セラミド産生促進剤の製造方法
【課題】特定微生物を利用し、入手易い大豆残渣を培地の主原料として用いることで、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を安価で効率良く得る方法の提供。
【解決手段】本発明は、大豆残渣および糖類を含有する培地中で細菌を培養し、培養上清からセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を採取する、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造方法を提供する。
【解決手段】本発明は、大豆残渣および糖類を含有する培地中で細菌を培養し、培養上清からセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を採取する、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生を促進させることができるセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚はセラミド（ceramide）及びグルコシルセラミド(glucosylceramide)を産生する能力を有する。皮膚では、特に表皮角質層において、表皮細胞によって合成分泌されたセラミドが集積しており、細胞間脂質の主成分となっている。皮膚表皮細胞で合成されたセラミドは一旦グルコシルセラミドまたはスフィンゴミエリン（sphingomyelin）の形で蓄えられたあと、細胞外へ排出されて、β−グルコセレブロシダーゼ（glucocerebrosidase）とスフィンゴミエリナーゼ（sphingomyelinase）の作用を受けて、再びセラミドとなり、細胞間脂質として機能する。皮膚におけるセラミド及びグルコシルセラミドは、皮膚の保湿機能及び皮膚のバリヤ機能を向上させるなどの生理作用を有する。
【０００３】
しかし、近年、環境、気候等の影響によって、皮膚が乾燥しやすい状態にある。従って、皮膚自らのセラミド等の産生により皮膚の保湿機能を向上させる能力が十分ではなくなる。
【０００４】
従って、外部から皮膚にセラミドを補充する方法が考えられる。例えば、特許文献１には、キャンディダ（Candida）属に属する微生物を培養してグルコシルセラミドを製造する方法が記載されている。当該グルコシルセラミドをヒトの乾燥性の皮膚へ塗布することによって皮膚の保湿機能を向上できる。その方法が、培養後の菌体中に多く存在するグルコシルセラミドを直接に取得する方法であるので、その方法で合成されたグルコシルセラミドのセラミド骨格は、２重結合が２箇所に存在し、且つ、分岐を有するため、ヒト生体中に存在するセラミド類のセラミド骨格と異なる。よって、このような、微生物の体内から直接に取得されたグルコシルセラミドを人の皮膚へ塗布すると、皮膚に適応できなく、使用上の安全性に関する問題を生じる恐れがある。
【０００５】
また、特許文献６に、酢酸菌から酢酸菌型セラミドを得る方法が報告されている。しかし、この方法で得られるセラミドは、上記のような人の皮膚に適応できないという問題も存在している。また、このような方法では、菌体内から抽出してセラミドを得るという工程等が必要であるので、工程が複雑になり、コストも高くなるという問題も存在している。
【０００６】
また、外部から皮膚にセラミドを補充する方法は、従来から用いられていた保湿剤などと同様に、保湿効果の持続性の点で不十分であるという問題もある。また、皮膚の状態によって、外部から補充されたセラミド等を吸収することが不十分であり、保湿効果が十分発揮されない場合がある。
【０００７】
一方、皮膚自らのセラミド又はグルコシルセラミド産生能力を増強または促進させることができれば、外からセラミド又はグルコシルセラミドを補充する必要がなく、皮膚自身がセラミド及び／又はグルコシルセラミドを産生することで皮膚のバリヤ機能、水分保持機能を向上させることが可能であると考えられている。さらに、このように得られたセラミド及び／又はグルコシルセラミドは皮膚自身から産生されたものであるため、通常の皮膚が有する構造のセラミドなどが合成され、皮膚への適応性がよくない等の安全性問題が無くなると考えられる。
【０００８】
そこで、最近では、皮膚の角質層において、表皮セラミドの生成の促進を目的とした物質を生産する研究が活発に進められている。ここでセラミドの生成を促進し得る物質としては、マンネンタケ、ビーポーレン（Ｂｅｅ Ｐｏｌｌｅｎ）、センキュウなどの抽出物を有効成分とするセラミド産生促進剤が報告されている（特許文献２〜４）。しかし、これらのセラミド産生促進剤がいずれも植物性原料から抽出したものであり、この抽出操作には長時間を要し、天然資源の利用可能性には制限があるため、製造コストは高い。
【０００９】
また、特許文献５には、皮膚表層内部で表皮細胞自身のセラミド合成を活発化させ得る、ニコチン酸および/またはニコチンアミドを含む菌培養物を有効成分とするセラミド合成促進剤であって、当該菌培養物は乳酸菌培養物、ビフィズス菌培養物、きのこ菌体培養物または酵母菌培養物であってもよいことが開示されている。しかし、そのセラミド合成促進剤を調製するために用いられる培地は、実質的にニコチン酸および/またはニコチンアミドを有効成分とするため、製造コストが高い。
【００１０】
一方、複数の属の細菌、例えば、Bacillus属の細菌、Lactobacillus属の細菌、Acetobacter属の細菌、Leuconostoc属の細菌等が食品等の工業に広く用いられていることが知られている。
【００１１】
Bacillus属の微生物（細菌）が、水中や土壌に普遍的に存在するものである。なかでも、高pHや低温、高塩濃度、高圧といった様々な極限環境にも適応している種も多い。Bacillus属には、種々の酵素（食品用、洗剤用、ほか多種多様な産業用酵素）の生産に用いられる等、枯草菌を筆頭として極めて有用性の高い種を含む。
【００１２】
また、Lactobacillus属の微生物はヒトや動物の消化管に多く存在しており、その糞便から分離され、また、野外からも容易に分離される。Lactobacillus属の微生物が、ヨーグルト等の製造に古くから用いられた。
【００１３】
また、Acetobacter属の微生物が、エタノールを酸化させて酢酸とし、それをさらに酸化させて二酸化炭素にすることが可能であるものである。Acetobacter属の微生物が、一般、ビール、果実の酒及び花果上に分布している。Acetobacter属の微生物が、アルコールの低い酒の変質を起こすことができ、食べた酢を醸造することに用いることができる。
【００１４】
また、Leuconostoc属の微生物が植物、乳製品及び他の食品中に広く分布しているものである。Leuconostoc mesenteroidesがLeuconostoc属の菌において重要な菌である。研究によって、Leuconostoc mesenteroidesが、糖類を発酵させて多種の酸とアルコールを生じることができ、高い酸生産能力、抗酸化能力及び拮抗病原菌などの能力を有することが確認された。Leuconostoc mesenteroides菌が、すでに風味剤、血漿代用品、マイクロ生態調合剤などに広く応用されている。
【００１５】
しかし、従来では、細菌（特に、上記の各属の細菌）によって、セラミド又はグルコシルセラミド産生促進剤を安価で効率良く製造することがまだ報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】特開２０１０−２２２１７号公報
【特許文献２】特開２００５−１９４２４０号公報
【特許文献３】特開２０１０−７０４９９号公報
【特許文献４】特開２０１０−１５０２３７号公報
【特許文献５】特開平９−１９４３８３号公報
【特許文献６】特開２００６−３４５７９６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明は、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を安価で効率良く製造する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、大豆残渣および糖類を含有する培地中で細菌を培養して、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を安価で効率良く得ることができることを見出し、本発明をなすに至ったものである。
【００１９】
本発明は、大豆残渣および糖類を含有する培地中で細菌を培養し、培養上清からセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を採取する、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造方法を提供する。
【００２０】
また、本発明は、大豆残渣および糖類を含有する培地中で細菌を培養して得られる、大豆残渣の発酵エキスのセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤に関する。
また、本発明は、大豆残渣および糖類を含有する培地中で細菌を培養して得られる、大豆残渣の発酵エキスのセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤としての使用に関する。
また、本発明は、大豆残渣および糖類を含有する培地中で細菌を培養して得られる、大豆残渣の発酵エキスのセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造のための使用に関する。
【００２１】
本発明で用いられる細菌は、Bacillus属の細菌、Lactobacillus属の細菌、Acetobacter属の細菌、及びLeuconostoc属の細菌から選ばれる何れかのものであってもよい。
【発明の効果】
【００２２】
本発明に係る製造方法によれば、特定微生物を利用し大豆残渣のような入手が容易であるものを培地の主原料として用いることで、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を安価で効率良く得ることができる。当該促進剤は、皮膚の持つセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生能力を効率的に向上させることができるため、皮膚の保湿機能を有効に向上させることもできる。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明の製造方法は、大豆残渣および糖類を含有する培地中で細菌を培養し、培養上清からセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を採取する。
【００２４】
本発明で用いられる細菌は、Bacillus属の細菌、Lactobacillus属の細菌、Acetobacter属の細菌、及びLeuconostoc属の細菌から選ばれる何れかのものであってもよい。
【００２５】
本発明に使用されるBacillus属に属する微生物としては、Bacillus subtilis、Bacillus acidicola、Bacillus gibsonii、Bacillus licheniformis、Bacillus alcalophilus、Bacillus cereus、Bacillus pumilus、Bacillus sphaericus、Bacillus diffusus、Bacillus globigii、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus coagulans、Bacillus megaterium、Bacillus mucilaginosus、Bacillus mycoides、Bacillus thuringiensis、Bacillus circulans、Bacillus mucilaginosus、Bacillus stearothermophilus等が挙げられる。
このうち、得られる成分がより高いセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進効果を有するという観点から、Bacillus subtilis、Bacillus acidicola、Bacillus gibsonii、Bacillus licheniformisが好ましい。
【００２６】
本発明に使用されるLactobacillus属に属する微生物としては、Lactobacillus brevis、Lactobacillus farciminis、Lactobacillus pentosus、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus coryniformi、Lactobacillus curvatus、Lactobacillus alimentarius、Lactobacillus rhamnosus、Lactobacillus casei、Lactobacillus buchneri、Lactobacillus cellobiosus、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus murinus、Lactobacillus fermentum、Lactobacillus helveticus等が挙げられる。
このうち、得られる成分がより高いセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進効果を有するという観点から、Lactobacillus brevis、Lactobacillus farciminis、Lactobacillus pentosus、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus coryniformi、Lactobacillus curvatus、Lactobacillus alimentariusが好ましい。
【００２７】
本発明に使用されるAcetobacter属に属する微生物としては、Acetobacter aceti、Acetobacter tropicalis、Acetobacter pasteurianus等が挙げられる。
このうち、、得られる成分がより高いセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進効果を有するという観点から、Acetobacter acetiが好ましい。
【００２８】
本発明に使用されるLeuconostoc属に属する微生物としては、Leuconostoc mesenteroides、Leuconostoc lactis、Leuconostoc gelidum、Leuconostoc carnosum、Leuconostoc fallax、Leuconostoc citreum、Leuconostoc argentinum、Leuconostoc pseudomesenteroides等が挙げられる。
このうち、得られる成分がより高いセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進効果を有するという観点から、Leuconostoc mesenteroidesが好ましい。
【００２９】
本発明にかかる微生物（細菌）は、何れも、中国普通微生物保蔵管理中心（CGMCC）及び中国典型培養物保蔵中心（CCTCC）、中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIM: Culture & Information Center of Industrial Microorganism of China Universities）などの商業ルートで購入できるのもである。
【００３０】
また、本発明の製造方法においては、上記微生物を１種類単独で又は２種類以上を組み合わせて用いることができる。
【００３１】
本発明において用いる培地としては、大豆残渣と糖類とを含有するものである。大豆残渣も糖類も入手やすい原料であるため、本発明の培地が従来より安価上で優れた利点を有する。また、その他に１％のペプトン、０.５％の酵母粉等を適宜添加してもよい。
【００３２】
本発明で使われる大豆残渣は、大豆を水に浸漬し、水を吸収させて、粉砕、濾過を経て、水を除去して、乾燥して、得られたものが好ましい。食品産業において豆乳を搾り取ったという大豆製品を製造する工程で残した大豆残渣、例えばおから等を用いることも可能である。
【００３３】
糖類としては、例えば葡萄糖、麦芽糖、蔗糖などが挙がられる。また、それらが、いずれかを単独、または混合して使用できる。セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進効果を向上させるという観点から、葡萄糖を好適に用いることができる。
【００３４】
本発明においては、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進の効果を高めるという観点から、培地は、大豆残渣、葡萄糖及び水からなるのが好ましい。その中に大豆残渣を５〜２０％（ｗ/ｖ）、より好ましくは８〜１２％（ｗ/ｖ）、葡萄糖を０．２〜２％（ｗ/ｖ）、より好ましくは０.８〜１．２％（ｗ/ｖ）含有することが好ましい。
【００３５】
細菌との微生物の生理的な特性、及びセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進の効果を高める観点から、２７〜３５℃の培養温度で上記培養を行うことが好ましい。
【００３６】
細菌との微生物の生理的な特性、及びセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進の効果を高める観点から、１〜７日、より好ましくは４８〜９６時間、更に好ましくは６８〜７６時間で培養するのが好ましい。
【００３７】
製品の純度を高める観点から、前記培養により得られた培養液を精製して、上清を得る。精製の方法としては、ろ過、遠心分離、イオン交換または吸着クロマトグラフィー、溶媒抽出、結晶化などの通常用いられる操作を必要に応じて適宜組み合わせて行われてもよい。また、遠心分離などにより上清を得ることが好ましい。遠心分離の回転数は、２０００〜４０００rpmが好ましく、２５００〜３５００rpmがより好ましい。遠心分離の時間は、０〜２０分が好ましく、５〜１５分がより好ましい。
【００３８】
遠心分離して得られた上記上清にエタノールを加えて殺菌し、本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤としてもよい。
【００３９】
また、遠心分離して培養液から菌体を除去し、次いで超音波処理し、遠心分離して上清を回収する。再び、回収した上清をろ過して夾雑物などを除き、さらに真空で乾燥処理して本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤としてもよい。
【００４０】
本発明の細菌を培養し、培養上清から得た大豆残渣の発酵エキスは、正常ヒト角化細胞において、セラミド及び／又はグルコシルセラミドの量を増加させる作用を有する。
【００４１】
従って、本発明の細菌を培養し、培養上清から得られた大豆残渣の発酵エキスは、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進のための治療目的又は非治療目的の使用ができ、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤としての治療目的又は非治療目的の使用もできる。非治療目的の使用には、美容目的の使用や、健康状態の維持のための使用などが含まれる。また、上記のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進のための、治療目的の使用と、非治療目的の使用は、分けて行われることもできる。
【００４２】
また、本発明の細菌を培養し、培養上清から得た大豆残渣の発酵エキスは、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を製造するために使用できる。
【００４３】
本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤は、角質層中のセラミド及び／又はグルコシルセラミドを増加させ、皮膚のバリア機能及び保湿機能を回復及び向上するための医薬品、医薬部外品、化粧品等としても使用できる。また、本発明のセラミド又はグルコシルセラミド産生促進剤は、セラミド又はグルコシルセラミド産生促進をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した医薬部外品、化粧品として使用することもできる。
【００４４】
本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の使用形態としては、培養細胞へ添加するための添加剤とすることができ、皮膚洗浄剤、メイクアップ化粧料などの皮膚外用剤へ配合することもできる。例えば、ローション、乳液、ゲル、クリーム、軟膏剤等の種々の形態で提供することができる。外用剤の基剤としては、公知の外用基剤でよく、特に限定されない。このような種々の皮膚外用剤を調製するには、本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を単独で、又は、皮膚洗浄剤、メイクアップ化粧料などの皮膚外用剤に配合される、通常の油性成分、保湿剤、粉体、色素、乳化剤、可溶化剤、紫外線吸収剤、増粘剤、薬効成分、香料、防菌防黴剤、植物抽出物、アルコール類等を適宜組み合わせて用いることができる。
【００４５】
本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を、培養表皮細胞系へ添加してセラミド及び／又はグルコシルセラミド合成を促進する場合の添加量は、促進剤の乾燥物（固形分換算）として、０．０００１〜１０ｗ/ｖ％、特に０．００１〜５ｗ/ｖ％が好ましい。添加量が０．００１ｗ/ｖ％以上であると、産生促進の効果を十分にすることになる。添加量が１０ｗ/ｖ％以下であると、表皮細胞への刺激が少ないという点で好ましい。
【００４６】
本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の皮膚外用剤への配合量は、大豆残渣の発酵エキスの乾燥物（固形分換算）として、セラミド及び／又はグルコシルセラミド合成を十分に促進して皮膚の保湿能力を効率的に高め、しかも培養物の色や臭いが出にくいことから、全皮膚外用剤の０．０１〜２０ｗ/ｖ％とするのが好ましく、特に好ましくは０．１〜１０ｗ/ｖ％である。
【実施例】
【００４７】
次に、本発明を実施例により詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
なお、実施例に使用された微生物が、いずれも江南大学から購入され、中国高校工業微生物資源および情報センターCICIMに受託されていたものである。
【００４８】
（実施例１−１）
＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞
まず、以下の方法で培地を調製した。大豆を水に入れ、１２時間含浸し、大豆に水を十分に吸収させた。水を吸収した大豆を研削して粉砕し、濾過、滴り乾燥し、大豆残渣を得た。当該大豆残渣を、大豆残渣の濃度が１０ｗ/ｖ％、ブドウ糖の濃度が１ｗ/ｖ％になるように、ブドウ糖及び水と混合して、培地とした。
次いで、上記培地１００ｍｌを三角フラスコに入れ、Bacillus subtilis（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B1677として受託されている。）を規定の量で接種し、３０℃で３日間培養した。
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、当該ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料１−Ａ、１−Ｂとし、さらに、試料１−Ａ、１−Ｂをそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【００４９】
＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の評価＞
（細胞培養）
まず、正常ヒトの活性化角化細胞（Cascade Co., Ltd）を初代細胞として、７５ｃｍ2の培養フラスコ（増殖因子を含有する培地２ｍｌ）に、７℃、５％ＣＯ2のインキュベーターにて８０〜９０％コンフルエントの状態に達するまで培養した。継代細胞を１７５ｃｍ2の培養フラスコに８０〜９０％コンフルエントの状態に達するまでに持続培養した。継代培養した後のヒト表皮角化細胞を１２well Plate （細胞数１×１０5個/ｍＬ）に２ｍＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ2のインキュベーターにて８０〜９０％コンフルエントの状態に達するまで持続培養した。
次いで、上記１２well Plateにおいて増殖因子を含有しない培地を変更し、本発明の製品（試料１−Ａ、１−Ｂ）及びコントロール（50v/v%のエタノール溶液）を当該１２well Plate（n=2）に添加した。同じ条件で３日間培養した。
その後、上清の培養液を除去し、PBS（２ｍＬ/Ｗｅｌｌ）にて細胞を２回洗浄した後、１ｍＬＰＢＳを入れ、各々の細胞をセルハーベスターで試験管に回収した。それを、後のセラミド、グルコシルセラミド及び蛋白質の量を解析するための試料とした。
【００５０】
（セラミド/グルコシルセラミド産生促進効果の確認）
前記回収された細胞を含むＰＢＳ液に、まず、メタノール：クロロホルム（２．５ｍｌ：１．２５ｍｌ）加え攪拌し、次に、２０分間振とうした。その後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）を行い、上清aと沈殿bを取り分けて、その上清aをセラミド/グルコシルセラミド量の解析に供し、沈殿bを次のタンパク量解析に供した。
（１）セラミド/グルコシルセラミド量の解析
上清aにPBS：クロロホルム（１．２５ｍｌ：１．２５ｍｌ）を入れ、２０分間振動し、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）を行い、下相にあるクロロホルム層を単離、回収した。回収されたクロロホルム層を３０℃、窒素雰囲気で乾固させた。乾燥品をクロロホルム−メタノール混合溶媒（容量比＝２.５ｍｌ：１.２５ｍｌ）１００μｌに溶解し、下記の薄層クロマトグラフィーによりセラミド量及びグルコシルセラミド量の定量に供した。
セラミド（又はグルコシルセラミド）標準品と試料溶液とを乾燥のTLC板に入れ、展開溶媒であるクロロホルム：メタノール：酢酸＝１９０：９：１（ｖ/ｖ/ｖ）で薄層クロマトグラフィーを行った。展開剤がＴＣＬ板のトップに到達した後、ドライヤーで展開剤を乾燥した。次いで上記操作を１回繰り返した。その後、展開溶媒であるクロロホルム：メタノール：アセトン＝７６：２０：４（ｖ/ｖ/ｖ）で薄層クロマトグラフィーを行った。展開剤がＴＣＬ板のボタムからの２．５ｃｍの位置に到達した後、展開を停止し、ドライヤーで展開剤を乾燥した。硫酸銅のリン酸溶液を吹き、乾燥して、ＴＣＬ板を１８０℃のヒータに置き７分間加熱して顕色させた。顕色されたTLC板をスキャンしてセラミド（又はグルコシルセラミド）の量（それぞれをCer及びGlyCerとし、単位μｇ/ｍＬ）を解析した。
【００５１】
（２）タンパク量の解析
細胞中のセラミド量及びグルコシルセラミド量を表示するためにタンパク量の解析を行った。上記沈殿ｂに、９００μｌ ＳＤＳ（ドデシルスルホン酸ナトリウム）溶液を入れ、混合し、６０℃で２時間加熱した後、タンパク質を変性・降解させ、冷却した。次いで、１００μｌ ２Ｎ ＨＣｌを加え、ＢＣＡ Ｋｉｔ法（タンパク量の解析用のキット）によりタンパク量（Proと記する。μｇ/ｍＬ）を測定した。
【００５２】
（３）解析の結果
本発明品とコントロールの試料のそれぞれに対して、下式のように、Cer/ProとGlyCer/Proを測定した。前記コントロールのCer/ProとGlyCer/Proのそれぞれを１とした場合の、本発明のCer/ProとGlyCer/Proの相対値を算出して表１に示した。また、前記コントロールのwellあたりのタンパク量を１００とした場合の、本発明のwellあたりのタンパク量の相対値（Pro.（％））を算出して、それによりwellあたりのセラミドの量及びグルコシルセラミド量（コントロールに対する相対量）を求めた。合わせて表１に示した。
Cer/Well=Cer/Pro×Pro.(%)
GlyCer/Well=GlyCer/Pro×Pro.(%)
【００５３】
なお、Cer/Pro（又はCer/Well）が１（コントロール）よりも高い場合、当該試料がセラミド産生促進効果を有すると見なされる。また、GlyCer/Pro（又はGlyCer/Well）が１（コントロール）よりも高い場合、当該試料がグルコシルセラミド産生促進効果を有すると見なされる。
【００５４】
表１から明らかなように、実施例１−１の試料１−Ａ、１−Ｂは、セラミド及びグルコシルセラミド産生促進効果が認められた。
【００５５】
（実施例１−２）
実施例１−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Bacillus属の微生物として、Bacillus subtilis（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B1923として受託されている。）を使用した以外、実施例１−１と同様に培養した。
【００５６】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、当該ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料１−Ｃ、１−Ｄとし、さらに、試料１−Ｃ、１−Ｄをそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【００５７】
実施例１−１と同様にして、試料１−Ｃ、１−Ｄのセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表１に示した。
【００５８】
表１から明らかなように、実施例１−２の試料１−Ｃ、１−Ｄは、セラミド及び/またはグルコシルセラミド産生促進効果が認められた。
【００５９】
（実施例１−３）
実施例００５１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Bacillus属の微生物として、Bacillus acidicola（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B1297として受託されている。）を使用した以外、実施例１−１と同様に培養した。
【００６０】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料１−Ｅとし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【００６１】
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料１−Ｆ、１−Ｇとし、さらに、試料１−Ｆ、１−Ｇをそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【００６２】
実施例１−１と同様にして、試料１−Ｅ、１−Ｆ、１−Ｇのセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表１に示した。
【００６３】
表１から明らかなように、実施例１−３の試料１−Ｅ、１−Ｇは、セラミド産生促進効果が認められた。
【００６４】
（実施例１−４）
【００６５】
実施例１−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Bacillus属の微生物として、Bacillus gibsonii（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B1171として受託されている。）を使用した以外、実施例１−１と同様に培養した。
【００６６】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料１−Ｈとし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【００６７】
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料１−Ｉ、１−Ｊとし、さらに、試料１−Ｉ、１−Ｊをそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【００６８】
実施例１−１と同様にして、試料１−Ｈ、１−Ｉ、１−Ｊのセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表１に示した。
【００６９】
表１から明らかなように、実施例１−４の試料１−Ｈ、１−Ｉ、１−Ｊは、セラミド及び/またはグルコシルセラミド産生促進効果が認められた。
【００７０】
（実施例１−５）
【００７１】
実施例１−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Bacillus属の微生物として、Bacillus licheniformis（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B1294として受託されている。）を使用した以外、実施例１−１と同様に培養した。
【００７２】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料１−Ｋとし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【００７３】
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料１−Ｌ、１−Ｍとし、さらに、試料１−Ｌ、１−Ｍをそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【００７４】
実施例１−１と同様にして、試料１−Ｋ、１−Ｌ、１−Ｍのセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表１に示した。
【００７５】
表１から明らかなように、実施例１−５の試料１−Ｋ、１−Ｌ、１−Ｍは、セラミド及び/またはグルコシルセラミド産生促進効果が認められた。
【００７６】
（実施例１−６）
【００７７】
実施例１−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Bacillus属の微生物として、Bacillus licheniformis（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B1282として受託されている。）を使用した以外、実施例１−１と同様に培養した。
【００７８】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料１−Ｎとし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【００７９】
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料１−Ｏ、１−Ｐとし、さらに、試料１−Ｏ、１−Ｐをそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【００８０】
実施例１−１と同様にして、試料１−Ｎ、１−Ｏ、１−Ｐのセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表１に示した。
【００８１】
表１から明らかなように、実施例１−６の試料１−Ｎ、１−Ｏ、１−Ｐは、セラミド及び/またはグルコシルセラミド産生促進効果が認められた。
【００８２】
（実施例１−７）
【００８３】
実施例１−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Bacillus属の微生物として、Bacillus licheniformis（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B1298として受託されている。）を使用した以外、実施例１−１と同様に培養した。
【００８４】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、当該ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料１−Ｑ、１−Ｒとし、さらに、試料１−Ｑ、１−Ｒをそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【００８５】
実施例１−１と同様にして、試料１−Ｑ、１−Ｒのセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表１に示した。
【００８６】
表１から明らかなように、実施例１−７の試料１−Ｑ、１−Ｒは、グルコシルセラミド産生促進効果が認められた。
【００８７】
【表１】
【００８８】
なお、試料１−Ａ〜１−Ｒについて、それらを上記ヒトの活性化角化細胞を含む１２well Plateに加えることを行わない（即ち、上記細胞培養を行わない）ままで、セラミド量及びグルコシルセラミド量の解析を行った。上記以外は、上記実施例１−１と同様にした。その結果は、試料１−Ａ〜１−Ｒの何れかの自身にもセラミド又はグルコシルセラミドが存在しないことが確認された。
これから、本発明の製品自身には、セラミド又はグルコシルセラミドが存在しないが、本発明の製品が、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進の効果を有し、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤として用いることが分かる。
【００８９】
（実施例２−１）
＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞
まず、以下の方法で培地を調製した。大豆を水に入れ、１２時間含浸し、大豆に水を十分に吸収させた。水を吸収した大豆を研削して粉砕し、濾過、滴り乾燥し、大豆残渣を得た。当該大豆残渣を、大豆残渣の濃度が１０ｗ/ｖ％、ブドウ糖の濃度が１ｗ/ｖ％になるように、ブドウ糖及び水と混合して、培地とした。
次いで、上記培地１００ｍｌを三角フラスコに入れ、Lactobacillus brevis（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B1257として受託されている。）を規定の量で接種し、３０℃で３日間培養した。
【００９０】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ａ-１とし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ａ-２、２−Ａ-３とし、さらに、試料２−Ａ-２、２−Ａ-３をそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【００９１】
＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の評価＞
（細胞培養）
まず、正常ヒトの活性化角化細胞（Cascade Co., Ltd）を初代細胞として、７５ｃｍ2の培養フラスコ（増殖因子を含有する培地２ｍｌ）に、７℃、５％ＣＯ2のインキュベーターにて８０〜９０％コンフルエントの状態に達するまで培養した。継代細胞を１７５ｃｍ2の培養フラスコに８０〜９０％コンフルエントの状態に達するまでに持続培養した。継代培養した後のヒト表皮角化細胞を１２well Plate （細胞数１×１０5個/ｍＬ）に２ｍＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ2のインキュベーターにて８０〜９０％コンフルエントの状態に達するまで持続培養した。
【００９２】
次いで、上記１２well Plateにおいて増殖因子を含有しない培地を変更し、本発明の製品（試料２−Ａ-１、２−Ａ-２、２−Ａ-３）及びコントロール（50v/v%のエタノール溶液）を当該１２well Plate（n=2）に添加した。同じ条件で３日間培養した。
【００９３】
その後、上清の培養液を除去し、PBS（２ｍＬ/Ｗｅｌｌ）にて細胞を２回洗浄した後、１ｍＬＰＢＳを入れ、各々の細胞をセルハーベスターで試験管に回収した。それを、後のセラミド、グルコシルセラミド及び蛋白質の量を解析するための試料とした。
【００９４】
（セラミド/グルコシルセラミド産生促進効果の確認）
前記回収された細胞を含むＰＢＳ液に、まず、メタノール：クロロホルム（２．５ｍｌ：１．２５ｍｌ）加え攪拌し、次に、２０分間振とうした。その後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）を行い、上清aと沈殿bを取り分けて、その上清aをセラミド/グルコシルセラミド量の解析に供し、沈殿bを次のタンパク量解析に供した。
【００９５】
（１）セラミド/グルコシルセラミド量の解析
上清aにPBS：クロロホルム（１．２５ｍｌ：１．２５ｍｌ）を入れ、２０分間振動し、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）を行い、下相にあるクロロホルム層を単離、回収した。回収されたクロロホルム層を３０℃、窒素雰囲気で乾固させた。乾燥品をクロロホルム−メタノール混合溶媒（容量比＝２.５ｍｌ：１.２５ｍｌ）１００μｌに溶解し、下記の薄層クロマトグラフィーによりセラミド量及びグルコシルセラミド量の定量に供した。
【００９６】
セラミド（又はグルコシルセラミド）標準品と試料溶液とを乾燥のTLC板に入れ、展開溶媒であるクロロホルム：メタノール：酢酸＝１９０：９：１（ｖ/ｖ/ｖ）で薄層クロマトグラフィーを行った。展開剤がＴＣＬ板のトップに到達した後、ドライヤーで展開剤を乾燥した。次いで上記操作を１回繰り返した。その後、展開溶媒であるクロロホルム：メタノール：アセトン＝７６：２０：４（ｖ/ｖ/ｖ）で薄層クロマトグラフィーを行った。展開剤がＴＣＬ板のボタムからの２．５ｃｍの位置に到達した後、展開を停止し、ドライヤーで展開剤を乾燥した。硫酸銅のリン酸溶液を吹き、乾燥して、ＴＣＬ板を１８０℃のヒータに置き７分間加熱して顕色させた。顕色されたTLC板をスキャンしてセラミド（又はグルコシルセラミド）の量（それぞれをCer及びGlyCerとし、単位μｇ/ｍＬ）を解析した。
【００９７】
（２）タンパク量の解析
細胞中のセラミド量及びグルコシルセラミド量を表示するためにタンパク量の解析を行った。上記沈殿ｂに、９００μｌ ＳＤＳ（ドデシルスルホン酸ナトリウム）溶液を入れ、混合し、６０℃で２時間加熱した後、タンパク質を変性・降解させ、冷却した。次いで、１００μｌ ２Ｎ ＨＣｌを加え、ＢＣＡ Ｋｉｔ法（タンパク量の解析用のキット）によりタンパク量（Proと記する。μｇ/ｍＬ）を測定した。
【００９８】
（３）解析の結果
本発明品とコントロールの試料のそれぞれに対して、Cer/ProとGlyCer/Proを測定した。前記コントロールのCer/ProとGlyCer/Proのそれぞれを１とした場合の、本発明のCer/ProとGlyCer/Proの相対値を算出して表２に示した。また、前記コントロールのwellあたりのタンパク量を１００とした場合の、本発明のwellあたりのタンパク量の相対値（Pro.（％））を算出して、それによりwellあたりのセラミドの量及びグルコシルセラミド量（コントロールに対する相対量）を求めた。これらの結果を合わせて表２に示した。
Cer/Well=Cer/Pro×Pro.(%)
GlyCer/Well=GlyCer/Pro×Pro.(%)
【００９９】
なお、Cer/Pro（又はCer/Well）が１（コントロール）よりも高い場合、当該試料がセラミド産生促進効果を有すると見なされる。また、GlyCer/Pro（又はGlyCer/Well）が１（コントロール）よりも高い場合、当該試料がグルコシルセラミド産生促進効果を有すると見なされる。
【０１００】
表２から明らかなように、実施例２−１の試料２−Ａ-１、２−Ａ-２、２−Ａ-３は、グルコシルセラミド産生促進効果を果たすことが確認された。
【０１０１】
（実施例２−２）
実施例２−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Lactobacillus属の微生物として、Lactobacillus brevis（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B1199として受託されている。）を使用した以外、実施例２−１と同様に培養した。
【０１０２】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｂ-１とし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【０１０３】
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｂ-２、２−Ｂ-３とし、さらに、試料２−Ｂ-２、２−Ｂ-３をそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０１０４】
実施例２−１と同様にして、試料２−Ｂ-１、２−Ｂ-２、２−Ｂ-３のセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表２に示した。
【０１０５】
表２から明らかなように、実施例２−２の試料２−Ｂ-１、２−Ｂ-２、２−Ｂ-３は、グルコシルセラミド産生促進効果を果たすことが確認された。
【０１０６】
【表２】
【０１０７】
（実施例２−３）
実施例２−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Lactobacillus属の微生物として、Lactobacillus farciminis（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B1173として受託されている。）を使用した以外、実施例２−１と同様に培養した。
【０１０８】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｃ-１とし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【０１０９】
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｃ-２、２−Ｃ-３とし、さらに、試料２−Ｃ-２、２−Ｃ-３をそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０１１０】
実施例２−１と同様にして、試料２−Ｃ-１、２−Ｃ-２、２−Ｃ-３のセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表３に示した。
【０１１１】
表３から明らかなように、実施例２−３の試料２−Ｃ-１、２−Ｃ-２、２−Ｃ-３は、セラミド産生促進効果を果たすことが確認された。
【０１１２】
【表３】
【０１１３】
（実施例２−４）
実施例２−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Lactobacillus属の微生物として、Lactobacillus pentosus（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B1174として受託されている。）を使用した以外、実施例２−１と同様に培養した。
【０１１４】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｄ-１とし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【０１１５】
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｄ-２、２−Ｄ-３とし、さらに、試料２−Ｄ-２、２−Ｄ-３をそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０１１６】
実施例２−１と同様にして、試料２−Ｄ-１、２−Ｄ-２、２−Ｄ-３のセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表４に示した。
【０１１７】
表４から明らかなように、実施例２−４の試料２−Ｄ-１、２−Ｄ-２、２−Ｄ-３は、セラミド産生促進効果を果たすことが確認された。
【０１１８】
【表４】
【０１１９】
（実施例２−５）
実施例２−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Lactobacillus属の微生物として、Lactobacillus plantarum（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B1172として受託されている。）を使用した以外、実施例２−１と同様に培養した。
【０１２０】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｅ-１とし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【０１２１】
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｅ-２、２−Ｅ-３とし、さらに、試料２−Ｅ-２、２−Ｅ-３をそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０１２２】
実施例２−１と同様にして、試料２−Ｅ-１、２−Ｅ-２、２−Ｅ-３のセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表５に示した。
【０１２３】
表５から明らかなように、実施例２−５の試料２−Ｅ-１、２−Ｅ-２、２−Ｅ-３は、グルコシルセラミド産生促進効果を果たすことが確認された。
【０１２４】
（実施例２−６）
実施例２−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Lactobacillus属の微生物として、Lactobacillus plantarum（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B1189として受託されている。）を使用した以外、実施例２−１と同様に培養した。
【０１２５】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、当該ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｆ-１、２−Ｆ-２とし、さらに、試料２−Ｆ-１、２−Ｆ-２をそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０１２６】
実施例２−１と同様にして、試料２−Ｆ-１、２−Ｆ-２のセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表５に示した。
【０１２７】
表５から明らかなように、実施例２−６の試料２−Ｆ-１、２−Ｆ-２は、セラミド及びグルコシルセラミド産生促進効果を果たすことが確認された。
【０１２８】
（実施例２−７）
実施例２−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Lactobacillus属の微生物として、Lactobacillus plantarum（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B1187として受託されている。）を使用した以外、実施例２−１と同様に培養した。
【０１２９】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、当該ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｇ-１とし、さらに、試料２−Ｇ-１を５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０１３０】
実施例２−１と同様にして、試料２−Ｇ-１のセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表５に示した。
【０１３１】
表５から明らかなように、実施例２−７の試料２−Ｇ-１は、セラミド及びグルコシルセラミド産生促進効果を果たすことが確認された。
【０１３２】
（実施例２−８）
実施例２−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Lactobacillus属の微生物として、Lactobacillus plantarum（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B1170として受託されている。）を使用した以外、実施例２−１と同様に培養した。
【０１３３】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｈ-１とし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【０１３４】
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｈ-２、２−Ｈ-３とし、さらに、試料２−Ｈ-２、２−Ｈ-３をそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０１３５】
実施例２−１と同様にして、試料２−Ｈ-１、２−Ｈ-２、２−Ｈ-３のセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表５に示した。
【０１３６】
表５から明らかなように、実施例２−８の試料２−Ｈ-１、２−Ｈ-２、２−Ｈ-３は、セラミド及び/又はグルコシルセラミド産生促進効果を果たすことが確認された。
【０１３７】
（実施例２−９）
実施例２−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Lactobacillus属の微生物として、Lactobacillus plantarum（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B1188として受託されている。）を使用した以外、実施例２−１と同様に培養した。
【０１３８】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｉ-１とし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【０１３９】
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｉ-２とし、さらに、試料２−Ｉ-２を５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０１４０】
実施例２−１と同様にして、試料２−Ｉ-１、２−Ｉ-２のセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表５に示した。
【０１４１】
表５から明らかなように、実施例２−９の試料２−Ｉ-１、２−Ｉ-２は、グルコシルセラミド産生促進効果を果たすことが確認された。
【０１４２】
【表５】
【０１４３】
（実施例２−１０）
実施例２−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Lactobacillus属の微生物として、Lactobacillus coryniformis（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B1243として受託されている。）を使用した以外、実施例２−１と同様に培養した。
【０１４４】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｊ-１とし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【０１４５】
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｊ-２、２−Ｊ−３とし、さらに、試料２−Ｉ-２、２−Ｊ−３をそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０１４６】
実施例２−１と同様にして、試料２−Ｊ-１、２−Ｊ-２、２−Ｊ−３のセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表６に示した。
【０１４７】
表６から明らかなように、実施例２−１０の試料２−Ｊ-１、２−Ｊ-２、２−Ｊ−３は、セラミド及び/又はグルコシルセラミド産生促進効果を果たすことが確認された。
【０１４８】
（実施例２−１１）
実施例２−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Lactobacillus属の微生物として、Lactobacillus coryniformis（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B1190として受託されている。）を使用した以外、実施例２−１と同様に培養した。
【０１４９】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｋ-１とし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【０１５０】
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｋ-２、２−Ｋ-３とし、さらに、試料２−Ｋ-２、２−Ｋ-３ををそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０１５１】
実施例２−１と同様にして、試料２−Ｋ-１、２−Ｋ-２、２−Ｋ-３のセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表６に示した。
【０１５２】
表６から明らかなように、実施例２−１１の試料２−Ｋ-１は、グルコシルセラミド産生促進効果を果たすことが確認された。
【０１５３】
（実施例２−１２）
実施例２−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Lactobacillus属の微生物として、Lactobacillus coryniformis（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B1259として受託されている。）を使用した以外、実施例２−１と同様に培養した。
【０１５４】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｌ-１とし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【０１５５】
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｌ-２、２−Ｌ-３とし、さらに、試料２−Ｌ-２、２−Ｌ-３をそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０１５６】
実施例２−１と同様にして、試料２−Ｌ-１、２−Ｌ-２、２−Ｌ-３のセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表６に示した。
【０１５７】
表６から明らかなように、実施例６１２の試料６Ｌ-２、６Ｌ-３は、グルコシルセラミド産生促進効果を果たすことが確認された。
【０１５８】
【表６】
【０１５９】
（実施例２−１３）
実施例２−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Lactobacillus属の微生物として、Lactobacillus curvatus（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B1248として受託されている。）を使用した以外、実施例２−１と同様に培養した。
【０１６０】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｍ-１とし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【０１６１】
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｍ-２、２−Ｍ−３とし、さらに、試料２−Ｍ-２、２−Ｍ−３をそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０１６２】
実施例２−１と同様にして、試料２−Ｍ-１、２−Ｍ-２、２−Ｍ−３のセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表７に示した。
【０１６３】
表７から明らかなように、実施例２−１３の試料２−Ｍ-１、２−Ｍ−３は、セラミド及び/又はグルコシルセラミド産生促進効果を果たすことが確認された。
【０１６４】
（実施例２−１４）
実施例２−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Lactobacillus属の微生物として、Lactobacillus curvatus（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B1413として受託されている。）を使用した以外、実施例２−１と同様に培養した。
【０１６５】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｎ-１とし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【０１６６】
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｎ-２、２−Ｎ−３とし、さらに、試料２−Ｎ-２、２−Ｎ−３をそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０１６７】
実施例２−１と同様にして、試料２−Ｎ-１、２−Ｎ-２、２−Ｎ−３のセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表７に示した。
【０１６８】
表７から明らかなように、実施例２−１４の試料２−Ｎ-２は、セラミド及びグルコシルセラミド産生促進効果を果たすことが確認された。
【０１６９】
【表７】
【０１７０】
（実施例２−１５）
実施例２−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Lactobacillus属の微生物として、Lactobacillus plantarum（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B1430として受託されている。）を使用した以外、実施例２−１と同様に培養した。
【０１７１】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｏ-１とし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【０１７２】
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｏ-２、２−Ｏ-３とし、さらに、試料２−Ｏ-２、２−Ｏ-３をそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０１７３】
実施例２−１と同様にして、試料２−Ｏ-１、２−Ｏ-２、２−Ｏ-３のセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表８に示した。
【０１７４】
表８から明らかなように、実施例２−１５の試料２−Ｏ-１、２−Ｏ-２、２−Ｏ-３は、セラミド及び/又はグルコシルセラミド産生促進効果を果たすことが確認された。
【０１７５】
（実施例２−１６）
実施例２−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Lactobacillus属の微生物として、Lactobacillus plantarum（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B1441として受託されている。）を使用した以外、実施例２−１と同様に培養した。
【０１７６】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｐ-１とし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【０１７７】
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｐ-２、２−Ｐ-３とし、さらに、試料２−Ｐ-２、２−Ｐ-３をそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０１７８】
実施例２−１と同様にして、試料２−Ｐ-１、２−Ｐ-２、２−Ｐ-３のセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表８に示した。
【０１７９】
表８から明らかなように、実施例２−１６の試料２−Ｐ-１、２−Ｐ-２、２−Ｐ-３は、セラミド及び/又はグルコシルセラミド産生促進効果を果たすことが確認された。
【０１８０】
（実施例２−１７）
実施例２−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Lactobacillus属の微生物として、Lactobacillus plantarum（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B1191として受託されている。）を使用した以外、実施例２−１と同様に培養した。
【０１８１】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｑ-１とし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【０１８２】
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｑ-２、２−Ｑ-３とし、さらに、試料２−Ｑ-２、２−Ｑ-３をそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０１８３】
実施例２−１と同様にして、試料２−Ｑ-１、２−Ｑ-２、２−Ｑ-３のセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表８に示した。
【０１８４】
表８から明らかなように、実施例２−１７の試料２−Ｑ-１、２−Ｑ-２、２−Ｑ-３は、セラミド及び/又はグルコシルセラミド産生促進効果を果たすことが確認された。
【０１８５】
（実施例２−１８）
実施例２−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Lactobacillus属の微生物として、Lactobacillus plantarum（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B1179として受託されている。）を使用した以外、実施例２−１と同様に培養した。
【０１８６】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｒ-１とし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【０１８７】
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｒ-２、２−Ｒ-３とし、さらに、試料２−Ｒ-２、２−Ｒ-３をそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０１８８】
実施例２−１と同様にして、試料２−Ｒ-１、２−Ｒ-２、２−Ｒ-３のセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表８に示した。
【０１８９】
表８から明らかなように、実施例２−１８の試料２−Ｒ-１、２−Ｒ-２、２−Ｒ-３は、グルコシルセラミド産生促進効果を果たすことが確認された。
【０１９０】
（実施例２−１９）
実施例２−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Lactobacillus属の微生物として、Lactobacillus plantarum（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B1249として受託されている。）を使用した以外、実施例２−１と同様に培養した。
【０１９１】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、当該ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｓ-１、２−Ｓ-２とし、さらに、試料２−Ｓ-１、２−Ｓ-２をそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０１９２】
実施例２−１と同様にして、試料２−Ｓ-１、２−Ｓ-２のセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表８に示した。
【０１９３】
表８から明らかなように、実施例２−１９の試料２−Ｓ-１、２−Ｓ-２は、グルコシルセラミド産生促進効果を果たすことが確認された。
【０１９４】
（実施例２−２０）
実施例２−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Lactobacillus属の微生物として、Lactobacillus plantarum（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B1250として受託されている。）を使用した以外、実施例２−１と同様に培養した。
【０１９５】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｔ-１とし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【０１９６】
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｔ-２とし、さらに、試料２−Ｔ-２を５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０１９７】
実施例２−１と同様にして、試料２−Ｔ-１、２−Ｔ-２のセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表８に示した。
【０１９８】
表８から明らかなように、実施例２−２０の試料２−Ｔ-１、２−Ｔ-２は、グルコシルセラミド産生促進効果を果たすことが確認された。
【０１９９】
（実施例２−２１）
実施例２−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Lactobacillus属の微生物として、Lactobacillus plantarum（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B1255として受託されている。）を使用した以外、実施例２−１と同様に培養した。
【０２００】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｕ-１とし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【０２０１】
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｕ-２、２−Ｕ-３とし、さらに、試料２−Ｕ-２、２−Ｕ-３をそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０２０２】
実施例２−１と同様にして、試料２−Ｕ-１、２−Ｕ-２、２−Ｕ-３のセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表８に示した。
【０２０３】
表８から明らかなように、実施例２−２１の試料２−Ｕ-１、２−Ｕ-２、２−Ｕ-３は、グルコシルセラミド産生促進効果を果たすことが確認された。
【０２０４】
（実施例２−２２）
実施例２−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Lactobacillus属の微生物として、Lactobacillus plantarum（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B1433として受託されている。）を使用した以外、実施例２−１と同様に培養した。
【０２０５】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｖ-１とし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【０２０６】
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｖ-２、２−Ｖ-３とし、さらに、試料２−Ｖ-２、２−Ｖ-３をそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０２０７】
実施例２−１と同様にして、試料２−Ｖ-１、２−Ｖ-２、２−Ｖ-３のセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表８に示した。
【０２０８】
表８から明らかなように、実施例２−２２の試料２−Ｖ-１、２−Ｖ-２、２−Ｖ-３は、グルコシルセラミド産生促進効果を果たすことが確認された。
【０２０９】
（実施例２−２３）
実施例２−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Lactobacillus属の微生物として、Lactobacillus plantarum（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B1432として受託されている。）を使用した以外、実施例２−１と同様に培養した。
【０２１０】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｗ-１とし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【０２１１】
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｗ-２、２−Ｗ-３とし、さらに、試料２−Ｗ-２、２−Ｗ-３をそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０２１２】
実施例２−１と同様にして、試料２−Ｗ-１、２−Ｗ-２、２−Ｗ-３のセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表８に示した。
【０２１３】
表８から明らかなように、実施例２−２３の試料２−Ｗ-１、２−Ｗ-２、２−Ｗ-３は、セラミド及びグルコシルセラミド産生促進効果を果たすことが確認された。
【０２１４】
（実施例２−２４）
実施例２−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Lactobacillus属の微生物として、Lactobacillus plantarum（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B1442として受託されている。）を使用した以外、実施例２−１と同様に培養した。
【０２１５】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｘ-１とし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【０２１６】
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｘ-２、２−Ｘ-３とし、さらに、試料２−Ｘ-２、２−Ｘ-３をそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０２１７】
実施例２−１と同様にして、試料２−Ｘ-１、２−Ｘ-２、２−Ｘ-３のセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表８に示した。
【０２１８】
表８から明らかなように、実施例２−２４の試料２−Ｘ-１、２−Ｘ-２、２−Ｘ-３は、セラミド及びグルコシルセラミド産生促進効果を果たすことが確認された。
【０２１９】
【表８】
【０２２０】
（実施例２−２５）
実施例２−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Lactobacillus属の微生物として、Lactobacillus alimentarius（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B1439として受託されている。）を使用した以外、実施例２−１と同様に培養した。
【０２２１】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、当該ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｙ-１、２−Ｙ-２とし、さらに、試料２−Ｙ-１、２−Ｙ-２をそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０２２２】
実施例２−１と同様にして、試料２−Ｙ-１、２−Ｙ-２のセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表９に示した。
【０２２３】
表９から明らかなように、実施例２−２５の試料２−Ｙ-１、２−Ｙ-２は、セラミド及び/又はグルコシルセラミド産生促進効果を果たすことが確認された。
【０２２４】
（実施例２−２６）
実施例２−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Lactobacillus属の微生物として、Lactobacillus alimentarius（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B1440として受託されている。）を使用した以外、実施例２−１と同様に培養した。
【０２２５】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、当該ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｚ-１とし、さらに、試料２−Ｚ-１を５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０２２６】
実施例２−１と同様にして、試料２−Ｚ-１のセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表９に示した。
【０２２７】
表９から明らかなように、実施例２−２６の試料２−Ｚ-１は、セラミド産生促進効果を果たすことが確認された。
【０２２８】
（実施例２−２７）
実施例２−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Lactobacillus属の微生物として、Lactobacillus farciminis（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B1443として受託されている。）を使用した以外、実施例２−１と同様に培養した。
【０２２９】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、当該ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−ａ-１とし、さらに、試料２−ａ-１を５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０２３０】
実施例２−１と同様にして、試料２−ａ-１のセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表９に示した。
【０２３１】
表９から明らかなように、実施例２−２７の試料２−ａ-１は、セラミド産生促進効果を果たすことが確認された。
【０２３２】
【表９】
【０２３３】
なお、上記試料のそれぞれについて、それを上記ヒトの活性化角化細胞を含む１２well Plateに加えることを行わない（即ち、上記細胞培養を行わない）ままで、セラミド量及びグルコシルセラミド量の解析を行った。上記以外は、上記実施例２−１と同様にした。その結果は、上記試料のそれぞれの何れかの自身にもセラミド又はグルコシルセラミドが存在しないことが確認された。
これから、本発明の製品自身には、セラミド又はグルコシルセラミドが存在しないが、本発明の製品が、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進の効果を有し、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤として用いることが分かる。
【０２３４】
（実施例３−１）
＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞
まず、以下の方法で培地を調製した。大豆を水に入れ、１２時間含浸し、大豆に水を十分に吸収させた。水を吸収した大豆を研削して粉砕し、濾過、滴り乾燥し、大豆残渣を得た。当該大豆残渣を、大豆残渣の濃度が１０ｗ/ｖ％、ブドウ糖の濃度が１ｗ/ｖ％になるように、ブドウ糖及び水と混合して、培地とした。
次いで、上記培地１００ｍｌを三角フラスコに入れ、Acetobacter aceti（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B0137として受託されている。）を規定の量で接種し、３０℃で３日間培養した。
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料３−Ａとし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料３−Ｂ、３−Ｃとし、さらに、試料３−Ｂ、３−Ｃをそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０２３５】
＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の評価＞
【０２３６】
（細胞培養）
まず、正常ヒトの活性化角化細胞（Cascade Co., Ltd）を初代細胞として、７５ｃｍ2の培養フラスコ（増殖因子を含有する培地２ｍｌ）に、７℃、５％ＣＯ2のインキュベーターにて８０〜９０％コンフルエントの状態に達するまで培養した。継代細胞を１７５ｃｍ2の培養フラスコに８０〜９０％コンフルエントの状態に達するまでに持続培養した。継代培養した後のヒト表皮角化細胞を１２well Plate （細胞数１×１０5個/ｍＬ）に２ｍＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ2のインキュベーターにて８０〜９０％コンフルエントの状態に達するまで持続培養した。
次いで、上記１２well Plateにおいて増殖因子を含有しない培地を変更し、本発明の製品（試料３−Ａ、３−Ｂ、３−Ｃ）及びコントロール（50v/v%のエタノール溶液）を当該１２well Plate（n=2）に添加した。同じ条件で３日間培養した。
その後、上清の培養液を除去し、PBS（２ｍＬ/Ｗｅｌｌ）にて細胞を２回洗浄した後、１ｍＬＰＢＳを入れ、各々の細胞をセルハーベスターで試験管に回収した。それを、後のセラミド、グルコシルセラミド及び蛋白質の量を解析するための試料とした。
【０２３７】
（セラミド/グルコシルセラミド産生促進効果の確認）
前記回収された細胞を含むＰＢＳ液に、まず、メタノール：クロロホルム（２．５ｍｌ：１．２５ｍｌ）加え攪拌し、次に、２０分間振とうした。その後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）を行い、上清aと沈殿bを取り分けて、その上清aをセラミド/グルコシルセラミド量の解析に供し、沈殿bを次のタンパク量解析に供した。
【０２３８】
（１）セラミド/グルコシルセラミド量の解析
上清aにPBS：クロロホルム（１．２５ｍｌ：１．２５ｍｌ）を入れ、２０分間振動し、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）を行い、下相にあるクロロホルム層を単離、回収した。回収されたクロロホルム層を３０℃、窒素雰囲気で乾固させた。乾燥品をクロロホルム−メタノール混合溶媒（容量比＝２.５ｍｌ：１.２５ｍｌ）１００μｌに溶解し、下記の薄層クロマトグラフィーによりセラミド量及びグルコシルセラミド量の定量に供した。
【０２３９】
セラミド（又はグルコシルセラミド）標準品と試料溶液とを乾燥のTLC板に入れ、展開溶媒であるクロロホルム：メタノール：酢酸＝１９０：９：１（ｖ/ｖ/ｖ）で薄層クロマトグラフィーを行った。展開剤がＴＣＬ板のトップに到達した後、ドライヤーで展開剤を乾燥した。次いで上記操作を１回繰り返した。その後、展開溶媒であるクロロホルム：メタノール：アセトン＝７６：２０：４（ｖ/ｖ/ｖ）で薄層クロマトグラフィーを行った。展開剤がＴＣＬ板のボタムからの２．５ｃｍの位置に到達した後、展開を停止し、ドライヤーで展開剤を乾燥した。硫酸銅のリン酸溶液を吹き、乾燥して、ＴＣＬ板を１８０℃のヒータに置き７分間加熱して顕色させた。顕色されたTLC板をスキャンしてセラミド（又はグルコシルセラミド）の量（それぞれをCer及びGlyCerとし、単位μｇ/ｍＬ）を解析した。
【０２４０】
（２）タンパク量の解析
細胞中のセラミド量及びグルコシルセラミド量を表示するためにタンパク量の解析を行った。上記沈殿ｂに、９００μｌ ＳＤＳ（ドデシルスルホン酸ナトリウム）溶液を入れ、混合し、６０℃で２時間加熱した後、タンパク質を変性・降解させ、冷却した。次いで、１００μｌ ２Ｎ ＨＣｌを加え、ＢＣＡ Ｋｉｔ法（タンパク量の解析用のキット）によりタンパク量（Proと記する。μｇ/ｍＬ）を測定した。
【０２４１】
（３）解析の結果
本発明品とコントロールの試料のそれぞれに対して、下式のように、Cer/ProとGlyCer/Proを測定した。前記コントロールのCer/ProとGlyCer/Proのそれぞれを１とした場合の、本発明のCer/ProとGlyCer/Proの相対値を算出して表１０に示した。また、前記コントロールのwellあたりのタンパク量を１００とした場合の、本発明のwellあたりのタンパク量の相対値（Pro.（％））を算出して、それによりwellあたりのセラミドの量及びグルコシルセラミド量（コントロールに対する相対量）を求めた。合わせて表１０に示した。
Cer/Well=Cer/Pro×Pro.(%)
GlyCer/Well=GlyCer/Pro×Pro.(%)
【０２４２】
なお、Cer/Pro（又はCer/Well）が１（コントロール）よりも高い場合、当該試料がセラミド産生促進効果を有すると見なされる。また、GlyCer/Pro（又はGlyCer/Well）が１（コントロール）よりも高い場合、当該試料がグルコシルセラミド産生促進効果を有すると見なされる。
【０２４３】
表１０から明らかなように、実施例３−１の試料３−Ａ、３−Ｂ、３−Ｃは、グルコシルセラミド産生促進効果が認められた。
【０２４４】
（実施例３−２）
実施例３−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Acetobacter属の微生物として、Acetobacter aceti（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B0142として受託されている。）を使用した以外、実施例３−１と同様に培養した。
【０２４５】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料３−Ｄとし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料３−Ｅ、３−Ｆとし、さらに、試料３−Ｅ、３−Ｆをそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０２４６】
実施例３−１と同様にして、試料３−Ｄ、３−Ｅ、３−Ｆのセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表１０に示した。
【０２４７】
表１０から明らかなように、実施例３−２の試料３−Ｄ、３−Ｅ、３−Ｆは、セラミド及びグルコシルセラミド産生促進効果が認められた。
【０２４８】
（実施例３−３）
実施例３−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Acetobacter属の微生物として、Acetobacter aceti（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B0145として受託されている。）を使用した以外、実施例３−１と同様に培養した。
【０２４９】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料３−Ｇとし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【０２５０】
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料３−Ｈ、３−Ｉとし、さらに、試料３−Ｈ、３−Ｉをそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０２５１】
実施例３−１と同様にして、試料３−Ｇ、３−Ｈ、３−Ｉのセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表１０に示した。
【０２５２】
表１０から明らかなように、実施例３−３の試料３−Ｇ、３−Ｈ、３−Ｉは、セラミド産生促進効果が認められた。
【０２５３】
（実施例３−４）
実施例３−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Acetobacter属の微生物として、Acetobacter aceti（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B0133として受託されている。）を使用した以外、実施例３−１と同様に培養した。
【０２５４】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料３−Ｊとし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【０２５５】
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料３−Ｋ、３−Ｌとし、さらに、試料３−Ｋ、３−Ｌをそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０２５６】
実施例３−１と同様にして、試料３−Ｊ、３−Ｋ、３−Ｌのセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表１０に示した。
【０２５７】
表１０から明らかなように、実施例３−４の試料３−Ｊ、３−Ｋ、３−Ｌは、セラミド産生促進効果が認められた。
【０２５８】
（実施例３−５）
【０２５９】
実施例３−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Acetobacter属の微生物として、Acetobacter aceti（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B0128として受託されている。）を使用した以外、実施例３−１と同様に培養した。
【０２６０】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料３−Ｍとし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【０２６１】
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料３−Ｎ、３−Ｏとし、さらに、試料３−Ｎ、３−Ｏをそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０２６２】
実施例３−１と同様にして、試料３−Ｍ、３−Ｎ、３−Ｏのセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表１０に示した。
【０２６３】
表１０から明らかなように、実施例３−５の試料３−Ｍ、３−Ｎ、３−Ｏは、セラミド産生促進効果が認められた。
【０２６４】
（実施例３−６）
【０２６５】
実施例３−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Acetobacter属の微生物として、Acetobacter aceti（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B0130として受託されている。）を使用した以外、実施例３−１と同様に培養した。
【０２６６】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料３−Ｐとし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【０２６７】
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料３−Ｑ、３−Ｒとし、さらに、試料３−Ｑ、３−Ｒをそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０２６８】
実施例３−１と同様にして、試料３−Ｐ、３−Ｑ、３−Ｒのセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表１０に示した。
【０２６９】
表１０から明らかなように、実施例３−６の試料３−Ｐ、３−Ｑ、３−Ｒは、セラミド産生促進効果が認められた。
【０２７０】
（実施例３−７）
【０２７１】
実施例３−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Acetobacter属の微生物として、Acetobacter aceti（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B0120として受託されている。）を使用した以外、実施例３−１と同様に培養した。
【０２７２】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料３−Ｓとし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【０２７３】
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料３−Ｔ、３−Ｕとし、さらに、試料３−Ｔ、３−Ｕをそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０２７４】
実施例３−１と同様にして、試料３−Ｓ、３−Ｔ、３−Ｕのセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表１０に示した。
【０２７５】
表１０から明らかなように、実施例３−７の試料３−Ｓ、３−Ｔは、グルコシルセラミド産生促進効果が認められた。
【０２７６】
【表１０】
【０２７７】
なお、試料３−Ａ〜３−Ｕについて、それらを上記ヒトの活性化角化細胞を含む１２well Plateに加えることを行わない（即ち、上記細胞培養を行わない）ままで、セラミド量及びグルコシルセラミド量の解析を行った。上記以外は、上記実施例３−１と同様にした。その結果は、試料３−Ａ〜３−Ｕの何れかの自身にもセラミド又はグルコシルセラミドが存在しないことが確認された。
【０２７８】
これから、本発明の製品自身には、セラミド又はグルコシルセラミドが存在しないが、本発明の製品が、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進の効果を有し、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤として用いることが分かる。
【０２７９】
（実施例４−１）
＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞
まず、以下の方法で培地を調製した。大豆を水に入れ、１２時間含浸し、大豆に水を十分に吸収させた。水を吸収した大豆を研削して粉砕し、濾過、滴り乾燥し、大豆残渣を得た。当該大豆残渣を、大豆残渣の濃度が１０ｗ/ｖ％、ブドウ糖の濃度が１ｗ/ｖ％になるように、ブドウ糖及び水と混合して、培地とした。
【０２８０】
次いで、上記培地１００ｍｌを三角フラスコに入れ、Leuconostoc mesenteroides（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B1254として受託されている。）を規定の量で接種し、３０℃で３日間培養した。
【０２８１】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料４−Ａとし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料４−Ｂ、４−Ｃとし、さらに、試料４−Ｂ、４−Ｃをそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０２８２】
＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の評価＞
（細胞培養）
まず、正常ヒトの活性化角化細胞（Cascade Co., Ltd）を初代細胞として、７５ｃｍ2の培養フラスコ（増殖因子を含有する培地２ｍｌ）に、７℃、５％ＣＯ2のインキュベーターにて８０〜９０％コンフルエントの状態に達するまで培養した。継代細胞を１７５ｃｍ2の培養フラスコに８０〜９０％コンフルエントの状態に達するまでに持続培養した。継代培養した後のヒト表皮角化細胞を１２well Plate （細胞数１×１０5個/ｍＬ）に２ｍＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ2のインキュベーターにて８０〜９０％コンフルエントの状態に達するまで持続培養した。
【０２８３】
次いで、上記１２well Plateにおいて増殖因子を含有しない培地を変更し、本発明の製品（試料４−Ａ、４−Ｂ、４−Ｃ）及びコントロール（50v/v%のエタノール溶液）を当該１２well Plate（n=2）に添加した。同じ条件で３日間培養した。
【０２８４】
その後、上清の培養液を除去し、PBS（２ｍＬ/Ｗｅｌｌ）にて細胞を２回洗浄した後、１ｍＬＰＢＳを入れ、各々の細胞をセルハーベスターで試験管に回収した。それを、後のセラミド及び蛋白質の解析する用の試料とした。
【０２８５】
（セラミド産生促進効果の確認）
前記回収された細胞を含むＰＢＳ液に、まず、メタノール：クロロホルム（２．５ｍｌ：１．２５ｍｌ）加え攪拌し、次に、２０分間振とうした。その後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）を行い、上清aと沈殿bを取り分けて、その上清aをセラミド量の解析に供し、沈殿bを次のタンパク量解析に供した。
【０２８６】
（１）セラミド量の解析
上清aにPBS：クロロホルム（１．２５ｍｌ：１．２５ｍｌ）を入れ、２０分間振動し、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）を行い、下相にあるクロロホルム層を単離、回収した。回収されたクロロホルム層を３０℃、窒素雰囲気で乾固させた。乾燥品をクロロホルム−メタノール混合溶媒（容量比＝２.５ｍｌ：１.２５ｍｌ）１００μｌに溶解し、下記の薄層クロマトグラフィーによりセラミド量の定量に供した。
【０２８７】
セラミド標準品と試料溶液とを乾燥のTLC板に入れ、展開溶媒であるクロロホルム：メタノール：酢酸＝１９０：９：１（ｖ/ｖ/ｖ）で薄層クロマトグラフィーを行った。展開剤がＴＣＬ板のトップに到達した後、ドライヤーで展開剤を乾燥した。次いで上記操作を１回繰り返した。その後、展開溶媒であるクロロホルム：メタノール：アセトン＝７６：２０：４（ｖ/ｖ/ｖ）で薄層クロマトグラフィーを行った。展開剤がＴＣＬ板のボタムからの２．５ｃｍの位置に到達した後、展開を停止し、ドライヤーで展開剤を乾燥した。硫酸銅のリン酸溶液を吹き、乾燥して、ＴＣＬ板を１８０℃のヒータに置き７分間加熱して顕色させた。顕色されたTLC板をスキャンしてセラミドの量（Cerとし、単位μｇ/ｍＬ）を解析した。
【０２８８】
（２）タンパク量の解析
細胞中のセラミド量及びグルコシルセラミド量を表示するためにタンパク量の解析を行った。上記沈殿ｂに、９００μｌ ＳＤＳ（ドデシルスルホン酸ナトリウム）溶液を入れ、混合し、６０℃で２時間加熱した後、タンパク質を変性・降解させ、冷却した。次いで、１００μｌ ２Ｎ ＨＣｌを加え、ＢＣＡ Ｋｉｔ法（タンパク量の解析用のキット）によりタンパク量（Proと記する。μｇ/ｍＬ）を測定した。
【０２８９】
（３）解析の結果
本発明品とコントロールの試料のそれぞれに対して、下式のように、Cer/Proを測定した。前記コントロールのCer/Proを１とした場合の、本発明のCer/Proの相対値を算出して表１1に示した。また、前記コントロールのwellあたりのタンパク量を１００とした場合の、本発明のwellあたりのタンパク量の相対値（Pro.（％））を算出して、それによりwellあたりのセラミドの量（コントロールに対する相対量）を求めた。合わせて表１１に示した。
Cer/Well=Cer/Pro×Pro.(%)
【０２９０】
なお、Cer/Pro（又はCer/Well）が１（コントロール）よりも高い場合、当該試料がセラミド産生促進効果を有すると見なされる。
【０２９１】
表１１から明らかなように、実施例４−１の試料４−Ａ、４−Ｂ、４−Ｃは、セラミド産生促進効果が認められた。
【０２９２】
（実施例４−２）
実施例４−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Leuconostoc属の微生物として、Leuconostoc mesenteroides（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B1364として受託されている。）を使用した以外、実施例４−１と同様に培養した。
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料４−Ｄとし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料４−Ｅ、４−Ｆとし、さらに、試料４−Ｅ、４−Ｆをそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
実施例４−１と同様にして、試料４−Ｄ、４−Ｅ、４−Ｆのセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表１1に示した。
表１１から明らかなように、実施例４−２の試料４−Ｄ、４−Ｅ、４−Ｆは、セラミド産生促進効果が認められた。
【０２９３】
【表１１】
【０２９４】
なお、試料４−Ａ〜４−Ｆについて、それらを上記ヒトの活性化角化細胞を含む１２well Plateに加えることを行わない（即ち、上記細胞培養を行わない）ままで、セラミド量及びグルコシルセラミド量の解析を行った。上記以外は、上記実施例４−１と同様にした。その結果は、試料４−Ａ〜４−Ｆの何れかの自身にもセラミド又はグルコシルセラミドが存在しないことが確認された。
【０２９５】
これから、本発明の製品自身には、セラミド又はグルコシルセラミドが存在しないが、本発明の製品が、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進の効果を有し、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤として用いることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【０２９６】
本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤は、医薬品、医薬部外品、化粧品等に利用できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生を促進させることができるセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚はセラミド（ceramide）及びグルコシルセラミド(glucosylceramide)を産生する能力を有する。皮膚では、特に表皮角質層において、表皮細胞によって合成分泌されたセラミドが集積しており、細胞間脂質の主成分となっている。皮膚表皮細胞で合成されたセラミドは一旦グルコシルセラミドまたはスフィンゴミエリン（sphingomyelin）の形で蓄えられたあと、細胞外へ排出されて、β−グルコセレブロシダーゼ（glucocerebrosidase）とスフィンゴミエリナーゼ（sphingomyelinase）の作用を受けて、再びセラミドとなり、細胞間脂質として機能する。皮膚におけるセラミド及びグルコシルセラミドは、皮膚の保湿機能及び皮膚のバリヤ機能を向上させるなどの生理作用を有する。
【０００３】
しかし、近年、環境、気候等の影響によって、皮膚が乾燥しやすい状態にある。従って、皮膚自らのセラミド等の産生により皮膚の保湿機能を向上させる能力が十分ではなくなる。
【０００４】
従って、外部から皮膚にセラミドを補充する方法が考えられる。例えば、特許文献１には、キャンディダ（Candida）属に属する微生物を培養してグルコシルセラミドを製造する方法が記載されている。当該グルコシルセラミドをヒトの乾燥性の皮膚へ塗布することによって皮膚の保湿機能を向上できる。その方法が、培養後の菌体中に多く存在するグルコシルセラミドを直接に取得する方法であるので、その方法で合成されたグルコシルセラミドのセラミド骨格は、２重結合が２箇所に存在し、且つ、分岐を有するため、ヒト生体中に存在するセラミド類のセラミド骨格と異なる。よって、このような、微生物の体内から直接に取得されたグルコシルセラミドを人の皮膚へ塗布すると、皮膚に適応できなく、使用上の安全性に関する問題を生じる恐れがある。
【０００５】
また、特許文献６に、酢酸菌から酢酸菌型セラミドを得る方法が報告されている。しかし、この方法で得られるセラミドは、上記のような人の皮膚に適応できないという問題も存在している。また、このような方法では、菌体内から抽出してセラミドを得るという工程等が必要であるので、工程が複雑になり、コストも高くなるという問題も存在している。
【０００６】
また、外部から皮膚にセラミドを補充する方法は、従来から用いられていた保湿剤などと同様に、保湿効果の持続性の点で不十分であるという問題もある。また、皮膚の状態によって、外部から補充されたセラミド等を吸収することが不十分であり、保湿効果が十分発揮されない場合がある。
【０００７】
一方、皮膚自らのセラミド又はグルコシルセラミド産生能力を増強または促進させることができれば、外からセラミド又はグルコシルセラミドを補充する必要がなく、皮膚自身がセラミド及び／又はグルコシルセラミドを産生することで皮膚のバリヤ機能、水分保持機能を向上させることが可能であると考えられている。さらに、このように得られたセラミド及び／又はグルコシルセラミドは皮膚自身から産生されたものであるため、通常の皮膚が有する構造のセラミドなどが合成され、皮膚への適応性がよくない等の安全性問題が無くなると考えられる。
【０００８】
そこで、最近では、皮膚の角質層において、表皮セラミドの生成の促進を目的とした物質を生産する研究が活発に進められている。ここでセラミドの生成を促進し得る物質としては、マンネンタケ、ビーポーレン（Ｂｅｅ Ｐｏｌｌｅｎ）、センキュウなどの抽出物を有効成分とするセラミド産生促進剤が報告されている（特許文献２〜４）。しかし、これらのセラミド産生促進剤がいずれも植物性原料から抽出したものであり、この抽出操作には長時間を要し、天然資源の利用可能性には制限があるため、製造コストは高い。
【０００９】
また、特許文献５には、皮膚表層内部で表皮細胞自身のセラミド合成を活発化させ得る、ニコチン酸および/またはニコチンアミドを含む菌培養物を有効成分とするセラミド合成促進剤であって、当該菌培養物は乳酸菌培養物、ビフィズス菌培養物、きのこ菌体培養物または酵母菌培養物であってもよいことが開示されている。しかし、そのセラミド合成促進剤を調製するために用いられる培地は、実質的にニコチン酸および/またはニコチンアミドを有効成分とするため、製造コストが高い。
【００１０】
一方、複数の属の細菌、例えば、Bacillus属の細菌、Lactobacillus属の細菌、Acetobacter属の細菌、Leuconostoc属の細菌等が食品等の工業に広く用いられていることが知られている。
【００１１】
Bacillus属の微生物（細菌）が、水中や土壌に普遍的に存在するものである。なかでも、高pHや低温、高塩濃度、高圧といった様々な極限環境にも適応している種も多い。Bacillus属には、種々の酵素（食品用、洗剤用、ほか多種多様な産業用酵素）の生産に用いられる等、枯草菌を筆頭として極めて有用性の高い種を含む。
【００１２】
また、Lactobacillus属の微生物はヒトや動物の消化管に多く存在しており、その糞便から分離され、また、野外からも容易に分離される。Lactobacillus属の微生物が、ヨーグルト等の製造に古くから用いられた。
【００１３】
また、Acetobacter属の微生物が、エタノールを酸化させて酢酸とし、それをさらに酸化させて二酸化炭素にすることが可能であるものである。Acetobacter属の微生物が、一般、ビール、果実の酒及び花果上に分布している。Acetobacter属の微生物が、アルコールの低い酒の変質を起こすことができ、食べた酢を醸造することに用いることができる。
【００１４】
また、Leuconostoc属の微生物が植物、乳製品及び他の食品中に広く分布しているものである。Leuconostoc mesenteroidesがLeuconostoc属の菌において重要な菌である。研究によって、Leuconostoc mesenteroidesが、糖類を発酵させて多種の酸とアルコールを生じることができ、高い酸生産能力、抗酸化能力及び拮抗病原菌などの能力を有することが確認された。Leuconostoc mesenteroides菌が、すでに風味剤、血漿代用品、マイクロ生態調合剤などに広く応用されている。
【００１５】
しかし、従来では、細菌（特に、上記の各属の細菌）によって、セラミド又はグルコシルセラミド産生促進剤を安価で効率良く製造することがまだ報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】特開２０１０−２２２１７号公報
【特許文献２】特開２００５−１９４２４０号公報
【特許文献３】特開２０１０−７０４９９号公報
【特許文献４】特開２０１０−１５０２３７号公報
【特許文献５】特開平９−１９４３８３号公報
【特許文献６】特開２００６−３４５７９６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明は、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を安価で効率良く製造する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、大豆残渣および糖類を含有する培地中で細菌を培養して、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を安価で効率良く得ることができることを見出し、本発明をなすに至ったものである。
【００１９】
本発明は、大豆残渣および糖類を含有する培地中で細菌を培養し、培養上清からセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を採取する、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造方法を提供する。
【００２０】
また、本発明は、大豆残渣および糖類を含有する培地中で細菌を培養して得られる、大豆残渣の発酵エキスのセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤に関する。
また、本発明は、大豆残渣および糖類を含有する培地中で細菌を培養して得られる、大豆残渣の発酵エキスのセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤としての使用に関する。
また、本発明は、大豆残渣および糖類を含有する培地中で細菌を培養して得られる、大豆残渣の発酵エキスのセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造のための使用に関する。
【００２１】
本発明で用いられる細菌は、Bacillus属の細菌、Lactobacillus属の細菌、Acetobacter属の細菌、及びLeuconostoc属の細菌から選ばれる何れかのものであってもよい。
【発明の効果】
【００２２】
本発明に係る製造方法によれば、特定微生物を利用し大豆残渣のような入手が容易であるものを培地の主原料として用いることで、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を安価で効率良く得ることができる。当該促進剤は、皮膚の持つセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生能力を効率的に向上させることができるため、皮膚の保湿機能を有効に向上させることもできる。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明の製造方法は、大豆残渣および糖類を含有する培地中で細菌を培養し、培養上清からセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を採取する。
【００２４】
本発明で用いられる細菌は、Bacillus属の細菌、Lactobacillus属の細菌、Acetobacter属の細菌、及びLeuconostoc属の細菌から選ばれる何れかのものであってもよい。
【００２５】
本発明に使用されるBacillus属に属する微生物としては、Bacillus subtilis、Bacillus acidicola、Bacillus gibsonii、Bacillus licheniformis、Bacillus alcalophilus、Bacillus cereus、Bacillus pumilus、Bacillus sphaericus、Bacillus diffusus、Bacillus globigii、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus coagulans、Bacillus megaterium、Bacillus mucilaginosus、Bacillus mycoides、Bacillus thuringiensis、Bacillus circulans、Bacillus mucilaginosus、Bacillus stearothermophilus等が挙げられる。
このうち、得られる成分がより高いセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進効果を有するという観点から、Bacillus subtilis、Bacillus acidicola、Bacillus gibsonii、Bacillus licheniformisが好ましい。
【００２６】
本発明に使用されるLactobacillus属に属する微生物としては、Lactobacillus brevis、Lactobacillus farciminis、Lactobacillus pentosus、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus coryniformi、Lactobacillus curvatus、Lactobacillus alimentarius、Lactobacillus rhamnosus、Lactobacillus casei、Lactobacillus buchneri、Lactobacillus cellobiosus、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus murinus、Lactobacillus fermentum、Lactobacillus helveticus等が挙げられる。
このうち、得られる成分がより高いセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進効果を有するという観点から、Lactobacillus brevis、Lactobacillus farciminis、Lactobacillus pentosus、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus coryniformi、Lactobacillus curvatus、Lactobacillus alimentariusが好ましい。
【００２７】
本発明に使用されるAcetobacter属に属する微生物としては、Acetobacter aceti、Acetobacter tropicalis、Acetobacter pasteurianus等が挙げられる。
このうち、、得られる成分がより高いセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進効果を有するという観点から、Acetobacter acetiが好ましい。
【００２８】
本発明に使用されるLeuconostoc属に属する微生物としては、Leuconostoc mesenteroides、Leuconostoc lactis、Leuconostoc gelidum、Leuconostoc carnosum、Leuconostoc fallax、Leuconostoc citreum、Leuconostoc argentinum、Leuconostoc pseudomesenteroides等が挙げられる。
このうち、得られる成分がより高いセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進効果を有するという観点から、Leuconostoc mesenteroidesが好ましい。
【００２９】
本発明にかかる微生物（細菌）は、何れも、中国普通微生物保蔵管理中心（CGMCC）及び中国典型培養物保蔵中心（CCTCC）、中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIM: Culture & Information Center of Industrial Microorganism of China Universities）などの商業ルートで購入できるのもである。
【００３０】
また、本発明の製造方法においては、上記微生物を１種類単独で又は２種類以上を組み合わせて用いることができる。
【００３１】
本発明において用いる培地としては、大豆残渣と糖類とを含有するものである。大豆残渣も糖類も入手やすい原料であるため、本発明の培地が従来より安価上で優れた利点を有する。また、その他に１％のペプトン、０.５％の酵母粉等を適宜添加してもよい。
【００３２】
本発明で使われる大豆残渣は、大豆を水に浸漬し、水を吸収させて、粉砕、濾過を経て、水を除去して、乾燥して、得られたものが好ましい。食品産業において豆乳を搾り取ったという大豆製品を製造する工程で残した大豆残渣、例えばおから等を用いることも可能である。
【００３３】
糖類としては、例えば葡萄糖、麦芽糖、蔗糖などが挙がられる。また、それらが、いずれかを単独、または混合して使用できる。セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進効果を向上させるという観点から、葡萄糖を好適に用いることができる。
【００３４】
本発明においては、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進の効果を高めるという観点から、培地は、大豆残渣、葡萄糖及び水からなるのが好ましい。その中に大豆残渣を５〜２０％（ｗ/ｖ）、より好ましくは８〜１２％（ｗ/ｖ）、葡萄糖を０．２〜２％（ｗ/ｖ）、より好ましくは０.８〜１．２％（ｗ/ｖ）含有することが好ましい。
【００３５】
細菌との微生物の生理的な特性、及びセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進の効果を高める観点から、２７〜３５℃の培養温度で上記培養を行うことが好ましい。
【００３６】
細菌との微生物の生理的な特性、及びセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進の効果を高める観点から、１〜７日、より好ましくは４８〜９６時間、更に好ましくは６８〜７６時間で培養するのが好ましい。
【００３７】
製品の純度を高める観点から、前記培養により得られた培養液を精製して、上清を得る。精製の方法としては、ろ過、遠心分離、イオン交換または吸着クロマトグラフィー、溶媒抽出、結晶化などの通常用いられる操作を必要に応じて適宜組み合わせて行われてもよい。また、遠心分離などにより上清を得ることが好ましい。遠心分離の回転数は、２０００〜４０００rpmが好ましく、２５００〜３５００rpmがより好ましい。遠心分離の時間は、０〜２０分が好ましく、５〜１５分がより好ましい。
【００３８】
遠心分離して得られた上記上清にエタノールを加えて殺菌し、本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤としてもよい。
【００３９】
また、遠心分離して培養液から菌体を除去し、次いで超音波処理し、遠心分離して上清を回収する。再び、回収した上清をろ過して夾雑物などを除き、さらに真空で乾燥処理して本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤としてもよい。
【００４０】
本発明の細菌を培養し、培養上清から得た大豆残渣の発酵エキスは、正常ヒト角化細胞において、セラミド及び／又はグルコシルセラミドの量を増加させる作用を有する。
【００４１】
従って、本発明の細菌を培養し、培養上清から得られた大豆残渣の発酵エキスは、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進のための治療目的又は非治療目的の使用ができ、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤としての治療目的又は非治療目的の使用もできる。非治療目的の使用には、美容目的の使用や、健康状態の維持のための使用などが含まれる。また、上記のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進のための、治療目的の使用と、非治療目的の使用は、分けて行われることもできる。
【００４２】
また、本発明の細菌を培養し、培養上清から得た大豆残渣の発酵エキスは、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を製造するために使用できる。
【００４３】
本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤は、角質層中のセラミド及び／又はグルコシルセラミドを増加させ、皮膚のバリア機能及び保湿機能を回復及び向上するための医薬品、医薬部外品、化粧品等としても使用できる。また、本発明のセラミド又はグルコシルセラミド産生促進剤は、セラミド又はグルコシルセラミド産生促進をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した医薬部外品、化粧品として使用することもできる。
【００４４】
本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の使用形態としては、培養細胞へ添加するための添加剤とすることができ、皮膚洗浄剤、メイクアップ化粧料などの皮膚外用剤へ配合することもできる。例えば、ローション、乳液、ゲル、クリーム、軟膏剤等の種々の形態で提供することができる。外用剤の基剤としては、公知の外用基剤でよく、特に限定されない。このような種々の皮膚外用剤を調製するには、本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を単独で、又は、皮膚洗浄剤、メイクアップ化粧料などの皮膚外用剤に配合される、通常の油性成分、保湿剤、粉体、色素、乳化剤、可溶化剤、紫外線吸収剤、増粘剤、薬効成分、香料、防菌防黴剤、植物抽出物、アルコール類等を適宜組み合わせて用いることができる。
【００４５】
本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を、培養表皮細胞系へ添加してセラミド及び／又はグルコシルセラミド合成を促進する場合の添加量は、促進剤の乾燥物（固形分換算）として、０．０００１〜１０ｗ/ｖ％、特に０．００１〜５ｗ/ｖ％が好ましい。添加量が０．００１ｗ/ｖ％以上であると、産生促進の効果を十分にすることになる。添加量が１０ｗ/ｖ％以下であると、表皮細胞への刺激が少ないという点で好ましい。
【００４６】
本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の皮膚外用剤への配合量は、大豆残渣の発酵エキスの乾燥物（固形分換算）として、セラミド及び／又はグルコシルセラミド合成を十分に促進して皮膚の保湿能力を効率的に高め、しかも培養物の色や臭いが出にくいことから、全皮膚外用剤の０．０１〜２０ｗ/ｖ％とするのが好ましく、特に好ましくは０．１〜１０ｗ/ｖ％である。
【実施例】
【００４７】
次に、本発明を実施例により詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
なお、実施例に使用された微生物が、いずれも江南大学から購入され、中国高校工業微生物資源および情報センターCICIMに受託されていたものである。
【００４８】
（実施例１−１）
＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞
まず、以下の方法で培地を調製した。大豆を水に入れ、１２時間含浸し、大豆に水を十分に吸収させた。水を吸収した大豆を研削して粉砕し、濾過、滴り乾燥し、大豆残渣を得た。当該大豆残渣を、大豆残渣の濃度が１０ｗ/ｖ％、ブドウ糖の濃度が１ｗ/ｖ％になるように、ブドウ糖及び水と混合して、培地とした。
次いで、上記培地１００ｍｌを三角フラスコに入れ、Bacillus subtilis（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B1677として受託されている。）を規定の量で接種し、３０℃で３日間培養した。
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、当該ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料１−Ａ、１−Ｂとし、さらに、試料１−Ａ、１−Ｂをそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【００４９】
＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の評価＞
（細胞培養）
まず、正常ヒトの活性化角化細胞（Cascade Co., Ltd）を初代細胞として、７５ｃｍ2の培養フラスコ（増殖因子を含有する培地２ｍｌ）に、７℃、５％ＣＯ2のインキュベーターにて８０〜９０％コンフルエントの状態に達するまで培養した。継代細胞を１７５ｃｍ2の培養フラスコに８０〜９０％コンフルエントの状態に達するまでに持続培養した。継代培養した後のヒト表皮角化細胞を１２well Plate （細胞数１×１０5個/ｍＬ）に２ｍＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ2のインキュベーターにて８０〜９０％コンフルエントの状態に達するまで持続培養した。
次いで、上記１２well Plateにおいて増殖因子を含有しない培地を変更し、本発明の製品（試料１−Ａ、１−Ｂ）及びコントロール（50v/v%のエタノール溶液）を当該１２well Plate（n=2）に添加した。同じ条件で３日間培養した。
その後、上清の培養液を除去し、PBS（２ｍＬ/Ｗｅｌｌ）にて細胞を２回洗浄した後、１ｍＬＰＢＳを入れ、各々の細胞をセルハーベスターで試験管に回収した。それを、後のセラミド、グルコシルセラミド及び蛋白質の量を解析するための試料とした。
【００５０】
（セラミド/グルコシルセラミド産生促進効果の確認）
前記回収された細胞を含むＰＢＳ液に、まず、メタノール：クロロホルム（２．５ｍｌ：１．２５ｍｌ）加え攪拌し、次に、２０分間振とうした。その後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）を行い、上清aと沈殿bを取り分けて、その上清aをセラミド/グルコシルセラミド量の解析に供し、沈殿bを次のタンパク量解析に供した。
（１）セラミド/グルコシルセラミド量の解析
上清aにPBS：クロロホルム（１．２５ｍｌ：１．２５ｍｌ）を入れ、２０分間振動し、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）を行い、下相にあるクロロホルム層を単離、回収した。回収されたクロロホルム層を３０℃、窒素雰囲気で乾固させた。乾燥品をクロロホルム−メタノール混合溶媒（容量比＝２.５ｍｌ：１.２５ｍｌ）１００μｌに溶解し、下記の薄層クロマトグラフィーによりセラミド量及びグルコシルセラミド量の定量に供した。
セラミド（又はグルコシルセラミド）標準品と試料溶液とを乾燥のTLC板に入れ、展開溶媒であるクロロホルム：メタノール：酢酸＝１９０：９：１（ｖ/ｖ/ｖ）で薄層クロマトグラフィーを行った。展開剤がＴＣＬ板のトップに到達した後、ドライヤーで展開剤を乾燥した。次いで上記操作を１回繰り返した。その後、展開溶媒であるクロロホルム：メタノール：アセトン＝７６：２０：４（ｖ/ｖ/ｖ）で薄層クロマトグラフィーを行った。展開剤がＴＣＬ板のボタムからの２．５ｃｍの位置に到達した後、展開を停止し、ドライヤーで展開剤を乾燥した。硫酸銅のリン酸溶液を吹き、乾燥して、ＴＣＬ板を１８０℃のヒータに置き７分間加熱して顕色させた。顕色されたTLC板をスキャンしてセラミド（又はグルコシルセラミド）の量（それぞれをCer及びGlyCerとし、単位μｇ/ｍＬ）を解析した。
【００５１】
（２）タンパク量の解析
細胞中のセラミド量及びグルコシルセラミド量を表示するためにタンパク量の解析を行った。上記沈殿ｂに、９００μｌ ＳＤＳ（ドデシルスルホン酸ナトリウム）溶液を入れ、混合し、６０℃で２時間加熱した後、タンパク質を変性・降解させ、冷却した。次いで、１００μｌ ２Ｎ ＨＣｌを加え、ＢＣＡ Ｋｉｔ法（タンパク量の解析用のキット）によりタンパク量（Proと記する。μｇ/ｍＬ）を測定した。
【００５２】
（３）解析の結果
本発明品とコントロールの試料のそれぞれに対して、下式のように、Cer/ProとGlyCer/Proを測定した。前記コントロールのCer/ProとGlyCer/Proのそれぞれを１とした場合の、本発明のCer/ProとGlyCer/Proの相対値を算出して表１に示した。また、前記コントロールのwellあたりのタンパク量を１００とした場合の、本発明のwellあたりのタンパク量の相対値（Pro.（％））を算出して、それによりwellあたりのセラミドの量及びグルコシルセラミド量（コントロールに対する相対量）を求めた。合わせて表１に示した。
Cer/Well=Cer/Pro×Pro.(%)
GlyCer/Well=GlyCer/Pro×Pro.(%)
【００５３】
なお、Cer/Pro（又はCer/Well）が１（コントロール）よりも高い場合、当該試料がセラミド産生促進効果を有すると見なされる。また、GlyCer/Pro（又はGlyCer/Well）が１（コントロール）よりも高い場合、当該試料がグルコシルセラミド産生促進効果を有すると見なされる。
【００５４】
表１から明らかなように、実施例１−１の試料１−Ａ、１−Ｂは、セラミド及びグルコシルセラミド産生促進効果が認められた。
【００５５】
（実施例１−２）
実施例１−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Bacillus属の微生物として、Bacillus subtilis（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B1923として受託されている。）を使用した以外、実施例１−１と同様に培養した。
【００５６】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、当該ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料１−Ｃ、１−Ｄとし、さらに、試料１−Ｃ、１−Ｄをそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【００５７】
実施例１−１と同様にして、試料１−Ｃ、１−Ｄのセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表１に示した。
【００５８】
表１から明らかなように、実施例１−２の試料１−Ｃ、１−Ｄは、セラミド及び/またはグルコシルセラミド産生促進効果が認められた。
【００５９】
（実施例１−３）
実施例００５１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Bacillus属の微生物として、Bacillus acidicola（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B1297として受託されている。）を使用した以外、実施例１−１と同様に培養した。
【００６０】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料１−Ｅとし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【００６１】
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料１−Ｆ、１−Ｇとし、さらに、試料１−Ｆ、１−Ｇをそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【００６２】
実施例１−１と同様にして、試料１−Ｅ、１−Ｆ、１−Ｇのセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表１に示した。
【００６３】
表１から明らかなように、実施例１−３の試料１−Ｅ、１−Ｇは、セラミド産生促進効果が認められた。
【００６４】
（実施例１−４）
【００６５】
実施例１−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Bacillus属の微生物として、Bacillus gibsonii（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B1171として受託されている。）を使用した以外、実施例１−１と同様に培養した。
【００６６】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料１−Ｈとし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【００６７】
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料１−Ｉ、１−Ｊとし、さらに、試料１−Ｉ、１−Ｊをそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【００６８】
実施例１−１と同様にして、試料１−Ｈ、１−Ｉ、１−Ｊのセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表１に示した。
【００６９】
表１から明らかなように、実施例１−４の試料１−Ｈ、１−Ｉ、１−Ｊは、セラミド及び/またはグルコシルセラミド産生促進効果が認められた。
【００７０】
（実施例１−５）
【００７１】
実施例１−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Bacillus属の微生物として、Bacillus licheniformis（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B1294として受託されている。）を使用した以外、実施例１−１と同様に培養した。
【００７２】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料１−Ｋとし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【００７３】
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料１−Ｌ、１−Ｍとし、さらに、試料１−Ｌ、１−Ｍをそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【００７４】
実施例１−１と同様にして、試料１−Ｋ、１−Ｌ、１−Ｍのセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表１に示した。
【００７５】
表１から明らかなように、実施例１−５の試料１−Ｋ、１−Ｌ、１−Ｍは、セラミド及び/またはグルコシルセラミド産生促進効果が認められた。
【００７６】
（実施例１−６）
【００７７】
実施例１−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Bacillus属の微生物として、Bacillus licheniformis（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B1282として受託されている。）を使用した以外、実施例１−１と同様に培養した。
【００７８】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料１−Ｎとし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【００７９】
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料１−Ｏ、１−Ｐとし、さらに、試料１−Ｏ、１−Ｐをそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【００８０】
実施例１−１と同様にして、試料１−Ｎ、１−Ｏ、１−Ｐのセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表１に示した。
【００８１】
表１から明らかなように、実施例１−６の試料１−Ｎ、１−Ｏ、１−Ｐは、セラミド及び/またはグルコシルセラミド産生促進効果が認められた。
【００８２】
（実施例１−７）
【００８３】
実施例１−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Bacillus属の微生物として、Bacillus licheniformis（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B1298として受託されている。）を使用した以外、実施例１−１と同様に培養した。
【００８４】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、当該ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料１−Ｑ、１−Ｒとし、さらに、試料１−Ｑ、１−Ｒをそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【００８５】
実施例１−１と同様にして、試料１−Ｑ、１−Ｒのセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表１に示した。
【００８６】
表１から明らかなように、実施例１−７の試料１−Ｑ、１−Ｒは、グルコシルセラミド産生促進効果が認められた。
【００８７】
【表１】
【００８８】
なお、試料１−Ａ〜１−Ｒについて、それらを上記ヒトの活性化角化細胞を含む１２well Plateに加えることを行わない（即ち、上記細胞培養を行わない）ままで、セラミド量及びグルコシルセラミド量の解析を行った。上記以外は、上記実施例１−１と同様にした。その結果は、試料１−Ａ〜１−Ｒの何れかの自身にもセラミド又はグルコシルセラミドが存在しないことが確認された。
これから、本発明の製品自身には、セラミド又はグルコシルセラミドが存在しないが、本発明の製品が、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進の効果を有し、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤として用いることが分かる。
【００８９】
（実施例２−１）
＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞
まず、以下の方法で培地を調製した。大豆を水に入れ、１２時間含浸し、大豆に水を十分に吸収させた。水を吸収した大豆を研削して粉砕し、濾過、滴り乾燥し、大豆残渣を得た。当該大豆残渣を、大豆残渣の濃度が１０ｗ/ｖ％、ブドウ糖の濃度が１ｗ/ｖ％になるように、ブドウ糖及び水と混合して、培地とした。
次いで、上記培地１００ｍｌを三角フラスコに入れ、Lactobacillus brevis（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B1257として受託されている。）を規定の量で接種し、３０℃で３日間培養した。
【００９０】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ａ-１とし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ａ-２、２−Ａ-３とし、さらに、試料２−Ａ-２、２−Ａ-３をそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【００９１】
＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の評価＞
（細胞培養）
まず、正常ヒトの活性化角化細胞（Cascade Co., Ltd）を初代細胞として、７５ｃｍ2の培養フラスコ（増殖因子を含有する培地２ｍｌ）に、７℃、５％ＣＯ2のインキュベーターにて８０〜９０％コンフルエントの状態に達するまで培養した。継代細胞を１７５ｃｍ2の培養フラスコに８０〜９０％コンフルエントの状態に達するまでに持続培養した。継代培養した後のヒト表皮角化細胞を１２well Plate （細胞数１×１０5個/ｍＬ）に２ｍＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ2のインキュベーターにて８０〜９０％コンフルエントの状態に達するまで持続培養した。
【００９２】
次いで、上記１２well Plateにおいて増殖因子を含有しない培地を変更し、本発明の製品（試料２−Ａ-１、２−Ａ-２、２−Ａ-３）及びコントロール（50v/v%のエタノール溶液）を当該１２well Plate（n=2）に添加した。同じ条件で３日間培養した。
【００９３】
その後、上清の培養液を除去し、PBS（２ｍＬ/Ｗｅｌｌ）にて細胞を２回洗浄した後、１ｍＬＰＢＳを入れ、各々の細胞をセルハーベスターで試験管に回収した。それを、後のセラミド、グルコシルセラミド及び蛋白質の量を解析するための試料とした。
【００９４】
（セラミド/グルコシルセラミド産生促進効果の確認）
前記回収された細胞を含むＰＢＳ液に、まず、メタノール：クロロホルム（２．５ｍｌ：１．２５ｍｌ）加え攪拌し、次に、２０分間振とうした。その後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）を行い、上清aと沈殿bを取り分けて、その上清aをセラミド/グルコシルセラミド量の解析に供し、沈殿bを次のタンパク量解析に供した。
【００９５】
（１）セラミド/グルコシルセラミド量の解析
上清aにPBS：クロロホルム（１．２５ｍｌ：１．２５ｍｌ）を入れ、２０分間振動し、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）を行い、下相にあるクロロホルム層を単離、回収した。回収されたクロロホルム層を３０℃、窒素雰囲気で乾固させた。乾燥品をクロロホルム−メタノール混合溶媒（容量比＝２.５ｍｌ：１.２５ｍｌ）１００μｌに溶解し、下記の薄層クロマトグラフィーによりセラミド量及びグルコシルセラミド量の定量に供した。
【００９６】
セラミド（又はグルコシルセラミド）標準品と試料溶液とを乾燥のTLC板に入れ、展開溶媒であるクロロホルム：メタノール：酢酸＝１９０：９：１（ｖ/ｖ/ｖ）で薄層クロマトグラフィーを行った。展開剤がＴＣＬ板のトップに到達した後、ドライヤーで展開剤を乾燥した。次いで上記操作を１回繰り返した。その後、展開溶媒であるクロロホルム：メタノール：アセトン＝７６：２０：４（ｖ/ｖ/ｖ）で薄層クロマトグラフィーを行った。展開剤がＴＣＬ板のボタムからの２．５ｃｍの位置に到達した後、展開を停止し、ドライヤーで展開剤を乾燥した。硫酸銅のリン酸溶液を吹き、乾燥して、ＴＣＬ板を１８０℃のヒータに置き７分間加熱して顕色させた。顕色されたTLC板をスキャンしてセラミド（又はグルコシルセラミド）の量（それぞれをCer及びGlyCerとし、単位μｇ/ｍＬ）を解析した。
【００９７】
（２）タンパク量の解析
細胞中のセラミド量及びグルコシルセラミド量を表示するためにタンパク量の解析を行った。上記沈殿ｂに、９００μｌ ＳＤＳ（ドデシルスルホン酸ナトリウム）溶液を入れ、混合し、６０℃で２時間加熱した後、タンパク質を変性・降解させ、冷却した。次いで、１００μｌ ２Ｎ ＨＣｌを加え、ＢＣＡ Ｋｉｔ法（タンパク量の解析用のキット）によりタンパク量（Proと記する。μｇ/ｍＬ）を測定した。
【００９８】
（３）解析の結果
本発明品とコントロールの試料のそれぞれに対して、Cer/ProとGlyCer/Proを測定した。前記コントロールのCer/ProとGlyCer/Proのそれぞれを１とした場合の、本発明のCer/ProとGlyCer/Proの相対値を算出して表２に示した。また、前記コントロールのwellあたりのタンパク量を１００とした場合の、本発明のwellあたりのタンパク量の相対値（Pro.（％））を算出して、それによりwellあたりのセラミドの量及びグルコシルセラミド量（コントロールに対する相対量）を求めた。これらの結果を合わせて表２に示した。
Cer/Well=Cer/Pro×Pro.(%)
GlyCer/Well=GlyCer/Pro×Pro.(%)
【００９９】
なお、Cer/Pro（又はCer/Well）が１（コントロール）よりも高い場合、当該試料がセラミド産生促進効果を有すると見なされる。また、GlyCer/Pro（又はGlyCer/Well）が１（コントロール）よりも高い場合、当該試料がグルコシルセラミド産生促進効果を有すると見なされる。
【０１００】
表２から明らかなように、実施例２−１の試料２−Ａ-１、２−Ａ-２、２−Ａ-３は、グルコシルセラミド産生促進効果を果たすことが確認された。
【０１０１】
（実施例２−２）
実施例２−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Lactobacillus属の微生物として、Lactobacillus brevis（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B1199として受託されている。）を使用した以外、実施例２−１と同様に培養した。
【０１０２】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｂ-１とし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【０１０３】
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｂ-２、２−Ｂ-３とし、さらに、試料２−Ｂ-２、２−Ｂ-３をそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０１０４】
実施例２−１と同様にして、試料２−Ｂ-１、２−Ｂ-２、２−Ｂ-３のセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表２に示した。
【０１０５】
表２から明らかなように、実施例２−２の試料２−Ｂ-１、２−Ｂ-２、２−Ｂ-３は、グルコシルセラミド産生促進効果を果たすことが確認された。
【０１０６】
【表２】
【０１０７】
（実施例２−３）
実施例２−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Lactobacillus属の微生物として、Lactobacillus farciminis（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B1173として受託されている。）を使用した以外、実施例２−１と同様に培養した。
【０１０８】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｃ-１とし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【０１０９】
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｃ-２、２−Ｃ-３とし、さらに、試料２−Ｃ-２、２−Ｃ-３をそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０１１０】
実施例２−１と同様にして、試料２−Ｃ-１、２−Ｃ-２、２−Ｃ-３のセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表３に示した。
【０１１１】
表３から明らかなように、実施例２−３の試料２−Ｃ-１、２−Ｃ-２、２−Ｃ-３は、セラミド産生促進効果を果たすことが確認された。
【０１１２】
【表３】
【０１１３】
（実施例２−４）
実施例２−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Lactobacillus属の微生物として、Lactobacillus pentosus（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B1174として受託されている。）を使用した以外、実施例２−１と同様に培養した。
【０１１４】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｄ-１とし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【０１１５】
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｄ-２、２−Ｄ-３とし、さらに、試料２−Ｄ-２、２−Ｄ-３をそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０１１６】
実施例２−１と同様にして、試料２−Ｄ-１、２−Ｄ-２、２−Ｄ-３のセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表４に示した。
【０１１７】
表４から明らかなように、実施例２−４の試料２−Ｄ-１、２−Ｄ-２、２−Ｄ-３は、セラミド産生促進効果を果たすことが確認された。
【０１１８】
【表４】
【０１１９】
（実施例２−５）
実施例２−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Lactobacillus属の微生物として、Lactobacillus plantarum（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B1172として受託されている。）を使用した以外、実施例２−１と同様に培養した。
【０１２０】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｅ-１とし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【０１２１】
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｅ-２、２−Ｅ-３とし、さらに、試料２−Ｅ-２、２−Ｅ-３をそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０１２２】
実施例２−１と同様にして、試料２−Ｅ-１、２−Ｅ-２、２−Ｅ-３のセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表５に示した。
【０１２３】
表５から明らかなように、実施例２−５の試料２−Ｅ-１、２−Ｅ-２、２−Ｅ-３は、グルコシルセラミド産生促進効果を果たすことが確認された。
【０１２４】
（実施例２−６）
実施例２−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Lactobacillus属の微生物として、Lactobacillus plantarum（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B1189として受託されている。）を使用した以外、実施例２−１と同様に培養した。
【０１２５】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、当該ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｆ-１、２−Ｆ-２とし、さらに、試料２−Ｆ-１、２−Ｆ-２をそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０１２６】
実施例２−１と同様にして、試料２−Ｆ-１、２−Ｆ-２のセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表５に示した。
【０１２７】
表５から明らかなように、実施例２−６の試料２−Ｆ-１、２−Ｆ-２は、セラミド及びグルコシルセラミド産生促進効果を果たすことが確認された。
【０１２８】
（実施例２−７）
実施例２−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Lactobacillus属の微生物として、Lactobacillus plantarum（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B1187として受託されている。）を使用した以外、実施例２−１と同様に培養した。
【０１２９】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、当該ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｇ-１とし、さらに、試料２−Ｇ-１を５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０１３０】
実施例２−１と同様にして、試料２−Ｇ-１のセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表５に示した。
【０１３１】
表５から明らかなように、実施例２−７の試料２−Ｇ-１は、セラミド及びグルコシルセラミド産生促進効果を果たすことが確認された。
【０１３２】
（実施例２−８）
実施例２−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Lactobacillus属の微生物として、Lactobacillus plantarum（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B1170として受託されている。）を使用した以外、実施例２−１と同様に培養した。
【０１３３】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｈ-１とし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【０１３４】
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｈ-２、２−Ｈ-３とし、さらに、試料２−Ｈ-２、２−Ｈ-３をそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０１３５】
実施例２−１と同様にして、試料２−Ｈ-１、２−Ｈ-２、２−Ｈ-３のセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表５に示した。
【０１３６】
表５から明らかなように、実施例２−８の試料２−Ｈ-１、２−Ｈ-２、２−Ｈ-３は、セラミド及び/又はグルコシルセラミド産生促進効果を果たすことが確認された。
【０１３７】
（実施例２−９）
実施例２−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Lactobacillus属の微生物として、Lactobacillus plantarum（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B1188として受託されている。）を使用した以外、実施例２−１と同様に培養した。
【０１３８】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｉ-１とし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【０１３９】
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｉ-２とし、さらに、試料２−Ｉ-２を５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０１４０】
実施例２−１と同様にして、試料２−Ｉ-１、２−Ｉ-２のセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表５に示した。
【０１４１】
表５から明らかなように、実施例２−９の試料２−Ｉ-１、２−Ｉ-２は、グルコシルセラミド産生促進効果を果たすことが確認された。
【０１４２】
【表５】
【０１４３】
（実施例２−１０）
実施例２−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Lactobacillus属の微生物として、Lactobacillus coryniformis（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B1243として受託されている。）を使用した以外、実施例２−１と同様に培養した。
【０１４４】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｊ-１とし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【０１４５】
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｊ-２、２−Ｊ−３とし、さらに、試料２−Ｉ-２、２−Ｊ−３をそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０１４６】
実施例２−１と同様にして、試料２−Ｊ-１、２−Ｊ-２、２−Ｊ−３のセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表６に示した。
【０１４７】
表６から明らかなように、実施例２−１０の試料２−Ｊ-１、２−Ｊ-２、２−Ｊ−３は、セラミド及び/又はグルコシルセラミド産生促進効果を果たすことが確認された。
【０１４８】
（実施例２−１１）
実施例２−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Lactobacillus属の微生物として、Lactobacillus coryniformis（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B1190として受託されている。）を使用した以外、実施例２−１と同様に培養した。
【０１４９】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｋ-１とし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【０１５０】
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｋ-２、２−Ｋ-３とし、さらに、試料２−Ｋ-２、２−Ｋ-３ををそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０１５１】
実施例２−１と同様にして、試料２−Ｋ-１、２−Ｋ-２、２−Ｋ-３のセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表６に示した。
【０１５２】
表６から明らかなように、実施例２−１１の試料２−Ｋ-１は、グルコシルセラミド産生促進効果を果たすことが確認された。
【０１５３】
（実施例２−１２）
実施例２−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Lactobacillus属の微生物として、Lactobacillus coryniformis（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B1259として受託されている。）を使用した以外、実施例２−１と同様に培養した。
【０１５４】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｌ-１とし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【０１５５】
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｌ-２、２−Ｌ-３とし、さらに、試料２−Ｌ-２、２−Ｌ-３をそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０１５６】
実施例２−１と同様にして、試料２−Ｌ-１、２−Ｌ-２、２−Ｌ-３のセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表６に示した。
【０１５７】
表６から明らかなように、実施例６１２の試料６Ｌ-２、６Ｌ-３は、グルコシルセラミド産生促進効果を果たすことが確認された。
【０１５８】
【表６】
【０１５９】
（実施例２−１３）
実施例２−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Lactobacillus属の微生物として、Lactobacillus curvatus（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B1248として受託されている。）を使用した以外、実施例２−１と同様に培養した。
【０１６０】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｍ-１とし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【０１６１】
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｍ-２、２−Ｍ−３とし、さらに、試料２−Ｍ-２、２−Ｍ−３をそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０１６２】
実施例２−１と同様にして、試料２−Ｍ-１、２−Ｍ-２、２−Ｍ−３のセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表７に示した。
【０１６３】
表７から明らかなように、実施例２−１３の試料２−Ｍ-１、２−Ｍ−３は、セラミド及び/又はグルコシルセラミド産生促進効果を果たすことが確認された。
【０１６４】
（実施例２−１４）
実施例２−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Lactobacillus属の微生物として、Lactobacillus curvatus（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B1413として受託されている。）を使用した以外、実施例２−１と同様に培養した。
【０１６５】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｎ-１とし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【０１６６】
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｎ-２、２−Ｎ−３とし、さらに、試料２−Ｎ-２、２−Ｎ−３をそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０１６７】
実施例２−１と同様にして、試料２−Ｎ-１、２−Ｎ-２、２−Ｎ−３のセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表７に示した。
【０１６８】
表７から明らかなように、実施例２−１４の試料２−Ｎ-２は、セラミド及びグルコシルセラミド産生促進効果を果たすことが確認された。
【０１６９】
【表７】
【０１７０】
（実施例２−１５）
実施例２−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Lactobacillus属の微生物として、Lactobacillus plantarum（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B1430として受託されている。）を使用した以外、実施例２−１と同様に培養した。
【０１７１】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｏ-１とし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【０１７２】
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｏ-２、２−Ｏ-３とし、さらに、試料２−Ｏ-２、２−Ｏ-３をそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０１７３】
実施例２−１と同様にして、試料２−Ｏ-１、２−Ｏ-２、２−Ｏ-３のセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表８に示した。
【０１７４】
表８から明らかなように、実施例２−１５の試料２−Ｏ-１、２−Ｏ-２、２−Ｏ-３は、セラミド及び/又はグルコシルセラミド産生促進効果を果たすことが確認された。
【０１７５】
（実施例２−１６）
実施例２−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Lactobacillus属の微生物として、Lactobacillus plantarum（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B1441として受託されている。）を使用した以外、実施例２−１と同様に培養した。
【０１７６】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｐ-１とし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【０１７７】
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｐ-２、２−Ｐ-３とし、さらに、試料２−Ｐ-２、２−Ｐ-３をそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０１７８】
実施例２−１と同様にして、試料２−Ｐ-１、２−Ｐ-２、２−Ｐ-３のセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表８に示した。
【０１７９】
表８から明らかなように、実施例２−１６の試料２−Ｐ-１、２−Ｐ-２、２−Ｐ-３は、セラミド及び/又はグルコシルセラミド産生促進効果を果たすことが確認された。
【０１８０】
（実施例２−１７）
実施例２−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Lactobacillus属の微生物として、Lactobacillus plantarum（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B1191として受託されている。）を使用した以外、実施例２−１と同様に培養した。
【０１８１】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｑ-１とし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【０１８２】
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｑ-２、２−Ｑ-３とし、さらに、試料２−Ｑ-２、２−Ｑ-３をそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０１８３】
実施例２−１と同様にして、試料２−Ｑ-１、２−Ｑ-２、２−Ｑ-３のセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表８に示した。
【０１８４】
表８から明らかなように、実施例２−１７の試料２−Ｑ-１、２−Ｑ-２、２−Ｑ-３は、セラミド及び/又はグルコシルセラミド産生促進効果を果たすことが確認された。
【０１８５】
（実施例２−１８）
実施例２−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Lactobacillus属の微生物として、Lactobacillus plantarum（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B1179として受託されている。）を使用した以外、実施例２−１と同様に培養した。
【０１８６】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｒ-１とし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【０１８７】
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｒ-２、２−Ｒ-３とし、さらに、試料２−Ｒ-２、２−Ｒ-３をそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０１８８】
実施例２−１と同様にして、試料２−Ｒ-１、２−Ｒ-２、２−Ｒ-３のセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表８に示した。
【０１８９】
表８から明らかなように、実施例２−１８の試料２−Ｒ-１、２−Ｒ-２、２−Ｒ-３は、グルコシルセラミド産生促進効果を果たすことが確認された。
【０１９０】
（実施例２−１９）
実施例２−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Lactobacillus属の微生物として、Lactobacillus plantarum（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B1249として受託されている。）を使用した以外、実施例２−１と同様に培養した。
【０１９１】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、当該ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｓ-１、２−Ｓ-２とし、さらに、試料２−Ｓ-１、２−Ｓ-２をそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０１９２】
実施例２−１と同様にして、試料２−Ｓ-１、２−Ｓ-２のセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表８に示した。
【０１９３】
表８から明らかなように、実施例２−１９の試料２−Ｓ-１、２−Ｓ-２は、グルコシルセラミド産生促進効果を果たすことが確認された。
【０１９４】
（実施例２−２０）
実施例２−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Lactobacillus属の微生物として、Lactobacillus plantarum（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B1250として受託されている。）を使用した以外、実施例２−１と同様に培養した。
【０１９５】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｔ-１とし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【０１９６】
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｔ-２とし、さらに、試料２−Ｔ-２を５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０１９７】
実施例２−１と同様にして、試料２−Ｔ-１、２−Ｔ-２のセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表８に示した。
【０１９８】
表８から明らかなように、実施例２−２０の試料２−Ｔ-１、２−Ｔ-２は、グルコシルセラミド産生促進効果を果たすことが確認された。
【０１９９】
（実施例２−２１）
実施例２−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Lactobacillus属の微生物として、Lactobacillus plantarum（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B1255として受託されている。）を使用した以外、実施例２−１と同様に培養した。
【０２００】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｕ-１とし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【０２０１】
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｕ-２、２−Ｕ-３とし、さらに、試料２−Ｕ-２、２−Ｕ-３をそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０２０２】
実施例２−１と同様にして、試料２−Ｕ-１、２−Ｕ-２、２−Ｕ-３のセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表８に示した。
【０２０３】
表８から明らかなように、実施例２−２１の試料２−Ｕ-１、２−Ｕ-２、２−Ｕ-３は、グルコシルセラミド産生促進効果を果たすことが確認された。
【０２０４】
（実施例２−２２）
実施例２−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Lactobacillus属の微生物として、Lactobacillus plantarum（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B1433として受託されている。）を使用した以外、実施例２−１と同様に培養した。
【０２０５】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｖ-１とし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【０２０６】
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｖ-２、２−Ｖ-３とし、さらに、試料２−Ｖ-２、２−Ｖ-３をそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０２０７】
実施例２−１と同様にして、試料２−Ｖ-１、２−Ｖ-２、２−Ｖ-３のセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表８に示した。
【０２０８】
表８から明らかなように、実施例２−２２の試料２−Ｖ-１、２−Ｖ-２、２−Ｖ-３は、グルコシルセラミド産生促進効果を果たすことが確認された。
【０２０９】
（実施例２−２３）
実施例２−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Lactobacillus属の微生物として、Lactobacillus plantarum（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B1432として受託されている。）を使用した以外、実施例２−１と同様に培養した。
【０２１０】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｗ-１とし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【０２１１】
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｗ-２、２−Ｗ-３とし、さらに、試料２−Ｗ-２、２−Ｗ-３をそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０２１２】
実施例２−１と同様にして、試料２−Ｗ-１、２−Ｗ-２、２−Ｗ-３のセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表８に示した。
【０２１３】
表８から明らかなように、実施例２−２３の試料２−Ｗ-１、２−Ｗ-２、２−Ｗ-３は、セラミド及びグルコシルセラミド産生促進効果を果たすことが確認された。
【０２１４】
（実施例２−２４）
実施例２−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Lactobacillus属の微生物として、Lactobacillus plantarum（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B1442として受託されている。）を使用した以外、実施例２−１と同様に培養した。
【０２１５】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｘ-１とし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【０２１６】
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｘ-２、２−Ｘ-３とし、さらに、試料２−Ｘ-２、２−Ｘ-３をそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０２１７】
実施例２−１と同様にして、試料２−Ｘ-１、２−Ｘ-２、２−Ｘ-３のセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表８に示した。
【０２１８】
表８から明らかなように、実施例２−２４の試料２−Ｘ-１、２−Ｘ-２、２−Ｘ-３は、セラミド及びグルコシルセラミド産生促進効果を果たすことが確認された。
【０２１９】
【表８】
【０２２０】
（実施例２−２５）
実施例２−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Lactobacillus属の微生物として、Lactobacillus alimentarius（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B1439として受託されている。）を使用した以外、実施例２−１と同様に培養した。
【０２２１】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、当該ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｙ-１、２−Ｙ-２とし、さらに、試料２−Ｙ-１、２−Ｙ-２をそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０２２２】
実施例２−１と同様にして、試料２−Ｙ-１、２−Ｙ-２のセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表９に示した。
【０２２３】
表９から明らかなように、実施例２−２５の試料２−Ｙ-１、２−Ｙ-２は、セラミド及び/又はグルコシルセラミド産生促進効果を果たすことが確認された。
【０２２４】
（実施例２−２６）
実施例２−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Lactobacillus属の微生物として、Lactobacillus alimentarius（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B1440として受託されている。）を使用した以外、実施例２−１と同様に培養した。
【０２２５】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、当該ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−Ｚ-１とし、さらに、試料２−Ｚ-１を５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０２２６】
実施例２−１と同様にして、試料２−Ｚ-１のセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表９に示した。
【０２２７】
表９から明らかなように、実施例２−２６の試料２−Ｚ-１は、セラミド産生促進効果を果たすことが確認された。
【０２２８】
（実施例２−２７）
実施例２−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Lactobacillus属の微生物として、Lactobacillus farciminis（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B1443として受託されている。）を使用した以外、実施例２−１と同様に培養した。
【０２２９】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、当該ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２−ａ-１とし、さらに、試料２−ａ-１を５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０２３０】
実施例２−１と同様にして、試料２−ａ-１のセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表９に示した。
【０２３１】
表９から明らかなように、実施例２−２７の試料２−ａ-１は、セラミド産生促進効果を果たすことが確認された。
【０２３２】
【表９】
【０２３３】
なお、上記試料のそれぞれについて、それを上記ヒトの活性化角化細胞を含む１２well Plateに加えることを行わない（即ち、上記細胞培養を行わない）ままで、セラミド量及びグルコシルセラミド量の解析を行った。上記以外は、上記実施例２−１と同様にした。その結果は、上記試料のそれぞれの何れかの自身にもセラミド又はグルコシルセラミドが存在しないことが確認された。
これから、本発明の製品自身には、セラミド又はグルコシルセラミドが存在しないが、本発明の製品が、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進の効果を有し、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤として用いることが分かる。
【０２３４】
（実施例３−１）
＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞
まず、以下の方法で培地を調製した。大豆を水に入れ、１２時間含浸し、大豆に水を十分に吸収させた。水を吸収した大豆を研削して粉砕し、濾過、滴り乾燥し、大豆残渣を得た。当該大豆残渣を、大豆残渣の濃度が１０ｗ/ｖ％、ブドウ糖の濃度が１ｗ/ｖ％になるように、ブドウ糖及び水と混合して、培地とした。
次いで、上記培地１００ｍｌを三角フラスコに入れ、Acetobacter aceti（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B0137として受託されている。）を規定の量で接種し、３０℃で３日間培養した。
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料３−Ａとし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料３−Ｂ、３−Ｃとし、さらに、試料３−Ｂ、３−Ｃをそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０２３５】
＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の評価＞
【０２３６】
（細胞培養）
まず、正常ヒトの活性化角化細胞（Cascade Co., Ltd）を初代細胞として、７５ｃｍ2の培養フラスコ（増殖因子を含有する培地２ｍｌ）に、７℃、５％ＣＯ2のインキュベーターにて８０〜９０％コンフルエントの状態に達するまで培養した。継代細胞を１７５ｃｍ2の培養フラスコに８０〜９０％コンフルエントの状態に達するまでに持続培養した。継代培養した後のヒト表皮角化細胞を１２well Plate （細胞数１×１０5個/ｍＬ）に２ｍＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ2のインキュベーターにて８０〜９０％コンフルエントの状態に達するまで持続培養した。
次いで、上記１２well Plateにおいて増殖因子を含有しない培地を変更し、本発明の製品（試料３−Ａ、３−Ｂ、３−Ｃ）及びコントロール（50v/v%のエタノール溶液）を当該１２well Plate（n=2）に添加した。同じ条件で３日間培養した。
その後、上清の培養液を除去し、PBS（２ｍＬ/Ｗｅｌｌ）にて細胞を２回洗浄した後、１ｍＬＰＢＳを入れ、各々の細胞をセルハーベスターで試験管に回収した。それを、後のセラミド、グルコシルセラミド及び蛋白質の量を解析するための試料とした。
【０２３７】
（セラミド/グルコシルセラミド産生促進効果の確認）
前記回収された細胞を含むＰＢＳ液に、まず、メタノール：クロロホルム（２．５ｍｌ：１．２５ｍｌ）加え攪拌し、次に、２０分間振とうした。その後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）を行い、上清aと沈殿bを取り分けて、その上清aをセラミド/グルコシルセラミド量の解析に供し、沈殿bを次のタンパク量解析に供した。
【０２３８】
（１）セラミド/グルコシルセラミド量の解析
上清aにPBS：クロロホルム（１．２５ｍｌ：１．２５ｍｌ）を入れ、２０分間振動し、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）を行い、下相にあるクロロホルム層を単離、回収した。回収されたクロロホルム層を３０℃、窒素雰囲気で乾固させた。乾燥品をクロロホルム−メタノール混合溶媒（容量比＝２.５ｍｌ：１.２５ｍｌ）１００μｌに溶解し、下記の薄層クロマトグラフィーによりセラミド量及びグルコシルセラミド量の定量に供した。
【０２３９】
セラミド（又はグルコシルセラミド）標準品と試料溶液とを乾燥のTLC板に入れ、展開溶媒であるクロロホルム：メタノール：酢酸＝１９０：９：１（ｖ/ｖ/ｖ）で薄層クロマトグラフィーを行った。展開剤がＴＣＬ板のトップに到達した後、ドライヤーで展開剤を乾燥した。次いで上記操作を１回繰り返した。その後、展開溶媒であるクロロホルム：メタノール：アセトン＝７６：２０：４（ｖ/ｖ/ｖ）で薄層クロマトグラフィーを行った。展開剤がＴＣＬ板のボタムからの２．５ｃｍの位置に到達した後、展開を停止し、ドライヤーで展開剤を乾燥した。硫酸銅のリン酸溶液を吹き、乾燥して、ＴＣＬ板を１８０℃のヒータに置き７分間加熱して顕色させた。顕色されたTLC板をスキャンしてセラミド（又はグルコシルセラミド）の量（それぞれをCer及びGlyCerとし、単位μｇ/ｍＬ）を解析した。
【０２４０】
（２）タンパク量の解析
細胞中のセラミド量及びグルコシルセラミド量を表示するためにタンパク量の解析を行った。上記沈殿ｂに、９００μｌ ＳＤＳ（ドデシルスルホン酸ナトリウム）溶液を入れ、混合し、６０℃で２時間加熱した後、タンパク質を変性・降解させ、冷却した。次いで、１００μｌ ２Ｎ ＨＣｌを加え、ＢＣＡ Ｋｉｔ法（タンパク量の解析用のキット）によりタンパク量（Proと記する。μｇ/ｍＬ）を測定した。
【０２４１】
（３）解析の結果
本発明品とコントロールの試料のそれぞれに対して、下式のように、Cer/ProとGlyCer/Proを測定した。前記コントロールのCer/ProとGlyCer/Proのそれぞれを１とした場合の、本発明のCer/ProとGlyCer/Proの相対値を算出して表１０に示した。また、前記コントロールのwellあたりのタンパク量を１００とした場合の、本発明のwellあたりのタンパク量の相対値（Pro.（％））を算出して、それによりwellあたりのセラミドの量及びグルコシルセラミド量（コントロールに対する相対量）を求めた。合わせて表１０に示した。
Cer/Well=Cer/Pro×Pro.(%)
GlyCer/Well=GlyCer/Pro×Pro.(%)
【０２４２】
なお、Cer/Pro（又はCer/Well）が１（コントロール）よりも高い場合、当該試料がセラミド産生促進効果を有すると見なされる。また、GlyCer/Pro（又はGlyCer/Well）が１（コントロール）よりも高い場合、当該試料がグルコシルセラミド産生促進効果を有すると見なされる。
【０２４３】
表１０から明らかなように、実施例３−１の試料３−Ａ、３−Ｂ、３−Ｃは、グルコシルセラミド産生促進効果が認められた。
【０２４４】
（実施例３−２）
実施例３−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Acetobacter属の微生物として、Acetobacter aceti（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B0142として受託されている。）を使用した以外、実施例３−１と同様に培養した。
【０２４５】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料３−Ｄとし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料３−Ｅ、３−Ｆとし、さらに、試料３−Ｅ、３−Ｆをそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０２４６】
実施例３−１と同様にして、試料３−Ｄ、３−Ｅ、３−Ｆのセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表１０に示した。
【０２４７】
表１０から明らかなように、実施例３−２の試料３−Ｄ、３−Ｅ、３−Ｆは、セラミド及びグルコシルセラミド産生促進効果が認められた。
【０２４８】
（実施例３−３）
実施例３−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Acetobacter属の微生物として、Acetobacter aceti（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B0145として受託されている。）を使用した以外、実施例３−１と同様に培養した。
【０２４９】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料３−Ｇとし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【０２５０】
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料３−Ｈ、３−Ｉとし、さらに、試料３−Ｈ、３−Ｉをそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０２５１】
実施例３−１と同様にして、試料３−Ｇ、３−Ｈ、３−Ｉのセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表１０に示した。
【０２５２】
表１０から明らかなように、実施例３−３の試料３−Ｇ、３−Ｈ、３−Ｉは、セラミド産生促進効果が認められた。
【０２５３】
（実施例３−４）
実施例３−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Acetobacter属の微生物として、Acetobacter aceti（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B0133として受託されている。）を使用した以外、実施例３−１と同様に培養した。
【０２５４】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料３−Ｊとし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【０２５５】
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料３−Ｋ、３−Ｌとし、さらに、試料３−Ｋ、３−Ｌをそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０２５６】
実施例３−１と同様にして、試料３−Ｊ、３−Ｋ、３−Ｌのセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表１０に示した。
【０２５７】
表１０から明らかなように、実施例３−４の試料３−Ｊ、３−Ｋ、３−Ｌは、セラミド産生促進効果が認められた。
【０２５８】
（実施例３−５）
【０２５９】
実施例３−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Acetobacter属の微生物として、Acetobacter aceti（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B0128として受託されている。）を使用した以外、実施例３−１と同様に培養した。
【０２６０】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料３−Ｍとし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【０２６１】
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料３−Ｎ、３−Ｏとし、さらに、試料３−Ｎ、３−Ｏをそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０２６２】
実施例３−１と同様にして、試料３−Ｍ、３−Ｎ、３−Ｏのセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表１０に示した。
【０２６３】
表１０から明らかなように、実施例３−５の試料３−Ｍ、３−Ｎ、３−Ｏは、セラミド産生促進効果が認められた。
【０２６４】
（実施例３−６）
【０２６５】
実施例３−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Acetobacter属の微生物として、Acetobacter aceti（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B0130として受託されている。）を使用した以外、実施例３−１と同様に培養した。
【０２６６】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料３−Ｐとし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【０２６７】
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料３−Ｑ、３−Ｒとし、さらに、試料３−Ｑ、３−Ｒをそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０２６８】
実施例３−１と同様にして、試料３−Ｐ、３−Ｑ、３−Ｒのセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表１０に示した。
【０２６９】
表１０から明らかなように、実施例３−６の試料３−Ｐ、３−Ｑ、３−Ｒは、セラミド産生促進効果が認められた。
【０２７０】
（実施例３−７）
【０２７１】
実施例３−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Acetobacter属の微生物として、Acetobacter aceti（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B0120として受託されている。）を使用した以外、実施例３−１と同様に培養した。
【０２７２】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料３−Ｓとし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【０２７３】
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料３−Ｔ、３−Ｕとし、さらに、試料３−Ｔ、３−Ｕをそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０２７４】
実施例３−１と同様にして、試料３−Ｓ、３−Ｔ、３−Ｕのセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表１０に示した。
【０２７５】
表１０から明らかなように、実施例３−７の試料３−Ｓ、３−Ｔは、グルコシルセラミド産生促進効果が認められた。
【０２７６】
【表１０】
【０２７７】
なお、試料３−Ａ〜３−Ｕについて、それらを上記ヒトの活性化角化細胞を含む１２well Plateに加えることを行わない（即ち、上記細胞培養を行わない）ままで、セラミド量及びグルコシルセラミド量の解析を行った。上記以外は、上記実施例３−１と同様にした。その結果は、試料３−Ａ〜３−Ｕの何れかの自身にもセラミド又はグルコシルセラミドが存在しないことが確認された。
【０２７８】
これから、本発明の製品自身には、セラミド又はグルコシルセラミドが存在しないが、本発明の製品が、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進の効果を有し、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤として用いることが分かる。
【０２７９】
（実施例４−１）
＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞
まず、以下の方法で培地を調製した。大豆を水に入れ、１２時間含浸し、大豆に水を十分に吸収させた。水を吸収した大豆を研削して粉砕し、濾過、滴り乾燥し、大豆残渣を得た。当該大豆残渣を、大豆残渣の濃度が１０ｗ/ｖ％、ブドウ糖の濃度が１ｗ/ｖ％になるように、ブドウ糖及び水と混合して、培地とした。
【０２８０】
次いで、上記培地１００ｍｌを三角フラスコに入れ、Leuconostoc mesenteroides（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B1254として受託されている。）を規定の量で接種し、３０℃で３日間培養した。
【０２８１】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料４−Ａとし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料４−Ｂ、４−Ｃとし、さらに、試料４−Ｂ、４−Ｃをそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０２８２】
＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の評価＞
（細胞培養）
まず、正常ヒトの活性化角化細胞（Cascade Co., Ltd）を初代細胞として、７５ｃｍ2の培養フラスコ（増殖因子を含有する培地２ｍｌ）に、７℃、５％ＣＯ2のインキュベーターにて８０〜９０％コンフルエントの状態に達するまで培養した。継代細胞を１７５ｃｍ2の培養フラスコに８０〜９０％コンフルエントの状態に達するまでに持続培養した。継代培養した後のヒト表皮角化細胞を１２well Plate （細胞数１×１０5個/ｍＬ）に２ｍＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ2のインキュベーターにて８０〜９０％コンフルエントの状態に達するまで持続培養した。
【０２８３】
次いで、上記１２well Plateにおいて増殖因子を含有しない培地を変更し、本発明の製品（試料４−Ａ、４−Ｂ、４−Ｃ）及びコントロール（50v/v%のエタノール溶液）を当該１２well Plate（n=2）に添加した。同じ条件で３日間培養した。
【０２８４】
その後、上清の培養液を除去し、PBS（２ｍＬ/Ｗｅｌｌ）にて細胞を２回洗浄した後、１ｍＬＰＢＳを入れ、各々の細胞をセルハーベスターで試験管に回収した。それを、後のセラミド及び蛋白質の解析する用の試料とした。
【０２８５】
（セラミド産生促進効果の確認）
前記回収された細胞を含むＰＢＳ液に、まず、メタノール：クロロホルム（２．５ｍｌ：１．２５ｍｌ）加え攪拌し、次に、２０分間振とうした。その後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）を行い、上清aと沈殿bを取り分けて、その上清aをセラミド量の解析に供し、沈殿bを次のタンパク量解析に供した。
【０２８６】
（１）セラミド量の解析
上清aにPBS：クロロホルム（１．２５ｍｌ：１．２５ｍｌ）を入れ、２０分間振動し、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）を行い、下相にあるクロロホルム層を単離、回収した。回収されたクロロホルム層を３０℃、窒素雰囲気で乾固させた。乾燥品をクロロホルム−メタノール混合溶媒（容量比＝２.５ｍｌ：１.２５ｍｌ）１００μｌに溶解し、下記の薄層クロマトグラフィーによりセラミド量の定量に供した。
【０２８７】
セラミド標準品と試料溶液とを乾燥のTLC板に入れ、展開溶媒であるクロロホルム：メタノール：酢酸＝１９０：９：１（ｖ/ｖ/ｖ）で薄層クロマトグラフィーを行った。展開剤がＴＣＬ板のトップに到達した後、ドライヤーで展開剤を乾燥した。次いで上記操作を１回繰り返した。その後、展開溶媒であるクロロホルム：メタノール：アセトン＝７６：２０：４（ｖ/ｖ/ｖ）で薄層クロマトグラフィーを行った。展開剤がＴＣＬ板のボタムからの２．５ｃｍの位置に到達した後、展開を停止し、ドライヤーで展開剤を乾燥した。硫酸銅のリン酸溶液を吹き、乾燥して、ＴＣＬ板を１８０℃のヒータに置き７分間加熱して顕色させた。顕色されたTLC板をスキャンしてセラミドの量（Cerとし、単位μｇ/ｍＬ）を解析した。
【０２８８】
（２）タンパク量の解析
細胞中のセラミド量及びグルコシルセラミド量を表示するためにタンパク量の解析を行った。上記沈殿ｂに、９００μｌ ＳＤＳ（ドデシルスルホン酸ナトリウム）溶液を入れ、混合し、６０℃で２時間加熱した後、タンパク質を変性・降解させ、冷却した。次いで、１００μｌ ２Ｎ ＨＣｌを加え、ＢＣＡ Ｋｉｔ法（タンパク量の解析用のキット）によりタンパク量（Proと記する。μｇ/ｍＬ）を測定した。
【０２８９】
（３）解析の結果
本発明品とコントロールの試料のそれぞれに対して、下式のように、Cer/Proを測定した。前記コントロールのCer/Proを１とした場合の、本発明のCer/Proの相対値を算出して表１1に示した。また、前記コントロールのwellあたりのタンパク量を１００とした場合の、本発明のwellあたりのタンパク量の相対値（Pro.（％））を算出して、それによりwellあたりのセラミドの量（コントロールに対する相対量）を求めた。合わせて表１１に示した。
Cer/Well=Cer/Pro×Pro.(%)
【０２９０】
なお、Cer/Pro（又はCer/Well）が１（コントロール）よりも高い場合、当該試料がセラミド産生促進効果を有すると見なされる。
【０２９１】
表１１から明らかなように、実施例４−１の試料４−Ａ、４−Ｂ、４−Ｃは、セラミド産生促進効果が認められた。
【０２９２】
（実施例４−２）
実施例４−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Leuconostoc属の微生物として、Leuconostoc mesenteroides（中国高校工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM B1364として受託されている。）を使用した以外、実施例４−１と同様に培養した。
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料４−Ｄとし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料４−Ｅ、４−Ｆとし、さらに、試料４−Ｅ、４−Ｆをそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
実施例４−１と同様にして、試料４−Ｄ、４−Ｅ、４−Ｆのセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表１1に示した。
表１１から明らかなように、実施例４−２の試料４−Ｄ、４−Ｅ、４−Ｆは、セラミド産生促進効果が認められた。
【０２９３】
【表１１】
【０２９４】
なお、試料４−Ａ〜４−Ｆについて、それらを上記ヒトの活性化角化細胞を含む１２well Plateに加えることを行わない（即ち、上記細胞培養を行わない）ままで、セラミド量及びグルコシルセラミド量の解析を行った。上記以外は、上記実施例４−１と同様にした。その結果は、試料４−Ａ〜４−Ｆの何れかの自身にもセラミド又はグルコシルセラミドが存在しないことが確認された。
【０２９５】
これから、本発明の製品自身には、セラミド又はグルコシルセラミドが存在しないが、本発明の製品が、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進の効果を有し、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤として用いることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【０２９６】
本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤は、医薬品、医薬部外品、化粧品等に利用できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
大豆残渣および糖類を含有する培地中で細菌を培養し、培養上清からセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を採取する、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造方法。
【請求項２】
前記細菌は、Bacillus属の細菌、Lactobacillus属の細菌、Acetobacter属の細菌、及びLeuconostoc属の細菌から選ばれる何れかのものである、請求項１に記載のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造方法。
【請求項３】
前記Bacillus属の細菌が、Bacillus subtilis、Bacillus acidicola、Bacillus gibsonii、又はBacillus licheniformisである、請求項２に記載のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造方法。
【請求項４】
前記Lactobacillus属の細菌が、Lactobacillus brevis、Lactobacillus farciminis、Lactobacillus pentosus、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus coryniformis、Lactobacillus curvatus、又はLactobacillus alimentariusである、請求項２に記載のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造方法。
【請求項５】
前記Acetobacter属の細菌が、Acetobacter acetiである、請求項２に記載のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造方法。
【請求項６】
前記Leuconostoc属の細菌が、Leuconostoc mesenteroidesである、請求項２に記載のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造方法。
【請求項７】
前記糖類は葡萄糖である、請求項１〜６の何れか一項に記載のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造方法。
【請求項８】
前記培地は、大豆残渣、葡萄糖及び水からなるものである、請求項７に記載のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造方法。
【請求項９】
前記培地の中に前記大豆残渣を８〜１２ｗ/ｖ％、前記糖類を０．８〜１．２ｗ/ｖ％含有する、請求項８に記載のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造方法。
【請求項１０】
前記培養の温度は２７〜３５℃である、請求項１〜９の何れか一項に記載のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造方法。
【請求項１１】
前記培養時間は１〜７日間である、請求項１〜１０の何れか一項に記載のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造方法。
【請求項１２】
前記培養して得られた培養液を遠心分離により、前記上清を得る、請求項１〜１１の何れか一項に記載のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造方法。
【請求項１３】
前記遠心分離した上清に、エタノールを加え、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤をとする、請求項１２に記載のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造方法。
【請求項１４】
上記エタノールを加えたものを、さらに、超音波処理、遠心分離、ろ過、真空乾燥処理で精製して、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤として得る、請求項１３に記載のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれかに記載の製造方法によって得られるセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤。
【請求項１】
大豆残渣および糖類を含有する培地中で細菌を培養し、培養上清からセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を採取する、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造方法。
【請求項２】
前記細菌は、Bacillus属の細菌、Lactobacillus属の細菌、Acetobacter属の細菌、及びLeuconostoc属の細菌から選ばれる何れかのものである、請求項１に記載のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造方法。
【請求項３】
前記Bacillus属の細菌が、Bacillus subtilis、Bacillus acidicola、Bacillus gibsonii、又はBacillus licheniformisである、請求項２に記載のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造方法。
【請求項４】
前記Lactobacillus属の細菌が、Lactobacillus brevis、Lactobacillus farciminis、Lactobacillus pentosus、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus coryniformis、Lactobacillus curvatus、又はLactobacillus alimentariusである、請求項２に記載のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造方法。
【請求項５】
前記Acetobacter属の細菌が、Acetobacter acetiである、請求項２に記載のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造方法。
【請求項６】
前記Leuconostoc属の細菌が、Leuconostoc mesenteroidesである、請求項２に記載のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造方法。
【請求項７】
前記糖類は葡萄糖である、請求項１〜６の何れか一項に記載のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造方法。
【請求項８】
前記培地は、大豆残渣、葡萄糖及び水からなるものである、請求項７に記載のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造方法。
【請求項９】
前記培地の中に前記大豆残渣を８〜１２ｗ/ｖ％、前記糖類を０．８〜１．２ｗ/ｖ％含有する、請求項８に記載のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造方法。
【請求項１０】
前記培養の温度は２７〜３５℃である、請求項１〜９の何れか一項に記載のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造方法。
【請求項１１】
前記培養時間は１〜７日間である、請求項１〜１０の何れか一項に記載のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造方法。
【請求項１２】
前記培養して得られた培養液を遠心分離により、前記上清を得る、請求項１〜１１の何れか一項に記載のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造方法。
【請求項１３】
前記遠心分離した上清に、エタノールを加え、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤をとする、請求項１２に記載のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造方法。
【請求項１４】
上記エタノールを加えたものを、さらに、超音波処理、遠心分離、ろ過、真空乾燥処理で精製して、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤として得る、請求項１３に記載のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれかに記載の製造方法によって得られるセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤。
【公開番号】特開２０１２−１３９２１７（Ｐ２０１２−１３９２１７Ａ）
【公開日】平成２４年７月２６日（２０１２．７．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２８６０４８（Ｐ２０１１−２８６０４８）
【出願日】平成２３年１２月２７日（２０１１．１２．２７）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年７月２６日（２０１２．７．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１２月２７日（２０１１．１２．２７）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【Ｆターム（参考）】
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