セリアック病の腸内の免疫炎症性成分の選択的処置のための化合物
【課題】本発明の主な目的の１つは、セリアック病の局所的免疫炎症性成分に対する選択的作用を与える化合物を提供することである。
【解決手段】一態様において、本発明は、セリアック病の炎症化合物の処置に使用するためのアミノサリチル酸−アミノフェニルプロピオン酸化合物に関する。それらの化合物は、セリアック病において放出されるサイトカインを遮断することによって作用し、特に、食事療法に対して難治性の症状の処置、食事療法の誤り、およびセリアック病の寛解時間の減少に有用である。
【解決手段】一態様において、本発明は、セリアック病の炎症化合物の処置に使用するためのアミノサリチル酸−アミノフェニルプロピオン酸化合物に関する。それらの化合物は、セリアック病において放出されるサイトカインを遮断することによって作用し、特に、食事療法に対して難治性の症状の処置、食事療法の誤り、およびセリアック病の寛解時間の減少に有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セリアック病の腸内の免疫炎症性成分の選択的処置のための化合物に関する。
【０００２】
本発明は、小腸の最初の管の粘膜の位置に局在化する炎症性成分を有する疾患、例えばセリアック病の処置のための薬物の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
特に、本発明は、セリアック病を罹患している個体における十二指腸および近位空腸の位置で発生する炎症を選択的に減少させるのに適切な一群の分子に関する。
【０００４】
セリアックスプルー（ｃｅｌｉａｃ ｓｐｒｕｅ）としても公知である、セリアック病は、遺伝的、免疫学的および環境的要素を有する非常によく見られる自己免疫疾患である。
【０００５】
セリアック病の根底には、コムギに含まれるグルテンのタンパク質分画である、グリアジン、またはオオムギ、ライムギ、スペルト、カムートおよび他の少数の穀物に含まれる、アルコール（プロラミン）に可溶性の類似のタンパク質分画に対する永続的な過敏症がある。
【０００６】
セリアック病において、小腸の粘膜は、抗原（グリアジン）に対する曝露後に損傷を受ける。この疾患において、腸絨毛は平らになる傾向があり、埋め合わせるために陰窩が過剰に増え、腸細胞が管形状よりむしろ立方体になり、腸管腔内のリンパ球の数が増加する。
【０００７】
この疾患に付随する症状は、非常に複雑であり、胃腸領域に限定されない。実際に、一般に、下痢、潜在的な出血を伴う腹部の痛み、乳糖不耐症を含む、局所的な位置での典型的な症状は、アフタ性口内炎、骨痛、弱体化を伴う進行性の体重減少を含み得る腸以外での症状と付随して起こる。さらに、未処置または難治性のセリアック病の場合において、胃腸のリンパ腫または同様の癌を発生する危険性が存在する。
【０００８】
さらに、しばしば、セリアック病の被験体は、腸の吸収不良によって引き起こされるビタミンＡ、Ｂ１２、Ｄ、Ｅ、Ｋおよび葉酸の起こり得る欠損とともに、鉄またはフェリチンの欠損を示す場合がある。さらに、排便による脂肪の連続的な損失は、カルシウム欠損を引き起こし、１つは腎臓位置でシュウ酸カルシウム結石の形成、もう１つは骨組織の位置で骨弱化を引き起こす症状である、骨軟化症の発生を伴う起こり得る２つの合併症を発生する場合がある。
【０００９】
一定の割合の個体において、この疾患は、完全または部分的に無症状である場合があり、明らかな症状を示さないか、潜在的な形態であり、特定の事象の後に発生しやすい。
【００１０】
この疾患を誘発する抗原は公知であるので、グルテンを含む食物の摂取を単に回避することによって、関連症状の完全な寛解を得ることは可能である。
【００１１】
疾患の管理は厳重食の順守に基づくため、誰でも知っている、パスタ、パン、オオムギ、スプレトなどのグルテンを含む食物の摂取を回避するだけでは十分ではなく、例えば、増粘剤または構造化剤あるいは加工中に損失する微量物質などの食物の中に少量含まれ得るものの摂取を回避することも必須である。
【００１２】
例えば、セリアック病の患者は、バーでエスプレッソコーヒー（これはオオムギで汚染されている可能性がある）、スパイス、粉砂糖、一部の医薬品を摂取することを回避しなければならず、例えば、切手および郵便用封筒に見られる糊にも注意を払わなければならない。
【００１３】
いずれの場合においても、セリアック病の患者の食事は、十分に変化に富ませて、コメ、トウモロコシ、ソバ、キビ、アマランサス、肉、魚、野菜、果物、チーズおよびマメなどの食物のみを十分にバランスよく食べる必要がある。
【００１４】
いくつかの最近の研究によれば、食物あたり２０ｐｐｍのグルテンの臨界閾値が存在し、食物含量がそれを超えると、セリアック病の被験体にとって有害になる。コーデックス委員会は、グルテンを含まない食物をラベル付けするために２種類の閾値を想定している。第１のものは１００ｐｐｍに設定され、出発物質の中にも有害な穀物誘導体、例えばコムギデンプンなどを含む「有害性を中和された（ｄｅｔｏｘｉｆｉｅｄ）」食物に関し、有害な穀物由来の成分を含まない食物に関しては２０ｐｐｍの閾値に設定される。
【００１５】
食事および一部の基本的な行動ルールの厳守は、新しい症状の発症を予防し、一般に、個人の反応による程度の差はあるが示された様式において、発生する症状の寛解を生じる。しかしながら、症状の欠如または血清中の抗体の欠如にもかかわらず、生活全てについて食事を管理されなければならない。
【００１６】
しかしながら、食事以外に、セリアック病の被験体に現在利用可能な処置の形態はなく、特に、偶発的でもグルテンを含む食物の摂取に伴う炎症症状を抑え得る製剤が存在しない。
【００１７】
今までに試みられた少数の治療的介入の方法は、有意な結果の達成をもたらさなかった。
【００１８】
この疾患は、ヒト白血球（ＨＬＡ）ＤＱ２およびＤＱ８の抗原をコードする一部の遺伝子と厳密に関連するため、一部の処置形態は、ＨＬＡ ＤＱ２／ＤＱ８においてグルテンのペプチドの結合を阻害することを目的としている。特に、一部のＨＬＡ−ＤＱ２−遮断化合物が試験されているが、有意な結果をもたらしていない。
【００１９】
小腸の細胞間結合部の調節に関与するタンパク質であり、その発現が疾患の急性期の間に増加する、ゾヌリン拮抗薬の使用が、セリアック症候群の処置に関する文献に記載されている。しかしながら、このタンパク質に基づいた薬物は現在市場で利用可能ではない。
【００２０】
さらに、局所的な粘膜に使用するための抗炎症性薬物は、今まで、腸の末梢管である大腸の位置に局在化する慢性的腸炎の形態の処置以外の適用に見出されていない。この理由のために、クローン病および潰瘍性大腸炎を処置するための市場で利用可能な製剤は、直腸用途のための坐薬または液剤として販売されている。一方、これらの製剤が経口投与を意図される場合、それらは、消化管をインタクトに通過し、結腸のみの位置で活性成分を放出させるように、活性成分の遅延放出のために処方される。
【００２１】
従って、これらの薬物は、セリアック病において集中する炎症が局在化する腸の十二指腸部分に対する効果を有さない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
従って、臨床的必要性として、現在、セリアック病において小腸の十二指腸粘膜の位置で発生する症状に基づいた免疫炎症を抑制する薬理学的活性を与えられる物質が求められている。
【００２３】
本発明の一般的目的は、薬理学的活性を与える化合物の使用に対する新規の適切な効能を提供することである。
【００２４】
従って、本発明の主な目的の１つは、セリアック病の局所的免疫炎症性成分に対する選択的作用を与える化合物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
これらの目的を考慮して、本発明の一般的態様によれば、セリアック病の炎症性成分の選択的処置に使用するための以下の共通の化学構造
【化１】
（式中、Ｒ１およびＲ２は以下に定義され、Ｘは
【化２】
から選択され、
Ｙ、ＺおよびＲ３は以下に定義される）
を有する化合物が提供される。
【００２６】
一態様において、出願人は、式（Ａ）の化合物および本明細書の以下に記載される式（Ｉ）および（ＩＩ）を有する化合物が、特異的親和性を有すること、例えば、ＰＰＡＲガンマ（ＰＰＡＲγ）受容体についての作動薬であり、その活性化を与えることを見出した。特に、このような受容体の存在は、セリアック病を罹患している患者の十二指腸上皮細胞の位置で検出され、式（Ａ）、ＩおよびＩＩの化合物の抗炎症性効果は、炎症性サイトカインの産生の減少により示された。
【００２７】
典型的に、式（Ｉ）および（ＩＩ）の化合物は、それぞれ、アミノフェニルプロピオン酸およびアミノサリチル酸様構造を有し、セリアック病で放出されるサイトカインを遮断することにより作用する。
【００２８】
一実施形態において、式（Ｉ）および（ＩＩ）の化合物は、食事療法に対する難治性のセリアック病の処置、食事療法の誤り、およびセリアック病の寛解時間の減少において特に有用である。
【００２９】
本発明の一態様によれば、セリアック病の免疫炎症性成分を選択的に処置するための医薬を製造するための式（Ｉ）の化合物
【化３】
（式中、
Ｒ１およびＲ２は、互いに同じであるか、または異なり、−Ｈまたは１〜６個の炭素を有する直鎖もしくは分枝アルキル基からなる群より選択されるか、あるいはそれらは一緒に、５または６個の原子を有する芳香環または脂肪族環を形成し、
ＹおよびＺは、互いに同じであるか、または異なり、−Ｈ、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＯＲ３、−ＣＨ（ＯＲ３）ＣＯＯＨからなる群より選択され、
Ｒ３は、Ｈ、フェニル、ベンジル、−ＣＦ３、−ＣＦ２ＣＦ３、ビニル、アリル、１〜６個の炭素、好ましくは３〜６個の炭素を有する直鎖もしくは分枝アルキル基から選択される）
またはその混合物および薬理学的に許容可能な塩もしくはエステルの使用が提供される。
【００３０】
一実施形態において、式（Ｉ）の化合物において、
Ｒ１およびＲ２は、互いに同じであるか、または異なり、−Ｈまたは１〜６個の炭素、好ましくは１〜３個の炭素を有する直鎖もしくは分枝アルキル基からなる群より選択され、
ＹおよびＺは、互いに同じであるか、または異なり、−Ｈ、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＯＲ３、−ＣＨ（ＯＲ３）ＣＯＯＨからなる群より選択され、
Ｒ３は、Ｈ、１〜６個の炭素、好ましくは３〜６個の炭素を有する直鎖もしくは分枝アルキル基から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】生検試料においてサイトカインをコードするｍＲＮＡの存在および量を確認するために、１×ＴＢＥ中で１％アガロースゲル電気泳動を行った結果のグラフを示す。
【図２】蛍光顕微鏡によって現されるＰＰＡＲγ受容体の存在を示す。
【図３】蛍光顕微鏡によって現されるＰＰＡＲγ受容体の存在を示す。
【図４】蛍光顕微鏡によって蛍光が検出されないコントロールを示す。
【図５】蛍光顕微鏡によって蛍光が検出されないコントロールを示す。
【図６】１×アガロースゲルを用いる電気泳動によって得られた異なるバンドから推定される吸光度の値を示す。
【図７】１×アガロースゲルを用いる電気泳動によって得られた異なるバンドから推定される吸光度の値を示す。
【図８】１×アガロースゲルを用いる電気泳動によって得られた異なるバンドから推定される吸光度の値を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明の範囲内において、前記式（Ｉ）の化合物の実施形態は、添付の特許請求の範囲２〜６に与えられる。例として、実施例７および
（±）−２−ヒドロキシ−３−（３’−アミノフェニル）−プロピオン酸、
（±）−２−メトキシ−２−（４’−アミノフェニル）酢酸、
（±）−２−エトキシ−２−（３’−アミノフェニル）酢酸、
（±）−２−エトキシ−２−（４’−アミノフェニル）酢酸、
（±）−２−メトキシ−３−（４’−アミノフェニル）プロピオン酸、
（±）−２−エトキシ−３−（４’−アミノフェニル）プロピオン酸、
（±）−２−エトキシ−３−（３’−アミノフェニル）プロピオン酸
にも例示される化合物Ｈ〜Ｑが、特にプロピオン酸誘導体に関して、本発明による使用に適切である。
【００３３】
一態様において、本発明の使用に適切な式（Ｉ）の化合物のさらなる例は、国際公開ＷＯ２００７／０１０５１６号に記載され、その内容は参照として完全に本明細書に援用される。
【００３４】
本発明の別の態様によれば、セリアック病の免疫炎症性成分を選択的に処置するための医薬を製造するための式（ＩＩ）の化合物
【化４】
（式中、
Ｒ１およびＲ２は、互いに同じであるか、または異なり、Ｈ、−ＣＯ−ＣＨ３、ｎが１〜６、好ましくは１〜３の整数である−ＣｎＨ２ｎ−１、１〜６個、好ましくは１〜３個の炭素を有する直鎖もしくは分枝アルキル基からなる群より選択されるか、あるいはそれらは一緒に、５または６個の原子を有する芳香環または脂肪族環を形成し、
Ｒ３は、Ｈ、−ＣＯ−ＣＨ３、−ＮＨＯＨ、−ＯＨ、−ＯＲ６から選択され、Ｒ６は、１〜６個の炭素を有する直鎖もしくは分枝アルキル基であり、
Ｒ４は、Ｈ、１〜６個の炭素を有する直鎖もしくは分枝アルキル基から選択され、
Ｒ５、Ｒ７、Ｒ８は、Ｈ原子であり、
Ｒ３およびＲ４、Ｒ４およびＲ５、またはＲ７およびＲ８は、一緒に、ベンゼン環に縮合された環、Ｎ、Ｏからなる群より独立して選択される１〜２個のヘテロ原子を含む５または６個の原子を有する芳香環または脂肪族環のいずれかを形成する）
またはその混合物および薬理学的に許容可能な塩もしくはエステルの使用が提供される。
【００３５】
前記式（ＩＩ）の化合物の実施形態は、添付の特許請求の範囲８〜２４に与えられる。
【００３６】
例として、実施例５に例示される化合物Ａ〜Ｇが本発明の使用に適切である。
【００３７】
本発明の使用に適切な式（ＩＩ）の化合物のさらなる例は、国際公開ＷＯ２００７／０１０５１４号に記載され、その内容は参照として完全に本明細書に援用される。
【００３８】
出願人は、式ＩおよびＩＩの化合物が、セリアック病の被験体の腸粘膜の位置、特に２番目の十二指腸部分の位置で観測される免疫炎症性成分に対する特異的活性を有することを示している。
【００３９】
出願人は、式（Ｉ）および（ＩＩ）の化合物によって与えられる局所的な抗炎症活性が、炎症プロセスにおいて重要な役割、および／またはその炎症プロセスが慢性的になるのに重要な役割を果たす物質である、サイトカインの放出に対する阻害活性に関与していることをさらに示している。
【００４０】
特に、驚くべきことに、式ＩおよびＩＩの化合物が、セリアック病の被験体においてのみ、サイトカインを十分な方法で遮断するか、またはいずれかの場合において、実質的および有意に阻害するが、それらの化合物は、セリアック病以外の特定の胃腸管に影響を与える炎症性疾患を罹患している被験体において有意な活性を有さないことを見出した。
【００４１】
特に、式ＩおよびＩＩの化合物は、いわゆるプロフロゴジェン（ｐｒｏｐｈｌｏｇｏｇｅｎ）Ｔｈ１（ヘルパーＴ細胞タイプ１）サイトカインを遮断するのに適切である。なぜなら、それらの化合物は、損傷部位における免疫細胞および炎症細胞の動員に有利に働くからである。
【００４２】
この特異的活性は、セリアック病において、排除できず、免疫系が耐性を生じることができない抗原（グルテンのグルアジン分画）に対する免疫系の活性化を、Ｔｈ１タイプの炎症（ｐｈｌｏｇｏｓｉｓ）の持続が反映するという事実に帰する可能性がある。
【００４３】
セリアック病の免疫病原性に関与する典型的なプロフロゴジェンサイトカイン（Ｔｈ１）は、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６（インターロイキン１、２、６）、ＩＦＮ（インターフェロン）を含む。さらに、Ｔｈ２（ヘルパーＴ細胞タイプ２）に関連するサイトカイン、およびＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子）などのマクロファージ由来のサイトカインもまた、セリアック病に関与する。特に、ＴＮＦ−αは、プロフロゴジェンサイトカイン（その一部はかなりの毒性を与えられる）の産生を上昇させる能力に起因する慢性的な炎症性疾患の発生に重要な役割を果たす。
【００４４】
特に、セリアック病を罹患している腸粘膜試料由来のサイトカインの産生および放出に対する式（Ｉ）および（ＩＩ）の化合物の効果は、有機培養系を用いて実証されている。特に、培養に対して腸免疫対象物の生検において式（Ｉ）（ＩＩ）の化合物の１つ以上を用いることによるＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α値の有意な減少が強調されているため、フロゴシス（ｐｈｌｏｇｏｓｉｓ）の効果的な減少が示されている。
【００４５】
本発明の別の態様によれば、難治性セリアック病の被験体における炎症を処置するための医薬を製造するための上記のような式ＩまたはＩＩの化合物およびそれらの混合物の使用が提供される。
【００４６】
本発明の別の態様によれば、食事療法の誤りによって誘発される、食事療法中のセリアック病の被験体における炎症性反応を処置するための医薬を製造するための上記のような式ＩまたはＩＩの化合物およびそれらの混合物の使用が提供される。
【００４７】
本発明の別の態様によれば、典型的に、１つ以上の薬理学的に許容可能な賦形剤またはアジュバントと組み合わせて、セリアック病における免疫炎症性成分を処置するため、臨床時間および／または組織学的寛解時間を短縮するための医薬を製造するための式ＩまたはＩＩの化合物およびそれらの混合物の使用が提供される。
【００４８】
本発明の１つ以上の態様に従って医薬を調製する際に、１つ以上の薬理学的に許容可能な賦形剤に加えて、薬理学的使用のための調製物の範囲内で典型的に使用される滑剤、保湿剤、懸濁化剤、分散剤、防腐剤を使用することも可能である。
【００４９】
一実施形態において、式（Ｉ）および／または（ＩＩ）の化合物は、錠剤、カプセル剤、粒状処方物、分散剤および薬理学的分野に典型的な他の処方物などの様々な形態で投与されてもよい。
【００５０】
典型的に、活性成分（Ｉ）および（ＩＩ）は、セリアック病における抗炎症性反応を達成するのに有効な量で投与に適切な処方物に組み込まれてもよい。
【００５１】
例として、活性成分は、５０ｍｇ〜２０００ｍｇの範囲、好ましくは２００〜６００ｍｇ、より好ましくは２５０〜５００ｍｇの範囲の量で医薬組成物に組み込まれてもよい。
【００５２】
式（Ｉ）および／または（ＩＩ）の１つ以上の化合物に基づいた医薬の使用は、患者および医師のコンプライアンスを改善し、寛解時間を減少させることを決定づけることが示されている。
【００５３】
別の実施形態において、式（Ｉ）および／または（ＩＩ）の化合物は、抵抗性および／または難治性のセリアック病の処置におけるさらなる治療用途を見出された。
【００５４】
以下の実施例は単に本発明の例示のみとして与えられ、添付の特許請求の範囲から明らかなように、保護の範囲を限定することを意図しない。
【実施例】
【００５５】
（実施例１）
セリアック病で観測される炎症性成分に対する、本発明の好ましい化合物の１つである、メサラジンの効果を評価した。
【００５６】
このために、疾患の活動期中の１６人の被験体およびグルテンを含まない食事療法中の臨床的寛解期中の６人の患者を選択した。
【００５７】
各研究被験体につき５つの生検断片を、ＥＧＤＳ試験により得た。
【００５８】
腸粘膜の各断片を、メサラジン（５ＡＳＡ）を含むものと、含まないものの両方で、適切な培地中の培養物に入れた。
【００５９】
次いで、以下のものを液体培地中で観測した：
異なる培地中で放出されたサイトカインのレベル、
適切に均質化された生検粘膜に存在する同じサイトカインの量。
【００６０】
（物質および方法）
（方法）
３群の被験体を評価した。
【００６１】
第１（萎縮性）の群は、抗筋肉膜および抗トランスグルタミナーゼ抗体に対して血清試験で陽性であり、セリアック病の新診断をして、グルテンを含む食事をしている２９人の被験体を含んだ。
【００６２】
第２（寛解）の群は、臨床的寛解において、少なくとも６ヶ月間、グルテンを含まない食事療法の１７人のセリアック病の被験体を含んだ。
【００６３】
第３（健康的）の群は、セリアック病を罹患していないが、胃腸管の炎症を罹患している被験体を含んだ。
【００６４】
（液体培地中のサイトカインアッセイ）
（臓器培養）
この研究患者は、ＥＧＤＳ検査によって十二指腸粘膜の５つの生検を提供した。１つは組織学的アッセイについてのものであり、他の４つ（それぞれ２つの部分に分けた）は、それぞれ、１つの培地のみ（培地Ｃ）およびグリアジンペプチドを含む培地ならびにメサラジンの存在下でグリアジンを含む培地（培地＋５ＡＳＡ Ｃ）を用いて培養に供した。
【００６５】
生検を、少なくとも３回、生理食塩水で２分間洗浄した。その生検を、１ｍｌに相当する体積を有する培地に入れた：
培地（ＲＰＭ１１８６０＋ウシ胎仔血清＋ペニシリン／ストレプトマイシン）、
培地＋グリアジンまたは３１〜４３または他の穀物のペプシン−トリプシン消化物、
培地＋メサラジン（５−ＡＳＡ）、
培地＋グリアジンのペプシン−トリプシン消化物＋５−ＡＳＡ（培地１ｍｌあたり１．５〜８．０ｍｇ）。
【００６６】
生検を、４時間〜７２時間の間、３７℃の温度でＯ２（９５％）およびＣＯ２（５％）雰囲気下でインキュベートする。
【００６７】
３つの異なる量の培地を、培地に放出されたＴｈ１およびＴｈ２サイトカインのＥＬＩＳＡアッセイについて共有する。
【００６８】
（ホモジネートからのサイトカインアッセイ）
３７℃の温度で４時間〜７２時間のインキュベーション時間の後、生検断片を２分間、生理食塩水で３回洗浄し、生検を機械的または化学的分解により均質化する。遠心分離を実施し、上清を回収し、１．５ｍｌのエッペンドルフに移す。粘膜組織中の固定されたサイトカインをＥｌｉｓａアッセイにより分析する。
【００６９】
（結果）
見出されるデータは、培地中のメサラジンの存在が、セリアック病の被験体のみにおいてサイトカインを遮断し、従って、セリアック病の被験体から得た試料において選択的に炎症性成分の減少を決定づけることを示す（表１）。
【００７０】
【表１】
【００７１】
【表２】
【００７２】
【表３】
【００７３】
【表４】
【００７４】
達成された炎症性成分の減少により、メサラジンの単独の使用または全ての緩慢もしくは困難な臨床的解決の症例における治療支持としての使用が可能になる。
【００７５】
（実施例２）
（サイトカインの遺伝子発現）
胃内視鏡検査処置の間に患者から得た生検の十二指腸断片を、５−ＡＳＡ薬物の非存在下および存在下で、４８時間、３７℃で培養物中に入れた。培養後、断片を、フェノールおよびグアニジン（Ｉｓｏｌ−ＲＮＡ溶解試薬）からなる単相溶液中で均質化した。
【００７６】
ホモジナイザーＩＫＡ Ｔ１０−Ｕｌｔｒａ Ｔｕｒｒａｘを、均質化のために使用した。
【００７７】
全ての不溶性物質を遠心分離により溶液から分離し、上清を無菌の試験管に移し、それに、溶解物１ｍｌあたり２００μｌのクロロホルムを加えた。
【００７８】
短時間の機械的攪拌後、試料を室温で数分間静置させ、その後、４℃で１５分間、１２０００ｒｐｍで遠心分離した。ＲＮＡを含む無機段階を無菌の試験管に移して行った。
【００７９】
ＲＮＡを、溶解物１ｍｌあたり５００μｌのイソプロピルアルコールを加えることにより沈殿させた。試料を、室温で１０分間インキュベートし、次いで、４℃で１５分間、１２０００ｒｐｍで遠心分離した。
【００８０】
上清を除去した後に、ＲＮＡ沈殿物を、溶解物１ｍｌあたり１０００μｌの７５％エタノールで洗浄し、機械的に攪拌し、４℃で５分間、７５００ｒｐｍで遠心分離した。最終的に、エタノールを除去し、ＲＮＡ沈殿物を化学フード下で空気乾燥させた。
【００８１】
ＲＮＡを、適切な量のＲＮａｓｉを含まない水に再懸濁した。
【００８２】
ＲＮＡの濃度を、分光光度計で２６０ｎｍでの吸収を測定することにより決定し、異なるＲＮＡ鋳型についてのＡ２６０／Ａ２８０の比を評価した。
【００８３】
（ＲＴ−ＰＣＲ）
ｃＤＮＡを、適切な体積のＲＮａｓｉを含まない水に希釈した異なる量の抽出したＲＮＡから開始して合成した。関連遺伝子（サイトカイン）のｃＤＮＡを、特異的プライマーを使用してＰＣＲにより増幅させた。
【００８４】
マスタースクリプト ＲＴ−ＰＣＲ系（５プライマー）をＲＴ−ＰＣＲに使用した。
【００８５】
生検試料においてサイトカインをコードするｍＲＮＡの存在および量を確認するために、１×ＴＢＥ中で１％アガロースゲル電気泳動を行った。
【００８６】
得られた結果を図１のグラフに示す。
【００８７】
（実施例３）
（セリアック病患者の十二指腸上皮細胞におけるＰＰＡＲγ受容体の存在）
ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γは、核内受容体のスーパーファミリーに属し、それは、エストロゲン、糖質コルチコイド、甲状腺ホルモン、ビタミンＤ３およびレチノイン酸についての受容体ならびに脂質代謝の異なる生成物を結合できる受容体（例えば、ＰＰＡＲおよびＬＸＲ受容体）を含む。
【００８８】
特に、ＰＰＡＲファミリーは、異なる組織分布および異なるリガンド特異性を有する３つのサブタイプ（ＰＰＡＲα、βまたはδおよびγ）を含む。
【００８９】
ＰＰＡＲγおよびαの両方は、分化したヒトマクロファージにおいて発現され、それらは、炎症性反応に関係する遺伝子を調節し、マクロファージの分化を調節する。
【００９０】
異なるＰＰＡＲγ作動薬は、ヒトの単球において炎症性サイトカインの産生を阻害し、活性化マクロファージにおけるＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１ｂ、ｉＮＯＳ、ゼラチンＢ、スカベンジャー受容体ＡおよびＣＯＸ−２についての遺伝子発現を減少させ、ＰＰＡＲγの抗炎症性の役割を確認する。
【００９１】
主な目的の１つは、セリアック病患者の十二指腸上皮細胞においてこのような受容体の存在を検出することであり、式（Ａ）、Ｉ、ＩＩの化合物の抗炎症性効果および炎症性サイトカインの産生の減少によって現れる５−ＡＳＡの特異性は、以前に確認されている。
【００９２】
（免疫蛍光）
十二指腸生検断片を、グルテンを含む食事をしているセリアック病の患者およびセリアック病を罹患していない被験体（コントロール群）の両方からＥＧＤＳ処置により取得した。生検断片を洗浄し、ＯＣＴに配向し、−８０℃で保存した。５μｍのいくつかの断片を、各々の凍結した生検切片（セリアック病の患者およびその疾患を罹患していない被験体の両方からＥＧＤＳ工程で得た）から得て、その断片をＰＰＡＲγ一次抗体に一晩（適切な固定および特異性除去の処置後）、曝露した。
【００９３】
ＰＢＳで洗浄した後、試料を、約１時間、二次フルオレセイン抗体ＡＬＥＸＡ ４８８とともにインキュベートした。一次抗体がＰＰＡＲγ受容体に結合する場合において、存在する場合、一次／二次抗体複合体が形成され、顕微鏡によって観測可能な断片上の蛍光として現される。
【００９４】
蛍光顕微鏡によって現されるＰＰＡＲγ受容体の存在は、図２および図３（写真診断）から証明される。
【００９５】
特に、図２および図３の画像において、受容体の存在は、末梢部分の断片において検出可能な蛍光シグナルによって現される。蛍光により、腸管腔の方を向いている表面上の腸細胞、腸上皮細胞の位置でＰＰＡＲγの存在が実証される。
【００９６】
セリアック病を罹患していない患者の生検は、ネガティブコントロールとして使用され、シグナルが存在せず、その結果として、顕微鏡によって分析された断片で受容体が存在しない。特に、図４および図５（コントロール）は蛍光が検出されないことを示し、これは、コントロールの健康な群の同じ腸内部分の位置において受容体が存在しないことのしるしである。
【００９７】
同じように、本明細書の以下に記載される化合物を試験し、同様の結果を得た。
【００９８】
（実施例４）
疾患の急性期で放出される炎症性サイトカインＩＬ−２、ＴＦＮ−αおよびＩＦＮ−γの遺伝子発現（ｍＲＮＡ）をモニターした。
【００９９】
特に、図６〜８に示される図は、１×アガロースゲルを用いる電気泳動によって得られた異なるバンドから推定される吸光度の値（ＩＭＡＧＥ Ｊ）を示し、この研究のサイトカイン増幅対象に関連する。
【０１００】
サイトカインの遺伝子発現は、セリアック病を罹患している患者の十二指腸の生検の抽出されたＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲによって評価される。このような生検は、５−ＡＳＡ薬物が加えられる、グリアジンのトリプシン消化物（ＰＴ）を含む培地およびＰＴ培地の両方において、４８時間、３７℃で増殖を維持されている。
【０１０１】
（結果）
３つの図により、生検断片が薬物の存在下において培地中に維持され、疾患急性期に放出される炎症性サイトカインＩＬ−２、ＴＦＮ−αおよびＩＦＮ−γの遺伝子発現（ｍＲＮＡ）が十分に減少されることが示される。
【０１０２】
患者が、薬物でのより持続的かつ一定の処置を受けている場合に、この減少が増加する。
【０１０３】
（実施例５）
（ＰＰＡＲγ活性化／発現ならびに細胞増殖およびアポトーシスの調節に対する本発明による化合物の効果の研究）
（物質および方法）
化合物Ａ−Ｇ
５−ＡＳＡを、Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈＴＭ（Ｓｔ Ｑｕｅｎｔｉｎ Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，フランス）で購入した。ロシグリタゾンを、Ｓｐｉ ＢｉｏＴＭ（Ｍａｓｓｙ，フランス）で得た。式（ＩＩ）の範囲内である以下の化合物Ａ〜Ｇを試験した。
【化５】
【０１０４】
（細胞株）
結腸細胞株ＨＴ−２９ ＳＴＤ（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−３８）を、１０％のｈｅａｔ−ＦＣＳおよび抗生物質を補足したＤＭＥＭ中で慣例的に増殖させた。細胞を単分子層で増殖させ、５％ＣＯ２および９５％相対湿度において３７℃でインキュベートした。
【０１０５】
（ＰＰＡＲγでの一過性トランスフェクションおよび細胞の刺激）
ＨＴ−２９ ＳＴＤ細胞を、製造業者の指示書に従ってＥｆｆｅｃｔｅｎｅ ＴＭトランスフェクション試薬（Ｑｉａｇｅｎ ＴＭ）を用いて一過性トランスフェクションした。ＰＰＡＲγ活性化を試験するために、本発明者らは、シトクロムｐ４５０ ４Ａ（２ＸＣＹＰ）から得た２つのコピーのＰＰＲＥを含む５００ｎｇの最小プロモーター構築物でトランスフェクションを実施した。ウミシイタケルシフェラーゼプラスミド（０．１μｇ／ウェル）も、トランスフェクション効果をモニターするため、およびホタルルシフェラーゼ活性を正規化するための内部コントロールとしてトランスフェクションした。トランスフェクションした細胞を４８時間静置し、３７℃でインキュベートした。刺激を、３０ｍＭの濃度で化合物Ａ−Ｇを用いて、３−６−９−１２−１５−１８−２４時間の間、細胞のインキュベーション後に実施し、ポジティブコントロールとして使用した２つのＰＰＡＲγ合成リガンド５−ＡＳＡ ３０ｍＭおよびロシグリタゾン １０〜５Ｍと比較した。薬物溶液のｐＨをＮａＯＨで７．４に調整した。全細胞抽出物を、受動的溶解緩衝液（Ｐａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ）（ＰｒｏｍｅｇａＴＭ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）を用いて調製した。ルシフェラーゼ活性を、製造業者のプロトコルによるＰｒｏｍｅｇａＴＭのデュアルルシフェラーゼアッセイシステムを用いて２０μｌの抽出物中で測定した。トランスフェクションを、少なくとも３つの別々の実験において３連で分析した。ルシフェラーゼ活性を、刺激していない細胞からのルシフェラーゼ活性で割られた異なる分子で処理した細胞で得られた活性の倍数として表した。
【０１０６】
（ウェスタンブロット解析によるＰＰＡＲγおよびβ−アクチンの評価）
全タンパク質を、２％のＴｒｉｔｏｎＴＭ、フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）１００ｍＭおよび古典的プロテアーゼ阻害剤カクテルを含むＰＢＳからなる抽出緩衝液中での細胞均質化によって得た。次いで、全タンパク質を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動および電気ブロットによって分離した。二フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）膜を、ＰＰＡＲγに対するウサギポリクローナル一次抗体（１／５００希釈，ＴＥＢＵ，Ｌｅ Ｐｅｒｒａｙ ｅｎ Ｙｖｅｌｉｎｅ，フランス）とともに一晩インキュベートした。β−アクチンを、１／１０，０００で希釈したウサギモノクローナル一次抗体（Ｓｉｇｍａ）を用いて検出した。二次ペルオキシダーゼ標識抗体（１／１０００，ＤａｋｏＴＭ，Ｔｒａｐｐｅｓ，フランス）および化学発光を用いる免疫検出を、製造業者のプロトコル（ＥＣＬＴＭ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＢｉｏｔｅｃｈＴＭ，Ｏｒｓａｙ，フランス）に従って実施した。ＰＰＡＲγの吸光度の値を、同じ試料内の内部コントロールβ−アクチンの量に比例して各条件について得た。
【０１０７】
（Ｋｉ−６７免疫染色による細胞増殖の分析）
２４時間の培養後、ＨＴ−２９ ＳＴＤ細胞を、３０ｍＭで化合物Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＦを用いて２４時間、処理した。５−ＡＳＡ（３０ｍＭ）およびロシグリタゾン（１０〜５Ｍ）を、ポジティブコントロールとして使用した。分子Ｇは、その不十分な溶解性のために、この実験に含まなかった。薬物溶液のｐＨをＮａＯＨで７．４に調整した。細胞を、ＰＦＡ ４％中で固定し、４℃で０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ＴＭを含むＰＢＳ中で透過処理し、次いで、抗体の非特異的吸着を最小化するためにヤギ正常血清および遮断バッファー（ＰＢＳ中の１％ ＢＳＡ）とともにインキュベートした。
【０１０８】
細胞増殖を、Ｋｉ−６７に対するマウスモノクローナル一次抗体を用いて核のＫｉ−６７染色によって評価した（１：５０希釈、一晩；ＺＹＭＥＤＴＭ，ＣｌｉｎｉｓｃｉｅｎｃｅｓＴＭ，Ｍｏｎｔｒｏｕｇｅ，フランス）。一次抗体を、アクリジン赤蛍光色素（１：１００希釈，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＰｒｏｂｅｓＴＭ，ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭ，Ｃｅｒｇｙ Ｐｏｎｔｏｉｓｅ，フランス）と結合したＡｌｅｘａ ５９４ロバ抗マウスＩｇＧで明らかにした。核を、Ｈｏｅｓｃｈｔ ３３３４２溶液（０．１２５ｍｇ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈＴＭ）で染色し、蛍光顕微鏡（ＬｅｉｃａＴＭ，Ｂｅｎｓｈｅｉｍ，ドイツ）下で視覚化した。ネガティブコントロールは、特異的抗体の代わりに非特異的マウス血清での染色からなる。少なくとも５００細胞／試料のカウントを、１つの実験において体系的に盲目的に実施した。その結果を、染色細胞の数の平均±ＳＥＭとして表した。
【０１０９】
（アポトーシスの検出）
２４時間の培養後、ＨＴ−２９ ＳＴＤ細胞を、２４時間の間、３０ｍＭの濃度で化合物Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆを用いて処理した。５−ＡＳＡ（３０ｍＭ）およびロシグリタゾン（１０〜５Ｍ）を、ポジティブコントロールとして使用した。分子ＥおよびＧは、それらの不十分な溶解度のためにこの実験に含まなかった。薬物溶液のｐＨをＮａＯＨで７．４に調整した。アポトーシスを受けた細胞を、ターミナルトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識アッセイ（ＴＵＮＥＬアッセイ，Ｒｏｃｈｅ ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓＴＭ，Ｍｅｙｌａｎ，フランス）を用いてＤＮＡ鎖の酵素標識により同定した。少なくとも５００細胞／試料のカウントを、１つの実験において体系的に盲目的に実施した。その結果を、染色細胞の数の平均±ＳＥＭとして表した。
【０１１０】
（結果）
分子ＣおよびＦは、ＰＰＡＲγ活性化を誘導することが観測された。化合物Ｄもまた、ＰＰＡＲγを誘導するが、わずかに少ない程度である。ＰＰＡＡＲγの活性化は、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体エレメント（ＰＰＲＥ）と呼ばれる特異的ＤＮＡ配列エレメントに対する結合を導く反応のカスケードを生じる。
【０１１１】
本発明者らは、ウミシイタケルシフェラーゼＰＰＲＥプラスミドでの上皮細胞の一過性トランスフェクションによるＰＰＡＲγ転写活性を研究した。細胞を、２４時間、異なる分子で刺激した。トランスフェクションされたＨＴ−２９細胞におけるＰＰＡＲγ活性の分析により、３０ｍＭの濃度で化合物ＣおよびＦが、レポーター遺伝子活性を２倍増加させ、それにより、５−ＡＳＡおよびロシグリタゾンと同様の活性を表したことが示された。３０ｍＭの濃度で化合物Ａ、ＢおよびＧは、６時間後にＰＰＡＲγ活性化の研究を制限する上皮細胞に対する急速な細胞毒性効果を与えた。
【０１１２】
特に、分子Ｃ、ＤおよびＦは、ＰＰＡＲγ発現を誘導する。通常、全ての化合物Ａ〜Ｇは、ＨＴ−２９細胞株におけるタンパク質レベルでＰＰＡＲγ発現を誘導する能力を示す。特に、ウェスタンブロットにより定量化したＰＰＡＲγタンパク質レベルの平均２倍の誘導を、２４時間、分子Ｃ、ＤおよびＦで処理した細胞において観測した。
【０１１３】
特に、分子ＣおよびＦは、上皮細胞増殖を阻害する。本発明者は、細胞増殖の調節における分子の役割をＨＴ−２９ ＳＴＤ細胞株において評価した。細胞増殖を、増殖細胞中で発現される核タンパク質Ｋｉ−６７染色により評価し、Ｋｉ−６７の存在が細胞増殖を維持するのに必須であった。未処理の細胞と比較して、分子ＣおよびＦ（３０ｍＭ）との２４時間のＨＴ−２９細胞のインキュベーションは、細胞増殖の６７〜７５％の阻害を生じた。
【０１１４】
同様の結果を、最適濃度で使用した２つのポジティブコントロールのロシグリタゾン（１０〜５Ｍ）および５−ＡＳＡ（３０ｍＭ）で得た。分子Ａ、ＢおよびＤの潜在的抗分離促進効果の確認は、この濃度での上皮細胞に対するそれらの急速な細胞毒性効果によって制限された。
【０１１５】
化合物Ｆもまた、ＰＰＡＲγを介して上皮細胞のアポトーシスを誘発する。ロシグリタゾンおよび５−ＡＳＡと同様に、分子Ｆは、ターミナルトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）を用いてＤＮＡ鎖の分裂を標識することにより同定された８０％の上皮細胞のアポトーシスを示した。以前の実験と同様に、分子Ａ、ＢおよびＤは、３０ｍＭの阻害細胞アポトーシス分析において急速な細胞毒性効果を誘発した。
【０１１６】
（結論）
この実施例は特に、ＰＰＡＲγ発現および活性化を誘発し、上皮細胞増殖およびアポトーシスを調節する化合物ＣおよびＦの能力を示す。さらに、３０ｍＭでの化合物Ａ、Ｂ、Ｄ（およびＥ〜Ｇ）の上皮細胞に対する細胞毒性効果は、多くの種々の酵素と高い親和性を示すことが知られている高い反応性のヒドロキサム酸基の構造の存在と関連し得る。
【０１１７】
（実施例６）
（分子モデル）
分子モデル研究を、Ｓｉｌｉｃｏｎ ＧｒａｐｈｉｃｓＴＭワークステーションで作動するＳＹＢＹＬソフトウェアバージョン６．９．１（Ｔｒｉｐｏｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ＩｎｃＴＭ，ＳＴ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて実施した。５−ＡＳＡの両性イオン形態の三次元モデルを、標準的なフラグメントライブラリーから構築し、次いで、その形状を、Ｔｒｉｐｏｓ力場を用いて最適化した。化合物のｐＫａはまだ知られていないため、ＳＰＡＲＣオンライン計算機を、生理学的ｐＨ（７．４）で生じる種を決定するために使用した。イオン化化合物の三次元モデルを、標準的なフラグメントライブラリーから構築し、次いで、それらの形状を、ＧａｓｔｅｉｇｅｒおよびＨｕｃｋｅｌ原子電荷から計算される静電条件を含むＴｒｉｐｏｓ力場を用いて最適化した。Ｍａｘｉｍｉｎ２処理に利用可能なＰｏｗｅｌｌ法を、勾配値が０．００１ｋｃａｌ／ｍｏｌ．Åより小さくなるまで、エネルギー最小化に使用した。ヒトＰＰＡＲγリガンド結合ドメインの構造を、ＲＣＳＢタンパク質データバンク（１１７１）（４，５）で利用可能なテサグリタザル（ＡＺ２４２）を用いてその錯体化したＸ線結晶構造から得た。化合物の受容体活性部位へのフレキシブルなドッキングを、ＧＯＬＤソフトウェアを用いて実施した。最も安定なドッキングモデルを、ＧｏｌｄＳｃｏｒｅおよびＸ−Ｓｃｏｒｅ評価関数によって予測された最適に評価された構造に従って選択した。錯体を、勾配値が０．０１ｋｃａｌ／ｍｏｌ．Åに到達するまで、Ｔｒｉｐｏｓ力場および４．０の誘電率でＭａｘｉｍｉｎ２処理に利用可能なＰｏｗｅｌｌ法を用いてエネルギー最小化をした。アニール機能を使用して、リガンドのホット領域（ｈｏｔ ｒｅｇｉｏｎ）（１０Å）を規定する。
【０１１８】
（ドッキング研究）
化合物Ａ〜Ｇは、分子認識およびＰＰＡＲγ活性化に必要な主要な決定因子とみなされるＨｉｓ−３２３、Ｈｉｓ−４４９、Ｔｙｒ−４７３およびＳｅｒ−２８９との水素結合を介して相互作用するＰＰＡＲγ−ＬＢＤと強く適合した。
【０１１９】
式（ＩＩ）に含まれる化合物の抗炎症効果は、上皮細胞によって主に発現されるＰＰＡＲγにより媒介されることが示された。このドッキング分析により、３０ｍＭの濃度で使用される上述の化合物がＰＰＡＲγを活性化し、腸の上皮細胞によりその発現を誘導し、セリアック病の免疫炎症性成分に対する薬理作用を与えることが明らかにされた。
【０１２０】
（結論）
アミノサリチル酸構造（５−ＡＳＡ構造など）との式ＩＩの化合物の抗炎症効果は、ＰＰＡＲγにより媒介され、十二指腸の位置で上皮細胞において発現されることが以前に示されている。ドッキング分析に基づいた化合物Ａ〜Ｇの合理的開発により、３０ｍＭの濃度で使用される前記化合物、特にＣ、Ｆが、ＰＰＡＲγを活性化し、腸の上皮細胞によりその発現を誘導することが明らかにされた。その化合物はまた、ＰＰＡＲγ活性化による２つの重要な機構である、上皮細胞増殖を阻害し、アポトーシスを誘導する。特に、分子Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｇに関して、それらが、ＰＰＡＲγ活性化の分析ならびに細胞増殖およびアポトーシスの調節および評価を妨げる、３０ｍＭの濃度での上皮細胞に対する細胞毒性効果に関することが検出されている。
【０１２１】
（実施例７）
（ＰＰＡＲγ活性化に対する式（Ｉ）の化合物Ｈ〜Ｑの効果）
（物質および方法）
（物質）
５−ＡＳＡを、Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈＴＭ（Ｓｔ Ｑｕｅｎｔｉｎ Ｆａｌｌａｖｉｅｒ、フランス）で購入した。ロシグリタゾンを、Ｓｐｉ ＢｉｏＴＭ（Ｍａｓｓｙ、フランス）で得た。式（Ｉ）内に含まれる以下の化合物Ｈ〜Ｑを試験した。
【化６】
【化７】
【０１２２】
（細胞株）
結腸癌細胞株ＨＴ−２９ ＳＴＤ（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−３８）を、１０％のｈｅａｔ−ＦＣＳおよび抗生物質を補足したＤＭＥＭ中で慣例的に増殖させた。細胞を単分子層で増殖させ、５％ＣＯ２および９５％相対湿度において３７℃でインキュベートした。
【０１２３】
（ＰＰＡＲγでの一過性トランスフェクションおよび細胞の刺激）
ＨＴ−２９ ＳＴＤ細胞を、製造業者の指示書に従ってＥｆｆｅｃｔｅｎｅＴＭトランスフェクション試薬（ＱｉａｇｅｎＴＭ）を用いて一過性トランスフェクトした。ＰＰＡＲγ活性化を試験するために、本発明者らは、シトクロムｐ４５０ ４Ａ（２ＸＣＹＰ）から得た２つのコピーのＰＰＲＥを含む５００ｎｇの最小プロモーター構築物でトランスフェクションを実施した。ウミシイタケルシフェラーゼプラスミド（０．１μｇ／ウェル）も、トランスフェクション効果をモニタリングするため、およびホタルルシフェラーゼ活性を正規化するための内部コントロールとしてトランスフェクションした。トランスフェクションした細胞を、３７℃で２４時間のインキュベーションのために静置させておいた。刺激を、１ｍＭの濃度で化合物Ｈ〜Ｑを用いて１８時間の細胞のインキュベーション後に実施して、ポジティブコントロールとして使用した２つのＰＰＡＲγ合成リガンド５−ＡＳＡ（３０ｍＭ）およびロシグリタゾン（１０〜５Ｍ）と比較した。薬物溶液のｐＨをＮａＯＨで７．４に調整した。全細胞抽出物を、受動的溶解緩衝液（Ｐａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ）（ＰｒｏｍｅｇａＴＭ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）を用いて調製した。ルシフェラーゼ活性を、製造業者のプロトコルによるＰｒｏｍｅｇａのデュアルルシフェラーゼアッセイシステムを用いて２０μｌの抽出物中で測定した。トランスフェクションを、少なくとも３つの別々の実験において３連で分析した。ルシフェラーゼ活性を、刺激していない細胞からのルシフェラーゼ活性で割られた異なる分子で処理した細胞で得られた活性の倍数として表した。
【０１２４】
（結果）
ＰＰＡＲγの活性化は、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体エレメント（ＰＰＲＥ）と呼ばれる特異的ＤＮＡ配列エレメントに対する結合を導く反応のカスケードを生じる。
【０１２５】
本発明者らは、ウミシイタケルシフェラーゼおよびＰＰＲＥプラスミドでの上皮細胞の一過性トランスフェクションによるＰＰＡＲγ転写活性を調べた。化合物Ｈ〜ＱがＰＰＡＲγ活性化を刺激する有効性および／または５−ＡＳＡより有効かどうかを評価するために、本発明者らは１ｍＭの濃度でこれらの分子を試験した。１ｍＭの濃度での新規の分子の効果を、それぞれ３０ｍＭおよび１０〜５Ｍの最適濃度でポジティブコントロールとして使用した５−ＡＳＡおよびロシグリタゾンと比較した。細胞を、２４時間、異なる分子で刺激した。
【０１２６】
トランスフェクションされたＨＴ−２９細胞中のＰＰＡＲγ活性の分析により、１ｍＭで前記化合物４０が、それぞれ、４．８±０．７１倍、２．７３±０．３１倍、２．６４±０．４６倍、３．４±０．９７倍、受容体遺伝子活性を増加させ、それにより、３０ｍＭでの５−ＡＳＡ（２．８±０．７）および１０〜５Ｍでのロシグリタゾン（３．１７±０．２９）と同等またはそれらより優れた活性を表したことが示された。
【０１２７】
トランスフェクションされたＨＴ−２９細胞中のＰＰＡＲγ活性を増加させる本発明の式（Ｉ）の化合物に含まれる分子Ｈ〜Ｑの能力は、３０ｍＭでの５−ＡＳＡおよび１０〜５Ｍでのロシグリタゾンと同等またはそれらより優れた活性を表す。
【０１２８】
２００７年１２月２４日に出願された、詳細な説明、特許請求の範囲および図面を含む伊国特許出願第ＭＩ２００７Ａ２４２９号は、その優先権が本明細書で主張され、完全に参照によって援用される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セリアック病の腸内の免疫炎症性成分の選択的処置のための化合物に関する。
【０００２】
本発明は、小腸の最初の管の粘膜の位置に局在化する炎症性成分を有する疾患、例えばセリアック病の処置のための薬物の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
特に、本発明は、セリアック病を罹患している個体における十二指腸および近位空腸の位置で発生する炎症を選択的に減少させるのに適切な一群の分子に関する。
【０００４】
セリアックスプルー（ｃｅｌｉａｃ ｓｐｒｕｅ）としても公知である、セリアック病は、遺伝的、免疫学的および環境的要素を有する非常によく見られる自己免疫疾患である。
【０００５】
セリアック病の根底には、コムギに含まれるグルテンのタンパク質分画である、グリアジン、またはオオムギ、ライムギ、スペルト、カムートおよび他の少数の穀物に含まれる、アルコール（プロラミン）に可溶性の類似のタンパク質分画に対する永続的な過敏症がある。
【０００６】
セリアック病において、小腸の粘膜は、抗原（グリアジン）に対する曝露後に損傷を受ける。この疾患において、腸絨毛は平らになる傾向があり、埋め合わせるために陰窩が過剰に増え、腸細胞が管形状よりむしろ立方体になり、腸管腔内のリンパ球の数が増加する。
【０００７】
この疾患に付随する症状は、非常に複雑であり、胃腸領域に限定されない。実際に、一般に、下痢、潜在的な出血を伴う腹部の痛み、乳糖不耐症を含む、局所的な位置での典型的な症状は、アフタ性口内炎、骨痛、弱体化を伴う進行性の体重減少を含み得る腸以外での症状と付随して起こる。さらに、未処置または難治性のセリアック病の場合において、胃腸のリンパ腫または同様の癌を発生する危険性が存在する。
【０００８】
さらに、しばしば、セリアック病の被験体は、腸の吸収不良によって引き起こされるビタミンＡ、Ｂ１２、Ｄ、Ｅ、Ｋおよび葉酸の起こり得る欠損とともに、鉄またはフェリチンの欠損を示す場合がある。さらに、排便による脂肪の連続的な損失は、カルシウム欠損を引き起こし、１つは腎臓位置でシュウ酸カルシウム結石の形成、もう１つは骨組織の位置で骨弱化を引き起こす症状である、骨軟化症の発生を伴う起こり得る２つの合併症を発生する場合がある。
【０００９】
一定の割合の個体において、この疾患は、完全または部分的に無症状である場合があり、明らかな症状を示さないか、潜在的な形態であり、特定の事象の後に発生しやすい。
【００１０】
この疾患を誘発する抗原は公知であるので、グルテンを含む食物の摂取を単に回避することによって、関連症状の完全な寛解を得ることは可能である。
【００１１】
疾患の管理は厳重食の順守に基づくため、誰でも知っている、パスタ、パン、オオムギ、スプレトなどのグルテンを含む食物の摂取を回避するだけでは十分ではなく、例えば、増粘剤または構造化剤あるいは加工中に損失する微量物質などの食物の中に少量含まれ得るものの摂取を回避することも必須である。
【００１２】
例えば、セリアック病の患者は、バーでエスプレッソコーヒー（これはオオムギで汚染されている可能性がある）、スパイス、粉砂糖、一部の医薬品を摂取することを回避しなければならず、例えば、切手および郵便用封筒に見られる糊にも注意を払わなければならない。
【００１３】
いずれの場合においても、セリアック病の患者の食事は、十分に変化に富ませて、コメ、トウモロコシ、ソバ、キビ、アマランサス、肉、魚、野菜、果物、チーズおよびマメなどの食物のみを十分にバランスよく食べる必要がある。
【００１４】
いくつかの最近の研究によれば、食物あたり２０ｐｐｍのグルテンの臨界閾値が存在し、食物含量がそれを超えると、セリアック病の被験体にとって有害になる。コーデックス委員会は、グルテンを含まない食物をラベル付けするために２種類の閾値を想定している。第１のものは１００ｐｐｍに設定され、出発物質の中にも有害な穀物誘導体、例えばコムギデンプンなどを含む「有害性を中和された（ｄｅｔｏｘｉｆｉｅｄ）」食物に関し、有害な穀物由来の成分を含まない食物に関しては２０ｐｐｍの閾値に設定される。
【００１５】
食事および一部の基本的な行動ルールの厳守は、新しい症状の発症を予防し、一般に、個人の反応による程度の差はあるが示された様式において、発生する症状の寛解を生じる。しかしながら、症状の欠如または血清中の抗体の欠如にもかかわらず、生活全てについて食事を管理されなければならない。
【００１６】
しかしながら、食事以外に、セリアック病の被験体に現在利用可能な処置の形態はなく、特に、偶発的でもグルテンを含む食物の摂取に伴う炎症症状を抑え得る製剤が存在しない。
【００１７】
今までに試みられた少数の治療的介入の方法は、有意な結果の達成をもたらさなかった。
【００１８】
この疾患は、ヒト白血球（ＨＬＡ）ＤＱ２およびＤＱ８の抗原をコードする一部の遺伝子と厳密に関連するため、一部の処置形態は、ＨＬＡ ＤＱ２／ＤＱ８においてグルテンのペプチドの結合を阻害することを目的としている。特に、一部のＨＬＡ−ＤＱ２−遮断化合物が試験されているが、有意な結果をもたらしていない。
【００１９】
小腸の細胞間結合部の調節に関与するタンパク質であり、その発現が疾患の急性期の間に増加する、ゾヌリン拮抗薬の使用が、セリアック症候群の処置に関する文献に記載されている。しかしながら、このタンパク質に基づいた薬物は現在市場で利用可能ではない。
【００２０】
さらに、局所的な粘膜に使用するための抗炎症性薬物は、今まで、腸の末梢管である大腸の位置に局在化する慢性的腸炎の形態の処置以外の適用に見出されていない。この理由のために、クローン病および潰瘍性大腸炎を処置するための市場で利用可能な製剤は、直腸用途のための坐薬または液剤として販売されている。一方、これらの製剤が経口投与を意図される場合、それらは、消化管をインタクトに通過し、結腸のみの位置で活性成分を放出させるように、活性成分の遅延放出のために処方される。
【００２１】
従って、これらの薬物は、セリアック病において集中する炎症が局在化する腸の十二指腸部分に対する効果を有さない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
従って、臨床的必要性として、現在、セリアック病において小腸の十二指腸粘膜の位置で発生する症状に基づいた免疫炎症を抑制する薬理学的活性を与えられる物質が求められている。
【００２３】
本発明の一般的目的は、薬理学的活性を与える化合物の使用に対する新規の適切な効能を提供することである。
【００２４】
従って、本発明の主な目的の１つは、セリアック病の局所的免疫炎症性成分に対する選択的作用を与える化合物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
これらの目的を考慮して、本発明の一般的態様によれば、セリアック病の炎症性成分の選択的処置に使用するための以下の共通の化学構造
【化１】
（式中、Ｒ１およびＲ２は以下に定義され、Ｘは
【化２】
から選択され、
Ｙ、ＺおよびＲ３は以下に定義される）
を有する化合物が提供される。
【００２６】
一態様において、出願人は、式（Ａ）の化合物および本明細書の以下に記載される式（Ｉ）および（ＩＩ）を有する化合物が、特異的親和性を有すること、例えば、ＰＰＡＲガンマ（ＰＰＡＲγ）受容体についての作動薬であり、その活性化を与えることを見出した。特に、このような受容体の存在は、セリアック病を罹患している患者の十二指腸上皮細胞の位置で検出され、式（Ａ）、ＩおよびＩＩの化合物の抗炎症性効果は、炎症性サイトカインの産生の減少により示された。
【００２７】
典型的に、式（Ｉ）および（ＩＩ）の化合物は、それぞれ、アミノフェニルプロピオン酸およびアミノサリチル酸様構造を有し、セリアック病で放出されるサイトカインを遮断することにより作用する。
【００２８】
一実施形態において、式（Ｉ）および（ＩＩ）の化合物は、食事療法に対する難治性のセリアック病の処置、食事療法の誤り、およびセリアック病の寛解時間の減少において特に有用である。
【００２９】
本発明の一態様によれば、セリアック病の免疫炎症性成分を選択的に処置するための医薬を製造するための式（Ｉ）の化合物
【化３】
（式中、
Ｒ１およびＲ２は、互いに同じであるか、または異なり、−Ｈまたは１〜６個の炭素を有する直鎖もしくは分枝アルキル基からなる群より選択されるか、あるいはそれらは一緒に、５または６個の原子を有する芳香環または脂肪族環を形成し、
ＹおよびＺは、互いに同じであるか、または異なり、−Ｈ、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＯＲ３、−ＣＨ（ＯＲ３）ＣＯＯＨからなる群より選択され、
Ｒ３は、Ｈ、フェニル、ベンジル、−ＣＦ３、−ＣＦ２ＣＦ３、ビニル、アリル、１〜６個の炭素、好ましくは３〜６個の炭素を有する直鎖もしくは分枝アルキル基から選択される）
またはその混合物および薬理学的に許容可能な塩もしくはエステルの使用が提供される。
【００３０】
一実施形態において、式（Ｉ）の化合物において、
Ｒ１およびＲ２は、互いに同じであるか、または異なり、−Ｈまたは１〜６個の炭素、好ましくは１〜３個の炭素を有する直鎖もしくは分枝アルキル基からなる群より選択され、
ＹおよびＺは、互いに同じであるか、または異なり、−Ｈ、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＯＲ３、−ＣＨ（ＯＲ３）ＣＯＯＨからなる群より選択され、
Ｒ３は、Ｈ、１〜６個の炭素、好ましくは３〜６個の炭素を有する直鎖もしくは分枝アルキル基から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】生検試料においてサイトカインをコードするｍＲＮＡの存在および量を確認するために、１×ＴＢＥ中で１％アガロースゲル電気泳動を行った結果のグラフを示す。
【図２】蛍光顕微鏡によって現されるＰＰＡＲγ受容体の存在を示す。
【図３】蛍光顕微鏡によって現されるＰＰＡＲγ受容体の存在を示す。
【図４】蛍光顕微鏡によって蛍光が検出されないコントロールを示す。
【図５】蛍光顕微鏡によって蛍光が検出されないコントロールを示す。
【図６】１×アガロースゲルを用いる電気泳動によって得られた異なるバンドから推定される吸光度の値を示す。
【図７】１×アガロースゲルを用いる電気泳動によって得られた異なるバンドから推定される吸光度の値を示す。
【図８】１×アガロースゲルを用いる電気泳動によって得られた異なるバンドから推定される吸光度の値を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明の範囲内において、前記式（Ｉ）の化合物の実施形態は、添付の特許請求の範囲２〜６に与えられる。例として、実施例７および
（±）−２−ヒドロキシ−３−（３’−アミノフェニル）−プロピオン酸、
（±）−２−メトキシ−２−（４’−アミノフェニル）酢酸、
（±）−２−エトキシ−２−（３’−アミノフェニル）酢酸、
（±）−２−エトキシ−２−（４’−アミノフェニル）酢酸、
（±）−２−メトキシ−３−（４’−アミノフェニル）プロピオン酸、
（±）−２−エトキシ−３−（４’−アミノフェニル）プロピオン酸、
（±）−２−エトキシ−３−（３’−アミノフェニル）プロピオン酸
にも例示される化合物Ｈ〜Ｑが、特にプロピオン酸誘導体に関して、本発明による使用に適切である。
【００３３】
一態様において、本発明の使用に適切な式（Ｉ）の化合物のさらなる例は、国際公開ＷＯ２００７／０１０５１６号に記載され、その内容は参照として完全に本明細書に援用される。
【００３４】
本発明の別の態様によれば、セリアック病の免疫炎症性成分を選択的に処置するための医薬を製造するための式（ＩＩ）の化合物
【化４】
（式中、
Ｒ１およびＲ２は、互いに同じであるか、または異なり、Ｈ、−ＣＯ−ＣＨ３、ｎが１〜６、好ましくは１〜３の整数である−ＣｎＨ２ｎ−１、１〜６個、好ましくは１〜３個の炭素を有する直鎖もしくは分枝アルキル基からなる群より選択されるか、あるいはそれらは一緒に、５または６個の原子を有する芳香環または脂肪族環を形成し、
Ｒ３は、Ｈ、−ＣＯ−ＣＨ３、−ＮＨＯＨ、−ＯＨ、−ＯＲ６から選択され、Ｒ６は、１〜６個の炭素を有する直鎖もしくは分枝アルキル基であり、
Ｒ４は、Ｈ、１〜６個の炭素を有する直鎖もしくは分枝アルキル基から選択され、
Ｒ５、Ｒ７、Ｒ８は、Ｈ原子であり、
Ｒ３およびＲ４、Ｒ４およびＲ５、またはＲ７およびＲ８は、一緒に、ベンゼン環に縮合された環、Ｎ、Ｏからなる群より独立して選択される１〜２個のヘテロ原子を含む５または６個の原子を有する芳香環または脂肪族環のいずれかを形成する）
またはその混合物および薬理学的に許容可能な塩もしくはエステルの使用が提供される。
【００３５】
前記式（ＩＩ）の化合物の実施形態は、添付の特許請求の範囲８〜２４に与えられる。
【００３６】
例として、実施例５に例示される化合物Ａ〜Ｇが本発明の使用に適切である。
【００３７】
本発明の使用に適切な式（ＩＩ）の化合物のさらなる例は、国際公開ＷＯ２００７／０１０５１４号に記載され、その内容は参照として完全に本明細書に援用される。
【００３８】
出願人は、式ＩおよびＩＩの化合物が、セリアック病の被験体の腸粘膜の位置、特に２番目の十二指腸部分の位置で観測される免疫炎症性成分に対する特異的活性を有することを示している。
【００３９】
出願人は、式（Ｉ）および（ＩＩ）の化合物によって与えられる局所的な抗炎症活性が、炎症プロセスにおいて重要な役割、および／またはその炎症プロセスが慢性的になるのに重要な役割を果たす物質である、サイトカインの放出に対する阻害活性に関与していることをさらに示している。
【００４０】
特に、驚くべきことに、式ＩおよびＩＩの化合物が、セリアック病の被験体においてのみ、サイトカインを十分な方法で遮断するか、またはいずれかの場合において、実質的および有意に阻害するが、それらの化合物は、セリアック病以外の特定の胃腸管に影響を与える炎症性疾患を罹患している被験体において有意な活性を有さないことを見出した。
【００４１】
特に、式ＩおよびＩＩの化合物は、いわゆるプロフロゴジェン（ｐｒｏｐｈｌｏｇｏｇｅｎ）Ｔｈ１（ヘルパーＴ細胞タイプ１）サイトカインを遮断するのに適切である。なぜなら、それらの化合物は、損傷部位における免疫細胞および炎症細胞の動員に有利に働くからである。
【００４２】
この特異的活性は、セリアック病において、排除できず、免疫系が耐性を生じることができない抗原（グルテンのグルアジン分画）に対する免疫系の活性化を、Ｔｈ１タイプの炎症（ｐｈｌｏｇｏｓｉｓ）の持続が反映するという事実に帰する可能性がある。
【００４３】
セリアック病の免疫病原性に関与する典型的なプロフロゴジェンサイトカイン（Ｔｈ１）は、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６（インターロイキン１、２、６）、ＩＦＮ（インターフェロン）を含む。さらに、Ｔｈ２（ヘルパーＴ細胞タイプ２）に関連するサイトカイン、およびＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子）などのマクロファージ由来のサイトカインもまた、セリアック病に関与する。特に、ＴＮＦ−αは、プロフロゴジェンサイトカイン（その一部はかなりの毒性を与えられる）の産生を上昇させる能力に起因する慢性的な炎症性疾患の発生に重要な役割を果たす。
【００４４】
特に、セリアック病を罹患している腸粘膜試料由来のサイトカインの産生および放出に対する式（Ｉ）および（ＩＩ）の化合物の効果は、有機培養系を用いて実証されている。特に、培養に対して腸免疫対象物の生検において式（Ｉ）（ＩＩ）の化合物の１つ以上を用いることによるＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α値の有意な減少が強調されているため、フロゴシス（ｐｈｌｏｇｏｓｉｓ）の効果的な減少が示されている。
【００４５】
本発明の別の態様によれば、難治性セリアック病の被験体における炎症を処置するための医薬を製造するための上記のような式ＩまたはＩＩの化合物およびそれらの混合物の使用が提供される。
【００４６】
本発明の別の態様によれば、食事療法の誤りによって誘発される、食事療法中のセリアック病の被験体における炎症性反応を処置するための医薬を製造するための上記のような式ＩまたはＩＩの化合物およびそれらの混合物の使用が提供される。
【００４７】
本発明の別の態様によれば、典型的に、１つ以上の薬理学的に許容可能な賦形剤またはアジュバントと組み合わせて、セリアック病における免疫炎症性成分を処置するため、臨床時間および／または組織学的寛解時間を短縮するための医薬を製造するための式ＩまたはＩＩの化合物およびそれらの混合物の使用が提供される。
【００４８】
本発明の１つ以上の態様に従って医薬を調製する際に、１つ以上の薬理学的に許容可能な賦形剤に加えて、薬理学的使用のための調製物の範囲内で典型的に使用される滑剤、保湿剤、懸濁化剤、分散剤、防腐剤を使用することも可能である。
【００４９】
一実施形態において、式（Ｉ）および／または（ＩＩ）の化合物は、錠剤、カプセル剤、粒状処方物、分散剤および薬理学的分野に典型的な他の処方物などの様々な形態で投与されてもよい。
【００５０】
典型的に、活性成分（Ｉ）および（ＩＩ）は、セリアック病における抗炎症性反応を達成するのに有効な量で投与に適切な処方物に組み込まれてもよい。
【００５１】
例として、活性成分は、５０ｍｇ〜２０００ｍｇの範囲、好ましくは２００〜６００ｍｇ、より好ましくは２５０〜５００ｍｇの範囲の量で医薬組成物に組み込まれてもよい。
【００５２】
式（Ｉ）および／または（ＩＩ）の１つ以上の化合物に基づいた医薬の使用は、患者および医師のコンプライアンスを改善し、寛解時間を減少させることを決定づけることが示されている。
【００５３】
別の実施形態において、式（Ｉ）および／または（ＩＩ）の化合物は、抵抗性および／または難治性のセリアック病の処置におけるさらなる治療用途を見出された。
【００５４】
以下の実施例は単に本発明の例示のみとして与えられ、添付の特許請求の範囲から明らかなように、保護の範囲を限定することを意図しない。
【実施例】
【００５５】
（実施例１）
セリアック病で観測される炎症性成分に対する、本発明の好ましい化合物の１つである、メサラジンの効果を評価した。
【００５６】
このために、疾患の活動期中の１６人の被験体およびグルテンを含まない食事療法中の臨床的寛解期中の６人の患者を選択した。
【００５７】
各研究被験体につき５つの生検断片を、ＥＧＤＳ試験により得た。
【００５８】
腸粘膜の各断片を、メサラジン（５ＡＳＡ）を含むものと、含まないものの両方で、適切な培地中の培養物に入れた。
【００５９】
次いで、以下のものを液体培地中で観測した：
異なる培地中で放出されたサイトカインのレベル、
適切に均質化された生検粘膜に存在する同じサイトカインの量。
【００６０】
（物質および方法）
（方法）
３群の被験体を評価した。
【００６１】
第１（萎縮性）の群は、抗筋肉膜および抗トランスグルタミナーゼ抗体に対して血清試験で陽性であり、セリアック病の新診断をして、グルテンを含む食事をしている２９人の被験体を含んだ。
【００６２】
第２（寛解）の群は、臨床的寛解において、少なくとも６ヶ月間、グルテンを含まない食事療法の１７人のセリアック病の被験体を含んだ。
【００６３】
第３（健康的）の群は、セリアック病を罹患していないが、胃腸管の炎症を罹患している被験体を含んだ。
【００６４】
（液体培地中のサイトカインアッセイ）
（臓器培養）
この研究患者は、ＥＧＤＳ検査によって十二指腸粘膜の５つの生検を提供した。１つは組織学的アッセイについてのものであり、他の４つ（それぞれ２つの部分に分けた）は、それぞれ、１つの培地のみ（培地Ｃ）およびグリアジンペプチドを含む培地ならびにメサラジンの存在下でグリアジンを含む培地（培地＋５ＡＳＡ Ｃ）を用いて培養に供した。
【００６５】
生検を、少なくとも３回、生理食塩水で２分間洗浄した。その生検を、１ｍｌに相当する体積を有する培地に入れた：
培地（ＲＰＭ１１８６０＋ウシ胎仔血清＋ペニシリン／ストレプトマイシン）、
培地＋グリアジンまたは３１〜４３または他の穀物のペプシン−トリプシン消化物、
培地＋メサラジン（５−ＡＳＡ）、
培地＋グリアジンのペプシン−トリプシン消化物＋５−ＡＳＡ（培地１ｍｌあたり１．５〜８．０ｍｇ）。
【００６６】
生検を、４時間〜７２時間の間、３７℃の温度でＯ２（９５％）およびＣＯ２（５％）雰囲気下でインキュベートする。
【００６７】
３つの異なる量の培地を、培地に放出されたＴｈ１およびＴｈ２サイトカインのＥＬＩＳＡアッセイについて共有する。
【００６８】
（ホモジネートからのサイトカインアッセイ）
３７℃の温度で４時間〜７２時間のインキュベーション時間の後、生検断片を２分間、生理食塩水で３回洗浄し、生検を機械的または化学的分解により均質化する。遠心分離を実施し、上清を回収し、１．５ｍｌのエッペンドルフに移す。粘膜組織中の固定されたサイトカインをＥｌｉｓａアッセイにより分析する。
【００６９】
（結果）
見出されるデータは、培地中のメサラジンの存在が、セリアック病の被験体のみにおいてサイトカインを遮断し、従って、セリアック病の被験体から得た試料において選択的に炎症性成分の減少を決定づけることを示す（表１）。
【００７０】
【表１】
【００７１】
【表２】
【００７２】
【表３】
【００７３】
【表４】
【００７４】
達成された炎症性成分の減少により、メサラジンの単独の使用または全ての緩慢もしくは困難な臨床的解決の症例における治療支持としての使用が可能になる。
【００７５】
（実施例２）
（サイトカインの遺伝子発現）
胃内視鏡検査処置の間に患者から得た生検の十二指腸断片を、５−ＡＳＡ薬物の非存在下および存在下で、４８時間、３７℃で培養物中に入れた。培養後、断片を、フェノールおよびグアニジン（Ｉｓｏｌ−ＲＮＡ溶解試薬）からなる単相溶液中で均質化した。
【００７６】
ホモジナイザーＩＫＡ Ｔ１０−Ｕｌｔｒａ Ｔｕｒｒａｘを、均質化のために使用した。
【００７７】
全ての不溶性物質を遠心分離により溶液から分離し、上清を無菌の試験管に移し、それに、溶解物１ｍｌあたり２００μｌのクロロホルムを加えた。
【００７８】
短時間の機械的攪拌後、試料を室温で数分間静置させ、その後、４℃で１５分間、１２０００ｒｐｍで遠心分離した。ＲＮＡを含む無機段階を無菌の試験管に移して行った。
【００７９】
ＲＮＡを、溶解物１ｍｌあたり５００μｌのイソプロピルアルコールを加えることにより沈殿させた。試料を、室温で１０分間インキュベートし、次いで、４℃で１５分間、１２０００ｒｐｍで遠心分離した。
【００８０】
上清を除去した後に、ＲＮＡ沈殿物を、溶解物１ｍｌあたり１０００μｌの７５％エタノールで洗浄し、機械的に攪拌し、４℃で５分間、７５００ｒｐｍで遠心分離した。最終的に、エタノールを除去し、ＲＮＡ沈殿物を化学フード下で空気乾燥させた。
【００８１】
ＲＮＡを、適切な量のＲＮａｓｉを含まない水に再懸濁した。
【００８２】
ＲＮＡの濃度を、分光光度計で２６０ｎｍでの吸収を測定することにより決定し、異なるＲＮＡ鋳型についてのＡ２６０／Ａ２８０の比を評価した。
【００８３】
（ＲＴ−ＰＣＲ）
ｃＤＮＡを、適切な体積のＲＮａｓｉを含まない水に希釈した異なる量の抽出したＲＮＡから開始して合成した。関連遺伝子（サイトカイン）のｃＤＮＡを、特異的プライマーを使用してＰＣＲにより増幅させた。
【００８４】
マスタースクリプト ＲＴ−ＰＣＲ系（５プライマー）をＲＴ−ＰＣＲに使用した。
【００８５】
生検試料においてサイトカインをコードするｍＲＮＡの存在および量を確認するために、１×ＴＢＥ中で１％アガロースゲル電気泳動を行った。
【００８６】
得られた結果を図１のグラフに示す。
【００８７】
（実施例３）
（セリアック病患者の十二指腸上皮細胞におけるＰＰＡＲγ受容体の存在）
ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γは、核内受容体のスーパーファミリーに属し、それは、エストロゲン、糖質コルチコイド、甲状腺ホルモン、ビタミンＤ３およびレチノイン酸についての受容体ならびに脂質代謝の異なる生成物を結合できる受容体（例えば、ＰＰＡＲおよびＬＸＲ受容体）を含む。
【００８８】
特に、ＰＰＡＲファミリーは、異なる組織分布および異なるリガンド特異性を有する３つのサブタイプ（ＰＰＡＲα、βまたはδおよびγ）を含む。
【００８９】
ＰＰＡＲγおよびαの両方は、分化したヒトマクロファージにおいて発現され、それらは、炎症性反応に関係する遺伝子を調節し、マクロファージの分化を調節する。
【００９０】
異なるＰＰＡＲγ作動薬は、ヒトの単球において炎症性サイトカインの産生を阻害し、活性化マクロファージにおけるＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１ｂ、ｉＮＯＳ、ゼラチンＢ、スカベンジャー受容体ＡおよびＣＯＸ−２についての遺伝子発現を減少させ、ＰＰＡＲγの抗炎症性の役割を確認する。
【００９１】
主な目的の１つは、セリアック病患者の十二指腸上皮細胞においてこのような受容体の存在を検出することであり、式（Ａ）、Ｉ、ＩＩの化合物の抗炎症性効果および炎症性サイトカインの産生の減少によって現れる５−ＡＳＡの特異性は、以前に確認されている。
【００９２】
（免疫蛍光）
十二指腸生検断片を、グルテンを含む食事をしているセリアック病の患者およびセリアック病を罹患していない被験体（コントロール群）の両方からＥＧＤＳ処置により取得した。生検断片を洗浄し、ＯＣＴに配向し、−８０℃で保存した。５μｍのいくつかの断片を、各々の凍結した生検切片（セリアック病の患者およびその疾患を罹患していない被験体の両方からＥＧＤＳ工程で得た）から得て、その断片をＰＰＡＲγ一次抗体に一晩（適切な固定および特異性除去の処置後）、曝露した。
【００９３】
ＰＢＳで洗浄した後、試料を、約１時間、二次フルオレセイン抗体ＡＬＥＸＡ ４８８とともにインキュベートした。一次抗体がＰＰＡＲγ受容体に結合する場合において、存在する場合、一次／二次抗体複合体が形成され、顕微鏡によって観測可能な断片上の蛍光として現される。
【００９４】
蛍光顕微鏡によって現されるＰＰＡＲγ受容体の存在は、図２および図３（写真診断）から証明される。
【００９５】
特に、図２および図３の画像において、受容体の存在は、末梢部分の断片において検出可能な蛍光シグナルによって現される。蛍光により、腸管腔の方を向いている表面上の腸細胞、腸上皮細胞の位置でＰＰＡＲγの存在が実証される。
【００９６】
セリアック病を罹患していない患者の生検は、ネガティブコントロールとして使用され、シグナルが存在せず、その結果として、顕微鏡によって分析された断片で受容体が存在しない。特に、図４および図５（コントロール）は蛍光が検出されないことを示し、これは、コントロールの健康な群の同じ腸内部分の位置において受容体が存在しないことのしるしである。
【００９７】
同じように、本明細書の以下に記載される化合物を試験し、同様の結果を得た。
【００９８】
（実施例４）
疾患の急性期で放出される炎症性サイトカインＩＬ−２、ＴＦＮ−αおよびＩＦＮ−γの遺伝子発現（ｍＲＮＡ）をモニターした。
【００９９】
特に、図６〜８に示される図は、１×アガロースゲルを用いる電気泳動によって得られた異なるバンドから推定される吸光度の値（ＩＭＡＧＥ Ｊ）を示し、この研究のサイトカイン増幅対象に関連する。
【０１００】
サイトカインの遺伝子発現は、セリアック病を罹患している患者の十二指腸の生検の抽出されたＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲによって評価される。このような生検は、５−ＡＳＡ薬物が加えられる、グリアジンのトリプシン消化物（ＰＴ）を含む培地およびＰＴ培地の両方において、４８時間、３７℃で増殖を維持されている。
【０１０１】
（結果）
３つの図により、生検断片が薬物の存在下において培地中に維持され、疾患急性期に放出される炎症性サイトカインＩＬ−２、ＴＦＮ−αおよびＩＦＮ−γの遺伝子発現（ｍＲＮＡ）が十分に減少されることが示される。
【０１０２】
患者が、薬物でのより持続的かつ一定の処置を受けている場合に、この減少が増加する。
【０１０３】
（実施例５）
（ＰＰＡＲγ活性化／発現ならびに細胞増殖およびアポトーシスの調節に対する本発明による化合物の効果の研究）
（物質および方法）
化合物Ａ−Ｇ
５−ＡＳＡを、Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈＴＭ（Ｓｔ Ｑｕｅｎｔｉｎ Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，フランス）で購入した。ロシグリタゾンを、Ｓｐｉ ＢｉｏＴＭ（Ｍａｓｓｙ，フランス）で得た。式（ＩＩ）の範囲内である以下の化合物Ａ〜Ｇを試験した。
【化５】
【０１０４】
（細胞株）
結腸細胞株ＨＴ−２９ ＳＴＤ（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−３８）を、１０％のｈｅａｔ−ＦＣＳおよび抗生物質を補足したＤＭＥＭ中で慣例的に増殖させた。細胞を単分子層で増殖させ、５％ＣＯ２および９５％相対湿度において３７℃でインキュベートした。
【０１０５】
（ＰＰＡＲγでの一過性トランスフェクションおよび細胞の刺激）
ＨＴ−２９ ＳＴＤ細胞を、製造業者の指示書に従ってＥｆｆｅｃｔｅｎｅ ＴＭトランスフェクション試薬（Ｑｉａｇｅｎ ＴＭ）を用いて一過性トランスフェクションした。ＰＰＡＲγ活性化を試験するために、本発明者らは、シトクロムｐ４５０ ４Ａ（２ＸＣＹＰ）から得た２つのコピーのＰＰＲＥを含む５００ｎｇの最小プロモーター構築物でトランスフェクションを実施した。ウミシイタケルシフェラーゼプラスミド（０．１μｇ／ウェル）も、トランスフェクション効果をモニターするため、およびホタルルシフェラーゼ活性を正規化するための内部コントロールとしてトランスフェクションした。トランスフェクションした細胞を４８時間静置し、３７℃でインキュベートした。刺激を、３０ｍＭの濃度で化合物Ａ−Ｇを用いて、３−６−９−１２−１５−１８−２４時間の間、細胞のインキュベーション後に実施し、ポジティブコントロールとして使用した２つのＰＰＡＲγ合成リガンド５−ＡＳＡ ３０ｍＭおよびロシグリタゾン １０〜５Ｍと比較した。薬物溶液のｐＨをＮａＯＨで７．４に調整した。全細胞抽出物を、受動的溶解緩衝液（Ｐａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ）（ＰｒｏｍｅｇａＴＭ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）を用いて調製した。ルシフェラーゼ活性を、製造業者のプロトコルによるＰｒｏｍｅｇａＴＭのデュアルルシフェラーゼアッセイシステムを用いて２０μｌの抽出物中で測定した。トランスフェクションを、少なくとも３つの別々の実験において３連で分析した。ルシフェラーゼ活性を、刺激していない細胞からのルシフェラーゼ活性で割られた異なる分子で処理した細胞で得られた活性の倍数として表した。
【０１０６】
（ウェスタンブロット解析によるＰＰＡＲγおよびβ−アクチンの評価）
全タンパク質を、２％のＴｒｉｔｏｎＴＭ、フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）１００ｍＭおよび古典的プロテアーゼ阻害剤カクテルを含むＰＢＳからなる抽出緩衝液中での細胞均質化によって得た。次いで、全タンパク質を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動および電気ブロットによって分離した。二フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）膜を、ＰＰＡＲγに対するウサギポリクローナル一次抗体（１／５００希釈，ＴＥＢＵ，Ｌｅ Ｐｅｒｒａｙ ｅｎ Ｙｖｅｌｉｎｅ，フランス）とともに一晩インキュベートした。β−アクチンを、１／１０，０００で希釈したウサギモノクローナル一次抗体（Ｓｉｇｍａ）を用いて検出した。二次ペルオキシダーゼ標識抗体（１／１０００，ＤａｋｏＴＭ，Ｔｒａｐｐｅｓ，フランス）および化学発光を用いる免疫検出を、製造業者のプロトコル（ＥＣＬＴＭ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＢｉｏｔｅｃｈＴＭ，Ｏｒｓａｙ，フランス）に従って実施した。ＰＰＡＲγの吸光度の値を、同じ試料内の内部コントロールβ−アクチンの量に比例して各条件について得た。
【０１０７】
（Ｋｉ−６７免疫染色による細胞増殖の分析）
２４時間の培養後、ＨＴ−２９ ＳＴＤ細胞を、３０ｍＭで化合物Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＦを用いて２４時間、処理した。５−ＡＳＡ（３０ｍＭ）およびロシグリタゾン（１０〜５Ｍ）を、ポジティブコントロールとして使用した。分子Ｇは、その不十分な溶解性のために、この実験に含まなかった。薬物溶液のｐＨをＮａＯＨで７．４に調整した。細胞を、ＰＦＡ ４％中で固定し、４℃で０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ＴＭを含むＰＢＳ中で透過処理し、次いで、抗体の非特異的吸着を最小化するためにヤギ正常血清および遮断バッファー（ＰＢＳ中の１％ ＢＳＡ）とともにインキュベートした。
【０１０８】
細胞増殖を、Ｋｉ−６７に対するマウスモノクローナル一次抗体を用いて核のＫｉ−６７染色によって評価した（１：５０希釈、一晩；ＺＹＭＥＤＴＭ，ＣｌｉｎｉｓｃｉｅｎｃｅｓＴＭ，Ｍｏｎｔｒｏｕｇｅ，フランス）。一次抗体を、アクリジン赤蛍光色素（１：１００希釈，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＰｒｏｂｅｓＴＭ，ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭ，Ｃｅｒｇｙ Ｐｏｎｔｏｉｓｅ，フランス）と結合したＡｌｅｘａ ５９４ロバ抗マウスＩｇＧで明らかにした。核を、Ｈｏｅｓｃｈｔ ３３３４２溶液（０．１２５ｍｇ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈＴＭ）で染色し、蛍光顕微鏡（ＬｅｉｃａＴＭ，Ｂｅｎｓｈｅｉｍ，ドイツ）下で視覚化した。ネガティブコントロールは、特異的抗体の代わりに非特異的マウス血清での染色からなる。少なくとも５００細胞／試料のカウントを、１つの実験において体系的に盲目的に実施した。その結果を、染色細胞の数の平均±ＳＥＭとして表した。
【０１０９】
（アポトーシスの検出）
２４時間の培養後、ＨＴ−２９ ＳＴＤ細胞を、２４時間の間、３０ｍＭの濃度で化合物Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆを用いて処理した。５−ＡＳＡ（３０ｍＭ）およびロシグリタゾン（１０〜５Ｍ）を、ポジティブコントロールとして使用した。分子ＥおよびＧは、それらの不十分な溶解度のためにこの実験に含まなかった。薬物溶液のｐＨをＮａＯＨで７．４に調整した。アポトーシスを受けた細胞を、ターミナルトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識アッセイ（ＴＵＮＥＬアッセイ，Ｒｏｃｈｅ ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓＴＭ，Ｍｅｙｌａｎ，フランス）を用いてＤＮＡ鎖の酵素標識により同定した。少なくとも５００細胞／試料のカウントを、１つの実験において体系的に盲目的に実施した。その結果を、染色細胞の数の平均±ＳＥＭとして表した。
【０１１０】
（結果）
分子ＣおよびＦは、ＰＰＡＲγ活性化を誘導することが観測された。化合物Ｄもまた、ＰＰＡＲγを誘導するが、わずかに少ない程度である。ＰＰＡＡＲγの活性化は、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体エレメント（ＰＰＲＥ）と呼ばれる特異的ＤＮＡ配列エレメントに対する結合を導く反応のカスケードを生じる。
【０１１１】
本発明者らは、ウミシイタケルシフェラーゼＰＰＲＥプラスミドでの上皮細胞の一過性トランスフェクションによるＰＰＡＲγ転写活性を研究した。細胞を、２４時間、異なる分子で刺激した。トランスフェクションされたＨＴ−２９細胞におけるＰＰＡＲγ活性の分析により、３０ｍＭの濃度で化合物ＣおよびＦが、レポーター遺伝子活性を２倍増加させ、それにより、５−ＡＳＡおよびロシグリタゾンと同様の活性を表したことが示された。３０ｍＭの濃度で化合物Ａ、ＢおよびＧは、６時間後にＰＰＡＲγ活性化の研究を制限する上皮細胞に対する急速な細胞毒性効果を与えた。
【０１１２】
特に、分子Ｃ、ＤおよびＦは、ＰＰＡＲγ発現を誘導する。通常、全ての化合物Ａ〜Ｇは、ＨＴ−２９細胞株におけるタンパク質レベルでＰＰＡＲγ発現を誘導する能力を示す。特に、ウェスタンブロットにより定量化したＰＰＡＲγタンパク質レベルの平均２倍の誘導を、２４時間、分子Ｃ、ＤおよびＦで処理した細胞において観測した。
【０１１３】
特に、分子ＣおよびＦは、上皮細胞増殖を阻害する。本発明者は、細胞増殖の調節における分子の役割をＨＴ−２９ ＳＴＤ細胞株において評価した。細胞増殖を、増殖細胞中で発現される核タンパク質Ｋｉ−６７染色により評価し、Ｋｉ−６７の存在が細胞増殖を維持するのに必須であった。未処理の細胞と比較して、分子ＣおよびＦ（３０ｍＭ）との２４時間のＨＴ−２９細胞のインキュベーションは、細胞増殖の６７〜７５％の阻害を生じた。
【０１１４】
同様の結果を、最適濃度で使用した２つのポジティブコントロールのロシグリタゾン（１０〜５Ｍ）および５−ＡＳＡ（３０ｍＭ）で得た。分子Ａ、ＢおよびＤの潜在的抗分離促進効果の確認は、この濃度での上皮細胞に対するそれらの急速な細胞毒性効果によって制限された。
【０１１５】
化合物Ｆもまた、ＰＰＡＲγを介して上皮細胞のアポトーシスを誘発する。ロシグリタゾンおよび５−ＡＳＡと同様に、分子Ｆは、ターミナルトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）を用いてＤＮＡ鎖の分裂を標識することにより同定された８０％の上皮細胞のアポトーシスを示した。以前の実験と同様に、分子Ａ、ＢおよびＤは、３０ｍＭの阻害細胞アポトーシス分析において急速な細胞毒性効果を誘発した。
【０１１６】
（結論）
この実施例は特に、ＰＰＡＲγ発現および活性化を誘発し、上皮細胞増殖およびアポトーシスを調節する化合物ＣおよびＦの能力を示す。さらに、３０ｍＭでの化合物Ａ、Ｂ、Ｄ（およびＥ〜Ｇ）の上皮細胞に対する細胞毒性効果は、多くの種々の酵素と高い親和性を示すことが知られている高い反応性のヒドロキサム酸基の構造の存在と関連し得る。
【０１１７】
（実施例６）
（分子モデル）
分子モデル研究を、Ｓｉｌｉｃｏｎ ＧｒａｐｈｉｃｓＴＭワークステーションで作動するＳＹＢＹＬソフトウェアバージョン６．９．１（Ｔｒｉｐｏｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ＩｎｃＴＭ，ＳＴ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて実施した。５−ＡＳＡの両性イオン形態の三次元モデルを、標準的なフラグメントライブラリーから構築し、次いで、その形状を、Ｔｒｉｐｏｓ力場を用いて最適化した。化合物のｐＫａはまだ知られていないため、ＳＰＡＲＣオンライン計算機を、生理学的ｐＨ（７．４）で生じる種を決定するために使用した。イオン化化合物の三次元モデルを、標準的なフラグメントライブラリーから構築し、次いで、それらの形状を、ＧａｓｔｅｉｇｅｒおよびＨｕｃｋｅｌ原子電荷から計算される静電条件を含むＴｒｉｐｏｓ力場を用いて最適化した。Ｍａｘｉｍｉｎ２処理に利用可能なＰｏｗｅｌｌ法を、勾配値が０．００１ｋｃａｌ／ｍｏｌ．Åより小さくなるまで、エネルギー最小化に使用した。ヒトＰＰＡＲγリガンド結合ドメインの構造を、ＲＣＳＢタンパク質データバンク（１１７１）（４，５）で利用可能なテサグリタザル（ＡＺ２４２）を用いてその錯体化したＸ線結晶構造から得た。化合物の受容体活性部位へのフレキシブルなドッキングを、ＧＯＬＤソフトウェアを用いて実施した。最も安定なドッキングモデルを、ＧｏｌｄＳｃｏｒｅおよびＸ−Ｓｃｏｒｅ評価関数によって予測された最適に評価された構造に従って選択した。錯体を、勾配値が０．０１ｋｃａｌ／ｍｏｌ．Åに到達するまで、Ｔｒｉｐｏｓ力場および４．０の誘電率でＭａｘｉｍｉｎ２処理に利用可能なＰｏｗｅｌｌ法を用いてエネルギー最小化をした。アニール機能を使用して、リガンドのホット領域（ｈｏｔ ｒｅｇｉｏｎ）（１０Å）を規定する。
【０１１８】
（ドッキング研究）
化合物Ａ〜Ｇは、分子認識およびＰＰＡＲγ活性化に必要な主要な決定因子とみなされるＨｉｓ−３２３、Ｈｉｓ−４４９、Ｔｙｒ−４７３およびＳｅｒ−２８９との水素結合を介して相互作用するＰＰＡＲγ−ＬＢＤと強く適合した。
【０１１９】
式（ＩＩ）に含まれる化合物の抗炎症効果は、上皮細胞によって主に発現されるＰＰＡＲγにより媒介されることが示された。このドッキング分析により、３０ｍＭの濃度で使用される上述の化合物がＰＰＡＲγを活性化し、腸の上皮細胞によりその発現を誘導し、セリアック病の免疫炎症性成分に対する薬理作用を与えることが明らかにされた。
【０１２０】
（結論）
アミノサリチル酸構造（５−ＡＳＡ構造など）との式ＩＩの化合物の抗炎症効果は、ＰＰＡＲγにより媒介され、十二指腸の位置で上皮細胞において発現されることが以前に示されている。ドッキング分析に基づいた化合物Ａ〜Ｇの合理的開発により、３０ｍＭの濃度で使用される前記化合物、特にＣ、Ｆが、ＰＰＡＲγを活性化し、腸の上皮細胞によりその発現を誘導することが明らかにされた。その化合物はまた、ＰＰＡＲγ活性化による２つの重要な機構である、上皮細胞増殖を阻害し、アポトーシスを誘導する。特に、分子Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｇに関して、それらが、ＰＰＡＲγ活性化の分析ならびに細胞増殖およびアポトーシスの調節および評価を妨げる、３０ｍＭの濃度での上皮細胞に対する細胞毒性効果に関することが検出されている。
【０１２１】
（実施例７）
（ＰＰＡＲγ活性化に対する式（Ｉ）の化合物Ｈ〜Ｑの効果）
（物質および方法）
（物質）
５−ＡＳＡを、Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈＴＭ（Ｓｔ Ｑｕｅｎｔｉｎ Ｆａｌｌａｖｉｅｒ、フランス）で購入した。ロシグリタゾンを、Ｓｐｉ ＢｉｏＴＭ（Ｍａｓｓｙ、フランス）で得た。式（Ｉ）内に含まれる以下の化合物Ｈ〜Ｑを試験した。
【化６】
【化７】
【０１２２】
（細胞株）
結腸癌細胞株ＨＴ−２９ ＳＴＤ（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−３８）を、１０％のｈｅａｔ−ＦＣＳおよび抗生物質を補足したＤＭＥＭ中で慣例的に増殖させた。細胞を単分子層で増殖させ、５％ＣＯ２および９５％相対湿度において３７℃でインキュベートした。
【０１２３】
（ＰＰＡＲγでの一過性トランスフェクションおよび細胞の刺激）
ＨＴ−２９ ＳＴＤ細胞を、製造業者の指示書に従ってＥｆｆｅｃｔｅｎｅＴＭトランスフェクション試薬（ＱｉａｇｅｎＴＭ）を用いて一過性トランスフェクトした。ＰＰＡＲγ活性化を試験するために、本発明者らは、シトクロムｐ４５０ ４Ａ（２ＸＣＹＰ）から得た２つのコピーのＰＰＲＥを含む５００ｎｇの最小プロモーター構築物でトランスフェクションを実施した。ウミシイタケルシフェラーゼプラスミド（０．１μｇ／ウェル）も、トランスフェクション効果をモニタリングするため、およびホタルルシフェラーゼ活性を正規化するための内部コントロールとしてトランスフェクションした。トランスフェクションした細胞を、３７℃で２４時間のインキュベーションのために静置させておいた。刺激を、１ｍＭの濃度で化合物Ｈ〜Ｑを用いて１８時間の細胞のインキュベーション後に実施して、ポジティブコントロールとして使用した２つのＰＰＡＲγ合成リガンド５−ＡＳＡ（３０ｍＭ）およびロシグリタゾン（１０〜５Ｍ）と比較した。薬物溶液のｐＨをＮａＯＨで７．４に調整した。全細胞抽出物を、受動的溶解緩衝液（Ｐａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ）（ＰｒｏｍｅｇａＴＭ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）を用いて調製した。ルシフェラーゼ活性を、製造業者のプロトコルによるＰｒｏｍｅｇａのデュアルルシフェラーゼアッセイシステムを用いて２０μｌの抽出物中で測定した。トランスフェクションを、少なくとも３つの別々の実験において３連で分析した。ルシフェラーゼ活性を、刺激していない細胞からのルシフェラーゼ活性で割られた異なる分子で処理した細胞で得られた活性の倍数として表した。
【０１２４】
（結果）
ＰＰＡＲγの活性化は、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体エレメント（ＰＰＲＥ）と呼ばれる特異的ＤＮＡ配列エレメントに対する結合を導く反応のカスケードを生じる。
【０１２５】
本発明者らは、ウミシイタケルシフェラーゼおよびＰＰＲＥプラスミドでの上皮細胞の一過性トランスフェクションによるＰＰＡＲγ転写活性を調べた。化合物Ｈ〜ＱがＰＰＡＲγ活性化を刺激する有効性および／または５−ＡＳＡより有効かどうかを評価するために、本発明者らは１ｍＭの濃度でこれらの分子を試験した。１ｍＭの濃度での新規の分子の効果を、それぞれ３０ｍＭおよび１０〜５Ｍの最適濃度でポジティブコントロールとして使用した５−ＡＳＡおよびロシグリタゾンと比較した。細胞を、２４時間、異なる分子で刺激した。
【０１２６】
トランスフェクションされたＨＴ−２９細胞中のＰＰＡＲγ活性の分析により、１ｍＭで前記化合物４０が、それぞれ、４．８±０．７１倍、２．７３±０．３１倍、２．６４±０．４６倍、３．４±０．９７倍、受容体遺伝子活性を増加させ、それにより、３０ｍＭでの５−ＡＳＡ（２．８±０．７）および１０〜５Ｍでのロシグリタゾン（３．１７±０．２９）と同等またはそれらより優れた活性を表したことが示された。
【０１２７】
トランスフェクションされたＨＴ−２９細胞中のＰＰＡＲγ活性を増加させる本発明の式（Ｉ）の化合物に含まれる分子Ｈ〜Ｑの能力は、３０ｍＭでの５−ＡＳＡおよび１０〜５Ｍでのロシグリタゾンと同等またはそれらより優れた活性を表す。
【０１２８】
２００７年１２月２４日に出願された、詳細な説明、特許請求の範囲および図面を含む伊国特許出願第ＭＩ２００７Ａ２４２９号は、その優先権が本明細書で主張され、完全に参照によって援用される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
セリアック病の炎症性成分の処置に使用するための式（Ｉ）の化合物
【化８】
（式中、
Ｒ１およびＲ２は、互いに同じであるか、または異なり、−Ｈまたは１〜６個の炭素を有する直鎖もしくは分枝アルキル基からなる群より選択されるか、あるいはそれらは一緒に、５または６個の原子を有する芳香環または脂肪族環を形成し、
ＹおよびＺは、互いに同じであるか、または異なり、−Ｈ、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＯＲ３、−ＣＨ（ＯＲ３）ＣＯＯＨからなる群より選択され、
ここで、Ｒ３は、Ｈ、フェニル、ベンジル、−ＣＦ３、−ＣＦ２ＣＦ３、ビニル、アリル、１〜６個の炭素を有する直鎖もしくは分枝アルキル基から選択される）
またはその混合物および薬理学的に許容可能な塩もしくはエステル。
【請求項２】
１〜６個の炭素を有する前記直鎖もしくは分枝アルキル基は、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、−ＣｎＨ２ｎ−１から選択され、ｎが１〜６の整数である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
ＹはＨである、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｚは、−ＣＨ３（ＯＲ３）ＣＯＯＨである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ３は、Ｈ、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項６】
前記化合物は、式
【化９】
の（±）３−（３’−アミノフェニル）−２−ヒドロキシ−プロピオン酸、
２−（４−アミノフェニル）−２−メトキシ酢酸、
２−（３−アミノフェニル）−２−エトキシ酢酸、
２−（４−アミノフェニル）−２−エトキシ酢酸、
式
【化１０】
の３−（４’−アミノフェニル）−２−メトキシプロピオン酸、
式
【化１１】
の３−（４’−アミノフェニル）−２−エトキシプロピオン酸、
式
【化１２】
の３−（３’−アミノフェニル）−２−メトキシプロピオン酸、
式
【化１３】
の３−（３’−アミノフェニル）−２−エトキシプロピオン酸
からなる群より選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
セリアック病の炎症性成分の処置に使用するための式（ＩＩ）の化合物
【化１４】
（式中、
Ｒ１およびＲ２は、互いに同じであるか、または異なり、−Ｈ、−ＣＯ−ＣＨ３、ｎが１〜６である−ＣｎＨ２ｎ−１、１〜６個の炭素を有する直鎖もしくは分枝アルキル基からなる群より選択されるか、あるいはそれらは一緒に、５または６個の原子を有する芳香環または脂肪族環を形成し、
Ｒ３は、Ｈ、−ＣＯ−ＣＨ３、−ＮＨＯＨ、−ＯＨ、−ＯＲ６から選択され、ここでＲ６は、１〜６個の炭素を有する直鎖もしくは分枝アルキル基であり、
Ｒ４は、Ｈ、１〜６個の炭素を有する直鎖もしくは分枝アルキル基、フェニル、ベンジル、−ＣＦ３、−ＣＦ２ＣＦ３、ビニルまたはアリルから選択され、
Ｒ５、Ｒ７、Ｒ８は、Ｈ原子であるか、あるいは
Ｒ３およびＲ４、Ｒ４およびＲ５、またはＲ７およびＲ８は、一緒に、ベンゼン環に縮合された環、Ｎ、Ｏからなる群より独立して選択される１〜２個のヘテロ原子を含む５または６個の原子を有する芳香環または脂肪族環のいずれかを形成する）
またはその混合物およびそれらの薬理学的に許容可能な塩もしくはエステル。
【請求項８】
１〜６個の炭素を有する前記直鎖または分枝アルキル基は、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、イソプロピル、プロピル、−ＣｎＨ２ｎ−１から選択される、請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
Ｒ３およびＲ４は、以下の式（ＩＩＩ）
【化１５】
による環を形成する、請求項７に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ４およびＲ５は、以下の式（ＩＶ）
【化１６】
による環を形成する、請求項７に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｒ７およびＲ８は、以下の式（Ｖ）または（ＶＩ）
【化１７】
による環を形成する、請求項７に記載の化合物。
【請求項１２】
前記化合物は、
４−アミノ−Ｎ−ヒドロキシ−２−メトキシベンズアミド、
５−アミノ−Ｎ−ヒドロキシ−２−メトキシベンズアミド、
５−アミノ−２，３−ジヒドロベンゾフラン−７−カルボン酸、
５−アミノ−２−エトキシ−Ｎ−ヒドロキシベンズアミド、
６−アミノ−２，２−ジメチル−４Ｈ−ベンゾ［１，３］ジオキシン−４−オン、
１，２，３，４−テトラヒドロ−６−ヒドロキシキノリン−５−カルボン酸、
５−アミノ−２−イソプロポキシ安息香酸、
６−メトキシキノリン−５−カルボン酸、
６−メトキシ−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−５−カルボン酸、
５−ジイソプロピルアミノサリチル酸、
４−ジイソプロピルアミノサリチル酸
からなる群より選択される、請求項７に記載の化合物。
【請求項１３】
Ｒ１およびＲ２は、両方とも−ＣＨ（ＣＨ３）２である、請求項７に記載の化合物。
【請求項１４】
前記化合物は、以下の構造
【化１８】
を含む、請求項１３に記載の化合物。
【請求項１５】
Ｒ１およびＲ２は、両方とも−Ｈである、請求項７に記載の化合物。
【請求項１６】
Ｒ３は、−ＮＨＯＨである、請求項７または１５に記載の化合物。
【請求項１７】
前記化合物は、以下の構造
【化１９】
を含む、請求項１６に記載の化合物。
【請求項１８】
前記化合物は、以下の構造
【化２０】
を含む、請求項１６に記載の化合物。
【請求項１９】
前記化合物は、以下の構造
【化２１】
を含む、請求項１６に記載の化合物。
【請求項２０】
Ｒ３は−ＯＨである、請求項１５に記載の化合物。
【請求項２１】
前記化合物は、以下の構造
【化２２】
を含む、請求項２０に記載の化合物。
【請求項２２】
前記化合物は、以下の構造
【化２３】
を含む、請求項２０に記載の化合物。
【請求項２３】
前記化合物は、以下の構造
【化２４】
を含む、請求項９に記載の化合物。
【請求項２４】
前記化合物は、メサラジンまたは５−アミノサリチル酸である、請求項７に記載の化合物。
【請求項２５】
難治性のセリアック病被験体における免疫炎症の処置に使用するための請求項１〜２４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２６】
食事療法の誤りにより誘発される、食事療法中のセリアック病被験体における免疫炎症反応の処置に使用するための請求項１〜２４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２７】
臨床的および／または組織学的寛解時間を短縮するためのセリアック病における免疫炎症性成分の処置に使用するための請求項１〜２４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２８】
セリアック病におけるサイトカインの放出を選択的に遮断するのに使用するための請求項１〜２４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１】
セリアック病の炎症性成分の処置に使用するための式（Ｉ）の化合物
【化８】
（式中、
Ｒ１およびＲ２は、互いに同じであるか、または異なり、−Ｈまたは１〜６個の炭素を有する直鎖もしくは分枝アルキル基からなる群より選択されるか、あるいはそれらは一緒に、５または６個の原子を有する芳香環または脂肪族環を形成し、
ＹおよびＺは、互いに同じであるか、または異なり、−Ｈ、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＯＲ３、−ＣＨ（ＯＲ３）ＣＯＯＨからなる群より選択され、
ここで、Ｒ３は、Ｈ、フェニル、ベンジル、−ＣＦ３、−ＣＦ２ＣＦ３、ビニル、アリル、１〜６個の炭素を有する直鎖もしくは分枝アルキル基から選択される）
またはその混合物および薬理学的に許容可能な塩もしくはエステル。
【請求項２】
１〜６個の炭素を有する前記直鎖もしくは分枝アルキル基は、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、−ＣｎＨ２ｎ−１から選択され、ｎが１〜６の整数である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
ＹはＨである、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｚは、−ＣＨ３（ＯＲ３）ＣＯＯＨである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ３は、Ｈ、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項６】
前記化合物は、式
【化９】
の（±）３−（３’−アミノフェニル）−２−ヒドロキシ−プロピオン酸、
２−（４−アミノフェニル）−２−メトキシ酢酸、
２−（３−アミノフェニル）−２−エトキシ酢酸、
２−（４−アミノフェニル）−２−エトキシ酢酸、
式
【化１０】
の３−（４’−アミノフェニル）−２−メトキシプロピオン酸、
式
【化１１】
の３−（４’−アミノフェニル）−２−エトキシプロピオン酸、
式
【化１２】
の３−（３’−アミノフェニル）−２−メトキシプロピオン酸、
式
【化１３】
の３−（３’−アミノフェニル）−２−エトキシプロピオン酸
からなる群より選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
セリアック病の炎症性成分の処置に使用するための式（ＩＩ）の化合物
【化１４】
（式中、
Ｒ１およびＲ２は、互いに同じであるか、または異なり、−Ｈ、−ＣＯ−ＣＨ３、ｎが１〜６である−ＣｎＨ２ｎ−１、１〜６個の炭素を有する直鎖もしくは分枝アルキル基からなる群より選択されるか、あるいはそれらは一緒に、５または６個の原子を有する芳香環または脂肪族環を形成し、
Ｒ３は、Ｈ、−ＣＯ−ＣＨ３、−ＮＨＯＨ、−ＯＨ、−ＯＲ６から選択され、ここでＲ６は、１〜６個の炭素を有する直鎖もしくは分枝アルキル基であり、
Ｒ４は、Ｈ、１〜６個の炭素を有する直鎖もしくは分枝アルキル基、フェニル、ベンジル、−ＣＦ３、−ＣＦ２ＣＦ３、ビニルまたはアリルから選択され、
Ｒ５、Ｒ７、Ｒ８は、Ｈ原子であるか、あるいは
Ｒ３およびＲ４、Ｒ４およびＲ５、またはＲ７およびＲ８は、一緒に、ベンゼン環に縮合された環、Ｎ、Ｏからなる群より独立して選択される１〜２個のヘテロ原子を含む５または６個の原子を有する芳香環または脂肪族環のいずれかを形成する）
またはその混合物およびそれらの薬理学的に許容可能な塩もしくはエステル。
【請求項８】
１〜６個の炭素を有する前記直鎖または分枝アルキル基は、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、イソプロピル、プロピル、−ＣｎＨ２ｎ−１から選択される、請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
Ｒ３およびＲ４は、以下の式（ＩＩＩ）
【化１５】
による環を形成する、請求項７に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ４およびＲ５は、以下の式（ＩＶ）
【化１６】
による環を形成する、請求項７に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｒ７およびＲ８は、以下の式（Ｖ）または（ＶＩ）
【化１７】
による環を形成する、請求項７に記載の化合物。
【請求項１２】
前記化合物は、
４−アミノ−Ｎ−ヒドロキシ−２−メトキシベンズアミド、
５−アミノ−Ｎ−ヒドロキシ−２−メトキシベンズアミド、
５−アミノ−２，３−ジヒドロベンゾフラン−７−カルボン酸、
５−アミノ−２−エトキシ−Ｎ−ヒドロキシベンズアミド、
６−アミノ−２，２−ジメチル−４Ｈ−ベンゾ［１，３］ジオキシン−４−オン、
１，２，３，４−テトラヒドロ−６−ヒドロキシキノリン−５−カルボン酸、
５−アミノ−２−イソプロポキシ安息香酸、
６−メトキシキノリン−５−カルボン酸、
６−メトキシ−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−５−カルボン酸、
５−ジイソプロピルアミノサリチル酸、
４−ジイソプロピルアミノサリチル酸
からなる群より選択される、請求項７に記載の化合物。
【請求項１３】
Ｒ１およびＲ２は、両方とも−ＣＨ（ＣＨ３）２である、請求項７に記載の化合物。
【請求項１４】
前記化合物は、以下の構造
【化１８】
を含む、請求項１３に記載の化合物。
【請求項１５】
Ｒ１およびＲ２は、両方とも−Ｈである、請求項７に記載の化合物。
【請求項１６】
Ｒ３は、−ＮＨＯＨである、請求項７または１５に記載の化合物。
【請求項１７】
前記化合物は、以下の構造
【化１９】
を含む、請求項１６に記載の化合物。
【請求項１８】
前記化合物は、以下の構造
【化２０】
を含む、請求項１６に記載の化合物。
【請求項１９】
前記化合物は、以下の構造
【化２１】
を含む、請求項１６に記載の化合物。
【請求項２０】
Ｒ３は−ＯＨである、請求項１５に記載の化合物。
【請求項２１】
前記化合物は、以下の構造
【化２２】
を含む、請求項２０に記載の化合物。
【請求項２２】
前記化合物は、以下の構造
【化２３】
を含む、請求項２０に記載の化合物。
【請求項２３】
前記化合物は、以下の構造
【化２４】
を含む、請求項９に記載の化合物。
【請求項２４】
前記化合物は、メサラジンまたは５−アミノサリチル酸である、請求項７に記載の化合物。
【請求項２５】
難治性のセリアック病被験体における免疫炎症の処置に使用するための請求項１〜２４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２６】
食事療法の誤りにより誘発される、食事療法中のセリアック病被験体における免疫炎症反応の処置に使用するための請求項１〜２４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２７】
臨床的および／または組織学的寛解時間を短縮するためのセリアック病における免疫炎症性成分の処置に使用するための請求項１〜２４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２８】
セリアック病におけるサイトカインの放出を選択的に遮断するのに使用するための請求項１〜２４のいずれか１項に記載の化合物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２０１１−５０７８１８（Ｐ２０１１−５０７８１８Ａ）
【公表日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３８８０１（Ｐ２０１０−５３８８０１）
【出願日】平成２０年１２月２３日（２００８．１２．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６８２６５
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０８０８２８
【国際公開日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【出願人】（５０５３６７０１７）ジュリアーニ インターナショナル リミテッド (9)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月２３日（２００８．１２．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６８２６５
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０８０８２８
【国際公開日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【出願人】（５０５３６７０１７）ジュリアーニ インターナショナル リミテッド (9)
【Ｆターム（参考）】
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