セルロースエステル膜の架橋方法
本発明は、多孔質架橋セルロース膜の製造方法、及びクロマトグラフィー用リガンドを架橋セルロース膜にカップリングさせる方法に関するものである。本発明は、本発明の方法で得ることができる膜を使用することにより、溶液中で、第一成分の第二成分からの分離を、第一成分と第二成分のサイズの違いにもとづいて行う方法、並びに標的分子を、溶液中の他の成分から分離する方法を提供するものである。こうした方法は、タンパク質を細胞溶解液や培養液から分離する際に特に有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セルロースエステル膜を架橋して、物理的強さと塩基による加水分解に対する抵抗性を向上する方法に関するものである。膜を活性化し、クロマトグラフィー用リガンドにカップリングする方法、並びに本発明の方法によって製造された膜を使用して、標的分子を溶液から分離する方法も記載する。
【背景技術】
【０００２】
化学やバイオテクノロジーの現場、例えば、新規な生物薬剤や診断薬を大規模に生産する現場では、標的分子のクロマトグラフィーによる分離の商業的価値は高い。また、最近では、ヒトゲノムによって発現されるタンパク質の機能を調べるプロテオミクスの分野が進捗したため、タンパク質の精製も重要な意味をもつようになっている。
【０００３】
一般に、タンパク質は、細胞培養によって生産され、この場合、タンパク質は、細胞内にとどまるか、周囲の培養液に分泌される。使用する株化細胞は、生きた生物であるため、白糖、アミノ酸、成長因子などを含む複雑な生育用培養液を与える必要がある。栄養分と細胞の副生物が入り混じった複雑な混合物から、所望のタンパク質を、治療に利用するうえで十分なレベルまで分離、精製する作業は、大変な作業である。
【０００４】
多孔質ポリスルホン膜及びセルロース膜は、化学物質や生体物質が入り混じった混合物を濾過、分離する用途で、広く利用されている（欧州特許第０４８３１４３号参照）。こうした膜としては、限外濾過膜及び精密濾過膜を挙げることができ、こうした濾過の過程は、静水圧の差に基づいている。限外濾過膜は、分子量が５００〜１，０００，０００ダルトンの高分子を保持できる孔径を持つことを特徴としており、精密濾過膜には、直径が０．０１〜１０μｍの範囲の選択透過性の孔が設けられている。
【０００５】
セルロースの水和物やエステル膜のは、膜を用いた濾過技術では周知であり、それぞれ、有利な利点をあわせ持っている。こうした利点としては、例えば、親水性であることを挙げることができ、界面活性剤を使わなくても膜を湿潤させることができる。また、この種の膜は、タンパク質の吸着も少なく、耐熱性が高く、柔軟性も高い。
【０００６】
しかし、広く利用されているにも関わらず、セルロース膜にはいくつかの欠点があり、こうした欠点としては、例えば、強酸及び強塩基並びにセルラーゼ酵素の攻撃を受けやすい点を挙げることができる。塩基への感受性は、まず収縮と膨潤によって示され、最終的には、膜が分解する。高温では、化学的分解と収縮が進行し、低温では、特に、実質的な濃度のアルカリが存在する場合には、膨潤及び破裂が進行する。膜の孔構造は、容易に破壊され、膜を通過する流体の流量が劇的に低減する。セルロース膜のアルカリ感受性は、例えば、強アルカリ洗浄液を用いて膜を洗浄することによって濾過能を回復せねばならない場合には、大きく不利になる。
【０００７】
セルラーゼは、醸造産業では日常的に見られ、セルロース膜を、非滅菌環境で長期にわたって貯蔵した際にセルロース膜に生育する微生物からも自然に発生する。セルラーゼは、セルロース多糖を分解して、より小型の化学物質の断片、例えばグルコースとすることによって、膜を攻撃する。セルロース水和物膜が分解すると、分解副生物の一部がいわゆる「疑似パイロジェン」又は発熱物質を生じるので、セルロース水和物膜は、製剤製品の濾過には利用しにくい。
【０００８】
セルロース繊維は、架橋によって改質できることが、繊維産業での経験にもとづいて従来から知られている（Ｋｉｒｋ−Ｏｔｈｍｅｒ’ｓ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２２，ｐｐ．７７０−７９０（３ｒｄ Ｅｄ．１９８３）参照）。こうした架橋は、セルロース膜の物理的強さと化学的抵抗性を改善するうえでも、極めて望ましい。また、例えば、タンパク質結合性リガンドをセルロースポリマーのヒドロキシル基にカップリングさせる等の目的で膜を化学的に誘導化することが望ましい場合も、塩基に対する感受性は、極めて重要である。
【０００９】
欧州特許第０１４５１２７号には、ケトン脱ろう溶剤を、脱ろう油から分離する際に使用するための、再生セルロース水和物膜の架橋方法が開示されており、この方法では、セルロース水和物膜を、架橋剤溶液と接触させる。しかし、この架橋膜生成物は、もとの膜と比べて、親水性が相当低下おり、また、架橋度が上がると、この種の膜を通過する流体の流量は、非架橋セルロース水和物膜と比べて、一気に約８０％も低減する。さらに、二官能性試薬と架橋させる場合には、二官能性試薬の水溶性が低いため、有機溶剤又は非プロトン性溶剤を用いなければならず、この方法は技術的に困難で、費用を要するものであった。
【００１０】
欧州特許第０２１４３４６号には、脱ろう油中に存在する極性溶媒、例えばケトン脱ろう溶剤を分離する際に使用ために、酢酸セルロース膜を架橋して、有機溶液に対する抵抗性を改善する方法が記載されている。この方法では、架橋は、酢酸セルロース膜の構造中に存在するヒドロキシル基と反応する二官能性試薬を用いることによって、実現されている。なお、二官能性試薬は、酢酸セルロース膜中に存在する遊離ヒドロキシル基と直接反応するが、文献中には、塩基による加水分解によってアセテート基を除去することは、開示されていない。
【００１１】
米国特許第５７３９３１６号には、セルロース水和物膜を、水溶性ジエポキシド（例えば、５−エチル−１，３−ジグリシジル−５−メチルヒダントイン）と、塩基の存在下で架橋する方法が教示されている。アルカリ性溶媒が、ジエポキシドとセルロースの反応の触媒として作用し、また、水がセルロースに対して及ぼす悪影響を失活させるうえでの触媒として作用する。膜の用途としては、水性／油性エマルションの分離と、バイオ技術で製造した水性溶媒及び飲料からのタンパク質の分離への利用が記載されている。
【００１２】
米国特許出願公開第２００４／０２０６６９４号には、架橋セルロース水和物膜の製造方法が開示されている。この方法では、再生セルロース水和物膜を、塩基性かつ還元性の条件下で、エピクロロヒドリンによって処理して、エポキシ化架橋生成物を得、この生成物を、アミン求核試薬（例えば、ジメチルエチレンジアミン）でさらに処理して、正に帯電した架橋セルロース膜を製造している。あるいは、エポキシ化架橋生成物を、クロロ酢酸ナトリウムと、塩基性の条件下で反応させることによって、負に帯電した膜を得ることもできる。
【００１３】
正又は負に帯電した膜の１工程での製造方法も記載されており、この方法では、エポキシド基及び、電荷を持ちうる基を持つグリシジル試薬（例えば、グリシジル第四級化合物又はグリシジル酸）を、塩基性の条件下で、直接、ヒドロキシルポリマーと反応させることができる。
【００１４】
したがって、本発明の目的は、高い流量に対しても、また、タンパク質が吸着しにくく、柔軟だという特性に対しても悪影響を及ぼすことなく、セルロースエステル膜を架橋させて、この膜の塩基に対する抵抗性を向上させ、クロマトグラフィー用リガンドによる化学的修飾を可能とすることにある。本発明のもう一つの目的は、クロマトグラフィー用リガンドを、架橋膜のヒドロキシル基に、直接、又は化学的修飾を行ってからカップリングさせる方法を提供することにある。本発明の別の目的は、上述の方法によって調製した膜を提供することにある。こうした膜は、溶液の成分を、サイズと形状にもとづいて分離する際に使用することができる。本発明のさらに別の目的は、この膜を使用して、標的分子を、標的分子の結合アフィニティにもとづいて、溶液中の他の成分から分離する方法を提供することにある。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の第一の観点では、多孔質架橋セルロース膜の製造方法を提供する。この方法は、複数のセルロースエステル基を含む膜に、塩基を、二官能性試薬の水溶液の存在下で、上記エステル基のヒドロキシル基への加水分解並びに上記ヒドロキシル基の上記二官能性試薬との架橋が生じうるような条件で加える工程を含んでおり、上記の加水分解と架橋とが、実質的に同時に生じることを特徴としている。当業者であれば、セルロース膜が、当初、複数のエステル基に加えて、遊離ヒドロキシル基を含んでいてもよいことを理解できるはずである。これらの遊離ヒドロキシル基が、二官能性試薬との架橋反応に関与してもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
塩基は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化バリウム、水酸化テトラアルキルアンモニウム、炭酸ナトリウム、炭酸セシウム、三リン酸ナトリウム、ケイ酸ナトリウム、炭酸カリウム、ケイ酸カリウム、三リン酸カリウム、炭酸水素ナトリウムからなる群から選ぶのが適当である。塩基は、好ましくは、水酸化ナトリウムである。
【００１７】
セルロースエステルは、酢酸セルロース、硝酸セルロース、キサントゲン酸セルロース、プロピオン酸セルロース、酪酸セルロース、安息香酸セルロース、及びそれらの混合物からなる群から選ぶのが適当である。エステルは、好ましくは、酢酸セルロースである。
【００１８】
二官能性試薬は、エピクロロヒドリン、エピブロモヒドリン、ジイソシアネート、ジメチル尿素、ジメチルエチレン尿素、ジメチルクロロシラン、ビス（２−ヒドロキシエチルスルホン）、グリシジルエーテル、ブタンジオールジグリシジルエーテル、ジビニルスルホン、アルキレンジハロゲン、ヒドロキシアルキレンジハロゲンからなる群から選ばのが適当である。
【００１９】
グリシジルエーテルは、ブタンジオールジグリシジルエーテル、エチレングリコールジグリシジルエーテル、グリセロールジグリシジルエーテル、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテルからなる群から選ぶのが適当である。
【００２０】
二官能性試薬は、エピクロロヒドリン（ＥＣＨ）とするのが好ましい。エピクロロヒドリンは、３−クロロプロピレンオキシド、クロロメチロキシラン、１−クロロ−２，３−エポキシプロパンとしても知られている。
【００２１】
必要に応じて、二官能性試薬の混合物を使用する。
【００２２】
この過程は、無機塩の存在下で行うことが好ましい。塩は、硫酸ナトリウムとするのがさらに好ましい。
【００２３】
この方法は、水混和性溶剤を加えて、二官能性試薬の溶解度を上昇させる工程をさらに含むものとするのが適当である。なお、溶剤の濃度は、セルロースエステル膜が溶解したり、膨潤しはじめたりするレベルより低いものとする必要があることを理解されたい。
【００２４】
溶剤は、アルコール、ケトン、エーテルからなる群から選ぶのが適当である。溶剤は、メタノール、エタノール、エチレングリコール、グリセロール、プロピレングリコール、アセトン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジグリムからなる群から選ぶのが好ましい。
【００２５】
水混和性溶剤は、最終濃度が５０％（ｖ／ｖ）となるまで加えるのが適当であり、最終濃度が２５％（ｖ／ｖ）程度となるまで加えるのが好適である。
【００２６】
この方法は、２０℃〜７０℃の温度で３０分〜４８時間にわたってに実施するのが適当であり、好ましくは、２５℃〜６０℃の温度で、より好ましくは、４５℃〜５５℃の温度で３０分〜４８時間にわたって実施するのが好ましい。２５℃〜６０℃の温度で２〜２４時間にわたって実施するのが好ましく、４５℃〜５５℃の温度で２〜２４時間にわたって実施するのがさらに好ましい。
【００２７】
膜は、複数の酢酸セルロース基を含んでいるのが好ましい。
【００２８】
より好ましくは、膜は、複数の酢酸セルロース基を含んでおり、塩基は水酸化ナトリウムであり、二官能性試薬はエピクロロヒドリンである。
【００２９】
特に好ましくは、この方法は、４５℃〜５５℃の温度で、少なくとも１時間にわたって実施し、好ましくは、この方法は、４７℃の温度で実施する。
【００３０】
二官能性試薬がエピクロロヒドリンである場合は、上記方法が、さらなるエピクロロヒドリン水溶液と塩基を、エステル基のヒドロキシル基への加水分解と、ヒドロキシル基のエピクロロヒドリンによる活性化が生じうるような条件で加えて、エポキシ活性化架橋セルロース膜を生成する工程をさらに含むものとするのが適当である。
【００３１】
一形態では、この方法は、さらに、クロマトグラフィーリガンドを、架橋セルロース膜のヒドロキシル基に結合させる工程を含んでいる。このクロマトグラフィーリガンドの結合は、官能化としても、また場合によっては、誘導化としても知られており、この工程は、帯電ずみ又は帯電可能な基を結合させて、イオン交換マトリックスを調製することにより、生物学的アフィニティを示す基を結合させて、アフィニティマトリックスを調製することにより、キレート基を結合させて、固定化金属アフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）マトリックスを調製することにより、あるいは、疎水基を結合させて、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）マトリックスを調製することによって行う。具体的な形態では、官能基は、第四級アンモニウム（Ｑ）及びジエチルアミノアチル（ＤＥＡＥ）基からなる群から選択されるイオン交換リガンドである。他のイオン交換基の例としては、ジエチルアミノプロピル、スルフォプロピル（ＳＰ）、カルボキシメチル（ＣＭ）基がある。
【００３２】
官能基を固相支持体、例えば分離用マトリックスに結合する方法は、当業者には周知であり、前もって、置換基をアリル化しておく工程を実施し、標準的な試薬及び条件を用いることができる（例えば、『Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｌｉｇａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ』，Ｈｅｒｍａｎｓｏｎら（Ｇｒｅｇ Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ， Ａ．Ｋｒｉｓｈｎａ Ｍａｌｌｉａ、及びＰａｕｌ Ｋ．Ｓｍｉｔｈ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＩＮＣ，１９９２参照）。本発明の架橋セルロース膜には、官能化を行う前に、エキステンダー（可撓性アーム、テンタクル、又はフラフとしても公知）を設けておいてもよい。周知のエキステンダーとしては、デキストランを挙げることができる。例えば、米国特許第６，５３７，７９３号を参照のこと。この特許では、多糖マトリックスにエキステンダーを加えることが詳述されている。
【００３３】
この方法は、クロマトグラフィー用リガンドを、上記のエポキシ活性化架橋セルロース膜とカップリングさせる工程をさら含むものとするのが好ましい。リガンドは、アミン又はチオール基を含むものとするのが好ましく、アミンがアンモニアであるのがさらに好ましい。
【００３４】
上記の方法は、クロマトグラフィー用リガンドを、上記のエポキシ活性化架橋セルロース膜とカップリングさせる工程をさら含むものとするのが適当である。
【００３５】
カップリングは、第一の酸化工程と、第二の還元アミノ化工程を含むものとするのが適当である。第一の酸化工程は、膜の過ヨウ素酸塩溶液による処理を含むものとするのが好ましい。第二の還元アミノ化工程が、膜の水素化ホウ素ナトリウ（ＮａＢＨ4）による処理を含むものとするのが好ましい。
【００３６】
リガンドは、アミン基を含むものとするのが適当であり、アミンは、第二級アミンとするのが好ましい。第二級アミンは、より好ましくは、ビス（３−アミノプロピル）アミンである。
【００３７】
リガンドは、グリシジル第四級アンモニウム化合物、例えば塩化グリシジルトリメチルアンモニウム（ＧＭＡＣ）を含むものとするのが適当である。このグリシジル第四級アンモニウム化合物のカップリングでは、還元剤の存在下で、塩基を使用するのが適当である。還元剤は、水素化ホウ素ナトリウとするのが好ましい。塩基は、水酸化ナトリウムとするのが好ましい。
【００３８】
本発明の第二の観点では、多孔質架橋セルロース膜を提供するものであり、この多孔質架橋セルロース膜は、複数のセルロースエステル基を含む膜に、塩基を、二官能性試薬の水溶液の存在下で、上記エステル基のヒドロキシル基への加水分解並びに上記ヒドロキシル基の上記二官能性試薬との架橋が生じうるような条件で加える工程を含み、上記の加水分解と架橋とが、実質的に同時に生じることを特徴とする多孔質架橋セルロース膜の製造方法によって製造された多孔質架橋セルロース膜である。
【００３９】
本発明の第三の観点では、溶液又は懸濁液中で、第一成分の第二成分からの分離を、第一成分と第二成分のサイズの違いにもとづいて行う方法を提供する。この方法は、上述の膜を利用した精密濾過法又は限外濾過法である。
【００４０】
精密濾過は、一般に直径０．１μｍを超える懸濁した固形物やコロイドを除去する低圧での膜濾過法であるとして定義される。こうした方法は、顕微鏡を用いれば見ることのできる粒子や微生物、例えば、細胞、マクロファージ、大型のウイルス粒子、及び細胞の細片を分離する際に使用することができる。
【００４１】
限外濾過は、粒径０．１μｍ以下の溶質を分離する低圧での膜濾過法であるとして定義される。したがって、例えば、分子のサイズが、溶剤分子より有意に大きい溶質は、適当な膜（通常は、孔径範囲が０．００１〜０．１μｍの膜）を通して溶剤のみを通過させるような水圧をを加えることによって、溶剤から除去できる。限外濾過を用いると、溶液から細菌やウイルスを除去することができる。
【００４２】
本発明の膜は、標的化合物、特に生体分子を単離する際にも使用できる。こうした生体分子としては、タンパク質、モノクローナル又はポリクローナル抗体、ペプチド（例えば、ジペプチド又はオリゴペプチド）、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）、ペプチド核酸、ウイルス及び細胞（例えば、細菌細胞、プリオンなど）を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。一方、この膜は、有機分子、例えば代謝生成物及び薬剤候補物質を単離する際にも、有用である。別の形態では、本発明の膜は、診断目的などで、上述の標的化合物の任意のものを識別するうえでも有用である。したがって、本発明の膜を利用して精製する生成物としては、薬剤又は薬剤の標的；治療用ベクター、例えば遺伝子治療用のプラスミド又はウイルス；サプリメンツ、例えば機能性食品；診断薬などを挙げることができる。また、本発明にしたがって精製した生体分子の具体的用途としては、テイラーメード医療用の薬剤を挙げることができる。本発明の膜は、不要な標的化合物、例えば、上述のような化合物から、所望の液体を精製する際にも利用できる。
【００４３】
したがって、本発明の第四の観点では、標的分子を、溶液中の他の成分から分離する方法であって、この方法が、上述の膜を使用するようなクロマトグラフィーである方法を提供する。
【００４４】
クロマトグラフィーという用語は、一連の似通った方法をまとめて称する名称であり、クロマトグラフィーに含まれる各種の方法には、いずれも、共通の特徴として、２つの互いに非混和性の相を接触させ、一方の相が静止相で、もう一方の相が移動相であるという特徴がある。本発明では、膜が静止相を、溶液が移動相を構成する。クロマトグラフィーは、混入した化合物から液体を精製する際にも、液体から、１以上の特定の化合物を回収する際にも、使用できる。
【００４５】
これまで、細胞及び／又は細胞の細片は、濾過によって除去されてきた。目的タンパク質を含む透明な溶液が得られたら、この目的タンパク質の、溶液の他の成分からの分離は、通常、各種のクロマトグラフィー技術を組み合わせて実施される。こうした技術では、タンパク質を、電荷、疎水性の程度、アフィニティ特性、サイズなどにもとづいて分離する。これらの各技術に用いるいくつもの異なったクロマトグラフィー用のマトリックスが市販されているので、目的とする特定のタンパク質に応じた精製スキームを自在に組むことができる。本発明の文脈では、タンパク質は、主に、電荷及び／又はアフィニティ特性にもとづいて分離することができる。
【００４６】
標的分子は、膜中に存在するクロマトグラフィー用リガンドと結合する結合性部分を含んでいるものとするのが適当である。
【００４７】
標的分子は、タンパク質とするのが適当である。標的分子は、ポリヌクレオチド又は天然生成物とすることができる。標的分子は、タンパク質とするのが好ましい。
【００４８】
標的分子をタンパク質とし、溶液を細胞抽出物、細胞溶解物、又は細胞培養液とするのが好ましい。
【００４９】
リガンドは、正又は負に帯電しているのが適当である。
【００５０】
リガンドと結合部分は、それぞれ、特異的結合ペアの片方とし、各成分が、もう一方の成分に対して、特異的結合アフィニティを有するものするのが好適である。リガンドと結合部分は、ビオチン／ストレプトアビジン、ビオチン／アビジン、ビオチンビオチン／ニュートラアビジン、ビオチン／キャプトアビジン、エピトープ／抗体、ＧＳＴ／グルタチオン、Ｈｉｓ−ｔａｇ／ニッケル、抗原／抗体、ＦＬＡＧ／Ｍ１抗体、マルトース結合性タンパク質／マルトース、キチン結合性タンパク質／キチン、カルモジュリン結合性タンパク質／カルモジュリン（Ｔｅｒｐｅ、２００３、Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、６０、５２３−５３３）、Ｌｕｍｉｏ（登録商標）試薬／Ｌｕｍｉｏ（登録商標）認識配列からなる群から選ぶのが好ましい。Ｌｕｍｉｏ（登録商標）試薬と認識配列（Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ）は、のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ社（米国カールスバッド）より入手可能である。
【００５１】
リガンド／結合部分の他の例としては、酵素阻害物質／酵素（例えば、ベンズアミジン又はアルギニンと、セリンプロテアーゼ、例えばカタラーゼ）、ヘパリン／凝固因子、リジン残基／プラスミノーゲン又はリボソームＲＮＡ、プロシオンレッド／ＮＡＤＰ＋依存性酵素、Ｃｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅ／血清アルブミン、コンカナバリンＡ／グルコピラノシル及びマンノピラノシル基、並びにプロテインＡ又はプロテインＣ／ＩｇＧのＦｃ領域を挙げることができる。
定義
「架橋」という用語は、本発明の文脈において使用する場合には、ポリマー（すなわち、セルロースポリマー）の別々の鎖の間、又は単一の鎖の一部の間に結合が存在し、その結果、ポリマーの剛性及び／又は保存性が増大することを意味すると理解されたい。
【００５２】
「膜」という用語は、本発明で使用する場合には、通常、その性質上積層が可能であり、複数の孔を含み、その両側に位置する溶液に対してフィルターとして機能する薄いシート又は層を意味すると理解されたい。
【００５３】
「塩基」という用語は、プロトンを獲得する傾向のある物質という従来通りの化学的意味として理解されたい。したがって、塩基は、例えば、水溶液中で酸と反応して塩と水のみを形成する物質、したがって、ヒドロキシルイオンを生じる物質である。
【００５４】
「二官能性試薬」という用語は、本明細書で用いる場合には、反応性官能基を２つ有する化合物であって、１分子の２つの基、又は２つの異なった分子のそれぞれに含まれる１つの基と相互作用を生じうる化合物のことを意味している。
【００５５】
「実質的に同時」という表現は、加水分解によって反応しうる状態となったヒドロキシル基の一部が、架橋反応に関与するかたちで、加水分解及び架橋が、本質的に並行して生じることを意味すると理解されたい。
【００５６】
「標的分子」という用語は、本発明の方法によって、吸着によって標的とされる任意の化合物又は実体のことをいう。
【実施例】
【００５７】
実施例１：酢酸セルロース膜の架橋
Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社から販売されている０．６５μｍの酢酸セルロース（ＣＡ）膜を、全実験で使用した。酢酸セルロース膜を、エピクロロヒドリン（以下ＥＣＨと称する。Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ ６０６， ３１９０ ＡＮ Ｈｏｏｇｖｌｉｅｔ Ｒｔ， Ｔｈｅ ＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓのＲｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｓｖｅｒｉｇｅ社から入手）及びＮａＯＨと架橋した。膜は、架橋工程の間はピンセットで所定の場所に保持し、架橋完了後、水洗した。
【００５８】
架橋膜はいずれも蒸留水で洗浄した（０．６Ｌで４回）。１Ｌの水を用い、後述する方法で、流れ時間を測定した（「流れ時間の測定」参照）。膜について行った実験の要旨については、表１及び２を参照されたい。
【００５９】
基準／対照膜
膜を秤量し、蒸留水中に３．５週間浸漬した。流れ時間は、８８秒及び８８秒（ｐ≒−０．８８バール）であった。０．６５μｍのＣＡ膜の流れ時間は、蒸留水中で保存することによって、６５〜７０秒から８５〜９０秒に伸びるようである。膜を真空室で４８時間にわたって乾燥したところ、新しい膜が７９．７７ｍｇであるのに対し、７８．７９ｍｇとなった。この重量の減少幅は、水洗後真空乾燥を行った場合の正常な範囲内である。流れ時間を再度測定し、未処理の膜の正常値に戻るかどうかを観察した。流れ時間は９２秒及び９３秒（ｐ≒−０．８９）であった。膜を蒸留水中で一晩保存し、流れ時間を２回測定したところ、両回とも７０秒であった（ｐ≒−０．８９バール）。
【００６０】
サンプルＫ２Ｃ：
２５５μＬのＥＣＨ（エピクロロヒドリン）を、１００ｍＬの蒸留水に４℃で溶解した。０．６５μｍの酢酸セルロース膜を、この溶液中に浸漬し、ピンセットで、その位置に保持した。５ｍＬの１．０ＭのＮａＯＨを加え、膜を４５℃で２時間保持した。
【００６１】
サンプルＫ７Ｃ：
湿潤させた膜（Ｋ７）を、１０ｇのＮａ2ＳＯ4と２．５０ｍＬのＥＣＨの１００ｍＬの水への溶液の入った１００ｍＬのデュランフラスコに浸漬した。ＥＣＨの一部が蒸発したかどうかは不明である。膜（Ｋ７）は、溶液と接触することで、やや硬化したように見えた。１．６８８ｍＬの５０％ＮａＯＨを、０．０２８ｍＬ／分で加えた。膜を一晩そのままの状態で載置し、ｐＨを測定したところ、ｐＨは１３〜１４であった。
【００６２】
サンプルＫ８Ｃ：
湿潤させた膜（Ｋ８）を、２．５０ｍＬのＥＣＨの１００ｍＬの水への溶液の入った１００ｍＬのデュランフラスコに浸漬した。１．６８８ｍＬの５０％ＮａＯＨを、０．０２８ｍＬ／分で加えた。膜を一晩そのままの状態で載置し、ｐＨを測定したところ、ｐＨは１２であった。
【００６３】
サンプルＫ９Ｃ：
１．００ｍＬのＥＣＨを１００ｍＬの水に加え、室温で撹拌することによって溶解させた。ＥＣＨが溶解した時点で、１０ｇのＮａ2ＳＯ4を加えた。溶液の入ったデュランフラスコを水浴に入れ、４７℃に加熱した。湿潤させた膜（Ｋ９）を、デュランフラスコに浸漬した。０．６７４ｍＬの５０％ＮａＯＨを３４分にわたって加えた（０．０２０ｍＬ／分）。塩基の全量を加えた後も、膜を溶液中に４時間そのまま保持した。
【００６４】
サンプルＫ１０Ｃ
１０ｇのＮａ2ＳＯ4を、１００ｍＬの水に溶解した。ゆっくり撹拌しながら、１．００ｍＬのＥＣＨを加え、デュランフラスコを、撹拌せずに２．７５時間静置した。ＥＣＨがすべて溶解した時点で、フラスコを水浴（４７℃）に入れた。０．６７４ｍＬの５０％ＮａＯＨを０．０２０ｍＬ／分で、３４分にわたって加えた。塩基の全量を加えた後も、膜を溶液中に１時間そのまま保持した。ｐＨは１３〜１４であった。
【００６５】
サンプルＬ１Ｃ：
１．００ｍＬのＥＣＨを、１００ｍＬの水に加え、室温で撹拌することによって溶解させた。ＥＣＨが溶解した時点で、１０ｇのＮａ2ＳＯ4を加えた。溶液の入ったデュランフラスコを水浴に入れ、２５℃（ｐＨ６〜７）に加熱した。湿潤させた膜（Ｌ１、７８．９９ｍｇ）を、デュランフラスコに浸漬した。０．６７４ｍＬの５０％ＮａＯＨを３４分にわたって加えた（０．０２０ｍＬ／分）（ｐＨ１３〜１４）。塩基の全量を加えた後も、膜を、溶液中に２５℃で１８時間そのまま保持した（ｐＨ１２〜１３）。
【００６６】
サンプルＬ２Ｃ：
０．５０ｍＬのＥＣＨを１００ｍＬの水に加え、室温で撹拌することによって溶解させた。ＥＣＨが溶解した時点で、１０ｇのＮａ2ＳＯ4を加えた。溶液の入ったデュランフラスコを水浴に入れ、４７℃に加熱した。湿潤させた膜（Ｌ２、７８．７４ｍｇ）を、デュランフラスコに浸漬し、０．３３６ｍＬの５０％ＮａＯＨを、０．０２０ｍＬ／分で１７分間にわたって加えた。膜を、溶液中に１７℃で１８時間そのまま保持した（ｐＨ１１〜１２）。
【００６７】
サンプルＬ３Ｃ：
１．００ｍＬのＥＣＨを１００ｍＬの水に加え、室温で撹拌することによって溶解させた。ＥＣＨが溶解した時点で、１０ｇのＮａ2ＳＯ4を加えた。溶液の入ったデュランフラスコを水浴に入れ、３０℃に加熱した。湿潤させた膜（Ｌ３、７８．７７ｍｇ）を、デュランフラスコに浸漬した。０．６７４ｍＬの５０％ＮａＯＨを３４分間にわたって加えた（０．０２０ｍＬ／分）（ｐＨ≒１４）。膜を３０℃で一晩静置した。膜は、塩基の添加終了後、合計で１７．２５時間浸漬した。膜を洗浄し、流れを測定した。
【００６８】
サンプルＬ４Ｃ：
サンプルを、サンプルＫ９Ｃと同様に処理した（表１を参照のこと）。反応後のｐＨは、１２〜１３であった。
【００６９】
サンプルＭ１Ｃ：
このサンプルは、Ｎａ2ＳＯ4の添加量を５ｇのみとした以外は、サンプルＬ４Ｃと同様に調製した（表１を参照のこと）。
【００７０】
サンプルＭ３Ｃ：
このサンプルは、サンプルを反応混合物中に４．５時間浸漬した以外は、サンプルＬ４Ｃと同様に調製した（表１）。反応後のｐＨは、１２〜１３であった。
【００７１】
Ｍ５Ｃ：
２．５ｍＬのＥＣＨを１００ｍＬの水に加え、室温で撹拌することによって溶解させた。ＥＣＨが溶解した時点で、１０ｇのＮａ2ＳＯ4を加えた。溶液の入ったデュランフラスコを水浴に入れ、４７℃に加熱した。湿潤させた膜（Ｍ５、７９．２０ｍｇ）を、デュランフラスコに浸漬した。１．６８８ｍＬの５０％ＮａＯＨを、０．０２０ｍＬ／分で加えた（８４分）。塩基を加え終わった後も、膜を、４７℃で２１時間にわたって浸漬させ、その後、洗浄を行った（ｐＨ１３〜１４）。ｐ≒−０．９１バールでの流れ時間は、５７秒及び５７秒であった。
【００７２】
流れ時間の測定
膜を通過する水の流れを、架橋した膜の孔の構造のちがいを近似する手段として測定した。流れの変化が生じていれば、孔の構造に変化があったことが示唆される。水をメスシリンダーで計測し、真空フラスコに接続したメンブレンフィルターの漏斗に加えた。真空フラスコは、真空中央値（約−０．９バール）に接続し、圧力計を使用して圧力を測定した。流れ時間は、１リットルについて測定した。メンブレンフィルターの漏斗に水を加え（約０．２５Ｌ）、残りの水は、水が膜を通過するにしたがって、徐々に加えた。流量及び圧力についての観察結果を、表１及び２に示す。
【００７３】
流れ特性
流れ特性は、１Ｌの水が膜を通過するのに要した時間を測定することによって決定した。以下では、この時間のことを、「流れ時間」と称する。未処理の０．６５μｍのＣＡ膜の流れ時間は、通常、６５〜７０秒程度であった。しかし、未処理膜の流れ時間は、水中に保存すると、徐々に上昇した（上述の「参照／対照膜」を参照のこと）。一例を挙げると、蒸留水中に３．５週間保存しておいた膜の流れ時間は、８５〜９０秒であった。乾燥後、再度一晩湿潤させたところ、流れ時間は７０秒となった。したがって、膜を一度乾燥させ、その後再度湿潤させることによっても、効果を復元することが可能なようであった。
【００７４】
架橋膜の流れ時間は、未反応のＣＡ膜でも、ほぼ同じであった。また、流れ時間は、未反応膜の方が、水中に約２週間保存してあった膜（流れ時間は、８５〜９０秒と長かった）より短かった。測定された流れ時間（表１及び表２を参照のこと）は、６５〜９０秒の範囲であった。このことによって、架橋によって膜の孔構造に有意な変化が生じないことが示唆された。各実験で、架橋剤の量と架橋条件の双方を変化させた。硫酸ナトリウムの存在下で架橋を行った場合（例えば、表１のサンプルＫ７Ｃ及びＫ８Ｃ）、架橋膜の流れ特性が改善することが観察された。
【００７５】
架橋酢酸セルロース膜の塩基に対する抵抗性
架橋について調べるために、膜Ｋ２Ｃ及びＬ１Ｃを、１．０ＭのＮａＯＨで２時間にわたって処理した（Ｋ２Ｃは、約２０ｍＬに、Ｌ１Ｃは２５ｍＬに浸漬した）。この塩基処理によって流れ時間が変化しなければ、架橋が生じ、膜は、その結果として、塩基処理による構造の変化から保護されたことが示唆されたものと理解した。一方、流量が低下していれば、膜の孔構造に何らかの構造の変化が生じたことが示唆されたものと理解することができる。
【００７６】
流量は、架橋が最も少ない膜（Ｋ２ＣＨ）についてのみ、有意に減少した。表３を参照のこと。この膜は、有意な程度に重量が減少した唯一の膜でもあった。他の膜は、塩基による処理の前の流れ時間及び重量を維持していた。こうした結果から、架橋が成功していたことが示された。膜Ｋ2ＣＨも、同様の処理の後には、未架橋膜より優れた流れ特性を示したので、架橋していたものと考えられる。未架橋膜の流れは、１．０ＭのＮａＯＨで２．５分間処理すると、劇的に低減した。膜Ｌ１ＣＨが有意な重量変化を示さなかったことからは、酢酸塩基の大半が脱離し、その結果、膜が、主に、架橋酢酸セルロースではなく、架橋セルロースから構成されていたことが示唆される。
【００７７】
実施例２： ＣＡ膜のエポキシ活性化
エポキシ活性化膜（Ｋ１０ＣＥ）を、表１に記載したようにして調製した。膜を、まず、Ｋ１０Ｃについて上述のしたようにしてＥＣＨで４７℃にて架橋し、次に、温度を２５℃まで下げ、ＥＣＨとＮａＯＨをさらに加えた（表１を参照のこと）。
【００７８】
エポキシ活性化の工程では、（架橋反応と比べて）反応温度を下げ、過剰なＥＣＨを使用した。目標は、反応後に膜に残るエポキシ基の量を増やすことであった。反応後に膜上に残っているエポキシ基の量は、相当多いはずである。
【００７９】
表１（Ｋ１０ＣＥを参照のこと）の結果からは、架橋後も膜が流れ特性を維持していることが明らかである。
【００８０】
エポキシ活性化には、酸化及び還元アミノ化を行う後述の方法より反応工程の数が少なくてすむという利点がある。
【００８１】
実施例３：酸化及びアミノ化による、アミン官能基を用いたリガンドの架橋膜とのカップリング
リガンドの結合のモデル物質として、アミンビス（３−アミノプロピル）アミンを使用した。酸化及び還元アミノ化によって、アミンを架橋膜にカップリングさせた。
【００８２】
第一段階：過ヨウ素酸ナトリウムによる酸化
膜中のアセテート基の大半は、架橋反応の過程で脱離したので、架橋膜を直接酸化することが可能であった。１５０ｍＬ入りのビーカー中で、ＮａＩＯ4を蒸留水に溶解した。ビーカーを、振盪版上に載置して、加水分解して洗浄した膜を加えた。膜を室温で２時間おき、蒸留水で洗浄した。下記の各実験では、各種の量のＮａＩＯ4を、使用した。
【００８３】
サンプルＫ９ＣＯ：
膜Ｋ９Ｃを湿潤させ、ＮａＩＯ4溶液（２．０ｇ、２０ｍＬの蒸留水への溶液）に加えた。２０ｍＬの蒸留水を加えた。膜を２時間浸漬したままとし、０．６Ｌの水で６回洗浄した。真空下で膜を一晩乾燥し、その後秤量した（４８．５７ｍｇ）。少量のサンプルを取り出し、膜を再度秤量した（４８．４９ｍｇ）。膜のこのサンプルは、シッフ試薬（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社より入手）で処理すると、濃紫色（ほぼ黒色）となった。この色から、膜が、アルデヒド基を含むことが示され、色が濃いほど、アルデヒドの量が多い。
【００８４】
サンプルＬ２ＣＯ：
膜Ｌ２Ｃを、ＮａＩＯ4溶液（１．０ｇの２０ｍＬの蒸留水への溶液）に加え、２時間浸漬した後、洗浄した。流れ時間は８０秒及び８５秒（ｐ≒−０．９３バール）であった。
【００８５】
サンプルＫ７ＣＯ：
９９．８ｍｇのＮａＩＯ4を、２０ｍＬの蒸留水に溶解した。膜Ｋ７Ｃを、この溶液に加えた。膜を２時間にわたって酸化し、洗浄した（ｐ≒−０．９１バールでの流れ時間、７０秒及び７１秒）。この膜を、真空で一晩乾燥させた。膜を秤量し（５０．３０ｍｇ）、その後、小片を切り取り、再度秤量した（５０．９３ｍｇ）。なお、この重量は、当初の重量より少なかった。シッフ試薬で処理したところ、膜から回収したサンプルは、濃紫色になった。
【００８６】
サンプルＬ４ＣＯ：
１００．７ｍｇのＮａＩＯ4を、２０ｍＬの蒸留水に溶解した。この溶液に膜Ｌ４Ｃを加えた。膜を２時間にわたって酸化し、その後洗浄した。その後、流れ時間を測定した（ｐ≒−０．９２バールでの流れ時間、７３秒及び７３秒）。膜を、真空下で一晩乾燥した。膜を乾燥し、シッフ試薬との反応用の小片を取り出す前に秤量し（５０．１９ｍｇ）、取り出した後も秤量した（５０．２０ｍｇ）。シッフ試薬で処理したところ、このサンプル小片は、濃紫色となった。
【００８７】
サンプルＭ３ＣＯ：
３３６．１ｍｇのＮａＩＯ4を、２０ｍＬの蒸留水に溶解した。この溶液に膜Ｍ３Ｃを加えた。膜を２時間にわたって酸化し、その後洗浄した。その後、流れ時間を測定した（ｐ≒−０．９１バールでの流れ時間、７２秒及び７５秒）。
【００８８】
第二段階：還元アミノ化
ビス（３−アミノプロピル）アミン（Ｌａｂｃｈｅｍ社より入手）を、１５０ｍＬのビーカーで、蒸留水又はメタノールで溶解した。酸化膜（すなわち、サンプルＫ９ＣＯ、Ｌ２ＣＯ、Ｋ７ＣＯ、Ｌ４ＣＯ）を加え、所定時間後（通常２時間後）、水素化ホウ素ナトリウ（ＮａＢＨ4、９５％、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を加えた。還元剤で２時間以上処理した後、膜を洗浄した。
【００８９】
サンプルＫ９ＣＯＡ：
５．９ｍＬのビス（３−アミノプロピル）アミンを２０ｍＬのメタノールに加えた。膜Ｋ９ＣＯをメタノール中で湿潤させ、アミン溶液に加えた。２時間後、０．５ｇのＮａＢＨ4を反応に加え、さらに２時間後に、０．５ｇのＮａＢＨ4を加えた。膜を、還元剤の存在下で合計３．２５時間インキュベートした。膜を、メンブレンフィルター用漏斗に載置し、０．６Ｌの蒸留水を６回、さらに１Ｌの蒸留水を通過させることによって洗浄した。膜を、真空下で一晩乾燥した。サンプル小片を、シッフ試薬に加えたところ、濃い紫色を呈した。これとは別に、膜のサンプル小片を切り出して、窒素分析に供した。
【００９０】
サンプルＬ２ＣＯＡ：
５．９ｍＬのビス（３−アミノプロピル）アミンを２０ｍＬのメタノールに加えた。膜Ｌ２ＣＯＡをアミン溶液に加えた。１０ｍＬのメタノールを加えた。膜を、３時間以上静置してから、ＮａＢＨ4溶液を加えた。ＮａＢＨ4溶液（０．３９ｇの１０ｍＬの冷却メタノールへの溶液）は、少量ずつ、３０分にわたって加えた。最後にＮａＢＨ4を加えた後、膜を１時間洗浄し、流れ時間を測定した（ｐ≒−０．９１で９１秒及び９６秒）。この膜を乾燥し、秤量した（４９．８２ｍｇ。シッフ試薬用サンプル採取後は、４９．７０ｍｇ）。シッフ試薬では、この膜のサンプルは、極めて濃い紫色となった。
【００９１】
サンプルＫ７ＣＯＡ：
５．９ｍＬのビス（３−アミノプロピル）アミンを２０ｍＬのメタノールに加えた。膜Ｋ７ＣＯＡを、アミン溶液に加えた。膜を３．５時間静置してから、氷浴で冷却しておいたＮａＢＨ4溶液を加えた。ＮａＢＨ4溶液（０．３９ｇの１０ｍＬのメタノールへの溶液）を少量ずつ加えたところ、膜が白色となった。最後にＮａＢＨ4溶液を加えた時点では、最初にＮａＢＨ4溶液を加えてから、約４５分が経過していた。最後にＮａＢＨ4溶液を加えてから約１５分後に、反応系を氷浴から取り出した。膜を、最後にＮａＢＨ4溶液を加えてから２．５時間にわたって乾燥した。膜を乾燥し、秤量した（５３．３２ｍｇ。シッフ試薬用サンプル採取後は、５３．１６ｍｇ）。窒素分析用のサンプルを切り出した（重量、５３．３４〜４３．３１ｍｇ）。シッフ試薬では、サンプル膜は濃紫色となった。
【００９２】
サンプルＬ４ＣＯＡ：
５．９ｍＬのビス（３−アミノプロピル）アミンを２０ｍＬのメタノールに加えた。膜Ｌ４ＣＯＡを水で湿潤させ、アミン溶液に加えた。２．５時間時間後、混合物に、ＮａＢＨ4の結晶をいくつか加えた。０．３９ｇのＮａＢＨ4を、最初にＮａＢＨ4を加えてから約１．５時間をかけて、少量ずつ加えた。反応系を一晩静置した。０．２０ｇのＮａＢＨ4を加えたところ、膜は、再度、白亜色となった。６時間後に膜を洗浄した。ｐ≒−０．９３バールでの流れ時間は、７４秒及び７６秒であった。
【００９３】
リガンドのアミン官能基とのカップリングの結果
アミノ化した膜のサンプル小片は、ＭＩＫＲＯ ＫＥＭＩ社（Ｓｅｍｉｎａｒｉｅｇａｔａｎ ２９、７５２ ２８ ＵＰＰＳＡＬＡ、Ｓｗｅｄｅｎ）に送って、窒素分析を行った。未架橋膜（Ｕ７９１０６９＿Ｉ６Ａ〜Ｊ８Ａ）及び架橋膜（Ｕ７９１０７５＿Ｋ９ＣＯＡ及びＵ７９１０７６＿Ｋ７ＣＯＡ）についての窒素分析の結果は、表４に示してある。リガンドの含量は、窒素含量から計算した。２種の架橋膜Ｋ９ＣＯＡ及びＫ７ＣＯＡは、他の未架橋膜より、リガンド濃度の計算値が高かった（表４参照）。未架橋膜についてのリガンド濃度の計算値は、いずれも、０．０５〜０．１８ｍｍｏｌ／ｇ（乾燥膜）であった（表４参照）。これらの値は、処理膜の面積及び容積が、未処理膜と同じだと仮定して計算したものである。未処理膜の面積及び容積は、スライドキャリパスで膜を１０枚積層したものを測定することによって計算した。膜の容積は、乾燥膜が０．１９ｍＬ、湿潤膜が０．２１ｍＬであった。
【００９４】
この単位は、リガンド濃度を示す単位としては一般的ではないので、より一般的な単位を以下に示す。
・Ｋ９ＣＯＡ：０．９６ｍｍｏｌ／ｇ（乾燥重量）は、ほぼ２４０μｍｏｌ／ｍＬ及び３．４μｍｏｌ／ｃｍ2に相当
Ｕ７９１０７６−Ｋ７ＣＯＡ：０．３２ｍｍｏｌ／ｇ（乾燥重量）は、ほぼ８０μｍｏｌ／ｍＬ及び１．１μｍｏｌ／ｃｍ2に相当。
【００９５】
表５は、上記実験の過程で観察された架橋膜の重量変化をまとめたものである。
【００９６】
実施例４：アミンリガンドのエポキシ活性化膜との直接カップリング
膜Ｋ１０ＣＥを、５．０ｍＬの水とともにビーカーに入れ、その後、５．０ｍＬのアンモニア水（２４％）を加えた。ビーカーを、室温で３時間振盪してから、蒸留水（５×５０ｍＬ）で３回洗浄した。得られた膜Ｋ１０ＣＥＡを、真空下で乾燥してから、元素分析に送った。
【００９７】
Ｋ１０ＣＥＡの元素分析結果：Ｎが０．１９％。
【００９８】
実施例５：リガンドの架橋膜との直接カップリング
０．６５μｍのＣＡ膜を、ＮａＯＨ及びＥＣＨで処理することによって上述のようにして架橋した。
【００９９】
１．０ｍＬのＥＣＨを１００ｍＬの蒸留水に溶解した。１０ｇの硫酸ナトリウムを、ＥＣＨ溶液に溶解した。０．６５μｍの酢酸セルロース膜を湿潤させ、流れ時間を測定した。ｐ≒−０．９３バールでの流れ時間は、６４秒及び６４秒であった。ＥＣＨ溶液を、４７℃の水浴中に載置した。０．６７４ｍＬのＮａＯＨ（５０％ｗ／ｗ）を、０．０２０ｍＬ／分で、３４分間にわたって加えた。次に、１．００ｍＬのＥＣＨを、０．０３０ｍＬ／分で、０．６７４ｍＬのＮａＯＨ（０．０２０ｍＬ／分）と並行して加えた。添加後、反応系を、４７℃で一晩静置し、１９時間後に、０．６７４ｍＬのＮａＯＨを、２ｍＬ／分の流量で加えた。０．５時間後、膜を、蒸留水で何度も洗浄した。その後、ｐ≒−０．９３バールでの流れ時間を測定したところ、７１秒、７７秒、７６秒及び７５秒であった。
【０１００】
次に、膜を、ＧＭＡＣ（グリシジルトリメチルアンモニウムクロリド、Ｄｅｇｕｓｓａ社（Ｐｏｓｔｆａｃｈ １３ ４５、Ｄ−６３４０３ Ｈａｎａｕ））、５ｍＬのＮａＯＨ（５０％ｗ／ｗ）、及び０．３ｇのＮａＢＨ4の水溶液７５ｍＬの入った１００ｍＬ入りデュランフラスコに入れた。フラスコを、温度２９℃に保った氷浴中で一晩回転させた。次に、膜を取り出し、蒸留水で洗浄した。
【０１０１】
リガンドをカップリングさせた膜の結合能力を、メタニルイエロー（Ａｌｄｒｉｃｈ社、カタログ番号２０，２０２−９）及びＤＮＡ結合アッセイを用いて測定した。
【０１０２】
メタニルイエロー法は、膜が、この染料の２５ｐｐｍの溶液から色を除去する能力にもとづいて開発された方法である。この方法では、膜の円形小片を、ＡＫＴＡクロマトグラフィー装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に付属しているＨＲ１６カラムの２つのカラムアダプターの間に挿入する。能力は、メタニルイエローの２５ｐｐｍ溶液を、能力の急変が観察されるまで膜に加えつづけることによって調べた。
【０１０３】
能力は、以下のようにして計算した。
【０１０４】
分析対象面積：１．５ｃｍ2（直径：１．４ｃｍ）
メタニルの分子量：３７５．４ｇ／ｍｏｌ
溶液の濃度：２５ｐｐｍ
能力（μｍｏｌ／ｃｍ2）＝吸着容積（ｍＬ）×２５
３７５．４×１．５
ＤＮＡ結合アッセイでは、ＡＫＴＡクロマトグラフィー装置に付属のＨＲ１６カラムに挿入した膜について、流量０．５ｍＬ／分で、ＤＮＡのＱｂ５０％を測定する。ＤＮＡ溶液の濃度は、ＤＮＡ０．１ｍｇ／ｍＬとした。ＤＮＡ溶液は、第一緩衝液（緩衝液Ａ：２５ｍＭＴｒｉｓ−６ＭＨＣｌを加えてｐＨを８．０に調整）中の膜に適用し、第二緩衝液（緩衝液Ｂ：２５ｍＭのＴｒｉｓ、１ＭＮａＣｌ−６ＭＨＣｌを加えてｐＨを８．０に調整）で溶出させた。
【０１０５】
検出は、ＵＶ−センサーを用いて、２８０ｎｍで行った。
【０１０６】
ＤＮＡ結合能力は、以下のようにして計算した。
【０１０７】
分析対象面積：１．５ｃｍ2（直径：１．４ｃｍ）
溶液の濃度：０．１ｍｇ／ｍＬ
ＤＮＡ結合能力（ｍｇ ＤＮＡ／ｃｍ2）＝吸着量（ｍＬ）×０．１
１．５
この膜は、動的流量が５．７μｍｏｌ／ｃｍ2 、ＤＮＡ結合能力が０．５２ｍｇ／ｃｍ2であり、これらの結果は、動的流量が１．２０μｍｏｌ／ｃｍ2、ＤＮＡ結合能力が０．４５ｍｇ／ｃｍ2である標準として使用したＭｕｓｔａｎｇＱ膜（Ｐａｌｌ社）より優れていた。
【０１０８】
【表１】
【０１０９】
【表２】
【０１１０】
【表３】
【０１１１】
【表４】
【０１１２】
【表５】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セルロースエステル膜を架橋して、物理的強さと塩基による加水分解に対する抵抗性を向上する方法に関するものである。膜を活性化し、クロマトグラフィー用リガンドにカップリングする方法、並びに本発明の方法によって製造された膜を使用して、標的分子を溶液から分離する方法も記載する。
【背景技術】
【０００２】
化学やバイオテクノロジーの現場、例えば、新規な生物薬剤や診断薬を大規模に生産する現場では、標的分子のクロマトグラフィーによる分離の商業的価値は高い。また、最近では、ヒトゲノムによって発現されるタンパク質の機能を調べるプロテオミクスの分野が進捗したため、タンパク質の精製も重要な意味をもつようになっている。
【０００３】
一般に、タンパク質は、細胞培養によって生産され、この場合、タンパク質は、細胞内にとどまるか、周囲の培養液に分泌される。使用する株化細胞は、生きた生物であるため、白糖、アミノ酸、成長因子などを含む複雑な生育用培養液を与える必要がある。栄養分と細胞の副生物が入り混じった複雑な混合物から、所望のタンパク質を、治療に利用するうえで十分なレベルまで分離、精製する作業は、大変な作業である。
【０００４】
多孔質ポリスルホン膜及びセルロース膜は、化学物質や生体物質が入り混じった混合物を濾過、分離する用途で、広く利用されている（欧州特許第０４８３１４３号参照）。こうした膜としては、限外濾過膜及び精密濾過膜を挙げることができ、こうした濾過の過程は、静水圧の差に基づいている。限外濾過膜は、分子量が５００〜１，０００，０００ダルトンの高分子を保持できる孔径を持つことを特徴としており、精密濾過膜には、直径が０．０１〜１０μｍの範囲の選択透過性の孔が設けられている。
【０００５】
セルロースの水和物やエステル膜のは、膜を用いた濾過技術では周知であり、それぞれ、有利な利点をあわせ持っている。こうした利点としては、例えば、親水性であることを挙げることができ、界面活性剤を使わなくても膜を湿潤させることができる。また、この種の膜は、タンパク質の吸着も少なく、耐熱性が高く、柔軟性も高い。
【０００６】
しかし、広く利用されているにも関わらず、セルロース膜にはいくつかの欠点があり、こうした欠点としては、例えば、強酸及び強塩基並びにセルラーゼ酵素の攻撃を受けやすい点を挙げることができる。塩基への感受性は、まず収縮と膨潤によって示され、最終的には、膜が分解する。高温では、化学的分解と収縮が進行し、低温では、特に、実質的な濃度のアルカリが存在する場合には、膨潤及び破裂が進行する。膜の孔構造は、容易に破壊され、膜を通過する流体の流量が劇的に低減する。セルロース膜のアルカリ感受性は、例えば、強アルカリ洗浄液を用いて膜を洗浄することによって濾過能を回復せねばならない場合には、大きく不利になる。
【０００７】
セルラーゼは、醸造産業では日常的に見られ、セルロース膜を、非滅菌環境で長期にわたって貯蔵した際にセルロース膜に生育する微生物からも自然に発生する。セルラーゼは、セルロース多糖を分解して、より小型の化学物質の断片、例えばグルコースとすることによって、膜を攻撃する。セルロース水和物膜が分解すると、分解副生物の一部がいわゆる「疑似パイロジェン」又は発熱物質を生じるので、セルロース水和物膜は、製剤製品の濾過には利用しにくい。
【０００８】
セルロース繊維は、架橋によって改質できることが、繊維産業での経験にもとづいて従来から知られている（Ｋｉｒｋ−Ｏｔｈｍｅｒ’ｓ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２２，ｐｐ．７７０−７９０（３ｒｄ Ｅｄ．１９８３）参照）。こうした架橋は、セルロース膜の物理的強さと化学的抵抗性を改善するうえでも、極めて望ましい。また、例えば、タンパク質結合性リガンドをセルロースポリマーのヒドロキシル基にカップリングさせる等の目的で膜を化学的に誘導化することが望ましい場合も、塩基に対する感受性は、極めて重要である。
【０００９】
欧州特許第０１４５１２７号には、ケトン脱ろう溶剤を、脱ろう油から分離する際に使用するための、再生セルロース水和物膜の架橋方法が開示されており、この方法では、セルロース水和物膜を、架橋剤溶液と接触させる。しかし、この架橋膜生成物は、もとの膜と比べて、親水性が相当低下おり、また、架橋度が上がると、この種の膜を通過する流体の流量は、非架橋セルロース水和物膜と比べて、一気に約８０％も低減する。さらに、二官能性試薬と架橋させる場合には、二官能性試薬の水溶性が低いため、有機溶剤又は非プロトン性溶剤を用いなければならず、この方法は技術的に困難で、費用を要するものであった。
【００１０】
欧州特許第０２１４３４６号には、脱ろう油中に存在する極性溶媒、例えばケトン脱ろう溶剤を分離する際に使用ために、酢酸セルロース膜を架橋して、有機溶液に対する抵抗性を改善する方法が記載されている。この方法では、架橋は、酢酸セルロース膜の構造中に存在するヒドロキシル基と反応する二官能性試薬を用いることによって、実現されている。なお、二官能性試薬は、酢酸セルロース膜中に存在する遊離ヒドロキシル基と直接反応するが、文献中には、塩基による加水分解によってアセテート基を除去することは、開示されていない。
【００１１】
米国特許第５７３９３１６号には、セルロース水和物膜を、水溶性ジエポキシド（例えば、５−エチル−１，３−ジグリシジル−５−メチルヒダントイン）と、塩基の存在下で架橋する方法が教示されている。アルカリ性溶媒が、ジエポキシドとセルロースの反応の触媒として作用し、また、水がセルロースに対して及ぼす悪影響を失活させるうえでの触媒として作用する。膜の用途としては、水性／油性エマルションの分離と、バイオ技術で製造した水性溶媒及び飲料からのタンパク質の分離への利用が記載されている。
【００１２】
米国特許出願公開第２００４／０２０６６９４号には、架橋セルロース水和物膜の製造方法が開示されている。この方法では、再生セルロース水和物膜を、塩基性かつ還元性の条件下で、エピクロロヒドリンによって処理して、エポキシ化架橋生成物を得、この生成物を、アミン求核試薬（例えば、ジメチルエチレンジアミン）でさらに処理して、正に帯電した架橋セルロース膜を製造している。あるいは、エポキシ化架橋生成物を、クロロ酢酸ナトリウムと、塩基性の条件下で反応させることによって、負に帯電した膜を得ることもできる。
【００１３】
正又は負に帯電した膜の１工程での製造方法も記載されており、この方法では、エポキシド基及び、電荷を持ちうる基を持つグリシジル試薬（例えば、グリシジル第四級化合物又はグリシジル酸）を、塩基性の条件下で、直接、ヒドロキシルポリマーと反応させることができる。
【００１４】
したがって、本発明の目的は、高い流量に対しても、また、タンパク質が吸着しにくく、柔軟だという特性に対しても悪影響を及ぼすことなく、セルロースエステル膜を架橋させて、この膜の塩基に対する抵抗性を向上させ、クロマトグラフィー用リガンドによる化学的修飾を可能とすることにある。本発明のもう一つの目的は、クロマトグラフィー用リガンドを、架橋膜のヒドロキシル基に、直接、又は化学的修飾を行ってからカップリングさせる方法を提供することにある。本発明の別の目的は、上述の方法によって調製した膜を提供することにある。こうした膜は、溶液の成分を、サイズと形状にもとづいて分離する際に使用することができる。本発明のさらに別の目的は、この膜を使用して、標的分子を、標的分子の結合アフィニティにもとづいて、溶液中の他の成分から分離する方法を提供することにある。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の第一の観点では、多孔質架橋セルロース膜の製造方法を提供する。この方法は、複数のセルロースエステル基を含む膜に、塩基を、二官能性試薬の水溶液の存在下で、上記エステル基のヒドロキシル基への加水分解並びに上記ヒドロキシル基の上記二官能性試薬との架橋が生じうるような条件で加える工程を含んでおり、上記の加水分解と架橋とが、実質的に同時に生じることを特徴としている。当業者であれば、セルロース膜が、当初、複数のエステル基に加えて、遊離ヒドロキシル基を含んでいてもよいことを理解できるはずである。これらの遊離ヒドロキシル基が、二官能性試薬との架橋反応に関与してもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
塩基は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化バリウム、水酸化テトラアルキルアンモニウム、炭酸ナトリウム、炭酸セシウム、三リン酸ナトリウム、ケイ酸ナトリウム、炭酸カリウム、ケイ酸カリウム、三リン酸カリウム、炭酸水素ナトリウムからなる群から選ぶのが適当である。塩基は、好ましくは、水酸化ナトリウムである。
【００１７】
セルロースエステルは、酢酸セルロース、硝酸セルロース、キサントゲン酸セルロース、プロピオン酸セルロース、酪酸セルロース、安息香酸セルロース、及びそれらの混合物からなる群から選ぶのが適当である。エステルは、好ましくは、酢酸セルロースである。
【００１８】
二官能性試薬は、エピクロロヒドリン、エピブロモヒドリン、ジイソシアネート、ジメチル尿素、ジメチルエチレン尿素、ジメチルクロロシラン、ビス（２−ヒドロキシエチルスルホン）、グリシジルエーテル、ブタンジオールジグリシジルエーテル、ジビニルスルホン、アルキレンジハロゲン、ヒドロキシアルキレンジハロゲンからなる群から選ばのが適当である。
【００１９】
グリシジルエーテルは、ブタンジオールジグリシジルエーテル、エチレングリコールジグリシジルエーテル、グリセロールジグリシジルエーテル、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテルからなる群から選ぶのが適当である。
【００２０】
二官能性試薬は、エピクロロヒドリン（ＥＣＨ）とするのが好ましい。エピクロロヒドリンは、３−クロロプロピレンオキシド、クロロメチロキシラン、１−クロロ−２，３−エポキシプロパンとしても知られている。
【００２１】
必要に応じて、二官能性試薬の混合物を使用する。
【００２２】
この過程は、無機塩の存在下で行うことが好ましい。塩は、硫酸ナトリウムとするのがさらに好ましい。
【００２３】
この方法は、水混和性溶剤を加えて、二官能性試薬の溶解度を上昇させる工程をさらに含むものとするのが適当である。なお、溶剤の濃度は、セルロースエステル膜が溶解したり、膨潤しはじめたりするレベルより低いものとする必要があることを理解されたい。
【００２４】
溶剤は、アルコール、ケトン、エーテルからなる群から選ぶのが適当である。溶剤は、メタノール、エタノール、エチレングリコール、グリセロール、プロピレングリコール、アセトン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジグリムからなる群から選ぶのが好ましい。
【００２５】
水混和性溶剤は、最終濃度が５０％（ｖ／ｖ）となるまで加えるのが適当であり、最終濃度が２５％（ｖ／ｖ）程度となるまで加えるのが好適である。
【００２６】
この方法は、２０℃〜７０℃の温度で３０分〜４８時間にわたってに実施するのが適当であり、好ましくは、２５℃〜６０℃の温度で、より好ましくは、４５℃〜５５℃の温度で３０分〜４８時間にわたって実施するのが好ましい。２５℃〜６０℃の温度で２〜２４時間にわたって実施するのが好ましく、４５℃〜５５℃の温度で２〜２４時間にわたって実施するのがさらに好ましい。
【００２７】
膜は、複数の酢酸セルロース基を含んでいるのが好ましい。
【００２８】
より好ましくは、膜は、複数の酢酸セルロース基を含んでおり、塩基は水酸化ナトリウムであり、二官能性試薬はエピクロロヒドリンである。
【００２９】
特に好ましくは、この方法は、４５℃〜５５℃の温度で、少なくとも１時間にわたって実施し、好ましくは、この方法は、４７℃の温度で実施する。
【００３０】
二官能性試薬がエピクロロヒドリンである場合は、上記方法が、さらなるエピクロロヒドリン水溶液と塩基を、エステル基のヒドロキシル基への加水分解と、ヒドロキシル基のエピクロロヒドリンによる活性化が生じうるような条件で加えて、エポキシ活性化架橋セルロース膜を生成する工程をさらに含むものとするのが適当である。
【００３１】
一形態では、この方法は、さらに、クロマトグラフィーリガンドを、架橋セルロース膜のヒドロキシル基に結合させる工程を含んでいる。このクロマトグラフィーリガンドの結合は、官能化としても、また場合によっては、誘導化としても知られており、この工程は、帯電ずみ又は帯電可能な基を結合させて、イオン交換マトリックスを調製することにより、生物学的アフィニティを示す基を結合させて、アフィニティマトリックスを調製することにより、キレート基を結合させて、固定化金属アフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）マトリックスを調製することにより、あるいは、疎水基を結合させて、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）マトリックスを調製することによって行う。具体的な形態では、官能基は、第四級アンモニウム（Ｑ）及びジエチルアミノアチル（ＤＥＡＥ）基からなる群から選択されるイオン交換リガンドである。他のイオン交換基の例としては、ジエチルアミノプロピル、スルフォプロピル（ＳＰ）、カルボキシメチル（ＣＭ）基がある。
【００３２】
官能基を固相支持体、例えば分離用マトリックスに結合する方法は、当業者には周知であり、前もって、置換基をアリル化しておく工程を実施し、標準的な試薬及び条件を用いることができる（例えば、『Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｌｉｇａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ』，Ｈｅｒｍａｎｓｏｎら（Ｇｒｅｇ Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ， Ａ．Ｋｒｉｓｈｎａ Ｍａｌｌｉａ、及びＰａｕｌ Ｋ．Ｓｍｉｔｈ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＩＮＣ，１９９２参照）。本発明の架橋セルロース膜には、官能化を行う前に、エキステンダー（可撓性アーム、テンタクル、又はフラフとしても公知）を設けておいてもよい。周知のエキステンダーとしては、デキストランを挙げることができる。例えば、米国特許第６，５３７，７９３号を参照のこと。この特許では、多糖マトリックスにエキステンダーを加えることが詳述されている。
【００３３】
この方法は、クロマトグラフィー用リガンドを、上記のエポキシ活性化架橋セルロース膜とカップリングさせる工程をさら含むものとするのが好ましい。リガンドは、アミン又はチオール基を含むものとするのが好ましく、アミンがアンモニアであるのがさらに好ましい。
【００３４】
上記の方法は、クロマトグラフィー用リガンドを、上記のエポキシ活性化架橋セルロース膜とカップリングさせる工程をさら含むものとするのが適当である。
【００３５】
カップリングは、第一の酸化工程と、第二の還元アミノ化工程を含むものとするのが適当である。第一の酸化工程は、膜の過ヨウ素酸塩溶液による処理を含むものとするのが好ましい。第二の還元アミノ化工程が、膜の水素化ホウ素ナトリウ（ＮａＢＨ4）による処理を含むものとするのが好ましい。
【００３６】
リガンドは、アミン基を含むものとするのが適当であり、アミンは、第二級アミンとするのが好ましい。第二級アミンは、より好ましくは、ビス（３−アミノプロピル）アミンである。
【００３７】
リガンドは、グリシジル第四級アンモニウム化合物、例えば塩化グリシジルトリメチルアンモニウム（ＧＭＡＣ）を含むものとするのが適当である。このグリシジル第四級アンモニウム化合物のカップリングでは、還元剤の存在下で、塩基を使用するのが適当である。還元剤は、水素化ホウ素ナトリウとするのが好ましい。塩基は、水酸化ナトリウムとするのが好ましい。
【００３８】
本発明の第二の観点では、多孔質架橋セルロース膜を提供するものであり、この多孔質架橋セルロース膜は、複数のセルロースエステル基を含む膜に、塩基を、二官能性試薬の水溶液の存在下で、上記エステル基のヒドロキシル基への加水分解並びに上記ヒドロキシル基の上記二官能性試薬との架橋が生じうるような条件で加える工程を含み、上記の加水分解と架橋とが、実質的に同時に生じることを特徴とする多孔質架橋セルロース膜の製造方法によって製造された多孔質架橋セルロース膜である。
【００３９】
本発明の第三の観点では、溶液又は懸濁液中で、第一成分の第二成分からの分離を、第一成分と第二成分のサイズの違いにもとづいて行う方法を提供する。この方法は、上述の膜を利用した精密濾過法又は限外濾過法である。
【００４０】
精密濾過は、一般に直径０．１μｍを超える懸濁した固形物やコロイドを除去する低圧での膜濾過法であるとして定義される。こうした方法は、顕微鏡を用いれば見ることのできる粒子や微生物、例えば、細胞、マクロファージ、大型のウイルス粒子、及び細胞の細片を分離する際に使用することができる。
【００４１】
限外濾過は、粒径０．１μｍ以下の溶質を分離する低圧での膜濾過法であるとして定義される。したがって、例えば、分子のサイズが、溶剤分子より有意に大きい溶質は、適当な膜（通常は、孔径範囲が０．００１〜０．１μｍの膜）を通して溶剤のみを通過させるような水圧をを加えることによって、溶剤から除去できる。限外濾過を用いると、溶液から細菌やウイルスを除去することができる。
【００４２】
本発明の膜は、標的化合物、特に生体分子を単離する際にも使用できる。こうした生体分子としては、タンパク質、モノクローナル又はポリクローナル抗体、ペプチド（例えば、ジペプチド又はオリゴペプチド）、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）、ペプチド核酸、ウイルス及び細胞（例えば、細菌細胞、プリオンなど）を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。一方、この膜は、有機分子、例えば代謝生成物及び薬剤候補物質を単離する際にも、有用である。別の形態では、本発明の膜は、診断目的などで、上述の標的化合物の任意のものを識別するうえでも有用である。したがって、本発明の膜を利用して精製する生成物としては、薬剤又は薬剤の標的；治療用ベクター、例えば遺伝子治療用のプラスミド又はウイルス；サプリメンツ、例えば機能性食品；診断薬などを挙げることができる。また、本発明にしたがって精製した生体分子の具体的用途としては、テイラーメード医療用の薬剤を挙げることができる。本発明の膜は、不要な標的化合物、例えば、上述のような化合物から、所望の液体を精製する際にも利用できる。
【００４３】
したがって、本発明の第四の観点では、標的分子を、溶液中の他の成分から分離する方法であって、この方法が、上述の膜を使用するようなクロマトグラフィーである方法を提供する。
【００４４】
クロマトグラフィーという用語は、一連の似通った方法をまとめて称する名称であり、クロマトグラフィーに含まれる各種の方法には、いずれも、共通の特徴として、２つの互いに非混和性の相を接触させ、一方の相が静止相で、もう一方の相が移動相であるという特徴がある。本発明では、膜が静止相を、溶液が移動相を構成する。クロマトグラフィーは、混入した化合物から液体を精製する際にも、液体から、１以上の特定の化合物を回収する際にも、使用できる。
【００４５】
これまで、細胞及び／又は細胞の細片は、濾過によって除去されてきた。目的タンパク質を含む透明な溶液が得られたら、この目的タンパク質の、溶液の他の成分からの分離は、通常、各種のクロマトグラフィー技術を組み合わせて実施される。こうした技術では、タンパク質を、電荷、疎水性の程度、アフィニティ特性、サイズなどにもとづいて分離する。これらの各技術に用いるいくつもの異なったクロマトグラフィー用のマトリックスが市販されているので、目的とする特定のタンパク質に応じた精製スキームを自在に組むことができる。本発明の文脈では、タンパク質は、主に、電荷及び／又はアフィニティ特性にもとづいて分離することができる。
【００４６】
標的分子は、膜中に存在するクロマトグラフィー用リガンドと結合する結合性部分を含んでいるものとするのが適当である。
【００４７】
標的分子は、タンパク質とするのが適当である。標的分子は、ポリヌクレオチド又は天然生成物とすることができる。標的分子は、タンパク質とするのが好ましい。
【００４８】
標的分子をタンパク質とし、溶液を細胞抽出物、細胞溶解物、又は細胞培養液とするのが好ましい。
【００４９】
リガンドは、正又は負に帯電しているのが適当である。
【００５０】
リガンドと結合部分は、それぞれ、特異的結合ペアの片方とし、各成分が、もう一方の成分に対して、特異的結合アフィニティを有するものするのが好適である。リガンドと結合部分は、ビオチン／ストレプトアビジン、ビオチン／アビジン、ビオチンビオチン／ニュートラアビジン、ビオチン／キャプトアビジン、エピトープ／抗体、ＧＳＴ／グルタチオン、Ｈｉｓ−ｔａｇ／ニッケル、抗原／抗体、ＦＬＡＧ／Ｍ１抗体、マルトース結合性タンパク質／マルトース、キチン結合性タンパク質／キチン、カルモジュリン結合性タンパク質／カルモジュリン（Ｔｅｒｐｅ、２００３、Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、６０、５２３−５３３）、Ｌｕｍｉｏ（登録商標）試薬／Ｌｕｍｉｏ（登録商標）認識配列からなる群から選ぶのが好ましい。Ｌｕｍｉｏ（登録商標）試薬と認識配列（Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ）は、のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ社（米国カールスバッド）より入手可能である。
【００５１】
リガンド／結合部分の他の例としては、酵素阻害物質／酵素（例えば、ベンズアミジン又はアルギニンと、セリンプロテアーゼ、例えばカタラーゼ）、ヘパリン／凝固因子、リジン残基／プラスミノーゲン又はリボソームＲＮＡ、プロシオンレッド／ＮＡＤＰ＋依存性酵素、Ｃｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅ／血清アルブミン、コンカナバリンＡ／グルコピラノシル及びマンノピラノシル基、並びにプロテインＡ又はプロテインＣ／ＩｇＧのＦｃ領域を挙げることができる。
定義
「架橋」という用語は、本発明の文脈において使用する場合には、ポリマー（すなわち、セルロースポリマー）の別々の鎖の間、又は単一の鎖の一部の間に結合が存在し、その結果、ポリマーの剛性及び／又は保存性が増大することを意味すると理解されたい。
【００５２】
「膜」という用語は、本発明で使用する場合には、通常、その性質上積層が可能であり、複数の孔を含み、その両側に位置する溶液に対してフィルターとして機能する薄いシート又は層を意味すると理解されたい。
【００５３】
「塩基」という用語は、プロトンを獲得する傾向のある物質という従来通りの化学的意味として理解されたい。したがって、塩基は、例えば、水溶液中で酸と反応して塩と水のみを形成する物質、したがって、ヒドロキシルイオンを生じる物質である。
【００５４】
「二官能性試薬」という用語は、本明細書で用いる場合には、反応性官能基を２つ有する化合物であって、１分子の２つの基、又は２つの異なった分子のそれぞれに含まれる１つの基と相互作用を生じうる化合物のことを意味している。
【００５５】
「実質的に同時」という表現は、加水分解によって反応しうる状態となったヒドロキシル基の一部が、架橋反応に関与するかたちで、加水分解及び架橋が、本質的に並行して生じることを意味すると理解されたい。
【００５６】
「標的分子」という用語は、本発明の方法によって、吸着によって標的とされる任意の化合物又は実体のことをいう。
【実施例】
【００５７】
実施例１：酢酸セルロース膜の架橋
Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社から販売されている０．６５μｍの酢酸セルロース（ＣＡ）膜を、全実験で使用した。酢酸セルロース膜を、エピクロロヒドリン（以下ＥＣＨと称する。Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ ６０６， ３１９０ ＡＮ Ｈｏｏｇｖｌｉｅｔ Ｒｔ， Ｔｈｅ ＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓのＲｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｓｖｅｒｉｇｅ社から入手）及びＮａＯＨと架橋した。膜は、架橋工程の間はピンセットで所定の場所に保持し、架橋完了後、水洗した。
【００５８】
架橋膜はいずれも蒸留水で洗浄した（０．６Ｌで４回）。１Ｌの水を用い、後述する方法で、流れ時間を測定した（「流れ時間の測定」参照）。膜について行った実験の要旨については、表１及び２を参照されたい。
【００５９】
基準／対照膜
膜を秤量し、蒸留水中に３．５週間浸漬した。流れ時間は、８８秒及び８８秒（ｐ≒−０．８８バール）であった。０．６５μｍのＣＡ膜の流れ時間は、蒸留水中で保存することによって、６５〜７０秒から８５〜９０秒に伸びるようである。膜を真空室で４８時間にわたって乾燥したところ、新しい膜が７９．７７ｍｇであるのに対し、７８．７９ｍｇとなった。この重量の減少幅は、水洗後真空乾燥を行った場合の正常な範囲内である。流れ時間を再度測定し、未処理の膜の正常値に戻るかどうかを観察した。流れ時間は９２秒及び９３秒（ｐ≒−０．８９）であった。膜を蒸留水中で一晩保存し、流れ時間を２回測定したところ、両回とも７０秒であった（ｐ≒−０．８９バール）。
【００６０】
サンプルＫ２Ｃ：
２５５μＬのＥＣＨ（エピクロロヒドリン）を、１００ｍＬの蒸留水に４℃で溶解した。０．６５μｍの酢酸セルロース膜を、この溶液中に浸漬し、ピンセットで、その位置に保持した。５ｍＬの１．０ＭのＮａＯＨを加え、膜を４５℃で２時間保持した。
【００６１】
サンプルＫ７Ｃ：
湿潤させた膜（Ｋ７）を、１０ｇのＮａ2ＳＯ4と２．５０ｍＬのＥＣＨの１００ｍＬの水への溶液の入った１００ｍＬのデュランフラスコに浸漬した。ＥＣＨの一部が蒸発したかどうかは不明である。膜（Ｋ７）は、溶液と接触することで、やや硬化したように見えた。１．６８８ｍＬの５０％ＮａＯＨを、０．０２８ｍＬ／分で加えた。膜を一晩そのままの状態で載置し、ｐＨを測定したところ、ｐＨは１３〜１４であった。
【００６２】
サンプルＫ８Ｃ：
湿潤させた膜（Ｋ８）を、２．５０ｍＬのＥＣＨの１００ｍＬの水への溶液の入った１００ｍＬのデュランフラスコに浸漬した。１．６８８ｍＬの５０％ＮａＯＨを、０．０２８ｍＬ／分で加えた。膜を一晩そのままの状態で載置し、ｐＨを測定したところ、ｐＨは１２であった。
【００６３】
サンプルＫ９Ｃ：
１．００ｍＬのＥＣＨを１００ｍＬの水に加え、室温で撹拌することによって溶解させた。ＥＣＨが溶解した時点で、１０ｇのＮａ2ＳＯ4を加えた。溶液の入ったデュランフラスコを水浴に入れ、４７℃に加熱した。湿潤させた膜（Ｋ９）を、デュランフラスコに浸漬した。０．６７４ｍＬの５０％ＮａＯＨを３４分にわたって加えた（０．０２０ｍＬ／分）。塩基の全量を加えた後も、膜を溶液中に４時間そのまま保持した。
【００６４】
サンプルＫ１０Ｃ
１０ｇのＮａ2ＳＯ4を、１００ｍＬの水に溶解した。ゆっくり撹拌しながら、１．００ｍＬのＥＣＨを加え、デュランフラスコを、撹拌せずに２．７５時間静置した。ＥＣＨがすべて溶解した時点で、フラスコを水浴（４７℃）に入れた。０．６７４ｍＬの５０％ＮａＯＨを０．０２０ｍＬ／分で、３４分にわたって加えた。塩基の全量を加えた後も、膜を溶液中に１時間そのまま保持した。ｐＨは１３〜１４であった。
【００６５】
サンプルＬ１Ｃ：
１．００ｍＬのＥＣＨを、１００ｍＬの水に加え、室温で撹拌することによって溶解させた。ＥＣＨが溶解した時点で、１０ｇのＮａ2ＳＯ4を加えた。溶液の入ったデュランフラスコを水浴に入れ、２５℃（ｐＨ６〜７）に加熱した。湿潤させた膜（Ｌ１、７８．９９ｍｇ）を、デュランフラスコに浸漬した。０．６７４ｍＬの５０％ＮａＯＨを３４分にわたって加えた（０．０２０ｍＬ／分）（ｐＨ１３〜１４）。塩基の全量を加えた後も、膜を、溶液中に２５℃で１８時間そのまま保持した（ｐＨ１２〜１３）。
【００６６】
サンプルＬ２Ｃ：
０．５０ｍＬのＥＣＨを１００ｍＬの水に加え、室温で撹拌することによって溶解させた。ＥＣＨが溶解した時点で、１０ｇのＮａ2ＳＯ4を加えた。溶液の入ったデュランフラスコを水浴に入れ、４７℃に加熱した。湿潤させた膜（Ｌ２、７８．７４ｍｇ）を、デュランフラスコに浸漬し、０．３３６ｍＬの５０％ＮａＯＨを、０．０２０ｍＬ／分で１７分間にわたって加えた。膜を、溶液中に１７℃で１８時間そのまま保持した（ｐＨ１１〜１２）。
【００６７】
サンプルＬ３Ｃ：
１．００ｍＬのＥＣＨを１００ｍＬの水に加え、室温で撹拌することによって溶解させた。ＥＣＨが溶解した時点で、１０ｇのＮａ2ＳＯ4を加えた。溶液の入ったデュランフラスコを水浴に入れ、３０℃に加熱した。湿潤させた膜（Ｌ３、７８．７７ｍｇ）を、デュランフラスコに浸漬した。０．６７４ｍＬの５０％ＮａＯＨを３４分間にわたって加えた（０．０２０ｍＬ／分）（ｐＨ≒１４）。膜を３０℃で一晩静置した。膜は、塩基の添加終了後、合計で１７．２５時間浸漬した。膜を洗浄し、流れを測定した。
【００６８】
サンプルＬ４Ｃ：
サンプルを、サンプルＫ９Ｃと同様に処理した（表１を参照のこと）。反応後のｐＨは、１２〜１３であった。
【００６９】
サンプルＭ１Ｃ：
このサンプルは、Ｎａ2ＳＯ4の添加量を５ｇのみとした以外は、サンプルＬ４Ｃと同様に調製した（表１を参照のこと）。
【００７０】
サンプルＭ３Ｃ：
このサンプルは、サンプルを反応混合物中に４．５時間浸漬した以外は、サンプルＬ４Ｃと同様に調製した（表１）。反応後のｐＨは、１２〜１３であった。
【００７１】
Ｍ５Ｃ：
２．５ｍＬのＥＣＨを１００ｍＬの水に加え、室温で撹拌することによって溶解させた。ＥＣＨが溶解した時点で、１０ｇのＮａ2ＳＯ4を加えた。溶液の入ったデュランフラスコを水浴に入れ、４７℃に加熱した。湿潤させた膜（Ｍ５、７９．２０ｍｇ）を、デュランフラスコに浸漬した。１．６８８ｍＬの５０％ＮａＯＨを、０．０２０ｍＬ／分で加えた（８４分）。塩基を加え終わった後も、膜を、４７℃で２１時間にわたって浸漬させ、その後、洗浄を行った（ｐＨ１３〜１４）。ｐ≒−０．９１バールでの流れ時間は、５７秒及び５７秒であった。
【００７２】
流れ時間の測定
膜を通過する水の流れを、架橋した膜の孔の構造のちがいを近似する手段として測定した。流れの変化が生じていれば、孔の構造に変化があったことが示唆される。水をメスシリンダーで計測し、真空フラスコに接続したメンブレンフィルターの漏斗に加えた。真空フラスコは、真空中央値（約−０．９バール）に接続し、圧力計を使用して圧力を測定した。流れ時間は、１リットルについて測定した。メンブレンフィルターの漏斗に水を加え（約０．２５Ｌ）、残りの水は、水が膜を通過するにしたがって、徐々に加えた。流量及び圧力についての観察結果を、表１及び２に示す。
【００７３】
流れ特性
流れ特性は、１Ｌの水が膜を通過するのに要した時間を測定することによって決定した。以下では、この時間のことを、「流れ時間」と称する。未処理の０．６５μｍのＣＡ膜の流れ時間は、通常、６５〜７０秒程度であった。しかし、未処理膜の流れ時間は、水中に保存すると、徐々に上昇した（上述の「参照／対照膜」を参照のこと）。一例を挙げると、蒸留水中に３．５週間保存しておいた膜の流れ時間は、８５〜９０秒であった。乾燥後、再度一晩湿潤させたところ、流れ時間は７０秒となった。したがって、膜を一度乾燥させ、その後再度湿潤させることによっても、効果を復元することが可能なようであった。
【００７４】
架橋膜の流れ時間は、未反応のＣＡ膜でも、ほぼ同じであった。また、流れ時間は、未反応膜の方が、水中に約２週間保存してあった膜（流れ時間は、８５〜９０秒と長かった）より短かった。測定された流れ時間（表１及び表２を参照のこと）は、６５〜９０秒の範囲であった。このことによって、架橋によって膜の孔構造に有意な変化が生じないことが示唆された。各実験で、架橋剤の量と架橋条件の双方を変化させた。硫酸ナトリウムの存在下で架橋を行った場合（例えば、表１のサンプルＫ７Ｃ及びＫ８Ｃ）、架橋膜の流れ特性が改善することが観察された。
【００７５】
架橋酢酸セルロース膜の塩基に対する抵抗性
架橋について調べるために、膜Ｋ２Ｃ及びＬ１Ｃを、１．０ＭのＮａＯＨで２時間にわたって処理した（Ｋ２Ｃは、約２０ｍＬに、Ｌ１Ｃは２５ｍＬに浸漬した）。この塩基処理によって流れ時間が変化しなければ、架橋が生じ、膜は、その結果として、塩基処理による構造の変化から保護されたことが示唆されたものと理解した。一方、流量が低下していれば、膜の孔構造に何らかの構造の変化が生じたことが示唆されたものと理解することができる。
【００７６】
流量は、架橋が最も少ない膜（Ｋ２ＣＨ）についてのみ、有意に減少した。表３を参照のこと。この膜は、有意な程度に重量が減少した唯一の膜でもあった。他の膜は、塩基による処理の前の流れ時間及び重量を維持していた。こうした結果から、架橋が成功していたことが示された。膜Ｋ2ＣＨも、同様の処理の後には、未架橋膜より優れた流れ特性を示したので、架橋していたものと考えられる。未架橋膜の流れは、１．０ＭのＮａＯＨで２．５分間処理すると、劇的に低減した。膜Ｌ１ＣＨが有意な重量変化を示さなかったことからは、酢酸塩基の大半が脱離し、その結果、膜が、主に、架橋酢酸セルロースではなく、架橋セルロースから構成されていたことが示唆される。
【００７７】
実施例２： ＣＡ膜のエポキシ活性化
エポキシ活性化膜（Ｋ１０ＣＥ）を、表１に記載したようにして調製した。膜を、まず、Ｋ１０Ｃについて上述のしたようにしてＥＣＨで４７℃にて架橋し、次に、温度を２５℃まで下げ、ＥＣＨとＮａＯＨをさらに加えた（表１を参照のこと）。
【００７８】
エポキシ活性化の工程では、（架橋反応と比べて）反応温度を下げ、過剰なＥＣＨを使用した。目標は、反応後に膜に残るエポキシ基の量を増やすことであった。反応後に膜上に残っているエポキシ基の量は、相当多いはずである。
【００７９】
表１（Ｋ１０ＣＥを参照のこと）の結果からは、架橋後も膜が流れ特性を維持していることが明らかである。
【００８０】
エポキシ活性化には、酸化及び還元アミノ化を行う後述の方法より反応工程の数が少なくてすむという利点がある。
【００８１】
実施例３：酸化及びアミノ化による、アミン官能基を用いたリガンドの架橋膜とのカップリング
リガンドの結合のモデル物質として、アミンビス（３−アミノプロピル）アミンを使用した。酸化及び還元アミノ化によって、アミンを架橋膜にカップリングさせた。
【００８２】
第一段階：過ヨウ素酸ナトリウムによる酸化
膜中のアセテート基の大半は、架橋反応の過程で脱離したので、架橋膜を直接酸化することが可能であった。１５０ｍＬ入りのビーカー中で、ＮａＩＯ4を蒸留水に溶解した。ビーカーを、振盪版上に載置して、加水分解して洗浄した膜を加えた。膜を室温で２時間おき、蒸留水で洗浄した。下記の各実験では、各種の量のＮａＩＯ4を、使用した。
【００８３】
サンプルＫ９ＣＯ：
膜Ｋ９Ｃを湿潤させ、ＮａＩＯ4溶液（２．０ｇ、２０ｍＬの蒸留水への溶液）に加えた。２０ｍＬの蒸留水を加えた。膜を２時間浸漬したままとし、０．６Ｌの水で６回洗浄した。真空下で膜を一晩乾燥し、その後秤量した（４８．５７ｍｇ）。少量のサンプルを取り出し、膜を再度秤量した（４８．４９ｍｇ）。膜のこのサンプルは、シッフ試薬（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社より入手）で処理すると、濃紫色（ほぼ黒色）となった。この色から、膜が、アルデヒド基を含むことが示され、色が濃いほど、アルデヒドの量が多い。
【００８４】
サンプルＬ２ＣＯ：
膜Ｌ２Ｃを、ＮａＩＯ4溶液（１．０ｇの２０ｍＬの蒸留水への溶液）に加え、２時間浸漬した後、洗浄した。流れ時間は８０秒及び８５秒（ｐ≒−０．９３バール）であった。
【００８５】
サンプルＫ７ＣＯ：
９９．８ｍｇのＮａＩＯ4を、２０ｍＬの蒸留水に溶解した。膜Ｋ７Ｃを、この溶液に加えた。膜を２時間にわたって酸化し、洗浄した（ｐ≒−０．９１バールでの流れ時間、７０秒及び７１秒）。この膜を、真空で一晩乾燥させた。膜を秤量し（５０．３０ｍｇ）、その後、小片を切り取り、再度秤量した（５０．９３ｍｇ）。なお、この重量は、当初の重量より少なかった。シッフ試薬で処理したところ、膜から回収したサンプルは、濃紫色になった。
【００８６】
サンプルＬ４ＣＯ：
１００．７ｍｇのＮａＩＯ4を、２０ｍＬの蒸留水に溶解した。この溶液に膜Ｌ４Ｃを加えた。膜を２時間にわたって酸化し、その後洗浄した。その後、流れ時間を測定した（ｐ≒−０．９２バールでの流れ時間、７３秒及び７３秒）。膜を、真空下で一晩乾燥した。膜を乾燥し、シッフ試薬との反応用の小片を取り出す前に秤量し（５０．１９ｍｇ）、取り出した後も秤量した（５０．２０ｍｇ）。シッフ試薬で処理したところ、このサンプル小片は、濃紫色となった。
【００８７】
サンプルＭ３ＣＯ：
３３６．１ｍｇのＮａＩＯ4を、２０ｍＬの蒸留水に溶解した。この溶液に膜Ｍ３Ｃを加えた。膜を２時間にわたって酸化し、その後洗浄した。その後、流れ時間を測定した（ｐ≒−０．９１バールでの流れ時間、７２秒及び７５秒）。
【００８８】
第二段階：還元アミノ化
ビス（３−アミノプロピル）アミン（Ｌａｂｃｈｅｍ社より入手）を、１５０ｍＬのビーカーで、蒸留水又はメタノールで溶解した。酸化膜（すなわち、サンプルＫ９ＣＯ、Ｌ２ＣＯ、Ｋ７ＣＯ、Ｌ４ＣＯ）を加え、所定時間後（通常２時間後）、水素化ホウ素ナトリウ（ＮａＢＨ4、９５％、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を加えた。還元剤で２時間以上処理した後、膜を洗浄した。
【００８９】
サンプルＫ９ＣＯＡ：
５．９ｍＬのビス（３−アミノプロピル）アミンを２０ｍＬのメタノールに加えた。膜Ｋ９ＣＯをメタノール中で湿潤させ、アミン溶液に加えた。２時間後、０．５ｇのＮａＢＨ4を反応に加え、さらに２時間後に、０．５ｇのＮａＢＨ4を加えた。膜を、還元剤の存在下で合計３．２５時間インキュベートした。膜を、メンブレンフィルター用漏斗に載置し、０．６Ｌの蒸留水を６回、さらに１Ｌの蒸留水を通過させることによって洗浄した。膜を、真空下で一晩乾燥した。サンプル小片を、シッフ試薬に加えたところ、濃い紫色を呈した。これとは別に、膜のサンプル小片を切り出して、窒素分析に供した。
【００９０】
サンプルＬ２ＣＯＡ：
５．９ｍＬのビス（３−アミノプロピル）アミンを２０ｍＬのメタノールに加えた。膜Ｌ２ＣＯＡをアミン溶液に加えた。１０ｍＬのメタノールを加えた。膜を、３時間以上静置してから、ＮａＢＨ4溶液を加えた。ＮａＢＨ4溶液（０．３９ｇの１０ｍＬの冷却メタノールへの溶液）は、少量ずつ、３０分にわたって加えた。最後にＮａＢＨ4を加えた後、膜を１時間洗浄し、流れ時間を測定した（ｐ≒−０．９１で９１秒及び９６秒）。この膜を乾燥し、秤量した（４９．８２ｍｇ。シッフ試薬用サンプル採取後は、４９．７０ｍｇ）。シッフ試薬では、この膜のサンプルは、極めて濃い紫色となった。
【００９１】
サンプルＫ７ＣＯＡ：
５．９ｍＬのビス（３−アミノプロピル）アミンを２０ｍＬのメタノールに加えた。膜Ｋ７ＣＯＡを、アミン溶液に加えた。膜を３．５時間静置してから、氷浴で冷却しておいたＮａＢＨ4溶液を加えた。ＮａＢＨ4溶液（０．３９ｇの１０ｍＬのメタノールへの溶液）を少量ずつ加えたところ、膜が白色となった。最後にＮａＢＨ4溶液を加えた時点では、最初にＮａＢＨ4溶液を加えてから、約４５分が経過していた。最後にＮａＢＨ4溶液を加えてから約１５分後に、反応系を氷浴から取り出した。膜を、最後にＮａＢＨ4溶液を加えてから２．５時間にわたって乾燥した。膜を乾燥し、秤量した（５３．３２ｍｇ。シッフ試薬用サンプル採取後は、５３．１６ｍｇ）。窒素分析用のサンプルを切り出した（重量、５３．３４〜４３．３１ｍｇ）。シッフ試薬では、サンプル膜は濃紫色となった。
【００９２】
サンプルＬ４ＣＯＡ：
５．９ｍＬのビス（３−アミノプロピル）アミンを２０ｍＬのメタノールに加えた。膜Ｌ４ＣＯＡを水で湿潤させ、アミン溶液に加えた。２．５時間時間後、混合物に、ＮａＢＨ4の結晶をいくつか加えた。０．３９ｇのＮａＢＨ4を、最初にＮａＢＨ4を加えてから約１．５時間をかけて、少量ずつ加えた。反応系を一晩静置した。０．２０ｇのＮａＢＨ4を加えたところ、膜は、再度、白亜色となった。６時間後に膜を洗浄した。ｐ≒−０．９３バールでの流れ時間は、７４秒及び７６秒であった。
【００９３】
リガンドのアミン官能基とのカップリングの結果
アミノ化した膜のサンプル小片は、ＭＩＫＲＯ ＫＥＭＩ社（Ｓｅｍｉｎａｒｉｅｇａｔａｎ ２９、７５２ ２８ ＵＰＰＳＡＬＡ、Ｓｗｅｄｅｎ）に送って、窒素分析を行った。未架橋膜（Ｕ７９１０６９＿Ｉ６Ａ〜Ｊ８Ａ）及び架橋膜（Ｕ７９１０７５＿Ｋ９ＣＯＡ及びＵ７９１０７６＿Ｋ７ＣＯＡ）についての窒素分析の結果は、表４に示してある。リガンドの含量は、窒素含量から計算した。２種の架橋膜Ｋ９ＣＯＡ及びＫ７ＣＯＡは、他の未架橋膜より、リガンド濃度の計算値が高かった（表４参照）。未架橋膜についてのリガンド濃度の計算値は、いずれも、０．０５〜０．１８ｍｍｏｌ／ｇ（乾燥膜）であった（表４参照）。これらの値は、処理膜の面積及び容積が、未処理膜と同じだと仮定して計算したものである。未処理膜の面積及び容積は、スライドキャリパスで膜を１０枚積層したものを測定することによって計算した。膜の容積は、乾燥膜が０．１９ｍＬ、湿潤膜が０．２１ｍＬであった。
【００９４】
この単位は、リガンド濃度を示す単位としては一般的ではないので、より一般的な単位を以下に示す。
・Ｋ９ＣＯＡ：０．９６ｍｍｏｌ／ｇ（乾燥重量）は、ほぼ２４０μｍｏｌ／ｍＬ及び３．４μｍｏｌ／ｃｍ2に相当
Ｕ７９１０７６−Ｋ７ＣＯＡ：０．３２ｍｍｏｌ／ｇ（乾燥重量）は、ほぼ８０μｍｏｌ／ｍＬ及び１．１μｍｏｌ／ｃｍ2に相当。
【００９５】
表５は、上記実験の過程で観察された架橋膜の重量変化をまとめたものである。
【００９６】
実施例４：アミンリガンドのエポキシ活性化膜との直接カップリング
膜Ｋ１０ＣＥを、５．０ｍＬの水とともにビーカーに入れ、その後、５．０ｍＬのアンモニア水（２４％）を加えた。ビーカーを、室温で３時間振盪してから、蒸留水（５×５０ｍＬ）で３回洗浄した。得られた膜Ｋ１０ＣＥＡを、真空下で乾燥してから、元素分析に送った。
【００９７】
Ｋ１０ＣＥＡの元素分析結果：Ｎが０．１９％。
【００９８】
実施例５：リガンドの架橋膜との直接カップリング
０．６５μｍのＣＡ膜を、ＮａＯＨ及びＥＣＨで処理することによって上述のようにして架橋した。
【００９９】
１．０ｍＬのＥＣＨを１００ｍＬの蒸留水に溶解した。１０ｇの硫酸ナトリウムを、ＥＣＨ溶液に溶解した。０．６５μｍの酢酸セルロース膜を湿潤させ、流れ時間を測定した。ｐ≒−０．９３バールでの流れ時間は、６４秒及び６４秒であった。ＥＣＨ溶液を、４７℃の水浴中に載置した。０．６７４ｍＬのＮａＯＨ（５０％ｗ／ｗ）を、０．０２０ｍＬ／分で、３４分間にわたって加えた。次に、１．００ｍＬのＥＣＨを、０．０３０ｍＬ／分で、０．６７４ｍＬのＮａＯＨ（０．０２０ｍＬ／分）と並行して加えた。添加後、反応系を、４７℃で一晩静置し、１９時間後に、０．６７４ｍＬのＮａＯＨを、２ｍＬ／分の流量で加えた。０．５時間後、膜を、蒸留水で何度も洗浄した。その後、ｐ≒−０．９３バールでの流れ時間を測定したところ、７１秒、７７秒、７６秒及び７５秒であった。
【０１００】
次に、膜を、ＧＭＡＣ（グリシジルトリメチルアンモニウムクロリド、Ｄｅｇｕｓｓａ社（Ｐｏｓｔｆａｃｈ １３ ４５、Ｄ−６３４０３ Ｈａｎａｕ））、５ｍＬのＮａＯＨ（５０％ｗ／ｗ）、及び０．３ｇのＮａＢＨ4の水溶液７５ｍＬの入った１００ｍＬ入りデュランフラスコに入れた。フラスコを、温度２９℃に保った氷浴中で一晩回転させた。次に、膜を取り出し、蒸留水で洗浄した。
【０１０１】
リガンドをカップリングさせた膜の結合能力を、メタニルイエロー（Ａｌｄｒｉｃｈ社、カタログ番号２０，２０２−９）及びＤＮＡ結合アッセイを用いて測定した。
【０１０２】
メタニルイエロー法は、膜が、この染料の２５ｐｐｍの溶液から色を除去する能力にもとづいて開発された方法である。この方法では、膜の円形小片を、ＡＫＴＡクロマトグラフィー装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に付属しているＨＲ１６カラムの２つのカラムアダプターの間に挿入する。能力は、メタニルイエローの２５ｐｐｍ溶液を、能力の急変が観察されるまで膜に加えつづけることによって調べた。
【０１０３】
能力は、以下のようにして計算した。
【０１０４】
分析対象面積：１．５ｃｍ2（直径：１．４ｃｍ）
メタニルの分子量：３７５．４ｇ／ｍｏｌ
溶液の濃度：２５ｐｐｍ
能力（μｍｏｌ／ｃｍ2）＝吸着容積（ｍＬ）×２５
３７５．４×１．５
ＤＮＡ結合アッセイでは、ＡＫＴＡクロマトグラフィー装置に付属のＨＲ１６カラムに挿入した膜について、流量０．５ｍＬ／分で、ＤＮＡのＱｂ５０％を測定する。ＤＮＡ溶液の濃度は、ＤＮＡ０．１ｍｇ／ｍＬとした。ＤＮＡ溶液は、第一緩衝液（緩衝液Ａ：２５ｍＭＴｒｉｓ−６ＭＨＣｌを加えてｐＨを８．０に調整）中の膜に適用し、第二緩衝液（緩衝液Ｂ：２５ｍＭのＴｒｉｓ、１ＭＮａＣｌ−６ＭＨＣｌを加えてｐＨを８．０に調整）で溶出させた。
【０１０５】
検出は、ＵＶ−センサーを用いて、２８０ｎｍで行った。
【０１０６】
ＤＮＡ結合能力は、以下のようにして計算した。
【０１０７】
分析対象面積：１．５ｃｍ2（直径：１．４ｃｍ）
溶液の濃度：０．１ｍｇ／ｍＬ
ＤＮＡ結合能力（ｍｇ ＤＮＡ／ｃｍ2）＝吸着量（ｍＬ）×０．１
１．５
この膜は、動的流量が５．７μｍｏｌ／ｃｍ2 、ＤＮＡ結合能力が０．５２ｍｇ／ｃｍ2であり、これらの結果は、動的流量が１．２０μｍｏｌ／ｃｍ2、ＤＮＡ結合能力が０．４５ｍｇ／ｃｍ2である標準として使用したＭｕｓｔａｎｇＱ膜（Ｐａｌｌ社）より優れていた。
【０１０８】
【表１】
【０１０９】
【表２】
【０１１０】
【表３】
【０１１１】
【表４】
【０１１２】
【表５】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多孔質架橋セルロース膜の製造方法であって、
複数のセルロースエステル基を含む膜に、塩基を、二官能性試薬の水溶液の存在下で、上記エステル基のヒドロキシル基への加水分解並びに上記ヒドロキシル基の上記二官能性試薬との架橋が生じうるような条件で加える工程を含み、上記の加水分解と架橋とが、実質的に同時に生じることを特徴とする方法。
【請求項２】
塩基が、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化バリウム、水酸化テトラアルキルアンモニウム、炭酸ナトリウム、炭酸セシウム、三リン酸ナトリウム、ケイ酸ナトリウム、炭酸カリウム、ケイ酸カリウム、三リン酸カリウム、炭酸水素ナトリウムからなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
セルロースエステルが、酢酸セルロース、硝酸セルロース、キサントゲン酸セルロース、プロピオン酸セルロース、酪酸セルロース、安息香酸セルロース、及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項４】
二官能性試薬が、エピクロロヒドリン、エピブロモヒドリン、ジイソシアネート、ジメチル尿素、ジメチルエチレン尿素、ジメチルクロロシラン、ビス（２−ヒドロキシエチルスルホン）、グリシジルエーテル、ブタンジオールジグリシジルエーテル、ジビニルスルホン、アルキレンジハロゲン、ヒドロキシアルキレンジハロゲンからなる群から選択される、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
グリシジルエーテルが、ブタンジオールジグリシジルエーテル、エチレングリコールジグリシジルエーテル、グリセロールジグリシジルエーテル、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテルからなる群から選択される、請求項４記載の方法。
【請求項６】
二官能性試薬がエピクロロヒドリンである、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
二官能性試薬の混合物を使用する、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
当該方法が無機塩の存在下で実施される、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
上記の塩が硫酸ナトリウムである、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
水混和性溶剤を加えて、二官能性試薬の溶解度を上昇させる工程をさらに含む、請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
水混和性溶剤がアルコール、ケトン、エーテルからなる群から選択される、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
水混和性溶剤を最終濃度が５０％（ｖ／ｖ）となるまで加える、請求項１０又は請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
膜が複数の酢酸セルロース基を含んでいる、請求項１乃至請求項１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
膜が、複数の酢酸セルロース基を含んでおり、塩基が水酸化ナトリウムであり、二官能性試薬がエピクロロヒドリンである、請求項１乃至請求項１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
当該方法が４５℃〜５５℃の温度で１時間以上実施される、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
二官能性試薬がエピクロロヒドリンである場合に、当該方法が、さらなるエピクロロヒドリン水溶液と塩基を、エステル基のヒドロキシル基への加水分解と、ヒドロキシル基のエピクロロヒドリンによる活性化が生じうるような条件で加えて、エポキシ活性化架橋セルロース膜を生成する工程をさらに含む、請求項１乃至請求項１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
クロマトグラフィー用リガンドを上記のエポキシ活性化架橋セルロース膜とカップリングさせる工程をさら含む、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
上記リガンドがアミン又はチオール基を含む、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
上記アミンがアンモニアである、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
クロマトグラフィー用リガンドを架橋セルロース膜とカップリングさせる工程をさらに含む、請求項１乃至請求項１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項２１】
カップリングが第一の酸化工程と第二の還元アミノ化工程を含む、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
上記の第一の酸化工程が膜の過ヨウ素酸塩溶液による処理を含む、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
第二の還元アミノ化工程が膜の水素化ホウ素ナトリウ（ＮａＢＨ4）による処理を含む、請求項２１又は請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
上記リガンドがアミンを含む、請求項２０乃至請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
上記アミンが第二級アミンである、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
上記第二級アミンがビス（３−アミノプロピル）アミンである、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
上記リガンドがグリシジル第四級アンモニウム化合物を含む、請求項２０記載の方法。
【請求項２８】
カップリングが還元剤の存在下での塩基の使用を含む、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
還元剤が水素化ホウ素ナトリウである、請求項２８の方法。
【請求項３０】
塩基が水酸化ナトリウムである、請求項２８又は請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
グリシジル第四級アンモニウム化合物が塩化グリシジルトリメチルアンモニウム（ＧＭＡＣ）である、請求項２７乃至請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
複数のセルロースエステル基を含む膜に、塩基を、二官能性試薬の水溶液の存在下で、上記エステル基のヒドロキシル基への加水分解並びに上記ヒドロキシル基の上記二官能性試薬との架橋が生じうるような条件で加える工程を含み、上記の加水分解と架橋とが、実質的に同時に生じることを特徴とする多孔質架橋セルロース膜の製造方法によって製造された多孔質架橋セルロース膜。
【請求項３３】
溶液又は懸濁液中で、第一成分の第二成分からの分離を、第一成分と第二成分のサイズの違いにもとづいて行う方法であって、当該方法が、請求項３２記載の膜を利用した精密濾過又は限外濾過である方法。
【請求項３４】
標的分子を、溶液中の他の成分から分離する方法であって、当該方法が、請求項３２記載の膜を使用するクロマトグラフィーである方法。
【請求項３５】
標的分子が膜中に存在するクロマトグラフィー用リガンドと結合する結合性部分を含む、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
標的分子がタンパク質である、請求項３４又は請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
標的分子がポリヌクレオチドである、請求項３４又は請求項３５記載の方法。
【請求項３８】
上記溶液が細胞抽出液、細胞溶解液又は細胞培養液である、請求項３３乃至請求項３７のいずれか１項記載の方法。
【請求項３９】
リガンドが正又は負に帯電している、請求項３４乃至請求項３８のいずれか１項記載の方法。
【請求項４０】
リガンドと結合部分が、それぞれ、特異的結合ペアの片方である、請求項３５乃至請求項３８のいずれか１項記載の方法。
【請求項４１】
リガンドと結合部分が、ビオチン／ストレプトアビジン、ビオチン／アビジン、ビオチンビオチン／ニュートラアビジン、ビオチン／キャプトアビジン、エピトープ／抗体、ＧＳＴ／グルタチオン、Ｈｉｓ−ｔａｇ／ニッケル、抗原／抗体、ＦＬＡＧ／Ｍ１抗体、マルトース結合性タンパク質／マルトース、キチン結合性タンパク質／キチン、カルモジュリン結合性タンパク質／カルモジュリン、Ｌｕｍｉｏ（登録商標）試薬／Ｌｕｍｉｏ（登録商標）認識配列からなる群から選択される請求項４０記載の方法。
【請求項１】
多孔質架橋セルロース膜の製造方法であって、
複数のセルロースエステル基を含む膜に、塩基を、二官能性試薬の水溶液の存在下で、上記エステル基のヒドロキシル基への加水分解並びに上記ヒドロキシル基の上記二官能性試薬との架橋が生じうるような条件で加える工程を含み、上記の加水分解と架橋とが、実質的に同時に生じることを特徴とする方法。
【請求項２】
塩基が、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化バリウム、水酸化テトラアルキルアンモニウム、炭酸ナトリウム、炭酸セシウム、三リン酸ナトリウム、ケイ酸ナトリウム、炭酸カリウム、ケイ酸カリウム、三リン酸カリウム、炭酸水素ナトリウムからなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
セルロースエステルが、酢酸セルロース、硝酸セルロース、キサントゲン酸セルロース、プロピオン酸セルロース、酪酸セルロース、安息香酸セルロース、及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項４】
二官能性試薬が、エピクロロヒドリン、エピブロモヒドリン、ジイソシアネート、ジメチル尿素、ジメチルエチレン尿素、ジメチルクロロシラン、ビス（２−ヒドロキシエチルスルホン）、グリシジルエーテル、ブタンジオールジグリシジルエーテル、ジビニルスルホン、アルキレンジハロゲン、ヒドロキシアルキレンジハロゲンからなる群から選択される、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
グリシジルエーテルが、ブタンジオールジグリシジルエーテル、エチレングリコールジグリシジルエーテル、グリセロールジグリシジルエーテル、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテルからなる群から選択される、請求項４記載の方法。
【請求項６】
二官能性試薬がエピクロロヒドリンである、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
二官能性試薬の混合物を使用する、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
当該方法が無機塩の存在下で実施される、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
上記の塩が硫酸ナトリウムである、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
水混和性溶剤を加えて、二官能性試薬の溶解度を上昇させる工程をさらに含む、請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
水混和性溶剤がアルコール、ケトン、エーテルからなる群から選択される、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
水混和性溶剤を最終濃度が５０％（ｖ／ｖ）となるまで加える、請求項１０又は請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
膜が複数の酢酸セルロース基を含んでいる、請求項１乃至請求項１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
膜が、複数の酢酸セルロース基を含んでおり、塩基が水酸化ナトリウムであり、二官能性試薬がエピクロロヒドリンである、請求項１乃至請求項１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
当該方法が４５℃〜５５℃の温度で１時間以上実施される、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
二官能性試薬がエピクロロヒドリンである場合に、当該方法が、さらなるエピクロロヒドリン水溶液と塩基を、エステル基のヒドロキシル基への加水分解と、ヒドロキシル基のエピクロロヒドリンによる活性化が生じうるような条件で加えて、エポキシ活性化架橋セルロース膜を生成する工程をさらに含む、請求項１乃至請求項１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
クロマトグラフィー用リガンドを上記のエポキシ活性化架橋セルロース膜とカップリングさせる工程をさら含む、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
上記リガンドがアミン又はチオール基を含む、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
上記アミンがアンモニアである、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
クロマトグラフィー用リガンドを架橋セルロース膜とカップリングさせる工程をさらに含む、請求項１乃至請求項１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項２１】
カップリングが第一の酸化工程と第二の還元アミノ化工程を含む、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
上記の第一の酸化工程が膜の過ヨウ素酸塩溶液による処理を含む、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
第二の還元アミノ化工程が膜の水素化ホウ素ナトリウ（ＮａＢＨ4）による処理を含む、請求項２１又は請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
上記リガンドがアミンを含む、請求項２０乃至請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
上記アミンが第二級アミンである、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
上記第二級アミンがビス（３−アミノプロピル）アミンである、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
上記リガンドがグリシジル第四級アンモニウム化合物を含む、請求項２０記載の方法。
【請求項２８】
カップリングが還元剤の存在下での塩基の使用を含む、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
還元剤が水素化ホウ素ナトリウである、請求項２８の方法。
【請求項３０】
塩基が水酸化ナトリウムである、請求項２８又は請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
グリシジル第四級アンモニウム化合物が塩化グリシジルトリメチルアンモニウム（ＧＭＡＣ）である、請求項２７乃至請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
複数のセルロースエステル基を含む膜に、塩基を、二官能性試薬の水溶液の存在下で、上記エステル基のヒドロキシル基への加水分解並びに上記ヒドロキシル基の上記二官能性試薬との架橋が生じうるような条件で加える工程を含み、上記の加水分解と架橋とが、実質的に同時に生じることを特徴とする多孔質架橋セルロース膜の製造方法によって製造された多孔質架橋セルロース膜。
【請求項３３】
溶液又は懸濁液中で、第一成分の第二成分からの分離を、第一成分と第二成分のサイズの違いにもとづいて行う方法であって、当該方法が、請求項３２記載の膜を利用した精密濾過又は限外濾過である方法。
【請求項３４】
標的分子を、溶液中の他の成分から分離する方法であって、当該方法が、請求項３２記載の膜を使用するクロマトグラフィーである方法。
【請求項３５】
標的分子が膜中に存在するクロマトグラフィー用リガンドと結合する結合性部分を含む、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
標的分子がタンパク質である、請求項３４又は請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
標的分子がポリヌクレオチドである、請求項３４又は請求項３５記載の方法。
【請求項３８】
上記溶液が細胞抽出液、細胞溶解液又は細胞培養液である、請求項３３乃至請求項３７のいずれか１項記載の方法。
【請求項３９】
リガンドが正又は負に帯電している、請求項３４乃至請求項３８のいずれか１項記載の方法。
【請求項４０】
リガンドと結合部分が、それぞれ、特異的結合ペアの片方である、請求項３５乃至請求項３８のいずれか１項記載の方法。
【請求項４１】
リガンドと結合部分が、ビオチン／ストレプトアビジン、ビオチン／アビジン、ビオチンビオチン／ニュートラアビジン、ビオチン／キャプトアビジン、エピトープ／抗体、ＧＳＴ／グルタチオン、Ｈｉｓ−ｔａｇ／ニッケル、抗原／抗体、ＦＬＡＧ／Ｍ１抗体、マルトース結合性タンパク質／マルトース、キチン結合性タンパク質／キチン、カルモジュリン結合性タンパク質／カルモジュリン、Ｌｕｍｉｏ（登録商標）試薬／Ｌｕｍｉｏ（登録商標）認識配列からなる群から選択される請求項４０記載の方法。
【公表番号】特表２００９−５０３１６０（Ｐ２００９−５０３１６０Ａ）
【公表日】平成２１年１月２９日（２００９．１．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５２３２０４（Ｐ２００８−５２３２０４）
【出願日】平成１８年７月２４日（２００６．７．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／００７２５６
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０１７０８５
【国際公開日】平成１９年２月１５日（２００７．２．１５）
【出願人】（５９７０６４７１３）ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・アクチボラグ (109)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１月２９日（２００９．１．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年７月２４日（２００６．７．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／００７２５６
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０１７０８５
【国際公開日】平成１９年２月１５日（２００７．２．１５）
【出願人】（５９７０６４７１３）ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・アクチボラグ (109)
【Ｆターム（参考）】
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