セルロース結合ドメインが不活性化されたセロビオヒドロラーゼ活性を有するタンパク質
【課題】より比活性に優れたP.chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼの提供。
【解決手段】特定のアミノ酸配列において、セルラーゼ結合領域が不活性化ないし欠失しており、セロビオヒドロラーゼ活性を有するタンパク質。該タンパク質をコードするＤＮＡ。該発現用ＤＮＡコンストラクトにより形質転換された細胞。
【解決手段】特定のアミノ酸配列において、セルラーゼ結合領域が不活性化ないし欠失しており、セロビオヒドロラーゼ活性を有するタンパク質。該タンパク質をコードするＤＮＡ。該発現用ＤＮＡコンストラクトにより形質転換された細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオマスに含まれるセルロースを有効利用するためのセロビオヒドロラーゼ及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、有限である石油資源を代替するものとして、植物の光合成作用に由来するバイオマスへの期待が高まってきており、バイオマスをエネルギーや各種材料に利用するための各種の試みがなされている。なかでも、セルロースの利用が期待されている。セルロースは、糖であるグルコースがβ−１，４グリコシド結合によって縮合した高分子化合物であり、分子間水素結合により強固な結晶構造を構成している。セルロースを分解し、さらに、グルコースに糖化し発酵原料として用いるには、セルロースを単糖まで分解（糖化）するには、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ及びβ−グルコシダーゼという、少なくとも３種類のセルラーゼ（セルロース分解酵素）セルラーゼの相乗効果が必要である。
【０００３】
自然界においては、クロストリジウム・サーモセラム（Clostridium thermocellum）やトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）などある種のカビ等が強力なセルラーゼを分泌することが知られている。セルラーゼは、通常、セルロース結合ドメインという、基質であるセルロースに結合するためのドメインを有していることが多い。セルロース結合ドメインを有することにより、水不溶性のセルロースや水溶性のオリゴマーに結合し、セルロースを分解しやすくなると考えられている。しかしながら、こうしたセルロース結合ドメインを有しないセルラーゼも天然に存在しており、例えば、T. reesei由来のエンドグルカナーゼ３やシロアリ腸内細菌由来のセルラーゼなどが挙げられる。
【０００４】
一方、本来的に存在するセルロース結合ドメインを人工的に欠失させたエンドグルカナーゼが開示されている（特許文献１）。この文献には、この接合菌由来のエンドグルカナーゼにおいてセルロース結合ドメインを欠失させることでエンドグルカナーゼ活性が向上したことが記載されている。
【０００５】
効率的にあるいは低コストにセルロースを利用するには、強力なセルラーゼあるいは相乗効果の高いセルラーゼを提供することが必要である。ここで、セルラーゼの一種であるセロビオヒドロラーゼとして、ファネロケーテ・クリソスポリウム（Phanerochaete chrysosporium）由来のセロビオヒドロラーゼが知られている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第WO2002/042474号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Uzcatsguiら、Ｊ．Biotechnol．19(2-3)：271-85, 1991
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
P. chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼは高い相乗効果を奏するため、さらなる比活性の向上が求められている。
【０００９】
また、特許文献１に開示される特定の接合菌由来のエンドグルカナーゼについては、セルロース結合ドメインの欠失がエンドグルカナーゼ活性向上に寄与していた。セルロース結合ドメインは、セルロースに結合する部位ではあるため、通常は、当該部位がセルロース分解活性に寄与するもの考えられ、当該部位の欠失は酵素活性の低下を招くことが予想される。また、セルロース結合ドメインと触媒部位とがセルロースに対して一定の位置関係が、セルロースの分解に寄与することも想定されており、かかる場合には、セルロース結合ドメインの欠失は、著しく酵素活性を低下させることがある。ましてや、セルロース結合ドメインの欠失がセルラーゼ活性の向上に寄与するセルラーゼをアミノ酸配列等から識別することもできなかった。加えて、こうした酵素活性の変化は、基質であるセルロースの状態により変動することもあった。したがって、本来的にセルロース結合ドメインを有するセルラーゼからセルロース結合活性を不活性化させることが、そのセルラーゼの酵素活性の向上に寄与するかどうかは全く予測することはできなかった。
【００１０】
そこで、本明細書の開示は、より優れた比活性を備えるセロビオヒドロラーゼを提供し、さらにその利用を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、P. chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼIIの活性向上を目的として、種々検討しているなか、基質過剰条件下において、見かけの酵素活性が低下する傾向があるという知見を得た。人工的な環境下でのセルロースの分解・糖化反応を考慮すると、反応効率を向上させるためには、基質濃度は著しく高い環境下での反応を行うことが求められる。したがって、このセロビオヒドロラーゼをセルロースの糖化に用いるには不利であると考えられた。そこで、本発明者らは、過剰のセルロースの存在下においては、セルロース結合ドメインが存在することにより、セロビオヒドロラーゼがセルロースから離れにくくなり、引き続き生じうる酵素反応を阻害する可能性があるとの推論に至った。そして、このセロビオヒドロラーゼからセルロース結合ドメインを欠失させてセルロース結合活性を低下させたところ、セロビオヒドロラーゼ活性が向上するという知見を得た。本明細書の開示は、これらの知見に基づいて提供される。
【００１２】
本明細書の開示によれば、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのアミノ酸配列において、セルロース結合ドメインが不活性化しており、セロビオヒドロラーゼ活性を有するタンパク質。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸の置換、欠失及び/又は付加を有するアミノ酸配列
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ又はその一部とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列
（ｅ）配列番号１で表される塩基配列と７５％以上の同一性を有する塩基配列によってコードされるアミノ酸配列
【００１３】
本明細書の開示によれば、また、上記タンパク質をコードする、ＤＮＡ、当該ＤＮＡを含む発現用コンストラクト、当該発現用ＤＮＡコンストラクトにより形質転換された細胞、上記タンパク質を細胞外に分泌又は細胞表層に提示する細胞も提供される。
【００１４】
本明細書の開示によれば、セルロースの分解産物の生産方法であって、上記タンパク質を含む１種又は２種以上のセルラーゼを用いて、セルロースを分解する工程、を備える、セルロースの分解産物の生産方法が提供される。
【００１５】
本明細書の開示によれば、微生物の発酵により有用物質を生産する方法であって、上記タンパク質を含む１種又は２種以上のセルラーゼを用いて、セルロースを分解してセルロース分解産物を取得する工程と、微生物により前記セルロース分解産物を含む炭素源を発酵して、前記有用物質を生産する工程と、を備える、方法が提供される。また、微生物の発酵により有用物質を生産する方法であって、前記微生物の細胞外に分泌又は細胞表層に提示される上記タンパク質を含む、１種又は２種以上のセルラーゼの存在下、前記微生物を用いて、セルロースを少なくとも含む炭素源を発酵して前記有用物質を生産する工程、を備える、方法も提供される。
【００１６】
さらに、本明細書の開示によれば、上記タンパク質を含むセルラーゼ組成物及び上記タンパク質を含む、タンパク質複合体も提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ＣＢＤ部位の有無によるP. chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼIIの試験管内合成量の比較を示す図である。
【図２】ＣＢＤ部位の有無（保有状態vs欠失状態）によるP. chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼIIのＰＳＣを基質とした場合の相対比活性を示す図である。
【図３】ＣＢＤ部位の有無によるP. chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼIIのＡｖｉｃｅｌを基質とした場合の相対比活性を示す図である。
【図４】ＣＢＤ部位の有無によるT. reesei由来のエンドグルカナーゼIIのＰＳＣ、Ａｖｉｃｅｌ及びＣＭＣを基質とした場合の相対比活性を示す図である。
【図５】ＣＢＤ部位の有無によるP. chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼ７ＣのＰＳＣを基質とした場合の相対比活性を示す図である。
【図６】P. chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼIIの耐熱変異体についての52℃環境下での有利変異を持つ変異体の残存活性値を示す図である。
【図７】第２世代の有利変異の蓄積実験結果を示す図である。
【図８】第３世代の有利変異の蓄積実験結果を示す図である。
【図９】第４世代の有利変異の蓄積実験結果を示す図である。
【図１０】第５世代の有利変異の蓄積実験結果を示す図である。
【図１１】第６世代の有利変異の蓄積実験結果を示す図である。
【図１２】スクリーニング実験の耐熱試験結果を示す図である。
【図１３】スクリーニングで得られた変異体の耐熱性評価結果を示す図である。
【図１４】各世代の耐熱化変異体の耐熱試験結果を示す図である。
【図１５】耐熱化変異体のＣＢＤ欠失体の活性評価結果を示す図である。
【図１６】ＣＢＤ欠失変異体のセルロースへの結合力の評価結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本明細書の開示は、バイオマスに含まれるセルロースを有効利用するための活性の高いPhanerochaete chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼ及びその利用に関する。本明細書に開示されるタンパク質は、基質であるセルロースに対する結合活性が不活性化されることで、セルロースに対する分解活性（比活性）が、当該不活性化前よりも高められている。なお、セルロース結合活性の不活性化による比活性に対する効果は、各種セルラーゼにおいて異なり、不活性化の効果を当業者といえども予測することはできなかった。また、本タンパク質におけるセロビオヒドロラーゼ活性の向上程度は、通常の変異導入による改変による活性向上と同等あるいはそれ以上であり、当業者の予測を超えるものであった。
【００１９】
Phanerochaete chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼは、本来的に、他の１種又は２種以上のセルラーゼと組み合わせることにより高い相乗効果を発揮してセルロースを分解できるため、本明細書に開示されるタンパク質によれば、さらに活性の高いセルロース分解能を有する組み合わせを提供でき、セルロースの分解、セルロースからの有用物質の生産を効率的に行うことができるようになる。
【００２０】
セルロース結合活性の不活性化による、セロビオヒドロラーゼ活性（比活性）の向上には、本来的に有していたセルロース結合ドメインによる、セルロースの過剰存在下における、非生産的なセロビオヒドロラーゼのセルロースへの吸着を抑制するものと推測されるが、推論であって、本発明を拘束するものではない。
【００２１】
以下、本明細書の開示に含まれる種々の実施形態について詳細に説明する。なお、本明細書において用いる「ＧＨＦ（Glycoside Hydrolase Family）」とは、ＣＡＺｙ（Carbohydrate active Enzymes）のホームページ（http://www.cazy.org/fam/acc_GH.html）において提供される、グリコシド加水分解酵素の分類である。
【００２２】
（セルロース結合ドメインが不活性化されたPhanerochaete chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼ）
配列番号２で表されるアミノ酸配列は、Phanerochaete chrysosporiumのセロビオヒドロラーゼIIのアミノ酸配列をコードしている（Ａｐｐｌ. Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂａｉａｌ． ６０（１２），４３８７−４３９３（１９９４））。Phanerochaete chrysosporiumのセロビオヒドロラーゼIIは、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、Ｎ末端側にセルロース結合ドメインを有し、リンカー領域を介して活性ドメインを有している。本タンパク質は、Phanerochaete chrysosporiumから取得したセロビオヒドロラーゼ IIのアミノ酸配列（配列番号２）において、セルロース結合活性が不活性化されているが、セロビオヒドロラーゼ活性を有するタンパク質である。このような本タンパク質は、配列番号２で表されるアミノ酸配列において以下に説明するような各種態様でセルロース結合ドメインが不活性化され、しかも、セロビオヒドロラーゼ活性を維持するアミノ酸配列を有するタンパク質である。
【００２３】
（セルロース結合ドメインの不活性化の態様）
本タンパク質における、セルロース結合ドメインの不活性化の態様としては、セルロース結合ドメインの部分的又は全体の欠失が挙げられる。セルロース結合ドメインは、配列番号２で表されるアミノ酸配列の２番目から３７番目までのアミノ酸３６残基の領域とされており、不活性化の態様としては、このアミノ酸配列において１個以上、典型的には、複数個から全体（１００％）に及ぶアミノ酸の欠失が挙げられる。好ましくは、２以上の連続したアミノ酸の欠失である。たとえば、セルロース結合ドメインを除去したアミノ酸配列を配列番号３に示す。
【００２４】
アミノ酸が欠失されている領域やアミノ酸の数は、セルロース結合活性を評価することにより決定することができる。セルロース結合ドメインが部分的に欠失されている場合、セルロース結合ドメインをコードするアミノ酸配列の２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは４０％以上、さらに好ましくは５０％以上、一層好ましくは６０％以上、より一層好ましくは７０％以上、さらに一層好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、欠失されている。典型的には、セルロース結合ドメインのＮ末端側又はＣ末端側から連続してアミノ酸が欠失されているが、好ましくは、Ｎ末端側から連続して複数個のアミノ酸が欠失されている。
【００２５】
セルロース結合ドメインの不活性化は、タンパク質においてセルロース結合ドメインの一部又は全体が欠失している態様が好ましい。アミノ酸の欠失により、ペプチド鎖が短くなり、異種タンパク質としての合成量を増大させることができる。特に、本タンパク質を、試験管内におけるタンパク質生産や遺伝子工学的に異種タンパク質として微生物宿主等において生産させる場合には、好適である。
【００２６】
あるタンパク質がセルロース結合ドメイン活性（セルロース結合活性）を有しているか否か又はその程度は、例えば、タンパク質とアビセルとの結合力を測定することで評価することができる。具体的には、酢酸緩衝液pH5.0でけん濁したアビセルにタンパク質を添加し攪拌そして氷上にて一定時間静置後の遠心上清のタンパク質量を測定することで評価できる。その遠心上清にタンパク質がないかあるいは少ない時にはセルロース結合ドメイン活性を有すると言える。
【００２７】
セルロース結合活性の不活性化の他の態様としては、セルロース結合ドメインにおける１以上のアミノ酸の置換及び/又は挿入が挙げられる。置換又は挿入されているアミノ酸の部位や個数、置換又は挿入されて新たにセルロース結合ドメイン中に配置されるアミノ酸の種類は、得られた変異体タンパク質につき、セルロース結合活性を評価することで適宜決定することができる。
【００２８】
セルロース結合ドメインの不活性化は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるセロビオヒドロラーゼIIのセルロース結合活性と比較したとき、当該結合活性より低くなっていればよく、その程度は問わないが、好ましくは、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるセロビオヒドロラーゼIIのセルロース結合活性の６０％以下、より好ましくは５０％以下、さらに好ましくは４０％以下、一層好ましくは３０％以下、より一層好ましくは２０％以下、さらに一層好ましくは１０％以下、最も好ましくは５％以下である。
【００２９】
本タンパク質は、セロビオヒドロラーゼ活性を有している。セロビオヒドロラーゼ活性は、例えば、５０ｍＭ酢酸緩衝液ｐＨ５．０で１００倍希釈後、１％リン酸膨潤セルロース（ＰＳＣ）又は２．５％Ａｖｉｃｅｌを同量添加し（０．５％ＰＳＣ又は１．２５％Ａｖｉｃｅｌ）、４０℃で１６時間反応させ、反応液を、ＴＺアッセイ法（Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 11 (1985) 109-115）にて遠心上精の還元糖量を測定することにより、測定できる。セロビオヒドロラーゼ活性の程度は、特に問わないが、セルロース結合活性の不活性化により、本タンパク質のセロビオヒドロラーゼ活性が向上することがわかっている。本タンパク質のセロビオヒドロラーゼ活性は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるセロビオヒドロラーゼIIのセロビオヒドロラーゼ活性と比較したとき、好ましくは、当該活性の同等又はそれ以上であり、より好ましくは１１０％以上、さらに好ましくは１２０％以上、一層好ましくは１３０％以上、より一層好ましくは１４０％以上、さらに一層好ましくは１５０％以上、最も好ましくは１６０％以上である。
【００３０】
本タンパク質は、また、配列番号２で表されるアミノ酸配列と一定の関係を有するアミノ酸配列においてセルロース結合ドメインが不活性化されつつ、セロビオヒドロラーゼ活性を有するものであってもよい。すなわち、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質の変異体であって、セルロース結合活性やセロビオヒドロラーゼ活性を有する改変体において、セルロース結合ドメインが不活性化された態様が挙げられる。典型的には、セロビオヒドロラーゼ活性ドメインにおいては有効な変異を有し、かつセルロース結合ドメインには、セルロース結合活性が不活性化されるような変異を備えるタンパク質が挙げられる。このような本タンパク質においては、配列番号２で表されるアミノ酸配列と一定関係のあるアミノ酸配列において各種態様でセルロース結合ドメインが不活性化されており、しかも、セロビオヒドロラーゼ活性を維持するアミノ酸配列を有している。
【００３１】
こうした本タンパク質の他の一態様としては、配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して１又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列において、セルロース結合ドメインが不活性化されており、セロビオヒドロラーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。配列番号２で表されるアミノ酸配列に対するアミノ酸の変異は、欠失、置換及び／又は付加は、いずれか１種類であってもよいし、２種類以上が組み合わされていてもよい。また、これらの変異の総数は、特に限定されないが、好ましくは、１個以上２５個以下程度である。より好ましくは、１個以上２０個以下である。さらに好ましくは１個以上１５個以下であり、一層このましくは１０個以下であり、より一層好ましくは５個以下である。アミノ酸置換の例としては、保存的置換が好ましく、具体的には以下のグループ内での置換が挙げられる。（グリシン、アラニン）（バリン、イソロイシン、ロイシン）（アスパラギン酸、グルタミン酸）（アスパラギン、グルタミン）（セリン、トレオニン）（リジン、アルギニン）（フェニルアラニン、チロシン）。このような態様としては、たとえば、セロビオヒドロラーゼの活性ドメインやセルロース結合ドメインに隣接するリンカードメインの一部又は全部の欠失などが挙げられる。また、セロビオヒドロラーゼ活性向上のためのアミノ酸置換の導入等が挙げられる。
【００３２】
さらに他の一態様としては、配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、セルロース結合ドメインが不活性化されており、セロビオヒドロラーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。同一性は好ましくは８０％以上であり、より好ましくは８５％以上であり、さらに好ましくは、９０％以上であり、一層好ましくは９５％以上である。最も好ましくは、９８％以上である。
【００３３】
本明細書において同一性又は類似性とは、当該技術分野で知られているとおり、配列を比較することにより決定される、２以上のタンパク質あるいは２以上のポリヌクレオチドの間の関係である。当該技術で“同一性 ”とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間のアラインメントによって、あるいは場合によっては、一続きのそのような配列間のアラインメントによって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の配列不変性の程度を意味する。また、類似性とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間のアラインメントによって、あるいは場合によっては、一続きの部分的な配列間のアラインメントによって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の相関性の程度を意味する。より具体的には、配列の同一性と保存性（配列中の特定アミノ酸又は配列における物理化学特性を維持する置換）によって決定される。なお、類似性は、後述するＢＬＡＳＴの配列相同性検索結果においてSimilarity と称される。同一性及び類似性を決定する方法は、対比する配列間で最も長くアラインメントするように設計される方法であることが好ましい。同一性及び類似性を決定するための方法は、公衆に利用可能なプログラムとして提供されている。例えば、AltschulらによるBLAST (Basic Local Alignment Search Tool) プログラム（たとえば、Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ., J. Mol. Biol., 215: p403-410 (1990), Altschyl SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Miller W, Lipman DJ., Nucleic Acids Res. 25: p3389-3402 (1997))を利用し決定することができる。ＢＬＡＳＴのようなソフトウェアを用いる場合の条件は、特に限定するものではないが、デフォルト値を用いるのが好ましい。
【００３４】
さらに他の一態様として、配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡ又はその一部とストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列において、セルロース結合ドメインが不活性化されており、セロビオヒドロラーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。ストリンジェントな条件とは、たとえば、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、塩基配列の同一性が高い核酸、すなわち、配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましく９５％以上、最も好ましくは９７％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡの相補鎖がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸の相補鎖がハイブリダイズしない条件が挙げられる。より具体的には、ナトリウム塩濃度が１５〜７５０ｍＭ、好ましくは５０〜７５０ｍＭ、より好ましくは３００〜７５０ｍＭ、温度が２５〜７０℃、好ましくは５０〜７０℃、より好ましくは５５〜６５℃、ホルムアミド濃度が０〜５０％、好ましくは２０〜５０％、より好ましくは３５〜４５％での条件をいう。さらに、ストリンジェントな条件では、ハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄条件が、通常はナトリウム塩濃度が１５〜６００ｍＭ、好ましくは５０〜６００ｍＭ、より好ましくは３００〜６００ｍＭ、温度が５０〜７０℃、好ましくは５５〜７０℃、より好ましくは６０〜６５℃である。なお、以上のことから、さらなる他の一態様として、配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましく９５％以上、最も好ましくは９７％以上の同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列において、セルロース結合ドメインが不活性化されており、セロビオヒドロラーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。
【００３５】
なお、Phanerochaete chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼIIの活性ドメインにおける改変体のアミノ酸配列としては、特開２０１０-４１９９６号公報に開示される各種の改変体のアミノ酸配列が挙げられる。また、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１０個のアミノ酸置換(T130I/S134Q/S183T/A241E/M259I/Q307R/A309S/T342H/Q381S/F382L)を有するアミノ酸配列及び同アミノ酸配列において１５個のアミノ酸置換(T112S/N125K/T130I/S134Q/S183T/Q204K/F206Y/A241E/M259I/Q307R/A309S/T342H/I365V/Q381S/F382L)を含むアミノ酸配列が挙げられる。
【００３６】
本タンパク質は、P. chrysosporiumから取得したセロビオヒドロラーゼ IIのアミノ酸配列（配列番号２）において、以下の表１に示される１又は２以上のアミノ酸置換に相当するアミノ酸置換を備えることができる。「アミノ酸配列において１又は２以上のアミノ酸置換に相当するアミノ酸置換を備える」とは、配列番号２で表されるアミノ酸配列に表１から選択される１又は２以上のアミノ酸置換を備えるほか、配列番号２で表されるアミノ酸配列と一定の関係を有するアミノ酸配列において、配列番号２で表されるアミノ酸配列と対比したときに、表１から選択される１又は２以上のアミノ酸置換に相当するアミノ酸置換を備えていることをいう。
【００３７】
なお、アミノ酸置換を備えるとは、当該位置において、置換前のアミノ酸と置換後のアミノ酸とをそれぞれ特定して意味するほか、結果として「アミノ酸置換」によって特定されるアミノ酸を備えていればよいことを意味する。すなわち、「Ｍ２５９Ｌ」のアミノ酸置換を備えるとは、配列番号２において２５９位に相当する部位にＬ（ロイシン）を備えていることを意味する。以下、本タンパク質が備えることのできる変異であるアミノ酸置換について説明する。
【００３８】
【表１】
【００３９】
本タンパク質は、表２に示す各欄に示す１又は２以上のアミノ酸置換を備えるものであってもよい。なかでも、本タンパク質は、好ましくは、少なくとも、Ｍ２５９Ｌ、Ｍ２５９Ｉ、Ｔ３４２Ｈ、Ｑ３８１Ｓ＋Ｆ３８２Ｌから選択される１種又は２種以上に相当するアミノ酸置換を備えている。これらの各変異に組み合わせて、好ましくは、Ｔ１３０Ｉ及びＳ１３４の双方又はいずれかを含んでいることが好ましい。さらに、追加して、好ましくは、Ｍ２５９Ｉの変異を含んでいる。さらにまた、好ましくは、Ａ２４１Ｅの変異を含んでいることが好ましい。さらに追加して、好ましくは、Ｑ３０７Ｒ＋Ａ３０９Ｓの双方又はいずれかの変異を含んでいる。さらにまた、加えて、Ｓ１８３Ｔの変異を含んでいることが好ましい。さらに追加して、Ｔ１１２Ｓ、Ｎ１２５Ｋ、Ｑ２０４Ｋ、Ｉ３６５Ｖ及びＦ２０６Ｙからなる群から選択される１又は２以上の変異を含んでいることが好ましく、より好ましくは３種以上であり、さらに好ましくは４種以上であり、一層好ましくは５種である。
【００４０】
【表２】
【００４１】
以上のことから、好ましい変異体としては、たとえば、少なくとも以下の表３に示す組み合わせのアミノ酸置換を備えるものが挙げられる。なかでも、第３世代以降が好ましく、より好ましくは第４世代以降、さらに好ましくは第５世代以降、一層好ましくは第６世代以降、最も好ましくは第７世代以降である。表３中、Ｓｅｐｔ２５の組み合わせのアミノ酸置換を備え、さらに、Ｔ１１２Ｓ、Ｎ１２５Ｋ、Ｑ２０４Ｋ、Ｉ３６５Ｖ及びＦ２０６Ｙからなる群から選択される１又は２以上のアミノ酸置換を備えるタンパク質も好ましい。
【表３】
【００４２】
配列番号２で表されるアミノ酸配列において部分的な欠失を生じさせたり、アミノ酸の置換、付加を導入するには、公知の各種の手法を採用できる。例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列や当該配列と一定の関係を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ等の遺伝子情報を改変する方法を用いることができる。例えば、アミノ酸配列において欠失部位を形成するには、ＤＮＡの一部をＰＣＲ等により増幅したり、あるいはこうして部分的に増幅したＤＮＡ断片を適宜結合することで任意の部位に欠失を導入することができる。また、例えば、アミノ酸配列に置換及び／又は付加などの変異を導入して遺伝子情報を改変して本発明のタンパク質を得るには、Ｋｕｎｋｅｌ法、Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法等の公知の手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎ−Ｋ（ＴＡＫＡＲＡ社製）やＭｕｔａｎ−Ｇ（ＴＡＫＡＲＡ社製））などを用いて変異の導入が行われる。また、エラー導入ＰＣＲやＤＮＡシャッフリング等の手法により、遺伝子の変異導入やキメラ遺伝子を構築することもできる。エラー導入ＰＣＲ及びＤＮＡシャッフリング手法は、当技術分野で公知の手法であり、例えばエラー導入ＰＣＲについてはChen K, and Arnold FH. 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 90: 5618-5622を、またＤＮＡシャフリングやカセットＰＣＲ等の分子進化工学的手法は、例えば、Kurtzman,A.L.,Govindarajan, S., Vahle, K., Jones, J. T., Heinrichs, V., Patten P. A.,Advances in directed protein evolution by recursive genetic recombination: applications to therapeutic proteins. Curr. Opinion Biotechnol.,12, 361-370, 2001、及び、Okuta, A., Ohnishi, A. and Harayama, S., PCR isolation of catechol 2,3-dioxygenase gene fragments from environmental samples and their assembly into functional genes. Gene, 212, 221-228, 1998を参照することができる。なかでも、エラープローンＰＣＲ等によりランダム変異を導入する分子進化的手法を利用する無細胞タンパク質合成系を採用することが好ましい。エラープローンＰＣＲに適用する無細胞タンパク質合成系としては、公知のあるいは本出願人が出願した特開２００６−６１０８０号公報及び特開２００３−１１６５９０号公報に記載のタンパク質合成系を用いることができる。本出願人によるこれらの無細胞タンパク質合成系を用いることで活性型の酵素を容易に得ることができる。このため、これらのタンパク質合成系が適用されたエラープローンＰＣＲは、本発明のタンパク質を取得する手法として好ましく用いることができる。
【００４３】
なお、本タンパク質は、決定されたアミノ酸配列や塩基配列に基づいて、化学的な合成方法のほか、遺伝子工学的な方法によって製造され、必要に応じて精製される。
【００４４】
本タンパク質は、セルロース結合ドメインが不活性化されているために、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるPhanerochaete chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼIIやその改変体よりも、基質であるセルロースへの結合能が低減又は喪失している。一方、本タンパク質は、セロビオヒドロラーゼ活性及びエンドグルカナーゼやβ−グルコシダーゼとの相乗効果においても、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等以上の活性を有している。
【００４５】
（セルラーゼ組成物）
本明細書の開示によれば、本タンパク質と、さらに、他のセルラーゼ、たとえば、他のセロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ及びβ−グルコシダーゼからなる群から選択される１種又は２種以上を組み合わせの組成物が提供される。本組成物によれば、本タンパク質の優れたセロビオヒドロラーゼ活性により高いセルロース分解活性を呈することができる。本組成物に含まれる本タンパク質以外のセルラーゼとしては、特に限定しないで、公知のセルラーゼから適宜選択される。例えば、Phanerochaete chrysosporium由来でない他起源のエンドグルカナーゼが挙げられる。他起源由来のエンドグルカナーゼとしては、公知の各種エンドグルカナーゼが挙げられ、これらを単独であるいは２種類以上を適宜組み合わせて用いることができる。たとえば、ＧＨＦ５に属するエンドグルカナーゼが挙げられる。ＧＨＦ５に分類されるエンドグルカナーゼのなかでも、好ましくは、Trichoderma reesei由来のエンドグルカナーゼ、Aspergillus oryzae由来のエンドグルカナーゼ及びAspergillus niger由来のエンドグルカナーゼを好ましく用いることができる。より好ましくはTrichoderma reesei由来のエンドグルカナーゼAspergillus niger由来のエンドグルカナーゼである。ＧＨＦ５に分類されるエンドグルカナーゼは、こうしたエンドグルカナーゼから選択される１種又は２種以上を適宜組み合わせて用いることができる。
【００４６】
エンドグルカナーゼとしては、ＧＨＦ１２に属するエンドグルカナーゼが挙げられる。なかでも、Trichoderma reesei由来のエンドグルカナーゼ、Aspergillus niger由来のエンドグルカナーゼ及びAspergillus oryzae由来のエンドグルカナーゼが挙げられる。また、Phanerochaete chrysosporium由来のエンドグルカナーゼであってもよい。こうしたエンドグルカナーゼから選択される１種又は２種以上を適宜組み合わせて用いることができる。エンドグルカナーゼとしては、ＧＨＦ７及びＧＨＦ４５に属するエンドグルカナーゼであってもよい。なかでも、Trichoderma reesei由来のエンドグルカナーゼを好ましく用いることができる。
【００４７】
本セルラーゼ組成物は、Phanerochaete chrysosporium由来のエンドグルカナーゼを含んでいてもよい。Phanerochaete chrysosporium由来のエンドグルカナーゼは、セロビオヒドロラーゼII及びその改変体をPhanerochaete chrysosporiumの培養物等から取得した場合においてセロビオヒドロラーゼII及びその改変体とともに容易に取得できる。
【００４８】
本セルラーゼ組成物は、エンドグルカナーゼ以外の他のセルラーゼを含むことができる。例えば、ＧＨＦ７に属するセロビオヒドロラーゼＩを含有することができる。セロビオヒドロラーゼＩは、セロビオヒドロラーゼＩが、セロビオヒドロラーゼII等と協動することにより、一層セルロース分解の相乗効果が発揮される。セロビオヒドロラーゼＩは、Phanerochaete chrysosporium由来であってもよいし、他起源であってもよい。
【００４９】
本セルラーゼ組成物は、Phanerochaete chrysosporium以外の他起源のセルラーゼ生産菌の培養物（培養上清であってもよい）から取得された２種類以上のセルラーゼを含有していてもよい。セルラーゼ生産菌としては、特に限定されないで、適宜選択できるが、エンドグルカナーゼの起源としてTrichoderma reesei、Aspergillus aculeatus、Aspergillus niger、Aspergillus oryzae等が好ましく挙げられる。より好ましくは、Trichoderma reeseiである。
【００５０】
本セルラーゼ組成物は、化学的あるいは遺伝子工学的に本タンパク質及び必要に応じて他のセルラーゼを生産し、組み合わせることによって得ることができる。本セルラーゼ組成物を構成する全てのセルラーゼを同一の宿主細胞で遺伝子工学的に生産し、その培養上清や培養菌体を回収することによって、本セルラーゼ組成物を得るようにしてもよい。
【００５１】
本セルラーゼ組成物は、本タンパク質及び他のセルラーゼを、それぞれ精製したものとして含有していてもよいし、未精製タンパク質として他タンパク質やその他の成分を含んでいてもよい。また、その製剤形態は、特に限定されず、固形製剤（粉末（凍結乾燥体等）、タブレット等、顆粒等）であってもよいし、溶液（流通時においては凍結体であることが好ましい。）であってもよい。
【００５２】
（タンパク質複合体）
本明細書に開示されるタンパク質複合体は、本タンパク質と、本タンパク質をコヘシン−ドックリン結合によりコヘシンタンパク質上に備えている。ある種の細菌が、複数種類のセルラーゼを保持するタンパク質構造体を自己細胞表層に構築することが知られており、当該タンパク質構造体がセルロソームとして知られている。セルロソームは、セルラーゼが、スキャホールディンタンパク質に保持されて構成されており、セルロソームとスキャホールディンタンパク質とは、それぞれが備えるドックリンドメインとコヘシンドメインとの間の結合、すなわち、コヘシン−ドッケリン結合により結合されている。公知のセルロソームにおけるドックリンドメイン及びコヘシンドメインのアミノ酸配列は既にいくつか開示されている。コヘシン−ドックリン結合は、非共有結合性であって、そのアミノ酸配列に依存した水素結合等に基づくと考えられる。したがって、こうした開示に従い、ドックリンドメインを付加した本タンパク質と１又は２以上のコヘシンドメインを備えるスキャホールディンタンパク質とにより、人工的なセルロソーム、すなわち、タンパク質複合体を構築することができる。
【００５３】
本タンパク質複合体においては、本タンパク質には、ドックリンドメインが付加されている。ドックリンドメインは、コヘシン−ドックリン結合により後述するコヘシンタンパク質に本タンパク質を結合させる部位である。ドックリンドメインは、例えば、公知のセルロソーム生産微生物のセルロソームを構成するセルラーゼの一部に備えられている。本セルラーゼ複合体に用いるドックリンドメインとしては、公知の各種のセルロソーム生産微生物のセルラーゼのドックリンドメインから選択される。例えば、C. thermocellumのエンドグルカナーゼのドックリンドメインを含むアミノ酸配列が挙げられる。ドックリンリンドメインは、活性ドメインのＮ末端側及びＣ末端側のいずれの側にあってもよいが、好ましくは、Ｃ末端側に配置される。
【００５４】
本タンパク質複合体は、本セルラーゼ組成物が含みうる他のセルラーゼがコヘシンタンパク質に保持されていてもよい。他のセルラーゼに関しても、本タンパク質と同様に、ドックリンドメインが付加されている。他のセルラーゼに付加されるドックリンドメインは、本タンパク質に付加されるドックリンドメインと同一であってもよいし異なっていてもよい。
【００５５】
コヘシンタンパク質は、コヘシンタンパク質は、本タンパク質が備えるドックリンドメインを結合する１又は２以上のコヘシンドメインを有している。これにより、コヘシンタンパク質は、本タンパク質をコヘシン−ドックリン結合で保持でき、本タンパク質複合体の骨格として機能する。また、本タンパク質複合体は、他のセルラーゼを保持するための異なるコヘシンドメインの組み合わせあるいは配列を有するコヘシンタンパク質を備えていてもよい。
【００５６】
（コヘシンドメイン）
コヘシンタンパク質が備える、１又は２以上のコヘシンドメインは、セルロソームのスキャホールディンタンパク質が備えるコヘシンドメインに由来している。コヘシンドメインは、セルロソーム生産微生物の形成するセルロソームにおけるタイプＩ〜III骨格タンパク質に備えられる触媒活性のあるセルラーゼ等を非共有結合で結合するドメインとして知られている（粟冠ら、蛋白質核酸酵素、Vol.44、No.10（1999）、p41-p50、Demain, A. L., et al., Microbiol Mol. Biol Rev., 69(1), 124-54(2005), Doi, R. H., et al., J. Bacterol., 185(20), 5907-5914(2003)等）。すなわち、コヘシンドメインとしては、セルロソームのタイプＩ骨格タンパク質上のタイプＩコヘシンドメイン、同タイプII骨格タンパク質上のタイプIIコヘシンドメイン及びタイプIII骨格タンパク質上のタイプIIIコヘシンドメインが挙げられる。こうした各種タイプのコヘシンドメインとしては、各種セルロソーム生産微生物において多数その配列が決定されている。これらの各種のタイプのコヘシンのアミノ酸配列及びＤＮＡ配列は、NCBIのHP（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）等を介してアクセス可能な各種のタンパク質データベースやDNA配列のデータベースにより容易に取得することができる。
【００５７】
コヘシンドメインは、こうしたコヘシンドメインに由来するドメインであって、キメラタンパク質のドックリンドメインと結合することができる。セルラーゼの活性ドメインへのドックリンドメインのキメラ化は活性ドメインの活性が意図せずに低下することなどにより困難な場合があることから、キメラタンパク質のドックリンドメインに応じてコヘシンドメインを選択することができる。また、コヘシン−ドックリン結合の強度等も考慮してコヘシンドメインを選択することができる。
【００５８】
本タンパク質複合体にあっては、例えば、キメラタンパク質のドックリンドメインが例えば、C. thermocellumのcelＡのドックリンドメインに対して、C. thermocellumのスキャホールディンタンパク質のコヘシンドメインが挙げられる。
【００５９】
本タンパク質複合体は、タンパク質の複合体として、それ自体独立した形態であってもよいし、適当なキャリアに固定化ないし保持されていてもよい。また、後述するように、酵母等の微生物の表層に提示された状態であってもよい。本セルラーゼ複合体は、例えば、それぞれのタンパク質を公知のタンパク質製造方法により取得し、これらのタンパク質を接触させる条件下において、コヘシンタンパク質に対してキメラタンパク質を自己集合させることにより、本セルラーゼ複合体を取得できる。
【００６０】
また、本タンパク質複合体は、その構成タンパク質のうち１又は２以上を分泌発現する微生物の培養上清又はそのタンパク質精製物を混合してすべての構成タンパク質を接触させて自己集合させることによって取得できる。なお、構成タンパク質のすべてが微生物によって分泌発現されなくてもよく、必要に応じ微生物によって生産されない構成タンパク質を別途製造して混合してもよい。また、構成タンパク質のすべてを分泌発現する微生物の場合、この微生物の培養上清に、これらタンパク質が自己集合可能な状態で含まれるため、その培養上清に、本タンパク質複合体を取得できる。
【００６１】
（本タンパク質をコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡを含む発現用コンストラクト）
本明細書に開示されるＤＮＡは、本タンパク質をコードしている。かかるＤＮＡは、本タンパク質をコードしている限り、異なるコドンを用いてコードされるＤＮＡも含まれる。本明細書に開示される発現用コンストラクトは、本タンパク質をコードするＤＮＡを含んでいる。本タンパク質をコードするＤＮＡは、発現用コンストラクトを導入しようとする宿主細胞において本タンパク質を発現可能に保持されていればよい。例えば、宿主細胞で作動可能なプロモーターの制御下に連結されるとともに適切なターミネーターをその下流に有した状態で保持されている。プロモーターは、構成的プロモーターであっても誘導的プロモーターであってもよい。本発現用コンストラクトにおいて、このような状態のＤＮＡは、宿主染色体内に組み込み可能に備えられていてもよいし、染色体外に保持可能に備えられていてもよい。本発現用コンストラクトには、こうした外来ＤＮＡの導入に伴って、宿主において利用可能な選択マーカー遺伝子も同時に保持されていることが好ましい。本発現用コンストラクトは、特に真核微生物、好ましくは、酵母での本タンパク質の発現用であることが好ましい。
【００６２】
本発現用コンストラクトは、本タンパク質を既に説明したタンパク質複合体を構成可能な形態で発現可能に構築されていてもよい。すなわち、本タンパク質に対してドックリンドメインを付加した融合タンパク質を発現可能に形成されていてもよい。さらに、タンパク質複合体を構成可能な発現用コンストラクトとして、コヘシンタンパク質をコードするＤＮＡを含む、コヘシンタンパク質の発現用コンストラクトを構築してもよい。こうした発現コンストラクトにおいて、融合タンパク質やコヘシンタンパク質のコード化ＤＮＡは、本タンパク質をコードするＤＮＡと同様、各種形態でコンストラクトに備えられる。
【００６３】
（発現用ＤＮＡコンストラクトにより形質転換された細胞、上記タンパク質を細胞外に分泌又は細胞表層に提示する真核微生物）
本明細書に開示される形質転換細胞は、本発現用ＤＮＡコンストラクトによって形質転換された細胞である。本形質転換細胞は、本発現用ＤＮＡコンストラクトによって形質転換されることにより、本タンパク質を発現可能となっている。
【００６４】
本形質転換細胞は、本タンパク質又は本タンパク質複合体を発現可能な細胞であればよく、その種類を限定しないが、本タンパク質の生産及び回収を考慮すると、大腸菌などの細菌等が挙げられるが、好ましくは、本タンパク質によるセルロースの分解及び資化のための真核微生物である。真核微生物は、特に限定しないが、例えば、公知の各種酵母を利用できる。後述するエタノール発酵等を考慮すると、サッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）等のサッカロマイセス属の酵母、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）等のシゾサッカロマイセス属の酵母、キャンディダ・シェハーテ（Candida shehatae）等のキャンディダ属の酵母、ピヒア・スティピティス（Pichia stipitis）等のピヒア属の酵母、ハンセヌラ（Hansenula）属の酵母、トリコスポロン（Trichosporon）属の酵母、ブレタノマイセス（Brettanomyces）属の酵母、パチソレン（Pachysolen）属の酵母、ヤマダジマ（Yamadazyma）属の酵母、クルイベロマイセス・マーキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）、クルイベロマイセス・ラクティス（Kluveromyces lactis）等のクルイベロマイセス属の酵母が挙げられる。なかでも、工業的利用性等の観点からサッカロマイセス属酵母が好ましい。なかでも、サッカロマイセス・セレビジエが好ましい。また、真核微生物は、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・アキュリータス（Aspergillus aculeatus）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・ニジュランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus soya）、アスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・サイトイ（Aspergillus saitoi）等の麹菌であってもよい。異種タンパク質を大量に発現させるには、セルラーゼ非生産菌がより好ましい。また、Trichoderma reeseiなどのセルラーゼ生産菌で生産させることも好ましい。本タンパク質は、セルロース結合ドメインが不活性化されているため、セルラーゼ生産菌が生産するセルロース結合ドメインを有するセルラーゼとは異なる場所で働くことができる。したがって、セルラーゼ生産菌において本タンパク質を生産させることで、全体としてセルロース分解活性の高いセルラーゼの組み合わせ（セルラーゼ製剤）を提供できることになる。
【００６５】
本形質転換細胞は、本形質転換細胞のセルロースの分解への利用を考慮すると、本タンパク質を細胞外に分泌又は細胞表層に提示するものであることが好ましい。本タンパク質に細胞外分泌性や細胞表層提示性を付与するには、公知の分泌シグナルや表層提示用のシステムを用いることができる。例えば、分泌シグナルや凝集性タンパク質又はその一部のアミノ酸配列が付与される。分泌シグナルとしては、例えば、Rhizopus oryzaeやC. albicansのグルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル、酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダーなどが挙げられる。また、凝集性タンパク質としては、α−アグルチニンをコードするSAG1遺伝子の５’領域の３２０アミノ酸残基からなるペプチドが挙げられる。また、所望のタンパク質を細胞表層に提示するためのポリペプチドや手法は、ＷＯ０１／７９４８３号公報や、特開２００３−２３５５７９号公報、ＷＯ２００２／０４２４８３号パンフレット、ＷＯ２００３／０１６５２５号パンフレット、特開２００６−１３６２２３号公報、藤田らの文献（藤田ら，2004. Appl Environ Microbiol 70:1207-1212および藤田ら, 2002. Appl Environ Microbiol 68:5136-5141.）、村井ら, 1998. Appl Environ Microbiol 64:4857-4861.に開示されている。
【００６６】
本形質転換細胞は、本タンパク質複合体を細胞外に分泌又は細胞表層に提示するものであることも好ましい。本形質転換細胞は、好ましくは、コヘシンタンパク質を細胞表層提示し、本タンパク質を細胞外に分泌して、コヘシンタンパク質に本タンパク質をコヘシン−ドッケリン結合を介して保持させて、タンパク質複合体を細胞表層に提示する。
【００６７】
本タンパク質、本タンパク質複合体及びこれらを細胞外に分泌又は細胞表層に提示する細胞、好ましく酵母などの真核微生物は、向上されたセロビオヒドロラーゼ活性及び増強された相乗効果により、セルロースの分解、糖化、及び糖化と発酵とを同時進行させるＣＢＰ（連結バイオプロセス（糖化発酵同時進行））において、セルロースの分解効率を高めて、セルロースの効率的利用を具現化することができる。
【００６８】
以上説明した本明細書に開示される形質転換細胞は、いずれも、モレキュラークローニング第３版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載されている方法に準じて作製することができる。真核微生物などの宿主細胞の形質転換のためのベクター及びその構築方法は、当業者において周知であって、モレキュラークローニング第３版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に開示されている。また、コヘシンタンパク質やドックリンドメインを有するタンパク質を真核微生物において発現させるためのベクター及びその構築方法も、同様に、当業者において周知である。また、形質転換にあたり、従来公知の各種方法、例えば、トランスフォーメーション法や、トランスフェクション法、接合法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、酢酸リチウム法等を用いることも、同様に当業者において周知である。
【００６９】
なお、本明細書の開示によれば、本セルラーゼ複合体を構成する第１〜第３のキメラタンパク質及び当該キメラタンパク質をコードするＤＮＡも提供される。
【００７０】
（セルロースの分解産物の生産方法）
本明細書に開示されるセルロースの分解産物の生産方法は、本明細書の開示によれば、本タンパク質を含む１種又は２種以上のセルラーゼを用いて、セルロースを分解する工程、を備えることができる。本方法によれば、セロビオヒドロラーゼ活性が向上した本タンパク質を用いることにより、効率的にセルロースを分解できる。分解工程で用いる１種又は２種以上のセルラーゼとしては、本セルラーゼ組成物に含まれうる他のセルラーゼから適宜選択して用いることができる。分解工程においては、セルラーゼは、本セルラーゼ組成物として供給されてもよいし、本タンパク質複合体として提供されていてもよい。分解工程における処理温度や時間等の条件は、用いるセルラーゼの種類及びセルロースの供給形態によって適宜設定することができる。
【００７１】
本明細書において、セルロースとは、バイオマスから他の成分から分離工程を経たセルロースとして供給されてもよいし、リグニン、ヘミセルロース及び／又はペクチンが共存する未処理あるいは部分的な前処理を施したバイオマスなどセルロースを含有する材料として供給されてもよい。こうしたバイオマス資源としては、稲ワラ、麦ワラ、バガス、枯れ草等の廃棄資源のほか、未利用資源であってもよい。また、本明細書において、セルロース分解産物としては、セルロースの低分子化物であればよく、グルコース、そのオリゴマー、セロビオース等が挙げられる。
【００７２】
（有用物質の生産方法）
本明細書の開示によれば、微生物の発酵により有用物質を生産する方法であって、本タンパク質を含む１種又は２種以上のセルラーゼを用いて、セルロースを分解してセルロース分解産物を取得する工程と、微生物によりセルロース分解産物を含む炭素源を発酵して、前記有用物質を生産する工程と、を備える、方法が提供される。本生産方法によれば、本タンパク質を用い、向上したセロビオヒドロラーゼ活性がセルロースの分解に寄与するため、効率的にセルロースを分解することができる。本生産方法では、セルロースの分解工程と、当該分解工程で得られたセルロース分解産物を含む炭素源を微生物により発酵する工程と、をそれぞれ独立して実施することができる。したがって、セルロースの分解工程は、本セルラーゼ組成物や本タンパク質複合体を、酵素製剤として用いてセルロースを分解し、その後、このセルロース分解物を発酵工程に供給して発酵してもよい。
【００７３】
本明細書の開示によれば、発酵のための微生物の細胞外に分泌又は細胞表層に提示される本タンパク質を含む、１種又は２種以上のセルラーゼの存在下、前記微生物を用いて、セルロースを少なくとも含む炭素源を発酵して前記有用物質を生産する工程、を備えることができる。このような生産方法によれば、セロビオヒドロラーゼ活性の向上したタンパク質を細胞外に発現する発酵用微生物を用いることで、いわゆる糖化・発酵同時プロセス（ＣＢＰ）を効率的に行うことができる。１種又は２種以上のセルラーゼは、全て発酵用微生物の細胞表層に提示されていてもよいし、部分的に細胞外から添加されていてもよい。こうしたセルラーゼは、発酵用微生物の表層において本タンパク質複合体を構築していてもよい。
【００７４】
発酵用の微生物は、酵母などのエタノール生産微生物や麹菌等の真核微生物を好ましく用いることができる。微生物は、人工的に取得された微生物であってもよい。例えば、グルコースからの代謝系の１種又は２種以上の酵素を遺伝子組換えにより置換、追加等して得られる本来の代謝物でない化合物を産生可能に遺伝子工学的に改変したものであってもよい。このような微生物を用いることで、例えば、イソプレノド合成経路の追加によるファインケミカル（コエンザイムＱ１０、ビタミン及びその原料等）、解糖系の改変によるグリセリンの生産、プラスチック・化成品原料を生産するなどのバイオリファイナリー技術に適用できる。有用物質としては特に限定しないが、グルコースを利用して微生物が生成可能なものが好ましく、上記したように、バイオリファイナリー技術全般にわたる物質を対象とすることができる。
【実施例】
【００７５】
以下、本発明を、実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、以下に述べる遺伝子組換え操作は既出のMolecular Cloningに従い行った。
【実施例１】
【００７６】
（セルロース結合ドメインを有しないPhanerochaete chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼIIの合成）
ファネロケーテ由来セロビオヒドラーゼII（ＰｃＣＢＨ２）はセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）と触媒ドメインがリンカーでつながった構造を持っている。今回ＣＢＤ機能を喪失させるため、ＰｃＣＢＨ２のＣＢＤ部位を取り除き、「リンカー−触媒ドメイン」からなるペプチドを合成した。
【００７７】
（ＣＢＤを欠失したPhanerochaete chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼIIの試験内合成のためのＤＮＡ断片の調製）
pET23bのNdeI/HindIIIにファネロケーテ由来セロビオヒドラーゼ遺伝子（配列番号１）を挿入したプラスミドpET23b_PcCBH2wtをテンプレートに、２種類のオリゴマー配列（5’-GGATCTGCGGTCACGACCACCTCCGTT -3’（配列番号４）, 5’- CATATGTATATCTCCTTCTTAAAGT-3’（配列番号５））をプライマーとしてインバースＰＣＲを行った。取得したＰＣＲ産物につき、アガロースゲル電気泳動、ゲル染色にて目的バンドを取り出し、ゲル中のＤＮＡをキット（Wizard(R) SV Gel and PCR Clean-up System、Promega）を用いて抽出した。抽出したＤＮＡ断片をポリヌクレオチドキナーゼ（New England BioLabs）で両5’- 末端をリン酸化後、ライゲーションキット(DNA Ligation kit、Takara)を用いてライゲーション反応をさせた。ライゲーション産物を大腸菌DH5α株に導入し、その形質転換体を培養後、プラスミド抽出精製キット（QIAprep Spin Miniprep Kit、Qiagen）で目的のＤＮＡ断片を含むプラスミドを取り出した。ＣＢＤ部位の欠失は、シーケンスにより確認した。
【００７８】
（ＣＢＤを欠失したPhanerochaete chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼII改変体の試験内合成のためのＤＮＡ断片の調製）
次いで、ＣＢＨ２改変体として、Sept25：PcCBH2に１０個のアミノ酸置換(T130I/S134Q/S183T/A241E/M259I/Q307R/A309S/T342H/Q381S/F382L)を行った改変体及びMall4：PcCBH2に１５個のアミノ酸置換(T112S/N125K/T130I/S134Q/S183T/Q204K/F206Y/A241E/M259I/Q307R/A309S/T342H/I365V/Q381S/F382L)を行った改変体につき、それぞれＣＢＤを欠失させたＤＮＡ断片を、ＰｃＣＢＨ２についてのＤＮＡ断片を含むプラスミド構築に準じて調製した。
【００７９】
（セルラーゼの試験管内合成方法）
試験管内合成の鋳型として、作製したプラスミドに対して２本のプライマー（5’- ATCTCGATCCCGCGAAATTAATAC-3’（配列番号６）、 5’- TCCGGATATAGTTCCTCCTTTCAG-3’（配列番号７））で増幅、PCR purification kit (Qiagen)で精製したＰＣＲ産物を使用した。なおこのＰＣＲ産物には、T7プロモーター配列、開始コドン、遺伝子配列、終始コドン、ターミネーター配列が含まれている。
【００８０】
試験管内合成は、表４に示す組成の反応液で、26℃、3時間、in vitroでの転写翻訳共役反応を行なった。無細胞蛋白質合成反応の促進剤として、ＡＴＰの枯渇を補うためにクレアチンキナーゼをＡＴＰ生成酵素（ＡＤＰ＋ホスホクレアチン→ＡＴＰ）として、リファンピシンはＲＮＡ合成開始阻害剤、フォリン酸はＲＮＡ転写阻害剤として添加した。また、タンパク質のフォールディングを助ける因子として、各種シャペロンを高発現した大腸菌Ａ１９株から抽出したＳ３０菌体抽出液（−ＤＴＴ）を用いた。更に、Ｓ−Ｓ結合形成促進因子であるカビ由来プロテインジスルフィドイソメラーゼも添加した。なお合成されたセルラーゼ量を評価するため、蛍光標識されたリジン（FluoroTect GreenLys in vitro Translation Labeling System：プロメガ）を混ぜて合成反応を行った。
【００８１】
【表４】
【実施例２】
【００８２】
（試験管内合成反応におけるセルラーゼ合成量の評価）
ＣＢＤ欠失状態（リンカー−触媒ドメイン）とＣＢＤ保有状態（ＣＢＤ−リンカー−触媒ドメイン）とのそれぞれにつき、野生型ＰｃＣＢＨ２及び２種類のＰｃＣＢＨ２改変体の試験管内合成量及び比活性を評価した。
【００８３】
合成量の評価は、無細胞合成時に蛍光標識されたリジン（FluoroTect GreenLys in vitro Translation Labeling System：プロメガ）を取り込ませた合成産物をSDS-PAGE後、蛍光イメージアナライザー（FLA9000：富士フィルム株式会社）で検出、画像解析ソフトであるMulti Gauge（富士フィルム株式会社）での解析により行った。なお今回使用したＰｃＣＢＨ２野生型および改変体はそれぞれ、ＣＢＤ保有状態とＣＢＤ欠失状態で同数のリジンを持っているため、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの目的バンドの蛍光量でその合成量が比較評価できる。結果を図１に示す。図１には、セルラーゼの試験管内合成量を、野生型及び改変体につき、ＣＢＤ保有状態（黒）及びＣＢＤ欠失状態（灰色）として、ＣＢＤ保有状態の合成量に対する相対量として示す。
【００８４】
図１に示すように、野生型ＰｃＣＢＨ２ではＣＢＤ欠失状態の方がＣＢＤ有状態よりも合成量が約１．３倍向上していた（図１）。また評価した２つのＰｃＣＢＨ２変異体では共に、ＣＢＤ欠失状態の方がＣＢＤ保有状態よりも合成量が約１．７倍向上していた。
【実施例３】
【００８５】
（セルラーゼ（セロビオヒドロラーゼ）比活性の評価）
試験管内合成されたセルラーゼは、野生型及び各ＰｃＣＢＨ２改変体でＣＢＤ保有状態及びＣＢＤ欠失状態で同じセルラーゼ量となるように試験管内合成試薬で希釈し、その活性を評価した。具体的には、５０ｍＭ酢酸緩衝液ｐＨ５．０で１００倍希釈後、１％リン酸膨潤セルロース（ＰＳＣ）又は２．５％Ａｖｉｃｅｌを同量添加し（０．５％ＰＳＣ又は１．２５％Ａｖｉｃｅｌ）、４０℃で１６時間反応させた。反応液を、ＴＺアッセイ法（Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 11 (1985) 109-115）にて遠心上精の還元糖量を測定し、セルラーゼ比活性とした。図２及び図３には、セルラーゼの比活性を、野生型及び改変体につき、ＣＢＤ保有状態（黒）及びＣＢＤ欠失状態（灰色）として、ＣＢＤ保有状態の活性に対する相対比活性として示す。
【００８６】
（１）比活性の比較（ＰＳＣが基質の場合）
野生型ＰｃＣＢＨ２、改変体Ｓｅｐｔ２５およびＭａｌｌ４を用いて、ＰＳＣを基質とした条件でのＣＢＤ有欠失状態の比活性を評価した。結果は、図２に示すように、評価した野生型及び各改変体でＣＢＤ欠失状態はＣＢＤ保有状態よりも比活性が向上していた。すなわち、野生型及びＳｅｐｔ２５では２倍以上、Ｍａｌｌ４では、４倍以上であった。
【００８７】
（２）比活性の比較（Ａｖｉｃｅｌが基質の場合）
野生型ＰｃＣＢＨ２、改変体Ｓｅｐｔ２５およびＭａｌｌ４を用いて、Ａｖｉｃｅｌを基質とした条件でのＣＢＤ欠失／保有状態の比活性を評価した。結果は、図３に示すように、評価した野生型及び各改変体でＣＢＤ欠失状態はＣＢＤ保有状態よりも比活性が向上していた。すなわち、野生型では１．４倍、Ｓｅｐｔ２５では１．２倍、Ｍａｌｌ４では、１．７倍であった。
【実施例４】
【００８８】
（トリコデルマ由来のエンドグルカナーゼ２のＣＢＤ欠失／保有状態での比活性比較）
本実施例では、トリコデルマ由来のエンドグルカナーゼ２（ＴｒＥＧ２、ＧＨＦ５）を用いて、そのＣＢＤ欠失変異体を合成し、実施例３に準じて、ＣＢＤ欠失／保有状態での比活性測定を行った。ＣＢＤ欠失変異体のＤＮＡ断片を含むプラスミド作製は、上記エンドグルカナーゼIIの遺伝子（GenBankアクセッション番号P07982（配列番号１２）に対して、プライマー配列（5’- GGGGTCCGATTTGCCGGCGTTAACAT-3’（配列番号８））及び5’- CATATGTATATCTCCTTCTTAAAGT-3’ （配列番号９））を用いる以外は、実施例１に準じてプラスミドを構築し、各ペプチドを試験管内合成した。
【００８９】
実施例３と同様に、ＰＳＣ（０．５％）及びＡｖｉｃｅｌ（１．２５％）を基質としてＣＢＤ欠失／保有状態での比活性を評価した。さらに、基質としてカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ、０．２％）を使用して同様にして比活性を評価した。結果を図４に示す。図４には、セルラーゼの比活性を、ＣＢＤ保有状態（黒）及びＣＢＤ欠失状態（灰色）として、ＣＢＤ保有状態の活性に対する相対比活性として示す。
【００９０】
図４に示すように、トリコデルマ由来のエンドグルカナーゼＩＩについては、ＰＳＣが基質の場合には、ＣＢＤ欠失状態の方がＣＢＤ保有状態よりも比活性が高いことが示された。また、Ａｖｉｃｅｌが基質の場合には、ＣＢＤ欠失状態の方がＣＢＤ保有状態よりも比活性が低いことが示された。さらに、ＣＭＣが基質の場合には、ＣＢＤ保有状態とＣＢＤ欠失状態はほぼ同じ比活性を示した。以上のことから、ＧＨＦ４５とは異なるＧＨＦ２のエンドグルカナーゼでのＣＢＤ削除の効果は、基質によって様々で、一概にＣＢＤ削除による比活性の向上を示すことはできなかった。
【実施例５】
【００９１】
（ファネロケーテ由来のセロビオヒドラーゼ７ＣのＣＢＤ欠失／保有状態での比活性比較）
ＰｃＣＢＨ２とは異なるファネロケーテ由来のセロビオヒドラーゼ７Ｃ（ＰｃＣＢＨ７Ｃ、ＧＨＦ７）を用いて、そのＣＢＤ欠失変異体を合成し、実施例４と同様にしてＣＢＤ欠失／保有状態での比活性測定を行った。ＰｃＣＢＨ７ＣのＣＢＤ欠失変異体のＤＮＡ断片を含むプラスミドの作製は、ＰｃＣＢＨ７Ｃ遺伝子（GenBankアクセッション番号M22220H（配列番号１３））に対して、プライマー配列（5’- TTAGCCGGTGTACGTGGTGTTGAGGT-3’ （配列番号１０）及び5’-AAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCA -3’ （配列番号１１））を用いる以外は、実施例１に準じて行い、各ペプチドを試験管内合成した。実施例３と同様に、ＰＳＣ（０．５％）を基質としてＣＢＤ欠失／保有状態での比活性を評価した。結果を図５に示す。図５には、セルラーゼの比活性を、ＣＢＤ保有状態（黒）及びＣＢＤ欠失状態（灰色）として、ＣＢＤ保有状態の活性に対する相対比活性として示す。
【００９２】
図５に示すように、実施例３におけるＰｃＣＢＨ２の結果とは異なり、ＣＢＤ保有状態の方がＣＢＤ欠失状態よりも比活性が高かった（図５）。以上の結果から、ＰｃＣＢＨ２と同じファネロケーテ由来のセロビオヒドラーゼでも、ＣＢＤの欠失が比活性を向上させるわけではないことがわかる。
【実施例６】
【００９３】
（耐熱化変異体）
（１）耐熱性候補変異の選定
P. chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼII（PcCBH2）は、触媒ドメインとセルロース結合ドメイン（CBD）がリンカーでつながった構造を持つ。以下に、触媒ドメイン内のアミノ酸置換による耐熱化変異体の取得について説明する。
【００９４】
（２）耐熱性候補変異を含む変異体の構築
耐熱化への初期配列としてPcCBH2変異体5−6（配列番号１４、配列番号１５）を用いた。変異体5−6は、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、そのCBDのみに、アミノ酸置換（S22P置換（塩基配列上の変異：T64C））及び同義置換（塩基配列上の変異：G9A）をそれぞれ各一つ備えており、試験管内合成において野生型PcCBH2よりもタンパク質合成量が高い変異体であることがわかっている。耐熱化変異体の取得にあたり、変異体5−6に対して、以下の表５に示す変異（アミノ酸置換）を有する変異体作成した。すなわち、これらの変異体に相当するアミノ酸配列をそれぞれコードするオリゴマーＤＮＡ及びその直近の相補鎖オリゴマーＤＮＡをプライマーとして用いてインバースＰＣＲ法でプラスミド鎖を増幅し、５’−末端をリン酸化後、ライゲーションによるプラスミドの環状化、大腸菌への形質転換を経て取得した。各変異体の変異導入は、シーケンスを行い確認した。
【００９５】
【表５】
【００９６】
４３種の変異体を試験管内で合成した。試験管内合成の鋳型として、（１）で取得したＤＮＡに対してプライマー（5’- ATCTCGATCCCGCGAAATTAATAC-3’（配列番号１６）、 5’- TCCGGATATAGTTCCTCCTTTCAG-3’（配列番号１７））を用いて増幅させたPCR産物を、PCR purification kit (Qiagen)で精製したものを用いた。なお、このPCR産物には、T7プロモーター配列、開始コドン、遺伝子配列、終始コドン、ターミネーター配列が含まれている。
【００９７】
変異体の試験管内合成は、表６に示す組成の反応液で、２６℃、３時間、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写翻訳共役反応として行った。無細胞蛋白質合成反応の促進剤として、ＡＴＰの枯渇を補うためにクレアチンキナーゼをＡＴＰ生成酵素（ＡＤＰ＋ホスホクレアチン→ＡＴＰ）として、リファンピシンはＲＮＡ合成開始阻害剤、フォリン酸はＲＮＡ転写阻害剤として添加した。また、タンパク質のフォールディングを助ける因子として、各種シャペロンを高発現した大腸菌Ａ１９株から抽出したＳ３０菌体抽出液（−ＤＴＴ）を用いた。更に、Ｓ−Ｓ結合形成促進因子である、カビ由来プロテインジスルフィドイソメラーゼも添加した。
【００９８】
【表６】
【００９９】
（３）変異体の耐熱試験方法
合成した変異体を、５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で１００倍に希釈、４９，５０，５１，５２，５３及び５４℃の各温度で２時間保温する熱処理後、その残存活性をリン酸膨潤セルロース（ＰＳＣ）分解（反応条件：４０℃、１６時間）後の遠心上清の還元糖量をＴＺアッセイ法（Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 11 (1985) 109-115）を用いて評価した。残存活性は熱処理前の活性との比で表した。またセルラーゼの耐熱温度は上記残存活性が５０％となるときの温度と定義した。
【０１００】
（４）有利変異の選定
以上の耐熱性評価の結果、１３個の耐熱性が向上した変異体が得られた。その耐熱性を向上させた変異を有利変異と呼ぶこととした。今回に実験で得られた有利変異を表７及び図６に示す。図６に示すように、これらの有利変異は、いずれも、５２℃環境下で２時間保温後において、氷冷保持条件と比較して１．３〜７倍残存活性を向上させるものであった。
【表７】
【０１０１】
（５）第１世代変異体の選択
有利変異を一つずつ親配列に加算したＤＮＡを合成し、当該ＤＮＡを鋳型として、各変異体を実施例６の（２）と同様にして試験管内合成して、（３）に記載の方法に準じて耐熱性評価を行ったところ、最も耐熱性が高かった有利変異Ｍ−１８による変異体第１世代とした。
【０１０２】
（６）第２世代の選択
実施例２で得た変異体Ｔ３４２Ｈ（Ｍ１−１８）に有利変異Ｑ３８１Ｓ／Ｆ３８２Ｌ（Ｍ１−２０）を導入した変異体（Ｗ１８２０）を実施例１と同様にして合成し、（３）に記載の方法に準じて耐熱性を評価した。結果を図７に示す。図７に示すように、有利変異を蓄積したＷ１８＋２０の耐熱性はＭ１−１８及びＭ１−２０と比較して向上していた。この変異体を第２世代として選択した。
【０１０３】
（７）第３世代の選択
実施例３で得られた変異体Ｗ１８＋２０に有利変異（Ｍ１−１，−２，−４，−１２）をそれぞれ導入し、その変異体を上記（２）と同様にして合成し、上記（３）と同様にして耐熱性を評価した。結果を図８に示す。図８に示すように、有利変異Ｔ１３０Ｉ／Ｓ１３４Ｑ（Ｍ１−４）を導入した変異体（Ｔｒｉ４）の耐熱性が最も向上していた。この変異体を第３世代として選択した。
【０１０４】
（８）第４世代の選択
実施例４で得られた有利変異が３個導入された変異体Ｔｒｉ４に４つの有利変異（Ｍ１−１，−１１，−１２，−１４，−１５）をそれぞれ導入した変異体を、上記（２）と同様にして合成し、上記（３）と同様にして耐熱性を評価した。結果を図９に示す。図９に示すように、有利変異Ｍ２５９Ｉ（Ｍ１−１５）を導入した変異体（Ｑｕａｒｄ１５）の耐熱性が最も向上していた。この変異体を第４世代として選択した。
【０１０５】
（９）第５世代の選択
実施例５で得られた有利変異が４個導入された変異体Ｑｕａｒｄ１５に４つの有利変異（Ｍ１−１，−１１，−１２，−２７）をそれぞれ導入し、その変異体を、上記（２）と同様にして合成し、上記（３）と同様にして耐熱性を評価した。結果を図１０に示す。図１０に示すように、耐熱評価した。その結果、有利変異Ａ２４１Ｅ（Ｍ１−１２）を導入した変異体（Ｑｕｉｎｔ１２）の耐熱性が最も向上していた。この変異体を第５世代として選択した。
【０１０６】
（１０）第６世代の選択
実施例６で得られた有利変異が５個導入された変異体Ｑｕｉｎｔ１２に耐熱性への寄与度が高かった有利変異Ｑ３０７Ｒ／Ａ３０９Ｓ（Ｍ１−３７）とその他の３つの有利変異（Ｍ１−１，−２１，−２５）をそれぞれ導入した変異体を、上記（２）と同様にして合成し、上記（３）と同様にして耐熱性を評価した。結果を図１１に示す。図１１に示すように、Ｑｕｉｎｔ１２にＱ３０７Ｒ／Ａ３０９Ｓ及び有利変異Ｓ１８３Ｔ（Ｍ１−２５）を導入した変異体（Ｓｅｐｔ２５）の耐熱性が最も向上していた。この変異体を第６世代として選択した。
【０１０７】
（１１）スクリーニングによる耐熱化変異体の取得
加算していない有利変異（Ｍ１−１，−２，−１１，−２１，−２７）を変異体Ｓｅｐｔ２５にばらつきを持って導入後、スクリーニングにより最も高い耐熱性を有する変異体の取得を試みた。具体的には、QuickChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)を用いて変異を導入し、その変異体９２個をクローニングした。上記（２）と同様にして試験管内合成した変異体を５６℃にて２時間の熱処理後、熱処理前に対する残存活性を指標にスクリーニングを行った。結果を図１２に示す。図１２に示すように、熱処理に対する残存活性がSept25と比較して約5倍向上した変異体が得られた。
【０１０８】
（１２）スクリーニングで得られた変異体の耐熱性評価
上記スクリーニングで、残存活性が高かった上位３個の変異体について、上記（３）と同様に耐熱性を評価した。結果を図１３に示す。図１３に示すように、評価した３変異体は共にＳｅｐｔ２５と比較して耐熱温度が１℃向上していた。
【０１０９】
（１３）スクリーニングで得られた耐熱化変異体のアミノ酸配列の決定
上記で得られた耐熱化変異体のアミノ酸配列を塩基配列解析行うことで解析した。その結果、残りの有利変異（Ｍ１−１，−２，−１１，−２１，−２７）がすべて入っていることが分かった。この得られたクローンを耐熱化実験での最終変異体（Ｍａｌｌ４と呼ぶ）こととした。
【０１１０】
各世代の変異体における変異の組み合わせを以下の表に示す。
【表８】
【実施例７】
【０１１１】
（１４）各世代の耐熱化変異体を耐熱性評価
これまでに得られた各世代の耐熱変異体につき、上記（３）と同様に耐熱性を評価した。結果を図１４に示す。図１４に示すように、その結果、有利変異を加えるに従い耐熱温度が向上していることが確認できた。初期変異体５−６の耐熱温度が４９．９℃であるのに対し、耐熱化変異体Ｓｅｐｔ２５は４．４℃向上した５４．３℃、さらに最終変異体Ｍａｌｌ４では５．４℃向上した５４．３℃であった。
【実施例８】
【０１１２】
（CBD欠失PcCBH2変異体の耐熱性評価）
さらに、耐熱化変異体Mall4のCBD部位を削除した変異体を作製した。当該変異体は、実施例１に準じて試験管内合成した。Mall４及びそのＣＢＤ欠失変異体の耐熱性を評価した。また、変異体５−６の評価も併せて行った。結果を図１５に示す。図１５に示すように、耐熱化変異体Mall4からCBDを欠失させた変異体は、Mall4CBD保有体と同様、変異体５−６よりも、高い耐熱性を有していた。
【実施例９】
【０１１３】
（CBD欠失変異体のセルロースへの結合力の評価）
配列番号２で表されるアミノ酸配列の野生型PcCBH2（CBD保有）、上記の耐熱性変異体Mall4及びそれぞれのCBD欠失変異体を用いて、各セルラーゼのセルロースへの結合力をアビセルからの遊離率で評価した。具体的には、酵母で分泌発現そしてアビセルカラムで精製したそれぞれのセルラーゼ１００ngを、50mM酢酸緩衝液pH5.0でけん濁したアビセル１００ul（終濃度2％(w/v)）に添加、攪拌後、氷上で2時間静置させた。なお、コントロール実験として、アビセル無条件でも行った。それぞれの遠心上清のセルラーゼ活性を測定し、セルラーゼのアビセルからの遊離率を算出した。結果を図１６に示す。
【０１１４】
図１６に示すように、CBD保有セルラーゼの遊離率は約０．１であったのに対しCBD失活変異体では０．３〜０．５の値を示した。以上の結果より、CBD欠失セルラーゼは、保有セルラーゼと比較して、アビセルに対する結合性が低下していた。
【配列表フリーテキスト】
【０１１５】
配列番号４〜１３，１６、１７：プライマー
配列番号１４，１５：Phanerochaete chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼの変異体
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオマスに含まれるセルロースを有効利用するためのセロビオヒドロラーゼ及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、有限である石油資源を代替するものとして、植物の光合成作用に由来するバイオマスへの期待が高まってきており、バイオマスをエネルギーや各種材料に利用するための各種の試みがなされている。なかでも、セルロースの利用が期待されている。セルロースは、糖であるグルコースがβ−１，４グリコシド結合によって縮合した高分子化合物であり、分子間水素結合により強固な結晶構造を構成している。セルロースを分解し、さらに、グルコースに糖化し発酵原料として用いるには、セルロースを単糖まで分解（糖化）するには、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ及びβ−グルコシダーゼという、少なくとも３種類のセルラーゼ（セルロース分解酵素）セルラーゼの相乗効果が必要である。
【０００３】
自然界においては、クロストリジウム・サーモセラム（Clostridium thermocellum）やトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）などある種のカビ等が強力なセルラーゼを分泌することが知られている。セルラーゼは、通常、セルロース結合ドメインという、基質であるセルロースに結合するためのドメインを有していることが多い。セルロース結合ドメインを有することにより、水不溶性のセルロースや水溶性のオリゴマーに結合し、セルロースを分解しやすくなると考えられている。しかしながら、こうしたセルロース結合ドメインを有しないセルラーゼも天然に存在しており、例えば、T. reesei由来のエンドグルカナーゼ３やシロアリ腸内細菌由来のセルラーゼなどが挙げられる。
【０００４】
一方、本来的に存在するセルロース結合ドメインを人工的に欠失させたエンドグルカナーゼが開示されている（特許文献１）。この文献には、この接合菌由来のエンドグルカナーゼにおいてセルロース結合ドメインを欠失させることでエンドグルカナーゼ活性が向上したことが記載されている。
【０００５】
効率的にあるいは低コストにセルロースを利用するには、強力なセルラーゼあるいは相乗効果の高いセルラーゼを提供することが必要である。ここで、セルラーゼの一種であるセロビオヒドロラーゼとして、ファネロケーテ・クリソスポリウム（Phanerochaete chrysosporium）由来のセロビオヒドロラーゼが知られている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第WO2002/042474号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Uzcatsguiら、Ｊ．Biotechnol．19(2-3)：271-85, 1991
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
P. chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼは高い相乗効果を奏するため、さらなる比活性の向上が求められている。
【０００９】
また、特許文献１に開示される特定の接合菌由来のエンドグルカナーゼについては、セルロース結合ドメインの欠失がエンドグルカナーゼ活性向上に寄与していた。セルロース結合ドメインは、セルロースに結合する部位ではあるため、通常は、当該部位がセルロース分解活性に寄与するもの考えられ、当該部位の欠失は酵素活性の低下を招くことが予想される。また、セルロース結合ドメインと触媒部位とがセルロースに対して一定の位置関係が、セルロースの分解に寄与することも想定されており、かかる場合には、セルロース結合ドメインの欠失は、著しく酵素活性を低下させることがある。ましてや、セルロース結合ドメインの欠失がセルラーゼ活性の向上に寄与するセルラーゼをアミノ酸配列等から識別することもできなかった。加えて、こうした酵素活性の変化は、基質であるセルロースの状態により変動することもあった。したがって、本来的にセルロース結合ドメインを有するセルラーゼからセルロース結合活性を不活性化させることが、そのセルラーゼの酵素活性の向上に寄与するかどうかは全く予測することはできなかった。
【００１０】
そこで、本明細書の開示は、より優れた比活性を備えるセロビオヒドロラーゼを提供し、さらにその利用を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、P. chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼIIの活性向上を目的として、種々検討しているなか、基質過剰条件下において、見かけの酵素活性が低下する傾向があるという知見を得た。人工的な環境下でのセルロースの分解・糖化反応を考慮すると、反応効率を向上させるためには、基質濃度は著しく高い環境下での反応を行うことが求められる。したがって、このセロビオヒドロラーゼをセルロースの糖化に用いるには不利であると考えられた。そこで、本発明者らは、過剰のセルロースの存在下においては、セルロース結合ドメインが存在することにより、セロビオヒドロラーゼがセルロースから離れにくくなり、引き続き生じうる酵素反応を阻害する可能性があるとの推論に至った。そして、このセロビオヒドロラーゼからセルロース結合ドメインを欠失させてセルロース結合活性を低下させたところ、セロビオヒドロラーゼ活性が向上するという知見を得た。本明細書の開示は、これらの知見に基づいて提供される。
【００１２】
本明細書の開示によれば、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのアミノ酸配列において、セルロース結合ドメインが不活性化しており、セロビオヒドロラーゼ活性を有するタンパク質。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸の置換、欠失及び/又は付加を有するアミノ酸配列
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ又はその一部とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列
（ｅ）配列番号１で表される塩基配列と７５％以上の同一性を有する塩基配列によってコードされるアミノ酸配列
【００１３】
本明細書の開示によれば、また、上記タンパク質をコードする、ＤＮＡ、当該ＤＮＡを含む発現用コンストラクト、当該発現用ＤＮＡコンストラクトにより形質転換された細胞、上記タンパク質を細胞外に分泌又は細胞表層に提示する細胞も提供される。
【００１４】
本明細書の開示によれば、セルロースの分解産物の生産方法であって、上記タンパク質を含む１種又は２種以上のセルラーゼを用いて、セルロースを分解する工程、を備える、セルロースの分解産物の生産方法が提供される。
【００１５】
本明細書の開示によれば、微生物の発酵により有用物質を生産する方法であって、上記タンパク質を含む１種又は２種以上のセルラーゼを用いて、セルロースを分解してセルロース分解産物を取得する工程と、微生物により前記セルロース分解産物を含む炭素源を発酵して、前記有用物質を生産する工程と、を備える、方法が提供される。また、微生物の発酵により有用物質を生産する方法であって、前記微生物の細胞外に分泌又は細胞表層に提示される上記タンパク質を含む、１種又は２種以上のセルラーゼの存在下、前記微生物を用いて、セルロースを少なくとも含む炭素源を発酵して前記有用物質を生産する工程、を備える、方法も提供される。
【００１６】
さらに、本明細書の開示によれば、上記タンパク質を含むセルラーゼ組成物及び上記タンパク質を含む、タンパク質複合体も提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ＣＢＤ部位の有無によるP. chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼIIの試験管内合成量の比較を示す図である。
【図２】ＣＢＤ部位の有無（保有状態vs欠失状態）によるP. chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼIIのＰＳＣを基質とした場合の相対比活性を示す図である。
【図３】ＣＢＤ部位の有無によるP. chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼIIのＡｖｉｃｅｌを基質とした場合の相対比活性を示す図である。
【図４】ＣＢＤ部位の有無によるT. reesei由来のエンドグルカナーゼIIのＰＳＣ、Ａｖｉｃｅｌ及びＣＭＣを基質とした場合の相対比活性を示す図である。
【図５】ＣＢＤ部位の有無によるP. chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼ７ＣのＰＳＣを基質とした場合の相対比活性を示す図である。
【図６】P. chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼIIの耐熱変異体についての52℃環境下での有利変異を持つ変異体の残存活性値を示す図である。
【図７】第２世代の有利変異の蓄積実験結果を示す図である。
【図８】第３世代の有利変異の蓄積実験結果を示す図である。
【図９】第４世代の有利変異の蓄積実験結果を示す図である。
【図１０】第５世代の有利変異の蓄積実験結果を示す図である。
【図１１】第６世代の有利変異の蓄積実験結果を示す図である。
【図１２】スクリーニング実験の耐熱試験結果を示す図である。
【図１３】スクリーニングで得られた変異体の耐熱性評価結果を示す図である。
【図１４】各世代の耐熱化変異体の耐熱試験結果を示す図である。
【図１５】耐熱化変異体のＣＢＤ欠失体の活性評価結果を示す図である。
【図１６】ＣＢＤ欠失変異体のセルロースへの結合力の評価結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本明細書の開示は、バイオマスに含まれるセルロースを有効利用するための活性の高いPhanerochaete chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼ及びその利用に関する。本明細書に開示されるタンパク質は、基質であるセルロースに対する結合活性が不活性化されることで、セルロースに対する分解活性（比活性）が、当該不活性化前よりも高められている。なお、セルロース結合活性の不活性化による比活性に対する効果は、各種セルラーゼにおいて異なり、不活性化の効果を当業者といえども予測することはできなかった。また、本タンパク質におけるセロビオヒドロラーゼ活性の向上程度は、通常の変異導入による改変による活性向上と同等あるいはそれ以上であり、当業者の予測を超えるものであった。
【００１９】
Phanerochaete chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼは、本来的に、他の１種又は２種以上のセルラーゼと組み合わせることにより高い相乗効果を発揮してセルロースを分解できるため、本明細書に開示されるタンパク質によれば、さらに活性の高いセルロース分解能を有する組み合わせを提供でき、セルロースの分解、セルロースからの有用物質の生産を効率的に行うことができるようになる。
【００２０】
セルロース結合活性の不活性化による、セロビオヒドロラーゼ活性（比活性）の向上には、本来的に有していたセルロース結合ドメインによる、セルロースの過剰存在下における、非生産的なセロビオヒドロラーゼのセルロースへの吸着を抑制するものと推測されるが、推論であって、本発明を拘束するものではない。
【００２１】
以下、本明細書の開示に含まれる種々の実施形態について詳細に説明する。なお、本明細書において用いる「ＧＨＦ（Glycoside Hydrolase Family）」とは、ＣＡＺｙ（Carbohydrate active Enzymes）のホームページ（http://www.cazy.org/fam/acc_GH.html）において提供される、グリコシド加水分解酵素の分類である。
【００２２】
（セルロース結合ドメインが不活性化されたPhanerochaete chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼ）
配列番号２で表されるアミノ酸配列は、Phanerochaete chrysosporiumのセロビオヒドロラーゼIIのアミノ酸配列をコードしている（Ａｐｐｌ. Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂａｉａｌ． ６０（１２），４３８７−４３９３（１９９４））。Phanerochaete chrysosporiumのセロビオヒドロラーゼIIは、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、Ｎ末端側にセルロース結合ドメインを有し、リンカー領域を介して活性ドメインを有している。本タンパク質は、Phanerochaete chrysosporiumから取得したセロビオヒドロラーゼ IIのアミノ酸配列（配列番号２）において、セルロース結合活性が不活性化されているが、セロビオヒドロラーゼ活性を有するタンパク質である。このような本タンパク質は、配列番号２で表されるアミノ酸配列において以下に説明するような各種態様でセルロース結合ドメインが不活性化され、しかも、セロビオヒドロラーゼ活性を維持するアミノ酸配列を有するタンパク質である。
【００２３】
（セルロース結合ドメインの不活性化の態様）
本タンパク質における、セルロース結合ドメインの不活性化の態様としては、セルロース結合ドメインの部分的又は全体の欠失が挙げられる。セルロース結合ドメインは、配列番号２で表されるアミノ酸配列の２番目から３７番目までのアミノ酸３６残基の領域とされており、不活性化の態様としては、このアミノ酸配列において１個以上、典型的には、複数個から全体（１００％）に及ぶアミノ酸の欠失が挙げられる。好ましくは、２以上の連続したアミノ酸の欠失である。たとえば、セルロース結合ドメインを除去したアミノ酸配列を配列番号３に示す。
【００２４】
アミノ酸が欠失されている領域やアミノ酸の数は、セルロース結合活性を評価することにより決定することができる。セルロース結合ドメインが部分的に欠失されている場合、セルロース結合ドメインをコードするアミノ酸配列の２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは４０％以上、さらに好ましくは５０％以上、一層好ましくは６０％以上、より一層好ましくは７０％以上、さらに一層好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、欠失されている。典型的には、セルロース結合ドメインのＮ末端側又はＣ末端側から連続してアミノ酸が欠失されているが、好ましくは、Ｎ末端側から連続して複数個のアミノ酸が欠失されている。
【００２５】
セルロース結合ドメインの不活性化は、タンパク質においてセルロース結合ドメインの一部又は全体が欠失している態様が好ましい。アミノ酸の欠失により、ペプチド鎖が短くなり、異種タンパク質としての合成量を増大させることができる。特に、本タンパク質を、試験管内におけるタンパク質生産や遺伝子工学的に異種タンパク質として微生物宿主等において生産させる場合には、好適である。
【００２６】
あるタンパク質がセルロース結合ドメイン活性（セルロース結合活性）を有しているか否か又はその程度は、例えば、タンパク質とアビセルとの結合力を測定することで評価することができる。具体的には、酢酸緩衝液pH5.0でけん濁したアビセルにタンパク質を添加し攪拌そして氷上にて一定時間静置後の遠心上清のタンパク質量を測定することで評価できる。その遠心上清にタンパク質がないかあるいは少ない時にはセルロース結合ドメイン活性を有すると言える。
【００２７】
セルロース結合活性の不活性化の他の態様としては、セルロース結合ドメインにおける１以上のアミノ酸の置換及び/又は挿入が挙げられる。置換又は挿入されているアミノ酸の部位や個数、置換又は挿入されて新たにセルロース結合ドメイン中に配置されるアミノ酸の種類は、得られた変異体タンパク質につき、セルロース結合活性を評価することで適宜決定することができる。
【００２８】
セルロース結合ドメインの不活性化は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるセロビオヒドロラーゼIIのセルロース結合活性と比較したとき、当該結合活性より低くなっていればよく、その程度は問わないが、好ましくは、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるセロビオヒドロラーゼIIのセルロース結合活性の６０％以下、より好ましくは５０％以下、さらに好ましくは４０％以下、一層好ましくは３０％以下、より一層好ましくは２０％以下、さらに一層好ましくは１０％以下、最も好ましくは５％以下である。
【００２９】
本タンパク質は、セロビオヒドロラーゼ活性を有している。セロビオヒドロラーゼ活性は、例えば、５０ｍＭ酢酸緩衝液ｐＨ５．０で１００倍希釈後、１％リン酸膨潤セルロース（ＰＳＣ）又は２．５％Ａｖｉｃｅｌを同量添加し（０．５％ＰＳＣ又は１．２５％Ａｖｉｃｅｌ）、４０℃で１６時間反応させ、反応液を、ＴＺアッセイ法（Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 11 (1985) 109-115）にて遠心上精の還元糖量を測定することにより、測定できる。セロビオヒドロラーゼ活性の程度は、特に問わないが、セルロース結合活性の不活性化により、本タンパク質のセロビオヒドロラーゼ活性が向上することがわかっている。本タンパク質のセロビオヒドロラーゼ活性は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるセロビオヒドロラーゼIIのセロビオヒドロラーゼ活性と比較したとき、好ましくは、当該活性の同等又はそれ以上であり、より好ましくは１１０％以上、さらに好ましくは１２０％以上、一層好ましくは１３０％以上、より一層好ましくは１４０％以上、さらに一層好ましくは１５０％以上、最も好ましくは１６０％以上である。
【００３０】
本タンパク質は、また、配列番号２で表されるアミノ酸配列と一定の関係を有するアミノ酸配列においてセルロース結合ドメインが不活性化されつつ、セロビオヒドロラーゼ活性を有するものであってもよい。すなわち、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質の変異体であって、セルロース結合活性やセロビオヒドロラーゼ活性を有する改変体において、セルロース結合ドメインが不活性化された態様が挙げられる。典型的には、セロビオヒドロラーゼ活性ドメインにおいては有効な変異を有し、かつセルロース結合ドメインには、セルロース結合活性が不活性化されるような変異を備えるタンパク質が挙げられる。このような本タンパク質においては、配列番号２で表されるアミノ酸配列と一定関係のあるアミノ酸配列において各種態様でセルロース結合ドメインが不活性化されており、しかも、セロビオヒドロラーゼ活性を維持するアミノ酸配列を有している。
【００３１】
こうした本タンパク質の他の一態様としては、配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して１又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列において、セルロース結合ドメインが不活性化されており、セロビオヒドロラーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。配列番号２で表されるアミノ酸配列に対するアミノ酸の変異は、欠失、置換及び／又は付加は、いずれか１種類であってもよいし、２種類以上が組み合わされていてもよい。また、これらの変異の総数は、特に限定されないが、好ましくは、１個以上２５個以下程度である。より好ましくは、１個以上２０個以下である。さらに好ましくは１個以上１５個以下であり、一層このましくは１０個以下であり、より一層好ましくは５個以下である。アミノ酸置換の例としては、保存的置換が好ましく、具体的には以下のグループ内での置換が挙げられる。（グリシン、アラニン）（バリン、イソロイシン、ロイシン）（アスパラギン酸、グルタミン酸）（アスパラギン、グルタミン）（セリン、トレオニン）（リジン、アルギニン）（フェニルアラニン、チロシン）。このような態様としては、たとえば、セロビオヒドロラーゼの活性ドメインやセルロース結合ドメインに隣接するリンカードメインの一部又は全部の欠失などが挙げられる。また、セロビオヒドロラーゼ活性向上のためのアミノ酸置換の導入等が挙げられる。
【００３２】
さらに他の一態様としては、配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、セルロース結合ドメインが不活性化されており、セロビオヒドロラーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。同一性は好ましくは８０％以上であり、より好ましくは８５％以上であり、さらに好ましくは、９０％以上であり、一層好ましくは９５％以上である。最も好ましくは、９８％以上である。
【００３３】
本明細書において同一性又は類似性とは、当該技術分野で知られているとおり、配列を比較することにより決定される、２以上のタンパク質あるいは２以上のポリヌクレオチドの間の関係である。当該技術で“同一性 ”とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間のアラインメントによって、あるいは場合によっては、一続きのそのような配列間のアラインメントによって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の配列不変性の程度を意味する。また、類似性とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間のアラインメントによって、あるいは場合によっては、一続きの部分的な配列間のアラインメントによって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の相関性の程度を意味する。より具体的には、配列の同一性と保存性（配列中の特定アミノ酸又は配列における物理化学特性を維持する置換）によって決定される。なお、類似性は、後述するＢＬＡＳＴの配列相同性検索結果においてSimilarity と称される。同一性及び類似性を決定する方法は、対比する配列間で最も長くアラインメントするように設計される方法であることが好ましい。同一性及び類似性を決定するための方法は、公衆に利用可能なプログラムとして提供されている。例えば、AltschulらによるBLAST (Basic Local Alignment Search Tool) プログラム（たとえば、Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ., J. Mol. Biol., 215: p403-410 (1990), Altschyl SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Miller W, Lipman DJ., Nucleic Acids Res. 25: p3389-3402 (1997))を利用し決定することができる。ＢＬＡＳＴのようなソフトウェアを用いる場合の条件は、特に限定するものではないが、デフォルト値を用いるのが好ましい。
【００３４】
さらに他の一態様として、配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡ又はその一部とストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列において、セルロース結合ドメインが不活性化されており、セロビオヒドロラーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。ストリンジェントな条件とは、たとえば、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、塩基配列の同一性が高い核酸、すなわち、配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましく９５％以上、最も好ましくは９７％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡの相補鎖がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸の相補鎖がハイブリダイズしない条件が挙げられる。より具体的には、ナトリウム塩濃度が１５〜７５０ｍＭ、好ましくは５０〜７５０ｍＭ、より好ましくは３００〜７５０ｍＭ、温度が２５〜７０℃、好ましくは５０〜７０℃、より好ましくは５５〜６５℃、ホルムアミド濃度が０〜５０％、好ましくは２０〜５０％、より好ましくは３５〜４５％での条件をいう。さらに、ストリンジェントな条件では、ハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄条件が、通常はナトリウム塩濃度が１５〜６００ｍＭ、好ましくは５０〜６００ｍＭ、より好ましくは３００〜６００ｍＭ、温度が５０〜７０℃、好ましくは５５〜７０℃、より好ましくは６０〜６５℃である。なお、以上のことから、さらなる他の一態様として、配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましく９５％以上、最も好ましくは９７％以上の同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列において、セルロース結合ドメインが不活性化されており、セロビオヒドロラーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。
【００３５】
なお、Phanerochaete chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼIIの活性ドメインにおける改変体のアミノ酸配列としては、特開２０１０-４１９９６号公報に開示される各種の改変体のアミノ酸配列が挙げられる。また、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１０個のアミノ酸置換(T130I/S134Q/S183T/A241E/M259I/Q307R/A309S/T342H/Q381S/F382L)を有するアミノ酸配列及び同アミノ酸配列において１５個のアミノ酸置換(T112S/N125K/T130I/S134Q/S183T/Q204K/F206Y/A241E/M259I/Q307R/A309S/T342H/I365V/Q381S/F382L)を含むアミノ酸配列が挙げられる。
【００３６】
本タンパク質は、P. chrysosporiumから取得したセロビオヒドロラーゼ IIのアミノ酸配列（配列番号２）において、以下の表１に示される１又は２以上のアミノ酸置換に相当するアミノ酸置換を備えることができる。「アミノ酸配列において１又は２以上のアミノ酸置換に相当するアミノ酸置換を備える」とは、配列番号２で表されるアミノ酸配列に表１から選択される１又は２以上のアミノ酸置換を備えるほか、配列番号２で表されるアミノ酸配列と一定の関係を有するアミノ酸配列において、配列番号２で表されるアミノ酸配列と対比したときに、表１から選択される１又は２以上のアミノ酸置換に相当するアミノ酸置換を備えていることをいう。
【００３７】
なお、アミノ酸置換を備えるとは、当該位置において、置換前のアミノ酸と置換後のアミノ酸とをそれぞれ特定して意味するほか、結果として「アミノ酸置換」によって特定されるアミノ酸を備えていればよいことを意味する。すなわち、「Ｍ２５９Ｌ」のアミノ酸置換を備えるとは、配列番号２において２５９位に相当する部位にＬ（ロイシン）を備えていることを意味する。以下、本タンパク質が備えることのできる変異であるアミノ酸置換について説明する。
【００３８】
【表１】
【００３９】
本タンパク質は、表２に示す各欄に示す１又は２以上のアミノ酸置換を備えるものであってもよい。なかでも、本タンパク質は、好ましくは、少なくとも、Ｍ２５９Ｌ、Ｍ２５９Ｉ、Ｔ３４２Ｈ、Ｑ３８１Ｓ＋Ｆ３８２Ｌから選択される１種又は２種以上に相当するアミノ酸置換を備えている。これらの各変異に組み合わせて、好ましくは、Ｔ１３０Ｉ及びＳ１３４の双方又はいずれかを含んでいることが好ましい。さらに、追加して、好ましくは、Ｍ２５９Ｉの変異を含んでいる。さらにまた、好ましくは、Ａ２４１Ｅの変異を含んでいることが好ましい。さらに追加して、好ましくは、Ｑ３０７Ｒ＋Ａ３０９Ｓの双方又はいずれかの変異を含んでいる。さらにまた、加えて、Ｓ１８３Ｔの変異を含んでいることが好ましい。さらに追加して、Ｔ１１２Ｓ、Ｎ１２５Ｋ、Ｑ２０４Ｋ、Ｉ３６５Ｖ及びＦ２０６Ｙからなる群から選択される１又は２以上の変異を含んでいることが好ましく、より好ましくは３種以上であり、さらに好ましくは４種以上であり、一層好ましくは５種である。
【００４０】
【表２】
【００４１】
以上のことから、好ましい変異体としては、たとえば、少なくとも以下の表３に示す組み合わせのアミノ酸置換を備えるものが挙げられる。なかでも、第３世代以降が好ましく、より好ましくは第４世代以降、さらに好ましくは第５世代以降、一層好ましくは第６世代以降、最も好ましくは第７世代以降である。表３中、Ｓｅｐｔ２５の組み合わせのアミノ酸置換を備え、さらに、Ｔ１１２Ｓ、Ｎ１２５Ｋ、Ｑ２０４Ｋ、Ｉ３６５Ｖ及びＦ２０６Ｙからなる群から選択される１又は２以上のアミノ酸置換を備えるタンパク質も好ましい。
【表３】
【００４２】
配列番号２で表されるアミノ酸配列において部分的な欠失を生じさせたり、アミノ酸の置換、付加を導入するには、公知の各種の手法を採用できる。例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列や当該配列と一定の関係を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ等の遺伝子情報を改変する方法を用いることができる。例えば、アミノ酸配列において欠失部位を形成するには、ＤＮＡの一部をＰＣＲ等により増幅したり、あるいはこうして部分的に増幅したＤＮＡ断片を適宜結合することで任意の部位に欠失を導入することができる。また、例えば、アミノ酸配列に置換及び／又は付加などの変異を導入して遺伝子情報を改変して本発明のタンパク質を得るには、Ｋｕｎｋｅｌ法、Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法等の公知の手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎ−Ｋ（ＴＡＫＡＲＡ社製）やＭｕｔａｎ−Ｇ（ＴＡＫＡＲＡ社製））などを用いて変異の導入が行われる。また、エラー導入ＰＣＲやＤＮＡシャッフリング等の手法により、遺伝子の変異導入やキメラ遺伝子を構築することもできる。エラー導入ＰＣＲ及びＤＮＡシャッフリング手法は、当技術分野で公知の手法であり、例えばエラー導入ＰＣＲについてはChen K, and Arnold FH. 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 90: 5618-5622を、またＤＮＡシャフリングやカセットＰＣＲ等の分子進化工学的手法は、例えば、Kurtzman,A.L.,Govindarajan, S., Vahle, K., Jones, J. T., Heinrichs, V., Patten P. A.,Advances in directed protein evolution by recursive genetic recombination: applications to therapeutic proteins. Curr. Opinion Biotechnol.,12, 361-370, 2001、及び、Okuta, A., Ohnishi, A. and Harayama, S., PCR isolation of catechol 2,3-dioxygenase gene fragments from environmental samples and their assembly into functional genes. Gene, 212, 221-228, 1998を参照することができる。なかでも、エラープローンＰＣＲ等によりランダム変異を導入する分子進化的手法を利用する無細胞タンパク質合成系を採用することが好ましい。エラープローンＰＣＲに適用する無細胞タンパク質合成系としては、公知のあるいは本出願人が出願した特開２００６−６１０８０号公報及び特開２００３−１１６５９０号公報に記載のタンパク質合成系を用いることができる。本出願人によるこれらの無細胞タンパク質合成系を用いることで活性型の酵素を容易に得ることができる。このため、これらのタンパク質合成系が適用されたエラープローンＰＣＲは、本発明のタンパク質を取得する手法として好ましく用いることができる。
【００４３】
なお、本タンパク質は、決定されたアミノ酸配列や塩基配列に基づいて、化学的な合成方法のほか、遺伝子工学的な方法によって製造され、必要に応じて精製される。
【００４４】
本タンパク質は、セルロース結合ドメインが不活性化されているために、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるPhanerochaete chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼIIやその改変体よりも、基質であるセルロースへの結合能が低減又は喪失している。一方、本タンパク質は、セロビオヒドロラーゼ活性及びエンドグルカナーゼやβ−グルコシダーゼとの相乗効果においても、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等以上の活性を有している。
【００４５】
（セルラーゼ組成物）
本明細書の開示によれば、本タンパク質と、さらに、他のセルラーゼ、たとえば、他のセロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ及びβ−グルコシダーゼからなる群から選択される１種又は２種以上を組み合わせの組成物が提供される。本組成物によれば、本タンパク質の優れたセロビオヒドロラーゼ活性により高いセルロース分解活性を呈することができる。本組成物に含まれる本タンパク質以外のセルラーゼとしては、特に限定しないで、公知のセルラーゼから適宜選択される。例えば、Phanerochaete chrysosporium由来でない他起源のエンドグルカナーゼが挙げられる。他起源由来のエンドグルカナーゼとしては、公知の各種エンドグルカナーゼが挙げられ、これらを単独であるいは２種類以上を適宜組み合わせて用いることができる。たとえば、ＧＨＦ５に属するエンドグルカナーゼが挙げられる。ＧＨＦ５に分類されるエンドグルカナーゼのなかでも、好ましくは、Trichoderma reesei由来のエンドグルカナーゼ、Aspergillus oryzae由来のエンドグルカナーゼ及びAspergillus niger由来のエンドグルカナーゼを好ましく用いることができる。より好ましくはTrichoderma reesei由来のエンドグルカナーゼAspergillus niger由来のエンドグルカナーゼである。ＧＨＦ５に分類されるエンドグルカナーゼは、こうしたエンドグルカナーゼから選択される１種又は２種以上を適宜組み合わせて用いることができる。
【００４６】
エンドグルカナーゼとしては、ＧＨＦ１２に属するエンドグルカナーゼが挙げられる。なかでも、Trichoderma reesei由来のエンドグルカナーゼ、Aspergillus niger由来のエンドグルカナーゼ及びAspergillus oryzae由来のエンドグルカナーゼが挙げられる。また、Phanerochaete chrysosporium由来のエンドグルカナーゼであってもよい。こうしたエンドグルカナーゼから選択される１種又は２種以上を適宜組み合わせて用いることができる。エンドグルカナーゼとしては、ＧＨＦ７及びＧＨＦ４５に属するエンドグルカナーゼであってもよい。なかでも、Trichoderma reesei由来のエンドグルカナーゼを好ましく用いることができる。
【００４７】
本セルラーゼ組成物は、Phanerochaete chrysosporium由来のエンドグルカナーゼを含んでいてもよい。Phanerochaete chrysosporium由来のエンドグルカナーゼは、セロビオヒドロラーゼII及びその改変体をPhanerochaete chrysosporiumの培養物等から取得した場合においてセロビオヒドロラーゼII及びその改変体とともに容易に取得できる。
【００４８】
本セルラーゼ組成物は、エンドグルカナーゼ以外の他のセルラーゼを含むことができる。例えば、ＧＨＦ７に属するセロビオヒドロラーゼＩを含有することができる。セロビオヒドロラーゼＩは、セロビオヒドロラーゼＩが、セロビオヒドロラーゼII等と協動することにより、一層セルロース分解の相乗効果が発揮される。セロビオヒドロラーゼＩは、Phanerochaete chrysosporium由来であってもよいし、他起源であってもよい。
【００４９】
本セルラーゼ組成物は、Phanerochaete chrysosporium以外の他起源のセルラーゼ生産菌の培養物（培養上清であってもよい）から取得された２種類以上のセルラーゼを含有していてもよい。セルラーゼ生産菌としては、特に限定されないで、適宜選択できるが、エンドグルカナーゼの起源としてTrichoderma reesei、Aspergillus aculeatus、Aspergillus niger、Aspergillus oryzae等が好ましく挙げられる。より好ましくは、Trichoderma reeseiである。
【００５０】
本セルラーゼ組成物は、化学的あるいは遺伝子工学的に本タンパク質及び必要に応じて他のセルラーゼを生産し、組み合わせることによって得ることができる。本セルラーゼ組成物を構成する全てのセルラーゼを同一の宿主細胞で遺伝子工学的に生産し、その培養上清や培養菌体を回収することによって、本セルラーゼ組成物を得るようにしてもよい。
【００５１】
本セルラーゼ組成物は、本タンパク質及び他のセルラーゼを、それぞれ精製したものとして含有していてもよいし、未精製タンパク質として他タンパク質やその他の成分を含んでいてもよい。また、その製剤形態は、特に限定されず、固形製剤（粉末（凍結乾燥体等）、タブレット等、顆粒等）であってもよいし、溶液（流通時においては凍結体であることが好ましい。）であってもよい。
【００５２】
（タンパク質複合体）
本明細書に開示されるタンパク質複合体は、本タンパク質と、本タンパク質をコヘシン−ドックリン結合によりコヘシンタンパク質上に備えている。ある種の細菌が、複数種類のセルラーゼを保持するタンパク質構造体を自己細胞表層に構築することが知られており、当該タンパク質構造体がセルロソームとして知られている。セルロソームは、セルラーゼが、スキャホールディンタンパク質に保持されて構成されており、セルロソームとスキャホールディンタンパク質とは、それぞれが備えるドックリンドメインとコヘシンドメインとの間の結合、すなわち、コヘシン−ドッケリン結合により結合されている。公知のセルロソームにおけるドックリンドメイン及びコヘシンドメインのアミノ酸配列は既にいくつか開示されている。コヘシン−ドックリン結合は、非共有結合性であって、そのアミノ酸配列に依存した水素結合等に基づくと考えられる。したがって、こうした開示に従い、ドックリンドメインを付加した本タンパク質と１又は２以上のコヘシンドメインを備えるスキャホールディンタンパク質とにより、人工的なセルロソーム、すなわち、タンパク質複合体を構築することができる。
【００５３】
本タンパク質複合体においては、本タンパク質には、ドックリンドメインが付加されている。ドックリンドメインは、コヘシン−ドックリン結合により後述するコヘシンタンパク質に本タンパク質を結合させる部位である。ドックリンドメインは、例えば、公知のセルロソーム生産微生物のセルロソームを構成するセルラーゼの一部に備えられている。本セルラーゼ複合体に用いるドックリンドメインとしては、公知の各種のセルロソーム生産微生物のセルラーゼのドックリンドメインから選択される。例えば、C. thermocellumのエンドグルカナーゼのドックリンドメインを含むアミノ酸配列が挙げられる。ドックリンリンドメインは、活性ドメインのＮ末端側及びＣ末端側のいずれの側にあってもよいが、好ましくは、Ｃ末端側に配置される。
【００５４】
本タンパク質複合体は、本セルラーゼ組成物が含みうる他のセルラーゼがコヘシンタンパク質に保持されていてもよい。他のセルラーゼに関しても、本タンパク質と同様に、ドックリンドメインが付加されている。他のセルラーゼに付加されるドックリンドメインは、本タンパク質に付加されるドックリンドメインと同一であってもよいし異なっていてもよい。
【００５５】
コヘシンタンパク質は、コヘシンタンパク質は、本タンパク質が備えるドックリンドメインを結合する１又は２以上のコヘシンドメインを有している。これにより、コヘシンタンパク質は、本タンパク質をコヘシン−ドックリン結合で保持でき、本タンパク質複合体の骨格として機能する。また、本タンパク質複合体は、他のセルラーゼを保持するための異なるコヘシンドメインの組み合わせあるいは配列を有するコヘシンタンパク質を備えていてもよい。
【００５６】
（コヘシンドメイン）
コヘシンタンパク質が備える、１又は２以上のコヘシンドメインは、セルロソームのスキャホールディンタンパク質が備えるコヘシンドメインに由来している。コヘシンドメインは、セルロソーム生産微生物の形成するセルロソームにおけるタイプＩ〜III骨格タンパク質に備えられる触媒活性のあるセルラーゼ等を非共有結合で結合するドメインとして知られている（粟冠ら、蛋白質核酸酵素、Vol.44、No.10（1999）、p41-p50、Demain, A. L., et al., Microbiol Mol. Biol Rev., 69(1), 124-54(2005), Doi, R. H., et al., J. Bacterol., 185(20), 5907-5914(2003)等）。すなわち、コヘシンドメインとしては、セルロソームのタイプＩ骨格タンパク質上のタイプＩコヘシンドメイン、同タイプII骨格タンパク質上のタイプIIコヘシンドメイン及びタイプIII骨格タンパク質上のタイプIIIコヘシンドメインが挙げられる。こうした各種タイプのコヘシンドメインとしては、各種セルロソーム生産微生物において多数その配列が決定されている。これらの各種のタイプのコヘシンのアミノ酸配列及びＤＮＡ配列は、NCBIのHP（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）等を介してアクセス可能な各種のタンパク質データベースやDNA配列のデータベースにより容易に取得することができる。
【００５７】
コヘシンドメインは、こうしたコヘシンドメインに由来するドメインであって、キメラタンパク質のドックリンドメインと結合することができる。セルラーゼの活性ドメインへのドックリンドメインのキメラ化は活性ドメインの活性が意図せずに低下することなどにより困難な場合があることから、キメラタンパク質のドックリンドメインに応じてコヘシンドメインを選択することができる。また、コヘシン−ドックリン結合の強度等も考慮してコヘシンドメインを選択することができる。
【００５８】
本タンパク質複合体にあっては、例えば、キメラタンパク質のドックリンドメインが例えば、C. thermocellumのcelＡのドックリンドメインに対して、C. thermocellumのスキャホールディンタンパク質のコヘシンドメインが挙げられる。
【００５９】
本タンパク質複合体は、タンパク質の複合体として、それ自体独立した形態であってもよいし、適当なキャリアに固定化ないし保持されていてもよい。また、後述するように、酵母等の微生物の表層に提示された状態であってもよい。本セルラーゼ複合体は、例えば、それぞれのタンパク質を公知のタンパク質製造方法により取得し、これらのタンパク質を接触させる条件下において、コヘシンタンパク質に対してキメラタンパク質を自己集合させることにより、本セルラーゼ複合体を取得できる。
【００６０】
また、本タンパク質複合体は、その構成タンパク質のうち１又は２以上を分泌発現する微生物の培養上清又はそのタンパク質精製物を混合してすべての構成タンパク質を接触させて自己集合させることによって取得できる。なお、構成タンパク質のすべてが微生物によって分泌発現されなくてもよく、必要に応じ微生物によって生産されない構成タンパク質を別途製造して混合してもよい。また、構成タンパク質のすべてを分泌発現する微生物の場合、この微生物の培養上清に、これらタンパク質が自己集合可能な状態で含まれるため、その培養上清に、本タンパク質複合体を取得できる。
【００６１】
（本タンパク質をコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡを含む発現用コンストラクト）
本明細書に開示されるＤＮＡは、本タンパク質をコードしている。かかるＤＮＡは、本タンパク質をコードしている限り、異なるコドンを用いてコードされるＤＮＡも含まれる。本明細書に開示される発現用コンストラクトは、本タンパク質をコードするＤＮＡを含んでいる。本タンパク質をコードするＤＮＡは、発現用コンストラクトを導入しようとする宿主細胞において本タンパク質を発現可能に保持されていればよい。例えば、宿主細胞で作動可能なプロモーターの制御下に連結されるとともに適切なターミネーターをその下流に有した状態で保持されている。プロモーターは、構成的プロモーターであっても誘導的プロモーターであってもよい。本発現用コンストラクトにおいて、このような状態のＤＮＡは、宿主染色体内に組み込み可能に備えられていてもよいし、染色体外に保持可能に備えられていてもよい。本発現用コンストラクトには、こうした外来ＤＮＡの導入に伴って、宿主において利用可能な選択マーカー遺伝子も同時に保持されていることが好ましい。本発現用コンストラクトは、特に真核微生物、好ましくは、酵母での本タンパク質の発現用であることが好ましい。
【００６２】
本発現用コンストラクトは、本タンパク質を既に説明したタンパク質複合体を構成可能な形態で発現可能に構築されていてもよい。すなわち、本タンパク質に対してドックリンドメインを付加した融合タンパク質を発現可能に形成されていてもよい。さらに、タンパク質複合体を構成可能な発現用コンストラクトとして、コヘシンタンパク質をコードするＤＮＡを含む、コヘシンタンパク質の発現用コンストラクトを構築してもよい。こうした発現コンストラクトにおいて、融合タンパク質やコヘシンタンパク質のコード化ＤＮＡは、本タンパク質をコードするＤＮＡと同様、各種形態でコンストラクトに備えられる。
【００６３】
（発現用ＤＮＡコンストラクトにより形質転換された細胞、上記タンパク質を細胞外に分泌又は細胞表層に提示する真核微生物）
本明細書に開示される形質転換細胞は、本発現用ＤＮＡコンストラクトによって形質転換された細胞である。本形質転換細胞は、本発現用ＤＮＡコンストラクトによって形質転換されることにより、本タンパク質を発現可能となっている。
【００６４】
本形質転換細胞は、本タンパク質又は本タンパク質複合体を発現可能な細胞であればよく、その種類を限定しないが、本タンパク質の生産及び回収を考慮すると、大腸菌などの細菌等が挙げられるが、好ましくは、本タンパク質によるセルロースの分解及び資化のための真核微生物である。真核微生物は、特に限定しないが、例えば、公知の各種酵母を利用できる。後述するエタノール発酵等を考慮すると、サッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）等のサッカロマイセス属の酵母、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）等のシゾサッカロマイセス属の酵母、キャンディダ・シェハーテ（Candida shehatae）等のキャンディダ属の酵母、ピヒア・スティピティス（Pichia stipitis）等のピヒア属の酵母、ハンセヌラ（Hansenula）属の酵母、トリコスポロン（Trichosporon）属の酵母、ブレタノマイセス（Brettanomyces）属の酵母、パチソレン（Pachysolen）属の酵母、ヤマダジマ（Yamadazyma）属の酵母、クルイベロマイセス・マーキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）、クルイベロマイセス・ラクティス（Kluveromyces lactis）等のクルイベロマイセス属の酵母が挙げられる。なかでも、工業的利用性等の観点からサッカロマイセス属酵母が好ましい。なかでも、サッカロマイセス・セレビジエが好ましい。また、真核微生物は、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・アキュリータス（Aspergillus aculeatus）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・ニジュランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus soya）、アスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・サイトイ（Aspergillus saitoi）等の麹菌であってもよい。異種タンパク質を大量に発現させるには、セルラーゼ非生産菌がより好ましい。また、Trichoderma reeseiなどのセルラーゼ生産菌で生産させることも好ましい。本タンパク質は、セルロース結合ドメインが不活性化されているため、セルラーゼ生産菌が生産するセルロース結合ドメインを有するセルラーゼとは異なる場所で働くことができる。したがって、セルラーゼ生産菌において本タンパク質を生産させることで、全体としてセルロース分解活性の高いセルラーゼの組み合わせ（セルラーゼ製剤）を提供できることになる。
【００６５】
本形質転換細胞は、本形質転換細胞のセルロースの分解への利用を考慮すると、本タンパク質を細胞外に分泌又は細胞表層に提示するものであることが好ましい。本タンパク質に細胞外分泌性や細胞表層提示性を付与するには、公知の分泌シグナルや表層提示用のシステムを用いることができる。例えば、分泌シグナルや凝集性タンパク質又はその一部のアミノ酸配列が付与される。分泌シグナルとしては、例えば、Rhizopus oryzaeやC. albicansのグルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル、酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダーなどが挙げられる。また、凝集性タンパク質としては、α−アグルチニンをコードするSAG1遺伝子の５’領域の３２０アミノ酸残基からなるペプチドが挙げられる。また、所望のタンパク質を細胞表層に提示するためのポリペプチドや手法は、ＷＯ０１／７９４８３号公報や、特開２００３−２３５５７９号公報、ＷＯ２００２／０４２４８３号パンフレット、ＷＯ２００３／０１６５２５号パンフレット、特開２００６−１３６２２３号公報、藤田らの文献（藤田ら，2004. Appl Environ Microbiol 70:1207-1212および藤田ら, 2002. Appl Environ Microbiol 68:5136-5141.）、村井ら, 1998. Appl Environ Microbiol 64:4857-4861.に開示されている。
【００６６】
本形質転換細胞は、本タンパク質複合体を細胞外に分泌又は細胞表層に提示するものであることも好ましい。本形質転換細胞は、好ましくは、コヘシンタンパク質を細胞表層提示し、本タンパク質を細胞外に分泌して、コヘシンタンパク質に本タンパク質をコヘシン−ドッケリン結合を介して保持させて、タンパク質複合体を細胞表層に提示する。
【００６７】
本タンパク質、本タンパク質複合体及びこれらを細胞外に分泌又は細胞表層に提示する細胞、好ましく酵母などの真核微生物は、向上されたセロビオヒドロラーゼ活性及び増強された相乗効果により、セルロースの分解、糖化、及び糖化と発酵とを同時進行させるＣＢＰ（連結バイオプロセス（糖化発酵同時進行））において、セルロースの分解効率を高めて、セルロースの効率的利用を具現化することができる。
【００６８】
以上説明した本明細書に開示される形質転換細胞は、いずれも、モレキュラークローニング第３版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載されている方法に準じて作製することができる。真核微生物などの宿主細胞の形質転換のためのベクター及びその構築方法は、当業者において周知であって、モレキュラークローニング第３版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に開示されている。また、コヘシンタンパク質やドックリンドメインを有するタンパク質を真核微生物において発現させるためのベクター及びその構築方法も、同様に、当業者において周知である。また、形質転換にあたり、従来公知の各種方法、例えば、トランスフォーメーション法や、トランスフェクション法、接合法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、酢酸リチウム法等を用いることも、同様に当業者において周知である。
【００６９】
なお、本明細書の開示によれば、本セルラーゼ複合体を構成する第１〜第３のキメラタンパク質及び当該キメラタンパク質をコードするＤＮＡも提供される。
【００７０】
（セルロースの分解産物の生産方法）
本明細書に開示されるセルロースの分解産物の生産方法は、本明細書の開示によれば、本タンパク質を含む１種又は２種以上のセルラーゼを用いて、セルロースを分解する工程、を備えることができる。本方法によれば、セロビオヒドロラーゼ活性が向上した本タンパク質を用いることにより、効率的にセルロースを分解できる。分解工程で用いる１種又は２種以上のセルラーゼとしては、本セルラーゼ組成物に含まれうる他のセルラーゼから適宜選択して用いることができる。分解工程においては、セルラーゼは、本セルラーゼ組成物として供給されてもよいし、本タンパク質複合体として提供されていてもよい。分解工程における処理温度や時間等の条件は、用いるセルラーゼの種類及びセルロースの供給形態によって適宜設定することができる。
【００７１】
本明細書において、セルロースとは、バイオマスから他の成分から分離工程を経たセルロースとして供給されてもよいし、リグニン、ヘミセルロース及び／又はペクチンが共存する未処理あるいは部分的な前処理を施したバイオマスなどセルロースを含有する材料として供給されてもよい。こうしたバイオマス資源としては、稲ワラ、麦ワラ、バガス、枯れ草等の廃棄資源のほか、未利用資源であってもよい。また、本明細書において、セルロース分解産物としては、セルロースの低分子化物であればよく、グルコース、そのオリゴマー、セロビオース等が挙げられる。
【００７２】
（有用物質の生産方法）
本明細書の開示によれば、微生物の発酵により有用物質を生産する方法であって、本タンパク質を含む１種又は２種以上のセルラーゼを用いて、セルロースを分解してセルロース分解産物を取得する工程と、微生物によりセルロース分解産物を含む炭素源を発酵して、前記有用物質を生産する工程と、を備える、方法が提供される。本生産方法によれば、本タンパク質を用い、向上したセロビオヒドロラーゼ活性がセルロースの分解に寄与するため、効率的にセルロースを分解することができる。本生産方法では、セルロースの分解工程と、当該分解工程で得られたセルロース分解産物を含む炭素源を微生物により発酵する工程と、をそれぞれ独立して実施することができる。したがって、セルロースの分解工程は、本セルラーゼ組成物や本タンパク質複合体を、酵素製剤として用いてセルロースを分解し、その後、このセルロース分解物を発酵工程に供給して発酵してもよい。
【００７３】
本明細書の開示によれば、発酵のための微生物の細胞外に分泌又は細胞表層に提示される本タンパク質を含む、１種又は２種以上のセルラーゼの存在下、前記微生物を用いて、セルロースを少なくとも含む炭素源を発酵して前記有用物質を生産する工程、を備えることができる。このような生産方法によれば、セロビオヒドロラーゼ活性の向上したタンパク質を細胞外に発現する発酵用微生物を用いることで、いわゆる糖化・発酵同時プロセス（ＣＢＰ）を効率的に行うことができる。１種又は２種以上のセルラーゼは、全て発酵用微生物の細胞表層に提示されていてもよいし、部分的に細胞外から添加されていてもよい。こうしたセルラーゼは、発酵用微生物の表層において本タンパク質複合体を構築していてもよい。
【００７４】
発酵用の微生物は、酵母などのエタノール生産微生物や麹菌等の真核微生物を好ましく用いることができる。微生物は、人工的に取得された微生物であってもよい。例えば、グルコースからの代謝系の１種又は２種以上の酵素を遺伝子組換えにより置換、追加等して得られる本来の代謝物でない化合物を産生可能に遺伝子工学的に改変したものであってもよい。このような微生物を用いることで、例えば、イソプレノド合成経路の追加によるファインケミカル（コエンザイムＱ１０、ビタミン及びその原料等）、解糖系の改変によるグリセリンの生産、プラスチック・化成品原料を生産するなどのバイオリファイナリー技術に適用できる。有用物質としては特に限定しないが、グルコースを利用して微生物が生成可能なものが好ましく、上記したように、バイオリファイナリー技術全般にわたる物質を対象とすることができる。
【実施例】
【００７５】
以下、本発明を、実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、以下に述べる遺伝子組換え操作は既出のMolecular Cloningに従い行った。
【実施例１】
【００７６】
（セルロース結合ドメインを有しないPhanerochaete chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼIIの合成）
ファネロケーテ由来セロビオヒドラーゼII（ＰｃＣＢＨ２）はセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）と触媒ドメインがリンカーでつながった構造を持っている。今回ＣＢＤ機能を喪失させるため、ＰｃＣＢＨ２のＣＢＤ部位を取り除き、「リンカー−触媒ドメイン」からなるペプチドを合成した。
【００７７】
（ＣＢＤを欠失したPhanerochaete chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼIIの試験内合成のためのＤＮＡ断片の調製）
pET23bのNdeI/HindIIIにファネロケーテ由来セロビオヒドラーゼ遺伝子（配列番号１）を挿入したプラスミドpET23b_PcCBH2wtをテンプレートに、２種類のオリゴマー配列（5’-GGATCTGCGGTCACGACCACCTCCGTT -3’（配列番号４）, 5’- CATATGTATATCTCCTTCTTAAAGT-3’（配列番号５））をプライマーとしてインバースＰＣＲを行った。取得したＰＣＲ産物につき、アガロースゲル電気泳動、ゲル染色にて目的バンドを取り出し、ゲル中のＤＮＡをキット（Wizard(R) SV Gel and PCR Clean-up System、Promega）を用いて抽出した。抽出したＤＮＡ断片をポリヌクレオチドキナーゼ（New England BioLabs）で両5’- 末端をリン酸化後、ライゲーションキット(DNA Ligation kit、Takara)を用いてライゲーション反応をさせた。ライゲーション産物を大腸菌DH5α株に導入し、その形質転換体を培養後、プラスミド抽出精製キット（QIAprep Spin Miniprep Kit、Qiagen）で目的のＤＮＡ断片を含むプラスミドを取り出した。ＣＢＤ部位の欠失は、シーケンスにより確認した。
【００７８】
（ＣＢＤを欠失したPhanerochaete chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼII改変体の試験内合成のためのＤＮＡ断片の調製）
次いで、ＣＢＨ２改変体として、Sept25：PcCBH2に１０個のアミノ酸置換(T130I/S134Q/S183T/A241E/M259I/Q307R/A309S/T342H/Q381S/F382L)を行った改変体及びMall4：PcCBH2に１５個のアミノ酸置換(T112S/N125K/T130I/S134Q/S183T/Q204K/F206Y/A241E/M259I/Q307R/A309S/T342H/I365V/Q381S/F382L)を行った改変体につき、それぞれＣＢＤを欠失させたＤＮＡ断片を、ＰｃＣＢＨ２についてのＤＮＡ断片を含むプラスミド構築に準じて調製した。
【００７９】
（セルラーゼの試験管内合成方法）
試験管内合成の鋳型として、作製したプラスミドに対して２本のプライマー（5’- ATCTCGATCCCGCGAAATTAATAC-3’（配列番号６）、 5’- TCCGGATATAGTTCCTCCTTTCAG-3’（配列番号７））で増幅、PCR purification kit (Qiagen)で精製したＰＣＲ産物を使用した。なおこのＰＣＲ産物には、T7プロモーター配列、開始コドン、遺伝子配列、終始コドン、ターミネーター配列が含まれている。
【００８０】
試験管内合成は、表４に示す組成の反応液で、26℃、3時間、in vitroでの転写翻訳共役反応を行なった。無細胞蛋白質合成反応の促進剤として、ＡＴＰの枯渇を補うためにクレアチンキナーゼをＡＴＰ生成酵素（ＡＤＰ＋ホスホクレアチン→ＡＴＰ）として、リファンピシンはＲＮＡ合成開始阻害剤、フォリン酸はＲＮＡ転写阻害剤として添加した。また、タンパク質のフォールディングを助ける因子として、各種シャペロンを高発現した大腸菌Ａ１９株から抽出したＳ３０菌体抽出液（−ＤＴＴ）を用いた。更に、Ｓ−Ｓ結合形成促進因子であるカビ由来プロテインジスルフィドイソメラーゼも添加した。なお合成されたセルラーゼ量を評価するため、蛍光標識されたリジン（FluoroTect GreenLys in vitro Translation Labeling System：プロメガ）を混ぜて合成反応を行った。
【００８１】
【表４】
【実施例２】
【００８２】
（試験管内合成反応におけるセルラーゼ合成量の評価）
ＣＢＤ欠失状態（リンカー−触媒ドメイン）とＣＢＤ保有状態（ＣＢＤ−リンカー−触媒ドメイン）とのそれぞれにつき、野生型ＰｃＣＢＨ２及び２種類のＰｃＣＢＨ２改変体の試験管内合成量及び比活性を評価した。
【００８３】
合成量の評価は、無細胞合成時に蛍光標識されたリジン（FluoroTect GreenLys in vitro Translation Labeling System：プロメガ）を取り込ませた合成産物をSDS-PAGE後、蛍光イメージアナライザー（FLA9000：富士フィルム株式会社）で検出、画像解析ソフトであるMulti Gauge（富士フィルム株式会社）での解析により行った。なお今回使用したＰｃＣＢＨ２野生型および改変体はそれぞれ、ＣＢＤ保有状態とＣＢＤ欠失状態で同数のリジンを持っているため、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの目的バンドの蛍光量でその合成量が比較評価できる。結果を図１に示す。図１には、セルラーゼの試験管内合成量を、野生型及び改変体につき、ＣＢＤ保有状態（黒）及びＣＢＤ欠失状態（灰色）として、ＣＢＤ保有状態の合成量に対する相対量として示す。
【００８４】
図１に示すように、野生型ＰｃＣＢＨ２ではＣＢＤ欠失状態の方がＣＢＤ有状態よりも合成量が約１．３倍向上していた（図１）。また評価した２つのＰｃＣＢＨ２変異体では共に、ＣＢＤ欠失状態の方がＣＢＤ保有状態よりも合成量が約１．７倍向上していた。
【実施例３】
【００８５】
（セルラーゼ（セロビオヒドロラーゼ）比活性の評価）
試験管内合成されたセルラーゼは、野生型及び各ＰｃＣＢＨ２改変体でＣＢＤ保有状態及びＣＢＤ欠失状態で同じセルラーゼ量となるように試験管内合成試薬で希釈し、その活性を評価した。具体的には、５０ｍＭ酢酸緩衝液ｐＨ５．０で１００倍希釈後、１％リン酸膨潤セルロース（ＰＳＣ）又は２．５％Ａｖｉｃｅｌを同量添加し（０．５％ＰＳＣ又は１．２５％Ａｖｉｃｅｌ）、４０℃で１６時間反応させた。反応液を、ＴＺアッセイ法（Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 11 (1985) 109-115）にて遠心上精の還元糖量を測定し、セルラーゼ比活性とした。図２及び図３には、セルラーゼの比活性を、野生型及び改変体につき、ＣＢＤ保有状態（黒）及びＣＢＤ欠失状態（灰色）として、ＣＢＤ保有状態の活性に対する相対比活性として示す。
【００８６】
（１）比活性の比較（ＰＳＣが基質の場合）
野生型ＰｃＣＢＨ２、改変体Ｓｅｐｔ２５およびＭａｌｌ４を用いて、ＰＳＣを基質とした条件でのＣＢＤ有欠失状態の比活性を評価した。結果は、図２に示すように、評価した野生型及び各改変体でＣＢＤ欠失状態はＣＢＤ保有状態よりも比活性が向上していた。すなわち、野生型及びＳｅｐｔ２５では２倍以上、Ｍａｌｌ４では、４倍以上であった。
【００８７】
（２）比活性の比較（Ａｖｉｃｅｌが基質の場合）
野生型ＰｃＣＢＨ２、改変体Ｓｅｐｔ２５およびＭａｌｌ４を用いて、Ａｖｉｃｅｌを基質とした条件でのＣＢＤ欠失／保有状態の比活性を評価した。結果は、図３に示すように、評価した野生型及び各改変体でＣＢＤ欠失状態はＣＢＤ保有状態よりも比活性が向上していた。すなわち、野生型では１．４倍、Ｓｅｐｔ２５では１．２倍、Ｍａｌｌ４では、１．７倍であった。
【実施例４】
【００８８】
（トリコデルマ由来のエンドグルカナーゼ２のＣＢＤ欠失／保有状態での比活性比較）
本実施例では、トリコデルマ由来のエンドグルカナーゼ２（ＴｒＥＧ２、ＧＨＦ５）を用いて、そのＣＢＤ欠失変異体を合成し、実施例３に準じて、ＣＢＤ欠失／保有状態での比活性測定を行った。ＣＢＤ欠失変異体のＤＮＡ断片を含むプラスミド作製は、上記エンドグルカナーゼIIの遺伝子（GenBankアクセッション番号P07982（配列番号１２）に対して、プライマー配列（5’- GGGGTCCGATTTGCCGGCGTTAACAT-3’（配列番号８））及び5’- CATATGTATATCTCCTTCTTAAAGT-3’ （配列番号９））を用いる以外は、実施例１に準じてプラスミドを構築し、各ペプチドを試験管内合成した。
【００８９】
実施例３と同様に、ＰＳＣ（０．５％）及びＡｖｉｃｅｌ（１．２５％）を基質としてＣＢＤ欠失／保有状態での比活性を評価した。さらに、基質としてカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ、０．２％）を使用して同様にして比活性を評価した。結果を図４に示す。図４には、セルラーゼの比活性を、ＣＢＤ保有状態（黒）及びＣＢＤ欠失状態（灰色）として、ＣＢＤ保有状態の活性に対する相対比活性として示す。
【００９０】
図４に示すように、トリコデルマ由来のエンドグルカナーゼＩＩについては、ＰＳＣが基質の場合には、ＣＢＤ欠失状態の方がＣＢＤ保有状態よりも比活性が高いことが示された。また、Ａｖｉｃｅｌが基質の場合には、ＣＢＤ欠失状態の方がＣＢＤ保有状態よりも比活性が低いことが示された。さらに、ＣＭＣが基質の場合には、ＣＢＤ保有状態とＣＢＤ欠失状態はほぼ同じ比活性を示した。以上のことから、ＧＨＦ４５とは異なるＧＨＦ２のエンドグルカナーゼでのＣＢＤ削除の効果は、基質によって様々で、一概にＣＢＤ削除による比活性の向上を示すことはできなかった。
【実施例５】
【００９１】
（ファネロケーテ由来のセロビオヒドラーゼ７ＣのＣＢＤ欠失／保有状態での比活性比較）
ＰｃＣＢＨ２とは異なるファネロケーテ由来のセロビオヒドラーゼ７Ｃ（ＰｃＣＢＨ７Ｃ、ＧＨＦ７）を用いて、そのＣＢＤ欠失変異体を合成し、実施例４と同様にしてＣＢＤ欠失／保有状態での比活性測定を行った。ＰｃＣＢＨ７ＣのＣＢＤ欠失変異体のＤＮＡ断片を含むプラスミドの作製は、ＰｃＣＢＨ７Ｃ遺伝子（GenBankアクセッション番号M22220H（配列番号１３））に対して、プライマー配列（5’- TTAGCCGGTGTACGTGGTGTTGAGGT-3’ （配列番号１０）及び5’-AAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCA -3’ （配列番号１１））を用いる以外は、実施例１に準じて行い、各ペプチドを試験管内合成した。実施例３と同様に、ＰＳＣ（０．５％）を基質としてＣＢＤ欠失／保有状態での比活性を評価した。結果を図５に示す。図５には、セルラーゼの比活性を、ＣＢＤ保有状態（黒）及びＣＢＤ欠失状態（灰色）として、ＣＢＤ保有状態の活性に対する相対比活性として示す。
【００９２】
図５に示すように、実施例３におけるＰｃＣＢＨ２の結果とは異なり、ＣＢＤ保有状態の方がＣＢＤ欠失状態よりも比活性が高かった（図５）。以上の結果から、ＰｃＣＢＨ２と同じファネロケーテ由来のセロビオヒドラーゼでも、ＣＢＤの欠失が比活性を向上させるわけではないことがわかる。
【実施例６】
【００９３】
（耐熱化変異体）
（１）耐熱性候補変異の選定
P. chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼII（PcCBH2）は、触媒ドメインとセルロース結合ドメイン（CBD）がリンカーでつながった構造を持つ。以下に、触媒ドメイン内のアミノ酸置換による耐熱化変異体の取得について説明する。
【００９４】
（２）耐熱性候補変異を含む変異体の構築
耐熱化への初期配列としてPcCBH2変異体5−6（配列番号１４、配列番号１５）を用いた。変異体5−6は、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、そのCBDのみに、アミノ酸置換（S22P置換（塩基配列上の変異：T64C））及び同義置換（塩基配列上の変異：G9A）をそれぞれ各一つ備えており、試験管内合成において野生型PcCBH2よりもタンパク質合成量が高い変異体であることがわかっている。耐熱化変異体の取得にあたり、変異体5−6に対して、以下の表５に示す変異（アミノ酸置換）を有する変異体作成した。すなわち、これらの変異体に相当するアミノ酸配列をそれぞれコードするオリゴマーＤＮＡ及びその直近の相補鎖オリゴマーＤＮＡをプライマーとして用いてインバースＰＣＲ法でプラスミド鎖を増幅し、５’−末端をリン酸化後、ライゲーションによるプラスミドの環状化、大腸菌への形質転換を経て取得した。各変異体の変異導入は、シーケンスを行い確認した。
【００９５】
【表５】
【００９６】
４３種の変異体を試験管内で合成した。試験管内合成の鋳型として、（１）で取得したＤＮＡに対してプライマー（5’- ATCTCGATCCCGCGAAATTAATAC-3’（配列番号１６）、 5’- TCCGGATATAGTTCCTCCTTTCAG-3’（配列番号１７））を用いて増幅させたPCR産物を、PCR purification kit (Qiagen)で精製したものを用いた。なお、このPCR産物には、T7プロモーター配列、開始コドン、遺伝子配列、終始コドン、ターミネーター配列が含まれている。
【００９７】
変異体の試験管内合成は、表６に示す組成の反応液で、２６℃、３時間、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写翻訳共役反応として行った。無細胞蛋白質合成反応の促進剤として、ＡＴＰの枯渇を補うためにクレアチンキナーゼをＡＴＰ生成酵素（ＡＤＰ＋ホスホクレアチン→ＡＴＰ）として、リファンピシンはＲＮＡ合成開始阻害剤、フォリン酸はＲＮＡ転写阻害剤として添加した。また、タンパク質のフォールディングを助ける因子として、各種シャペロンを高発現した大腸菌Ａ１９株から抽出したＳ３０菌体抽出液（−ＤＴＴ）を用いた。更に、Ｓ−Ｓ結合形成促進因子である、カビ由来プロテインジスルフィドイソメラーゼも添加した。
【００９８】
【表６】
【００９９】
（３）変異体の耐熱試験方法
合成した変異体を、５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で１００倍に希釈、４９，５０，５１，５２，５３及び５４℃の各温度で２時間保温する熱処理後、その残存活性をリン酸膨潤セルロース（ＰＳＣ）分解（反応条件：４０℃、１６時間）後の遠心上清の還元糖量をＴＺアッセイ法（Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 11 (1985) 109-115）を用いて評価した。残存活性は熱処理前の活性との比で表した。またセルラーゼの耐熱温度は上記残存活性が５０％となるときの温度と定義した。
【０１００】
（４）有利変異の選定
以上の耐熱性評価の結果、１３個の耐熱性が向上した変異体が得られた。その耐熱性を向上させた変異を有利変異と呼ぶこととした。今回に実験で得られた有利変異を表７及び図６に示す。図６に示すように、これらの有利変異は、いずれも、５２℃環境下で２時間保温後において、氷冷保持条件と比較して１．３〜７倍残存活性を向上させるものであった。
【表７】
【０１０１】
（５）第１世代変異体の選択
有利変異を一つずつ親配列に加算したＤＮＡを合成し、当該ＤＮＡを鋳型として、各変異体を実施例６の（２）と同様にして試験管内合成して、（３）に記載の方法に準じて耐熱性評価を行ったところ、最も耐熱性が高かった有利変異Ｍ−１８による変異体第１世代とした。
【０１０２】
（６）第２世代の選択
実施例２で得た変異体Ｔ３４２Ｈ（Ｍ１−１８）に有利変異Ｑ３８１Ｓ／Ｆ３８２Ｌ（Ｍ１−２０）を導入した変異体（Ｗ１８２０）を実施例１と同様にして合成し、（３）に記載の方法に準じて耐熱性を評価した。結果を図７に示す。図７に示すように、有利変異を蓄積したＷ１８＋２０の耐熱性はＭ１−１８及びＭ１−２０と比較して向上していた。この変異体を第２世代として選択した。
【０１０３】
（７）第３世代の選択
実施例３で得られた変異体Ｗ１８＋２０に有利変異（Ｍ１−１，−２，−４，−１２）をそれぞれ導入し、その変異体を上記（２）と同様にして合成し、上記（３）と同様にして耐熱性を評価した。結果を図８に示す。図８に示すように、有利変異Ｔ１３０Ｉ／Ｓ１３４Ｑ（Ｍ１−４）を導入した変異体（Ｔｒｉ４）の耐熱性が最も向上していた。この変異体を第３世代として選択した。
【０１０４】
（８）第４世代の選択
実施例４で得られた有利変異が３個導入された変異体Ｔｒｉ４に４つの有利変異（Ｍ１−１，−１１，−１２，−１４，−１５）をそれぞれ導入した変異体を、上記（２）と同様にして合成し、上記（３）と同様にして耐熱性を評価した。結果を図９に示す。図９に示すように、有利変異Ｍ２５９Ｉ（Ｍ１−１５）を導入した変異体（Ｑｕａｒｄ１５）の耐熱性が最も向上していた。この変異体を第４世代として選択した。
【０１０５】
（９）第５世代の選択
実施例５で得られた有利変異が４個導入された変異体Ｑｕａｒｄ１５に４つの有利変異（Ｍ１−１，−１１，−１２，−２７）をそれぞれ導入し、その変異体を、上記（２）と同様にして合成し、上記（３）と同様にして耐熱性を評価した。結果を図１０に示す。図１０に示すように、耐熱評価した。その結果、有利変異Ａ２４１Ｅ（Ｍ１−１２）を導入した変異体（Ｑｕｉｎｔ１２）の耐熱性が最も向上していた。この変異体を第５世代として選択した。
【０１０６】
（１０）第６世代の選択
実施例６で得られた有利変異が５個導入された変異体Ｑｕｉｎｔ１２に耐熱性への寄与度が高かった有利変異Ｑ３０７Ｒ／Ａ３０９Ｓ（Ｍ１−３７）とその他の３つの有利変異（Ｍ１−１，−２１，−２５）をそれぞれ導入した変異体を、上記（２）と同様にして合成し、上記（３）と同様にして耐熱性を評価した。結果を図１１に示す。図１１に示すように、Ｑｕｉｎｔ１２にＱ３０７Ｒ／Ａ３０９Ｓ及び有利変異Ｓ１８３Ｔ（Ｍ１−２５）を導入した変異体（Ｓｅｐｔ２５）の耐熱性が最も向上していた。この変異体を第６世代として選択した。
【０１０７】
（１１）スクリーニングによる耐熱化変異体の取得
加算していない有利変異（Ｍ１−１，−２，−１１，−２１，−２７）を変異体Ｓｅｐｔ２５にばらつきを持って導入後、スクリーニングにより最も高い耐熱性を有する変異体の取得を試みた。具体的には、QuickChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)を用いて変異を導入し、その変異体９２個をクローニングした。上記（２）と同様にして試験管内合成した変異体を５６℃にて２時間の熱処理後、熱処理前に対する残存活性を指標にスクリーニングを行った。結果を図１２に示す。図１２に示すように、熱処理に対する残存活性がSept25と比較して約5倍向上した変異体が得られた。
【０１０８】
（１２）スクリーニングで得られた変異体の耐熱性評価
上記スクリーニングで、残存活性が高かった上位３個の変異体について、上記（３）と同様に耐熱性を評価した。結果を図１３に示す。図１３に示すように、評価した３変異体は共にＳｅｐｔ２５と比較して耐熱温度が１℃向上していた。
【０１０９】
（１３）スクリーニングで得られた耐熱化変異体のアミノ酸配列の決定
上記で得られた耐熱化変異体のアミノ酸配列を塩基配列解析行うことで解析した。その結果、残りの有利変異（Ｍ１−１，−２，−１１，−２１，−２７）がすべて入っていることが分かった。この得られたクローンを耐熱化実験での最終変異体（Ｍａｌｌ４と呼ぶ）こととした。
【０１１０】
各世代の変異体における変異の組み合わせを以下の表に示す。
【表８】
【実施例７】
【０１１１】
（１４）各世代の耐熱化変異体を耐熱性評価
これまでに得られた各世代の耐熱変異体につき、上記（３）と同様に耐熱性を評価した。結果を図１４に示す。図１４に示すように、その結果、有利変異を加えるに従い耐熱温度が向上していることが確認できた。初期変異体５−６の耐熱温度が４９．９℃であるのに対し、耐熱化変異体Ｓｅｐｔ２５は４．４℃向上した５４．３℃、さらに最終変異体Ｍａｌｌ４では５．４℃向上した５４．３℃であった。
【実施例８】
【０１１２】
（CBD欠失PcCBH2変異体の耐熱性評価）
さらに、耐熱化変異体Mall4のCBD部位を削除した変異体を作製した。当該変異体は、実施例１に準じて試験管内合成した。Mall４及びそのＣＢＤ欠失変異体の耐熱性を評価した。また、変異体５−６の評価も併せて行った。結果を図１５に示す。図１５に示すように、耐熱化変異体Mall4からCBDを欠失させた変異体は、Mall4CBD保有体と同様、変異体５−６よりも、高い耐熱性を有していた。
【実施例９】
【０１１３】
（CBD欠失変異体のセルロースへの結合力の評価）
配列番号２で表されるアミノ酸配列の野生型PcCBH2（CBD保有）、上記の耐熱性変異体Mall4及びそれぞれのCBD欠失変異体を用いて、各セルラーゼのセルロースへの結合力をアビセルからの遊離率で評価した。具体的には、酵母で分泌発現そしてアビセルカラムで精製したそれぞれのセルラーゼ１００ngを、50mM酢酸緩衝液pH5.0でけん濁したアビセル１００ul（終濃度2％(w/v)）に添加、攪拌後、氷上で2時間静置させた。なお、コントロール実験として、アビセル無条件でも行った。それぞれの遠心上清のセルラーゼ活性を測定し、セルラーゼのアビセルからの遊離率を算出した。結果を図１６に示す。
【０１１４】
図１６に示すように、CBD保有セルラーゼの遊離率は約０．１であったのに対しCBD失活変異体では０．３〜０．５の値を示した。以上の結果より、CBD欠失セルラーゼは、保有セルラーゼと比較して、アビセルに対する結合性が低下していた。
【配列表フリーテキスト】
【０１１５】
配列番号４〜１３，１６、１７：プライマー
配列番号１４，１５：Phanerochaete chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼの変異体
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのアミノ酸配列において、セルロース結合ドメインが不活性化されており、セロビオヒドロラーゼ活性を有するタンパク質。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸の置換、欠失及び/又は付加を有するアミノ酸配列
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ又はその一部とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列
（ｅ）配列番号１で表される塩基配列と７５％以上の同一性を有する塩基配列によってコードされるアミノ酸配列
【請求項２】
前記（ｂ）のアミノ酸配列は、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、アミノ酸置換(T130I/S134Q/S183T/A241E/M259I/Q307R/A309S/T342H/Q381S/F382L)を有するアミノ酸配列である、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
前記（ｂ）のアミノ酸配列は、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、アミノ酸置換(T112S/N125K/T130I/S134Q/S183T/Q204K/F206Y/A241E/M259I/Q307R/A309S/T342H/I365V/Q381S/F382L)を有するアミノ酸配列である、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項５】
請求項４に記載のＤＮＡを含む、発現用ＤＮＡコンストラクト。
【請求項６】
請求項５に記載の発現用ＤＮＡコンストラクトにより形質転換された細胞。
【請求項７】
真核微生物である、請求項６に記載の細胞。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質を細胞外に分泌又は細胞表層に提示する、請求項７に記載の細胞。
【請求項９】
前記真核微生物は、非セルラーゼ生産微生物である、請求項７又は８に記載の細胞。
【請求項１０】
前記真核微生物は、セルラーゼ生産微生物である、請求項７又は８に記載の細胞。
【請求項１１】
セルロースの分解産物の生産方法であって、
請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質を含む１種又は２種以上のセルラーゼを用いて、セルロースを分解する工程、を備える、セルロースの分解産物の生産方法。
【請求項１２】
微生物の発酵により有用物質を生産する方法であって、
請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質を含む１種又は２種以上のセルラーゼを用いて、セルロースを分解してセルロース分解産物を取得する工程と、
微生物により前記セルロース分解産物を含む炭素源を発酵して、前記有用物質を生産する工程と、
を備える、方法。
【請求項１３】
微生物の発酵により有用物質を生産する方法であって、
前記微生物の細胞外に分泌又は細胞表層に提示される請求項１に記載のタンパク質を含む１種又は２種以上のセルラーゼの存在下、前記微生物を用いて、セルロースを少なくとも含む炭素源を発酵して前記有用物質を生産する工程、を備える、方法。
【請求項１４】
請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質を含むセルラーゼ組成物。
【請求項１５】
請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質を含む、タンパク質複合体。
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのアミノ酸配列において、セルロース結合ドメインが不活性化されており、セロビオヒドロラーゼ活性を有するタンパク質。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸の置換、欠失及び/又は付加を有するアミノ酸配列
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ又はその一部とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列
（ｅ）配列番号１で表される塩基配列と７５％以上の同一性を有する塩基配列によってコードされるアミノ酸配列
【請求項２】
前記（ｂ）のアミノ酸配列は、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、アミノ酸置換(T130I/S134Q/S183T/A241E/M259I/Q307R/A309S/T342H/Q381S/F382L)を有するアミノ酸配列である、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
前記（ｂ）のアミノ酸配列は、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、アミノ酸置換(T112S/N125K/T130I/S134Q/S183T/Q204K/F206Y/A241E/M259I/Q307R/A309S/T342H/I365V/Q381S/F382L)を有するアミノ酸配列である、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項５】
請求項４に記載のＤＮＡを含む、発現用ＤＮＡコンストラクト。
【請求項６】
請求項５に記載の発現用ＤＮＡコンストラクトにより形質転換された細胞。
【請求項７】
真核微生物である、請求項６に記載の細胞。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質を細胞外に分泌又は細胞表層に提示する、請求項７に記載の細胞。
【請求項９】
前記真核微生物は、非セルラーゼ生産微生物である、請求項７又は８に記載の細胞。
【請求項１０】
前記真核微生物は、セルラーゼ生産微生物である、請求項７又は８に記載の細胞。
【請求項１１】
セルロースの分解産物の生産方法であって、
請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質を含む１種又は２種以上のセルラーゼを用いて、セルロースを分解する工程、を備える、セルロースの分解産物の生産方法。
【請求項１２】
微生物の発酵により有用物質を生産する方法であって、
請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質を含む１種又は２種以上のセルラーゼを用いて、セルロースを分解してセルロース分解産物を取得する工程と、
微生物により前記セルロース分解産物を含む炭素源を発酵して、前記有用物質を生産する工程と、
を備える、方法。
【請求項１３】
微生物の発酵により有用物質を生産する方法であって、
前記微生物の細胞外に分泌又は細胞表層に提示される請求項１に記載のタンパク質を含む１種又は２種以上のセルラーゼの存在下、前記微生物を用いて、セルロースを少なくとも含む炭素源を発酵して前記有用物質を生産する工程、を備える、方法。
【請求項１４】
請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質を含むセルラーゼ組成物。
【請求項１５】
請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質を含む、タンパク質複合体。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【公開番号】特開２０１２−３９９６６（Ｐ２０１２−３９９６６Ａ）
【公開日】平成２４年３月１日（２０１２．３．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１８５６１４（Ｐ２０１０−１８５６１４）
【出願日】平成２２年８月２０日（２０１０．８．２０）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２１年度および２２年度独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構「新エネルギー技術研究開発／バイオマスエネルギー等高効率転換技術開発（先導技術開発）／セルロースエタノール高効率製造のための環境調和型統合プロセス開発」の委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（０００００３６０９）株式会社豊田中央研究所 (4,200)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年３月１日（２０１２．３．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年８月２０日（２０１０．８．２０）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２１年度および２２年度独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構「新エネルギー技術研究開発／バイオマスエネルギー等高効率転換技術開発（先導技術開発）／セルロースエタノール高効率製造のための環境調和型統合プロセス開発」の委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（０００００３６０９）株式会社豊田中央研究所 (4,200)
【Ｆターム（参考）】
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