本発明は、「セーフハーバー遺伝子座」、すなわち導入遺伝子の安全な発現を可能にする遺伝子座に位置する標的配列を切断することが可能なエンドヌクレアーゼに関する。本発明は、細胞、組織又は個体への導入遺伝子の挿入のためのかかるエンドヌクレアーゼの使用に更に関する。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、「セーフハーバー遺伝子座」、すなわち導入遺伝子の安全な発現を可能にする遺伝子座に位置する標的配列を切断することが可能なエンドヌクレアーゼに関する。本発明は、細胞、組織又は生物への導入遺伝子の挿入のためのかかるエンドヌクレアーゼの使用に更に関する。
【背景技術】
【０００２】
メガヌクレアーゼ
ホーミングエンドヌクレアーゼとも称されるメガヌクレアーゼは、生細胞における二本鎖切断及び組換えを誘導するために使用された最初のエンドヌクレアーゼであった（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４）。しかしながら、それらの使用は、それらの狭い特異性によって長年制限されていた。数百個の天然メガヌクレアーゼが過去数年にわたって同定されたが、この多様性は依然としてゲノムの複雑性に対応するにはほとんどが不十分であり、関心の遺伝子内のメガヌクレアーゼ切断部位を発見する確率は、依然として極めて低い。これらの知見から、選ばれた配列を天然エンドヌクレアーゼと同じ選択性で切断する、個々に適合した特異性を有する人工エンドヌクレアーゼの必要性が問題となっている。
【０００３】
メガヌクレアーゼは、所望の標的配列を切断するゲノム工学ツールを得るのに最適な足場として登場した（非特許文献５）。変更された特異性を有するメガヌクレアーゼの改変を可能にするコンビナトリアルアセンブリプロセスは、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９によって記載されている。簡潔に述べると、これらのプロセスは、野生型メガヌクレアーゼの基質特異性と数ヌクレオチドだけ異なる基質特異性を有する局所改変変異体の同定に依存する。次いで、かかるタンパク質において同定された最大で４組の突然変異を、完全に再設計された結合面を有する新たなメガヌクレアーゼを生成するために、新たなタンパク質に組み立てることができる。
【０００４】
これらのプロセスは２つの工程を必要とする。初めに、異なる組の突然変異を、パリンドローム標的を切断するホモ二量体変異体に組み立てる。次いで、２つのホモ二量体を、選ばれた非パリンドローム標的を切断するヘテロ二量体メガヌクレアーゼを生成するために共発現させることができる。このプロセスの第１の工程は、依然として最も難しいものであり、所与の遺伝子座を切断するメガヌクレアーゼを絶対確実に得ることができるか否かを事前に知ることはできない。実際に、全ての配列が改変メガヌクレアーゼによって同等に切断される可能性があるわけではなく、場合によっては、メガヌクレアーゼの改変は困難であることが判明し得る（非特許文献１０）。
【０００５】
部位特異的ゲノム修飾に好適な他の酵素
インテグラーゼ、リコンビナーゼ、トランスポザーゼ及びエンドヌクレアーゼのような特殊化された酵素が、部位特異的ゲノム修飾に提案されている。何年もの間、これらの酵素の使用は、所望の標的部位に対するそれらの天然の特異性の再標的化の難しさのために制限されたままである。実際に、これらのタンパク質の標的部位又は十分な程度の配列同一性を有する配列は、訂正される突然変異に近接する配列中又は不活性化される遺伝子内に存在しなくてはならないが、予め改変された配列の場合を除いて、通常はそのようなことはない。遺伝子療法におけるこれらのＤＮＡ修飾酵素の使用を可能にすることの主な課題は、それらのＤＮＡ結合特性を再設計する可能性に左右される。個々に適合した基質特異性を有する人工タンパク質を得ることを目的として、多くの戦略が開発されている。
【０００６】
ストレプトミセスファージＰｈｉＣ３１に由来するインテグラーゼは、内因性遺伝子座における標的化遺伝子導入に早くから使用されていた。この酵素は、ファージ付着部位（ａｔｔＰ）と細菌付着部位（ａｔｔＢ）との間の部位特異的反応による細菌染色体へのファージゲノムの組換えを媒介する（非特許文献１１、非特許文献１２）。これはａｔｔＢ部位を保有するプラスミドから、偽ａｔｔＰ部位（ａｔｔＰ’）と呼ばれるａｔｔＰとの部分同一性を有する天然のゲノム配列へと起こり得る。ＰｈｉＣ３１インテグラーゼは、ヒトゲノムにおいてｈＦＩＸを含む幾つかの導入遺伝子を導入するために使用されている（非特許文献１３、非特許文献１４、非特許文献１５、非特許文献１６、非特許文献１７）。ここでの欠点は、組込みが起こり得る部位を選ぶことができず（非特許文献１６）、正確な組込みについてヒトゲノム遺伝子座内の偽ａｔｔＰ部位に依存せざるを得ないということである。主要な組込み部位は染色体１９に見られるが、数百個の他の組込み遺伝子座が同定されている（非特許文献１６）。最近の研究では、ａｔｔＰ’部位での組込みの効率及び特異性を高め、選ばれた部位を標的とする改変インテグラーゼの開発の道を開くために、ＰｈｉＣ３１インテグラーゼを突然変異させた（非特許文献１８）。しかしながら、改変インテグラーゼの開発は、標的化リコンビナーゼ系及び標的化エンドヌクレアーゼ系に焦点を合わせた同様の試みに遅れを取っている。
【０００７】
バクテリオファージＰ１に由来するＣｒｅリコンビナーゼ又はサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）に由来するＦｌｐタンパク質等の部位特異的リコンビナーゼは、それらの同族部位を含有する予め改変された配列間の組換えを誘導するために使用されている。Ｃｒｅリコンビナーゼは、ｌｏｘＰとして知られる２つの同一の３４ｂｐ部位を認識し、それらの間の組換えを媒介する（非特許文献１９）。長年にわたって、Ｃｒｅ由来リコンビナーゼの制限は、反復ｌｏｘＰ部位又は偽ｌｏｘＰ部位が、これら２つの部位間のＤＮＡ組込みを可能にするために存在しなければならないということであった。しかしながら、この分子のＤＮＡ結合面の指向進化を使用して、新たな特異性を有するリコンビナーゼが作り出されている（非特許文献２０、非特許文献２１）。Ｃｒｅリコンビナーゼ系は、ウイルス配列の切除を誘導するＤＮＡ標的化酵素の使用のためのフレームワークの提供にも有用であった。実際に、レトロウイルスのモロニーマウス白血病ウイルスのベクター系を用いた研究から、ｌｏｘＰ部位を組込みレトロウイルスベクターのＬＴＲに導入する場合、Ｃｒｅの発現が２つのｌｏｘＰ部位間の全ての配列の欠失をもたらし得ることが示されている（非特許文献２２）。ごく最近では、改変Ｃｒｅリコンビナーゼ変異体が、細胞からＨＩＶ１型プロウイルスを切除するために使用されている（非特許文献２３）。リコンビナーゼはプロウイルスＬＴＲを標的とするように再設計され、全ての介在配列の切除を誘導するために使用されている。ＦＲＴ（Ｆｌｐ組換え標的）配列を標的とするＦｌｐリコンビナーゼを用いた改変も試みられており（非特許文献２４）、非天然Ｆｌｐ組換え標的を認識する変異体が得られている（非特許文献２５）。しかしながら、今日、かかる酵素による予め改変されていない遺伝子座における標的化挿入の例はない。
【０００８】
Ｐｉｇｇｙ Ｂａｃｋ及びＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ等のトランスポゾンは、脊椎動物細胞への配列の挿入に効率的なツールを提供することができ、長期的発現を達成するウイルス媒介遺伝子送達の代替として提案されている（非特許文献２６、非特許文献２７、非特許文献２８）。トランスポゾンは、ＤＮＡ分子中に存在するＤＮＡ配列がトランスポザーゼの作用によって別の位置に挿入される、遺伝子送達の天然の手段である。ＳＢ１００Ｘと呼ばれる改変ＳＢトランスポザーゼが、このプロセスの効率を高めることが近年示されている（非特許文献２８）。転位はゲノムレベルでランダムであり（例えば、ＳＢはＴＡジヌクレオチドに組み込まれる）（非特許文献２９）、したがって標的化アプローチのためのツールとみなすべきではない。しかしながら、更なる研究から、トランスポザーゼ触媒ドメインを特異的なＤＮＡ結合ドメインに融合させることにより、ヒト細胞において改変トランスポザーゼによって媒介される染色体転位の可能性が示されており（非特許文献３０）、新たなカテゴリーの標的化ツールの開発の道が開かれている。
【０００９】
遺伝子療法
１０年近く前の遺伝子療法による数人のＸ−ＳＣＩＤ患者の治療の成功は、遺伝子療法の分野における最も重要な節目の１つであった。この素晴らしい業績の後、別の形態のＳＣＩＤ、表皮水疱症及びレーバー黒内障等を含む種々の疾患に対処する他の臨床試験における大きな成功が続いた。しかしながら、これらの当初の成功は、一連の深刻な有害事象、すなわちＸ−ＳＣＩＤ治療患者における白血病の発生のために長い間目立たないものであった（非特許文献３１、非特許文献３２、非特許文献３３）。１例を除く白血病の全ての症例を化学療法によって最終的に治療することができたため、このアプローチは全体的にみて成功のように思われるが、これらの深刻な有害事象は、現行の遺伝子療法アプローチの重大なリスクを浮き彫りにしている。
【００１０】
このため、当該技術分野においては、遺伝子を被験体のゲノムに挿入する安全な方法が必要とされている。
【００１１】
遺伝性疾患の治療のために現在開発されている遺伝子療法プロトコルの大半は、疾患原因遺伝子の付加的かつ機能的なコピーによる変異型対立遺伝子の補完に基づいている。網膜等の非分裂組織では、このコピーの送達は、例えばアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に由来する非組込みベクターを用いて達成することができる。しかしながら、増殖する運命である造血幹細胞（ＨＳＣ）等の幹細胞を標的とする場合、持続的発現が問題になり、組込みベクターが必要とされる。ゲノム内に組み込まれ、宿主の染色体を用いて複製するレトロウイルスベクターが、この目的に有効であることが証明されたが、それらの挿入のランダム性は、全て遺伝子発現に関係する様々な懸念を生じている。Ｘ−ＳＣＩＤ試験において観察された白血病の症例は、組込み部位の近傍のがん原遺伝子の活性化に明らかに関連していた。加えて、導入遺伝子の不適切な発現は代謝的問題又は免疫学的問題をもたらす可能性がある。最後に、挿入は内因性遺伝子のノックアウトをもたらす可能性がある。
【００１２】
部位特異的組込みは、挿入突然変異誘発のリスクを緩和し得るため、ウイルスベクターのランダム組込みの有望な代替策であり得る（非特許文献３４、非特許文献３５、非特許文献５）。しかしながら、標的化組換えのツールを設計するには比較的時間がかかる。加えて、各々のツールは活性及び特異性に関してその固有の特性を有する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Rouet et al. PNAS 1994 91:6064-6068
【非特許文献２】Rouet et al. Mol Cell Biol. 1994 14:8096-8106
【非特許文献３】Choulika et al. Mol Cell Biol. 1995 15:1968-1973
【非特許文献４】Puchta et al. PNAS 1996 93:5055-5060
【非特許文献５】Paques et al. Curr Gen Ther. 2007 7:49-66
【非特許文献６】Arnould et al. J Mol Biol. 2006 355:443-458
【非特許文献７】Arnould et al. J Mol Biol. 2007 371:49-65
【非特許文献８】Smith et al. NAR 2006 34:e149
【非特許文献９】Grizot et al. NAR 2009 37:5405
【非特許文献１０】Galetto et al. Expert Opin Biol Ther. 2009 9:1289-303
【非特許文献１１】Kuhstoss et al. J Mol Biol 1991 222:897-908
【非特許文献１２】Rausch et al. NAR 1991 19:5187-5189
【非特許文献１３】Olivares et al. Nat Biotech 2002 20:1124-1128
【非特許文献１４】Ginsburg et al. Adv Genet 2005 54:179-187
【非特許文献１５】Calos Curr Gene Ther 2006 6:633-645
【非特許文献１６】Chalberg et al. J Mol Biol 2006 357:28-48
【非特許文献１７】Aneja et al. J Gene Med 2007 9:967-975
【非特許文献１８】Keravala et al. Mol Ther 2009 17:112-120
【非特許文献１９】Abremski et al. Cell 1983 32:1301-1311
【非特許文献２０】Buchholz et al. Nat Biotech 2001 19:1047-1052
【非特許文献２１】Santoro et al. PNAS 2002 99:4185-4190
【非特許文献２２】Choulika et al. J Virol 1996 70:1792-1798
【非特許文献２３】Sarkar et al. Science 2007 316:1912-1915
【非特許文献２４】Buchholzt et al. Nat Biotech 1998 16:657-662
【非特許文献２５】Voziyanov et al. J Mol Biol 2003 326:65-76
【非特許文献２６】Izsvak et al. Mol ther 2004 9:147-156
【非特許文献２７】Ivics et al. Curr Gene Ther 2006 6:593-607
【非特許文献２８】Mates et al. Nat Genet 2009 41:753-761
【非特許文献２９】Vigdal et al. J Mol Biol 2002 323:441-452
【非特許文献３０】Ivics, et al. Mol Ther 2007 15:1137-1144
【非特許文献３１】Hacein-Bey-Abina et al. Science 2003 302:415-419
【非特許文献３２】Hacein-Bey-Abina et al. J Clin Invest. 2008 118:3132-3142
【非特許文献３３】Howe et al. J Clin Invest. 2008 118:3143-3150
【非特許文献３４】Kolb et al. Trends Biotechnol. 2005 23:399-406
【非特許文献３５】Porteus et al. Nat Biotechnol. 2005 23:967-973
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
したがって、当該技術分野では、遺伝子付加の「セーフハーバー」であるとみなされ得るゲノムの遺伝子座への導入遺伝子の標的化挿入を可能にするツールが必要とされている。加えて、このツールを、それらの配列に関わりなく導入遺伝子の挿入に使用し、それにより同じツールを用いた遺伝子療法による多数の疾患の治療を可能にすることができれば極めて有利であり得る。さらに、このツールが高い有効性でゲノムに導入遺伝子を挿入し、高いレベルで導入遺伝子の安定な発現をもたらすことができれば極めて有利であり得る。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明はとりわけ、以下の実施の形態に関する（drawn to）：
実施の形態１：導入遺伝子を個体のゲノムに挿入する際に使用される標的配列を切断することが可能な変異型エンドヌクレアーゼであって、
ｉ．上記ゲノムが上記標的配列を含む遺伝子座を含み、
ｉｉ．上記標的配列がレトロウイルス挿入部位（ＲＩＳ）から最大で２００ｋｂ離れて位置し、該ＲＩＳが、がんとも異常細胞増殖とも関連しない、変異型エンドヌクレアーゼ。
実施の形態２：上記導入遺伝子の挿入が、上記標的配列の近傍に位置する遺伝子の発現を実質的に変更しない、実施の形態１に記載のエンドヌクレアーゼ。
実施の形態３：上記標的配列が、最近接遺伝子から少なくとも１００ｋｂ離れて位置する、実施の形態１又は２に記載のエンドヌクレアーゼ。
実施の形態４：上記ＲＩＳが、幹細胞の形質導入による遺伝子療法によって治療される患者に由来する細胞において同定されたものである、実施の形態１〜３のいずれか１つに記載のエンドヌクレアーゼ。
実施の形態５：上記ＲＩＳが、造血幹細胞の形質導入による遺伝子療法によって治療される患者に由来する細胞において同定されたものである、実施の形態１〜３のいずれか１つに記載のエンドヌクレアーゼ。
実施の形態６：ホーミングエンドヌクレアーゼである、実施の形態１〜５のいずれか１つに記載のエンドヌクレアーゼ。
実施の形態７：上記ホーミングエンドヌクレアーゼが、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧエンドヌクレアーゼファミリーの成員である、実施の形態６に記載のエンドヌクレアーゼ。
実施の形態８：上記ＬＡＧＬＩＤＡＤＧエンドヌクレアーゼファミリーの成員がＩ−ＣｒｅＩである、実施の形態７に記載のエンドヌクレアーゼ。
実施の形態９：上記遺伝子座が、ヒト染色体６ｐ２５．１上のＳＨ３遺伝子座、ヒト染色体７ｑ３１．２上のＳＨ４遺伝子座、ヒト染色体２１ｑ２１．１上のＳＨ６遺伝子座、ヒト染色体１３ｑ３４上のＳＨ１２遺伝子座、ヒト染色体３ｐ１２．２上のＳＨ１３遺伝子座、ヒト染色体２２上のＳＨ１９遺伝子座、ヒト染色体１２ｑ２１．２上のＳＨ２０遺伝子座、ヒト染色体３ｐ２４．１上のＳＨ２１遺伝子座、ヒト染色体６ｐ１２．２上のＳＨ３３遺伝子座、ヒト染色体２ｐ１６．１上のＳＨ７遺伝子座及びヒト染色体５上のＳＨ８遺伝子座から選択される、実施の形態１〜８のいずれか１つに記載のエンドヌクレアーゼ。
実施の形態１０：導入遺伝子を細胞又は組織のゲノムに挿入するための実施の形態１〜９のいずれか１つに記載のエンドヌクレアーゼのｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏでの使用。
実施の形態１１：配列番号１又は配列番号４２と少なくとも８０％同一な配列を含む２つの単量体を含む変異型二量体Ｉ−ＣｒｅＩタンパク質であって、
ｉ．上記二量体Ｉ−ＣｒｅＩタンパク質が、個体の遺伝子座内に位置する標的配列を切断することが可能であり、該標的配列がレトロウイルス挿入部位（ＲＩＳ）から最大で２００ｋｂ離れて位置し、該ＲＩＳが、がんとも異常細胞増殖とも関連せず、
ｉｉ．上記標的配列が配列番号４の配列を含まない、変異型二量体Ｉ−ＣｒｅＩタンパク質。
実施の形態１２：ヒト染色体６ｐ２５．１上のＳＨ３遺伝子座内に位置する標的配列を切断することが可能である、実施の形態１１に記載の二量体Ｉ−ＣｒｅＩタンパク質。
実施の形態１３：上記標的配列が配列番号２の配列を含む、実施の形態１２に記載の二量体Ｉ−ＣｒｅＩタンパク質。
実施の形態１４：
ａ）配列番号１の３０位、３８位、７０位及び７５位にアミノ酸置換を含む第１の単量体と、
ｂ）配列番号１の４４位、５４位、７０位及び７５位にアミノ酸置換を含む第２の単量体と、
を含む、実施の形態１２又は１３に記載の二量体Ｉ−ＣｒｅＩタンパク質。
実施の形態１５：上記ポリペプチドが、
ａ）３０Ｇ ３８Ｒ ７０Ｄ ７５Ｎ ８６Ｄ突然変異を含む第１の単量体、
ｂ）
ｉ．４４Ａ ５４Ｌ ６４Ａ ７０Ｑ ７５Ｎ １５８Ｒ １６２Ａ突然変異を含む単量体、
ｉｉ．４４Ａ ５４Ｌ ７０Ｑ ７５Ｙ ９２Ｒ １５８Ｒ １６２Ａ突然変異を含む単量体、
ｉｉｉ．４Ｅ ４４Ａ ５４Ｌ ６４Ａ ７０Ｑ ７５Ｎ １５８Ｒ １６２Ａ突然変異を含む単量体、
ｉｖ．４４Ａ ５４Ｌ ６４Ａ ７０Ｑ ７５Ｎ １５８Ｗ １６２Ａ突然変異を含む単量体、
ｖ．４４Ａ ５４Ｌ ７０Ｑ ７５Ｎ突然変異を含む単量体、
ｖｉ．４４Ａ ５４Ｌ ５７Ｅ ７０Ｑ ７５Ｎ １５８Ｒ １６２Ａ突然変異を含む単量体、及び
ｖｉｉ．４４Ｖ ５４Ｌ ７０Ｑ ７５Ｎ ７７Ｖ突然変異を含む単量体からなる群から選択される第２の単量体、
を含む、実施の形態１４に記載の二量体Ｉ−ＣｒｅＩタンパク質。
実施の形態１６：上記ポリペプチドが、
ａ）３０Ｇ ３８Ｒ ７０Ｄ ７５Ｎ ８１Ｔ １５４Ｇ突然変異を含む第１の単量体、
ｂ）
ｉ．４４Ａ ５４Ｌ ７０Ｑ ７５Ｎ １０５Ａ １５８Ｒ １６２Ａ突然変異を含む単量体、
ｉｉ．４４Ａ ５４Ｌ ６４Ａ ７０Ｑ ７５Ｎ １５８Ｒ １６２Ａ突然変異を含む単量体、
ｉｉｉ．４Ｅ ４４Ａ ５４Ｌ ６４Ａ ７０Ｑ ７５Ｎ １５８Ｒ １６２Ａ突然変異を含む単量体、
ｉｖ．４４Ａ ５４Ｌ ６４Ａ ７０Ｑ ７５Ｎ １５８Ｗ １６２Ａ突然変異を含む単量体、
ｖ．４４Ａ ５４Ｌ ７０Ｑ ７５Ｎ突然変異を含む単量体、及び
ｖｉ．４４Ｖ ５４Ｌ ７０Ｑ ７５Ｎ ７７Ｖ突然変異を含む単量体からなる群から選択される第２の単量体、
を含む、実施の形態１４に記載の二量体Ｉ−ＣｒｅＩタンパク質。
実施の形態１７：上記ポリペプチドが、
ａ）３０Ｇ ３８Ｒ ５０Ｒ ７０Ｄ ７５Ｎ １４２Ｒ突然変異を含む第１の単量体、
ｂ）
ｉ．４４Ａ ５４Ｌ ７０Ｑ ７５Ｎ １０５Ａ １５８Ｒ １６２Ａ突然変異を含む単量体、
ｉｉ．４４Ａ ５４Ｌ ６４Ａ ７０Ｑ ７５Ｎ １５８Ｒ １６２Ａ突然変異を含む単量体、
ｉｉｉ．４４Ａ ５４Ｌ ７０Ｑ ７５Ｙ ９２Ｒ １５８Ｒ １６２Ａ突然変異を含む単量体、
ｉｖ．４Ｅ ４４Ａ ５４Ｌ ６４Ａ ７０Ｑ ７５Ｎ １５８Ｒ １６２Ａ突然変異を含む単量体、
ｖ．４４Ａ ５４Ｌ ６４Ａ ７０Ｑ ７５Ｎ １５８Ｗ １６２Ａ突然変異を含む単量体、
ｖｉ．４４Ａ ５４Ｌ ６６Ｃ ７０Ｑ ７１Ｒ ７５Ｎ １５１Ａ １５８Ｒ １６２Ａ突然変異を含む単量体、
ｖｉｉ．４４Ａ ５４Ｌ ７０Ｑ ７５Ｎ突然変異を含む単量体、
ｖｉｉｉ．４４Ａ ５４Ｌ ５７Ｅ ７０Ｑ ７５Ｎ １５８Ｒ １６２Ａ突然変異を含む単量体、及び
ｉｘ．４４Ｖ ５４Ｌ ７０Ｑ ７５Ｎ ７７Ｖ突然変異を含む単量体からなる群から選択される第２の単量体、
を含む、実施の形態１４に記載の二量体Ｉ−ＣｒｅＩタンパク質。
実施の形態１８：ヒト染色体７ｑ３１．２上のＳＨ４遺伝子座内に位置する標的配列を切断することが可能である、実施の形態１１に記載の二量体Ｉ−ＣｒｅＩタンパク質。
実施の形態１９：上記標的配列が配列番号３の配列を含む、実施の形態１８に記載の二量体Ｉ−ＣｒｅＩタンパク質。
実施の形態２０：
ａ）配列番号１の２４位、７０位、７５位及び７７位にアミノ酸置換を含む第１の単量体と、
ｂ）配列番号１の２４位、４４位及び７０位にアミノ酸置換を含む第２の単量体と、
を含む、実施の形態１８又は１９に記載の二量体Ｉ−ＣｒｅＩタンパク質。
実施の形態２１：上記ポリペプチドが、
ａ）
ｉ．２４Ｖ ４４Ｒ ６８Ｙ ７０Ｓ ７５Ｙ ７７Ｎ突然変異を含む単量体、
ｉｉ．２４Ｖ ６８Ａ ７０Ｓ ７５Ｎ ７７Ｒ突然変異を含む単量体、及び
ｉｉｉ．２４Ｖ ７０Ｄ ７５Ｎ ７７Ｒ突然変異を含む単量体からなる群から選択される第１の単量体、
ｂ）
ｉ．２４Ｖ ４４Ｙ ７０Ｓ突然変異を含む単量体、及び
ｉｉ．２４Ｖ ４４Ｙ ７０Ｓ ７７Ｖ突然変異を含む単量体からなる群から選択される第２の単量体、
を含む、実施の形態２０に記載の二量体Ｉ−ＣｒｅＩタンパク質。
実施の形態２２：ヒト染色体２１ｑ２１．１上のＳＨ６遺伝子座内に位置する標的配列を切断することが可能である、実施の形態１１に記載の二量体Ｉ−ＣｒｅＩタンパク質。
実施の形態２３：上記標的配列が配列番号５９の配列を含む、実施の形態２２に記載の二量体Ｉ−ＣｒｅＩタンパク質。
実施の形態２４：
ａ）配列番号１の４４位、並びに任意に７０位及び／又は７５位にアミノ酸置換を含む第１の単量体と、
ｂ）配列番号１の２８位、４０位、４４位、７０位及び７５位にアミノ酸置換を含む第２の単量体と、
を含む、実施の形態２２又は２３に記載の二量体Ｉ−ＣｒｅＩタンパク質。
実施の形態２５：上記ポリペプチドが、
ａ）４４Ｋ ６８Ｔ ７０Ｇ ７５Ｎ突然変異を含む第１の単量体と、
ｂ）
ｉ．２８Ｑ ４０Ｒ ４４Ａ ７０Ｌ ７５Ｎ ９６Ｒ １１１Ｈ １４４Ｓ突然変異を含む単量体、
ｉｉ．７Ｒ ２８Ｑ ４０Ｒ ４４Ａ ７０Ｌ ７５Ｎ ８５Ｒ １０３Ｔ突然変異を含む単量体、
ｉｉｉ．２８Ｑ ４０Ｒ ４４Ａ ７０Ｌ ７５Ｎ １０３Ｓ突然変異を含む単量体、
ｉｖ．２４Ｆ ２７Ｖ ２８Ｑ ４０Ｒ ４４Ａ ７０Ｌ ７５Ｎ ９９Ｒ突然変異を含む単量体、
ｖ．７Ｒ ２８Ｑ ４０Ｒ ４４Ａ ７０Ｌ ７５Ｎ ８１Ｔ突然変異を含む単量体、
ｖｉ．７Ｒ ２８Ｑ ４０Ｒ ４４Ａ ７０Ｌ ７５Ｎ ７７Ｖ突然変異を含む単量体、
ｖｉｉ．７Ｒ ２８Ｑ ４０Ｒ ４４Ａ ７０Ｌ ７５Ｎ １０３Ｔ １２１Ｅ １３２Ｖ １６０Ｒ突然変異を含む単量体、
ｖｉｉｉ．２８Ｑ ４０Ｒ ４４Ａ ７０Ｌ ７５Ｎ突然変異を含む単量体、
ｉｘ．７Ｒ ２８Ｑ ４０Ｒ ４４Ａ ７０Ｌ ７５Ｎ １０３Ｔ突然変異を含む単量体、及び
ｘ．２８Ｑ ３４Ｒ ４０Ｒ ４４Ａ ７０Ｌ ７５Ｎ ８１Ｖ １０３Ｔ １０８Ｖ １６０Ｅ突然変異を含む単量体からなる群から選択される第２の単量体と、
を含む、実施の形態２４に記載の二量体Ｉ−ＣｒｅＩタンパク質。
実施の形態２６：上記ポリペプチドが、
ａ）４４Ｋ突然変異、並びに任意に７０Ｓ及び／又は７５Ｎ突然変異を含む第１の単量体と、
ｂ）
ｉ．２８Ｑ ４０Ｒ ４４Ａ ７０Ｌ ７５Ｎ ９６Ｒ １１１Ｈ １４４Ｓ突然変異を含む単量体、
ｉｉ．７Ｒ ２８Ｑ ４０Ｒ ４４Ａ ７０Ｌ ７５Ｎ ８５Ｒ １０３Ｔ突然変異を含む単量体、
ｉｉｉ．２８Ｑ ４０Ｒ ４４Ａ ７０Ｌ ７５Ｎ １０３Ｓ突然変異を含む単量体、
ｉｖ．２４Ｆ ２７Ｖ ２８Ｑ ４０Ｒ ４４Ａ ７０Ｌ ７５Ｎ ９９Ｒ突然変異を含む単量体、
ｖ．７Ｒ ２８Ｑ ４０Ｒ ４４Ａ ７０Ｌ ７５Ｎ ８１Ｔ突然変異を含む単量体、
ｖｉ．７Ｒ ２８Ｑ ４０Ｒ ４４Ａ ７０Ｌ ７５Ｎ １０３Ｔ １２１Ｅ １３２Ｖ １６０Ｒ突然変異を含む単量体、
ｖｉｉ．７Ｒ ２８Ｑ ４０Ｒ ４４Ａ ７０Ｌ ７５Ｎ １０３Ｔ突然変異を含む単量体、及び
ｖｉｉｉ．２８Ｑ ３４Ｒ ４０Ｒ ４４Ａ ７０Ｌ ７５Ｎ ８１Ｖ １０３Ｔ １０８Ｖ １６０Ｅ突然変異を含む単量体からなる群から選択される第２の単量体と、
を含む、実施の形態２４に記載の二量体Ｉ−ＣｒｅＩタンパク質。
実施の形態２７：実施の形態１１〜２６のいずれか１つに記載の二量体Ｉ−ＣｒｅＩタンパク質の単量体を含む融合タンパク質。
実施の形態２８：上記単量体が、配列番号４３の配列を含むペプチドリンカーによって連結される、実施の形態２７に記載の融合タンパク質。
実施の形態２９：Ｃ末端単量体がＫ７Ｅ突然変異及びＫ９６Ｅ突然変異を更に含み、Ｎ末端単量体がＥ８Ｋ突然変異、Ｅ６１Ｒ突然変異及びＧ１９Ｓ突然変異を更に含む、実施の形態２７又は２８に記載の融合タンパク質。
実施の形態３０：配列番号２５〜配列番号４０及び配列番号７６〜配列番号９６からなる群から選択される配列を含む、実施の形態２７〜２９のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
実施の形態３１：実施の形態１〜９のいずれか１つに記載のエンドヌクレアーゼ又は実施の形態１１〜３０のいずれか１つに記載のタンパク質をコードする核酸。
実施の形態３２：実施の形態３１に記載の核酸を含む発現ベクター。
実施の形態３３：導入遺伝子を含む標的化構築物と、実施の形態１〜９のいずれか１つに記載のエンドヌクレアーゼ又は実施の形態１１〜３０のいずれか１つに記載のタンパク質によって認識される標的配列に隣接するゲノム配列に相同な２つの配列とを更に含む、実施の形態３２に記載の発現ベクター。
実施の形態３４：上記導入遺伝子が治療用ポリペプチドをコードする、実施の形態３３に記載の発現ベクター。
実施の形態３５：遺伝子療法に使用される、実施の形態３２〜３４のいずれか１つに記載の発現ベクター。
実施の形態３６：実施の形態３２に記載の発現ベクターと、
導入遺伝子を含む標的化構築物と、実施の形態１〜９のいずれか１つに記載のエンドヌクレアーゼ又は実施の形態１１〜３０のいずれか１つに記載のタンパク質によって認識される標的配列のゲノム配列に相同な２つの配列とを含むベクターと、
の組合せ。
実施の形態３７：実施の形態３２〜３４のいずれか１つに記載の発現ベクター又は実施の形態３６に記載の組合せと、薬学的に活性な担体とを含む医薬組成物。
実施の形態３８：遺伝子療法によって個体を治療する方法であって、有効量の実施の形態３２〜３４のいずれか１つに記載の発現ベクター又は実施の形態３６に記載の組合せを、それを必要とする個体に投与することを含む、遺伝子療法によって個体を治療する方法。
実施の形態３９：個体のゲノムへの導入遺伝子の挿入に好適なエンドヌクレアーゼを得る方法であって、
ａ）上記個体のゲノム内で、がんとも異常細胞増殖とも関連しないレトロウイルス挿入部位（ＲＩＳ）を選択する工程と、
ｂ）上記ＲＩＳの２００ｋｂ上流及び２００ｋｂ下流に伸びるゲノム領域を規定する工程と、
ｃ）上記ゲノム領域内に位置する標的配列を切断することが可能な野生型エンドヌクレアーゼを同定するか、又は変異型エンドヌクレアーゼを構築する工程と、
を含む、個体のゲノムへの導入遺伝子の挿入に好適なエンドヌクレアーゼを得る方法。
実施の形態４０：導入遺伝子を細胞、組織又は非ヒト動物のゲノムに挿入するための実施の形態１〜９のいずれか１つに記載のエンドヌクレアーゼ又は実施の形態１１〜３０のいずれか１つに記載のタンパク質又は実施の形態３１に記載の核酸又は実施の形態３２〜３４のいずれか１つに記載の発現ベクター又は実施の形態３６に記載の組合せの使用であって、治療目的でない、使用。
実施の形態４１：遺伝性障害の非ヒト動物モデルを作製するための、実施の形態４０に記載の使用。
実施の形態４２：組換えタンパク質を製造するための、実施の形態４０に記載の使用。
実施の形態４３：実施の形態３１に記載の核酸又は実施の形態３２〜３４のいずれか１つに記載の発現ベクター又は実施の形態３６に記載の組合せを、そのゲノム内に含む非ヒトトランスジェニック動物。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】実施例１に記載のメガヌクレアーゼの標的配列を示す図である。図中の「SEQ ID NO:」の記載は「配列番号」を意味する。以下の図も同様である。
【図２】ＳＣＯＨ ＳＨ３メガヌクレアーゼ対Ｉ−ＳｃｅＩ及びＳＣＯＨ−ＲＡＧ ＤＮＡのＣＨＯにおける用量応答を示す図である。
【図３】ＳＣＯＨ ＳＨ３メガヌクレアーゼ対Ｉ−ＳｃｅＩ及びＳＣＯＨ−ＲＡＧ ＤＮＡのＣＨＯにおける用量応答を示す図である。
【図４】実施例２に記載のメガヌクレアーゼの標的配列を示す図である。
【図５】ＳＣＯＨ ＳＨ４メガヌクレアーゼ対Ｉ−ＳｃｅＩ及びＳＣＯＨ−ＲＡＧ ＤＮＡのＣＨＯにおける用量応答を示す図である。
【図６】ＳＣＯＨ ＳＨ４メガヌクレアーゼ対Ｉ−ＳｃｅＩ及びＳＣＯＨ−ＲＡＧ ＤＮＡのＣＨＯにおける用量応答を示す図である。
【図７】非相同末端結合（ＮＨＥＪ）による二本鎖切断の修復時に小さな欠失及び挿入（ＩｎＤｅｌ）の生成をもたらす機構のスキームを示す図である。
【図８】ＳＨ３メガヌクレアーゼ又はＳＨ４メガヌクレアーゼによる切断の際の挿入部位を示す図である。
【図９】実施例５に記載のメガヌクレアーゼの標的配列を示す図である。
【図１０】ＳＣＯＨ ＳＨ６メガヌクレアーゼ対Ｉ−ＳｃｅＩ及びＳＣＯＨ−ＲＡＧ ＤＮＡのＣＨＯにおける用量応答を示す図である。
【図１１】配列番号１のＩ−ＣｒｅＩ単量体と配列番号４２のＩ−ＣｒｅＩ単量体との間の配列アラインメントを示す図である。
【図１２】配列番号１のＩ−ＣｒｅＩ単量体と、４４Ａ ５４Ｌ ６４Ａ ７０Ｑ ７５Ｎ １５８Ｒ及び１６２Ａの突然変異を含む２つのＩ−ＣｒｅＩ単量体との間の配列アラインメントを示す図である。第１の単量体（配列番号５７）は配列番号１に直接由来し、第２の単量体（配列番号５８）は配列番号４２に直接由来する。
【図１３】実施例６〜実施例９を説明する図である。
【図１４】実施例６〜実施例９を説明する図である。
【図１５】実施例７を説明する図である。
【図１６】実施例７を説明する図である。
【図１７】実施例８を説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明者らは、標的化挿入による導入遺伝子の安全な発現を可能にするゲノム内の「セーフハーバー」遺伝子座を同定したが、ここで、（ｉ）上記遺伝子座は、遺伝子療法によって治療される患者に由来する細胞において同定されたレトロウイルス挿入部位の近くにあり、及び（ｉｉ）上記レトロウイルス挿入は、がん又は異常細胞増殖と関連しない。以下の説明及び実施例からすぐに分かるように、本発明によるセーフハーバー遺伝子座は遺伝子のイントロン内に位置していても、又は遺伝子間領域内に位置していてもよい。
【００１８】
特に、本発明者らは、エンドヌクレアーゼを、上記セーフハーバーを遺伝子付加の標的とするように改変することができることを見出した。
【００１９】
より具体的には、本発明者らは、種々のセーフハーバー遺伝子座、例えば本明細書中で更に説明するＳＨ６遺伝子座、ＳＨ３遺伝子座、ＳＨ４遺伝子座、ＳＨ１２遺伝子座、ＳＨ１３遺伝子座、ＳＨ１９遺伝子座、ＳＨ２０遺伝子座、ＳＨ２１遺伝子座、ＳＨ３３遺伝子座、ＳＨ７遺伝子座、ＳＨ８遺伝子座、ＳＨ１８遺伝子座、ＳＨ３１遺伝子座、ＳＨ３８遺伝子座、ＳＨ３９遺伝子座、ＳＨ４１遺伝子座、ＳＨ４２遺伝子座、ＳＨ４３遺伝子座、ＳＨ４４遺伝子座、ＳＨ４５遺伝子座、ＳＨ４６遺伝子座、ＳＨ４７遺伝子座、ＳＨ４８遺伝子座、ＳＨ４９遺伝子座、ＳＨ５０遺伝子座、ＳＨ５１遺伝子座、ＳＨ５２遺伝子座、ＳＨ７０遺伝子座、ＳＨ７１遺伝子座、ＳＨ７２遺伝子座、ＳＨ７３遺伝子座、ＳＨ７４遺伝子座、ＳＨ７５遺伝子座、ＳＨ１０１遺伝子座、ＳＨ１０６遺伝子座、ＳＨ１０７遺伝子座、ＳＨ１０２遺伝子座、ＳＨ１０５遺伝子座、ＳＨ１０３遺伝子座、ＳＨ１０４遺伝子座、ＳＨ１１３遺伝子座、ＳＨ１０９遺伝子座、ＳＨ１１２遺伝子座、ＳＨ１０８遺伝子座、ＳＨ１１０遺伝子座、ＳＨ１１４遺伝子座、ＳＨ１１６遺伝子座、ＳＨ１１１遺伝子座、ＳＨ１１５遺伝子座、ＳＨ１２１遺伝子座、ＳＨ１２０遺伝子座、ＳＨ１２２遺伝子座、ＳＨ１１７遺伝子座、ＳＨ１１８遺伝子座、ＳＨ１１９遺伝子座、ＳＨ１２３遺伝子座、ＳＨ１２６遺伝子座、ＳＨ１２８遺伝子座、ＳＨ１２９遺伝子座、ＳＨ１２４遺伝子座、ＳＨ１３１遺伝子座、ＳＨ１２５遺伝子座、ＳＨ１２７遺伝子座、ＳＨ１３０遺伝子座、ＳＨ１１遺伝子座、ＳＨ１７遺伝子座、ＳＨ２３遺伝子座、ＳＨ３４遺伝子座、ＳＨ４０遺伝子座、ＳＨ５３遺伝子座、ＳＨ５４遺伝子座、ＳＨ５５遺伝子座、ＳＨ５６遺伝子座、ＳＨ５７遺伝子座、ＳＨ５８遺伝子座、ＳＨ５９遺伝子座、ＳＨ６０遺伝子座、ＳＨ６１遺伝子座、ＳＨ６２遺伝子座、ＳＨ６５遺伝子座、ＳＨ６７遺伝子座、ＳＨ６８遺伝子座及びＳＨ６９遺伝子座内に位置する標的配列を認識し切断することが可能な幾つかのＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼを設計した。
【００２０】
これらのメガヌクレアーゼが、それらの標的配列を効率的に切断することができることが更に示された。
【００２１】
したがって、これらのメガヌクレアーゼ、並びにインテグラーゼ、リコンビナーゼ及びトランスポザーゼのような他の酵素（enzymes）を、導入遺伝子をセーフハーバーに挿入するためのツールとして使用し、それにより遺伝子療法における白血病等の有害事象の発生を回避することができる。加えて、これらのメガヌクレアーゼ、並びにインテグラーゼ、リコンビナーゼ及びトランスポザーゼのような他の酵素は、導入遺伝子の配列に関わりなく単一の標的化構築物から出発して任意の導入遺伝子をセーフハーバーに挿入するために使用することができる。
【００２２】
本発明によるエンドヌクレアーゼ及びその使用
本発明はしたがって、以下のものに関する：
導入遺伝子を個体のゲノムに挿入する際に使用される標的配列を切断することが可能なエンドヌクレアーゼであって、（ｉ）上記ゲノムが上記標的配列を含む遺伝子座を含み、（ｉｉ）上記標的配列がレトロウイルス挿入部位（ＲＩＳ）から最大で２００ｋｂ離れて位置し、該ＲＩＳが、がんとも異常細胞増殖とも関連しない、エンドヌクレアーゼ；
導入遺伝子を細胞又は組織のゲノムに挿入するための標的配列を切断することが可能なエンドヌクレアーゼのｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏでの使用であって、（ｉ）上記ゲノムが上記標的配列を含む遺伝子座を含み、（ｉｉ）上記標的配列がレトロウイルス挿入部位（ＲＩＳ）から最大で２００ｋｂ離れて位置し、該ＲＩＳが、がんとも異常細胞増殖とも関連しない、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏでの使用；
導入遺伝子を個体のゲノムに挿入する方法であって、（ｉ）標的配列を切断することが可能なエンドヌクレアーゼを準備する工程であって、上記ゲノムが上記標的配列を含む遺伝子座を含み、該標的配列が、がんとも異常細胞増殖とも関連しないレトロウイルス挿入部位（ＲＩＳ）から最大で２００ｋｂ離れて位置する、工程と、（ｉｉ）個体を導入遺伝子及び上記エンドヌクレアーゼと接触させ、それにより上記導入遺伝子を個体のゲノムの上記遺伝子座に挿入する、工程とを含む、導入遺伝子を個体のゲノムに挿入する方法。
【００２３】
本明細書中で使用される場合、「エンドヌクレアーゼ」という用語は、ＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子、好ましくはＤＮＡ分子内の核酸間の結合の加水分解（切断）を触媒することが可能な任意の野生型又は変異型の酵素を指す。本発明によるエンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子を、その配列に関係なく切断することはなく、「標的配列」又は「標的部位」と更に称される特異的なポリヌクレオチド配列でＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子を認識し切断する。本発明によるエンドヌクレアーゼによって認識され切断される標的配列は、本発明による標的配列と称される。
【００２４】
本発明によるエンドヌクレアーゼは例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼ（非特許文献５）、改変ジンクフィンガードメインとＦｏｋＩ等の制限酵素の触媒ドメインとの融合から得られるキメラジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）（非特許文献３５）又は化学的エンドヌクレアーゼ（Arimondo et al. Mol Cell Biol. 2006 26:324-333、Simon et al. NAR 2008 36:3531-3538、Eisenschmidt et al. NAR 2005 33:7039-7047、Cannata et al. PNAS 2008 105:9576-9581）であり得る。化学的エンドヌクレアーゼでは、化学的切断剤（cleaver）又はペプチド切断剤を核酸のポリマー又は特異的な標的配列を認識する別のＤＮＡのいずれかと結合させ、それにより特異的な配列に対する切断活性を標的とする。
【００２５】
本発明によるエンドヌクレアーゼは好ましくは、メガヌクレアーゼの名称でも知られるホーミングエンドヌクレアーゼである。かかるホーミングエンドヌクレアーゼは、当該技術分野で既知である（例えば、Stoddard, Quarterly Reviews of Biophysics, 2006, 38:49-95を参照されたい）。ホーミングエンドヌクレアーゼはＤＮＡ標的配列を認識し、一本鎖又は二本鎖の切断を生じる。ホーミングエンドヌクレアーゼは高度に特異的であり、１２塩基対（ｂｐ）〜４５塩基対の範囲の長さ、通常は１４ｂｐ〜４０ｂｐの範囲の長さのＤＮＡ標的部位を認識する。本発明によるホーミングエンドヌクレアーゼは、例えばＬＡＧＬＩＤＡＤＧエンドヌクレアーゼ、ＨＮＨエンドヌクレアーゼ又はＧＩＹ−ＹＩＧエンドヌクレアーゼに相当し得る。かかるエンドヌクレアーゼの例としては、Ｉ−Ｓｃｅ Ｉ、Ｉ−Ｃｈｕ Ｉ、Ｉ−Ｃｒｅ Ｉ、Ｉ−Ｃｓｍ Ｉ、ＰＩ−Ｓｃｅ Ｉ、ＰＩ−Ｔｌｉ Ｉ、ＰＩ−Ｍｔｕ Ｉ、Ｉ−Ｃｅｕ Ｉ、Ｉ−Ｓｃｅ ＩＩ、Ｉ−Ｓｃｅ ＩＩＩ、ＨＯ、ＰＩ−Ｃｉｖ Ｉ、ＰＩ−Ｃｔｒ Ｉ、ＰＩ−Ａａｅ Ｉ、ＰＩ−Ｂｓｕ Ｉ、ＰＩ−Ｄｈａ Ｉ、ＰＩ−Ｄｒａ Ｉ、ＰＩ−Ｍａｖ Ｉ、ＰＩ−Ｍｃｈ Ｉ、ＰＩ−Ｍｆｕ Ｉ、ＰＩ−Ｍｆｌ Ｉ、ＰＩ−Ｍｇａ Ｉ、ＰＩ−Ｍｇｏ Ｉ、ＰＩ−Ｍｉｎ Ｉ、ＰＩ−Ｍｋａ Ｉ、ＰＩ−Ｍｌｅ Ｉ、ＰＩ−Ｍｍａ Ｉ、ＰＩ−Ｍｓｈ Ｉ、ＰＩ−Ｍｓｍ Ｉ、ＰＩ−Ｍｔｈ Ｉ、ＰＩ−Ｍｔｕ Ｉ、ＰＩ−Ｍｘｅ Ｉ、ＰＩ−Ｎｐｕ Ｉ、ＰＩ−Ｐｆｕ Ｉ、ＰＩ−Ｒｍａ Ｉ、ＰＩ−Ｓｐｂ Ｉ、ＰＩ−Ｓｓｐ Ｉ、ＰＩ−Ｆａｃ Ｉ、ＰＩ−Ｍｊａ Ｉ、ＰＩ−Ｐｈｏ Ｉ、ＰＩ−Ｔａｇ Ｉ、ＰＩ−Ｔｈｙ Ｉ、ＰＩ−Ｔｋｏ Ｉ、ＰＩ−Ｔｓｐ Ｉ、Ｉ−ＭｓｏＩが挙げられる。
【００２６】
好ましい実施形態では、本発明によるホーミングエンドヌクレアーゼは、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ及びＩ−ＤｍｏＩ等のＬＡＧＬＩＤＡＤＧエンドヌクレアーゼである。
【００２７】
最も好ましい実施形態では、上記ＬＡＧＬＩＤＡＤＧエンドヌクレアーゼはＩ−ＣｒｅＩである。野生型Ｉ−ＣｒｅＩは、２２ｂｐ〜２４ｂｐの二本鎖標的配列を切断することが可能なホモ二量体ホーミングエンドヌクレアーゼである。Ｉ−ＣｒｅＩの野生型単量体の配列は、配列番号１として示される配列（ｐｄｂアクセッション番号１ｇ９ｙのＩ−ＣｒｅＩ配列に相当する）及びＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０５７２５で示される配列（特にバージョン７３で示される配列、最終更新日２００９年１１月３日）を含む。
【００２８】
本特許出願において、Ｉ−ＣｒｅＩ変異体は、野生型Ｉ−ＣｒｅＩ配列の最初のメチオニンの後に更なるアラニン及びＣ末端（C-terminal extremity）に３つの更なるアミノ酸残基を含み得る（配列番号４２の配列及び図１１を参照されたい）。これら３つの更なるアミノ酸残基は、野生型Ｉ−ＣｒｅＩ配列の最後のプロリンの後の２つの更なるアラニン残基及び１つのアスパラギン酸残基からなる。これらの更なる残基は、酵素の特性に影響を与えない。明確化のために、これらの更なる残基はＩ−ＣｒｅＩ又はその変異体における残基のナンバリングに影響を与えないものとする。より具体的には、本明細書中で使用されるナンバリングは、配列番号１の野生型Ｉ−ＣｒｅＩ酵素における残基の位置のみを指す。例えば、野生型Ｉ−ＣｒｅＩの２番目の残基は、この変異体が最初のメチオニンの後に更なるアラニンを含むため、実際には配列番号４２の変異体の３番目の残基である。
【００２９】
本出願において、Ｉ−ＣｒｅＩ変異体は、ホモ二量体（２つの同一の単量体を含むメガヌクレアーゼ）、ヘテロ二量体（２つの同一でない単量体を含むメガヌクレアーゼ）及び一本鎖であり得る。
【００３０】
本発明は、野生型（天然）エンドヌクレアーゼ及び変異型エンドヌクレアーゼの両方を包含する。好ましい実施形態では、本発明によるエンドヌクレアーゼは、「変異型」エンドヌクレアーゼ、すなわち自然界に天然に存在せず、遺伝子操作又はランダム突然変異誘発によって得られるエンドヌクレアーゼである。本発明による変異型エンドヌクレアーゼは例えば、野生型、天然のエンドヌクレアーゼのアミノ酸配列の少なくとも１つの残基を異なるアミノ酸で置換することによって得ることができる。上記置換（複数も可）は、例えば部位特異的突然変異誘発及び／又はランダム突然変異誘発によって導入することができる。本発明の枠組みにおいて、かかる変異型エンドヌクレアーゼは機能的なままである、すなわち標的配列を認識し、特異的に切断する能力を保持する。
【００３１】
本発明による変異型エンドヌクレアーゼは、対応する野生型エンドヌクレアーゼの標的配列とは異なる標的配列を切断する。例えば、変異型Ｉ−ＣｒｅＩエンドヌクレアーゼの標的配列は、配列番号４の配列とは異なる。新規の特異性を有するかかる変異型エンドヌクレアーゼを得る方法は、当該技術分野で既知である。
【００３２】
本発明は、新規の特異性を有するかかる変異型エンドヌクレアーゼを、細胞、組織又は個体のゲノムの「セーフハーバー」遺伝子座に遺伝子を挿入するために使用することができるという発見に基づく。
【００３３】
本明細書中で使用される場合、「遺伝子座」という用語は、染色体上のＤＮＡ配列（例えば遺伝子）の特定の物理的な位置である。本明細書中で使用される場合、「遺伝子座」という用語は、通常は染色体上のエンドヌクレアーゼの標的配列の特定の物理的な位置を指す。本発明によるエンドヌクレアーゼによって認識され切断される標的配列を含むかかる遺伝子座は、「本発明による遺伝子座」と称される。
【００３４】
理想的には、セーフハーバー遺伝子座への挿入は、他の遺伝子の発現に対して影響を有しないものとする。これらの特性の試験は多工程プロセスであり、最初に候補セーフハーバー遺伝子座のプレスクリーニングをバイオインフォマティクス手段により行うことが望ましい。このため、標的化挿入が挿入突然変異誘発をもたらす可能性が低い遺伝子座を最初に同定することができる。
【００３５】
本発明による遺伝子座の主要な特徴の１つは、（ｉ）遺伝子療法の臨床試験において患者に由来する細胞でレトロウイルス挿入が観察された領域中に位置すること、及び（ｉｉ）上記レトロウイルス挿入が、がん又は異常細胞増殖と関連しなかったことである。
【００３６】
実際には、本発明によるセーフハーバー遺伝子座を同定する一方法は、先の遺伝子療法試験によって生成したデータを使用することである。Ｘ−ＳＣＩＤ試験では、ＬＭＯ２遺伝子及びＣＣＮＤ２遺伝子の隣のレトロウイルスベクター媒介導入遺伝子の挿入が、白血病と関連することが示されている。患者におけるベクター挿入の追跡調査から、この挿入を保有する細胞の数が数年の経過後に他の修飾細胞の数を上回ることが明らかに実証されている（非特許文献３１、Deichmann et al. J. of Clin. Invest. 2007 117:2225-32、Cavazzana-Calvo et al. Blood 2007 109:4575-4581）。別の臨床試験では、幾つかの遺伝子座における挿入が、２人の患者において高い増殖速度を引き起こすことが見出された（Ott et al. Nat Med 2006 12:401-9）。これらの症例においては、増殖はＭＤＳ１−ＥＶＩ１遺伝子、ＰＲＤＭ１６遺伝子又はＳＥＴＢＰ１遺伝子の挿入活性化の結果のようであった。悪性腫瘍は当初観察されなかったが、ＥＶＩＩ活性化は最終的に両方の患者において骨髄異形成をもたらした（Stein et al., Nat. Med 2010 16: 198-205）。より一般的には、非発がん性であっても、挿入断片の近くにある遺伝子の活性化から生じる細胞増殖が悪性腫瘍に向かう第一段階を示し、したがって安全性に関する潜在的な問題を招く可能性がある。ウイルスベクター組込みのパターン及び形質転換細胞の運命に対するその潜在的な結果をよりよく理解するために、遺伝子療法試験の患者においてレトロウイルス挿入部位（ＲＩＳ）の大規模研究が幾つか行われている（Mavilio et al., Nat Med 2006:1397-1402、Recchia et al. PNAS 2006:1457-62、Aiuti, et al. J Clin Invest 2007:2233-40、Schwarzwaelder et al. J Clin Invest 2007:2241-9、Deichmann et al. J Clin Invest 2007:2225-32）。白血病又は異常細胞増殖と関連しないＲＩＳはセーフハーバーとみなすことができる。したがって、本発明による遺伝子座は、臨床試験において同定されたＲＩＳと重複するか又はその近くにあり、それにも関わらず、がん又は異常細胞増殖と関連しないことが好ましい。
【００３７】
より具体的には、本発明による遺伝子座は、がんとも異常細胞増殖とも関連しないレトロウイルス挿入部位（ＲＩＳ）から最大で２００ｋｂ、１８０ｋｂ、１５０ｋｂ、１００ｋｂ又は５０ｋｂ離れて位置する標的配列を含む遺伝子座と定義される。かかる遺伝子座は、本発明による「セーフハーバー」遺伝子座（又は本発明による遺伝子座）、すなわち導入遺伝子の挿入に安全な遺伝子座と称される。
【００３８】
「レトロウイルス挿入部位」（ＲＩＳ）とは、レトロウイルスベクターを用いた遺伝子療法によって治療される患者に由来する細胞において上記レトロウイルスベクターの挿入部位として同定されたゲノム部位を意味する。かかるＲＩＳは当該技術分野で既知である。ＲＩＳとしては、Schwarzwaelder et al.（J. Clin. Invest. 2007 117:2241）、Deichmann et al.（J. of Clin. Invest. 2007 117:2225）、Aiuti et al.（J. Clin. Invest. 2007 117:2233）、Recchia et al.（PNAS 2006 103:1457）及びMavilio et al.（Nature Medicine 12:1397, 2006）に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３９】
「レトロウイルスベクター」とは、レトロウイルス科のウイルスに由来する任意のベクターを意味する。
【００４０】
本発明によるＲＩＳは、がんとも異常細胞増殖とも関連しない。白血病又は異常細胞増殖と関連することが知られるＲＩＳは当該技術分野で既知であり、当業者であれば容易に除外することができる。白血病又は異常細胞増殖と関連することが知られるかかるＲＩＳとしては、例えばＬＭＯ２遺伝子、ＣＣＮＤ２遺伝子、ＭＤＳ１−ＥＶＩ１遺伝子、ＰＲＤＭ１６遺伝子及びＳＥＴＢＰ１遺伝子の隣の挿入部位が挙げられる。
【００４１】
本発明によるより好ましい実施形態では、セーフハーバー遺伝子座を規定するために使用されるＲＩＳは、形質導入細胞が幹細胞である臨床試験において同定されている。ＲＩＳはこのように、幹細胞の形質導入による遺伝子療法によって治療される患者に由来する細胞において同定されている可能性がある。
【００４２】
本発明による別の最も好ましい実施形態では、セーフハーバー遺伝子座を規定するために使用するＲＩＳは、形質導入細胞が造血幹細胞（ＨＳＣ）であるＳＣＩＤ患者の臨床試験において同定されている。ＲＩＳはこのように、造血幹細胞の形質導入による遺伝子療法によって治療される患者に由来する細胞において同定されている可能性がある。
【００４３】
さらに、本発明によるＲＩＳを既定するためのより厳しい基準を使用することができる。
【００４４】
ＲＩＳの中でも、共通組込み部位（ＣＩＳ）は、ＲＩＳの統計的過剰出現が挿入時の細胞の高い増殖速度の結果であると解釈され得る遺伝子座である（Mikkers et al., 2003, Nat. Genet. 32:153、Lund et al., 2002, Nat. Genet 32 :160、Hemati et al. 2004, PLOS Biol. 2:e423、Suzuki et al., 2002, Nat. Genet. 32:166-174、Deichman et al. J. of Clin. Invest. 2007 117:2225-32）。例えば、Deichman et al.（J. of Clin. Invest. 2007 117:2225-32）は、遺伝子療法によって治療した９人のＸ−ＳＣＩＤ患者に由来するＲＩＳに関する調査を行い、ヒトゲノムに明白にマップすることができる５７２個の独自のＲＩＳを見出した。それらの中でも、Deichman et al.は２次、３次、４次、５次及びより高次のＣＩＳを規定した。２次のＣＩＳは、３０ｋｂ距離内での２個のレトロウイルス挿入の発生によって規定され、３次、４次及び５次のＣＩＳは、それぞれ５０ｋｂ、１００ｋｂ又は２００ｋｂ内での３つ、４つ又は５つの挿入の発生によって規定された。ＲＩＳのランダム分布で期待される値の３３倍である、１２２個のＲＩＳが４７個の異なるＣＩＳ遺伝子座において発見された。１１個のＣＩＳが、ＺＮＦ２１７、ＶＡＶ−３、ＣＣＮＤ２、ＬＭＯ２、ＭＤＳ１、ＢＣＬ２Ｌ１、ＮＯＴＣＨ２、ＳＯＣＳ２、ＲＵＮＸ１、ＲＵＮＸ３及びＳＥＰＴ６を含むがん原遺伝子の隣に局在することが見出された。
【００４５】
最大の安全性を確保するために、ＣＩＳ内に位置するＲＩＳを回避することが好ましい場合がある。したがって、本発明による好ましい実施形態では、本発明による標的配列はＣＩＳに位置しない。加えて、上記標的配列又は遺伝子座は、共通組込み部位（ＣＩＳ）の一部であるＲＩＳから少なくとも５０ｋｂ、１００ｋｂ又は２００ｋｂ離れて位置するのが好ましい。
【００４６】
「共通組込み部位」（ＣＩＳ）とは、臨床試験において同定されたＲＩＳが大きな比率を占める（挿入のランダム分布を仮定する）３０ｋｂ、５０ｋｂ、１００ｋｂ又は２００ｋｂのゲノム領域を意味する。かかるＣＩＳは当該技術分野で既知であり、Schwarzwaelder et al.（J. Clin. Invest. 2007 117:2241）、Deichmann et al.（J. of Clin. Invest. 2007 117:2225）、Aiuti et al.（J. Clin. Invest. 2007 117:2233）、Recchia et al.（PNAS 2006 103:1457）、Mavilio et al.（Nature Medicine 12:1397, 2006）及びGabriel et al.（Nat. Med. 2009 15(12):143）に記載されている。
【００４７】
ＲＩＳの近くであることに加えて、本発明による遺伝子座への標的化組込みは、標的化細胞における必須機能の破壊をもたらさないものとする。
【００４８】
したがって、本発明による具体的な実施形態では、本発明による遺伝子座への挿入は、好ましくは標的配列の近傍に位置する遺伝子、例えば最近接遺伝子の発現を実質的に変更しない。
【００４９】
加えて、別の具体的な実施形態では、上記遺伝子座への遺伝要素の挿入は、好ましくは上記細胞、組織又は個体の表現型（遺伝要素の発現による表現型を除く）を実質的に変更しない。「表現型」とは、細胞、組織又は個体の目に見える形質を意味する。表現型としては、例えば生存能力、細胞増殖及び／又は成長速度が挙げられる。当業者であれば、例えば隣接遺伝子の発現パターンを分析すること、トランスクリプトームのマイクロアレイ研究を行うこと、並びに／又は増殖及び／若しくは（もしあれば）分化異常を特性評価することによって、遺伝子座が本発明によるセーフハーバー遺伝子座であるかを容易に検証することができる。
【００５０】
また別の具体的な実施形態では、本発明による遺伝子座は任意の遺伝子を含まない。任意の遺伝子を含まない遺伝子座とは、任意の参照された又は既知の遺伝子を含まない遺伝子座を指す。言い換えると、かかる遺伝子座は、米国国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のウェブサイト上で入手可能なもののような配列データベースによる任意の既知の遺伝子を含まない。したがって、本発明による標的配列及び／又は本発明による遺伝子座は、最近接遺伝子から少なくとも１ｋｂ、５ｋｂ、１０ｋｂ、２５ｋｂ、５０ｋｂ、１００ｋｂ、１８０ｋｂ、２００ｋｂ、２５０ｋｂ、３００ｋｂ、４００ｋｂ又は５００ｋｂ離れて有利に位置することができる。
【００５１】
「遺伝子」とは、特定のタンパク質又はタンパク質の一部をコードする、染色体に沿って線状に配列したＤＮＡの一部からなる遺伝の基本単位を意味する。遺伝子は通常、プロモーター、５’非翻訳領域、１つ又は複数のコード配列（エクソン）、任意にイントロン、３’非翻訳領域を含む。遺伝子はターミネーター、エンハンサー及び／又はサイレンサーを更に含み得る。
【００５２】
「最近接遺伝子」とは、それぞれ標的配列の最も近くに、標的配列に対してセントロメリックに（centromeric）及びテロメリックに（telomeric）位置する１つ、２つ又は３つの遺伝子を意味する。
【００５３】
好ましい実施形態では、本発明による遺伝子座は、導入遺伝子の安定な発現を更に可能にする。
【００５４】
別の好ましい実施形態では、本発明による標的配列は、上記細胞、組織又は個体のゲノム内に１回しか存在しない。
【００５５】
本発明によるかかるセーフハーバー遺伝子座を選択した後、（ｉ）例えば実施例１、実施例２及び実施例５に記載のように、上記遺伝子座内に位置する標的配列を特異的に認識し切断する変異型エンドヌクレアーゼを構築するか、又は（ｉｉ）既知の野生型エンドヌクレアーゼが、上記遺伝子座内に位置する標的配列を切断することが可能か否かを決定することができる。代替的には、本発明によるセーフハーバー遺伝子座を選択した後、当業者は、既知の野生型エンドヌクレアーゼ又は変異型エンドヌクレアーゼによって認識され切断される標的配列をそれに挿入することができる。
【００５６】
したがって、本発明は、個体のゲノムへの導入遺伝子の挿入に好適なエンドヌクレアーゼを得る方法であって、
ａ）上記個体のゲノム内で、がんとも異常細胞増殖とも関連しないレトロウイルス挿入部位（ＲＩＳ）を選択及び／又は同定する工程と、
ｂ）上記ＲＩＳの２００ｋｂ上流及び２００ｋｂ下流に伸びるゲノム領域を規定する工程と、
ｃ）上記ゲノム領域内に位置する標的配列を切断することが可能な野生型エンドヌクレアーゼを同定するか、又は変異型エンドヌクレアーゼを構築する工程と、
を含む、個体のゲノムへの導入遺伝子の挿入に好適なエンドヌクレアーゼを得る方法に関する。
【００５７】
かかるエンドヌクレアーゼは、例えば（ｉ）最近接遺伝子の発現、並びに／又は（ｉｉ）細胞、組織若しくは個体の細胞増殖及び／若しくは成長速度を実質的に変更することなく、細胞、組織又は個体のゲノムに導入遺伝子を安全に挿入することを可能にする。
【００５８】
本発明による遺伝子座に関連して上で提示する全ての基準は、当然ながら上記の方法を行う場合に適用することができる。例えば、ＣＩＳの一部であるＲＩＳを除外してもよく、並びに／又は工程（ｂ）で規定されるゲノム領域が上記ＲＩＳの５０ｋｂ上流及び５０ｋｂ下流にしか伸びなくてもよく、並びに／又は標的配列を含む遺伝子座が任意の遺伝子を含まなくてもよい。
【００５９】
本発明による遺伝子座は例えば、下記表Ａ〜表Ｃに記載のＳＨ３遺伝子座、ＳＨ４遺伝子座、ＳＨ６遺伝子座、ＳＨ１２遺伝子座、ＳＨ１３遺伝子座、ＳＨ１９遺伝子座、ＳＨ２０遺伝子座、ＳＨ２１遺伝子座、ＳＨ３３遺伝子座、ＳＨ７遺伝子座又はＳＨ８遺伝子座のいずれか１つに相当し得る。
【００６０】
表Ａは、ヒトゲノム内の遺伝子座の位置、遺伝子座内に含まれる標的配列、最も近いＲＩＳの位置及びＲＩＳを記載する刊行物への参照、及び遺伝子座を切断する本発明によるエンドヌクレアーゼの例を提示する。
【００６１】
表Ｂは、本発明による遺伝子座のすぐ上流（５’側）及び下流（３’側）に位置する最近接遺伝子に関する情報を提示する。距離とは、標的配列と遺伝子の最も近いコード配列との距離を示す。
【００６２】
表Ｃ及び表Ｄは、表Ｂと同様であるが、第２の最近接遺伝子及び第３の最近接遺伝子についての情報をそれぞれ提示する。
【００６３】
表Ａ’、表Ｂ’、表Ｃ’及び表Ｄ’は、一部の遺伝子座、すなわちＳＨ３、ＳＨ４、ＳＨ６、ＳＨ８及びＳＨ１９、並びに関連するこれらの遺伝子座内の標的配列の例についての表Ａ、表Ｂ、表Ｃ及び表Ｄと同様の最新情報をそれぞれ提示する。最新の局在情報は、ヒトゲノムアセンブリのＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９バージョンを参照することによって与えられる。
【００６４】
本発明による遺伝子座は、下記表Ａ’’〜表Ｄ’’に記載のＳＨ１８、ＳＨ３１、ＳＨ３８、ＳＨ３９、ＳＨ４１、ＳＨ４２、ＳＨ４３、ＳＨ４４、ＳＨ４５、ＳＨ４６、ＳＨ４７、ＳＨ４８、ＳＨ４９、ＳＨ５０、ＳＨ５１、ＳＨ５２、ＳＨ７０、ＳＨ７１、ＳＨ７２、ＳＨ７３、ＳＨ７４及びＳＨ７５のいずれか１つにも相当し得る。
【００６５】
表Ａ’’は、ヒトゲノム内の遺伝子座の位置、遺伝子座内に含まれる標的配列、最も近いＲＩＳの位置及びＲＩＳを記載する刊行物への参照、上記標的と最も近いＲＩＳとの距離、及び遺伝子座を切断する本発明によるエンドヌクレアーゼの例を提示する。
【００６６】
表Ｂ’’は、本発明による遺伝子座のすぐ上流（５’側）及び下流（３’側）に位置する最近接遺伝子に関する情報を提示する。距離とは、標的配列と遺伝子の最も近いコード配列との距離を示す。
【００６７】
表Ｃ’’及び表Ｄ’’は、表Ｂ’’と同様であるが、第２の最近接遺伝子及び第３の最近接遺伝子についての情報をそれぞれ提示する。
【００６８】
遺伝子座の位置、この遺伝子座における標的及び遺伝子は、ヒトゲノムアセンブリのＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９バージョンに従って与えられる。
【００６９】
【表１】

【００７０】
【表２】

【００７１】
【表３−１】

【表３−２】

【００７２】
【表４】

【００７３】
【表５】

【００７４】
【表６】

【００７５】
【表７】

【００７６】
【表８】

【００７７】
【表９】

【００７８】
【表１０】

【００７９】
【表１１】

【００８０】
【表１２】

【００８１】
本発明による遺伝子座は、下記表Ｅ及び表Ｆに記載のＳＨ１０１、ＳＨ１０６、ＳＨ１０７、ＳＨ１０２、ＳＨ１０５、ＳＨ１０３、ＳＨ１０４、ＳＨ１１３、ＳＨ１０９、ＳＨ１１２、ＳＨ１０８、ＳＨ１１０、ＳＨ１１４、ＳＨ１１６、ＳＨ１１１、ＳＨ１１５、ＳＨ１２１、ＳＨ１２０、ＳＨ１２２、ＳＨ１１７、ＳＨ１１８、ＳＨ１１９、ＳＨ１２３、ＳＨ１２６、ＳＨ１２８、ＳＨ１２９、ＳＨ１２４、ＳＨ１３１、ＳＨ１２５、ＳＨ１２７及びＳＨ１３０のいずれか１つにも相当し得る。
【００８２】
表Ｅは、ヒトゲノム内の遺伝子座の位置、遺伝子座内に含まれる標的配列、最も近いＲＩＳの位置及びＲＩＳを記載する刊行物への参照、上記標的と最も近いＲＩＳとの距離、及び遺伝子座を切断する本発明によるエンドヌクレアーゼの例を提示する。
【００８３】
表Ｆは、本発明による遺伝子座のすぐ上流（５’側）及び下流（３’側）に位置する最近接遺伝子に関する情報を提示する。距離とは、標的配列と遺伝子の最も近いコード配列との距離を示す。
【００８４】
表Ｅ及び表Ｆにおいて、遺伝子座の位置、この遺伝子座における標的及び遺伝子は、ヒトゲノムアセンブリのＧＲＣｈ３６．３／ｈｇ１９バージョンに従って与えられる。
【００８５】
【表１３−１】

【表１３−２】

【００８６】
【表１４】

【００８７】
本発明による遺伝子座は、下記表Ｇに記載のＳＨ１２５、ＳＨ１２７、ＳＨ１３０、ＳＨ１０２、ＳＨ１０５、ＳＨ１０３、ＳＨ１０４、ＳＨ１１７、ＳＨ１１８、ＳＨ１１９及びＳＨ１２３のいずれか１つにも相当し得る。
【００８８】
表Ｇは、言及した遺伝子のイントロン内に位置する標的配列の例及び該イントロン遺伝子座を切断する本発明によるエンドヌクレアーゼの例を提示する。
【００８９】
【表１５】

【００９０】
本発明による遺伝子座は、下記表Ｈに記載のＳＨ１１、ＳＨ１２、ＳＨ１３、ＳＨ１７、ＳＨ１９、ＳＨ２０、ＳＨ２１、ＳＨ２３、ＳＨ３３、ＳＨ３４、ＳＨ４０、ＳＨ５３、ＳＨ５４、ＳＨ５５、ＳＨ５６、ＳＨ５７、ＳＨ５８、ＳＨ５９、ＳＨ６０、ＳＨ６１、ＳＨ６２、ＳＨ６５、ＳＨ６７、ＳＨ６８及びＳＨ６９のいずれか１つも含有し得る。
【００９１】
表Ｈは、これらの遺伝子座内に含まれる標的配列及びこれらの標的配列を切断する本発明によるエンドヌクレアーゼの例を提示する。
【００９２】
【表１６】

【００９３】
具体的な実施形態では、本発明による遺伝子座はＳＨ３遺伝子座である。「ＳＨ３遺伝子座」という用語は、リンパ球抗原８６をコードする遺伝子に対して約１２０ｋｂセントロメリックに位置するヒト染色体６の領域（例えば、染色体６の６４３０Ｋ〜７２３０Ｋ領域を示す、ワールドワイドウェブサイトncbi.nlm.nih.gov/projects/mapview/maps.cgi?TAXID=9606&CHR=6&MAPS=ideogr%2Ccntg-r%2CugHs%2Cgenes&BEG=6432845&END=7232845&thmb=onを参照されたい）及び他の種における相同領域を指す。より正確には、ＳＨ３遺伝子座は、ＮＣ＿０００００６．１１に示される配列の６８５０５１０位から６８５３６７７位に伸びる。これは配列番号５４の配列を含む。
【００９４】
別の具体的な実施形態では、本発明による遺伝子座はＳＨ４遺伝子座である。ＳＨ４遺伝子座は、本明細書ではＭｙｏＤファミリー阻害剤ドメイン含有遺伝子座（ＭＤＦＩＣ）に対して約３２０ｋｂテロメリックに位置するヒト染色体７の領域として、又は別の種における相同領域として規定される（例えば、染色体７の１１４６６０Ｋ〜１１５６６０Ｋ領域を示す、ワールドワイドウェブサイトncbi.nlm.nih.gov/projects/mapview/maps.cgi?TAXID=9606&CHR=7&MAPS=ideogr,cntg-r,ugHs,genes[113908811.00%3A114908811.00]&CMD=DNを参照されたい）。より正確には、ＳＨ４遺伝子座は、ＮＣ＿０００００７．１３に示される配列の１１４９７２７５１位から１１４９７６３８０位に伸びる。これは配列番号５５の配列を含む。
【００９５】
本明細書中で使用される場合、「導入遺伝子」という用語は、ポリペプチドをコードする配列を指す。好ましくは、導入遺伝子によってコードされるポリペプチドは、導入遺伝子が挿入される細胞、組織又は個体において発現されないか、又は発現されるが生物学的に活性ではない。最も好ましくは、導入遺伝子は、個体の治療に有用な治療用ポリペプチドをコードする。
【００９６】
本発明の枠組みにおいて、個体はヒト又は非ヒト動物であり得る。個体は好ましくはヒトである。代替的に、個体は非ヒト動物、好ましくは脊椎動物、及び／又は例えばマウス、ラット、ウサギ、チャイニーズハムスター、モルモット若しくはサル等の哺乳動物であってもよい。本発明による細胞及び組織は好ましくは、かかるヒト又は非ヒト動物に由来する。
【００９７】
Ｉ−ＣｒｅＩに由来する本発明によるエンドヌクレアーゼ
本発明による変異型エンドヌクレアーゼは、例えば、
各々が配列番号１の配列若しくはＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０５７２５に示される配列を含む２つの単量体を含むホモ二量体タンパク質である野生型Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼ、又は
各々が配列番号４２の配列を含む２つの単量体を含むＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼ
のいずれかに由来し得る。野生型標的配列を認識するかかるＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼは、新規の特異性を有するエンドヌクレアーゼの改変に好適であることが示されている。
【００９８】
したがって、本発明は、セーフハーバー遺伝子座内に位置する標的配列を切断することが可能である、各々が配列番号１又は配列番号４２と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一な配列を含むか又はそれらからなる２つの単量体を含むか又はそれらからなる二量体Ｉ−ＣｒｅＩタンパク質に関する。
【００９９】
好ましくは、標的配列は配列番号４の配列を含みも、それらからなりもしない。
【０１００】
最も好ましくは、本発明による二量体Ｉ−ＣｒｅＩタンパク質はヘテロ二量体タンパク質である。
【０１０１】
本発明のクエリー配列と少なくとも例えば９５％「同一な」配列を有するタンパク質とは、タンパク質の配列が、クエリー配列の１００個のアミノ酸当たり最大で５個のヌクレオチド突然変異を含み得る以外はクエリー配列と同一であることを意図する。言い換えると、クエリー配列と少なくとも９５％同一な配列を有するタンパク質を得るには、最大で配列の５％（１００個のうち５個）のアミノ酸が挿入されているか、欠失しているか、又は別のヌクレオチドで置き換えられていてもよい。２つの配列の最適アラインメント（ギャップを含む）をそれらの全長を考慮して見出すために、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈグローバルアライメントアルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970 J. Mol. Biol. 48:443-453）を使用する「ｎｅｅｄｌｅ」プログラムを例えば使用することができる。ｎｅｅｄｌｅプログラムは、例えばebi.ac.ukワールドワイドウェブサイト上で入手可能である。本発明に従う同一性のパーセンテージはこのように、「Ｇａｐ Ｏｐｅｎ」パラメータが１０．０に等しく、「Ｇａｐ Ｅｘｔｅｎｄ」パラメータが０．５に等しいＥＭＢＯＳＳ：：ｎｅｅｄｌｅ（グローバル）プログラム及びＢｌｏｓｕｍ６２マトリックスを用いて算出することができる。
【０１０２】
本発明による二量体Ｉ−ＣｒｅＩタンパク質の各々の単量体は例えば、野生型単量体の配列（配列番号１）又は配列番号４２の単量体の配列と比較して少なくとも、多くとも又は約２個、５個、８個、１０個、１２個、１５個、１８個、２０個又は２５個の突然変異を含み得る。言い換えると、本発明による単量体は、配列番号１又は配列番号４２と少なくとも、多くとも又は約２個、５個、８個、１０個、１２個、１５個、１８個、２０個、２５個又は３０個の突然変異によって異なる配列を含む。
【０１０３】
本発明の枠組みにおいて、突然変異は、好ましくは１つのアミノ酸の別のアミノ酸による置換に相当する。したがって、本発明による好ましい実施形態は、配列番号１又は配列番号４２とアミノ酸置換の存在によってのみ異なる、配列番号１又は配列番号４２と少なくとも８０％同一な配列を含む２つの単量体を含むか又はそれらからなる二量体Ｉ−ＣｒｅＩタンパク質に関する。
【０１０４】
本発明による二量体Ｉ−ＣｒｅＩタンパク質の単量体は、好ましくは配列番号４２の配列を含むか又はそれからなる単量体に由来する。
【０１０５】
突然変異は、好ましくは標的配列の認識に関与するＩ−ＣｒｅＩ配列の位置に位置する。実際に、かかる突然変異の導入は、新規の特異性を有するメガヌクレアーゼの設計を可能にする。
【０１０６】
かかる突然変異に加えて、単量体は以下のものに相当する突然変異も有し得る：
標的部位に対するタンパク質の結合特性及び／又は切断特性を改善する突然変異、例えばＧ１９Ｓ、Ｇ１９Ａ、Ｆ５４Ｌ、Ｓ７９Ｇ、Ｅ８０Ｋ、Ｆ８７Ｌ、Ｖ１０５Ａ及び／又はＩ１３２Ｖ等（例えば国際公開第２００８／１５２５２４号を参照されたい）；及び／又は
偏性ヘテロ二量体（例えば、国際公開第２００８／０９３２４９号及びFajardo-Sanchez et al., Nucleic Acids Res. 2008 36:2163-73を参照されたい）の獲得をもたらす突然変異；及び／又は
融合タンパク質の生成に好適な突然変異、例えば融合タンパク質のＣ末端単量体における配列番号１の５個の主要なＮ末端アミノ酸残基の欠失等；及び／又は
配列番号４２の単量体の場合と同様に、配列番号１の１番目及び２番目の残基の間のアラニンの挿入からなる突然変異。
【０１０７】
配列番号１又は配列番号４２に相同な配列に加えて、本発明によるタンパク質の単量体は、配列のＮＨ₂末端及び／又はＣＯＯＨ末端で付加された１つ又は複数のアミノ酸、例えばタンパク質、プロペプチド及び／又は核局在化シグナルの精製に有用なタグを含み得る。特に、本発明によるタンパク質の単量体は、配列番号４２の単量体の場合と同様、配列番号１の配列のＣＯＯＨ末端で付加されたＡＡＤアミノ酸を含み得る。
【０１０８】
本明細書において、突然変異は、配列番号１上の位置に続く、配列番号１のその位置に位置するアミノ酸を置き換えるアミノ酸の性質で示される。例えば、４４Ａ突然変異を含む単量体は、配列番号１の４４位のアミノ酸（すなわちグルタミン、Ｑ）がアラニン（Ａ）で置き換えられたＩ−ＣｒｅＩ単量体を指す。このため、この単量体は、配列番号１の野生型Ｉ−ＣｒｅＩ単量体と、少なくともアミノ酸置換Ｑ４４Ａによって異なる。上で説明したように、配列番号４２のＩ−ＣｒｅＩ単量体は、配列番号１のＩ−ＣｒｅＩ単量体と比較して幾つかの更なるアミノ酸残基を含む（図１１を参照されたい）。したがって、配列番号４２上では、４４Ａ突然変異はアラニンによる配列番号４２の４５位のグルタミンの置き換えに相当する。
【０１０９】
説明のために、４４Ａ ５４Ｌ ６４Ａ ７０Ｑ ７５Ｎ １５８Ｒ １６２Ａ突然変異を含む単量体は例えば、配列番号５７の配列（この単量体が配列番号１のＩ−ＣｒｅＩ単量体に直接由来する場合）又は配列番号５８の配列（この単量体が配列番号４２のＩ−ＣｒｅＩ単量体に直接由来する場合）を有し得る。図１２は２つのかかる単量体間のアラインメントを示し、これらの単量体上の４４Ａ ５４Ｌ ６４Ａ ７０Ｑ ７５Ｎ １５８Ｒ及び１６２Ａ突然変異の位置を示す。
【０１１０】
ＳＨ３遺伝子座、ＳＨ４遺伝子座又はＳＨ６遺伝子座に位置する標的配列を切断することが可能な本発明による二量体Ｉ−ＣｒｅＩタンパク質の例を、下記に更に記載する。
【０１１１】
ＳＨ３遺伝子座を切断することが可能な本発明による二量体Ｉ−ＣｒｅＩタンパク質
好ましい実施形態では、標的配列はＳＨ３遺伝子座（上で規定される）内に位置する。ＳＨ３内に位置する標的配列は例えば、配列番号２又は配列番号２のヌクレオチド２〜２３を含むか又はそれらからなっていてもよい。実施例１は、かかる標的配列を切断することが可能な本発明によるヘテロ二量体Ｉ−ＣｒｅＩタンパク質の幾つかの例を開示する。加えて、他のかかるタンパク質を構築する方法は当該技術分野で既知であり、例えばＰＣＴ出願の国際公開第２００６／０９７７８４号、国際公開第２００６／０９７８５３号及び国際公開第２００９０１９６１４号、並びに非特許文献６に記載されているものが挙げられる。
【０１１２】
かかる二量体タンパク質の単量体は好ましくは、配列番号１の４位、２４位、２６位、２８位、３０位、３２位、３３位、３８位、４４位、５０位、５４位、５７位、６４位、６６位、７０位、７１位、７５位、７７位、８１位、８６位、９２位、１０５位、１４２位、１５１位、１５４位、１５８位及び１６２位、好ましくは配列番号１の４位、３０位、３８位、４４位、５０位、５４位、５７位、６４位、６６位、７０位、７１位、７５位、７７位、８１位、８６位、９２位、１０５位、１４２位、１５１位、１５４位、１５８位及び１６２位からなる群から選択される位置に位置する少なくとも１つ、好ましくは少なくとも３つ、４つ、５つ又は６つのアミノ酸置換を含む。該置換は、例えば以下の置換から選択され得る：４Ｅ、３０Ｇ、３８Ｒ、４４Ａ、５０Ｒ、５４Ｌ、５７Ｅ、６４Ａ、６６Ｃ、７０Ｑ、７０Ｄ、７１Ｒ、７５Ｎ、７５Ｙ、７７Ｖ、８１Ｔ、８６Ｄ、９２Ｒ、１０５Ａ、１４２Ｒ、１５１Ａ、１５４Ｇ、１５８Ｒ、１５８Ｗ及び１６２Ａ。二量体タンパク質は任意に１位に突然変異を含んでいてもよいが、かかる突然変異は切断活性又は切断特異性に影響を有しない。
【０１１３】
かかる二量体Ｉ−ＣｒｅＩタンパク質は、例えば以下のものを含むか又はそれらからなっていてもよい：
配列番号１と比較して、配列番号１の３０位、３８位、５０位、７０位、７５位、８１位、８６位、１４２位及び１５４位からなる群から選択される位置に位置する少なくとも１つのアミノ酸置換を含む第１の単量体。好ましくは、該第１の単量体は、配列番号１の３０位、３８位、７０位及び７５位に置換を含む。最も好ましくは、該置換は以下の置換から選択される：３０Ｇ、３８Ｒ、５０Ｒ、７０Ｄ、７５Ｎ、８１Ｔ、８６Ｄ、１４２Ｒ及び１５４Ｇ。かかる単量体は例えば、配列番号１と比較して少なくとも４個、５個若しくは６個の突然変異、及び／又は配列番号１と比較して最大で４個、５個、６個、８個、１０個、１２個若しくは１５個のアミノ酸突然変異を含み得る；及び
配列番号１と比較して、配列番号１の４位、４４位、５４位、５７位、６４位、６６位、７０位、７１位、７５位、７７位、９２位、１０５位、１５１位、１５８位及び１６２位からなる群から選択される位置に位置する少なくとも１つのアミノ酸置換を含む第２の単量体。好ましくは、該第２の単量体は、配列番号１の４４位、５４位、７０位及び７５位に置換を含む。最も好ましくは、該置換は以下の置換から選択される：４Ｅ、４４Ａ、５４Ｌ、５７Ｅ、６４Ａ、６６Ｃ、７０Ｑ、７１Ｒ、７５Ｎ、７５Ｙ、７７Ｖ、９２Ｒ、１０５Ａ、１５１Ａ １５８Ｒ、１５８Ｗ及び１６２Ａ。かかる単量体は例えば、配列番号１と比較して少なくとも４個、５個若しくは６個の突然変異、及び／又は配列番号１と比較して最大で４個、６個、８個、１０個、１２個又は１５個のアミノ酸突然変異を含み得る。
【０１１４】
具体的な実施形態では、本発明による二量体Ｉ−ＣｒｅＩタンパク質は、
ａ）３０Ｇ ３８Ｒ ７０Ｄ ７５Ｎ ８６Ｄ突然変異を含む第１の単量体、
ｂ）
ｉ．４４Ａ ５４Ｌ ６４Ａ ７０Ｑ ７５Ｎ １５８Ｒ １６２Ａ突然変異を含む単量体、
ｉｉ．４４Ａ ５４Ｌ ７０Ｑ ７５Ｙ ９２Ｒ １５８Ｒ １６２Ａ突然変異を含む単量体、
ｉｉｉ．４Ｅ ４４Ａ ５４Ｌ ６４Ａ ７０Ｑ ７５Ｎ １５８Ｒ １６２Ａ突然変異を含む単量体、
ｉｖ．４４Ａ ５４Ｌ ６４Ａ ７０Ｑ ７５Ｎ １５８Ｗ １６２Ａ突然変異を含む単量体、
ｖ．４４Ａ ５４Ｌ ７０Ｑ ７５Ｎ突然変異を含む単量体、
ｖｉ．４４Ａ ５４Ｌ ５７Ｅ ７０Ｑ ７５Ｎ １５８Ｒ １６２Ａ突然変異を含む単量体、及び
ｖｉｉ．４４Ｖ ５４Ｌ ７０Ｑ ７５Ｎ ７７Ｖ突然変異を含む単量体からなる群から選択される第２の単量体、
を含むか又はそれらからなる。
【０１１５】
別の具体的な実施形態では、本発明による二量体Ｉ−ＣｒｅＩタンパク質は、
ａ）３０Ｇ ３８Ｒ ７０Ｄ ７５Ｎ ８１Ｔ １５４Ｇ突然変異を含む第１の単量体、
ｂ）
ｉ．４４Ａ ５４Ｌ ７０Ｑ ７５Ｎ １０５Ａ １５８Ｒ １６２Ａ突然変異を含む単量体、
ｉｉ．４４Ａ ５４Ｌ ６４Ａ ７０Ｑ ７５Ｎ １５８Ｒ １６２Ａ突然変異を含む単量体、
ｉｉｉ．４Ｅ ４４Ａ ５４Ｌ ６４Ａ ７０Ｑ ７５Ｎ １５８Ｒ １６２Ａ突然変異を含む単量体、
ｉｖ．４４Ａ ５４Ｌ ６４Ａ ７０Ｑ ７５Ｎ １５８Ｗ １６２Ａ突然変異を含む単量体、
ｖ．４４Ａ ５４Ｌ ７０Ｑ ７５Ｎ突然変異を含む単量体、及び
ｖｉ．４４Ｖ ５４Ｌ ７０Ｑ ７５Ｎ ７７Ｖ突然変異を含む単量体からなる群から選択される第２の単量体、
を含むか又はそれらからなる。
【０１１６】
更に別の具体的な実施形態では、本発明による二量体Ｉ−ＣｒｅＩタンパク質は、
ａ）３０Ｇ ３８Ｒ ５０Ｒ ７０Ｄ ７５Ｎ １４２Ｒ突然変異を含む第１の単量体、
ｂ）
ｉ．４４Ａ ５４Ｌ ７０Ｑ ７５Ｎ １０５Ａ １５８Ｒ １６２Ａ突然変異を含む単量体、
ｉｉ．４４Ａ ５４Ｌ ６４Ａ ７０Ｑ ７５Ｎ １５８Ｒ １６２Ａ突然変異を含む単量体、
ｉｉｉ．４４Ａ ５４Ｌ ７０Ｑ ７５Ｙ ９２Ｒ １５８Ｒ １６２Ａ突然変異を含む単量体、
ｉｖ．４Ｅ ４４Ａ ５４Ｌ ６４Ａ ７０Ｑ ７５Ｎ １５８Ｒ １６２Ａ突然変異を含む単量体、
ｖ．４４Ａ ５４Ｌ ６４Ａ ７０Ｑ ７５Ｎ １５８Ｗ １６２Ａ突然変異を含む単量体、
ｖｉ．４４Ａ ５４Ｌ ６６Ｃ ７０Ｑ ７１Ｒ ７５Ｎ １５１Ａ １５８Ｒ １６２Ａ突然変異を含む単量体、
ｖｉｉ．４４Ａ ５４Ｌ ７０Ｑ ７５Ｎ突然変異を含む単量体、
ｖｉｉｉ．４４Ａ ５４Ｌ ５７Ｅ ７０Ｑ ７５Ｎ １５８Ｒ １６２Ａ突然変異を含む単量体、及び
ｉｘ．４４Ｖ ５４Ｌ ７０Ｑ ７５Ｎ ７７Ｖ突然変異を含む単量体からなる群から選択される第２の単量体、
を含むか又はそれらからなる。
【０１１７】
二量体Ｉ−ＣｒｅＩタンパク質の単量体は、例えば偏性ヘテロ二量体の獲得を可能にする更なる突然変異も含み得る。かかる突然変異は当業者に既知であり、Fajardo-Sanchez et al.（Nucleic Acids Res. 2008 36:2163-73）に記載されるものが挙げられる。
【０１１８】
具体的な実施形態では、上記の単量体は配列番号４２の単量体に直接由来し、配列番号４２の配列と指定の突然変異の存在によってのみ異なる。
【０１１９】
ＳＨ４遺伝子座を切断することが可能な本発明による二量体Ｉ−ＣｒｅＩタンパク質
好ましい実施形態では、標的配列はＳＨ４遺伝子座（上で規定される）内に位置する。ＳＨ４内に位置する標的配列は例えば、配列番号３又は配列番号３のヌクレオチド２〜２３を含むか又はそれらからなっていてもよい。実施例２は、かかる標的配列を切断することが可能な本発明による二量体Ｉ−ＣｒｅＩタンパク質の幾つかの例を開示する。
【０１２０】
かかる二量体タンパク質の単量体は好ましくは、配列番号１の２４位、４４位、６８位、７０位、７５位及び７７位からなる群から選択される位置に位置する少なくとも１つ、好ましくは少なくとも３つ、４つ、５つ又は６つのアミノ酸置換を含む。該置換は、例えば以下の置換から選択され得る：２４Ｖ、４４Ｒ、４４Ｙ、６８Ｙ、６８Ａ、７０Ｓ、７０Ｄ、７５Ｙ、７５Ｎ、７７Ｒ、７７Ｎ及び７７Ｖ。
【０１２１】
かかる二量体Ｉ−ＣｒｅＩタンパク質は、例えば以下のものを含むか又はそれらからなっていてもよい：
配列番号１と比較して、配列番号１の２４位、４４位、６８位、７０位、７５位及び７７位からなる群から選択される位置に位置する少なくとも１つのアミノ酸置換を含む第１の単量体。好ましくは、第１の単量体は、配列番号１の２４位、７０位、７５位及び７７位に置換を含む。最も好ましくは、該置換は以下の置換から選択される：２４Ｖ、４４Ｒ、６８Ｙ、６８Ａ、７０Ｄ、７０Ｓ、７５Ｙ、７５Ｎ、７７Ｎ及び７７Ｒ。かかる単量体は例えば、配列番号１と比較して少なくとも４個、５個若しくは６個の突然変異、及び／又は配列番号１と比較して最大で４個、５個、６個、８個、１０個、１２個若しくは１５個のアミノ酸突然変異を含み得る；及び
配列番号１と比較して、配列番号１の２４位、４４位、７０位及び７７位からなる群から選択される位置に位置する少なくとも１つのアミノ酸置換を含む第２の単量体。好ましくは、第２の単量体は配列番号１の２４位、４４位及び７０位に置換を含む。最も好ましくは、該置換は以下の置換から選択される：２４Ｖ、４４Ｙ、７０Ｓ及び７７Ｖ。かかる単量体は例えば、配列番号１と比較して少なくとも３個若しくは４個の突然変異、及び／又は配列番号１と比較して最大で３個、４個、６個、８個、１０個、１２個若しくは１５個のアミノ酸突然変異を含み得る。
【０１２２】
具体的な実施形態では、本発明による二量体Ｉ−ＣｒｅＩタンパク質は、
ａ）
ｉ．２４Ｖ ４４Ｒ ６８Ｙ ７０Ｓ ７５Ｙ ７７Ｎ突然変異を含む単量体、
ｉｉ．２４Ｖ ６８Ａ ７０Ｓ ７５Ｎ ７７Ｒ突然変異を含む単量体、及び
ｉｉｉ．２４Ｖ ７０Ｄ ７５Ｎ ７７Ｒ突然変異を含む単量体からなる群から選択される第１の単量体、
ｂ）
ｉ．２４Ｖ ４４Ｙ ７０Ｓ突然変異を含む単量体、及び
ｉｉ．２４Ｖ ４４Ｙ ７０Ｓ ７７Ｖ突然変異を含む単量体からなる群から選択される第２の単量体、
を含むか又はそれらからなる。
【０１２３】
二量体Ｉ−ＣｒｅＩタンパク質の単量体は、例えば偏性ヘテロ二量体の獲得を可能にする更なる突然変異も含み得る。かかる突然変異は当業者に既知であり、Fajardo-Sanchez et al.（Nucleic Acids Res. 2008 36:2163-73）に記載されるものが挙げられる。
【０１２４】
具体的な実施形態では、上記の単量体は配列番号４２の単量体に直接由来し、配列番号４２の配列と指定の突然変異の存在によってのみ異なる。
【０１２５】
ＳＨ６遺伝子座を切断することが可能な本発明による二量体Ｉ−ＣｒｅＩタンパク質
好ましい実施形態では、標的配列はＳＨ６遺伝子座（上で規定される）内に位置する。ＳＨ６内に位置する標的配列は例えば、配列番号５９又は配列番号５９のヌクレオチド２〜２３を含むか又はそれらからなっていてもよい。実施例５は、かかる標的配列を切断することが可能な本発明による二量体Ｉ−ＣｒｅＩタンパク質の幾つかの例を開示する。
【０１２６】
かかる二量体タンパク質の単量体は好ましくは、配列番号１の７位、２４位、２７位、２８位、３４位、４０位、４４位、６８位、７０位、７５位、７７位、８１位、８５位、９６位、９９位、１０３位、１０８位、１１１位、１２１位、１３２位、１４４位及び１６０位からなる群から選択される位置に位置する少なくとも１つ、好ましくは少なくとも３つ、４つ、５つ又は６つのアミノ酸置換を含む。該置換は、例えば以下の置換から選択され得る：７Ｒ、２４Ｆ、２７Ｖ、２８Ｑ、３４Ｒ、４０Ｒ、４４Ａ、４４Ｋ、６８Ｔ、７０Ｌ、７０Ｇ、７０Ｓ、７５Ｎ、７７Ｖ、８１Ｔ、８１Ｖ、８５Ｒ、９６Ｒ、９９Ｒ、１０３Ｔ、１０３Ｓ、１０８Ｖ、１１１Ｈ、１２１Ｅ、１３２Ｖ、１４４Ｓ、１６０Ｒ及び１６０Ｅ。
【０１２７】
かかる二量体Ｉ−ＣｒｅＩタンパク質は、例えば以下のものを含むか又はそれらからなっていてもよい：
配列番号１と比較して、配列番号１の７位、２４位、２７位、２８位、３４位、４０位、４４位、７０位、７５位、７７位、８１位、８５位、９６位、９９位、１０３位、１０８位、１１１位、１２１位、１３２位、１４４位及び１６０位からなる群から選択される位置に位置する少なくとも１つのアミノ酸置換を含む第１の単量体。好ましくは、第１の単量体は、配列番号１の２８位、４０位、４４位、７０位及び７５位に置換を含む。最も好ましくは、該置換は以下の置換から選択される：７Ｒ、２４Ｆ、２７Ｖ、２８Ｑ、３４Ｒ、４０Ｒ、４４Ａ、７０Ｌ、７５Ｎ、７７Ｖ、８１Ｔ、８１Ｖ、８５Ｒ、９６Ｒ、９９Ｒ、１０３Ｔ、１０３Ｓ、１０８Ｖ、１１１Ｈ、１２１Ｅ、１３２Ｖ、１４４Ｓ、１６０Ｒ及び（and）１６０Ｅ。かかる単量体は例えば、配列番号１と比較して少なくとも５個若しくは６個の突然変異、及び／又は配列番号１と比較して最大で５個、６個、８個、１０個、１２個、１５個若しくは２０個のアミノ酸突然変異を含み得る；及び
配列番号１と比較して、配列番号１の４４位、６８位、７０位及び７５位からなる群から選択される位置に位置する少なくとも１つのアミノ酸置換を含む第２の単量体。好ましくは、第２の単量体は配列番号１の４４位、７０位及び７５位に置換を含む。最も好ましくは、該置換は以下の置換から選択される：４４Ｋ、６８Ｔ、７０Ｇ、７０Ｓ及び７５Ｎ。かかる単量体は例えば、配列番号１と比較して少なくとも３個若しくは４個の突然変異、及び／又は配列番号１と比較して最大で３個、４個、６個、８個、１０個、１２個若しくは１５個のアミノ酸突然変異を含み得る。
【０１２８】
具体的な実施形態では、本発明による二量体Ｉ−ＣｒｅＩタンパク質は、
ａ）４４Ｋ ６８Ｔ ７０Ｇ ７５Ｎ突然変異を含む第１の単量体と、
ｂ）
ｉ．２８Ｑ ４０Ｒ ４４Ａ ７０Ｌ ７５Ｎ ９６Ｒ １１１Ｈ １４４Ｓ突然変異を含む単量体、
ｉｉ．７Ｒ ２８Ｑ ４０Ｒ ４４Ａ ７０Ｌ ７５Ｎ ８５Ｒ １０３Ｔ突然変異を含む単量体、
ｉｉｉ．２８Ｑ ４０Ｒ ４４Ａ ７０Ｌ ７５Ｎ １０３Ｓ突然変異を含む単量体、
ｉｖ．２４Ｆ ２７Ｖ ２８Ｑ ４０Ｒ ４４Ａ ７０Ｌ ７５Ｎ ９９Ｒ突然変異を含む単量体、
ｖ．７Ｒ ２８Ｑ ４０Ｒ ４４Ａ ７０Ｌ ７５Ｎ ８１Ｔ突然変異を含む単量体、
ｖｉ．７Ｒ ２８Ｑ ４０Ｒ ４４Ａ ７０Ｌ ７５Ｎ ７７Ｖ突然変異を含む単量体、
ｖｉｉ．７Ｒ ２８Ｑ ４０Ｒ ４４Ａ ７０Ｌ ７５Ｎ １０３Ｔ １２１Ｅ １３２Ｖ １６０Ｒ突然変異を含む単量体、
ｖｉｉｉ．２８Ｑ ４０Ｒ ４４Ａ ７０Ｌ ７５Ｎ突然変異を含む単量体、
ｉｘ．７Ｒ ２８Ｑ ４０Ｒ ４４Ａ ７０Ｌ ７５Ｎ １０３Ｔ突然変異を含む単量体、及び
ｘ．２８Ｑ ３４Ｒ ４０Ｒ ４４Ａ ７０Ｌ ７５Ｎ ８１Ｖ １０３Ｔ １０８Ｖ １６０Ｅ突然変異を含む単量体からなる群から選択される第２の単量体と、
を含むか又はそれらからなる。
【０１２９】
別の具体的な実施形態では、本発明による二量体Ｉ−ＣｒｅＩタンパク質は、
ａ）４４Ｋ ７０Ｓ ７５Ｎ突然変異を含む第１の単量体と、
ｂ）
ｉ．２８Ｑ ４０Ｒ ４４Ａ ７０Ｌ ７５Ｎ ９６Ｒ １１１Ｈ １４４Ｓ突然変異を含む単量体、
ｉｉ．７Ｒ ２８Ｑ ４０Ｒ ４４Ａ ７０Ｌ ７５Ｎ ８５Ｒ １０３Ｔ突然変異を含む単量体、
ｉｉｉ．２８Ｑ ４０Ｒ ４４Ａ ７０Ｌ ７５Ｎ １０３Ｓ突然変異を含む単量体、
ｉｖ．２４Ｆ ２７Ｖ ２８Ｑ ４０Ｒ ４４Ａ ７０Ｌ ７５Ｎ ９９Ｒ突然変異を含む単量体、
ｖ．７Ｒ ２８Ｑ ４０Ｒ ４４Ａ ７０Ｌ ７５Ｎ ８１Ｔ突然変異を含む単量体、
ｖｉ．７Ｒ ２８Ｑ ４０Ｒ ４４Ａ ７０Ｌ ７５Ｎ １０３Ｔ １２１Ｅ １３２Ｖ １６０Ｒ突然変異を含む単量体、
ｖｉｉ．７Ｒ ２８Ｑ ４０Ｒ ４４Ａ ７０Ｌ ７５Ｎ １０３Ｔ突然変異を含む単量体、及び
ｖｉｉｉ．２８Ｑ ３４Ｒ ４０Ｒ ４４Ａ ７０Ｌ ７５Ｎ ８１Ｖ １０３Ｔ １０８Ｖ １６０Ｅ突然変異を含む単量体からなる群から選択される第２の単量体と、
を含むか又はそれらからなる。
【０１３０】
二量体Ｉ−ＣｒｅＩタンパク質の単量体は、例えば偏性ヘテロ二量体の獲得を可能にする更なる突然変異も含み得る。かかる突然変異は当業者に既知であり、Fajardo-Sanchez et al.（Nucleic Acids Res. 2008 36:2163-73）に記載されるものが挙げられる。
【０１３１】
具体的な実施形態では、上記の単量体は配列番号４２の単量体に直接由来し、配列番号４２の配列と指定の突然変異の存在によってのみ異なる。
【０１３２】
本発明による融合タンパク質
融合した二量体Ｉ−ＣｒｅＩタンパク質の２つの単量体を含み、親二量体Ｉ−ＣｒｅＩタンパク質の生物学的活性を保持する融合タンパク質を構築することができる（非特許文献９、Li et al. Nucleic Acids Res. 2009 37:1650-62、Epinat et al. Nucleic Acids Res. 2003 31:2952-62）。かかる融合タンパク質は、一般に「一本鎖メガヌクレアーゼ」と称される。
【０１３３】
したがって、本発明は、上で規定される二量体Ｉ−ＣｒｅＩタンパク質の２つの単量体又はかかる単量体の生物学的に活性な断片を含む融合タンパク質に更に関する。かかる融合タンパク質では、上で規定される二量体Ｉ−ＣｒｅＩタンパク質の第１の単量体及び第２の単量体は融合し、任意にペプチドリンカー等のリンカーによって互いに連結される。リンカーは例えば、配列番号４３又は配列番号３２６を含むか又はそれらからなっていてもよい。
【０１３４】
本発明の範囲において、本発明に従うかかる融合タンパク質は、本発明による標的配列を切断することが可能であること、すなわち、それが由来する二量体Ｉ−ＣｒｅＩタンパク質と同じ標的配列を切断することが可能であることが理解される。本発明の一本鎖メガヌクレアーゼは、一本鎖偏性ヘテロ二量体メガヌクレアーゼ変異体が得られるように、上に記載のような偏性ヘテロ二量体突然変異を更に含む。
【０１３５】
最初のバージョンのＩ−ＣｒｅＩ一本鎖（Epinat et al. NAR 2003 3:2952-2962、国際公開第０３／０７８６１９号）では、一本鎖メガヌクレアーゼのＮ末端単量体は本質的にＩ−ＣｒｅＩアミノ酸配列の１位〜９３位からなっていたが、Ｃ末端（Ｉ−ＣｒｅＩアミノ酸配列の８位〜１６３位）は、ほぼ完全なＩ−ＣｒｅＩ単量体であった。ごく最近では、Ｉ−ＣｒｅＩホモ二量体メガヌクレアーゼに由来する一本鎖分子を設計する新たな方法は、２つのほぼ完全なＣ末端Ｉ−ＣｒｅＩ単量体及びＮ末端Ｉ−ＣｒｅＩ単量体であった（例えば国際公開第２００９／０９５７９３号を参照されたい）。この設計はオフサイト切断及び毒性を大幅に減少させ、一方で有効性を向上させる。この一本鎖分子の構造及び安定性は二量体変異体のものとほぼ同じであり、この分子は溶液中で単量体状であるようである。あらゆる点で、この一本鎖分子は、特異性に関して至適基準（gold standard）であると考えられるＩ−ＳｃｅＩと同様に振る舞う。これらの特性から、この新たなメガヌクレアーゼの生成はゲノム手術戦略に利用可能な最良な分子バサミの一つとなり、単一遺伝子疾患、例えば重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）の遺伝子修正療法を容易にする一方で、これまでの遺伝子療法アプローチの有害作用を回避する可能性がある。
【０１３６】
上に記載の突然変異に加えて、更なる突然変異を融合タンパク質の２つの単量体の各々の配列に導入してもよい。例えば、Ｃ末端単量体はＫ７Ｅ突然変異及びＫ９６Ｅ突然変異を含んでいてもよく、Ｎ末端単量体はＥ８Ｋ突然変異、Ｅ６１Ｒ突然変異及びＧ１９Ｓ突然変異を含んでいてもよい。
【０１３７】
実施例１、実施例２及び実施例５は、本発明によるかかる融合タンパク質の幾つかの例を開示する。
【０１３８】
具体的な実施形態では、本発明による融合タンパク質は、配列番号２５〜配列番号４０及び配列番号７６〜配列番号９６のいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一な配列又はその少なくとも５０アミノ酸、１００アミノ酸、１５０アミノ酸若しくは２００アミノ酸の断片を含むか又はそれらからなる。
【０１３９】
本発明による核酸、ベクター及び組合せ
導入遺伝子を細胞、組織又は動物のゲノムに挿入する場合、本発明によるエンドヌクレアーゼを上記細胞、組織又は動物にタンパク質としてではなく核酸分子として導入するのが好ましい。
【０１４０】
したがって、本発明は、本発明によるエンドヌクレアーゼをコードする、例えば上に記載の二量体Ｉ−ＣｒｅＩタンパク質又は融合タンパク質をコードする核酸に関する。エンドヌクレアーゼが二量体Ｉ−ＣｒｅＩタンパク質である場合、上記核酸は、各々の単量体につき１つの少なくとも２つのコード配列を含む。エンドヌクレアーゼが融合タンパク質である場合、上記核酸は少なくとも１つのコード配列を含む。エンドヌクレアーゼタンパク質は、組換えタンパク質をもたらす様々な細胞透過性ペプチドと組み合わせることができ、そのような組み合わせた分子は、エンドヌクレアーゼ単独よりもはるかに高いレベルの効率で標的細胞に入ることが可能である。これらの細胞透過性ペプチドは、Diatos S.A.によって開発されている（国際公開第０１／６４７３８号、国際公開第０５／０１６９６０号、国際公開第０３／０１８６３６号、国際公開第０５／０１８６５０号、国際公開第０７／０６９０６８号）。本出願人はこれまで、エンドヌクレアーゼ細胞透過性ペプチドの組合せが標的細胞に効率的に入ることができること及び取り込まれたエンドヌクレアーゼが、ＤＳＢを生じ、次に相同組換え事象を刺激するように標的細胞ゲノムに作用することができることを示している。本出願人は、エンドヌクレアーゼの複雑な三次元構造が細胞透過性ペプチドの存在によって影響されないこと、またエンドヌクレアーゼの全ての重要な特異性も影響を受けないままであることを示している（データは示さない）。
【０１４１】
本発明の別の態様は、本発明によるかかる核酸を含むベクターである。「ベクター」とは、それが連結された別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を意味する。
【０１４２】
本発明において使用することができるベクターとしては、染色体性核酸、非染色体性核酸、半合成核酸又は合成核酸からなり得るウイルスベクター、プラスミド及びＹＡＣが挙げられるが、これらに限定されない。好ましいベクターは、自己複製（エピソームベクター）及び／又はそれが連結された核酸の発現（発現ベクター）が可能なものである。多数の好適なベクターが当業者に既知であり、市販されている。
【０１４３】
好ましい実施形態では、ベクターはウイルスベクター、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス（例えばアデノ随伴ウイルス）、コロナウイルス、マイナス鎖ＲＮＡウイルス（例えば、インフルエンザウイルス等のオルトミクソウイルス、狂犬病ウイルス及び水疱性口内炎ウイルス等のラブドウイルス、麻疹ウイルス及びセンダイウイルス等のパラミクソウイルス）、ピコルナウイルス及びアルファウイルス等のプラス鎖ＲＮＡウイルス又はアデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス１型及び２型、エプスタイン・バーウイルス、サイトメガロウイルス）及びポックスウイルス（例えばワクシニアウイルス、鶏痘ウイルス及びカナリア痘ウイルス）等の二本鎖ＤＮＡウイルス等に由来するウイルスベクターである。好ましいベクターとしては、レンチウイルスベクター、特に自己不活性化レンチウイルスベクターが挙げられる。
【０１４４】
本発明によるエンドヌクレアーゼをコードする配列に加えて、ベクターは以下のもののような要素も含み得る：
転写制御要素及び翻訳制御要素、例えばプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化部位、終結シグナル、イントロン等；
多重クローニング部位；
複製起点；
選択マーカー；
導入遺伝子；及び／又は
本明細書中で規定されるようなゲノム標的部位の周囲の領域と相同性を有する配列を含む標的化構築物。
【０１４５】
好ましい実施形態では、上記ベクターは「発現ベクター」、すなわち少なくとも１つのコード配列が転写制御要素及び翻訳制御要素に動作可能に連結したベクターである。この実施形態の範囲において、本発明によるエンドヌクレアーゼをコードする（例えば、上に記載の二量体Ｉ−ＣｒｅＩタンパク質又は融合タンパク質をコードする）核酸は、転写制御要素及び翻訳制御要素に動作可能に連結する。
【０１４６】
好ましい実施形態では、本発明によるベクターは、導入遺伝子を含む標的化構築物と、本明細書中で規定されるような標的配列（例えば配列番号２又は配列番号３の標的配列）に隣接するゲノム配列に相同な２つの配列とを含む。標的配列に隣接するゲノム配列は、好ましくは標的部位に直接隣接する。
【０１４７】
かかる標的化構築物は当業者に既知である。導入遺伝子の挿入については、かかる構築物は通常、導入遺伝子が挿入される標的配列に隣接する上流（５’）ゲノム配列に相同な第１の配列と、標的配列に隣接する下流（３’）ゲノム配列に相同な第２の断片とを含む。
【０１４８】
「相同な」とは、別の配列に対して配列間で相同組換えをもたらすのに十分な同一性を有する、より具体的には互いに少なくとも９５％の同一性、好ましくは９７％の同一性、より好ましくは９９％の同一性を有する配列を意図する。
【０１４９】
好ましくは、少なくとも５０ｂｐ、好ましくは１００ｂｐ超、より好ましくは２００ｂｐ超の相同配列が使用される。したがって、標的化ＤＮＡ構築物は、好ましくは２００ｐｂ〜６０００ｐｂ、より好ましくは１０００ｐｂ〜２０００ｐｂである。実際に、共通ＤＮＡ相同性は切断部位の上流及び下流に隣接する領域に位置し、導入されるＤＮＡ配列は２つのアーム間に位置するものとする。
【０１５０】
標的化構築物は、２つのホモロジーアーム間に陽性選択マーカー、最終的には第１のホモロジーアームの上流又は第２のホモロジーアームの下流に陰性選択マーカーも含み得る。マーカー（複数も可）により、相同組換えによって標的部位で関心の配列が挿入された細胞の選択が可能になる。
【０１５１】
導入遺伝子をＳＨ３遺伝子座又はＳＨ４遺伝子座に挿入するのに好適な標的化構築物を構築する方法は、実施例４に与えられる。
【０１５２】
本発明によるエンドヌクレアーゼ及び標的化構築物をコードする核酸は、２つの別個のベクター上に位置することもできる。したがって、本発明は２つのベクター、すなわち：
本発明による発現ベクター；及び
導入遺伝子を含む標的化構築物と、本発明による標的配列のゲノム配列に相同な２つの配列とを含むベクター
の組合せにも関する。
【０１５３】
本発明による薬学的使用
上に記載のベクター及び組合せは、例えば薬剤として使用することができる。特に、これらのベクター及び組合せは遺伝子療法において使用することができる。
【０１５４】
したがって、本発明は、薬剤として使用される本発明によるベクター又は組合せに関する。かかるベクター及び組合せでは、導入遺伝子は治療用ポリペプチドをコードする。
【０１５５】
特に、本発明によるベクター及び組合せを用いた遺伝子療法によって治療され得る疾患としては、Ｘ−ＳＣＩＤ、ＳＣＩＤ、表皮水疱症、レーバー黒内障、血友病、サラセミア、ファンコニ貧血及び筋ジストロフィーが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５６】
これらの疾患では、導入遺伝子はそれぞれ以下の治療用ポリペプチドをコードする：ＩＬ２ＲＧ、Ｇｌ７Ａ１、Ｒｐ ６５、血液第ＶＩＩＩ因子及び血液第ＩＸ因子、ヘモグロビンＡ及びヘモグロビンＢ、Ｆａｎｃ−Ａ、Ｆａｎｃ−Ｃ（又は他のファンコニ貧血関連遺伝子）、ジストロフィン。
【０１５７】
本発明は、本発明によるベクター及び組合せと、薬学的に活性な担体とを含む医薬組成物に更に関する。
【０１５８】
本発明は、遺伝子療法によって個体を治療する方法であって、それを必要とする個体に有効量の本発明によるベクター又は組合せを投与することを含む、遺伝子療法によって個体を治療する方法にも関する。
【０１５９】
「有効量」とは、治療対象の個体のゲノムへの導入遺伝子の挿入を達成するのに十分な量を意味する。当業者はかかる濃度を日常的に決定することができる。
【０１６０】
「それを必要とする被験体」とは、導入遺伝子の挿入によって治療又は予防することができる遺伝的疾患を患っているか又はそれを患いやすい個体を意味する。本発明の範囲における治療対象の個体は、好ましくはヒトである。
【０１６１】
本発明による非薬学的使用
上に記載のベクター及び組合せは、遺伝子療法だけでなく、例えば動物モデルの作製及び関心のタンパク質を発現する組換え細胞株の作製等の非薬学的使用にも利用される。
【０１６２】
したがって、本発明は、以下のものに関する：
治療目的でない、導入遺伝子を細胞、組織又は非ヒト動物のゲノムに挿入するための本発明によるエンドヌクレアーゼ、核酸、発現ベクター又は組合せの使用；
導入遺伝子を細胞、組織又は非ヒト動物のゲノムに挿入する方法であって、該細胞、組織又は非ヒト動物を、本発明によるエンドヌクレアーゼ、核酸、発現ベクター又は組合せと接触させ、それにより上記導入遺伝子を上記ゲノムに挿入することを含む、導入遺伝子を細胞、組織又は非ヒト動物のゲノムに挿入する方法。
【０１６３】
好ましい実施形態では、上記の使用又は方法は、タンパク質産生のための組換え細胞株を得るために関心のタンパク質をコードする導入遺伝子を細胞のゲノムに挿入することを目的とする。タンパク質産生のための組換え細胞株を構築するのに好適な細胞としては、ヒト（例えばＰＥＲ．Ｃ６又はＨＥＫ）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞及びマウス（ＮＳＥ０）細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６４】
別の好ましい実施形態では、上記の使用は、遺伝性障害の非ヒト動物モデルを作製することを目的とする。
【０１６５】
本発明は、そのゲノム内に本発明による核酸、発現ベクター又は組合せを含む非ヒトトランスジェニック動物にも関する。
【０１６６】
学術論文又は抄録、公開特許出願、交付済み特許又は任意の他の参考文献を含む本明細書中で引用される全ての参考文献は、引用される参考文献に提示される全てのデータ、表、図面及び本文を含めて参照により本明細書中に完全に援用される。
【０１６７】
本発明は以下の実施例及び添付の図面に鑑みて更に評価される。
【０１６８】
配列の簡単な説明
配列番号１は、野生型Ｉ−ＣｒｅＩ単量体のアミノ酸配列を示す。
【０１６９】
配列番号２は、ＳＨ３遺伝子座内に位置する本発明による標的配列の配列を示す。
【０１７０】
配列番号３は、ＳＨ４遺伝子座内に位置する本発明による標的配列の配列を示す。
【０１７１】
配列番号４は、野生型Ｉ−ＣｒｅＩホモ二量体タンパク質の標的配列の配列を示す。
【０１７２】
配列番号５〜配列番号１０は、図１に示される配列を表す。
【０１７３】
配列番号１１〜配列番号１５は、実施例１において使用されるオリゴヌクレオチド、プライマー及びリンカーを表す。
【０１７４】
配列番号１６〜配列番号１９は、図４に示される配列を表す。
【０１７５】
配列番号２０〜配列番号２４は、実施例２において使用されるオリゴヌクレオチド、プライマー及びリンカーを表す。
【０１７６】
配列番号２５〜配列番号３２は、それぞれＳＣＯＨ−ＳＨ３−ｂ５６−Ａ、ＳＣＯＨ−ＳＨ３−ｂ５６−Ｂ、ＳＣＯＨ−ＳＨ３−ｂ５６−Ｃ、ＳＣＯＨ−ＳＨ３−ｂ５６−Ｄ、ＳＣＯＨ−ＳＨ３−ｂ１−Ａ、ＳＣＯＨ−ＳＨ３−ｂ１−Ｂ、ＳＣＯＨ−ＳＨ３−ｂ１−Ｃ及びＳＣＯＨ−ＳＨ３−ｂ１−Ｄと称される、実施例１において構築される一本鎖メガヌクレアーゼを表す。
【０１７７】
配列番号３３〜配列番号４０は、それぞれＳＣＯＨ−ＳＨ４−ｂ５６−Ａ、ＳＣＯＨ−ＳＨ４−ｂ５６−Ｂ、ＳＣＯＨ−ＳＨ４−ｂ５６−Ｃ、ＳＣＯＨ−ＳＨ４−ｂ５６−Ｄ、ＳＣＯＨ−ＳＨ４−ｂ１−Ａ、ＳＣＯＨ−ＳＨ４−ｂ１−Ｂ、ＳＣＯＨ−ＳＨ４−ｂ１−Ｃ及びＳＣＯＨ−ＳＨ４−ｂ１−Ｄと称される、実施例２において構築される一本鎖メガヌクレアーゼを表す。
【０１７８】
配列番号４１は、陽性対照であるＳＣＯＨ−ＲＡＧを表す。
【０１７９】
配列番号４２は、２位に更なるアラニン及び最後のプロリンの後に３つの更なる残基を有するＩ−ＣｒｅＩ単量体のアミノ酸配列を示す。
【０１８０】
配列番号４３は、ＲＭ２リンカーのアミノ酸配列を示す。
【０１８１】
配列番号４４〜配列番号４９は、実施例３において使用されるオリゴヌクレオチド、プライマー及びリンカーを表す。
【０１８２】
配列番号５０〜配列番号５３は、実施例４において使用されるオリゴヌクレオチド、プライマー及びリンカーを表す。
【０１８３】
配列番号５４〜配列番号５５は、それぞれＳＨ３遺伝子座、ＳＨ４遺伝子座及びＳＨ６遺伝子座に含まれる配列を示す。
【０１８４】
配列番号５７は、４４Ａ ５４Ｌ ６４Ａ ７０Ｑ ７５Ｎ １５８Ｒ １６２Ａ突然変異を含む配列番号１の単量体に由来する単量体を示す。
【０１８５】
配列番号５８は、４４Ａ ５４Ｌ ６４Ａ ７０Ｑ ７５Ｎ １５８Ｒ １６２Ａ突然変異を含む配列番号４２の単量体に由来する単量体を示す。
【０１８６】
配列番号５９は、ＳＨ６遺伝子座内に位置する本発明による標的配列の配列を示す。
【０１８７】
配列番号６０〜配列番号６４は、図９に示される配列を表す。
【０１８８】
配列番号６５〜配列番号７５は、実施例５において使用されるオリゴヌクレオチド、プライマー及びリンカーを表す。
【０１８９】
配列番号７６〜配列番号８５は、それぞれＳＣＯＨ−ＳＨ６−ｂ１−Ｂ、ＳＣＯＨ−ＳＨ６−ｂ１−Ｃ、ＳＣＯＨ−ＳＨ６−ｂ１−Ｃ、ＱＣＳＨ６１−Ａ０１、ＱＣＳＨ６１−Ｅ０１、ＱＣＳＨ６１−Ｈ０、ＱＣＳＨ６２−Ａ０２、ＱＣＳＨ６１−Ｈ０１ｂ、ＱＣＳＨ６１−Ｈ０１ｃ及びＱＣＳＨ６１−Ｈ０１ｄと称される、実施例５において構築される一本鎖メガヌクレアーゼを表す。
【０１９０】
配列番号８６〜配列番号９６は、ＳＨ７遺伝子座（配列番号８６及び配列番号８７）、ＳＨ８遺伝子座（配列番号８８）、ＳＨ１２遺伝子座（配列番号８９）、ＳＨ１３遺伝子座（配列番号９０）、ＳＨ１９遺伝子座（配列番号９１）、ＳＨ２０遺伝子座（配列番号９２）、ＳＨ２１遺伝子座（配列番号９３〜配列番号９５）及びＳＨ３３遺伝子座（配列番号９６）を切断することが可能な一本鎖メガヌクレアーゼを表す。
【０１９１】
配列番号９７〜配列番号１０４は、それぞれＳＨ１２遺伝子座、ＳＨ１３遺伝子座、ＳＨ１９遺伝子座、ＳＨ２０遺伝子座、ＳＨ２１遺伝子座、ＳＨ３３遺伝子座、ＳＨ７遺伝子座及びＳＨ８遺伝子座内に含まれる配列を表す。
【０１９２】
配列番号１０５〜配列番号３２５は、実施例６〜実施例９並びに／又は表Ａ’、表Ａ’’、表Ｅ、表Ｇ及び表Ｈのいずれか１つに開示される配列を表す。
【０１９３】
配列番号３２６は、ＢＱＹリンカーのアミノ酸配列を示す。
【実施例】
【０１９４】
以下の実施例において、全てのＩ−ＣｒｅＩ変異体は、配列番号４２のＩ−ＣｒｅＩ単量体の遺伝子操作によって構築した。
【０１９５】
実施例１： ＳＨ３遺伝子座を標的とするメガヌクレアーゼの改変
ＳＨ３は、染色体６上に存在する２４ｂｐの非パリンドローム標的（配列番号２）を含む遺伝子座である。表Ａに示されるように、ＳＨ３は、Deichmann et al.（J. of Clin. Invest. 2007 117:2225）に開示されるＲＩＳの近傍に位置する。ＳＨ３配列は、Deichmann et alに記載されるＣＩＳのいずれにも含まれない。
【０１９６】
配列番号２の標的配列を切断することが可能なＩ−ＣｒｅＩヘテロ二量体を、Chames et al.（Nucleic Acids Res., 2005, 33, e178）、非特許文献６、非特許文献８、非特許文献７に記載されるものに基づく方法を用いて同定した。次いで、これらのヘテロ二量体の一部を、ＣＨＯ細胞におけるＳＨ３切断を判定するための哺乳動物発現ベクターにクローニングした。次いで、これらの結果を利用して、配列番号２の標的配列に指向性を有する一本鎖メガヌクレアーゼを設計した。これらの一本鎖メガヌクレアーゼを哺乳動物発現ベクターにクローニングし、ＣＨＯ細胞におけるＳＨ３切断を試験した。ＳＨ３標的の強い切断活性を、これらの一本鎖分子について哺乳動物細胞において観察することができた。
【０１９７】
実施例１．１． ＳＨ３を切断するメガヌクレアーゼの同定
ＳＨ３標的配列を切断する可能性があるヘテロ二量体形態のＩ−ＣｒｅＩ変異体を、遺伝子操作によって構築した。次いで、かかる変異体の対を酵母において共発現させた。共発現時に３つの分子種、すなわち２つのホモ二量体及び１つのヘテロ二量体が得られる。次いで、このヘテロ二量体が配列番号２のＳＨ３標的配列を切断することが可能であるか否かを決定した。
【０１９８】
ａ）ＳＨ３標的配列に由来するパリンドローム配列を切断するＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼの変異体の構築
ＳＨ３配列は部分的に、図１に示される１０ＡＡＴ＿Ｐ（配列番号５）、５ＡＡＧ＿Ｐ（配列番号６）、１０ＡＧＧ＿Ｐ（配列番号７）及び５ＴＴＴ＿Ｐ（配列番号８）標的配列の組合せである。これらの配列は、国際ＰＣＴ出願の国際公開第２００６／０９７７８４号及び国際公開第２００６／０９７８５３号、非特許文献６、並びに非特許文献８に記載のように得られるメガヌクレアーゼによって切断される。このため、ＳＨ３は、これらのこれまでに同定されたメガヌクレアーゼから生じるコンビナトリアル変異体によって切断されるはずである。
【０１９９】
２つのパリンドローム標的ＳＨ３．３及びＳＨ３．４は、ＳＨ３に由来するものであった（図１）。ＳＨ３．３及びＳＨ３．４はパリンドローム性であるため、ホモ二量体タンパク質によって切断されるはずである。したがって、配列番号９のＳＨ３．３パリンドローム標的配列又は配列番号１０のＳＨ３．４パリンドローム標的配列のいずれかを切断するホモ二量体Ｉ−ＣｒｅＩ変異体は、Chames et al.（Nucleic Acids Res., 2005, 33, e178）、非特許文献６、非特許文献８及び非特許文献７に記載されるものに基づく方法を用いて構築した。
【０２００】
ｂ）標的ベクターの構築
ゲートウェイクローニング配列に隣接するＳＨ３標的配列に相当する配列番号１１のオリゴヌクレオチドを、PROLIGOにオーダーした。このオリゴヌクレオチドは以下の配列を有する：ＴＧＧＣＡＴＡＣＡＡＧＴＴＴＣＣＡＡＴＡＣＡＡＧＧＴＡＣＡＡＡＧＴＣＣＴＧＡＣＡＡＴＣＧＴＣＴＧＴＣＡ）。一本鎖オリゴヌクレオチドのＰＣＲ増幅によって生成した二本鎖標的ＤＮＡを、ｐＣＬＳ１０５５酵母レポーターベクターにゲートウェイプロトコル（INVITROGEN）を用いてクローニングした。
【０２０１】
酵母レポーターベクターを、以下の遺伝子型を有するＦＹＢＬ２−７Ｂサッカロミセス・セレビシエ株に形質転換した：ＭＡＴ ａ、ｕｒａ３Δ８５１、ｔｒｐ１Δ６３、ｌｅｕ２Δ１、ｌｙｓ２Δ２０２。得られた株はレポーター株（MilleGen）に相当する。
【０２０２】
ｃ）変異体の共発現
ＳＨ３．４配列又はＳＨ３．３配列を切断する変異体をコードするオープンリーディングフレームを、それぞれｐＣＬＳ５４２発現ベクター及びｐＣＬＳ１１０７発現ベクターにクローニングした。これらの変異体に由来する酵母ＤＮＡを標準プロトコルを用いて抽出し、大腸菌を形質転換するために使用した。次いで、得られたプラスミドを使用して、酵母を同時形質転換した。形質転換体を、ロイシンを欠き、Ｇ４１８を含有する合成培地上で選択した。
【０２０３】
ｄ）メガヌクレアーゼを共発現するクローンの接合及び酵母におけるスクリーニング
接合はコロニーグリッダー（ＱｐｉｘＩＩ、Genetix）を用いて行った。変異体をＹＰＤプレートを覆うナイロンフィルター上に、低グリッド密度（４〜６スポット／ｃｍ²）を用いてグリッドした。第２のグリッドプロセスを同じフィルター上で行い、各々の標的について異なるレポーターを有する酵母株からなる第２の層をスポットした。メンブレンを固形寒天ＹＰＤ富栄養培地上に置き、３０℃で一晩インキュベートして接合させた。次に、フィルターを、ロイシン及びトリプトファンを欠き、ガラクトース（２％）を炭素源として含むＧ４１８を添加した合成培地に移し、３７℃で５日間インキュベートして、発現ベクター及び標的ベクターを保有する２倍体を選択した。５日後、フィルターを、０．５Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）中の０．０２％Ｘ−Ｇａｌ、０．１％ＳＤＳ、６％ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、７ｍＭ β−メルカプトエタノール、１％アガロースを含む固形アガロース培地上に置き、３７℃でインキュベートして、β−ガラクトシダーゼ活性をモニタリングした。結果をスキャニングによって分析し、適切なソフトウェアを用いて定量化を行った。
【０２０４】
ｅ）結果
異なる変異体の共発現は、５８個の試験した組合せにおいてＳＨ３標的の切断をもたらした。機能的組合せを下の表Ｉにまとめる。この表において、「＋」はＳＨ３標的配列に対する機能的な組合せ、すなわちヘテロ二量体がＳＨ３標的配列を切断することが可能であることを示す。
【０２０５】
【表１７】

【０２０６】
結論として、酵母においてＳＨ３標的配列を切断することが可能な幾つかのヘテロ二量体Ｉ−ＣｒｅＩ変異体が同定された。
【０２０７】
実施例１．２． ＣＨＯ細胞における染色体外モデルでのＳＨ３標的切断の検証
ヘテロ二量体を形成した場合に酵母においてＳＨ３標的を効率的に切断することが可能なＩ−ＣｒｅＩ変異体は、上の実施例１．１で記載している。ＣＨＯ細胞においてＳＨ３標的に対する最大切断活性を示すヘテロ二量体を同定するために、これらの変異体の一部の効率を、ＣＨＯ細胞における染色体外アッセイを用いて比較した。ＣＨＯ細胞におけるスクリーニングは、メガヌクレアーゼによる標的の切断がＬａｇｏＺレポーター遺伝子（細菌ｌａｃＺ遺伝子の誘導体）の相同組換え及び発現を誘導する一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）ベースのアッセイである。
【０２０８】
ａ）ＣＨＯスクリーニングのためのベクターにおけるＳＨ３標的のクローニング
ゲートウェイクローニング配列に隣接するＳＨ３標的配列に相当するオリゴヌクレオチドを、PROLIGOにオーダーした（配列番号１２、ＴＧＧＣＡＴＡＣＡＡＧＴＴＴＣＣＡＡＴＡＣＡＡＧＧＴＡＣＡＡＡＧＴＣＣＴＧＡＣＡＡＴＣＧＴＣＴＧＴＣＡ）。一本鎖オリゴヌクレオチドのＰＣＲ増幅によって生成した二本鎖標的ＤＮＡを、ゲートウェイプロトコル（INVITROGEN）を用いてｐＣＬＳ１０５８ ＣＨＯレポーターベクターにクローニングした。クローニングした標的をシークエンシング（MILLEGEN）によって検証した。
【０２０９】
ｂ）メガヌクレアーゼの再クローニング
上の表Ｉの同定されたこれらの変異体をコードするオープンリーディングフレームを、ｐＣＬＳ２４３７発現ベクターにサブクローニングした。ＯＲＦを、酵母ＤＮＡ上で配列番号１３及び配列番号１４（５’−ＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＧＧＣＧＣＧＣＣＴＡＣＡＣＡＧＣＧＧＣＣＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧ−３’及び５’−ＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＧＣＴＡＧＣＧＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＣＡＧＴＣＧＧ−３’）のプライマーを用いてＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ産物をＣＨＯ発現ベクターｐＣＬＳ２４３７に、内部断片置き換えのためのＡｓｃＩ制限酵素及びＸｈｏＩ制限酵素を用いてクローニングした。ライゲーション工程及び大腸菌形質転換工程から得られる選択されたクローンを、シークエンシング（MILLEGEN）によって検証した。
【０２１０】
ｃ）哺乳動物細胞における染色体外アッセイ
ＣＨＯ Ｋ１細胞を、Ｐｏｌｙｆｅｃｔ（商標）トランスフェクション試薬を用い、供給業者のプロトコル（QIAGEN）に従ってトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後に、培養培地を除去し、β−ガラクトシダーゼ液体アッセイのための溶解／曝露バッファーを１５０μｌ（通常は、１００ｍｌの溶解バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００、０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、プロテアーゼ阻害剤）、１０ｍｌのＭｇ １００Ｘバッファー（１００ｍＭ ＭｇＣｌ₂、３５％β−メルカプトエタノール）、１１０ｍｌのＯＮＰＧ（８ｍｇ／ｍｌ）及び７８０ｍｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）を含有するバッファーを１リットル）添加した。３７℃でのインキュベーション後、ＯＤを４２０ｎｍで測定した。全プロセスを自動Ｖｅｌｏｃｉｔｙ１１ ＢｉｏＣｅｌプラットフォーム上で行った。
【０２１１】
１回のアッセイにつき、１５０ｎｇの標的ベクターを、両方の変異体それぞれ１２．５ｎｇと共トランスフェクトした。
【０２１２】
ｄ）結果
表Ｉに記載の以下の４つの変異体を、ｐＣＬＳ２４３７に再クローニングした：
４４Ａ ５４Ｌ ７０Ｑ ７５Ｙ ９２Ｒ １５８Ｒ １６２Ａ（ＳＨ３．３−ＭＡと称される）；
１Ｖ ４４Ａ ５４Ｌ ６４Ａ ７０Ｑ ７５Ｎ １５８Ｗ １６２Ａ（ＳＨ３．３−ＭＢと称される）；
３０Ｇ ３８Ｒ ７０Ｄ ７５Ｎ ８６Ｄ（ＳＨ３．４−Ｍ１と称される）；及び
３０Ｇ ３８Ｒ ７０Ｄ ７５Ｎ ８１Ｔ １５４Ｇ（ＳＨ３．４−Ｍ２と称される）。
【０２１３】
これらのＩ−ＣｒｅＩ変異体を、ＣＨＯ染色体外アッセイにおいてＳＨ３標的に対するヘテロ二量体としてともにアッセイした。
【０２１４】
表ＩＩは、９つのヘテロ二量体から得られた機能的な組合せを示す。
【０２１５】
【表１８】

【０２１６】
ＳＨ３配列の切断及び組換えの効率の分析から、Ｉ−ＣｒｅＩ変異体の試験した４つの組合せが全て、更なる突然変異なしにそれらの切断活性を酵母からＣＨＯ細胞へと移すことが可能であったことが実証される。
【０２１７】
実施例１．３． 一本鎖としての共有結合アセンブリ及びＳＨ３を切断するメガヌクレアーゼの改良
実施例１．１．において同定された変異体の共発現は、酵母におけるＳＨ３標的の高い切断活性をもたらす。ヘテロ二量体の一部は哺乳動物発現系におけるＳＨ３切断が検証されている（実施例１．２．）。表ＩＩＩに示される、そのうちの１つを更なる最適化のために選択した。
【０２１８】
【表１９】

【０２１９】
ＭＡ ｘ Ｍ１ ＳＨ３ヘテロ二量体は酵母における高い切断活性をもたらす。ＳＨ３．３−ＭＡは、Ｉ−ＣｒｅＩ野生型配列と比較して以下の突然変異を有するＳＨ３．３カッターである：４４Ａ ５４Ｌ ７０Ｑ ７５Ｙ ９２Ｒ １５８Ｒ １６２Ａ。ＳＨ３．４−Ｍ１は、Ｉ−ＣｒｅＩ野生型配列と比較して以下の突然変異を有するＳＨ３．４カッターである：３０Ｇ ３８Ｒ ７０Ｄ ７５Ｎ ８６Ｄ。
【０２２０】
一本鎖構築物を配列番号１５（ＡＡＧＧＳＤＫＹＮＱＡＬＳＫＹＮＱＡＬＳＫＹＮＱＡＬＳＧＧＧＧＳ）のリンカーＲＭ２を用いて改変し、それにより一本鎖分子：ＭＡ−リンカーＲＭ２−Ｍ１を作製した。この設計工程において、Ｇ１９Ｓ突然変異をＣ末端Ｍ１変異体に導入した。加えて、突然変異Ｋ７Ｅ、Ｋ９６ＥをＭＡ変異体に、突然変異Ｅ８Ｋ、Ｅ６１ＲをＭ１変異体に導入して、更にＳＣＯＨ−ＳＨ３−ｂ１足場と呼ばれる一本鎖分子：ＭＡ（Ｋ７Ｅ Ｋ９６Ｅ）−リンカーＲＭ２−Ｍ１（Ｅ８Ｋ Ｅ６１Ｒ Ｇ１９Ｓ）を作り出した。一部の更なるアミノ酸置換は、これまでの研究においてＩ−ＣｒｅＩ誘導体の活性を増強することが見出されている。イソロイシン１３２のバリンでの置き換え（Ｉ１３２Ｖ）がそのうちの１つである。Ｉ１３２Ｖ突然変異を、Ｎ末端タンパク質断片及びＣ末端タンパク質断片のコード配列のいずれか１つ若しくは両方に導入するか、又はいずれにも導入しなかった。
【０２２１】
同じ戦略を、ＳＨ３．３（４４Ａ ５４Ｌ ７０Ｑ ７５Ｙ ９２Ｒ １５８Ｒ １６２Ａ）及びＳＨ３．４（３０Ｇ ３８Ｒ ５０Ｒ ７０Ｄ ７５Ｎ １４２Ｒ）をそれぞれホモ二量体として切断する最良な変異体に基づく、ＳＣＯＨ−ＳＨ３−ｂ５６足場と称される第２の足場に適用した。
【０２２２】
得られたタンパク質を下記表ＩＶに示す。全ての一本鎖分子を、ＳＨ３標的の切断についてＣＨＯにおいてアッセイした。
【０２２３】
ａ）一本鎖分子のクローニング
一連の合成遺伝子アセンブリをMWG-EUROFINSにオーダーした。ＳＨ３を標的とする異なる一本鎖変異体をコードする合成遺伝子を、ＡｓｃＩ制限部位及びＸｈｏＩ制限部位を用いてｐＣＬＳ１８５３にクローニングした。
【０２２４】
ｂ）哺乳動物細胞における染色体外アッセイ
ＣＨＯ Ｋ１細胞を実施例１．２に記載のようにトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後に、培養培地を除去し、β−ガラクトシダーゼ液体アッセイのための溶解／曝露バッファーを１５０μｌ添加した。３７℃でのインキュベーション後、ＯＤを４２０ｎｍで測定した。全プロセスを自動Ｖｅｌｏｃｉｔｙ１１ ＢｉｏＣｅｌプラットフォーム上で行った。１回のアッセイにつき、１５０ｎｇの標的ベクターを、３．１２ｎｇから２５ｎｇまでの漸増量の変異体ＤＮＡ（１２．５ｎｇ＋１２．５ｎｇのヘテロ二量体ＤＮＡに相当する２５ｎｇの一本鎖ＤＮＡ）と共トランスフェクトした。最後に、トランスフェクトしたＤＮＡ変異体のＤＮＡ量は３．１２ｎｇ、６．２５ｎｇ、１２．５ｎｇ及び２５ｎｇであった。トランスフェクトしたＤＮＡの総量は、空ベクター（ｐＣＬＳ０００２）を用いて１７５ｎｇ（標的ＤＮＡ、変異体ＤＮＡ、担体ＤＮＡ）とした。
【０２２５】
ｄ）結果
ＳＨ３標的に対する一本鎖分子の活性を、これまでに記載されたＣＨＯアッセイを本内部対照ＳＣＯＨ−ＲＡＧ及びＩ−Ｓｃｅ Ｉメガヌクレアーゼとともに用いてモニタリングした。全ての比較は、３．１２ｎｇ、６．２５ｎｇ、１２．５ｎｇ及び２５ｎｇのトランスフェクトした変異体ＤＮＡで行った（図２及び図３）。全ての一本鎖分子が、表ＩＶに挙げられるようにＣＨＯアッセイにおいてＳＨ３標的切断活性を示した。
【０２２６】
【表２０】

【０２２７】
変異体は、それらが有する突然変異プロファイルに応じて、アッセイした用量で特異的な挙動を共有していた（図２及び図３）。例えば、ＳＣＯＨ−ＳＨ３−ｂ１−Ｃは、同様のプロファイルを有し、更に活性が高い。その活性は、低い量から高い量にかけてトランスフェクトした最も低いＤＮＡ量で最大に達する。ＳＣＯＨ−ＳＨ３−ｂ１−Ｃと比較して、分子ＳＣＯＨ−ＳＨ３−ｂ５６−Ａは、より高いＤＮＡ用量で最大活性を有するが、ＳＣＯＨ−ＳＨ３−ｂ１−Ｃ及び本内部標準と同等のレベルの活性に達する。
【０２２８】
記載の全ての変異体が活性であり、導入遺伝子をＳＨ３遺伝子座へ挿入するのに使用することができる。
【０２２９】
実施例２： ＳＨ４遺伝子座を標的とするメガヌクレアーゼの改変
ＳＨ４は染色体７上に存在する遺伝子座である。ＳＨ４遺伝子座は配列番号３の２４ｂｐの非パリンドローム配列を含む。表Ａに示されるように、ＳＨ４は、Schwarzwaelder et al.（J. Clin. Invest. 2007 117:2241）に開示されるＲＩＳの周辺に位置する。ＳＨ４配列は、Deichmann et alに記載されるＣＩＳのいずれにも含まれない。
【０２３０】
上の実施例１に記載のものと同様の実験を行い、配列番号３の標的配列を切断することが可能なＩ−ＣｒｅＩヘテロ二量体及び一本鎖メガヌクレアーゼを同定した。
【０２３１】
実施例２．１． ＳＨ４を切断するメガヌクレアーゼの同定
ＳＨ４標的配列を切断する可能性があるヘテロ二量体形態のＩ−ＣｒｅＩ変異体を、遺伝子操作によって構築した。次いで、かかる変異体の対を酵母において共発現させた。共発現時に３つの分子種、すなわち２つのホモ二量体及び１つのヘテロ二量体が得られる。次いで、このヘテロ二量体が配列番号３のＳＨ４標的配列を切断することが可能であるか否かを決定した。
【０２３２】
ａ）ＳＨ４標的配列に由来するパリンドローム配列を切断するＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼの変異体の構築
ＳＨ４配列は部分的に、図４に示される１０ＡＡＡ＿Ｐ（配列番号４）、５ＡＣＴ＿Ｐ（配列番号１６）、１０ＡＡＡ＿Ｐ（配列番号４）、５ＧＧＴ＿Ｐ（配列番号１７）標的の組合せである。これらの配列は、国際ＰＣＴ出願の国際公開第２００６／０９７７８４号及び国際公開第２００６／０９７８５３号、非特許文献６、非特許文献８に記載のように得られる、これまでに同定されたメガヌクレアーゼによって切断される。このため、ＳＨ４は、これらのこれまでに同定されたメガヌクレアーゼから生じるコンビナトリアル変異体によって切断されるはずである。
【０２３３】
スクリーニング手順を、Chames et al.（Nucleic Acids Res., 2005, 33, e178）、非特許文献６、非特許文献８及び非特許文献７に記載されるものに基づく方法を用いて、以下の２つのパリンドローム配列に対して行った：配列番号１８のＳＨ４．３配列及び配列番号１９のＳＨ４．４配列。
【０２３４】
ｂ）標的ベクターの構築
実験手順は、配列番号２０（５’−ＴＧＧＣＡＴＡＣＡＡＧＴＴＴＴＴＡＡＡＡＣＡＣＴＧＴＡＣＡＣＣＡＴＴＴＴＧＡＣＡＡＴＣＧＴＣＴＧＴＣＡ−３’）のＳＨ４標的配列に相当するオリゴヌクレオチドを使用した以外は実施例１．１に記載されるものである。
【０２３５】
ｃ）変異体の共発現
酵母ＤＮＡを、ｐＣＬＳ５４２発現ベクター及びｐＣＬＳ１１０７発現ベクターにおいてＳＨ４．３標的及びＳＨ４．４標的を切断する変異体から標準プロトコルを用いて抽出し、大腸菌を形質転換するために使用した。次いで、得られたプラスミドＤＮＡを使用して、酵母株を同時形質転換した。形質転換体を、ロイシンを欠き、Ｇ４１８を含有する合成培地上で選択した。
【０２３６】
ｄ）メガヌクレアーゼを共発現するクローンの接合及び酵母におけるスクリーニング
接合はコロニーグリッダー（ＱｐｉｘＩＩ、genetix）を用いて行った。変異体をＹＰＤプレートを覆うナイロンフィルター上に、低グリッド密度（４〜６スポット／ｃｍ²）を用いてグリッドした。第２のグリッドプロセスを同じフィルター上で行い、各々の標的について異なるレポーターを有する酵母株からなる第２の層をスポットした。膜を固形寒天ＹＰＤ富栄養培地上に置き、３０℃で一晩インキュベートして接合させた。次に、フィルターを、ロイシン及びトリプトファンを欠き、ガラクトース（２％）を炭素源として含むＧ４１８を添加した合成培地に移し、３７℃で５日間インキュベートして、発現ベクター及び標的ベクターを保有する２倍体を選択した。５日後、フィルターを、０．５Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）中の０．０２％Ｘ−Ｇａｌ、０．１％ＳＤＳ、６％ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、７ｍＭ β−メルカプトエタノール、１％アガロースを含む固形アガロース培地上に置き、３７℃でインキュベートして、β−ガラクトシダーゼ活性をモニタリングした。結果をスキャニングによって分析し、適切なソフトウェアを用いて定量化を行った。
【０２３７】
ｅ）結果
ＳＨ４．３標的を切断する変異体及びＳＨ４．４標的を切断する変異体の共発現は、６つの事例においてＳＨ４標的の切断をもたらした。機能的組合せを表Ｖにまとめる。
【０２３８】
【表２１】

【０２３９】
実施例２．２． ＣＨＯ細胞における染色体外モデルでのＳＨ４標的切断の検証
ＣＨＯ細胞においてＳＨ４標的に対して最大切断活性を示すヘテロ二量体を同定するために、ＳＨ４標的を切断する変異体の幾つかの組合せの効率を、ＣＨＯ細胞における染色体外アッセイを用いて判断した。ＣＨＯ細胞におけるスクリーニングは、メガヌクレアーゼによる標的の切断がＬａｇｏＺレポーター遺伝子（細菌ｌａｃＺ遺伝子の誘導体）の相同組換え及び発現を誘導する一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）ベースのアッセイである。
【０２４０】
ａ）ＣＨＯスクリーニングのためのベクターにおけるＳＨ４標的のクローニング
標的を以下のようにクローニングした。ゲートウェイクローニング配列に隣接するＳＨ４標的配列に相当する配列番号２１のオリゴヌクレオチドを、PROLIGOにオーダーした（５’−ＴＧＧＣＡＴＡＣＡＡＧＴＴＴＴＴＡＡＡＡＣＡＣＴＧＴＡＣＡＣＣＡＴＴＴＴＧＡＣＡＡＴＣＧＴＣＴＧＴＣＡ−３’）。一本鎖オリゴヌクレオチドのＰＣＲ増幅によって生成した二本鎖標的ＤＮＡを、ゲートウェイプロトコル（INVITROGEN）を用いてＣＨＯレポーターベクター（ｐＣＬＳ１０５８）にクローニングした。クローニングした断片をシークエンシング（MILLEGEN）によって検証した。
【０２４１】
ｂ）メガヌクレアーゼの再クローニング
上で得られたＳＨ４．５標的及びＳＨ４．６標的を切断するＩ−ＣｒｅＩ変異体のＯＲＦをｐＣＬＳ２４３７にサブクローニングした。ＯＲＦを、酵母ＤＮＡ上で配列番号２２及び配列番号２３（５’−ＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＧＧＣＧＣＧＣＣＴＡＣＡＣＡＧＣＧＧＣＣＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧ−３’及び５’−ＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＧＣＴＡＧＣＧＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＣＡＧＴＣＧＧ−３’）のプライマーを用いてＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ産物をＣＨＯ発現ベクターｐＣＬＳ２４３７に、内部断片置き換えのためのＡｓｃＩ制限部位及びＮｈｅＩ制限部位を用いてクローニングした。ライゲーション工程及び大腸菌形質転換工程から得られる選択されたクローンを、シークエンシング（MILLEGEN）によって検証した。
【０２４２】
ｃ）哺乳動物細胞における染色体外アッセイ
ＣＨＯ Ｋ１細胞を、Ｐｏｌｙｆｅｃｔ（商標）トランスフェクション試薬を用い、供給業者のプロトコル（QIAGEN）に従ってトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後に、培養培地を除去し、β−ガラクトシダーゼ液体アッセイのための溶解／曝露バッファーを１５０μｌ（通常は、１００ｍｌの溶解バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００、０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、プロテアーゼ阻害剤）、１０ｍｌのＭｇ １００Ｘバッファー（１００ｍＭ ＭｇＣｌ₂、３５％β−メルカプトエタノール）、１１０ｍｌのＯＮＰＧ（８ｍｇ／ｍｌ）及び７８０ｍｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）を含有するバッファーを１リットル）添加した。３７℃でのインキュベーション後、ＯＤを４２０ｎｍで測定した。全プロセスを自動Ｖｅｌｏｃｉｔｙ１１ ＢｉｏＣｅｌプラットフォーム上で行った。１回のアッセイにつき、１５０ｎｇの標的ベクターを、両方の変異体それぞれ１２．５ｎｇ（パリンドロームＳＨ４．３標的を切断する変異体１２．５ｎｇ及びパリンドロームＳＨ４．４標的を切断する変異体１２．５ｎｇ）と共トランスフェクトした。
【０２４３】
ｄ）結果
表ＶＩに示され、上の実施例２．１に記載の４つの変異体を更なる分析に選択した。
【０２４４】
【表２２】

【０２４５】
これらの変異体をｐＣＬＳ２４３７にクローニングした。次いで、ＳＨ４．３標的又はＳＨ４．４標的を切断するＩ−ＣｒｅＩ変異体を、ＣＨＯ染色体外アッセイにおいてＳＨ４標的に対するヘテロ二量体としてともにアッセイした。ＳＨ４配列の切断及び組換えの効率の分析から、Ｉ−ＣｒｅＩ変異体の試験した全ての組合せが、更なる突然変異なしにそれらの切断活性を酵母からＣＨＯ細胞へと移すことが可能であったことが実証される（表ＶＩＩ）。
【０２４６】
【表２３】

【０２４７】
実施例２．３． 一本鎖としての共有結合アセンブリ及び部位特異的突然変異誘発によるＳＨ４を切断するメガヌクレアーゼの改良
実施例２．１．に記載の変異体の共発現は、酵母におけるＳＨ４標的の高い切断活性をもたらす。加えて、それらの一部は哺乳動物発現系におけるＳＨ４切断が検証されている（実施例２．２．）。
【０２４８】
ＭＡ ｘ Ｍ２ ＳＨ４ヘテロ二量体は酵母における高い切断活性をもたらす。ＳＨ４．３−ＭＡは、Ｉ−ＣｒｅＩ野生型配列と比較して以下の突然変異を有するＳＨ４．３カッターである：２４Ｖ ４４Ｒ ６８Ｙ ７０Ｓ ７５Ｙ ７７Ｎ。ＳＨ４．４−Ｍ２は、Ｉ−ＣｒｅＩ野生型配列と比較して以下の突然変異を有するＳＨ４．４カッターである：２４Ｖ ４４Ｙ ７０Ｓ ７７Ｖ。
【０２４９】
実施例１．３に記載のように、リンカーＲＭ２を用いて一本鎖構築物を改変し、それによりＭＡ−リンカーＲＭ２−Ｍ２と称される一本鎖分子を作製した。この設計工程において、Ｇ１９Ｓ突然変異をＣ末端Ｍ２突然変異体に導入した。加えて、更にＳＣＯＨ−ＳＨ４−ｂ１足場と呼ばれる、ＭＡ（Ｋ７Ｅ Ｋ９６Ｅ）−リンカーＲＭ２−Ｍ２（Ｅ８Ｋ Ｅ６１Ｒ Ｇ１９Ｓ）と称される一本鎖分子を作り出すために、Ｋ７Ｅ突然変異及びＫ９６Ｅ突然変異をＭＡ突然変異体に、Ｅ８Ｋ突然変異及びＥ６１Ｒ突然変異をＭ２突然変異体に導入した。
【０２５０】
イソロイシン１３２のバリンへの（Ｉ１３２Ｖ）突然変異を、Ｎ末端タンパク質断片及びＣ末端タンパク質断片のコード配列のいずれか１つ若しくは両方に導入するか、又はいずれにも導入しなかった。
【０２５１】
同じ戦略を、ＳＨ４．３（４４Ｒ ６８Ｙ ７０Ｓ ７５Ｙ ７７Ｎ）及びＳＨ４．４（２４Ｖ ４４Ｙ ７０Ｓ ７７Ｖ）に対する良好なカッターに基づく第２の足場に適用した。この足場は更にＳＣＯＨ−ＳＨ４−ｂ５６足場と称される。
【０２５２】
得られた一本鎖構築物の設計を表ＶＩＩＩに示す。一本鎖構築物を、ＳＨ４標的の切断を誘導するそれらの能力についてＣＨＯにおいて試験した。
【０２５３】
ａ）一本鎖分子のクローニング
一連の合成遺伝子アセンブリをMWG-EUROFINSに依頼した。ＳＨ４を標的とする異なる一本鎖変異体をコードする合成遺伝子を、ＡｓｃＩ制限部位及びＸｈｏＩ制限部位を用いてｐＣＬＳ１８５３にクローニングした。
【０２５４】
ｂ）哺乳動物細胞における染色体外アッセイ
ＣＨＯ Ｋ１細胞を上に記載のようにトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後に、培養培地を除去し、β−ガラクトシダーゼ液体アッセイのための溶解／曝露バッファーを１５０μｌ添加した。３７℃でのインキュベーション後、ＯＤを４２０ｎｍで測定した。全プロセスを自動Ｖｅｌｏｃｉｔｙ１１ ＢｉｏＣｅｌプラットフォーム上で行った。１回のアッセイにつき、１５０ｎｇの標的ベクターを、３．１２ｎｇから２５ｎｇまでの漸増量の変異体ＤＮＡ（１２．５ｎｇ＋１２．５ｎｇのヘテロ二量体ＤＮＡに相当する２５ｎｇの一本鎖ＤＮＡ）と共トランスフェクトした。最後に、トランスフェクトしたＤＮＡ変異体のＤＮＡ量は３．１２ｎｇ、６．２５ｎｇ、１２．５ｎｇ及び２５ｎｇであった。トランスフェクトしたＤＮＡの総量は、空ベクター（ｐＣＬＳ０００２）を用いて１７５ｎｇ（標的ＤＮＡ、変異体ＤＮＡ、担体ＤＮＡ）とした。
【０２５５】
ｃ）結果
表ＶＩＩＩに記載の一本鎖分子を、ＳＨ４標的に対するそれらの活性について、これまでに記載されたＣＨＯアッセイを用いて、本内部対照ＳＣＯＨ−ＲＡＧ及びＩ−Ｓｃｅ Ｉメガヌクレアーゼと比較することによってモニタリングした。全ての活性評価は、３．１２ｎｇ、６．２５ｎｇ、１２．５ｎｇ及び２５ｎｇのＤＮＡトランスフェクト用量で行った。全ての一本鎖分子が、表ＶＩＩＩで報告されるようにＳＨ４標的に対する活性を示していた。
【０２５６】
【表２４】

【０２５７】
変異体は、それらが有する突然変異プロファイルに応じて、アッセイした用量で特異的な挙動を共有していた（図５及び図６）。例えば、ＳＣＯＨ−ＳＨ４−ｂ１Ｃは、内部標準ＳＣＯＨ−ＲＡＧと同じ範囲内の活性レベルを示す（。その活性は、低い量から高い量にかけて増大する。アッセイしたＤＮＡトランスフェクト用量で、その活性はＳＣＯＨ−ＳＨ４−Ｂ５６Ａよりも優れている。
【０２５８】
これらの変異体は全て、異なるレベルの強度で活性であるため、ＳＨ４ゲノム標的化に使用することができる。
【０２５９】
実施例３： ヒト細胞株におけるＳＨ遺伝子座での切断活性の検出
酵母及び哺乳動物細胞（ＣＨＯ Ｋ１細胞）においてＳＨ３標的及びＳＨ４標的を効率的に切断することが可能なＩ−ＣｒｅＩ変異体が、実施例１及び実施例２において同定されている。それらの内因性ＤＮＡ標的配列を切断するＳＨ３メガヌクレアーゼ及びＳＨ４メガヌクレアーゼの効率を次に試験した。本実施例では、ＳＨ３標的配列及びＳＨ４標的配列を切断するように改変されたメガヌクレアーゼが、ヒト細胞においてそれらの同族内因性部位を切断することが実証される。
【０２６０】
非相同末端結合（ＮＨＥＪ）による二本鎖切断の修復は、小さな欠失及び挿入（ＩｎＤｅｌ）を生成し得る（図７）。本来は、このエラーを起こしやすい機構は細胞の生存に有害であり得るが、内因性遺伝子座でのメガヌクレアーゼ活性の迅速な指標をもたらす。
【０２６１】
実施例３．１： 内因性部位で誘導された突然変異誘発の検出
特異性が変化した変異体のスクリーニングに使用される、哺乳動物細胞又は酵母細胞における切断誘導組換えに基づくアッセイが、国際ＰＣＴ出願の国際公開第２００４／０６７７３６号、Epinat et al., Nucleic Acids Res., 2003, 31:2952-2962、Chames et al., Nucleic Acids Res., 2005, 33:e178及び非特許文献６に記載されている。これらのアッセイは、標準方法によってモニタリングすることができる機能的なＬａｃＺレポーター遺伝子をもたらす。
【０２６２】
ｐＣＬＳ１８５３プラスミドにクローニングしたＳＨ３及びＳＨ４に対する一本鎖Ｉ−ＣｒｅＩ変異体を、この実験に使用した。実験の前日に、ヒト胎児腎臓細胞株２９３−Ｈ（Invitrogen）に由来する細胞を、１０ｃｍディッシュに１．２×１０⁶細胞／ディッシュの密度で播種した。翌日、細胞に３μｇの空プラスミド又はメガヌクレアーゼ発現プラスミドを、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Invitrogen）を用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後、細胞を回収し、新鮮培養培地で希釈した（希釈率２０倍）。７日間の培養後、細胞を回収し、ゲノムＤＮＡを抽出した。
【０２６３】
２００ｎｇのゲノムＤＮＡを使用して、メガヌクレアーゼ切断部位の周囲の内因性遺伝子座をＰＣＲ増幅によって増幅した。ＳＨ３遺伝子座に相当する３７７ｂｐの断片は、特異的なＰＣＲプライマーＡ（配列番号４４；５’−ｔｇｇｇｇｇｔｃｔｔａｃｔｃｔｇｔｔｔｃｃｃ−３’）及びＰＣＲプライマーＢ（配列番号４５；５’−ａｇｇａｇａｇｔｃｃｔｔｃｔｔｔｇｇｃｃ−３’）を用いて増幅した。ＳＨ４遺伝子座に相当する３９６ｂｐの断片は、ＰＣＲプライマーＣ（配列番号４６；５’−ｇａｇｔｇａｔａｇｃａｔａａｔｇａａａａｃｃ−３’）及びＰＣＲプライマーＤ（配列番号４７；５’−ｃｔｃａｃｃａｔａａｇｔｃａａｃｔｇｔｃｔｃ−３’）を用いて増幅した。ＰＣＲ増幅を４５４シークエンシングシステム（454 Life Sciences）上で行い、シークエンシングサービスを提供する会社（GATC Biotech AG，Germany）によって供給される特異的なアダプター配列（配列番号４８；５’−ＣＣＡＴＣＴＣＡＴＣＣＣＴＧＣＧＴＧＴＣＴＣＣＧＡＣＴＣＡＧ−３’及び配列番号４９；５’−ＣＣＴＡＴＣＣＣＣＴＧＴＧＴＧＣＣＴＴＧＧＣＡＧＴＣＴＣＡＧ−３’）に隣接する断片を得た。平均して１８０００個の配列が２つの単位複製配列のプール（各々５００ｎｇ）から得られた。シークエンシング後、種々のサンプルを、上記のアダプターの最初に導入したバーコード配列に基づき同定した。
【０２６４】
次いで、配列をそれぞれＳＨ３又はＳＨ４の切断部位における挿入又は欠失の存在について分析した。
【０２６５】
実施例３．２： 結果
表ＩＸに得られた結果をまとめる。
【０２６６】
【表２５】

【０２６７】
ＳＨ３遺伝子座を標的とするメガヌクレアーゼをトランスフェクトした細胞から抽出したゲノムＤＮＡの分析によって、１２８４１個の分析した配列のうち５６個（０．４４％）がＳＨ３の認識部位内にＩｎＤｅｌ事象を有することが示された。同様に、ＳＨ４遺伝子座を標的とするメガヌクレアーゼのトランスフェクション後、８２５９個の分析した配列のうち１８個（０．２２％）がＳＨ４の認識部位内にＩｎＤｅｌ事象を有していた。
【０２６８】
小さな欠失又は挿入はＰＣＲ又はシークエンシングのアーチファクト（artefacts）に関連し得るため、同じ遺伝子座を、メガヌクレアーゼを発現しないプラスミドのトランスフェクション後に分析した。ＳＨ３遺伝子座及びＳＨ４遺伝子座の分析から、ＩｎＤｅｌ事象を実質的に全く検出することができないことが明らかとなった。実際に、分析した配列の０．０５％（１／２１５３）及び０．０２％（３／１２８１１）しか突然変異を含有しなかった。
【０２６９】
さらに、ＤＮＡ挿入配列又はＤＮＡ欠失配列のサイズの分析（図８）から、小さな挿入（５ｂｐ未満）及び小さな欠失（１０ｂｐ未満）の優勢な同様のタイプの事象が明らかとなった。
【０２７０】
これらのデータから、それぞれＳＨ３遺伝子座又はＳＨ４遺伝子座を標的とするように改変されたメガヌクレアーゼが、ヒト細胞において活性であり、それらの同族内因性配列を切断することができることが実証される。さらに、メガヌクレアーゼが、遺伝子ＯＲＦを破壊し、それにより対応する遺伝子発現産物を不活性化し得る配列内に小さなＩｎＤｅｌ事象を発生させる能力があることが示される。
【０２７１】
実施例４： ヒト細胞における内因性ＳＨ３及びＳＨ４遺伝子座での遺伝子標的化
改変された一本鎖ＳＨ３メガヌクレアーゼ及び一本鎖ＳＨ４メガヌクレアーゼの切断活性を検証するために、内因性ヒトＳＨ３遺伝子座及び内因性ヒトＳＨ４遺伝子座で相同組換えを刺激するそれらの能力を次に評価した。細胞に、一本鎖分子ＳＣＯＨ−ＳＨ３−ｂ１−Ｃ又はＳＣＯＨ−ＳＨ４−ｂ１−Ｃに対する哺乳動物発現プラスミド及び標的化構築物を含むベクターをトランスフェクトした。標的化構築物を含むベクター（「ドナー修復プラスミド」とも称される）は、ヒトＳＨ３遺伝子座又はヒトＳＨ４遺伝子座に相同な２つの配列に隣接する外因性ＤＮＡ配列からなる２．８ｋｂの配列を含有するｐＣＬＳ３７７７プラスミド又はｐＣＬＳ３７７８プラスミドであった。ヒトＳＨ３遺伝子座又はヒトＳＨ４遺伝子座に相同な配列は１．５ｋｂの長さを有していた。メガヌクレアーゼによる天然のＳＨ３遺伝子座又はＳＨ４遺伝子座の切断は、ドナー修復プラスミドを修復マトリックスとして使用し得る相同組換えのための基質を生じる。このため、ＳＨ３遺伝子座又はＳＨ４遺伝子座で標的化組込みが起こる頻度は、ゲノムＳＨ３標的部位又はゲノムＳＨ４標的部位の切断効率を示す。
【０２７２】
実施例４．１： 材料及び方法
ａ）メガヌクレアーゼ発現プラスミド
本実施例で使用されるメガヌクレアーゼは、哺乳動物発現ベクターにクローニングされ、それぞれプラスミドｐＣＬＳ２６９７及びｐＣＬＳ２７０５を生じるＳＣＯＨ−ＳＨ３−ｂ１−Ｃ及びＳＣＯＨ−ＳＨ４−ｂ１−Ｃである。
【０２７３】
ｂ）ドナー修復プラスミド
ＳＨ３遺伝子標的化実験については、ドナープラスミドは以下のものを含有していた：
左ホモロジーアームとして、ＳＨ３遺伝子座のＰＣＲ生成断片（染色体６上の６８５０５１０位〜６８５２０５１位、ＮＣ＿０００００６．１１）。この断片は１５４０ｂｐの長さを有する；
右ホモロジーアームとして、ＳＨ３遺伝子座の断片（染色体６上の６８５２１０７位〜６８５３６７７位、ＮＣ＿０００００６．１１）。この断片は１５７１ｂｐの長さを有する。
【０２７４】
ＳＨ４遺伝子標的化実験については、ドナープラスミドは以下のものを含有していた：
左ホモロジーアームとして、ＳＨ４遺伝子座のＰＣＲ生成断片（染色体７上の１１４９７２７５１位〜１１４９７４２６９位、ＮＣ＿０００００７．１３）。この断片は１５１９ｂｐの長さを有する；及び
右ホモロジーアームとして、ＳＨ４遺伝子座の断片（染色体７上の１１４９７４３１６位〜１１４９７６３８０位、ＮＣ＿０００００７．１３）。この断片は２０６５ｂｐの長さを有する。
【０２７５】
ＳＨ３及びＳＨ４の両方について、左ホモロジーアーム及び右ホモロジーアームを、２つのＣＭＶプロモーター及びネオマイシン耐性遺伝子を含有する２．８ｋｂの外因性ＤＮＡ断片のそれぞれ上流（ＡｓｃＩ部位を用いる）及び下流（ＳｂｆＩ部位を用いる）に挿入した。得られたプラスミドはｐＣＬＳ３７７７（ＳＨ３に対する）及びｐＣＬＳ３７７８（ＳＨ４に対する）と称される。
【０２７６】
ｃ）Ｓｈ３遺伝子及びＳｈ４遺伝子の標的化実験
ヒト胎児腎臓２９３Ｈ細胞（Invitrogen）を、１０ｃｍディッシュ１枚当たり１×１０⁶細胞の密度で、完全培地（２ｍＭ Ｌ−グルタミン、ペニシリン（１００ＵＩ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、アムホテリシンＢ（Ｆｏｎｇｉｚｏｎｅ）（０．２５μｇ／ｍｌ）（Invitrogen-Life Science）及び１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ）中で平板培養した。翌日、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００トランスフェクション試薬（Invitrogen）を用い、供給業者のプロトコルに従って細胞をトランスフェクトした。簡潔に述べると、２μｇのドナープラスミドを３μｇの一本鎖メガヌクレアーゼ発現ベクターと共トランスフェクトした。３７℃で７２時間のインキュベーション後、細胞をトリプシン処理し、９６ウェルプレートにおいて１ウェル当たり１０細胞又は１００細胞で、完全培地中で平板培養した。細胞が８０％〜１００％コンフルエントになった時点で、ＺＲ−９６ゲノムＤＮＡキット（Zymo research）を用い、供給業者のプロトコルに従ってゲノムＤＮＡ抽出を行った。
【０２７７】
ｄ）遺伝子標的化事象のＰＣＲ分析
遺伝子標的化頻度を、以下のプライマーを用いたゲノムＤＮＡに対するＰＣＲによって決定した：ＳＨ３については５’−ＣＴＧＴＧＴＧＣＴＡＴＧＡＴＣＴＴＧＣＣ−３’（ＳＨ３ＧＨＧＦ４；配列番号５０）及び５’−ＣＣＴＧＴＣＴＣＴＴＧＡＴＣＡＧＡＴＣＣ−３’（ＮｅｏＲ２；配列番号５１）、並びにＳＨ４については５’−ＧＴＧＧＣＣＴＣＴＣＡＧＴＣＴＧＴＴＴＡ−３’（ＳＨ４ＧＨＧＦ２；配列番号５２）及び５’−ＡＧＴＣＡＴＡＧＣＣＧＡＡＴＡＧＣＣＴＣ−３’（ＮｅｏＲ５；配列番号５３）。ＰＣＲによって、２５００ｂｐ（ＳＨ３）又は２２６８ｂｐ（ＳＨ４）の遺伝子標的化特異的ＰＣＲ産物が得られる。ＳＨ３ＧＨＧＦ４プライマー及びＳＨ４ＧＨＧＦ２プライマーは、ドナー修復プラスミドの左ホモロジーアームの上流に位置するフォワードプライマーである。ＮｅｏＲプライマーは、ドナー修復プラスミドの２つのホモロジーアームの間に挿入される外因性ＤＮＡに位置するリバースプライマーである。
【０２７８】
実施例４．２： 結果
ヒト胎児腎臓２９３Ｈ細胞に、２つの一本鎖ＳＨ３メガヌクレアーゼ又は一本鎖ＳＨ４メガヌクレアーゼの一方を発現するプラスミド及びドナー修復プラスミドｐＣＬＳ３７７７又はｐＣＬＳ３７７８を共トランスフェクトした。自発的組換えの対照として、２９３Ｈ細胞をドナー修復プラスミド単独でもトランスフェクトした。次いで、細胞を９６ウェルマイクロプレートにおいて１ウェル当たり１０細胞又は１００細胞で平板培養した。これらの細胞に由来するゲノムＤＮＡを遺伝子標的化について、材料及び方法の項に記載されるようにＰＣＲによって分析した。
【０２７９】
メガヌクレアーゼの非存在下（修復プラスミド単独）では、１０個又は１００個の細胞のプールにおいて分析した２２５６０個及び１８８００個の細胞（それぞれＳＨ３及びＳＨ４に対する）の中でＰＣＲ陽性シグナルは検出されなかった。
【０２８０】
これに対し、ＳＨ３メガヌクレアーゼの存在下では、１００個の細胞のプールにおいて分析した１８８００個の細胞の中で１２個の陽性クローンが検出され、それにより組換えの頻度が０．０６４％であることが示された。ＳＨ４メガヌクレアーゼの存在下では、１０個の細胞のプールにおいて分析した３７６０個の細胞の中で１１個の陽性クローンが検出され、組換えの頻度が０．２９％であることが示された。結果を下記表Ｘに提示する。ここで示される組換え頻度は、平板培養した全ての細胞が再び分裂を開始したわけではないため、低く見積もったものである。平板培養時の生存率はこのため、約３３％であると推定することができる。したがって、組換えの頻度はおそらく３倍低く見積もられている。
【０２８１】
【表２６】

【０２８２】
これらの結果から、２つの一本鎖分子ＳＣＯＨ−ＳＨ３−ｂ１−Ｃ及びＳＣＯＨ−ＳＨ４−ｂ１−Ｃが、それぞれ内因性ＳＨ３遺伝子座及び内因性ＳＨ４遺伝子座で高レベルの遺伝子標的化を誘導することが可能であることが実証される。
【０２８３】
実施例５： ＳＨ６遺伝子座を標的とするメガヌクレアーゼの改変
ＳＨ６は、染色体２１上に存在する２４ｂｐの非パリンドローム標的（ＴＴＡＡＴＡＣＣＣＣＧＴＡＣＣＴＡＡＴＡＴＴＧＣ、配列番号５９）を含む遺伝子座である。ＳＨ６は、Schwarzwaelder et al.（J Clin Invest 2007:2241-9）に開示されるＲＩＳの近傍に位置する。ＳＨ６配列は、Deichmann et alに記載されるＣＩＳのいずれにも含まれない。
【０２８４】
実施例５．１． ＳＨ６を切断するメガヌクレアーゼの同定
ＳＨ６標的配列を切断する可能性があるヘテロ二量体形態のＩ−ＣｒｅＩ変異体を、遺伝子操作によって構築した。次いで、かかる変異体の対を酵母において共発現させた。共発現時に３つの分子種、すなわち２つのホモ二量体及び１つのヘテロ二量体が得られる。次いで、このヘテロ二量体が配列番号５９のＳＨ６標的配列を切断することが可能であるか否かを決定した。
【０２８５】
ａ）ＳＨ６標的配列に由来するパリンドローム配列を切断するＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼの変異体の構築
ＳＨ６配列は部分的に、図９に示される１０ＡＡＴ＿Ｐ（配列番号６０）、５ＣＣＣ＿Ｐ（配列番号６１）、１０ＡＡＴ＿Ｐ（配列番号６０）、５ＴＡＧ＿Ｐ（配列番号６２）標的配列の組合せである。これらの配列は、国際ＰＣＴ出願の国際公開第２００６／０９７７８４号及び国際公開第２００６／０９７８５３号、非特許文献６、並びに非特許文献８に記載のように得られるメガヌクレアーゼによって切断される。このため、ＳＨ６は、これらのこれまでに同定されたメガヌクレアーゼから生じるコンビナトリアル変異体によって切断されるはずである。
【０２８６】
２つのパリンドローム標的ＳＨ６．３及びＳＨ６．４は、ＳＨ６に由来するものであった（図９）。ＳＨ６．３及びＳＨ６．４はパリンドローム性であるため、ホモ二量体タンパク質によって切断されるはずである。したがって、配列番号６３のＳＨ６．３パリンドローム標的配列又は配列番号６４のＳＨ６．４パリンドローム標的配列のいずれかを切断するホモ二量体Ｉ−ＣｒｅＩ変異体は、Chames et al.（Nucleic Acids Res., 2005, 33, e178）、非特許文献６、非特許文献８及び非特許文献７に記載されるものに基づく方法を用いて構築した。
【０２８７】
ｂ）標的ベクターの構築
実験手順は、ＳＨ６標的配列（５’−ＴＧＧＣＡＴＡＣＡＡＧＴＴＴＴＴＡＡＴＡＣＣＣＣＧＴＡＣＣＴＡＡＴＡＴＴＧＣＣＡＡＴＣＧＴＣＴＧＴＣＡ−３’（配列番号６５））に相当するオリゴヌクレオチドを使用した以外は実施例１．１に記載されるものである。
【０２８８】
ｃ）変異体の共発現
ｐＣＬＳ５４２発現ベクター及びｐＣＬＳ１１０７発現ベクターにおいてＳＨ６．３標的及びＳＨ６．４標的を切断する変異体に由来する酵母ＤＮＡを、標準プロトコルを用いて抽出し、大腸菌を形質転換するために使用した。形質転換体を、ロイシンを欠き、Ｇ４１８を含有する合成培地上で選択した。
【０２８９】
ｄ）メガヌクレアーゼを共発現するクローンの接合及び酵母におけるスクリーニング
接合はコロニーグリッダー（ＱｐｉｘＩＩ、Genetix）を用いて行った。変異体をＹＰＤプレートを覆うナイロンフィルター上に、低グリッド密度（４〜６スポット／ｃｍ²）を用いてグリッドした。第２のグリッドプロセスを同じフィルター上で行い、各々の標的について異なるレポーターを有する酵母株からなる第２の層をスポットした。膜を固形寒天ＹＰＤ富栄養培地上に置き、３０℃で一晩インキュベートして接合させた。次に、フィルターを、ロイシン及びトリプトファンを欠き、ガラクトース（２％）を炭素源として含むＧ４１８を添加した合成培地に移し、３７℃で５日間インキュベートして、発現ベクター及び標的ベクターを保有する２倍体を選択した。５日後、フィルターを、０．５Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）中の０．０２％Ｘ−Ｇａｌ、０．１％ＳＤＳ、６％ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、７ｍＭ β−メルカプトエタノール、１％アガロースを含む固形アガロース培地上に置き、３７℃でインキュベートして、β−ガラクトシダーゼ活性をモニタリングした。結果をスキャニングによって分析し、適切なソフトウェアを用いて定量化を行った。
【０２９０】
ｅ）結果
ＳＨ６．４標的を切断する１０個の変異体及びＳＨ６．３標的を切断する２個の変異体の共発現は、２つを除く全ての事例においてＳＨ６．１標的の切断をもたらした。これらの２つの事例は、二重形質転換体が得られなかった場合に相当する。機能的組合せを表ＸＩにまとめる。
【０２９１】
【表２７】

【０２９２】
実施例５．２． ＣＨＯ細胞における染色体外モデルでのＳＨ６標的切断の検証
ヘテロ二量体を形成した場合に酵母においてＳＨ６標的を効率的に切断することが可能なＩ−ＣｒｅＩ変異体は、上の実施例５．１で記載している。ＣＨＯ細胞においてＳＨ３標的に対して最大切断活性を示すヘテロ二量体を同定するために、これらの変異体の幾つかの効率を、ＣＨＯ細胞における染色体外アッセイを用いて比較した。ＣＨＯ細胞におけるスクリーニングは、メガヌクレアーゼによる標的の切断がＬａｇｏＺレポーター遺伝子（細菌ｌａｃＺ遺伝子の誘導体）の相同組換え及び発現を誘導する一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）ベースのアッセイである。
【０２９３】
ａ）ＣＨＯスクリーニングのためのベクターにおけるＳＨ６標的のクローニング
標的を以下のようにクローニングした。ゲートウェイクローニング配列に隣接するＳＨ６標的配列に相当するオリゴヌクレオチドを、PROLIGOにオーダーした（５’−ＴＧＧＣＡＴＡＣＡＡＧＴＴＴＴＴＡＡＴＡＣＣＣＣＧＴＡＣＣＴＡＡＴＡＴＴＧＣＣＡＡＴＣＧＴＣＴＧＴＣＡ−３’（配列番号６５））。一本鎖オリゴヌクレオチドのＰＣＲ増幅によって生成した二本鎖標的ＤＮＡを、ゲートウェイプロトコル（INVITROGEN）を用いてＣＨＯレポーターベクター（ｐＣＬＳ１０５８）にクローニングした。クローニングした標的をシークエンシング（MILLEGEN）によって検証した。
【０２９４】
ｂ）メガヌクレアーゼの再クローニング
実施例５．１で同定されたＳＨ６．３標的及びＳＨ６．４標的を切断するＩ−ＣｒｅＩ変異体のＯＲＦをｐＣＬＳ２４３７にサブクローニングした。ＯＲＦを、酵母ＤＮＡ上で以下のプライマー：５’−ＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＧＧＣＧＣＧＣＣＴＡＣＡＣＡＧＣＧＧＣＣＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧ−３’（配列番号６６）及び５’−ＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＧＣＴＡＧＣＧＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＣＡＧＴＣＧＧ−３’（配列番号６７）のプライマーを用いてＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ産物をＣＨＯ発現ベクターｐＣＬＳ２４３７に、内部断片置き換えのためのＡｓｃＩ及びＸｈｏＩを用いてクローニングした。ライゲーション工程及び大腸菌形質転換工程から得られる選択されたクローンを、シークエンシング（MILLEGEN）によって検証した。
【０２９５】
ｃ）哺乳動物細胞における染色体外アッセイ
ＣＨＯ Ｋ１細胞を、Ｐｏｌｙｆｅｃｔ（商標）トランスフェクション試薬を用い、供給業者のプロトコル（QIAGEN）に従ってトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後に、培養培地を除去し、β−ガラクトシダーゼ液体アッセイのための溶解／曝露バッファーを１５０μｌ（通常は、１００ｍｌの溶解バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００、０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、プロテアーゼ阻害剤）、１０ｍｌのＭｇ １００Ｘバッファー（１００ｍＭ ＭｇＣｌ₂、３５％β−メルカプトエタノール）、１１０ｍｌのＯＮＰＧ（８ｍｇ／ｍｌ）及び７８０ｍｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）を含有するバッファーを１リットル）添加した。３７℃でのインキュベーション後、ＯＤを４２０ｎｍで測定した。全プロセスを自動Ｖｅｌｏｃｉｔｙ１１ ＢｉｏＣｅｌプラットフォーム上で行った。１回のアッセイにつき、１５０ｎｇの標的ベクターを、両方の変異体それぞれ１２．５ｎｇ（パリンドロームＳＨ６．３標的を切断する変異体１２．５ｎｇ及びパリンドロームＳＨ６．４標的を切断する変異体１２．５ｎｇ）と共トランスフェクトした。
【０２９６】
ｄ）結果
酵母においてＳＨ６を切断することが可能なヘテロ二量体エンドヌクレアーゼを形成する変異体の１つの組を、ＣＨＯにおいて一時的トランスフェクションでの染色体外アッセイを用いて確認するために選んだ。
【０２９７】
ＳＨ６．３を切断することが可能な単量体は、以下の突然変異：４４Ｋ ７０Ｓ ７５Ｎを含み（ＳＨ６−３−Ｍ１−４４Ｋ ７０Ｓ ７５Ｎと称される）、ＳＨ６．４を切断することが可能な単量体は、以下の突然変異：２８Ｑ ４０Ｒ ４４Ａ ７０Ｌ ７５Ｎ ９６Ｒ １１１Ｈ １４４Ｓを含んでいた（ＳＨ６−４−ＭＢ−２８Ｑ ４０Ｒ ４４Ａ ７０Ｌ ７５Ｎ ９６Ｒ １１１Ｈ １４４Ｓと称される）。
【０２９８】
ＳＨ６配列の切断及び組換えの効率の分析から、Ｉ−ＣｒｅＩ変異体の試験した組合せが、更なる突然変異なしにその切断活性を酵母からＣＨＯ細胞へと移すことが可能であったことが実証される。
【０２９９】
実施例５．３． 一本鎖としての共有結合アセンブリ及びＳＨ６を切断するメガヌクレアーゼの改良
実施例５．１に記載のカッターの共発現は、酵母におけるＳＨ６標的の高い切断活性をもたらす。それらのうちの１つは哺乳動物発現系におけるＳＨ６切断が検証されている（実施例５．２）。
【０３００】
Ｍ１ ｘ ＭＡ ＳＨ６ヘテロ二量体は酵母における高い切断活性をもたらす。Ｍ１は、Ｉ−ＣｒｅＩ野生型配列と比較して以下の突然変異を有するＳＨ６．３カッターである：４４Ｋ ７０Ｓ ７５Ｎ。ＭＡは、Ｉ−ＣｒｅＩ野生型配列と比較して以下の突然変異を有するＳＨ６．４カッターである：７Ｒ ２８Ｑ ４０Ｒ ４４Ａ ７０Ｌ ７５Ｎ １０３Ｔ １２１Ｅ １３２Ｖ １６０Ｒ。
【０３０１】
リンカーＲＭ２（ＡＡＧＧＳＤＫＹＮＱＡＬＳＫＹＮＱＡＬＳＫＹＮＱＡＬＳＧＧＧＧＳ；配列番号１５）を用いて一本鎖構築物を改変し、それにより一本鎖分子：ＭＡ−ＲＭ２−Ｍ１を作製した。この設計工程において、Ｇ１９Ｓ突然変異をＣ末端Ｍ１突然変異体に導入した。加えて、更にＳＣＯＨ−ＳＨ６ ｂ１足場と呼ばれる一本鎖分子：ＭＡ（Ｋ９６Ｅ）−ＲＭ２−ＭＡ（Ｅ８Ｋ Ｅ６１Ｒ）を作り出すために、突然変異Ｋ９６ＥをＭＡ突然変異体に、突然変異Ｅ８Ｋ、Ｅ６１ＲをＭ１突然変異体に導入した。
【０３０２】
４つの更なるアミノ酸置換が、これまでの研究においてＩ−ＣｒｅＩ誘導体の活性を増強することが見出されている。これらの突然変異は、フェニルアラニン５４のロイシンでの置き換え（Ｆ５４Ｌ）、グルタミン酸８０のリジンでの置き換え（Ｅ８０Ｋ）、バリン１０５のアラニンでの置き換え（Ｖ１０５Ａ）、及びイソロイシン１３２のバリンでの置き換え（Ｉ１３２Ｖ）に相当する。幾つかの組合せをＮ末端タンパク質断片及びＣ末端タンパク質断片のコード配列に導入し、得られたタンパク質の最初のバッチを、ＳＨ６標的の切断を誘導するそれらの能力についてアッセイした。
【０３０３】
ａ）ＳＣ−ＯＨ一本鎖構築物への更なる突然変異の導入
更なる突然変異を、Stratagene/Agilent technologies Inc製のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用い、製造業者の使用説明書に従って導入した。オリゴヌクレオチドの第１のセットを使用して、第１の単量体に相当する一本鎖分子の一部に突然変異を導入した。オリゴヌクレオチドの第２のセットを、同じ突然変異を表ＸＩＩに示される第２の単量体に相当する一本鎖分子の第２の部分に特異的に導入するように設計した。
【０３０４】
【表２８】

【０３０５】
このプロセスの間に得られた単離クローンをシークエンシングして、得られる特異的な突然変異プロファイルを確認した。次いで、関心のプロファイルをＣＨＯ ＳＳＡアッセイにおいて記載の最初の構築物と比較して試験した。
【０３０６】
ｂ）哺乳動物細胞における染色体外アッセイ
ＣＨＯ Ｋ１細胞を上に記載されるようにトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後に、培養培地を除去し、β−ガラクトシダーゼ液体アッセイのための溶解／曝露バッファーを１５０μｌ添加した。３７℃でのインキュベーション後、ＯＤを４２０ｎｍで測定した。全プロセスを自動Ｖｅｌｏｃｉｔｙ１１ ＢｉｏＣｅｌプラットフォーム上で行った。
【０３０７】
１回のアッセイにつき、１５０ｎｇの標的ベクターを、３．１２ｎｇから２５ｎｇまでの漸増量の変異体ＤＮＡ（１２．５ｎｇ＋１２．５ｎｇのヘテロ二量体ＤＮＡに相当する２５ｎｇの一本鎖ＤＮＡ）と共トランスフェクトした。最後に、トランスフェクトしたＤＮＡ変異体のＤＮＡ量は３．１２ｎｇ、６．２５ｎｇ、１２．５ｎｇ及び２５ｎｇであった。トランスフェクトしたＤＮＡの総量は、空ベクター（ｐＣＬＳ０００１）を用いて１７５ｎｇ（標的ＤＮＡ、変異体ＤＮＡ、担体ＤＮＡ）とした。
【０３０８】
ｃ）結果
ＳＨ６標的に対するＳＣＯＨ−ＳＨ６−ｂ１−Ｃ（ｐＣＬＳ２７９６）及びＳＣＯＨ−ＳＨ６−ｂ１−Ｂ（ｐＣＬＳ２９２８）一本鎖分子（表ＸＩＩＩを参照されたい）の活性を、これまでに記載されたＣＨＯアッセイを用い、ＳＨ６．３−Ｍ１ ｘ ＳＨ６．４−ＭＢを形成するヘテロ二量体及び本内部対照ＳＣＯＨ−ＲＡＧ及びＩ−Ｓｃｅ Ｉメガヌクレアーゼと比較することによってモニタリングした。全ての比較は、３．１２ｎｇ、６．２５ｎｇ、１２．５ｎｇ及び２５ｎｇのトランスフェクトした変異体ＤＮＡで行った（図１０）。２つの一本鎖メガヌクレアーゼは、開始(starting)ヘテロ二量体よりも効率的にＳＨ６標的を切断することが可能であった。最良の分子ＳＣＯＨ−ＳＨ６−ｂ１−Ｃの活性を、メガヌクレアーゼの新たなバッチにおいて上に記載されたものに更なる突然変異を導入することによって更に改善した。
【０３０９】
【表２９】

【０３１０】
更なる突然変異を材料及び方法の項に従って一本鎖足場に更に導入した。得られて試験した分子を表ＸＩＶに挙げる。
【０３１１】
【表３０】

【０３１２】
全ての変異体は記載の条件で活性であり、それらが有する突然変異プロファイルに応じて、アッセイした用量で特異的な挙動を共有していた（図１０）。例えば、ＱＣＳＨ６１−Ｈ０１ａ、ＱＣＳＨ６１−Ｈ０１ｂ、ＱＣＳＨ６１−Ｈ０１ｃ、ＱＣＳＨ６１−Ｈ０１ｄは、本内部標準ＳＣＯＨ−ＲＡＧと同様のプロファイルを有する。これらは低用量であっても非常に活性な分子である。これらの変異体は全てＳＨ６ゲノム標的化に使用することができた。
【０３１３】
実施例６： ヒト細胞における内因性ＳＨ６遺伝子座での遺伝子標的化
改変された一本鎖ＳＨ６メガヌクレアーゼの切断活性を検証するために、内因性ヒトＳＨ６遺伝子座で相同組換えを刺激するそれらの能力を評価した。細胞に、一本鎖分子ＳＣＯＨ−ＱＣＳＨ６−Ｈ０１（配列番号８１；ｐＣＬＳ３６９０）又はＳＣＯＨ−ＱＣ−ＳＨ６−Ｈ０１−Ｖ２−７Ｅ−７０Ｒ７５Ｄ（配列番号８５；ｐＣＬＳ４３７３）に対する哺乳動物発現プラスミド、及びヒトＳＨ６遺伝子座に相同な２つの配列（どちらも１．５ｋｂ長）に隣接する２．８ｋｂの外因性ＤＮＡ配列を含有するドナー修復プラスミドｐＣＬＳ３７７９（図１３；配列番号２７９）をトランスフェクトした。メガヌクレアーゼによる天然のＳＨ６遺伝子座の切断は、ホモロジーアームに隣接する２．８ｋｂの外因性ＤＮＡを含有するドナー修復プラスミドを修復マトリックスとして使用し得る相同組換えのための基質を生じる。このため、ＳＨ６遺伝子座で標的化組込みが起こる頻度は、ゲノムＳＨ６標的部位の切断効率を示す。
【０３１４】
実施例６．１． 材料及び方法
ａ）メガヌクレアーゼ発現プラスミド
本実施例で使用されるメガヌクレアーゼは、哺乳動物発現ベクターにクローニングされ、それぞれプラスミドｐＣＬＳ３６９０（図１３）及びｐＣＬＳ４３７３を生じるＳＣＯＨ−ＱＣＳＨ６−Ｈ０１（配列番号８１）又はＳＣＯＨ−ＱＣ−ＳＨ６−Ｈ０１−Ｖ２−７Ｅ−７０Ｒ７５Ｄ（配列番号８５）である。
【０３１５】
ｂ）ドナー修復プラスミド
ドナープラスミドは、左ホモロジーアームとしてＳＨ６遺伝子座のＰＣＲ生成１５１７ｂｐ断片（染色体２１上の１８４３７７７１位〜１８４３９２８７位、ＮＣ＿００００２１．８）、及び右ホモロジーアームとして、ＳＨ６遺伝子座の１５７１ｂｐ断片（染色体２１上の１８４３９３４３位〜１８４４０８４６位、ＮＣ＿００００２１．８）を含有する。左ホモロジーアーム及び右ホモロジーアームを、２つのＣＭＶプロモーター及びネオマイシン耐性遺伝子を含有する２．８ｋｂの外因性ＤＮＡ断片のそれぞれ上流（ＡｓｃＩ部位を用いる）及び下流（ＳｂｆＩ部位を用いる）に挿入した。得られたプラスミドはｐＣＬＳ３７７９（図１３；配列番号２７９）である。
【０３１６】
ｃ）Ｓｈ６遺伝子標的化実験
ヒト胎児腎臓２９３Ｈ細胞（Invitrogen）を、１０ｃｍディッシュ１枚当たり１×１０⁶細胞の密度で、完全培地（２ｍＭ Ｌ−グルタミン、ペニシリン（１００ＵＩ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、アムホテリシンＢ（Ｆｏｎｇｉｚｏｎｅ）（０．２５μｇ／ｍｌ）（Invitrogen-Life Science）及び１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ）中で平板培養した。翌日、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００トランスフェクション試薬（Invitrogen）を用い、供給業者のプロトコルに従って細胞をトランスフェクトした。簡潔に述べると、２μｇのドナープラスミドを３μｇの一本鎖メガヌクレアーゼ発現ベクターと共トランスフェクトした。３７℃で７２時間のインキュベーション後、細胞をトリプシン処理し、９６ウェルプレートにおいて１ウェル当たり１０細胞又は１００細胞で、完全培地中で平板培養した。代替的に、３７℃で７２時間のインキュベーション後、細胞をトリプシン処理し、１０ｃｍディッシュ１枚当たり３００細胞で、完全培地中で平板培養した。３７℃で２週間のインキュベーション後、個々のクローン細胞コロニーを採取し、９６ウェルプレートにおいて完全培地中で平板培養した。細胞が８０％〜１００％コンフルエントになった時点で、ＺＲ−９６ゲノムＤＮＡキット（Zymo research）を用い、供給業者のプロトコルに従ってゲノムＤＮＡ抽出を行った。
【０３１７】
ｄ）遺伝子標的化事象のＰＣＲ分析
遺伝子標的化の頻度を、プライマーＳＨ６ＧＨＧＦ３：５’−ＣＡＡＴＧＧＡＧＴＴＴＴＧＧＡＧＣＣＡＣ−３’（配列番号２８０）及びＮｅｏＲ９：５’−ＡＴＣＡＧＡＧＣＡＧＣＣＧＡＴＴＧＴＣＴ−３’（配列番号２８１）を用いたゲノムＤＮＡに対するＰＣＲによって決定した。ＰＣＲによって、２３００ｂｐの遺伝子標的化特異的ＰＣＲ産物が得られる（図１４）。ＳＨ６ＧＨＧＦ３プライマーは、ドナー修復プラスミドの左ホモロジーアームの上流に位置するフォワードプライマーである。ＮｅｏＲ９プライマーは、ドナー修復プラスミドの２つのホモロジーアームの間に挿入される外因性ＤＮＡに位置するリバースプライマーである。
【０３１８】
実施例６．２． 結果
ヒト胎児腎臓２９３Ｈ細胞に、２つのベクター：２つの一本鎖ＳＨ６メガヌクレアーゼの一方を発現するプラスミド及びドナー修復プラスミドｐＣＬＳ３７７９（図１３；配列番号２７９）を共トランスフェクトした。自発的組換えの対照として、２９３Ｈ細胞をドナー修復プラスミド単独でもトランスフェクトした。次いで、細胞を９６ウェルマイクロプレートにおいて１ウェル当たり１０細胞又は１００細胞で、又は１０ｃｍディッシュ１枚当たり３００細胞で平板培養し、２週間後にクローンコロニーを単離し、９６ウェルマイクロプレートにおいて平板培養した。これらの細胞に由来するゲノムＤＮＡを遺伝子標的化について、材料及び方法の項に記載されるようにＰＣＲによって分析した。メガヌクレアーゼの非存在下（修復プラスミド単独）では、１０個又は１００個の細胞のプールにおいて分析した６７６８０個の細胞の中で５個のＰＣＲ陽性シグナルが検出され、０．００７％の自発的組換えの頻度が示された。対照的に、ＳＣＯＨ−ＱＣＳＨ６−Ｈ０１メガヌクレアーゼ（配列番号８１；ｐＣＬＳ３６９０）又はＳＣＯＨ−ＱＣ−ＳＨ６−Ｈ０１−Ｖ２−７Ｅ−７０Ｒ７５Ｄメガヌクレアーゼ（配列番号８５；ｐＣＬＳ４７７３）の存在下では、１０個又は１００個の細胞のプールにおいて分析した７３３２０個及び１８８００個の細胞の中で１７７個及び３５個の陽性シグナルが検出され、それぞれ０．２４％及び０．１９％の組換えの頻度が示された。結果を表ＸＶに提示する。これらの結果から、２つの一本鎖分子ＳＣＯＨ−ＱＣＳＨ６−Ｈ０１（配列番号８１；ｐＣＬＳ３６９０）及びＳＣＯＨ−ＱＣ−ＳＨ６−Ｈ０１−Ｖ２−７Ｅ−７０Ｒ７５Ｄ（配列番号８５；ｐＣＬＳ４７７３）が、内因性ｓｈ６遺伝子座で高レベルの遺伝子標的化を誘導することが可能なことが実証される。
【０３１９】
【表３１】

【０３２０】
実施例７： ヒト細胞における内因性ｓｈ６遺伝子座での遺伝子標的化後の導入遺伝子発現
ｓｈ６遺伝子座での導入遺伝子発現を支持するｓｈ６遺伝子座の能力、改変された一本鎖ＳＨ６メガヌクレアーゼの切断活性を検証するために、ネオマイシン耐性遺伝子発現カセットを含有する修復プラスミドを用いて遺伝子標的化実験を行い、ネオマイシン含有培地中で成長する修飾細胞の能力を測定した。ネオマイシンの存在下での細胞の生存及び成長はネオマイシン耐性遺伝子の発現に依存し、したがって標的化組込み後のＳＨ６遺伝子座での導入遺伝子の発現を示す。
【０３２１】
実施例７．１． 材料及び方法
ａ）メガヌクレアーゼ発現プラスミド
本実施例で使用されるメガヌクレアーゼは、哺乳動物発現ベクターにクローニングされ、プラスミドｐＣＬＳ３６９０を生じるＳＣＯＨ−ＱＣＳＨ６−Ｈ０１（配列番号８１）である。
【０３２２】
ｂ）ドナー修復プラスミド
ドナープラスミドは、左ホモロジーアームとしてＳＨ６遺伝子座のＰＣＲ生成１５１７ｂｐ断片（染色体２１上の１８４３７７７１位〜１８４３９２８７位、ＮＣ＿００００２１．８）、及び右ホモロジーアームとして、ＳＨ６遺伝子座の１５７１ｂｐ断片（染色体２１上の１８４３９３４３位〜１８４４０８４６位、ＮＣ＿００００２１．８）を含有する。左ホモロジーアーム及び右ホモロジーアームを、２つのＣＭＶプロモーター及びネオマイシン耐性遺伝子を含有する２．８ｋｂの外因性ＤＮＡ断片のそれぞれ上流（ＡｓｃＩ部位を用いる）及び下流（ＳｂｆＩ部位を用いる）に挿入した。得られたプラスミドはｐＣＬＳ３７７９（図１３；配列番号２７９）である。
【０３２３】
ｃ）Ｓｈ６遺伝子標的化実験
ヒト胎児腎臓２９３Ｈ細胞（Invitrogen）を、１０ｃｍディッシュ１枚当たり１×１０⁶細胞の密度で、完全培地（２ｍＭ Ｌ−グルタミン、ペニシリン（１００ＵＩ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、アムホテリシンＢ（Ｆｏｎｇｉｚｏｎｅ）（０．２５μｇ／ｍｌ）（Invitrogen-Life Science）及び１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ）中で平板培養した。翌日、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００トランスフェクション試薬（Invitrogen）を用い、供給業者のプロトコルに従って細胞をトランスフェクトした。簡潔に述べると、２μｇのドナープラスミドを３μｇの一本鎖メガヌクレアーゼ発現ベクターと共トランスフェクトした。３７℃で７２時間のインキュベーション後、細胞をトリプシン処理し、１０ｃｍディッシュ１枚当たり３００細胞で、完全培地中で平板培養した。３７℃で２週間のインキュベーション後、個々のクローン細胞コロニーを採取し、９６ウェルプレートにおいて完全培地中で平板培養した。３７℃で１週間のインキュベーション後、細胞をトリプシン処理し、２つの９６ウェル複製プレートに平板培養して、３７℃でインキュベートした。細胞が８０％〜１００％コンフルエントになった時点で、ＺＲ−９６ゲノムＤＮＡキット（Zymo research）を用い複製プレートの１つで、供給業者のプロトコルに従ってゲノムＤＮＡ抽出を行った。他の複製プレートを使用して遺伝子標的化クローンを単離し、それらを増殖させた。
【０３２４】
ｄ）遺伝子標的化クローンのＰＣＲ同定
遺伝子標的化を、プライマーＳＨ６ＧＨＧＦ３：５’−ＣＡＡＴＧＧＡＧＴＴＴＴＧＧＡＧＣＣＡＣ−３’（配列番号２８０）及びＮｅｏＲ９：５’−ＡＴＣＡＧＡＧＣＡＧＣＣＧＡＴＴＧＴＣＴ−３’（配列番号２８１）を用いたゲノムＤＮＡに対するＰＣＲによって決定した。ＰＣＲによって、２３００ｂｐの遺伝子標的化特異的ＰＣＲ産物が得られる（図１４）。ＳＨ６ＧＨＧＦ３プライマーは、ドナー修復プラスミドの左ホモロジーアームの上流に位置するフォワードプライマーである。ＮｅｏＲ９プライマーは、ドナー修復プラスミドの２つのホモロジーアームの間に挿入される外因性ＤＮＡに位置するリバースプライマーである。
【０３２５】
ｅ）サザンブロット法による標的化組込みの検証
細胞クローンに由来するゲノムＤＮＡを、ＳｔｕＩ制限酵素又はＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素（New England Biolabs）で消化し、０．８％アガロースゲル（gel）上での電気泳動によって分離し、ニトロセルロース膜に転写した。ＤＮＡプローブを、ネオマイシン耐性遺伝子に相同な２５ｎｇのＤＮＡ断片から、³²Ｐ放射標識ｄＣＴＰ及びＲｅｄｉｐｒｉｍｅ ＩＩランダムプライムラベリングシステム（GE Healthcare）を用い、供給業者のプロトコルに従って調製し、ハイブリダイゼーションバッファー（２０ｍＭ ＮａＰｉ、７％ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中でプレインキュベートしたニトロセルロース膜に添加した。６５℃で一晩のインキュベーションの後、膜を洗浄し、放射線写真用フィルムに感光させた。期待されるバンドの放射線写真上でのサイズは、ＳｔｕＩ消化については５．３ｋｂ、ＨｉｎｄＩＩＩ消化については６．８ｋｂである（図１５）。
【０３２６】
ｆ）ネオマイシン耐性試験：
ＳＨ６遺伝子座で標的化されるＰＣＲによって同定された細胞クローンを、９６ウェルマイクロプレートにおいて１ウェル当たり３００細胞で、Ｇ４１８抗生物質（PAA laboratories）の存在下で平板培養した。３７℃で１０日間のインキュベーションの後、Ｖｉａｌｉｇｈｔバイオアッセイキット（Lonza）及びＶｉｃｔｏｒルミネッセンスリーダー（Perkin Elmer）を用い、供給業者のプロトコルに従って生存能力を測定した。
【０３２７】
実施例７．２． 結果
ヒト胎児腎臓２９３Ｈ細胞に、２つのベクター：２つの一本鎖ＳＨ６メガヌクレアーゼの一方を発現するプラスミド及びドナー修復プラスミドｐＣＬＳ３７７９を共トランスフェクトした。次いで、細胞を１０ｃｍディッシュ１枚当たり３００細胞で平板培養し、２週間後にクローンコロニーを単離し、９６ウェルマイクロプレートにおいて平板培養した。これらの細胞に由来するゲノムＤＮＡを遺伝子標的化について、材料及び方法の項に記載されるようにＰＣＲによって分析した。次いで、ゲノムＤＮＡを使用して、サザンブロット分析により標的化組込みを検証した。クローンの＃７及び＃８は期待されるサイズのバンドを示したが、陰性対照クローンの＃５及び＃６は示さなかった（図１６）。これらの細胞クローンを、Ｇ４１８（PAA laboratories）の存在下で生存するそれらの能力について試験した。標的化組込みを有するクローン（＃７及び＃８）のみが、０．４ｍｇ／ｍｌを上回る濃度のＧ４１８に対する耐性を示した（図１６）。このことは、ｓｈ６遺伝子座での標的化組込みが機能的な導入遺伝子の発現を支持し得ることを示している。
【０３２８】
実施例８． ヒト細胞における内因性ｓｈ６遺伝子座での遺伝子標的化後の近接遺伝子の発現
近接遺伝子の発現を妨げることなく導入遺伝子組込みを支持するｓｈ６遺伝子座の能力を検証するために、２．８ｋｂの外因性ＤＮＡ断片を含有する修復プラスミドを用いて遺伝子標的化実験を行い、標的化組込みを有する細胞クローンを同定した。ｓｈ６組込み部位の上流及び下流の遺伝子の発現を測定し、標的化組込みが起こっていない細胞クローンの発現と比較した。
【０３２９】
実施例８．１． 材料及び方法
ａ）メガヌクレアーゼ発現プラスミド
本実施例で使用されるメガヌクレアーゼは、哺乳動物発現ベクターにクローニングされ、プラスミドｐＣＬＳ３６９０を生じるＳＣＯＨ−ＱＣＳＨ６−Ｈ０１（配列番号８１）である。
【０３３０】
ｂ）ドナー修復プラスミド
ドナープラスミドは、左ホモロジーアームとしてＳＨ６遺伝子座のＰＣＲ生成１５１７ｂｐ断片（染色体２１上の１８４３７７７１位〜１８４３９２８７位、ＮＣ＿００００２１．８）、及び右ホモロジーアームとして、ＳＨ６遺伝子座の１５７１ｂｐ断片（染色体２１上の１８４３９３４３位〜１８４４０８４６位、ＮＣ＿００００２１．８）を含有する。左ホモロジーアーム及び右ホモロジーアームを、２つのＣＭＶプロモーター及びネオマイシン耐性遺伝子を含有する２．８ｋｂの外因性ＤＮＡ断片のそれぞれ上流（ＡｓｃＩ部位を用いる）及び下流（ＳｂｆＩ部位を用いる）に挿入した。得られたプラスミドはｐＣＬＳ３７７９（図１３；配列番号２７９）である。
【０３３１】
ｃ）Ｓｈ６遺伝子標的化実験
ヒト胎児腎臓２９３Ｈ細胞（Invitrogen）を、１０ｃｍディッシュ１枚当たり１×１０⁶細胞の密度で、完全培地（２ｍＭ Ｌ−グルタミン、ペニシリン（１００ＵＩ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、アムホテリシンＢ（Ｆｏｎｇｉｚｏｎｅ）（０．２５μｇ／ｍｌ）（Invitrogen-Life Science）及び１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ）中で平板培養した。翌日、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００トランスフェクション試薬（Invitrogen）を用い、供給業者のプロトコルに従って細胞をトランスフェクトした。簡潔に述べると、２μｇのドナープラスミドを３μｇの一本鎖メガヌクレアーゼ発現ベクターと共トランスフェクトした。３７℃で７２時間のインキュベーション後、細胞をトリプシン処理し、１０ｃｍディッシュ１枚当たり３００細胞で、完全培地中で平板培養した。３７℃で２週間のインキュベーション後、個々のクローン細胞コロニーを採取し、９６ウェルプレートにおいて完全培地中で平板培養した。３７℃で１週間のインキュベーション後、細胞をトリプシン処理し、２つの９６ウェル複製プレートに平板培養し、３７℃でインキュベートした。細胞が８０％〜１００％コンフルエントになった時点で、ＺＲ−９６ゲノムＤＮＡキット（Zymo research）を用い複製プレートの１つで、供給業者のプロトコルに従ってゲノムＤＮＡ抽出を行った。他の複製プレートを使用して遺伝子標的化クローンを単離し、それらを増殖させた。
【０３３２】
ｄ）遺伝子標的化クローンのＰＣＲ同定
遺伝子標的化を、プライマーＳＨ６ＧＨＧＦ３：５’−ＣＡＡＴＧＧＡＧＴＴＴＴＧＧＡＧＣＣＡＣ−３’（配列番号２８０）及びＮｅｏＲ９：５’−ＡＴＣＡＧＡＧＣＡＧＣＣＧＡＴＴＧＴＣＴ−３’（配列番号２８１）を用いたゲノムＤＮＡに対するＰＣＲによって決定した。ＰＣＲによって、２３００ｂｐの遺伝子標的化特異的ＰＣＲ産物が得られる（図ＸＸ）。ＳＨ６ＧＨＧＦ３プライマー（配列番号２８０）は、ドナー修復プラスミドの左ホモロジーアームの上流に位置するフォワードプライマーである。ＮｅｏＲ９プライマー（配列番号２８１）は、ドナー修復プラスミドの２つのホモロジーアームの間に挿入される外因性ＤＮＡに位置するリバースプライマーである。
【０３３３】
ｅ）ｓｈ６遺伝子座の上流及び下流の遺伝子の発現
遺伝子発現を定量ＲＴ−ＰＣＲによって測定した。ＲＮＡをサブコンフルエントな細胞クローンからＲＮｅａｓｙ ＲＮＡ単離キット（Qiagen）を用いて、製造業者のプロトコルに従って単離した。３μｇのＲＮＡを使用し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄキット（Invitrogen）を用いてｃＤＮＡを生成した。定量ＰＣＲを、２連の（duplicate）サンプルにおいて、ＳＹＢＲ（商標）Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（商標）ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Lonza）を用い、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ＭＰＸ３０００機器上で１２μｌの反応につき１０ｎｇのｃＤＮＡに対して行った。各々の遺伝子について、使用したプライマーを以下の表に挙げる。
【０３３４】
【表３２】

【０３３５】
サイクル閾値（threshold cycles）（Ｃｔ）を、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅソフトウェアを用い、ＲＯＸリファレンス色素による正規化の後に蛍光（ｄＲｎ）に対して決定した。遺伝子発現の強度を、ハウスキーピング遺伝子ＨＰＲＴの発現を内部正規化因子として使用して、式２^{Ct(HPRT)-Ct(遺伝子)}を用いて算出した。
【０３３６】
実施例８．２． 結果
ヒト胎児腎臓２９３Ｈ細胞に、２つのベクター：３つの一本鎖ＳＨ６メガヌクレアーゼのうち１つを発現するプラスミド及びドナー修復プラスミドｐＣＬＳ３７７９を共トランスフェクトした。次いで、細胞を１０ｃｍディッシュ１枚当たり３００細胞で平板培養し、２週間後にクローンコロニーを単離し、９６ウェルマイクロプレートにおいて平板培養した。これらの細胞に由来するゲノムＤＮＡを遺伝子標的化について、材料及び方法の項に記載されるようにＰＣＲによって分析した。標的化組込みを示すクローン及び陰性対照からＲＮＡを単離した。定量ＲＴ−ＰＣＲを行い、標的化組込みの遺伝子座の周囲の遺伝子の発現を測定した。データを図１７に提示する。図１７では、ハウスキーピング遺伝子ＨＰＲＴでの正規化後の３つの個々の標的化クローン（ＫＩ）及び３つの個々の非標的化クローン（ＷＴ）について２連のサンプルの平均強度を示す。測定した５つの遺伝子の各々について有意差は観察されず、ｓｈ６遺伝子座での標的化組込みが近接遺伝子の発現に影響をもたらさないことが示される。
【０３３７】
実施例９： ヒト細胞における内因性セーフハーバー遺伝子座での突然変異誘発
改変された一本鎖セーフハーバーメガヌクレアーゼの切断活性を検証するために、内因性ヒトセーフハーバー遺伝子座での突然変異誘発を刺激するそれらの能力を評価した。細胞に、一本鎖分子に対する哺乳動物発現プラスミドをトランスフェクトした。メガヌクレアーゼによる天然のセーフハーバー遺伝子座の切断は、エラーを起こしやすいプロセスである非相同末端結合の基質を生じ、メガヌクレアーゼ標的部位で小さな挿入又は欠失をもたらし得る。このため、内因性セーフハーバー遺伝子座で突然変異が起こる頻度は、メガヌクレアーゼによるゲノム標的部位の切断効率を示す。
【０３３８】
実施例９．１． 材料及び方法
ａ）メガヌクレアーゼ発現プラスミド
本実施例で使用されるメガヌクレアーゼに対するコード配列は、哺乳動物発現ベクターにクローニングされ、表ＸＶＩに挙げるプラスミドを生じた。
【０３３９】
【表３３】

【０３４０】
ｂ）セーフハーバー遺伝子座の突然変異誘発実験
ヒト胎児腎臓２９３Ｈ細胞（Invitrogen）を、１０ｃｍディッシュ１枚当たり１×１０⁶細胞の密度で、完全培地（２ｍＭ Ｌ−グルタミン、ペニシリン（１００ＵＩ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、アムホテリシンＢ（Ｆｏｎｇｉｚｏｎｅ）（０．２５μｇ／ｍｌ）（Invitrogen-Life Science）及び１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ）中で平板培養した。翌日、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００トランスフェクション試薬（Invitrogen）を用い、供給業者のプロトコルに従って細胞に３μｇの一本鎖メガヌクレアーゼ発現ベクターをトランスフェクトした。３７℃で２日間〜６日間のインキュベーション後、細胞をトリプシン処理し、ＤＮｅａｓｙ血液及び組織キット（Qiagen）を用い、供給業者のプロトコルに従ってゲノムＤＮＡ抽出を行った。
【０３４１】
ｃ）突然変異誘発事象のディープシークエンシング分析
突然変異誘発の頻度をディープシークエンシング分析によって決定した。オリゴヌクレオチドを各々のセーフハーバー標的の周囲のＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅のために設計した。それらを表ＸＶＩＩに挙げる。
【０３４２】
【表３４】

【０３４３】
ヌクレオチドを添加し、４５４シークエンシングシステム（454 Life Sciences）上で、シークエンシングサービスを提供する会社（GATC Biotech AG，Germany）によって供給される特異的なアダプター配列（５’−ＣＣＡＴＣＴＣＡＴＣＣＣＴＧＣＧＴＧＴＣＴＣＣＧＡＣＴＣＡＧ−３’；配列番号３２４）及び（５’−ＣＣＴＡＴＣＣＣＣＴＧＴＧＴＧＣＣＴＴＧＧＣＡＧＴＣＴＣＡＧ−３’；配列番号３２５）に隣接する断片を得た。平均して１８０００個の配列が２つ又は３つの単位複製配列のプール（各々５００ｎｇ）から得られた。シークエンシング後、種々のサンプルを、上記のアダプターの最初に導入したバーコード配列に基づき同定した。
【０３４４】
実施例９．２． 結果
ヒト胎児腎臓２９３Ｈ細胞に、一本鎖セーフハーバーメガヌクレアーゼを発現するプラスミドをトランスフェクトした。３７℃で２日間〜６日間のインキュベーション後、ゲノムＤＮＡを単離し、ＰＣＲを用いてメガヌクレアーゼ標的部位の周囲のゲノム配列を増幅した。次いで、各々のセーフハーバー標的の切断部位における挿入又は欠失の事象（ＩｎＤｅｌ）の存在について配列を分析した。結果を表ＸＶＩＩＩにまとめる。
【０３４５】
【表３５】

【０３４６】
実施例１０： 結論
結論として、実施例１、実施例２、実施例３及び実施例５から、ＳＨ３遺伝子座、ＳＨ４遺伝子座及びＳＨ６遺伝子座を切断することが可能なＩ−ＣｒｅＩヘテロ二量体タンパク質及び一本鎖メガヌクレアーゼの両方を得ることができることが実証される。さらに、これらのエンドヌクレアーゼは、これらの遺伝子座を強い切断活性で切断することが可能である。
【０３４７】
実施例４から、ＳＨ３遺伝子座及びＳＨ４遺伝子座を切断することが可能な一本鎖メガヌクレアーゼが、ヒト細胞の標的部位への導入遺伝子の効率的な挿入を可能にすることが実証される。
【０３４８】
このため、これらのエンドヌクレアーゼは、個体のＳＨ３遺伝子座、ＳＨ４遺伝子座又はＳＨ６遺伝子座への導入遺伝子の挿入に有利に使用することができる。
【０３４９】
実施例６から、本発明による少なくとも２つの一本鎖分子が、内因性ｓｈ６遺伝子座で高レベルの遺伝子標的化を誘導することが可能であることが実証される。
【０３５０】
実施例７から、遺伝子座での標的化組込みが機能的な導入遺伝子の発現を支持し得ることが実証される。
【０３５１】
実施例８から、遺伝子座での標的化組込みが、標的配列の近傍に位置する５個の遺伝子の発現を実質的に変更しないことが実証される。
【０３５２】
実施例９から、セーフハーバー配列を標的とする種々のメガヌクレアーゼの突然変異誘発頻度（該メガヌクレアーゼによるゲノム標的部位の切断効率を示す）が実証される。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
導入遺伝子を個体のゲノムに挿入する際に使用される標的配列を切断することが可能な変異型エンドヌクレアーゼであって、
ｉ．前記ゲノムが前記標的配列を含む遺伝子座を含み、
ｉｉ．前記標的配列がレトロウイルス挿入部位（ＲＩＳ）から最大で２００ｋｂ離れて位置し、該ＲＩＳが、がんとも異常細胞増殖とも関連しない、変異型エンドヌクレアーゼ。
【請求項２】
前記導入遺伝子の挿入が、前記標的配列の近傍に位置する遺伝子の発現を実質的に変更しない、請求項１に記載のエンドヌクレアーゼ。
【請求項３】
前記標的配列が、最近接遺伝子から少なくとも１００ｋｂ離れて位置する、請求項１又は２に記載のエンドヌクレアーゼ。
【請求項４】
ホーミングエンドヌクレアーゼである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のエンドヌクレアーゼ。
【請求項５】
ヒト染色体２１ｑ２１．１上のＳＨ６遺伝子座、ヒト染色体６ｐ２５．１上のＳＨ３遺伝子座、ヒト染色体７ｑ３１．２上のＳＨ４遺伝子座、ヒト染色体１３ｑ３４上のＳＨ１２遺伝子座、ヒト染色体３ｐ１２．２上のＳＨ１３遺伝子座、ヒト染色体２２上のＳＨ１９遺伝子座、ヒト染色体１２ｑ２１．２上のＳＨ２０遺伝子座、ヒト染色体３ｐ２４．１上のＳＨ２１遺伝子座、ヒト染色体６ｐ１２．２上のＳＨ３３遺伝子座、ヒト染色体２ｐ１６．１上のＳＨ７遺伝子座、ヒト染色体５上のＳＨ８遺伝子座、ＳＨ１８遺伝子座、ＳＨ３１遺伝子座、ＳＨ３８遺伝子座、ＳＨ３９遺伝子座、ＳＨ４１遺伝子座、ＳＨ４２遺伝子座、ＳＨ４３遺伝子座、ＳＨ４４遺伝子座、ＳＨ４５遺伝子座、ＳＨ４６遺伝子座、ＳＨ４７遺伝子座、ＳＨ４８遺伝子座、ＳＨ４９遺伝子座、ＳＨ５０遺伝子座、ＳＨ５１遺伝子座、ＳＨ５２遺伝子座、ＳＨ７０遺伝子座、ＳＨ７１遺伝子座、ＳＨ７２遺伝子座、ＳＨ７３遺伝子座、ＳＨ７４遺伝子座、ＳＨ７５遺伝子座、ＳＨ１０１遺伝子座、ＳＨ１０６遺伝子座、ＳＨ１０７遺伝子座、ＳＨ１０２遺伝子座、ＳＨ１０５遺伝子座、ＳＨ１０３遺伝子座、ＳＨ１０４遺伝子座、ＳＨ１１３遺伝子座、ＳＨ１０９遺伝子座、ＳＨ１１２遺伝子座、ＳＨ１０８遺伝子座、ＳＨ１１０遺伝子座、ＳＨ１１４遺伝子座、ＳＨ１１６遺伝子座、ＳＨ１１１遺伝子座、ＳＨ１１５遺伝子座、ＳＨ１２１遺伝子座、ＳＨ１２０遺伝子座、ＳＨ１２２遺伝子座、ＳＨ１１７遺伝子座、ＳＨ１１８遺伝子座、ＳＨ１１９遺伝子座、ＳＨ１２３遺伝子座、ＳＨ１２６遺伝子座、ＳＨ１２８遺伝子座、ＳＨ１２９遺伝子座、ＳＨ１２４遺伝子座、ＳＨ１３１遺伝子座、ＳＨ１２５遺伝子座、ＳＨ１２７遺伝子座、ＳＨ１３０遺伝子座、ＳＨ１１遺伝子座、ＳＨ１７遺伝子座、ＳＨ２３遺伝子座、ＳＨ３４遺伝子座、ＳＨ４０遺伝子座、ＳＨ５３遺伝子座、ＳＨ５４遺伝子座、ＳＨ５５遺伝子座、ＳＨ５６遺伝子座、ＳＨ５７遺伝子座、ＳＨ５８遺伝子座、ＳＨ５９遺伝子座、ＳＨ６０遺伝子座、ＳＨ６１遺伝子座、ＳＨ６２遺伝子座、ＳＨ６５遺伝子座、ＳＨ６７遺伝子座、ＳＨ６８遺伝子座及びＳＨ６９遺伝子座からなる群から選択される遺伝子座内に位置する標的配列を切断することが可能である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のエンドヌクレアーゼ。
【請求項６】
各々が配列番号１又は配列番号４２と少なくとも８０％同一な配列を含む２つの単量体を含む変異型二量体Ｉ−ＣｒｅＩタンパク質であって、
ｉ．前記二量体Ｉ−ＣｒｅＩタンパク質が、個体の遺伝子座内に位置する標的配列を切断することが可能であり、該標的配列がレトロウイルス挿入部位（ＲＩＳ）から最大で２００ｋｂ離れて位置し、該ＲＩＳが、がんとも異常細胞増殖とも関連せず、
ｉｉ．前記標的配列が配列番号４の配列を含まない、変異型二量体Ｉ−ＣｒｅＩタンパク質。
【請求項７】
ヒト染色体２１ｑ２１．１上のＳＨ６遺伝子座、ヒト染色体６ｐ２５．１上のＳＨ３遺伝子座、ヒト染色体７ｑ３１．２上のＳＨ４遺伝子座、ヒト染色体１３ｑ３４上のＳＨ１２遺伝子座、ヒト染色体３ｐ１２．２上のＳＨ１３遺伝子座、ヒト染色体２２上のＳＨ１９遺伝子座、ヒト染色体１２ｑ２１．２上のＳＨ２０遺伝子座、ヒト染色体３ｐ２４．１上のＳＨ２１遺伝子座、ヒト染色体６ｐ１２．２上のＳＨ３３遺伝子座、ヒト染色体２ｐ１６．１上のＳＨ７遺伝子座、ヒト染色体５上のＳＨ８遺伝子座、ＳＨ１８遺伝子座、ＳＨ３１遺伝子座、ＳＨ３８遺伝子座、ＳＨ３９遺伝子座、ＳＨ４１遺伝子座、ＳＨ４２遺伝子座、ＳＨ４３遺伝子座、ＳＨ４４遺伝子座、ＳＨ４５遺伝子座、ＳＨ４６遺伝子座、ＳＨ４７遺伝子座、ＳＨ４８遺伝子座、ＳＨ４９遺伝子座、ＳＨ５０遺伝子座、ＳＨ５１遺伝子座、ＳＨ５２遺伝子座、ＳＨ７０遺伝子座、ＳＨ７１遺伝子座、ＳＨ７２遺伝子座、ＳＨ７３遺伝子座、ＳＨ７４遺伝子座、ＳＨ７５遺伝子座、ＳＨ１０１遺伝子座、ＳＨ１０６遺伝子座、ＳＨ１０７遺伝子座、ＳＨ１０２遺伝子座、ＳＨ１０５遺伝子座、ＳＨ１０３遺伝子座、ＳＨ１０４遺伝子座、ＳＨ１１３遺伝子座、ＳＨ１０９遺伝子座、ＳＨ１１２遺伝子座、ＳＨ１０８遺伝子座、ＳＨ１１０遺伝子座、ＳＨ１１４遺伝子座、ＳＨ１１６遺伝子座、ＳＨ１１１遺伝子座、ＳＨ１１５遺伝子座、ＳＨ１２１遺伝子座、ＳＨ１２０遺伝子座、ＳＨ１２２遺伝子座、ＳＨ１１７遺伝子座、ＳＨ１１８遺伝子座、ＳＨ１１９遺伝子座、ＳＨ１２３遺伝子座、ＳＨ１２６遺伝子座、ＳＨ１２８遺伝子座、ＳＨ１２９遺伝子座、ＳＨ１２４遺伝子座、ＳＨ１３１遺伝子座、ＳＨ１２５遺伝子座、ＳＨ１２７遺伝子座、ＳＨ１３０遺伝子座、ＳＨ１１遺伝子座、ＳＨ１７遺伝子座、ＳＨ２３遺伝子座、ＳＨ３４遺伝子座、ＳＨ４０遺伝子座、ＳＨ５３遺伝子座、ＳＨ５４遺伝子座、ＳＨ５５遺伝子座、ＳＨ５６遺伝子座、ＳＨ５７遺伝子座、ＳＨ５８遺伝子座、ＳＨ５９遺伝子座、ＳＨ６０遺伝子座、ＳＨ６１遺伝子座、ＳＨ６２遺伝子座、ＳＨ６５遺伝子座、ＳＨ６７遺伝子座、ＳＨ６８遺伝子座及びＳＨ６９遺伝子座からなる群から選択される遺伝子座内に位置する標的配列を切断することが可能である、請求項６に記載の二量体Ｉ−ＣｒｅＩタンパク質。
【請求項８】
ヒト染色体２１ｑ２１．１上のＳＨ６遺伝子座内に位置する標的配列を切断することが可能である、請求項６又は７に記載の二量体Ｉ−ＣｒｅＩタンパク質。
【請求項９】
前記標的配列が配列番号５９の配列を含む、請求項８に記載の二量体Ｉ−ＣｒｅＩタンパク質。
【請求項１０】
請求項６〜９のいずれか一項に記載の二量体Ｉ−ＣｒｅＩタンパク質の単量体を含む融合タンパク質。
【請求項１１】
配列番号８１、配列番号８２〜配列番号８５、配列番号２９４、配列番号２９５、配列番号７６〜配列番号８０、配列番号２５〜配列番号４０、配列番号８６〜配列番号９６、配列番号１２７〜配列番号１５０、配列番号１８２〜配列番号２１３、配列番号２３５〜配列番号２７０及び配列番号２７５〜配列番号２７８からなる群から選択される配列を含む、請求項１０に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のエンドヌクレアーゼ又は請求項６〜１１のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする核酸。
【請求項１３】
請求項１２に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項１４】
導入遺伝子を含む標的化構築物と、請求項１〜５のいずれか一項に記載のエンドヌクレアーゼ又は請求項６〜１１のいずれか一項に記載のタンパク質によって認識される標的配列に隣接するゲノム配列に相同な２つの配列とを更に含む、請求項１３に記載の発現ベクター。
【請求項１５】
請求項１３に記載の発現ベクター並びに、
導入遺伝子を含む標的化構築物と、請求項１〜５のいずれか一項に記載のエンドヌクレアーゼ又は請求項６〜１１のいずれか一項に記載のタンパク質によって認識される標的配列のゲノム配列に相同な２つの配列とを含むベクターと、
の組合せ。
【請求項１６】
請求項１４に記載の発現ベクター又は請求項１５に記載の組合せと、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。
【請求項１７】
導入遺伝子を細胞、組織又は非ヒト動物のゲノムに挿入するための請求項１〜５のいずれか一項に記載のエンドヌクレアーゼ又は請求項６〜１１のいずれか一項に記載のタンパク質又は請求項１２に記載の核酸又は請求項１３若しくは１４に記載の発現ベクター又は請求項１５に記載の組合せの使用であって、該使用は治療目的でない、使用。
【請求項１８】
遺伝性障害の非ヒト動物モデルを作製するための、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
組換えタンパク質を製造するための、請求項１７に記載の使用。
【請求項２０】
個体のゲノムへの導入遺伝子の挿入に好適なエンドヌクレアーゼを得る方法であって、
ａ）前記個体のゲノム内で、がんとも異常細胞増殖とも関連しないレトロウイルス挿入部位（ＲＩＳ）を選択する工程と、
ｂ）前記ＲＩＳの２００ｋｂ上流及び２００ｋｂ下流に伸びるゲノム領域を規定する工程と、
ｃ）前記ゲノム領域内に位置する標的配列を切断することが可能な野生型エンドヌクレアーゼを同定するか、又は変異型エンドヌクレアーゼを構築する工程と、
を含む、個体のゲノムへの導入遺伝子の挿入に好適なエンドヌクレアーゼを得る方法。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】


【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【公表番号】特表２０１３−５２０１９０（Ｐ２０１３−５２０１９０Ａ）
【公表日】平成２５年６月６日（２０１３．６．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５５４３６８（Ｐ２０１２−５５４３６８）
【出願日】平成２３年２月２８日（２０１１．２．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０５２９１６
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／１０４３８２
【国際公開日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【出願人】（５０８２４５２３１）
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＬＬＥＣＴＩＳ
【住所又は居所原語表記】１０２　ａｖｅｎｕｅ　Ｇａｓｔｏｎ　Ｒｏｕｓｓｅｌ，Ｆ−９３２３５　Ｒｏｍａｉｎｖｉｌｌｅ　Ｃｅｄｅｘ，Ｆｒａｎｃｅ
【Ｆターム（参考）】