セラリシン（Ｓｅｒｒａｌｉｓｉｎｓ）のポリペプチド断片を含む医薬組成物
本発明は、組織学的起源が異なる腫瘍細胞及び活性化された内皮細胞の増殖を抑制することができる組成物に関するものである。前記組成物の成分はセラリシンのポリペプチド断片であり、配列の内部メチオニンから分子の末端までのＣ末端断片に対応し、それらはお互いと、及び任意選択でその組成物の抗癌効果を強化するプロジギオシンと組み合わせることができる。組成物中のプロジギオシンは、０．１〜１００ｎＭの濃度が可能である。組成物の増殖抑制作用は、アポトーシスのメカニズムによって提供される。本発明組成物のｉｎ ｖｉｖｏ投与は抗腫瘍効果、抗血管新生効果を有し、悪性腫瘍から保護する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジー、医薬産業の分野、より詳細には腫瘍細胞の増殖を抑制することが可能な組成物の産生に関連する。この組成物は、セラリシン分子全体よりも高い抗増殖作用を有する、完全なタンパク質の分解から得られるセラリシンからのポリペプチド断片を含む。この断片は、その配列の内部メチオニンから分子の末端までのセラリシンＣ末端に属し、これをプロジギオシン(prodigiosins)と組み合わせると、この組成物の抗腫瘍効果が強化される。
【背景技術】
【０００２】
癌化学療法は従来、癌細胞増殖の抑制に向けられてきた。それにも拘らず、近年、増殖過剰の代わり、癌がアポトーシスの相対的な欠乏に関係する病理として確立されたので、アポトーシスを誘導する抗腫瘍製品に対する関心が増加している。
【０００３】
細菌又はそれらの抽出物は、癌治療のためにほぼ１００年の間用いられてきた。最も引用された報告書は、スローンケッタリング記念病院と呼ばれるニューヨーク市の記念病院の内科医及び外科医であるＷｉｌｌｉａｍ Ｂ．Ｃｏｌｅｙのものである。彼は、数種類の癌を患う彼の患者の多くが病原細菌に感染した後に腫瘍退縮を経験することを観察した（Ｃｏｌｅｙ、Ｗ．Ｂ．１９９１年−１８９３年からの再刷−Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．２６２：３）。
【０００４】
感染した患者又は動物の腫瘍抵抗性は、付随する細胞媒介性の抗腫瘍免疫によるものであるとされた（Ｐａｇｌｉａ，Ｐ．及びＧｕｚｍａｎ，Ｃ．Ａ．１９９８．Ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４６：８８）。病原性細菌又は原生動物が感染すれば先天性免疫又は適応免疫の活性化を通して癌退縮を活性化できるはずであるという考えは、Ｈｕｎｔｅｒらによって最近疑問視されている（Ｈｕｎｔｅｒ，Ｃ．Ａ．、Ｙｕ，Ｄ．、Ｇｅｅ，Ｍ．、Ｎｇｏ，Ｃ．Ｖ．、Ｓｅｖｉｇｎａｎｉ，Ｃ．、Ｇｏｌｄｓｃｈｍｉｄｔ，Ｍ．、Ｇｏｌｏｖｋｉｎａ，Ｔ．Ｖ．、Ｅｖａｎｓ，Ｓ．、Ｌｅｅ，Ｗ．Ｆ．及びＴｈｏｍａｓ−Ｔｅｋｈｏｎｅｎｋｏ，Ａ．２００１．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：５８７８）。彼らは、Ｔ．Ｇｏｎｄｉｉに感染した組織は、腫瘍内での血管の形成を妨げるいくつかの可溶性抗血管新生因子を産生することを証明したが、これらは潜在的に治療目的に成り得る。血管形成として知られる新しい毛細血管のこの形成過程は、癌及びその転移に対する新しい療法の実施のための重要な焦点となった。抗血管新生因子の探索は、新しい抗癌治療法の基盤である（Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．２００３．Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．１３：１５９）。最近、化学療法薬及び選択的な抗血管剤としての嫌気性菌の使用は、マウスで皮下（ｓｃ）腫瘍のかなりの退縮をもたらした。本療法は、併用溶菌療法（ＣＯＢＡＬＴＯ）と名づけられている（Ｄａｎｇ，Ｌ．Ｈ．、Ｂｅｔｔｅｇｏｗｄａ，Ｃ．、Ｈｕｓｏ，Ｄ．Ｌ．、Ｋｌｎｚｌｅｒ，Ｋ．Ｗ．及びＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂ．２００１．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｒａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９８：１５１５５）。しかし、生きている細菌は、ヒト癌に対するそれらの使用を制限する重大な毒性及び副次的な反応を生じる。
【０００５】
過去数年、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導するレドックスタンパク質を嫌気性菌が放出することを示すいくつかの報告書が現れた（Ｙａｍａｄａ，Ｔ．、Ｇｏｔｏ，Ｍ．、Ｐｕｎｊ，Ｖ．、Ｚａｂｏｒｉｎａ，Ｏ及びＣｈｅｎ，Ｍ．Ｌ．２００２．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９９：１４０８８；Ｇｏｔｏ，Ｍ．、Ｙａｍａｄａ，Ｔ．、Ｋｉｍｂａｒａ，Ｋ．、Ｈｏｒｎｅｒ，Ｊ．、Ｎｅｗｃｏｍｂ，Ｍ．、Ｇｕｐｔａ，Ｔ．Ｋ．及びＣｈａｋｒａｂａｒｔｙ，Ａ．Ｍ．２００３．Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４７：５４９）。レドックスタンパク質は原核細胞祖先によって分泌された一群の可溶タンパク質に属し、それらの機能は祖先の真核細胞の除去であろうと仮定された（Ｐｕｎｊ，Ｖ．及びＣｈａｋｒａｂａｒｔｙ，Ａ．Ｍ．２００３．Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．５：２２５）。一般に、癌細胞に特異的に作用してそれらの死、及び同時に腫瘍退縮を引き起こすことができるこれらの原核生物による可溶性分泌因子の産生に関しては、ほとんど知られていない。
【０００６】
セラチアマルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）は、通性嫌気性細菌である。その系統のいくつかから、抗腫瘍特性を有するいくつかの製剤が得られ、最も研究されたのは、［ａ］患者の免疫系を活性化するリボソーム膜の製剤である、ＩｍｕＶｅｒｔ（登録商標）（Ｂｕｄａｇｏｖ，Ｒ．Ｓ．及びＵｌｉａｎｏｖａ，Ｌ．Ｐ．２００１．Ｒａｄｉａｔｓ Ｂｉｏｌ Ｒａｄｉｏｅｃｏｌ Ｒｕｓｓｉａｎ．４１：３８）、［ｂ］α−２マクログロブリンの発現に依存する壊死によって細胞死を誘導する、セラチアのプロテアーゼＭｒ５６，０００（Ｗｕ，Ｊ．、Ａｋａｉｋｅ，Ｔ．、Ｈａｙａｓｈｉｂａ，Ｋ．、Ｏｋａｍｏｔｏ，Ｔ．、Ｏｋｕｙａｍａ，Ａ．及びＭａｅｄａ，Ｈ．２００１．Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．９２：４３９）、並びに［ｃ］アポトーシスの誘導を通して免疫抑制及び抗発癌原性の働きをする色素ファミリーである、プロジギオシン、（Ｍｏｎｔａｎｅｒ，Ｂ及びＰｅｒｅｚ Ｔｏｍａｓ，Ｒ．２００３．Ｃｕｒｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ．３：５７；Ｐｅｒｅｚ Ｔｏｍａｓ，Ｒ．ｙ Ｍｏｎｔａｎｅｒ，Ｂ．２００３．Ｈｉｓｔｏｌ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．１８：３７９）である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
我々は、分子全体よりも高い細胞傷害活性を有する、セラリシンの非タンパク分解性断片を得た。これにより、これらの断片を低用量のプロジギオシンと組み合わせて、その色素で報告されている毒性を低下させ、腫瘍細胞に対する増殖抑制作用を高めることが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の組成物は、腫瘍細胞の増殖を抑制することができ、セラリシン分子全体よりも高い抗増殖効果を有する、セラリシンのポリペプチド断片により形成され、その抗腫瘍作用を強化するプロジギオシンと組み合わせることができる。
【０００９】
本発明では、ポリペプチド及びプロジギオシンが共存し、悪性細胞系に対して広範囲の細胞傷害活性を有し、形質転換された腫瘍細胞、特に増殖が活性化された細胞に対して選択効果を示す、ＭＧ２３２７調製物の獲得が記載される。腫瘍性又は非腫瘍性の異なる細胞系に関する感受性試験は、正常な細胞系はＭＧ２３２７調製物にわずかに感受性であるが、黒色腫、喉頭癌腫、線維肉腫、肝臓癌腫及び頸子宮癌腫（ヒト乳頭腫ウイルスは陽性又は非陽性）に由来する細胞は非常に感受性であることを示す。造血器官起源の癌腫の感受性は低い。その増殖が活性化されたＨＵＶＥＣ細胞は、活性化されていないものよりもＭＧ２３２７に対して感受性が高い。ＭＧ２３２７調製物は、細胞分裂の過程で発現又は過剰発現される因子に特異的に作用することができる。これらの因子は、癌又は他の増殖性疾患に対する治療標的を構成する。さらに、これらの因子は、分化型若しくは非分化型の細胞の増殖過剰又は非制御増殖によって開始される疾患の早期診断のための標的も構成する。正常細胞はその作用に対しより抵抗性であるので、これらの分子を含む放出制御製剤は、これらの増殖性標的に対し特異的に作用するように、それら標的に向かわせることができるであろう。
【００１０】
ＭＧ２３２７調製物の抗腫瘍活性を証明するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスに、腹水マウス腫瘍を引き起こすことができる骨髄起源の腫瘍細胞ＣＢ Ｈｅｐ．１を腹腔内接種によって投与した（Ｆｏｎｔｉｒｒｏｃｈｉ，Ｇ．、Ｄｕｅｎａｓ，Ｍ．、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ ｄｅ Ｃｏｓｓｉｏ．Ｍ．Ｅ．、Ｆｕｅｎｔｅｓ，Ｐ．、Ｐｅｒｅｚ，Ｍ．、Ｍａｉｎｅｔ，Ｄ．、Ａｙａｌａ，Ｍ．、Ｇａｖｉｌｏｎｄｏ，Ｊ．Ｖ．及びＤｕａｒｔｅ，Ｃ．１９９３．Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌ Ａｐｌｉｃ．１０：２４〜３０）。１０日後、マウスにＭＧ２３２７調製物又はＰＢＳを腹腔内注射した。１ｍｇ／ｋｇで治療した動物の６０％は生存したものの、対照では治療開始から４５日後に２５％しか生存しなかった（図８）。総腫瘍退縮は、治療した生存マウスで観察され、健康な状態を示し、対照では腫瘍が進行して大きな固形塊を形成し、マウスは全身状態の悪化を示した。
【００１１】
ＭＧ２３２７調製物の１ｍｇ／ｋｇ体重の単回投与で治療した骨髄起源の腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃマウスは、全体的な退縮を示して生存した。この同じ投与により、Ｅ６／Ｅ７形質転換線維芽細胞起源の腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃマウスで腫瘍量のかなりの減少を示して生存率が高まる。ＭＧ２３２７は、骨髄性腫瘍の移植組織からＢＡＬＢ／ｃマウスを保護する。
【００１２】
ＭＧ２３２７調製物は、抗増殖性分子を産生するための培養条件の最適化の結果として得られた。ＭＧ２３２７調製物は、抗増殖性分子を産生するための培養条件の最適化の結果として得られ、その分子は、正常細胞及び腫瘍細胞内の増殖抑制性で、アポトーシス性抗血管新生分子の産生の誘導物質としての移植組織及び悪性腫瘍の生成に対する１つの保護剤を構成し、癌、さらにはこの事象に関連する他の疾患の予防（ｐｒｏｆｉｌａｘｉｓ）及び治療で有利に用いることができる。ＣＭＩＢ４２０２株は４５〜５０及び２０〜３０ｋＤａの範囲の可溶タンパク質を過剰発現する（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによると５０及び２５ｋＤａ、０．９８４の１測定係数）。ｐ２５と命名された２５ｋＤａ分画は、ＥＤＴＡとともにインキュベートしたＨＥｐ−２細胞系で実施された実験で、用量依存性の（ｄｏｓｉｓ−ｄｅｐｅｎｄｉｅｎｔｅ）強力な増殖抑制活性を示したが、ｐ５０と命名された５０ｋＤａ分画は増殖を抑制しなかった。しかし、ｐ５０分画を５μＭのＺｎ２ＳＯ４とともにインキュベートすると、増殖抑制活性が示されたが、それはｐ２５分画よりも弱かった。ｐ２５及びｐ５０分画のＩＣ５０値は、それぞれ０．４８ｎＭ及び１６ｎＭであった。
【００１３】
増殖抑制効果を有するタンパク質生体分子（ポリペプチド及びプロジギオシン）の単離は、本発明では一段階のみのクロマトグラフィー、即ち不連続勾配のＮａＣｌを用いるイオン交換によって実施した。それは、５０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ８．００で平衡化した１つのＤＥＡＥ又はＱＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓａ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ ｍａｔｒｉｚを用いた。溶出は、不連続勾配のＮａＣｌ：５０ｍＭリン酸緩衝液−０．１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．００；５０ｍＭリン酸緩衝液−０．２Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．００；５０ｍＭ−２Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．００で実施し、最後に、マトリックスに吸着した色素分画を無水エタノールから７０％エタノールを用いて溶出した。この結果は、２５ｋＤａのタンパク成分調製物は、同じ調製物の５０ｋＤａのタンパク成分よりも細胞腫瘍の増殖を抑制する能力が高く、両者は独立した形態のｉｎ ｖｉｔｒｏ生物活性を示すことを確証する。
【００１４】
２５ｋＤａの断片を含めて、いくつかの大きさの分子の断片は、ｐ５０の分解を引き起こした。ｐ５０の分解の増加は高温で得られ、ｐ２５の生成はこの温度上昇に比例していたが、それはｐ５０を減少させた。ヒツジで得られた抗ｐ５０ポリクローナル抗体はウェスタンブロットアッセイでｐ２５を認識したので、ｐ２５はｐ５０タンパク質の分解生成物に由来する。分解生成物は分解生成物の増殖抑制作用と比例して増加した。この結果はｐ５０分解（ａｕｔｏｌｉｓｉｓ）が、元の分子ｐ５０よりも強い増殖抑制作用を有する分解断片を産生することが可能であることを確証する。さらに、ｐ２５タンパク質は、骨髄源の悪性腫瘍の総退縮も誘導する。ｐ５０の断片は、抗体断片の既に公知の方法によって遺伝的にコンジュゲートして、増殖性病因の疾患の治療に役立つ免疫毒素を生成することができる。また、この断片は単独で又は他のタンパク分子と組み合わせて、細胞内部からの担体として、又は特異的受容体として（inner of celulas orspecififc receptors）使用されよう。ｐ５０の断片は、特異標的からの指向性制御を保つように調節された放出系の外部媒体にそれ自体を露出させることもできる。
【００１５】
ｐ５０のタンパク分解活性は７ｍＭのＥＤＴＡで抑制され、ｐ５０は質量分析計でセラリシンファミリーに属すると同定された金属プロテアーゼであることが証明された。
【００１６】
主な類似性は、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔタンパク質データベースの識別子ＰＲＺＮ＿ＳＥＲＳＰ及びＰＲＺＮ＿ＳＥＲＭＡの種で発見された。クロマトグラフィーによって精製されたｐ２５タンパク質は酵素活性を示さず、このことはセラリシンＣ末端領域の非触媒性と一致する。
【００１７】
タンパク成分及びプロジギオシンは同じ１つの組成物中に製剤化され、それはその製剤の独立した形態と比較して抑制効果を有意に（ｐ＜０．００５）増加させた。この組成物は、独立した形態の成分を評価するために用いたタンパク質及びプロジギオシンと同じ関係を維持して得られた。そのような組成物では、プロジギオシンは０．１〜１００ｎＭの濃度で見られ、セラリシン断片は０．１〜１５０μｇ／ｍＬの範囲で見られる。
【００１８】
セラリシン由来のポリペプチド断片を含み、セラリシンの完全な分子と比較して増加した増殖抑制効果を有する組成物、並びにその組成物の選択的に強力な生物活性を有するセラリシン−プロジギオシン断片の組合せの獲得。
【００１９】
さらに、これらのポリペプチドの断片は、癌細胞に対してアポトーシス効果を有する。このアポトーシス効果は、ミトコンドリア、微小管及びＤＮＡ断片化、プログラム細胞死シグナル増幅、この組成物の用量減量を伴った。この事象は、ポリペプチド及びプロジギオシンの結合組成物でも観察された。
【００２０】
ＭＧ２３２７及び増殖抑制ポリペプチド断片の抗血管新生効果は、マトリゲル内の管状構造物形成の方法により評価した。ＭＧ２３２７及びそれらの分画ｐ２５及びｐ５０の非細胞傷害性濃度をヒト微小血管系内皮細胞（ＨＭＥＣ）とインキュベートした。最終結果は形成した管状構造物の長さ、及びそれらの間の内部結合（ｉｎｔｅｒｃｏｎｅｘｉｏｎ）数を考慮して評価する。このために、Ｐｒｏ Ｅｘｐｒｅｓｓ ４．５ Ｉｍａｇｅプログラムを用いた。結果は、ＭＧ２３２７組成物による治療は、タンパク質及びそれらの抗増殖性ポリペプチドによる治療は内皮細胞の分化又は成熟を有意に（ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡ）抑制し、このようにポリペプチドとして単離されたＭＧ２３２７は抗血管新生活性を有することを説明する。
【００２１】
アポトーシス性の、抗血管新生活性及び選択性は、癌に対するその可能性のある治療薬及び保護剤として、本発明の目的組成物の最も重要な特性の１つである。
【００２２】
断片セラリシンとプロジギオシンファミリーとの組合せは、ｃａｎｃｅｒｉｇｅｎとして最も強力で選択的な形態であることが示された。これらのポリペプチドは、癌又は内皮細胞及び形質転換細胞の増殖に関係する他の疾患の予防（ｐｒｏｆｉｌａｘｉｓ）及び治療のための、組換え毒素及び免疫毒素の獲得のために用いることができる。
【００２３】
これらのポリペプチド及びそれらのプロジギオシンとの可能な組合せは、ヒト又は動物で癌及び他の増殖性病理に対して使用するための、非常に選択的で１つの十分な作用スペクトルを有するｖａｃｕｎａｌｅｓ ｐｒｅｐａｒａｄｏｓ、治療薬又は診断薬を獲得するために、医薬産業で直ちに応用される。
【００２４】
（図面の簡単な説明）
［図１］Ｓ．マルセッセンスと腫瘍細胞ＣＢ Ｈｅｐ．１との相互作用は、高い抗増殖性能力及び修飾されたタンパク質発現を有する細菌系統を生成する。Ａ−細胞生存。７２時間後に、細胞生存をＭＴＴ法によって推定した。系統ＣＭＩＢ４２０２は、ヒト腫瘍細胞ＨＥｐ−２に対して強い抗増殖性効果を示したが、ＳＭ１９９５系統の効果は非常に弱かった。これらの結果は、１試料４反復を用いた３つの独立した実験の平均であった。Ｂ−ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動（銀染色）。ＣＭＩＢ４２０２は、２５ｋＤａ近辺を移動する可溶タンパク質を過剰発現した。
［図２］細胞系ＨＥｐ−２に対する２５及び５０ｋＤａ分画の増殖抑制作用を示す図である。細胞生存能力はＭＴＴ法で測定して、対照細胞と比較した率で表した。分画はＳＤＳゲル（亜鉛−イミダゾール染色）から回収して再生した。２５ｋＤａ近くの分画は強い増殖抑制作用（ＩＣ５０値０．３５ｎＭ／ｍＬ）を示したが、ｐ５０は増殖を抑制することができなかった。Ｚｎ４ＳＯ２の５μＭをｐ５０に加えたとき、増殖抑制作用の増加が観察された（ＩＣ５０値４５ｎＭ／ｍＬ）が、ｐ２５のそれよりは劣っていた。５つの独立した実験の平均値から曲線を作成して、対応する標準偏差（ＳＤ）とともにグラフ表示する。
［図３］系統ＣＢＭＩ４２０２によるタンパク質及びプロジギオシンの発現の動態を示す図である。培地へのプロジギオシンの発現は、増殖期から安定期までの移行期間の間に起こり、そこではＣＢＭＩ４２０２はその高い複製時間に達する。Ａ−細胞複製時間の動態。Ｂ−プロジギオシン発現の効率（生成物／バイオマス）。Ｃ−ＭＴＴ法で測定されたＨｅｐ−２細胞に対する増殖抑制効果の動態。Ｄ−光学密度及びタンパク質生合成で測定された細胞増殖の動態。
［図４］ＭＧ２３２７による治療に対する腫瘍細胞及び正常ヒト細胞の感受性を示す図である。正常細胞は低い感受性を有し、造血起源のそれらの感受性は分析した残りの細胞系よりも低い。一方、成長を活性化した細胞（ＨＵＶＥＣ ｂＦＧＦ）及び腫瘍悪性病変由来の細胞は、より感受性である。
［図５］ＭＧ２３２７調製物で治療され、又は治療されなく、ＣＢＨｅｐ１腫瘍を投与された後のＢＡＬＢ／ｃマウス生存の分析を示す図である。Ａ−１ｍｇ／ｋｇの用量は治療された動物の６０％で腫瘍退縮を誘導し、未処置動物の１００％がｄａｙ６０までに死亡した。Ｂ−腫瘍細胞接種の４５日後に、無処置動物は充実性腫瘍及び腹水が存在して極めて虚弱な状態を示したが、１ｍｇ／ｋｇで治療されたものは腫瘍の所見を示さず、３００日を超えて生存した。
［図６］腫瘍モデル３Ｔ３１６に及ぼすＭＧ２３２７の抗腫瘍効果を示す図である。Ａ−各群の日別平均を示すグラフは、治療動物及び無処置動物の腫瘍量の間の統計学的に有意な差（ｐ＜０．００３）を示す。その時間を通しての腫瘍増殖の分析は、ＭＧ２３２７治療群で有意な変動（ｐ＝０．１０９）を示さなかったが、陰性対照群はこのパラメータの有意な増加（ｐ＝０．０４）を示した。Ｂ−治療動物及び無処置動物の生存。
［図７］ＭＧ２３２７からのタンパク質有効成分の単離を示す図である。（Ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの電気泳動（１２．５％）。クマシー染色の結果。レーン１は０．２Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．００による溶出に対応する試料を示し、５０ｋＤａに対応するタンパク質バンドを認める。レーン２は、２５ｋＤａのタンパク質バンドを示す。染色は、クマシー法によって実施した。（Ｂ）ヒト腫瘍細胞上のｐ５０及びｐ２５タンパク質のＨＥｐ−２に対する増殖抑制効果。総タンパク質濃度で表したｐ２５、ｐ５０及びＭＧ２３２７に対する用量反応関係。
［図８］ＭＧ２３２７から単離された有効成分のＨＥｐ−２細胞に及ぼす増殖抑制効果を示す図である。ＭＧ２３２７に封入された５０及び２５ｋＤａのタンパク質は、増殖抑制活性を示した。これらのタンパク質とプロジギオシンとの組合せは、対照と比較して腫瘍細胞の５０％の増殖を抑制することができる用量（ＩＣ５０値）を低下させた。
［図９］ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット法。（Ａ）ＭＧ２３２７から得られたタンパク質のパターン。試料は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（１２％）によって分析して銀染色した。（Ｂ）約５０及び２５ｋＤａのタンパク質バンド（矢印）を亜鉛イミダゾールで染色した類似のゲルから切断し、再生して新しいＳＤＳ−ＰＡＧＥに流した。これをニトロセルロース膜へ移して、ウェスタンブロットを抗ｐ５０抗体で展開した。ヤギで得られたポリクローナル抗体は、ｐ２５及びｐ５０の分解物を認識したが、関連しないタンパク質バンド（Ｎｅｇ Ｃ）を認識しない。
［図１０］ｐ５０自己消化を示す図である。Ａ−ＳＤＳページ電気泳動：１−２４℃、２−３７℃、３−４５℃、４−６０℃、５−４℃。Ｂ−ｐ５０及びｐ２５の濃度測定分析は、インキュベーション温度の上昇に伴いｐ５０バンドの強度は低下し、ｐ２５バンドの強度は増加することを示した。
［図１１］ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓａ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗクロマトグラフィーで精製したｐ５０を示す図である。ｐ５０（０．２ＭのＮａＣｌで溶出）は、親分子より高い増殖抑制作用を有する分解物を生成した。
［図１２］異なるクロマトグラフィーから得られたｐ２５及びｐ５０の酵素活性を示す図である。Ａ−ｐ２５は活性を示さないがｐ５０は酵素活性を示した。Ｂ−ｐ５０の酵素活性は、７ｍＭのＥＤＴＡで完全に抑制された。
［図１３］ＭＧ２３２７は、腫瘍細胞Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８の時間依存性ＤＮＡ断片化を誘導した。インキュベーションの６時間後からオリゴヌクレオソーム断片が観察され、それらは経時的に増加し、２４時間後に１８０〜２００塩基対のオリゴヌクレオソーム断片で典型的なアポトーシスのパターンに到達する。
［図１５］マトリゲル内の内皮細胞の分化に及ぼすＭＧ２３２７、ｐ２５及びｐ５０（クロマトグラフィーによって精製される）及びそれらの分画の影響を示す図である。ＨＭＥＣ細胞を、活性化条件（１０ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、１μｇ／ｍＬのヒドロコルチゾン）で、ＭＧ２３２７（Ａ）、ｐ５０（Ｂ）及びｐ２５（Ｃ）の類似した濃度の存在下で、治療なし（Ｅ）及び活性化なし（Ｄ）で培養した。グラフ（Ｆ）では、３つの独立した実験の結果が集められ、それはマトリゲル内の管状ネットの形成に及ぼすＭＧ２３２７及びその成分の抑制作用を示す。ＭＧ２３２７及びｐ５０は、誘導された活性化を完全に非活性化細胞のレベルに戻す（ＡＮＯＶＡ ＭＧ２３２７、ｐ５０及びＣＮ ｐ＞０．０５）。ｐ２５で治療した細胞は、ＭＧ２３２７及びｐ５０で観察されたものより劣った（対応のないｔ、それぞれｐ＝０．０１０７及びｐ＝０．０４９８）ネット形成指数を示した。
［図１６］ＭＧ２３２７で免疫化されたか又はされていない、また、Ｘ６３骨髄腫細胞を投与されたＢＡＬＢ／ｃの生存を示す図である。１ｍｇ／ｋｇのＭＧ２３２７の３及び６の用量を用いて免疫化された動物の１００％は、骨髄性腫瘍を拒絶する。
【実施例】
【００２５】
（実施例１）
系統ＣＭＩＢ４２０２の獲得
抗腫瘍分子の細菌系統産生者を得るために、ＢＡＬＢ／ｃマウスの前方表面から単離した野生型セラチアマルセッセンスＳＭ１９９５を腫瘍細胞ＣＢＨＥｐ．１と混合し（Ａｌｅｍａｎ，Ｍ．Ｒ．、Ｖａｌｄｅｓ，Ｒ．、Ｐｅｒｅｚ，Ｍ．、Ｉｂａｒｒａ，Ｎ．、Ｒｅｙｅｓ，Ｂ．、Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｍ．、Ｍｅｎｄｏｚａ，Ｏ．、Ｐａｄｉｌｌａ，Ｓ．、Ａｇｒａｚ，Ａ．及びＲｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｍ．Ｐ．２０００．Ｂｉｏｐｈａｒｍ １３：４８〜５２）、１０日前に重流動ワセリン（heavy liquid petrolate）を事前接種したＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内接種をした。細胞混合物の接種の８日後に、腹水抽出を２日ごとに実施した。腫瘍増殖の動態を分析して、腫瘍退縮を示す各動物の腹水に微生物管理を実施した。
【００２６】
単離した細菌は異なる培地及び培養条件で増殖させた。培養液上清は０．２２μｍのメンブランフィルターを用いて濾過滅菌し、それらの毒性はＣＢＨＥｐ．１細胞で評価した。強い細胞傷害性の系統が、アクセッション番号ＣＭＩＢ４２０２でＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ ｗｉｔｈ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｈａｂａｎａ市、Ｃｕｂａに寄託された。ＣＭＩＢ４２０２及びその親系統ＳＭ１９９５を５Ｌ発酵槽内の２８℃のペプトン−グリセリン培地で、並行して培養した。ＣＭＩＢ４２０２の滅菌濾液は用量依存性の活性を示すが、ＳＭ１９９５からのものはＭＴＴ法を用いた増殖抑制アッセイにおいてヒト癌細胞系Ｈｅｐ−２に対してわずかな活性を有する（図１Ａ）（Ｓｋｅｈａｎ，Ｐ．、Ｓｔｏｒｅｎｇ，Ｒ．、Ｓｃｕｄｉｅｒｏ，Ｄ．、Ｍｏｎｋｓ，Ａ．、Ｍｃｍａｈｏｎ，Ｊ．、Ｖｉｓｔｉｃａ，Ｄ．、Ｗａｒｒｅｎ，Ｊ．Ｔ．、Ｂｏｋｅｓｃｈ，Ｈ．、Ｋｅｎｎｅｙ，Ｓ．及びＢｏｙｄ，Ｍ．Ｒ．１９９０．Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｉｎｓｔ．８２：１１０７）。
【００２７】
ＣＭＩＢ４２０２株は４５〜５０及び２０〜３０ｋＤａの範囲の可溶タンパク質を過剰発現した（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによると５０及び２５ｋＤａ、０．９８４の測定係数）、図１Ｂ。
【００２８】
亜鉛イミダゾールで染色したＳＤＳゲルで示されたバンドから回収されたｐ２５分画（Ｈａｒｄｙ，Ｅ．、Ｓａｎｔａｎａ，Ｈ．、Ｓｏｓａ，Ａ．、Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｌ．、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｐａｄｒｏｎ，Ｃ．及びＣａｓｔｅｌｌａｎｏｓ−Ｓｅｒｒａ，Ｌ．１９９６．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２４０：１５０）は、Ｈｅｐ−２で強い抗増殖性用量依存性活性を示したが、ｐ５０分画は細胞増殖を抑制しない。しかし、ｐ５０を５μＭのＺｎ２ＳＯ４とインキュベートしたときは増殖抑制作用を示した。但し、ｐ２５で観察されたものよりも低かった（図２）。ｐ２５及びｐ５０分画のＩＣ５０値は、それぞれ０．４８ｎＭ及び１６ｎＭであった。
【００２９】
タンパク質を発現する両株の能力を比較する目的で、多元ＡＮＯＶＡを適用した。相互作用の見込まれる値は、有意ではなかった（ｐ＝０．９３）。
他方、両者の見込まれる主要な効果は、両者のタンパク質が量の点で顕著な相違を発現すること（ｐ＝０．０１）、並びにその量が、貯蔵に依存することを示す（ｐ＝０．０００４）。
さらに、両者の保存状態間で、これらのたんぱく質の発現について顕著な相違が存在する。
［Furthermore, the probability of both principal effects Por otro lado, la probabilidad de ambos efectos principales mostro que ambas proteinas son expresadas en cantidades significativamente diferentes (P = 0.01) y que la cantidad es fuertemente dependiente de la cepa (P = 0.0004). Ademas, existieron diferencias extremadamente significativas de la expresion de estas proteinas entre ambas cepas (P<0.001).］
【００３０】
（実施例２）
ＭＧ２３２７増殖抑制調製物の獲得
得られたＣＭＩＢ４２０２のＳ．マルセッセンス系統の一部の増殖抑制調製物のために、１Ｌの微生物培養物及び関心の分子を産生するための最適な培地を産生した（図３）。ＣＭＩＢ４２０２培養物は、４℃、１２０００ｇで３０分間遠心分離した。Ｓｏｂｒｅｎａｔａｎを収集し、その後無菌条件下で分子ｔａｍｉｚａｊｅにより０．２μから濾過した。ｓｏｂｒｅｎａｄａｎｔｅの量は、同じ無菌条件で１０倍に減らした。上清の量を１０ｋＤａ排除限度の膜を用いて１０倍に減らし、生理的条件で２４時間の間、４℃でＰＢＳに対して透析した。透析した材料を無菌条件下で濾過し、５ｍＬのバイアルに分け、パイロジェンフリーのクリスタルバイアルに入れた。この調製物を４℃で保存し、ＭＧ２３２７と命名した。
【００３１】
５Ｌの培養器に移し、スクリーニングで既に確立された条件（ペプトン−グリセロール培地中、２８℃で１４時間、通気量１ｖｖｍ、２５０ｒｐｍ、初期吸光度０．１）にかけた。培地は生理的ｐＨに調節し、培養は自由なｐＨにした。残りのｐａｓｅを同様に実施し、スクリーニングした。
【００３２】
（実施例３）
「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」におけるＭＧ２３２７調製物の増殖抑制作用の特性評価
「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」におけるＭＧ２３２７の増殖抑制作用の特性評価のために、一群のヒト細胞系を評価した（表１）。ＰＢＭＣ（２００００）を除く合計２０００細胞を９６穴培養ウェルに接種し、ＭＧ２３２７の異なる濃度を加えた。７２時間後に、生存細胞数をＭＴＴの添加により推定した（Ｓｋｅｈａｎ，Ｐ．、Ｓｔｏｒｅｎｇ，Ｒ．、Ｓｃｕｄｉｅｒｏ，Ｄ．、Ｍｏｎｋｓ，Ａ．、Ｍｃｍａｈｏｎ，Ｊ．、Ｖｉｓｔｉｃａ，Ｄ．、Ｗａｒｒｅｎ，Ｊ．Ｔ．、Ｂｏｋｅｓｃｈ，Ｈ．、Ｋｅｎｎｅｙ，Ｓ．及びＢＯＹＤ，Ｍ．Ｒ．１９９０．Ｊ．Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８２：１１０７）。可溶性ホルマザン生成物が、マルチスキャンプレートリーダーにおいて５４０ｎｍで検出された。ＭＧ２３２７は、分析したヒト細胞系に対して広範囲の細胞傷害活性を示した。ＩＣ５０値は、μｇ／ｍＬの範囲にあった。
【００３３】
表１．「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」試験で用いた細胞及び培地
【表１】
【００３４】
ＭＧ２３２７選択性を、ＨＴ１０８０細胞系（線維肉腫から）及び一次線維芽細胞を用いて、市販薬剤ドキソルビシン（ＤＸＲ）と比較した。用いた抗増殖性アッセイは、上で記載した。ＤＸＲ及びＭＧ２３２７調製物の連続希釈を１０μｇ／ｍＬから適用して、５点曲線を作成した。死亡比率は、ＨＴ１０８０の死亡率パーセント及び一次線維芽細胞の死亡率パーセントの間の関係として、各点で計算した。試験した低い方の濃度でより大きな差が検出された（ＭＧ２３２７ ９：１、ＤＸＲ １．７：１）。ＭＧ２３２７は、２μｇ／ｍＬ未満の濃度で非常に選択的であった。
【００３５】
喉頭癌起源のＨＥｐ−２細胞は、分析した他の細胞系と比較して臨床で用いた抗腫瘍薬に非常に抵抗性である。このために、我々は、ＭＧ２３２７調製物の影響の「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」試験のためのモデルとしてそれを用いた。公知の抗腫瘍薬で治療したＨＥｐ−２細胞で作成した細胞傷害性曲線の比較は、ＭＧ２３２７調製物、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、ドキソルビシン（ＤＸＲ）、ビンクリスチン（ＶＣ）、ビンブラスチン（ＶＢ）及びタキソール（ＴＸ）の３μｇ／ｍＬで増殖の類似した結果（４０％）を示した、（ｐ＞０．０５、ＡＮＯＶＡによる検定）。同じ条件で、Ａｒａ Ｃ、メトトレキサート（ＭＴＣ）、ブレオマイシン（Ｂｌｅｏ）及びシクロホスファミド（ＣＰＡ）などの他の抗腫瘍薬は、効果を示さなかった。ＣＤＤＰは喉頭癌の治療のためにＦＤＡによって認可された抗腫瘍薬の１つであり、ＭＧ２３２７調製物及びＣＤＤＰの生存曲線の分析は、ＩＣ１０、ＩＣ５０及びＩＣ９０で類似した値を示した。
【００３６】
様々な発癌性又は非発癌性細胞系（図４）の感受性試験は、正常な細胞系統はわずかに感受性であるが、黒色腫、喉頭癌、線維肉腫、肝癌及び頸部−子宮癌（ヒト乳頭腫ウイルスの担体）のそれは非常に感受性である。造血起源の癌腫の感受性はより低い。活性化されなかった増殖する細胞のＨＵＶＥＣ活性は、ＭＧ２３２７調製物に対して最も感受性である。
【００３７】
以前の結果は、調製物ＭＧ２３２７は悪性細胞系に対して十分な細胞傷害作用スペクトルを有し、腫瘍／形質転換され活性化された細胞の増殖に対して選択的効果を有することを示している。
【００３８】
（実施例４）
ＭＧ２３２７調製物の抗腫瘍活性
ＭＧ２３２７調製物の抗腫瘍活性を示すために、我々はマウス腹水腫瘍を生成することができる骨髄起源のＣＢ Ｈｅｐ−１腫瘍細胞を腹腔内（ｉ．ｐ．）に移植された、ＢＡＬＢ／ｃマウスを使用した（Ｆｏｎｔｉｒｒｏｃｈｉ，Ｇ．、Ｄｕｅｎａｓ，Ｍ．、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ ｄｅ Ｃｏｓｓｉｏ，Ｍ．Ｅ．、Ｆｕｅｎｔｅｓ，Ｐ．、Ｐｅｒｅｚ，Ｍ．、Ｍａｉｎｅｔ，Ｄ．、Ａｙａｌａ，Ｍ．、Ｇａｖｉｌｏｎｄｏ，Ｊ．Ｖ．及びＤｕａｒｔｅ，Ｃ．１９９３．Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌ Ａｐｌｉｃ．１０：２４〜３０）。１０日後、マウスはＭＧ２３２７又はＰＢＳで腹腔内注射した。１ｍｇ／ｋｇ体重で治療した動物の６０パーセントは生存したが、対照のわずか２５パーセントが最初の治療から４５日まで生存した（図５）。総腫瘍退縮は健康な状態を示したすべての治療された生存動物で観察されたが、対照では腫瘍が進行して大きな固形塊を形成して、動物は不健康な全身状態を示した。
【００３９】
Ｅ６／Ｅ７で形質転換した線維芽細胞の腫瘍を抱えるＢＡＬＢ／ｃマウスはＭＧ２３２７調製物で治療した後に生存期間を延ばし、腫瘍量の有意な減少を示した。
【００４０】
また、ＭＧ２３２の抗腫瘍活性を評価するために、Ｈｅｒｎａｎｄｅｚら（Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｐ．、Ｍｅｒｉｎａ，Ｎ．、Ｌｏｐｅｚ−Ｏｃｅｊｏ，Ｏ．及びＡｒａｎａ，Ｍ．Ｊ．２０００．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．２７０：１１９〜１２４）によって開発されたヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ１６）に関連する癌のモデルを用いた。２群のＢＡＬＢ／ｃマウスに対して、２×１０６の３Ｔ３１６細胞を左前方のゾーンの皮下（ｓ．ｃ．）に接種した。４８時間後、対照群の一次細胞接種近くに、ＭＧ２３２７又はＰＢＳの０．７５ｍｇ／ｋｇ体重の用量を皮下に投与し、ノギスで毎日測定した。腫瘍量は標準式Ｖ＝０．５２×ａ２×ｂを用いて計算し、ａは腫瘍の横周辺部の幅であり、ｂは長さである（Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｐ．、Ｍｅｒｉｎａ，Ｎ．、Ｌｏｐｅｚ−Ｏｃｅｊｏ，Ｏ．及びＡｒａｎａ，Ｍ．Ｊ．２０００．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．２７０：１１９〜１２４）。動態を図６に示す。
【００４１】
腫瘍発達の時間の差は、治療動物及び無処置動物の間で統計学的に有意であった（ｐ＝０．００５４）。ＡＮＯＶＡ検定による時間：治療の関係の研究は、治療群及び非治療群の間では同程度の差が維持されないことを示した。このことは、動物に適用された治療に関連した差の存在を示した。
【００４２】
ウィルコクソン検定をペアードデータのために各群のｄａｙ２１及びｄａｙ４５の間の測定値に適用したとき、我々は対照群で有意な腫瘍量の増加（ｐ＝０．０４３）を検出したが、治療群ではそうではなかった（図６Ａ）。各評価時点における群間の有意差の存在を分析するために、我々は第１の点を例外に有意差を検出したＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定を適用した（ｐ＜０．０１）。また、我々は腫瘍の増殖速度に重要な差を検出した。増殖曲線を１つの線に調節して、勾配を適合度によって生成された方程式から計算した。勾配の比較は、対照群の腫瘍は、治療群で観察されたものより有意に速い速度で成長したことを示した（ｐ＝０．００８８）。
【００４３】
対照群のマウスは腫瘍移植のためにｄａｙ４５及びｄａｙ６４の間に死亡したが、治療群の動物はｄａｙ５２から死に始め、２０％の生存率が期間内（１７０日）に維持された（図６Ｂ）。
【００４４】
生存データをベイジアン階層モデルに調節することで（５００反復のワイブル回帰）、我々は統計学的に有意の差（ｐ＝０．０２４４７）を得たが、それは平均生存期間の信頼区間が完全に排他的であることが示されたときに確認された。
【００４５】
（実施例５）
ＭＧ２３２７調製物の分画、非タンパク質生体分子から単離
ＭＧ２３２７調製物の組成を決定するために、分子分画を実施してｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞Ｈｅｐ−２ヒト腫瘍細胞系の細胞増殖を抑制するそれらの能力を評価した。
【００４６】
多糖分画（ｔｒ＝６．８５分）をＡｍｉｎｅｘ前ゲルＨＰＸ８７−Ｎクロマトグラフィー（寸法：３００×７．８ｍｍ、流速：０．５ｍｌ／分）で分離した。フルクトースｔｒ＝１３．１５分、グルコースｔｒ＝１２．１２分、二糖ｔｒ＝９．４０分、三糖ｔｒ＝８．２４分、多糖ｔｒ＝７．０１分のパターンを利用した。色素分画を２０ｍＭリン酸（ｐＨ７）で平衡化したＭＥＲＣＫのＴＳＫ−ｂｕｔｉｌｏカラムで分離し、次いで、マトリックスに保持されたものを無水エタノールで溶出した。得られた生成物の吸収スペクトル（エタノール１００％、ｐＨ５．００）は、最大４７０及び４９０ｎｍでバンドを、また５３７ｎｍで最大ピークを示し、これらはそれぞれ報告されている増殖抑制活性を有する単量体及び二量体で記載されている特性と一致する（Ｐｅｒｅｚ−Ｔｏｍａｓ，Ｒ．及びＭｏｎｔａｎｅｒ，Ｂ．２００３ Ｈｉｓｔｏｌ．Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．１８：３７９〜３８５；Ｍｏｎｔａｎｅｒ，Ｂ．及びＰｅｒｅｚ Ｔｈｏｍａｓ，Ｒ．２００３．Ｃｕｒｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ．３：５７〜６５）。単離された多糖は抑制効果を示さなかったが、プロジギオシンに対応するその分画は、用量依存的増殖抑制活性を示した。
【００４７】
（実施例６）
ＭＧ２３２７調製物の分画。増殖抑制効果を有するタンパク質生体分子から、わずか１つのクロマトグラフィー段階、即ちＮａＣｌ不連続勾配を用いるイオン交換だけで単離した
組成物ＭＧ２３２７調製物を、５０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ８．００、で平衡化したＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ ｍａｔｒｉｚに加えた。溶出は、ＮａＣｌ不連続勾配で実施した：５０ｍＭリン酸緩衝液−０．１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．００、５０ｍＭリン酸緩衝液−０．２Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．００、５０ｍＭ−２Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．００、及び、最後にマトリックスに吸収された色素分画を７０％無水エタノールで溶出した。
【００４８】
０．２ＭＮａＣｌ（ｐＨ８．０）に対応する分画と、結合せずに通過したこの分画からの最初の溶出液は、既述の試験で用量依存的増殖抑制活性を示した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動は、５０ｋＤａの高さでタンパク質バンドを、２５ｋＤａの高さで最大バンド（純度＞９０％）をそれぞれ観察した（図７Ａ）。分子量は、市販パターンの分子量をバンドの移動距離と関連づける関数により計算した、ｒ２＝０．９８４。
【００４９】
図７Ｂは、ＭＧ２３２７調製物と比較してのｐ５０及びｐ２５の増殖抑制効果を示す。ｐ５０及びｐ２５は、ＨＥｐ−２に対して増殖抑制効果を示した。
【００５０】
表２は、統計的分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用してｐ５０、ｐ２５及びＭＧ２３２７調製物の間で比較した結果を示す。それは、使用した各用量に対する応答の比較を行った。３つの分析試料の活性の間に、有意差が存在することが観察される。これらの差は使用した用量に依存する。調製物の成分の高濃度（９及び１８μｇ／ｍＬ）では、２５及び５０ｋＤａの分画の間に有意差が存在し、２５ｋＤａ分画の活性が最も高かったが、低い方の濃度（２．２５及び４．５μｇ／ｍＬ）ではこのようではなかった。
【００５１】
表２．統計的分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用してタンパク成分及びＭＧ２３２７調製物の間で比較した結果
【表２】
【００５２】
５０ｋＤａのタンパク成分及びＭＧ２３２７調製物の間には、調製物が最も活性であり腫瘍細胞の１００％の成長抑制を達成した１８μｇ／ｍＬの用量に有意差が存在し、５０ｋＤａのタンパク成分は成長の約８０％の抑制を達成した。２．２５、４〜５及び９μｇ／ｍＬの用量では、５０ｋＤａ分画及びＭＧ２３２７調製物に対して引き起こされた応答の間に、有意差は存在しなかった。
【００５３】
しかし、２５ｋＤａのタンパク質成分の活性はＭＧ２３２７調製物とは２．５、４．５及び９μｇ／ｍＬの用量で有意に異なり、２５ｋＤａのタンパク質成分は大きな生物活性を示し、１８μｇ／ｍＬの用量では両方とも同じ１００％の腫瘍細胞抑制を達成したので有意差は存在しなかった。
【００５４】
これらの結果は、２５ｋＤａのタンパク質成分は腫瘍細胞の成長を抑制する大きな能力を有し、５０ｋＤａのタンパク質成分及び両成分が独立してｉｎ ｖｉｔｒｏで生物活性を示した。
【００５５】
精製のこれらのもの（ｅｓｑｕｅｌｕ）では３種のものが得られ、同様の結果であった。
【００５６】
（実施例７）
セラリシンポリペプチドとプロジギオシンとの組成物
タンパク成分及びプロジギオシンを同じ１つの組成で製剤化し、それはその独立した形態との比較で抑制効果を有意に（ｐ＜０．００５）増加させた。図８で、ＭＧ２３２７調製物から単離された増殖抑制性生体分子及びその組成物のＩＣ５０を図示する。ＭＧ２３２７調製物は総タンパクと称され、組成物は、独立形態の成分を評価するときに用いたのと同じタンパク質とプロジギオシンとの関係を固く維持すると認められた。そのような組成物では、プロジギオシンの０．１〜１００ｎＭの１濃度に対して０．１〜１５０μｇ／ｍＬのセラリシン断片を合わせることができる。
【００５７】
（実施例８）
ｐ５０とｐ２５
ヒツジで得られた抗ｐ５０は、ｐ２５及びｐ５０の関係を知るため利用した。ＭＧ２３２７は、イミダゾール−亜鉛染色した１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに加えた（Ｈａｒｄｙ，Ｅ．，Ｓａｎｔａｎａ，Ｈ．，Ｓｏｓａ，Ａ．，Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｌ．，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｐａｄｒｏｎ，Ｃ．及びＣａｓｔｅｌｌａｎｏｓ−Ｓｅｒｒａ，Ｌ．１９９６．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２４０：１５０〜１５２）。約５０及び２５ｋＤａのタンパク質バンド（図９）を切断し、ゲル内で再生して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに加えた。これらをニトロセルロース膜に移し、ウェスタンブロットを実施した。ｐ５０の分解によりｐ２５と認められた抗ｐ５０ポリクローナル抗体の分子サイズを予備染色した分子量マーカー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で推定した。ここで示したウェスタンブロットは、３つの同等実験を代表する。
【００５８】
（実施例９）
得られたｐ５０を温度により分解した結果、ｐ５０自体が最も活性である
実施例６で得られたｐ５０を異なる温度でインキュベートし、その増殖抑制活性は前記ＭＴＴ法を用いてＨＥｐ−２で試験した。各条件（４、３７、４５及び６０℃）で生成した分解パターンは、デンシトメータで測定した。
【００５９】
分解生成物の断片の生成は温度上昇に正比例し、したがってｐ５０の量が減少したときにｐ５０の分解生成物としてのｐ２５は増加した（図１０）。ｐ５０の分解生成物は、元のｐ５０より大きな増殖抑制活性を示した（図１１）。
【００６０】
（実施例１０）
ｐ２５は、悪性腫瘍の退縮を誘導する
実施例６で記載されたクロマトグラフィーによって得られたタンパク質ｐ２５は、その均質性及び純度を検査するために逆相クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）に加えた。それは、１００分で０〜１００のアセトニトリル勾配を使用した。それは、９０％の高純度タンパク質のピークを観察し、溶出液の均一性を示す。
【００６１】
ｐ２５は次に、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８骨髄腫腫瘍を移植して完全に発達してから８日後に、ＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内注射した。ｐ２５の２２μｇ／ｋｇ体重の用量は、治療した動物の８０％で全退縮を誘導した。陰性対照は３０日の最後に死亡し、そのときには小さい腫瘍が既に発達していた。
【００６２】
（実施例１１）
ｐ５０は金属プロテアーゼであり、ｐ２５はタンパク分解活性を有しない
カゼインを基質として用いるＡｎｓｏｎ及びＭｉｒｓｋｙの修正方法（Ａｎｓｏｎ，Ｍ．Ｌ．、Ｍｉｒｓｋｙ，Ａ．Ｅ．１９３２．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１６：５９）を、我々の研究所でＴｒｉｐｓｉｎａで調整した（ｙ＝１，９３１４ｘ−０．６８２：Ｒ２＝０．９９９）。実施例６で記載したクロマトグラフィーで得られたタンパク質分画を、この方法で分析した。ｐ５０はタンパク分解活性を示したが、それは７ｍＭのＥＤＴＡで抑制され、したがってこの結果は金属プロテアーゼｐ２５は酵素活性を示さないことを示す、図１２。
【００６３】
ｐ５０及びｐ２５のタンパク分解活性を検査するために、ゼラチンを基質として用いるｃｉｍｏｇｅｎｏの方法（Ｖａｃｃａ，Ａ．、ｌｕｒｌａｒｏ，Ｍ．、Ｒｉｂａｔｔｉ，Ｄ．、Ｍｉｎｉｓｃｈｅｔｔｉ，Ｍ．、Ｎｉｃｏ，Ｂ．、Ｒｉａ，Ｒ．、Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｏ，Ａ．及びＤａｍｍａｃｃｏ，Ｆ．１９９９．Ｂｌｏｏｄ．９４：４１４３〜４１５５）を用いた。さらに、ｐ５０の分解の酵素能力も分析した。実施例６で記載したクロマトグラフィーによって得たタンパク質ｐ５０は、このアッセイで酵素活性を示した。２５ｋＤａの高さ（ＭＧ２３２７から）のゲルのタンパク質バンド分画はタンパク分解活性を示したが、クロマトグラフィーによって得たｐ２５はこの活性を示さなかった。
【００６４】
（実施例１２）
ＭＧ２３２７からの２５ｋＤａの増殖抑制ポリペプチドの同定
２５ｋＤａのバンドに存在する増殖抑制活性を有するタンパク質の同定のために、ＭＧ２３２７を加えたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（実施例８で記載）を切断した。バンドは、それが完全にｔｒａｎｓｌｕｃｅｄするまで１ｍＬのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（１００ｍＭ、ｐＨ８．５）緩衝液で５分間インキュベートした。バンドを約１ｍｍ３の小さな立方体に切断して、アセトニトリルで吸収し、１２．５ｎｇ／μＬの濃度までトリプシン又はＬＥＰを含む重炭酸アンモニウム（２５ｍＭ）の最小量で再水和した。ゲル内の消化は、３７℃で１８時間、温度調節ミキサー内でインキュベートした。
【００６５】
ＬＥＰ消化のペプチド生成物は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳで分析した。最も強いシグナルのモノアイソトピックイオンは、配列データベース内の関心タンパク質の同定のためにＰｒｏＦｏｕｎｄプログラムに導入した。データベース内の探索の間、我々は非分類的制限は実施しなかったが、セラチアマルセッセンスＥＣ３．４．２４．４０の５０ｋＤａプロテアーゼは主要な類似体として移転可能であった。タンパク質のＮ末端領域に属する４つのペプチド類（５１〜５７、５８〜６６、６７〜８０及び８１〜９０）及びＣ末端領域に属する１つ（４０２〜４０９）。ＥＣ ３．４．２４．４０の分子サイズは分析したバンドでの移動度の低下として示される（ほぼ２５ｋＤａ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる推定）。これらの知見は、セラリシンファミリーに属する５０ｋＤａのＥＣ．３．４．２４．４０のタンパク質と同様に、２５ｋＤａのバンドは２５ｋＤａの２つの共泳動断片を含むことを示唆する。
【００６６】
この仮説を確認するために、トリプシン消化のタンパク質の２５ｋＤａバンドを作製した。取り出したペプチドのＥＳＩ−ＭＳスペクトルを解読して、最も強いシグナルをＰｒｏＦｏｕｎｄプログラムへ導入した。結果は以前に同定されたものと同じタンパク質を示した（ＥＣ３．４．２４．４０）。トリプシン消化の配列カバー（２１％）は、以前の消化（１０％）よりも大きかった。配列カバーマップは、タンパク質のトリプシン分解フラグメントＰＲＺＮ＿ＳＥＲＭＡ／ＰＲＺＮ＿ＳＥＲＳＰのいくつかと非常に一致した７つのペプチドを証明した。それらのうちの５つ（２８〜４１、５８〜６６、６７〜８０、８１〜９０及び１６３〜１７１）はＮ末端領域に対応し、残りの２ペプチド（３５１〜３７３及び３７４〜３９３）はＣ末端領域に対応した。これらの結果は以前のタンパク質の同定を確証するだけにとどまらず、マップカバーは、分析したバンド内の、ＰＲＺＮ＿ＳＥＲＭＡ／ＰＲＺＮ＿ＳＥＲＳＰと同定されたタンパク質の２つの２５ｋＤａの共泳動断片の存在を示唆する。
【００６７】
前に指摘したタンパク質のＮ末端及びＣ末端の領域のペプチドに対応するＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳスペクトルが都合よく（ｈａｎｄｌｙ）説明され、部分（ｐａｒｃｉａｌ）配列がその同定により取り出された、表３。
【００６８】
表３．２５ｋＤａバンドに存在する５つのペプチドのＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳスペクトルの解釈マニュアル。１〜４のペプチドはＰＲＺＮ＿ＳＥＲＭＡ／ＰＲＺＮ＿ＳＥＲＳＰタンパク質のＮ末端領域に付属し、５のペプチドは、この同じタンパク質のＣ末端領域に対応する。
【表３】
【００６９】
使用した方法及び得られた結果から、我々は、分析した２５ｋＤａバンドには、タンパク質Ｎ末端及びＣ末端の類似のＰＲＺＮ＿ＳＥＲＭＡ／ＰＲＺＮ＿ＳＥＲＳＰを有する断片を有するタンパク質混合物が存在すると結論した。
【００７０】
（実施例１３）
ｐ５０の同定
増殖抑制活性を有するタンパク質ｐ５０を特定するために、実施例６で記載した精製プロトコルから得られた５０ｋＤａタンパク質に対応するタンパク質分画を、Ｌｙｓ−Ｃエンドプロテイナーゼで消化した。ペプチドの同定は、自動Ｅｄｍａｎ Ｄｅｇｒａｄａｃｉｏｎによる配列決定及びＦＡＢキャノンを備えるＪＭＳ ＨＸ−１１０二重セクター質量分析計で実施した。これらの結果とＳｗｉｓｓｐｒｏｔ及びＰＩＲソフトウェアで実施したアラインメントから、このタンパク質は５０ｋＤａの分子量を有するセラリシンファミリーであると結論づけた。主要な類似は、ＳｗｉｓｓｐｒｏｔバンクのＰＲＺＮ＿ＳＥＲＳＰ及びＰＲＺＮ＿ＳＥＲＭＡ識別子を有する種で見られた。質量分析計によって分析されたすべてのペプチドの分子質量は、同時だった予想する、Ｌｙｓ−Ｃエンドプロテイナーゼによるこれらの消化タンパク質のペプチドの期待理論（ｅｘｐｅｃｔ ｔｅｏｒｉｃｓ）値に一致した。
【００７１】
（実施例１４）
クロマトグラフィーによる精製ｐ２５の同定
増殖抑制、アポトーシス及び抗血管新生活性を有する２５ｋＤａタンパク質を同定するために、実施例６で記載したＤＥＡＥクロマトグラフィーにより精製したｐ２５を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに加えた。タンパク質バンドは５００μＬの水で５分間洗浄し、次にクエン酸溶液１００ｍＭで脱色し、その後ｍｉｌｌｉＱ水で新しく洗浄して、約１ｍｍ３の小さな立方体に切断した。次に、脱水されて過剰分が除去されるまでアセトニトリルを添加した。ゲル立方体を蒸発遠心機で完全に脱水し、その後、１２．５ｎｇ／μＬの濃度のトリプシンを含む炭酸水素アンモニウム溶液（５０ｍＭ）中で再水和した。温度調節した攪拌機（ｍｉｎｇｌｅｒ）中で３０分インキュベートした後、３７℃で終夜インキュベートした。
【００７２】
ペプチドを受動的に避けて、２０μＬの炭酸水素アンモニウム溶液を加え、さらに３７℃で４５分間インキュベーションした。ペプチドはＺｉｐＴｉｐｃ１８（商標）を用いて取り出し、その後５μＬの遊離ギ酸を加えて混合反応液を酸性化し、ＺｉｐＴｉｐｃ１８（商標）を用いて新たにペプチドを除去した。ＺｉｐＴｉｐｃ１８（商標）に付着したペプチドは５％ギ酸溶液で連続的に洗浄し、その後、１％ギ酸を含む６０％アセトニトリル溶液の２〜３μＬの量で除いた。
【００７３】
消化の間に形成されたペプチドは、（ＱＴＯＦ−２（商標））ナノスプレーファウンテンを備えた直交性幾何学的ハイブリッド質量分析計のイオン化ファウンテンを導入する金被覆のホウ珪酸毛細管に注入した。
【００７４】
ＥＳＩ−ＭＳマススペクトルは、１秒間に３５０〜２０００Ｄａの範囲で得られた。最も強いシグナルは、その後部ＥＳＩ−ＭＳＭＳ配列で選択された。使用した衝突ガスはアルゴンであり、それは選択されたペプチドの広範囲の断片化を生成するために適当な衝突エネルギーを用い、データベース内での明確な特定を可能にする。
【００７５】
ＥＳＩ−ＭＳスペクトルを解読してＤＴＡフォーマットに送り、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｍａｓｓ Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ（ＰＭＦ）の手法によるＳＷＩＳＳＰＲＯＴ及びＮＣＢＩｎｒデータベース内のタンパク質の同定のためにＭＡＳＣＯＴプログラムへ入れた。このタンパク質を正確に同定するために、トリプシンで自己タンパク質分解したペプチドを内部標準とした較正を使用し、誤差は０．０５Ｄａに固定して、そのスペクトル中に認められたペプチドを検討し、ベースピークの強度より１０％高い強度のシグナルを選択した。
【００７６】
分析したバンドに存在する４つのペプチドは、ＥＳＩ−ＭＳＭＳにより配列決定をした（表４）。Ｃ末端領域（表６の配列で赤で示す）に関するタンパク質のこれらのペプチド類ＰＲＺＮ＿ＳＥＲＭＡ／ＰＲＺＮ＿ＳＥＲＳＰは、前の実施例で同定されている。
【００７７】
表４．ＥＳＩ−ＭＳＭＳで配列決定をされたＳ．マルセッセンスのｐ２５に関するペプチド
【表４】
【００７８】
同様に、配列決定はしていないが、他のシグナルが認められ、その質量値は、タンパク質Ｃ末端領域のＰＲＺＮ＿ＳＥＲＭＡ／ＰＲＺＮ＿ＳＥＲＳＰと同定されたトリプシン性ペプチドへの質量期待値と非常によく一致する、表５（表６では青で記す）。これらのペプチドの間に、ＰＲＺＮ＿ＳＥＲＭＡ／ＰＲＺＮ＿ＳＥＲＳＰタンパク質Ｃ末端のペプチドと一致した、ロードされた二重シグナルが現れる。ＰＲＺＮ＿ＳＥＲＭＡ／ＰＲＺＮ＿ＳＥＲＳＰタンパク質Ｎ末端領域に特異的な切片に帰属させることのできるペプチドは見られなかった。
【００７９】
表５．ＥＳＩ−ＭＳスペクトルで検出したＰＲＺＮ＿ＳＥＲＭＡタンパク質に属するトリプシン性ペプチド類
【表５】
【００８０】
この実施例で示した方法及び結果は、増殖抑制性の強いｐ２５バンドのＤＥＡＥクロマトグラフィーで精製された中には、タンパク質の２５ｋＤａのＣ末端断片のＰＲＺＮ＿ＳＥＲＭＡ／ＰＲＺＮ＿ＳＥＲＳＰが存在することを確証することができる。
【００８１】
表６．ＤＥＡＥクロマトグラフィーによって得られたｐ５０及びｐ２５の同定
配列内には、成熟タンパク質には存在しないアミノ酸が見られる。これらのアミノ酸がない場合は、ＰＲＺＮ＿ＳＥＲＳＰ及びＰＲＺＮ＿ＳＥＲＭＡタンパク質の分子量はそれぞれ５０５９５．４Ｄａ及び５０２９３．４Ｄａである。分子が異なるトリプシン性ペプチドが同定されたことは、両種が存在して共存物（ｃｏｅｘｉｓｔｉｒ）（緑（イタリック）：質量分析で同定、栗色（強調）：連続長方形中のエドマン分解による同定）を含むことを示唆する。ペプチド標識
が、実施例６で記載したクロマトグラフィーによって得られたｐ２５で特定された。ペプチド標識
及び下線は、実施例６で記載したクロマトグラフィーによって得られたｐ５０で特定され、（イタリックの）ペプチドはゲル断片から特定された。
【表６】
【００８２】
（実施例１５）
Ｎ末端及びＣ末端の２５ｋＤａタンパク質
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの２５ｋＤａでＰＲＺＮ＿ＳＥＲＭＡ／ＰＲＺＮ＿ＳＥＲの分解の一部と共存する可能性のあるタンパク質の分子の大きさを測定するために、その配列を作製してＧｅｎＲｕｎプログラムに導入した。２５ｋＤａ（±２ｋＤａ）のＮ及びＣ末端に対応する断片を表７で示す。
【００８３】
表７．２５±２ｋＤａの大きさのタンパク質、ファウンテンからＰＲＺＮ＿ＳＥＲＭＡ／ＰＲＺＮ＿ＳＥＲＳＰ分解の一部。分子量はＧｅｎＲｕｎプログラムを介してＮ及びＣ末端の一部で測定した。最終。
【表７】
【００８４】
（実施例１６）
ＭＧ２３２７によって誘導されるアポトーシス
ＭＧ２３２７は骨髄腫Ｘ６３でアポトーシスを誘導し、断片化ＤＮＡ、ミトコンドリア及び微小管を含む。
【００８５】
腫瘍細胞死の種類を決定するために、マウス骨髄腫Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８細胞（２＊１０７）をｉｎ ｖｉｔｒｏで２２μｇ／ｍＬのＭＧ２３２７で処理した。処理された細胞及び非処理の細胞を異なる時間での超微細透過型電子顕微鏡観察のために調製し、ゲノムＤＮＡはＤＮＡラダリングアッセイのために抽出した。
【００８６】
ＤＮＡ断片は、２％アガロースゲル電気泳動によって評価した。アポトーシスは、典型的なヌクレオソーム間距離の１８０〜２００ｂｐの細胞ＤＮＡラダリングをしばしば含む（Ｓｏｌｄａｔｅｎｋｏｖ，Ｖ．Ａ．Ｐｒａｓａｄ，Ｓ．Ｖｏｌｏｓｈｉｎ，Ｙ及びＤｒｉｔｓｃｈｉｌｏ，Ａ．１９９８．Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．５：３０７〜１２）。図１３で示すように、オリゴヌクレオソームで有意な増加が観察され、それは培養中の形態学的変化と相関して電顕法によって確証された。
【００８７】
ヌクレオソーム間断片化の前には、光学顕微鏡検査で検出されるアポトーシスの形態学的徴候が見られた。さらに、顕微鏡写真は変化した細胞質内オルガネラ（ミトコンドリア、２ｈ）を示し、これもクロマチン凝集（４ｈ）及びヌクレオソーム間断片化（６ｈ）に先行した。
【００８８】
ＭＧ２３２７は微小管及びミトコンドリアの超微細組織に影響を及ぼし、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８細胞のアポトーシスを増加させる。
【００８９】
非処理細胞は、典型的なミトコンドリアの超微細構造を示した−明らかに可視のミトコンドリアのクリステ及び細胞質全体に均一に分布した高密度のミトコンドリア基質（図１４Ａ）。
【００９０】
ＭＧ２３２７で処理した細胞は、拡大したミトコンドリア、低い基質密度及びかなり影響を受けたクリステ形態を示した（図１４Ｂ〜Ｅ）。これらの超微構造変化は、大部分は機能障害性オルガネラを示す。
【００９１】
さらに、我々は処理の２時間後に広範囲な細胞質内の液胞を観察し、小胞体はミトコンドリア及び核構造とみなした（図１４Ｂ）。
【００９２】
異なる形態学的変化が、処理から６時間後に核で観察された（クロマチン凝縮、融合及びラダリング）。ＭＧ２３２７で処理したＰ３Ｘ６３Ａｇ８細胞の後期アポトーシス顕微鏡写真（８時間）では、クロマチンの外観はコンパクトであった（図１４Ｆ）。出芽は、どの時間でも検出されなかった。
【００９３】
興味深いことに、２時間処理したＰ３Ｘ６３Ａｇ８細胞上のミトコンドリアは細胞膜周辺に集まり（図１４Ｂ〜Ｅ）、これは微小管破壊及びこのオルガネラに沿ったミトコンドリア輸送の妨害から生じた。（Ｓｃｈａｔｔｅｎ，Ｈ．及びＬｅｗｉｓ，Ｍ．Ｌ．２００１ Ａｃｔａ Ａｓｔｒｏｎａｕｔ．４９：３９９〜４１８）。
【００９４】
図１４Ｃ及びＤは、内部のミトコンドリア膜に結合した凝縮構造を抱える、より大きなミトコンドリアを示す。これらの構造物は、連続したクリステ融合によって生成されたものであろう。ＭＧ２３２７は、拡大しながらのミトコンドリア外膜の膨張後のシトクロムＣのサイトゾルへの放出と、続くカスパーゼ活性化及びアポトーシスによってアポトーシスを起こすことができた（Ｇｒｅｅｎ，Ｄ．Ｒ．及びＲｅｅｄ，Ｊ．Ｃ．１９９８．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２８：１３０９〜１３１２．レビュー）。
【００９５】
拡大することなく、シトクロムＣは融合後の膜間腔及びクリステの間の接合点を通って、ミトコンドリアの損傷したクリステからサイトゾルへ完全に、迅速に放出されもした（Ｓｃｏｒｒａｎｏ，Ｌ．、Ａｓｈｉｙａ，Ｍ．、Ｂｕｔｔｌｅ，Ｋ．、Ｗｅｉｌｅｒ，Ｓ．、Ｏａｋｅｓ，Ｓ．Ａ．、Ｍａｎｎｅｌｌａ，Ｃ．Ａ．及びＫｏｒｓｍｅｙｅｒ，Ｓ．Ｊ．２００２．Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ．２：５５〜６７）。記載した方法は、ＭＧ２３２７によって生成されたアポトーシスシグナルの細胞への伝達を有意に増幅した。
【００９６】
（実施例１７）
ｐ２５及びｐ５０はアポトーシスを誘導する
ＭＧ２３２７によって誘導されるアポトーシス事象におけるｐ２５及びｐ５０の役割を確かめるために、それらを個々に異なる濃度でＰ３Ｘ６３Ａｇ８細胞に投与して、電顕法により分析した。すべての場合において、クロマチン凝縮、損傷したミトコンドリアクリステ及び集合したミトコンドリアが検出された。実際、ＭＧ２３２７によるアポトーシス誘導は、これらの２つのタンパク質の影響に関係する。
【００９７】
（実施例１８）
ＭＧ２３２７の抗血管新生効果及び抗増殖性ポリペプチド
マトリゲル内の管状構造物の発達
ヒト微小脈管構造由来のヒト内皮細胞（ＨＭＥＣ）を、ＭＧ２３２７、ｐ２５及びｐ５０の非細胞傷害性濃度の下で培養した後に、マトリゲル上の内皮コード形成について評価した（Ｃｒｕｍ Ｒ、Ｓｚａｂｏ Ｓ、Ｆｏｌｋｍａｎ Ｊ．１９８５．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２３０：１３７５〜８、Ｖａｃｃａ，Ａ．、Ｒｉｂａｔｔｉ，Ｄ．、Ｐｒｅｓｔａ，Ｍ．、Ｍｉｎｉｓｃｈｅｔｔｔｉ，Ｍ．、Ｉｕｒｌａｒｏ，Ｍ、Ｒｉａ，Ｒ、Ａｌｂｉｎｉ，Ａ、Ｂｕｓｓｏｌｉｎｏ，Ｆ．及びＤａｍｍａａｃｃｏ，Ｆ．１９９９．Ｂｌｏｏｄ ９３：３０６４）（Ｓａｎｚ．Ｌ．、Ｐａｓｃｕａｌ，Ｍ．、Ｍｕｎｏｚ，Ａ．、Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｍ．Ａ．、Ｓａｌｖａｄｏｒ ＣＨ、Ａｌｖａｒｅｚ−Ｖａｌｌｉｎａ Ｌ．２００２．Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６３：３３５〜３３９）。結果は、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ Ｅｘｐｒｅｓｓ ４．５パッケージを用いて計算した管状構造物の長さ及びそれらの間の接続の数を考慮した。それらは、ＭＧ２３２７調製物並びにそのｐ２５及びｐ５０分画による処理後の内皮細胞の分化又は成熟の有意な抑制（ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡ）を示した（図１５）。
【００９８】
（実施例１９）
増殖性細胞に及ぼすＭＧ２３２７の間接効果
ＭＧ２３２７は、Ｂａｌｂ／ｃマウスを骨髄性腫瘍移植片から保護する。
【００９９】
移植された腫瘍に対するＭＧ２３２７の保護活性を分析するために、Ｂａｌｂ／ｃマウスを異なる免疫化スケジュールの下でこの抗腫瘍調製物の１ｍｇ／ｍｌで接種した（腹腔内）。毎週１用量及び２用量を３週間投与し、用量間は少なくとも３日空けた。陰性対照群は、１×ＰＢＳで接種した。２００万のＰ３Ｘ６３Ａｇ８骨髄腫細胞を、第１の用量の１５０日後（５カ月後）に実験群（治療群及び対照群）へ腹腔内接種をした。陰性対照群からのすべてのマウスは最初の２５日内に死に、一方、治療動物の１００％は腫瘍が形成されずに生存した。（図１６）。
【０１００】
（実施例２０）
他のセラリシンのＣ末端ドメインも細胞傷害効果を有するがタンパク質分解活性はない
ＡＴＣＣ１４７５６系統を実施例２に従ってＣＭＩＢ４２０２系統と類似した条件の下で培養し、その培養液上清を実施例６で記載したように処理した。両方の調製物において、我々は５０ｍＭリン酸−０．２Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．００、で溶出した５０ｋＤａレベルのタンパク質を観察した。これらのタンパク質は、１０ｍＭのＥＤＴＡで抑制され、５μＭのＺｎ２ＳＯ４で回復された酵素活性を示した。両タンパク質をＣＮＢｒで化学的に消化したが消化パターンは類似していて、配列の内部メチオニンから分子の末端までのｐ５０のＣ末端に対応する約２５ｋＤａの類似した断片を生成した。
【０１０１】
消化から得られた断片を、４８時間の透析を通して緩衝液の変化で再生した。これらの断片の生物活性を、それらの存在下で７２時間インキュベートしたＨＥｐ−２細胞を用いて、本明細書で記載した細胞傷害性アッセイで試験した。５ｍＭ ＥＤＴＡの存在下で消化により産生されたタンパク質分解活性のない断片は、用量依存性で、完全なｐ５０分子のそれの約２．５倍の高い細胞傷害活性を示した。一旦それらの配列が分かれば、これらの断片は化学合成又は組換え手法によって得ることもできる。
【０１０２】
（実施例２１）
セラリシン断片と抗体又は抗体断片との組合せ
実施例６及び２０で得られたポリペプチド断片を、モノクローナル抗体ＣＢ／ｉｏｒ−ＣＥＡ．１（Ｔｏｒｍｏ ＢらＡＰＭＩＳ ９７：１０７３〜１０８０、１９８９）、その可変部、及び組換えＤＮＡ技術によってその配列から得られた抗体断片（ｄｉａｂｏｄｙ）（ＷＯ０３／０９３３１５）と化学的にコンジュゲートした。コンジュゲートした生体分子は、実施例３で記載したものと類似した抗増殖アッセイを通してヒト腫瘍細胞系ＬｏＶｏ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２２９）、ＡｓＰＣ−１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６８２）及びＬＳ １７４Ｔ（ＡＴＣＣ ＣＬ−１８８）で分析したが、これらのすべては培養内にＣＥＡを発現した。コンジュゲートした断片は、非コンジュゲート型断片のそれらと同等の細胞傷害性濃度で用いると用量依存的反応を示したが、非コンジュゲート型分子では抗増殖反応は観察されなかった。コンジュゲートした断片は細胞上のＣＥＡと結合することが、細胞ＥＬＩＳＡ及び間接免疫蛍光法（ＷＯ０３／０９３３１５）のような手法を用いて明らかになった。これらの結果は、本明細書で記載したコンジュゲート体は癌の治療及び診断のために用いることができることを証明する。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図２】
【図４】
【図５】
【図６】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１】
【図３】
【図７】
【図１３】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジー、医薬産業の分野、より詳細には腫瘍細胞の増殖を抑制することが可能な組成物の産生に関連する。この組成物は、セラリシン分子全体よりも高い抗増殖作用を有する、完全なタンパク質の分解から得られるセラリシンからのポリペプチド断片を含む。この断片は、その配列の内部メチオニンから分子の末端までのセラリシンＣ末端に属し、これをプロジギオシン(prodigiosins)と組み合わせると、この組成物の抗腫瘍効果が強化される。
【背景技術】
【０００２】
癌化学療法は従来、癌細胞増殖の抑制に向けられてきた。それにも拘らず、近年、増殖過剰の代わり、癌がアポトーシスの相対的な欠乏に関係する病理として確立されたので、アポトーシスを誘導する抗腫瘍製品に対する関心が増加している。
【０００３】
細菌又はそれらの抽出物は、癌治療のためにほぼ１００年の間用いられてきた。最も引用された報告書は、スローンケッタリング記念病院と呼ばれるニューヨーク市の記念病院の内科医及び外科医であるＷｉｌｌｉａｍ Ｂ．Ｃｏｌｅｙのものである。彼は、数種類の癌を患う彼の患者の多くが病原細菌に感染した後に腫瘍退縮を経験することを観察した（Ｃｏｌｅｙ、Ｗ．Ｂ．１９９１年−１８９３年からの再刷−Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．２６２：３）。
【０００４】
感染した患者又は動物の腫瘍抵抗性は、付随する細胞媒介性の抗腫瘍免疫によるものであるとされた（Ｐａｇｌｉａ，Ｐ．及びＧｕｚｍａｎ，Ｃ．Ａ．１９９８．Ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４６：８８）。病原性細菌又は原生動物が感染すれば先天性免疫又は適応免疫の活性化を通して癌退縮を活性化できるはずであるという考えは、Ｈｕｎｔｅｒらによって最近疑問視されている（Ｈｕｎｔｅｒ，Ｃ．Ａ．、Ｙｕ，Ｄ．、Ｇｅｅ，Ｍ．、Ｎｇｏ，Ｃ．Ｖ．、Ｓｅｖｉｇｎａｎｉ，Ｃ．、Ｇｏｌｄｓｃｈｍｉｄｔ，Ｍ．、Ｇｏｌｏｖｋｉｎａ，Ｔ．Ｖ．、Ｅｖａｎｓ，Ｓ．、Ｌｅｅ，Ｗ．Ｆ．及びＴｈｏｍａｓ−Ｔｅｋｈｏｎｅｎｋｏ，Ａ．２００１．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：５８７８）。彼らは、Ｔ．Ｇｏｎｄｉｉに感染した組織は、腫瘍内での血管の形成を妨げるいくつかの可溶性抗血管新生因子を産生することを証明したが、これらは潜在的に治療目的に成り得る。血管形成として知られる新しい毛細血管のこの形成過程は、癌及びその転移に対する新しい療法の実施のための重要な焦点となった。抗血管新生因子の探索は、新しい抗癌治療法の基盤である（Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．２００３．Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．１３：１５９）。最近、化学療法薬及び選択的な抗血管剤としての嫌気性菌の使用は、マウスで皮下（ｓｃ）腫瘍のかなりの退縮をもたらした。本療法は、併用溶菌療法（ＣＯＢＡＬＴＯ）と名づけられている（Ｄａｎｇ，Ｌ．Ｈ．、Ｂｅｔｔｅｇｏｗｄａ，Ｃ．、Ｈｕｓｏ，Ｄ．Ｌ．、Ｋｌｎｚｌｅｒ，Ｋ．Ｗ．及びＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂ．２００１．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｒａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９８：１５１５５）。しかし、生きている細菌は、ヒト癌に対するそれらの使用を制限する重大な毒性及び副次的な反応を生じる。
【０００５】
過去数年、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導するレドックスタンパク質を嫌気性菌が放出することを示すいくつかの報告書が現れた（Ｙａｍａｄａ，Ｔ．、Ｇｏｔｏ，Ｍ．、Ｐｕｎｊ，Ｖ．、Ｚａｂｏｒｉｎａ，Ｏ及びＣｈｅｎ，Ｍ．Ｌ．２００２．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９９：１４０８８；Ｇｏｔｏ，Ｍ．、Ｙａｍａｄａ，Ｔ．、Ｋｉｍｂａｒａ，Ｋ．、Ｈｏｒｎｅｒ，Ｊ．、Ｎｅｗｃｏｍｂ，Ｍ．、Ｇｕｐｔａ，Ｔ．Ｋ．及びＣｈａｋｒａｂａｒｔｙ，Ａ．Ｍ．２００３．Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４７：５４９）。レドックスタンパク質は原核細胞祖先によって分泌された一群の可溶タンパク質に属し、それらの機能は祖先の真核細胞の除去であろうと仮定された（Ｐｕｎｊ，Ｖ．及びＣｈａｋｒａｂａｒｔｙ，Ａ．Ｍ．２００３．Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．５：２２５）。一般に、癌細胞に特異的に作用してそれらの死、及び同時に腫瘍退縮を引き起こすことができるこれらの原核生物による可溶性分泌因子の産生に関しては、ほとんど知られていない。
【０００６】
セラチアマルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）は、通性嫌気性細菌である。その系統のいくつかから、抗腫瘍特性を有するいくつかの製剤が得られ、最も研究されたのは、［ａ］患者の免疫系を活性化するリボソーム膜の製剤である、ＩｍｕＶｅｒｔ（登録商標）（Ｂｕｄａｇｏｖ，Ｒ．Ｓ．及びＵｌｉａｎｏｖａ，Ｌ．Ｐ．２００１．Ｒａｄｉａｔｓ Ｂｉｏｌ Ｒａｄｉｏｅｃｏｌ Ｒｕｓｓｉａｎ．４１：３８）、［ｂ］α−２マクログロブリンの発現に依存する壊死によって細胞死を誘導する、セラチアのプロテアーゼＭｒ５６，０００（Ｗｕ，Ｊ．、Ａｋａｉｋｅ，Ｔ．、Ｈａｙａｓｈｉｂａ，Ｋ．、Ｏｋａｍｏｔｏ，Ｔ．、Ｏｋｕｙａｍａ，Ａ．及びＭａｅｄａ，Ｈ．２００１．Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．９２：４３９）、並びに［ｃ］アポトーシスの誘導を通して免疫抑制及び抗発癌原性の働きをする色素ファミリーである、プロジギオシン、（Ｍｏｎｔａｎｅｒ，Ｂ及びＰｅｒｅｚ Ｔｏｍａｓ，Ｒ．２００３．Ｃｕｒｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ．３：５７；Ｐｅｒｅｚ Ｔｏｍａｓ，Ｒ．ｙ Ｍｏｎｔａｎｅｒ，Ｂ．２００３．Ｈｉｓｔｏｌ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．１８：３７９）である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
我々は、分子全体よりも高い細胞傷害活性を有する、セラリシンの非タンパク分解性断片を得た。これにより、これらの断片を低用量のプロジギオシンと組み合わせて、その色素で報告されている毒性を低下させ、腫瘍細胞に対する増殖抑制作用を高めることが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の組成物は、腫瘍細胞の増殖を抑制することができ、セラリシン分子全体よりも高い抗増殖効果を有する、セラリシンのポリペプチド断片により形成され、その抗腫瘍作用を強化するプロジギオシンと組み合わせることができる。
【０００９】
本発明では、ポリペプチド及びプロジギオシンが共存し、悪性細胞系に対して広範囲の細胞傷害活性を有し、形質転換された腫瘍細胞、特に増殖が活性化された細胞に対して選択効果を示す、ＭＧ２３２７調製物の獲得が記載される。腫瘍性又は非腫瘍性の異なる細胞系に関する感受性試験は、正常な細胞系はＭＧ２３２７調製物にわずかに感受性であるが、黒色腫、喉頭癌腫、線維肉腫、肝臓癌腫及び頸子宮癌腫（ヒト乳頭腫ウイルスは陽性又は非陽性）に由来する細胞は非常に感受性であることを示す。造血器官起源の癌腫の感受性は低い。その増殖が活性化されたＨＵＶＥＣ細胞は、活性化されていないものよりもＭＧ２３２７に対して感受性が高い。ＭＧ２３２７調製物は、細胞分裂の過程で発現又は過剰発現される因子に特異的に作用することができる。これらの因子は、癌又は他の増殖性疾患に対する治療標的を構成する。さらに、これらの因子は、分化型若しくは非分化型の細胞の増殖過剰又は非制御増殖によって開始される疾患の早期診断のための標的も構成する。正常細胞はその作用に対しより抵抗性であるので、これらの分子を含む放出制御製剤は、これらの増殖性標的に対し特異的に作用するように、それら標的に向かわせることができるであろう。
【００１０】
ＭＧ２３２７調製物の抗腫瘍活性を証明するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスに、腹水マウス腫瘍を引き起こすことができる骨髄起源の腫瘍細胞ＣＢ Ｈｅｐ．１を腹腔内接種によって投与した（Ｆｏｎｔｉｒｒｏｃｈｉ，Ｇ．、Ｄｕｅｎａｓ，Ｍ．、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ ｄｅ Ｃｏｓｓｉｏ．Ｍ．Ｅ．、Ｆｕｅｎｔｅｓ，Ｐ．、Ｐｅｒｅｚ，Ｍ．、Ｍａｉｎｅｔ，Ｄ．、Ａｙａｌａ，Ｍ．、Ｇａｖｉｌｏｎｄｏ，Ｊ．Ｖ．及びＤｕａｒｔｅ，Ｃ．１９９３．Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌ Ａｐｌｉｃ．１０：２４〜３０）。１０日後、マウスにＭＧ２３２７調製物又はＰＢＳを腹腔内注射した。１ｍｇ／ｋｇで治療した動物の６０％は生存したものの、対照では治療開始から４５日後に２５％しか生存しなかった（図８）。総腫瘍退縮は、治療した生存マウスで観察され、健康な状態を示し、対照では腫瘍が進行して大きな固形塊を形成し、マウスは全身状態の悪化を示した。
【００１１】
ＭＧ２３２７調製物の１ｍｇ／ｋｇ体重の単回投与で治療した骨髄起源の腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃマウスは、全体的な退縮を示して生存した。この同じ投与により、Ｅ６／Ｅ７形質転換線維芽細胞起源の腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃマウスで腫瘍量のかなりの減少を示して生存率が高まる。ＭＧ２３２７は、骨髄性腫瘍の移植組織からＢＡＬＢ／ｃマウスを保護する。
【００１２】
ＭＧ２３２７調製物は、抗増殖性分子を産生するための培養条件の最適化の結果として得られた。ＭＧ２３２７調製物は、抗増殖性分子を産生するための培養条件の最適化の結果として得られ、その分子は、正常細胞及び腫瘍細胞内の増殖抑制性で、アポトーシス性抗血管新生分子の産生の誘導物質としての移植組織及び悪性腫瘍の生成に対する１つの保護剤を構成し、癌、さらにはこの事象に関連する他の疾患の予防（ｐｒｏｆｉｌａｘｉｓ）及び治療で有利に用いることができる。ＣＭＩＢ４２０２株は４５〜５０及び２０〜３０ｋＤａの範囲の可溶タンパク質を過剰発現する（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによると５０及び２５ｋＤａ、０．９８４の１測定係数）。ｐ２５と命名された２５ｋＤａ分画は、ＥＤＴＡとともにインキュベートしたＨＥｐ−２細胞系で実施された実験で、用量依存性の（ｄｏｓｉｓ−ｄｅｐｅｎｄｉｅｎｔｅ）強力な増殖抑制活性を示したが、ｐ５０と命名された５０ｋＤａ分画は増殖を抑制しなかった。しかし、ｐ５０分画を５μＭのＺｎ２ＳＯ４とともにインキュベートすると、増殖抑制活性が示されたが、それはｐ２５分画よりも弱かった。ｐ２５及びｐ５０分画のＩＣ５０値は、それぞれ０．４８ｎＭ及び１６ｎＭであった。
【００１３】
増殖抑制効果を有するタンパク質生体分子（ポリペプチド及びプロジギオシン）の単離は、本発明では一段階のみのクロマトグラフィー、即ち不連続勾配のＮａＣｌを用いるイオン交換によって実施した。それは、５０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ８．００で平衡化した１つのＤＥＡＥ又はＱＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓａ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ ｍａｔｒｉｚを用いた。溶出は、不連続勾配のＮａＣｌ：５０ｍＭリン酸緩衝液−０．１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．００；５０ｍＭリン酸緩衝液−０．２Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．００；５０ｍＭ−２Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．００で実施し、最後に、マトリックスに吸着した色素分画を無水エタノールから７０％エタノールを用いて溶出した。この結果は、２５ｋＤａのタンパク成分調製物は、同じ調製物の５０ｋＤａのタンパク成分よりも細胞腫瘍の増殖を抑制する能力が高く、両者は独立した形態のｉｎ ｖｉｔｒｏ生物活性を示すことを確証する。
【００１４】
２５ｋＤａの断片を含めて、いくつかの大きさの分子の断片は、ｐ５０の分解を引き起こした。ｐ５０の分解の増加は高温で得られ、ｐ２５の生成はこの温度上昇に比例していたが、それはｐ５０を減少させた。ヒツジで得られた抗ｐ５０ポリクローナル抗体はウェスタンブロットアッセイでｐ２５を認識したので、ｐ２５はｐ５０タンパク質の分解生成物に由来する。分解生成物は分解生成物の増殖抑制作用と比例して増加した。この結果はｐ５０分解（ａｕｔｏｌｉｓｉｓ）が、元の分子ｐ５０よりも強い増殖抑制作用を有する分解断片を産生することが可能であることを確証する。さらに、ｐ２５タンパク質は、骨髄源の悪性腫瘍の総退縮も誘導する。ｐ５０の断片は、抗体断片の既に公知の方法によって遺伝的にコンジュゲートして、増殖性病因の疾患の治療に役立つ免疫毒素を生成することができる。また、この断片は単独で又は他のタンパク分子と組み合わせて、細胞内部からの担体として、又は特異的受容体として（inner of celulas orspecififc receptors）使用されよう。ｐ５０の断片は、特異標的からの指向性制御を保つように調節された放出系の外部媒体にそれ自体を露出させることもできる。
【００１５】
ｐ５０のタンパク分解活性は７ｍＭのＥＤＴＡで抑制され、ｐ５０は質量分析計でセラリシンファミリーに属すると同定された金属プロテアーゼであることが証明された。
【００１６】
主な類似性は、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔタンパク質データベースの識別子ＰＲＺＮ＿ＳＥＲＳＰ及びＰＲＺＮ＿ＳＥＲＭＡの種で発見された。クロマトグラフィーによって精製されたｐ２５タンパク質は酵素活性を示さず、このことはセラリシンＣ末端領域の非触媒性と一致する。
【００１７】
タンパク成分及びプロジギオシンは同じ１つの組成物中に製剤化され、それはその製剤の独立した形態と比較して抑制効果を有意に（ｐ＜０．００５）増加させた。この組成物は、独立した形態の成分を評価するために用いたタンパク質及びプロジギオシンと同じ関係を維持して得られた。そのような組成物では、プロジギオシンは０．１〜１００ｎＭの濃度で見られ、セラリシン断片は０．１〜１５０μｇ／ｍＬの範囲で見られる。
【００１８】
セラリシン由来のポリペプチド断片を含み、セラリシンの完全な分子と比較して増加した増殖抑制効果を有する組成物、並びにその組成物の選択的に強力な生物活性を有するセラリシン−プロジギオシン断片の組合せの獲得。
【００１９】
さらに、これらのポリペプチドの断片は、癌細胞に対してアポトーシス効果を有する。このアポトーシス効果は、ミトコンドリア、微小管及びＤＮＡ断片化、プログラム細胞死シグナル増幅、この組成物の用量減量を伴った。この事象は、ポリペプチド及びプロジギオシンの結合組成物でも観察された。
【００２０】
ＭＧ２３２７及び増殖抑制ポリペプチド断片の抗血管新生効果は、マトリゲル内の管状構造物形成の方法により評価した。ＭＧ２３２７及びそれらの分画ｐ２５及びｐ５０の非細胞傷害性濃度をヒト微小血管系内皮細胞（ＨＭＥＣ）とインキュベートした。最終結果は形成した管状構造物の長さ、及びそれらの間の内部結合（ｉｎｔｅｒｃｏｎｅｘｉｏｎ）数を考慮して評価する。このために、Ｐｒｏ Ｅｘｐｒｅｓｓ ４．５ Ｉｍａｇｅプログラムを用いた。結果は、ＭＧ２３２７組成物による治療は、タンパク質及びそれらの抗増殖性ポリペプチドによる治療は内皮細胞の分化又は成熟を有意に（ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡ）抑制し、このようにポリペプチドとして単離されたＭＧ２３２７は抗血管新生活性を有することを説明する。
【００２１】
アポトーシス性の、抗血管新生活性及び選択性は、癌に対するその可能性のある治療薬及び保護剤として、本発明の目的組成物の最も重要な特性の１つである。
【００２２】
断片セラリシンとプロジギオシンファミリーとの組合せは、ｃａｎｃｅｒｉｇｅｎとして最も強力で選択的な形態であることが示された。これらのポリペプチドは、癌又は内皮細胞及び形質転換細胞の増殖に関係する他の疾患の予防（ｐｒｏｆｉｌａｘｉｓ）及び治療のための、組換え毒素及び免疫毒素の獲得のために用いることができる。
【００２３】
これらのポリペプチド及びそれらのプロジギオシンとの可能な組合せは、ヒト又は動物で癌及び他の増殖性病理に対して使用するための、非常に選択的で１つの十分な作用スペクトルを有するｖａｃｕｎａｌｅｓ ｐｒｅｐａｒａｄｏｓ、治療薬又は診断薬を獲得するために、医薬産業で直ちに応用される。
【００２４】
（図面の簡単な説明）
［図１］Ｓ．マルセッセンスと腫瘍細胞ＣＢ Ｈｅｐ．１との相互作用は、高い抗増殖性能力及び修飾されたタンパク質発現を有する細菌系統を生成する。Ａ−細胞生存。７２時間後に、細胞生存をＭＴＴ法によって推定した。系統ＣＭＩＢ４２０２は、ヒト腫瘍細胞ＨＥｐ−２に対して強い抗増殖性効果を示したが、ＳＭ１９９５系統の効果は非常に弱かった。これらの結果は、１試料４反復を用いた３つの独立した実験の平均であった。Ｂ−ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動（銀染色）。ＣＭＩＢ４２０２は、２５ｋＤａ近辺を移動する可溶タンパク質を過剰発現した。
［図２］細胞系ＨＥｐ−２に対する２５及び５０ｋＤａ分画の増殖抑制作用を示す図である。細胞生存能力はＭＴＴ法で測定して、対照細胞と比較した率で表した。分画はＳＤＳゲル（亜鉛−イミダゾール染色）から回収して再生した。２５ｋＤａ近くの分画は強い増殖抑制作用（ＩＣ５０値０．３５ｎＭ／ｍＬ）を示したが、ｐ５０は増殖を抑制することができなかった。Ｚｎ４ＳＯ２の５μＭをｐ５０に加えたとき、増殖抑制作用の増加が観察された（ＩＣ５０値４５ｎＭ／ｍＬ）が、ｐ２５のそれよりは劣っていた。５つの独立した実験の平均値から曲線を作成して、対応する標準偏差（ＳＤ）とともにグラフ表示する。
［図３］系統ＣＢＭＩ４２０２によるタンパク質及びプロジギオシンの発現の動態を示す図である。培地へのプロジギオシンの発現は、増殖期から安定期までの移行期間の間に起こり、そこではＣＢＭＩ４２０２はその高い複製時間に達する。Ａ−細胞複製時間の動態。Ｂ−プロジギオシン発現の効率（生成物／バイオマス）。Ｃ−ＭＴＴ法で測定されたＨｅｐ−２細胞に対する増殖抑制効果の動態。Ｄ−光学密度及びタンパク質生合成で測定された細胞増殖の動態。
［図４］ＭＧ２３２７による治療に対する腫瘍細胞及び正常ヒト細胞の感受性を示す図である。正常細胞は低い感受性を有し、造血起源のそれらの感受性は分析した残りの細胞系よりも低い。一方、成長を活性化した細胞（ＨＵＶＥＣ ｂＦＧＦ）及び腫瘍悪性病変由来の細胞は、より感受性である。
［図５］ＭＧ２３２７調製物で治療され、又は治療されなく、ＣＢＨｅｐ１腫瘍を投与された後のＢＡＬＢ／ｃマウス生存の分析を示す図である。Ａ−１ｍｇ／ｋｇの用量は治療された動物の６０％で腫瘍退縮を誘導し、未処置動物の１００％がｄａｙ６０までに死亡した。Ｂ−腫瘍細胞接種の４５日後に、無処置動物は充実性腫瘍及び腹水が存在して極めて虚弱な状態を示したが、１ｍｇ／ｋｇで治療されたものは腫瘍の所見を示さず、３００日を超えて生存した。
［図６］腫瘍モデル３Ｔ３１６に及ぼすＭＧ２３２７の抗腫瘍効果を示す図である。Ａ−各群の日別平均を示すグラフは、治療動物及び無処置動物の腫瘍量の間の統計学的に有意な差（ｐ＜０．００３）を示す。その時間を通しての腫瘍増殖の分析は、ＭＧ２３２７治療群で有意な変動（ｐ＝０．１０９）を示さなかったが、陰性対照群はこのパラメータの有意な増加（ｐ＝０．０４）を示した。Ｂ−治療動物及び無処置動物の生存。
［図７］ＭＧ２３２７からのタンパク質有効成分の単離を示す図である。（Ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの電気泳動（１２．５％）。クマシー染色の結果。レーン１は０．２Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．００による溶出に対応する試料を示し、５０ｋＤａに対応するタンパク質バンドを認める。レーン２は、２５ｋＤａのタンパク質バンドを示す。染色は、クマシー法によって実施した。（Ｂ）ヒト腫瘍細胞上のｐ５０及びｐ２５タンパク質のＨＥｐ−２に対する増殖抑制効果。総タンパク質濃度で表したｐ２５、ｐ５０及びＭＧ２３２７に対する用量反応関係。
［図８］ＭＧ２３２７から単離された有効成分のＨＥｐ−２細胞に及ぼす増殖抑制効果を示す図である。ＭＧ２３２７に封入された５０及び２５ｋＤａのタンパク質は、増殖抑制活性を示した。これらのタンパク質とプロジギオシンとの組合せは、対照と比較して腫瘍細胞の５０％の増殖を抑制することができる用量（ＩＣ５０値）を低下させた。
［図９］ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット法。（Ａ）ＭＧ２３２７から得られたタンパク質のパターン。試料は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（１２％）によって分析して銀染色した。（Ｂ）約５０及び２５ｋＤａのタンパク質バンド（矢印）を亜鉛イミダゾールで染色した類似のゲルから切断し、再生して新しいＳＤＳ−ＰＡＧＥに流した。これをニトロセルロース膜へ移して、ウェスタンブロットを抗ｐ５０抗体で展開した。ヤギで得られたポリクローナル抗体は、ｐ２５及びｐ５０の分解物を認識したが、関連しないタンパク質バンド（Ｎｅｇ Ｃ）を認識しない。
［図１０］ｐ５０自己消化を示す図である。Ａ−ＳＤＳページ電気泳動：１−２４℃、２−３７℃、３−４５℃、４−６０℃、５−４℃。Ｂ−ｐ５０及びｐ２５の濃度測定分析は、インキュベーション温度の上昇に伴いｐ５０バンドの強度は低下し、ｐ２５バンドの強度は増加することを示した。
［図１１］ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓａ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗクロマトグラフィーで精製したｐ５０を示す図である。ｐ５０（０．２ＭのＮａＣｌで溶出）は、親分子より高い増殖抑制作用を有する分解物を生成した。
［図１２］異なるクロマトグラフィーから得られたｐ２５及びｐ５０の酵素活性を示す図である。Ａ−ｐ２５は活性を示さないがｐ５０は酵素活性を示した。Ｂ−ｐ５０の酵素活性は、７ｍＭのＥＤＴＡで完全に抑制された。
［図１３］ＭＧ２３２７は、腫瘍細胞Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８の時間依存性ＤＮＡ断片化を誘導した。インキュベーションの６時間後からオリゴヌクレオソーム断片が観察され、それらは経時的に増加し、２４時間後に１８０〜２００塩基対のオリゴヌクレオソーム断片で典型的なアポトーシスのパターンに到達する。
［図１５］マトリゲル内の内皮細胞の分化に及ぼすＭＧ２３２７、ｐ２５及びｐ５０（クロマトグラフィーによって精製される）及びそれらの分画の影響を示す図である。ＨＭＥＣ細胞を、活性化条件（１０ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、１μｇ／ｍＬのヒドロコルチゾン）で、ＭＧ２３２７（Ａ）、ｐ５０（Ｂ）及びｐ２５（Ｃ）の類似した濃度の存在下で、治療なし（Ｅ）及び活性化なし（Ｄ）で培養した。グラフ（Ｆ）では、３つの独立した実験の結果が集められ、それはマトリゲル内の管状ネットの形成に及ぼすＭＧ２３２７及びその成分の抑制作用を示す。ＭＧ２３２７及びｐ５０は、誘導された活性化を完全に非活性化細胞のレベルに戻す（ＡＮＯＶＡ ＭＧ２３２７、ｐ５０及びＣＮ ｐ＞０．０５）。ｐ２５で治療した細胞は、ＭＧ２３２７及びｐ５０で観察されたものより劣った（対応のないｔ、それぞれｐ＝０．０１０７及びｐ＝０．０４９８）ネット形成指数を示した。
［図１６］ＭＧ２３２７で免疫化されたか又はされていない、また、Ｘ６３骨髄腫細胞を投与されたＢＡＬＢ／ｃの生存を示す図である。１ｍｇ／ｋｇのＭＧ２３２７の３及び６の用量を用いて免疫化された動物の１００％は、骨髄性腫瘍を拒絶する。
【実施例】
【００２５】
（実施例１）
系統ＣＭＩＢ４２０２の獲得
抗腫瘍分子の細菌系統産生者を得るために、ＢＡＬＢ／ｃマウスの前方表面から単離した野生型セラチアマルセッセンスＳＭ１９９５を腫瘍細胞ＣＢＨＥｐ．１と混合し（Ａｌｅｍａｎ，Ｍ．Ｒ．、Ｖａｌｄｅｓ，Ｒ．、Ｐｅｒｅｚ，Ｍ．、Ｉｂａｒｒａ，Ｎ．、Ｒｅｙｅｓ，Ｂ．、Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｍ．、Ｍｅｎｄｏｚａ，Ｏ．、Ｐａｄｉｌｌａ，Ｓ．、Ａｇｒａｚ，Ａ．及びＲｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｍ．Ｐ．２０００．Ｂｉｏｐｈａｒｍ １３：４８〜５２）、１０日前に重流動ワセリン（heavy liquid petrolate）を事前接種したＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内接種をした。細胞混合物の接種の８日後に、腹水抽出を２日ごとに実施した。腫瘍増殖の動態を分析して、腫瘍退縮を示す各動物の腹水に微生物管理を実施した。
【００２６】
単離した細菌は異なる培地及び培養条件で増殖させた。培養液上清は０．２２μｍのメンブランフィルターを用いて濾過滅菌し、それらの毒性はＣＢＨＥｐ．１細胞で評価した。強い細胞傷害性の系統が、アクセッション番号ＣＭＩＢ４２０２でＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ ｗｉｔｈ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｈａｂａｎａ市、Ｃｕｂａに寄託された。ＣＭＩＢ４２０２及びその親系統ＳＭ１９９５を５Ｌ発酵槽内の２８℃のペプトン−グリセリン培地で、並行して培養した。ＣＭＩＢ４２０２の滅菌濾液は用量依存性の活性を示すが、ＳＭ１９９５からのものはＭＴＴ法を用いた増殖抑制アッセイにおいてヒト癌細胞系Ｈｅｐ−２に対してわずかな活性を有する（図１Ａ）（Ｓｋｅｈａｎ，Ｐ．、Ｓｔｏｒｅｎｇ，Ｒ．、Ｓｃｕｄｉｅｒｏ，Ｄ．、Ｍｏｎｋｓ，Ａ．、Ｍｃｍａｈｏｎ，Ｊ．、Ｖｉｓｔｉｃａ，Ｄ．、Ｗａｒｒｅｎ，Ｊ．Ｔ．、Ｂｏｋｅｓｃｈ，Ｈ．、Ｋｅｎｎｅｙ，Ｓ．及びＢｏｙｄ，Ｍ．Ｒ．１９９０．Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｉｎｓｔ．８２：１１０７）。
【００２７】
ＣＭＩＢ４２０２株は４５〜５０及び２０〜３０ｋＤａの範囲の可溶タンパク質を過剰発現した（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによると５０及び２５ｋＤａ、０．９８４の測定係数）、図１Ｂ。
【００２８】
亜鉛イミダゾールで染色したＳＤＳゲルで示されたバンドから回収されたｐ２５分画（Ｈａｒｄｙ，Ｅ．、Ｓａｎｔａｎａ，Ｈ．、Ｓｏｓａ，Ａ．、Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｌ．、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｐａｄｒｏｎ，Ｃ．及びＣａｓｔｅｌｌａｎｏｓ−Ｓｅｒｒａ，Ｌ．１９９６．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２４０：１５０）は、Ｈｅｐ−２で強い抗増殖性用量依存性活性を示したが、ｐ５０分画は細胞増殖を抑制しない。しかし、ｐ５０を５μＭのＺｎ２ＳＯ４とインキュベートしたときは増殖抑制作用を示した。但し、ｐ２５で観察されたものよりも低かった（図２）。ｐ２５及びｐ５０分画のＩＣ５０値は、それぞれ０．４８ｎＭ及び１６ｎＭであった。
【００２９】
タンパク質を発現する両株の能力を比較する目的で、多元ＡＮＯＶＡを適用した。相互作用の見込まれる値は、有意ではなかった（ｐ＝０．９３）。
他方、両者の見込まれる主要な効果は、両者のタンパク質が量の点で顕著な相違を発現すること（ｐ＝０．０１）、並びにその量が、貯蔵に依存することを示す（ｐ＝０．０００４）。
さらに、両者の保存状態間で、これらのたんぱく質の発現について顕著な相違が存在する。
［Furthermore, the probability of both principal effects Por otro lado, la probabilidad de ambos efectos principales mostro que ambas proteinas son expresadas en cantidades significativamente diferentes (P = 0.01) y que la cantidad es fuertemente dependiente de la cepa (P = 0.0004). Ademas, existieron diferencias extremadamente significativas de la expresion de estas proteinas entre ambas cepas (P<0.001).］
【００３０】
（実施例２）
ＭＧ２３２７増殖抑制調製物の獲得
得られたＣＭＩＢ４２０２のＳ．マルセッセンス系統の一部の増殖抑制調製物のために、１Ｌの微生物培養物及び関心の分子を産生するための最適な培地を産生した（図３）。ＣＭＩＢ４２０２培養物は、４℃、１２０００ｇで３０分間遠心分離した。Ｓｏｂｒｅｎａｔａｎを収集し、その後無菌条件下で分子ｔａｍｉｚａｊｅにより０．２μから濾過した。ｓｏｂｒｅｎａｄａｎｔｅの量は、同じ無菌条件で１０倍に減らした。上清の量を１０ｋＤａ排除限度の膜を用いて１０倍に減らし、生理的条件で２４時間の間、４℃でＰＢＳに対して透析した。透析した材料を無菌条件下で濾過し、５ｍＬのバイアルに分け、パイロジェンフリーのクリスタルバイアルに入れた。この調製物を４℃で保存し、ＭＧ２３２７と命名した。
【００３１】
５Ｌの培養器に移し、スクリーニングで既に確立された条件（ペプトン−グリセロール培地中、２８℃で１４時間、通気量１ｖｖｍ、２５０ｒｐｍ、初期吸光度０．１）にかけた。培地は生理的ｐＨに調節し、培養は自由なｐＨにした。残りのｐａｓｅを同様に実施し、スクリーニングした。
【００３２】
（実施例３）
「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」におけるＭＧ２３２７調製物の増殖抑制作用の特性評価
「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」におけるＭＧ２３２７の増殖抑制作用の特性評価のために、一群のヒト細胞系を評価した（表１）。ＰＢＭＣ（２００００）を除く合計２０００細胞を９６穴培養ウェルに接種し、ＭＧ２３２７の異なる濃度を加えた。７２時間後に、生存細胞数をＭＴＴの添加により推定した（Ｓｋｅｈａｎ，Ｐ．、Ｓｔｏｒｅｎｇ，Ｒ．、Ｓｃｕｄｉｅｒｏ，Ｄ．、Ｍｏｎｋｓ，Ａ．、Ｍｃｍａｈｏｎ，Ｊ．、Ｖｉｓｔｉｃａ，Ｄ．、Ｗａｒｒｅｎ，Ｊ．Ｔ．、Ｂｏｋｅｓｃｈ，Ｈ．、Ｋｅｎｎｅｙ，Ｓ．及びＢＯＹＤ，Ｍ．Ｒ．１９９０．Ｊ．Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８２：１１０７）。可溶性ホルマザン生成物が、マルチスキャンプレートリーダーにおいて５４０ｎｍで検出された。ＭＧ２３２７は、分析したヒト細胞系に対して広範囲の細胞傷害活性を示した。ＩＣ５０値は、μｇ／ｍＬの範囲にあった。
【００３３】
表１．「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」試験で用いた細胞及び培地
【表１】
【００３４】
ＭＧ２３２７選択性を、ＨＴ１０８０細胞系（線維肉腫から）及び一次線維芽細胞を用いて、市販薬剤ドキソルビシン（ＤＸＲ）と比較した。用いた抗増殖性アッセイは、上で記載した。ＤＸＲ及びＭＧ２３２７調製物の連続希釈を１０μｇ／ｍＬから適用して、５点曲線を作成した。死亡比率は、ＨＴ１０８０の死亡率パーセント及び一次線維芽細胞の死亡率パーセントの間の関係として、各点で計算した。試験した低い方の濃度でより大きな差が検出された（ＭＧ２３２７ ９：１、ＤＸＲ １．７：１）。ＭＧ２３２７は、２μｇ／ｍＬ未満の濃度で非常に選択的であった。
【００３５】
喉頭癌起源のＨＥｐ−２細胞は、分析した他の細胞系と比較して臨床で用いた抗腫瘍薬に非常に抵抗性である。このために、我々は、ＭＧ２３２７調製物の影響の「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」試験のためのモデルとしてそれを用いた。公知の抗腫瘍薬で治療したＨＥｐ−２細胞で作成した細胞傷害性曲線の比較は、ＭＧ２３２７調製物、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、ドキソルビシン（ＤＸＲ）、ビンクリスチン（ＶＣ）、ビンブラスチン（ＶＢ）及びタキソール（ＴＸ）の３μｇ／ｍＬで増殖の類似した結果（４０％）を示した、（ｐ＞０．０５、ＡＮＯＶＡによる検定）。同じ条件で、Ａｒａ Ｃ、メトトレキサート（ＭＴＣ）、ブレオマイシン（Ｂｌｅｏ）及びシクロホスファミド（ＣＰＡ）などの他の抗腫瘍薬は、効果を示さなかった。ＣＤＤＰは喉頭癌の治療のためにＦＤＡによって認可された抗腫瘍薬の１つであり、ＭＧ２３２７調製物及びＣＤＤＰの生存曲線の分析は、ＩＣ１０、ＩＣ５０及びＩＣ９０で類似した値を示した。
【００３６】
様々な発癌性又は非発癌性細胞系（図４）の感受性試験は、正常な細胞系統はわずかに感受性であるが、黒色腫、喉頭癌、線維肉腫、肝癌及び頸部−子宮癌（ヒト乳頭腫ウイルスの担体）のそれは非常に感受性である。造血起源の癌腫の感受性はより低い。活性化されなかった増殖する細胞のＨＵＶＥＣ活性は、ＭＧ２３２７調製物に対して最も感受性である。
【００３７】
以前の結果は、調製物ＭＧ２３２７は悪性細胞系に対して十分な細胞傷害作用スペクトルを有し、腫瘍／形質転換され活性化された細胞の増殖に対して選択的効果を有することを示している。
【００３８】
（実施例４）
ＭＧ２３２７調製物の抗腫瘍活性
ＭＧ２３２７調製物の抗腫瘍活性を示すために、我々はマウス腹水腫瘍を生成することができる骨髄起源のＣＢ Ｈｅｐ−１腫瘍細胞を腹腔内（ｉ．ｐ．）に移植された、ＢＡＬＢ／ｃマウスを使用した（Ｆｏｎｔｉｒｒｏｃｈｉ，Ｇ．、Ｄｕｅｎａｓ，Ｍ．、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ ｄｅ Ｃｏｓｓｉｏ，Ｍ．Ｅ．、Ｆｕｅｎｔｅｓ，Ｐ．、Ｐｅｒｅｚ，Ｍ．、Ｍａｉｎｅｔ，Ｄ．、Ａｙａｌａ，Ｍ．、Ｇａｖｉｌｏｎｄｏ，Ｊ．Ｖ．及びＤｕａｒｔｅ，Ｃ．１９９３．Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌ Ａｐｌｉｃ．１０：２４〜３０）。１０日後、マウスはＭＧ２３２７又はＰＢＳで腹腔内注射した。１ｍｇ／ｋｇ体重で治療した動物の６０パーセントは生存したが、対照のわずか２５パーセントが最初の治療から４５日まで生存した（図５）。総腫瘍退縮は健康な状態を示したすべての治療された生存動物で観察されたが、対照では腫瘍が進行して大きな固形塊を形成して、動物は不健康な全身状態を示した。
【００３９】
Ｅ６／Ｅ７で形質転換した線維芽細胞の腫瘍を抱えるＢＡＬＢ／ｃマウスはＭＧ２３２７調製物で治療した後に生存期間を延ばし、腫瘍量の有意な減少を示した。
【００４０】
また、ＭＧ２３２の抗腫瘍活性を評価するために、Ｈｅｒｎａｎｄｅｚら（Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｐ．、Ｍｅｒｉｎａ，Ｎ．、Ｌｏｐｅｚ−Ｏｃｅｊｏ，Ｏ．及びＡｒａｎａ，Ｍ．Ｊ．２０００．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．２７０：１１９〜１２４）によって開発されたヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ１６）に関連する癌のモデルを用いた。２群のＢＡＬＢ／ｃマウスに対して、２×１０６の３Ｔ３１６細胞を左前方のゾーンの皮下（ｓ．ｃ．）に接種した。４８時間後、対照群の一次細胞接種近くに、ＭＧ２３２７又はＰＢＳの０．７５ｍｇ／ｋｇ体重の用量を皮下に投与し、ノギスで毎日測定した。腫瘍量は標準式Ｖ＝０．５２×ａ２×ｂを用いて計算し、ａは腫瘍の横周辺部の幅であり、ｂは長さである（Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｐ．、Ｍｅｒｉｎａ，Ｎ．、Ｌｏｐｅｚ−Ｏｃｅｊｏ，Ｏ．及びＡｒａｎａ，Ｍ．Ｊ．２０００．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．２７０：１１９〜１２４）。動態を図６に示す。
【００４１】
腫瘍発達の時間の差は、治療動物及び無処置動物の間で統計学的に有意であった（ｐ＝０．００５４）。ＡＮＯＶＡ検定による時間：治療の関係の研究は、治療群及び非治療群の間では同程度の差が維持されないことを示した。このことは、動物に適用された治療に関連した差の存在を示した。
【００４２】
ウィルコクソン検定をペアードデータのために各群のｄａｙ２１及びｄａｙ４５の間の測定値に適用したとき、我々は対照群で有意な腫瘍量の増加（ｐ＝０．０４３）を検出したが、治療群ではそうではなかった（図６Ａ）。各評価時点における群間の有意差の存在を分析するために、我々は第１の点を例外に有意差を検出したＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定を適用した（ｐ＜０．０１）。また、我々は腫瘍の増殖速度に重要な差を検出した。増殖曲線を１つの線に調節して、勾配を適合度によって生成された方程式から計算した。勾配の比較は、対照群の腫瘍は、治療群で観察されたものより有意に速い速度で成長したことを示した（ｐ＝０．００８８）。
【００４３】
対照群のマウスは腫瘍移植のためにｄａｙ４５及びｄａｙ６４の間に死亡したが、治療群の動物はｄａｙ５２から死に始め、２０％の生存率が期間内（１７０日）に維持された（図６Ｂ）。
【００４４】
生存データをベイジアン階層モデルに調節することで（５００反復のワイブル回帰）、我々は統計学的に有意の差（ｐ＝０．０２４４７）を得たが、それは平均生存期間の信頼区間が完全に排他的であることが示されたときに確認された。
【００４５】
（実施例５）
ＭＧ２３２７調製物の分画、非タンパク質生体分子から単離
ＭＧ２３２７調製物の組成を決定するために、分子分画を実施してｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞Ｈｅｐ−２ヒト腫瘍細胞系の細胞増殖を抑制するそれらの能力を評価した。
【００４６】
多糖分画（ｔｒ＝６．８５分）をＡｍｉｎｅｘ前ゲルＨＰＸ８７−Ｎクロマトグラフィー（寸法：３００×７．８ｍｍ、流速：０．５ｍｌ／分）で分離した。フルクトースｔｒ＝１３．１５分、グルコースｔｒ＝１２．１２分、二糖ｔｒ＝９．４０分、三糖ｔｒ＝８．２４分、多糖ｔｒ＝７．０１分のパターンを利用した。色素分画を２０ｍＭリン酸（ｐＨ７）で平衡化したＭＥＲＣＫのＴＳＫ−ｂｕｔｉｌｏカラムで分離し、次いで、マトリックスに保持されたものを無水エタノールで溶出した。得られた生成物の吸収スペクトル（エタノール１００％、ｐＨ５．００）は、最大４７０及び４９０ｎｍでバンドを、また５３７ｎｍで最大ピークを示し、これらはそれぞれ報告されている増殖抑制活性を有する単量体及び二量体で記載されている特性と一致する（Ｐｅｒｅｚ−Ｔｏｍａｓ，Ｒ．及びＭｏｎｔａｎｅｒ，Ｂ．２００３ Ｈｉｓｔｏｌ．Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．１８：３７９〜３８５；Ｍｏｎｔａｎｅｒ，Ｂ．及びＰｅｒｅｚ Ｔｈｏｍａｓ，Ｒ．２００３．Ｃｕｒｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ．３：５７〜６５）。単離された多糖は抑制効果を示さなかったが、プロジギオシンに対応するその分画は、用量依存的増殖抑制活性を示した。
【００４７】
（実施例６）
ＭＧ２３２７調製物の分画。増殖抑制効果を有するタンパク質生体分子から、わずか１つのクロマトグラフィー段階、即ちＮａＣｌ不連続勾配を用いるイオン交換だけで単離した
組成物ＭＧ２３２７調製物を、５０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ８．００、で平衡化したＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ ｍａｔｒｉｚに加えた。溶出は、ＮａＣｌ不連続勾配で実施した：５０ｍＭリン酸緩衝液−０．１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．００、５０ｍＭリン酸緩衝液−０．２Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．００、５０ｍＭ−２Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．００、及び、最後にマトリックスに吸収された色素分画を７０％無水エタノールで溶出した。
【００４８】
０．２ＭＮａＣｌ（ｐＨ８．０）に対応する分画と、結合せずに通過したこの分画からの最初の溶出液は、既述の試験で用量依存的増殖抑制活性を示した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動は、５０ｋＤａの高さでタンパク質バンドを、２５ｋＤａの高さで最大バンド（純度＞９０％）をそれぞれ観察した（図７Ａ）。分子量は、市販パターンの分子量をバンドの移動距離と関連づける関数により計算した、ｒ２＝０．９８４。
【００４９】
図７Ｂは、ＭＧ２３２７調製物と比較してのｐ５０及びｐ２５の増殖抑制効果を示す。ｐ５０及びｐ２５は、ＨＥｐ−２に対して増殖抑制効果を示した。
【００５０】
表２は、統計的分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用してｐ５０、ｐ２５及びＭＧ２３２７調製物の間で比較した結果を示す。それは、使用した各用量に対する応答の比較を行った。３つの分析試料の活性の間に、有意差が存在することが観察される。これらの差は使用した用量に依存する。調製物の成分の高濃度（９及び１８μｇ／ｍＬ）では、２５及び５０ｋＤａの分画の間に有意差が存在し、２５ｋＤａ分画の活性が最も高かったが、低い方の濃度（２．２５及び４．５μｇ／ｍＬ）ではこのようではなかった。
【００５１】
表２．統計的分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用してタンパク成分及びＭＧ２３２７調製物の間で比較した結果
【表２】
【００５２】
５０ｋＤａのタンパク成分及びＭＧ２３２７調製物の間には、調製物が最も活性であり腫瘍細胞の１００％の成長抑制を達成した１８μｇ／ｍＬの用量に有意差が存在し、５０ｋＤａのタンパク成分は成長の約８０％の抑制を達成した。２．２５、４〜５及び９μｇ／ｍＬの用量では、５０ｋＤａ分画及びＭＧ２３２７調製物に対して引き起こされた応答の間に、有意差は存在しなかった。
【００５３】
しかし、２５ｋＤａのタンパク質成分の活性はＭＧ２３２７調製物とは２．５、４．５及び９μｇ／ｍＬの用量で有意に異なり、２５ｋＤａのタンパク質成分は大きな生物活性を示し、１８μｇ／ｍＬの用量では両方とも同じ１００％の腫瘍細胞抑制を達成したので有意差は存在しなかった。
【００５４】
これらの結果は、２５ｋＤａのタンパク質成分は腫瘍細胞の成長を抑制する大きな能力を有し、５０ｋＤａのタンパク質成分及び両成分が独立してｉｎ ｖｉｔｒｏで生物活性を示した。
【００５５】
精製のこれらのもの（ｅｓｑｕｅｌｕ）では３種のものが得られ、同様の結果であった。
【００５６】
（実施例７）
セラリシンポリペプチドとプロジギオシンとの組成物
タンパク成分及びプロジギオシンを同じ１つの組成で製剤化し、それはその独立した形態との比較で抑制効果を有意に（ｐ＜０．００５）増加させた。図８で、ＭＧ２３２７調製物から単離された増殖抑制性生体分子及びその組成物のＩＣ５０を図示する。ＭＧ２３２７調製物は総タンパクと称され、組成物は、独立形態の成分を評価するときに用いたのと同じタンパク質とプロジギオシンとの関係を固く維持すると認められた。そのような組成物では、プロジギオシンの０．１〜１００ｎＭの１濃度に対して０．１〜１５０μｇ／ｍＬのセラリシン断片を合わせることができる。
【００５７】
（実施例８）
ｐ５０とｐ２５
ヒツジで得られた抗ｐ５０は、ｐ２５及びｐ５０の関係を知るため利用した。ＭＧ２３２７は、イミダゾール−亜鉛染色した１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに加えた（Ｈａｒｄｙ，Ｅ．，Ｓａｎｔａｎａ，Ｈ．，Ｓｏｓａ，Ａ．，Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｌ．，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｐａｄｒｏｎ，Ｃ．及びＣａｓｔｅｌｌａｎｏｓ−Ｓｅｒｒａ，Ｌ．１９９６．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２４０：１５０〜１５２）。約５０及び２５ｋＤａのタンパク質バンド（図９）を切断し、ゲル内で再生して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに加えた。これらをニトロセルロース膜に移し、ウェスタンブロットを実施した。ｐ５０の分解によりｐ２５と認められた抗ｐ５０ポリクローナル抗体の分子サイズを予備染色した分子量マーカー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で推定した。ここで示したウェスタンブロットは、３つの同等実験を代表する。
【００５８】
（実施例９）
得られたｐ５０を温度により分解した結果、ｐ５０自体が最も活性である
実施例６で得られたｐ５０を異なる温度でインキュベートし、その増殖抑制活性は前記ＭＴＴ法を用いてＨＥｐ−２で試験した。各条件（４、３７、４５及び６０℃）で生成した分解パターンは、デンシトメータで測定した。
【００５９】
分解生成物の断片の生成は温度上昇に正比例し、したがってｐ５０の量が減少したときにｐ５０の分解生成物としてのｐ２５は増加した（図１０）。ｐ５０の分解生成物は、元のｐ５０より大きな増殖抑制活性を示した（図１１）。
【００６０】
（実施例１０）
ｐ２５は、悪性腫瘍の退縮を誘導する
実施例６で記載されたクロマトグラフィーによって得られたタンパク質ｐ２５は、その均質性及び純度を検査するために逆相クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）に加えた。それは、１００分で０〜１００のアセトニトリル勾配を使用した。それは、９０％の高純度タンパク質のピークを観察し、溶出液の均一性を示す。
【００６１】
ｐ２５は次に、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８骨髄腫腫瘍を移植して完全に発達してから８日後に、ＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内注射した。ｐ２５の２２μｇ／ｋｇ体重の用量は、治療した動物の８０％で全退縮を誘導した。陰性対照は３０日の最後に死亡し、そのときには小さい腫瘍が既に発達していた。
【００６２】
（実施例１１）
ｐ５０は金属プロテアーゼであり、ｐ２５はタンパク分解活性を有しない
カゼインを基質として用いるＡｎｓｏｎ及びＭｉｒｓｋｙの修正方法（Ａｎｓｏｎ，Ｍ．Ｌ．、Ｍｉｒｓｋｙ，Ａ．Ｅ．１９３２．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１６：５９）を、我々の研究所でＴｒｉｐｓｉｎａで調整した（ｙ＝１，９３１４ｘ−０．６８２：Ｒ２＝０．９９９）。実施例６で記載したクロマトグラフィーで得られたタンパク質分画を、この方法で分析した。ｐ５０はタンパク分解活性を示したが、それは７ｍＭのＥＤＴＡで抑制され、したがってこの結果は金属プロテアーゼｐ２５は酵素活性を示さないことを示す、図１２。
【００６３】
ｐ５０及びｐ２５のタンパク分解活性を検査するために、ゼラチンを基質として用いるｃｉｍｏｇｅｎｏの方法（Ｖａｃｃａ，Ａ．、ｌｕｒｌａｒｏ，Ｍ．、Ｒｉｂａｔｔｉ，Ｄ．、Ｍｉｎｉｓｃｈｅｔｔｉ，Ｍ．、Ｎｉｃｏ，Ｂ．、Ｒｉａ，Ｒ．、Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｏ，Ａ．及びＤａｍｍａｃｃｏ，Ｆ．１９９９．Ｂｌｏｏｄ．９４：４１４３〜４１５５）を用いた。さらに、ｐ５０の分解の酵素能力も分析した。実施例６で記載したクロマトグラフィーによって得たタンパク質ｐ５０は、このアッセイで酵素活性を示した。２５ｋＤａの高さ（ＭＧ２３２７から）のゲルのタンパク質バンド分画はタンパク分解活性を示したが、クロマトグラフィーによって得たｐ２５はこの活性を示さなかった。
【００６４】
（実施例１２）
ＭＧ２３２７からの２５ｋＤａの増殖抑制ポリペプチドの同定
２５ｋＤａのバンドに存在する増殖抑制活性を有するタンパク質の同定のために、ＭＧ２３２７を加えたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（実施例８で記載）を切断した。バンドは、それが完全にｔｒａｎｓｌｕｃｅｄするまで１ｍＬのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（１００ｍＭ、ｐＨ８．５）緩衝液で５分間インキュベートした。バンドを約１ｍｍ３の小さな立方体に切断して、アセトニトリルで吸収し、１２．５ｎｇ／μＬの濃度までトリプシン又はＬＥＰを含む重炭酸アンモニウム（２５ｍＭ）の最小量で再水和した。ゲル内の消化は、３７℃で１８時間、温度調節ミキサー内でインキュベートした。
【００６５】
ＬＥＰ消化のペプチド生成物は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳで分析した。最も強いシグナルのモノアイソトピックイオンは、配列データベース内の関心タンパク質の同定のためにＰｒｏＦｏｕｎｄプログラムに導入した。データベース内の探索の間、我々は非分類的制限は実施しなかったが、セラチアマルセッセンスＥＣ３．４．２４．４０の５０ｋＤａプロテアーゼは主要な類似体として移転可能であった。タンパク質のＮ末端領域に属する４つのペプチド類（５１〜５７、５８〜６６、６７〜８０及び８１〜９０）及びＣ末端領域に属する１つ（４０２〜４０９）。ＥＣ ３．４．２４．４０の分子サイズは分析したバンドでの移動度の低下として示される（ほぼ２５ｋＤａ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる推定）。これらの知見は、セラリシンファミリーに属する５０ｋＤａのＥＣ．３．４．２４．４０のタンパク質と同様に、２５ｋＤａのバンドは２５ｋＤａの２つの共泳動断片を含むことを示唆する。
【００６６】
この仮説を確認するために、トリプシン消化のタンパク質の２５ｋＤａバンドを作製した。取り出したペプチドのＥＳＩ−ＭＳスペクトルを解読して、最も強いシグナルをＰｒｏＦｏｕｎｄプログラムへ導入した。結果は以前に同定されたものと同じタンパク質を示した（ＥＣ３．４．２４．４０）。トリプシン消化の配列カバー（２１％）は、以前の消化（１０％）よりも大きかった。配列カバーマップは、タンパク質のトリプシン分解フラグメントＰＲＺＮ＿ＳＥＲＭＡ／ＰＲＺＮ＿ＳＥＲＳＰのいくつかと非常に一致した７つのペプチドを証明した。それらのうちの５つ（２８〜４１、５８〜６６、６７〜８０、８１〜９０及び１６３〜１７１）はＮ末端領域に対応し、残りの２ペプチド（３５１〜３７３及び３７４〜３９３）はＣ末端領域に対応した。これらの結果は以前のタンパク質の同定を確証するだけにとどまらず、マップカバーは、分析したバンド内の、ＰＲＺＮ＿ＳＥＲＭＡ／ＰＲＺＮ＿ＳＥＲＳＰと同定されたタンパク質の２つの２５ｋＤａの共泳動断片の存在を示唆する。
【００６７】
前に指摘したタンパク質のＮ末端及びＣ末端の領域のペプチドに対応するＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳスペクトルが都合よく（ｈａｎｄｌｙ）説明され、部分（ｐａｒｃｉａｌ）配列がその同定により取り出された、表３。
【００６８】
表３．２５ｋＤａバンドに存在する５つのペプチドのＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳスペクトルの解釈マニュアル。１〜４のペプチドはＰＲＺＮ＿ＳＥＲＭＡ／ＰＲＺＮ＿ＳＥＲＳＰタンパク質のＮ末端領域に付属し、５のペプチドは、この同じタンパク質のＣ末端領域に対応する。
【表３】
【００６９】
使用した方法及び得られた結果から、我々は、分析した２５ｋＤａバンドには、タンパク質Ｎ末端及びＣ末端の類似のＰＲＺＮ＿ＳＥＲＭＡ／ＰＲＺＮ＿ＳＥＲＳＰを有する断片を有するタンパク質混合物が存在すると結論した。
【００７０】
（実施例１３）
ｐ５０の同定
増殖抑制活性を有するタンパク質ｐ５０を特定するために、実施例６で記載した精製プロトコルから得られた５０ｋＤａタンパク質に対応するタンパク質分画を、Ｌｙｓ−Ｃエンドプロテイナーゼで消化した。ペプチドの同定は、自動Ｅｄｍａｎ Ｄｅｇｒａｄａｃｉｏｎによる配列決定及びＦＡＢキャノンを備えるＪＭＳ ＨＸ−１１０二重セクター質量分析計で実施した。これらの結果とＳｗｉｓｓｐｒｏｔ及びＰＩＲソフトウェアで実施したアラインメントから、このタンパク質は５０ｋＤａの分子量を有するセラリシンファミリーであると結論づけた。主要な類似は、ＳｗｉｓｓｐｒｏｔバンクのＰＲＺＮ＿ＳＥＲＳＰ及びＰＲＺＮ＿ＳＥＲＭＡ識別子を有する種で見られた。質量分析計によって分析されたすべてのペプチドの分子質量は、同時だった予想する、Ｌｙｓ−Ｃエンドプロテイナーゼによるこれらの消化タンパク質のペプチドの期待理論（ｅｘｐｅｃｔ ｔｅｏｒｉｃｓ）値に一致した。
【００７１】
（実施例１４）
クロマトグラフィーによる精製ｐ２５の同定
増殖抑制、アポトーシス及び抗血管新生活性を有する２５ｋＤａタンパク質を同定するために、実施例６で記載したＤＥＡＥクロマトグラフィーにより精製したｐ２５を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに加えた。タンパク質バンドは５００μＬの水で５分間洗浄し、次にクエン酸溶液１００ｍＭで脱色し、その後ｍｉｌｌｉＱ水で新しく洗浄して、約１ｍｍ３の小さな立方体に切断した。次に、脱水されて過剰分が除去されるまでアセトニトリルを添加した。ゲル立方体を蒸発遠心機で完全に脱水し、その後、１２．５ｎｇ／μＬの濃度のトリプシンを含む炭酸水素アンモニウム溶液（５０ｍＭ）中で再水和した。温度調節した攪拌機（ｍｉｎｇｌｅｒ）中で３０分インキュベートした後、３７℃で終夜インキュベートした。
【００７２】
ペプチドを受動的に避けて、２０μＬの炭酸水素アンモニウム溶液を加え、さらに３７℃で４５分間インキュベーションした。ペプチドはＺｉｐＴｉｐｃ１８（商標）を用いて取り出し、その後５μＬの遊離ギ酸を加えて混合反応液を酸性化し、ＺｉｐＴｉｐｃ１８（商標）を用いて新たにペプチドを除去した。ＺｉｐＴｉｐｃ１８（商標）に付着したペプチドは５％ギ酸溶液で連続的に洗浄し、その後、１％ギ酸を含む６０％アセトニトリル溶液の２〜３μＬの量で除いた。
【００７３】
消化の間に形成されたペプチドは、（ＱＴＯＦ−２（商標））ナノスプレーファウンテンを備えた直交性幾何学的ハイブリッド質量分析計のイオン化ファウンテンを導入する金被覆のホウ珪酸毛細管に注入した。
【００７４】
ＥＳＩ−ＭＳマススペクトルは、１秒間に３５０〜２０００Ｄａの範囲で得られた。最も強いシグナルは、その後部ＥＳＩ−ＭＳＭＳ配列で選択された。使用した衝突ガスはアルゴンであり、それは選択されたペプチドの広範囲の断片化を生成するために適当な衝突エネルギーを用い、データベース内での明確な特定を可能にする。
【００７５】
ＥＳＩ−ＭＳスペクトルを解読してＤＴＡフォーマットに送り、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｍａｓｓ Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ（ＰＭＦ）の手法によるＳＷＩＳＳＰＲＯＴ及びＮＣＢＩｎｒデータベース内のタンパク質の同定のためにＭＡＳＣＯＴプログラムへ入れた。このタンパク質を正確に同定するために、トリプシンで自己タンパク質分解したペプチドを内部標準とした較正を使用し、誤差は０．０５Ｄａに固定して、そのスペクトル中に認められたペプチドを検討し、ベースピークの強度より１０％高い強度のシグナルを選択した。
【００７６】
分析したバンドに存在する４つのペプチドは、ＥＳＩ−ＭＳＭＳにより配列決定をした（表４）。Ｃ末端領域（表６の配列で赤で示す）に関するタンパク質のこれらのペプチド類ＰＲＺＮ＿ＳＥＲＭＡ／ＰＲＺＮ＿ＳＥＲＳＰは、前の実施例で同定されている。
【００７７】
表４．ＥＳＩ−ＭＳＭＳで配列決定をされたＳ．マルセッセンスのｐ２５に関するペプチド
【表４】
【００７８】
同様に、配列決定はしていないが、他のシグナルが認められ、その質量値は、タンパク質Ｃ末端領域のＰＲＺＮ＿ＳＥＲＭＡ／ＰＲＺＮ＿ＳＥＲＳＰと同定されたトリプシン性ペプチドへの質量期待値と非常によく一致する、表５（表６では青で記す）。これらのペプチドの間に、ＰＲＺＮ＿ＳＥＲＭＡ／ＰＲＺＮ＿ＳＥＲＳＰタンパク質Ｃ末端のペプチドと一致した、ロードされた二重シグナルが現れる。ＰＲＺＮ＿ＳＥＲＭＡ／ＰＲＺＮ＿ＳＥＲＳＰタンパク質Ｎ末端領域に特異的な切片に帰属させることのできるペプチドは見られなかった。
【００７９】
表５．ＥＳＩ−ＭＳスペクトルで検出したＰＲＺＮ＿ＳＥＲＭＡタンパク質に属するトリプシン性ペプチド類
【表５】
【００８０】
この実施例で示した方法及び結果は、増殖抑制性の強いｐ２５バンドのＤＥＡＥクロマトグラフィーで精製された中には、タンパク質の２５ｋＤａのＣ末端断片のＰＲＺＮ＿ＳＥＲＭＡ／ＰＲＺＮ＿ＳＥＲＳＰが存在することを確証することができる。
【００８１】
表６．ＤＥＡＥクロマトグラフィーによって得られたｐ５０及びｐ２５の同定
配列内には、成熟タンパク質には存在しないアミノ酸が見られる。これらのアミノ酸がない場合は、ＰＲＺＮ＿ＳＥＲＳＰ及びＰＲＺＮ＿ＳＥＲＭＡタンパク質の分子量はそれぞれ５０５９５．４Ｄａ及び５０２９３．４Ｄａである。分子が異なるトリプシン性ペプチドが同定されたことは、両種が存在して共存物（ｃｏｅｘｉｓｔｉｒ）（緑（イタリック）：質量分析で同定、栗色（強調）：連続長方形中のエドマン分解による同定）を含むことを示唆する。ペプチド標識
が、実施例６で記載したクロマトグラフィーによって得られたｐ２５で特定された。ペプチド標識
及び下線は、実施例６で記載したクロマトグラフィーによって得られたｐ５０で特定され、（イタリックの）ペプチドはゲル断片から特定された。
【表６】
【００８２】
（実施例１５）
Ｎ末端及びＣ末端の２５ｋＤａタンパク質
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの２５ｋＤａでＰＲＺＮ＿ＳＥＲＭＡ／ＰＲＺＮ＿ＳＥＲの分解の一部と共存する可能性のあるタンパク質の分子の大きさを測定するために、その配列を作製してＧｅｎＲｕｎプログラムに導入した。２５ｋＤａ（±２ｋＤａ）のＮ及びＣ末端に対応する断片を表７で示す。
【００８３】
表７．２５±２ｋＤａの大きさのタンパク質、ファウンテンからＰＲＺＮ＿ＳＥＲＭＡ／ＰＲＺＮ＿ＳＥＲＳＰ分解の一部。分子量はＧｅｎＲｕｎプログラムを介してＮ及びＣ末端の一部で測定した。最終。
【表７】
【００８４】
（実施例１６）
ＭＧ２３２７によって誘導されるアポトーシス
ＭＧ２３２７は骨髄腫Ｘ６３でアポトーシスを誘導し、断片化ＤＮＡ、ミトコンドリア及び微小管を含む。
【００８５】
腫瘍細胞死の種類を決定するために、マウス骨髄腫Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８細胞（２＊１０７）をｉｎ ｖｉｔｒｏで２２μｇ／ｍＬのＭＧ２３２７で処理した。処理された細胞及び非処理の細胞を異なる時間での超微細透過型電子顕微鏡観察のために調製し、ゲノムＤＮＡはＤＮＡラダリングアッセイのために抽出した。
【００８６】
ＤＮＡ断片は、２％アガロースゲル電気泳動によって評価した。アポトーシスは、典型的なヌクレオソーム間距離の１８０〜２００ｂｐの細胞ＤＮＡラダリングをしばしば含む（Ｓｏｌｄａｔｅｎｋｏｖ，Ｖ．Ａ．Ｐｒａｓａｄ，Ｓ．Ｖｏｌｏｓｈｉｎ，Ｙ及びＤｒｉｔｓｃｈｉｌｏ，Ａ．１９９８．Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．５：３０７〜１２）。図１３で示すように、オリゴヌクレオソームで有意な増加が観察され、それは培養中の形態学的変化と相関して電顕法によって確証された。
【００８７】
ヌクレオソーム間断片化の前には、光学顕微鏡検査で検出されるアポトーシスの形態学的徴候が見られた。さらに、顕微鏡写真は変化した細胞質内オルガネラ（ミトコンドリア、２ｈ）を示し、これもクロマチン凝集（４ｈ）及びヌクレオソーム間断片化（６ｈ）に先行した。
【００８８】
ＭＧ２３２７は微小管及びミトコンドリアの超微細組織に影響を及ぼし、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８細胞のアポトーシスを増加させる。
【００８９】
非処理細胞は、典型的なミトコンドリアの超微細構造を示した−明らかに可視のミトコンドリアのクリステ及び細胞質全体に均一に分布した高密度のミトコンドリア基質（図１４Ａ）。
【００９０】
ＭＧ２３２７で処理した細胞は、拡大したミトコンドリア、低い基質密度及びかなり影響を受けたクリステ形態を示した（図１４Ｂ〜Ｅ）。これらの超微構造変化は、大部分は機能障害性オルガネラを示す。
【００９１】
さらに、我々は処理の２時間後に広範囲な細胞質内の液胞を観察し、小胞体はミトコンドリア及び核構造とみなした（図１４Ｂ）。
【００９２】
異なる形態学的変化が、処理から６時間後に核で観察された（クロマチン凝縮、融合及びラダリング）。ＭＧ２３２７で処理したＰ３Ｘ６３Ａｇ８細胞の後期アポトーシス顕微鏡写真（８時間）では、クロマチンの外観はコンパクトであった（図１４Ｆ）。出芽は、どの時間でも検出されなかった。
【００９３】
興味深いことに、２時間処理したＰ３Ｘ６３Ａｇ８細胞上のミトコンドリアは細胞膜周辺に集まり（図１４Ｂ〜Ｅ）、これは微小管破壊及びこのオルガネラに沿ったミトコンドリア輸送の妨害から生じた。（Ｓｃｈａｔｔｅｎ，Ｈ．及びＬｅｗｉｓ，Ｍ．Ｌ．２００１ Ａｃｔａ Ａｓｔｒｏｎａｕｔ．４９：３９９〜４１８）。
【００９４】
図１４Ｃ及びＤは、内部のミトコンドリア膜に結合した凝縮構造を抱える、より大きなミトコンドリアを示す。これらの構造物は、連続したクリステ融合によって生成されたものであろう。ＭＧ２３２７は、拡大しながらのミトコンドリア外膜の膨張後のシトクロムＣのサイトゾルへの放出と、続くカスパーゼ活性化及びアポトーシスによってアポトーシスを起こすことができた（Ｇｒｅｅｎ，Ｄ．Ｒ．及びＲｅｅｄ，Ｊ．Ｃ．１９９８．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２８：１３０９〜１３１２．レビュー）。
【００９５】
拡大することなく、シトクロムＣは融合後の膜間腔及びクリステの間の接合点を通って、ミトコンドリアの損傷したクリステからサイトゾルへ完全に、迅速に放出されもした（Ｓｃｏｒｒａｎｏ，Ｌ．、Ａｓｈｉｙａ，Ｍ．、Ｂｕｔｔｌｅ，Ｋ．、Ｗｅｉｌｅｒ，Ｓ．、Ｏａｋｅｓ，Ｓ．Ａ．、Ｍａｎｎｅｌｌａ，Ｃ．Ａ．及びＫｏｒｓｍｅｙｅｒ，Ｓ．Ｊ．２００２．Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ．２：５５〜６７）。記載した方法は、ＭＧ２３２７によって生成されたアポトーシスシグナルの細胞への伝達を有意に増幅した。
【００９６】
（実施例１７）
ｐ２５及びｐ５０はアポトーシスを誘導する
ＭＧ２３２７によって誘導されるアポトーシス事象におけるｐ２５及びｐ５０の役割を確かめるために、それらを個々に異なる濃度でＰ３Ｘ６３Ａｇ８細胞に投与して、電顕法により分析した。すべての場合において、クロマチン凝縮、損傷したミトコンドリアクリステ及び集合したミトコンドリアが検出された。実際、ＭＧ２３２７によるアポトーシス誘導は、これらの２つのタンパク質の影響に関係する。
【００９７】
（実施例１８）
ＭＧ２３２７の抗血管新生効果及び抗増殖性ポリペプチド
マトリゲル内の管状構造物の発達
ヒト微小脈管構造由来のヒト内皮細胞（ＨＭＥＣ）を、ＭＧ２３２７、ｐ２５及びｐ５０の非細胞傷害性濃度の下で培養した後に、マトリゲル上の内皮コード形成について評価した（Ｃｒｕｍ Ｒ、Ｓｚａｂｏ Ｓ、Ｆｏｌｋｍａｎ Ｊ．１９８５．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２３０：１３７５〜８、Ｖａｃｃａ，Ａ．、Ｒｉｂａｔｔｉ，Ｄ．、Ｐｒｅｓｔａ，Ｍ．、Ｍｉｎｉｓｃｈｅｔｔｔｉ，Ｍ．、Ｉｕｒｌａｒｏ，Ｍ、Ｒｉａ，Ｒ、Ａｌｂｉｎｉ，Ａ、Ｂｕｓｓｏｌｉｎｏ，Ｆ．及びＤａｍｍａａｃｃｏ，Ｆ．１９９９．Ｂｌｏｏｄ ９３：３０６４）（Ｓａｎｚ．Ｌ．、Ｐａｓｃｕａｌ，Ｍ．、Ｍｕｎｏｚ，Ａ．、Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｍ．Ａ．、Ｓａｌｖａｄｏｒ ＣＨ、Ａｌｖａｒｅｚ−Ｖａｌｌｉｎａ Ｌ．２００２．Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６３：３３５〜３３９）。結果は、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ Ｅｘｐｒｅｓｓ ４．５パッケージを用いて計算した管状構造物の長さ及びそれらの間の接続の数を考慮した。それらは、ＭＧ２３２７調製物並びにそのｐ２５及びｐ５０分画による処理後の内皮細胞の分化又は成熟の有意な抑制（ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡ）を示した（図１５）。
【００９８】
（実施例１９）
増殖性細胞に及ぼすＭＧ２３２７の間接効果
ＭＧ２３２７は、Ｂａｌｂ／ｃマウスを骨髄性腫瘍移植片から保護する。
【００９９】
移植された腫瘍に対するＭＧ２３２７の保護活性を分析するために、Ｂａｌｂ／ｃマウスを異なる免疫化スケジュールの下でこの抗腫瘍調製物の１ｍｇ／ｍｌで接種した（腹腔内）。毎週１用量及び２用量を３週間投与し、用量間は少なくとも３日空けた。陰性対照群は、１×ＰＢＳで接種した。２００万のＰ３Ｘ６３Ａｇ８骨髄腫細胞を、第１の用量の１５０日後（５カ月後）に実験群（治療群及び対照群）へ腹腔内接種をした。陰性対照群からのすべてのマウスは最初の２５日内に死に、一方、治療動物の１００％は腫瘍が形成されずに生存した。（図１６）。
【０１００】
（実施例２０）
他のセラリシンのＣ末端ドメインも細胞傷害効果を有するがタンパク質分解活性はない
ＡＴＣＣ１４７５６系統を実施例２に従ってＣＭＩＢ４２０２系統と類似した条件の下で培養し、その培養液上清を実施例６で記載したように処理した。両方の調製物において、我々は５０ｍＭリン酸−０．２Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．００、で溶出した５０ｋＤａレベルのタンパク質を観察した。これらのタンパク質は、１０ｍＭのＥＤＴＡで抑制され、５μＭのＺｎ２ＳＯ４で回復された酵素活性を示した。両タンパク質をＣＮＢｒで化学的に消化したが消化パターンは類似していて、配列の内部メチオニンから分子の末端までのｐ５０のＣ末端に対応する約２５ｋＤａの類似した断片を生成した。
【０１０１】
消化から得られた断片を、４８時間の透析を通して緩衝液の変化で再生した。これらの断片の生物活性を、それらの存在下で７２時間インキュベートしたＨＥｐ−２細胞を用いて、本明細書で記載した細胞傷害性アッセイで試験した。５ｍＭ ＥＤＴＡの存在下で消化により産生されたタンパク質分解活性のない断片は、用量依存性で、完全なｐ５０分子のそれの約２．５倍の高い細胞傷害活性を示した。一旦それらの配列が分かれば、これらの断片は化学合成又は組換え手法によって得ることもできる。
【０１０２】
（実施例２１）
セラリシン断片と抗体又は抗体断片との組合せ
実施例６及び２０で得られたポリペプチド断片を、モノクローナル抗体ＣＢ／ｉｏｒ−ＣＥＡ．１（Ｔｏｒｍｏ ＢらＡＰＭＩＳ ９７：１０７３〜１０８０、１９８９）、その可変部、及び組換えＤＮＡ技術によってその配列から得られた抗体断片（ｄｉａｂｏｄｙ）（ＷＯ０３／０９３３１５）と化学的にコンジュゲートした。コンジュゲートした生体分子は、実施例３で記載したものと類似した抗増殖アッセイを通してヒト腫瘍細胞系ＬｏＶｏ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２２９）、ＡｓＰＣ−１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６８２）及びＬＳ １７４Ｔ（ＡＴＣＣ ＣＬ−１８８）で分析したが、これらのすべては培養内にＣＥＡを発現した。コンジュゲートした断片は、非コンジュゲート型断片のそれらと同等の細胞傷害性濃度で用いると用量依存的反応を示したが、非コンジュゲート型分子では抗増殖反応は観察されなかった。コンジュゲートした断片は細胞上のＣＥＡと結合することが、細胞ＥＬＩＳＡ及び間接免疫蛍光法（ＷＯ０３／０９３３１５）のような手法を用いて明らかになった。これらの結果は、本明細書で記載したコンジュゲート体は癌の治療及び診断のために用いることができることを証明する。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図２】
【図４】
【図５】
【図６】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１】
【図３】
【図７】
【図１３】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ又は複数のセラリシンのカルボキシ末端配列、即ち配列の内部メチオニンから分子末端までの１つ又は複数のポリペプチド断片、又はここで指摘した断片の変異体を含み、抗腫瘍効果をレシピエント生物に及ぼすことができ、前記抗腫瘍効果は治療的又は予防的であることを特徴とする医薬組成物。
【請求項２】
前記セラリシン断片は遺伝子操作又は化学合成により細胞培養上清から得られる、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記断片又はそれらの変異体は、単独の、コンジュゲートした、又は混合した組成物で現れる、請求項１及び２に記載の組成物。
【請求項４】
前記セラリシン断片の変異体又は変異体修飾が化学合成、遺伝子操作又は細胞培養上清から得られる、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記セラリシン断片又はそれらの変異体は、遺伝子操作又は化学合成によって得られるキメラ又はハイブリッドの分子の一部でよい、請求項１、２、３、４に記載の組成物。
【請求項６】
ＡＲＡ１、ＡＲＡ２、ＡＲＡ３及びＡＲＡ４と命名され、配列リスト内でそれぞれ特定された配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４を含むことを特徴とし、請求項１から５までに記載の、単独の、コンジュゲートした又は混合した組成物の一部であることを特徴とする、請求項１、２、３、４及び５に記載のセラリシン断片。
【請求項７】
断片、それらに由来する遺伝的又は合成による変異体は抗腫瘍効果を誘導し、前記効果はレシピエント生物内で治療的又は予防的である、請求項６に記載のセラリシン断片ＡＲＡ１、ＡＲＡ２、ＡＲＡ３及びＡＲＡ４。
【請求項８】
前記断片は抗体、抗体断片、核酸鎖又は炭水化物若しくはタンパク質の性質を有する分子を含む組成物の一部でよく、前記断片は単独、コンジュゲート体、混合体又は挿入体であり、レシピエント生物で治療的又は予防的な抗腫瘍効果を誘導する、請求項６及び７に記載のセラリシン断片ＡＲＡ１、ＡＲＡ２、ＡＲＡ３及びＡＲＡ４。
【請求項９】
分子凝集体、単独体、それらの間の組合せ又はタンパク質若しくは炭水化物の性質を有する他の分子との組合せとしての前記組成物の一部であることを特徴とする、請求項６から８までに記載の単独の又は組み合わせたセラリシン断片ＡＲＡ１、ＡＲＡ２、ＡＲＡ３及びＡＲＡ４、又はそれらの断片。
【請求項１０】
成長因子受容体の過剰発現に関連した病理及び炎症性疾患の診断又はスクリーニングのための調製物の一部であることを特徴とする、請求項６から９までに記載の単独の又は組み合わせたセラリシン断片ＡＲＡ１、ＡＲＡ２、ＡＲＡ３及びＡＲＡ４、又はそれらの断片。
【請求項１１】
１つ又は複数のプロジギオシンを含み、前記プロジギオシンは指摘した組成物の抗腫瘍活性を強化することを特徴とする、請求項１から５までに記載の組成物。
【請求項１２】
免疫刺激剤、抗血管形成剤、アポトーシス剤、抗増殖剤、抗微生物剤、及び抗増殖性因子、アポトーシス因子、抗血管新生因子、免疫調節因子又は分化抑制因子のインデューサーとしての、請求項１から５までに記載の組成物の使用。
【請求項１】
１つ又は複数のセラリシンのカルボキシ末端配列、即ち配列の内部メチオニンから分子末端までの１つ又は複数のポリペプチド断片、又はここで指摘した断片の変異体を含み、抗腫瘍効果をレシピエント生物に及ぼすことができ、前記抗腫瘍効果は治療的又は予防的であることを特徴とする医薬組成物。
【請求項２】
前記セラリシン断片は遺伝子操作又は化学合成により細胞培養上清から得られる、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記断片又はそれらの変異体は、単独の、コンジュゲートした、又は混合した組成物で現れる、請求項１及び２に記載の組成物。
【請求項４】
前記セラリシン断片の変異体又は変異体修飾が化学合成、遺伝子操作又は細胞培養上清から得られる、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記セラリシン断片又はそれらの変異体は、遺伝子操作又は化学合成によって得られるキメラ又はハイブリッドの分子の一部でよい、請求項１、２、３、４に記載の組成物。
【請求項６】
ＡＲＡ１、ＡＲＡ２、ＡＲＡ３及びＡＲＡ４と命名され、配列リスト内でそれぞれ特定された配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４を含むことを特徴とし、請求項１から５までに記載の、単独の、コンジュゲートした又は混合した組成物の一部であることを特徴とする、請求項１、２、３、４及び５に記載のセラリシン断片。
【請求項７】
断片、それらに由来する遺伝的又は合成による変異体は抗腫瘍効果を誘導し、前記効果はレシピエント生物内で治療的又は予防的である、請求項６に記載のセラリシン断片ＡＲＡ１、ＡＲＡ２、ＡＲＡ３及びＡＲＡ４。
【請求項８】
前記断片は抗体、抗体断片、核酸鎖又は炭水化物若しくはタンパク質の性質を有する分子を含む組成物の一部でよく、前記断片は単独、コンジュゲート体、混合体又は挿入体であり、レシピエント生物で治療的又は予防的な抗腫瘍効果を誘導する、請求項６及び７に記載のセラリシン断片ＡＲＡ１、ＡＲＡ２、ＡＲＡ３及びＡＲＡ４。
【請求項９】
分子凝集体、単独体、それらの間の組合せ又はタンパク質若しくは炭水化物の性質を有する他の分子との組合せとしての前記組成物の一部であることを特徴とする、請求項６から８までに記載の単独の又は組み合わせたセラリシン断片ＡＲＡ１、ＡＲＡ２、ＡＲＡ３及びＡＲＡ４、又はそれらの断片。
【請求項１０】
成長因子受容体の過剰発現に関連した病理及び炎症性疾患の診断又はスクリーニングのための調製物の一部であることを特徴とする、請求項６から９までに記載の単独の又は組み合わせたセラリシン断片ＡＲＡ１、ＡＲＡ２、ＡＲＡ３及びＡＲＡ４、又はそれらの断片。
【請求項１１】
１つ又は複数のプロジギオシンを含み、前記プロジギオシンは指摘した組成物の抗腫瘍活性を強化することを特徴とする、請求項１から５までに記載の組成物。
【請求項１２】
免疫刺激剤、抗血管形成剤、アポトーシス剤、抗増殖剤、抗微生物剤、及び抗増殖性因子、アポトーシス因子、抗血管新生因子、免疫調節因子又は分化抑制因子のインデューサーとしての、請求項１から５までに記載の組成物の使用。
【公表番号】特表２００８−５０５１２９（Ｐ２００８−５０５１２９Ａ）
【公表日】平成２０年２月２１日（２００８．２．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５１９５９９（Ｐ２００７−５１９５９９）
【出願日】平成１７年７月５日（２００５．７．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＵ２００５／０００００３
【国際公開番号】ＷＯ２００６／００５２６８
【国際公開日】平成１８年１月１９日（２００６．１．１９）
【出願人】（３０４０１２８９５）セントロ デ インジエニエリア ジエネテイカ イ バイオテクノロジア (46)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年２月２１日（２００８．２．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年７月５日（２００５．７．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＵ２００５／０００００３
【国際公開番号】ＷＯ２００６／００５２６８
【国際公開日】平成１８年１月１９日（２００６．１．１９）
【出願人】（３０４０１２８９５）セントロ デ インジエニエリア ジエネテイカ イ バイオテクノロジア (46)
【Ｆターム（参考）】
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