度；１００ｎｇ／ｌ）
・０．００２％ブクリョウ抽出液含有サンプル（ブクリョウ抽出物濃度；２０ｎｇ／ｌ）
・０．０００４％ブクリョウ抽出液含有サンプル（ブクリョウ抽出物濃度；４ｎｇ／ｌ）
【００２６】
＜実施例１＞（ブクリョウのセラミド合成促進効果）
ヒト表皮由来ケラチノサイト細胞株HaCaTを、φ６ｃｍ培養皿（Nunc）に、６．０×１０４cells/dishになるように、播種した。培地には５ｖ／ｖ％ウシ胎児血清を含むDulbecco's Minimum Essential Medium (Sigma)を使用し、７２時間培養した。細胞の状態を確認した後、培地を吸引除去し、０．０５％、０．０１％、０．００２％および０．０００４％ブクリョウ抽出液含有サンプル、１ｍＭニコチン酸（Sigma）を含有する上記培地に培地を交換した。培地交換７２時間後、細胞を回収し、該細胞中のＣ２４−セラミド量を薄相クロマトグラフィー法で、細胞の総タンパク質量をBCA Protein Assay kit (Pierce)によって測定し、単位タンパク質量当たりのセラミド合成量を算出した。結果を表１及び図−１に示す。
【００２７】
【表１】
【００２８】
＜実施例２＞（ブクリョウのセラミド合成酵素遺伝子発現促進効果）
ヒト表皮由来ケラチノサイト細胞株HaCaTを、φ６ｃｍ培養皿（Nunc）に、６．０×１０４cells/dishになるように、播種した。培地には５ｖ／ｖ％ウシ胎児血清を含むDulbecco's Minimum Essential Medium (Sigma)を使用し、７２時間培養した。細胞の状態を確認した後、培地を吸引除去し、０．０５％、０．０１％、０．００２％および０．０００４％ブクリョウ抽出液含有サンプル、１ｍＭニコチン酸（Sigma）を含有する上記培地に培地を交換した。培地交換７２時間後、細胞を回収し、該細胞中の全ＲＮＡを常法に従って抽出、逆転写酵素によるＤＮＡ合成およびリアルタイムＰＣＲ（使用機器；Real-time PCR Detector Chromo4；Bio Rad社製）によってＬＡＳＳ３及びＬＡＳＳ４遺伝子の発現量を測定した。結果を表２及び図−２に示す。
【００２９】
【表２】
【００３０】
＜実施例３＞（ブクリョウの細胞傷害性に対する影響）
ヒト表皮由来ケラチノサイト細胞株HaCaTを、φ６ｃｍ培養皿（Nunc）に、６．０×１０４cells/dishになるように、播種した。培地には５ｖ／ｖ％ウシ胎児血清を含むDulbecco's Minimum Essential Medium (Sigma)を使用し、７２時間培養した。細胞の状態を確認した後、培地を吸引除去し、０．０５％、０．０１％、０．００２％および０．０００４％ブクリョウ抽出液含有サンプル、ＤＭＳＯを含有する上記培地に培地を交換した。培地交換７２時間後、培養上清を回収し、ＬＤＨ測定キットで細胞破壊によって放出されたＬＤＨ量を、測定した。測定は以下の方法で行った（単位；吸光度（％））。結果を表３及び図−３に示す。
測定用試薬キット：宝酒造社製
測定波長：４９０ｎｍ
測定機器：Microplate Reader SH1000（Corona Electric社製）
【００３１】
【表３】
【００３２】
＜実施例４＞（ブクリョウの細胞毒性に対する影響）
ヒト表皮由来ケラチノサイト細胞株HaCaTを、φ６ｃｍ培養皿（Nunc）に、６．０×１０４cells/dishになるように、播種した。培地には５ｖ／ｖ％ウシ胎児血清を含むDulbecco's Minimum Essential Medium (Sigma)を使用し、７２時間培養した。細胞の状態を確認した後、培地を吸引除去し、０．０５％、０．０１％、０．００２％および０．０００４％ブクリョウ抽出液含有サンプル、ＤＭＳＯを含有する上記培地に培地を交換した。培地交換７２時間後、培養上清を除去し、常法に従ってニュートラルレッド細胞毒性試験を行い、ブクリョウの細胞増殖阻害を調べた。測定は以下の方法で行った（単位；吸光度（％））。結果を表４及び図−４に示す。
測定波長：５４０ｎｍ
測定機器：Microplate Reader SH1000（Corona Electric社製）
【００３３】
【表４】
【００３４】
＜実施例５、比較例１＞（荒れ肌における角層水分量に対する作用）
被験者９名（弾性７名、女性２名、２４〜６２歳、平均年齢４２．３±１２．５歳）を、試験製剤使用群と比較製剤使用群に２群に振り分けた。また、被検部位は有機溶媒（アセトン：エーテル＝１：１）を含有した脱脂綿とアルミホイルを載せて密着した状態で１５分間処理し、荒れ肌の状態にした。
表５に示した皮膚外用剤を調製し、試験製剤及び比較製剤とした。左右の前腕屈側部を被検部位とし、試験製剤（実施例５）あるいは比較製剤（比較例１）を、試験開始日の夜から１日２回（朝・夜）、約１ｇ／回を被検部位に塗布した。測定日の朝は試験製剤あるいは比較製剤の塗布を行わずに測定を行い、測定終了後に塗布した。また、いずれの製剤も塗布しない無塗布部を陰性対象とした。
有機溶媒処理前、有機溶媒処理後、製剤塗布３日後、及び８日後に表皮角層水分量を測定した。測定は以下に示す測定機器を用いて行い、塗布部位と陰性対象部位との表皮角層水分量の変化率（％）を以下の式で求めた。結果を表６及び図−５に示した。
測定機器：Corneometer CM825 (Courage+Khazaka社製）
計算式：（［塗布部位の表皮角層水分量］−［陰性対象部位の表皮角質水分量］／［陰性対象部位の表皮角質水分量］×１００（％））
【００３５】
【表５】
【００３６】
【表６】
【００３７】
＜実施例６、比較例２＞（荒れ肌におけるセラミド合成量に対する作用）
被験者９名（弾性７名、女性２名、２４〜６２歳、平均年齢４２．３±１２．５歳）を、試験製剤使用群と比較製剤使用群に２群に振り分けた。また、被検部位は有機溶媒（アセトン：エーテル＝１：１）を含有した脱脂綿とアルミホイルを載せて密着した状態で１５分間処理し、荒れ肌の状態にした。
【００３８】
表５に示した皮膚外用剤を調製し、試験製剤（実施例６）及び比較製剤（比較例２）とした。左右の前腕屈側部を被検部位とし、試験製剤（実施例６）あるいは比較製剤（比較例２）を、試験開始日の夜から１日２回（朝・夜）、約１ｇ／回を被検部位に塗布した。測定日の朝は試験製剤あるいは比較製剤の塗布を行わずに測定を行い、測定終了後に塗布した。また、いずれの製剤も塗布しない無塗布部を陰性対象とした。
【００３９】
有機溶媒処理前、有機溶媒処理後、製剤塗布３日後、及び８日後にアロンアルファＡ（第一三共株式会社製；商品名）を用いて被検部位より角層をストリッピングによって採取した。採取した角層の重量を秤量しセラミドを抽出後、薄層クロマトグラフィー法（使用機器；ChemiDoc XRS （Bio-Rad Laboratories社製））によって角層重量当たりのセラミド量（セラミド１〜６の合計）を測定し、角層採取日毎の総セラミド量（セラミド量×角層総重量）を求めた。
【００４０】
これらの測定結果から、以下の計算式で総セラミド量及びセラミド回復率（％）を求めた。結果を表７及び図−６に示した。
計算式：
（［総セラミド量］−［有機溶媒処理後総セラミド量］）／（［有機溶媒処理前総セラミド量］−［有機溶媒処理後総セラミド量］）×１００（％））
【００４１】
【表７】
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明によれば、ブクリョウ抽出物を有効成分とするセラミド合成促進剤は保湿作用に優れ、且つ副作用が少なく、セラミド合成促進用皮膚外用剤として有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セラミド合成促進剤及びそれを含有する皮膚外用剤に関する。詳しくは、本発明は、ブクリョウ抽出物を有効成分とし、経皮吸収性、安全性等に優れたセラミド合成促進剤及びそれを含有する皮膚外用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
セラミドは表皮角化細胞で合成・蓄積され、細胞の分化に伴い放出されて角層の細胞間脂質の主要成分となる。セラミドはバリア機能や水分保持機能において重要な役割を担っており、これが減少すると乾燥肌や荒れ肌、老人性乾皮症の原因のひとつとなる。
【０００３】
従来は、セラミドの減少した皮膚に対してセラミドを含有した皮膚外用剤などの塗布が行われてきた。しかし、セラミドは皮膚への浸透性や、安全性の問題から十分な効果が得られていない。なお、種々の天然物の抽出成分がセラミド合成促進作用を有することが知られている（特許文献１，２，３参照）。
【０００４】
一方、ブクリョウ抽出物が細胞賦活作用や抗炎症作用を有することは知られており、化粧料等の外用剤へ配合して使用することが提案されている。しかしながら、ブクリョウ抽出物が特定のセラミド合成促進作用を有することは知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００２−３７０９９８
【特許文献２】特開２００６−１１１５６０
【特許文献３】特開２００５−１９４２４０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、経皮吸収性に優れ、副作用が少なく、且つ安全性の高いセラミド合成促進剤及びそれを含有する皮膚外用剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、ブクリョウ抽出物が、ＬＡＳＳ３、ＬＡＳＳ４と言ったセラミド合成酵素遺伝子の発現促進作用に優れること、特にＬＡＳＳ３の発現を促進する作用に優れること、及び同時に生体に対しては安全であることを見いだし、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下に示すセラミド産生促進剤及び皮膚外用剤に関する。
（１）ブクリョウ抽出物を有効成分とする、セラミド合成促進剤。
（２）（１）記載のセラミド合成促進剤を含有することを特徴とする、セラミド合成促進用皮膚外用剤。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、ブクリョウ抽出物を有効成分とするセラミド合成促進剤はセラミド合成促進作用に加え、セラミド分解酵素抑制作用などに優れ、副作用が少なく、且つ経皮吸収性及び人体への安全性が高い。よって、セラミド合成促進用皮膚外用剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の実施例１の結果を示すグラフである。
【図２】本発明の実施例２の結果を示すグラフである。
【図３】本発明の実施例３の結果を示すグラフである。
【図４】本発明の実施例４の結果を示すグラフである。
【図５】本発明の実施例５，比較例１の結果を示すグラフである。
【図６】本発明の実施例６，比較例２の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
（１）ブクリョウ抽出物
本発明に使用されるブクリョウは枯死したマツに生じるサルノコシカケ科の菌核であり、ブクリョウ抽出物はその外層を除いた菌核から抽出することができる。抽出物は、水、エタノール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等の親水性有機溶剤、又はこれらの混合物に浸漬し、得られた液をろ過して得られる。溶剤の温度及び浸漬時間は特に制限されない。このようにして得られるブクリョウ抽出物の形態は、粉末状、ゲル状、ペースト状などいずれであってもよい。
【００１２】
（２）セラミド合成促進剤
上記ブクリョウ抽出物は、そのままセラミド合成促進剤として利用することができる。特に、前記セラミド合成酵素としてＬＡＳＳ３に対し、優れた産生促進作用を有する。そして、セラミドの減少により引き起こされるとされる乾燥肌や荒れ肌、老人性乾皮症を抑制又は予防する作用が期待される。
【００１３】
（３）皮膚外用剤
本発明のセラミド合成促進剤はそのまま、あるいは皮膚外用剤へ配合して使用することができる。
皮膚外用剤中のブクリョウ抽出物の配合量は、特に限定されるものではないが、乾燥固形物重量で、総量を基準として０．０００１〜１０．０重量％が好ましく、更に好ましくは０．０００５〜５．０重量％、特に好ましくは０．０１〜５重量％である。該配合量が０．０００１重量％未満であると、本発明の効果が充分に得られない。
【００１４】
本発明の皮膚外用剤は、例えばローション類、乳液類、クリーム類、軟膏類、パック類等の剤型とすることができる。
また、本発明の皮膚外用剤には、上記セラミド合成促進制剤に加え、本発明の効果を損なわない範囲で必要に応じて医薬品類、医薬部外品類、化粧品類などの製剤に使用される成分や添加剤、例えば色素（着色剤）、防腐剤、界面活性剤、香料、顔料等を任意成分として適宜配合することができる。
【００１５】
そのような任意成分としては、例えば、マカデミアナッツ油、アボガド油、トウモロコシ油、オリーブ油、ナタネ油、ゴマ油、ヒマシ油、サフラワー油、綿実油、ホホバ油、ヤシ油、パーム油、液状ラノリン、硬化ヤシ油、硬化油、モクロウ、硬化ヒマシ油、ミツロウ、キャンデリラロウ、カルナウバロウ、イボタロウ、ラノリン、還元ラノリン、硬質ラノリン、ホホバロウ、鉱物油（ミネラルオイル）等のオイル、ワックス類、流動パラフィン、スクワラン、プリスタン、オゾケライト、パラフィン、セレシン、ワセリン、マイクロクリスタリンワックス等の炭化水素類；
【００１６】
イソオクタン酸セチル、ミリスチン酸イソプロピル、イソステアリン酸ヘキシルデシル、アジピン酸ジイソプロピル、セバチン酸ジ−２−エチルヘキシル、乳酸セチル、リンゴ酸ジイソステアリル、ジ−２−エチルヘキサン酸エチレングリコール、ジカプリン酸ネオペンチルグリコール、ジ−２−ヘプチルウンデカン酸グリセリン、トリ−２−エチルヘキサン酸グリセリン、トリ−２−エチルヘキサン酸トリメチロールプロパン、トリイソステアリン酸トリメチロールプロパン、テトラ−２−エチルヘキサン酸ペンタンエリトリット、水添ココグリセリル、ステアリン酸ポリグリセリル、パラオキシ安息香酸メチル（メチルパラベン）等のエステル類；
【００１７】
ジメチルポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサン、ジフェニルポリシロキサン等の鎖状ポリシロキサン、オクタメチルシクロテトラシロキサン、デカメチルシクロペンタシロキサン、ドデカメチルシクロヘキサンシロキサン等の環状ポリシロキサン、アミノ変性ポリシロキサン、ポリエーテル変性ポリシロキサン、アルキル変性ポリシロキサン、フッ素変性ポリシロキサン等の変性ポリシロキサン等のシリコーン油等の油剤類；
【００１８】
脂肪酸セッケン（ラウリン酸ナトリウム、パルミチン酸ナトリウム等）、ラウリル硫酸カリウム、アルキル硫酸トリエタノールアミンエーテル等のアニオン界面活性剤類、塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム、ラウリルアミンオキサイド等のカチオン界面活性剤類、イミダゾリン系両性界面活性剤（２−ココイル−２−イミダゾリニウムヒドロキサイド−１−カルボキシエチロキシ２ナトリウム塩等）、ベタイン系界面活性剤（アルキルベタイン、アミドベタイン、スルホベタイン等）、アシルメチルタウリン等の両性界面活性剤類、ソルビタン脂肪酸エステル類（ソルビタンモノステアレート、セスキオレイン酸ソルビタン等）、グリセリン脂肪酸類（モノステアリン酸グリセリン等）、プロピレングリコール脂肪酸エステル類（モノステアリン酸プロピレングリコール等）、硬化ヒマシ油誘導体、グリセリンアルキルエーテル、ショ糖脂肪酸エステル、アルキルグルコシド等の非イオン界面活性剤類等の界面活性剤類；
【００１９】
ポリエチレングリコール、１，３−ブチレングリコール、グリセリン等の多価アルコール類；
ステアリン酸等の高級脂肪酸類；
ピロリドンカルボン酸ナトリウム、乳酸、乳酸ナトリウム等の保湿成分類；
【００２０】
グアガム、クインスシード、カラギーナン、ガラクタン、アラビアガム、ペクチン、マンナン、デンプン、カードラン、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、メチルヒドロキシプロピルセルロース、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、グリコーゲン、ヘパラン硫酸、ヒアルロン酸ナトリウム、トラガントガム、ケラタン硫酸、コンドロイチン、ムコイチン硫酸、ヒドロキシエチルグアガム、カルボキシメチルグアガム、デキストラン、ケラト硫酸、ローカストビーンガム、サクシノグルカン、カロニン酸、キチン、キトサン、カルボキシメチルキチン、寒天、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー（カルボマー）、ポリアクリル酸ナトリウム等のポリアクリル酸及び／又はその塩、ポリエチレングリコール、ベントナイト、微粒子セルロースゲル等の増粘剤；
【００２１】
表面を処理されていても良い、マイカ、タルク、カオリン、合成雲母、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、無水ケイ酸（シリカ）、酸化アルミニウム、硫酸バリウム等の粉体類； 表面を処理されていても良い、ベンガラ、黄酸化鉄、黒酸化鉄、酸化コバルト、群青、紺青、酸化チタン、酸化亜鉛の無機顔料類；表面を処理されていても良い、雲母チタン、魚燐箔、オキシ塩化ビスマス等のパール剤類；レーキ化されていても良い赤色２０２号、赤色２２８号、赤色２２６号、黄色４号、青色４０４号、黄色５号、赤色５０５号、赤色２３０号、赤色２２３号、橙色２０１号、赤色２１３号、黄色２０４号、黄色２０３号、青色１号、緑色２０１号、紫色２０１号、赤色２０４号等の有機色素類；ポリエチレン末、ポリメタクリル酸メチル、ナイロン粉末、オルガノポリシロキサンエラストマー等の有機粉体類；
【００２２】
パラアミノ安息香酸系紫外線吸収剤、アントラニル酸系紫外線吸収剤、サリチル酸系紫外線吸収剤、桂皮酸系紫外線吸収剤、ベンゾフェノン系紫外線吸収剤、糖系紫外線吸収剤、２−（２’−ヒドロキシ−５’−ｔ−オクチルフェニル)ベンゾトリアゾール、４−メトキシ−４’−ｔ−ブチルジベンゾイルメタン等の紫外線吸収剤類；
【００２３】
エタノール、イソプロパノール等の低級アルコール類；
ビタミンＡ又はその誘導体、ビタミンＢ６塩酸塩、ビタミンＢ６トリパルミテート、ビタミンＢ６ジオクタノエート、ビタミンＢ２又はその誘導体、ビタミンＢ１２、ビタミンＢ１５又はその誘導体等のビタミンＢ類、α−トコフェロール、β−トコフェロール、γ−トコフェロール、ビタミンＥアセテート等のビタミンＥ類、ビタミンＤ類、ビタミンＨ、パントテン酸、パンテチン、ピロロキノリンキノン等のビタミン類；などが好ましく例示できる。
【実施例】
【００２４】
以下に、本発明を実施例に基づいてさらに詳しく説明する。ただし本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、以下の調製例及び実施例中％とあるのは、特に指定がない場合ｗ／ｗ％である。
【００２５】
＜製造例１＞（ブクリョウ抽出液含有サンプルの製造）
市販ブクリョウ抽出液（丸善製薬社製；固形分（蒸発残量）＝０．４％；溶媒＝水：１，３−ブチレングリコール＝５０：５０（重量比））を凍結乾燥後、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に再溶解し、１０％ブクリョウ溶液を作成した。これを各試験に使用する細胞培養用培地で希釈して、以下のような０．０５％，０．０１％、０．００２％および０．０００４％ブクリョウ抽出液含有サンプルとした。
・０．０５％ブクリョウ抽出液含有サンプル（ブクリョウ抽出物濃度；５００ｎｇ／ｌ）
・０．０１％ブクリョウ抽出液含有サンプル（ブクリョウ抽出物濃度；１００ｎｇ／ｌ）
・０．００２％ブクリョウ抽出液含有サンプル（ブクリョウ抽出物濃度；２０ｎｇ／ｌ）
・０．０００４％ブクリョウ抽出液含有サンプル（ブクリョウ抽出物濃度；４ｎｇ／ｌ）
【００２６】
＜実施例１＞（ブクリョウのセラミド合成促進効果）
ヒト表皮由来ケラチノサイト細胞株HaCaTを、φ６ｃｍ培養皿（Nunc）に、６．０×１０４cells/dishになるように、播種した。培地には５ｖ／ｖ％ウシ胎児血清を含むDulbecco's Minimum Essential Medium (Sigma)を使用し、７２時間培養した。細胞の状態を確認した後、培地を吸引除去し、０．０５％、０．０１％、０．００２％および０．０００４％ブクリョウ抽出液含有サンプル、１ｍＭニコチン酸（Sigma）を含有する上記培地に培地を交換した。培地交換７２時間後、細胞を回収し、該細胞中のＣ２４−セラミド量を薄相クロマトグラフィー法で、細胞の総タンパク質量をBCA Protein Assay kit (Pierce)によって測定し、単位タンパク質量当たりのセラミド合成量を算出した。結果を表１及び図−１に示す。
【００２７】
【表１】
【００２８】
＜実施例２＞（ブクリョウのセラミド合成酵素遺伝子発現促進効果）
ヒト表皮由来ケラチノサイト細胞株HaCaTを、φ６ｃｍ培養皿（Nunc）に、６．０×１０４cells/dishになるように、播種した。培地には５ｖ／ｖ％ウシ胎児血清を含むDulbecco's Minimum Essential Medium (Sigma)を使用し、７２時間培養した。細胞の状態を確認した後、培地を吸引除去し、０．０５％、０．０１％、０．００２％および０．０００４％ブクリョウ抽出液含有サンプル、１ｍＭニコチン酸（Sigma）を含有する上記培地に培地を交換した。培地交換７２時間後、細胞を回収し、該細胞中の全ＲＮＡを常法に従って抽出、逆転写酵素によるＤＮＡ合成およびリアルタイムＰＣＲ（使用機器；Real-time PCR Detector Chromo4；Bio Rad社製）によってＬＡＳＳ３及びＬＡＳＳ４遺伝子の発現量を測定した。結果を表２及び図−２に示す。
【００２９】
【表２】
【００３０】
＜実施例３＞（ブクリョウの細胞傷害性に対する影響）
ヒト表皮由来ケラチノサイト細胞株HaCaTを、φ６ｃｍ培養皿（Nunc）に、６．０×１０４cells/dishになるように、播種した。培地には５ｖ／ｖ％ウシ胎児血清を含むDulbecco's Minimum Essential Medium (Sigma)を使用し、７２時間培養した。細胞の状態を確認した後、培地を吸引除去し、０．０５％、０．０１％、０．００２％および０．０００４％ブクリョウ抽出液含有サンプル、ＤＭＳＯを含有する上記培地に培地を交換した。培地交換７２時間後、培養上清を回収し、ＬＤＨ測定キットで細胞破壊によって放出されたＬＤＨ量を、測定した。測定は以下の方法で行った（単位；吸光度（％））。結果を表３及び図−３に示す。
測定用試薬キット：宝酒造社製
測定波長：４９０ｎｍ
測定機器：Microplate Reader SH1000（Corona Electric社製）
【００３１】
【表３】
【００３２】
＜実施例４＞（ブクリョウの細胞毒性に対する影響）
ヒト表皮由来ケラチノサイト細胞株HaCaTを、φ６ｃｍ培養皿（Nunc）に、６．０×１０４cells/dishになるように、播種した。培地には５ｖ／ｖ％ウシ胎児血清を含むDulbecco's Minimum Essential Medium (Sigma)を使用し、７２時間培養した。細胞の状態を確認した後、培地を吸引除去し、０．０５％、０．０１％、０．００２％および０．０００４％ブクリョウ抽出液含有サンプル、ＤＭＳＯを含有する上記培地に培地を交換した。培地交換７２時間後、培養上清を除去し、常法に従ってニュートラルレッド細胞毒性試験を行い、ブクリョウの細胞増殖阻害を調べた。測定は以下の方法で行った（単位；吸光度（％））。結果を表４及び図−４に示す。
測定波長：５４０ｎｍ
測定機器：Microplate Reader SH1000（Corona Electric社製）
【００３３】
【表４】
【００３４】
＜実施例５、比較例１＞（荒れ肌における角層水分量に対する作用）
被験者９名（弾性７名、女性２名、２４〜６２歳、平均年齢４２．３±１２．５歳）を、試験製剤使用群と比較製剤使用群に２群に振り分けた。また、被検部位は有機溶媒（アセトン：エーテル＝１：１）を含有した脱脂綿とアルミホイルを載せて密着した状態で１５分間処理し、荒れ肌の状態にした。
表５に示した皮膚外用剤を調製し、試験製剤及び比較製剤とした。左右の前腕屈側部を被検部位とし、試験製剤（実施例５）あるいは比較製剤（比較例１）を、試験開始日の夜から１日２回（朝・夜）、約１ｇ／回を被検部位に塗布した。測定日の朝は試験製剤あるいは比較製剤の塗布を行わずに測定を行い、測定終了後に塗布した。また、いずれの製剤も塗布しない無塗布部を陰性対象とした。
有機溶媒処理前、有機溶媒処理後、製剤塗布３日後、及び８日後に表皮角層水分量を測定した。測定は以下に示す測定機器を用いて行い、塗布部位と陰性対象部位との表皮角層水分量の変化率（％）を以下の式で求めた。結果を表６及び図−５に示した。
測定機器：Corneometer CM825 (Courage+Khazaka社製）
計算式：（［塗布部位の表皮角層水分量］−［陰性対象部位の表皮角質水分量］／［陰性対象部位の表皮角質水分量］×１００（％））
【００３５】
【表５】
【００３６】
【表６】
【００３７】
＜実施例６、比較例２＞（荒れ肌におけるセラミド合成量に対する作用）
被験者９名（弾性７名、女性２名、２４〜６２歳、平均年齢４２．３±１２．５歳）を、試験製剤使用群と比較製剤使用群に２群に振り分けた。また、被検部位は有機溶媒（アセトン：エーテル＝１：１）を含有した脱脂綿とアルミホイルを載せて密着した状態で１５分間処理し、荒れ肌の状態にした。
【００３８】
表５に示した皮膚外用剤を調製し、試験製剤（実施例６）及び比較製剤（比較例２）とした。左右の前腕屈側部を被検部位とし、試験製剤（実施例６）あるいは比較製剤（比較例２）を、試験開始日の夜から１日２回（朝・夜）、約１ｇ／回を被検部位に塗布した。測定日の朝は試験製剤あるいは比較製剤の塗布を行わずに測定を行い、測定終了後に塗布した。また、いずれの製剤も塗布しない無塗布部を陰性対象とした。
【００３９】
有機溶媒処理前、有機溶媒処理後、製剤塗布３日後、及び８日後にアロンアルファＡ（第一三共株式会社製；商品名）を用いて被検部位より角層をストリッピングによって採取した。採取した角層の重量を秤量しセラミドを抽出後、薄層クロマトグラフィー法（使用機器；ChemiDoc XRS （Bio-Rad Laboratories社製））によって角層重量当たりのセラミド量（セラミド１〜６の合計）を測定し、角層採取日毎の総セラミド量（セラミド量×角層総重量）を求めた。
【００４０】
これらの測定結果から、以下の計算式で総セラミド量及びセラミド回復率（％）を求めた。結果を表７及び図−６に示した。
計算式：
（［総セラミド量］−［有機溶媒処理後総セラミド量］）／（［有機溶媒処理前総セラミド量］−［有機溶媒処理後総セラミド量］）×１００（％））
【００４１】
【表７】
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明によれば、ブクリョウ抽出物を有効成分とするセラミド合成促進剤は保湿作用に優れ、且つ副作用が少なく、セラミド合成促進用皮膚外用剤として有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブクリョウ抽出物を有効成分とする、セラミド合成促進剤。
【請求項２】
請求項１記載のセラミド合成促進剤を含有することを特徴とする、セラミド合成促進用皮膚外用剤。
【請求項１】
ブクリョウ抽出物を有効成分とする、セラミド合成促進剤。
【請求項２】
請求項１記載のセラミド合成促進剤を含有することを特徴とする、セラミド合成促進用皮膚外用剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１２−３６１６２（Ｐ２０１２−３６１６２Ａ）
【公開日】平成２４年２月２３日（２０１２．２．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１８０６５１（Ｐ２０１０−１８０６５１）
【出願日】平成２２年８月１２日（２０１０．８．１２）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 「第３５回日本香粧品学会 講演要旨」 発行所 第３５回日本香粧品学会事務局 発行日 平成２２年５月２０日 該当ページ 第３４ページ
【出願人】（５０４４０１９９４）株式会社セプテム総研 (11)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年２月２３日（２０１２．２．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年８月１２日（２０１０．８．１２）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 「第３５回日本香粧品学会 講演要旨」 発行所 第３５回日本香粧品学会事務局 発行日 平成２２年５月２０日 該当ページ 第３４ページ
【出願人】（５０４４０１９９４）株式会社セプテム総研 (11)
【Ｆターム（参考）】
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