タイプ１ライアノジン受容体に基づく方法
この発明は、心不全の間の欠陥のある骨格筋機能を治療する方法及びそのような治療において有用な化合物を同定する方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
この出願は、２００３年３月７日に出願された仮出願米国連続番号６０／４５２，６６４の優先権を主張し、その内容を引用により本明細書に取り込む。
本明細書に開示された発明は、ナショナルインスティチュートオブヘルス、ヘルスアンドヒューマンサービスの米国部門の交付番号Ｒ０１ ＨＬ６１５０３−０５のもとで、政府の支持においてなされた。従って、米国政府はこの発明に一定の権利を有する。
【０００２】
発明の背景
この出願を通して、様々な刊行物が著者及び発行年により括弧で引用される。これらの引用に関する全ての引用文献は、特許請求の範囲の前に明細書の終わりに見いだされる。これらの刊行物全体の開示は、引用によりこの出願に取り込まれ、この発明が属する分野の事情を、より完全に記載する。
【０００３】
横紋筋の収縮は、カルシウム（Ｃａ２＋）が、細管から、筋小胞体（ＳＲ）として知られる筋肉細胞へ放出される時に開始する。ＳＲ上のライアノジン受容体（ＲｙＲ）と呼ばれるカルシウム放出チャネルは、興奮−修飾（ＥＣ）のカップリングに必要とされる。タイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）は心臓に見いだされ、一方、タイプ１のライアノジン受容体（ＲｙＲ１）は骨格筋に見いだされる。ＲｙＲ１受容体は、４つの５６５，０００ドルトンのＲｙＲ１ポリペプチド及び４つの１２，０００ドルトンのＦＫ−５０６結合蛋白質（ＦＫＢＰ１２）からなるテトラマーである。ＦＫＢＰ１２ｓはＲｙＲチャネル機能を安定化させ（Ｂｒｉｌｌａｎｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４）、そして隣のＲｙＲチャネル間のカップリングされた関門（gating）を容易にする調節サブユニットである；後者はＣａ２＋の細胞内保存物を放出する特化されたＳＲセクション内で密集したアレイにパックされて、それにより筋肉の修飾を誘導する。ＦＫＢＰ１２に加えて、ＲｙＲ１マクロ分子複合体もＰＫＡの触媒サブユニットと調節サブユニット、及びホスファターゼＰＰ１を含む（Ｍａｒｘ ｅｔ ａｌ．，２００１）。
【０００４】
一つのＦＫＢＰ１２分子は各ＲｙＲ１サブユニットに結合する。ＦＫＢＰ１２の解離はチャネルの生物物理特性を顕著に変え、亜伝導性（subconductance）状態の出現、及びチャネルの開確率（Ｐｏ）の増加をもたらす（Ｂｒｉｌｌａｎｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｇａｂｕｒｊａｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２００１）。さらに、ＲｙＲ１チャネルからのＥＣ１２の解離は、カップリングされた関門を阻害し、集団としてよりむしろ確率的に関門するチャネルをもたらす（Ｍａｒｘ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。ＲｙＲチャネルのアレイのカップリングされた関門は、筋肉の収縮を調節する有効なＥＣカップリングに重要であると考えられる（Ｍａｒｘ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。ＦＫＢＰｓは、広く発現されて様々な細胞機能の役に立つシス−トランスのペプチジル−プロリルイソメラーゼである（Ｍａｒｋｓ，１９９６）。ＦＫＢＰ１２ｓは、骨格筋型（ＲｙＲ１）（Ｂｒｉｌｌａｎｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｊａｙａｒａｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２）及び心臓型（ＲｙＲ２）（Ｋａｆｔａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６）の筋肉Ｃａ２＋放出チャネル、並びにタイプ１イノシトール１，４，５−３リン酸受容体（ＩＰ３Ｒ１）（Ｃａｍｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７）、及びタイプ１トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦβ）受容体（ＴβＲＩ）（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７）として知られる、関連する細胞内放出チャネルに強く結合して、その機能を調節する。
【０００５】
心不全（ＨＦ）は、世界的に死亡率及び罹患率のトップの原因である。当該疾患は、不可欠な器官の低灌流（hypoperfusion）を導く心臓の収縮機能の累進的低下により特徴付けされる。さらに、中程度の心機能不全（cardiac dysfunction）の多くの患者は、彼らのＨＦの程度のみによっては説明できない運動能力の実質上の欠陥を有する（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｃｏａｔｓ，１９９７；Ｍｉｎｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，１９９１；Ｓｕｌｌｉｖａｎ ａｎｄ Ｈａｗｔｈｏｒｎｅ，１９９５；Ｗｉｌｓｏｎ，１９９５）。これは、根本的な心筋の欠陥に加えて、ＨＦの患者において根本的な骨格筋の欠陥が存在するという仮説を導いてきた（Ｍｉｎｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。
【０００６】
ほとんどのＨＦ患者は、彼らの顕著に低下した運動上の忍耐力のため、生命の質の発達性の劣化を経験する。より重度のＨＦの場合（ニューヨークハートアソシエーションクラスＩＶ）、２年の死亡率が５０％を超える（Ｂｒａｕｎｗａｌｄ，１９９２）。ＨＦの患者及び動物のモデルは、慢性の高アドレナリン作用性刺激を含む不順応性応答により特徴付けされる（Ｂｒｉｓｔｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９８２）。ＨＦにおける慢性アドレナリン作用性刺激の病理上の重要性は、β−アドレナリン刺激及び左心室の心筋壁のストレスを低下させて心室リモデリングを有力に逆転させる治療上の戦略により支持される（Ｂａｒｂｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｂｒｉｓｔｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。
【０００７】
ＨＦの間の慢性のβアドレナリン刺激は、心臓のＲｙＲ２受容体のｃＡＭＰ−依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）の高リン酸化に付随する（Ｍａｒｘ ｅｔ ａｌ．，２０００）。ＰＫＡ−高リン酸化チャネルを通したＳＲのＣａ２＋リークにより明らかにされた、結果としてのＲｙＲ２の欠陥性機能が、ＨＦにおける抑圧された修飾機能及び不整脈発生に対して寄与する因子として提案された（Ｍａｒｘ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｍａｒｘ ｅｔ ａｌ．，２０００）。この仮説に一致して、弱った心臓におけるＲｙＲ２のＰＫＡ高リン酸化が、動物モデルと心臓移植を経験したＨＦ患者の両方において生体内にて証明された（Ａｎｔｏｓ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｍａｒｘ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｏｎｏ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｒｅｉｋｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｓｅｍｓａｒｉａｎ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｙａｎｏ ｅｔ ａｌ．，２０００）。
【０００８】
ＨＦの動物モデルを用いて、加速された疲労の発現を含む抑圧された収縮機能が、骨格筋（Ｌｕｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｐｅｒｒｅａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．，１９９３）と横隔膜筋（ＭａｃＦａｒｌａｎｅ ｅｔ ａｌ．，２０００）の両方において証明された。これらの研究においては、Ｃａ２＋シグナリングの欠損が提案されたが、ＨＦにおける欠損した骨格筋機能の下にある分子機構は今のところ明らかにされていない。
【０００９】
発明の概要
本発明は、タイプ１ライアノジン（ＲｙＲ１）受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離を第１薬剤が阻害するか否かを決定する方法を提供し、（ａ）別々に、（ｉ）ＲｙＲ１受容体を発現する細胞又は（ｉｉ）そのような細胞からの抽出物からの筋形質網状構造又は細胞質網状構造を、（１）上記の第１薬剤とＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離を引き起こすことが知られている第２薬剤の両方と、及び（２）そのような第２薬剤の存在下でＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離に適した条件下で、そのような第２薬剤のみと、接触させ、そして（ｂ）第２薬剤のみの存在下、及び第１と第２薬剤の両方の存在下で、ＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離の程度を測定するが、第１と第２薬剤の両方の存在下でのＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離の程度が第１薬剤のみの存在下でのＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離の程度よりも小さいことが、第１薬剤がＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離の程度を阻害することを示し、それにより、第１薬剤がタイプ１ライアノジン（ＲｙＲ１）受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離の程度を阻害するか否かを示す。
【００１０】
この発明は、ＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離を阻害する薬剤を同定するために、ＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離を阻害することが知られていない多数の薬剤をスクリーニングする方法も提供し、（ａ）（ｉ）ＲｙＲ１受容体を発現する細胞又は（ｉｉ）そのような細胞からの抽出物からの筋形質網状構造又は細胞質網状構造を引き起こすことが知られている多数の薬剤の一つ又は複数と、そのような解離薬剤の存在下でＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離を許容する条件下で接触させ；そして（ｂ）そのような薬剤の不在下でのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離の程度に比較して、多数の薬剤の一つ又は複数の存在下でＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離の程度が低下するか否かを測定し；そして（ｃ）工程（ｂ）において測定された解離の程度が一つより多い薬剤の存在下において低下したなら、別々に、そのような薬剤がＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離の程度を阻害するか否か測定し、それによりそのような多数の薬剤のうちのそのような薬剤がＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離を阻害すると決定する。
【００１１】
発明は、さらに、組成物を製造する方法を提供するが、薬剤を用意し、本発明によるタイプ１ライアノジン（ＲｙＲ１）受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離を当該薬剤が阻害するか否かを決定し、ＲｙＲ１受容体と離して当該薬剤を回収し、そして担体と当該薬剤を混合することを含む。
【００１２】
発明は、さらに、欠陥のある骨格筋機能を有する被験者を治療する方法を提供するが、被験者に、被験者の骨格筋のタイプ１ライアノジン（ＲｙＲ１）受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離を低下させるのに有効な薬剤をある量投与し、それにより被験者の骨格筋の機能を軽減させることを含む。
【００１３】
この発明は、さらに、欠陥のある骨格筋機能を有する被験者を治療する方法を提供するが、被験者に、被験者の骨格筋のタイプ１ライアノジン（ＲｙＲ１）受容体／カルシウム放出チャネルへのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の結合を模倣するのに有効な薬剤をある量投与することによりチャネルの開口の確率を減じ、それにより被験者の骨格筋の機能を軽減させることを含む。
【００１４】
この発明は、さらに、欠陥のある骨格筋機能を有する被験者を治療する方法を提供するが、被験者に、本明細書にて開示された何れかの方法によりタイプ１ライアノジン（ＲｙＲ１）受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離を阻害するために決定された治療上有効な量の薬剤、又はそのような薬剤の構造上及び機能上の類似体又は相同体を投与することを含む。
【００１５】
最後に、この発明は、本明細書にて開示された何れかの方法によりタイプ１ライアノジン（ＲｙＲ１）受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離を阻害するために決定された薬剤の異常性の治療のための使用であって、タイプ１ライアノジン（ＲｙＲ１）受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離を阻害することにより異常性が緩和される使用を提供する。
【００１６】
発明の詳細な説明
定義
以下の定義は、この発明を理解することにおいて助けとなる。
【００１７】
本明細書において使用される「ＲｙＲ１受容体」は、骨格筋の筋小胞体（ＳＲ）上に見いだされるカルシウム（Ｃａ２＋）放出チャネルであるタイプ１ライアノジン受容体を意味する。「ＲｙＲ２」受容体は、心臓の筋小胞体（ＳＲ）上に見いだされるカルシウム（Ｃａ２＋）放出チャネルであるタイプ２ライアノジン受容体を意味する。
【００１８】
「ＦＫＢＰ１２」は、約１２，０００ドルトンの分子量を有するＦＫ−５０６結合蛋白質を意味し、ＲｙＲ１受容体チャネルに結合してその機能を制御する。「ＦＫＢＰ１２．６」は、約１２，０００ドルトンの分子量を有するＦＫ−５０６結合蛋白質を意味し、ＲｙＲ２受容体チャネルに結合してその機能を制御する。
【００１９】
「ＰＫＡ−リン酸化」は、酵素プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）によりリン酸基でヒドロキシル基を置換する反応を意味する。
ＲｙＲ１又はＲｙＲ２受容体の「逆−リン酸化（back-phosphorylation）」は、プロテインキナーゼＡによる受容体のインビトロリン酸化を意味する。
【００２０】
発明の態様
この出願は、ＨＦのイヌ及びラットのモデルからの骨格筋におけるＲｙＲ１チャネルがＰＫＡ−高リン酸化されて、ＦＫＢＰ１２が消耗し、そして増加した活性を呈したことで、上記チャネルが「リーキー」であることを示唆することを開示する。ＲｙＲ１のＰＫＡ高リン酸化は、ＨＦ骨格筋における障害をもったＳＲ Ｃａ２＋放出及び初期の疲労に相関した。これらの発見は、ＳＮＳ刺激に応答してＰＫＡリン酸化によりＲｙＲ１の機能を制御する新規な機構を明らかにする。ＲｙＲ１のＰＫＡ高リン酸化は、ＨＦにおける障害を持つ骨格筋機能に寄与するかもしれず、一般化されたＥＣ共役筋疾患が心不全において役割を担うかもしれないことを示唆する。
【００２１】
特定すれば、本発明は、タイプ１ライアノジン（ＲｙＲ１）受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離を第１の薬剤が阻害するか否かを決定するための方法を提供し、（ａ）別々に、（ｉ）ＲｙＲ１受容体を発現する細胞又は（ｉｉ）そのような細胞からの抽出物からの筋形質網状構造又は細胞質網状構造を、（１）上記の第１薬剤とＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離を引き起こすことが知られている第２薬剤の両方と、及び（２）そのような第２薬剤の存在下でＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離に適した条件下で、そのような第２薬剤のみと、接触させ、そして（ｂ）第２薬剤のみの存在下、及び第１と第２薬剤の両方の存在下で、ＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離の程度を測定するが、第１と第２薬剤の両方の存在下でのＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離の程度が第１薬剤のみの存在下でのＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離の程度よりも小さいことが、第１薬剤がＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離の程度を阻害することを示し、それにより、第１薬剤がタイプ１ライアノジン（ＲｙＲ１）受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離の程度を阻害するか否かを示す。
【００２２】
この発明は、ＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離を阻害する薬剤を同定するために、ＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離を阻害することが知られていない多数の薬剤をスクリーニングする方法も提供し、（ａ）（ｉ）ＲｙＲ１受容体を発現する細胞又は（ｉｉ）そのような細胞からの抽出物からの筋形質網状構造又は細胞質網状構造を引き起こすことが知られている多数の薬剤の一つ又は複数と、そのような解離薬剤の存在下でＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離を許容する条件下で接触させ；（ｂ）そのような薬剤の不在下でのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離の程度に比較して、多数の薬剤の一つ又は複数の存在下でＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離の程度が低下するか否かを測定し；そして（ｃ）工程（ｂ）において測定された解離の程度が一つより多い薬剤の存在下において低下したなら、別々に、そのような薬剤がＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離の程度を阻害するか否か測定し、それによりそのような多数の薬剤のうちのそのような薬剤がＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離を阻害すると決定する。
【００２３】
本明細書に記載された方法の何れかの一つの態様において、ＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離の程度を測定することは、ＲｙＲ１受容体のプロテインキナーゼＡのリン酸化を測定することを含む。一つの態様において、例えば、ＲｙＲ１受容体のプロテインキナーゼＡのリン酸化を測定することは、ＲｙＲ１受容体の、リン酸化された形態には結合するがリン酸化されていない形態には結合しない抗体の結合を検出することを含む。別の態様において、ＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離の程度を測定することは、カルシウム感受性蛍光染料の蛍光を測定することを含む。さらなる態様において、ＲｙＲ１受容体は、ヒトＲｙＲ１受容体である。
【００２４】
本発明の方法の一つの態様においては、細胞を薬剤に接触させ、そしてＲｙＲ１受容体をそのような細胞に対して内因性である核酸から発現させる。別の態様においては、細胞を薬剤と接触させ、そしてＲｙＲ１受容体をそのような細胞にトランスフェクトした核酸から発現させる。さらなる態様においては、細胞が細菌、酵母、昆虫、両生類、植物又は哺乳類細胞である。哺乳類細胞は、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＬＭ（ｔｋ−）細胞、マウス胚性繊維芽ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、マウスＹ１細胞、２９３ヒト胚性腎臓細胞及びヒーラ細胞を含む。昆虫細胞は、例えば、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞及びイラクサギンウワバ（Trichoplusia ni）５Ｂ−４細胞を含む。両生類細胞は、例えば、アフリカツメガエル（Xenopus）卵母細胞及びアフリカツメガエル黒色胞細胞を含む。
【００２５】
別の態様において、細胞は、欠陥を有する心臓を持つ被験者からの骨格筋細胞である。被験者は、例えば、心臓の欠陥が、急速な心臓ペーシング又はヒトにより誘導された動物であり得る。
【００２６】
この発明は、組成物を製造する方法も提供するが、薬剤を用意し、本明細書に記載された方法の何れかによりタイプ１ライアノジン（ＲｙＲ１）受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離を当該薬剤が阻害するか否かを決定し、ＲｙＲ１受容体と離して当該薬剤を回収し、そして担体と当該薬剤を混合することを含む。
【００２７】
この発明は、さらに、欠陥のある骨格筋機能を有する被験者を治療する方法を提供するが、被験者に、被験者の骨格筋のタイプ１ライアノジン（ＲｙＲ１）受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離を低下させるのに有効な薬剤をある量投与し、それにより、被験者の骨格筋の機能を軽減させることを含む。一つの態様において、上記薬剤は、ＪＴＶ５１９，１，４−ベンゾチアゼピン誘導体である（Ｙａｎｏ ｅｔ ａｌ．，２００３）。
【００２８】
この薬剤は、以下に記載される他の本発明の方法及び組成物における使用に関して構想される。別の態様において、上記薬剤は、被験者の骨格筋のタイプ１ライアノジン（ＲｙＲ１）受容体のプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）リン酸化を低下させる。さらなる態様において、上記薬剤は、ベータアドレナリン様ブロッカーではない。
【００２９】
この発明は、さらに、被験者の欠陥のある骨格筋機能を軽減するのに有効なベータアドレナリン様ブロッカーをある量被験者に投与することを含む、欠陥のある骨格筋機能を有する患者を治療する方法を提供する。
【００３０】
一つの態様において、ベータアドレナリン様ブロッカーは、カルベジロール（Ｃｏｒｅｇ（登録商標）、スミスクラインビーチャム）又はメトプロロール（Ｔｏｐｒｏｌ−ＸＬ（登録商標）、アストラゼネカ）である。別の態様において、カルベジロールの用量は、１日あたり経口で６．２５ｍｇから１日２回経口で５０ｍｇまでである。別の態様において、メトプロロールの用量は、１日あたり経口で１２．５から２００ｍｇである。
【００３１】
上記の方法の何れかの一つの態様において、被験者の欠陥のある骨格筋機能は、心不全の間に起こる。別の態様において、上記薬剤は、被験者の心不全を軽減もする。さらなる態様において、上記薬剤は、ベータアドレナリン様ブロッカーではない。上記薬剤は、例えば、ダントロレン、又はダントロレンの誘導体、相同体、類似体、代謝物、又はプロドラッグであり得る。
【００３２】
上記の方法の何れかの一つの態様において、被験者の欠陥のある骨格筋機能は、慢性の閉塞性肺疾患、高血圧、喘息又は甲状腺機能亢進症の間に起こる。
この発明は、さらに、欠陥のある骨格筋機能を有する被験者を治療する方法を提供するが、被験者に、被験者の骨格筋のタイプ１ライアノジン（ＲｙＲ１）受容体／カルシウム放出チャネルへのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の結合を模倣するのに有効な薬剤をある量投与することにより、チャネルの開口の確率を減少させ、それにより被験者の欠陥のある骨格筋機能を軽減させることを含む。一つの態様において、被験者の欠陥のある骨格筋機能は、心不全の間に起こる。別の態様において、上記薬剤は、被験者の心不全を軽減もする。さらなる態様において、被験者の欠陥のある骨格筋機能は、慢性の閉塞性肺疾患、高血圧、喘息又は甲状腺機能亢進症の間に起こる。
【００３３】
この発明は、さらに、欠陥のある骨格筋機能を有する被験者を治療する方法を提供するが、被験者に、本明細書に開示された方法の何れかにより、タイプ１ライアノジン（ＲｙＲ１）受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離を阻害すると決定された薬剤又はそのような薬剤の構造上及び機能上の類似体又は相同体を治療上有効な量投与することを含む。
【００３４】
上記の方法の何れかの一つの態様において、被験者の欠陥のある骨格筋機能は、心不全の間に起こる。別の態様において、上記薬剤は、被験者の心不全を軽減もする。さらなる態様において、被験者の欠陥のある骨格筋機能は、慢性の閉塞性肺疾患、高血圧、喘息又は甲状腺機能亢進症の間に起こる。またさらなる態様において、上記薬剤は、ベータアドレナリン様ブロッカーではない。
【００３５】
この発明は、さらに、異常性を治療するための、本明細書に開示された方法の何れかにより、タイプ１ライアノジン（ＲｙＲ１）受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離を阻害すると決定された薬剤の使用を提供するが、異常性は、タイプ１（ＲｙＲ１）受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離を阻害することにより軽減される。一つの態様において、上記化合物は、ベータアドレナリン様ブロッカーではない。別の態様において、薬学組成物の製造は、上記薬剤を治療上有効な量、薬学上受容可能な担体と混合することを含む。
【００３６】
この発明は、さらに、本明細書に開示された方法の何れかにより同定された化学化合物を提供する。
この発明は、またさらに、ＲｙＲ１受容体に特異的に結合する組成物を作成する方法を提供するが、本明細書に開示された方法の何れか一つを用いて化学化合物を同定し、当該化学化合物又はその新規な構造上及び機能上の類似体又は相同体を合成し、そして薬学上有効な量の当該化学化合物を薬学上受容可能な担体と混合することを含む。
【００３７】
この発明は、（ａ）本明細書に開示された方法の何れかを用いて同定された化学化合物をある量、及び（ｂ）細胞膜を通過することができる薬学上受容可能な担体を含む、薬学組成物も提供する。
【００３８】
この発明は、さらに、ＲｙＲ１受容体チャネル機能に関するアッセイを提供するが、ＲｙＲ１受容体のプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）リン酸化、ＲｙＲ１受容体によるＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離の程度、ＲｙＲ１受容体チャネルの亜伝導状態、ＲｙＲ１受容体チャネルの活性化のためのＣａ２＋感受性、又はＲｙＲ１受容体チャネルの開確率（Ｐｏ）を測定することを含む。
【００３９】
主題の発明において、「薬学上有効な量」は、化合物が有効な疾患を罹患する被験者に投与されたときに、疾患の軽減（reduction）、沈静（remission）、又は緩解（regression）を導く、化合物の何れかの量である。
【００４０】
一つの態様において、治療上有効な量の化合物は、１日あたり、約０．０３から約１０００ｍｇの間である。別の態様において、治療上有効な量は、１日あたり約０．３０から約３００ｍｇの間である。一つの態様において、治療上有効な量は、１日あたり約１．０から約１００ｍｇの間である。
【００４１】
さらに、本明細書にて使用される、句「薬学上受容可能な担体」は、標準の薬学上受容可能な担体の何れも意味する。例は、限定ではないが、リン酸緩衝塩、生理食塩水、水、及びエマルジョン、例えば、オイル／水エマルジョンを含む。一つの態様において、担体は水ではない。
【００４２】
最後に、この発明は、本明細書に開示された化合物又は薬剤の相同体、類似体、アイソマー、プロドラッグ及び代謝物を提供する。化学化合物の「構造上及び機能上の類似体」は、化合物の構造と類似の構造を有するが、特定の成分（１つ又はそれ以上）に関してその化合物とは異なる。化学化合物の「構造上及び機能上の類似体」は、一定の要素の追加により、それの前のものから形成される（formed from the one before it）各々の化合物のシリーズの一つである。用語「類似体」は、用語「相同体」よりも広く、これを包含する。「アイソマー」は、同じ分子式を有する化学化合物であるが、原子の異なる分子構造又は異なる配置（arrangement）が存在する（space）。アイソマーは、構造アイソマー、位置的アイソマー、ステレオアイソマー、光学アイソマー、又はシス−トランスアイソマーであってよい。一般に、「プロドラッグ」は、要求される化合物に生体内で容易に変換可能な化合物の機能性誘導体になる。適切なプロドラッグ誘導体の選択及び製造のための慣用の手法は、例えば、Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ，ｅｄ．Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８５に記載される。「代謝物」は、化合物の生物学的環境への導入に際して生産される活性種を含む。
【００４３】
受容体選択的化合物をデザイン及び合成するアプローチは、よく知られており、伝統的な医化学及びコンビナトリアルケミストリーの新規な技術を含み、両方とも、コンピューターにより補助される分子モデリングにより支持される。そのようなアプローチにより、化学者及び薬学者らは、これらの受容体サブタイプにおいて活性を有する構造をデザインして合成するために、受容体を結合すると決定された標的化受容体サブタイプ及び化合物の構造に関する彼らの知見を使用する。
【００４４】
コンビナトリアルケミストリーは、化学的ビルディングブロックの異なる組み合わせを用いて新規な化合物を集合させることによる、様々な新規な化合物の自動化された合成を含む。コンビナトリアルケミストリーの使用は、化合物を生成するプロセスを多大に加速させる。結果の化合物のアレイはライブラリーと呼ばれ、目的の受容体において十分なレベルの活性を証明する「リード化合物」に関してスクリーニングするために使用される。コンビナトリアルケミストリーを用いることにより、目的の受容体標的に対して多大に偏ったと認識される化合物の「一本化された（focused）」ライブラリーを合成することが可能である。
【００４５】
リード化合物が同定されたら、コンビナトリアルケミストリーの使用によるか又は伝統的医化学の使用によるか又はそれ以外かに拘わらず、様々な相同体及び類似体が製造されることにより、化学構造と生物活性又は機能活性の間の関係の理解を促進する。これらの研究は、構造活性関係を規定し、次に、改善された能力、選択性及び薬力学特性を有する薬剤をデザインするために用いられる。コンビナトリアルケミストリーは、リードの最適化のために様々な構造を迅速に製造するのにも用いられる。伝統的な医化学は、一度の一つの化合物の合成を含み、さらなる改善のため、及び自動化された技術により接近可能でない化合物を生成するためにも使用される。そのようなドラッグが規定されたら、薬学工業及び化学工業を通して利用された標準化学製造方法論を用いて、生成物がスケールアップされる。
【００４６】
この発明は続く実験の詳細から良好に理解される。しかしながら、当業者は、特定の方法及び考察された結果は単に発明の例示であって、以後に続く特許請求の範囲において、より完全に記載されるものとして容易に認識する。
【００４７】
実験の詳細
本出願は、骨格筋のＥＣ共役に必要なＳＲ上のＲｙＲ１カルシウム放出チャネルの組成と機能が、心不全の動物モデルにおいてＰＫＡ高リン酸化のために変動するという発見に基づく。心不全の間、ＲｙＲ１のＰＫＡ高リン酸化は制御サブユニットＦＫ５０６結合蛋白質（ＦＫＢＰ１２）のＲｙＲ１チャネルマクロ分子複合体中での消耗を引き起こし、変更された開門（gating）をもつチャネルをもたらす。ＲｙＲ１のＰＫＡ高リン酸化は、心不全の骨格筋において変更されたＣａ２＋シグナリング及び初期の疲労と相関する。ＲｙＲ１の構造及び機能の欠陥は、心筋のＲｙＲ２に関して以前に報告されたものと類似していることから、心不全は心筋と骨格筋の両方を含む、一般化されたＥＣ共役筋疾患であることを示唆する。本発見は、実際に、不適応の応答を示して筋肉の機能のさらなる障害をもたらす心不全の慢性的高アドレナリン様状態のために、骨格筋が心筋のように変化を受けることを示す。
【００４８】
材料と方法
組換え体ＲｙＲ１を発現及び精製すること
組換え体ＷＴ及び変異体ＲｙＲ１を発現させ、単離し、そして特性決定したが、以前に記載された通りにした（Ｂｒｉｌｌａｎｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｇａｂｕｒｊａｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２００１）。簡単に言えば、ＲｙＲ１のｃＤＮＡをＮｈｅＩ及びＸｂａＩ部位を用いて、哺乳類発現ベクターｐＣＭＶ５にクローン化した。ＨＥＫ２９３細胞を最小必須培地（ＭＥＭ）中で２５ｍＭＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ）と共に、１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清（Ｇｉｂｃｏ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍｌ）、及びＬ−グルタミン（２ｍＭ）を追加して生育させた。一つのＴ１７５フラスコ（５０％コンフルエント）のＨＥＫ２９３細胞に、２０μｇのＲｙＲ１ ｃＤＮＡを、Ｃａ２＋リン酸沈殿法を用いてトランスフェクトした（Ｇａｂｕｒｊａｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２００１）。４８時間後のトランスフェクション細胞を２回洗浄して、リン酸緩衝塩溶液中にスクラップし、そして２５００ｘｇにて５分間、４℃における遠心分離により沈殿させた。記載されたとおり、マイクロソームを調製し、等分し、そして−８０℃に保存した（Ｇａｂｕｒｊａｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２００１）。
【００４９】
イムノブロット、免疫沈殿及びリン酸化
骨格筋の筋小胞体（ＳＲ）膜を、イヌの後肢骨格筋組織から調製した。簡単に言えば、約１０ｇの組織を切り刻み、そしてＮａＦ（５ｍＭ）及びプロテアーゼ阻害剤（１．０ｍＭベンザミジン、５．０μｇ／ｍｌペプスタチン、５．０μｇ／ｍｌロイペプチン、１．０μｇ／ｍｌアプロチン、１．０ｍＭペファブロック）を含む５０ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−マレイン酸バッファー、ｐＨ６．８中でホモジェナイズした。ホモジェネートを２０分間４，０００ｘｇにて遠心分離し、そして上清を再度１０，０００ｘｇにて２０分間遠心分離した。結果の上清を４０，０００ｘｇにて３０分間遠心分離し、そして沈殿物を、０．３Ｍショ糖及び０．９％ＮａＣｌを含む０．２ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−マレイン酸（ｐＨ６．８）に懸濁した。蛋白質の濃度はＢｒａｄｆｏｒｄの方法により、ウシ血清アルブミンを標準として測定し、サンプルを等分し、液体窒素中で急速凍結し、そして−８０℃において使用まで保存した。骨格筋溶解物は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），２００ｍＭ ＮａＣｌ，２０ｍＭ ＮａＦ，１．０ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４，１．０ｍＭ ＤＴＴ，及びプロテアーゼ阻害剤を含む１．０ｍｌのバッファー中でホモジェナイズされた１．０ｇのイヌ組織又は健康な（whole）ラットのひらめ筋から調製した。蛋白質濃度を測定後に、上清を等分し、そして使用まで−８０℃に保存した。免疫沈殿に関しては、骨格筋ＳＲサンプルを０．５ｍｌのＩＰバッファー［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），０．９％ ＮａＣｌ，０．５ｍＭ ＮａＦ，０．５ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４，０．２５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，及びプロテアーゼ阻害剤］に懸濁して、抗−ＲｙＲ抗体と一晩４℃においてインキュベートした。イムノブロットは、以下の一次抗体：抗−ＰＫＡ触媒サブユニット（１：１０００）、抗−ＰＰｌ（１：１０００）、（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｓ）、抗−ＦＫＢＰ（１：１０００）（Ｊａｙａｒａｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２）、抗−ＲｙＲ−５０２９（１：３０００）（Ｊａｙａｒａｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２）、抗体−ＰＤＥ４Ｄ３（１：１０００）［カサガイ（keyhole limpet）のヘモシアニン（ＫＬＨ）へのコンジュゲーションのために追加されたカルボキシル末端のシステインを有するヒトＰＤＥ４Ｄ３の残基１−１４、及び残基６のＮに代えてＴを有する相当するラットの配列の２つのＰＤＥ４Ｄ３ペプチド（ＭＭＨＶＮＮ／ＴＦＰＦＲＲＨＳＷ（Ｃ））の混合物により免疫されたウサギにおいて生じさせた、親和精製されたポリクローナル抗体］、抗−ｍＡＫＡＰ（１：７５０）［ＫＬＨへのコンジュゲーションのために追加されたアミノ末端のシステインを有するｍＡＫＡＰ配列（Ｃ）ＥＴＲＦＮＮＲＱＤＳＤＡＬＫＳＳＤＤに相当するペプチドにより免疫されたウサギにおいて生じさせた、親和精製されたポリクローナル抗体］を用いて実施した。プロテインＡ−セファロースビーズを加え、４℃において１時間インキュベートし、そしてＩＰバッファーにより３回洗浄した。洗浄後に、膜をペルオキシダーゼ−コンジュゲートされたヤギの抗ウサギ又はヤギ抗マウスのＩｇＧ抗血清（１：３０００、ベーリンガーマンハイム）と６０分間室温においてインキュベートし、Ｔｒｉｓ−緩衝塩（ＴＢＳ）、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０により３回洗浄し、そして増強されたケミルミネッセンスにより発色させた（ＥＣＬ，アマシャム）。
【００５０】
リン酸化に関しては、ビーズを１Ｘリン酸化バッファー［８ｍＭ ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ ＥＧＴＡ，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルフォン酸）、ｐＨ６．８］により洗浄し、媒質のみ、ＰＫＡ触媒サブユニット（５ユニット、シグマ）ＰＫＡプラスＰＫＡ阻害剤（ＰＫＩ５−２４，５００ｎＭ，カルビオケム）、又はｃＡＭＰ（１０μＭ）の何れかを含む、１０μｌの１．５Ｘリン酸化バッファーに懸濁した。免疫沈殿されたＲｙＲ１のリン酸化は、Ｍｇ−ＡＴＰ（３３μＭ），［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰにより開始して、５μｌの停止溶液（４％ＳＤＳ及び０．２５Ｍ ＤＴＴ）と共に室温において５分間インキュベートした後に停止させた。脱リン酸化実験に関しては、ｃＡＭＰ反応をＰＫＩの添加、続いてプロタミン（１ｍｇ／ｍｌ）＋／−オカダ酸（５μＭ）の添加により停止した。サンプルを９５℃に加熱し、６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりサイズで分画し、そしてＲｙＲ２放射活性をＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ及びＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウエア（アマシャムファルマシアバイオテック）を用いて定量した。非特異的リン酸化（ＰＫＩにより阻害されない）を差し引いて、３２Ｐ−リン酸化を高親和性［３Ｈ］−ライアノジン結合の量で割ることにより、３２Ｐ／ＲｙＲ１比を計算した（ＲｙＲ１あたり一つの高親和性ライアノジン結合部位）。全ての実験は３通りに実施され、研究者はサンプルの源を知らなかった。
【００５１】
ＦＫＢＰ１２結合
マイクロソーム（２００μｇ）を、プロタミン阻害剤を含む０．１ｍｌのイミダゾールバッファー（５ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４，及び０．３Ｍショ糖）に懸濁して、Ｍｇ−ＡＴＰ（１００μＭ）及びＰＫＡ（１０ユニット）又はｃＡＭＰ（１０μＭ）の何れかと、３０℃において３０分間インキュベートした。サンプルを９５，０００ｘｇにて１０分間遠心分離し、そして上清を回収した。沈殿物を２回０．２ｍｌイミダゾールバッファーで洗浄し、そして９５，０００ｘｇにて１０分間遠心分離した。最終沈殿物を０．１ｍｌのイミダゾールバッファーに懸濁した。いくつかの実験においては、沈殿物をｃＡＭＰでリン酸化して、次にアルカリホスファターゼにより（１：１００ 酵素：蛋白質）又はプロタミン（１ｍｇ／ｍｌ）により内因性ホスファターゼを活性化することにより、脱リン酸化した。組換え体ＦＫＢＰ１２をこれらのサンプルに４時間４℃において添加することにより、ＲｙＲ１への結合を許容した。沈殿物と上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥによりサイズ分画して、ＦＫＢＰ１２に関してイムノブロットした。
【００５２】
筋肉の機能の測定
ひらめ筋を水浴バス中で重力変換器（force transducer）に付着させ（attached）、５％のＣＯ２／９５％のＯ２で泡立たせた２ｍＭのＣａ２＋を含むクレブスヘンゼライトで潅流した。筋肉を６０分間休ませ、次に、単一のパルスにより１０秒間隔で刺激した。痙攣の力、痙攣の収縮の時間、及び半弛緩時間を測定した。刺激は、１−３０Ｖにおいて１Ｈｚにおいてであった。５０Ｈｚと６００ｍｓの刺激頻度及び強縮性時間（titanic duration）を用いて、強直性痙攣症の力、半収縮時間、及び半弛緩時間も測定した（Ｌｕｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，２００１）。疲労は、筋肉の強直性痙攣を２秒ごとに導入し、力が最大の４０％に下がるための時間を測定することにより、生じさせた。
【００５３】
単一チャネルの記録
対照又はＨＦの骨格筋からのＳＲ小胞、又は組換え体ＷＴ又は変異体ＲｙＲ１をトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞からの小胞を、平坦な脂質２層に取り込ませ、そしてＲｙＲ１の単一チャネル記録を記載された通りに実施した（Ｂｒｉｌｌａｎｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｇａｂｕｒｊａｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２００１）。ＷＴ ＲｙＲ１を含むマイクロソームを上で記載されたとおりにＰＫＡでリン酸化した。小胞をｃｉｓチェンバーに加え、そして３：１のホスファチジルエタノールアミン／ホスファチジルセリンからなる平坦脂質２層に融合するように誘導した（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）。２層のカップは、０．１５ｍｍの開口を有するポリスチレンから作成した。ｃｉｓチェンバーに添加されたＫＣｌにより融合を促進させた。単一Ｃａ２＋−放出チャネルの取り込みの後に、ｃｉｓチェンバーをｃｉｓ溶液で潅流することにより、ＫＣｌ勾配を消去した。
【００５４】
チャネルの分析のために使用された溶液は、以下のとおりであった：ｔｒａｎｓ溶液、２５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，５３ｍＭ Ｃａ（ＯＨ）２，５０ｍＭ ＫＣｌ，ｐＨ＝７．３５；ｃｉｓ溶液、２５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ，５０ｍＭ ＫＣｌ，１ｍＭ ＥＧＴＡ，０．５ｍＭ ＣａＣｌ２，ｐＨ＝７．３５。ｃｉｓコンパートメント中の遊離の［Ｃａ２＋］は、Ｃｈｅｌａｔｏｒソフトウエアを用いて計算した（Ｓｃｈｏｅｎｍａｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。ｔｒａｎｓチェンバーは、Ａｘｏｎ２００増幅器（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）のヘッドステージへ、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極及びＡｇａｒ／ＫＣｌブリッジを用いて接続した。ｃｉｓチェンバーは、類似の電極によりアースした（held at ground）。単一のチャネルの電流を、１Ｈｚにおいて８−穴Ｂｅｓｓｅｌフィルター（Ｗａｒｎｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）にてフィルターをかけ（filtered）、そして４ｋＨｚにおいてデジタル化した。データはＰｅｎｔｉｕｍコンピューター上でＡｘｏＳｃｏｐｅｌ及びＤｉｇｉｄａｔａ１２００インターフェイス（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて回収した。ｐＣｌａｍｐ６（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を単一チャネルデータを分析するのに用いた。開事象及び開門頻度の開確率及び寿命を、少なくとも２分の連続記録を用いて５０％閾値分析により確認した。各実験の結論において、ライアノジン（５μＭ）をｃｉｓチェンバーに適用することにより、チャネルがライアノジン受容体であったことを確認した。平均開及び閉休止時間分析を、Ｆｅｔｃｈａｎソフトウエア（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて実施し、そして開時間分散を二指数最小二乗回帰分析（two-exponential least-square regression analysis）により記載されたとおりに適合させた（Ｍａｒｘ ｅｔ ａｌ．，２００１）。全てのデータを平均±ＳＥとして表した。不対スチューデンツｔ−試験を実験間の平均値の統計比較の為に使用した。Ｐ＜０．０５の値が有意であると考えた。
【００５５】
イヌの心不全モデル
２８から３０ｋｇの重さの７匹のイヌをこの研究に用いた。早い左心室のペーシング（pacing）を用いることにより、前に記載されたとおりに心不全を誘導した（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。動物たちは、２つのグループのうちの一つに指定された：１）心臓の器具以外は正常（ｎ＝２）、及び２）心不全（ｎ＝５）。グループ２において、ベースラインの測定が得られた後に、早いＬＶペーシングが２１０ｂｐｍにて３週間開始し、外部ペースメーカーにより２４０ｂｐｍにてさらに２週間のペーシングが続いた（ＥＶ４５４３，Ｐａｃｅ Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｉｎｃ）。この早い心臓のペーシングの養生法は、よく特性決定された重度のＨＦを誘導するために以前に使用された（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ，１９９７）。ペースメーカーを止めた後、少なくとも４０分間は血流力学の測定を実施した。早いＬＶペーシングに供された動物における、圧力割る時間のベースラインのＬＶの変化（ｄＰ／ｄｔｍａｘ，ｍｍＨｇ／ｓ）は、３４２０±１０５であり、１７２２．２±３２２に落ち（ｐ＜０．０１）、ＨＦの発症と一致する。
【００５６】
ラットの梗塞モデル
１２匹のＳｐｒａｑｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（３００−４００ｇ）及び２匹のＷｉｓｔａｒラットを、左側の開胸により左の冠動脈を縛った（ligation）。処置の間は、全ての動物に挿管して酸素を供給した（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ，Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）。追加の６匹のＳｐｒａｑｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット及び３匹のＷｉｓｔａｒラットを冠動脈を縛らずにシャム手術した（対照グループ）。１週間後に、全１８匹のラットに超音波心臓検査を行った。冠動脈を縛って６カ月後に、超音波心臓検査を繰り返して、血流力学データを回収した。このため、Ｍｉｌｌａｒカテーテル（Ｍｉｌｌａｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）を右の頸動脈に挿入して、左心室まで進ませた。Ｍｉｌｌａｒの圧力変換カテーテル（Ｍｉｌｌａｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）及びＭａｃＬａｂ（ＡＤ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｇｒａｎｄ Ｊｕｎｃｔｉｏｎ，ＣＯ）を用いて、左心室エンドの拡張期圧、左心室の収縮期圧、平均大動脈圧、心臓レート、心拍及び左心室のｄＰ／ｄｔを測定した。次に、動物を安楽死させて、ひらめ筋を回収した。
【００５７】
Ｃａ２＋−スパーク測定
繊維の束（４−７繊維）を弛緩溶液（ｍＭにて：Ｋ−グルタミン酸 １４０、ＨＥＰＥＳ １０、ＭｇＣｌ２ １０、ＥＧＴＡ ０．１，ｐＨ＝７．０）中で伸筋のディジトラスロンガム（digitorus longum）（ＥＤＬ）筋肉からマニュアルで切り出した。束を記載されたとおりにマウントし（Ｌａｃａｍｐａｇｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８）、そして０．０１％サポニンを含む弛緩溶液に３０−４０秒間浸透させた。当該溶液を、イメージの記録のために内部培地（ｍＭにて：Ｋ−グルタミン酸 １４０、Ｎａ２ＡＴＰ ５，グルコース １０，ＨＥＰＥＳ １０，ＭｇＣｌ２ ４．４，ＥＧＴＡ １．１，ＣａＣｌ２ ０．３，Ｆｌｕｏ−３ ０．０５（ペンタカリウム塩、Ｔｅｆ−ｌａｂｓ，ＵＳＡ），ｐＨ＝７．０）に代えた。
【００５８】
蛍光イメージを、ラインスキャンモードにて操作された（ｘ ｖｓ．ｔ，１．９ｍｓ／ライン）Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ５１０ ＮＬＯ共焦点システム（６３Ｘオイル浸漬、ＮＡ＝１．４，Ｚｅｉｓｓ Ｆｒａｎｃｅ）にて捕捉した。Ｆｌｕｏ−３をアルゴン／クリトンレーザーにより４８８ｎｍにおいて励起し、放射された蛍光を約５２５ｎｍにおいて記録した。ポテンシャルスパークエリアは自動検出アルゴリズムを用いて経験的に同定した（Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。イメージに関する平均Ｆ値は、ポテンシャルスパークエリアを無視して、各空間位置において時間的な（temporal）Ｆを合計して平均化することにより、計算した。このＦ値を、次に、△Ｆ／Ｆイメージピクセル−バイ−ピクセルを創製するために使用した。Ｃａ２＋スパークの選択及び分析は、本質的にはＫｌｅｉｎら（１９９７）により記載されたとおりに実施した。個々のＣａ２＋スパークの空間−時間的特性の決定は、Ｃａ２＋スパークのピーク振幅において中央に置かれた（centered）スパークの空間的（ｘ）及び時間的（ｔ）特性の上でなされた。△Ｆ／Ｆ振幅並びに時間的パラメーター、立ち上がりの時間（ピークの△Ｆ／Ｆ，ＲＴの１０から９０％）、及び時間（半最大ピーク振幅における全時間、ＦＤＨＭ）は、時間的プロフィールに由来した。Ｃａ２＋スパークの振幅（半最大ピーク振幅における全振幅、ＦＷＨＭ）は、空間的プロフィールから決定した。２つのグループの間の集団パラメーターの統計的比較は、非パラメーターＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ試験を用いて実施した。
【００５９】
細胞をトランスフェクトする方法
ライアノジン受容体が発現される細胞を得るためにライアノジン受容体をコードする核酸で細胞をトランスフェクトする方法は、当業界で知られている（例えば、Ｂｒｉｌｌａｎｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４を参照）。非筋肉細胞においては、ＲｙＲ１受容体を内部原形質中で発現させる。当該細胞は、ＲｙＲ１受容体とベータアドレナリン性受容体の両方が発現される細胞を得るために、ベータアドレナリン受容体をコードする核酸で、追加にトランスフェクトしてよい。そのようなトランスフェクトされた細胞は、受容体を結合する化合物又はそのような細胞内で機能性応答を活性化するか又は活性化を阻害する化合物を得るために化合物を試験して化合物ライブラリーをスクリーンするために使用してもよく、よって、生体内でそうするのが有望である。
【００６０】
異種発現される蛋白質を研究するために、広いバライエティの宿主細胞を使用することができる。これらの細胞は、限定ではないが、哺乳類細胞系、例えばＣＯＳ−７，チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ），ＬＭ（ｔｋ−），ＨＥＫ２９３；昆虫細胞系、例えばＳｆ９，Ｓｆ２１；両生類細胞系、例えばアフリカツメガエル卵母細胞；雑多な酵母株；雑多な細菌細胞株；及びその他を含む。これらの細胞各々の培養条件は、特別であり、当業界ではよく知られている。
【００６１】
研究される蛋白質をコードする核酸は、様々な哺乳類、昆虫、両生類、酵母、細菌及び他の細胞系の中で、いくつかのトランスフェクション方法により一時的に発現させることができ、限定ではないが、リン酸カルシウム媒介性、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性；リポソーム−媒介性、ウイルス媒介性、エレクトロポレーション媒介性、及びマイクロインジェクション送達を含む。これらの方法の各々は、ＤＮＡ、細胞系、及び後で用いられるアッセイの種類に依存して、雑多な実験パラメーターの最適化を必要とするかもしれない。
【００６２】
異種ＤＮＡは、宿主細胞へ安定に取り込むことができ、細胞が外来蛋白質を永久に発現するよう誘導する。ＤＮＡの細胞への送達の方法は、一時的発現のための上記の方法と類似するが、標的化された宿主細胞に薬剤耐性を付与するためには補助的な遺伝子の同時トランスフェクションを必要とする。結果として起こる薬剤耐性は、ＤＮＡを受け取った細胞を選択して保持するように活用され得る。耐性遺伝子の分類は、限定ではないが、ネオマイシン、カナマイシン、及びハイグロマイシンを含むものが利用可能である。
【００６３】
結合アッセイ
結合アッセイを実施するための方法は、当業界でよく知られている。標識された化合物を、完全細胞、又は筋形質網状構造又は細胞質網状構造を含み、ＲｙＲ１受容体を発現する細胞抽出物に接触させる。筋形質網状構造又は細胞質網状構造を含む細胞抽出物を製造する方法は当業界で知られている（例えば、Ｋａｆｔａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。上記化合物が放射性アイソトープ、例えば３Ｈ，１４Ｃ，１２５Ｉ，３５Ｓ，３２Ｐ，３３Ｐで標識されたなら、結合した化合物は、液体シンチレーションカウンティング、シンチレーション近接、又は放射性アイソトープの検出のための他のあらゆる方法を用いて検出してよい。化合物を蛍光化合物で標識するなら、結合した標識化合物は、限定ではないが、蛍光強度、時間解析された蛍光、蛍光分極化（polarization）、蛍光転移（transfer）、又は蛍光相関分光学のような方法により測定してよい。この様式において、受容体に結合する化合物は、それらが標識化合物の受容体への結合を阻害するために同定してよい。
【００６４】
欠陥のある骨格筋機能及び心臓疾患を治療するための化合物のアッセイ
ＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化は、ＲｙＲ１チャネルの活性を増加させ、チャネルの所定の活性化剤に関して細胞の細胞質へのカルシウムのより多い放出をもたらす。ＲｙＲ１のＰＫＡ活性化をブロックする化合物は、ＲｙＲ１チャネルの活性化を低下させ、細胞へのカルシウムのより少ない放出をもたらすと期待されるはずである。ＦＫＢＰ１２．６結合部位においてＲｙＲ１チャネルに結合するが、チャネルがＰＫＡによりリン酸化されたときに当該チャネルをはずさない（not come off）化合物も、ＰＫＡリン酸化又はＲｙＲ１チャネルを活性化する他の誘因に応答してチャネルの活性化を低下させるとも予測される。そのような化合物は、細胞へのより少ないカルシウムの放出をももたらす。
【００６５】
欠陥のある骨格筋機能を治療するのに有効かもしれない化合物の一つのアッセイは、カルシウム感受性蛍光染料（例えば、Ｆｌｕｏ−３，Ｆｕｒａ−２）を用いて、ＲｙＲ１チャネルにより、細胞へのカルシウムの放出を測定することを含む。当該アッセイは、蛍光染料を細胞に負荷し、そしてＲｙＲ１受容体により細胞を刺激し、そして細胞に添加された化合物がカルシウム依存性蛍光シグナルを低下させるか否かを測定することを含む（Ｂｒｉｌｌａｎｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｇｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｊａｙａｒａｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。一つのＲｙＲ１活性化剤はカフェインであり、細胞に添加することができる。カルシウムが細胞の細胞質に放出された場合、カルシウム感受性染料により結合されて、次に、蛍光シグナルを放射する。カルシウム依存性蛍光シグナルは、Ｂｒｉｌｌａｎｔｅｓら、１９９４、Ｇｉｌｌｏら、１９９３；及びＪａｙａｒａｍａｎら、１９９６に記載されたとおりに、光電子倍増管により監視されて、適切なソフトウエアにより分析される。このアッセイは、複数ウエルの皿を用いて多数の化合物をスクリーンするために容易に自動化できる。当該アッセイは、異種発現系、例えば、細菌、酵母、昆虫、Ｓｆ９，ＨＥＫ２９３，ＣＨＯ，ＣＯＳ−７，ＬＭ（ｔｋ−），マウス胚性繊維芽ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、又はヒーラ細胞内で組換え体ＲｙＲ１チャネルを発現させることを含む（Ｂｒｉｌｌａｎｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。非筋肉細胞において、ＲｙＲ１受容体は小胞体（endoplasmic reticulum）上で発現される。ＲｙＲ１チャネルが活性化されたら、カルシウムが内部原形質から細胞の細胞質に放出される。ＲｙＲ１受容体はベータアドレナリン性受容体と同時発現させることができた。これは、ベータアドレナリン性受容体アゴニストの添加に応答してＲｙＲ１受容体の活性化に対する化合物の評価を可能にする。
【００６６】
別のアッセイは、ＲｙＲ１チャネルのＰＫＡリン酸化をブロックするためにデザインされた化合物の効果を決定するために使用できるＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化のレベルを測定することを含む。このアッセイは、心不全が早い心臓ペーシングにより誘導された動物モデルとの関連において使用することができる。当該アッセイは、ＲｙＲ１チャネルに特異的な抗体（抗ＲｙＲ１抗体）の使用に基づく。このアッセイのためには、ＲｙＲ１チャネル蛋白質を抗ＲｙＲ１抗体により免疫沈殿させ、次に、ＰＫＡ及び［γ−３２Ｐ］−アデノシン３リン酸（ＡＴＰ）により逆リン酸化する（back-phosphorylated）。ＲｙＲ１受容体蛋白質に転移した放射性３２Ｐレベルの量をホスホロイメジャーを用いて測定することができる。別のバージョンのアッセイにおいて、抗体は、ＲｙＲ１受容体のリン酸化された形態に特異的であって、その場合には逆リン酸化は必要ない。
【００６７】
ＲｙＲ１受容体チャネル機能のための他のアッセイは、ＦＫＢＰ１２．６結合蛋白質とＲｙＲ２受容体の結合の程度、ＲｙＲ１受容体チャネルの亜伝導性状態、ＲｙＲ１受容体チャネルの活性化のためのＣａ２＋感度、又はＲｙＲ１受容体チャネルの開確率（Ｐｏ）を測定することを含む。
【００６８】
ＦＫ５０６とラパマイシンの両者はＦＫＢＰ１２をＲｙＲ１から解離させる。一つのアッセイはカラムに結合するものを探す化合物のライブラリーをスクリーンするためのＦＫ５０６−セファロース又はラパマイシン−セファロースカラムの使用を含む。結合は、結合バッファーによりカラムを洗浄し、高塩濃度のバッファーにより溶出することにより、見積もることができる。カラムに結合する化合物は、それらが骨格筋ライアノジン受容体（骨格筋膜調製物中）に結合して、チャネルに結合したＦＫＢＰ１２を置き換える能力に関して試験することができる。この競合アッセイは、チャネルを化合物とインキュベートし、そして次に遠心分離し、そして沈殿物対上清の免役ブロッティングを行うことを含む。沈殿物に結合してＦＫＢＰ１２とコンピートオフする化合物は、上清中でＦＫＢＰ１２の検出をもたらすはずである。これは、９６ウエルのプレートをドットブロット装置と共に用い、そして抗−ＦＫＢＰ１２抗体によりイムノブロッティングを行うことによりアッセイできた。
【００６９】
これらのアッセイを用いて同定される化合物は、カルシウム感受性蛍光染料（例えば、ｆｌｕｏ−３又はｆｕｒａ−２）により負荷された細胞における、イソプロテレノール誘導性細胞内カルシウム放出を阻害するそれらの能力に関して試験することができた。
【００７０】
ＦＫＢＰ１２のＲｙＲ１への結合を安定化させる化合物は、例えば９６ウエルの皿の中で抗−ＦＫＢＰ１２抗体を用いてＦＫＢＰ１２の上清への放出に関してアッセイする高処理量ＥＬＩＳＡ、次にｃＡＭＰ及びＡＴＰによるＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化を用いて同定することができた。ＦＫＢＰ１２の上清への放出を阻害する化合物は、新規な治療剤に関してリード化合物の候補になるはずであり、そしてＨＦの動物モデルにおいて後で試験することができる。
【００７１】
結果
ＲｙＲ１中のＳｅｒ２８４３のＰＫＡリン酸化はＦＫＢＰ１２結合を制御してチャネルを活性化する
ＲｙＲ１チャネルが如何にしてＰＫＡリン酸化により制御されるかを理解するため、チャネル上のＰＫＡリン酸化の部位を部位特異的変異導入により最初に決定し、次に、この部位のＰＫＡリン酸化のＲｙＲ１マクロ分子シグナリング複合体の組成物に対する効果を試験した（Ｍａｒｘ ｅｔ ａｌ．，２００１）。アラニン（ＲｙＲ１−Ｓ２８４３Ａ）及びアスパラギン酸（ＲｙＲ１−Ｓ２８４３Ｄ）置換を、ＲｙＲ１上のユニークなＰＫＡリン酸化部位としてＳｅｒ２８４３を同定するのに使用した（図１Ａ及びＢ）。ＲｙＲ１−２８４３ＡとＲｙＲ１−Ｓ２８４３Ｄは、をＨＥＫ２９３細胞中で野生型（ＷＴ）ＲｙＲ１と同じ効率にて発現された（図１Ａ）。ＲｙＲ１に結合するＦＫＢＰ１２は、記載されたとおりに（Ｇａｂｕｒｊａｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２００１）、共沈殿により評価した（図１Ｃ）。ＦＫＢＰ１２は、ＲｙＲ１に結合したときにのみ沈殿物中でイムノブロットにより検出され、さもなくば、ＦＫＢＰ１２は上清中で検出された。Ｓｅｒ２８４３（ＲｙＲ２上のＰＫＡリン酸化部位、Ｓｅｒ２８０９に相同（Ｍａｒｘ ｅｔ ａｌ．，２０００））におけるＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化は、ＷＴ ＲｙＲ１からのＦＫＢＰ１２の解離をもたらしたが、変異体ＲｙＲ１−Ｓ２８４３Ａからの解離はもたらさず、ＰＫＡリン酸化できなかった（図１Ｃ）。変異体ＲｙＲ１−Ｓ２８４３Ａに結合したが変異体ＲｙＲ１−Ｓ２８４３ＤにはしなかったＦＫＢＰ１２は、構成的にＰＫＡリン酸化されたＲｙＲ１を模倣する。これらのデータは、Ｓｅｒ２８４３におけるＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化がＦＫＢＰ１２のＲｙＲ１チャネルへの結合を制御することを確証する。
【００７２】
ＰＫＡとＰＰ１は、以前に、チャネル上の高度に保存されたロイシン／イソロイシンジッパーに結合する標的化蛋白質によりＲｙＲ１を標的とすることが示された（Ｍａｒｘ ｅｔ ａｌ．，２００１）。ＲｙＲ１に結合したＰＫＡは、ｃＡＭＰにより活性化され（１０μＭ）、ＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化を誘導した（図１Ｄ）。ＲｙＲ１に結合したＰＰ１は、プロタミンにより活性化され（１ｍｇ／ｍｌ）、ＲｙＲ１の脱リン酸化をもたらした（図１Ｄ）。即ち、ＲｙＲ１マクロ分子複合体中のＰＫＡとＰＰ１は、外因性のキナーゼ又はホスファターゼの添加なしにチャネルのリン酸化／脱リン酸化を制御できる。
【００７３】
ＲｙＲ１マクロ分子複合体中のＰＫＡの活性化の、ＦＫＢＰ１２のＲｙＲ１への結合に対する効果は、記載されたとおりに（Ｇａｂｕｒｊａｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２００１）、共沈殿により評価した（図１Ｅ）。ｃＡＭＰ誘導されたＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化はＲｙＲ１からのＦＫＢＰ１２解離を誘導した（図１Ｅ）。過剰なＦＫＢＰ１２はＰＫＡリン酸化されたＲｙＲ１には結合できなかった。結合したＰＫＡのＰＫＩ５−２４（５００ｎＭ）によるｃＡＭＰ誘導による活性化を阻害することは、ＲｙＲ１からのＦＫＢＰ１２のリン酸化−誘導性解離をブロックした（図１Ｅ）。ＰＫＡリン酸化されたＲｙＲ１をアルカリホスファターゼ（１ユニット／ｍｇのＳＲ蛋白質）によるか又は結合した保存された（ＰＰ１）をプロタミン（１ｍｇ／ｍｌ）により活性化することにより脱リン酸化した後に、ＦＫＢＰ１２が再度チャネルに結合できた（図１Ｅ）。即ち、ＰＫＡリン酸化はＦＫＢＰ１２をＲｙＲ１から解離させ、そしてＦＫＢＰ１２はＰＫＡ−リン酸化されたＲｙＲ１に再び結合できない。
【００７４】
ＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化の機能上の効果を決定するため、ＲｙＲ１組換え体チャネルをＨＥＫ２９３細胞内で発現させて、平坦な脂質２層内で再構成することにより、それらの単一チャネル特性を試験した（図２Ａ）。野生型（ＷＴ）ＲｙＲ１チャネル（図２Ａ）を、１）ＰＫＡリン酸化できない変異体チャネル（ＲｙＲ１−Ｓ２８４３Ａ，図２Ｂ）；２）ＰＫＡリン酸化されたＷＴのＲｙＲ１（図２Ｃ）；３）構成的にＰＫＡリン酸化されたＲｙＲ１を模倣する変異体ＲｙＲ１（ＲｙＲ１−Ｓ２８４２Ｄ，図２Ｄ）；及び４）ＦＫＢＰ１２を結合できない変異体ＲｙＲ１（ＲｙＲ１−Ｓ２４６１Ｉ，図２２Ｅ）と比較した。ＷＴのＲｙＲ１は、前に報告されたとおり（Ｂｒｉｌｌａｎｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｇａｂｕｒｊａｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２００１）、天然のＲｙＲ１と同じ単一チャネル特性を呈した（図２Ａ、表Ｉ）。変異体ＲｙＲ１−Ｓ２８４３Ａも、天然ＲｙＲ１と同じ単一シグナル特性を呈した（図２Ｂ）。
【００７５】
【表１】
【００７６】
ＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化は、ＷＴのＲｙＲ１を活性化した（Ｐｏを増加させ、そして開及び閉休止時間を減少させた、図２Ｃ及び表Ｉ）。ＷＴのＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化は、逆リン酸化により確認された（図１Ｂ）。ＲｙＲ１−Ｓ２８４３ＡチャネルはＰＫＡにより活性化されなかった（表Ｉ）ことから、ＷＴのＲｙＲ１のＰＫＡによる活性化はＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化のためであったことが示唆されたが、ＷＴと変異体のＲｙＲ１−Ｓ２８４３Ａのチャネルの唯一の違いは、後者がＳｅｒ２８４３Ａｌａ置換のためにＰＫＡによりリン酸化され得ないことだからである。ＲｙＲ１−Ｓ２８４３Ｄは、ＰＫＡリン酸化されたＷＴのＲｙＲ１と同じ単一チャネル特性を呈した（図２Ｄ及び表Ｉ）ことから、ＰＫＡリン酸化のＲｙＲ１に対する効果はＳｅｒ２８４３のリン酸化によったという追加の証拠を提供する。即ち、ＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化は、１５０ｎＭ ｃｉｓ（細胞質）［Ｃａ２＋］ｃｉｓにおいてチャネルを有力に活性化する。ＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化がチャネルからのＦＫＢＰ１２の解離を誘導するため（図１Ｃ）、ＰＫＡリン酸化によるＲｙＲ１の活性化がチャネルからのＦＫＢＰ１２の解離によるか否かを決定することが必要であった。この疑問に近づくため、ＦＫＢＰ１２結合部位内の変異のためにＦＫＢＰ１２を結合できないＲｙＲ１−Ｖ２４６１Ｉの単一チャネル特性（Ｇａｂｕｒｊａｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２００１）を、ＰＫＡリン酸化されたＲｙＲ１の特性と比較した。ＲｙＲ１−Ｖ２４６１Ｉは、ＷＴのＲｙＲ１及びＲｙＲ１−Ｓ２８４３Ｄ変異体のチャネルと同じ単一チャネル特性の変化を呈し、非リン酸化ＷＴチャネルに比較して、Ｐｏを増加させ、そして開及び閉休止時間を減少させた（図２Ｅ及び表Ｉ）。
【００７７】
ＦＫＢＰ１２．６は、ＦＫＢＰ１２に相同であって、ＲｙＲ１−Ｖ２４６１Ｉに結合できるが、ＦＫＢＰ１２はできない（Ｇａｂｕｒｊａｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２００１）。ＲｙＲ１−Ｖ２４６１Ｉチャネルの変更された単一チャネル特性、増加したＰｏ及び減少した開及び閉休止時間が、Ｆ１２．６のチャネルへの結合により正常に回復できることは前に示された（Ｇａｂｕｒｊａｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２００１）。即ち、ＲｙＲ１−Ｖ２４６１Ｉ変異体チャネルにより呈された、増加したＰｏ及び減少した開及び閉休止時間は、チャネルの構造又は機能に対する変異の幾つかの定義されていない効果によるより、むしろ、ＦＫＢＰ１２の結合の欠如によるのが明確である。総合すると、これらのデータは、Ｓｅｒ２８４３におけるＰＫＡリン酸化によるＲｙＲ１の活性化がチャネルからのＦＫＢＰ１２の解離によることが明確であることを示す。
【００７８】
ＨＦ骨格筋におけるＲｙＲ１のＰＫＡ高リン酸化及び欠損機能
ＨＦの動物モデルからの骨格筋からのＲｙＲ１チャネル（慢性高アドレナリン条件）がＰＫＡ高リン酸化されたか、そして変更された単一チャネル特性を呈したか否かを決定するため、ペーシング誘導されたＨＦのイヌモデルからの後肢骨格筋からのＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化を、ＲｙＲ１の免疫沈殿、続く逆リン酸化を用いて、前に記載されたとおりに（Ｍａｒｘ ｅｔ ａｌ．，２０００）、評価した（図３Ａ）。このイヌのＨＦモデルにおいて、低下した左心室（ＬＶ）の機能は、血流力学評価により記録され、ＬＶ ｄＰ／ｄｔｍａｘが対照において３４２０±１０５であり、そしてＨＦにおいて１７２２．２±３２２であったことを示す（ｍｍＨｇ／ｓ，ｎ＝４正常、ｎ＝５ＨＦ，Ｐ＜０．０１）。ＨＦ骨格筋からのＲｙＲ１は、正常骨格筋からのＲｙＲ１に比較して、ＰＫＡ高リン酸化されていた（図３Ａ）。ＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化の化学量論は：ＲｙＲ１チャネルのモルあたり、正常０．４＋０．２、ＨＦ３．６＋０．８モルリン酸転移であった（ｎ＝４正常、ｎ＝５ ＨＦ，Ｐ＜０．０１）。即ち、各ＲｙＲ１上の平均３／４−４／４のＰＫＡリン酸化部位上において、チャネルはＨＦ骨格筋内でリン酸化され、一方チャネルあたり＜１／４部位が正常な対照骨格筋からのＲｙＲ１内ではＰＫＡリン酸化されていた。
【００７９】
心臓のＲｙＲ２のＰＫＡ高リン酸化がチャネルマクロ分子複合体からのＦＫＢＰ１２．６の消耗を誘導して、弱った心臓において変更された関門特性を有するチャネルをもたらすことは、前に示された（Ｍａｒｘ ｅｔ ａｌ．，２０００）。本出願においては、骨格筋ＲｙＲ１マクロ分子複合体中のＦＫＢＰ１２のレベルを、正常な動物とＣＨＦの動物に関して、以前に記載されたとおりに（Ｍａｒｘ ｅｔ ａｌ．，２０００）、共免疫沈殿を用いて測定した。正常な骨格筋からのＲｙＲ１チャネルをインビトロＰＫＡリン酸化に供した場合に観察されるＲｙＲ１複合体からのＦＫＢＰ１２の消耗の程度と比較して（図３Ｂ）、対照に比較して、ＨＦの骨格筋からのＲｙＲ１複合体中のＦＫＢＰ１２の量には顕著な低下があった（約３倍）（ｎ＝２対照、ｎ＝５ ＨＦ，Ｐ＜０．０１，図３Ｂ）。細胞のＦＫＢＰ１２の全量（図６Ｃ）、並びにＰＫＡの触媒サブユニットのレベル、及びＲｙＲ１マクロ分子複合体中のホスファターゼＰＰ１は、変化しなかった（図３Ｃ）。即ち、ＲｙＲ１のＰＫＡ高リン酸化は、ＨＦの骨格筋中のチャネルマクロ分子複合体からのＦＫＢＰ１２の消耗に関連しており、弱った心臓におけるＲｙＲ２からのＦＫＢＰ１２．６の高リン酸化誘導性消耗に類似している（Ｍａｒｘ ｅｔ ａｌ．，２０００）。
【００８０】
骨格筋中のＲｙＲ１マクロ分子複合体からのＦＫＢＰ１２のＰＫＡ高リン酸化及び消耗の機能上の因果関係を決定するため、正常骨格筋及びＨＦ骨格筋から単離されたＲｙＲ１の単一チャネル特性を比較した。ＨＦのＲｙＲ１チャネルは、１００ｎＭのｃｉｓ（細胞質）［Ｃａ２＋］において増加した開確率（Ｐｏ）を有した（図４Ａ及びＢ、表ＩＩ）。正常なＲｙＲ１チャネルは、１００ｎＭ［Ｃａ２＋］ｃｉｓにおいては活性ではない（Ｌａｉ ｅｔ ａｌ．，１９８９；Ｌａｖｅｒ ａｎｄ Ｌａｍｂ，１９９８；Ｍｅｉｓｓｎｅｒ，１９９４）。ＨＦのＲｙＲ１チャネルは、正常な骨格筋からのＲｙＲ１チャネルにおいて稀に観察される亜伝導性状態又は部分的開口（Ｂｒｉｌｌａｎｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４）を呈した（例えば、図４Ｂ及び表ＩＩ）。ＲｙＲ１チャネル間の共役された開門は、チャネルのクラスターが同時に開いて閉じる機構であり（Ｍａｒｘ ｅｔ ａｌ．，１９９８）、対照からのＲｙＲ１チャネルに比較して、ＨＦの骨格筋チャネルにおいて顕著に低下した（表ＩＩ）。平均の開及び閉休止時間は、対照に比較して、ＨＦのＲｙＲ１において顕著に低下した（例えば、図４Ａ及びＢ，及び表ＩＩ）。サブマイクロモラー［Ｃａ２＋］ｃｉｓにおいて増加したＰｏ、低下した開及び閉休止時間、亜伝導性開口、及び減少した共役開門は、ＦＫＢＰ１２無しで発現された組換え体ＲｙＲ１の特徴であり（Ｂｒｉｌｌａｎｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｍａｒｘ ｅｔ ａｌ．，１９９８）、そしてＦＫＢＰ１２除去後の天然ＦＫＢＰ１２の特徴である（Ａｈｅｒｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｍａｒｘ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。さらに、ＲｙＲ１単一チャネル特性における類似の欠損は、ＦＫＢＰ１２の空の（null）マウスからの骨格筋から単離されたＲｙＲ１において観察されたが、これらの動物は、発生する欠陥のために子宮内で（in utero）死ぬか、又は生後すぐに死に、骨格筋機能を評価できなかった（Ｓｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。
【００８１】
【表２】
【００８２】
ＨＦ骨格筋における変更されたＳＲ Ｃａ２＋放出
ＰＫＡにより高リン酸化されて且つＦＫＢＰ１２により消耗されたＲｙＲ１の単一チャネル特性の変化が、ＨＦ骨格筋の損なわれた機能に帰し得た変更されたＳＲ Ｃａ２＋放出に関連するか否かを決定するため、Ｃａ２＋スパークを記録した。個々のＲｙＲ１のクラスターからのＳＲ Ｃａ２＋放出を表すＣａ２＋スパークを、シャム手術された対照とＨＦのラットの骨格筋からの筋管において試験した（図５Ａ）。ＳＲ Ｃａ２＋放出（スパーク）の振幅は、ＰＫＡ高リン酸化されたＲｙＲ１を伴うＨＦ筋肉からの骨格筋管において顕著に減少した。対照に比較して、［Ｃａ２＋］の蛍光測定値は、ＨＦにおいて、△Ｆ／Ｆ＝０．９２±０．０２（シャム手術された対照）から０．７６±０．０３に減少した（ｎ＝６，Ｐ＜０．０１，図５Ｂ）。ＨＦ骨格筋のＣａ２＋スパークも、遅い上昇時間（対照、３．９８±０．１４ 対 ＨＦ，４．６６±０．２１ｍｓ，Ｐ＜０．０５）及び延期された半存続期間（half duration）（対照、１２．９１±０．５０ 対 ＨＦ，１５．４６±０．６９ｍｓ，Ｐ＜０．０５）を呈した（図５Ｂ）。最後に、Ｃａ２＋スパークの空間的な広がりは、ＨＦ骨格筋において大きかった（１．６５±０．０３ 対 １．９５±０．０９，Ｐ＜０．０５，図５Ｂ）。これらのデータは、ＰＫＡにより高リン酸化されたＲｙＲ１が、ゆっくりとしたＳＲ Ｃａ２＋放出の事象に関連しており、遅いピーク振幅を有し、そして対照よりも長く続くことを示す。
【００８３】
ＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化は心不全骨格筋における欠陥のある筋肉の機能に相関する
心不全において起こる骨格筋の変化の生理学的な結果を評価するため、及びＲｙＲ１のＰＫＡ高リン酸化及びＲｙＲ１複合体からのＦＫＢＰ１２の消耗が、損なわれた骨格筋機能に関連するか否かを決定するため、齧歯類の後−心筋梗塞（post-myocardial infraction）ＨＦモデルを用いた。このモデルにおいて、ＨＦは左の腹側の下行冠動脈（anterior descending coronary artery）を縛った後の心筋梗塞から６カ月にわたり発症する。ＨＦは、断片の短縮化を、ＨＦにおいては４１．４±４．７％（ｎ＝１０）に減少させ、対して、シャム手術された対照においては５１．６±５．３％（ｎ＝６，Ｐ＜０．０１）に減少させ；梗塞の収縮の断片面積は、ＨＦにおいて３９．１±５．１％に減少したのに対して、対照では６８．７±２．４％に減少した（Ｐ＜０．０１ ＨＦ 対 シャム手術された対照）。血流力学測定値もＨＦを確認した（シャム手術された対照に関してＬＶＥＤＰ＝９．１６±５．１９ｍｍＨｇ（ｎ＝６） 対 ＨＦに関して１８．２８±８．５６ｍｍＨｇ（ｎ＝１０），Ｐ＜０．０５；対照に関してｄＰ／ｄｔ＝５４８３±１７０４ｍｍＨｇ／ｓ 対 ＨＦに関して２９２２±７８４ｍｍＨｇ／ｓ，Ｐ＜０．０１）。
【００８４】
ＲｙＲ１チャネルは、シャム手術された対照に比較して、ラットＨＦ骨格筋において（ｎ＝１０）ＰＫＡにより高リン酸化されており（図６Ａ，ｎ＝６，Ｐ＜０．０１）、そしてＲｙＲ１に結合したＦＫＢＰ１２の量はＨＦ骨格筋において５８％減少した（図６Ｂ，Ｐ＜０．０１）が、ＦＫＢＰ１２の全細胞レベルはＨＦ骨格筋中で低下しなかった（図６Ｃ）。さらに、ＲｙＲ２チャネルのＰＫＡ高リン酸化に関して有力な説明を提供する、ＰＰ１とＰＰ２ＡのレベルがＨＦにおいて低下した心筋ＲｙＲ２マクロ分子複合体に対して（Ｍａｒｘ ｅｔ ａｌ．，２０００）、ＲｙＲ１複合体中のＰＰ１の量はＨＦ骨格筋において低下しなかった（図６Ｂ）。最近の研究は、ホスホジエステラーゼ、ＰＤＥ４Ｄ３、及び標的化蛋白質筋肉Ａ−キナーゼアンカーリング蛋白質（ｍＡＫＡＰ）が、ＰＫＡと共にシグナリング複合体を形成することを報告した（Ｄｏｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，２００１）。ＰＫＡはＲｙＲ１マクロ分子複合体の一部であり（Ｍａｒｘ ｅｔ ａｌ．，２００１）、そしてＰＫＡとｍＡＫＡＰはＲｙＲ２複合体の成分であることが（Ｍａｒｘ ｅｔ ａｌ．，２０００）、以前に示された。ｍＡＫＡＰとＰＤＥ４Ｄ３がＲｙＲ１マクロ分子複合体中に存在したか否かを決定するため、抗−ＲｙＲ−５０２９を用いた免疫沈殿、続くｍＡＫＡＰとＰＤＥ４Ｄ３を検出する抗体によるイムノブロッティング（図６Ｄ）を使用した。ｍＡＫＡＰとＰＤＥ４Ｄ３の両方がＲｙＲ１により免疫沈殿し、よって、ＲｙＲ１マクロ分子複合体の一部であるらしいことがわかった（図６Ｂ）。さらに、対照に比較して（ｎ＝４）、ＲｙＲ１複合体中のＲｙＲ１の量は、ＨＦ骨格筋において顕著に減少した（ｎ＝４，Ｐ＜０．０５，図６Ｂ）。ＲｙＲ１チャネル複合体において低下したＰＤＥ４Ｄ３のレベルは、ｃＡＭＰの局所的な増加及び増加したＰＫＡ活性に帰し得たことから、ＨＦ骨格筋中のＲｙＲ１のＰＫＡによる高リン酸化を説明するかもしれない（図３Ａ及び６Ａ）。
【００８５】
ひらめ筋機能を、張力変換器を用いて試験した。ＨＦのひらめ筋は、シャム対照の筋肉よりも、早く疲労して、よりゆっくりと強直性痙攣に達した（図６Ｅ及びＦ）。疲労時間は、対照のひらめ筋に関して２８０±５９秒で、対するにＨＦのひらめ筋に関しては２１６±２６秒であった（ｎ＝５ シャム手術された対照、ｎ＝８ ＨＦ，Ｐ＜０．０５，図６Ｅ）。強直性痙攣症の半分収縮時間は、対照のひらめ筋に関して１６４．６±７０．１ｍｓで、対するにＨＦのひらめ筋に関しては２９７．５±７４．１ｍｓであった（ｎ＝５ シャム手術された対照、ｎ＝８ ＨＦ，Ｐ＜０．０１，図６Ｆ）。ＨＦ骨格筋中の遅延した強直性痙攣症と加速した疲労を含む欠陥のある収縮機能の証明は、骨格筋（Ｌｕｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｌｕｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｐｅｒｅａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．，１９９３）と横隔膜筋（ＭａｃＦａｒｌａｎｅ ｅｔ ａｌ．，２０００）の両方における他の発見と一致する。さらに、ＲｙＲ１の高リン酸化の程度は初期の骨格筋疲労に顕著に相関した（ｒ＝０．８８，図６Ｇ）。即ち、ＲｙＲ１のＰＫＡ高リン酸化とＦＫＢＰ１２のＲｙＲ１マクロ分子複合体からの消耗は、変更された骨格筋機能に関連する。
【００８６】
考察
ライアノジン受容体（ＲｙＲｓ）は多くの種類の細胞においてシグナリングに関与するが、これらの細胞内Ｃａ２＋放出チャネルの機能を変調する生理学上の機構は、よく理解されていない。ＲｙＲｓを含む最大に理解されている系の一つは、筋肉の収縮を活性化させるＳＲ Ｃａ２＋放出にＲｙＲｓが必要な横紋筋中のＥＣ共役である。しかしながら、骨格筋及び心筋においてさえ、交感神経系（ＳＮＳ）のような系統的シグナルがＲｙＲ機能を変調させる機構は、まだ明らかにされていない。
【００８７】
「ファイトオアフライト」応答は、ＳＮＳの活性化を含む古典的なストレス経路であり、筋肉のβ−アドレナリン刺激を導く。ＳＮＳ刺激の間、カテコールアミンがβ−アドレナリン受容体に結合し、Ｇ−蛋白質によりアデニリルシクラーゼを活性化し、そしてＰＫＡを活性化する第２メッセンジャーｃＡＭＰの細胞内レベルを増加させる。本研究は、ＰＫＡリン酸化がＳｅｒ２８４３上でそれらをリン酸化することによりＲｙＲ１チャネルを活性化することを示す。このＰＫＡリン酸化部位は部位特異的変異導入を用いて確認され（図１Ａ及びＢ）、ホスホペプチドマッピングにより同じ部位が同定された以前の研究に一致する（Ｓｕｋｏ ｅｔ ａｌ．，１９９３）。ＲｙＲ１のＳｅｒ２８４３上のＰＫＡリン酸化の同定は、ＰＫＡリン酸化がＲｙＲ１チャネルを活性化する機構を釣り上げるために必要とされる変異ＲｙＲ１の生成を可能にさせた。
【００８８】
このアプローチは、ＰＫＡリン酸化がＳｅｒ２８４３をリン酸化することによりＲｙＲ１を活性化して、チャネルからのＦＫＢＰ１２の解離を引き起こすことを明らかにした（図１）。ＦＫＢＰ１２の解離は、チャネル開口の阻害を救済するが、これはＦＫＢＰ１２が結合したときに閉状態にあるＲｙＲ１チャネルの安定化による。
【００８９】
本研究からのデータは、骨格筋のＥＣ共役のコンテクストにおいてＦＫＢＰ１２がＲｙＲ１の機能を変調させる機構に関して新規な洞察を提供する。ＲｙＲ１チャネル複合体中のＦＫＢＰ１２の役割に関するオリジナルの研究は、この１２ｋＤａの蛋白質がＲｙＲ１チャネルを安定化するが、おそらくは、チャネルへの結合及びＥＣ共役の間の正常な生理学上の機能に必要とされる好ましいコンフォメーションにそれを安定化させるためであることを示唆した（Ｂｒｉｌｌａｎｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｊａｙａｒａｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。本明細書において記載された結果（図１及び２、及び表Ｉ）は、今、チャネル複合体からＦＫＢＰ１２を解離させることにより、ＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化がチャネルを活性化することを示す。この発見は、ＦＫＢＰ１２の一つの生理学上の役割が、チャネルの閉状態を安定化することであり、天然のチャネル阻害剤として本質的に作用することを示唆する。ＦＫＢＰ１２をチャネル複合体から解放することにより、ＰＫＡリン酸化がこの阻害を救済し、そしてチャネルを活性化する。即ち、ＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化は、ＥＣ共役のコンテクストにおいてＲｙＲ１の活性を増加させるための生理学上の機構を提供する。データはＦＫＢＰ１２がＲｙＲ１の開状態及び閉状態の両方を安定化することを示すが、ＲｙＲ１チャネルは骨格筋中ではＶＧＣＣとの相互作用により開くので（Ａｈｅｒｎ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｒｉｏｓ ａｎｄ Ｂｒｕｍ，１９８７；Ｒｉｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ａｎｄ Ｃｈａｎｄｌｅｒ，１９７３；Ｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．，１９９０）、骨格筋中のＲｙＲ１マクロ分子複合体中のＦＫＢＰ１２に関しての、より重要な役割は、チャネルの閉状態を安定化することであるらしい（即ち、筋肉が弛緩して骨格筋においてＳＲ Ｃａ２＋のリークを妨害するときに閉じたＲｙＲ１チャネルを、ＦＫＢＰ１２が助け続けるのかもしれない）。
【００９０】
以前の報告に一致した（Ｈａｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｓｏｎｎｌｅｉｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７）、ＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化による活性化の生理学上の結果を決定するため、正常な骨格筋の機能をＨＦの動物のモデルの機能と比較した。ＨＦは公知の高アドレナリン状態であり（Ｃｈｉｄｓｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９６２），そしてＲｙＲ１がＨＦ骨格筋中でＰＫＡ−高リン酸化されているという発見（図３）は、骨格筋機能におけるＲｙＲ１のこの形の制御の役割を探索するために、ＰＫＡ−リン酸化されたＲｙＲ１を伴うか又は伴わずに筋肉の機能を比較するモデルを提供した。
【００９１】
ＰＫＡリン酸化されたＲｙＲ１の増加した活性は、ＨＦ骨格筋中のＳＲ Ｃａ２＋放出の変更に関連した。骨格筋において、Ｃａ２＋スパークは、ＲｙＲ１チャネルのクラスターから起こった基本のＣａ２＋放出事象を表す（Ｇｏｎｚａｌｅｚ ｅｔ ａｌ．，２０００）。成体哺乳類骨格筋からのＣａ２＋スパークは、技術的に記録することが難しいが（Ｓｈｉｒｏｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，１９９８）、それらは示された（Ｋｉｒｓｈ ｅｔ ａｌ．，２００１）。本研究において、Ｃａ２＋スパークは、減少した振幅、遅れた上昇時間及び延期された継続時間をＨＦ筋肉において呈した（図５）。ＦＫＢＰ１２のＲｙＲ１からの消耗はＳＲ Ｃａ２＋リークの可能性を増加させると予測されるが、何故なら、これらのチャネルは閉状態において脱安定化されるはずだからである。ＳＲ Ｃａ２＋リークはＳＲ Ｃａ２＋を消耗し、そしてＨＦ骨格筋において観察されたＳＲ Ｃａ２＋事象の振幅を減少させることに寄与する。Ｃａ２＋スパークを記録するため、筋肉繊維をサポニンで皮をむき、遊離の［Ｃａ２＋］を１３０ｎＭにてクランプした。全部のスパーク頻度が１３０ｎＭの休止［Ｃａ２＋］において極めて低かったため、これらの条件はＨＦ骨格筋においてスパーク頻度が顕著に増加しなかった理由を説明するのに適当である。一部には低（休止）レベルにおいて遊離のＣａ２＋をクランプするために低スパーク率と結合した（combined with）ＳＲ Ｃａ２＋ ＡＴＰａｓｅ活性がＳＲを補充したため、１３０ｎＭにおいて遊離のＣａ２＋をクランプすることが、４−クロロ−ｍ−クレゾール（カフェイン類似体）の急の応用（acute application）を用いて測定されたＨＦ骨格筋内のＳＲ Ｃａ２＋含有量の顕著な低下がなかった理由を説明できた。ＲｙＲ１複合体からのＦＫＢＰ１２の消耗を伴うはずのＲｙＲ１共役された関門の減少（Ｍａｒｘ ｅｔ ａｌ．，１９９８）は、ＨＦ骨格筋内のＳＲ Ｃａ２＋放出事象の延期された時間経過に寄与し得た。ＲｙＲ１チャネル間の共役された関門は、ＳＲ膜内で互いに物理的に接触するチャネルのグループを、単一Ｃａ２＋放出ユニットとして開閉可能にする機構であるかもしれない（Ｍａｒｘ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。ＲｙＲ１に結合するＦＫＢＰ１２は、共役された関門に必要である（Ｍａｒｘ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。ＦＫＢＰ１２の消耗による共役された関門の減少は、それらが完全な共役された関門を伴うはずであるように、それらは全てが一緒に開かないはずであるから、クラスター中のいくつかのＲｙＲ１チャネルの開口を遅延させるかもしれない。いくつかのチャネルのこの遅延された開口は、ＳＲ Ｃａ２＋放出の遅くなった速度に寄与し得た。同様に、減少した共役関門の条件下では、いくつかのＲｙＲ１チャネルの閉鎖が遅れるかもしれず、そしてこれがＳＲ Ｃａ２＋放出遷移の延期された減衰に寄与し得た。ＨＦ骨格筋内のＲｙＲ１のＰＫＡ高リン酸化のこれらの作用を描写するモデルを図７に示す。
【００９２】
ＰＫＡ高リン酸化されたＲｙＲ１を含むＨＦ骨格筋は延期された強直性痙攣症の半分収縮時間を呈した（図６Ｆ）。延期された強直性痙攣の半分時間（同じ繰り返しの刺激により強直性痙攣症を達成するには長い時間がかかることを意味する）は、ＦＫＢＰ１２の消耗のために起こるかもしれない、損なわれたＥＣ共役を反映し得た（Ｌａｍｂ ａｎｄ Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ，１９９６）が、正常な筋肉のＥＣ共役におけるＦＫＢＰ１２の特定の役割は明らかにされていない。ＨＦ骨格筋の初期の疲労（図６Ｅを参照）は、ＲｙＲ１の増加したＰＫＡリン酸化に強く相関する（図６Ｇ）ことから、これらの２つの発見の間の機能的な関連を示唆する。骨格筋細胞ではＣａ２＋の出入がほとんど無いので、それらはＥＣ共役に必要なＣａ２＋のほとんどをリサイクルするに違いない。骨格筋内のＦＫＢＰ１２を消耗するＰＫＡ高リン酸化されたＲｙＲ１のために、増加したＳＲ Ｃａ２＋リークを補うための一つのコストは、ＨＦ骨格筋内で観察される初期の疲労に寄与し得た増加したエネルギー消費であるかもしれない（Ｃａ２＋−ＡＴＰａｓｅによるＳＲへのＣａ２＋の戻りを供給するためにＡＴＰが必要である；図７Ａを参照）。
【００９３】
ＨＦにおける主な骨格筋の欠陥の重要性は、患者の疲労が心臓の機能とうまく相関しないという事実により理解される（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｃｏａｔｓ，１９９７）。さらに、骨格筋の問題は、アンギオテンシン変換酵素阻害剤の投与（Ｄｒｅｘｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９）及び心臓移植（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９）の両方が心臓の出力及び骨格筋の血流を増加させるが骨格筋の機能を改善しないため、損なわれた骨格筋の血流の単なる問題ではないらしい。多くの研究が、増加した乳酸塩（lactate）の生産及び代謝回転（Ｋａｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３）、より迅速なクレアチンリン酸の分解、及び減少したクレアチンリン酸の再合成を含む、ＨＦにおける骨格筋エネルギーの代謝の変化を記録した（Ｍａｎｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。
【００９４】
ＳＲ Ｃａ２＋放出チャネル機能及びＣａ２＋シグナリングの欠陥は、一方で、ＨＦにおいて損なわれた骨格筋機能の基礎となり得た機構をまさに提供する。心筋及び骨格筋の両方においてＥＣ共役筋疾患を推進する根源的病理は、おそらく、このチャネルの心臓の形態及び骨格の形態の両方のＰＫＡ高リン酸化を通して欠陥のあるＳＲ Ｃａ２＋放出チャネル（ＲｙＲ１及びＲｙＲ２）機能を導く慢性の高アドレナリン状態である。ＨＦにおいて慢性の高アドレナリン状態の逆の役割に関するさらなるサポートは、ＨＦにおいて心臓機能を改善するβ−アドレナリン受容体ブロッカーがＲｙＲ２のＰＫＡ高リン酸化を逆転させてチャネル機能を標準化させることを示す最近の研究に由来する（Ｄｏｉ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｒｅｉｋｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００１）。β−ブロッカーは心筋の機能を改善するが（例えば、改善された放出（ejection）フラクション）、それらはＨＦの患者において改善された運動の忍耐力に関してささやかな利益を有するか又は全く有さないことが示された（Ｇｕｌｌｅｓｔａｄ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｋｕｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。しかしながら、上でほのめかしたとおり、運動の忍耐力は、骨格筋機能により単に決定されず、そして代謝の準備（reserve）及び筋肉の強さを含むらしい。β−ブロッカーは骨格筋エネルギー代謝に対して複雑な効果を有する；例えば、プロプラノールはホスホリラーゼキナーゼ及びグリコーゲン合成の両方のβアドレナリン誘導性活性化を阻害する（Ｄｉｅｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９８０）。即ち、改善された骨格筋機能に関するβ−遮断の有益な効果は運動の忍耐力におけるほんの最小の改善をもたらすエネルギー代謝に対する逆作用によりバランスを保たれていた。
【００９５】
以前の研究から（Ｍａｒｘ ｅｔ ａｌ．，２０００）、この出願において開示されたデータは、ＨＦが、心筋と骨格筋の両横紋筋形態に影響する一般化されたＥＣ共役筋疾患として特徴があるらしいことを示す。この一般的ＥＣ共役筋疾患を引き起こす根源的な病理は、ＨＦの間に起こる慢性高アドレナリン状態らしい。
【００９６】
文献
【００９７】
【表３】
【００９８】
【表４】
【００９９】
【表５】
【０１００】
【表６】
【０１０１】
【表７】
【０１０２】
【表８】
【０１０３】
【表９】
【０１０４】
【表１０】
【０１０５】
【表１１】
【０１０６】
【表１２】
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１Ａ】図１Ａ．ＲｙＲ１へのＦＫＢＰ１２の結合はＲｙＲ１−Ｓｅｒ２８４３のＰＫＡリン酸化により調節される。（Ａ）ＷＴのＲｙＲ１と変異体（ＲｙＲ１−Ｓ２８４３Ａ及びＲｙＲ１−Ｓ２８４３Ｄ）のＲｙＲ１が等量、ＨＥＫ２９３細胞内で発現されたことを示すイムノブロット。
【図１Ｂ】図１Ｂ．ＲｙＲ１へのＦＫＢＰ１２の結合はＲｙＲ１−Ｓｅｒ２８４３のＰＫＡリン酸化により調節される。（Ｂ）［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰを用いたＰＫＡリン酸化を示すオートラジオグラフであり、ＰＫＡの阻害剤であるＰＫＩ５−２４を用いることによりリン酸化反応の特異性を示した。アラニン置換を用いることにより、ＲｙＲ１上の唯一のＰＫＡリン酸化部位としてＳｅｒ２８４３を同定した。
【図１Ｃ】図１Ｃ．ＲｙＲ１へのＦＫＢＰ１２の結合はＲｙＲ１−Ｓｅｒ２８４３のＰＫＡリン酸化により調節される。（Ｃ）ＷＴ及び変異体のＲｙＲ１へのＦＫＢＰ１２の結合を示すイムノブロットを、遠心分離（ＲｙＲ１によるＦＫＢＰ１２共沈殿）及びＦＫＢＰ１２イムノブロッティングにより評価した。ＦＫＢＰ１２は、ＰＫＡ−リン酸化ＲｙＲ１を構成的に模倣するＲｙＲ１−Ｓ２８４３Ｄには結合しない。
【図１Ｄ】図１Ｄ．ＲｙＲ１へのＦＫＢＰ１２の結合はＲｙＲ１−Ｓｅｒ２８４３のＰＫＡリン酸化により調節される。（Ｄ）ＲｙＲ１に結合したＰＫＡのｃＡＭＰによる活性化がＰＫＡ阻害剤のＰＫＩ５−２４により阻害されるチャネルのリン酸化を誘導することを示すオートラジオグラフ。チャネルに結合したＰＰ１のプロタミンによる活性化はオカダ酸（okadaic acid）（ＯＡ）によりブロックされるチャネルの脱リン酸化を誘導する。
【図１Ｅ】図１Ｅ．ＲｙＲ１へのＦＫＢＰ１２の結合はＲｙＲ１−Ｓｅｒ２８４３のＰＫＡリン酸化により調節される。（Ｅ）ＦＫＢＰ１２イムノブロットは、ＲｙＲ１のｃＡＭＰにより誘導されたＰＫＡリン酸化がＦＫＢＰ１２を上記チャネル複合体から解離させることを示す；ＦＫＢＰ１２は、ＰＫＡリン酸化されたチャネルには結合できないが、アルカリホスファターゼによる（又は結合したホスファターゼのプロタミンによる活性化による）チャネルの脱リン酸化は、共遠心分離により評価したところ、チャネルへのＦＫＢＰ１２の、のちの再結合を許容する。
【図２Ａ】図２Ａ．Ｓｅｒ２８４３のＰＫＡリン酸化はＲｙＲ１チャネルを活性化する。（Ａ）ＷＴのＲｙＲ１の代表的単一チャネルトレーシング。平坦な脂質２層におけるＲｙＲ１単一チャネルレコーディングは、１ｍＭのＡＴＰの存在下で１５０ｎＭの［Ｃａ２＋］ｃｉｓにおいてチャネルの活性を示し、チャネルを活性化する。レコーディングは０ｍＶにおいてであり、チャネルの閉じた状態が示される（「Ｃ」）；チャネルの開口は上向きである（upwards）。全ての点の振幅（amplitude）のヒストグラムを示す。開確率（Ｐｏ）、平均閉時間（Ｔｃ）及び開（Ｔｏ）休止時間を各チャネルトレーシングの上に示す。
【図２Ｂ】図２Ｂ．Ｓｅｒ２８４３のＰＫＡリン酸化はＲｙＲ１チャネルを活性化する。（Ｂ）ＲｙＲ１−Ｓ２８４３Ａ。平坦な脂質２層におけるＲｙＲ１単一チャネルレコーディングは、１ｍＭのＡＴＰの存在下で１５０ｎＭの［Ｃａ２＋］ｃｉｓにおいてチャネルの活性を示し、チャネルを活性化する。レコーディングは０ｍＶにおいてであり、チャネルの閉じた状態が示される（「Ｃ」）；チャネルの開口は上向きである（upwards）。全ての点の振幅（amplitude）のヒストグラムを示す。開確率（Ｐｏ）、平均閉時間（Ｔｃ）及び開（Ｔｏ）休止時間を各チャネルトレーシングの上に示す。
【図２Ｃ】図２Ｃ．Ｓｅｒ２８４３のＰＫＡリン酸化はＲｙＲ１チャネルを活性化する。（Ｃ）ＰＫＡ−リン酸化されたＷＴ ＲｙＲ１。平坦な脂質２層におけるＲｙＲ１単一チャネルレコーディングは、１ｍＭのＡＴＰの存在下で１５０ｎＭの［Ｃａ２＋］ｃｉｓにおいてチャネルの活性を示し、チャネルを活性化する。レコーディングは０ｍＶにおいてであり、チャネルの閉じた状態が示される（「Ｃ」）；チャネルの開口は上向きである（upwards）。全ての点の振幅（amplitude）のヒストグラムを示す。開確率（Ｐｏ）、平均閉時間（Ｔｃ）及び開（Ｔｏ）休止時間を各チャネルトレーシングの上に示す。
【図２Ｄ】図２Ｄ．Ｓｅｒ２８４３のＰＫＡリン酸化はＲｙＲ１チャネルを活性化する。（Ｄ）ＲｙＲ１−Ｓ２８４３Ｄ。平坦な脂質２層におけるＲｙＲ１単一チャネルレコーディングは、１ｍＭのＡＴＰの存在下で１５０ｎＭの［Ｃａ２＋］ｃｉｓにおいてチャネルの活性を示し、チャネルを活性化する。レコーディングは０ｍＶにおいてであり、チャネルの閉じた状態が示される（「Ｃ」）；チャネルの開口は上向きである（upwards）。全ての点の振幅（amplitude）のヒストグラムを示す。開確率（Ｐｏ）、平均閉時間（Ｔｃ）及び開（Ｔｏ）休止時間を各チャネルトレーシングの上に示す。
【図２Ｅ】（Ｅ）ＲｙＲ１−Ｖ２４６１Ｉ（この変異体ＲｙＲ１はＦＫＢＰ１２．６には結合するがＦＫＢＰ１２にはしないことが以前に示された（Ｇａｂｕｒｊａｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２００１））。平坦な脂質２層におけるＲｙＲ１単一チャネルレコーディングは、１ｍＭのＡＴＰの存在下で１５０ｎＭの［Ｃａ２＋］ｃｉｓにおいてチャネルの活性を示し、チャネルを活性化する。レコーディングは０ｍＶにおいてであり、チャネルの閉じた状態が示される（「Ｃ」）；チャネルの開口は上向きである（upwards）。全ての点の振幅（amplitude）のヒストグラムを示す。開確率（Ｐｏ）、平均閉時間（Ｔｃ）及び開（Ｔｏ）休止時間を各チャネルトレーシングの上に示す。
【図３Ａ】図３Ａ．ＨＦ骨格筋におけるＲｙＲ１のＰＫＡ高リン酸化。（Ａ）ＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化を、対照の正常なイヌ及びペーシングにより誘導されたＨＦのイヌからの骨格筋ホモジェネートにおいて測定した。イムノブロッティングにより示されるとおり、均等な量のＲｙＲ１蛋白質を各キナージング反応において用いた。正常（ｎ＝２）及びＨＦ（ｎ＝５）動物からの骨格筋ホモジェネートからのＲｙＲ１の相対的ＰＫＡリン酸化は、特異的リン酸化シグナルをＲｙＲ１蛋白質の量で割ることにより決定した（イムノブロッティング及びデンシトメトリーにより測定）。結果はＰＫＡ−依存性［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰシグナル±平均の標準偏差の逆数として表す。
【図３Ｂ】図３Ｂ．ＨＦ骨格筋におけるＲｙＲ１のＰＫＡ高リン酸化。（Ｂ）ＲｙＲ１へ結合したＦＫＢＰ１２の量は、共免疫沈殿、続くイムノブロッティングにより評価した。
【図３Ｃ】図３Ｃ．ＨＦ骨格筋におけるＲｙＲ１のＰＫＡ高リン酸化。（Ｃ）代表的なイムノブロットは、ＲｙＲ１マクロ分子複合体：ＲｙＲ１，ＰＫＡ，ＰＰ１，及びＦＫＢＰ１２の成分に関して、正常（ｎ＝２）及びＨＦ動物（ｎ＝５）を用いて示される。蛋白質のレベルをイムノブロットのデンシトメトリーを用いて定量した。結果を、各免疫沈殿においてＲｙＲ１の量に関して補正されたＲｙＲ１マクロ分子複合体の成分の各々の相対量として表す。
【図４Ａ】図４Ａ．ＨＦの間の骨格筋から単離されたＲｙＲ１の欠陥性単一チャネルの特性。（Ａ）正常なイヌの骨格筋からのＲｙＲ１チャネルからの単一チャネルトレース及び対応する電流の振幅のヒストグラム。Ａ及びＢにおいて、上部のトレーシングは１００ｎＭ［Ｃａ２＋］ｃｉｓにおいて記録され、そして底部のトレーシングは、開確率（Ｐｏ）を増加させるために１ｍＭのＡＴＰによりＲｙＲ１チャネルを活性化した後に記録された。開（Ｔｏ）及び閉（Ｔｃ）休止時間及びＰｏを、代表的なトレーシングの上に各条件に関して示す。Ａ及びＢにおいて、底部トレーシングは延長された時間スケールを示す。ＰＫＡ−高リン酸化されたチャネルの副伝導性状態に関する電流レベル（０，１，２，３，４ｐＡ）をＢにおいて底部トレーシングにて示すことを示す線。各チャネルに関して全ての点の振幅のヒストグラムを示す。レコーディングは０ｍＶであり、そしてチャネルの閉じた状態を示す（「Ｃ」）；チャネルの開口は上向き偏差（deflections）である。
【図４Ｂ】図４Ｂ．ＨＦの間の骨格筋から単離されたＲｙＲ１の欠陥性単一チャネルの特性。（Ｂ）ＨＦのイヌの骨格筋からのＲｙＲ１チャネルからの単一チャネルトレース及び対応する電流の振幅のヒストグラム。Ａ及びＢにおいて、上部のトレーシングは１００ｎＭ［Ｃａ２＋］ｃｉｓにおいて記録され、そして底部のトレーシングは、開確率（Ｐｏ）を増加させるために１ｍＭのＡＴＰによりＲｙＲ１チャネルを活性化した後に記録された。開（Ｔｏ）及び閉（Ｔｃ）休止時間及びＰｏを、代表的なトレーシングの上に各条件に関して示す。Ａ及びＢにおいて、底部トレーシングは延長された時間スケールを示す。ＰＫＡ−高リン酸化されたチャネルの副伝導性状態に関する電流レベル（０，１，２，３，４ｐＡ）をＢにおいて底部トレーシングにて示すことを示す線。各チャネルに関して全ての点の振幅のヒストグラムを示す。レコーディングは０ｍＶであり、そしてチャネルの閉じた状態を示す（「Ｃ」）；チャネルの開口は上向き偏差（deflections）である。
【図５Ａ】図５Ａ．ＨＦ骨格筋における局所Ｃａ２＋シグナリングの欠損。（Ａ）シャム及び心筋梗塞後の治療（ＰＭＩ）ＨＦラットの筋肉内で回収されたＣａ２＋スパークの代表的な例の△Ｆ／Ｆラインスキャンイメージ。各イメージの上部おいては、対応するＣａ２＋スパーク時間経過を表す。各ヒストグラムの上部において、ボックスチャートは２５、５０及び７５百分順位を示す；水平線は１から９９％の範囲の分布を示す。シャム：白のシンボル（ｎ＝１３７．３動物）、ＰＭＩ：グレーのシンボル（ｎ＝８２．２動物）。（＊Ｐ＜０．０５）。ＦＤＨＭ，１／２ピーク振幅における全継続時間。ＦＷＨＭ，１／２ピーク振幅における全振幅。
【図５Ｂ】図５Ｂ．ＨＦ骨格筋における局所Ｃａ２＋シグナリングの欠損。（Ｂ）記録されたＣａ２＋スパークの集団の時空的な特性の相対的分布。各ヒストグラムの上部において、ボックスチャートは２５、５０及び７５百分順位を示す；水平線は１から９９％の範囲の分布を示す。シャム：白のシンボル（ｎ＝１３７．３動物）、ＰＭＩ：グレーのシンボル（ｎ＝８２．２動物）。（＊Ｐ＜０．０５）。ＦＤＨＭ，１／２ピーク振幅における全継続時間。ＦＷＨＭ，１／２ピーク振幅における全振幅。
【図６Ａ】図６Ａ．ＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化及び筋肉収縮。（Ａ）シャム手術された（対照）ラット及びＨＦラットの骨格筋からのＲｙＲ１のＰＫＡ逆−リン酸化（back-phosphorylation）を示すオートラジオグラム。棒グラフは、ＲｙＲ１の相対的ＰＫＡリン酸化を示す（記載されたとおり逆−リン酸化の逆数として表される）（Ｍａｒｘ ｅｔ ａｌ．，２０００）。
【図６Ｂ】図６Ｂ．ＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化及び筋肉収縮。（Ｂ）対照及びＨＦの骨格筋からの抗−ＲｙＲ１抗体により免疫沈殿されたＲｙＲ１，ｍＡＫＡＰ，ＰＤＥ４Ｄ３，ＰＰ１及びＦＫＢＰ１２の相対量を示すイムノブロット及び棒グラフ。
【図６Ｃ】図６Ｃ．ＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化及び筋肉収縮。（Ｃ）対照及びＨＦイヌ及びラット骨格筋中の等量の全細胞ＦＫＢＰ１２を示すイムノブロット。
【図６Ｄ】図６Ｄ．ＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化及び筋肉収縮。（Ｄ）１００μｇのヒト骨格筋ＳＲにおいて検出されたＲｙＲ１，ｍＡＫＡＰ及びＰＤＥ４Ｄ３を示すイムノブロット；陰性対照は対応する抗原ペプチドにより予め吸着された抗体を用いる。
【図６Ｅ】図６Ｅ．ＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化及び筋肉収縮。（Ｅ）ＨＦ骨格筋は対照より早く疲労する。各ラット（ｎ＝５対照、ｎ＝８ＨＦ）からの対側性ひらめ筋を組織のバスにマウントすることにより、収縮機能を評価した（筋肉機能プロトコルに関する材料と方法を参照）。代表的な疲労時間トレーシングを、対照とＨＦの骨格筋に関して示す。棒グラフは、平均（±ＳＤ）時間対疲労を示す、＊Ｐ＜０．０５。
【図６Ｆ】図６Ｆ．ＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化及び筋肉収縮。（Ｆ）ＨＦ骨格筋は、対照よりもゆっくりと強直性痙攣症を達する。代表的な強直性痙攣症トレーシングを、対照とＨＦの骨格筋に関して示す。強直性痙攣症は、材料と方法に記載されるとおり、高頻度の刺激により誘導された。棒グラフは、強直性痙攣症の１／２収縮時間を示す、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図６Ｇ】図６Ｇ．ＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化及び筋肉収縮。（Ｇ）シャム及びＨＦの動物のラット骨格筋の時間対疲労及びＲｙＲ１ ＰＫＡリン酸化（＝０．８８）の間の相関。筋肉の機能及びＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化を、各動物からの対側性ひらめ筋を用いて評価した。
【図７Ａ】図７Ａ．心不全の骨格筋におけるＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化の効果のモデル。（Ａ）骨格筋プラズマ膜（横断細管（transverse tubule））の脱分極は電圧関門Ｃａ２＋チャネル（ＤＨＰＲ）を活性化して、次に、ＤＨＰＲの細胞質ドメインとＲｙＲ１の細胞質ドメインの間の相互作用を通してＲｙＲ１を活性化する。ＲｙＲ１の活性化は、チャネルを開き、そしてＳＲ貯蔵所からＣａ２＋を筋形質へ放出させて、筋肉収縮をもたらす。筋肉の弛緩は、Ｃａ２＋−ＡＴＰａｓｅ，ＳＥＲＣＡにより細胞質からＳＲに戻るＣａ２＋の取り込みにより測定される。このモデルにおいては、ＲｙＲ１が、４つのＲｙＲ１及び４つのＦＫＢＰ１２（示された）、並びに標的化蛋白質（ＴＰ）によりＲｙＲ１に結合したＰＫＡとＰＰ１を含むマクロ分子複合体である（各々の４つの内の一つのみを示す）（Ｍａｒｘ ｅｔ ａｌ．，２００１）。
【図７Ｂ】図７Ｂ．心不全の骨格筋におけるＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化の効果のモデル。（Ｂ）正常なＲｙＲ１は、チャネルが低いμＭ［Ｃａ２＋］ｃｙｔにおいて活性化されてｍＭ［Ｃａ２＋］ｃｙｔにおいて阻害されるように、増加する［Ｃａ２＋］ｃｙｔに対してベル型の応答を呈する。
【図７Ｃ】図７Ｃ．心不全の骨格筋におけるＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化の効果のモデル。（Ｃ）ＲｙＲ１はＳＲ膜上でクラスター中に存在し、ＦＫＢＰ１２（小さなグレーの円）がチャネルに結合することを必要とする共役された関門（coupled gating）と呼ばれる機構によりチャネルのグループとして開いて閉じる（Ｍａｒｘ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。
【図７Ｄ】図７Ｄ．心不全の骨格筋におけるＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化の効果のモデル。（Ｄ）Ｃａ２＋スパークはＲｙＲ１チャネルのグループの活性化のために、本質的なＳＲ Ｃａ２＋放出事象を表す（Ｇｏｎｚａｌｅｚ ｅｔ ａｌ．，２０００）。
【図７Ｅ】図７Ｅ．心不全の骨格筋におけるＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化の効果のモデル。（Ｅ）強直性痙攣症（骨格筋収縮）は、複数の動作のポテンシャルが合計されて、筋形質のＣａ２＋の延期された上昇が連続する収縮を活性化する。
【図７Ｆ】図７Ｆ．心不全の骨格筋におけるＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化の効果のモデル。（Ｆ）β−アドレナリン受容体の活性化は、ｃＡＭＰレベルの上昇を導き、今度はＰＫＡを活性化して、ＲｙＲ１をリン酸化する。心不全におけるＲｙＲ１のＰＫＡ高リン酸化は、各チャネルからのＦＫＢＰ１２のほとんどの解離をもたらす。
【図７Ｇ】図７Ｇ．心不全の骨格筋におけるＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化の効果のモデル。（Ｇ）ＦＫＢＰ１２（小さなグレーの円）のＲｙＲ１からの解離は、チャネル間の共役された関門の損失を引き起こす（Ｍａｒｘ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。これは、確率論的な関門をもたらすが、解剖学上はたった５０％のＲｙＲ１チャネルしかＤＨＰＲと関連しないので（５０％のＲｙＲ１はＤＨＰＲとの相互作用により活性化できない）、ＲｙＲ１チャネルのグループ中で同時にチャネルのフラクションのみが開くことを意味する（Ｆｒａｎｚｉｎｉ−Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ ａｎｄ Ｋｉｓｈ，１９９５）。
【図７Ｈ】図７Ｈ．心不全の骨格筋におけるＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化の効果のモデル。（Ｈ）心不全の骨格筋からのＣａ２＋スパークは、遅延した上昇運動、低下した振幅、及び延期された減衰を呈し、全てはＲｙＲ１チャネルのグループの間の共役された関門の損失に一致する。実線は、心不全骨格筋におけるＣａ２＋シグナルであり、破線は正常な骨格筋におけるＣａ２＋シグナルを表す。
【図７Ｉ】図７Ｉ．心不全の骨格筋におけるＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化の効果のモデル。（Ｉ）強直性痙攣症は、筋形質Ｃａ２＋の保持された上昇をもたらすＣａ２＋放出事象の加重（summation）を引き起こす繰り返された高頻度の作動ポテンシャルの結果として、骨格筋において発症する。
【図７Ｊ】図７Ｊ．心不全の骨格筋におけるＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化の効果のモデル。（Ｊ）Ｃａ２＋の放出の上昇時間の遅延化及び減少した振幅は、心不全の骨格筋において観察された強直性痙攣症の発症における遅延と一致する。実線は、心不全の骨格筋における強直性痙攣症の発症であり、破線は正常な強直性痙攣症を表す。
【発明の開示】
【０００１】
この出願は、２００３年３月７日に出願された仮出願米国連続番号６０／４５２，６６４の優先権を主張し、その内容を引用により本明細書に取り込む。
本明細書に開示された発明は、ナショナルインスティチュートオブヘルス、ヘルスアンドヒューマンサービスの米国部門の交付番号Ｒ０１ ＨＬ６１５０３−０５のもとで、政府の支持においてなされた。従って、米国政府はこの発明に一定の権利を有する。
【０００２】
発明の背景
この出願を通して、様々な刊行物が著者及び発行年により括弧で引用される。これらの引用に関する全ての引用文献は、特許請求の範囲の前に明細書の終わりに見いだされる。これらの刊行物全体の開示は、引用によりこの出願に取り込まれ、この発明が属する分野の事情を、より完全に記載する。
【０００３】
横紋筋の収縮は、カルシウム（Ｃａ２＋）が、細管から、筋小胞体（ＳＲ）として知られる筋肉細胞へ放出される時に開始する。ＳＲ上のライアノジン受容体（ＲｙＲ）と呼ばれるカルシウム放出チャネルは、興奮−修飾（ＥＣ）のカップリングに必要とされる。タイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）は心臓に見いだされ、一方、タイプ１のライアノジン受容体（ＲｙＲ１）は骨格筋に見いだされる。ＲｙＲ１受容体は、４つの５６５，０００ドルトンのＲｙＲ１ポリペプチド及び４つの１２，０００ドルトンのＦＫ−５０６結合蛋白質（ＦＫＢＰ１２）からなるテトラマーである。ＦＫＢＰ１２ｓはＲｙＲチャネル機能を安定化させ（Ｂｒｉｌｌａｎｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４）、そして隣のＲｙＲチャネル間のカップリングされた関門（gating）を容易にする調節サブユニットである；後者はＣａ２＋の細胞内保存物を放出する特化されたＳＲセクション内で密集したアレイにパックされて、それにより筋肉の修飾を誘導する。ＦＫＢＰ１２に加えて、ＲｙＲ１マクロ分子複合体もＰＫＡの触媒サブユニットと調節サブユニット、及びホスファターゼＰＰ１を含む（Ｍａｒｘ ｅｔ ａｌ．，２００１）。
【０００４】
一つのＦＫＢＰ１２分子は各ＲｙＲ１サブユニットに結合する。ＦＫＢＰ１２の解離はチャネルの生物物理特性を顕著に変え、亜伝導性（subconductance）状態の出現、及びチャネルの開確率（Ｐｏ）の増加をもたらす（Ｂｒｉｌｌａｎｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｇａｂｕｒｊａｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２００１）。さらに、ＲｙＲ１チャネルからのＥＣ１２の解離は、カップリングされた関門を阻害し、集団としてよりむしろ確率的に関門するチャネルをもたらす（Ｍａｒｘ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。ＲｙＲチャネルのアレイのカップリングされた関門は、筋肉の収縮を調節する有効なＥＣカップリングに重要であると考えられる（Ｍａｒｘ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。ＦＫＢＰｓは、広く発現されて様々な細胞機能の役に立つシス−トランスのペプチジル−プロリルイソメラーゼである（Ｍａｒｋｓ，１９９６）。ＦＫＢＰ１２ｓは、骨格筋型（ＲｙＲ１）（Ｂｒｉｌｌａｎｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｊａｙａｒａｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２）及び心臓型（ＲｙＲ２）（Ｋａｆｔａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６）の筋肉Ｃａ２＋放出チャネル、並びにタイプ１イノシトール１，４，５−３リン酸受容体（ＩＰ３Ｒ１）（Ｃａｍｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７）、及びタイプ１トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦβ）受容体（ＴβＲＩ）（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７）として知られる、関連する細胞内放出チャネルに強く結合して、その機能を調節する。
【０００５】
心不全（ＨＦ）は、世界的に死亡率及び罹患率のトップの原因である。当該疾患は、不可欠な器官の低灌流（hypoperfusion）を導く心臓の収縮機能の累進的低下により特徴付けされる。さらに、中程度の心機能不全（cardiac dysfunction）の多くの患者は、彼らのＨＦの程度のみによっては説明できない運動能力の実質上の欠陥を有する（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｃｏａｔｓ，１９９７；Ｍｉｎｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，１９９１；Ｓｕｌｌｉｖａｎ ａｎｄ Ｈａｗｔｈｏｒｎｅ，１９９５；Ｗｉｌｓｏｎ，１９９５）。これは、根本的な心筋の欠陥に加えて、ＨＦの患者において根本的な骨格筋の欠陥が存在するという仮説を導いてきた（Ｍｉｎｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。
【０００６】
ほとんどのＨＦ患者は、彼らの顕著に低下した運動上の忍耐力のため、生命の質の発達性の劣化を経験する。より重度のＨＦの場合（ニューヨークハートアソシエーションクラスＩＶ）、２年の死亡率が５０％を超える（Ｂｒａｕｎｗａｌｄ，１９９２）。ＨＦの患者及び動物のモデルは、慢性の高アドレナリン作用性刺激を含む不順応性応答により特徴付けされる（Ｂｒｉｓｔｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９８２）。ＨＦにおける慢性アドレナリン作用性刺激の病理上の重要性は、β−アドレナリン刺激及び左心室の心筋壁のストレスを低下させて心室リモデリングを有力に逆転させる治療上の戦略により支持される（Ｂａｒｂｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｂｒｉｓｔｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。
【０００７】
ＨＦの間の慢性のβアドレナリン刺激は、心臓のＲｙＲ２受容体のｃＡＭＰ−依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）の高リン酸化に付随する（Ｍａｒｘ ｅｔ ａｌ．，２０００）。ＰＫＡ−高リン酸化チャネルを通したＳＲのＣａ２＋リークにより明らかにされた、結果としてのＲｙＲ２の欠陥性機能が、ＨＦにおける抑圧された修飾機能及び不整脈発生に対して寄与する因子として提案された（Ｍａｒｘ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｍａｒｘ ｅｔ ａｌ．，２０００）。この仮説に一致して、弱った心臓におけるＲｙＲ２のＰＫＡ高リン酸化が、動物モデルと心臓移植を経験したＨＦ患者の両方において生体内にて証明された（Ａｎｔｏｓ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｍａｒｘ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｏｎｏ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｒｅｉｋｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｓｅｍｓａｒｉａｎ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｙａｎｏ ｅｔ ａｌ．，２０００）。
【０００８】
ＨＦの動物モデルを用いて、加速された疲労の発現を含む抑圧された収縮機能が、骨格筋（Ｌｕｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｐｅｒｒｅａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．，１９９３）と横隔膜筋（ＭａｃＦａｒｌａｎｅ ｅｔ ａｌ．，２０００）の両方において証明された。これらの研究においては、Ｃａ２＋シグナリングの欠損が提案されたが、ＨＦにおける欠損した骨格筋機能の下にある分子機構は今のところ明らかにされていない。
【０００９】
発明の概要
本発明は、タイプ１ライアノジン（ＲｙＲ１）受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離を第１薬剤が阻害するか否かを決定する方法を提供し、（ａ）別々に、（ｉ）ＲｙＲ１受容体を発現する細胞又は（ｉｉ）そのような細胞からの抽出物からの筋形質網状構造又は細胞質網状構造を、（１）上記の第１薬剤とＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離を引き起こすことが知られている第２薬剤の両方と、及び（２）そのような第２薬剤の存在下でＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離に適した条件下で、そのような第２薬剤のみと、接触させ、そして（ｂ）第２薬剤のみの存在下、及び第１と第２薬剤の両方の存在下で、ＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離の程度を測定するが、第１と第２薬剤の両方の存在下でのＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離の程度が第１薬剤のみの存在下でのＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離の程度よりも小さいことが、第１薬剤がＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離の程度を阻害することを示し、それにより、第１薬剤がタイプ１ライアノジン（ＲｙＲ１）受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離の程度を阻害するか否かを示す。
【００１０】
この発明は、ＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離を阻害する薬剤を同定するために、ＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離を阻害することが知られていない多数の薬剤をスクリーニングする方法も提供し、（ａ）（ｉ）ＲｙＲ１受容体を発現する細胞又は（ｉｉ）そのような細胞からの抽出物からの筋形質網状構造又は細胞質網状構造を引き起こすことが知られている多数の薬剤の一つ又は複数と、そのような解離薬剤の存在下でＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離を許容する条件下で接触させ；そして（ｂ）そのような薬剤の不在下でのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離の程度に比較して、多数の薬剤の一つ又は複数の存在下でＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離の程度が低下するか否かを測定し；そして（ｃ）工程（ｂ）において測定された解離の程度が一つより多い薬剤の存在下において低下したなら、別々に、そのような薬剤がＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離の程度を阻害するか否か測定し、それによりそのような多数の薬剤のうちのそのような薬剤がＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離を阻害すると決定する。
【００１１】
発明は、さらに、組成物を製造する方法を提供するが、薬剤を用意し、本発明によるタイプ１ライアノジン（ＲｙＲ１）受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離を当該薬剤が阻害するか否かを決定し、ＲｙＲ１受容体と離して当該薬剤を回収し、そして担体と当該薬剤を混合することを含む。
【００１２】
発明は、さらに、欠陥のある骨格筋機能を有する被験者を治療する方法を提供するが、被験者に、被験者の骨格筋のタイプ１ライアノジン（ＲｙＲ１）受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離を低下させるのに有効な薬剤をある量投与し、それにより被験者の骨格筋の機能を軽減させることを含む。
【００１３】
この発明は、さらに、欠陥のある骨格筋機能を有する被験者を治療する方法を提供するが、被験者に、被験者の骨格筋のタイプ１ライアノジン（ＲｙＲ１）受容体／カルシウム放出チャネルへのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の結合を模倣するのに有効な薬剤をある量投与することによりチャネルの開口の確率を減じ、それにより被験者の骨格筋の機能を軽減させることを含む。
【００１４】
この発明は、さらに、欠陥のある骨格筋機能を有する被験者を治療する方法を提供するが、被験者に、本明細書にて開示された何れかの方法によりタイプ１ライアノジン（ＲｙＲ１）受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離を阻害するために決定された治療上有効な量の薬剤、又はそのような薬剤の構造上及び機能上の類似体又は相同体を投与することを含む。
【００１５】
最後に、この発明は、本明細書にて開示された何れかの方法によりタイプ１ライアノジン（ＲｙＲ１）受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離を阻害するために決定された薬剤の異常性の治療のための使用であって、タイプ１ライアノジン（ＲｙＲ１）受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離を阻害することにより異常性が緩和される使用を提供する。
【００１６】
発明の詳細な説明
定義
以下の定義は、この発明を理解することにおいて助けとなる。
【００１７】
本明細書において使用される「ＲｙＲ１受容体」は、骨格筋の筋小胞体（ＳＲ）上に見いだされるカルシウム（Ｃａ２＋）放出チャネルであるタイプ１ライアノジン受容体を意味する。「ＲｙＲ２」受容体は、心臓の筋小胞体（ＳＲ）上に見いだされるカルシウム（Ｃａ２＋）放出チャネルであるタイプ２ライアノジン受容体を意味する。
【００１８】
「ＦＫＢＰ１２」は、約１２，０００ドルトンの分子量を有するＦＫ−５０６結合蛋白質を意味し、ＲｙＲ１受容体チャネルに結合してその機能を制御する。「ＦＫＢＰ１２．６」は、約１２，０００ドルトンの分子量を有するＦＫ−５０６結合蛋白質を意味し、ＲｙＲ２受容体チャネルに結合してその機能を制御する。
【００１９】
「ＰＫＡ−リン酸化」は、酵素プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）によりリン酸基でヒドロキシル基を置換する反応を意味する。
ＲｙＲ１又はＲｙＲ２受容体の「逆−リン酸化（back-phosphorylation）」は、プロテインキナーゼＡによる受容体のインビトロリン酸化を意味する。
【００２０】
発明の態様
この出願は、ＨＦのイヌ及びラットのモデルからの骨格筋におけるＲｙＲ１チャネルがＰＫＡ−高リン酸化されて、ＦＫＢＰ１２が消耗し、そして増加した活性を呈したことで、上記チャネルが「リーキー」であることを示唆することを開示する。ＲｙＲ１のＰＫＡ高リン酸化は、ＨＦ骨格筋における障害をもったＳＲ Ｃａ２＋放出及び初期の疲労に相関した。これらの発見は、ＳＮＳ刺激に応答してＰＫＡリン酸化によりＲｙＲ１の機能を制御する新規な機構を明らかにする。ＲｙＲ１のＰＫＡ高リン酸化は、ＨＦにおける障害を持つ骨格筋機能に寄与するかもしれず、一般化されたＥＣ共役筋疾患が心不全において役割を担うかもしれないことを示唆する。
【００２１】
特定すれば、本発明は、タイプ１ライアノジン（ＲｙＲ１）受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離を第１の薬剤が阻害するか否かを決定するための方法を提供し、（ａ）別々に、（ｉ）ＲｙＲ１受容体を発現する細胞又は（ｉｉ）そのような細胞からの抽出物からの筋形質網状構造又は細胞質網状構造を、（１）上記の第１薬剤とＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離を引き起こすことが知られている第２薬剤の両方と、及び（２）そのような第２薬剤の存在下でＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離に適した条件下で、そのような第２薬剤のみと、接触させ、そして（ｂ）第２薬剤のみの存在下、及び第１と第２薬剤の両方の存在下で、ＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離の程度を測定するが、第１と第２薬剤の両方の存在下でのＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離の程度が第１薬剤のみの存在下でのＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離の程度よりも小さいことが、第１薬剤がＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離の程度を阻害することを示し、それにより、第１薬剤がタイプ１ライアノジン（ＲｙＲ１）受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離の程度を阻害するか否かを示す。
【００２２】
この発明は、ＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離を阻害する薬剤を同定するために、ＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離を阻害することが知られていない多数の薬剤をスクリーニングする方法も提供し、（ａ）（ｉ）ＲｙＲ１受容体を発現する細胞又は（ｉｉ）そのような細胞からの抽出物からの筋形質網状構造又は細胞質網状構造を引き起こすことが知られている多数の薬剤の一つ又は複数と、そのような解離薬剤の存在下でＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離を許容する条件下で接触させ；（ｂ）そのような薬剤の不在下でのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離の程度に比較して、多数の薬剤の一つ又は複数の存在下でＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離の程度が低下するか否かを測定し；そして（ｃ）工程（ｂ）において測定された解離の程度が一つより多い薬剤の存在下において低下したなら、別々に、そのような薬剤がＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離の程度を阻害するか否か測定し、それによりそのような多数の薬剤のうちのそのような薬剤がＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離を阻害すると決定する。
【００２３】
本明細書に記載された方法の何れかの一つの態様において、ＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離の程度を測定することは、ＲｙＲ１受容体のプロテインキナーゼＡのリン酸化を測定することを含む。一つの態様において、例えば、ＲｙＲ１受容体のプロテインキナーゼＡのリン酸化を測定することは、ＲｙＲ１受容体の、リン酸化された形態には結合するがリン酸化されていない形態には結合しない抗体の結合を検出することを含む。別の態様において、ＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離の程度を測定することは、カルシウム感受性蛍光染料の蛍光を測定することを含む。さらなる態様において、ＲｙＲ１受容体は、ヒトＲｙＲ１受容体である。
【００２４】
本発明の方法の一つの態様においては、細胞を薬剤に接触させ、そしてＲｙＲ１受容体をそのような細胞に対して内因性である核酸から発現させる。別の態様においては、細胞を薬剤と接触させ、そしてＲｙＲ１受容体をそのような細胞にトランスフェクトした核酸から発現させる。さらなる態様においては、細胞が細菌、酵母、昆虫、両生類、植物又は哺乳類細胞である。哺乳類細胞は、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＬＭ（ｔｋ−）細胞、マウス胚性繊維芽ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、マウスＹ１細胞、２９３ヒト胚性腎臓細胞及びヒーラ細胞を含む。昆虫細胞は、例えば、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞及びイラクサギンウワバ（Trichoplusia ni）５Ｂ−４細胞を含む。両生類細胞は、例えば、アフリカツメガエル（Xenopus）卵母細胞及びアフリカツメガエル黒色胞細胞を含む。
【００２５】
別の態様において、細胞は、欠陥を有する心臓を持つ被験者からの骨格筋細胞である。被験者は、例えば、心臓の欠陥が、急速な心臓ペーシング又はヒトにより誘導された動物であり得る。
【００２６】
この発明は、組成物を製造する方法も提供するが、薬剤を用意し、本明細書に記載された方法の何れかによりタイプ１ライアノジン（ＲｙＲ１）受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離を当該薬剤が阻害するか否かを決定し、ＲｙＲ１受容体と離して当該薬剤を回収し、そして担体と当該薬剤を混合することを含む。
【００２７】
この発明は、さらに、欠陥のある骨格筋機能を有する被験者を治療する方法を提供するが、被験者に、被験者の骨格筋のタイプ１ライアノジン（ＲｙＲ１）受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離を低下させるのに有効な薬剤をある量投与し、それにより、被験者の骨格筋の機能を軽減させることを含む。一つの態様において、上記薬剤は、ＪＴＶ５１９，１，４−ベンゾチアゼピン誘導体である（Ｙａｎｏ ｅｔ ａｌ．，２００３）。
【００２８】
この薬剤は、以下に記載される他の本発明の方法及び組成物における使用に関して構想される。別の態様において、上記薬剤は、被験者の骨格筋のタイプ１ライアノジン（ＲｙＲ１）受容体のプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）リン酸化を低下させる。さらなる態様において、上記薬剤は、ベータアドレナリン様ブロッカーではない。
【００２９】
この発明は、さらに、被験者の欠陥のある骨格筋機能を軽減するのに有効なベータアドレナリン様ブロッカーをある量被験者に投与することを含む、欠陥のある骨格筋機能を有する患者を治療する方法を提供する。
【００３０】
一つの態様において、ベータアドレナリン様ブロッカーは、カルベジロール（Ｃｏｒｅｇ（登録商標）、スミスクラインビーチャム）又はメトプロロール（Ｔｏｐｒｏｌ−ＸＬ（登録商標）、アストラゼネカ）である。別の態様において、カルベジロールの用量は、１日あたり経口で６．２５ｍｇから１日２回経口で５０ｍｇまでである。別の態様において、メトプロロールの用量は、１日あたり経口で１２．５から２００ｍｇである。
【００３１】
上記の方法の何れかの一つの態様において、被験者の欠陥のある骨格筋機能は、心不全の間に起こる。別の態様において、上記薬剤は、被験者の心不全を軽減もする。さらなる態様において、上記薬剤は、ベータアドレナリン様ブロッカーではない。上記薬剤は、例えば、ダントロレン、又はダントロレンの誘導体、相同体、類似体、代謝物、又はプロドラッグであり得る。
【００３２】
上記の方法の何れかの一つの態様において、被験者の欠陥のある骨格筋機能は、慢性の閉塞性肺疾患、高血圧、喘息又は甲状腺機能亢進症の間に起こる。
この発明は、さらに、欠陥のある骨格筋機能を有する被験者を治療する方法を提供するが、被験者に、被験者の骨格筋のタイプ１ライアノジン（ＲｙＲ１）受容体／カルシウム放出チャネルへのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の結合を模倣するのに有効な薬剤をある量投与することにより、チャネルの開口の確率を減少させ、それにより被験者の欠陥のある骨格筋機能を軽減させることを含む。一つの態様において、被験者の欠陥のある骨格筋機能は、心不全の間に起こる。別の態様において、上記薬剤は、被験者の心不全を軽減もする。さらなる態様において、被験者の欠陥のある骨格筋機能は、慢性の閉塞性肺疾患、高血圧、喘息又は甲状腺機能亢進症の間に起こる。
【００３３】
この発明は、さらに、欠陥のある骨格筋機能を有する被験者を治療する方法を提供するが、被験者に、本明細書に開示された方法の何れかにより、タイプ１ライアノジン（ＲｙＲ１）受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離を阻害すると決定された薬剤又はそのような薬剤の構造上及び機能上の類似体又は相同体を治療上有効な量投与することを含む。
【００３４】
上記の方法の何れかの一つの態様において、被験者の欠陥のある骨格筋機能は、心不全の間に起こる。別の態様において、上記薬剤は、被験者の心不全を軽減もする。さらなる態様において、被験者の欠陥のある骨格筋機能は、慢性の閉塞性肺疾患、高血圧、喘息又は甲状腺機能亢進症の間に起こる。またさらなる態様において、上記薬剤は、ベータアドレナリン様ブロッカーではない。
【００３５】
この発明は、さらに、異常性を治療するための、本明細書に開示された方法の何れかにより、タイプ１ライアノジン（ＲｙＲ１）受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離を阻害すると決定された薬剤の使用を提供するが、異常性は、タイプ１（ＲｙＲ１）受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離を阻害することにより軽減される。一つの態様において、上記化合物は、ベータアドレナリン様ブロッカーではない。別の態様において、薬学組成物の製造は、上記薬剤を治療上有効な量、薬学上受容可能な担体と混合することを含む。
【００３６】
この発明は、さらに、本明細書に開示された方法の何れかにより同定された化学化合物を提供する。
この発明は、またさらに、ＲｙＲ１受容体に特異的に結合する組成物を作成する方法を提供するが、本明細書に開示された方法の何れか一つを用いて化学化合物を同定し、当該化学化合物又はその新規な構造上及び機能上の類似体又は相同体を合成し、そして薬学上有効な量の当該化学化合物を薬学上受容可能な担体と混合することを含む。
【００３７】
この発明は、（ａ）本明細書に開示された方法の何れかを用いて同定された化学化合物をある量、及び（ｂ）細胞膜を通過することができる薬学上受容可能な担体を含む、薬学組成物も提供する。
【００３８】
この発明は、さらに、ＲｙＲ１受容体チャネル機能に関するアッセイを提供するが、ＲｙＲ１受容体のプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）リン酸化、ＲｙＲ１受容体によるＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離の程度、ＲｙＲ１受容体チャネルの亜伝導状態、ＲｙＲ１受容体チャネルの活性化のためのＣａ２＋感受性、又はＲｙＲ１受容体チャネルの開確率（Ｐｏ）を測定することを含む。
【００３９】
主題の発明において、「薬学上有効な量」は、化合物が有効な疾患を罹患する被験者に投与されたときに、疾患の軽減（reduction）、沈静（remission）、又は緩解（regression）を導く、化合物の何れかの量である。
【００４０】
一つの態様において、治療上有効な量の化合物は、１日あたり、約０．０３から約１０００ｍｇの間である。別の態様において、治療上有効な量は、１日あたり約０．３０から約３００ｍｇの間である。一つの態様において、治療上有効な量は、１日あたり約１．０から約１００ｍｇの間である。
【００４１】
さらに、本明細書にて使用される、句「薬学上受容可能な担体」は、標準の薬学上受容可能な担体の何れも意味する。例は、限定ではないが、リン酸緩衝塩、生理食塩水、水、及びエマルジョン、例えば、オイル／水エマルジョンを含む。一つの態様において、担体は水ではない。
【００４２】
最後に、この発明は、本明細書に開示された化合物又は薬剤の相同体、類似体、アイソマー、プロドラッグ及び代謝物を提供する。化学化合物の「構造上及び機能上の類似体」は、化合物の構造と類似の構造を有するが、特定の成分（１つ又はそれ以上）に関してその化合物とは異なる。化学化合物の「構造上及び機能上の類似体」は、一定の要素の追加により、それの前のものから形成される（formed from the one before it）各々の化合物のシリーズの一つである。用語「類似体」は、用語「相同体」よりも広く、これを包含する。「アイソマー」は、同じ分子式を有する化学化合物であるが、原子の異なる分子構造又は異なる配置（arrangement）が存在する（space）。アイソマーは、構造アイソマー、位置的アイソマー、ステレオアイソマー、光学アイソマー、又はシス−トランスアイソマーであってよい。一般に、「プロドラッグ」は、要求される化合物に生体内で容易に変換可能な化合物の機能性誘導体になる。適切なプロドラッグ誘導体の選択及び製造のための慣用の手法は、例えば、Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ，ｅｄ．Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８５に記載される。「代謝物」は、化合物の生物学的環境への導入に際して生産される活性種を含む。
【００４３】
受容体選択的化合物をデザイン及び合成するアプローチは、よく知られており、伝統的な医化学及びコンビナトリアルケミストリーの新規な技術を含み、両方とも、コンピューターにより補助される分子モデリングにより支持される。そのようなアプローチにより、化学者及び薬学者らは、これらの受容体サブタイプにおいて活性を有する構造をデザインして合成するために、受容体を結合すると決定された標的化受容体サブタイプ及び化合物の構造に関する彼らの知見を使用する。
【００４４】
コンビナトリアルケミストリーは、化学的ビルディングブロックの異なる組み合わせを用いて新規な化合物を集合させることによる、様々な新規な化合物の自動化された合成を含む。コンビナトリアルケミストリーの使用は、化合物を生成するプロセスを多大に加速させる。結果の化合物のアレイはライブラリーと呼ばれ、目的の受容体において十分なレベルの活性を証明する「リード化合物」に関してスクリーニングするために使用される。コンビナトリアルケミストリーを用いることにより、目的の受容体標的に対して多大に偏ったと認識される化合物の「一本化された（focused）」ライブラリーを合成することが可能である。
【００４５】
リード化合物が同定されたら、コンビナトリアルケミストリーの使用によるか又は伝統的医化学の使用によるか又はそれ以外かに拘わらず、様々な相同体及び類似体が製造されることにより、化学構造と生物活性又は機能活性の間の関係の理解を促進する。これらの研究は、構造活性関係を規定し、次に、改善された能力、選択性及び薬力学特性を有する薬剤をデザインするために用いられる。コンビナトリアルケミストリーは、リードの最適化のために様々な構造を迅速に製造するのにも用いられる。伝統的な医化学は、一度の一つの化合物の合成を含み、さらなる改善のため、及び自動化された技術により接近可能でない化合物を生成するためにも使用される。そのようなドラッグが規定されたら、薬学工業及び化学工業を通して利用された標準化学製造方法論を用いて、生成物がスケールアップされる。
【００４６】
この発明は続く実験の詳細から良好に理解される。しかしながら、当業者は、特定の方法及び考察された結果は単に発明の例示であって、以後に続く特許請求の範囲において、より完全に記載されるものとして容易に認識する。
【００４７】
実験の詳細
本出願は、骨格筋のＥＣ共役に必要なＳＲ上のＲｙＲ１カルシウム放出チャネルの組成と機能が、心不全の動物モデルにおいてＰＫＡ高リン酸化のために変動するという発見に基づく。心不全の間、ＲｙＲ１のＰＫＡ高リン酸化は制御サブユニットＦＫ５０６結合蛋白質（ＦＫＢＰ１２）のＲｙＲ１チャネルマクロ分子複合体中での消耗を引き起こし、変更された開門（gating）をもつチャネルをもたらす。ＲｙＲ１のＰＫＡ高リン酸化は、心不全の骨格筋において変更されたＣａ２＋シグナリング及び初期の疲労と相関する。ＲｙＲ１の構造及び機能の欠陥は、心筋のＲｙＲ２に関して以前に報告されたものと類似していることから、心不全は心筋と骨格筋の両方を含む、一般化されたＥＣ共役筋疾患であることを示唆する。本発見は、実際に、不適応の応答を示して筋肉の機能のさらなる障害をもたらす心不全の慢性的高アドレナリン様状態のために、骨格筋が心筋のように変化を受けることを示す。
【００４８】
材料と方法
組換え体ＲｙＲ１を発現及び精製すること
組換え体ＷＴ及び変異体ＲｙＲ１を発現させ、単離し、そして特性決定したが、以前に記載された通りにした（Ｂｒｉｌｌａｎｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｇａｂｕｒｊａｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２００１）。簡単に言えば、ＲｙＲ１のｃＤＮＡをＮｈｅＩ及びＸｂａＩ部位を用いて、哺乳類発現ベクターｐＣＭＶ５にクローン化した。ＨＥＫ２９３細胞を最小必須培地（ＭＥＭ）中で２５ｍＭＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ）と共に、１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清（Ｇｉｂｃｏ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍｌ）、及びＬ−グルタミン（２ｍＭ）を追加して生育させた。一つのＴ１７５フラスコ（５０％コンフルエント）のＨＥＫ２９３細胞に、２０μｇのＲｙＲ１ ｃＤＮＡを、Ｃａ２＋リン酸沈殿法を用いてトランスフェクトした（Ｇａｂｕｒｊａｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２００１）。４８時間後のトランスフェクション細胞を２回洗浄して、リン酸緩衝塩溶液中にスクラップし、そして２５００ｘｇにて５分間、４℃における遠心分離により沈殿させた。記載されたとおり、マイクロソームを調製し、等分し、そして−８０℃に保存した（Ｇａｂｕｒｊａｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２００１）。
【００４９】
イムノブロット、免疫沈殿及びリン酸化
骨格筋の筋小胞体（ＳＲ）膜を、イヌの後肢骨格筋組織から調製した。簡単に言えば、約１０ｇの組織を切り刻み、そしてＮａＦ（５ｍＭ）及びプロテアーゼ阻害剤（１．０ｍＭベンザミジン、５．０μｇ／ｍｌペプスタチン、５．０μｇ／ｍｌロイペプチン、１．０μｇ／ｍｌアプロチン、１．０ｍＭペファブロック）を含む５０ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−マレイン酸バッファー、ｐＨ６．８中でホモジェナイズした。ホモジェネートを２０分間４，０００ｘｇにて遠心分離し、そして上清を再度１０，０００ｘｇにて２０分間遠心分離した。結果の上清を４０，０００ｘｇにて３０分間遠心分離し、そして沈殿物を、０．３Ｍショ糖及び０．９％ＮａＣｌを含む０．２ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−マレイン酸（ｐＨ６．８）に懸濁した。蛋白質の濃度はＢｒａｄｆｏｒｄの方法により、ウシ血清アルブミンを標準として測定し、サンプルを等分し、液体窒素中で急速凍結し、そして−８０℃において使用まで保存した。骨格筋溶解物は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），２００ｍＭ ＮａＣｌ，２０ｍＭ ＮａＦ，１．０ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４，１．０ｍＭ ＤＴＴ，及びプロテアーゼ阻害剤を含む１．０ｍｌのバッファー中でホモジェナイズされた１．０ｇのイヌ組織又は健康な（whole）ラットのひらめ筋から調製した。蛋白質濃度を測定後に、上清を等分し、そして使用まで−８０℃に保存した。免疫沈殿に関しては、骨格筋ＳＲサンプルを０．５ｍｌのＩＰバッファー［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），０．９％ ＮａＣｌ，０．５ｍＭ ＮａＦ，０．５ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４，０．２５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，及びプロテアーゼ阻害剤］に懸濁して、抗−ＲｙＲ抗体と一晩４℃においてインキュベートした。イムノブロットは、以下の一次抗体：抗−ＰＫＡ触媒サブユニット（１：１０００）、抗−ＰＰｌ（１：１０００）、（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｓ）、抗−ＦＫＢＰ（１：１０００）（Ｊａｙａｒａｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２）、抗−ＲｙＲ−５０２９（１：３０００）（Ｊａｙａｒａｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２）、抗体−ＰＤＥ４Ｄ３（１：１０００）［カサガイ（keyhole limpet）のヘモシアニン（ＫＬＨ）へのコンジュゲーションのために追加されたカルボキシル末端のシステインを有するヒトＰＤＥ４Ｄ３の残基１−１４、及び残基６のＮに代えてＴを有する相当するラットの配列の２つのＰＤＥ４Ｄ３ペプチド（ＭＭＨＶＮＮ／ＴＦＰＦＲＲＨＳＷ（Ｃ））の混合物により免疫されたウサギにおいて生じさせた、親和精製されたポリクローナル抗体］、抗−ｍＡＫＡＰ（１：７５０）［ＫＬＨへのコンジュゲーションのために追加されたアミノ末端のシステインを有するｍＡＫＡＰ配列（Ｃ）ＥＴＲＦＮＮＲＱＤＳＤＡＬＫＳＳＤＤに相当するペプチドにより免疫されたウサギにおいて生じさせた、親和精製されたポリクローナル抗体］を用いて実施した。プロテインＡ−セファロースビーズを加え、４℃において１時間インキュベートし、そしてＩＰバッファーにより３回洗浄した。洗浄後に、膜をペルオキシダーゼ−コンジュゲートされたヤギの抗ウサギ又はヤギ抗マウスのＩｇＧ抗血清（１：３０００、ベーリンガーマンハイム）と６０分間室温においてインキュベートし、Ｔｒｉｓ−緩衝塩（ＴＢＳ）、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０により３回洗浄し、そして増強されたケミルミネッセンスにより発色させた（ＥＣＬ，アマシャム）。
【００５０】
リン酸化に関しては、ビーズを１Ｘリン酸化バッファー［８ｍＭ ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ ＥＧＴＡ，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルフォン酸）、ｐＨ６．８］により洗浄し、媒質のみ、ＰＫＡ触媒サブユニット（５ユニット、シグマ）ＰＫＡプラスＰＫＡ阻害剤（ＰＫＩ５−２４，５００ｎＭ，カルビオケム）、又はｃＡＭＰ（１０μＭ）の何れかを含む、１０μｌの１．５Ｘリン酸化バッファーに懸濁した。免疫沈殿されたＲｙＲ１のリン酸化は、Ｍｇ−ＡＴＰ（３３μＭ），［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰにより開始して、５μｌの停止溶液（４％ＳＤＳ及び０．２５Ｍ ＤＴＴ）と共に室温において５分間インキュベートした後に停止させた。脱リン酸化実験に関しては、ｃＡＭＰ反応をＰＫＩの添加、続いてプロタミン（１ｍｇ／ｍｌ）＋／−オカダ酸（５μＭ）の添加により停止した。サンプルを９５℃に加熱し、６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりサイズで分画し、そしてＲｙＲ２放射活性をＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ及びＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウエア（アマシャムファルマシアバイオテック）を用いて定量した。非特異的リン酸化（ＰＫＩにより阻害されない）を差し引いて、３２Ｐ−リン酸化を高親和性［３Ｈ］−ライアノジン結合の量で割ることにより、３２Ｐ／ＲｙＲ１比を計算した（ＲｙＲ１あたり一つの高親和性ライアノジン結合部位）。全ての実験は３通りに実施され、研究者はサンプルの源を知らなかった。
【００５１】
ＦＫＢＰ１２結合
マイクロソーム（２００μｇ）を、プロタミン阻害剤を含む０．１ｍｌのイミダゾールバッファー（５ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４，及び０．３Ｍショ糖）に懸濁して、Ｍｇ−ＡＴＰ（１００μＭ）及びＰＫＡ（１０ユニット）又はｃＡＭＰ（１０μＭ）の何れかと、３０℃において３０分間インキュベートした。サンプルを９５，０００ｘｇにて１０分間遠心分離し、そして上清を回収した。沈殿物を２回０．２ｍｌイミダゾールバッファーで洗浄し、そして９５，０００ｘｇにて１０分間遠心分離した。最終沈殿物を０．１ｍｌのイミダゾールバッファーに懸濁した。いくつかの実験においては、沈殿物をｃＡＭＰでリン酸化して、次にアルカリホスファターゼにより（１：１００ 酵素：蛋白質）又はプロタミン（１ｍｇ／ｍｌ）により内因性ホスファターゼを活性化することにより、脱リン酸化した。組換え体ＦＫＢＰ１２をこれらのサンプルに４時間４℃において添加することにより、ＲｙＲ１への結合を許容した。沈殿物と上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥによりサイズ分画して、ＦＫＢＰ１２に関してイムノブロットした。
【００５２】
筋肉の機能の測定
ひらめ筋を水浴バス中で重力変換器（force transducer）に付着させ（attached）、５％のＣＯ２／９５％のＯ２で泡立たせた２ｍＭのＣａ２＋を含むクレブスヘンゼライトで潅流した。筋肉を６０分間休ませ、次に、単一のパルスにより１０秒間隔で刺激した。痙攣の力、痙攣の収縮の時間、及び半弛緩時間を測定した。刺激は、１−３０Ｖにおいて１Ｈｚにおいてであった。５０Ｈｚと６００ｍｓの刺激頻度及び強縮性時間（titanic duration）を用いて、強直性痙攣症の力、半収縮時間、及び半弛緩時間も測定した（Ｌｕｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，２００１）。疲労は、筋肉の強直性痙攣を２秒ごとに導入し、力が最大の４０％に下がるための時間を測定することにより、生じさせた。
【００５３】
単一チャネルの記録
対照又はＨＦの骨格筋からのＳＲ小胞、又は組換え体ＷＴ又は変異体ＲｙＲ１をトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞からの小胞を、平坦な脂質２層に取り込ませ、そしてＲｙＲ１の単一チャネル記録を記載された通りに実施した（Ｂｒｉｌｌａｎｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｇａｂｕｒｊａｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２００１）。ＷＴ ＲｙＲ１を含むマイクロソームを上で記載されたとおりにＰＫＡでリン酸化した。小胞をｃｉｓチェンバーに加え、そして３：１のホスファチジルエタノールアミン／ホスファチジルセリンからなる平坦脂質２層に融合するように誘導した（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）。２層のカップは、０．１５ｍｍの開口を有するポリスチレンから作成した。ｃｉｓチェンバーに添加されたＫＣｌにより融合を促進させた。単一Ｃａ２＋−放出チャネルの取り込みの後に、ｃｉｓチェンバーをｃｉｓ溶液で潅流することにより、ＫＣｌ勾配を消去した。
【００５４】
チャネルの分析のために使用された溶液は、以下のとおりであった：ｔｒａｎｓ溶液、２５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，５３ｍＭ Ｃａ（ＯＨ）２，５０ｍＭ ＫＣｌ，ｐＨ＝７．３５；ｃｉｓ溶液、２５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ，５０ｍＭ ＫＣｌ，１ｍＭ ＥＧＴＡ，０．５ｍＭ ＣａＣｌ２，ｐＨ＝７．３５。ｃｉｓコンパートメント中の遊離の［Ｃａ２＋］は、Ｃｈｅｌａｔｏｒソフトウエアを用いて計算した（Ｓｃｈｏｅｎｍａｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。ｔｒａｎｓチェンバーは、Ａｘｏｎ２００増幅器（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）のヘッドステージへ、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極及びＡｇａｒ／ＫＣｌブリッジを用いて接続した。ｃｉｓチェンバーは、類似の電極によりアースした（held at ground）。単一のチャネルの電流を、１Ｈｚにおいて８−穴Ｂｅｓｓｅｌフィルター（Ｗａｒｎｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）にてフィルターをかけ（filtered）、そして４ｋＨｚにおいてデジタル化した。データはＰｅｎｔｉｕｍコンピューター上でＡｘｏＳｃｏｐｅｌ及びＤｉｇｉｄａｔａ１２００インターフェイス（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて回収した。ｐＣｌａｍｐ６（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を単一チャネルデータを分析するのに用いた。開事象及び開門頻度の開確率及び寿命を、少なくとも２分の連続記録を用いて５０％閾値分析により確認した。各実験の結論において、ライアノジン（５μＭ）をｃｉｓチェンバーに適用することにより、チャネルがライアノジン受容体であったことを確認した。平均開及び閉休止時間分析を、Ｆｅｔｃｈａｎソフトウエア（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて実施し、そして開時間分散を二指数最小二乗回帰分析（two-exponential least-square regression analysis）により記載されたとおりに適合させた（Ｍａｒｘ ｅｔ ａｌ．，２００１）。全てのデータを平均±ＳＥとして表した。不対スチューデンツｔ−試験を実験間の平均値の統計比較の為に使用した。Ｐ＜０．０５の値が有意であると考えた。
【００５５】
イヌの心不全モデル
２８から３０ｋｇの重さの７匹のイヌをこの研究に用いた。早い左心室のペーシング（pacing）を用いることにより、前に記載されたとおりに心不全を誘導した（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。動物たちは、２つのグループのうちの一つに指定された：１）心臓の器具以外は正常（ｎ＝２）、及び２）心不全（ｎ＝５）。グループ２において、ベースラインの測定が得られた後に、早いＬＶペーシングが２１０ｂｐｍにて３週間開始し、外部ペースメーカーにより２４０ｂｐｍにてさらに２週間のペーシングが続いた（ＥＶ４５４３，Ｐａｃｅ Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｉｎｃ）。この早い心臓のペーシングの養生法は、よく特性決定された重度のＨＦを誘導するために以前に使用された（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ，１９９７）。ペースメーカーを止めた後、少なくとも４０分間は血流力学の測定を実施した。早いＬＶペーシングに供された動物における、圧力割る時間のベースラインのＬＶの変化（ｄＰ／ｄｔｍａｘ，ｍｍＨｇ／ｓ）は、３４２０±１０５であり、１７２２．２±３２２に落ち（ｐ＜０．０１）、ＨＦの発症と一致する。
【００５６】
ラットの梗塞モデル
１２匹のＳｐｒａｑｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（３００−４００ｇ）及び２匹のＷｉｓｔａｒラットを、左側の開胸により左の冠動脈を縛った（ligation）。処置の間は、全ての動物に挿管して酸素を供給した（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ，Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）。追加の６匹のＳｐｒａｑｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット及び３匹のＷｉｓｔａｒラットを冠動脈を縛らずにシャム手術した（対照グループ）。１週間後に、全１８匹のラットに超音波心臓検査を行った。冠動脈を縛って６カ月後に、超音波心臓検査を繰り返して、血流力学データを回収した。このため、Ｍｉｌｌａｒカテーテル（Ｍｉｌｌａｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）を右の頸動脈に挿入して、左心室まで進ませた。Ｍｉｌｌａｒの圧力変換カテーテル（Ｍｉｌｌａｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）及びＭａｃＬａｂ（ＡＤ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｇｒａｎｄ Ｊｕｎｃｔｉｏｎ，ＣＯ）を用いて、左心室エンドの拡張期圧、左心室の収縮期圧、平均大動脈圧、心臓レート、心拍及び左心室のｄＰ／ｄｔを測定した。次に、動物を安楽死させて、ひらめ筋を回収した。
【００５７】
Ｃａ２＋−スパーク測定
繊維の束（４−７繊維）を弛緩溶液（ｍＭにて：Ｋ−グルタミン酸 １４０、ＨＥＰＥＳ １０、ＭｇＣｌ２ １０、ＥＧＴＡ ０．１，ｐＨ＝７．０）中で伸筋のディジトラスロンガム（digitorus longum）（ＥＤＬ）筋肉からマニュアルで切り出した。束を記載されたとおりにマウントし（Ｌａｃａｍｐａｇｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８）、そして０．０１％サポニンを含む弛緩溶液に３０−４０秒間浸透させた。当該溶液を、イメージの記録のために内部培地（ｍＭにて：Ｋ−グルタミン酸 １４０、Ｎａ２ＡＴＰ ５，グルコース １０，ＨＥＰＥＳ １０，ＭｇＣｌ２ ４．４，ＥＧＴＡ １．１，ＣａＣｌ２ ０．３，Ｆｌｕｏ−３ ０．０５（ペンタカリウム塩、Ｔｅｆ−ｌａｂｓ，ＵＳＡ），ｐＨ＝７．０）に代えた。
【００５８】
蛍光イメージを、ラインスキャンモードにて操作された（ｘ ｖｓ．ｔ，１．９ｍｓ／ライン）Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ５１０ ＮＬＯ共焦点システム（６３Ｘオイル浸漬、ＮＡ＝１．４，Ｚｅｉｓｓ Ｆｒａｎｃｅ）にて捕捉した。Ｆｌｕｏ−３をアルゴン／クリトンレーザーにより４８８ｎｍにおいて励起し、放射された蛍光を約５２５ｎｍにおいて記録した。ポテンシャルスパークエリアは自動検出アルゴリズムを用いて経験的に同定した（Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。イメージに関する平均Ｆ値は、ポテンシャルスパークエリアを無視して、各空間位置において時間的な（temporal）Ｆを合計して平均化することにより、計算した。このＦ値を、次に、△Ｆ／Ｆイメージピクセル−バイ−ピクセルを創製するために使用した。Ｃａ２＋スパークの選択及び分析は、本質的にはＫｌｅｉｎら（１９９７）により記載されたとおりに実施した。個々のＣａ２＋スパークの空間−時間的特性の決定は、Ｃａ２＋スパークのピーク振幅において中央に置かれた（centered）スパークの空間的（ｘ）及び時間的（ｔ）特性の上でなされた。△Ｆ／Ｆ振幅並びに時間的パラメーター、立ち上がりの時間（ピークの△Ｆ／Ｆ，ＲＴの１０から９０％）、及び時間（半最大ピーク振幅における全時間、ＦＤＨＭ）は、時間的プロフィールに由来した。Ｃａ２＋スパークの振幅（半最大ピーク振幅における全振幅、ＦＷＨＭ）は、空間的プロフィールから決定した。２つのグループの間の集団パラメーターの統計的比較は、非パラメーターＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ試験を用いて実施した。
【００５９】
細胞をトランスフェクトする方法
ライアノジン受容体が発現される細胞を得るためにライアノジン受容体をコードする核酸で細胞をトランスフェクトする方法は、当業界で知られている（例えば、Ｂｒｉｌｌａｎｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４を参照）。非筋肉細胞においては、ＲｙＲ１受容体を内部原形質中で発現させる。当該細胞は、ＲｙＲ１受容体とベータアドレナリン性受容体の両方が発現される細胞を得るために、ベータアドレナリン受容体をコードする核酸で、追加にトランスフェクトしてよい。そのようなトランスフェクトされた細胞は、受容体を結合する化合物又はそのような細胞内で機能性応答を活性化するか又は活性化を阻害する化合物を得るために化合物を試験して化合物ライブラリーをスクリーンするために使用してもよく、よって、生体内でそうするのが有望である。
【００６０】
異種発現される蛋白質を研究するために、広いバライエティの宿主細胞を使用することができる。これらの細胞は、限定ではないが、哺乳類細胞系、例えばＣＯＳ−７，チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ），ＬＭ（ｔｋ−），ＨＥＫ２９３；昆虫細胞系、例えばＳｆ９，Ｓｆ２１；両生類細胞系、例えばアフリカツメガエル卵母細胞；雑多な酵母株；雑多な細菌細胞株；及びその他を含む。これらの細胞各々の培養条件は、特別であり、当業界ではよく知られている。
【００６１】
研究される蛋白質をコードする核酸は、様々な哺乳類、昆虫、両生類、酵母、細菌及び他の細胞系の中で、いくつかのトランスフェクション方法により一時的に発現させることができ、限定ではないが、リン酸カルシウム媒介性、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性；リポソーム−媒介性、ウイルス媒介性、エレクトロポレーション媒介性、及びマイクロインジェクション送達を含む。これらの方法の各々は、ＤＮＡ、細胞系、及び後で用いられるアッセイの種類に依存して、雑多な実験パラメーターの最適化を必要とするかもしれない。
【００６２】
異種ＤＮＡは、宿主細胞へ安定に取り込むことができ、細胞が外来蛋白質を永久に発現するよう誘導する。ＤＮＡの細胞への送達の方法は、一時的発現のための上記の方法と類似するが、標的化された宿主細胞に薬剤耐性を付与するためには補助的な遺伝子の同時トランスフェクションを必要とする。結果として起こる薬剤耐性は、ＤＮＡを受け取った細胞を選択して保持するように活用され得る。耐性遺伝子の分類は、限定ではないが、ネオマイシン、カナマイシン、及びハイグロマイシンを含むものが利用可能である。
【００６３】
結合アッセイ
結合アッセイを実施するための方法は、当業界でよく知られている。標識された化合物を、完全細胞、又は筋形質網状構造又は細胞質網状構造を含み、ＲｙＲ１受容体を発現する細胞抽出物に接触させる。筋形質網状構造又は細胞質網状構造を含む細胞抽出物を製造する方法は当業界で知られている（例えば、Ｋａｆｔａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。上記化合物が放射性アイソトープ、例えば３Ｈ，１４Ｃ，１２５Ｉ，３５Ｓ，３２Ｐ，３３Ｐで標識されたなら、結合した化合物は、液体シンチレーションカウンティング、シンチレーション近接、又は放射性アイソトープの検出のための他のあらゆる方法を用いて検出してよい。化合物を蛍光化合物で標識するなら、結合した標識化合物は、限定ではないが、蛍光強度、時間解析された蛍光、蛍光分極化（polarization）、蛍光転移（transfer）、又は蛍光相関分光学のような方法により測定してよい。この様式において、受容体に結合する化合物は、それらが標識化合物の受容体への結合を阻害するために同定してよい。
【００６４】
欠陥のある骨格筋機能及び心臓疾患を治療するための化合物のアッセイ
ＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化は、ＲｙＲ１チャネルの活性を増加させ、チャネルの所定の活性化剤に関して細胞の細胞質へのカルシウムのより多い放出をもたらす。ＲｙＲ１のＰＫＡ活性化をブロックする化合物は、ＲｙＲ１チャネルの活性化を低下させ、細胞へのカルシウムのより少ない放出をもたらすと期待されるはずである。ＦＫＢＰ１２．６結合部位においてＲｙＲ１チャネルに結合するが、チャネルがＰＫＡによりリン酸化されたときに当該チャネルをはずさない（not come off）化合物も、ＰＫＡリン酸化又はＲｙＲ１チャネルを活性化する他の誘因に応答してチャネルの活性化を低下させるとも予測される。そのような化合物は、細胞へのより少ないカルシウムの放出をももたらす。
【００６５】
欠陥のある骨格筋機能を治療するのに有効かもしれない化合物の一つのアッセイは、カルシウム感受性蛍光染料（例えば、Ｆｌｕｏ−３，Ｆｕｒａ−２）を用いて、ＲｙＲ１チャネルにより、細胞へのカルシウムの放出を測定することを含む。当該アッセイは、蛍光染料を細胞に負荷し、そしてＲｙＲ１受容体により細胞を刺激し、そして細胞に添加された化合物がカルシウム依存性蛍光シグナルを低下させるか否かを測定することを含む（Ｂｒｉｌｌａｎｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｇｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｊａｙａｒａｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。一つのＲｙＲ１活性化剤はカフェインであり、細胞に添加することができる。カルシウムが細胞の細胞質に放出された場合、カルシウム感受性染料により結合されて、次に、蛍光シグナルを放射する。カルシウム依存性蛍光シグナルは、Ｂｒｉｌｌａｎｔｅｓら、１９９４、Ｇｉｌｌｏら、１９９３；及びＪａｙａｒａｍａｎら、１９９６に記載されたとおりに、光電子倍増管により監視されて、適切なソフトウエアにより分析される。このアッセイは、複数ウエルの皿を用いて多数の化合物をスクリーンするために容易に自動化できる。当該アッセイは、異種発現系、例えば、細菌、酵母、昆虫、Ｓｆ９，ＨＥＫ２９３，ＣＨＯ，ＣＯＳ−７，ＬＭ（ｔｋ−），マウス胚性繊維芽ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、又はヒーラ細胞内で組換え体ＲｙＲ１チャネルを発現させることを含む（Ｂｒｉｌｌａｎｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。非筋肉細胞において、ＲｙＲ１受容体は小胞体（endoplasmic reticulum）上で発現される。ＲｙＲ１チャネルが活性化されたら、カルシウムが内部原形質から細胞の細胞質に放出される。ＲｙＲ１受容体はベータアドレナリン性受容体と同時発現させることができた。これは、ベータアドレナリン性受容体アゴニストの添加に応答してＲｙＲ１受容体の活性化に対する化合物の評価を可能にする。
【００６６】
別のアッセイは、ＲｙＲ１チャネルのＰＫＡリン酸化をブロックするためにデザインされた化合物の効果を決定するために使用できるＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化のレベルを測定することを含む。このアッセイは、心不全が早い心臓ペーシングにより誘導された動物モデルとの関連において使用することができる。当該アッセイは、ＲｙＲ１チャネルに特異的な抗体（抗ＲｙＲ１抗体）の使用に基づく。このアッセイのためには、ＲｙＲ１チャネル蛋白質を抗ＲｙＲ１抗体により免疫沈殿させ、次に、ＰＫＡ及び［γ−３２Ｐ］−アデノシン３リン酸（ＡＴＰ）により逆リン酸化する（back-phosphorylated）。ＲｙＲ１受容体蛋白質に転移した放射性３２Ｐレベルの量をホスホロイメジャーを用いて測定することができる。別のバージョンのアッセイにおいて、抗体は、ＲｙＲ１受容体のリン酸化された形態に特異的であって、その場合には逆リン酸化は必要ない。
【００６７】
ＲｙＲ１受容体チャネル機能のための他のアッセイは、ＦＫＢＰ１２．６結合蛋白質とＲｙＲ２受容体の結合の程度、ＲｙＲ１受容体チャネルの亜伝導性状態、ＲｙＲ１受容体チャネルの活性化のためのＣａ２＋感度、又はＲｙＲ１受容体チャネルの開確率（Ｐｏ）を測定することを含む。
【００６８】
ＦＫ５０６とラパマイシンの両者はＦＫＢＰ１２をＲｙＲ１から解離させる。一つのアッセイはカラムに結合するものを探す化合物のライブラリーをスクリーンするためのＦＫ５０６−セファロース又はラパマイシン−セファロースカラムの使用を含む。結合は、結合バッファーによりカラムを洗浄し、高塩濃度のバッファーにより溶出することにより、見積もることができる。カラムに結合する化合物は、それらが骨格筋ライアノジン受容体（骨格筋膜調製物中）に結合して、チャネルに結合したＦＫＢＰ１２を置き換える能力に関して試験することができる。この競合アッセイは、チャネルを化合物とインキュベートし、そして次に遠心分離し、そして沈殿物対上清の免役ブロッティングを行うことを含む。沈殿物に結合してＦＫＢＰ１２とコンピートオフする化合物は、上清中でＦＫＢＰ１２の検出をもたらすはずである。これは、９６ウエルのプレートをドットブロット装置と共に用い、そして抗−ＦＫＢＰ１２抗体によりイムノブロッティングを行うことによりアッセイできた。
【００６９】
これらのアッセイを用いて同定される化合物は、カルシウム感受性蛍光染料（例えば、ｆｌｕｏ−３又はｆｕｒａ−２）により負荷された細胞における、イソプロテレノール誘導性細胞内カルシウム放出を阻害するそれらの能力に関して試験することができた。
【００７０】
ＦＫＢＰ１２のＲｙＲ１への結合を安定化させる化合物は、例えば９６ウエルの皿の中で抗−ＦＫＢＰ１２抗体を用いてＦＫＢＰ１２の上清への放出に関してアッセイする高処理量ＥＬＩＳＡ、次にｃＡＭＰ及びＡＴＰによるＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化を用いて同定することができた。ＦＫＢＰ１２の上清への放出を阻害する化合物は、新規な治療剤に関してリード化合物の候補になるはずであり、そしてＨＦの動物モデルにおいて後で試験することができる。
【００７１】
結果
ＲｙＲ１中のＳｅｒ２８４３のＰＫＡリン酸化はＦＫＢＰ１２結合を制御してチャネルを活性化する
ＲｙＲ１チャネルが如何にしてＰＫＡリン酸化により制御されるかを理解するため、チャネル上のＰＫＡリン酸化の部位を部位特異的変異導入により最初に決定し、次に、この部位のＰＫＡリン酸化のＲｙＲ１マクロ分子シグナリング複合体の組成物に対する効果を試験した（Ｍａｒｘ ｅｔ ａｌ．，２００１）。アラニン（ＲｙＲ１−Ｓ２８４３Ａ）及びアスパラギン酸（ＲｙＲ１−Ｓ２８４３Ｄ）置換を、ＲｙＲ１上のユニークなＰＫＡリン酸化部位としてＳｅｒ２８４３を同定するのに使用した（図１Ａ及びＢ）。ＲｙＲ１−２８４３ＡとＲｙＲ１−Ｓ２８４３Ｄは、をＨＥＫ２９３細胞中で野生型（ＷＴ）ＲｙＲ１と同じ効率にて発現された（図１Ａ）。ＲｙＲ１に結合するＦＫＢＰ１２は、記載されたとおりに（Ｇａｂｕｒｊａｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２００１）、共沈殿により評価した（図１Ｃ）。ＦＫＢＰ１２は、ＲｙＲ１に結合したときにのみ沈殿物中でイムノブロットにより検出され、さもなくば、ＦＫＢＰ１２は上清中で検出された。Ｓｅｒ２８４３（ＲｙＲ２上のＰＫＡリン酸化部位、Ｓｅｒ２８０９に相同（Ｍａｒｘ ｅｔ ａｌ．，２０００））におけるＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化は、ＷＴ ＲｙＲ１からのＦＫＢＰ１２の解離をもたらしたが、変異体ＲｙＲ１−Ｓ２８４３Ａからの解離はもたらさず、ＰＫＡリン酸化できなかった（図１Ｃ）。変異体ＲｙＲ１−Ｓ２８４３Ａに結合したが変異体ＲｙＲ１−Ｓ２８４３ＤにはしなかったＦＫＢＰ１２は、構成的にＰＫＡリン酸化されたＲｙＲ１を模倣する。これらのデータは、Ｓｅｒ２８４３におけるＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化がＦＫＢＰ１２のＲｙＲ１チャネルへの結合を制御することを確証する。
【００７２】
ＰＫＡとＰＰ１は、以前に、チャネル上の高度に保存されたロイシン／イソロイシンジッパーに結合する標的化蛋白質によりＲｙＲ１を標的とすることが示された（Ｍａｒｘ ｅｔ ａｌ．，２００１）。ＲｙＲ１に結合したＰＫＡは、ｃＡＭＰにより活性化され（１０μＭ）、ＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化を誘導した（図１Ｄ）。ＲｙＲ１に結合したＰＰ１は、プロタミンにより活性化され（１ｍｇ／ｍｌ）、ＲｙＲ１の脱リン酸化をもたらした（図１Ｄ）。即ち、ＲｙＲ１マクロ分子複合体中のＰＫＡとＰＰ１は、外因性のキナーゼ又はホスファターゼの添加なしにチャネルのリン酸化／脱リン酸化を制御できる。
【００７３】
ＲｙＲ１マクロ分子複合体中のＰＫＡの活性化の、ＦＫＢＰ１２のＲｙＲ１への結合に対する効果は、記載されたとおりに（Ｇａｂｕｒｊａｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２００１）、共沈殿により評価した（図１Ｅ）。ｃＡＭＰ誘導されたＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化はＲｙＲ１からのＦＫＢＰ１２解離を誘導した（図１Ｅ）。過剰なＦＫＢＰ１２はＰＫＡリン酸化されたＲｙＲ１には結合できなかった。結合したＰＫＡのＰＫＩ５−２４（５００ｎＭ）によるｃＡＭＰ誘導による活性化を阻害することは、ＲｙＲ１からのＦＫＢＰ１２のリン酸化−誘導性解離をブロックした（図１Ｅ）。ＰＫＡリン酸化されたＲｙＲ１をアルカリホスファターゼ（１ユニット／ｍｇのＳＲ蛋白質）によるか又は結合した保存された（ＰＰ１）をプロタミン（１ｍｇ／ｍｌ）により活性化することにより脱リン酸化した後に、ＦＫＢＰ１２が再度チャネルに結合できた（図１Ｅ）。即ち、ＰＫＡリン酸化はＦＫＢＰ１２をＲｙＲ１から解離させ、そしてＦＫＢＰ１２はＰＫＡ−リン酸化されたＲｙＲ１に再び結合できない。
【００７４】
ＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化の機能上の効果を決定するため、ＲｙＲ１組換え体チャネルをＨＥＫ２９３細胞内で発現させて、平坦な脂質２層内で再構成することにより、それらの単一チャネル特性を試験した（図２Ａ）。野生型（ＷＴ）ＲｙＲ１チャネル（図２Ａ）を、１）ＰＫＡリン酸化できない変異体チャネル（ＲｙＲ１−Ｓ２８４３Ａ，図２Ｂ）；２）ＰＫＡリン酸化されたＷＴのＲｙＲ１（図２Ｃ）；３）構成的にＰＫＡリン酸化されたＲｙＲ１を模倣する変異体ＲｙＲ１（ＲｙＲ１−Ｓ２８４２Ｄ，図２Ｄ）；及び４）ＦＫＢＰ１２を結合できない変異体ＲｙＲ１（ＲｙＲ１−Ｓ２４６１Ｉ，図２２Ｅ）と比較した。ＷＴのＲｙＲ１は、前に報告されたとおり（Ｂｒｉｌｌａｎｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｇａｂｕｒｊａｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２００１）、天然のＲｙＲ１と同じ単一チャネル特性を呈した（図２Ａ、表Ｉ）。変異体ＲｙＲ１−Ｓ２８４３Ａも、天然ＲｙＲ１と同じ単一シグナル特性を呈した（図２Ｂ）。
【００７５】
【表１】
【００７６】
ＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化は、ＷＴのＲｙＲ１を活性化した（Ｐｏを増加させ、そして開及び閉休止時間を減少させた、図２Ｃ及び表Ｉ）。ＷＴのＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化は、逆リン酸化により確認された（図１Ｂ）。ＲｙＲ１−Ｓ２８４３ＡチャネルはＰＫＡにより活性化されなかった（表Ｉ）ことから、ＷＴのＲｙＲ１のＰＫＡによる活性化はＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化のためであったことが示唆されたが、ＷＴと変異体のＲｙＲ１−Ｓ２８４３Ａのチャネルの唯一の違いは、後者がＳｅｒ２８４３Ａｌａ置換のためにＰＫＡによりリン酸化され得ないことだからである。ＲｙＲ１−Ｓ２８４３Ｄは、ＰＫＡリン酸化されたＷＴのＲｙＲ１と同じ単一チャネル特性を呈した（図２Ｄ及び表Ｉ）ことから、ＰＫＡリン酸化のＲｙＲ１に対する効果はＳｅｒ２８４３のリン酸化によったという追加の証拠を提供する。即ち、ＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化は、１５０ｎＭ ｃｉｓ（細胞質）［Ｃａ２＋］ｃｉｓにおいてチャネルを有力に活性化する。ＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化がチャネルからのＦＫＢＰ１２の解離を誘導するため（図１Ｃ）、ＰＫＡリン酸化によるＲｙＲ１の活性化がチャネルからのＦＫＢＰ１２の解離によるか否かを決定することが必要であった。この疑問に近づくため、ＦＫＢＰ１２結合部位内の変異のためにＦＫＢＰ１２を結合できないＲｙＲ１−Ｖ２４６１Ｉの単一チャネル特性（Ｇａｂｕｒｊａｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２００１）を、ＰＫＡリン酸化されたＲｙＲ１の特性と比較した。ＲｙＲ１−Ｖ２４６１Ｉは、ＷＴのＲｙＲ１及びＲｙＲ１−Ｓ２８４３Ｄ変異体のチャネルと同じ単一チャネル特性の変化を呈し、非リン酸化ＷＴチャネルに比較して、Ｐｏを増加させ、そして開及び閉休止時間を減少させた（図２Ｅ及び表Ｉ）。
【００７７】
ＦＫＢＰ１２．６は、ＦＫＢＰ１２に相同であって、ＲｙＲ１−Ｖ２４６１Ｉに結合できるが、ＦＫＢＰ１２はできない（Ｇａｂｕｒｊａｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２００１）。ＲｙＲ１−Ｖ２４６１Ｉチャネルの変更された単一チャネル特性、増加したＰｏ及び減少した開及び閉休止時間が、Ｆ１２．６のチャネルへの結合により正常に回復できることは前に示された（Ｇａｂｕｒｊａｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２００１）。即ち、ＲｙＲ１−Ｖ２４６１Ｉ変異体チャネルにより呈された、増加したＰｏ及び減少した開及び閉休止時間は、チャネルの構造又は機能に対する変異の幾つかの定義されていない効果によるより、むしろ、ＦＫＢＰ１２の結合の欠如によるのが明確である。総合すると、これらのデータは、Ｓｅｒ２８４３におけるＰＫＡリン酸化によるＲｙＲ１の活性化がチャネルからのＦＫＢＰ１２の解離によることが明確であることを示す。
【００７８】
ＨＦ骨格筋におけるＲｙＲ１のＰＫＡ高リン酸化及び欠損機能
ＨＦの動物モデルからの骨格筋からのＲｙＲ１チャネル（慢性高アドレナリン条件）がＰＫＡ高リン酸化されたか、そして変更された単一チャネル特性を呈したか否かを決定するため、ペーシング誘導されたＨＦのイヌモデルからの後肢骨格筋からのＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化を、ＲｙＲ１の免疫沈殿、続く逆リン酸化を用いて、前に記載されたとおりに（Ｍａｒｘ ｅｔ ａｌ．，２０００）、評価した（図３Ａ）。このイヌのＨＦモデルにおいて、低下した左心室（ＬＶ）の機能は、血流力学評価により記録され、ＬＶ ｄＰ／ｄｔｍａｘが対照において３４２０±１０５であり、そしてＨＦにおいて１７２２．２±３２２であったことを示す（ｍｍＨｇ／ｓ，ｎ＝４正常、ｎ＝５ＨＦ，Ｐ＜０．０１）。ＨＦ骨格筋からのＲｙＲ１は、正常骨格筋からのＲｙＲ１に比較して、ＰＫＡ高リン酸化されていた（図３Ａ）。ＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化の化学量論は：ＲｙＲ１チャネルのモルあたり、正常０．４＋０．２、ＨＦ３．６＋０．８モルリン酸転移であった（ｎ＝４正常、ｎ＝５ ＨＦ，Ｐ＜０．０１）。即ち、各ＲｙＲ１上の平均３／４−４／４のＰＫＡリン酸化部位上において、チャネルはＨＦ骨格筋内でリン酸化され、一方チャネルあたり＜１／４部位が正常な対照骨格筋からのＲｙＲ１内ではＰＫＡリン酸化されていた。
【００７９】
心臓のＲｙＲ２のＰＫＡ高リン酸化がチャネルマクロ分子複合体からのＦＫＢＰ１２．６の消耗を誘導して、弱った心臓において変更された関門特性を有するチャネルをもたらすことは、前に示された（Ｍａｒｘ ｅｔ ａｌ．，２０００）。本出願においては、骨格筋ＲｙＲ１マクロ分子複合体中のＦＫＢＰ１２のレベルを、正常な動物とＣＨＦの動物に関して、以前に記載されたとおりに（Ｍａｒｘ ｅｔ ａｌ．，２０００）、共免疫沈殿を用いて測定した。正常な骨格筋からのＲｙＲ１チャネルをインビトロＰＫＡリン酸化に供した場合に観察されるＲｙＲ１複合体からのＦＫＢＰ１２の消耗の程度と比較して（図３Ｂ）、対照に比較して、ＨＦの骨格筋からのＲｙＲ１複合体中のＦＫＢＰ１２の量には顕著な低下があった（約３倍）（ｎ＝２対照、ｎ＝５ ＨＦ，Ｐ＜０．０１，図３Ｂ）。細胞のＦＫＢＰ１２の全量（図６Ｃ）、並びにＰＫＡの触媒サブユニットのレベル、及びＲｙＲ１マクロ分子複合体中のホスファターゼＰＰ１は、変化しなかった（図３Ｃ）。即ち、ＲｙＲ１のＰＫＡ高リン酸化は、ＨＦの骨格筋中のチャネルマクロ分子複合体からのＦＫＢＰ１２の消耗に関連しており、弱った心臓におけるＲｙＲ２からのＦＫＢＰ１２．６の高リン酸化誘導性消耗に類似している（Ｍａｒｘ ｅｔ ａｌ．，２０００）。
【００８０】
骨格筋中のＲｙＲ１マクロ分子複合体からのＦＫＢＰ１２のＰＫＡ高リン酸化及び消耗の機能上の因果関係を決定するため、正常骨格筋及びＨＦ骨格筋から単離されたＲｙＲ１の単一チャネル特性を比較した。ＨＦのＲｙＲ１チャネルは、１００ｎＭのｃｉｓ（細胞質）［Ｃａ２＋］において増加した開確率（Ｐｏ）を有した（図４Ａ及びＢ、表ＩＩ）。正常なＲｙＲ１チャネルは、１００ｎＭ［Ｃａ２＋］ｃｉｓにおいては活性ではない（Ｌａｉ ｅｔ ａｌ．，１９８９；Ｌａｖｅｒ ａｎｄ Ｌａｍｂ，１９９８；Ｍｅｉｓｓｎｅｒ，１９９４）。ＨＦのＲｙＲ１チャネルは、正常な骨格筋からのＲｙＲ１チャネルにおいて稀に観察される亜伝導性状態又は部分的開口（Ｂｒｉｌｌａｎｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４）を呈した（例えば、図４Ｂ及び表ＩＩ）。ＲｙＲ１チャネル間の共役された開門は、チャネルのクラスターが同時に開いて閉じる機構であり（Ｍａｒｘ ｅｔ ａｌ．，１９９８）、対照からのＲｙＲ１チャネルに比較して、ＨＦの骨格筋チャネルにおいて顕著に低下した（表ＩＩ）。平均の開及び閉休止時間は、対照に比較して、ＨＦのＲｙＲ１において顕著に低下した（例えば、図４Ａ及びＢ，及び表ＩＩ）。サブマイクロモラー［Ｃａ２＋］ｃｉｓにおいて増加したＰｏ、低下した開及び閉休止時間、亜伝導性開口、及び減少した共役開門は、ＦＫＢＰ１２無しで発現された組換え体ＲｙＲ１の特徴であり（Ｂｒｉｌｌａｎｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｍａｒｘ ｅｔ ａｌ．，１９９８）、そしてＦＫＢＰ１２除去後の天然ＦＫＢＰ１２の特徴である（Ａｈｅｒｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｍａｒｘ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。さらに、ＲｙＲ１単一チャネル特性における類似の欠損は、ＦＫＢＰ１２の空の（null）マウスからの骨格筋から単離されたＲｙＲ１において観察されたが、これらの動物は、発生する欠陥のために子宮内で（in utero）死ぬか、又は生後すぐに死に、骨格筋機能を評価できなかった（Ｓｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。
【００８１】
【表２】
【００８２】
ＨＦ骨格筋における変更されたＳＲ Ｃａ２＋放出
ＰＫＡにより高リン酸化されて且つＦＫＢＰ１２により消耗されたＲｙＲ１の単一チャネル特性の変化が、ＨＦ骨格筋の損なわれた機能に帰し得た変更されたＳＲ Ｃａ２＋放出に関連するか否かを決定するため、Ｃａ２＋スパークを記録した。個々のＲｙＲ１のクラスターからのＳＲ Ｃａ２＋放出を表すＣａ２＋スパークを、シャム手術された対照とＨＦのラットの骨格筋からの筋管において試験した（図５Ａ）。ＳＲ Ｃａ２＋放出（スパーク）の振幅は、ＰＫＡ高リン酸化されたＲｙＲ１を伴うＨＦ筋肉からの骨格筋管において顕著に減少した。対照に比較して、［Ｃａ２＋］の蛍光測定値は、ＨＦにおいて、△Ｆ／Ｆ＝０．９２±０．０２（シャム手術された対照）から０．７６±０．０３に減少した（ｎ＝６，Ｐ＜０．０１，図５Ｂ）。ＨＦ骨格筋のＣａ２＋スパークも、遅い上昇時間（対照、３．９８±０．１４ 対 ＨＦ，４．６６±０．２１ｍｓ，Ｐ＜０．０５）及び延期された半存続期間（half duration）（対照、１２．９１±０．５０ 対 ＨＦ，１５．４６±０．６９ｍｓ，Ｐ＜０．０５）を呈した（図５Ｂ）。最後に、Ｃａ２＋スパークの空間的な広がりは、ＨＦ骨格筋において大きかった（１．６５±０．０３ 対 １．９５±０．０９，Ｐ＜０．０５，図５Ｂ）。これらのデータは、ＰＫＡにより高リン酸化されたＲｙＲ１が、ゆっくりとしたＳＲ Ｃａ２＋放出の事象に関連しており、遅いピーク振幅を有し、そして対照よりも長く続くことを示す。
【００８３】
ＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化は心不全骨格筋における欠陥のある筋肉の機能に相関する
心不全において起こる骨格筋の変化の生理学的な結果を評価するため、及びＲｙＲ１のＰＫＡ高リン酸化及びＲｙＲ１複合体からのＦＫＢＰ１２の消耗が、損なわれた骨格筋機能に関連するか否かを決定するため、齧歯類の後−心筋梗塞（post-myocardial infraction）ＨＦモデルを用いた。このモデルにおいて、ＨＦは左の腹側の下行冠動脈（anterior descending coronary artery）を縛った後の心筋梗塞から６カ月にわたり発症する。ＨＦは、断片の短縮化を、ＨＦにおいては４１．４±４．７％（ｎ＝１０）に減少させ、対して、シャム手術された対照においては５１．６±５．３％（ｎ＝６，Ｐ＜０．０１）に減少させ；梗塞の収縮の断片面積は、ＨＦにおいて３９．１±５．１％に減少したのに対して、対照では６８．７±２．４％に減少した（Ｐ＜０．０１ ＨＦ 対 シャム手術された対照）。血流力学測定値もＨＦを確認した（シャム手術された対照に関してＬＶＥＤＰ＝９．１６±５．１９ｍｍＨｇ（ｎ＝６） 対 ＨＦに関して１８．２８±８．５６ｍｍＨｇ（ｎ＝１０），Ｐ＜０．０５；対照に関してｄＰ／ｄｔ＝５４８３±１７０４ｍｍＨｇ／ｓ 対 ＨＦに関して２９２２±７８４ｍｍＨｇ／ｓ，Ｐ＜０．０１）。
【００８４】
ＲｙＲ１チャネルは、シャム手術された対照に比較して、ラットＨＦ骨格筋において（ｎ＝１０）ＰＫＡにより高リン酸化されており（図６Ａ，ｎ＝６，Ｐ＜０．０１）、そしてＲｙＲ１に結合したＦＫＢＰ１２の量はＨＦ骨格筋において５８％減少した（図６Ｂ，Ｐ＜０．０１）が、ＦＫＢＰ１２の全細胞レベルはＨＦ骨格筋中で低下しなかった（図６Ｃ）。さらに、ＲｙＲ２チャネルのＰＫＡ高リン酸化に関して有力な説明を提供する、ＰＰ１とＰＰ２ＡのレベルがＨＦにおいて低下した心筋ＲｙＲ２マクロ分子複合体に対して（Ｍａｒｘ ｅｔ ａｌ．，２０００）、ＲｙＲ１複合体中のＰＰ１の量はＨＦ骨格筋において低下しなかった（図６Ｂ）。最近の研究は、ホスホジエステラーゼ、ＰＤＥ４Ｄ３、及び標的化蛋白質筋肉Ａ−キナーゼアンカーリング蛋白質（ｍＡＫＡＰ）が、ＰＫＡと共にシグナリング複合体を形成することを報告した（Ｄｏｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，２００１）。ＰＫＡはＲｙＲ１マクロ分子複合体の一部であり（Ｍａｒｘ ｅｔ ａｌ．，２００１）、そしてＰＫＡとｍＡＫＡＰはＲｙＲ２複合体の成分であることが（Ｍａｒｘ ｅｔ ａｌ．，２０００）、以前に示された。ｍＡＫＡＰとＰＤＥ４Ｄ３がＲｙＲ１マクロ分子複合体中に存在したか否かを決定するため、抗−ＲｙＲ−５０２９を用いた免疫沈殿、続くｍＡＫＡＰとＰＤＥ４Ｄ３を検出する抗体によるイムノブロッティング（図６Ｄ）を使用した。ｍＡＫＡＰとＰＤＥ４Ｄ３の両方がＲｙＲ１により免疫沈殿し、よって、ＲｙＲ１マクロ分子複合体の一部であるらしいことがわかった（図６Ｂ）。さらに、対照に比較して（ｎ＝４）、ＲｙＲ１複合体中のＲｙＲ１の量は、ＨＦ骨格筋において顕著に減少した（ｎ＝４，Ｐ＜０．０５，図６Ｂ）。ＲｙＲ１チャネル複合体において低下したＰＤＥ４Ｄ３のレベルは、ｃＡＭＰの局所的な増加及び増加したＰＫＡ活性に帰し得たことから、ＨＦ骨格筋中のＲｙＲ１のＰＫＡによる高リン酸化を説明するかもしれない（図３Ａ及び６Ａ）。
【００８５】
ひらめ筋機能を、張力変換器を用いて試験した。ＨＦのひらめ筋は、シャム対照の筋肉よりも、早く疲労して、よりゆっくりと強直性痙攣に達した（図６Ｅ及びＦ）。疲労時間は、対照のひらめ筋に関して２８０±５９秒で、対するにＨＦのひらめ筋に関しては２１６±２６秒であった（ｎ＝５ シャム手術された対照、ｎ＝８ ＨＦ，Ｐ＜０．０５，図６Ｅ）。強直性痙攣症の半分収縮時間は、対照のひらめ筋に関して１６４．６±７０．１ｍｓで、対するにＨＦのひらめ筋に関しては２９７．５±７４．１ｍｓであった（ｎ＝５ シャム手術された対照、ｎ＝８ ＨＦ，Ｐ＜０．０１，図６Ｆ）。ＨＦ骨格筋中の遅延した強直性痙攣症と加速した疲労を含む欠陥のある収縮機能の証明は、骨格筋（Ｌｕｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｌｕｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｐｅｒｅａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．，１９９３）と横隔膜筋（ＭａｃＦａｒｌａｎｅ ｅｔ ａｌ．，２０００）の両方における他の発見と一致する。さらに、ＲｙＲ１の高リン酸化の程度は初期の骨格筋疲労に顕著に相関した（ｒ＝０．８８，図６Ｇ）。即ち、ＲｙＲ１のＰＫＡ高リン酸化とＦＫＢＰ１２のＲｙＲ１マクロ分子複合体からの消耗は、変更された骨格筋機能に関連する。
【００８６】
考察
ライアノジン受容体（ＲｙＲｓ）は多くの種類の細胞においてシグナリングに関与するが、これらの細胞内Ｃａ２＋放出チャネルの機能を変調する生理学上の機構は、よく理解されていない。ＲｙＲｓを含む最大に理解されている系の一つは、筋肉の収縮を活性化させるＳＲ Ｃａ２＋放出にＲｙＲｓが必要な横紋筋中のＥＣ共役である。しかしながら、骨格筋及び心筋においてさえ、交感神経系（ＳＮＳ）のような系統的シグナルがＲｙＲ機能を変調させる機構は、まだ明らかにされていない。
【００８７】
「ファイトオアフライト」応答は、ＳＮＳの活性化を含む古典的なストレス経路であり、筋肉のβ−アドレナリン刺激を導く。ＳＮＳ刺激の間、カテコールアミンがβ−アドレナリン受容体に結合し、Ｇ−蛋白質によりアデニリルシクラーゼを活性化し、そしてＰＫＡを活性化する第２メッセンジャーｃＡＭＰの細胞内レベルを増加させる。本研究は、ＰＫＡリン酸化がＳｅｒ２８４３上でそれらをリン酸化することによりＲｙＲ１チャネルを活性化することを示す。このＰＫＡリン酸化部位は部位特異的変異導入を用いて確認され（図１Ａ及びＢ）、ホスホペプチドマッピングにより同じ部位が同定された以前の研究に一致する（Ｓｕｋｏ ｅｔ ａｌ．，１９９３）。ＲｙＲ１のＳｅｒ２８４３上のＰＫＡリン酸化の同定は、ＰＫＡリン酸化がＲｙＲ１チャネルを活性化する機構を釣り上げるために必要とされる変異ＲｙＲ１の生成を可能にさせた。
【００８８】
このアプローチは、ＰＫＡリン酸化がＳｅｒ２８４３をリン酸化することによりＲｙＲ１を活性化して、チャネルからのＦＫＢＰ１２の解離を引き起こすことを明らかにした（図１）。ＦＫＢＰ１２の解離は、チャネル開口の阻害を救済するが、これはＦＫＢＰ１２が結合したときに閉状態にあるＲｙＲ１チャネルの安定化による。
【００８９】
本研究からのデータは、骨格筋のＥＣ共役のコンテクストにおいてＦＫＢＰ１２がＲｙＲ１の機能を変調させる機構に関して新規な洞察を提供する。ＲｙＲ１チャネル複合体中のＦＫＢＰ１２の役割に関するオリジナルの研究は、この１２ｋＤａの蛋白質がＲｙＲ１チャネルを安定化するが、おそらくは、チャネルへの結合及びＥＣ共役の間の正常な生理学上の機能に必要とされる好ましいコンフォメーションにそれを安定化させるためであることを示唆した（Ｂｒｉｌｌａｎｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｊａｙａｒａｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。本明細書において記載された結果（図１及び２、及び表Ｉ）は、今、チャネル複合体からＦＫＢＰ１２を解離させることにより、ＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化がチャネルを活性化することを示す。この発見は、ＦＫＢＰ１２の一つの生理学上の役割が、チャネルの閉状態を安定化することであり、天然のチャネル阻害剤として本質的に作用することを示唆する。ＦＫＢＰ１２をチャネル複合体から解放することにより、ＰＫＡリン酸化がこの阻害を救済し、そしてチャネルを活性化する。即ち、ＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化は、ＥＣ共役のコンテクストにおいてＲｙＲ１の活性を増加させるための生理学上の機構を提供する。データはＦＫＢＰ１２がＲｙＲ１の開状態及び閉状態の両方を安定化することを示すが、ＲｙＲ１チャネルは骨格筋中ではＶＧＣＣとの相互作用により開くので（Ａｈｅｒｎ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｒｉｏｓ ａｎｄ Ｂｒｕｍ，１９８７；Ｒｉｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ａｎｄ Ｃｈａｎｄｌｅｒ，１９７３；Ｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．，１９９０）、骨格筋中のＲｙＲ１マクロ分子複合体中のＦＫＢＰ１２に関しての、より重要な役割は、チャネルの閉状態を安定化することであるらしい（即ち、筋肉が弛緩して骨格筋においてＳＲ Ｃａ２＋のリークを妨害するときに閉じたＲｙＲ１チャネルを、ＦＫＢＰ１２が助け続けるのかもしれない）。
【００９０】
以前の報告に一致した（Ｈａｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｓｏｎｎｌｅｉｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７）、ＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化による活性化の生理学上の結果を決定するため、正常な骨格筋の機能をＨＦの動物のモデルの機能と比較した。ＨＦは公知の高アドレナリン状態であり（Ｃｈｉｄｓｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９６２），そしてＲｙＲ１がＨＦ骨格筋中でＰＫＡ−高リン酸化されているという発見（図３）は、骨格筋機能におけるＲｙＲ１のこの形の制御の役割を探索するために、ＰＫＡ−リン酸化されたＲｙＲ１を伴うか又は伴わずに筋肉の機能を比較するモデルを提供した。
【００９１】
ＰＫＡリン酸化されたＲｙＲ１の増加した活性は、ＨＦ骨格筋中のＳＲ Ｃａ２＋放出の変更に関連した。骨格筋において、Ｃａ２＋スパークは、ＲｙＲ１チャネルのクラスターから起こった基本のＣａ２＋放出事象を表す（Ｇｏｎｚａｌｅｚ ｅｔ ａｌ．，２０００）。成体哺乳類骨格筋からのＣａ２＋スパークは、技術的に記録することが難しいが（Ｓｈｉｒｏｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，１９９８）、それらは示された（Ｋｉｒｓｈ ｅｔ ａｌ．，２００１）。本研究において、Ｃａ２＋スパークは、減少した振幅、遅れた上昇時間及び延期された継続時間をＨＦ筋肉において呈した（図５）。ＦＫＢＰ１２のＲｙＲ１からの消耗はＳＲ Ｃａ２＋リークの可能性を増加させると予測されるが、何故なら、これらのチャネルは閉状態において脱安定化されるはずだからである。ＳＲ Ｃａ２＋リークはＳＲ Ｃａ２＋を消耗し、そしてＨＦ骨格筋において観察されたＳＲ Ｃａ２＋事象の振幅を減少させることに寄与する。Ｃａ２＋スパークを記録するため、筋肉繊維をサポニンで皮をむき、遊離の［Ｃａ２＋］を１３０ｎＭにてクランプした。全部のスパーク頻度が１３０ｎＭの休止［Ｃａ２＋］において極めて低かったため、これらの条件はＨＦ骨格筋においてスパーク頻度が顕著に増加しなかった理由を説明するのに適当である。一部には低（休止）レベルにおいて遊離のＣａ２＋をクランプするために低スパーク率と結合した（combined with）ＳＲ Ｃａ２＋ ＡＴＰａｓｅ活性がＳＲを補充したため、１３０ｎＭにおいて遊離のＣａ２＋をクランプすることが、４−クロロ−ｍ−クレゾール（カフェイン類似体）の急の応用（acute application）を用いて測定されたＨＦ骨格筋内のＳＲ Ｃａ２＋含有量の顕著な低下がなかった理由を説明できた。ＲｙＲ１複合体からのＦＫＢＰ１２の消耗を伴うはずのＲｙＲ１共役された関門の減少（Ｍａｒｘ ｅｔ ａｌ．，１９９８）は、ＨＦ骨格筋内のＳＲ Ｃａ２＋放出事象の延期された時間経過に寄与し得た。ＲｙＲ１チャネル間の共役された関門は、ＳＲ膜内で互いに物理的に接触するチャネルのグループを、単一Ｃａ２＋放出ユニットとして開閉可能にする機構であるかもしれない（Ｍａｒｘ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。ＲｙＲ１に結合するＦＫＢＰ１２は、共役された関門に必要である（Ｍａｒｘ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。ＦＫＢＰ１２の消耗による共役された関門の減少は、それらが完全な共役された関門を伴うはずであるように、それらは全てが一緒に開かないはずであるから、クラスター中のいくつかのＲｙＲ１チャネルの開口を遅延させるかもしれない。いくつかのチャネルのこの遅延された開口は、ＳＲ Ｃａ２＋放出の遅くなった速度に寄与し得た。同様に、減少した共役関門の条件下では、いくつかのＲｙＲ１チャネルの閉鎖が遅れるかもしれず、そしてこれがＳＲ Ｃａ２＋放出遷移の延期された減衰に寄与し得た。ＨＦ骨格筋内のＲｙＲ１のＰＫＡ高リン酸化のこれらの作用を描写するモデルを図７に示す。
【００９２】
ＰＫＡ高リン酸化されたＲｙＲ１を含むＨＦ骨格筋は延期された強直性痙攣症の半分収縮時間を呈した（図６Ｆ）。延期された強直性痙攣の半分時間（同じ繰り返しの刺激により強直性痙攣症を達成するには長い時間がかかることを意味する）は、ＦＫＢＰ１２の消耗のために起こるかもしれない、損なわれたＥＣ共役を反映し得た（Ｌａｍｂ ａｎｄ Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ，１９９６）が、正常な筋肉のＥＣ共役におけるＦＫＢＰ１２の特定の役割は明らかにされていない。ＨＦ骨格筋の初期の疲労（図６Ｅを参照）は、ＲｙＲ１の増加したＰＫＡリン酸化に強く相関する（図６Ｇ）ことから、これらの２つの発見の間の機能的な関連を示唆する。骨格筋細胞ではＣａ２＋の出入がほとんど無いので、それらはＥＣ共役に必要なＣａ２＋のほとんどをリサイクルするに違いない。骨格筋内のＦＫＢＰ１２を消耗するＰＫＡ高リン酸化されたＲｙＲ１のために、増加したＳＲ Ｃａ２＋リークを補うための一つのコストは、ＨＦ骨格筋内で観察される初期の疲労に寄与し得た増加したエネルギー消費であるかもしれない（Ｃａ２＋−ＡＴＰａｓｅによるＳＲへのＣａ２＋の戻りを供給するためにＡＴＰが必要である；図７Ａを参照）。
【００９３】
ＨＦにおける主な骨格筋の欠陥の重要性は、患者の疲労が心臓の機能とうまく相関しないという事実により理解される（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｃｏａｔｓ，１９９７）。さらに、骨格筋の問題は、アンギオテンシン変換酵素阻害剤の投与（Ｄｒｅｘｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９）及び心臓移植（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９）の両方が心臓の出力及び骨格筋の血流を増加させるが骨格筋の機能を改善しないため、損なわれた骨格筋の血流の単なる問題ではないらしい。多くの研究が、増加した乳酸塩（lactate）の生産及び代謝回転（Ｋａｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３）、より迅速なクレアチンリン酸の分解、及び減少したクレアチンリン酸の再合成を含む、ＨＦにおける骨格筋エネルギーの代謝の変化を記録した（Ｍａｎｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。
【００９４】
ＳＲ Ｃａ２＋放出チャネル機能及びＣａ２＋シグナリングの欠陥は、一方で、ＨＦにおいて損なわれた骨格筋機能の基礎となり得た機構をまさに提供する。心筋及び骨格筋の両方においてＥＣ共役筋疾患を推進する根源的病理は、おそらく、このチャネルの心臓の形態及び骨格の形態の両方のＰＫＡ高リン酸化を通して欠陥のあるＳＲ Ｃａ２＋放出チャネル（ＲｙＲ１及びＲｙＲ２）機能を導く慢性の高アドレナリン状態である。ＨＦにおいて慢性の高アドレナリン状態の逆の役割に関するさらなるサポートは、ＨＦにおいて心臓機能を改善するβ−アドレナリン受容体ブロッカーがＲｙＲ２のＰＫＡ高リン酸化を逆転させてチャネル機能を標準化させることを示す最近の研究に由来する（Ｄｏｉ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｒｅｉｋｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００１）。β−ブロッカーは心筋の機能を改善するが（例えば、改善された放出（ejection）フラクション）、それらはＨＦの患者において改善された運動の忍耐力に関してささやかな利益を有するか又は全く有さないことが示された（Ｇｕｌｌｅｓｔａｄ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｋｕｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。しかしながら、上でほのめかしたとおり、運動の忍耐力は、骨格筋機能により単に決定されず、そして代謝の準備（reserve）及び筋肉の強さを含むらしい。β−ブロッカーは骨格筋エネルギー代謝に対して複雑な効果を有する；例えば、プロプラノールはホスホリラーゼキナーゼ及びグリコーゲン合成の両方のβアドレナリン誘導性活性化を阻害する（Ｄｉｅｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９８０）。即ち、改善された骨格筋機能に関するβ−遮断の有益な効果は運動の忍耐力におけるほんの最小の改善をもたらすエネルギー代謝に対する逆作用によりバランスを保たれていた。
【００９５】
以前の研究から（Ｍａｒｘ ｅｔ ａｌ．，２０００）、この出願において開示されたデータは、ＨＦが、心筋と骨格筋の両横紋筋形態に影響する一般化されたＥＣ共役筋疾患として特徴があるらしいことを示す。この一般的ＥＣ共役筋疾患を引き起こす根源的な病理は、ＨＦの間に起こる慢性高アドレナリン状態らしい。
【００９６】
文献
【００９７】
【表３】
【００９８】
【表４】
【００９９】
【表５】
【０１００】
【表６】
【０１０１】
【表７】
【０１０２】
【表８】
【０１０３】
【表９】
【０１０４】
【表１０】
【０１０５】
【表１１】
【０１０６】
【表１２】
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１Ａ】図１Ａ．ＲｙＲ１へのＦＫＢＰ１２の結合はＲｙＲ１−Ｓｅｒ２８４３のＰＫＡリン酸化により調節される。（Ａ）ＷＴのＲｙＲ１と変異体（ＲｙＲ１−Ｓ２８４３Ａ及びＲｙＲ１−Ｓ２８４３Ｄ）のＲｙＲ１が等量、ＨＥＫ２９３細胞内で発現されたことを示すイムノブロット。
【図１Ｂ】図１Ｂ．ＲｙＲ１へのＦＫＢＰ１２の結合はＲｙＲ１−Ｓｅｒ２８４３のＰＫＡリン酸化により調節される。（Ｂ）［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰを用いたＰＫＡリン酸化を示すオートラジオグラフであり、ＰＫＡの阻害剤であるＰＫＩ５−２４を用いることによりリン酸化反応の特異性を示した。アラニン置換を用いることにより、ＲｙＲ１上の唯一のＰＫＡリン酸化部位としてＳｅｒ２８４３を同定した。
【図１Ｃ】図１Ｃ．ＲｙＲ１へのＦＫＢＰ１２の結合はＲｙＲ１−Ｓｅｒ２８４３のＰＫＡリン酸化により調節される。（Ｃ）ＷＴ及び変異体のＲｙＲ１へのＦＫＢＰ１２の結合を示すイムノブロットを、遠心分離（ＲｙＲ１によるＦＫＢＰ１２共沈殿）及びＦＫＢＰ１２イムノブロッティングにより評価した。ＦＫＢＰ１２は、ＰＫＡ−リン酸化ＲｙＲ１を構成的に模倣するＲｙＲ１−Ｓ２８４３Ｄには結合しない。
【図１Ｄ】図１Ｄ．ＲｙＲ１へのＦＫＢＰ１２の結合はＲｙＲ１−Ｓｅｒ２８４３のＰＫＡリン酸化により調節される。（Ｄ）ＲｙＲ１に結合したＰＫＡのｃＡＭＰによる活性化がＰＫＡ阻害剤のＰＫＩ５−２４により阻害されるチャネルのリン酸化を誘導することを示すオートラジオグラフ。チャネルに結合したＰＰ１のプロタミンによる活性化はオカダ酸（okadaic acid）（ＯＡ）によりブロックされるチャネルの脱リン酸化を誘導する。
【図１Ｅ】図１Ｅ．ＲｙＲ１へのＦＫＢＰ１２の結合はＲｙＲ１−Ｓｅｒ２８４３のＰＫＡリン酸化により調節される。（Ｅ）ＦＫＢＰ１２イムノブロットは、ＲｙＲ１のｃＡＭＰにより誘導されたＰＫＡリン酸化がＦＫＢＰ１２を上記チャネル複合体から解離させることを示す；ＦＫＢＰ１２は、ＰＫＡリン酸化されたチャネルには結合できないが、アルカリホスファターゼによる（又は結合したホスファターゼのプロタミンによる活性化による）チャネルの脱リン酸化は、共遠心分離により評価したところ、チャネルへのＦＫＢＰ１２の、のちの再結合を許容する。
【図２Ａ】図２Ａ．Ｓｅｒ２８４３のＰＫＡリン酸化はＲｙＲ１チャネルを活性化する。（Ａ）ＷＴのＲｙＲ１の代表的単一チャネルトレーシング。平坦な脂質２層におけるＲｙＲ１単一チャネルレコーディングは、１ｍＭのＡＴＰの存在下で１５０ｎＭの［Ｃａ２＋］ｃｉｓにおいてチャネルの活性を示し、チャネルを活性化する。レコーディングは０ｍＶにおいてであり、チャネルの閉じた状態が示される（「Ｃ」）；チャネルの開口は上向きである（upwards）。全ての点の振幅（amplitude）のヒストグラムを示す。開確率（Ｐｏ）、平均閉時間（Ｔｃ）及び開（Ｔｏ）休止時間を各チャネルトレーシングの上に示す。
【図２Ｂ】図２Ｂ．Ｓｅｒ２８４３のＰＫＡリン酸化はＲｙＲ１チャネルを活性化する。（Ｂ）ＲｙＲ１−Ｓ２８４３Ａ。平坦な脂質２層におけるＲｙＲ１単一チャネルレコーディングは、１ｍＭのＡＴＰの存在下で１５０ｎＭの［Ｃａ２＋］ｃｉｓにおいてチャネルの活性を示し、チャネルを活性化する。レコーディングは０ｍＶにおいてであり、チャネルの閉じた状態が示される（「Ｃ」）；チャネルの開口は上向きである（upwards）。全ての点の振幅（amplitude）のヒストグラムを示す。開確率（Ｐｏ）、平均閉時間（Ｔｃ）及び開（Ｔｏ）休止時間を各チャネルトレーシングの上に示す。
【図２Ｃ】図２Ｃ．Ｓｅｒ２８４３のＰＫＡリン酸化はＲｙＲ１チャネルを活性化する。（Ｃ）ＰＫＡ−リン酸化されたＷＴ ＲｙＲ１。平坦な脂質２層におけるＲｙＲ１単一チャネルレコーディングは、１ｍＭのＡＴＰの存在下で１５０ｎＭの［Ｃａ２＋］ｃｉｓにおいてチャネルの活性を示し、チャネルを活性化する。レコーディングは０ｍＶにおいてであり、チャネルの閉じた状態が示される（「Ｃ」）；チャネルの開口は上向きである（upwards）。全ての点の振幅（amplitude）のヒストグラムを示す。開確率（Ｐｏ）、平均閉時間（Ｔｃ）及び開（Ｔｏ）休止時間を各チャネルトレーシングの上に示す。
【図２Ｄ】図２Ｄ．Ｓｅｒ２８４３のＰＫＡリン酸化はＲｙＲ１チャネルを活性化する。（Ｄ）ＲｙＲ１−Ｓ２８４３Ｄ。平坦な脂質２層におけるＲｙＲ１単一チャネルレコーディングは、１ｍＭのＡＴＰの存在下で１５０ｎＭの［Ｃａ２＋］ｃｉｓにおいてチャネルの活性を示し、チャネルを活性化する。レコーディングは０ｍＶにおいてであり、チャネルの閉じた状態が示される（「Ｃ」）；チャネルの開口は上向きである（upwards）。全ての点の振幅（amplitude）のヒストグラムを示す。開確率（Ｐｏ）、平均閉時間（Ｔｃ）及び開（Ｔｏ）休止時間を各チャネルトレーシングの上に示す。
【図２Ｅ】（Ｅ）ＲｙＲ１−Ｖ２４６１Ｉ（この変異体ＲｙＲ１はＦＫＢＰ１２．６には結合するがＦＫＢＰ１２にはしないことが以前に示された（Ｇａｂｕｒｊａｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２００１））。平坦な脂質２層におけるＲｙＲ１単一チャネルレコーディングは、１ｍＭのＡＴＰの存在下で１５０ｎＭの［Ｃａ２＋］ｃｉｓにおいてチャネルの活性を示し、チャネルを活性化する。レコーディングは０ｍＶにおいてであり、チャネルの閉じた状態が示される（「Ｃ」）；チャネルの開口は上向きである（upwards）。全ての点の振幅（amplitude）のヒストグラムを示す。開確率（Ｐｏ）、平均閉時間（Ｔｃ）及び開（Ｔｏ）休止時間を各チャネルトレーシングの上に示す。
【図３Ａ】図３Ａ．ＨＦ骨格筋におけるＲｙＲ１のＰＫＡ高リン酸化。（Ａ）ＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化を、対照の正常なイヌ及びペーシングにより誘導されたＨＦのイヌからの骨格筋ホモジェネートにおいて測定した。イムノブロッティングにより示されるとおり、均等な量のＲｙＲ１蛋白質を各キナージング反応において用いた。正常（ｎ＝２）及びＨＦ（ｎ＝５）動物からの骨格筋ホモジェネートからのＲｙＲ１の相対的ＰＫＡリン酸化は、特異的リン酸化シグナルをＲｙＲ１蛋白質の量で割ることにより決定した（イムノブロッティング及びデンシトメトリーにより測定）。結果はＰＫＡ−依存性［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰシグナル±平均の標準偏差の逆数として表す。
【図３Ｂ】図３Ｂ．ＨＦ骨格筋におけるＲｙＲ１のＰＫＡ高リン酸化。（Ｂ）ＲｙＲ１へ結合したＦＫＢＰ１２の量は、共免疫沈殿、続くイムノブロッティングにより評価した。
【図３Ｃ】図３Ｃ．ＨＦ骨格筋におけるＲｙＲ１のＰＫＡ高リン酸化。（Ｃ）代表的なイムノブロットは、ＲｙＲ１マクロ分子複合体：ＲｙＲ１，ＰＫＡ，ＰＰ１，及びＦＫＢＰ１２の成分に関して、正常（ｎ＝２）及びＨＦ動物（ｎ＝５）を用いて示される。蛋白質のレベルをイムノブロットのデンシトメトリーを用いて定量した。結果を、各免疫沈殿においてＲｙＲ１の量に関して補正されたＲｙＲ１マクロ分子複合体の成分の各々の相対量として表す。
【図４Ａ】図４Ａ．ＨＦの間の骨格筋から単離されたＲｙＲ１の欠陥性単一チャネルの特性。（Ａ）正常なイヌの骨格筋からのＲｙＲ１チャネルからの単一チャネルトレース及び対応する電流の振幅のヒストグラム。Ａ及びＢにおいて、上部のトレーシングは１００ｎＭ［Ｃａ２＋］ｃｉｓにおいて記録され、そして底部のトレーシングは、開確率（Ｐｏ）を増加させるために１ｍＭのＡＴＰによりＲｙＲ１チャネルを活性化した後に記録された。開（Ｔｏ）及び閉（Ｔｃ）休止時間及びＰｏを、代表的なトレーシングの上に各条件に関して示す。Ａ及びＢにおいて、底部トレーシングは延長された時間スケールを示す。ＰＫＡ−高リン酸化されたチャネルの副伝導性状態に関する電流レベル（０，１，２，３，４ｐＡ）をＢにおいて底部トレーシングにて示すことを示す線。各チャネルに関して全ての点の振幅のヒストグラムを示す。レコーディングは０ｍＶであり、そしてチャネルの閉じた状態を示す（「Ｃ」）；チャネルの開口は上向き偏差（deflections）である。
【図４Ｂ】図４Ｂ．ＨＦの間の骨格筋から単離されたＲｙＲ１の欠陥性単一チャネルの特性。（Ｂ）ＨＦのイヌの骨格筋からのＲｙＲ１チャネルからの単一チャネルトレース及び対応する電流の振幅のヒストグラム。Ａ及びＢにおいて、上部のトレーシングは１００ｎＭ［Ｃａ２＋］ｃｉｓにおいて記録され、そして底部のトレーシングは、開確率（Ｐｏ）を増加させるために１ｍＭのＡＴＰによりＲｙＲ１チャネルを活性化した後に記録された。開（Ｔｏ）及び閉（Ｔｃ）休止時間及びＰｏを、代表的なトレーシングの上に各条件に関して示す。Ａ及びＢにおいて、底部トレーシングは延長された時間スケールを示す。ＰＫＡ−高リン酸化されたチャネルの副伝導性状態に関する電流レベル（０，１，２，３，４ｐＡ）をＢにおいて底部トレーシングにて示すことを示す線。各チャネルに関して全ての点の振幅のヒストグラムを示す。レコーディングは０ｍＶであり、そしてチャネルの閉じた状態を示す（「Ｃ」）；チャネルの開口は上向き偏差（deflections）である。
【図５Ａ】図５Ａ．ＨＦ骨格筋における局所Ｃａ２＋シグナリングの欠損。（Ａ）シャム及び心筋梗塞後の治療（ＰＭＩ）ＨＦラットの筋肉内で回収されたＣａ２＋スパークの代表的な例の△Ｆ／Ｆラインスキャンイメージ。各イメージの上部おいては、対応するＣａ２＋スパーク時間経過を表す。各ヒストグラムの上部において、ボックスチャートは２５、５０及び７５百分順位を示す；水平線は１から９９％の範囲の分布を示す。シャム：白のシンボル（ｎ＝１３７．３動物）、ＰＭＩ：グレーのシンボル（ｎ＝８２．２動物）。（＊Ｐ＜０．０５）。ＦＤＨＭ，１／２ピーク振幅における全継続時間。ＦＷＨＭ，１／２ピーク振幅における全振幅。
【図５Ｂ】図５Ｂ．ＨＦ骨格筋における局所Ｃａ２＋シグナリングの欠損。（Ｂ）記録されたＣａ２＋スパークの集団の時空的な特性の相対的分布。各ヒストグラムの上部において、ボックスチャートは２５、５０及び７５百分順位を示す；水平線は１から９９％の範囲の分布を示す。シャム：白のシンボル（ｎ＝１３７．３動物）、ＰＭＩ：グレーのシンボル（ｎ＝８２．２動物）。（＊Ｐ＜０．０５）。ＦＤＨＭ，１／２ピーク振幅における全継続時間。ＦＷＨＭ，１／２ピーク振幅における全振幅。
【図６Ａ】図６Ａ．ＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化及び筋肉収縮。（Ａ）シャム手術された（対照）ラット及びＨＦラットの骨格筋からのＲｙＲ１のＰＫＡ逆−リン酸化（back-phosphorylation）を示すオートラジオグラム。棒グラフは、ＲｙＲ１の相対的ＰＫＡリン酸化を示す（記載されたとおり逆−リン酸化の逆数として表される）（Ｍａｒｘ ｅｔ ａｌ．，２０００）。
【図６Ｂ】図６Ｂ．ＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化及び筋肉収縮。（Ｂ）対照及びＨＦの骨格筋からの抗−ＲｙＲ１抗体により免疫沈殿されたＲｙＲ１，ｍＡＫＡＰ，ＰＤＥ４Ｄ３，ＰＰ１及びＦＫＢＰ１２の相対量を示すイムノブロット及び棒グラフ。
【図６Ｃ】図６Ｃ．ＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化及び筋肉収縮。（Ｃ）対照及びＨＦイヌ及びラット骨格筋中の等量の全細胞ＦＫＢＰ１２を示すイムノブロット。
【図６Ｄ】図６Ｄ．ＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化及び筋肉収縮。（Ｄ）１００μｇのヒト骨格筋ＳＲにおいて検出されたＲｙＲ１，ｍＡＫＡＰ及びＰＤＥ４Ｄ３を示すイムノブロット；陰性対照は対応する抗原ペプチドにより予め吸着された抗体を用いる。
【図６Ｅ】図６Ｅ．ＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化及び筋肉収縮。（Ｅ）ＨＦ骨格筋は対照より早く疲労する。各ラット（ｎ＝５対照、ｎ＝８ＨＦ）からの対側性ひらめ筋を組織のバスにマウントすることにより、収縮機能を評価した（筋肉機能プロトコルに関する材料と方法を参照）。代表的な疲労時間トレーシングを、対照とＨＦの骨格筋に関して示す。棒グラフは、平均（±ＳＤ）時間対疲労を示す、＊Ｐ＜０．０５。
【図６Ｆ】図６Ｆ．ＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化及び筋肉収縮。（Ｆ）ＨＦ骨格筋は、対照よりもゆっくりと強直性痙攣症を達する。代表的な強直性痙攣症トレーシングを、対照とＨＦの骨格筋に関して示す。強直性痙攣症は、材料と方法に記載されるとおり、高頻度の刺激により誘導された。棒グラフは、強直性痙攣症の１／２収縮時間を示す、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図６Ｇ】図６Ｇ．ＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化及び筋肉収縮。（Ｇ）シャム及びＨＦの動物のラット骨格筋の時間対疲労及びＲｙＲ１ ＰＫＡリン酸化（＝０．８８）の間の相関。筋肉の機能及びＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化を、各動物からの対側性ひらめ筋を用いて評価した。
【図７Ａ】図７Ａ．心不全の骨格筋におけるＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化の効果のモデル。（Ａ）骨格筋プラズマ膜（横断細管（transverse tubule））の脱分極は電圧関門Ｃａ２＋チャネル（ＤＨＰＲ）を活性化して、次に、ＤＨＰＲの細胞質ドメインとＲｙＲ１の細胞質ドメインの間の相互作用を通してＲｙＲ１を活性化する。ＲｙＲ１の活性化は、チャネルを開き、そしてＳＲ貯蔵所からＣａ２＋を筋形質へ放出させて、筋肉収縮をもたらす。筋肉の弛緩は、Ｃａ２＋−ＡＴＰａｓｅ，ＳＥＲＣＡにより細胞質からＳＲに戻るＣａ２＋の取り込みにより測定される。このモデルにおいては、ＲｙＲ１が、４つのＲｙＲ１及び４つのＦＫＢＰ１２（示された）、並びに標的化蛋白質（ＴＰ）によりＲｙＲ１に結合したＰＫＡとＰＰ１を含むマクロ分子複合体である（各々の４つの内の一つのみを示す）（Ｍａｒｘ ｅｔ ａｌ．，２００１）。
【図７Ｂ】図７Ｂ．心不全の骨格筋におけるＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化の効果のモデル。（Ｂ）正常なＲｙＲ１は、チャネルが低いμＭ［Ｃａ２＋］ｃｙｔにおいて活性化されてｍＭ［Ｃａ２＋］ｃｙｔにおいて阻害されるように、増加する［Ｃａ２＋］ｃｙｔに対してベル型の応答を呈する。
【図７Ｃ】図７Ｃ．心不全の骨格筋におけるＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化の効果のモデル。（Ｃ）ＲｙＲ１はＳＲ膜上でクラスター中に存在し、ＦＫＢＰ１２（小さなグレーの円）がチャネルに結合することを必要とする共役された関門（coupled gating）と呼ばれる機構によりチャネルのグループとして開いて閉じる（Ｍａｒｘ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。
【図７Ｄ】図７Ｄ．心不全の骨格筋におけるＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化の効果のモデル。（Ｄ）Ｃａ２＋スパークはＲｙＲ１チャネルのグループの活性化のために、本質的なＳＲ Ｃａ２＋放出事象を表す（Ｇｏｎｚａｌｅｚ ｅｔ ａｌ．，２０００）。
【図７Ｅ】図７Ｅ．心不全の骨格筋におけるＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化の効果のモデル。（Ｅ）強直性痙攣症（骨格筋収縮）は、複数の動作のポテンシャルが合計されて、筋形質のＣａ２＋の延期された上昇が連続する収縮を活性化する。
【図７Ｆ】図７Ｆ．心不全の骨格筋におけるＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化の効果のモデル。（Ｆ）β−アドレナリン受容体の活性化は、ｃＡＭＰレベルの上昇を導き、今度はＰＫＡを活性化して、ＲｙＲ１をリン酸化する。心不全におけるＲｙＲ１のＰＫＡ高リン酸化は、各チャネルからのＦＫＢＰ１２のほとんどの解離をもたらす。
【図７Ｇ】図７Ｇ．心不全の骨格筋におけるＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化の効果のモデル。（Ｇ）ＦＫＢＰ１２（小さなグレーの円）のＲｙＲ１からの解離は、チャネル間の共役された関門の損失を引き起こす（Ｍａｒｘ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。これは、確率論的な関門をもたらすが、解剖学上はたった５０％のＲｙＲ１チャネルしかＤＨＰＲと関連しないので（５０％のＲｙＲ１はＤＨＰＲとの相互作用により活性化できない）、ＲｙＲ１チャネルのグループ中で同時にチャネルのフラクションのみが開くことを意味する（Ｆｒａｎｚｉｎｉ−Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ ａｎｄ Ｋｉｓｈ，１９９５）。
【図７Ｈ】図７Ｈ．心不全の骨格筋におけるＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化の効果のモデル。（Ｈ）心不全の骨格筋からのＣａ２＋スパークは、遅延した上昇運動、低下した振幅、及び延期された減衰を呈し、全てはＲｙＲ１チャネルのグループの間の共役された関門の損失に一致する。実線は、心不全骨格筋におけるＣａ２＋シグナルであり、破線は正常な骨格筋におけるＣａ２＋シグナルを表す。
【図７Ｉ】図７Ｉ．心不全の骨格筋におけるＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化の効果のモデル。（Ｉ）強直性痙攣症は、筋形質Ｃａ２＋の保持された上昇をもたらすＣａ２＋放出事象の加重（summation）を引き起こす繰り返された高頻度の作動ポテンシャルの結果として、骨格筋において発症する。
【図７Ｊ】図７Ｊ．心不全の骨格筋におけるＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化の効果のモデル。（Ｊ）Ｃａ２＋の放出の上昇時間の遅延化及び減少した振幅は、心不全の骨格筋において観察された強直性痙攣症の発症における遅延と一致する。実線は、心不全の骨格筋における強直性痙攣症の発症であり、破線は正常な強直性痙攣症を表す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タイプ１ライアノジン（ＲｙＲ１）受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離を第１の薬剤が阻害するか否かを決定するための方法であって、
（ａ）別々に、（ｉ）ＲｙＲ１受容体を発現する細胞又は（ｉｉ）そのような細胞からの抽出物からの筋形質網状構造又は細胞質網状構造を、（１）上記の第１薬剤とＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離を引き起こすことが知られている第２薬剤の両方と、及び（２）そのような第２薬剤の存在下でＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離に適した条件下で、そのような第２薬剤のみと、接触させ；そして
（ｂ）第２薬剤のみの存在下、及び第１と第２薬剤の両方の存在下で、ＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離の程度を測定するが、第１と第２薬剤の両方の存在下でのＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離の程度が第１薬剤のみの存在下でのＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離の程度よりも小さいことが、第１薬剤がＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離の程度を阻害することを示し、それにより、第１薬剤がタイプ１ライアノジン（ＲｙＲ１）受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離の程度を阻害するか否かを示す
ことを含む方法。
【請求項２】
第１薬剤がＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離を阻害することが以前に知られていない、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離を阻害する薬剤を同定するために、ＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離を阻害することが知られていない多数の薬剤をスクリーニングする方法であって、
（ａ）（ｉ）ＲｙＲ１受容体を発現する細胞又は（ｉｉ）そのような細胞からの抽出物からの筋形質網状構造又は細胞質網状構造を引き起こすことが知られている多数の薬剤の一つ又は複数と、そのような解離薬剤の存在下でＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離を許容する条件下で接触させ；
（ｂ）そのような薬剤の不在下でのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離の程度に比較して、多数の薬剤の一つ又は複数の存在下でＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離の程度が低下するか否かを測定し；そして
（ｃ）工程（ｂ）において測定された解離の程度が一つより多い薬剤の存在下において低下したなら、別々に、そのような薬剤がＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離の程度を阻害するか否か測定し、それによりそのような多数の薬剤のうちのそのような薬剤がＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離を阻害すると決定する
ことを含む方法。
【請求項４】
ＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離の程度を決定することが、ＲｙＲ１受容体のプロテインキナーゼＡリン酸化を測定することを含む、請求項１又は３記載の方法。
【請求項５】
ＲｙＲ１受容体のプロテインキナーゼＡリン酸化を測定することが、ＲｙＲ１受容体の非リン酸化形態ではなくてリン酸化形態に結合する抗体の結合を検出することを含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】
ＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離の程度を決定することが、カルシウム−感受性蛍光染料の蛍光を測定することを含む、請求項１又は３記載の方法。
【請求項７】
ＲｙＲ１受容体がヒトＲｙＲ１受容体である、請求項１又は３記載の方法。
【請求項８】
細胞を薬剤に接触させ、そしてＲｙＲ１受容体をそのような細胞に対して内因性である核酸から発現させる、請求項１又は３記載の方法。
【請求項９】
細胞を薬剤に接触させ、そしてＲｙＲ１受容体をそのような細胞にトランスフェクトされた核酸から発現させる、請求項１又は３記載の方法。
【請求項１０】
細胞が細菌、酵母、昆虫、両生類、植物又は哺乳類の細胞である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
細胞が、ＨＥＫ２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＬＭ（ｔｋ−）細胞、マウス胚性繊維芽ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、マウスＹ１細胞、２９３ヒト胚性腎臓細胞及びヒーラ細胞からなる群から選択される、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
細胞が、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞又はイラクサギンウワバ（Trichoplusia ni）５Ｂ−４細胞からなる群から選択される昆虫細胞である、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
細胞が、アフリカツメガエル（Xenopus）卵母細胞又はアフリカツメガエル黒色胞細胞からなる群から選択される両生類細胞である、請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
細胞が、欠陥を有する心臓を持つ被験者からの骨格筋である、請求項１又は３記載の方法。
【請求項１５】
被験者が、心臓の欠陥が急速な心臓ペーシング又はヒトにより誘導された動物である、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
組成物を製造する方法であって、薬剤を用意し、請求項１又は３記載の方法によるタイプ１ライアノジン（ＲｙＲ１）受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離を当該薬剤が阻害するか否かを決定し、ＲｙＲ１受容体と離して当該薬剤を回収し、そして担体と当該薬剤を混合することを含む方法。
【請求項１７】
欠陥のある骨格筋機能を有する被験者を治療する方法であって、被験者に、被験者の骨格筋のタイプ１ライアノジン（ＲｙＲ１）受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離を低下させるのに有効な薬剤をある量投与し、それにより、被験者の骨格筋の機能を軽減させることを含む方法。
【請求項１８】
薬剤が、被験者の骨格筋のタイプ１ライアノジン（ＲｙＲ１）受容体のプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）リン酸化を低下させる、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
被験者の欠陥のある骨格筋機能が心不全の間に起こる、請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
薬剤が被験者の心不全を軽減もする、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
薬剤がベータアドレナリン様ブロッカーではない、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
被験者の欠陥のある骨格筋機能が、慢性の閉塞性肺疾患、高血圧、喘息又は甲状腺機能亢進症の間に起こる、請求項１７記載の方法。
【請求項２３】
欠陥のある骨格筋機能を有する被験者を治療する方法であって、被験者に、被験者の骨格筋のタイプ１ライアノジン（ＲｙＲ１）受容体／カルシウム放出チャネルへのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の結合を模倣するのに有効な薬剤をある量投与することにより、チャネルの開口の確率を減少させ、それにより被験者の欠陥のある骨格筋機能を軽減させることを含む方法。
【請求項２４】
被験者の欠陥のある骨格筋機能が心不全の間に起こる、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
薬剤が被験者の心不全を軽減もする、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
被験者の欠陥のある骨格筋機能が、慢性の閉塞性肺疾患、高血圧、喘息又は甲状腺機能亢進症の間に起こる、請求項２３記載の方法。
【請求項２７】
欠陥のある骨格筋機能を有する被験者を治療する方法であって、被験者に、請求項１又は３記載の方法により、タイプ１ライアノジン（ＲｙＲ１）受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離を阻害すると決定された薬剤又はそのような薬剤の構造上及び機能上の類似体又は相同体を治療上有効な量投与することを含む方法。
【請求項２８】
被験者の欠陥のある骨格筋機能が心不全の間に起こる、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
薬剤が被験者の心不全を軽減もする、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
被験者の欠陥のある骨格筋機能が、慢性の閉塞性肺疾患、高血圧、喘息又は甲状腺機能亢進症の間に起こる、請求項２７記載の方法。
【請求項３１】
薬剤がベータアドレナリン様ブロッカーではない、請求項２８記載の方法。
【請求項３２】
異常性を治療するための薬学組成物の製造のための、請求項１又は３記載の方法により、タイプ１ライアノジン（ＲｙＲ１）受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離を阻害すると決定された薬剤の使用であって、異常性は、タイプ１（ＲｙＲ１）受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離を阻害することにより軽減される、上記使用。
【請求項３３】
薬学組成物の製造が、上記薬剤を治療上有効な量、薬学上受容可能な担体と混合することを含む、請求項３２の使用。
【請求項３４】
欠陥のある骨格筋機能を有する被験者を治療する方法であって、被験者に、被験者の骨格筋のタイプ１ライアノジン（ＲｙＲ１）受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離を低下させるのに有効なベータアドレナリン様ブロッカーをある量投与することにより被験者の骨格筋の機能を軽減させることを含む方法。
【請求項３５】
ベータアドレナリン様ブロッカーが、カルベジロール（Ｃｏｒｅｇ（登録商標）、スミスクラインビーチャム）又はメトプロロール（Ｔｏｐｒｏｌ−ＸＬ（登録商標）、アストラゼネカ）である、請求項３４記載の方法。
【請求項１】
タイプ１ライアノジン（ＲｙＲ１）受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離を第１の薬剤が阻害するか否かを決定するための方法であって、
（ａ）別々に、（ｉ）ＲｙＲ１受容体を発現する細胞又は（ｉｉ）そのような細胞からの抽出物からの筋形質網状構造又は細胞質網状構造を、（１）上記の第１薬剤とＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離を引き起こすことが知られている第２薬剤の両方と、及び（２）そのような第２薬剤の存在下でＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離に適した条件下で、そのような第２薬剤のみと、接触させ；そして
（ｂ）第２薬剤のみの存在下、及び第１と第２薬剤の両方の存在下で、ＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離の程度を測定するが、第１と第２薬剤の両方の存在下でのＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離の程度が第１薬剤のみの存在下でのＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離の程度よりも小さいことが、第１薬剤がＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離の程度を阻害することを示し、それにより、第１薬剤がタイプ１ライアノジン（ＲｙＲ１）受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離の程度を阻害するか否かを示す
ことを含む方法。
【請求項２】
第１薬剤がＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離を阻害することが以前に知られていない、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離を阻害する薬剤を同定するために、ＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離を阻害することが知られていない多数の薬剤をスクリーニングする方法であって、
（ａ）（ｉ）ＲｙＲ１受容体を発現する細胞又は（ｉｉ）そのような細胞からの抽出物からの筋形質網状構造又は細胞質網状構造を引き起こすことが知られている多数の薬剤の一つ又は複数と、そのような解離薬剤の存在下でＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離を許容する条件下で接触させ；
（ｂ）そのような薬剤の不在下でのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離の程度に比較して、多数の薬剤の一つ又は複数の存在下でＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離の程度が低下するか否かを測定し；そして
（ｃ）工程（ｂ）において測定された解離の程度が一つより多い薬剤の存在下において低下したなら、別々に、そのような薬剤がＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離の程度を阻害するか否か測定し、それによりそのような多数の薬剤のうちのそのような薬剤がＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離を阻害すると決定する
ことを含む方法。
【請求項４】
ＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離の程度を決定することが、ＲｙＲ１受容体のプロテインキナーゼＡリン酸化を測定することを含む、請求項１又は３記載の方法。
【請求項５】
ＲｙＲ１受容体のプロテインキナーゼＡリン酸化を測定することが、ＲｙＲ１受容体の非リン酸化形態ではなくてリン酸化形態に結合する抗体の結合を検出することを含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】
ＲｙＲ１受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離の程度を決定することが、カルシウム−感受性蛍光染料の蛍光を測定することを含む、請求項１又は３記載の方法。
【請求項７】
ＲｙＲ１受容体がヒトＲｙＲ１受容体である、請求項１又は３記載の方法。
【請求項８】
細胞を薬剤に接触させ、そしてＲｙＲ１受容体をそのような細胞に対して内因性である核酸から発現させる、請求項１又は３記載の方法。
【請求項９】
細胞を薬剤に接触させ、そしてＲｙＲ１受容体をそのような細胞にトランスフェクトされた核酸から発現させる、請求項１又は３記載の方法。
【請求項１０】
細胞が細菌、酵母、昆虫、両生類、植物又は哺乳類の細胞である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
細胞が、ＨＥＫ２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＬＭ（ｔｋ−）細胞、マウス胚性繊維芽ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、マウスＹ１細胞、２９３ヒト胚性腎臓細胞及びヒーラ細胞からなる群から選択される、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
細胞が、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞又はイラクサギンウワバ（Trichoplusia ni）５Ｂ−４細胞からなる群から選択される昆虫細胞である、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
細胞が、アフリカツメガエル（Xenopus）卵母細胞又はアフリカツメガエル黒色胞細胞からなる群から選択される両生類細胞である、請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
細胞が、欠陥を有する心臓を持つ被験者からの骨格筋である、請求項１又は３記載の方法。
【請求項１５】
被験者が、心臓の欠陥が急速な心臓ペーシング又はヒトにより誘導された動物である、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
組成物を製造する方法であって、薬剤を用意し、請求項１又は３記載の方法によるタイプ１ライアノジン（ＲｙＲ１）受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離を当該薬剤が阻害するか否かを決定し、ＲｙＲ１受容体と離して当該薬剤を回収し、そして担体と当該薬剤を混合することを含む方法。
【請求項１７】
欠陥のある骨格筋機能を有する被験者を治療する方法であって、被験者に、被験者の骨格筋のタイプ１ライアノジン（ＲｙＲ１）受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離を低下させるのに有効な薬剤をある量投与し、それにより、被験者の骨格筋の機能を軽減させることを含む方法。
【請求項１８】
薬剤が、被験者の骨格筋のタイプ１ライアノジン（ＲｙＲ１）受容体のプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）リン酸化を低下させる、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
被験者の欠陥のある骨格筋機能が心不全の間に起こる、請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
薬剤が被験者の心不全を軽減もする、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
薬剤がベータアドレナリン様ブロッカーではない、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
被験者の欠陥のある骨格筋機能が、慢性の閉塞性肺疾患、高血圧、喘息又は甲状腺機能亢進症の間に起こる、請求項１７記載の方法。
【請求項２３】
欠陥のある骨格筋機能を有する被験者を治療する方法であって、被験者に、被験者の骨格筋のタイプ１ライアノジン（ＲｙＲ１）受容体／カルシウム放出チャネルへのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の結合を模倣するのに有効な薬剤をある量投与することにより、チャネルの開口の確率を減少させ、それにより被験者の欠陥のある骨格筋機能を軽減させることを含む方法。
【請求項２４】
被験者の欠陥のある骨格筋機能が心不全の間に起こる、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
薬剤が被験者の心不全を軽減もする、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
被験者の欠陥のある骨格筋機能が、慢性の閉塞性肺疾患、高血圧、喘息又は甲状腺機能亢進症の間に起こる、請求項２３記載の方法。
【請求項２７】
欠陥のある骨格筋機能を有する被験者を治療する方法であって、被験者に、請求項１又は３記載の方法により、タイプ１ライアノジン（ＲｙＲ１）受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離を阻害すると決定された薬剤又はそのような薬剤の構造上及び機能上の類似体又は相同体を治療上有効な量投与することを含む方法。
【請求項２８】
被験者の欠陥のある骨格筋機能が心不全の間に起こる、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
薬剤が被験者の心不全を軽減もする、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
被験者の欠陥のある骨格筋機能が、慢性の閉塞性肺疾患、高血圧、喘息又は甲状腺機能亢進症の間に起こる、請求項２７記載の方法。
【請求項３１】
薬剤がベータアドレナリン様ブロッカーではない、請求項２８記載の方法。
【請求項３２】
異常性を治療するための薬学組成物の製造のための、請求項１又は３記載の方法により、タイプ１ライアノジン（ＲｙＲ１）受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離を阻害すると決定された薬剤の使用であって、異常性は、タイプ１（ＲｙＲ１）受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離を阻害することにより軽減される、上記使用。
【請求項３３】
薬学組成物の製造が、上記薬剤を治療上有効な量、薬学上受容可能な担体と混合することを含む、請求項３２の使用。
【請求項３４】
欠陥のある骨格筋機能を有する被験者を治療する方法であって、被験者に、被験者の骨格筋のタイプ１ライアノジン（ＲｙＲ１）受容体からのＦＫＢＰ１２結合蛋白質の解離を低下させるのに有効なベータアドレナリン様ブロッカーをある量投与することにより被験者の骨格筋の機能を軽減させることを含む方法。
【請求項３５】
ベータアドレナリン様ブロッカーが、カルベジロール（Ｃｏｒｅｇ（登録商標）、スミスクラインビーチャム）又はメトプロロール（Ｔｏｐｒｏｌ−ＸＬ（登録商標）、アストラゼネカ）である、請求項３４記載の方法。
【公表番号】特表２００７−５２５１６５（Ｐ２００７−５２５１６５Ａ）
【公表日】平成１９年９月６日（２００７．９．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５０９２３１（Ｐ２００６−５０９２３１）
【出願日】平成１６年３月５日（２００４．３．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００６９７１
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０８０２８３
【国際公開日】平成１６年９月２３日（２００４．９．２３）
【出願人】（５０５０１９９９８）トラスティーズ・オブ・コロンビア・ユニバーシティ・イン・ザ・シティ・オブ・ニューヨーク (7)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年９月６日（２００７．９．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年３月５日（２００４．３．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００６９７１
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０８０２８３
【国際公開日】平成１６年９月２３日（２００４．９．２３）
【出願人】（５０５０１９９９８）トラスティーズ・オブ・コロンビア・ユニバーシティ・イン・ザ・シティ・オブ・ニューヨーク (7)
【Ｆターム（参考）】
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