セロビオース２−エピメラーゼおよびその用途

【課題】工業的な製造が可能である、新たなセロビオース２−エピメラーゼを提供する。
【解決手段】本発明のセロビオース２−エピメラーゼは、下記の（Ａ）〜（Ｆ）の特性を有し、かつ好気性微生物由来であることを特徴とする。
（Ａ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法により測定された分子量が３７，８００〜４８，４００の範囲
（Ｂ）分子量の理論値が４２，５００〜５０，１００の範囲
（Ｃ）至適ｐＨが６〜９の範囲
（Ｄ）ｐＨ安定性がｐＨ２〜１２の範囲
（Ｅ）至適温度が３０〜９０℃の範囲
（Ｆ）熱安定性の上限が３０〜８０℃の範囲

【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（Ａ）〜（Ｆ）の特性を有し、かつ好気性微生物由来であることを特徴とするセロビオース２−エピメラーゼ。
（Ａ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法により測定された分子量が３７，８００〜４８，４００の範囲
（Ｂ）分子量の理論値が４２，５００〜５０，１００の範囲
（Ｃ）至適ｐＨが６〜９の範囲
（Ｄ）ｐＨ安定性がｐＨ２〜１２の範囲
（Ｅ）至適温度が３０〜９０℃の範囲
（Ｆ）熱安定性の上限が３０〜８０℃の範囲
【請求項２】
下記の（Ｐ１）から（Ｐ９）のいずれかのアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項１記載のセロビオース２−エピメラーゼ。
（Ｐ１）：下記の（Ｐ１ａ）、（Ｐ１ｂ）または（Ｐ１ｃ）のアミノ酸配列
（Ｐ１ａ）：配列番号２のアミノ酸配列
（Ｐ１ｂ）：配列番号２のアミノ酸配列において、１個から数個のアミノ酸残基が、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列であって、セロビオース２−エピメラーゼ活性を有するアミノ酸配列
（Ｐ１ｃ）：配列番号２のアミノ酸配列との相同性が７０％以上であるアミノ酸配列であって、セロビオース２−エピメラーゼ活性を有するアミノ酸配列
（Ｐ２）：下記の（Ｐ２ａ）、（Ｐ２ｂ）または（Ｐ２ｃ）のアミノ酸配列
（Ｐ２ａ）：配列番号４のアミノ酸配列
（Ｐ２ｂ）：配列番号４のアミノ酸配列において、１個から数個のアミノ酸残基が、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列であって、セロビオース２−エピメラーゼ活性を有するアミノ酸配列
（Ｐ２ｃ）：配列番号４のアミノ酸配列との相同性が７０％以上であるアミノ酸配列であって、セロビオース２−エピメラーゼ活性を有するアミノ酸配列
（Ｐ３）：下記の（Ｐ３ａ）、（Ｐ３ｂ）または（Ｐ３ｃ）のアミノ酸配列
（Ｐ３ａ）：配列番号６のアミノ酸配列
（Ｐ３ｂ）：配列番号６のアミノ酸配列において、１個から数個のアミノ酸残基が、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列であって、セロビオース２−エピメラーゼ活性を有するアミノ酸配列
（Ｐ３ｃ）：配列番号６のアミノ酸配列との相同性が７０％以上であるアミノ酸配列であって、セロビオース２−エピメラーゼ活性を有するアミノ酸配列
（Ｐ４）：下記の（Ｐ４ａ）、（Ｐ４ｂ）または（Ｐ４ｃ）のアミノ酸配列
（Ｐ４ａ）：配列番号８のアミノ酸配列
（Ｐ４ｂ）：配列番号８のアミノ酸配列において、１個から数個のアミノ酸残基が、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列であって、セロビオース２−エピメラーゼ活性を有するアミノ酸配列
（Ｐ４ｃ）：配列番号８のアミノ酸配列との相同性が７０％以上であるアミノ酸配列であって、セロビオース２−エピメラーゼ活性を有するアミノ酸配列
（Ｐ５）：下記の（Ｐ５ａ）、（Ｐ５ｂ）または（Ｐ５ｃ）のアミノ酸配列
（Ｐ５ａ）：配列番号１０のアミノ酸配列
（Ｐ５ｂ）：配列番号１０のアミノ酸配列において、１個から数個のアミノ酸残基が、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列であって、セロビオース２−エピメラーゼ活性を有するアミノ酸配列
（Ｐ５ｃ）：配列番号１０のアミノ酸配列との相同性が７０％以上であるアミノ酸配列であって、セロビオース２−エピメラーゼ活性を有するアミノ酸配列
（Ｐ６）：下記の（Ｐ６ａ）、（Ｐ６ｂ）または（Ｐ６ｃ）のアミノ酸配列
（Ｐ６ａ）：配列番号１２のアミノ酸配列
（Ｐ６ｂ）：配列番号１２のアミノ酸配列において、１個から数個のアミノ酸残基が、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列であって、セロビオース２−エピメラーゼ活性を有するアミノ酸配列
（Ｐ６ｃ）：配列番号１２のアミノ酸配列との相同性が７０％以上であるアミノ酸配列であって、セロビオース２−エピメラーゼ活性を有するアミノ酸配列
（Ｐ７）：下記の（Ｐ７ａ）、（Ｐ７ｂ）または（Ｐ７ｃ）のアミノ酸配列
（Ｐ７ａ）：配列番号１４のアミノ酸配列
（Ｐ７ｂ）：配列番号１４のアミノ酸配列において、１個から数個のアミノ酸残基が、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列であって、セロビオース２−エピメラーゼ活性を有するアミノ酸配列
（Ｐ７ｃ）：配列番号１４のアミノ酸配列との相同性が７０％以上であるアミノ酸配列であって、セロビオース２−エピメラーゼ活性を有するアミノ酸配列
（Ｐ８）：下記の（Ｐ８ａ）、（Ｐ８ｂ）または（Ｐ８ｃ）のアミノ酸配列
（Ｐ８ａ）：配列番号１６のアミノ酸配列
（Ｐ８ｂ）：配列番号１６のアミノ酸配列において、１個から数個のアミノ酸残基が、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列であって、セロビオース２−エピメラーゼ活性を有するアミノ酸配列
（Ｐ８ｃ）：配列番号１６のアミノ酸配列との相同性が７０％以上であるアミノ酸配列であって、セロビオース２−エピメラーゼ活性を有するアミノ酸配列
（Ｐ９）：下記の（Ｐ９ａ）、（Ｐ９ｂ）または（Ｐ９ｃ）のアミノ酸配列
（Ｐ９ａ）：配列番号１８のアミノ酸配列
（Ｐ９ｂ）：配列番号１８のアミノ酸配列において、１個から数個のアミノ酸残基が、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列であって、セロビオース２−エピメラーゼ活性を有するアミノ酸配列
（Ｐ９ｃ）：配列番号１８のアミノ酸配列との相同性が７０％以上であるアミノ酸配列であって、セロビオース２−エピメラーゼ活性を有するアミノ酸配列
【請求項３】
前記好気性微生物が、ロドサーマスマリナス（Rhodothermus marinus）、サッカロファガスデグラダンス（Saccharophagus degradans）、スピロソマリングアレ（Spirosoma linguale）、ヘルペトシフォンアウランチアクス（Herpetosiphon aurantiacus）、テレディニバクターツルネラエ（Teredinibacter turnerae）、ディアドバクターファーメンタンス（Dyadobacter fermentans）、キチノファーガピネンシス（Chitinophaga pinensis）、ペドバクターヘパリナス（Pedobacter heparinus）およびフラボバクテリウムジョンソニエ（Flavobacterium johnsoniae）からなる群から選択される少なくとも一種であることを特徴とする請求項１または２記載のセロビオース２−エピメラーゼ。
【請求項４】
前記セロビオース２−エピメラーゼが、固定化担体に固定化された固定化酵素であることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載のセロビオース２−エピメラーゼ。
【請求項５】
下記の（Ｇ１）から（Ｇ９）の塩基配列のいずれかの塩基配列からなることを特徴とするセロビオース２−エピメラーゼ遺伝子。
（Ｇ１）：下記の（Ｇ１ａ）、（Ｇ１ｂ）、（Ｇ１ｃ）または（Ｇ１ｄ）の塩基配列
（Ｇ１ａ）：配列番号１の塩基配列
（Ｇ１ｂ）：配列番号１の塩基配列において、１個から数個の塩基が、欠失、置換、付加および／または挿入された塩基配列であって、セロビオース２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ１ｃ）：配列番号１の塩基配列との相同性が７０％以上である塩基配列であって、セロビオース２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ１ｄ）：配列番号１の塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、セロビオース２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ２）：下記の（Ｇ２ａ）、（Ｇ２ｂ）、（Ｇ２ｃ）または（Ｇ２ｄ）の塩基配列
（Ｇ２ａ）：配列番号３の塩基配列
（Ｇ２ｂ）：配列番号３の塩基配列において、１個から数個の塩基が、欠失、置換、付加および／または挿入された塩基配列であって、セロビオース２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ２ｃ）：配列番号３の塩基配列との相同性が７０％以上である塩基配列であって、セロビオース２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ２ｄ）：配列番号３の塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、セロビオース２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ３）：下記の（Ｇ３ａ）、（Ｇ３ｂ）、（Ｇ３ｃ）または（Ｇ３ｄ）の塩基配列
（Ｇ３ａ）：配列番号５の塩基配列
（Ｇ３ｂ）：配列番号５の塩基配列において、１個から数個の塩基が、欠失、置換、付加および／または挿入された塩基配列であって、セロビオース２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ３ｃ）：配列番号５の塩基配列との相同性が７０％以上である塩基配列であって、セロビオース２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ３ｄ）：配列番号５の塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、セロビオース２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ４）：下記の（Ｇ４ａ）、（Ｇ４ｂ）、（Ｇ４ｃ）または（Ｇ４ｄ）の塩基配列
（Ｇ４ａ）：配列番号７の塩基配列
（Ｇ４ｂ）：配列番号７の塩基配列において、１個から数個の塩基が、欠失、置換、付加および／または挿入された塩基配列であって、セロビオース２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ４ｃ）：配列番号７の塩基配列との相同性が７０％以上である塩基配列であって、セロビオース２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ４ｄ）：配列番号７の塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、セロビオース２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ５）：下記の（Ｇ５ａ）、（Ｇ５ｂ）、（Ｇ５ｃ）または（Ｇ５ｄ）の塩基配列
（Ｇ５ａ）：配列番号９の塩基配列
（Ｇ５ｂ）：配列番号９の塩基配列において、１個から数個の塩基が、欠失、置換、付加および／または挿入された塩基配列であって、セロビオース２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ５ｃ）：配列番号９の塩基配列との相同性が７０％以上である塩基配列であって、セロビオース２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ５ｄ）：配列番号９の塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、セロビオース２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ６）：下記の（Ｇ６ａ）、（Ｇ６ｂ）、（Ｇ６ｃ）または（Ｇ６ｄ）の塩基配列
（Ｇ６ａ）：配列番号１１の塩基配列
（Ｇ６ｂ）：配列番号１１の塩基配列において、１個から数個の塩基が、欠失、置換、付加および／または挿入された塩基配列であって、セロビオース２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ６ｃ）：配列番号１１の塩基配列との相同性が７０％以上である塩基配列であって、セロビオース２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ６ｄ）：配列番号１１の塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、セロビオース２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ７）：下記の（Ｇ７ａ）、（Ｇ７ｂ）、（Ｇ７ｃ）または（Ｇ７ｄ）の塩基配列
（Ｇ７ａ）：配列番号１３の塩基配列
（Ｇ７ｂ）：配列番号１３の塩基配列において、１個から数個の塩基が、欠失、置換、付加および／または挿入された塩基配列であって、セロビオース２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ７ｃ）：配列番号１３の塩基配列との相同性が７０％以上である塩基配列であって、セロビオース２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ７ｄ）：配列番号１３の塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、セロビオース２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ８）：下記の（Ｇ８ａ）、（Ｇ８ｂ）、（Ｇ８ｃ）または（Ｇ８ｄ）の塩基配列
（Ｇ８ａ）：配列番号１５の塩基配列
（Ｇ８ｂ）：配列番号１５の塩基配列において、１個から数個の塩基が、欠失、置換、付加および／または挿入された塩基配列であって、セロビオース２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ８ｃ）：配列番号１５の塩基配列との相同性が７０％以上である塩基配列であって、セロビオース２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ８ｄ）：配列番号１５の塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、セロビオース２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ９）：下記の（Ｇ９ａ）、（Ｇ９ｂ）、（Ｇ９ｃ）または（Ｇ９ｄ）の塩基配列
（Ｇ９ａ）：配列番号１７の塩基配列
（Ｇ９ｂ）：配列番号１７の塩基配列において、１個から数個の塩基が、欠失、置換、付加および／または挿入された塩基配列であって、セロビオース２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ９ｃ）：配列番号１７の塩基配列との相同性が７０％以上である塩基配列であって、セロビオース２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ９ｄ）：配列番号１７の塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、セロビオース２−エピメラーゼをコードする塩基配列
【請求項６】
セロビオース２−エピメラーゼの製造方法であって、ロドサーマスマリナス（Rhodothermus marinus）、サッカロファガスデグラダンス（Saccharophagus degradans）、スピロソマリングアレ（Spirosoma linguale）、ヘルペトシフォンアウランチアクス（Herpetosiphon aurantiacus）、テレディニバクターツルネラエ（Teredinibacter turnerae）、ディアドバクターファーメンタンス（Dyadobacter fermentans）、キチノファーガピネンシス（Chitinophaga pinensis）、ペドバクターヘパリナス（Pedobacter heparinus）およびフラボバクテリウムジョンソニエ（Flavobacterium johnsoniae）からなる群から選択される少なくとも一種の好気性微生物を培養する工程と、
前記好気性微生物の培養物から無細胞抽出物を得る工程と
を含むことを特徴とする製造方法。
【請求項７】
請求項６のセロビオース２−エピメラーゼの製造方法に使用する好気性微生物であって、ロドサーマスマリナス（Rhodothermus marinus）、サッカロファガスデグラダンス（Saccharophagus degradans）、スピロソマリングアレ（Spirosoma linguale）、ヘルペトシフォンアウランチアクス（Herpetosiphon aurantiacus）、テレディニバクターツルネラエ（Teredinibacter turnerae）、ディアドバクターファーメンタンス（Dyadobacter fermentans）、キチノファーガピネンシス（Chitinophaga pinensis）、ペドバクターヘパリナス（Pedobacter heparinus）およびフラボバクテリウムジョンソニエ（Flavobacterium johnsoniae）からなる群から選択される少なくとも一種であることを特徴とする好気性微生物。
【請求項８】
還元末端糖残基がβ−１，４結合で結合している、２つ以上の糖残基からなる糖を基質とし、セロビオース２−エピメラーゼの酵素反応により、前記還元末端糖残基の２位の水酸基がエピメリ化された糖を製造する、エピメリ化糖の製造方法であって、
前記セロビオース２−エピメラーゼとして、請求項１から４のいずれか一項に記載のセロビオース２−エピメラーゼを使用することを特徴とする製造方法。
【請求項９】
前記基質が、ラクトースである、請求項８記載の製造方法。
【請求項１０】
前記酵素反応の温度が、４０〜１００℃の範囲である請求項８または９記載の製造方法。
【請求項１１】
前記酵素反応における基質濃度が、溶媒１００ｇあたり２５〜９０ｇの範囲である請求項８から１０のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１２】
前記セロビオース２−エピメラーゼが、前記好気性微生物からの無細胞抽出物、および前記好気性微生物の菌体の少なくとも一方であることを特徴とする請求項８から１１のいずれか一項に記載の製造方法。

【図５】