ゼニゴケ由来の不飽和脂肪酸合成系酵素遺伝子及びその利用
【課題】 高等植物中でアラキドン酸やエイコサペンタエン酸等の高度不飽和脂肪酸を効率よく生産すること。
【解決手段】 同一種のゼニゴケ（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）から、Δ５脂肪酸不飽和化酵素遺伝子、Δ６脂肪酸不飽和化酵素遺伝子及びΔ６脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子を単離する。これらの遺伝子を高等植物に導入し発現させることにより、アラキドン酸やエイコサペンタエン酸を生産し得る形質転換植物体を取得する。
【解決手段】 同一種のゼニゴケ（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）から、Δ５脂肪酸不飽和化酵素遺伝子、Δ６脂肪酸不飽和化酵素遺伝子及びΔ６脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子を単離する。これらの遺伝子を高等植物に導入し発現させることにより、アラキドン酸やエイコサペンタエン酸を生産し得る形質転換植物体を取得する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ゼニゴケ（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）由来の不飽和脂
肪酸合成系遺伝子、すなわち、Δ５脂肪酸不飽和化酵素、Δ６脂肪酸不飽和化酵素、及び
Δ６脂肪酸鎖長延長酵素の遺伝子とその利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
アラキドン酸、エイコサペンタエン酸（以下、適宜「ＥＰＡ」と略記する）等の高度不
飽和脂肪酸（Ｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ；ＰＵＦＡ）は、
ヒトにおいて神経系を中心とした細胞膜脂質に多く含まれている。これらの高度不飽和脂
肪酸は、プロスタグランジンやロイコトリエンといった、生理活性物質の前駆体として作
用しており、薬理学的に非常に重要である。近年、アラキドン酸やＥＰＡを含む健康食品
も販売されている。また、脂肪酸は、洗剤や生分解性プラスチックの原料にもなるため、
素材としても注目されている。
【０００３】
高度不飽和脂肪酸は、現在、培養微生物又は魚油からの抽出により生産されている。こ
のため、生産コストが高いこと、エネルギー使用量・廃棄物量が多くなること、特に魚油
から調製する方法では、魚資源が限られていることが問題になっている。
【０００４】
アラキドン酸及びＥＰＡは、それぞれリノール酸及びα−リノレン酸を起点として、Δ
６不飽和化、脂肪酸鎖長延長及びΔ５不飽和化という３つの連続した反応により生合成さ
れると考えられている。これらの反応は、それぞれ、Δ６脂肪酸不飽和化酵素（以下、「
Δ６不飽和化酵素」と略記する）、Δ６脂肪酸鎖長延長酵素（以下、「Δ６鎖長延長酵素
」と略記する）及びΔ５脂肪酸不飽和化酵素（以下、「Δ５不飽和化酵素」と略記する）
により触媒される。
【０００５】
Δ６不飽和化酵素の遺伝子は、いくつかの植物種でクローン化されている。例えば、ケ
イ藻、ヒメツリガネゴケ、ヤノウエノアカゴケ、ボリジ、ムラサキ、サクラソウ及びアネ
モネからΔ６不飽和化酵素の遺伝子がクローン化されている。また、植物以外では、糸状
菌、線虫、ラン藻、ラット及びヒトからΔ６不飽和化酵素遺伝子がクローン化されている
（非特許文献１：「Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６９，ｐ４１０５，２００２」、非
特許文献２：「Ｐｌａｎｔ Ｊ．１５，ｐ３９，１９９８」、非特許文献３：「Ｅｕｒ．
Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６７．ｐ３８０１，２０００」、非特許文献４：「Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４，ｐ４２１１，１９９７」、非特許文献５：
「Ｌｉｐｉｄｓ ３７，４１７，２００２」、非特許文献６：「ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５
４２，ｐ１００，２００３」、非特許文献７：「Ｗｈｉｔｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａ
ｎｔａ Ｅｐｕｂ ２００３」、非特許文献８：「Ｌｉｐｉｄｓ ３４，ｐ６４９，１９
９９」、非特許文献９：「Ｇｅｎｅ，２３８，ｐ４４５ １９９９」、非特許文献１０：
「Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．３３０，ｐ６１１ １９９８」、非特許文献１１：「Ｐｌａｎｔ
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２，ｐ２９３ １９９３」、非特許文献１２：「Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２５５，ｐ５７５，１９９９」、非特許文
献１３：「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，ｐ４７１，１９９９」参照）。また、ラン
藻のものを除いて、これらのΔ６不飽和化酵素は、いずれもＮ末端にシトクロムｂ５ドメ
インが存在する。
【０００６】
Δ６鎖長延長酵素の遺伝子は、最初に糸状菌及び線虫からクローン化された（非特許文
献１４：「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７，ｐ８２８４，２００
０」、非特許文献１５：「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７，ｐ６
４２１，２０００」参照）。植物種では、唯一ヒメツリガネからクローン化されている（
非特許文献１６：「Ｐｌａｎｔ Ｊ．３１，ｐ２５５，２００２」参照）。
【０００７】
酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）には、スフィンゴ脂質の
長鎖飽和アシル鎖合成に関与するＥＬＯ２蛋白及びＥＬＯ３蛋白が存在し（非特許文献１
７：「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，ｐ１７３７６，１９９７」参照）、Δ６鎖長
延長酵素のアミノ酸配列は、これらと相同性を示す。一方、植物には、別タイプの脂肪酸
鎖長延長酵素であるβ−ケトアシルＣｏＡ合成酵素（ＫＣＳ）が存在する。この酵素は、
長鎖飽和／一価不飽和脂肪酸の鎖長延長を触媒する（非特許文献１５及び非特許文献１８
：「Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ７，ｐ３０９，１９９５」参照）。しかしながら、Δ６鎖長
延長酵素遺伝子及び酵母ＥＬＯ２／ＥＬＯ３遺伝子は、ＫＣＳ遺伝子との直接的な進化上
の関係は見られない（非特許文献１５及び１６参照）。
【０００８】
Δ５不飽和化酵素の遺伝子は、糸状菌から、初めてクローン化された（非特許文献１９
：「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，ｐ２９３６０，１９９８」、非特許文献２０：「
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，ｐ１９０５５」参照）。Δ５不飽和化酵素の構造はΔ
６不飽和化酵素と共通しており、Ｎ末端にシトクロムｂ５ドメインを有する。Δ５不飽和
化酵素遺伝子は、ケイ藻、線虫、ラット、ヒト、ヒメツリガネゴケなどからクローン化さ
れている（非特許文献１，非特許文献２１：「ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４３９，ｐ２１５，
１９９８」、非特許文献２２：「Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３９１，
ｐ８，２００１」、非特許文献２３：「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，ｐ３７３３５
，１９９９」、非特許文献２４：「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８，３５１１５，２０
０３」参照）。
【０００９】
陸上植物は、コケ植物（コケ植物門（Ｂｒｙｏｐｈｙｔａ））、シダ植物、裸子植物及
び被子植物から構成されている。コケ植物は陸上植物の中で最も古くに分岐した群であり
、セン類（セン類網（Ｂｒｙｏｓｉｄａ））、タイ類（タイ類網（Ｈｅｐａｔｉｃｏｐｓ
ｉｄａ））及びツノゴケ類の３つのグループから構成されている。ゼニゴケは、上記生物
のうちヒメツリガネゴケに分類上最も近いが、ヒメツリゴケはセン類に属しており、ゼニ
ゴケはタイ類網の中のゼニゴケ亞網（Ｍａｒｃｈａｎｔｉｉｄａｅ）に属している。上記
３つのグループは、約４億３千年前には、すでに分岐していたことは確かである。したが
って、同じコケといっても、ヒメツリガネゴケとゼニゴケとは、例えば２億年前に分化し
たシロイナズナとイネとの違いどころでなく、進化上大きく異なる（非特許文献２５：「
１１０３６１５１４３９６８＿０．ｈｔｍｌ」参照）。
【００１０】
ゼニゴケ由来の高度不飽和脂肪酸合成系酵素遺伝子としては、上記のＫＣＳ様の鎖長延
長酵素遺伝子のＭｐＦＡＥ２及びＭｐＦＡＥ３が取得されている（非特許文献２６：「Ｂ
ｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７，ｐ６０５，２００３」、非
特許文献２７：「Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７，ｐ１６
６７，２００３」参照）。しかしながら、ＭｐＦＡＥ２及びＭｐＦＡＥ３はΔ６鎖長延長
酵素遺伝子ではない。
【００１１】
上述のように、多くの高度脂肪酸合成系酵素遺伝子が様々な生物種からクローン化され
ているが、アラキドン酸、ＥＰＡ等の、Ｃ２０以上で不飽和度４以上の高度不飽和脂肪酸
を植物中で生産させた例は少ない。このような例として、ケイ藻由来のΔ６不飽和化酵素
及びΔ５不飽和化酵素と、ヒメツリガネゴケ由来のΔ６鎖長延長酵素とをアマで発現させ
、アラキドン酸及びＥＰＡを生産させた報告があるが、その詳細は不明である（非特許文
献２４参照）。
【００１２】
上述のように、アラキドン酸やＥＰＡ等の高度不飽和脂肪酸の生産は、培養微生物又は
魚油からの抽出により生産されているため、生産コストが高いこと、エネルギー使用量・
廃棄物量が多くなること、魚資源が限られていること等の問題点を有している。アラキド
ン酸やＥＰＡ等の高度不飽和脂肪酸は、分子内に二重結合を複数有するというユニークな
物性を持っているため、様々な工業用途（例えばフィルム、生分解性プラスチック、機能
性繊維、潤滑油、洗剤の素材等）にも利用可能となる。このような高度不飽和脂肪酸を遺
伝子組み換え植物により生産することにより、生産コストを低減でき、同時に、より環境
にやさしい生産プロセスを実現することができると期待される。遺伝子組み換え技術を用
いて、これらの高度不飽和脂肪酸を、油糧植物で大量生産できるようになれば、安価な多
目的原料として非常に有用である。
【００１３】
一方、植物に異種生物の遺伝子を発現させる場合、その遺伝子が植物内でどの程度良好
に機能するかは、転写、翻訳、その後の修飾などの過程があるため、予想することは困難
である。特に、複数の異種生物の遺伝子を発現させる場合、上記非特許文献２４のように
異なる生物種由来の複数の遺伝子を発現させるより、同一の種に由来する複数の遺伝子を
発現させるほうが植物内で良好に機能することが予想される。また、最初の陸上植物であ
るコケ類のゼニゴケは、高等植物のモデル系として注目されており、その遺伝子は植物内
で良好に機能することが期待できる。したがって、ゼニゴケ由来の高度不飽和脂肪酸合成
酵素遺伝子、すなわちΔ５不飽和化酵素遺伝子、Δ６不飽和化酵素遺伝子及びΔ６鎖長延
長酵素遺伝子を取得することができれば、これらの遺伝子を植物に導入することにより、
アラキドン酸やＥＰＡが植物内で効率よく蓄積されることが期待できる。
【００１４】
また、ゼニゴケと同じコケ植物のヒメツリガネゴケからはΔ５不飽和化酵素遺伝子、Δ
６不飽和化酵素遺伝子及びΔ６鎖長延長酵素遺伝子がクローン化されているが、ゼニゴケ
とヒメツリガネゴケは進化上大きく異なっており、ヒメツリガネゴケの遺伝子に基づいて
ゼニゴケの遺伝子を取得することは、現在の技術水準をもってしても容易にできることで
はない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、上記従来の問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、高等植物中で
アラキドン酸やＥＰＡを生産し得る、ゼニゴケ（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ ｐｏｌｙｍｏｒ
ｐｈａ）由来の不飽和脂肪酸合成酵素遺伝子、すなわちΔ５不飽和化酵素遺伝子、Δ６不
飽和化酵素遺伝子及びΔ６鎖長延長酵素遺伝子、及びその利用法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意検討した結果、ゼニゴケ（Ｍａｒｃｈ
ａｎｔｉａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）由来のｃＤＮＡクローンから、上記Δ６不飽和化酵
素、Δ５不飽和化酵素及びΔ６鎖長延長酵素をコードする遺伝子を同定し、更にこれらの
遺伝子をメタノール資化性酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）に導入して発現させ
ることに成功し、これらの遺伝子を発現させたたんぱく質が、それぞれΔ６不飽和化、Δ
５不飽和化及びΔ６鎖長延長の酵素活性を有することを見出し、本発明を完成するに至っ
た。すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
【００１７】
（１）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡの全部又は一部、あるいは当該Ｄ
ＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡの全部又は一部とストリンジェントな条件でハイ
ブリダイズし、かつΔ６脂肪酸不飽和化活性を有するたんぱく質をコードするゼニゴケ目
生物由来の遺伝子。
【００１８】
（２）Δ６脂肪酸不飽和化活性を有するゼニゴケ目生物由来のたんぱく質をコードする
、下記（ａ）又は（ｂ）に記載の遺伝子。（ａ）配列番号１に示される塩基配列を有する
遺伝子。（ｂ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡ、又は当該ＤＮＡと相補的
な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子。
【００１９】
（３）Δ６脂肪酸不飽和化活性を有するゼニゴケ目生物由来のたんぱく質をコードする
、下記（ａ）又は（ｂ）に記載の遺伝子。（ａ）配列番号１に示される塩基配列のうち、
２５３ないし１６９８番目の塩基配列を有する遺伝子。（ｂ）配列番号１に示される塩基
配列のうち、２５３ないし１６９８番目の塩基配列からなるＤＮＡ、又は当該ＤＮＡと相
補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子。
【００２０】
（４）Δ６脂肪酸不飽和化活性を有するゼニゴケ目生物由来のたんぱく質をコードする
、下記（ａ）又は（ｂ）に記載の遺伝子。（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列から
なるたんぱく質をコードする遺伝子。（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の１個又
はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる
たんぱく質をコードする遺伝子。
【００２１】
（５）配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡの全部又は一部、あるいは当該Ｄ
ＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡの全部又は一部とストリンジェントな条件でハイ
ブリダイズし、かつΔ６脂肪酸鎖長延長活性を有するたんぱく質をコードするゼニゴケ目
生物由来の遺伝子。
【００２２】
（６）Δ６脂肪酸鎖長延長活性を有するゼニゴケ目生物由来のたんぱく質をコードする
、下記（ａ）又は（ｂ）に記載の遺伝子。（ａ）配列番号３に示される塩基配列を有する
遺伝子。（ｂ）配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡ、又は当該ＤＮＡと相補的
な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子。
【００２３】
（７）Δ６脂肪酸鎖長延長活性を有するゼニゴケ目生物由来のたんぱく質をコードする
、下記（ａ）又は（ｂ）に記載の遺伝子。（ａ）配列番号１に示される塩基配列のうち、
１９４ないし１０６６番目の塩基配列を有する遺伝子。（ｂ）配列番号１に示される塩基
配列のうち、１９４ないし１０６６番目の塩基配列からなるＤＮＡ、又は当該ＤＮＡと相
補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子。
【００２４】
（８）Δ６脂肪酸鎖長延長活性を有するゼニゴケ目由来のたんぱく質をコードする、下
記（ａ）又は（ｂ）に記載の遺伝子。（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる
たんぱく質、（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列の１個又はそれ以上のアミノ酸が
置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるたんぱく質をコードする
遺伝子。
【００２５】
（９）配列番号５に示される塩基配列からなるＤＮＡの全部又は一部、あるいは当該Ｄ
ＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡの全部又は一部とストリンジェントな条件でハイ
ブリダイズし、かつΔ５脂肪酸不飽和化活性を有するたんぱく質をコードするゼニゴケ目
生物由来の遺伝子。
【００２６】
（１０）Δ５脂肪酸不飽和化活性を有するゼニゴケ目生物由来のたんぱく質をコードす
る、下記（ａ）又は（ｂ）に記載の遺伝子。（ａ）配列番号５に示される塩基配列を有す
る遺伝子。（ｂ）配列番号５に示す塩基配列からなるＤＮＡ、又は当該ＤＮＡと相補的な
塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子。
【００２７】
（１１）Δ５脂肪酸不飽和化活性を有するゼニゴケ目生物由来のたんぱく質をコードす
る、下記（ａ）又は（ｂ）に記載の遺伝子。（ａ）配列番号５に示される塩基配列のうち
、３７５ないし１８２９番目の塩基配列を有する遺伝子。（ｂ）配列番号５に示される塩
基配列のうち、３７５ないし１８２９番目の塩基配列からなるＤＮＡ、又は当該ＤＮＡと
相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子
。
【００２８】
（１２）Δ５脂肪酸不飽和化活性を有するゼニゴケ目生物由来のたんぱく質をコードす
る、下記（ａ）又は（ｂ）に記載の遺伝子。（ａ）配列番号６に示されるアミノ酸配列か
らなるたんぱく質、（ｂ）配列番号６に示されるアミノ酸配列の１個又はそれ以上のアミ
ノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるたんぱく質をコー
ドする遺伝子。
【００２９】
（１３）上記（１）〜（１２）の何れかに記載の遺伝子によってコードされるたんぱく
質。
【００３０】
（１４）以下の（ａ）又は（ｂ）記載のたんぱく質。（ａ）配列番号２に示されるアミ
ノ酸配列からなるたんぱく質。（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個
又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からな
り、かつ、Δ６脂肪酸不飽和化活性を有するたんぱく質。
【００３１】
（１５）以下の（ａ）又は（ｂ）記載のたんぱく質。（ａ）配列番号４に示されるアミ
ノ酸配列からなるたんぱく質。（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１個
又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からな
り、かつ、Δ６脂肪酸鎖長延長活性を有するたんぱく質。
【００３２】
（１６）以下の（ａ）又は（ｂ）記載のたんぱく質。（ａ）配列番号６に示されるアミ
ノ酸配列からなるたんぱく質。（ｂ）配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１個
又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からな
り、かつ、Δ５脂肪酸不飽和化活性を有するたんぱく質。
【００３３】
（１７）上記（１３）〜（１６）の何れかに記載のたんぱく質を認識する抗体。
【００３４】
（１８）少なくとも上記（１）〜（１２）の何れかに記載の遺伝子を含む組換え発現ベ
クター。
【００３５】
（１９）少なくとも上記（１）〜（１２）の何れかに記載の遺伝子を導入してなる形質
転換体。
【００３６】
（２０）少なくとも上記（１）〜（１２）の何れかに記載の遺伝子が発現可能に導入さ
れた植物体、もしくは当該植物体と同一の性質を有する当該植物体の子孫となる植物体、
又は当該植物体の組織。
【００３７】
（２１）少なくとも上記（１）〜（１２）の何れかに記載の遺伝子が発現可能に導入さ
れ、脂肪酸組成が改変された植物体、もしくは当該植物体と同一の性質を有する当該植物
体の子孫となる植物体、又は当該植物体の組織。
【００３８】
（２２）上記（２０）又は（２１）に記載の植物体の繁殖材料。
【００３９】
（２３）上記（２１）に記載の植物体又は植物体の組織を用いる脂肪酸生産方法。
【００４０】
（２４）上記（２３）に記載の脂肪酸生産方法により得られた、γ−リノレン酸、ジホ
モ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、ステアリドン酸、エイコサテトラエン酸、およびエ
イコサペンタエン酸から選択される少なくとも１つ含む素材。
【００４１】
（２５）少なくとも（１）〜（１２）の何れかに記載の遺伝子を用いて脂肪酸組成を改
変する方法。
【００４２】
（２６）上記（１）〜（１２）の何れかに記載の遺伝子における少なくとも一部の塩基
配列又はその相補配列をプローブとして用いた遺伝子検出器具。
【００４３】
（２７）上記（１３）〜（１６）の何れかに記載のたんぱく質を用いて、当該たんぱく
質を調節する遺伝子、又は当該たんぱく質を調節する物質をスクリーニングする方法。
【００４４】
（２８）上記（２７）に記載のスクリーニング方法により得られた遺伝子又は物質。
【００４５】
なお、本明細書において、特に断らない限り、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴは、アデニン、シト
シン、グアニンおよびチミンの各塩基を示す。
【００４６】
本発明のさらに他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分わか
るであろう。また、本発明の利益は、添付図面を参照した次の説明で明白になるであろう
。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】実施例６で用いたＭｐＤＥＳ６遺伝子、ＭｐＥＬＯ１遺伝子及びＭｐＤＥＳ５遺伝子の各遺伝子の発現カセットが連結されたコンストラクトの構築手順を示す説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
本発明の実施の一形態について説明すれば、以下の通りである。なお、本発明は、これ
に限定されるものではない。
【００４９】
以下、アラキドン酸及びエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）の合成経路、本発明に係る遺
伝子、本発明に係るたんぱく質、本発明に係るたんぱく質及び遺伝子の取得方法、並びに
本発明に係る遺伝子及びたんぱく質の利用方法（有用性）の順で、本発明を詳細に説明す
る。
【００５０】
（１）アラキドン酸及びエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）の合成経路
アラキドン酸及びエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）は、それぞれリノール酸及びα−リ
ノレン酸を起点として、Δ６不飽和化、Δ６鎖長延長及びΔ５不飽和化という３つの連続
した反応により、生合成されると考えられる。これらの反応は、それぞれΔ６不飽和化酵
素、Δ６鎖長延長酵素及びΔ５不飽和化酵素により触媒され、それぞれ、ｎ−６経路（ア
ラキドン酸合成経路）及びｎ−３経路（ＥＰＡ合成経路）と呼ばれている。
【００５１】
これまでに報告されているΔ６不飽和化酵素、Δ６鎖長延長酵素及び、Δ５不飽和化酵
素は、いずれもｎ−６及びｎ−３経路の両方に関与していることが示されている。すなわ
ち、Δ６不飽和化酵素は、ｎ−６経路ではリノール酸（１８：２Ｄ９，１２、１８は炭素
数を表し、２は二重結合の数を表し、９、１２は二重結合の位置を表す。以下同様である
。）をｇ−リノレン酸（ＧＬＡ；１８：３Ｄ６，９，１２）に変換し、ｎ−３経路ではａ
−リノレン酸（ＡＬＡ；１８：３Ｄ９，１２，１５）をステアリドン酸（ＳＴＡ；１８：
４Ｄ６，９，１２，１５）に変換する。Δ６鎖長延長酵素は、ｎ−６経路ではＧＬＡをジ
ホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ；２０：３Δ８，１１，１４）に変換し、ｎ−３経路で
はＳＴＡをエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ；２０：４Δ８，１１，１４，１７）に変換す
る。Δ５不飽和化酵素は、ｎ−６経路ではＤＧＬＡをアラキドン酸（２０：４Δ５，８，
１１，１４）に、ｎ−３経路ではＥＴＡをエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ；２０：５Δ５
，８，１１，１４，１７）に変換する。
【００５２】
（２）本発明に係る遺伝子
〔本発明に係るΔ６不飽和化酵素遺伝子〕
本発明に係るΔ６不飽和化酵素遺伝子は、Δ６脂肪酸不飽和化活性を有するたんぱく質
をコードするゼニゴケ目生物由来の遺伝子であり、以下の条件に適合する遺伝子であれば
よい。
【００５３】
１．配列番号１に示される塩基配列を有する遺伝子。
【００５４】
２．配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡ、又は当該ＤＮＡと相補的な塩基配
列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子。
【００５５】
３．配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡの一部、又は当該ＤＮＡと相補的な
塩基配列からなるＤＮＡの一部とストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子。
【００５６】
４．配列番号１に示される塩基配列のうち、２５３ないし１６９８番目の塩基配列を有
する遺伝子。なお、配列番号１に示される塩基配列の２５３ないし１６９８番目の塩基配
列は配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるたんぱく質に翻訳される領域である。
【００５７】
５．配列番号１に示される塩基配列のうち、２５３ないし１６９８番目の塩基配列から
なるＤＮＡ、又は当該ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条
件でハイブリダイズする遺伝子。
【００５８】
６．配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるたんぱく質をコードする遺伝子。
【００５９】
７．配列番号２に示されるアミノ酸配列の１個又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、
挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるたんぱく質をコードする遺伝子。
【００６０】
〔本発明に係るΔ６鎖長延長酵素遺伝子〕
本発明に係るΔ６鎖長延長酵素遺伝子は、Δ６脂肪酸鎖長延長酵素活性を有するたんぱ
く質をコードするゼニゴケ目生物由来の遺伝子であり、以下の条件に適合する遺伝子であ
ればよい。
【００６１】
１．配列番号３に示される塩基配列を有する遺伝子。
【００６２】
２．配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡ、又は当該ＤＮＡと相補的な塩基配
列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子。
【００６３】
３．配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡの一部、又は当該ＤＮＡと相補的な
塩基配列からなるＤＮＡの一部とストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子。
【００６４】
４．配列番号３に示される塩基配列のうち、１９４ないし１０６６番目の塩基配列を有
する遺伝子。なお、配列番号３に示される塩基配列の１９４ないし１０６６番目の塩基配
列は配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるたんぱく質に翻訳される領域である。
【００６５】
５．配列番号３に示される塩基配列のうち、１９４ないし１０６６番目の塩基配列から
なるＤＮＡ、又は当該ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条
件でハイブリダイズする遺伝子。
【００６６】
６．配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるたんぱく質をコードする遺伝子。
【００６７】
７．配列番号４に示されるアミノ酸配列の１個又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、
挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるたんぱく質をコードする遺伝子。
【００６８】
〔本発明に係るΔ５不飽和化酵素遺伝子〕
本発明に係るΔ５不飽和化酵素遺伝子は、Δ５脂肪酸不飽和化活性を有するたんぱく質
をコードするゼニゴケ目生物由来の遺伝子であり、以下の条件に適合する遺伝子であれば
よい。
【００６９】
１．配列番号５に示される塩基配列を有する遺伝子。
【００７０】
２．配列番号５に示される塩基配列からなるＤＮＡ、又は当該ＤＮＡと相補的な塩基配
列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子。
【００７１】
３．配列番号５に示される塩基配列からなるＤＮＡの一部、又は当該ＤＮＡと相補的な
塩基配列からなるＤＮＡの一部とストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子。
【００７２】
４．配列番号５に示される塩基配列のうち、３７５ないし１８２９番目の塩基配列を有
する遺伝子。なお、配列番号５に示される塩基配列の３７５ないし１８２９番目の塩基配
列は配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるたんぱく質に翻訳される領域である。
【００７３】
５．配列番号５に示される塩基配列のうち、３７５ないし１８２９番目の塩基配列から
なるＤＮＡ、又は当該ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条
件でハイブリダイズする遺伝子。
【００７４】
６．配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるたんぱく質をコードする遺伝子。
【００７５】
７．配列番号６に示されるアミノ酸配列の１個又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、
挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるたんぱく質をコードする遺伝子。
【００７６】
なお、上記「ストリンジェントな条件」とは、少なくとも９０％の同一性、好ましくは
少なくとも９５％の同一性、最も好ましくは少なくとも９７％の同一性が配列間に存在す
るときにのみハイブリダイゼーションが起こることを意味する。
【００７７】
上記ハイブリダイゼーションは、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ Ｅｄ．，Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）に記載されてい
る方法等、従来公知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほ
どストリンジェンシーは高くなり（ハイブリダイズし難くなる）、より相同な遺伝子を取
得することができる。ハイブリダイゼーションの条件としては、従来公知の条件を好適に
用いることができ、特に限定しないが、例えば、４２℃、６×ＳＳＰＣ、５０％ホルムア
ミド、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ ｓａｌｍｏｎ ｓｐｅｒｍ ＤＮＡ、５×デンハ
ルト液（ただし、１×ＳＳＰＥ；０．１８Ｍ 塩化ナトリウム、１０ｍＭ リン酸ナトリ
ウム、ｐＨ７．７、１ｍＭ ＥＤＴＡ）が挙げられる。
【００７８】
上記「ゼニゴケ目生物」とは、ゼニゴケ（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈ
ａ）に限定されるものではなく、ゼニゴケ亞網ゼニゴケ目（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａｌｅｓ
）に属する生物が含まれる。これらのうち、Ｍｏｎｏｃｌｅａ ｆｏｒｓｔｅｒｉ（Ｍｏ
ｎｏｃｌｅａｌｅｓ）、Ｃｏｒｓｉｎｉａ ｃｏｒｉａｎｄｒｉｎａ（Ｍａｒｃｈａｎｔ
ｉａｌｅｓ）、Ｏｘｉｍｉｔｒａ ｐａｌｅａｃｅａ（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａｌｅｓ）、
Ｒｉｃｃｉｏｃａｒｐｏｓ ｎａｔａｎｓ（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａｌｅｓ）、Ｒｉｃｃａ
ｈｕｅｂｅｎｅｒｉａｎａ（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａｌｅｓ）、Ｒｉｃｃａ ｆｌｕｉｔ
ａｎｓ（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａｌｅｓ）、Ｒｉｃｃａ ｄｕｐｌｅｘ（Ｍａｒｃｈａｎｔ
ｉａｌｅｓ）、Ｒｉｃｃａ ｃａｎａｌｉｃｕｌａｔａ（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａｌｅｓ）
、Ｒｉｃｃａ ｂｉｆｕｒｃａ（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａｌｅｓ）、Ｒｉｃｃａ ｃｉｌｉ
ｉｆｅｒａ（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａｌｅｓ）、Ｒｉｃｃａ ｇｌａｕｃａ（Ｍａｒｃｈａ
ｎｔｉａｌｅｓ）、Ｒｉｃｃａ ｓｏｒｏｃａｒｐａ（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａｌｅｓ）、
Ｒｉｃｃａ ｗａｒｎｓｔｏｒｆｉｉ（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａｌｅｓ）、Ｒｉｃｃａ ｍ
ｉｃｈｅｌｉｉ（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａｌｅｓ）、Ｒｉｃｃａ ｐａｐｉｌｌｏｓａ（Ｍ
ａｒｃｈａｎｔｉａｌｅｓ）及びＲｉｃｃａ ｚａｃｈａｒｉａｅ（Ｍａｒｃｈａｎｔｉ
ａｌｅｓ）には、超長鎖長高度不飽和脂肪酸が存在することが知られている（Ｐｒｏｇ．
Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３２，ｐ２８１，１９９３参照）。これらの生物からΔ６不飽和化
酵素、Δ６鎖長延長酵素及びΔ５不飽和化酵素の遺伝子を取得することは現在の技術水準
を持ってすれば容易である。例えば、近縁生物の同じ機能を有する酵素をコードする遺伝
子は、クロスハイブリダイゼーションすることが一般に知られている。
【００７９】
本発明の遺伝子は、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖及びアンチセン
ス鎖といった各１本鎖ＤＮＡやＲＮＡを包含する。アンチセンス鎖は、プローブとして又
はアンチセンス化合物として利用できる。ＤＮＡには、例えばクローニングや化学合成技
術又はそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡなどが含まれる。さ
らに、本発明の遺伝子は、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配
列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
【００８０】
（３）本発明に係るたんぱく質
〔本発明に係るΔ６不飽和化酵素たんぱく質〕
本発明に係るΔ６不飽和化酵素たんぱく質は、ゼニゴケ目生物由来のたんぱく質であっ
てΔ６脂肪酸不飽和化活性を有するたんぱく質であればよい。より具体的には、以下に示
すたんぱく質であればよい。
【００８１】
１．上記（２）に記載した本発明に係るΔ６不飽和化酵素遺伝子によってコードされる
たんぱく質。
【００８２】
２．配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるたんぱく質。
【００８３】
３．配列番号２に示されるアミノ酸配列の１個又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、
挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるたんぱく質。
【００８４】
〔本発明に係るΔ６鎖長延長酵素たんぱく質〕
本発明に係るΔ６鎖長延長酵素たんぱく質は、ゼニゴケ目生物由来のたんぱく質であっ
てΔ６脂肪酸鎖長延長活性を有するたんぱく質であればよい。より具体的には、以下に示
すたんぱく質であればよい。
【００８５】
１．上記（２）に記載した本発明に係るΔ６鎖長延長酵素遺伝子によってコードされる
たんぱく質。
【００８６】
２．配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるたんぱく質。
【００８７】
３．配列番号４に示されるアミノ酸配列の１個又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、
挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるたんぱく質。
【００８８】
〔本発明に係るΔ５不飽和化酵素たんぱく質〕
本発明に係るΔ５不飽和化酵素たんぱく質は、ゼニゴケ目生物由来のたんぱく質であっ
てΔ５脂肪酸不飽和化活性を有するたんぱく質であればよい。より具体的には、以下に示
すたんぱく質であればよい。
【００８９】
１．上記（２）に記載した本発明に係るΔ５不飽和化酵素遺伝子によってコードされる
たんぱく質。
【００９０】
２．配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるたんぱく質。
【００９１】
３．配列番号６に示されるアミノ酸配列の１個又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、
挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるたんぱく質。
【００９２】
上記「Δ６脂肪酸不飽和化活性」とは、リノール酸又はα−リノレン酸に対して基質特
異性を有し、それぞれγ−リノレン酸又はステアリドン酸に変換する作用を意味する。ま
た、上記「Δ６脂肪酸鎖長延長活性」とは、γ−リノレン酸又はステアリドン酸に対して
基質特異性を有し、それぞれジホモ−γ−リノレン酸又はエイコサテトラエン酸に変換す
る作用を意味する。また、上記「Δ５脂肪酸不飽和化活性」とは、ジホモ−γ−リノレン
酸又はエイコサテトラエン酸に対して基質特異性を有し、それぞれアラキドン酸又はエイ
コサペンタエン酸（ＥＰＡ）に変換する作用を意味する。
【００９３】
上記「１個又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された」とは
、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異たんぱく質作製法により置換、欠失、挿入、
及び／又は付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さら
に好ましくは５個以下）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されることを意
味する。このような変異たんぱく質は、公知の変異たんぱく質作製法により人為的に導入
された変異を有するたんぱく質に限定されるものではなく、天然に存在する同様の変異た
んぱく質を単離精製したものであってもよい。
【００９４】
なお、本発明のたんぱく質は、アミノ酸がペプチド結合してなるポリペプチドであれば
よいが、これに限定されるものではなく、ポリペプチド以外の構造を含む複合たんぱく質
であってもよい。ここでいうポリペプチド以外の構造としては、糖鎖やイソプレノイド基
等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。
【００９５】
また、本発明のたんぱく質は、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。この
ようなポリペプチドが付加される場合としては、例えば、ＨｉｓやＭｙｃ、Ｆｌａｇ等に
よって本発明のたんぱく質がエピトープ標識されるような場合が挙げられる。
【００９６】
また、本発明のたんぱく質は、前述した本発明の遺伝子（本発明のたんぱく質をコード
する遺伝子）を宿主細胞に導入して、そのたんぱく質を細胞内発現させた状態であっても
よいし、細胞、組織などから単離精製された状態であってもよい。また、上記宿主細胞で
の発現条件によっては、本発明のたんぱく質は、他のたんぱく質とつながった融合たんぱ
く質であってもよい。さらに本発明のたんぱく質は、化学合成されたものであってもよい
。
【００９７】
（４）本発明に係るたんぱく質及び遺伝子の取得方法
本発明に係るたんぱく質及び遺伝子の取得方法（生産方法）は特に限定されるものでは
ないが、代表的な方法として次に示す各方法を挙げることができる。
【００９８】
〔たんぱく質の取得方法〕
本発明のたんぱく質を取得する方法（生産方法）は、上述したように特に限定されるも
のではないが、まず、本発明のたんぱく質を発現する細胞、組織などから単純精製する方
法を挙げることができる。精製方法も特に限定されるものではなく、公知の方法で細胞や
組織から細胞抽出液を調製し、この細胞抽出液を公知の方法、例えばカラム等を用いて精
製すればよい。
【００９９】
また、本発明のたんぱく質を取得する方法として、遺伝子組み換え技術等を用いる方法
も挙げられる。この場合、例えば、本発明の遺伝子をベクターなどに組み込んだ後、公知
の方法により発現可能に宿主細胞に導入し、細胞内で翻訳されて得られる上記たんぱく質
を精製するという方法などを採用することができる。
【０１００】
なお、このように宿主に外来遺伝子を導入する場合、外来遺伝子の発現のため宿主内で
機能するプロモーターを組み入れた発現ベクター及び宿主には様々なものが存在するので
、目的に応じたものを選択すればよい。産生されたたんぱく質を精製する方法は、用いた
宿主、たんぱく質の性質によって異なるが、タグの利用等によって比較的容易に目的のた
んぱく質を精製することが可能である。
【０１０１】
変異たんぱく質を作製する方法についても、特に限定されるものではない。例えば、部
位特異的突然変異誘発法（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，Ｇｅｎｅ １５２，２７１
−２７５（１９９５）他）、ＰＣＲ法を利用して塩基配列に点変異を導入し変異たんぱく
質を作製する方法、あるいはトランスポゾンの挿入による突然変異株作製法などの周知の
変異たんぱく質作製法を用いることができる。変異たんぱく質の作製には市販のキットを
利用してもよい。
【０１０２】
本発明のたんぱく質の取得方法は上述の方法限定されることはなく、例えば、化学合成
されたものであってもよい。例えば、無細胞系のたんぱく質合成液を利用して本発明の遺
伝子から本発明のたんぱく質を合成してもよい。
【０１０３】
〔遺伝子の取得方法〕
本発明の遺伝子を取得する方法（生産方法）も特に限定されるものではないが、例えば
、ディファレンシャルスクリーニング（サブトラクションクローニング）を利用する方法
を挙げることができる。この方法では、公知の技術に従って、試験管内での直接的ハイブ
リダイゼーションを繰り返し、目的のｃＤＮＡ（本発明の遺伝子）を濃縮すればよい。
【０１０４】
上記ディファレンシャルスクリーニングにおける各ステップについては、通常用いられ
る条件の下で行えばよい。これによって得られたクローンは、制限酵素地図の作成及びそ
の塩基配列決定（シークエンシング）によって、さらに詳しく解析することができる。こ
れらの解析によって、本発明の遺伝子配列を含むＤＮＡ断片を取得したか容易に確認する
ことができる。
【０１０５】
また、本発明の遺伝子を取得する方法として、公知の技術により、本発明の遺伝子を含
むＤＮＡ断片を単離し、クローニングする方法が挙げられる。例えば、本発明の遺伝子の
塩基配列の一部と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、ゲノムＤＮＡライブラ
リーやｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすればよい。このようなプローブとしては
、本発明の遺伝子の塩基配列又はその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイ
ズするプローブであれば、いずれの配列・長さのものを用いてもよい。
【０１０６】
また、上記プローブの配列を、上述したゼニゴケ間で良好に保存されている領域の中か
ら選択し、他のゼニゴケのゲノムＤＮＡ（又はｃＤＮＡ）ライブラリーをスクリーニング
すれば、上記たんぱく質と同様の機能を有する相同分子や類縁分子をコードする遺伝子を
単離しクローニングできる。
【０１０７】
あるいは、本発明の遺伝子を取得する方法として、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法を
挙げることができる。例えば、本発明の遺伝子のｃＤＮＡ配列のうち、５’側及び３’側
の配列（又はその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを
用いてゲノムＤＮＡ（又はｃＤＮＡ）等を鋳型にしてＰＣＲ等を行い、両プライマー間に
挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、本発明の遺伝子を含むＤＮＡ断片を大量に取得で
きる。
【０１０８】
（５）本発明に係る遺伝子及びたんぱく質の利用方法（有用性）
（５−１）組換え発現ベクター
本発明に係る組換え発現ベクターは、前記（２）に記載した本発明に係る遺伝子を含む
ものであれば、特に限定されるものではない。例えば、ｃＤＮＡが挿入された組換え発現
ベクターが挙げられる。組換え発現ベクターの作製には、プラスミド、ファージ、又はコ
スミドなどを用いることができるが特に限定されるものではない。また、作製方法も公知
の方法を用いて行えばよい。
【０１０９】
ベクターの具体的な種類は特に限定されるものではなく、ホスト細胞中で発現可能なベ
クターを適宜選択すればよい。すなわち、ホスト細胞の種類に応じて、確実に遺伝子を発
現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明の遺伝子を各種プラスミド
等に組み込んだものを発現ベクターとして用いればよい。
【０１１０】
本発明の遺伝子がホスト細胞に導入されたか否か、さらにはホスト細胞中で確実に発現
しているか否かを確認するために、各種マーカーを用いてもよい。例えば、ホスト細胞中
で欠失している遺伝子をマーカーとして用い、このマーカーと本発明の遺伝子とを含むプ
ラスミド等を発現ベクターとしてホスト細胞に導入する。これによってマーカー遺伝子の
発現から本発明の遺伝子の導入を確認することができる。あるいは、本発明のたんぱく質
を融合たんぱく質として発現させてもよく、例えば、オワンクラゲ由来の緑色蛍光たんぱ
く質ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）をマーカーとして
用い、本発明のたんぱく質をＧＦＰ融合たんぱく質として発現させてもよい。
【０１１１】
上記ホスト細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いる
ことができる。具体的には、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等の
細菌、酵母（出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、分裂酵母Ｓ
ｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉ
ｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）の卵
母細胞等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。
【０１１２】
上記発現ベクターをホスト細胞に導入する方法、すなわち形質転換方法も特に限定され
るものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソ−ム法、ＤＥＡＥデキストラ
ン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。また、例えば、本発明のたんぱく
質を昆虫で転移発現させる場合には、バキュロウイルスを用いた発現系を採用することが
できる。
【０１１３】
（５−２）形質転換体
本発明に係る形質転換体は、前記（２）に記載した本発明に係る遺伝子導入された形質
転換体であれば、特に限定されるものではない。ここで「形質転換体」とは、細胞・組織
・器官のみならず、生物個体を含む意味である。
【０１１４】
形質転換体の作製方法（生産方法）は特に限定されるものではないが、例えば、上述し
た組換え発現ベクターをホスト細胞に導入して形質転換する方法を挙げることができる。
また、形質転換の対象となる生物も特に限定されるものではなく、上記ホスト細胞で例示
した各種微生物や動物を挙げることができる。
【０１１５】
本発明に係る形質転換体は、本発明に係る遺伝子が発現可能に導入された植物体、もし
くは当該植物体と同一の性質を有する当該植物体の子孫となる植物体、又は当該植物体の
組織の組織であることが好ましい。このような形質転換植物により、低コストかつ環境に
やさしい生産プロセスでアラキドン酸やＥＰＡ等の高度不飽和脂肪酸を生産することがで
きる。
【０１１６】
ここで「遺伝子が発現可能に導入された」とは、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作
技術）により、対象細胞（宿主細胞）内に発現可能に導入されることを意味する。
【０１１７】
植物体の形質転換に用いられる組換え発現ベクターは、当該植物細胞内で挿入遺伝子を
発現させることが可能なものであれば特に限定しない。例えば、植物細胞内で恒常的に遺
伝子を発現させるプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモ
ーター）を有するベクターや、外的な刺激により誘導的に活性化されるプロモーターを有
するベクターを用いることができる。なお、この植物細胞には、種々の形態の植物細胞、
例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどが含まれる。
【０１１８】
植物細胞への組み換え発現ベクターの導入には、ポリエチレングリコール法、電気穿孔
法（エレクトロポレーション法）、アグロバクテリウムを介する方法、パーティクルガン
法など、当業者に公知の種々の方法を用いることができる。形質転換細胞から植物体の再
生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である。
【０１１９】
例えば、タバコにおいて形質転換植物体を作出する手法については、形質転換したアグ
ロバクテリウムをタバコリーフディスクに感染させる方法、ポリエチレングリコールを用
いてプロトプラストへ遺伝子を導入し植物体に再生させる方法、電気パルスによりプロト
プラストへ遺伝子導入し植物体を再生させる方法、パーティクルガン法により細胞へ遺伝
子を直接導入し植物体を再生させる方法など、いくつかの技術が既に確立されている。本
発明においては、これらの方法を好適に用いることができる。
【０１２０】
また、タバコは、シロイヌナズナと並んで遺伝子工学的手法を用いる植物育種のモデル
植物である。このタバコにおいて、アラキドン酸やＥＰＡの含量が増加した形質転換体を
取得できるということは、植物全般において形質転換体を取得することができるといって
も過言ではない。なお、本明細書では、後述する実施例に示すように、タバコだけでなく
、イネの形質転換体をも取得しており、本発明によれば、あらゆる種類の形質転換植物体
を取得できることを実証している。
【０１２１】
例えば、イネにおいて形質転換植物体を作出する手法については、ポリエチレングリコ
ールを用いてプロトプラストへ遺伝子を導入し、植物体に再生させる方法、電気パルスに
よりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体を再生させる方法、パーティクルガン法によ
り細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を再生させる方法など、いくつかの技術が既に確立
されている。本発明においては、これらの方法を好適に用いることができる。
【０１２２】
上記形質転換植物体がイネである場合、イネ内のアラキドン酸やＥＰＡの含量が増加す
るので、この形質転換植物体から得られる種子、すなわち、米を食べることで、容易にア
ラキドン酸やＥＰＡ等の高度不飽和脂肪酸を、体内に摂取することが可能になる。したが
って、イネの形質転換植物体は、食糧としての価値が高く、食品産業、農業分野に極めて
有用である。また、現在あまり利用されていない米ぬか、モミガラ、ヒコバエ等でアラキ
ドン酸やＥＰＡを生産すれば、ここからこれら脂肪酸を抽出することにより、健康食品の
原料として有効利用できる。また、家畜の飼料としても利用できる。
【０１２３】
ゲノム内に本発明の遺伝子が導入された形質転換植物体がいったん得られれば、当該植
物体から有性生殖又は無性生殖により子孫を得ることができる。また、当該植物体、又は
、その子孫、あるいは、クローンから、繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊
根、株、カルス、プロトプラストなど）を得て、それらを基に当該植物体を量産すること
も可能である。したがって、本発明には、本発明の遺伝子が発現可能に導入された植物体
、もしくは、当該植物体と同一の性質を有する当該植物体の子孫となる植物体、又は、当
該植物体の組織、あるいは、当該植物体の繁殖材料も含まれる。
【０１２４】
また、当該植物体、当該植物体と同一の性質を有する当該植物体の子孫となる植物体、
及び、当該植物体の組織には、栄養増殖された植物体も含まれる。栄養増殖は、栄養生殖
、クローン成長とも呼ばれ、挿し芽、挿し木などによる増殖が一般的であり、試験管内で
は、葉、茎、根などの器官からの植物体の再分化やカルスによる増殖が可能である。植物
種によっては、枝の先端が特殊な冬芽を作る、腋芽が多肉化する、花がムカゴ化する、芋
を形成するなどの場合がある。
【０１２５】
さらに、本発明に係る遺伝子が発現可能に導入され、脂肪酸組成が改変された植物体、
もしくは当該植物体と同一の性質を有する当該植物体の子孫となる植物体、又は当該植物
体の組織、当該植物体の繁殖材料も本発明に含まれる。「脂肪酸組成が改変された」とは
形質転換前の植物体における脂肪酸組成と形質転換後における植物体の脂肪酸組成が異な
っていることを意味する。例えば、本来脂肪酸組成にアラキドン酸やＥＰＡが含まれてい
なかった植物を本発明に係る遺伝子で形質転換することにより、形質転換植物の脂肪酸組
成にアラキドン酸やＥＰＡが含まれる場合等を挙げることができる。
【０１２６】
（５−３）脂肪酸生産方法
本発明には、本発明に係る遺伝子で形質転換され、脂肪酸組成が改変された植物体又は
植物体の組織を用いて脂肪酸を生産する方法が含まれる。
【０１２７】
例えば、上述のようにアラキドン酸やＥＰＡの含量が増加した本発明に係る形質転換植
物から製造された食用油はアラキドン酸やＥＰＡの含量が高く、価値の高いものになる。
上記形質転換植物体の種子、果実、切穂、塊茎、塊根等も、アラキドン酸やＥＰＡを含む
食料として価値の高いものになる。
【０１２８】
（５−４）素材
本発明には、上述の脂肪酸生産方法により得られた物質、すなわち、γ−リノレン酸、
ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、ステアリドン酸、エイコサテトラエン酸、エイ
コサペンタエン酸を少なくとも１つ含む素材も含まれる。この「素材」とは、上述の食料
としての種子、果実、切穂、塊茎、又は、塊根の他に、工業原料用途に利用できる素材全
般を意味する。
【０１２９】
上記素材としては、例えば、アラキドン酸やＥＰＡを含む健康食品、フィルム、生分解
性プラスチック、機能性繊維、潤滑油、洗剤の素材等が挙げられる。上記の不飽和脂肪酸
は、分子内に二重結合を複数有するという、ユニークな物性を持つ。このため、例えば、
本発明の形質転換植物体により、アラキドン酸やＥＰＡを生産させることにより、生産コ
ストを低減できる。また、本発明により、環境にやさしい生産プロセスを実現できる。
【０１３０】
（５−５）脂肪酸組成改変方法
本発明には、本発明に係る遺伝子を用いて脂肪酸組成を改変する方法が含まれる。例え
ば、上述のように本発明に係る遺伝子を導入した形質転換体を作製することによりホスト
細胞の脂肪酸組成を改変することが可能となる。脂肪酸組成を改変する対象は特に限定さ
れるものではなく、植物以外にも動物、細菌、酵母等、あらゆる生物を対象とすることが
可能である。
【０１３１】
（５−６）遺伝子検出器具
本発明に係る遺伝子検出器具は、本発明に係る遺伝子の少なくとも一部の塩基配列又は
その相補配列をプローブとして用いたものである。遺伝子検出器具は、種々の条件下にお
いて、本発明の遺伝子の発現パタ−ンの検出・測定などに利用することができる。
【０１３２】
本発明の遺伝子検出器具としては、例えば、本発明の遺伝子と特異的にハイブリダイズ
する上記プローブを基盤（担体）上に固定化したＤＮＡチップが挙げられる。ここで「Ｄ
ＮＡチップ」とは、主として、合成したオリゴヌクレオチドをプローブに用いる合成型Ｄ
ＮＡチップを意味するが、ＰＣＲ産物などのｃＤＮＡをプローブに用いる貼り付け型ＤＮ
Ａマイクロアレイをも包含するものとする。
【０１３３】
プローブとして用いる配列は、ｃＤＮＡ配列の中から特徴的な配列を特定する従来公知
の方法によって決定することができる。具体的には、例えば、ＳＡＧＥ：Ｓｅｒｉａｌ
Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６
：１２６８，１９９７；Ｃｅｌｌ ８８：２４３，１９９７；Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：
４８４，１９９５；Ｎａｔｕｒｅ ３８９：３００，１９９７；米国特許第５，６９５，
９３７号）等を挙げることができる。
【０１３４】
なお、ＤＮＡチップの製造には、公知の方法を採用すればよい。例えば、オリゴヌクレ
オチドとして合成オリゴヌクレオチドを使用する場合には、フォトリソグラフィ−技術と
固相法ＤＮＡ合成技術との組み合わせにより、基盤上で該オリゴヌクレオチドを合成すれ
ばよい。一方、オリゴヌクレオチドとしてｃＤＮＡを用いる場合には、アレイ機を用いて
基盤上に貼り付ければよい。
【０１３５】
また、一般的なＤＮＡチップと同様、パーフェクトマッチプローブ（オリゴヌクレオチ
ド）と、該パーフェクトマッチプローブにおいて一塩基置換されたミスマッチプローブと
を配置して遺伝子の検出精度をより向上させてもよい。さらに、異なる遺伝子を並行して
検出するために、複数種のオリゴヌクレオチドを同一の基盤上に固定してＤＮＡチップを
構成してもよい。
【０１３６】
本発明に係る遺伝子検出器具は、上記例示したＤＮＡチップに限定されるものではなく
、本発明に係る遺伝子の少なくとも一部の塩基配列又はその相補配列をプローブとして用
いたものであればよい。
【０１３７】
（５−７）抗体
本発明に係る抗体は、本発明に係るたんぱく質、又はその部分たんぱく質・部分ペプチ
ドを抗原として、公知の方法によりポリクロ−ナル抗体又はモノクロ−ナル抗体として得
られる抗体である。公知の方法としては、例えば、文献（Ｈａｒｌｏｗらの「Ａｎｔｉｂ
ｏｄｉｅｓ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８））、岩崎らの「単クロ
ーン抗体ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ，講談社（１９９１）」）に記載の方法が挙げられ
る。このようにして得られる抗体は、本発明のたんぱく質の検出・測定などに利用できる
。
【０１３８】
（５−８）スクリーニング方法
本発明に係るスクリーニング方法は、本発明に係るたんぱく質を用いて、当該たんぱく
質を調節する遺伝子、又は当該たんぱく質を調節する物質をスクリーニングする方法であ
る。本発明のスクリーニング方法としては、物質間の結合の有無や解離の有無を調べる従
来公知の種々の方法を適用することができ、特に限定されるものではない。例えば、本発
明に係るたんぱく質の活性（Δ６不飽和化活性、Δ６鎖長延長活性及び／又はΔ５不飽和
化活性）を促進するような物質のスクリーニングを挙げることができる。
【０１３９】
また、本発明には、上記スクリーニング方法により得られた遺伝子又は物質も含まれる
。
【０１４０】
以下、実施例を示し、本発明についてさらに詳しく説明するが、もちろん、本発明は以
下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはい
うまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に
示した範囲で種々の変更が可能であり、開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られ
る実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【０１４１】
本実施例において、実験手法は、特に断らない限り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ．ａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載されている方法に従った。
【０１４２】
〔実施例１：ゼニゴケ由来のΔ６不飽和化酵素遺伝子の単離〕
これまでにクローニングされたΔ６不飽和化酵素のアミノ酸配列の比較により、アミノ
酸配列Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−（Ｇｌｕ／Ａｓｐ）−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ（配列番
号３７）及びＴｒｐ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ（配列番号３８
）が保存されていることがわかった。そこで、ゼニゴケ由来のΔ６不飽和化酵素遺伝子を
単離するために、上記のアミノ酸配列をコードする下記の縮退プライマーを用いた。
ｄＤ６ＤＥＳ−Ｆ ５’−ＴＧＧＴＧＧＡＡ（Ａ／Ｇ）ＧＡ（Ａ／Ｇ／Ｔ／Ｃ）ＡＡ（Ａ
／Ｇ）ＣＡ（Ｔ／Ｃ）ＡＡ−３’（配列番号７）
ｄＤ６ＤＥＳ−Ｒ ５’−（Ａ／Ｇ）ＴＴＩＡ（Ａ／Ｇ）ＩＣＣＩＣＣＩＧＴ（Ａ／Ｇ）
ＡＡＣＣＡ−３’ （配列番号８）
（Ｉはイノシン、（）内は複数の塩基）
【０１４３】
試料にはＥ系統ゼニゴケ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．９，ｐ１７９，２０００参
照）の葉状体を用いた。葉状体からのｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡの単離については、文献（
Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７，ｐ６０５，２００３；Ｂ
ｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７，ｐ１６６７，２００３）に
記載の方法に従った。単離したｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ １．５μｌを、Ｒｅａｄｙ−Ｔ
ｏ−Ｇｏ Ｔ−ｐｒｉｍｅｄ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社
製）を用いてｃＤＮＡに逆転写した。ＰＣＲは、上記ｃＤＮＡ約１０ｎｇを鋳型とし、上
記プライマー（ｄＤ６ＤＥＳ−Ｆ及びｄＤ６ＤＥＳ−Ｒ）及び酵素（Ｔａｋａｒａ Ｅｘ
Ｔａｑ、Ｔａｋａｒａ社製）０．５Ｕとを用いて、製造者の推奨する方法で行った。反
応液量は２０μｌとし、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９７００（ＰＥ Ａｐ
ｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、９４℃２分間保持後、９４℃で１分
間、４５℃で１．５分間、７２℃で２分間の反応を３５回繰り返し、その後４℃に冷却し
た。
【０１４４】
得られたＰＣＲ産物を１％（ｗ／ｖ）アガロ−スゲルで電気泳動し、従来のΔ６不飽和
化酵素のアミノ酸配列から予想されるサイズを有する増幅断片を、Ｐｒｅｐ−Ａ Ｇｅｎ
ｅ（Ｂｉｏ−ｒａｄ社製）を用いてゲルより回収した。回収した増幅断片をｐＴ７Ｂｌｕ
ｅ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｔａｋａｒａ社製）に連結し、大腸菌Ｅｌｅｃｔｒｏ−ｍａｘ ＤＨ
１０Ｂ ｃｅｌｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に形質転換
した。
【０１４５】
ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ（
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）及びａｕｔｏｍａｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃ
ｅｒ ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用
いて得られた全クローンの塩基配列を決定し、目的のｃＤＮＡ配列をもつものを探索した
。
【０１４６】
さらに、全長ｃＤＮＡ配列を取得するために、５’−ＲＡＣＥ及び３’−ＲＡＣＥを行
った。これには、５’−ＲＡＣＥ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉ
ｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ社製）、Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ Ｔ−ｐｒｉｍｅｄ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ
ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）及び下記のプライマー（ＭｐＤＥＳ６−０２Ｒ及びＭｐ
ＤＥＳ６−０１Ｆ）を用い、製造者の推奨する方法で行った。
ＭｐＤＥＳ６−０２Ｒ：５’−ＡＡＧＴＴＧＣＣＴＴＣＧＡＴＧＴＴＴＣＴＧＧ−３’（
配列番号９）
ＭｐＤＥＳ６−０１Ｆ：５’−ＧＣＴＣＧＣＣＴＧＧＡＧＣＡＡＧＧＡＡＡＡＴＣ−３’
（配列番号１０）
【０１４７】
その結果、１種類のホモログ遺伝子候補が単離され、この遺伝子をＭｐＤＥＳ６遺伝子
とした。単離されたＭｐＤＥＳ６遺伝子のｃＤＮＡの長さ（ポリＡ部分を除く）は、２，
５２２ｂｐであり、そのコードする推定アミノ酸配列は４８１残基であった。その塩基配
列を配列番号１、アミノ酸配列を配列番号２に示した。
【０１４８】
ＭｐＤＥＳ６ｃＤＮＡの推定アミノ酸配列をヒメツリガネゴケのΔ６不飽和化酵素のア
ミノ酸配列と比較した結果、４７．５％の同一性しか示さなかった。
【０１４９】
〔実施例２：ゼニゴケ由来のΔ６鎖長延長酵素遺伝子の単離〕
これまでにクローニングされたΔ６鎖長延長酵素のアミノ酸配列の比較により、アミノ
酸配列Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ（配列番号３９）及び
Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（配列番号４０）が保存され
ていることがわかった。そこで、ゼニゴケ由来のΔ６鎖長延長酵素遺伝子を単離するため
に、上記のアミノ酸配列をコードする下記の縮退プライマーを用いた。
ｄＤ６ＥＬＯ−Ｆ ５’−ＧＴＩＧＡ（Ａ／Ｇ）ＴＴ（Ｔ／Ｃ）ＡＴＧＧＡ（Ｔ／Ｃ）Ａ
ＣＩＧＴ−３’ （配列番号１１）
ｄＤ６ＥＬＯ−Ｒ ５’−Ｃ（Ｇ／Ｔ）ＩＣＣＣＣＡ（Ａ／Ｇ）ＡＡＩＡ（Ａ／Ｇ）（Ａ
／Ｇ）ＴＡ（Ｔ／Ｃ）ＴＴ−３’（配列番号１２）
【０１５０】
上記のプライマー（ｄＤ６ＥＬＯ−Ｆ及びｄＤ６ＥＬＯ−Ｒ）を用いてＰＣＲをい、得
られたＤＮＡ断片をサブクローニングした。得られたクローンの塩基配列を決定し、目的
のｃＤＮＡ配列をもつクローンについて下記のプライマー（ＭｐＥＬＯ１−０２Ｒ及びＭ
ｐＥＬＯ１−０１Ｆ）を用いて完全長ｃＤＮＡを取得した。なお、実験材料及び方法は、
実施例１と同様である。
ＭｐＥＬＯ１−０２Ｒ：５’−ＧＣＧＡＧＣＴＴＴＣＴＣＧＴＴＣＴＴＴＣＣＣ−３’（
配列番号１３）
ＭｐＥＬＯ１−０１Ｆ：５’−ＴＡＴＧＡＴＴＴＴＧＡＡＧＣＧＣＡＡＣＡＣＧ−３’（
配列番号１４）
【０１５１】
その結果、１種類のホモログ遺伝子候補が単離され、この遺伝子をＭｐＥＬＯ１遺伝子
とした。ＭｐＥＬＯ１遺伝子のｃＤＮＡの長さ（ポリＡ部分を除く）は、１，５５９ｂｐ
で、推定アミノ酸配列は２９０残基であった。その塩基配列を配列番号３、アミノ酸配列
を配列番号４に示した。
【０１５２】
ＭｐＥＬＯ１ｃＤＮＡの推定アミノ酸配列をヒメツリガネゴケのΔ６鎖延長酵素のアミ
ノ酸配列と比較した結果、同一性は６２．７％であった。
【０１５３】
〔実施例３：ゼニゴケ由来のΔ５不飽和化酵素遺伝子の単離〕
他生物種のΔ５不飽和化酵素は、そのＮ末端にシトクロムｂ５ドメインを有する。この
ことから、ゼニゴケ由来のΔ５不飽和化酵素遺伝子は、Δ６不飽和化酵素遺伝子と同じく
、シトクロムｂ５ドメイン融合型不飽和化酵素遺伝子ファミリーに属することが予想され
た。しかしながら、ケイ藻や真菌においては、Δ５不飽和化酵素及びΔ６不飽和化酵素間
のアミノ酸配列レベルでの相同性は非常に低い。そこで、糸状菌（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）の
Δ５不飽和化酵素及びΔ６不飽和化酵素間のアミノ酸配列を比較した結果、縮退プライマ
ー設計に最低限必要な４から５残基程度の連続した保存配列が局所的に存在することを見
出した。驚くべきことに、これらの保存配列は、異種のΔ５不飽和化酵素のアミノ酸配列
間より、同種内のΔ５不飽和化酵素とΔ６不飽和化酵素との間で、より保存されているこ
とを見出した。このことから、シトクロムｂ５ドメイン融合型不飽和化酵素遺伝子には、
種特異的な保存配列が存在する場合があると考えられた。そこで、上述のＭｐＤＥＳ６と
、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５９，ｐ９８１，２００１に記載されている機能未知のＭｐＤＥ
Ｓとで、塩基配列を鋭意比較検討した結果、２箇所のアミノ酸配列（Ｉ（Ｅ／Ｎ）（Ｇ／
Ｄ）ＫＶＹＤＶ（配列番号４１）、及び、ＤＰＤＩ（Ｑ／Ｄ）（Ｙ／Ｔ）（Ｍ／Ｖ）Ｐ（
配列番号４２））のアミノ酸配列が保存されていることを見出した。それぞれのアミノ酸
配列に対応する縮退プライマーの配列を次に示す。
ｄＤ５ＤＥＳ−Ｆ ５’−ＡＴ（Ａ／Ｔ／Ｃ）（Ａ／Ｇ）ＡＩＧ（Ａ／Ｇ）ＩＡＡ（Ａ／
Ｇ）ＴＩＴＡ（Ｔ／Ｃ）ＧＡ（Ｔ／Ｃ）ＧＴ−３’（配列番号１５）
ｄＤ５ＤＥＳ−Ｒ ５’−ＧＧＩＡ（Ｔ／Ｃ）Ｉ（Ｇ／Ｔ）（Ａ／Ｔ）ＩＴ（Ｇ／Ｃ）（
Ａ／Ｇ／Ｔ）ＡＴ（Ａ／Ｇ）ＴＣＩＧＧ（Ａ／Ｇ）ＴＣ−３’（配列番号１６）
【０１５４】
上記プライマー（ｄＤ５ＤＥＳ−Ｆ及びｄＤ５ＤＥＳ−Ｒ）を用いてＰＣＲを行い、得
られたＤＮＡ断片をサブクローニングした。得られたクローンの塩基配列を決定し、目的
のｃＤＮＡ配列をもつクローンについて下記のプライマー（ＭｐＤＥＳ５−０２Ｒ及びＭ
ｐＤＥＳ５−０１Ｆ）を用いて完全長ｃＤＮＡを取得した。なお、実験材料及び方法は、
実施例１と同様である。
ＭｐＤＥＳ５−０２Ｒ：５’−ＧＴＧＴＧＴＡＣＧＡＴＣＣＧＴＧＧＴＴＡＣＣ−３’（
配列番号１７）
ＭｐＤＥＳ５−０１Ｆ：５’−ＡＡＧＧＣＧＧＧＡＣＡＧＧＡＴＴＣＡＡＣＡＣ−３’（
配列番号１８）
【０１５５】
その結果、ゼニゴケ由来のΔ５不飽和化酵素の候補として、２種類の長さの異なるクロ
ーンｃ１及びｃ２を単離した（ｃ１：２，４２７ｂｐ、ｃ２：２，２８５ｂｐ）。ｃ１と
ｃ２との塩基配列を比較したところ、５’非翻訳領域で、オルタナティブ・スプライシン
グ（選択的スプライシング）が起こっていることが明らかとなった。オルタナティブ・ス
プライシングによる読み枠の変化はなく、いずれのクローンも４８４個のアミノ酸をコー
ドしていた（配列番号６）。以下、２，４２７ｂｐの長さのクローンｃ１をＭｐＤＥＳ５
遺伝子（配列番号５）とし、以下の実施例に用いた。
【０１５６】
ＭｐＤＥＳ５ｃＤＮＡの推定アミノ酸配列を糸状菌（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）のΔ５不飽和
化酵素のアミノ酸配列と比較した結果、３１．４％の同一性であった。ゼニゴケと近縁な
ヒメツリガネゴケのΔ５不飽和化酵素に関しては、配列情報が公表されていないため、こ
こでは比較を行わなかった。
【０１５７】
〔実施例４：メタノール資化性酵母（Ｐｉｃｈｉｃａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）を用いた機能
解析〕
ＭｐＤＥＳ６、ＭｐＥＬＯ１及びＭｐＤＥＳ５のｃＤＮＡの機能を調べるために、まず
個々のＯＲＦを、メタノール誘導性プロモーターＡＯＸ１の下流に配置したコンストラク
トを作製した。これらのコンストラクトをメタノール資化性酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓ
ｔｏｒｉｓ）に導入し、その脂肪酸組成を解析した。ＭｐＤＥＳ６、ＭｐＥＬＯ１、及び
、ＭｐＤＥＳ５のｃＤＮＡ塩基配列のＯＲＦ部分を、下記のプライマーを用いて、ＰＣＲ
により増幅した。
（ＭｐＤＥＳ６ＯＲＦ増幅用プライマー）
ＭｐＤ６−１７Ｆ：５’−ＧＧＡＡＴＴＣＧＣＧＡＴＧＧＣＣＴＣＧＴＣＣＡＣＣＡＣＣ
ＡＣ−３’（配列番号１９）
ＭｐＤ６−１８Ｆ：５’−ＧＧＡＡＴＴＣＴＡＣＴＴＴＣＧＣＡＧＣＧＴＡＴＧＣＴＡＣ
Ｃ−３’（配列番号２０）
（ＭｐＥＬＯ１ＯＲＦ増幅用プライマー）
ＭｐＤ６ＥＬＯ１−１５Ｆ：５’−ＧＧＡＡＴＴＣＧＣＧＡＴＧＧＡＧＧＣＧＴＡＣＧＡ
ＧＡＴＧＧ−３’（配列番号２１）
ＭｐＤ６ＥＬＯ１−１６Ｆ：５’−ＧＧＡＡＴＴＣＴＴＣＴＧＣＣＴＴＴＴＴＧＣＴＣＴ
ＴＧＡＴＣ−３’（配列番号２２）
（ＭｐＤＥＳ５ＯＲＦ増幅用プライマー）
ＭｐＤ５−１１Ｆ：５’−ＧＴＴＧＡＡＴＴＣＧＡＣＡＧＴＴＡＴＧＣＣＧＣＣＡＣＡＣ
ＧＣ−３’（配列番号２３）
ＭｐＤ５−１２Ｒ：５’−ＧＴＴＧＡＡＴＴＣＡＧＧＣＣＣＡＡＡＧＣＡＴＧＣＴＧＴＣ
ＡＣ−３’（配列番号２４）
【０１５８】
これらのプライマーは、下線で示したＥｃｏＲＩ認識配列を含んでおり、これを以下の
クローニングに利用した。また、ＰＣＲにはＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒ
ａｓｅ（Ｔａｋａｒａ社製）０．５Ｕを用い、製造者の推奨する方法に従って反応液量２
０μｌで行った。反応条件は、９４℃で２分間保持後、９４℃で１分間、５７℃で１分間
、７２℃で１分間の反応を２５回繰り返し、その後４℃に冷却した。得られた各ＯＲＦ断
片をＥｃｏＲＩで消化した後、実施例１に記載の方法でゲル精製を行った。そして、メタ
ノール資化性酵母の発現ベクターｐＰＩＣＺＡ（マーカー：ゼオシン耐性遺伝子，Ｉｎｖ
ｉｔｒｏｇｅｎ社製）内のメタノール誘導性プロモーター５’ＡＯＸ１下流のＥｃｏＲＩ
部位にセンス方向に連結した。
【０１５９】
各々の発現コンストラクト及び対照としてのｐＰＩＣＺＡベクターを、Ｐｉｃｈｉａ
ＥａｓｙＣｏｍｐ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてメタノール資化性酵母
のＰＰＹ１系統に導入し、ゼオシン耐性をマーカーとして形質転換体を取得した。なお、
メタノール資化性酵母は、Δ６不飽和化酵素の基質であるリノール酸とα−リノレン酸を
合成することができるが、アラキドン酸やＥＰＡのその他の前駆体を合成することはでき
ない。
【０１６０】
導入した遺伝子を発現させるため、ＥａｓｙＳｅｌｅｃｔ Ｐｉｃｈｉａ Ｅｘｐｒｅ
ｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用い、当該キットの推奨する方法に
従いて、各形質転換体を１．０％グリセロールのみを炭素源とする最小培地中でＯＤ（６
００ｎｍ）が０．５になるまで培養した後、０．５％メタノールのみを炭素源とする最小
培地中で３０℃、３日間、飽和状態になるまで培養した。その後、各々の形質転換体の脂
肪酸組成を、ＧＣ−ＭＳを用いて公知の方法（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．６７，ｐ６０５，２００３）により測定した。
【０１６１】
ＭｐＤＥＳ６遺伝子を発現させた形質転換体では、Δ６不飽和化酵素の反応産物である
ｇ−リノレン酸及びステアリドン酸が、全脂肪酸のそれぞれ７．４％及び０．７％新たに
検出された。対照としてｐＰＩＣＺＡベクターを導入した酵母ではこれらは検出されなか
った。以上のことから、ＭｐＤＥＳ６はΔ６不飽和化酵素をコードしていることが示され
た。
【０１６２】
ＭｐＥＬＯ１遺伝子を発現させた形質転換体では、ｇ−リノレン酸を添加した場合にジ
ホモ−ｇ−リノレン酸が全脂肪酸の１４．１％、ステアリドン酸を添加した場合にエイコ
サテトラエン酸が１．５％新たに検出された。対照としてｐＰＩＣＺＡベクターを導入し
た酵母では、これらは検出されなかった。以上のことから、ＭｐＥＬＯ１はΔ６鎖長延長
酵素をコードしていることが示された。
【０１６３】
ＭｐＤＥＳ５遺伝子を発現させた形質転換体では、ジホモ−ｇ−リノレン酸を添加した
場合にアラキドン酸が全脂肪酸の１．１％、ステアリドン酸を添加した場合にエイコサペ
ンタエン酸（ＥＰＡ）が０．１％検出された。対照としてｐＰＩＣＺＡベクターを導入し
た酵母ではこれらは検出されなかった。以上から、ＭｐＤＥＳ５は、Δ５不飽和化酵素を
コードすることが示された。
【０１６４】
以上のようにゼニゴケから、Δ６不飽和化酵素、Δ６鎖長延長酵素及びΔ５不飽和化酵
素をコードする遺伝子として、それぞれＭｐＤＥＳ６、ＭｐＥＬＯ１及びＭｐＤＥＳ５を
取得することができた。
【０１６５】
〔実施例５：メタノール資化性酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）におけるゼニゴケ高度不飽
和脂肪酸生合成系の再構成〕
ＭｐＤＥＳ６、ＭｐＥＬＯ１及びＭｐＤＥＳ５を共発現させるために、上記実施例４で
作製した、ＥｃｏＲＩ消化したＭｐＥＬＯ１及びＭｐＤＥＳ５のＯＲＦ増幅断片を、各々
別のメタノール資化性酵母発現ベクターｐＰＩＣ３Ｋ（マーカー：ＨＩＳ４遺伝子、Ｉｎ
ｖｉｔｒｏｇｅｎ社製社）及びｐＰＩＣ６Ａ（マーカー：ブラスチシジン耐性遺伝子、Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製社）の５’ＡＯＸ１プロモーター下流のＥｃｏＲＩ部位にセンス
方向に連結した。また、ＭｐＤＥＳ６に関しては、実施例４で作製した発現ベクターを用
いた。以下各発現ベクターを、それぞれｐＰＩＣＺＡ−ＭｐＤＥＳ６、ｐＰＩＣ３Ｋ−Ｍ
ｐＥＬＯ１及びｐＰＩＣ６Ａ−ＭｐＤＥＳ５と表記する。
【０１６６】
まず、ｐＰＩＣＺＡ−ＭｐＤＥＳ６、又は、対照としてのｐＰＩＣＺＡベクターのみを
、上記実施例４で用いたメタノール資化性酵母ＰＰＹ１系統と同じ脂肪酸組成を持つメタ
ノール資化性酵母ＰＰＹ１２系統（ｈｉｓ４，ａｒｇ４）に形質転換し、ゼオシン耐性を
マーカーにして形質転換体を取得した。続いて、ｐＰＩＣ３Ｋ−ＭｐＥＬＯ１、又は、対
照としてのｐＰＩＣ３Ｋベクターのみを、それぞれ、ｐＰＩＣＺＡ−ＭｐＤＥＳ６、又は
ｐＰＩＣＺＡのみがゲノム中に組み込まれた形質転換体に導入し、ヒスチジン合成能をマ
ーカーにして形質転換体を取得した。最後に、ｐＰＩＣ６Ａ−ＭｐＤＥＳ５、又は、対照
としてのｐＰＩＣ６Ａベクターのみを、ｐＰＩＣＺＡ−ＭｐＤＥＳ６及びｐＰＩＣ３Ｋ−
ＭｐＥＬＯ１又はｐＰＩＣＺＡ及びｐＰＩＣ３Ｋがゲノム中に組み込まれた上記形質転換
体に導入し、ブラストジン耐性をマーカーとして形質転換体を取得した。
【０１６７】
得られた２種類又は３種類の遺伝子が導入された形質転換体を用いて、ゼニゴケのアラ
キドン酸／ＥＰＡ生合成系の再構成実験を行った。まず、上記２種類の遺伝子（ＭｐＤＥ
Ｓ６及びＭｐＥＬＯ１）を導入した。形質転換体を用いて、ＭｐＤＥＳ６たんぱく質及び
ＭｐＥＬＯ１たんぱく質をメタノール資化性酵母内で共発現させた。その結果、Δ６不飽
和化反応産物であるｇ−リノレン酸（全脂肪酸の２．９％）及びステアリドン酸（全脂肪
酸の０．４％）に加え、それらの鎖長延長反応産物であるジホモ−ｇ−リノレン酸（全脂
肪酸の２．８％）及びエイコサテトラエン酸（全脂肪酸の０．２％）が生じた。対照とし
た形質転換体では、これらの脂肪酸は検出されなかった。上記形質転換体に、さらにＭｐ
ＤＥＳ５を導入した形質転換体では、ｇ−リノレン酸（全脂肪酸の２．８％）、ステアリ
ドン酸（全脂肪酸の０．５％）、ジホモ−ｇ−リノレン酸（全脂肪酸の１．５％）及びエ
イコサテトラエン酸（全脂肪酸の０．１％）の４種の脂肪酸に加えて、アラキドン酸（全
脂肪酸の０．１％）及びエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、全脂肪酸の０．０３％）の生成
が認められた。対照とした形質転換体では、これらの脂肪酸は検出されなかった。この結
果から、ゼニゴケ由来のΔ６不飽和化酵素、Δ６鎖長延長酵素及びΔ５不飽和化酵素の遺
伝子を発現させることで、ゼニゴケ以外の生物種においても、高度不飽和脂肪酸生合成系
の再構築が可能であることが示された。
【０１６８】
〔実施例６：イネに導入するベクターの構築及び当該ベクターのイネへの導入〕
イネにおいて、ＭｐＤＥＳ６、ＭｐＥＬＯ１及びＭｐＤＥＳ５遺伝子を発現させるため
に、以下の（ｉ）〜（ｉｖ）に示す手順で発現コンストラクトを作製した。また、作製手
順を図１に示した。
【０１６９】
（ｉ）ｐＢＩ２２１（ＴＯＹＯＢＯ社製）のカリフラワ−モザイクウイルス（ＣａＭＶ
）３５Ｓプロモーター、及び、ＮＯＳターミネーター間に設計した以下のプライマーを用
いたＰＣＲにより、β−Ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ（ＧＵＳ）遺伝子部分を除いた発現
ベクターｐ３５Ｓ−ＮＯＳを作製した。
ＭＫ００１（Ｆ）：５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＣＣＴＧＧＣＧＣＡＣＣＡＴＣＧＴＣ
−３’（配列番号２５）
ＭＫ００２（Ｒ）：５’−ＧＧＧＧＴＡＣＣＡＡＣＧＣＧＣＴＴＴＣＣＣＡＣＣＡＡＣＧ
−３’（配列番号２６）
【０１７０】
なお、プライマーＭＫ００１（Ｆ）は下線で示すＢａｍＨＩ認識配列を含み、ＧＵＳ遺
伝子の３’末端にアニールし、プライマーＭＫ００２（Ｒ）はＧＵＳ遺伝子の５’末端に
アニールする（ＢａｍＨＩサイトがアニール部位の上流に存在する）。ＰＣＲにはＰｙｒ
ｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ社製）０．５Ｕを用い、製造
者の推奨する方法に従って反応液量５０μｌで行った。反応条件は、９６℃５分間保持後
、９４℃で３０秒間、６８℃で４分間の反応を３０回繰り返し、その後４℃に冷却した。
得られた各ＯＲＦ断片をＢａｍＨＩ消化した後、実施例１に記載の方法でゲル精製を行っ
た後、自己連結させた。
【０１７１】
（ｉｉ）次にｐ３５Ｓ−ＮＯＳのＸｂａＩサイトに、ＭｐＤＥＳ６遺伝子、ＭｐＥＬＯ
１遺伝子及びＭｐＤＥＳ５遺伝子のＯＲＦを各々連結した。ＯＲＦ増幅には、下線で示す
ＸｂａＩ認識配列を含む以下のプライマーを用いた。
（ＭｐＤＥＳ６ ＯＲＦ増幅用プライマー）
ＭｐＤ６−２１Ｆ：５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＧＣＧＡＴＧＧＣＣＴＣＧＴＣＣＡＣＣＡＣ
Ｃ−３’（配列番号２７）
ＭｐＤ６−１１Ｒ：５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＣＴＡＴＡＣＴＴＴＣＧＣＡＧＣＧＴＡＴＧ
Ｃ−３’（配列番号２８）
（ＭｐＥＬＯ１ ＯＲＦ増幅用プライマー）
ＭｐＤ６ＥＬＯ１−１８Ｆ：５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＧＣＧＡＴＧＧＡＧＧＣＧＴＡＣＧ
ＡＧＡＴＧＧ−３’（配列番号２９）
ＭｐＤ６ＥＬＯ１−１３Ｒ：５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＴＴＣＴＧＣＣＴＴＴＴＴＧ
ＣＴＣ−３’ （配列番号３０）
（ＭｐＤＥＳ５ ＯＲＦ増幅用プライマー）
ＭｐＤ５−２２Ｆ：５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＧＡＣＡＧＴＴＡＴＧＣＣＧＣＣＡＣＡＣＧ
Ｃ−３’（配列番号３１）
ＭｐＤ５−２３Ｒ：５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＡＧＧＣＣＣＡＡＡＧＣＡＴＧＣＴＧＴＣＡ
Ｃ−３’（配列番号３２）
【０１７２】
ＰＣＲにはＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ社製）０
．５Ｕを用い、製造者の推奨する方法に従って、反応液量２０μｌで行った。反応条件は
、９４℃で２分間保持後、９４℃で１分間、５７℃で１分間、７２℃で１分間の反応を２
５回繰り返し、その後４℃に冷却した。得られた各ＯＲＦ断片をＸｂａＩで消化した後、
実施例１に記載の方法でゲル精製を行いクローニングに用いた。
【０１７３】
（ｉｉｉ）得られた各遺伝子の発現コンストラクト（それぞれをｐ３５Ｓ−ＭｐＤＥＳ
６、ｐ３５Ｓ−ＭｐＥＬＯ１、ｐ３５Ｓ−ＭｐＤＥＳ５と表記する）がいずれもＣａＭＶ
３５Ｓプロモーター５’末端にＰｓｔＩサイトを、ＮＯＳターミネーター３’末端にＥｃ
ｏＲＩサイトを持つことを利用して、上記３遺伝子の発現カセットを連結した。まず、以
下に示すプライマーを用いてｐ３５Ｓ−ＭｐＤＥＳ５を鋳型としてＰＣＲを行い、ＭｐＤ
ＥＳ５遺伝子の発現カセット部分を増幅し、ｐ３５Ｓ−ＭｐＤＥＳ６のＣａＭＶ３５Ｓプ
ロモーター５’末端にあるＰｓｔＩサイトにクローニングした（図１参照）。
（ＭｐＤＥＳ５ 遺伝子発現カセット増幅用プライマー）
Ｍ１３Ｒ：５’−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣ−３’（配列番号３３）
ＮＯＳ−Ｒ４−ＰＳＴ：５’−ＡＡＡＣＴＧＣＡＧＡＴＴＣＣＣＧＡＴＣＴＡＧＴＡＡＣ
ＡＴＡＧ−３’（配列番号３４）
【０１７４】
なお、Ｍ１３Ｒプライマーは、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター上流のベクター配列にアニ
ールする。また、ＮＯＳ−Ｒ４−ＰＳＴプライマーは、下線で示すＰｓｔＩ認識配列を含
み、ＮＯＳターミネーター３’末端にアニールする。同じくＮＯＳターミネーター３’末
端に存在するＥｃｏＲＩサイトは含まない。
【０１７５】
ＰＣＲにはＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ社製）０
．５Ｕを用い、製造者の推奨する方法に従って、反応液量２０μｌで行った。反応条件は
、９４℃で２分間保持後、９４℃で１分間、５７℃で１分間、７２℃で１分間の反応を２
５回繰り返し、その後４℃に冷却した。得られたＤＮＡ断片をＰｓｔＩで消化した後、実
施例１に記載の方法でゲル精製を行い、ＭｐＤＥＳ６遺伝子の発現カセットを含むプラス
ミド（ｐ３５Ｓ−ＭｐＤＥＳ６）のＰｓｔＩサイトにクローニングした。
【０１７６】
（ｉｖ）上記で得られた、ＭｐＤＥＳ５及びＭｐＤＥＳ６遺伝子の発現カセットを連結
させたコンストラクト（ｐ３５Ｓ−ＭｐＤＥＳ５／３５Ｓ−ＭｐＤＥＳ６と表記する）に
、さらにＭｐＥＬＯ１遺伝子の発現カセットを連結した。以下のプライマーを用いてｐ３
５Ｓ−ＭｐＥＬＯ１を鋳型としてＰＣＲを行い、ＭｐＥＬＯ１遺伝子の発現カセット部分
を増幅し、ＭｐＤＥＳ６遺伝子発現カセット内のＮＯＳターミネーター３’末端にあるＥ
ｃｏＲＩサイトにクローニングした。
（ＭｐＥＬＯ１ 遺伝子発現カセット増幅用プライマー）
３５Ｓ−Ｆ３−ＥＩ：５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＣＣＣ
ＡＧＡ−３’（配列番号３５）
Ｍ１３Ｆ：５’−ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−３’ （配列番号３６）
【０１７７】
なお、３５Ｓ−Ｆ３−ＥＩプライマーは、下線で示すＥｃｏＲＩ認識配列を含み、Ｃａ
ＭＶ３５Ｓプロモーターの５’末端にアニールする。また、Ｍ１３ＦプライマーはＮＯＳ
ターミネーター下流のベクター配列にアニールする。
【０１７８】
ＰＣＲにはＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ社製）０
．５Ｕを用い、製造者の推奨する方法に従って、反応液量２０μｌで行った。反応条件は
、９４℃で２分間保持後、９４℃で１分間、５７℃で１分間、７２℃で１分間の反応を２
５回繰り返し、その後４℃に冷却した。得られたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩで消化した後、
実施例１に記載の方法でゲル精製を行い、ＭｐＤＥＳ５及びＭｐＤＥＳ６遺伝子の発現カ
セットを連結させたコンストラクト（ｐ３５Ｓ−ＭｐＤＥＳ５／３５Ｓ−ＭｐＤＥＳ６）
のＥｃｏＲＩ部位にクローニングした。
【０１７９】
以上の操作により、３遺伝子の発現カセットが、ＭｐＤＥＳ５，ＭｐＤＥＳ６，ＭｐＥ
ＬＯ１の順で連結した発現コンストラクト（ｐ３５Ｓ−ＭｐＤＥＳ５／３５Ｓ−ＭｐＤＥ
Ｓ６／ｐ３５Ｓ−ＭｐＥＬＯ１）を作製した。
【０１８０】
このようにして得られた上記コンストラクトを、公知の方法（Ｇｅｎｅｓ Ｇｅｎｅｔ
．Ｓｙｓｔ．７３，ｐ２１９，１９９８）で、ビアラフォスを選抜マーカーとして持つプ
ラスミドとともに、パーティクルガンでイネに導入し、形質転換イネを取得した。
【０１８１】
〔実施例７：タバコ（Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＳＲ−１）におけるゼニゴケ高度不飽和脂肪
酸合成系の再構成〕
本実施例では、上述のゼニゴケ由来の不飽和脂肪酸合成酵素遺伝子、すなわち、ＭｐＤ
ＥＳ６遺伝子、ＭｐＤＥＳ５遺伝子、およびＭｐＥＬＯ遺伝子が、植物体中で良好に機能
することを確認した。
【０１８２】
具体的には、タバコにＭｐＤＥＳ６遺伝子、ＭｐＤＥＳ５遺伝子、およびＭｐＥＬＯ遺
伝子を導入し、このタバコ中でアラキドン酸等が生産されることを確認した。比較対照と
して、糸状菌（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）由来のΔ６不飽和化酵素遺伝子（ＭａＤＥＳ６）、Δ
５不飽和化酵素遺伝子（ＭａＤＥＳ５）、Δ６脂肪酸鎖長延長酵素（ＭａＥＬＯ）の３遺
伝子を導入したタバコを作製した。
【０１８３】
（ｉ）糸状菌由来遺伝子を含むベクター（ｐＳＰＢ１５１９）の構築
ｐＥ２１１３（Ｍｉｔｓｕｈａｒａ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉ
ｏｌ．３７，４５−５９ １９９６）は、エンハンサー配列の繰り返しを有するカリフラ
ワーモザイクウィルス３５Ｓ（Ｅｌ２３５Ｓ）プロモーター、および、ノパリンシンター
ゼ（ｎｏｓ）ターミネーターを有する。
【０１８４】
ｐＥ２１１３をＳｎａＢＩで消化した後、ＸｈｏＩリンカー（ＴＡＫＡＲＡ社）と連結
することで、プラスミドを作製した。このプラスミドをＳａｃＩで消化後、平滑末端化し
、さらにＢａｍＨＩリンカー（ＴＡＫＡＲＡ社）と連結することによって、ｐＵＥ７を作
製した。ｐＵＥ７をＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化することによって得られるＤＮＡ
断片のうちＥｌ２３５Ｓプロモーターを有する断片と、ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消
化した植物形質転換用バイナリーベクターｐＢＩＮＰＬＵＳ（ｖａｎ Ｅｎｇｅｌｅｎ
ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｒｅｓｅａｒｃｈ ４，ｐ２８８，１９９５）とを
連結することで、ｐＳＰＢ５０５を作製した。
【０１８５】
一方、ＭａＤＥＳ６遺伝子を含むプラスミドであるｐＭＬＤ１０１をＸｈｏＩで消化後
、さらにＢａｍＨＩで部分消化することで、約１．６ｋｂのＤＮＡ断片を得た。この断片
と、ｐＳＰＢ５０５をＸｈｏＩとＢａｍＨＩで消化して得られるバイナリーベクター部分
のＤＮＡ断片とを連結することで、ｐＳＰＢ５５９を作製した。
【０１８６】
ｐＵＣＡＰ（ｖａｎ Ｅｎｇｅｌｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ ４，ｐ２８８，１９９５）をＡｓｃＩで消化した後平滑末端化し、ＰａｃＩリ
ンカーと連結することで、ｐＵＣＡＰＰを作製した。
【０１８７】
ｐＥ２１１３をＳｎａＢＩで消化した後、ＢａｍＨＩリンカー（ＴＡＫＡＲＡ社）と連
結することで、ｐＵＥ６を作製した。ｐＵＥ６をＳａｃＩで消化した後、平滑末端化し、
ＳａｌＩリンカー（ＴＡＫＡＲＡ社）と連結することで、ｐＵＥ８を作製した。ｐＵＥ８
をＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化して得られるＤＮＡ断片のうちＥｌ２３５Ｓプ
ロモーターを有する断片を、ｐＵＣＡＰＰのＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ間に挿入するこ
とで、プラスミドを作製した。このプラスミドをＢａｍＨＩとＳａｌＩで消化して得られ
たＤＮＡ断片と、ＭａＥＬＯ遺伝子のｃＤＮＡをＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで消化して得
られたＤＮＡ断片とを連結し、ｐＳＰＢ１１３０を作製した。ｐＳＰＢ１１３０をＰａｃ
Ｉで消化し、得られる約２．３ｋｂのＤＮＡ断片を、ｐＢＩＮＰＬＵＳのＰａｃＩサイト
に挿入した。ＭａＥＬＯ遺伝子の転写方向と、ｐＢＩＮＰＬＵＳ上のｎｐｔＩＩ遺伝子の
転写方向とが、同じ向きになっているプラスミドを選択し、そのプラスミドをｐＳＰＢ１
１５７Ｐとした。
【０１８８】
また、上述したｐＳＰＢ５５９をＰａｃＩで消化した後、平滑末端化し、ＡｓｃＩリン
カーと連結することで、ｐＳＰＢ５５９Ａを作製した。そして、ｐＳＰＢ５５９ＡをＡｓ
ｃＩで消化して得られるＭａＤＥＳ６遺伝子を含むＤＮＡ断片を、ｐＳＰＢ１１５７Ｐの
ＡｓｃＩサイトに挿入することで、ｐＳＰＢ１１５７を作製した。
【０１８９】
ｐＣＧＰ１３６４（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３６，１０２３，１９９
５）をＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｃＩＩで消化して得られる約１．３ｋｂのＤＮＡ断片と
、ｐＣＧＰ１３６４をＰｓｔＩで消化し、平滑末端化した後さらにＳａｃＩＩで消化して
得られる約２．９ｋｂのＤＮＡ断片と、ｐＵＣＡＰＡをＳａｃＩで消化し、平滑末端化し
た後さらにＨｉｎｄＩＩＩで消化して得られる約２．７ｋｂのＤＮＡ断片とを連結するこ
とにより、ｐＳＰＢ１８４を得た。
【０１９０】
一方、ＭａＤＥＳ５遺伝子がサブクローニングされたｐＣＲＩＩベクターから、Ｘｂａ
ＩとＫｐｎＩによる消化によってＭａＤＥＳ５遺伝子を含むＤＮＡ断片を切り出した。こ
のＤＮＡ断片と、上述のｐＳＰＢ１８４をＸｂａＩとＫｐｎＩで消化して得られたＤＮＡ
断片とを連結することで、ｐＳＰＢ１５１９Ａを作製した。ｐＳＰＢ１５１９ＡをＡｓｃ
Ｉで消化し、得られたＤＮＡ断片をｐＳＰＢ１１５７のＡｓｃＩサイトに挿入し、ｐＳＰ
Ｂ１５１９を作製した。このｐＳＰＢ１５１９上で、ＭａＤＥＳ６遺伝子、ＭａＤＥＳ５
遺伝子、およびＭａＥＬＯ遺伝子は、同じ向きに転写され、同じ構成的プロモーターの制
御下にある。
【０１９１】
（ｉｉ）ゼニゴケ由来遺伝子のベクター（ｐＳＰＢ２３６８）の構築
ｐＵＣＡＰ（ｖａｎ Ｅｎｇｅｌｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ ４，２８８−２９０，１９９５）をＡｓｃＩで消化した後ＳｇｆＩリンカーと
連結し、さらに、ＰａｃＩで消化した後ＦｓｅＩリンカーと連結することで、ｐＵＣＳＡ
ＰＦを作製した。また、ｐＢＩＮＰＬＵＳにも同様の処理を施し、ｐＢＩＮＳＡＰＦを作
製した。
【０１９２】
他にサブクローニング用のベクターとして、ｐＵＣ１９をＨｉｎｄＩＩＩで消化した後
、ＰａｃＩリンカーと連結し、さらにＥｃｏＲＩで消化した後ＦｓｅＩリンカーと連結す
ることで、ｐＵＣＰＦを作製した。また、ｐＵＣ１９をＨｉｎｄＩＩＩで消化した後Ｓｇ
ｆＩリンカーと連結し、さらに、ＥｃｏＲＩで消化した後ＡｓｃＩリンカーと連結するこ
とで、ｐＵＣＳＡを作製した。ｐＵＣＳＡＰＦのＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ間にＥｌ２３
５Ｓを、ＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩ間にマノピン合成酵素（ｍａｓ）遺伝子ターミネーターを
それぞれ挿入したベクターを、ＸｂａＩおよびＳａｃＩで消化した後、末端を平滑化する
ことで、ｐＳＰＢ２３５３Ａを得た。ｐＳＰＢ２３５３Ａの平滑末端に、ｐ３５Ｓ−Ｍｐ
ＤＥＳ６からＸｂａＩで切り出して末端を平滑化したＭａＤＥＳ６遺伝子を含むＤＮＡ断
片を連結し、ｐＳＰＢ２３５３作製した。
【０１９３】
ｐＵＣＳＡのＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ間にＥｌ２３５Ｓを、ＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩ間
にマノピン合成酵素（ｍａｓ）遺伝子ターミネーターをそれぞれ挿入したベクターを、Ｘ
ｂａＩ、ＳａｃＩで消化することで、ｐＳＰＢ２３５５Ａを作製した。
【０１９４】
一方、ｐ３５Ｓ−ＭｐＥＬＯ１を鋳型として、下記のプライマー、ＸｂａＭｐＥＬＯｆ
およびＳａｃＭｐＥＬＯｒを用いてＰＣＲを行った。
ＸｂａＭｐＥＬＯｆ：５‘−ＡＧＴＣＴＣＴＡＧＡＧＣＧＡＴＧＧＡＧＧＣＧＴＡＣＧ−
３’（配列番号４３）
ＳａｃＭｐＥＬＯｒ：５‘−ＣＡＧＴＧＡＧＣＴＣＧＧＴＧＴＣＴＴＡＴＴＣＴＧＣＣ−
３’（配列番号４４）
【０１９５】
ＰＣＲには、酵素として高精度なＫＯＤ＋ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡）を用い、９４
℃で２分間保持した後、９４℃で１５秒、６８℃で１−３分のサイクルを２５回繰り返し
た。このようにして調製されたＭｐＥＬＯＤＮＡ断片をＸｂａＩおよびＳａｃＩで消化し
たものを、上述のｐＳＰＢ２３５５Ａに連結し、ｐＳＰＢ２３５５を作製した。さらに、
ｐＳＰＢ２３５５をＳｇｆＩ、ＡｓｃＩで消化して得られたＤＮＡ断片を、ＳｇｆＩおよ
びＡｓｃＩで消化したｐＳＰＢ２３５３に連結し、ｐＳＰＢ２３６１を作製した。
【０１９６】
ｐＵＣＰＦのＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩサイトにＥｌ２３５Ｓを、ＳａｃＩ−ＥｃｏＲ
Ｉサイトにマノピン合成酵素（ｍａｓ）遺伝子ターミネーターをそれぞれ挿入したベクタ
ーを、ＸｂａＩおよびＳａｃＩで消化することで、ｐＳＰＢ２３５２Ａを作製した。
【０１９７】
一方、ｐ３５Ｓ−ＭｐＤＥＳ５を鋳型に、下記のプライマー、ＸｂａＭｐＤ５ｆおよび
ＳａｃＭｐＤ５ｒを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件は、上記のＰＣＲ条件と同
様である。
ＸｂａＭｐＤ５ｆ：５’−ＡＧＣＴＴＣＴＡＧＡＧＣＣＡＴＧＣＣＧＣＣＡＣＡＣＧＣＣ
Ｃ−３’（配列番号４５）
ＳａｃＭｐＤ５ｒ：５’−ＣＡＧＴＧＡＧＣＴＣＴＣＡＧＣＣＡＴＣＣＡＧＴＣＧＴ−３
’ （配列番号４６）
【０１９８】
ＰＣＲによって調製されたＭｐＤ５ＤＮＡ断片をＸｂａＩ、ＳａｃＩで消化したものを
、ｐＳＰＢ２３５２Ａに連結し、ｐＳＰＢ２３５２を作製した。
【０１９９】
ｐＢＩＮＳＡＰＦをＰａｃＩおよびＦｓｅＩで消化して得られたＤＮＡ断片に、ｐＳＰ
Ｂ２３５２よりＰａｃＩおよびＦｓｅＩで切り出したＭｐＤＥＳ５遺伝子を含むＤＮＡ断
片を連結し、ｐＳＰＢ２３６８Ａを作製した。さらにｐＳＰＢ２３６８ＡをＳｇｆＩおよ
びＰａｃＩで消化したものに、ｐＳＰＢ２３６１よりＳｇｆＩおよびＰａｃＩで切り出さ
れたＭｐＤＥＳ６遺伝子およびＭｐＥＬＯ遺伝子を含むＤＮＡ断片を連結することで、ｐ
ＳＰＢ２３６８を得た。このプラスミド上でＭｐＤＥＳ６遺伝子、ＭｐＤＥＳ５遺伝子、
およびＭｐＥＬＯ遺伝子は、同じ向きに転写され、同じ構成的プロモーターの制御下にあ
る。
【０２００】
（ｉｉｉ）タバコへの遺伝子導入
引き続いて、公知の方法（Ｐｌａｎｔ Ｊ．５，８１，１９９４）に基づいて、ｐＳＰ
Ｂ２３６８またはｐＳＰＢ１５１９を用いてＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａ
ｃｉｅｎｓ（菌株：ＡｇｌＯ（Ｌａｚｏ ｅｔ ａｌ．１９９１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ９：９６３−９６７））を形質転換した。このｐＳＰＢ２３６８またはｐＳＰＢ１
５１９を有する形質転換体アグロバクテリウムを、タバコリーフディスクに感染させた。
このようにして得られた組換えタバコの葉から、ＲＮｅａｓｙＰｌａｎｔｍｉｎｉＫｉｔ
（キアゲン）を用いてＲＮＡを抽出し、定法に従って、ＲＴ−ＰＣＲにより、導入した遺
伝子が発現している系統を選択した。
【０２０１】
このようにして得られた糸状菌由来の酵素遺伝子から成るｐＳＰＢ１５１９を導入した
タバコ（ｐＳＰＢ１５１９形質転換タバコ）、ゼニゴケ由来の酵素遺伝子から成るｐＳＰ
Ｂ２３６８を導入したタバコ（ｐＳＰＢ２３６８形質転換タバコ）の葉から、公知の方法
（藤野安彦編（１９７８）生物化学実験法９ 学会出版センター、山田晃弘編（１９８９
）生物化学実験法２４ 学会出版センター）にしたがって、脂質の抽出を行った。得られ
た脂質をガスクロマトグラフィー（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ社 ＨＰ−６８００
）で分析し、その結果を表１に示す。
【０２０２】
なお、コントロールとして、遺伝子が導入されていないタバコの葉を用いて、同様の分
析を行った。
【０２０３】
【表１】
【０２０４】
本実施例のガスクロマトグラフィーによる分析条件を以下に示す。
（ガスクロマトグラフィー分析条件）
カラム：Ｓｕｐｅｌｃｏ ＳＰ−２３３０、Ｆｕｓｅｄ Ｓｉｌｉｃａ Ｃａｐｉｌ
ｌａｒｙ Ｃｏｌｕｍｎ、３０ｍ ｘ ０．３２ｍｍ ＩＤ、０．２μｍ
温度：Ｉｎｊ：２４０℃、Ｄｅｔ：２５０℃、Ｏｖｅｎ：１８０℃ ３分、１８０℃
→２２０℃（２℃／ｍｉｎ）
カラム流量：３０ｃｍ／ｓｅｃ、圧力２００ｋＰａ、検出器 ＦＩＤ
【０２０５】
クロマトグラム中の各ピークは標準脂肪酸のメチルエステルのリテンションタイムとＧ
Ｃ−ＭＡＳＳ（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ社、ＨＰ−５９７３）分析により決定し
、またピーク面積より各脂肪酸の割合を決定した。
【０２０６】
表１において、Ｃｏｎｔｒｏｌはコントロールを、ｐＳＰＢ２３６８はｐＳＰＢ２３６
８形質転換タバコを、ｐＳＰＢ１５１９はｐＳＰＢ１５１９形質転換タバコを表す。
【０２０７】
表１に示す結果から、糸状菌由来の酵素遺伝子から成るｐＳＰＢ１５１９を導入したタ
バコ（ｐＳＰＢ１５１９形質転換タバコ）では、ジホモγリノレン酸の蓄積は確認できた
が、アラキドン酸の蓄積は認められなかった。一方、ゼニゴケ由来の酵素遺伝子から成る
ｐＳＰＢ２３６８を導入したタバコ（ｐＳＰＢ２３６８形質転換タバコ）ではアラキドン
酸だけでなく、エイコサテトラエン酸およびエイコサペンタエン酸の蓄積も確認できた。
このことから、高等植物においては、糸状菌由来の酵素よりもゼニゴケ由来の酵素の方が
機能的に優れており、リノール酸やαリノレン酸を基質として、アラキドン酸を始めとす
る高度不飽和脂肪酸を合成できると考えられた。
【０２０８】
Ａｂｂａｄｉらは、ケイソウ（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ
）のΔ６不飽和化酵素、Δ５不飽和化酵素、およびヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉ
ｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）の鎖長延長酵素の遺伝子を、タバコおよびアマ（Ｌｉｎｕ
ｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）に導入することで、アラキドン酸を、タバコの種子に
１．５％、アマの種子に１．０％蓄積させたことを報告している（Ａｍｉｎｅ Ａｂｂａ
ｄｉ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １６，２７３４−２７４８，２００４）。
【０２０９】
本実施例においては、ゼニゴケ由来のΔ６不飽和化酵素、Δ５不飽和化酵素および鎖長
延長酵素をタバコに導入したことで、タバコの葉にアラキドン酸を１０％以上蓄積させて
いる。この結果から、本実施例のｐＳＰＢ２３６８形質転換タバコは、上述の報告と比較
しても、より効率的に高度不飽和脂肪酸を合成できる能力があることが示唆された。
【０２１０】
また、ハプト藻（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ）のΔ９鎖長延長酵素、ミド
リムシ（Ｅｎｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）のΔ８不飽和化酵素、糸状菌のΔ５不飽和
化酵素の３種類の遺伝子を用いて、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌ
ｉａｎａ）で脂質の改変を行った報告では、葉中でアラキドン酸が総脂質に対して６．６
ｍｏｌ％、Ｃ２０以上の脂質が２２．５ｍｏｌ％であった（Ｂａｏｘｉｕ Ｑｉ ｅｔ
ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２２，７３９−７４５，２００４）
。この報告では、Δ６不飽和化酵素、Δ５不飽和化酵素、および鎖長延長酵素を用いる経
路とは別の修飾経路で高度不飽和脂肪酸を作っており、単純比較は出来ないが、ゼニゴケ
の酵素を用いたほうがより多くの高度不飽和脂肪酸を蓄積することがわかった。
【０２１１】
総脂質の３０％以上が改変脂肪酸になっているｐＳＰＢ２３６８形質転換タバコでは、
形態的な異常は見られなかった。さらに、稔性にも問題なく、多くの種子をつけたことか
ら、異所的な高度不飽和脂肪酸の増加が植物の生育に及ぼす影響は少ないと考えられた。
【０２１２】
これまでに報告されている遺伝子組換え植物におけるＣ２０以上の高度不飽和脂肪酸の
生産は総脂質の２０％前後、アラキドン酸に限ると６％前後が限界である。しかし、本実
施例のように、ゼニゴケ由来の脂肪酸合成酵素を用いることにより、この限界を打ち破り
、より多くの高度不飽和脂肪酸を植物で生産することが出来ると考えられる。
【０２１３】
尚、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様または実施
例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例に
のみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、本発明の精神と次に記載する特許請求
の範囲内で、いろいろと変更して実施することができるものである。
【産業上の利用可能性】
【０２１４】
本発明に係る遺伝子は、同一種のゼニゴケから単離されたΔ５不飽和化酵素遺伝子、Δ
６不飽和化酵素遺伝子及びΔ６鎖長延長酵素遺伝子である。したがって、これら３種類の
遺伝子を植物内で同時に発現させた場合に、異なる生物種由来の複数の遺伝子を発現させ
るより、植物内で良好に機能するという効果を奏する。さらに、ゼニゴケは、高等植物の
モデル系と考えられるため、これらの遺伝子は、植物以外の生物種由来の遺伝子より植物
内で良好に機能することができるという効果を奏する。
【０２１５】
また、本発明に係る形質転換体は、アラキドン酸やエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）等
の高度不飽和脂肪酸を生産することができるという効果を奏する。特に、本発明に係る形
質転換植物は、低コストかつ環境にやさしい生産プロセスでアラキドン酸やＥＰＡ等の高
度不飽和脂肪酸を生産することができるという効果を奏する。こうして得られたアラキド
ン酸やＥＰＡは、安価な多目的材料として活用できるという効果を奏する。さらに、上記
形質転換植物体を食料として用いた場合、アラキドン酸やＥＰＡの含量が高い食料として
の価値が高まるという効果を奏する。
【０２１６】
以上にように、本発明の遺伝子・たんぱく質は、アラキドン酸やＥＰＡの生産に有用で
ある。また、本発明の遺伝子を発現可能に導入した形質転換体は、製薬産業、食品産業、
各種素材産業等において、アラキドン酸やＥＰＡを生産するうえで、極めて有用である。
また、特に、上記形質転換体が植物体である場合、植物体内のアラキドン酸やＥＰＡの含
量が増加するので、農業分野等において非常に有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ゼニゴケ（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）由来の不飽和脂
肪酸合成系遺伝子、すなわち、Δ５脂肪酸不飽和化酵素、Δ６脂肪酸不飽和化酵素、及び
Δ６脂肪酸鎖長延長酵素の遺伝子とその利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
アラキドン酸、エイコサペンタエン酸（以下、適宜「ＥＰＡ」と略記する）等の高度不
飽和脂肪酸（Ｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ；ＰＵＦＡ）は、
ヒトにおいて神経系を中心とした細胞膜脂質に多く含まれている。これらの高度不飽和脂
肪酸は、プロスタグランジンやロイコトリエンといった、生理活性物質の前駆体として作
用しており、薬理学的に非常に重要である。近年、アラキドン酸やＥＰＡを含む健康食品
も販売されている。また、脂肪酸は、洗剤や生分解性プラスチックの原料にもなるため、
素材としても注目されている。
【０００３】
高度不飽和脂肪酸は、現在、培養微生物又は魚油からの抽出により生産されている。こ
のため、生産コストが高いこと、エネルギー使用量・廃棄物量が多くなること、特に魚油
から調製する方法では、魚資源が限られていることが問題になっている。
【０００４】
アラキドン酸及びＥＰＡは、それぞれリノール酸及びα−リノレン酸を起点として、Δ
６不飽和化、脂肪酸鎖長延長及びΔ５不飽和化という３つの連続した反応により生合成さ
れると考えられている。これらの反応は、それぞれ、Δ６脂肪酸不飽和化酵素（以下、「
Δ６不飽和化酵素」と略記する）、Δ６脂肪酸鎖長延長酵素（以下、「Δ６鎖長延長酵素
」と略記する）及びΔ５脂肪酸不飽和化酵素（以下、「Δ５不飽和化酵素」と略記する）
により触媒される。
【０００５】
Δ６不飽和化酵素の遺伝子は、いくつかの植物種でクローン化されている。例えば、ケ
イ藻、ヒメツリガネゴケ、ヤノウエノアカゴケ、ボリジ、ムラサキ、サクラソウ及びアネ
モネからΔ６不飽和化酵素の遺伝子がクローン化されている。また、植物以外では、糸状
菌、線虫、ラン藻、ラット及びヒトからΔ６不飽和化酵素遺伝子がクローン化されている
（非特許文献１：「Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６９，ｐ４１０５，２００２」、非
特許文献２：「Ｐｌａｎｔ Ｊ．１５，ｐ３９，１９９８」、非特許文献３：「Ｅｕｒ．
Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６７．ｐ３８０１，２０００」、非特許文献４：「Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４，ｐ４２１１，１９９７」、非特許文献５：
「Ｌｉｐｉｄｓ ３７，４１７，２００２」、非特許文献６：「ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５
４２，ｐ１００，２００３」、非特許文献７：「Ｗｈｉｔｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａ
ｎｔａ Ｅｐｕｂ ２００３」、非特許文献８：「Ｌｉｐｉｄｓ ３４，ｐ６４９，１９
９９」、非特許文献９：「Ｇｅｎｅ，２３８，ｐ４４５ １９９９」、非特許文献１０：
「Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．３３０，ｐ６１１ １９９８」、非特許文献１１：「Ｐｌａｎｔ
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２，ｐ２９３ １９９３」、非特許文献１２：「Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２５５，ｐ５７５，１９９９」、非特許文
献１３：「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，ｐ４７１，１９９９」参照）。また、ラン
藻のものを除いて、これらのΔ６不飽和化酵素は、いずれもＮ末端にシトクロムｂ５ドメ
インが存在する。
【０００６】
Δ６鎖長延長酵素の遺伝子は、最初に糸状菌及び線虫からクローン化された（非特許文
献１４：「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７，ｐ８２８４，２００
０」、非特許文献１５：「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７，ｐ６
４２１，２０００」参照）。植物種では、唯一ヒメツリガネからクローン化されている（
非特許文献１６：「Ｐｌａｎｔ Ｊ．３１，ｐ２５５，２００２」参照）。
【０００７】
酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）には、スフィンゴ脂質の
長鎖飽和アシル鎖合成に関与するＥＬＯ２蛋白及びＥＬＯ３蛋白が存在し（非特許文献１
７：「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，ｐ１７３７６，１９９７」参照）、Δ６鎖長
延長酵素のアミノ酸配列は、これらと相同性を示す。一方、植物には、別タイプの脂肪酸
鎖長延長酵素であるβ−ケトアシルＣｏＡ合成酵素（ＫＣＳ）が存在する。この酵素は、
長鎖飽和／一価不飽和脂肪酸の鎖長延長を触媒する（非特許文献１５及び非特許文献１８
：「Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ７，ｐ３０９，１９９５」参照）。しかしながら、Δ６鎖長
延長酵素遺伝子及び酵母ＥＬＯ２／ＥＬＯ３遺伝子は、ＫＣＳ遺伝子との直接的な進化上
の関係は見られない（非特許文献１５及び１６参照）。
【０００８】
Δ５不飽和化酵素の遺伝子は、糸状菌から、初めてクローン化された（非特許文献１９
：「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，ｐ２９３６０，１９９８」、非特許文献２０：「
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，ｐ１９０５５」参照）。Δ５不飽和化酵素の構造はΔ
６不飽和化酵素と共通しており、Ｎ末端にシトクロムｂ５ドメインを有する。Δ５不飽和
化酵素遺伝子は、ケイ藻、線虫、ラット、ヒト、ヒメツリガネゴケなどからクローン化さ
れている（非特許文献１，非特許文献２１：「ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４３９，ｐ２１５，
１９９８」、非特許文献２２：「Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３９１，
ｐ８，２００１」、非特許文献２３：「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，ｐ３７３３５
，１９９９」、非特許文献２４：「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８，３５１１５，２０
０３」参照）。
【０００９】
陸上植物は、コケ植物（コケ植物門（Ｂｒｙｏｐｈｙｔａ））、シダ植物、裸子植物及
び被子植物から構成されている。コケ植物は陸上植物の中で最も古くに分岐した群であり
、セン類（セン類網（Ｂｒｙｏｓｉｄａ））、タイ類（タイ類網（Ｈｅｐａｔｉｃｏｐｓ
ｉｄａ））及びツノゴケ類の３つのグループから構成されている。ゼニゴケは、上記生物
のうちヒメツリガネゴケに分類上最も近いが、ヒメツリゴケはセン類に属しており、ゼニ
ゴケはタイ類網の中のゼニゴケ亞網（Ｍａｒｃｈａｎｔｉｉｄａｅ）に属している。上記
３つのグループは、約４億３千年前には、すでに分岐していたことは確かである。したが
って、同じコケといっても、ヒメツリガネゴケとゼニゴケとは、例えば２億年前に分化し
たシロイナズナとイネとの違いどころでなく、進化上大きく異なる（非特許文献２５：「
１１０３６１５１４３９６８＿０．ｈｔｍｌ」参照）。
【００１０】
ゼニゴケ由来の高度不飽和脂肪酸合成系酵素遺伝子としては、上記のＫＣＳ様の鎖長延
長酵素遺伝子のＭｐＦＡＥ２及びＭｐＦＡＥ３が取得されている（非特許文献２６：「Ｂ
ｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７，ｐ６０５，２００３」、非
特許文献２７：「Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７，ｐ１６
６７，２００３」参照）。しかしながら、ＭｐＦＡＥ２及びＭｐＦＡＥ３はΔ６鎖長延長
酵素遺伝子ではない。
【００１１】
上述のように、多くの高度脂肪酸合成系酵素遺伝子が様々な生物種からクローン化され
ているが、アラキドン酸、ＥＰＡ等の、Ｃ２０以上で不飽和度４以上の高度不飽和脂肪酸
を植物中で生産させた例は少ない。このような例として、ケイ藻由来のΔ６不飽和化酵素
及びΔ５不飽和化酵素と、ヒメツリガネゴケ由来のΔ６鎖長延長酵素とをアマで発現させ
、アラキドン酸及びＥＰＡを生産させた報告があるが、その詳細は不明である（非特許文
献２４参照）。
【００１２】
上述のように、アラキドン酸やＥＰＡ等の高度不飽和脂肪酸の生産は、培養微生物又は
魚油からの抽出により生産されているため、生産コストが高いこと、エネルギー使用量・
廃棄物量が多くなること、魚資源が限られていること等の問題点を有している。アラキド
ン酸やＥＰＡ等の高度不飽和脂肪酸は、分子内に二重結合を複数有するというユニークな
物性を持っているため、様々な工業用途（例えばフィルム、生分解性プラスチック、機能
性繊維、潤滑油、洗剤の素材等）にも利用可能となる。このような高度不飽和脂肪酸を遺
伝子組み換え植物により生産することにより、生産コストを低減でき、同時に、より環境
にやさしい生産プロセスを実現することができると期待される。遺伝子組み換え技術を用
いて、これらの高度不飽和脂肪酸を、油糧植物で大量生産できるようになれば、安価な多
目的原料として非常に有用である。
【００１３】
一方、植物に異種生物の遺伝子を発現させる場合、その遺伝子が植物内でどの程度良好
に機能するかは、転写、翻訳、その後の修飾などの過程があるため、予想することは困難
である。特に、複数の異種生物の遺伝子を発現させる場合、上記非特許文献２４のように
異なる生物種由来の複数の遺伝子を発現させるより、同一の種に由来する複数の遺伝子を
発現させるほうが植物内で良好に機能することが予想される。また、最初の陸上植物であ
るコケ類のゼニゴケは、高等植物のモデル系として注目されており、その遺伝子は植物内
で良好に機能することが期待できる。したがって、ゼニゴケ由来の高度不飽和脂肪酸合成
酵素遺伝子、すなわちΔ５不飽和化酵素遺伝子、Δ６不飽和化酵素遺伝子及びΔ６鎖長延
長酵素遺伝子を取得することができれば、これらの遺伝子を植物に導入することにより、
アラキドン酸やＥＰＡが植物内で効率よく蓄積されることが期待できる。
【００１４】
また、ゼニゴケと同じコケ植物のヒメツリガネゴケからはΔ５不飽和化酵素遺伝子、Δ
６不飽和化酵素遺伝子及びΔ６鎖長延長酵素遺伝子がクローン化されているが、ゼニゴケ
とヒメツリガネゴケは進化上大きく異なっており、ヒメツリガネゴケの遺伝子に基づいて
ゼニゴケの遺伝子を取得することは、現在の技術水準をもってしても容易にできることで
はない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、上記従来の問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、高等植物中で
アラキドン酸やＥＰＡを生産し得る、ゼニゴケ（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ ｐｏｌｙｍｏｒ
ｐｈａ）由来の不飽和脂肪酸合成酵素遺伝子、すなわちΔ５不飽和化酵素遺伝子、Δ６不
飽和化酵素遺伝子及びΔ６鎖長延長酵素遺伝子、及びその利用法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意検討した結果、ゼニゴケ（Ｍａｒｃｈ
ａｎｔｉａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）由来のｃＤＮＡクローンから、上記Δ６不飽和化酵
素、Δ５不飽和化酵素及びΔ６鎖長延長酵素をコードする遺伝子を同定し、更にこれらの
遺伝子をメタノール資化性酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）に導入して発現させ
ることに成功し、これらの遺伝子を発現させたたんぱく質が、それぞれΔ６不飽和化、Δ
５不飽和化及びΔ６鎖長延長の酵素活性を有することを見出し、本発明を完成するに至っ
た。すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
【００１７】
（１）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡの全部又は一部、あるいは当該Ｄ
ＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡの全部又は一部とストリンジェントな条件でハイ
ブリダイズし、かつΔ６脂肪酸不飽和化活性を有するたんぱく質をコードするゼニゴケ目
生物由来の遺伝子。
【００１８】
（２）Δ６脂肪酸不飽和化活性を有するゼニゴケ目生物由来のたんぱく質をコードする
、下記（ａ）又は（ｂ）に記載の遺伝子。（ａ）配列番号１に示される塩基配列を有する
遺伝子。（ｂ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡ、又は当該ＤＮＡと相補的
な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子。
【００１９】
（３）Δ６脂肪酸不飽和化活性を有するゼニゴケ目生物由来のたんぱく質をコードする
、下記（ａ）又は（ｂ）に記載の遺伝子。（ａ）配列番号１に示される塩基配列のうち、
２５３ないし１６９８番目の塩基配列を有する遺伝子。（ｂ）配列番号１に示される塩基
配列のうち、２５３ないし１６９８番目の塩基配列からなるＤＮＡ、又は当該ＤＮＡと相
補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子。
【００２０】
（４）Δ６脂肪酸不飽和化活性を有するゼニゴケ目生物由来のたんぱく質をコードする
、下記（ａ）又は（ｂ）に記載の遺伝子。（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列から
なるたんぱく質をコードする遺伝子。（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の１個又
はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる
たんぱく質をコードする遺伝子。
【００２１】
（５）配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡの全部又は一部、あるいは当該Ｄ
ＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡの全部又は一部とストリンジェントな条件でハイ
ブリダイズし、かつΔ６脂肪酸鎖長延長活性を有するたんぱく質をコードするゼニゴケ目
生物由来の遺伝子。
【００２２】
（６）Δ６脂肪酸鎖長延長活性を有するゼニゴケ目生物由来のたんぱく質をコードする
、下記（ａ）又は（ｂ）に記載の遺伝子。（ａ）配列番号３に示される塩基配列を有する
遺伝子。（ｂ）配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡ、又は当該ＤＮＡと相補的
な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子。
【００２３】
（７）Δ６脂肪酸鎖長延長活性を有するゼニゴケ目生物由来のたんぱく質をコードする
、下記（ａ）又は（ｂ）に記載の遺伝子。（ａ）配列番号１に示される塩基配列のうち、
１９４ないし１０６６番目の塩基配列を有する遺伝子。（ｂ）配列番号１に示される塩基
配列のうち、１９４ないし１０６６番目の塩基配列からなるＤＮＡ、又は当該ＤＮＡと相
補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子。
【００２４】
（８）Δ６脂肪酸鎖長延長活性を有するゼニゴケ目由来のたんぱく質をコードする、下
記（ａ）又は（ｂ）に記載の遺伝子。（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる
たんぱく質、（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列の１個又はそれ以上のアミノ酸が
置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるたんぱく質をコードする
遺伝子。
【００２５】
（９）配列番号５に示される塩基配列からなるＤＮＡの全部又は一部、あるいは当該Ｄ
ＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡの全部又は一部とストリンジェントな条件でハイ
ブリダイズし、かつΔ５脂肪酸不飽和化活性を有するたんぱく質をコードするゼニゴケ目
生物由来の遺伝子。
【００２６】
（１０）Δ５脂肪酸不飽和化活性を有するゼニゴケ目生物由来のたんぱく質をコードす
る、下記（ａ）又は（ｂ）に記載の遺伝子。（ａ）配列番号５に示される塩基配列を有す
る遺伝子。（ｂ）配列番号５に示す塩基配列からなるＤＮＡ、又は当該ＤＮＡと相補的な
塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子。
【００２７】
（１１）Δ５脂肪酸不飽和化活性を有するゼニゴケ目生物由来のたんぱく質をコードす
る、下記（ａ）又は（ｂ）に記載の遺伝子。（ａ）配列番号５に示される塩基配列のうち
、３７５ないし１８２９番目の塩基配列を有する遺伝子。（ｂ）配列番号５に示される塩
基配列のうち、３７５ないし１８２９番目の塩基配列からなるＤＮＡ、又は当該ＤＮＡと
相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子
。
【００２８】
（１２）Δ５脂肪酸不飽和化活性を有するゼニゴケ目生物由来のたんぱく質をコードす
る、下記（ａ）又は（ｂ）に記載の遺伝子。（ａ）配列番号６に示されるアミノ酸配列か
らなるたんぱく質、（ｂ）配列番号６に示されるアミノ酸配列の１個又はそれ以上のアミ
ノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるたんぱく質をコー
ドする遺伝子。
【００２９】
（１３）上記（１）〜（１２）の何れかに記載の遺伝子によってコードされるたんぱく
質。
【００３０】
（１４）以下の（ａ）又は（ｂ）記載のたんぱく質。（ａ）配列番号２に示されるアミ
ノ酸配列からなるたんぱく質。（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個
又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からな
り、かつ、Δ６脂肪酸不飽和化活性を有するたんぱく質。
【００３１】
（１５）以下の（ａ）又は（ｂ）記載のたんぱく質。（ａ）配列番号４に示されるアミ
ノ酸配列からなるたんぱく質。（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１個
又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からな
り、かつ、Δ６脂肪酸鎖長延長活性を有するたんぱく質。
【００３２】
（１６）以下の（ａ）又は（ｂ）記載のたんぱく質。（ａ）配列番号６に示されるアミ
ノ酸配列からなるたんぱく質。（ｂ）配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１個
又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からな
り、かつ、Δ５脂肪酸不飽和化活性を有するたんぱく質。
【００３３】
（１７）上記（１３）〜（１６）の何れかに記載のたんぱく質を認識する抗体。
【００３４】
（１８）少なくとも上記（１）〜（１２）の何れかに記載の遺伝子を含む組換え発現ベ
クター。
【００３５】
（１９）少なくとも上記（１）〜（１２）の何れかに記載の遺伝子を導入してなる形質
転換体。
【００３６】
（２０）少なくとも上記（１）〜（１２）の何れかに記載の遺伝子が発現可能に導入さ
れた植物体、もしくは当該植物体と同一の性質を有する当該植物体の子孫となる植物体、
又は当該植物体の組織。
【００３７】
（２１）少なくとも上記（１）〜（１２）の何れかに記載の遺伝子が発現可能に導入さ
れ、脂肪酸組成が改変された植物体、もしくは当該植物体と同一の性質を有する当該植物
体の子孫となる植物体、又は当該植物体の組織。
【００３８】
（２２）上記（２０）又は（２１）に記載の植物体の繁殖材料。
【００３９】
（２３）上記（２１）に記載の植物体又は植物体の組織を用いる脂肪酸生産方法。
【００４０】
（２４）上記（２３）に記載の脂肪酸生産方法により得られた、γ−リノレン酸、ジホ
モ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、ステアリドン酸、エイコサテトラエン酸、およびエ
イコサペンタエン酸から選択される少なくとも１つ含む素材。
【００４１】
（２５）少なくとも（１）〜（１２）の何れかに記載の遺伝子を用いて脂肪酸組成を改
変する方法。
【００４２】
（２６）上記（１）〜（１２）の何れかに記載の遺伝子における少なくとも一部の塩基
配列又はその相補配列をプローブとして用いた遺伝子検出器具。
【００４３】
（２７）上記（１３）〜（１６）の何れかに記載のたんぱく質を用いて、当該たんぱく
質を調節する遺伝子、又は当該たんぱく質を調節する物質をスクリーニングする方法。
【００４４】
（２８）上記（２７）に記載のスクリーニング方法により得られた遺伝子又は物質。
【００４５】
なお、本明細書において、特に断らない限り、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴは、アデニン、シト
シン、グアニンおよびチミンの各塩基を示す。
【００４６】
本発明のさらに他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分わか
るであろう。また、本発明の利益は、添付図面を参照した次の説明で明白になるであろう
。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】実施例６で用いたＭｐＤＥＳ６遺伝子、ＭｐＥＬＯ１遺伝子及びＭｐＤＥＳ５遺伝子の各遺伝子の発現カセットが連結されたコンストラクトの構築手順を示す説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
本発明の実施の一形態について説明すれば、以下の通りである。なお、本発明は、これ
に限定されるものではない。
【００４９】
以下、アラキドン酸及びエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）の合成経路、本発明に係る遺
伝子、本発明に係るたんぱく質、本発明に係るたんぱく質及び遺伝子の取得方法、並びに
本発明に係る遺伝子及びたんぱく質の利用方法（有用性）の順で、本発明を詳細に説明す
る。
【００５０】
（１）アラキドン酸及びエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）の合成経路
アラキドン酸及びエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）は、それぞれリノール酸及びα−リ
ノレン酸を起点として、Δ６不飽和化、Δ６鎖長延長及びΔ５不飽和化という３つの連続
した反応により、生合成されると考えられる。これらの反応は、それぞれΔ６不飽和化酵
素、Δ６鎖長延長酵素及びΔ５不飽和化酵素により触媒され、それぞれ、ｎ−６経路（ア
ラキドン酸合成経路）及びｎ−３経路（ＥＰＡ合成経路）と呼ばれている。
【００５１】
これまでに報告されているΔ６不飽和化酵素、Δ６鎖長延長酵素及び、Δ５不飽和化酵
素は、いずれもｎ−６及びｎ−３経路の両方に関与していることが示されている。すなわ
ち、Δ６不飽和化酵素は、ｎ−６経路ではリノール酸（１８：２Ｄ９，１２、１８は炭素
数を表し、２は二重結合の数を表し、９、１２は二重結合の位置を表す。以下同様である
。）をｇ−リノレン酸（ＧＬＡ；１８：３Ｄ６，９，１２）に変換し、ｎ−３経路ではａ
−リノレン酸（ＡＬＡ；１８：３Ｄ９，１２，１５）をステアリドン酸（ＳＴＡ；１８：
４Ｄ６，９，１２，１５）に変換する。Δ６鎖長延長酵素は、ｎ−６経路ではＧＬＡをジ
ホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ；２０：３Δ８，１１，１４）に変換し、ｎ−３経路で
はＳＴＡをエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ；２０：４Δ８，１１，１４，１７）に変換す
る。Δ５不飽和化酵素は、ｎ−６経路ではＤＧＬＡをアラキドン酸（２０：４Δ５，８，
１１，１４）に、ｎ−３経路ではＥＴＡをエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ；２０：５Δ５
，８，１１，１４，１７）に変換する。
【００５２】
（２）本発明に係る遺伝子
〔本発明に係るΔ６不飽和化酵素遺伝子〕
本発明に係るΔ６不飽和化酵素遺伝子は、Δ６脂肪酸不飽和化活性を有するたんぱく質
をコードするゼニゴケ目生物由来の遺伝子であり、以下の条件に適合する遺伝子であれば
よい。
【００５３】
１．配列番号１に示される塩基配列を有する遺伝子。
【００５４】
２．配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡ、又は当該ＤＮＡと相補的な塩基配
列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子。
【００５５】
３．配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡの一部、又は当該ＤＮＡと相補的な
塩基配列からなるＤＮＡの一部とストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子。
【００５６】
４．配列番号１に示される塩基配列のうち、２５３ないし１６９８番目の塩基配列を有
する遺伝子。なお、配列番号１に示される塩基配列の２５３ないし１６９８番目の塩基配
列は配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるたんぱく質に翻訳される領域である。
【００５７】
５．配列番号１に示される塩基配列のうち、２５３ないし１６９８番目の塩基配列から
なるＤＮＡ、又は当該ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条
件でハイブリダイズする遺伝子。
【００５８】
６．配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるたんぱく質をコードする遺伝子。
【００５９】
７．配列番号２に示されるアミノ酸配列の１個又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、
挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるたんぱく質をコードする遺伝子。
【００６０】
〔本発明に係るΔ６鎖長延長酵素遺伝子〕
本発明に係るΔ６鎖長延長酵素遺伝子は、Δ６脂肪酸鎖長延長酵素活性を有するたんぱ
く質をコードするゼニゴケ目生物由来の遺伝子であり、以下の条件に適合する遺伝子であ
ればよい。
【００６１】
１．配列番号３に示される塩基配列を有する遺伝子。
【００６２】
２．配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡ、又は当該ＤＮＡと相補的な塩基配
列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子。
【００６３】
３．配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡの一部、又は当該ＤＮＡと相補的な
塩基配列からなるＤＮＡの一部とストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子。
【００６４】
４．配列番号３に示される塩基配列のうち、１９４ないし１０６６番目の塩基配列を有
する遺伝子。なお、配列番号３に示される塩基配列の１９４ないし１０６６番目の塩基配
列は配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるたんぱく質に翻訳される領域である。
【００６５】
５．配列番号３に示される塩基配列のうち、１９４ないし１０６６番目の塩基配列から
なるＤＮＡ、又は当該ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条
件でハイブリダイズする遺伝子。
【００６６】
６．配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるたんぱく質をコードする遺伝子。
【００６７】
７．配列番号４に示されるアミノ酸配列の１個又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、
挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるたんぱく質をコードする遺伝子。
【００６８】
〔本発明に係るΔ５不飽和化酵素遺伝子〕
本発明に係るΔ５不飽和化酵素遺伝子は、Δ５脂肪酸不飽和化活性を有するたんぱく質
をコードするゼニゴケ目生物由来の遺伝子であり、以下の条件に適合する遺伝子であれば
よい。
【００６９】
１．配列番号５に示される塩基配列を有する遺伝子。
【００７０】
２．配列番号５に示される塩基配列からなるＤＮＡ、又は当該ＤＮＡと相補的な塩基配
列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子。
【００７１】
３．配列番号５に示される塩基配列からなるＤＮＡの一部、又は当該ＤＮＡと相補的な
塩基配列からなるＤＮＡの一部とストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子。
【００７２】
４．配列番号５に示される塩基配列のうち、３７５ないし１８２９番目の塩基配列を有
する遺伝子。なお、配列番号５に示される塩基配列の３７５ないし１８２９番目の塩基配
列は配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるたんぱく質に翻訳される領域である。
【００７３】
５．配列番号５に示される塩基配列のうち、３７５ないし１８２９番目の塩基配列から
なるＤＮＡ、又は当該ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条
件でハイブリダイズする遺伝子。
【００７４】
６．配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるたんぱく質をコードする遺伝子。
【００７５】
７．配列番号６に示されるアミノ酸配列の１個又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、
挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるたんぱく質をコードする遺伝子。
【００７６】
なお、上記「ストリンジェントな条件」とは、少なくとも９０％の同一性、好ましくは
少なくとも９５％の同一性、最も好ましくは少なくとも９７％の同一性が配列間に存在す
るときにのみハイブリダイゼーションが起こることを意味する。
【００７７】
上記ハイブリダイゼーションは、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ Ｅｄ．，Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）に記載されてい
る方法等、従来公知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほ
どストリンジェンシーは高くなり（ハイブリダイズし難くなる）、より相同な遺伝子を取
得することができる。ハイブリダイゼーションの条件としては、従来公知の条件を好適に
用いることができ、特に限定しないが、例えば、４２℃、６×ＳＳＰＣ、５０％ホルムア
ミド、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ ｓａｌｍｏｎ ｓｐｅｒｍ ＤＮＡ、５×デンハ
ルト液（ただし、１×ＳＳＰＥ；０．１８Ｍ 塩化ナトリウム、１０ｍＭ リン酸ナトリ
ウム、ｐＨ７．７、１ｍＭ ＥＤＴＡ）が挙げられる。
【００７８】
上記「ゼニゴケ目生物」とは、ゼニゴケ（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈ
ａ）に限定されるものではなく、ゼニゴケ亞網ゼニゴケ目（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａｌｅｓ
）に属する生物が含まれる。これらのうち、Ｍｏｎｏｃｌｅａ ｆｏｒｓｔｅｒｉ（Ｍｏ
ｎｏｃｌｅａｌｅｓ）、Ｃｏｒｓｉｎｉａ ｃｏｒｉａｎｄｒｉｎａ（Ｍａｒｃｈａｎｔ
ｉａｌｅｓ）、Ｏｘｉｍｉｔｒａ ｐａｌｅａｃｅａ（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａｌｅｓ）、
Ｒｉｃｃｉｏｃａｒｐｏｓ ｎａｔａｎｓ（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａｌｅｓ）、Ｒｉｃｃａ
ｈｕｅｂｅｎｅｒｉａｎａ（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａｌｅｓ）、Ｒｉｃｃａ ｆｌｕｉｔ
ａｎｓ（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａｌｅｓ）、Ｒｉｃｃａ ｄｕｐｌｅｘ（Ｍａｒｃｈａｎｔ
ｉａｌｅｓ）、Ｒｉｃｃａ ｃａｎａｌｉｃｕｌａｔａ（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａｌｅｓ）
、Ｒｉｃｃａ ｂｉｆｕｒｃａ（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａｌｅｓ）、Ｒｉｃｃａ ｃｉｌｉ
ｉｆｅｒａ（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａｌｅｓ）、Ｒｉｃｃａ ｇｌａｕｃａ（Ｍａｒｃｈａ
ｎｔｉａｌｅｓ）、Ｒｉｃｃａ ｓｏｒｏｃａｒｐａ（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａｌｅｓ）、
Ｒｉｃｃａ ｗａｒｎｓｔｏｒｆｉｉ（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａｌｅｓ）、Ｒｉｃｃａ ｍ
ｉｃｈｅｌｉｉ（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａｌｅｓ）、Ｒｉｃｃａ ｐａｐｉｌｌｏｓａ（Ｍ
ａｒｃｈａｎｔｉａｌｅｓ）及びＲｉｃｃａ ｚａｃｈａｒｉａｅ（Ｍａｒｃｈａｎｔｉ
ａｌｅｓ）には、超長鎖長高度不飽和脂肪酸が存在することが知られている（Ｐｒｏｇ．
Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３２，ｐ２８１，１９９３参照）。これらの生物からΔ６不飽和化
酵素、Δ６鎖長延長酵素及びΔ５不飽和化酵素の遺伝子を取得することは現在の技術水準
を持ってすれば容易である。例えば、近縁生物の同じ機能を有する酵素をコードする遺伝
子は、クロスハイブリダイゼーションすることが一般に知られている。
【００７９】
本発明の遺伝子は、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖及びアンチセン
ス鎖といった各１本鎖ＤＮＡやＲＮＡを包含する。アンチセンス鎖は、プローブとして又
はアンチセンス化合物として利用できる。ＤＮＡには、例えばクローニングや化学合成技
術又はそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡなどが含まれる。さ
らに、本発明の遺伝子は、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配
列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
【００８０】
（３）本発明に係るたんぱく質
〔本発明に係るΔ６不飽和化酵素たんぱく質〕
本発明に係るΔ６不飽和化酵素たんぱく質は、ゼニゴケ目生物由来のたんぱく質であっ
てΔ６脂肪酸不飽和化活性を有するたんぱく質であればよい。より具体的には、以下に示
すたんぱく質であればよい。
【００８１】
１．上記（２）に記載した本発明に係るΔ６不飽和化酵素遺伝子によってコードされる
たんぱく質。
【００８２】
２．配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるたんぱく質。
【００８３】
３．配列番号２に示されるアミノ酸配列の１個又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、
挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるたんぱく質。
【００８４】
〔本発明に係るΔ６鎖長延長酵素たんぱく質〕
本発明に係るΔ６鎖長延長酵素たんぱく質は、ゼニゴケ目生物由来のたんぱく質であっ
てΔ６脂肪酸鎖長延長活性を有するたんぱく質であればよい。より具体的には、以下に示
すたんぱく質であればよい。
【００８５】
１．上記（２）に記載した本発明に係るΔ６鎖長延長酵素遺伝子によってコードされる
たんぱく質。
【００８６】
２．配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるたんぱく質。
【００８７】
３．配列番号４に示されるアミノ酸配列の１個又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、
挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるたんぱく質。
【００８８】
〔本発明に係るΔ５不飽和化酵素たんぱく質〕
本発明に係るΔ５不飽和化酵素たんぱく質は、ゼニゴケ目生物由来のたんぱく質であっ
てΔ５脂肪酸不飽和化活性を有するたんぱく質であればよい。より具体的には、以下に示
すたんぱく質であればよい。
【００８９】
１．上記（２）に記載した本発明に係るΔ５不飽和化酵素遺伝子によってコードされる
たんぱく質。
【００９０】
２．配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるたんぱく質。
【００９１】
３．配列番号６に示されるアミノ酸配列の１個又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、
挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるたんぱく質。
【００９２】
上記「Δ６脂肪酸不飽和化活性」とは、リノール酸又はα−リノレン酸に対して基質特
異性を有し、それぞれγ−リノレン酸又はステアリドン酸に変換する作用を意味する。ま
た、上記「Δ６脂肪酸鎖長延長活性」とは、γ−リノレン酸又はステアリドン酸に対して
基質特異性を有し、それぞれジホモ−γ−リノレン酸又はエイコサテトラエン酸に変換す
る作用を意味する。また、上記「Δ５脂肪酸不飽和化活性」とは、ジホモ−γ−リノレン
酸又はエイコサテトラエン酸に対して基質特異性を有し、それぞれアラキドン酸又はエイ
コサペンタエン酸（ＥＰＡ）に変換する作用を意味する。
【００９３】
上記「１個又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された」とは
、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異たんぱく質作製法により置換、欠失、挿入、
及び／又は付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さら
に好ましくは５個以下）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されることを意
味する。このような変異たんぱく質は、公知の変異たんぱく質作製法により人為的に導入
された変異を有するたんぱく質に限定されるものではなく、天然に存在する同様の変異た
んぱく質を単離精製したものであってもよい。
【００９４】
なお、本発明のたんぱく質は、アミノ酸がペプチド結合してなるポリペプチドであれば
よいが、これに限定されるものではなく、ポリペプチド以外の構造を含む複合たんぱく質
であってもよい。ここでいうポリペプチド以外の構造としては、糖鎖やイソプレノイド基
等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。
【００９５】
また、本発明のたんぱく質は、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。この
ようなポリペプチドが付加される場合としては、例えば、ＨｉｓやＭｙｃ、Ｆｌａｇ等に
よって本発明のたんぱく質がエピトープ標識されるような場合が挙げられる。
【００９６】
また、本発明のたんぱく質は、前述した本発明の遺伝子（本発明のたんぱく質をコード
する遺伝子）を宿主細胞に導入して、そのたんぱく質を細胞内発現させた状態であっても
よいし、細胞、組織などから単離精製された状態であってもよい。また、上記宿主細胞で
の発現条件によっては、本発明のたんぱく質は、他のたんぱく質とつながった融合たんぱ
く質であってもよい。さらに本発明のたんぱく質は、化学合成されたものであってもよい
。
【００９７】
（４）本発明に係るたんぱく質及び遺伝子の取得方法
本発明に係るたんぱく質及び遺伝子の取得方法（生産方法）は特に限定されるものでは
ないが、代表的な方法として次に示す各方法を挙げることができる。
【００９８】
〔たんぱく質の取得方法〕
本発明のたんぱく質を取得する方法（生産方法）は、上述したように特に限定されるも
のではないが、まず、本発明のたんぱく質を発現する細胞、組織などから単純精製する方
法を挙げることができる。精製方法も特に限定されるものではなく、公知の方法で細胞や
組織から細胞抽出液を調製し、この細胞抽出液を公知の方法、例えばカラム等を用いて精
製すればよい。
【００９９】
また、本発明のたんぱく質を取得する方法として、遺伝子組み換え技術等を用いる方法
も挙げられる。この場合、例えば、本発明の遺伝子をベクターなどに組み込んだ後、公知
の方法により発現可能に宿主細胞に導入し、細胞内で翻訳されて得られる上記たんぱく質
を精製するという方法などを採用することができる。
【０１００】
なお、このように宿主に外来遺伝子を導入する場合、外来遺伝子の発現のため宿主内で
機能するプロモーターを組み入れた発現ベクター及び宿主には様々なものが存在するので
、目的に応じたものを選択すればよい。産生されたたんぱく質を精製する方法は、用いた
宿主、たんぱく質の性質によって異なるが、タグの利用等によって比較的容易に目的のた
んぱく質を精製することが可能である。
【０１０１】
変異たんぱく質を作製する方法についても、特に限定されるものではない。例えば、部
位特異的突然変異誘発法（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，Ｇｅｎｅ １５２，２７１
−２７５（１９９５）他）、ＰＣＲ法を利用して塩基配列に点変異を導入し変異たんぱく
質を作製する方法、あるいはトランスポゾンの挿入による突然変異株作製法などの周知の
変異たんぱく質作製法を用いることができる。変異たんぱく質の作製には市販のキットを
利用してもよい。
【０１０２】
本発明のたんぱく質の取得方法は上述の方法限定されることはなく、例えば、化学合成
されたものであってもよい。例えば、無細胞系のたんぱく質合成液を利用して本発明の遺
伝子から本発明のたんぱく質を合成してもよい。
【０１０３】
〔遺伝子の取得方法〕
本発明の遺伝子を取得する方法（生産方法）も特に限定されるものではないが、例えば
、ディファレンシャルスクリーニング（サブトラクションクローニング）を利用する方法
を挙げることができる。この方法では、公知の技術に従って、試験管内での直接的ハイブ
リダイゼーションを繰り返し、目的のｃＤＮＡ（本発明の遺伝子）を濃縮すればよい。
【０１０４】
上記ディファレンシャルスクリーニングにおける各ステップについては、通常用いられ
る条件の下で行えばよい。これによって得られたクローンは、制限酵素地図の作成及びそ
の塩基配列決定（シークエンシング）によって、さらに詳しく解析することができる。こ
れらの解析によって、本発明の遺伝子配列を含むＤＮＡ断片を取得したか容易に確認する
ことができる。
【０１０５】
また、本発明の遺伝子を取得する方法として、公知の技術により、本発明の遺伝子を含
むＤＮＡ断片を単離し、クローニングする方法が挙げられる。例えば、本発明の遺伝子の
塩基配列の一部と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、ゲノムＤＮＡライブラ
リーやｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすればよい。このようなプローブとしては
、本発明の遺伝子の塩基配列又はその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイ
ズするプローブであれば、いずれの配列・長さのものを用いてもよい。
【０１０６】
また、上記プローブの配列を、上述したゼニゴケ間で良好に保存されている領域の中か
ら選択し、他のゼニゴケのゲノムＤＮＡ（又はｃＤＮＡ）ライブラリーをスクリーニング
すれば、上記たんぱく質と同様の機能を有する相同分子や類縁分子をコードする遺伝子を
単離しクローニングできる。
【０１０７】
あるいは、本発明の遺伝子を取得する方法として、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法を
挙げることができる。例えば、本発明の遺伝子のｃＤＮＡ配列のうち、５’側及び３’側
の配列（又はその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを
用いてゲノムＤＮＡ（又はｃＤＮＡ）等を鋳型にしてＰＣＲ等を行い、両プライマー間に
挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、本発明の遺伝子を含むＤＮＡ断片を大量に取得で
きる。
【０１０８】
（５）本発明に係る遺伝子及びたんぱく質の利用方法（有用性）
（５−１）組換え発現ベクター
本発明に係る組換え発現ベクターは、前記（２）に記載した本発明に係る遺伝子を含む
ものであれば、特に限定されるものではない。例えば、ｃＤＮＡが挿入された組換え発現
ベクターが挙げられる。組換え発現ベクターの作製には、プラスミド、ファージ、又はコ
スミドなどを用いることができるが特に限定されるものではない。また、作製方法も公知
の方法を用いて行えばよい。
【０１０９】
ベクターの具体的な種類は特に限定されるものではなく、ホスト細胞中で発現可能なベ
クターを適宜選択すればよい。すなわち、ホスト細胞の種類に応じて、確実に遺伝子を発
現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明の遺伝子を各種プラスミド
等に組み込んだものを発現ベクターとして用いればよい。
【０１１０】
本発明の遺伝子がホスト細胞に導入されたか否か、さらにはホスト細胞中で確実に発現
しているか否かを確認するために、各種マーカーを用いてもよい。例えば、ホスト細胞中
で欠失している遺伝子をマーカーとして用い、このマーカーと本発明の遺伝子とを含むプ
ラスミド等を発現ベクターとしてホスト細胞に導入する。これによってマーカー遺伝子の
発現から本発明の遺伝子の導入を確認することができる。あるいは、本発明のたんぱく質
を融合たんぱく質として発現させてもよく、例えば、オワンクラゲ由来の緑色蛍光たんぱ
く質ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）をマーカーとして
用い、本発明のたんぱく質をＧＦＰ融合たんぱく質として発現させてもよい。
【０１１１】
上記ホスト細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いる
ことができる。具体的には、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等の
細菌、酵母（出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、分裂酵母Ｓ
ｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉ
ｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）の卵
母細胞等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。
【０１１２】
上記発現ベクターをホスト細胞に導入する方法、すなわち形質転換方法も特に限定され
るものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソ−ム法、ＤＥＡＥデキストラ
ン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。また、例えば、本発明のたんぱく
質を昆虫で転移発現させる場合には、バキュロウイルスを用いた発現系を採用することが
できる。
【０１１３】
（５−２）形質転換体
本発明に係る形質転換体は、前記（２）に記載した本発明に係る遺伝子導入された形質
転換体であれば、特に限定されるものではない。ここで「形質転換体」とは、細胞・組織
・器官のみならず、生物個体を含む意味である。
【０１１４】
形質転換体の作製方法（生産方法）は特に限定されるものではないが、例えば、上述し
た組換え発現ベクターをホスト細胞に導入して形質転換する方法を挙げることができる。
また、形質転換の対象となる生物も特に限定されるものではなく、上記ホスト細胞で例示
した各種微生物や動物を挙げることができる。
【０１１５】
本発明に係る形質転換体は、本発明に係る遺伝子が発現可能に導入された植物体、もし
くは当該植物体と同一の性質を有する当該植物体の子孫となる植物体、又は当該植物体の
組織の組織であることが好ましい。このような形質転換植物により、低コストかつ環境に
やさしい生産プロセスでアラキドン酸やＥＰＡ等の高度不飽和脂肪酸を生産することがで
きる。
【０１１６】
ここで「遺伝子が発現可能に導入された」とは、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作
技術）により、対象細胞（宿主細胞）内に発現可能に導入されることを意味する。
【０１１７】
植物体の形質転換に用いられる組換え発現ベクターは、当該植物細胞内で挿入遺伝子を
発現させることが可能なものであれば特に限定しない。例えば、植物細胞内で恒常的に遺
伝子を発現させるプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモ
ーター）を有するベクターや、外的な刺激により誘導的に活性化されるプロモーターを有
するベクターを用いることができる。なお、この植物細胞には、種々の形態の植物細胞、
例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどが含まれる。
【０１１８】
植物細胞への組み換え発現ベクターの導入には、ポリエチレングリコール法、電気穿孔
法（エレクトロポレーション法）、アグロバクテリウムを介する方法、パーティクルガン
法など、当業者に公知の種々の方法を用いることができる。形質転換細胞から植物体の再
生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である。
【０１１９】
例えば、タバコにおいて形質転換植物体を作出する手法については、形質転換したアグ
ロバクテリウムをタバコリーフディスクに感染させる方法、ポリエチレングリコールを用
いてプロトプラストへ遺伝子を導入し植物体に再生させる方法、電気パルスによりプロト
プラストへ遺伝子導入し植物体を再生させる方法、パーティクルガン法により細胞へ遺伝
子を直接導入し植物体を再生させる方法など、いくつかの技術が既に確立されている。本
発明においては、これらの方法を好適に用いることができる。
【０１２０】
また、タバコは、シロイヌナズナと並んで遺伝子工学的手法を用いる植物育種のモデル
植物である。このタバコにおいて、アラキドン酸やＥＰＡの含量が増加した形質転換体を
取得できるということは、植物全般において形質転換体を取得することができるといって
も過言ではない。なお、本明細書では、後述する実施例に示すように、タバコだけでなく
、イネの形質転換体をも取得しており、本発明によれば、あらゆる種類の形質転換植物体
を取得できることを実証している。
【０１２１】
例えば、イネにおいて形質転換植物体を作出する手法については、ポリエチレングリコ
ールを用いてプロトプラストへ遺伝子を導入し、植物体に再生させる方法、電気パルスに
よりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体を再生させる方法、パーティクルガン法によ
り細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を再生させる方法など、いくつかの技術が既に確立
されている。本発明においては、これらの方法を好適に用いることができる。
【０１２２】
上記形質転換植物体がイネである場合、イネ内のアラキドン酸やＥＰＡの含量が増加す
るので、この形質転換植物体から得られる種子、すなわち、米を食べることで、容易にア
ラキドン酸やＥＰＡ等の高度不飽和脂肪酸を、体内に摂取することが可能になる。したが
って、イネの形質転換植物体は、食糧としての価値が高く、食品産業、農業分野に極めて
有用である。また、現在あまり利用されていない米ぬか、モミガラ、ヒコバエ等でアラキ
ドン酸やＥＰＡを生産すれば、ここからこれら脂肪酸を抽出することにより、健康食品の
原料として有効利用できる。また、家畜の飼料としても利用できる。
【０１２３】
ゲノム内に本発明の遺伝子が導入された形質転換植物体がいったん得られれば、当該植
物体から有性生殖又は無性生殖により子孫を得ることができる。また、当該植物体、又は
、その子孫、あるいは、クローンから、繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊
根、株、カルス、プロトプラストなど）を得て、それらを基に当該植物体を量産すること
も可能である。したがって、本発明には、本発明の遺伝子が発現可能に導入された植物体
、もしくは、当該植物体と同一の性質を有する当該植物体の子孫となる植物体、又は、当
該植物体の組織、あるいは、当該植物体の繁殖材料も含まれる。
【０１２４】
また、当該植物体、当該植物体と同一の性質を有する当該植物体の子孫となる植物体、
及び、当該植物体の組織には、栄養増殖された植物体も含まれる。栄養増殖は、栄養生殖
、クローン成長とも呼ばれ、挿し芽、挿し木などによる増殖が一般的であり、試験管内で
は、葉、茎、根などの器官からの植物体の再分化やカルスによる増殖が可能である。植物
種によっては、枝の先端が特殊な冬芽を作る、腋芽が多肉化する、花がムカゴ化する、芋
を形成するなどの場合がある。
【０１２５】
さらに、本発明に係る遺伝子が発現可能に導入され、脂肪酸組成が改変された植物体、
もしくは当該植物体と同一の性質を有する当該植物体の子孫となる植物体、又は当該植物
体の組織、当該植物体の繁殖材料も本発明に含まれる。「脂肪酸組成が改変された」とは
形質転換前の植物体における脂肪酸組成と形質転換後における植物体の脂肪酸組成が異な
っていることを意味する。例えば、本来脂肪酸組成にアラキドン酸やＥＰＡが含まれてい
なかった植物を本発明に係る遺伝子で形質転換することにより、形質転換植物の脂肪酸組
成にアラキドン酸やＥＰＡが含まれる場合等を挙げることができる。
【０１２６】
（５−３）脂肪酸生産方法
本発明には、本発明に係る遺伝子で形質転換され、脂肪酸組成が改変された植物体又は
植物体の組織を用いて脂肪酸を生産する方法が含まれる。
【０１２７】
例えば、上述のようにアラキドン酸やＥＰＡの含量が増加した本発明に係る形質転換植
物から製造された食用油はアラキドン酸やＥＰＡの含量が高く、価値の高いものになる。
上記形質転換植物体の種子、果実、切穂、塊茎、塊根等も、アラキドン酸やＥＰＡを含む
食料として価値の高いものになる。
【０１２８】
（５−４）素材
本発明には、上述の脂肪酸生産方法により得られた物質、すなわち、γ−リノレン酸、
ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、ステアリドン酸、エイコサテトラエン酸、エイ
コサペンタエン酸を少なくとも１つ含む素材も含まれる。この「素材」とは、上述の食料
としての種子、果実、切穂、塊茎、又は、塊根の他に、工業原料用途に利用できる素材全
般を意味する。
【０１２９】
上記素材としては、例えば、アラキドン酸やＥＰＡを含む健康食品、フィルム、生分解
性プラスチック、機能性繊維、潤滑油、洗剤の素材等が挙げられる。上記の不飽和脂肪酸
は、分子内に二重結合を複数有するという、ユニークな物性を持つ。このため、例えば、
本発明の形質転換植物体により、アラキドン酸やＥＰＡを生産させることにより、生産コ
ストを低減できる。また、本発明により、環境にやさしい生産プロセスを実現できる。
【０１３０】
（５−５）脂肪酸組成改変方法
本発明には、本発明に係る遺伝子を用いて脂肪酸組成を改変する方法が含まれる。例え
ば、上述のように本発明に係る遺伝子を導入した形質転換体を作製することによりホスト
細胞の脂肪酸組成を改変することが可能となる。脂肪酸組成を改変する対象は特に限定さ
れるものではなく、植物以外にも動物、細菌、酵母等、あらゆる生物を対象とすることが
可能である。
【０１３１】
（５−６）遺伝子検出器具
本発明に係る遺伝子検出器具は、本発明に係る遺伝子の少なくとも一部の塩基配列又は
その相補配列をプローブとして用いたものである。遺伝子検出器具は、種々の条件下にお
いて、本発明の遺伝子の発現パタ−ンの検出・測定などに利用することができる。
【０１３２】
本発明の遺伝子検出器具としては、例えば、本発明の遺伝子と特異的にハイブリダイズ
する上記プローブを基盤（担体）上に固定化したＤＮＡチップが挙げられる。ここで「Ｄ
ＮＡチップ」とは、主として、合成したオリゴヌクレオチドをプローブに用いる合成型Ｄ
ＮＡチップを意味するが、ＰＣＲ産物などのｃＤＮＡをプローブに用いる貼り付け型ＤＮ
Ａマイクロアレイをも包含するものとする。
【０１３３】
プローブとして用いる配列は、ｃＤＮＡ配列の中から特徴的な配列を特定する従来公知
の方法によって決定することができる。具体的には、例えば、ＳＡＧＥ：Ｓｅｒｉａｌ
Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６
：１２６８，１９９７；Ｃｅｌｌ ８８：２４３，１９９７；Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：
４８４，１９９５；Ｎａｔｕｒｅ ３８９：３００，１９９７；米国特許第５，６９５，
９３７号）等を挙げることができる。
【０１３４】
なお、ＤＮＡチップの製造には、公知の方法を採用すればよい。例えば、オリゴヌクレ
オチドとして合成オリゴヌクレオチドを使用する場合には、フォトリソグラフィ−技術と
固相法ＤＮＡ合成技術との組み合わせにより、基盤上で該オリゴヌクレオチドを合成すれ
ばよい。一方、オリゴヌクレオチドとしてｃＤＮＡを用いる場合には、アレイ機を用いて
基盤上に貼り付ければよい。
【０１３５】
また、一般的なＤＮＡチップと同様、パーフェクトマッチプローブ（オリゴヌクレオチ
ド）と、該パーフェクトマッチプローブにおいて一塩基置換されたミスマッチプローブと
を配置して遺伝子の検出精度をより向上させてもよい。さらに、異なる遺伝子を並行して
検出するために、複数種のオリゴヌクレオチドを同一の基盤上に固定してＤＮＡチップを
構成してもよい。
【０１３６】
本発明に係る遺伝子検出器具は、上記例示したＤＮＡチップに限定されるものではなく
、本発明に係る遺伝子の少なくとも一部の塩基配列又はその相補配列をプローブとして用
いたものであればよい。
【０１３７】
（５−７）抗体
本発明に係る抗体は、本発明に係るたんぱく質、又はその部分たんぱく質・部分ペプチ
ドを抗原として、公知の方法によりポリクロ−ナル抗体又はモノクロ−ナル抗体として得
られる抗体である。公知の方法としては、例えば、文献（Ｈａｒｌｏｗらの「Ａｎｔｉｂ
ｏｄｉｅｓ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８））、岩崎らの「単クロ
ーン抗体ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ，講談社（１９９１）」）に記載の方法が挙げられ
る。このようにして得られる抗体は、本発明のたんぱく質の検出・測定などに利用できる
。
【０１３８】
（５−８）スクリーニング方法
本発明に係るスクリーニング方法は、本発明に係るたんぱく質を用いて、当該たんぱく
質を調節する遺伝子、又は当該たんぱく質を調節する物質をスクリーニングする方法であ
る。本発明のスクリーニング方法としては、物質間の結合の有無や解離の有無を調べる従
来公知の種々の方法を適用することができ、特に限定されるものではない。例えば、本発
明に係るたんぱく質の活性（Δ６不飽和化活性、Δ６鎖長延長活性及び／又はΔ５不飽和
化活性）を促進するような物質のスクリーニングを挙げることができる。
【０１３９】
また、本発明には、上記スクリーニング方法により得られた遺伝子又は物質も含まれる
。
【０１４０】
以下、実施例を示し、本発明についてさらに詳しく説明するが、もちろん、本発明は以
下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはい
うまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に
示した範囲で種々の変更が可能であり、開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られ
る実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【０１４１】
本実施例において、実験手法は、特に断らない限り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ．ａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載されている方法に従った。
【０１４２】
〔実施例１：ゼニゴケ由来のΔ６不飽和化酵素遺伝子の単離〕
これまでにクローニングされたΔ６不飽和化酵素のアミノ酸配列の比較により、アミノ
酸配列Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−（Ｇｌｕ／Ａｓｐ）−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ（配列番
号３７）及びＴｒｐ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ（配列番号３８
）が保存されていることがわかった。そこで、ゼニゴケ由来のΔ６不飽和化酵素遺伝子を
単離するために、上記のアミノ酸配列をコードする下記の縮退プライマーを用いた。
ｄＤ６ＤＥＳ−Ｆ ５’−ＴＧＧＴＧＧＡＡ（Ａ／Ｇ）ＧＡ（Ａ／Ｇ／Ｔ／Ｃ）ＡＡ（Ａ
／Ｇ）ＣＡ（Ｔ／Ｃ）ＡＡ−３’（配列番号７）
ｄＤ６ＤＥＳ−Ｒ ５’−（Ａ／Ｇ）ＴＴＩＡ（Ａ／Ｇ）ＩＣＣＩＣＣＩＧＴ（Ａ／Ｇ）
ＡＡＣＣＡ−３’ （配列番号８）
（Ｉはイノシン、（）内は複数の塩基）
【０１４３】
試料にはＥ系統ゼニゴケ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．９，ｐ１７９，２０００参
照）の葉状体を用いた。葉状体からのｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡの単離については、文献（
Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７，ｐ６０５，２００３；Ｂ
ｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７，ｐ１６６７，２００３）に
記載の方法に従った。単離したｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ １．５μｌを、Ｒｅａｄｙ−Ｔ
ｏ−Ｇｏ Ｔ−ｐｒｉｍｅｄ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社
製）を用いてｃＤＮＡに逆転写した。ＰＣＲは、上記ｃＤＮＡ約１０ｎｇを鋳型とし、上
記プライマー（ｄＤ６ＤＥＳ−Ｆ及びｄＤ６ＤＥＳ−Ｒ）及び酵素（Ｔａｋａｒａ Ｅｘ
Ｔａｑ、Ｔａｋａｒａ社製）０．５Ｕとを用いて、製造者の推奨する方法で行った。反
応液量は２０μｌとし、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９７００（ＰＥ Ａｐ
ｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、９４℃２分間保持後、９４℃で１分
間、４５℃で１．５分間、７２℃で２分間の反応を３５回繰り返し、その後４℃に冷却し
た。
【０１４４】
得られたＰＣＲ産物を１％（ｗ／ｖ）アガロ−スゲルで電気泳動し、従来のΔ６不飽和
化酵素のアミノ酸配列から予想されるサイズを有する増幅断片を、Ｐｒｅｐ−Ａ Ｇｅｎ
ｅ（Ｂｉｏ−ｒａｄ社製）を用いてゲルより回収した。回収した増幅断片をｐＴ７Ｂｌｕ
ｅ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｔａｋａｒａ社製）に連結し、大腸菌Ｅｌｅｃｔｒｏ−ｍａｘ ＤＨ
１０Ｂ ｃｅｌｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に形質転換
した。
【０１４５】
ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ（
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）及びａｕｔｏｍａｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃ
ｅｒ ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用
いて得られた全クローンの塩基配列を決定し、目的のｃＤＮＡ配列をもつものを探索した
。
【０１４６】
さらに、全長ｃＤＮＡ配列を取得するために、５’−ＲＡＣＥ及び３’−ＲＡＣＥを行
った。これには、５’−ＲＡＣＥ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉ
ｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ社製）、Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ Ｔ−ｐｒｉｍｅｄ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ
ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）及び下記のプライマー（ＭｐＤＥＳ６−０２Ｒ及びＭｐ
ＤＥＳ６−０１Ｆ）を用い、製造者の推奨する方法で行った。
ＭｐＤＥＳ６−０２Ｒ：５’−ＡＡＧＴＴＧＣＣＴＴＣＧＡＴＧＴＴＴＣＴＧＧ−３’（
配列番号９）
ＭｐＤＥＳ６−０１Ｆ：５’−ＧＣＴＣＧＣＣＴＧＧＡＧＣＡＡＧＧＡＡＡＡＴＣ−３’
（配列番号１０）
【０１４７】
その結果、１種類のホモログ遺伝子候補が単離され、この遺伝子をＭｐＤＥＳ６遺伝子
とした。単離されたＭｐＤＥＳ６遺伝子のｃＤＮＡの長さ（ポリＡ部分を除く）は、２，
５２２ｂｐであり、そのコードする推定アミノ酸配列は４８１残基であった。その塩基配
列を配列番号１、アミノ酸配列を配列番号２に示した。
【０１４８】
ＭｐＤＥＳ６ｃＤＮＡの推定アミノ酸配列をヒメツリガネゴケのΔ６不飽和化酵素のア
ミノ酸配列と比較した結果、４７．５％の同一性しか示さなかった。
【０１４９】
〔実施例２：ゼニゴケ由来のΔ６鎖長延長酵素遺伝子の単離〕
これまでにクローニングされたΔ６鎖長延長酵素のアミノ酸配列の比較により、アミノ
酸配列Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ（配列番号３９）及び
Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（配列番号４０）が保存され
ていることがわかった。そこで、ゼニゴケ由来のΔ６鎖長延長酵素遺伝子を単離するため
に、上記のアミノ酸配列をコードする下記の縮退プライマーを用いた。
ｄＤ６ＥＬＯ−Ｆ ５’−ＧＴＩＧＡ（Ａ／Ｇ）ＴＴ（Ｔ／Ｃ）ＡＴＧＧＡ（Ｔ／Ｃ）Ａ
ＣＩＧＴ−３’ （配列番号１１）
ｄＤ６ＥＬＯ−Ｒ ５’−Ｃ（Ｇ／Ｔ）ＩＣＣＣＣＡ（Ａ／Ｇ）ＡＡＩＡ（Ａ／Ｇ）（Ａ
／Ｇ）ＴＡ（Ｔ／Ｃ）ＴＴ−３’（配列番号１２）
【０１５０】
上記のプライマー（ｄＤ６ＥＬＯ−Ｆ及びｄＤ６ＥＬＯ−Ｒ）を用いてＰＣＲをい、得
られたＤＮＡ断片をサブクローニングした。得られたクローンの塩基配列を決定し、目的
のｃＤＮＡ配列をもつクローンについて下記のプライマー（ＭｐＥＬＯ１−０２Ｒ及びＭ
ｐＥＬＯ１−０１Ｆ）を用いて完全長ｃＤＮＡを取得した。なお、実験材料及び方法は、
実施例１と同様である。
ＭｐＥＬＯ１−０２Ｒ：５’−ＧＣＧＡＧＣＴＴＴＣＴＣＧＴＴＣＴＴＴＣＣＣ−３’（
配列番号１３）
ＭｐＥＬＯ１−０１Ｆ：５’−ＴＡＴＧＡＴＴＴＴＧＡＡＧＣＧＣＡＡＣＡＣＧ−３’（
配列番号１４）
【０１５１】
その結果、１種類のホモログ遺伝子候補が単離され、この遺伝子をＭｐＥＬＯ１遺伝子
とした。ＭｐＥＬＯ１遺伝子のｃＤＮＡの長さ（ポリＡ部分を除く）は、１，５５９ｂｐ
で、推定アミノ酸配列は２９０残基であった。その塩基配列を配列番号３、アミノ酸配列
を配列番号４に示した。
【０１５２】
ＭｐＥＬＯ１ｃＤＮＡの推定アミノ酸配列をヒメツリガネゴケのΔ６鎖延長酵素のアミ
ノ酸配列と比較した結果、同一性は６２．７％であった。
【０１５３】
〔実施例３：ゼニゴケ由来のΔ５不飽和化酵素遺伝子の単離〕
他生物種のΔ５不飽和化酵素は、そのＮ末端にシトクロムｂ５ドメインを有する。この
ことから、ゼニゴケ由来のΔ５不飽和化酵素遺伝子は、Δ６不飽和化酵素遺伝子と同じく
、シトクロムｂ５ドメイン融合型不飽和化酵素遺伝子ファミリーに属することが予想され
た。しかしながら、ケイ藻や真菌においては、Δ５不飽和化酵素及びΔ６不飽和化酵素間
のアミノ酸配列レベルでの相同性は非常に低い。そこで、糸状菌（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）の
Δ５不飽和化酵素及びΔ６不飽和化酵素間のアミノ酸配列を比較した結果、縮退プライマ
ー設計に最低限必要な４から５残基程度の連続した保存配列が局所的に存在することを見
出した。驚くべきことに、これらの保存配列は、異種のΔ５不飽和化酵素のアミノ酸配列
間より、同種内のΔ５不飽和化酵素とΔ６不飽和化酵素との間で、より保存されているこ
とを見出した。このことから、シトクロムｂ５ドメイン融合型不飽和化酵素遺伝子には、
種特異的な保存配列が存在する場合があると考えられた。そこで、上述のＭｐＤＥＳ６と
、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５９，ｐ９８１，２００１に記載されている機能未知のＭｐＤＥ
Ｓとで、塩基配列を鋭意比較検討した結果、２箇所のアミノ酸配列（Ｉ（Ｅ／Ｎ）（Ｇ／
Ｄ）ＫＶＹＤＶ（配列番号４１）、及び、ＤＰＤＩ（Ｑ／Ｄ）（Ｙ／Ｔ）（Ｍ／Ｖ）Ｐ（
配列番号４２））のアミノ酸配列が保存されていることを見出した。それぞれのアミノ酸
配列に対応する縮退プライマーの配列を次に示す。
ｄＤ５ＤＥＳ−Ｆ ５’−ＡＴ（Ａ／Ｔ／Ｃ）（Ａ／Ｇ）ＡＩＧ（Ａ／Ｇ）ＩＡＡ（Ａ／
Ｇ）ＴＩＴＡ（Ｔ／Ｃ）ＧＡ（Ｔ／Ｃ）ＧＴ−３’（配列番号１５）
ｄＤ５ＤＥＳ−Ｒ ５’−ＧＧＩＡ（Ｔ／Ｃ）Ｉ（Ｇ／Ｔ）（Ａ／Ｔ）ＩＴ（Ｇ／Ｃ）（
Ａ／Ｇ／Ｔ）ＡＴ（Ａ／Ｇ）ＴＣＩＧＧ（Ａ／Ｇ）ＴＣ−３’（配列番号１６）
【０１５４】
上記プライマー（ｄＤ５ＤＥＳ−Ｆ及びｄＤ５ＤＥＳ−Ｒ）を用いてＰＣＲを行い、得
られたＤＮＡ断片をサブクローニングした。得られたクローンの塩基配列を決定し、目的
のｃＤＮＡ配列をもつクローンについて下記のプライマー（ＭｐＤＥＳ５−０２Ｒ及びＭ
ｐＤＥＳ５−０１Ｆ）を用いて完全長ｃＤＮＡを取得した。なお、実験材料及び方法は、
実施例１と同様である。
ＭｐＤＥＳ５−０２Ｒ：５’−ＧＴＧＴＧＴＡＣＧＡＴＣＣＧＴＧＧＴＴＡＣＣ−３’（
配列番号１７）
ＭｐＤＥＳ５−０１Ｆ：５’−ＡＡＧＧＣＧＧＧＡＣＡＧＧＡＴＴＣＡＡＣＡＣ−３’（
配列番号１８）
【０１５５】
その結果、ゼニゴケ由来のΔ５不飽和化酵素の候補として、２種類の長さの異なるクロ
ーンｃ１及びｃ２を単離した（ｃ１：２，４２７ｂｐ、ｃ２：２，２８５ｂｐ）。ｃ１と
ｃ２との塩基配列を比較したところ、５’非翻訳領域で、オルタナティブ・スプライシン
グ（選択的スプライシング）が起こっていることが明らかとなった。オルタナティブ・ス
プライシングによる読み枠の変化はなく、いずれのクローンも４８４個のアミノ酸をコー
ドしていた（配列番号６）。以下、２，４２７ｂｐの長さのクローンｃ１をＭｐＤＥＳ５
遺伝子（配列番号５）とし、以下の実施例に用いた。
【０１５６】
ＭｐＤＥＳ５ｃＤＮＡの推定アミノ酸配列を糸状菌（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）のΔ５不飽和
化酵素のアミノ酸配列と比較した結果、３１．４％の同一性であった。ゼニゴケと近縁な
ヒメツリガネゴケのΔ５不飽和化酵素に関しては、配列情報が公表されていないため、こ
こでは比較を行わなかった。
【０１５７】
〔実施例４：メタノール資化性酵母（Ｐｉｃｈｉｃａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）を用いた機能
解析〕
ＭｐＤＥＳ６、ＭｐＥＬＯ１及びＭｐＤＥＳ５のｃＤＮＡの機能を調べるために、まず
個々のＯＲＦを、メタノール誘導性プロモーターＡＯＸ１の下流に配置したコンストラク
トを作製した。これらのコンストラクトをメタノール資化性酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓ
ｔｏｒｉｓ）に導入し、その脂肪酸組成を解析した。ＭｐＤＥＳ６、ＭｐＥＬＯ１、及び
、ＭｐＤＥＳ５のｃＤＮＡ塩基配列のＯＲＦ部分を、下記のプライマーを用いて、ＰＣＲ
により増幅した。
（ＭｐＤＥＳ６ＯＲＦ増幅用プライマー）
ＭｐＤ６−１７Ｆ：５’−ＧＧＡＡＴＴＣＧＣＧＡＴＧＧＣＣＴＣＧＴＣＣＡＣＣＡＣＣ
ＡＣ−３’（配列番号１９）
ＭｐＤ６−１８Ｆ：５’−ＧＧＡＡＴＴＣＴＡＣＴＴＴＣＧＣＡＧＣＧＴＡＴＧＣＴＡＣ
Ｃ−３’（配列番号２０）
（ＭｐＥＬＯ１ＯＲＦ増幅用プライマー）
ＭｐＤ６ＥＬＯ１−１５Ｆ：５’−ＧＧＡＡＴＴＣＧＣＧＡＴＧＧＡＧＧＣＧＴＡＣＧＡ
ＧＡＴＧＧ−３’（配列番号２１）
ＭｐＤ６ＥＬＯ１−１６Ｆ：５’−ＧＧＡＡＴＴＣＴＴＣＴＧＣＣＴＴＴＴＴＧＣＴＣＴ
ＴＧＡＴＣ−３’（配列番号２２）
（ＭｐＤＥＳ５ＯＲＦ増幅用プライマー）
ＭｐＤ５−１１Ｆ：５’−ＧＴＴＧＡＡＴＴＣＧＡＣＡＧＴＴＡＴＧＣＣＧＣＣＡＣＡＣ
ＧＣ−３’（配列番号２３）
ＭｐＤ５−１２Ｒ：５’−ＧＴＴＧＡＡＴＴＣＡＧＧＣＣＣＡＡＡＧＣＡＴＧＣＴＧＴＣ
ＡＣ−３’（配列番号２４）
【０１５８】
これらのプライマーは、下線で示したＥｃｏＲＩ認識配列を含んでおり、これを以下の
クローニングに利用した。また、ＰＣＲにはＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒ
ａｓｅ（Ｔａｋａｒａ社製）０．５Ｕを用い、製造者の推奨する方法に従って反応液量２
０μｌで行った。反応条件は、９４℃で２分間保持後、９４℃で１分間、５７℃で１分間
、７２℃で１分間の反応を２５回繰り返し、その後４℃に冷却した。得られた各ＯＲＦ断
片をＥｃｏＲＩで消化した後、実施例１に記載の方法でゲル精製を行った。そして、メタ
ノール資化性酵母の発現ベクターｐＰＩＣＺＡ（マーカー：ゼオシン耐性遺伝子，Ｉｎｖ
ｉｔｒｏｇｅｎ社製）内のメタノール誘導性プロモーター５’ＡＯＸ１下流のＥｃｏＲＩ
部位にセンス方向に連結した。
【０１５９】
各々の発現コンストラクト及び対照としてのｐＰＩＣＺＡベクターを、Ｐｉｃｈｉａ
ＥａｓｙＣｏｍｐ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてメタノール資化性酵母
のＰＰＹ１系統に導入し、ゼオシン耐性をマーカーとして形質転換体を取得した。なお、
メタノール資化性酵母は、Δ６不飽和化酵素の基質であるリノール酸とα−リノレン酸を
合成することができるが、アラキドン酸やＥＰＡのその他の前駆体を合成することはでき
ない。
【０１６０】
導入した遺伝子を発現させるため、ＥａｓｙＳｅｌｅｃｔ Ｐｉｃｈｉａ Ｅｘｐｒｅ
ｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用い、当該キットの推奨する方法に
従いて、各形質転換体を１．０％グリセロールのみを炭素源とする最小培地中でＯＤ（６
００ｎｍ）が０．５になるまで培養した後、０．５％メタノールのみを炭素源とする最小
培地中で３０℃、３日間、飽和状態になるまで培養した。その後、各々の形質転換体の脂
肪酸組成を、ＧＣ−ＭＳを用いて公知の方法（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．６７，ｐ６０５，２００３）により測定した。
【０１６１】
ＭｐＤＥＳ６遺伝子を発現させた形質転換体では、Δ６不飽和化酵素の反応産物である
ｇ−リノレン酸及びステアリドン酸が、全脂肪酸のそれぞれ７．４％及び０．７％新たに
検出された。対照としてｐＰＩＣＺＡベクターを導入した酵母ではこれらは検出されなか
った。以上のことから、ＭｐＤＥＳ６はΔ６不飽和化酵素をコードしていることが示され
た。
【０１６２】
ＭｐＥＬＯ１遺伝子を発現させた形質転換体では、ｇ−リノレン酸を添加した場合にジ
ホモ−ｇ−リノレン酸が全脂肪酸の１４．１％、ステアリドン酸を添加した場合にエイコ
サテトラエン酸が１．５％新たに検出された。対照としてｐＰＩＣＺＡベクターを導入し
た酵母では、これらは検出されなかった。以上のことから、ＭｐＥＬＯ１はΔ６鎖長延長
酵素をコードしていることが示された。
【０１６３】
ＭｐＤＥＳ５遺伝子を発現させた形質転換体では、ジホモ−ｇ−リノレン酸を添加した
場合にアラキドン酸が全脂肪酸の１．１％、ステアリドン酸を添加した場合にエイコサペ
ンタエン酸（ＥＰＡ）が０．１％検出された。対照としてｐＰＩＣＺＡベクターを導入し
た酵母ではこれらは検出されなかった。以上から、ＭｐＤＥＳ５は、Δ５不飽和化酵素を
コードすることが示された。
【０１６４】
以上のようにゼニゴケから、Δ６不飽和化酵素、Δ６鎖長延長酵素及びΔ５不飽和化酵
素をコードする遺伝子として、それぞれＭｐＤＥＳ６、ＭｐＥＬＯ１及びＭｐＤＥＳ５を
取得することができた。
【０１６５】
〔実施例５：メタノール資化性酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）におけるゼニゴケ高度不飽
和脂肪酸生合成系の再構成〕
ＭｐＤＥＳ６、ＭｐＥＬＯ１及びＭｐＤＥＳ５を共発現させるために、上記実施例４で
作製した、ＥｃｏＲＩ消化したＭｐＥＬＯ１及びＭｐＤＥＳ５のＯＲＦ増幅断片を、各々
別のメタノール資化性酵母発現ベクターｐＰＩＣ３Ｋ（マーカー：ＨＩＳ４遺伝子、Ｉｎ
ｖｉｔｒｏｇｅｎ社製社）及びｐＰＩＣ６Ａ（マーカー：ブラスチシジン耐性遺伝子、Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製社）の５’ＡＯＸ１プロモーター下流のＥｃｏＲＩ部位にセンス
方向に連結した。また、ＭｐＤＥＳ６に関しては、実施例４で作製した発現ベクターを用
いた。以下各発現ベクターを、それぞれｐＰＩＣＺＡ−ＭｐＤＥＳ６、ｐＰＩＣ３Ｋ−Ｍ
ｐＥＬＯ１及びｐＰＩＣ６Ａ−ＭｐＤＥＳ５と表記する。
【０１６６】
まず、ｐＰＩＣＺＡ−ＭｐＤＥＳ６、又は、対照としてのｐＰＩＣＺＡベクターのみを
、上記実施例４で用いたメタノール資化性酵母ＰＰＹ１系統と同じ脂肪酸組成を持つメタ
ノール資化性酵母ＰＰＹ１２系統（ｈｉｓ４，ａｒｇ４）に形質転換し、ゼオシン耐性を
マーカーにして形質転換体を取得した。続いて、ｐＰＩＣ３Ｋ−ＭｐＥＬＯ１、又は、対
照としてのｐＰＩＣ３Ｋベクターのみを、それぞれ、ｐＰＩＣＺＡ−ＭｐＤＥＳ６、又は
ｐＰＩＣＺＡのみがゲノム中に組み込まれた形質転換体に導入し、ヒスチジン合成能をマ
ーカーにして形質転換体を取得した。最後に、ｐＰＩＣ６Ａ−ＭｐＤＥＳ５、又は、対照
としてのｐＰＩＣ６Ａベクターのみを、ｐＰＩＣＺＡ−ＭｐＤＥＳ６及びｐＰＩＣ３Ｋ−
ＭｐＥＬＯ１又はｐＰＩＣＺＡ及びｐＰＩＣ３Ｋがゲノム中に組み込まれた上記形質転換
体に導入し、ブラストジン耐性をマーカーとして形質転換体を取得した。
【０１６７】
得られた２種類又は３種類の遺伝子が導入された形質転換体を用いて、ゼニゴケのアラ
キドン酸／ＥＰＡ生合成系の再構成実験を行った。まず、上記２種類の遺伝子（ＭｐＤＥ
Ｓ６及びＭｐＥＬＯ１）を導入した。形質転換体を用いて、ＭｐＤＥＳ６たんぱく質及び
ＭｐＥＬＯ１たんぱく質をメタノール資化性酵母内で共発現させた。その結果、Δ６不飽
和化反応産物であるｇ−リノレン酸（全脂肪酸の２．９％）及びステアリドン酸（全脂肪
酸の０．４％）に加え、それらの鎖長延長反応産物であるジホモ−ｇ−リノレン酸（全脂
肪酸の２．８％）及びエイコサテトラエン酸（全脂肪酸の０．２％）が生じた。対照とし
た形質転換体では、これらの脂肪酸は検出されなかった。上記形質転換体に、さらにＭｐ
ＤＥＳ５を導入した形質転換体では、ｇ−リノレン酸（全脂肪酸の２．８％）、ステアリ
ドン酸（全脂肪酸の０．５％）、ジホモ−ｇ−リノレン酸（全脂肪酸の１．５％）及びエ
イコサテトラエン酸（全脂肪酸の０．１％）の４種の脂肪酸に加えて、アラキドン酸（全
脂肪酸の０．１％）及びエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、全脂肪酸の０．０３％）の生成
が認められた。対照とした形質転換体では、これらの脂肪酸は検出されなかった。この結
果から、ゼニゴケ由来のΔ６不飽和化酵素、Δ６鎖長延長酵素及びΔ５不飽和化酵素の遺
伝子を発現させることで、ゼニゴケ以外の生物種においても、高度不飽和脂肪酸生合成系
の再構築が可能であることが示された。
【０１６８】
〔実施例６：イネに導入するベクターの構築及び当該ベクターのイネへの導入〕
イネにおいて、ＭｐＤＥＳ６、ＭｐＥＬＯ１及びＭｐＤＥＳ５遺伝子を発現させるため
に、以下の（ｉ）〜（ｉｖ）に示す手順で発現コンストラクトを作製した。また、作製手
順を図１に示した。
【０１６９】
（ｉ）ｐＢＩ２２１（ＴＯＹＯＢＯ社製）のカリフラワ−モザイクウイルス（ＣａＭＶ
）３５Ｓプロモーター、及び、ＮＯＳターミネーター間に設計した以下のプライマーを用
いたＰＣＲにより、β−Ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ（ＧＵＳ）遺伝子部分を除いた発現
ベクターｐ３５Ｓ−ＮＯＳを作製した。
ＭＫ００１（Ｆ）：５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＣＣＴＧＧＣＧＣＡＣＣＡＴＣＧＴＣ
−３’（配列番号２５）
ＭＫ００２（Ｒ）：５’−ＧＧＧＧＴＡＣＣＡＡＣＧＣＧＣＴＴＴＣＣＣＡＣＣＡＡＣＧ
−３’（配列番号２６）
【０１７０】
なお、プライマーＭＫ００１（Ｆ）は下線で示すＢａｍＨＩ認識配列を含み、ＧＵＳ遺
伝子の３’末端にアニールし、プライマーＭＫ００２（Ｒ）はＧＵＳ遺伝子の５’末端に
アニールする（ＢａｍＨＩサイトがアニール部位の上流に存在する）。ＰＣＲにはＰｙｒ
ｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ社製）０．５Ｕを用い、製造
者の推奨する方法に従って反応液量５０μｌで行った。反応条件は、９６℃５分間保持後
、９４℃で３０秒間、６８℃で４分間の反応を３０回繰り返し、その後４℃に冷却した。
得られた各ＯＲＦ断片をＢａｍＨＩ消化した後、実施例１に記載の方法でゲル精製を行っ
た後、自己連結させた。
【０１７１】
（ｉｉ）次にｐ３５Ｓ−ＮＯＳのＸｂａＩサイトに、ＭｐＤＥＳ６遺伝子、ＭｐＥＬＯ
１遺伝子及びＭｐＤＥＳ５遺伝子のＯＲＦを各々連結した。ＯＲＦ増幅には、下線で示す
ＸｂａＩ認識配列を含む以下のプライマーを用いた。
（ＭｐＤＥＳ６ ＯＲＦ増幅用プライマー）
ＭｐＤ６−２１Ｆ：５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＧＣＧＡＴＧＧＣＣＴＣＧＴＣＣＡＣＣＡＣ
Ｃ−３’（配列番号２７）
ＭｐＤ６−１１Ｒ：５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＣＴＡＴＡＣＴＴＴＣＧＣＡＧＣＧＴＡＴＧ
Ｃ−３’（配列番号２８）
（ＭｐＥＬＯ１ ＯＲＦ増幅用プライマー）
ＭｐＤ６ＥＬＯ１−１８Ｆ：５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＧＣＧＡＴＧＧＡＧＧＣＧＴＡＣＧ
ＡＧＡＴＧＧ−３’（配列番号２９）
ＭｐＤ６ＥＬＯ１−１３Ｒ：５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＴＴＣＴＧＣＣＴＴＴＴＴＧ
ＣＴＣ−３’ （配列番号３０）
（ＭｐＤＥＳ５ ＯＲＦ増幅用プライマー）
ＭｐＤ５−２２Ｆ：５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＧＡＣＡＧＴＴＡＴＧＣＣＧＣＣＡＣＡＣＧ
Ｃ−３’（配列番号３１）
ＭｐＤ５−２３Ｒ：５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＡＧＧＣＣＣＡＡＡＧＣＡＴＧＣＴＧＴＣＡ
Ｃ−３’（配列番号３２）
【０１７２】
ＰＣＲにはＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ社製）０
．５Ｕを用い、製造者の推奨する方法に従って、反応液量２０μｌで行った。反応条件は
、９４℃で２分間保持後、９４℃で１分間、５７℃で１分間、７２℃で１分間の反応を２
５回繰り返し、その後４℃に冷却した。得られた各ＯＲＦ断片をＸｂａＩで消化した後、
実施例１に記載の方法でゲル精製を行いクローニングに用いた。
【０１７３】
（ｉｉｉ）得られた各遺伝子の発現コンストラクト（それぞれをｐ３５Ｓ−ＭｐＤＥＳ
６、ｐ３５Ｓ−ＭｐＥＬＯ１、ｐ３５Ｓ−ＭｐＤＥＳ５と表記する）がいずれもＣａＭＶ
３５Ｓプロモーター５’末端にＰｓｔＩサイトを、ＮＯＳターミネーター３’末端にＥｃ
ｏＲＩサイトを持つことを利用して、上記３遺伝子の発現カセットを連結した。まず、以
下に示すプライマーを用いてｐ３５Ｓ−ＭｐＤＥＳ５を鋳型としてＰＣＲを行い、ＭｐＤ
ＥＳ５遺伝子の発現カセット部分を増幅し、ｐ３５Ｓ−ＭｐＤＥＳ６のＣａＭＶ３５Ｓプ
ロモーター５’末端にあるＰｓｔＩサイトにクローニングした（図１参照）。
（ＭｐＤＥＳ５ 遺伝子発現カセット増幅用プライマー）
Ｍ１３Ｒ：５’−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣ−３’（配列番号３３）
ＮＯＳ−Ｒ４−ＰＳＴ：５’−ＡＡＡＣＴＧＣＡＧＡＴＴＣＣＣＧＡＴＣＴＡＧＴＡＡＣ
ＡＴＡＧ−３’（配列番号３４）
【０１７４】
なお、Ｍ１３Ｒプライマーは、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター上流のベクター配列にアニ
ールする。また、ＮＯＳ−Ｒ４−ＰＳＴプライマーは、下線で示すＰｓｔＩ認識配列を含
み、ＮＯＳターミネーター３’末端にアニールする。同じくＮＯＳターミネーター３’末
端に存在するＥｃｏＲＩサイトは含まない。
【０１７５】
ＰＣＲにはＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ社製）０
．５Ｕを用い、製造者の推奨する方法に従って、反応液量２０μｌで行った。反応条件は
、９４℃で２分間保持後、９４℃で１分間、５７℃で１分間、７２℃で１分間の反応を２
５回繰り返し、その後４℃に冷却した。得られたＤＮＡ断片をＰｓｔＩで消化した後、実
施例１に記載の方法でゲル精製を行い、ＭｐＤＥＳ６遺伝子の発現カセットを含むプラス
ミド（ｐ３５Ｓ−ＭｐＤＥＳ６）のＰｓｔＩサイトにクローニングした。
【０１７６】
（ｉｖ）上記で得られた、ＭｐＤＥＳ５及びＭｐＤＥＳ６遺伝子の発現カセットを連結
させたコンストラクト（ｐ３５Ｓ−ＭｐＤＥＳ５／３５Ｓ−ＭｐＤＥＳ６と表記する）に
、さらにＭｐＥＬＯ１遺伝子の発現カセットを連結した。以下のプライマーを用いてｐ３
５Ｓ−ＭｐＥＬＯ１を鋳型としてＰＣＲを行い、ＭｐＥＬＯ１遺伝子の発現カセット部分
を増幅し、ＭｐＤＥＳ６遺伝子発現カセット内のＮＯＳターミネーター３’末端にあるＥ
ｃｏＲＩサイトにクローニングした。
（ＭｐＥＬＯ１ 遺伝子発現カセット増幅用プライマー）
３５Ｓ−Ｆ３−ＥＩ：５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＣＣＣ
ＡＧＡ−３’（配列番号３５）
Ｍ１３Ｆ：５’−ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−３’ （配列番号３６）
【０１７７】
なお、３５Ｓ−Ｆ３−ＥＩプライマーは、下線で示すＥｃｏＲＩ認識配列を含み、Ｃａ
ＭＶ３５Ｓプロモーターの５’末端にアニールする。また、Ｍ１３ＦプライマーはＮＯＳ
ターミネーター下流のベクター配列にアニールする。
【０１７８】
ＰＣＲにはＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ社製）０
．５Ｕを用い、製造者の推奨する方法に従って、反応液量２０μｌで行った。反応条件は
、９４℃で２分間保持後、９４℃で１分間、５７℃で１分間、７２℃で１分間の反応を２
５回繰り返し、その後４℃に冷却した。得られたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩで消化した後、
実施例１に記載の方法でゲル精製を行い、ＭｐＤＥＳ５及びＭｐＤＥＳ６遺伝子の発現カ
セットを連結させたコンストラクト（ｐ３５Ｓ−ＭｐＤＥＳ５／３５Ｓ−ＭｐＤＥＳ６）
のＥｃｏＲＩ部位にクローニングした。
【０１７９】
以上の操作により、３遺伝子の発現カセットが、ＭｐＤＥＳ５，ＭｐＤＥＳ６，ＭｐＥ
ＬＯ１の順で連結した発現コンストラクト（ｐ３５Ｓ−ＭｐＤＥＳ５／３５Ｓ−ＭｐＤＥ
Ｓ６／ｐ３５Ｓ−ＭｐＥＬＯ１）を作製した。
【０１８０】
このようにして得られた上記コンストラクトを、公知の方法（Ｇｅｎｅｓ Ｇｅｎｅｔ
．Ｓｙｓｔ．７３，ｐ２１９，１９９８）で、ビアラフォスを選抜マーカーとして持つプ
ラスミドとともに、パーティクルガンでイネに導入し、形質転換イネを取得した。
【０１８１】
〔実施例７：タバコ（Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＳＲ−１）におけるゼニゴケ高度不飽和脂肪
酸合成系の再構成〕
本実施例では、上述のゼニゴケ由来の不飽和脂肪酸合成酵素遺伝子、すなわち、ＭｐＤ
ＥＳ６遺伝子、ＭｐＤＥＳ５遺伝子、およびＭｐＥＬＯ遺伝子が、植物体中で良好に機能
することを確認した。
【０１８２】
具体的には、タバコにＭｐＤＥＳ６遺伝子、ＭｐＤＥＳ５遺伝子、およびＭｐＥＬＯ遺
伝子を導入し、このタバコ中でアラキドン酸等が生産されることを確認した。比較対照と
して、糸状菌（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）由来のΔ６不飽和化酵素遺伝子（ＭａＤＥＳ６）、Δ
５不飽和化酵素遺伝子（ＭａＤＥＳ５）、Δ６脂肪酸鎖長延長酵素（ＭａＥＬＯ）の３遺
伝子を導入したタバコを作製した。
【０１８３】
（ｉ）糸状菌由来遺伝子を含むベクター（ｐＳＰＢ１５１９）の構築
ｐＥ２１１３（Ｍｉｔｓｕｈａｒａ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉ
ｏｌ．３７，４５−５９ １９９６）は、エンハンサー配列の繰り返しを有するカリフラ
ワーモザイクウィルス３５Ｓ（Ｅｌ２３５Ｓ）プロモーター、および、ノパリンシンター
ゼ（ｎｏｓ）ターミネーターを有する。
【０１８４】
ｐＥ２１１３をＳｎａＢＩで消化した後、ＸｈｏＩリンカー（ＴＡＫＡＲＡ社）と連結
することで、プラスミドを作製した。このプラスミドをＳａｃＩで消化後、平滑末端化し
、さらにＢａｍＨＩリンカー（ＴＡＫＡＲＡ社）と連結することによって、ｐＵＥ７を作
製した。ｐＵＥ７をＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化することによって得られるＤＮＡ
断片のうちＥｌ２３５Ｓプロモーターを有する断片と、ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消
化した植物形質転換用バイナリーベクターｐＢＩＮＰＬＵＳ（ｖａｎ Ｅｎｇｅｌｅｎ
ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｒｅｓｅａｒｃｈ ４，ｐ２８８，１９９５）とを
連結することで、ｐＳＰＢ５０５を作製した。
【０１８５】
一方、ＭａＤＥＳ６遺伝子を含むプラスミドであるｐＭＬＤ１０１をＸｈｏＩで消化後
、さらにＢａｍＨＩで部分消化することで、約１．６ｋｂのＤＮＡ断片を得た。この断片
と、ｐＳＰＢ５０５をＸｈｏＩとＢａｍＨＩで消化して得られるバイナリーベクター部分
のＤＮＡ断片とを連結することで、ｐＳＰＢ５５９を作製した。
【０１８６】
ｐＵＣＡＰ（ｖａｎ Ｅｎｇｅｌｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ ４，ｐ２８８，１９９５）をＡｓｃＩで消化した後平滑末端化し、ＰａｃＩリ
ンカーと連結することで、ｐＵＣＡＰＰを作製した。
【０１８７】
ｐＥ２１１３をＳｎａＢＩで消化した後、ＢａｍＨＩリンカー（ＴＡＫＡＲＡ社）と連
結することで、ｐＵＥ６を作製した。ｐＵＥ６をＳａｃＩで消化した後、平滑末端化し、
ＳａｌＩリンカー（ＴＡＫＡＲＡ社）と連結することで、ｐＵＥ８を作製した。ｐＵＥ８
をＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化して得られるＤＮＡ断片のうちＥｌ２３５Ｓプ
ロモーターを有する断片を、ｐＵＣＡＰＰのＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ間に挿入するこ
とで、プラスミドを作製した。このプラスミドをＢａｍＨＩとＳａｌＩで消化して得られ
たＤＮＡ断片と、ＭａＥＬＯ遺伝子のｃＤＮＡをＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで消化して得
られたＤＮＡ断片とを連結し、ｐＳＰＢ１１３０を作製した。ｐＳＰＢ１１３０をＰａｃ
Ｉで消化し、得られる約２．３ｋｂのＤＮＡ断片を、ｐＢＩＮＰＬＵＳのＰａｃＩサイト
に挿入した。ＭａＥＬＯ遺伝子の転写方向と、ｐＢＩＮＰＬＵＳ上のｎｐｔＩＩ遺伝子の
転写方向とが、同じ向きになっているプラスミドを選択し、そのプラスミドをｐＳＰＢ１
１５７Ｐとした。
【０１８８】
また、上述したｐＳＰＢ５５９をＰａｃＩで消化した後、平滑末端化し、ＡｓｃＩリン
カーと連結することで、ｐＳＰＢ５５９Ａを作製した。そして、ｐＳＰＢ５５９ＡをＡｓ
ｃＩで消化して得られるＭａＤＥＳ６遺伝子を含むＤＮＡ断片を、ｐＳＰＢ１１５７Ｐの
ＡｓｃＩサイトに挿入することで、ｐＳＰＢ１１５７を作製した。
【０１８９】
ｐＣＧＰ１３６４（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３６，１０２３，１９９
５）をＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｃＩＩで消化して得られる約１．３ｋｂのＤＮＡ断片と
、ｐＣＧＰ１３６４をＰｓｔＩで消化し、平滑末端化した後さらにＳａｃＩＩで消化して
得られる約２．９ｋｂのＤＮＡ断片と、ｐＵＣＡＰＡをＳａｃＩで消化し、平滑末端化し
た後さらにＨｉｎｄＩＩＩで消化して得られる約２．７ｋｂのＤＮＡ断片とを連結するこ
とにより、ｐＳＰＢ１８４を得た。
【０１９０】
一方、ＭａＤＥＳ５遺伝子がサブクローニングされたｐＣＲＩＩベクターから、Ｘｂａ
ＩとＫｐｎＩによる消化によってＭａＤＥＳ５遺伝子を含むＤＮＡ断片を切り出した。こ
のＤＮＡ断片と、上述のｐＳＰＢ１８４をＸｂａＩとＫｐｎＩで消化して得られたＤＮＡ
断片とを連結することで、ｐＳＰＢ１５１９Ａを作製した。ｐＳＰＢ１５１９ＡをＡｓｃ
Ｉで消化し、得られたＤＮＡ断片をｐＳＰＢ１１５７のＡｓｃＩサイトに挿入し、ｐＳＰ
Ｂ１５１９を作製した。このｐＳＰＢ１５１９上で、ＭａＤＥＳ６遺伝子、ＭａＤＥＳ５
遺伝子、およびＭａＥＬＯ遺伝子は、同じ向きに転写され、同じ構成的プロモーターの制
御下にある。
【０１９１】
（ｉｉ）ゼニゴケ由来遺伝子のベクター（ｐＳＰＢ２３６８）の構築
ｐＵＣＡＰ（ｖａｎ Ｅｎｇｅｌｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ ４，２８８−２９０，１９９５）をＡｓｃＩで消化した後ＳｇｆＩリンカーと
連結し、さらに、ＰａｃＩで消化した後ＦｓｅＩリンカーと連結することで、ｐＵＣＳＡ
ＰＦを作製した。また、ｐＢＩＮＰＬＵＳにも同様の処理を施し、ｐＢＩＮＳＡＰＦを作
製した。
【０１９２】
他にサブクローニング用のベクターとして、ｐＵＣ１９をＨｉｎｄＩＩＩで消化した後
、ＰａｃＩリンカーと連結し、さらにＥｃｏＲＩで消化した後ＦｓｅＩリンカーと連結す
ることで、ｐＵＣＰＦを作製した。また、ｐＵＣ１９をＨｉｎｄＩＩＩで消化した後Ｓｇ
ｆＩリンカーと連結し、さらに、ＥｃｏＲＩで消化した後ＡｓｃＩリンカーと連結するこ
とで、ｐＵＣＳＡを作製した。ｐＵＣＳＡＰＦのＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ間にＥｌ２３
５Ｓを、ＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩ間にマノピン合成酵素（ｍａｓ）遺伝子ターミネーターを
それぞれ挿入したベクターを、ＸｂａＩおよびＳａｃＩで消化した後、末端を平滑化する
ことで、ｐＳＰＢ２３５３Ａを得た。ｐＳＰＢ２３５３Ａの平滑末端に、ｐ３５Ｓ−Ｍｐ
ＤＥＳ６からＸｂａＩで切り出して末端を平滑化したＭａＤＥＳ６遺伝子を含むＤＮＡ断
片を連結し、ｐＳＰＢ２３５３作製した。
【０１９３】
ｐＵＣＳＡのＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ間にＥｌ２３５Ｓを、ＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩ間
にマノピン合成酵素（ｍａｓ）遺伝子ターミネーターをそれぞれ挿入したベクターを、Ｘ
ｂａＩ、ＳａｃＩで消化することで、ｐＳＰＢ２３５５Ａを作製した。
【０１９４】
一方、ｐ３５Ｓ−ＭｐＥＬＯ１を鋳型として、下記のプライマー、ＸｂａＭｐＥＬＯｆ
およびＳａｃＭｐＥＬＯｒを用いてＰＣＲを行った。
ＸｂａＭｐＥＬＯｆ：５‘−ＡＧＴＣＴＣＴＡＧＡＧＣＧＡＴＧＧＡＧＧＣＧＴＡＣＧ−
３’（配列番号４３）
ＳａｃＭｐＥＬＯｒ：５‘−ＣＡＧＴＧＡＧＣＴＣＧＧＴＧＴＣＴＴＡＴＴＣＴＧＣＣ−
３’（配列番号４４）
【０１９５】
ＰＣＲには、酵素として高精度なＫＯＤ＋ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡）を用い、９４
℃で２分間保持した後、９４℃で１５秒、６８℃で１−３分のサイクルを２５回繰り返し
た。このようにして調製されたＭｐＥＬＯＤＮＡ断片をＸｂａＩおよびＳａｃＩで消化し
たものを、上述のｐＳＰＢ２３５５Ａに連結し、ｐＳＰＢ２３５５を作製した。さらに、
ｐＳＰＢ２３５５をＳｇｆＩ、ＡｓｃＩで消化して得られたＤＮＡ断片を、ＳｇｆＩおよ
びＡｓｃＩで消化したｐＳＰＢ２３５３に連結し、ｐＳＰＢ２３６１を作製した。
【０１９６】
ｐＵＣＰＦのＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩサイトにＥｌ２３５Ｓを、ＳａｃＩ−ＥｃｏＲ
Ｉサイトにマノピン合成酵素（ｍａｓ）遺伝子ターミネーターをそれぞれ挿入したベクタ
ーを、ＸｂａＩおよびＳａｃＩで消化することで、ｐＳＰＢ２３５２Ａを作製した。
【０１９７】
一方、ｐ３５Ｓ−ＭｐＤＥＳ５を鋳型に、下記のプライマー、ＸｂａＭｐＤ５ｆおよび
ＳａｃＭｐＤ５ｒを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件は、上記のＰＣＲ条件と同
様である。
ＸｂａＭｐＤ５ｆ：５’−ＡＧＣＴＴＣＴＡＧＡＧＣＣＡＴＧＣＣＧＣＣＡＣＡＣＧＣＣ
Ｃ−３’（配列番号４５）
ＳａｃＭｐＤ５ｒ：５’−ＣＡＧＴＧＡＧＣＴＣＴＣＡＧＣＣＡＴＣＣＡＧＴＣＧＴ−３
’ （配列番号４６）
【０１９８】
ＰＣＲによって調製されたＭｐＤ５ＤＮＡ断片をＸｂａＩ、ＳａｃＩで消化したものを
、ｐＳＰＢ２３５２Ａに連結し、ｐＳＰＢ２３５２を作製した。
【０１９９】
ｐＢＩＮＳＡＰＦをＰａｃＩおよびＦｓｅＩで消化して得られたＤＮＡ断片に、ｐＳＰ
Ｂ２３５２よりＰａｃＩおよびＦｓｅＩで切り出したＭｐＤＥＳ５遺伝子を含むＤＮＡ断
片を連結し、ｐＳＰＢ２３６８Ａを作製した。さらにｐＳＰＢ２３６８ＡをＳｇｆＩおよ
びＰａｃＩで消化したものに、ｐＳＰＢ２３６１よりＳｇｆＩおよびＰａｃＩで切り出さ
れたＭｐＤＥＳ６遺伝子およびＭｐＥＬＯ遺伝子を含むＤＮＡ断片を連結することで、ｐ
ＳＰＢ２３６８を得た。このプラスミド上でＭｐＤＥＳ６遺伝子、ＭｐＤＥＳ５遺伝子、
およびＭｐＥＬＯ遺伝子は、同じ向きに転写され、同じ構成的プロモーターの制御下にあ
る。
【０２００】
（ｉｉｉ）タバコへの遺伝子導入
引き続いて、公知の方法（Ｐｌａｎｔ Ｊ．５，８１，１９９４）に基づいて、ｐＳＰ
Ｂ２３６８またはｐＳＰＢ１５１９を用いてＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａ
ｃｉｅｎｓ（菌株：ＡｇｌＯ（Ｌａｚｏ ｅｔ ａｌ．１９９１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ９：９６３−９６７））を形質転換した。このｐＳＰＢ２３６８またはｐＳＰＢ１
５１９を有する形質転換体アグロバクテリウムを、タバコリーフディスクに感染させた。
このようにして得られた組換えタバコの葉から、ＲＮｅａｓｙＰｌａｎｔｍｉｎｉＫｉｔ
（キアゲン）を用いてＲＮＡを抽出し、定法に従って、ＲＴ−ＰＣＲにより、導入した遺
伝子が発現している系統を選択した。
【０２０１】
このようにして得られた糸状菌由来の酵素遺伝子から成るｐＳＰＢ１５１９を導入した
タバコ（ｐＳＰＢ１５１９形質転換タバコ）、ゼニゴケ由来の酵素遺伝子から成るｐＳＰ
Ｂ２３６８を導入したタバコ（ｐＳＰＢ２３６８形質転換タバコ）の葉から、公知の方法
（藤野安彦編（１９７８）生物化学実験法９ 学会出版センター、山田晃弘編（１９８９
）生物化学実験法２４ 学会出版センター）にしたがって、脂質の抽出を行った。得られ
た脂質をガスクロマトグラフィー（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ社 ＨＰ−６８００
）で分析し、その結果を表１に示す。
【０２０２】
なお、コントロールとして、遺伝子が導入されていないタバコの葉を用いて、同様の分
析を行った。
【０２０３】
【表１】
【０２０４】
本実施例のガスクロマトグラフィーによる分析条件を以下に示す。
（ガスクロマトグラフィー分析条件）
カラム：Ｓｕｐｅｌｃｏ ＳＰ−２３３０、Ｆｕｓｅｄ Ｓｉｌｉｃａ Ｃａｐｉｌ
ｌａｒｙ Ｃｏｌｕｍｎ、３０ｍ ｘ ０．３２ｍｍ ＩＤ、０．２μｍ
温度：Ｉｎｊ：２４０℃、Ｄｅｔ：２５０℃、Ｏｖｅｎ：１８０℃ ３分、１８０℃
→２２０℃（２℃／ｍｉｎ）
カラム流量：３０ｃｍ／ｓｅｃ、圧力２００ｋＰａ、検出器 ＦＩＤ
【０２０５】
クロマトグラム中の各ピークは標準脂肪酸のメチルエステルのリテンションタイムとＧ
Ｃ−ＭＡＳＳ（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ社、ＨＰ−５９７３）分析により決定し
、またピーク面積より各脂肪酸の割合を決定した。
【０２０６】
表１において、Ｃｏｎｔｒｏｌはコントロールを、ｐＳＰＢ２３６８はｐＳＰＢ２３６
８形質転換タバコを、ｐＳＰＢ１５１９はｐＳＰＢ１５１９形質転換タバコを表す。
【０２０７】
表１に示す結果から、糸状菌由来の酵素遺伝子から成るｐＳＰＢ１５１９を導入したタ
バコ（ｐＳＰＢ１５１９形質転換タバコ）では、ジホモγリノレン酸の蓄積は確認できた
が、アラキドン酸の蓄積は認められなかった。一方、ゼニゴケ由来の酵素遺伝子から成る
ｐＳＰＢ２３６８を導入したタバコ（ｐＳＰＢ２３６８形質転換タバコ）ではアラキドン
酸だけでなく、エイコサテトラエン酸およびエイコサペンタエン酸の蓄積も確認できた。
このことから、高等植物においては、糸状菌由来の酵素よりもゼニゴケ由来の酵素の方が
機能的に優れており、リノール酸やαリノレン酸を基質として、アラキドン酸を始めとす
る高度不飽和脂肪酸を合成できると考えられた。
【０２０８】
Ａｂｂａｄｉらは、ケイソウ（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ
）のΔ６不飽和化酵素、Δ５不飽和化酵素、およびヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉ
ｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）の鎖長延長酵素の遺伝子を、タバコおよびアマ（Ｌｉｎｕ
ｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）に導入することで、アラキドン酸を、タバコの種子に
１．５％、アマの種子に１．０％蓄積させたことを報告している（Ａｍｉｎｅ Ａｂｂａ
ｄｉ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １６，２７３４−２７４８，２００４）。
【０２０９】
本実施例においては、ゼニゴケ由来のΔ６不飽和化酵素、Δ５不飽和化酵素および鎖長
延長酵素をタバコに導入したことで、タバコの葉にアラキドン酸を１０％以上蓄積させて
いる。この結果から、本実施例のｐＳＰＢ２３６８形質転換タバコは、上述の報告と比較
しても、より効率的に高度不飽和脂肪酸を合成できる能力があることが示唆された。
【０２１０】
また、ハプト藻（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ）のΔ９鎖長延長酵素、ミド
リムシ（Ｅｎｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）のΔ８不飽和化酵素、糸状菌のΔ５不飽和
化酵素の３種類の遺伝子を用いて、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌ
ｉａｎａ）で脂質の改変を行った報告では、葉中でアラキドン酸が総脂質に対して６．６
ｍｏｌ％、Ｃ２０以上の脂質が２２．５ｍｏｌ％であった（Ｂａｏｘｉｕ Ｑｉ ｅｔ
ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２２，７３９−７４５，２００４）
。この報告では、Δ６不飽和化酵素、Δ５不飽和化酵素、および鎖長延長酵素を用いる経
路とは別の修飾経路で高度不飽和脂肪酸を作っており、単純比較は出来ないが、ゼニゴケ
の酵素を用いたほうがより多くの高度不飽和脂肪酸を蓄積することがわかった。
【０２１１】
総脂質の３０％以上が改変脂肪酸になっているｐＳＰＢ２３６８形質転換タバコでは、
形態的な異常は見られなかった。さらに、稔性にも問題なく、多くの種子をつけたことか
ら、異所的な高度不飽和脂肪酸の増加が植物の生育に及ぼす影響は少ないと考えられた。
【０２１２】
これまでに報告されている遺伝子組換え植物におけるＣ２０以上の高度不飽和脂肪酸の
生産は総脂質の２０％前後、アラキドン酸に限ると６％前後が限界である。しかし、本実
施例のように、ゼニゴケ由来の脂肪酸合成酵素を用いることにより、この限界を打ち破り
、より多くの高度不飽和脂肪酸を植物で生産することが出来ると考えられる。
【０２１３】
尚、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様または実施
例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例に
のみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、本発明の精神と次に記載する特許請求
の範囲内で、いろいろと変更して実施することができるものである。
【産業上の利用可能性】
【０２１４】
本発明に係る遺伝子は、同一種のゼニゴケから単離されたΔ５不飽和化酵素遺伝子、Δ
６不飽和化酵素遺伝子及びΔ６鎖長延長酵素遺伝子である。したがって、これら３種類の
遺伝子を植物内で同時に発現させた場合に、異なる生物種由来の複数の遺伝子を発現させ
るより、植物内で良好に機能するという効果を奏する。さらに、ゼニゴケは、高等植物の
モデル系と考えられるため、これらの遺伝子は、植物以外の生物種由来の遺伝子より植物
内で良好に機能することができるという効果を奏する。
【０２１５】
また、本発明に係る形質転換体は、アラキドン酸やエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）等
の高度不飽和脂肪酸を生産することができるという効果を奏する。特に、本発明に係る形
質転換植物は、低コストかつ環境にやさしい生産プロセスでアラキドン酸やＥＰＡ等の高
度不飽和脂肪酸を生産することができるという効果を奏する。こうして得られたアラキド
ン酸やＥＰＡは、安価な多目的材料として活用できるという効果を奏する。さらに、上記
形質転換植物体を食料として用いた場合、アラキドン酸やＥＰＡの含量が高い食料として
の価値が高まるという効果を奏する。
【０２１６】
以上にように、本発明の遺伝子・たんぱく質は、アラキドン酸やＥＰＡの生産に有用で
ある。また、本発明の遺伝子を発現可能に導入した形質転換体は、製薬産業、食品産業、
各種素材産業等において、アラキドン酸やＥＰＡを生産するうえで、極めて有用である。
また、特に、上記形質転換体が植物体である場合、植物体内のアラキドン酸やＥＰＡの含
量が増加するので、農業分野等において非常に有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡの全部又は一部、あるいは当該ＤＮＡと相
補的な塩基配列からなるＤＮＡの全部又は一部とストリンジェントな条件でハイブリダイ
ズし、かつΔ６脂肪酸不飽和化活性を有するたんぱく質をコードするゼニゴケ目生物由来
の遺伝子。
【請求項２】
Δ６脂肪酸不飽和化活性を有するゼニゴケ目生物由来のたんぱく質をコードする、下記（
ａ）又は（ｂ）に記載の遺伝子。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列を有する遺伝子。
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡ、又は当該ＤＮＡと相補的な塩基
配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子。
【請求項３】
Δ６脂肪酸不飽和化活性を有するゼニゴケ目生物由来のたんぱく質をコードする、下記（
ａ）又は（ｂ）に記載の遺伝子。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列のうち、２５３ないし１６９８番目の塩基配列を
有する遺伝子。
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列のうち、２５３ないし１６９８番目の塩基配列か
らなるＤＮＡ、又は当該ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな
条件でハイブリダイズする遺伝子。
【請求項４】
Δ６脂肪酸不飽和化活性を有するゼニゴケ目生物由来のたんぱく質をコードする、下記（
ａ）又は（ｂ）に記載の遺伝子。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるたんぱく質をコードする遺伝子。
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の１個又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失
、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるたんぱく質をコードする遺伝子。
【請求項５】
配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡの全部又は一部、あるいは当該ＤＮＡと相
補的な塩基配列からなるＤＮＡの全部又は一部とストリンジェントな条件でハイブリダイ
ズし、かつΔ６脂肪酸鎖長延長活性を有するたんぱく質をコードするゼニゴケ目生物由来
の遺伝子。
【請求項６】
Δ６脂肪酸鎖長延長活性を有するゼニゴケ目生物由来のたんぱく質をコードする、下記（
ａ）又は（ｂ）に記載の遺伝子。
（ａ）配列番号３に示される塩基配列を有する遺伝子。
（ｂ）配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡ、又は当該ＤＮＡと相補的な塩基
配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子。
【請求項７】
Δ６脂肪酸鎖長延長活性を有するゼニゴケ目生物由来のたんぱく質をコードする、下記（
ａ）又は（ｂ）に記載の遺伝子。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列のうち、１９４ないし１０６６番目の塩基配列を
有する遺伝子。
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列のうち、１９４ないし１０６６番目の塩基配列か
らなるＤＮＡ、又は当該ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな
条件でハイブリダイズする遺伝子。
【請求項８】
Δ６脂肪酸鎖長延長活性を有するゼニゴケ目由来のたんぱく質をコードする、下記（ａ）
又は（ｂ）に記載の遺伝子。
（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるたんぱく質、
（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列の１個又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失
、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるたんぱく質をコードする遺伝子。
【請求項９】
配列番号５に示される塩基配列からなるＤＮＡの全部又は一部、あるいは当該ＤＮＡと相
補的な塩基配列からなるＤＮＡの全部又は一部とストリンジェントな条件でハイブリダイ
ズし、かつΔ５脂肪酸不飽和化活性を有するたんぱく質をコードするゼニゴケ目生物由来
の遺伝子。
【請求項１０】
Δ５脂肪酸不飽和化活性を有するゼニゴケ目生物由来のたんぱく質をコードする、下記（
ａ）又は（ｂ）に記載の遺伝子。
（ａ）配列番号５に示される塩基配列を有する遺伝子。
（ｂ）配列番号５に示す塩基配列からなるＤＮＡ、又は当該ＤＮＡと相補的な塩基配列
からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子。
【請求項１１】
Δ５脂肪酸不飽和化活性を有するゼニゴケ目生物由来のたんぱく質をコードする、下記（
ａ）又は（ｂ）に記載の遺伝子。
（ａ）配列番号５に示される塩基配列のうち、３７５ないし１８２９番目の塩基配列を
有する遺伝子。
（ｂ）配列番号５に示される塩基配列のうち、３７５ないし１８２９番目の塩基配列か
らなるＤＮＡ、又は当該ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな
条件でハイブリダイズする遺伝子。
【請求項１２】
Δ５脂肪酸不飽和化活性を有するゼニゴケ目生物由来のたんぱく質をコードする、下記（
ａ）又は（ｂ）に記載の遺伝子。
（ａ）配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるたんぱく質をコードする遺伝子。
（ｂ）配列番号６に示されるアミノ酸配列の１個又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失
、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるたんぱく質をコードする遺伝子。
【請求項１３】
請求項１〜１２の何れか１項に記載の遺伝子によってコードされるたんぱく質。
【請求項１４】
以下の（ａ）又は（ｂ）記載のたんぱく質。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるたんぱく質。
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個又はそれ以上のアミノ酸が置
換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Δ６脂肪酸不飽和
化活性を有するたんぱく質。
【請求項１５】
以下の（ａ）又は（ｂ）記載のたんぱく質。
（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるたんぱく質。
（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１個又はそれ以上のアミノ酸が置
換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Δ６脂肪酸鎖長延
長活性を有するたんぱく質。
【請求項１６】
以下の（ａ）又は（ｂ）記載のたんぱく質。
（ａ）配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるたんぱく質。
（ｂ）配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１個又はそれ以上のアミノ酸が置
換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Δ５脂肪酸不飽和
化活性を有するたんぱく質。
【請求項１７】
請求項１３〜１６の何れか１項に記載のたんぱく質を認識する抗体。
【請求項１８】
少なくとも請求項１〜１２の何れか１項に記載の遺伝子を含む組換え発現ベクター。
【請求項１９】
少なくとも請求項１〜１２の何れか１項に記載の遺伝子を導入してなる形質転換体。
【請求項２０】
少なくとも請求項１〜１２の何れか１項に記載の遺伝子が発現可能に導入された植物体、
もしくは当該植物体と同一の性質を有する当該植物体の子孫となる植物体、又は当該植物
体の組織。
【請求項２１】
少なくとも請求項１〜１２の何れか１項に記載の遺伝子が発現可能に導入され、脂肪酸組
成が改変された植物体、もしくは当該植物体と同一の性質を有する当該植物体の子孫とな
る植物体、又は当該植物体の組織。
【請求項２２】
請求項２０又は２１に記載の植物体の繁殖材料。
【請求項２３】
請求項２１に記載の植物体又は植物体の組織を用いることを特徴とする脂肪酸生産方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の脂肪酸生産方法により得られた、γ−リノレン酸、ジホモ−γ−リノ
レン酸、アラキドン酸、ステアリドン酸、エイコサテトラエン酸、およびエイコサペンタ
エン酸から選択される少なくとも１つ含む素材。
【請求項２５】
少なくとも請求項１〜１２の何れか１項に記載の遺伝子を用いて脂肪酸組成を改変する方
法。
【請求項２６】
請求項１〜１２の何れか１項に記載の遺伝子における少なくとも一部の塩基配列又はその
相補配列をプローブとして用いた遺伝子検出器具。
【請求項２７】
請求項１３〜１６の何れか１項に記載のたんぱく質を用いて、当該たんぱく質を調節する
遺伝子、又は当該たんぱく質を調節する物質をスクリーニングする方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載のスクリーニング方法により得られた遺伝子又は物質。
【請求項１】
配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡの全部又は一部、あるいは当該ＤＮＡと相
補的な塩基配列からなるＤＮＡの全部又は一部とストリンジェントな条件でハイブリダイ
ズし、かつΔ６脂肪酸不飽和化活性を有するたんぱく質をコードするゼニゴケ目生物由来
の遺伝子。
【請求項２】
Δ６脂肪酸不飽和化活性を有するゼニゴケ目生物由来のたんぱく質をコードする、下記（
ａ）又は（ｂ）に記載の遺伝子。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列を有する遺伝子。
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡ、又は当該ＤＮＡと相補的な塩基
配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子。
【請求項３】
Δ６脂肪酸不飽和化活性を有するゼニゴケ目生物由来のたんぱく質をコードする、下記（
ａ）又は（ｂ）に記載の遺伝子。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列のうち、２５３ないし１６９８番目の塩基配列を
有する遺伝子。
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列のうち、２５３ないし１６９８番目の塩基配列か
らなるＤＮＡ、又は当該ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな
条件でハイブリダイズする遺伝子。
【請求項４】
Δ６脂肪酸不飽和化活性を有するゼニゴケ目生物由来のたんぱく質をコードする、下記（
ａ）又は（ｂ）に記載の遺伝子。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるたんぱく質をコードする遺伝子。
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の１個又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失
、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるたんぱく質をコードする遺伝子。
【請求項５】
配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡの全部又は一部、あるいは当該ＤＮＡと相
補的な塩基配列からなるＤＮＡの全部又は一部とストリンジェントな条件でハイブリダイ
ズし、かつΔ６脂肪酸鎖長延長活性を有するたんぱく質をコードするゼニゴケ目生物由来
の遺伝子。
【請求項６】
Δ６脂肪酸鎖長延長活性を有するゼニゴケ目生物由来のたんぱく質をコードする、下記（
ａ）又は（ｂ）に記載の遺伝子。
（ａ）配列番号３に示される塩基配列を有する遺伝子。
（ｂ）配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡ、又は当該ＤＮＡと相補的な塩基
配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子。
【請求項７】
Δ６脂肪酸鎖長延長活性を有するゼニゴケ目生物由来のたんぱく質をコードする、下記（
ａ）又は（ｂ）に記載の遺伝子。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列のうち、１９４ないし１０６６番目の塩基配列を
有する遺伝子。
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列のうち、１９４ないし１０６６番目の塩基配列か
らなるＤＮＡ、又は当該ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな
条件でハイブリダイズする遺伝子。
【請求項８】
Δ６脂肪酸鎖長延長活性を有するゼニゴケ目由来のたんぱく質をコードする、下記（ａ）
又は（ｂ）に記載の遺伝子。
（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるたんぱく質、
（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列の１個又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失
、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるたんぱく質をコードする遺伝子。
【請求項９】
配列番号５に示される塩基配列からなるＤＮＡの全部又は一部、あるいは当該ＤＮＡと相
補的な塩基配列からなるＤＮＡの全部又は一部とストリンジェントな条件でハイブリダイ
ズし、かつΔ５脂肪酸不飽和化活性を有するたんぱく質をコードするゼニゴケ目生物由来
の遺伝子。
【請求項１０】
Δ５脂肪酸不飽和化活性を有するゼニゴケ目生物由来のたんぱく質をコードする、下記（
ａ）又は（ｂ）に記載の遺伝子。
（ａ）配列番号５に示される塩基配列を有する遺伝子。
（ｂ）配列番号５に示す塩基配列からなるＤＮＡ、又は当該ＤＮＡと相補的な塩基配列
からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子。
【請求項１１】
Δ５脂肪酸不飽和化活性を有するゼニゴケ目生物由来のたんぱく質をコードする、下記（
ａ）又は（ｂ）に記載の遺伝子。
（ａ）配列番号５に示される塩基配列のうち、３７５ないし１８２９番目の塩基配列を
有する遺伝子。
（ｂ）配列番号５に示される塩基配列のうち、３７５ないし１８２９番目の塩基配列か
らなるＤＮＡ、又は当該ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな
条件でハイブリダイズする遺伝子。
【請求項１２】
Δ５脂肪酸不飽和化活性を有するゼニゴケ目生物由来のたんぱく質をコードする、下記（
ａ）又は（ｂ）に記載の遺伝子。
（ａ）配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるたんぱく質をコードする遺伝子。
（ｂ）配列番号６に示されるアミノ酸配列の１個又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失
、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるたんぱく質をコードする遺伝子。
【請求項１３】
請求項１〜１２の何れか１項に記載の遺伝子によってコードされるたんぱく質。
【請求項１４】
以下の（ａ）又は（ｂ）記載のたんぱく質。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるたんぱく質。
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個又はそれ以上のアミノ酸が置
換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Δ６脂肪酸不飽和
化活性を有するたんぱく質。
【請求項１５】
以下の（ａ）又は（ｂ）記載のたんぱく質。
（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるたんぱく質。
（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１個又はそれ以上のアミノ酸が置
換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Δ６脂肪酸鎖長延
長活性を有するたんぱく質。
【請求項１６】
以下の（ａ）又は（ｂ）記載のたんぱく質。
（ａ）配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるたんぱく質。
（ｂ）配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１個又はそれ以上のアミノ酸が置
換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Δ５脂肪酸不飽和
化活性を有するたんぱく質。
【請求項１７】
請求項１３〜１６の何れか１項に記載のたんぱく質を認識する抗体。
【請求項１８】
少なくとも請求項１〜１２の何れか１項に記載の遺伝子を含む組換え発現ベクター。
【請求項１９】
少なくとも請求項１〜１２の何れか１項に記載の遺伝子を導入してなる形質転換体。
【請求項２０】
少なくとも請求項１〜１２の何れか１項に記載の遺伝子が発現可能に導入された植物体、
もしくは当該植物体と同一の性質を有する当該植物体の子孫となる植物体、又は当該植物
体の組織。
【請求項２１】
少なくとも請求項１〜１２の何れか１項に記載の遺伝子が発現可能に導入され、脂肪酸組
成が改変された植物体、もしくは当該植物体と同一の性質を有する当該植物体の子孫とな
る植物体、又は当該植物体の組織。
【請求項２２】
請求項２０又は２１に記載の植物体の繁殖材料。
【請求項２３】
請求項２１に記載の植物体又は植物体の組織を用いることを特徴とする脂肪酸生産方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の脂肪酸生産方法により得られた、γ−リノレン酸、ジホモ−γ−リノ
レン酸、アラキドン酸、ステアリドン酸、エイコサテトラエン酸、およびエイコサペンタ
エン酸から選択される少なくとも１つ含む素材。
【請求項２５】
少なくとも請求項１〜１２の何れか１項に記載の遺伝子を用いて脂肪酸組成を改変する方
法。
【請求項２６】
請求項１〜１２の何れか１項に記載の遺伝子における少なくとも一部の塩基配列又はその
相補配列をプローブとして用いた遺伝子検出器具。
【請求項２７】
請求項１３〜１６の何れか１項に記載のたんぱく質を用いて、当該たんぱく質を調節する
遺伝子、又は当該たんぱく質を調節する物質をスクリーニングする方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載のスクリーニング方法により得られた遺伝子又は物質。
【図１】
【公開番号】特開２０１１−１２３（Ｐ２０１１−１２３Ａ）
【公開日】平成２３年１月６日（２０１１．１．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１８３８６０（Ｐ２０１０−１８３８６０）
【出願日】平成２２年８月１９日（２０１０．８．１９）
【分割の表示】特願２００５−５１６５０６（Ｐ２００５−５１６５０６）の分割
【原出願日】平成１６年１２月２２日（２００４．１２．２２）
【出願人】（３０９００７９１１）サントリーホールディングス株式会社 (307)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１月６日（２０１１．１．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年８月１９日（２０１０．８．１９）
【分割の表示】特願２００５−５１６５０６（Ｐ２００５−５１６５０６）の分割
【原出願日】平成１６年１２月２２日（２００４．１２．２２）
【出願人】（３０９００７９１１）サントリーホールディングス株式会社 (307)
【Ｆターム（参考）】
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