タキサン類の生産方法、およびカルス誘導方法
【課題】イチイ属植物から形成されたカルス細胞から、タキサン類をより大量に生産する方法、および植物細胞または植物組織片から効率よくカルス誘導を行う方法の提供。
【解決手段】イチイ（Ｔａｘｕｓ）属植物の植物細胞または植物組織片から形成されたカルス細胞を、植物ホルモン、水素ガス、および一酸化窒素ガスからなる群より選択される１種以上のガスを含有する微細気泡を含む培養液中で懸濁培養し、培養後のカルス細胞または培養液からタキサン類を回収することを特徴とする、タキサン類の生産方法、並びに植物細胞または植物組織片を、二酸化塩素溶液を用いて殺菌処理する表面殺菌工程と、前記表面殺菌工程後に、当該植物細胞または植物組織片をカルス誘導固体培地で培養し、カルス化を誘導することによりカルス細胞を形成する培養工程と、を有することを特徴とするカルス誘導方法。
【解決手段】イチイ（Ｔａｘｕｓ）属植物の植物細胞または植物組織片から形成されたカルス細胞を、植物ホルモン、水素ガス、および一酸化窒素ガスからなる群より選択される１種以上のガスを含有する微細気泡を含む培養液中で懸濁培養し、培養後のカルス細胞または培養液からタキサン類を回収することを特徴とする、タキサン類の生産方法、並びに植物細胞または植物組織片を、二酸化塩素溶液を用いて殺菌処理する表面殺菌工程と、前記表面殺菌工程後に、当該植物細胞または植物組織片をカルス誘導固体培地で培養し、カルス化を誘導することによりカルス細胞を形成する培養工程と、を有することを特徴とするカルス誘導方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イチイ（Ｔａｘｕｓ）属植物から形成されたカルス細胞からタキサン類を生産する方法、および植物細胞または植物組織片からカルス細胞を形成する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タキソール（パクリタキセル）は、イチイ属植物から単離されたアルカロイドであって、種々の癌細胞に対して抗腫瘍活性を呈する。また、イチイ属植物からはその他にも、バッカチンIIIやタキサジエン等のタキソールと同様に抗腫瘍活性を有するタキサン類が単離されている。これらのタキサン類は、主に抗癌剤の有効成分として利用されている。
【０００３】
タキソールの製造方法としては、例えば、イチイ属植物の葉からバッチカンIIIを抽出した後、これを原料化合物として化学合成を行い、タキソールを生産する方法が開発されている。しかしながら、化学合成法では高コストとなるという問題があった。
一方で、タキソールは主としてタキサス・ブレビフォーリア（Ｔａｘｕｓ ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ）の樹皮に、グラム乾燥質量当たりおよそ０．０２％含まれることが知られている。このように、タキソールのイチイ属植物中のタキソール含有量は非常に少ないため、十分な量のタキソールを回収するためには、イチイ属植物が大量に必要になる。その上、イチイ属植物の成長速度は著しく遅い。このため、需要に足る分のタキソールを天然資源から回収することは、森林の生態系に甚大な影響を及ぼす可能性がある。
【０００４】
そこで、イチイ属植物から得られた培養細胞等にタキソールを生産させ、これを回収する方法が検討されている。例えば特許文献１には、次亜塩素酸による殺菌処理後にカルス誘導を行うことによって、イチイ属植物の組織片からカルス細胞を得、当該カルス細胞を、植物種ごとに最適化されたタキソール生産培地中で懸濁培養することにより、高収率でタキソールを回収することができる方法が開示されている。また、特許文献２には、イチイ属植物の組織片を次亜塩素酸により殺菌処理した後に、ジベレリンを含む固体培地で培養することによってカルス細胞を得、当該カルス細胞を、ジベレリンを含む液体培地で懸濁培養することにより、タキソールを回収することができる方法が開示されている。その他、特許文献３には、イチイ属植物の中でその他の植物組織よりも多くのタキソールを含有している接合体胚に対して、次亜塩素酸による殺菌処理後にカルス誘導を行うことによってカルス細胞を得た後、当該カルス細胞の培養を継続することにより、元の胚の分量の数十万倍もの胚発生カルスを得、当該胚発生カルスからタキソールを回収することができる方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第３５１３１５１号公報
【特許文献２】特開平６−２９６４９３号公報
【特許文献３】特許第２７９５５４２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、例えば特許文献１に記載の方法では、タキソール生産培地の組成や培養条件を、植物種ごとに最適化する必要があり、非常に煩雑であるという問題がある。また、特許文献２や３に記載の方法では、従来よりもタキソールの生産効率は改善されているものの、未だ十分ではなかった。
【０００７】
また、特許文献１〜３に記載の方法では、いずれもカルス誘導の前処理である殺菌処理を、次亜塩素酸を用いて行っている。次亜塩素酸による殺菌処理は、カルス誘導の前処理として一般的であるが、消毒、殺菌能力が不安定であるという問題がある。すなわち、次亜塩素酸が高濃度の場合には、植物組織にダメージを与え、カルスが形成されず、低濃度の場合にはカビが発生するという問題があり、カルスを安定して誘導することができなかった。
【０００８】
本発明は、イチイ属植物から形成されたカルス細胞から、タキサン類をより大量に生産する方法、および植物細胞または植物組織片から効率よくカルス誘導を行う方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明では、前記課題を解決するために以下の構成を採用した。
（１） イチイ属植物の植物細胞または植物組織片から形成されたカルス細胞を、植物ホルモン、水素ガス、および一酸化窒素ガスからなる群より選択される１種以上のガスを含有する微細気泡を含む培養液中で懸濁培養し、培養後のカルス細胞または培養液からタキサン類を回収することを特徴とする、タキサン類の生産方法。
（２） 前記微細気泡の平均気泡径が１０μｍ以下である、前記（１）に記載のタキサン類の生産方法。
（３） 前記微細気泡の気泡数が、培養液１ｍＬあたり１，０００個以上である、前記（１）または（２）に記載のタキサン類の生産方法。
（４） 前記微細気泡がエチレンを含有するガスを含む微細気泡である、前記（１）〜（３）のいずれか一つに記載のタキサン類の生産方法。
（５） 前記培養液が、さらにエリシターを含む、前記（１）〜（４）のいずれか一つに記載のタキサン類の生産方法。
（６） 前記エリシターが、ジャスモン酸またはその誘導体である、前記（５）に記載のタキサン類の生産方法。
（７） カルス細胞から分泌されたタキサン類を、培養後の培養液から回収する、前記（１）〜（６）のいずれか一つに記載のタキサン類の生産方法。
（８） 回収されるタキサン類がタキソールである、前記（１）〜（６）のいずれか一つに記載のタキサン類の生産方法。
（９） 前記カルス細胞が、イチイ属植物の植物細胞または植物組織片を、二酸化塩素溶液を用いて殺菌処理した後に、カルス化が誘導されて形成された、前記（１）〜（８）のいずれか一項に記載のタキサン類の生産方法。
（１０） 植物細胞または植物組織片を、二酸化塩素溶液を用いて殺菌処理する表面殺菌工程と、
前記表面殺菌工程後に、当該植物細胞または植物組織片をカルス誘導固体培地で培養し、カルス化を誘導することによりカルス細胞を形成する培養工程と、
を有することを特徴とするカルス誘導方法。
（１１） 前記植物細胞または植物組織片が、イチイ属植物の植物細胞または植物組織片である、前記（１０）に記載のカルス誘導方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のタキサン類の生産方法により、イチイ属植物の植物細胞または植物組織片から形成されたカルス細胞から、従来になく大量のタキサン類を生産することができる。
また、本発明のカルス誘導方法においては、カルス誘導前の殺菌処理を、二酸化塩素溶液を用いて行うため、従来の次亜塩素酸による殺菌処理を行った場合よりも、効率よくカルス細胞を形成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明のタキサン類の生産方法において用いられる植物ホルモン等を含有する微細気泡を含む培養液を製造するための装置の一例を示した図である。
【図２】製造例１および比較製造例１の培養液中のエチレンを含有するガスからなる気泡の安定性を示したグラフである。
【図３】実施例２〜３および比較例１〜３におけるタキサン類の生成の結果を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
カルスとは、構造的に未分化であり、固体培地上に培養された際に形成される植物細胞塊を意味する。また、カルス細胞とは、カルス中の細胞を意味する。カルスは、分化後の植物細胞や植物組織から適切な条件で培養することによって誘導される。
【００１３】
＜タキサン類の生産方法＞
本発明および本願明細書において、タキサン類とは、タキサン環またはその類縁構造を有する化合物を意味する。タキサン環を有する化合物としては、タキソール、バッカチンIII、１０−デアセチルバッカチンIII、タキサジエン、ドセタキセル等が挙げられる。タキサン環の類縁構造を有する化合物としては、タクスチニンＡ、ブレビフォリオール等が挙げられる。タキサン類は、イチイ属植物から適切な条件のもと生産できることが知られている。
【００１４】
本発明のタキサン類の生産方法は、イチイ属植物の植物細胞または植物組織片から形成されたカルス細胞を、植物ホルモン、水素ガス、および一酸化窒素ガスからなる群より選択される１種以上のガスを含有する微細気泡を含む培養液中で懸濁培養し、培養後のカルス細胞または培養液からタキサン類を回収することを特徴とする。イチイ属植物の植物細胞または植物組織片から形成されたカルス細胞を、植物ホルモン、水素ガス、および一酸化窒素ガスからなる群より選択される１種以上のガスを含有する微細気泡を含む培養液中で懸濁培養することにより、大量のタキサン類を生産させることができる。このため、本発明のタキサン類の生産方法は、タキサン類の安定的な供給に資することができる。なお、本発明のタキサン類の生産方法により、カルス細胞によるタキサン類の生産量を増大させられる理由は明らかではないが、植物ホルモンを微細気泡に含有させた状態で培養液に導入することにより、当該微細気泡に含まれている植物ホルモン、水素ガス、および一酸化窒素ガスを効率よくカルス細胞に作用させられる結果、カルス細胞の増殖速度が高められ、タキサン類を高速度で生産できる、または一のカルス細胞あたりのタキサン類の生産量を増大させることができるためと推察される。
【００１５】
本発明のタキサン類の生産方法に供されるカルス細胞は、イチイ属植物の植物細胞または植物組織片からカルス誘導され形成されたものである。イチイ属植物としては特に限定されるものではなく、例えば、タキサス・シネンシス(Ｔａｘｕｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ)、タキサス・ブレビフォーリア、タキサス・カナデンシス(Ｔａｘｕｓ ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ)、タキサス・カスピダータ(Ｔａｘｕｓ ｃａｓｐｉｄａｔａ)、タキサス・バッカータ(Ｔａｘｕｓ ｂａｃｃａｔａ)、タキサス・グロボーサ(Ｔａｘｕｓ ｇｌｏｂｏｓａ)、タキサス・フロリダーナ（Ｔａｘｕｓ ｆｌｏｒｉｄａｔａ）、タキサス・ワリキアーナ（Ｔａｘｕｓ ｗａｌｌｉｃｈｉａｎａ）、タキサス・メディア（Ｔａｘｕｓ ｍｅｄｉａ）、タキサス・スマトラーナ（Ｔａｘｕｓ ｓｕｍａｔｒａｎａ）、黄金イチイ（黄金キャラボクとセイヨウイチイの交配種）等が挙げられる。
【００１６】
カルス誘導がなされる植物細胞または植物組織片（以下、単に「植物材料」ということがある。）は、イチイ属植物由来のものであれば特に限定されるものではなく、樹皮、形成層、茎、枝、葉、種子、きゅう果、根を含む任意の組織から採取された植物細胞または植物組織片であればよい。タキサン類の収率をより高めることができるため、本発明のタキサン類の生産方法に供されるカルス細胞としては、葉または種子から形成されたカルス細胞であることが好ましく、新しく成長した葉や種子から形成されたカルス細胞であることがより好ましい。
【００１７】
本発明のタキサン類の生産方法に供されるカルス細胞としては、例えば、前処理として、イチイ属植物の植物材料を殺菌処理した後、カルス誘導を行うための固体培地に接種して培養することにより得られたものを用いることができる。殺菌処理およびカルス誘導は、常法により行うことができる。
【００１８】
殺菌処理は、エタノール、塩酸ベンザコルニウム、次亜塩素酸ナトリウム水溶液等の周知の殺菌剤・滅菌剤を適宜組み合わせて行うことができる。例えば、７０〜８０％エタノール等のアルコール水溶液に浸漬させた後、１〜２％程度の次亜塩素酸ナトリウム水溶液に浸漬させることにより行うことができる。アルコール水溶液の濃度や浸漬時間、次亜塩素酸溶液の濃度や浸漬時間は、植物材料の種類や状態に応じて適宜調整することができる。また、殺菌処理の前に、界面活性剤溶液等により、植物材料の表面を洗浄してもよい。
【００１９】
また、カルス誘導を行うための固体培地としては、一般的に植物細胞の培養に用いられる植物培養用の液体培地に、ゲランガムや寒天等の培地固定剤と、カルス誘導能を発揮する植物ホルモンとを添加したものを用いることができる。当該植物培養用の液体培地としては、ＷＰ培地（Ｗｏｏｄｙ Ｐｌａｎｔ培地）、ＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ培地）、ＧａｍｂｏｒｇＢ５培地等が挙げられる。また、当該植物ホルモンとしては、オーキシン類、ジベレリン類、カイトカイニン類等が挙げられる。用いる植物培養用の液体培地や植物ホルモンの種類や添加量等は、植物材料に合わせて適宜調整することができる。
【００２０】
本発明のタキサン類の生産方法においては、後述のカルス誘導方法に従い、二酸化塩素溶液を用いて殺菌処理が行われたカルス細胞を用いることが好ましい。殺菌力が弱い場合はカルス誘導の途中でカビ等が発生し、殺菌力が強い場合には組織を破壊し培養できなくなる。特に、イチイ属植物の植物材料に対して、次亜塩素酸ナトリウム溶液を用いて殺菌処理を行った場合には、殺菌力の強弱によってカルス誘導が影響を受けやすく、安定してカルス細胞を得ることができない。本発明のカルス誘導方法のように、二酸化塩素溶液を用いることにより、確実にカルス誘導することができる。
【００２１】
本発明のタキサン類の生産方法においては、カルス細胞を、植物ホルモン等を含有する微細気泡を含む培養液中で懸濁培養することにより、当該カルス細胞にタキサン類を生産させる。なお、懸濁培養とは、細胞を培養液中に分散された状態で培養することを意味する。具体的には、液体培地に植物ホルモン等を含有する微細気泡を通気することにより得られた培養液に、カルス細胞を投入し、懸濁培養する。カルスをそのまま培養液に投入してもよい。
【００２２】
懸濁培養の培養液に用いられる液体培地は、一般的に植物細胞の培養に用いられる植物培養用の液体培地の中から、カルス細胞の形成に用いられた植物材料の種類等を考慮して適宜選択して用いることができる。当該液体培地としては、例えば、前述のＷＰ培地、ＭＳ培地、ＧａｍｂｏｒｇＢ５培地に加えて、ＬＳ培地（Ｌｉｎｓｍｅｉｅｒ−Ｓｋｏｏｇ培地）、Ｗｈｉｔｅ培地、Ｎｉｔｃｈ培地、ＫＳ培地（Ｋｏｈｌｅｎｎｂａｃｈ−Ｓｃｈｍｉｄｔ培地）、またはそれらの改変培地が挙げられる。また、これらの液体培地は、カルス細胞の種類等を考慮して、栄養源となるグルコース等の炭素源をさらに添加してもよい。
【００２３】
当該液体培地には、界面活性作用を示す物質（界面活性剤）が添加されていることが好ましい。液体培地に界面活性剤が添加されていることにより、微細気泡を安定して発生させやすくなるため、培養液の製造が容易になり、かつ培養液中における微細気泡の安定性も向上する。また、培養液中に界面活性剤が含まれていることにより、培養液中の各種成分が植物組織に摂取されやすくなる。
【００２４】
界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤等を用いることができるが、好ましくは非イオン性界面活性剤である。また、非イオン性界面活性剤の例としては、ポリオキシアルキレン多価アルコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンショ糖脂肪酸エステル、アルキルグルコシド、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテルおよびポリオキシプロピレン・ポリオキシエチレン縮合物等が挙げられる。また、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルの一例としては、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ８０の名でＡｔｌａｓ Ｐｏｗｄｅｒ社から市販されている。）、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート（Ｔｗｅｅｎ６０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート（Ｔｗｅｅｎ４０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０）等が挙げられる。
これら以外にも、トライトンＸ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）、ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル（Ｂｒｉｊ−５８）やノニルフェノールエトキシレート（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ ＮＰ−４０）等の一般的に生物学の分野で用いられる界面活性剤が利用可能である。
これらの界面活性剤は、１種のみを単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
【００２５】
培養液中の界面活性剤の含有量は、界面活性剤の種類によっても異なるが、０．００１〜５質量％であることが好ましく、０．０１〜２質量％であることがより好ましい。界面活性剤の含有量が０．００１質量％以上であれば、培養液の製造が容易になり、培養液中における微細気泡の安定性も向上する。また、界面活性剤の含有量が５質量％以下であれば、微細気泡を生成する際の過度な発泡を防止しやすく、コストを低減できる。
【００２６】
培養液に通気させる微細気泡は、植物ホルモン、水素ガス、および一酸化窒素ガスからなる群より選択される１種以上のガスを少なくとも含む。当該植物ホルモンとしては、培養環境下でガス状であり、かつカルス細胞によるタキサン類の生産効率を高める効果を有する植物ホルモンであれば、特に限定されるものではない。例えば、当該植物ホルモンとしては、カルス細胞の増殖を促進する作用、またはカルス化を誘導する作用を有する常温でガス状の植物ホルモンが挙げられる。本発明においては、特に、エチレンであることが好ましい。
【００２７】
微細気泡中の植物ホルモン、水素ガス、または一酸化窒素ガスの濃度は、０．１〜９９．９体積％であることが好ましく、２〜９９体積％であることがより好ましく、５〜９０体積％であることがさらに好ましい。前記植物ホルモン等の濃度が０．１体積％以上であれば、植物ホルモン等によるカルスの誘導やタキサン類の生成促進等の効果が得られやすい。また、前記植物ホルモン等の濃度が９９．９体積％以下であれば、コストを低減できる。
【００２８】
微細気泡中の植物ホルモン等の濃度は、該微細気泡の発生に用いる、植物ホルモン、水素ガス、および一酸化窒素ガスからなる群より選択される１種以上のガスを少なくとも含有するガス（以下、「有効成分含有ガス」という。）中の植物ホルモン等の濃度を調整することにより調整できる。
有効成分含有ガス中の植物ホルモン等の濃度の調整に使用するガスは、培養液によるカルス細胞の培養に悪影響を与えないガスであればよく、例えば、窒素ガス、希ガス等の不活性ガス、炭酸ガス、細胞への呼吸促進を目的とした酸素ガスが挙げられる。これらのガスは、１種のみを単独で用いてもよく、２種以上を併用した混合ガスであってもよい。
【００２９】
本発明のタキサン類の生産方法においては、培養液中に有効成分含有ガスを微細気泡として存在させる。これにより、培養液中に植物ホルモン等を含む気泡を長期間培養液中に留めておくことができ、植物ホルモン等による効果が高効率でかつ安定して得られる。特に、植物ホルモンとしてエチレンを用いる場合、エチレンが水に難溶であるため、エチレン含有ガスを単に液体培地へ通気しただけでは、大部分のエチレンが気相中に放散され、エチレンの効果が充分に得られにくい。本発明においては、エチレン含有ガスを微細気泡として培養液中に存在させることにより、培養液中にエチレンを安定して維持することができ、エチレンによる効果を高効率でかつ安定して得られる。
【００３０】
培養液中の植物ホルモン等を含有する微細気泡の平均気泡径は、１０μｍ以下であることが好ましく、５μｍ以下であることがより好ましく、１μｍ以下であることがさらに好ましい。ただし、平均気泡径とは培養液中の微細気泡の気泡径の数平均を意味する。気泡径が１０μｍ以下であれば、培養液中で微細気泡が上昇していく速度が小さくなるため、該気泡が培養液から気相中に放出されるまでの滞留時間を長くしやすく、エチレン等の植物ホルモンによるカルスの誘導やタキサン類の生成促進の効果、水素ガスによる抗酸化効果、一酸化窒素ガスによる情報伝達経路の活性化効果等が充分に得られやすい。また、植物ホルモン等を含有する微細気泡の平均気泡径は、気泡形成の容易性から、０．０５μｍ以上であることが好ましく、０．１μｍ以上であることがより好ましい。
【００３１】
植物ホルモン等を含有する微細気泡の平均気泡径の測定方法としては、例えば、レーザー回折散乱法により測定するＬＳ １３ ３２０（ベックマンコールター社製）、細孔電気抵抗法により測定するＭｕｌｔｉｓｉｚｅｒ３（ベックマンコールター社製）等が挙げられる。
【００３２】
培養液中の植物ホルモン等を含有する微細気泡の気泡数は、培養液１ｍＬあたり、１，０００個以上であることが好ましく、１０，０００個以上であることがより好ましく、５０，０００個以上であることがさらに好ましい。気泡数が培養液１ｍＬあたり１，０００個以上であれば、植物ホルモンによるカルスの誘導やタキサン類の生成の促進効果等が得られやすく、特に１０，０００個以上であれば植物ホルモン等を含有する微細気泡と植物組織の接触効率が向上して得られる効果がより高まる。また、植物ホルモン等を含有する微細気泡の気泡数は、気泡形成の容易性から、培養液１ｍＬあたり、１，０００万個以下であることが好ましく、１００万個以下であることがより好ましい。
植物ホルモン等を含有する微細気泡の気泡数の測定方法としては、例えば、Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ３（ベックマンコールター社製）が挙げられる。
【００３３】
液体培地に植物ホルモン等を含有する微細気泡を通気する方法としては、微細気泡を発生させることができる方法であればよく、公知の旋回流方式、加圧溶解方式、機械撹拌方式、超音波方式、膜透過方式、もしくは、これらの方式を組み合わせた方式等を用いることができる。
【００３４】
植物ホルモン等を含有する微細気泡を含む培養液は、例えば、特開２０１０−１９３８３８号公報に開示されているような培養液製造装置を用いて製造することができる。当該培養液製造装置の一例を図１に示す。培養液製造装置３は、通気前の培養液（液体培地）を貯留する培養液貯留部１１と、有効成分含有ガスを貯留する有効成分含有ガス貯留部１２（以下、単に「ガス貯留部１２」という。）と、通気前の培養液に有効成分含有ガスを通気して有効成分含有気泡を発生させる有効成分含有気泡発生部１３（以下、単に「気泡発生部１３」という。）と、通気後の培養液を供給する培養液供給部１４とを備えている。また、培養液貯留部１１と気泡発生部１３とが配管２１で連結されており、ガス貯留部１２と気泡発生部１３とが配管２２で連結されており、気泡発生部１３の下流側と培養液貯留部１１とが配管２７で連結されており、培養液貯留部１１と培養液供給部１４とが配管２８で連結されている。
【００３５】
培養液貯留部１１に貯留される通気前の培養液（液体培地）の量は、通気後の培養液により培養されるカルス細胞の種類や培養規模等に応じて適宜決定できる。まず、ポンプ１５により、培養液貯留部１１に貯留されている通気前の培養液が配管２１を通じて気泡発生部１３に液送され、気泡発生ノズル１６に通液される。同時に、ガス貯留部１２に貯留されている有効成分含有ガスが配管２２を通じて気泡発生部１３の気泡発生ノズル１６に供給される。有効成分含有ガスの供給機構は、加圧により気泡発生部１６に送られる機構であってもよく、減圧により気泡発生部１６内に吸引される機構であってもよい。
気泡発生ノズル１６内では、通液される液体培地により旋回流が形成されており、該旋回流により生じた渦流の中心部には、植物ホルモン等を含む気体空洞部が形成される。この植物ホルモン等を含む気体空洞部の先端部が、液体培地の旋回流によるせん断力により引きちぎられることにより、植物ホルモン等を含有する微細気泡が発生する。
通気後の培養液中の植物ホルモン等を含有する気泡の平均気泡径、および気泡数は、気泡発生ノズル１６の形状および生じさせる旋回流の度合い、気泡発生ノズル１６に通液する通気前の培養液の液流量、有効成分含有ガスの流量、界面活性剤の種類や添加量等を調整することにより制御できる。
【００３６】
培養液製造装置３では、培養液貯留部１１から液送される通気前の培養液（液体培地）を、配管２１、気泡発生部１３、配管２７を順次通過させて培養液貯留部１１へと戻して循環させる。これにより、連続的に有効成分含有ガスを通気することで、植物ホルモン等を含有する気泡の気泡数を容易に向上させることができる。そして、植物ホルモン等を含有する気泡を含む通気後の培養液を、配管２８を通じて培養液供給部１４に送液し、培養液供給部１４からバルブ等の操作により所定の容器等に供給する。
培養液製造装置３における培養液供給部１４は、培養液貯留部１１の底部付近の一画に連結されることが好ましい。
【００３７】
気泡発生部１３は、前述の旋回流方式には限定されず、加圧溶解方式、機械攪拌方式、超音波方式、膜透過方式を採用したものであってもよく、それらを組み合わせたものであってもよい。
例えば、膜透過方式としては、多孔質ガラス膜を有し、内部に培養液を通液できる多孔質ガラスモジュール（気泡発生部）等が挙げられる。該多孔質ガラスモジュールでは、モジュール内に通液されている培養液に対して、微細な孔を多数有する多孔質ガラス膜を介して有効成分含有ガスを通気することにより、培養液中に有効成分含有気泡を発生させることができる。
【００３８】
膜透過方式における通気後の培養液中の植物ホルモン等を含有する気泡の平均気泡径は、有効成分含有ガスを通気する孔の平均孔径、有効成分含有ガスの圧力、通液する培養液の液流量、界面活性剤の種類や添加量を調整することにより制御できる。また、気泡数は、多孔質ガラス膜の表面積（孔数）、有効成分含有ガスの通気時間、通液する培養液の液流量、界面活性剤の種類や添加量を調整することにより制御できる。
【００３９】
前記モジュールにおいて平均気泡径が１０μｍ以下の植物ホルモン等を含有する気泡を充分に発生させるには、有効成分含有ガスを通気する孔の平均孔径は０．０５〜１μｍであることが好ましい。
通気する際の有効成分含有ガスの圧力は、通常、膜の平均孔径や界面活性剤の添加量等に依存するが、例えば、膜の平均孔径が０．０８μｍの場合、ガス圧力は２．５〜３．５ＭＰａであることが好ましい。培養液の液流量は、作製する培養液の量により異なるが、培養液１Ｌの場合、０．５〜１０Ｌ／分であることが好ましい。
【００４０】
本発明のタキサン類の生産方法において用いられる培養液には、微細気泡に含有させる植物ホルモン以外のその他の植物ホルモンが添加されていてもよい。培養液に添加される植物ホルモンとしては、例えば、オーキシン類、サイトカイニン類、ジベレリン類、アブジシン類、ブラシノステロイド類、ジャスモン酸、もしくはこれらの類似物質、エリシター類、および増殖促進活性を有する物質が挙げられる。
増殖促進活性を有する物質としては、例えば、ココナッツミルク、カゼイン分解物、酵母抽出物、ビタミン類、無機塩類、ペプチド性植物増殖因子等が挙げられる。
【００４１】
エリシターとは、生物学的由来または非生物由来の化合物であって、植物または植物細胞培養に適用されたときに、二次的中間代謝生産の増加を引き起こすものである。エリシターとしては、通常、（１）選ばれたグループの真菌、バクテリア、酵母からの細胞壁からの抽出物またはろ過物、並びにそれらの精製フラクションを含む生物エリシター類、（２）化学ストレス剤および生物由来の若干の化合物を含む非生物エリシター類を使用することができる。
【００４２】
具体的には、生物エリシター類のうち、微生物としては、ボトリチス・シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）、フィトフトラ・メガスペルマ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｍｅｇａｓｐｅｒｍａ）、ピネラス・ストリプチクム（Ｐｉｎｅｌｌａｓ ｓｔｒｉｐｔｉｃｕｍ）、オリゴスポラス ｓｐ．（Ｏｌｉｇｏｓｐｏｒｕｓ ｓｐ．）、ピチウム・マミアラツム（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｍａｍｉａｌｌａｔｕｍ）、ピチウム・シルバチクム（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｓｙｌｖａｔｉｃｕｍ）、バーティシリウム・ダリアエ（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌ ｉａｅ）、バーティシリウム ｓｐ．（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．）、ペニシリウム ミニオルテウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍｉｎｉｏｌｕｔｅｕｍ）、フィトフトラ・ラテラリス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｌａｔｅｒａｌｉｓ）、シトスポラ・シンクタ（Ｃｙｔｏｓｐｏｒａ ｃｉｎｃｔａ）、シトスポラ・リューコストーマ（Ｃｙｔｏｓｐｏｒａ ｌｅｕｃｏｓｔｏｍａ）、アルターナリア・ブラッシシコラ（Ａlｔｅｒｎａｒｉａ ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａ）、アルターナリア・ソラニ(Ａlｔｅｒｎａｒｉａ ｓｏｌａｎｉ)、アルターナリア・ククメリナ（Ａlｔｅｒｎａｒｉａ ｃｕｃｕｍｅｒｉｎａ）、ボトリチス・スクアモサ（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｓｑｕａｍｏｓａ）、コクリオポラス・ヘテロストロフス（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ）、コレトトリクム・トリホリイ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｔｒｉｆｏｌｉｉ）、コレトトリクム・オルビキュラレ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｏｒｂｉｃｕｌａｒｅ）、コレトトリクム・グラミニコ−ラ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）、コレトトリクム・グロエオスポリオイデス（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ）、シリンドロクラジウム・フロリダヌム（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃｌａｄｉｕｍ ｆｌｏｒｉｄａｎｕｍ）、フザリウム・クロオクウェレンス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウム・ヘテロスポリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｉｕｍ）、フザリウム・オキシスポラム ｆ．ｓｐ．コングルチナンス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ．ｓｐ．ｃｏｎｇｌｕｔｉｎａｎｓ）、フザリウム・オキシスポラム ｆ．ｓｐ．リコペルシシ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ．ｓｐ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ）、フザリウム・オキシスポラム ｆ．ｓｐ．ピジ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ．ｓｐ．ｐｉｓｉ）、ギべレラ・ゼアエ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｚｅａｅ）、ガエウマンノミセス・グラミニス バ−ル．トリチシ（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ ｇｒａｍｉｎｉｓ ｖａｒ．ｔｒｉｔｉｃｉ）、ジエオトリクム ｓｐ．（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐ．）、レプトスファエリア・コラエ（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ Ｋｏｒｒａｅ）、ネクトリア・ハエマトコッカ ＭＰＶＩ（Ｎｅｃｔｒｉａ ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃａ ＭＰＶＩ）、ミコスファエレラ・ピノデス（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｉａ ｐｉｎｏｄｅｓ）、オフィオストーマ・ウルミ（Ｏｐｈｉｏｓｔｏｍａ ｕｌｍｉ）、ホーマ・リンガム（Ｐｈｏｍａ ｌｉｎｇａｍ）、ホーマ・ピノデラ（Ｐｈｏｍａ ｐｉｎｏｄｅｌｌａ）、フィトフトーラ・インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）、フィチウム・アリストスポルム（Ｐｙｔｈｉｕｍ ａｒｉｓｔｏｓｐｏｒｕｍ）、フィチウム・グラミニコ−ラ（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）、フィチウム・ウルチムム（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｕｌｔｉｍｕｍ）、リゾクトニア・ソラーニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）、スクレロチニア ｓｐ．（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｐ．）、Ｓ．ノドルムＤ−４５（Ｓ．ｎｏｄｏｒｕｍ Ｄ−４５）、トラメテス・ベルシコロール（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、ウスチラゴ・マイディス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓ）、およびベンテュリア・イネクワリス（Ｖｅｎｔｕｒｉａ ｉｎｅｑｕａｌｉｓ）が挙げられる。生物エリシター類のうち、微生物フラクション又は生産物としては、キトサン（Ｃｈｉｔｏｓａｎ）、リケナン（Ｌｉｃｈｅｎａｎ）、グルコマンナン（Ｇｌｕｃｏｍａｎｎａｎ）、プルラン（Ｐｌｅｕｒａｎ）、グルカン（Ｇｌｕｃａｎ）、カルボキシメチルグルカン、ヒドロキシメチルグルカン、スルホエチルグルカン、マンナン（Ｍａｎｎａｎ）、キシラン（Ｘｙｌａｎ）、マンノビオース（Ｍａｎｎｏｂｉｏｓｅ）、マンノトリオース（Ｍａｎｎｏｔｒｉｏｓｅ）、マンノペンタオース（Ｍａｎｎｏｐｅｎｔａｏｓｅ）、マンノテトラオース（Ｍａｎｎｏｔｅｔｒａｏｓｅ）、セルリシン（Ｃｅｌｌｕｌｙｓｉｎ）、マルチフェクト ＸＬ（Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ ＸＬ）、マルチフェクト ＣＬ（Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ ＣＬ）、レジナーゼ（Ｒｅｓｉｎａｓｅ）、パルプキシム（Ｐｕｌｐｘｙｍｅ）、ＳＰ４３１、ペクチノール（Ｐｅｃｔｉｎｏｌ）、ラピダーゼ（Ｒａｐｉｄａｓｅ）、クレルザイム（Ｋｌｅｒｚｙｍｅ）、およびキチナーゼ（Ｃｈｉ ｔｉｎａｓｅ）が挙げられる。非生物エリシター類としては、アラキドン酸、エライジン酸、サイクリックＡＭＰ（Ｃｙｃｌｉｃ ＡＭＰ）、ジプチリル環状ＡＭＰ（Ｄｉｂｕｔｙｒｙｌ Ｃｙｃｌｉｃ ＡＭＰ）、メチルジャスモネート、シス−ジャスモン、ミコナゾ−ル（Ｍｉｃｏｎａｚｏｌ）、フェルラ酸（Ｆｅｒｕｌｉｃ ａｃｉｄ）、ＡＭＯ−１６１８、トリトン Ｘ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）、安息香酸、サリチル酸、没食子酸プロピル、セサモール（Ｓｅｓａｍｏｌ）、塩化クロロコリン（Ｃｈｌｏｒｏｃｈｏｌｉｎｅ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、３，４−ジクロロフェノキシトリエチル（アミン）、クロロエチルホスホン酸、ジエチルジチオカルバミン酸、ノルジヒドログアセレト酸（Ｎｏｒｄｉｈｙｄｒｏｇｕａｉａｒｅｔｉｃ ａｃｉｄ）、ジチオトレイトール（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）、メタ重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸カリウム、β−アミノ−ＤＬ−フェニルアラニン、硫酸バナジル（Ｖａｎａｄｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ）、ユニコナゾ−ル（Ｕｎｉｃｏｎａｚｏｌ）、バクロブトラゾ−ル（Ｐａｃｌｏｂｕｔｒａｚｏｌ）、スペルミン（Ｓｐｅｒｍｉｎｅ）、スペルミジン（Ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ）、プトレシン（Ｐｕｔｒｅｓｃｉｎｅ）、カダバリン（Ｃａｄａｖａｒｉｎｅ）、硫酸プロタミン（Ｐｒｏｔａｍｉｎｅ Ｓａｌｆａｔｅ）、ＳＫＰ−７９９７、ＭＥＲ ２９、アンシミド−ル（Ａｎｃｙｍｉｄｏｌ）、トリアジメフォン（Ｔｒｉａｄｉｍｅｆｏｎ）、フォスフォン Ｄ（Ｐｈｏｓｐｈｏｎ Ｄ）、チオ尿素（Ｔｈｉｏｕｒｅａ）、硫酸デキストラン（Ｄｅｘｔｒａｎ Ｓｕｌｆａｔｅ）、ハイドロキノン、グルタミン酸キトサン（Ｃｈｉｔｏｓａｎ ｇｌｕｔａｍａｔｅ）、フェンプロペモルフ（Ｆｅｎｐｒｏｐｅｍｏｒｐｈ）、プロクロラズ（Ｐｒｏｃｈｌｏｒａｚ）、ナプチフィン（Ｎａｐｔｉｆｉｎｅ）、ＥＤＵ、ＨＴＡ、ＭＰＴＡ、グルタチオン、ＥＧＴＡ、ジベレリン類（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎｓ）、アプシジン酸、１，３−ジフェニル尿素、ジアゾリジニル尿素（Ｄｉａｚｏｌｉｄｉｎｙｌ ｕｒｅａ）、フロログルシノール（Ｐｈｌｏｒｏｇｌｕｃｉｎｏｌ）、アルギン酸ナトリウム、およびカラギーナン（Ｃａｒｒａｇｅｎａｎ）が挙げられる。
【００４３】
これら他の植物ホルモンは、１種のみを単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。また、植物ホルモン等を含有する微細気泡を通気させる前の液体培地に添加してもよく、微細気泡を通気させた後の培養液に添加してもよい。
【００４４】
エリシター類は、溶存ガスと相互作用する場合があり、このため、培養液に通気させるガスの種類によっては、懸濁培地中にガスが留まっていることができず、このため、エチレンガス等の有効成分含有ガスを培養液に通気させたとしても、当該ガスによる効果を十分に発揮できないという問題があった。本発明においては、有効成分含有ガスを微細気泡として培養液中に存在させるため、ジャスモン酸等のエリシターが培養液中に存在したとしても、有効成分含有ガスによる十分な効果が得られる。
【００４５】
微細気泡に含有させる植物ホルモンとしてエチレンを用いる場合には、培養液にさらにエリシターとしてジャスモン酸またはその誘導体を添加することが好ましい。培養液中にエチレンガスを含有した微細気泡と、ジャスモン酸またはその誘導体が含まれている場合には、カルス細胞によるタキサン類の生産がより増大する。これは、エチレンとジャスモン酸またはその誘導体との組み合わせが、カルス細胞の代謝経路で代謝を繰り返し、細胞の二次代謝に影響を与えるためと考えられる。
【００４６】
ジャスモン酸またはその誘導体としては、下記一般式（１）〜（４）で表される化合物が挙げられる。
【００４７】
【化１】
［一般式（１）〜（４）中、Ｒ１は、アルキル基またはアルケニル基であり；Ｒ２は水素原子またはアルキル基であり；Ｒ３ａ、Ｒ３ｂ、Ｒ３ｃ、およびＲ３ｄは、それぞれ独立して、水素原子、水酸基、アルキル基、またはアルコキシ基であり；ｎは、１〜７の整数を表す。］
【００４８】
一般式（Ｉ）〜（４）中、Ｒ１はアルキル基またはアルケニル基である。アルキル基またはアルケニル基は、直鎖状であってもよく、分岐鎖状であってもよい。
Ｒ１のアルキル基としては、炭素数１〜２０のアルキル基であることが好ましく、炭素数１〜６のアルキル基であることがより好ましい。具体的には、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、２−メチルブチル基、ネオペンチル基、１−エチルプロピル基、ｎ−ヘキシル基、イソヘキシル基、４−メチルペンチル基、３−メチルペンチル基、２−メチルペンチル基、１−メチルペンチル基、３，３−ジメチルブチル基、２，２−ジメチルブチル基、１，１−ジメチルブチル基、１，２−ジメチルブチル基、１，３−ジメチルブチル基、２，３−ジメチルブチル基、２−エチルブチル基等が挙げられる。
Ｒ１のアルケニル基としては、炭素数２〜２０のアルケニル基であることが好ましく、炭素数２〜６のアルケニル基であることがより好ましい。具体的には、ビニル基、アリル基、２−ブテニル基、３−ブテニル基、イソブテニル基、１−ペンテニル基、２−ペンテニル基、３−ペンテニル基、４−ペンテニル基、３−メチル−２−ペンテニル基、２−ヘキセニル基、３−ヘキセニル基、５−ヘキセニル基等が挙げられる。
【００４９】
一般式（Ｉ）〜（４）中、Ｒ２は水素原子またはアルキル基である。Ｒ２のアルキル基としては、Ｒ１のアルキル基と同様のものが挙げられる。
【００５０】
一般式（Ｉ）〜（４）中、Ｒ３ａ、Ｒ３ｂ、Ｒ３ｃ、およびＲ３ｄは、それぞれ独立して、水素原子、水酸基、アルキル基、またはアルコキシ基である。
Ｒ３ａ、Ｒ３ｂ、Ｒ３ｃ、およびＲ３ｄのアルキル基としては、Ｒ１のアルキル基と同様のものが挙げられる。
Ｒ３ａ、Ｒ３ｂ、Ｒ３ｃ、およびＲ３ｄのアルコキシ基としては、炭素数１〜２０のアルコキシ基であることが好ましく、炭素数１〜６のアルコキシ基であることがより好ましい。具体的には、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基、エトキシカルボニルプロポキシ基、ｓｅｃ−ブトキシ基、ｎ−ペンチルオキシ基、ｎ−ヘキシルオキシ基、ｎ−ヘプチルオキシ基等が挙げられる。
【００５１】
一般式（Ｉ）〜（４）中、ｎは１〜７の整数を表す。本発明においては、ｎは１〜３の整数であることが好ましく、１または２であることがより好ましく、１であることがさらに好ましい。
【００５２】
ジャスモン酸またはその誘導体は、塩として培養液に添加してもよい。塩としては、ジャスモン酸またはその誘導体の効果を損なわず、かつカルス細胞の培養に影響しないものであれば特に限定されず、無機塩であってもよく、有機塩であってもよい。例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、グルコサミン塩、トリエチルアミン塩、ジエタノールアミン塩等のアミン塩等を挙げることができる。
【００５３】
本発明においては、培養液に添加するエリシターが、ジャスモン酸（上記一般式（１）において、Ｒ１が（Ｚ）−２−ペンテニル基であり、ｎが１であり、Ｒ２が水素原子である化合物。）またはジャスモン酸アルキルエステル（上記一般式（１）において、Ｒ１が（Ｚ）−２−ペンテニル基であり、ｎが１であり、Ｒ２がアルキル基である化合物。）であることが好ましく、ジャスモン酸または炭素数１〜６のアルキル基を有するジャスモン酸アルキルエステルであることがより好ましく、ジャスモン酸またはメチルジャスモン酸であることがさらに好ましい。
【００５４】
例えば、エチレンガス含有微細気泡とメチルジャスモン酸とを含む培養液は、液体培地に、エチレンガス含有微細気泡を通気し、フィルターろ過等により除菌し、メチルジャスモン酸を加えることにより、製造することができる。
【００５５】
本発明のタキサン類の生産方法において、植物ホルモン等を含有する微細気泡を含む培養液中でカルス細胞を懸濁培養する際の培養条件は、カルス細胞の種類に応じて適宜設定することができる。例えば、培養温度は１０〜４０℃であり、２０〜３７℃であることが好ましい。また、ｐＨは、植物ホルモン等を含有する微細気泡を発生させる前の培養液のｐＨを予め調整しておいてもよく、植物ホルモン等を含有する微細気泡を発生させた後に培養液のｐＨを調整してもよい。溶存酸素濃度（ＤＯ）は、植物ホルモン等を含有する微細気泡を発生させる有効成分含有ガスに予め所定の濃度で酸素を含有させておいてもよく、培養液中に酸素を別途供給するようにしてもよい。
【００５６】
また、培養中の光照射量、攪拌、振とう等の条件についても、培養するカルス細胞の種類に応じて、適宜条件を選択でき、通常の植物材料やカルス細胞の培養と比べて、特別な条件を設定する必要はない。特に、本発明における培養液では、植物材料やカルス細胞の培養に通常採用される条件で攪拌または振とうを行った場合でも、植物ホルモン等を含有する微細気泡の安定性はほとんど低下しないため。植物ホルモンによる効果を安定して充分に得ることが可能である。
【００５７】
懸濁培養により、カルス細胞によってタキサン類が生産される。このため、懸濁培養後のカルス細胞からタキサン類を回収することができる。また、本発明のタキサン類の生産方法においては、タキサン類は細胞内に存在するだけでなく、培養液中にも分泌される。このため、タキサン類を連続的に生産することが可能である。さらに、培養液中への分泌量自体も、従来法よりも多い傾向がある。このため、懸濁培養後の培養液からも、分泌されたタキサン類を回収することができる。
【００５８】
懸濁培養後のカルス細胞または培養液からのタキサン類の回収は、通例の方法を用いることができる。
例えば、懸濁培養を行った培養液を遠心分離して、細胞からなる沈殿物と、培養濾液からなる上清とに分離する。
沈殿物は、凍結乾燥した後、微粉化し、有機溶媒を使って抽出を行う。有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール等のアルコール類、ジクロロメタン、ベンゼン、クロロホルム、ジオキサン、アセトン等をあげることができる。これらは２種以上を併用してもよい。タキサン類が抽出された溶媒は、エバポレータを使用して溶媒を除去することにより、タキサン類を含む抽出物を得ることができる。これらの抽出物を少量のメタノールに溶解させ、その抽出物中のタキサン類を定量することができる。
【００５９】
一方、本発明のタキサン類の生産方法では、前述の通り、培養液中に大量にタキソールまたはタキサン類が分泌される。このため、遠心分離後の上清（培養液）からもタキサン類を回収することができる。例えば、上清は、前述した有機溶媒のいずれかを使って抽出を行う。特に、ジクロロメタンが好ましい。その後の抽出物を得るプロセスは、沈殿物の場合と同じプロセスで行うことができる。
【００６０】
回収されたタキサン類は、高速クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）法や、タキソール抗体を用いて抗原抗体反応を利用する方法により、定量することができる。さらに、定量結果から、乾燥細胞重量あたりのタキサン類の収量を見積もることもできる。
【００６１】
ＨＰＬＣ法では、タキサン類の標準品のピークと抽出物中に含まれるタキサン類のピークが、同じ保持期間に現れるか否かを調べることにより、生産されたタキサン類を同定し、定量することができる。
タキソール抗体を用いる方法としては、例えば、抗−タキソール・モノクローナル抗体および抗−タキソール・モノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏ Ｓｏｌｖｅｎｔ Ａｓｓａｙ）法を用いることができる。
【００６２】
＜カルス誘導方法＞
本発明のカルス誘導方法は、植物材料からカルスを誘導する際の、植物材料の殺菌方法に関する。具体的には、本発明のカルス誘導方法は、植物細胞または植物組織片を、二酸化塩素溶液を用いて殺菌処理する表面殺菌工程と、前記表面殺菌工程後に、当該植物細胞または植物組織片をカルス誘導固体培地で培養し、カルス化を誘導することによりカルス細胞を形成する培養工程と、を有することを特徴とする。カルス誘導前の植物材料の殺菌処理を、二酸化塩素溶液を用いて行うことにより、次亜塩素酸を用いる従来法に比べて、より安定かつ確実にカルス細胞を得ることができる。
【００６３】
本発明のカルス誘導方法に供される植物材料は、一般的にカルス誘導に用いられるものであれば特に限定されるものではなく、樹皮、形成層、茎、枝、葉、種子、きゅう果、根を含む任意の組織から採取された植物細胞または植物組織片であればよい。また、当該植物材料は、いずれの植物種由来のものであってもよい。例えば、本発明のカルス誘導方法に供される植物材料としては、イチイ（Ｔａｘａｌｅｓ）目、ハナシノブ目（Ｐｏｌｅｍｏｎｉａｌｅｓ）、アカネ目（Ｒｕｂｉａｌｅｓ）、ムラサキ目（Ｂｏｒａｇｉｎａｌｅｓ）、キンポウゲ目（Ｒａｎｕｎｃｕｌａｌｅｓ）、イチョウ目（Ｇｉｎｋｇｏａｌｅｓ）、ウリ目（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｌｅｓ）、ミズキ目（Ｃｏｒｎａｌｅｓ）、セリ目（Ｕｍｂｅｌｌａｌｅｓ）、アカザ目（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｌｅｓ）、ヒガンバナ目（Ａｍａｒｙｌｌｉｄａｌｅｓ）、トウダイグサ目（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｌｅｓ）またはユリ目（Ｌｉｌｉａｌｅｓ）に属する植物が挙げられる。イチイ目に属する植物の中では、イチイ科（Ｔａｘａｃｅａｅ）植物が好ましく、イチイ属植物がより好ましい。
【００６４】
ハナシノブ目に属する植物の中では、ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）植物およびゴマノハグサ科（Ｓｃｒｏｐｈｕｌａｒｉａｃｅａｅ）植物が好ましい。ナス科植物の中では、ズボイシア・ミオポロイダス（Ｄｕｂｏｉｓｉａ ｍｙｏｐｏｒｏｉｄｅｓ）などを含むズボイシア（Ｄｕｂｏｉｓｉａ）属植物、およびヒヨス（Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ ｎｉｇｅｒ）などを含むヒヨスチアムス（Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ）属植物がさらに好ましい。ゴマノハグサ科植物の中では、ジギタリス（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ ｐｕｒｐｕｒｅａ）、ケジギタリス（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ ｌａｎａｔａ）などを含むジギタリス（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ）属植物がさらに好ましい。
【００６５】
アカネ目に属する植物の中では、アカネ科（Ｒｕｂｉａｃｅａｅ）植物が好ましく、その中でもアカネ（Ｒｕｂｉａ ａｋａｎｅ）などを含むルビア（Ｒｕｂｉａ）属植物がさらに好ましい。ムラサキ目に属する植物の中では、ムラサキ科（Ｂｏｒａｇｉｎａｃｅａｅ）植物が好ましく、その中でもムラサキ（Ｌｉｔｈｏｓｐｅｒｍｕｍ ｅｒｙｔｈｒｏｒｈｉｚｏｎ）などを含むリソスペルマム（Ｌｉｔｈｏｓｐｅｒｍｕｍ）属植物がさらに好ましい。
【００６６】
キンポウゲ目に属する植物の中では、キンポウゲ科（Ｒａｎｕｎｃｕｌａｃｅａｅ）植物、メギ科（Ｂｅｒｂｅｒｉｄａｃｅａｅ）植物、およびツヅラフジ科（Ｍｅｎｉｓｐｅｒｍａｃｅａｅ）植物が好ましい。キンポウゲ科植物の中では、オウレン（Ｃｏｐｔｉｓ ｊａｐｏｎｉｃａ）などを含むコプチス（Ｃｏｐｔｉｓ）属植物がさらに好ましい。メギ科植物の中では、メギ（Ｂｅｒｂｅｒｉｓ ｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉ）などを含むベルベリス（Ｂｅｒｂｅｒｉｓ）属植物、およびポドフィルム・ペルタツム（Ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｕｍ ｐｅｌｔａｔｕｍ）などを含むポドフィルム（Ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｕｍ）属植物がさらに好ましい。ツヅラフジ科植物の中では、タマサキツヅラフジ（Ｓｔｅｐｈａｎｉａ ｃｅｐｈａｒａｎｔｈａ）などを含むステファニア（Ｓｔｅｐｈａｎｉａ）属植物がさらに好ましい。
【００６７】
イチョウ目に属する植物の中では、イチョウ（Ｇｉｎｋｇｏ ｂｉｌｏｂａ）が好ましい。ウリ目に属する植物の中では、ウリ科（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ） 植物が好ましく、その中でもヘチマ（Ｌｕｆｆａ ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａ）などを含むルファ（Ｌｕｆｆａ）属植物、メロン（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｍｅｌｏ）などを含むククミス（Ｃｕｃｕｍｉｓ）属植物、およびスイカ（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）などを含むキトルルス（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ）属植物がさらに好ましい。
【００６８】
ミズキ目に属する植物の中では、ニッサ科（Ｎｙｓｓａｃｅａｅ）植物が好ましく、その中でもキジュ（Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａ ａｃｕｍｉｎａｔａ）などを含むカンプトテカ（Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａ）属植物がさらに好ましい。セリ目に属する植物の中では、ウコギ科（Ａｒａｌｉａｃｅａｅ）植物が好ましく、その中でもオタネニンジン（Ｐａｎａｘ ｇｉｎｓｅｎｇ）などを含むパナクス（Ｐａｎａｘ）属植物がさらに好ましい。
【００６９】
アカザ目に属する植物の中では、ヤマゴボウ科（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａｃｅａｅ）植物、およびアカザ科（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｃｅａｅ）植物が好ましい。ヤマゴボウ科植物の中では、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）などを含むフィトラッカ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ）属植物がさらに好ましい。アカザ科植物の中では、ビート（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）などを含むベータ（Ｂｅｔａ）属植物がさらに好ましい。
【００７０】
ヒガンバナ目に属する植物の中では、ヤマノイモ科（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａｃｅａｅ）植物が好ましく、その中でもジオスコリア・コンポジータ（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ ｃｏｍｐｏｓｉｔａ）などを含むジオスコリア（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ）属植物、およびオニドコロ（Ａｓｐｉｄｉｓｔｒａ ｅｌａｔｉｏｒ）などを含むアスピディストラ（Ａｓｐｉｄｉｓｔｒａ）属植物がさらに好ましい。トウダイグサ目に属する植物の中では、トウダイグサ科（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｃｅａｅ） 植物が好ましく、その中でもハナキリン（Ｅｕｈｐｒｂｉａ ｍｉｌｌｉｉ）などを含むユーフォルビア（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ）属植物がさらに好ましい。
【００７１】
ユリ目に属する植物の中ではユリ科（ｌｉｌｉａｃｅａｅ）植物が好ましく、その中でもイヌサフラン（Ｃｏｌｃｈｉｃｕｍ ａｎｔｕｍｎａｌｅ）などを含むコルキカム（Ｃｏｌｃｈｉｃｕｍ）属植物がさらに好ましい。
【００７２】
上記植物の中でも、イチイ属植物、ズボイシア属植物、ルビア属植物、リソスペルマム属植物、コプチス属植物、イチョウ、ベルベリス属植物、ポドフィルム属植物、ステファニア属植物、ルファ属植物、ククミス属植物、キトルルス属植物、カンプトテカ属植物、パナクス属植物、フィトラッカ属植物、ベータ属植物、およびコルキカム属植物がよりさらに好ましい。
【００７３】
本発明のカルス誘導方法に供される植物材料としては、特にイチイ属植物の植物材料であることが好ましい。イチイ属植物は、次亜塩素酸による影響を受けやすく、このため、次亜塩素酸により殺菌処理がなされた植物材料は、カルス誘導が不安定であり、確実性に乏しい。これに対して、二酸化塩素溶液を用いて殺菌処理を行うことにより、イチイ属植物の植物材料に対する誘導効率が安定し、一度の処理で確実にカルス細胞が形成できる。
【００７４】
二酸化塩素溶液を用いた殺菌処理は、二酸化塩素溶液に植物材料を浸漬させることにより行われる。二酸化塩素溶液中の二酸化塩素の濃度や浸漬時間は、植物材料の種類に応じて適宜調整することができる。例えば、イチイ属植物の植物材料の場合には、１０〜１０００ｐｐｍの二酸化塩素溶液に１０〜８０分間浸漬させることが好ましく、３０〜１００ｐｐｍの二酸化塩素溶液に２０〜４０分間浸漬させることがより好ましい。殺菌力の高い二酸化塩素溶液を低濃度で使用するため、確実にカルス誘導を実現できる。
【００７５】
表面殺菌工程では、二酸化塩素溶液による処理と二酸化塩素溶液以外の消毒剤や殺菌剤とを併用することもできる。例えば、二酸化塩素溶液に、界面活性剤、エタノール溶液、次亜塩素酸ナトリウム溶液等を適宜組み合わせて、消毒または表面殺菌することができる。次亜塩素酸ナトリウム溶液のみを用いる場合よりも、二酸化塩素溶液を組み合わせることにより、よりカルス誘導の効率を改善することができる。また、各処理を終了するごとに、滅菌水により洗浄することも好ましい。
【００７６】
本発明においては、中でも、界面活性剤と、エタノール溶液と、二酸化塩素溶液とを組み合わせて消毒または表面殺菌することが好ましい。これらの処理はそれぞれ別個に行い、各処理が終了するごとに滅菌水により洗浄する。
【００７７】
本発明のカルス誘導方法では、表面殺菌工程後、培養工程として、表面殺菌処理後の植物材料をカルス誘導固体培地で培養し、カルス化を誘導することによりカルス細胞を形成する。当該培養工程は、植物材料の種類等を考慮し、公知のいずれのカルス誘導方法により行ってもよい。
【００７８】
本発明のカルス誘導方法により形成されたカルスおよびカルス細胞は、その他のカルス誘導方法により得られたカルス等と同様に、有用物質を生産させることや、再分化させることができる。
【実施例】
【００７９】
以下、実施例および比較例を示して本発明を詳細に説明する。ただし、本発明は以下の記載によっては限定されない。なお、本実施例においては特に明記しない限り「％」は「質量％」を意味する。
【００８０】
＜エチレン含有気泡の安定性＞
エチレン含有気泡を含む培養液を製造し、該培養液中におけるエチレン含有気泡の安定性を評価した。
【００８１】
［製造例１］
培養液製造装置は、気泡発生部として、多孔質ガラス膜（平均孔径０．０８μｍ、ＳＰＧテクノ社製）を用いた膜透過方式を採用した気泡発生部を有する図１の培養液製造装置３（以下、「製造装置３Ａ」という。）を用いた。
また、通気前の培養液は、ＧａｍｂｏｒｇＢ５培地に界面活性剤としてＴｗｅｅｎ８０（和光純薬工業社製）を０．０２％添加した培養液（ａ１）を用い、液温は２５℃に設定した。
製造装置３Ａにおいて、気泡発生部内部に培養液（ａ１）を循環（液流量１．３Ｌ／分）させ、該気泡発生部において培養液（ａ１）中に、窒素で希釈したエチレン濃度５．０体積％のエチレン含有ガスを３．５ＭＰａの圧力で多孔質ガラス膜を介して１０分間通気し、エチレン含有気泡を含む培養液（Ａ１）を製造した。
培養液（Ａ１）の作成直後に培養液（Ａ１）中に残存するエチレン含有気泡の平均気泡径および気泡数をＭｕｌｔｉｓｉｚｅｒ３（検出限界０．４μｍ、ベックマンコールター社製）で測定したところ、平均気泡径は１．０μｍ、気泡数（測定気泡径：０．４〜２μｍ）は培養液（Ａ１）１ｍＬあたり約５７，０００個であった。
【００８２】
［比較製造例１］
製造例１の前記培養液（ａ１）に、窒素で希釈したエチレン濃度５．０体積％のエチレン含有ガスを、内径５ｍｍのチューブ管を用いて１０分間通気して培養液（Ｂ１）を製造した。
培養液（Ｂ１）の作成直後に培養液（Ｂ１）中に残存するエチレン含有気泡の平均気泡径および気泡数をＭｕｌｔｉｓｉｚｅｒ３（ベックマンコールター製）で測定したところ、平均気泡径は約５１μｍ、培養液（Ｂ１）１ｍＬあたりの気泡数（測定気泡径：２〜８０μｍ）は、約３００個であった。通気時に生成する気泡径が数ｍｍ〜数ｃｍの気泡は、すぐに浮上して気相中に放散されてしまい、測定できなかった。
【００８３】
［評価方法］
製造例１および比較製造例１で得られたエチレン含有気泡を含む培養液（Ａ１）、（Ｂ１）について、１時間、３時間、２４時間、および７２時間静置したときの、培養液（Ａ１）、（Ｂ１）がそれぞれ含有するエチレン濃度をガスクロマトグラフィー（ＧＣ−１８Ａ、島津製作所製、カラム：Ｐｏｒａｐａｃｋ Ｑ（Ｍｅｓｈ６０／８０）、測定温度７５℃）により測定した。その結果を図３に示す。
図３に示すように、製造例１の培養液（Ａ１）では、７２時間経過後においてもエチレン濃度が５ｍｇ／ｋｇに維持されており、エチレンを含有する微細気泡を用いることで培養液（Ａ１）中にエチレンが長時間保持された。
一方、比較製造例１の培養液（Ｂ１）は、２４時間後にはすでにエチレン濃度がほぼ０ｍｇ／Ｌとなっており、７２時間後には培養液（Ｂ１）中のエチレン含有気泡が全て空気中に放散していた。
【００８４】
＜カルス細胞の誘導＞
［実施例１］
イチイ（タキサス・カスピダータ）の種子を植物材料とし、カルス誘導を行った。イチイの種子は、筑波大学実験植物園、森林総合研究所林木育種センターなどから入手し、使用するまで４℃で保存した。
最初に、種子と各薬品との接触を向上させる目的で、種子を、界面活性剤としてＴｗｅｅｎ８０（和光純薬工業社製）を０．２％添加した溶液に、１０分間浸漬させた。次いで、当該種子を、７０％エタノール（和光純薬工業製）水溶液に５分間浸漬して消毒した。さらに、当該種子を、５０ｐｐｍ二酸化塩素溶液に３０分間浸漬して殺菌を行った。その後、当該種子を滅菌水に３分間浸漬することを３回繰り返し、すすぎを行った。
そして、当該種子を取り出し、半分に切断した中身を固体培地５０ｍｌあたり３〜５個、固体培地上に置き、２５℃の明所で静置培養を行った。培地の観察は毎日実施し、カビや微生物等による汚染の有無を観察した。１〜２週間後には、種子表面にカルス形成が認められ、１〜２ケ月後には、半分に切断した種子の２〜５倍量のカルスが形成された。
なお、固体培地の組成は、ＷＰ培地に、ゲランガム（和光純薬工業製）を０．２％添加した水溶液、ナフタレン酢酸を２ｍｇ／ｌ、グルコースを２０ｇ／ｌ、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸を０．５ｍｇ／ｌを添加したものとした。
また滅菌水は、蒸留水を１２１℃で２０分間、オートクレーブ滅菌したものを用いた。
【００８５】
［実施例２］
実施例１と同じ種子を植物材料として使用し、カルス誘導を行った。
最初に、種子と各薬品との接触を向上させる目的で、種子を、界面活性剤としてＴｗｅｅｎ８０（和光純薬工業社製）を０．２％添加した溶液に、１０分間浸漬させた。次いで、当該種子を、７０％エタノール（和光純薬工業製）水溶液に５分間浸漬して消毒した。さらに、当該種子を、５ｐｐｍ二酸化塩素溶液に１時間浸漬して殺菌を行った。その後、当該種子を滅菌水に３分間浸漬することを３回繰り返し、すすぎを行った。
そして、当該種子を取り出し、半分に切断し中身を固体培地５０ｍｌあたり３〜５個、固体培地に置き、２５℃の明所で静置培養を行った。培地の観察は毎日実施し、カビや微生物等による汚染の有無を観察した。この結果、幾つかの種子から、カルスが形成された。
【００８６】
［比較例１］
実施例１と同じ種子を植物材料として使用し、カルス誘導を行った。
最初に、種子と各薬品との接触を向上させる目的で、種子を、界面活性剤としてＴｗｅｅｎ８０（和光純薬工業社製）を０．２％添加した溶液に、１０分間浸漬させた。次いで、当該種子を、７０％エタノール（和光純薬工業製）水溶液に５分間浸漬して消毒した。さらに、当該種子を、１．５％次亜塩素酸ナトリウム溶液に１時間浸漬して殺菌を行った。その後、当該種子を滅菌水に３分間浸漬することを３回繰り返し、すすぎを行った。
そして、当該種子を取り出し、半分に切断し中身を固体培地５０ｍｌあたり３〜５個、固体培地に置き、２５℃の明所で静置培養を行った。培地の観察は毎日実施し、カビや微生物等による汚染の有無を観察した。この結果、１週間経過してもカルスは形成されなかった。殺菌時に種子にダメージを与えたものと考えられた。
【００８７】
［比較例２］
実施例１と同じ種子を植物材料として使用し、カルス誘導を行った。
最初に、種子と各薬品との接触を向上させる目的で、種子を、界面活性剤としてＴｗｅｅｎ８０（和光純薬工業社製）を０．２％添加した溶液に、１０分間浸漬させた。次いで、当該種子を、７０％エタノール（和光純薬工業製）水溶液に５分間浸漬して消毒した。さらに、当該種子を、１．５％次亜塩素酸ナトリウム溶液に２０分間浸漬して殺菌を行った。その後、当該種子を滅菌水に３分間浸漬することを３回繰り返した後、さらに滅菌水に１２時間浸漬し、すすぎを行った。さらに、当該種子を、１．５％次亜塩素酸ナトリウム溶液に１０分間浸漬して２回目の殺菌を行った。その後、当該種子を滅菌水に３分間浸漬することを３回繰り返し、すすぎを行った。
そして、当該種子を取り出し、半分に切断し中身を固体培地５０ｍｌあたり３〜５個、固体培地に置き、２５℃の明所で静置培養を行った。培地の観察は毎日実施し、カビや微生物等による汚染の有無を観察した。この結果、１週間後、種子のほぼ全面にカビの発生が見られ、カルスの形成は確認できず、十分な殺菌ができていなかったことが確認された。
【００８８】
＜タキサン類の生産＞
［実施例３］
実施例１で得られたカルス細胞を用いて、懸濁培養を行い、タキサン類の生産を行った。
（培養）
培養液は、ＷＰ培地に界面活性剤としてＴｗｅｅｎ８０（和光純薬工業社製）を０．０２％添加した培養液（ａ２）を用い、液温は２５℃に設定した。製造装置３Ａにおいて、気泡発生部内部に培養液（ａ２）を循環（液流量１．３Ｌ／分）させ、該気泡発生部において培養液（ａ２）中に、窒素で希釈したエチレン濃度５．０体積％のエチレン含有ガスを３．５ＭＰａの圧力で多孔質ガラス膜を介して１０分間通気し、エチレン含有気泡を含む培養液（Ａ２）を製造した。これをさらに、孔径０．８μｍのフィルター（アドバンテック社製）で濾過して除菌を行った。この培養液２５ｍｌを含む１００ｍｌ容の三角フラスコに、実施例１で得たカルスを湿重量（ｆｒｅｓｈ ｗｅｉｇｈｔ）２ｇ投入した後、エリシターとしてメチルジャスモン酸（和光純薬工業製）を培養液中の濃度が１００μＭになるように添加し、２５℃、１１０ｒｐｍ、暗黒下で回転振とう培養を行った。その後７日間培養を行い、下記の方法でタキサン類を抽出した。
【００８９】
（抽出）
抽出方法は、まず培養液を遠心分離（遠心効果８００Ｇ、１５分間）して、沈殿物（細胞）と上清（培養瀘液）とに分離した。沈殿物は凍結乾燥した後、凍結乾燥物の全重量を測定した（全細胞量）。その後、微粉化し、１５０ｍｇを１００ｍｌメタノールを溶媒として２０℃、２４時間でタキサン類の抽出を行った。そして、当該溶媒を遠心分離（１７００Ｇ、１０分間）して、上清のみを回収して残査を除去した。当該上清をエバボレートした後、ジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２、和光純薬工業製）２０ｍｌと水２０ｍｌを１:１で分液ロートを用いて分配し、ジクロロメタン画分を回収し、さらにエバボレートした後、メタノール（和光純薬工業製）１ｍｌに再懸濁し、分析用サンプルとした。
一方、初期の遠心分離で得られた上清（培養瀘液）は、上清１５ｍｌに対してジクロロメタン（和光純薬工業製）１５ｍｌを加え、分液ロートを用いて３０秒間、激しく攪拌した後、分配し、ジクロロメタン画分を回収し、エバボレートした後、メタノール（和光純薬工業製）１ｍｌに再懸濁し、分析用サンプルとした。
【００９０】
（評価）
得られた分析用サンプルは、ＨＰＬＣにより、標準タキソールとの比較と、タキソールイムノアッセイキット（Ｃａｒｄａｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．， Ｈａｗａｉｉ）とを用いて定量を行った。
ＨＰＬＣでは、カラム（東ソー製、ＴＳＫ−ｇｅｌ ＯＤＳ−８０Ｔｓ：Φ４．６ｘ２５０ ｍｍ）に、流速１ｍｌ／分で、分析用サンプルと標準タキサン類（和光純薬工業製）をそれぞれ流して比較した。双方とも、ピークの検出波長２２０ｎｍが同一の保持時間（４０分）で出現することが示され、これらの化合物が同じであることが示唆された。
タキソールイムノアッセイキットによる定量は、商品の取扱説明書に記載の手順に従って、分析用サンプルと標準タキソールとを処理した。そして、標準タキソールと吸光度との検量線を導き、分析用サンプル中の吸光度からタキサン類の量を見積もった。その結果、沈殿物からは乾燥細胞１ｇあたり０．１３ｍｇ、上清からは乾燥細胞１ｇあたり２．７８ｍｇ、合計で乾燥細胞１ｇあたり２．９ｍｇのタキサン類が得られた。特に、上清が９５％を占めており、タキサン類が細胞外へ効率よく分泌されており、連続的に生産できる可能性があることが示唆された。
【００９１】
［実施例４］
実施例１で得られたカルス細胞を用いて、懸濁培養を行い、タキサン類の生産を行った。
（培養・抽出）
実施例３で製造されたエチレン含有気泡を含む培養液（Ａ２）に対して、さらに、孔径０．８μｍのフィルター（アドバンテック社製）で濾過して除菌を行った。この培養液２５ｍｌを含む１００ｍｌ容の三角フラスコに、実施例１で得たカルスを湿重量（ｆｒｅｓｈ ｗｅｉｇｈｔ）２ｇ投入し、２５℃、１１０ｒｐｍ、暗黒下で回転振とう培養を行った。その後１０日間培養を行い、実施例３と同様の方法でタキサン類を抽出した。
【００９２】
（評価）
得られた分析用サンプルに対して、実施例３と同様にして、ＨＰＬＣにより、標準タキソールとの比較と、およびタキソールイムノアッセイキットとを用いた定量を行った。
この結果、ＨＰＬＣでは、実施例１と同様に、分析用サンプルと標準タキサン類のピークの検出波長２２０ｎｍが、同一の保持時間（４０分）で出現することが示された。
また、タキソールイムノアッセイキットによる定量の結果、沈殿物からは乾燥細胞１ｇあたり０．６４ｍｇ、上清からは乾燥細胞１ｇあたり１．４４ｍｇ、合計で乾燥細胞１ｇあたり２．０８ｍｇのタキサン類が得られた。全生産量のうち、上清中のタキサン類が占める割合は６９％であった。
【００９３】
実験例３と実験例４の結果を比較すると、メチルジャスモン酸が含まれている培養液中で懸濁培養した実施例３のほうが、メチルジャスモン酸が含まれていない培養液中で懸濁培養した実験例４よりも、乾燥細胞重量あたりのタキサン類の生産量が多く、また、培養液へ分泌されるタキサン類の割合も多いことがわかった。
【００９４】
［比較例３］
実施例１で得られたカルス細胞中のタキサン類を定量した。
具体的には、実施例１で得たカルスの湿重量（ｆｒｅｓｈ ｗｅｉｇｈｔ）２ｇを凍結乾燥した後、凍結乾燥物の全重量を測定した（全細胞量）。当該凍結乾燥物から、実施例１と同様にして、タキサン類を抽出し、分析用サンプルを調製した。
【００９５】
（評価）
得られた分析用サンプルに対して、実施例３と同様にして、ＨＰＬＣにより、標準タキソールとの比較と、およびタキソールイムノアッセイキットとを用いた定量を行った。
この結果、ＨＰＬＣでは、実施例１と同様に、分析用サンプルと標準タキサン類のピークの検出波長２２０ｎｍが、同一の保持時間（４０分）で出現することが示された。
また、タキソールイムノアッセイキットによる定量の結果、沈殿物からは乾燥細胞１ｇあたり０ｍｇ、上清からは乾燥細胞１ｇあたり０．３ｍｇ、合計で乾燥細胞１ｇあたり０．３ｍｇのタキサン類が得られた。
【００９６】
［比較例４］
実施例１で得られたカルス細胞を用いて、懸濁培養を行い、タキサン類の生産を行った。
（培養）
培養液は、ＷＰ培地に界面活性剤としてＴｗｅｅｎ８０（和光純薬工業社製）を０．０２％添加した培養液（ａ２）を用い、液温は２５℃に設定した。この培養液２５ｍｌを含む１００ｍｌ容の三角フラスコに、実施例１で得たカルスを湿重量（ｆｒｅｓｈ ｗｅｉｇｈｔ）２ｇ投入し、その後７日間培養を行い、実施例３と同様の方法でタキサン類を抽出した。
【００９７】
（評価）
得られた分析用サンプルに対して、実施例３と同様にして、ＨＰＬＣにより、標準タキソールとの比較と、およびタキソールイムノアッセイキットとを用いた定量を行った。
この結果、ＨＰＬＣでは、実施例１と同様に、分析用サンプルと標準タキサン類のピークの検出波長２２０ｎｍが、同一の保持時間（４０分）で出現することが示された。
また、タキソールイムノアッセイキットによる定量の結果、沈殿物からは乾燥細胞１ｇあたり０ｍｇ、上清からは乾燥細胞１ｇあたり０．３ｍｇ、合計で乾燥細胞１ｇあたり０．３ｍｇのタキサン類が得られた。
比較例３の結果と比較して明らかなように、比較例４では、懸濁培養によりカルス細胞が生産するタキサン類はほとんど増大していなかった。
【００９８】
［比較例５］
実施例１で得られたカルス細胞を用いて、懸濁培養を行い、タキサン類の生産を行った。
（培養）
培養液は、ＷＰ培地に界面活性剤としてＴｗｅｅｎ８０（和光純薬工業社製）を０．０２％添加した培養液（ａ２）を用い、液温は２５℃に設定した。この培養液２５ｍｌを含む１００ｍｌ容の三角フラスコに、実施例１で得たカルスを湿重量（ｆｒｅｓｈ ｗｅｉｇｈｔ）２ｇ投入し、その後１０日間培養を行い、実施例３と同様の方法でタキサン類を抽出した。
【００９９】
（評価）
得られた分析用サンプルに対して、実施例３と同様にして、ＨＰＬＣにより、標準タキソールとの比較と、およびタキソールイムノアッセイキットとを用いた定量を行った。
この結果、ＨＰＬＣでは、実施例１と同様に、分析用サンプルと標準タキサン類のピークの検出波長２２０ｎｍが、同一の保持時間（４０分）で出現することが示された。
また、タキソールイムノアッセイキットによる定量の結果、沈殿物からは乾燥細胞１ｇあたり０．５ｍｇ、上清からは乾燥細胞１ｇあたり１．０ｍｇ、合計で乾燥細胞１ｇあたり１．５ｍｇのタキサン類しか得られなかった。
実施例４、比較例３、および比較例４の結果と比較して明らかなように、懸濁培養時間がより長かった比較例５では、比較例４よりも懸濁培養によりカルス細胞が生産するタキサン類は増えていたものの、同じ培養時間であった実施例４と比べて明らかに少なかった。
【産業上の利用可能性】
【０１００】
本発明のタキサン類の生産方法により、従来になく大量のタキサン類を生産することができるため、当該方法は、タキサン類を有効成分とする医薬品の製造分野等で特に有用である。
また、本発明のカルス誘導方法により、効率よくカルス細胞を形成することができるため、当該方法は、カルス細胞を利用する多くの分野において有用である。
【符号の説明】
【０１０１】
３ 培養液製造装置、１１ 培養液貯留部、１２ 有効成分含有ガス貯留部、１３ 有効成分含有気泡発生部、１４ 培養液供給部、１５ ポンプ、１６ 気泡発生ノズル、２１、２２、２７、２８ 配管
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イチイ（Ｔａｘｕｓ）属植物から形成されたカルス細胞からタキサン類を生産する方法、および植物細胞または植物組織片からカルス細胞を形成する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タキソール（パクリタキセル）は、イチイ属植物から単離されたアルカロイドであって、種々の癌細胞に対して抗腫瘍活性を呈する。また、イチイ属植物からはその他にも、バッカチンIIIやタキサジエン等のタキソールと同様に抗腫瘍活性を有するタキサン類が単離されている。これらのタキサン類は、主に抗癌剤の有効成分として利用されている。
【０００３】
タキソールの製造方法としては、例えば、イチイ属植物の葉からバッチカンIIIを抽出した後、これを原料化合物として化学合成を行い、タキソールを生産する方法が開発されている。しかしながら、化学合成法では高コストとなるという問題があった。
一方で、タキソールは主としてタキサス・ブレビフォーリア（Ｔａｘｕｓ ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ）の樹皮に、グラム乾燥質量当たりおよそ０．０２％含まれることが知られている。このように、タキソールのイチイ属植物中のタキソール含有量は非常に少ないため、十分な量のタキソールを回収するためには、イチイ属植物が大量に必要になる。その上、イチイ属植物の成長速度は著しく遅い。このため、需要に足る分のタキソールを天然資源から回収することは、森林の生態系に甚大な影響を及ぼす可能性がある。
【０００４】
そこで、イチイ属植物から得られた培養細胞等にタキソールを生産させ、これを回収する方法が検討されている。例えば特許文献１には、次亜塩素酸による殺菌処理後にカルス誘導を行うことによって、イチイ属植物の組織片からカルス細胞を得、当該カルス細胞を、植物種ごとに最適化されたタキソール生産培地中で懸濁培養することにより、高収率でタキソールを回収することができる方法が開示されている。また、特許文献２には、イチイ属植物の組織片を次亜塩素酸により殺菌処理した後に、ジベレリンを含む固体培地で培養することによってカルス細胞を得、当該カルス細胞を、ジベレリンを含む液体培地で懸濁培養することにより、タキソールを回収することができる方法が開示されている。その他、特許文献３には、イチイ属植物の中でその他の植物組織よりも多くのタキソールを含有している接合体胚に対して、次亜塩素酸による殺菌処理後にカルス誘導を行うことによってカルス細胞を得た後、当該カルス細胞の培養を継続することにより、元の胚の分量の数十万倍もの胚発生カルスを得、当該胚発生カルスからタキソールを回収することができる方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第３５１３１５１号公報
【特許文献２】特開平６−２９６４９３号公報
【特許文献３】特許第２７９５５４２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、例えば特許文献１に記載の方法では、タキソール生産培地の組成や培養条件を、植物種ごとに最適化する必要があり、非常に煩雑であるという問題がある。また、特許文献２や３に記載の方法では、従来よりもタキソールの生産効率は改善されているものの、未だ十分ではなかった。
【０００７】
また、特許文献１〜３に記載の方法では、いずれもカルス誘導の前処理である殺菌処理を、次亜塩素酸を用いて行っている。次亜塩素酸による殺菌処理は、カルス誘導の前処理として一般的であるが、消毒、殺菌能力が不安定であるという問題がある。すなわち、次亜塩素酸が高濃度の場合には、植物組織にダメージを与え、カルスが形成されず、低濃度の場合にはカビが発生するという問題があり、カルスを安定して誘導することができなかった。
【０００８】
本発明は、イチイ属植物から形成されたカルス細胞から、タキサン類をより大量に生産する方法、および植物細胞または植物組織片から効率よくカルス誘導を行う方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明では、前記課題を解決するために以下の構成を採用した。
（１） イチイ属植物の植物細胞または植物組織片から形成されたカルス細胞を、植物ホルモン、水素ガス、および一酸化窒素ガスからなる群より選択される１種以上のガスを含有する微細気泡を含む培養液中で懸濁培養し、培養後のカルス細胞または培養液からタキサン類を回収することを特徴とする、タキサン類の生産方法。
（２） 前記微細気泡の平均気泡径が１０μｍ以下である、前記（１）に記載のタキサン類の生産方法。
（３） 前記微細気泡の気泡数が、培養液１ｍＬあたり１，０００個以上である、前記（１）または（２）に記載のタキサン類の生産方法。
（４） 前記微細気泡がエチレンを含有するガスを含む微細気泡である、前記（１）〜（３）のいずれか一つに記載のタキサン類の生産方法。
（５） 前記培養液が、さらにエリシターを含む、前記（１）〜（４）のいずれか一つに記載のタキサン類の生産方法。
（６） 前記エリシターが、ジャスモン酸またはその誘導体である、前記（５）に記載のタキサン類の生産方法。
（７） カルス細胞から分泌されたタキサン類を、培養後の培養液から回収する、前記（１）〜（６）のいずれか一つに記載のタキサン類の生産方法。
（８） 回収されるタキサン類がタキソールである、前記（１）〜（６）のいずれか一つに記載のタキサン類の生産方法。
（９） 前記カルス細胞が、イチイ属植物の植物細胞または植物組織片を、二酸化塩素溶液を用いて殺菌処理した後に、カルス化が誘導されて形成された、前記（１）〜（８）のいずれか一項に記載のタキサン類の生産方法。
（１０） 植物細胞または植物組織片を、二酸化塩素溶液を用いて殺菌処理する表面殺菌工程と、
前記表面殺菌工程後に、当該植物細胞または植物組織片をカルス誘導固体培地で培養し、カルス化を誘導することによりカルス細胞を形成する培養工程と、
を有することを特徴とするカルス誘導方法。
（１１） 前記植物細胞または植物組織片が、イチイ属植物の植物細胞または植物組織片である、前記（１０）に記載のカルス誘導方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のタキサン類の生産方法により、イチイ属植物の植物細胞または植物組織片から形成されたカルス細胞から、従来になく大量のタキサン類を生産することができる。
また、本発明のカルス誘導方法においては、カルス誘導前の殺菌処理を、二酸化塩素溶液を用いて行うため、従来の次亜塩素酸による殺菌処理を行った場合よりも、効率よくカルス細胞を形成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明のタキサン類の生産方法において用いられる植物ホルモン等を含有する微細気泡を含む培養液を製造するための装置の一例を示した図である。
【図２】製造例１および比較製造例１の培養液中のエチレンを含有するガスからなる気泡の安定性を示したグラフである。
【図３】実施例２〜３および比較例１〜３におけるタキサン類の生成の結果を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
カルスとは、構造的に未分化であり、固体培地上に培養された際に形成される植物細胞塊を意味する。また、カルス細胞とは、カルス中の細胞を意味する。カルスは、分化後の植物細胞や植物組織から適切な条件で培養することによって誘導される。
【００１３】
＜タキサン類の生産方法＞
本発明および本願明細書において、タキサン類とは、タキサン環またはその類縁構造を有する化合物を意味する。タキサン環を有する化合物としては、タキソール、バッカチンIII、１０−デアセチルバッカチンIII、タキサジエン、ドセタキセル等が挙げられる。タキサン環の類縁構造を有する化合物としては、タクスチニンＡ、ブレビフォリオール等が挙げられる。タキサン類は、イチイ属植物から適切な条件のもと生産できることが知られている。
【００１４】
本発明のタキサン類の生産方法は、イチイ属植物の植物細胞または植物組織片から形成されたカルス細胞を、植物ホルモン、水素ガス、および一酸化窒素ガスからなる群より選択される１種以上のガスを含有する微細気泡を含む培養液中で懸濁培養し、培養後のカルス細胞または培養液からタキサン類を回収することを特徴とする。イチイ属植物の植物細胞または植物組織片から形成されたカルス細胞を、植物ホルモン、水素ガス、および一酸化窒素ガスからなる群より選択される１種以上のガスを含有する微細気泡を含む培養液中で懸濁培養することにより、大量のタキサン類を生産させることができる。このため、本発明のタキサン類の生産方法は、タキサン類の安定的な供給に資することができる。なお、本発明のタキサン類の生産方法により、カルス細胞によるタキサン類の生産量を増大させられる理由は明らかではないが、植物ホルモンを微細気泡に含有させた状態で培養液に導入することにより、当該微細気泡に含まれている植物ホルモン、水素ガス、および一酸化窒素ガスを効率よくカルス細胞に作用させられる結果、カルス細胞の増殖速度が高められ、タキサン類を高速度で生産できる、または一のカルス細胞あたりのタキサン類の生産量を増大させることができるためと推察される。
【００１５】
本発明のタキサン類の生産方法に供されるカルス細胞は、イチイ属植物の植物細胞または植物組織片からカルス誘導され形成されたものである。イチイ属植物としては特に限定されるものではなく、例えば、タキサス・シネンシス(Ｔａｘｕｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ)、タキサス・ブレビフォーリア、タキサス・カナデンシス(Ｔａｘｕｓ ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ)、タキサス・カスピダータ(Ｔａｘｕｓ ｃａｓｐｉｄａｔａ)、タキサス・バッカータ(Ｔａｘｕｓ ｂａｃｃａｔａ)、タキサス・グロボーサ(Ｔａｘｕｓ ｇｌｏｂｏｓａ)、タキサス・フロリダーナ（Ｔａｘｕｓ ｆｌｏｒｉｄａｔａ）、タキサス・ワリキアーナ（Ｔａｘｕｓ ｗａｌｌｉｃｈｉａｎａ）、タキサス・メディア（Ｔａｘｕｓ ｍｅｄｉａ）、タキサス・スマトラーナ（Ｔａｘｕｓ ｓｕｍａｔｒａｎａ）、黄金イチイ（黄金キャラボクとセイヨウイチイの交配種）等が挙げられる。
【００１６】
カルス誘導がなされる植物細胞または植物組織片（以下、単に「植物材料」ということがある。）は、イチイ属植物由来のものであれば特に限定されるものではなく、樹皮、形成層、茎、枝、葉、種子、きゅう果、根を含む任意の組織から採取された植物細胞または植物組織片であればよい。タキサン類の収率をより高めることができるため、本発明のタキサン類の生産方法に供されるカルス細胞としては、葉または種子から形成されたカルス細胞であることが好ましく、新しく成長した葉や種子から形成されたカルス細胞であることがより好ましい。
【００１７】
本発明のタキサン類の生産方法に供されるカルス細胞としては、例えば、前処理として、イチイ属植物の植物材料を殺菌処理した後、カルス誘導を行うための固体培地に接種して培養することにより得られたものを用いることができる。殺菌処理およびカルス誘導は、常法により行うことができる。
【００１８】
殺菌処理は、エタノール、塩酸ベンザコルニウム、次亜塩素酸ナトリウム水溶液等の周知の殺菌剤・滅菌剤を適宜組み合わせて行うことができる。例えば、７０〜８０％エタノール等のアルコール水溶液に浸漬させた後、１〜２％程度の次亜塩素酸ナトリウム水溶液に浸漬させることにより行うことができる。アルコール水溶液の濃度や浸漬時間、次亜塩素酸溶液の濃度や浸漬時間は、植物材料の種類や状態に応じて適宜調整することができる。また、殺菌処理の前に、界面活性剤溶液等により、植物材料の表面を洗浄してもよい。
【００１９】
また、カルス誘導を行うための固体培地としては、一般的に植物細胞の培養に用いられる植物培養用の液体培地に、ゲランガムや寒天等の培地固定剤と、カルス誘導能を発揮する植物ホルモンとを添加したものを用いることができる。当該植物培養用の液体培地としては、ＷＰ培地（Ｗｏｏｄｙ Ｐｌａｎｔ培地）、ＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ培地）、ＧａｍｂｏｒｇＢ５培地等が挙げられる。また、当該植物ホルモンとしては、オーキシン類、ジベレリン類、カイトカイニン類等が挙げられる。用いる植物培養用の液体培地や植物ホルモンの種類や添加量等は、植物材料に合わせて適宜調整することができる。
【００２０】
本発明のタキサン類の生産方法においては、後述のカルス誘導方法に従い、二酸化塩素溶液を用いて殺菌処理が行われたカルス細胞を用いることが好ましい。殺菌力が弱い場合はカルス誘導の途中でカビ等が発生し、殺菌力が強い場合には組織を破壊し培養できなくなる。特に、イチイ属植物の植物材料に対して、次亜塩素酸ナトリウム溶液を用いて殺菌処理を行った場合には、殺菌力の強弱によってカルス誘導が影響を受けやすく、安定してカルス細胞を得ることができない。本発明のカルス誘導方法のように、二酸化塩素溶液を用いることにより、確実にカルス誘導することができる。
【００２１】
本発明のタキサン類の生産方法においては、カルス細胞を、植物ホルモン等を含有する微細気泡を含む培養液中で懸濁培養することにより、当該カルス細胞にタキサン類を生産させる。なお、懸濁培養とは、細胞を培養液中に分散された状態で培養することを意味する。具体的には、液体培地に植物ホルモン等を含有する微細気泡を通気することにより得られた培養液に、カルス細胞を投入し、懸濁培養する。カルスをそのまま培養液に投入してもよい。
【００２２】
懸濁培養の培養液に用いられる液体培地は、一般的に植物細胞の培養に用いられる植物培養用の液体培地の中から、カルス細胞の形成に用いられた植物材料の種類等を考慮して適宜選択して用いることができる。当該液体培地としては、例えば、前述のＷＰ培地、ＭＳ培地、ＧａｍｂｏｒｇＢ５培地に加えて、ＬＳ培地（Ｌｉｎｓｍｅｉｅｒ−Ｓｋｏｏｇ培地）、Ｗｈｉｔｅ培地、Ｎｉｔｃｈ培地、ＫＳ培地（Ｋｏｈｌｅｎｎｂａｃｈ−Ｓｃｈｍｉｄｔ培地）、またはそれらの改変培地が挙げられる。また、これらの液体培地は、カルス細胞の種類等を考慮して、栄養源となるグルコース等の炭素源をさらに添加してもよい。
【００２３】
当該液体培地には、界面活性作用を示す物質（界面活性剤）が添加されていることが好ましい。液体培地に界面活性剤が添加されていることにより、微細気泡を安定して発生させやすくなるため、培養液の製造が容易になり、かつ培養液中における微細気泡の安定性も向上する。また、培養液中に界面活性剤が含まれていることにより、培養液中の各種成分が植物組織に摂取されやすくなる。
【００２４】
界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤等を用いることができるが、好ましくは非イオン性界面活性剤である。また、非イオン性界面活性剤の例としては、ポリオキシアルキレン多価アルコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンショ糖脂肪酸エステル、アルキルグルコシド、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテルおよびポリオキシプロピレン・ポリオキシエチレン縮合物等が挙げられる。また、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルの一例としては、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ８０の名でＡｔｌａｓ Ｐｏｗｄｅｒ社から市販されている。）、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート（Ｔｗｅｅｎ６０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート（Ｔｗｅｅｎ４０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０）等が挙げられる。
これら以外にも、トライトンＸ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）、ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル（Ｂｒｉｊ−５８）やノニルフェノールエトキシレート（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ ＮＰ−４０）等の一般的に生物学の分野で用いられる界面活性剤が利用可能である。
これらの界面活性剤は、１種のみを単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
【００２５】
培養液中の界面活性剤の含有量は、界面活性剤の種類によっても異なるが、０．００１〜５質量％であることが好ましく、０．０１〜２質量％であることがより好ましい。界面活性剤の含有量が０．００１質量％以上であれば、培養液の製造が容易になり、培養液中における微細気泡の安定性も向上する。また、界面活性剤の含有量が５質量％以下であれば、微細気泡を生成する際の過度な発泡を防止しやすく、コストを低減できる。
【００２６】
培養液に通気させる微細気泡は、植物ホルモン、水素ガス、および一酸化窒素ガスからなる群より選択される１種以上のガスを少なくとも含む。当該植物ホルモンとしては、培養環境下でガス状であり、かつカルス細胞によるタキサン類の生産効率を高める効果を有する植物ホルモンであれば、特に限定されるものではない。例えば、当該植物ホルモンとしては、カルス細胞の増殖を促進する作用、またはカルス化を誘導する作用を有する常温でガス状の植物ホルモンが挙げられる。本発明においては、特に、エチレンであることが好ましい。
【００２７】
微細気泡中の植物ホルモン、水素ガス、または一酸化窒素ガスの濃度は、０．１〜９９．９体積％であることが好ましく、２〜９９体積％であることがより好ましく、５〜９０体積％であることがさらに好ましい。前記植物ホルモン等の濃度が０．１体積％以上であれば、植物ホルモン等によるカルスの誘導やタキサン類の生成促進等の効果が得られやすい。また、前記植物ホルモン等の濃度が９９．９体積％以下であれば、コストを低減できる。
【００２８】
微細気泡中の植物ホルモン等の濃度は、該微細気泡の発生に用いる、植物ホルモン、水素ガス、および一酸化窒素ガスからなる群より選択される１種以上のガスを少なくとも含有するガス（以下、「有効成分含有ガス」という。）中の植物ホルモン等の濃度を調整することにより調整できる。
有効成分含有ガス中の植物ホルモン等の濃度の調整に使用するガスは、培養液によるカルス細胞の培養に悪影響を与えないガスであればよく、例えば、窒素ガス、希ガス等の不活性ガス、炭酸ガス、細胞への呼吸促進を目的とした酸素ガスが挙げられる。これらのガスは、１種のみを単独で用いてもよく、２種以上を併用した混合ガスであってもよい。
【００２９】
本発明のタキサン類の生産方法においては、培養液中に有効成分含有ガスを微細気泡として存在させる。これにより、培養液中に植物ホルモン等を含む気泡を長期間培養液中に留めておくことができ、植物ホルモン等による効果が高効率でかつ安定して得られる。特に、植物ホルモンとしてエチレンを用いる場合、エチレンが水に難溶であるため、エチレン含有ガスを単に液体培地へ通気しただけでは、大部分のエチレンが気相中に放散され、エチレンの効果が充分に得られにくい。本発明においては、エチレン含有ガスを微細気泡として培養液中に存在させることにより、培養液中にエチレンを安定して維持することができ、エチレンによる効果を高効率でかつ安定して得られる。
【００３０】
培養液中の植物ホルモン等を含有する微細気泡の平均気泡径は、１０μｍ以下であることが好ましく、５μｍ以下であることがより好ましく、１μｍ以下であることがさらに好ましい。ただし、平均気泡径とは培養液中の微細気泡の気泡径の数平均を意味する。気泡径が１０μｍ以下であれば、培養液中で微細気泡が上昇していく速度が小さくなるため、該気泡が培養液から気相中に放出されるまでの滞留時間を長くしやすく、エチレン等の植物ホルモンによるカルスの誘導やタキサン類の生成促進の効果、水素ガスによる抗酸化効果、一酸化窒素ガスによる情報伝達経路の活性化効果等が充分に得られやすい。また、植物ホルモン等を含有する微細気泡の平均気泡径は、気泡形成の容易性から、０．０５μｍ以上であることが好ましく、０．１μｍ以上であることがより好ましい。
【００３１】
植物ホルモン等を含有する微細気泡の平均気泡径の測定方法としては、例えば、レーザー回折散乱法により測定するＬＳ １３ ３２０（ベックマンコールター社製）、細孔電気抵抗法により測定するＭｕｌｔｉｓｉｚｅｒ３（ベックマンコールター社製）等が挙げられる。
【００３２】
培養液中の植物ホルモン等を含有する微細気泡の気泡数は、培養液１ｍＬあたり、１，０００個以上であることが好ましく、１０，０００個以上であることがより好ましく、５０，０００個以上であることがさらに好ましい。気泡数が培養液１ｍＬあたり１，０００個以上であれば、植物ホルモンによるカルスの誘導やタキサン類の生成の促進効果等が得られやすく、特に１０，０００個以上であれば植物ホルモン等を含有する微細気泡と植物組織の接触効率が向上して得られる効果がより高まる。また、植物ホルモン等を含有する微細気泡の気泡数は、気泡形成の容易性から、培養液１ｍＬあたり、１，０００万個以下であることが好ましく、１００万個以下であることがより好ましい。
植物ホルモン等を含有する微細気泡の気泡数の測定方法としては、例えば、Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ３（ベックマンコールター社製）が挙げられる。
【００３３】
液体培地に植物ホルモン等を含有する微細気泡を通気する方法としては、微細気泡を発生させることができる方法であればよく、公知の旋回流方式、加圧溶解方式、機械撹拌方式、超音波方式、膜透過方式、もしくは、これらの方式を組み合わせた方式等を用いることができる。
【００３４】
植物ホルモン等を含有する微細気泡を含む培養液は、例えば、特開２０１０−１９３８３８号公報に開示されているような培養液製造装置を用いて製造することができる。当該培養液製造装置の一例を図１に示す。培養液製造装置３は、通気前の培養液（液体培地）を貯留する培養液貯留部１１と、有効成分含有ガスを貯留する有効成分含有ガス貯留部１２（以下、単に「ガス貯留部１２」という。）と、通気前の培養液に有効成分含有ガスを通気して有効成分含有気泡を発生させる有効成分含有気泡発生部１３（以下、単に「気泡発生部１３」という。）と、通気後の培養液を供給する培養液供給部１４とを備えている。また、培養液貯留部１１と気泡発生部１３とが配管２１で連結されており、ガス貯留部１２と気泡発生部１３とが配管２２で連結されており、気泡発生部１３の下流側と培養液貯留部１１とが配管２７で連結されており、培養液貯留部１１と培養液供給部１４とが配管２８で連結されている。
【００３５】
培養液貯留部１１に貯留される通気前の培養液（液体培地）の量は、通気後の培養液により培養されるカルス細胞の種類や培養規模等に応じて適宜決定できる。まず、ポンプ１５により、培養液貯留部１１に貯留されている通気前の培養液が配管２１を通じて気泡発生部１３に液送され、気泡発生ノズル１６に通液される。同時に、ガス貯留部１２に貯留されている有効成分含有ガスが配管２２を通じて気泡発生部１３の気泡発生ノズル１６に供給される。有効成分含有ガスの供給機構は、加圧により気泡発生部１６に送られる機構であってもよく、減圧により気泡発生部１６内に吸引される機構であってもよい。
気泡発生ノズル１６内では、通液される液体培地により旋回流が形成されており、該旋回流により生じた渦流の中心部には、植物ホルモン等を含む気体空洞部が形成される。この植物ホルモン等を含む気体空洞部の先端部が、液体培地の旋回流によるせん断力により引きちぎられることにより、植物ホルモン等を含有する微細気泡が発生する。
通気後の培養液中の植物ホルモン等を含有する気泡の平均気泡径、および気泡数は、気泡発生ノズル１６の形状および生じさせる旋回流の度合い、気泡発生ノズル１６に通液する通気前の培養液の液流量、有効成分含有ガスの流量、界面活性剤の種類や添加量等を調整することにより制御できる。
【００３６】
培養液製造装置３では、培養液貯留部１１から液送される通気前の培養液（液体培地）を、配管２１、気泡発生部１３、配管２７を順次通過させて培養液貯留部１１へと戻して循環させる。これにより、連続的に有効成分含有ガスを通気することで、植物ホルモン等を含有する気泡の気泡数を容易に向上させることができる。そして、植物ホルモン等を含有する気泡を含む通気後の培養液を、配管２８を通じて培養液供給部１４に送液し、培養液供給部１４からバルブ等の操作により所定の容器等に供給する。
培養液製造装置３における培養液供給部１４は、培養液貯留部１１の底部付近の一画に連結されることが好ましい。
【００３７】
気泡発生部１３は、前述の旋回流方式には限定されず、加圧溶解方式、機械攪拌方式、超音波方式、膜透過方式を採用したものであってもよく、それらを組み合わせたものであってもよい。
例えば、膜透過方式としては、多孔質ガラス膜を有し、内部に培養液を通液できる多孔質ガラスモジュール（気泡発生部）等が挙げられる。該多孔質ガラスモジュールでは、モジュール内に通液されている培養液に対して、微細な孔を多数有する多孔質ガラス膜を介して有効成分含有ガスを通気することにより、培養液中に有効成分含有気泡を発生させることができる。
【００３８】
膜透過方式における通気後の培養液中の植物ホルモン等を含有する気泡の平均気泡径は、有効成分含有ガスを通気する孔の平均孔径、有効成分含有ガスの圧力、通液する培養液の液流量、界面活性剤の種類や添加量を調整することにより制御できる。また、気泡数は、多孔質ガラス膜の表面積（孔数）、有効成分含有ガスの通気時間、通液する培養液の液流量、界面活性剤の種類や添加量を調整することにより制御できる。
【００３９】
前記モジュールにおいて平均気泡径が１０μｍ以下の植物ホルモン等を含有する気泡を充分に発生させるには、有効成分含有ガスを通気する孔の平均孔径は０．０５〜１μｍであることが好ましい。
通気する際の有効成分含有ガスの圧力は、通常、膜の平均孔径や界面活性剤の添加量等に依存するが、例えば、膜の平均孔径が０．０８μｍの場合、ガス圧力は２．５〜３．５ＭＰａであることが好ましい。培養液の液流量は、作製する培養液の量により異なるが、培養液１Ｌの場合、０．５〜１０Ｌ／分であることが好ましい。
【００４０】
本発明のタキサン類の生産方法において用いられる培養液には、微細気泡に含有させる植物ホルモン以外のその他の植物ホルモンが添加されていてもよい。培養液に添加される植物ホルモンとしては、例えば、オーキシン類、サイトカイニン類、ジベレリン類、アブジシン類、ブラシノステロイド類、ジャスモン酸、もしくはこれらの類似物質、エリシター類、および増殖促進活性を有する物質が挙げられる。
増殖促進活性を有する物質としては、例えば、ココナッツミルク、カゼイン分解物、酵母抽出物、ビタミン類、無機塩類、ペプチド性植物増殖因子等が挙げられる。
【００４１】
エリシターとは、生物学的由来または非生物由来の化合物であって、植物または植物細胞培養に適用されたときに、二次的中間代謝生産の増加を引き起こすものである。エリシターとしては、通常、（１）選ばれたグループの真菌、バクテリア、酵母からの細胞壁からの抽出物またはろ過物、並びにそれらの精製フラクションを含む生物エリシター類、（２）化学ストレス剤および生物由来の若干の化合物を含む非生物エリシター類を使用することができる。
【００４２】
具体的には、生物エリシター類のうち、微生物としては、ボトリチス・シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）、フィトフトラ・メガスペルマ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｍｅｇａｓｐｅｒｍａ）、ピネラス・ストリプチクム（Ｐｉｎｅｌｌａｓ ｓｔｒｉｐｔｉｃｕｍ）、オリゴスポラス ｓｐ．（Ｏｌｉｇｏｓｐｏｒｕｓ ｓｐ．）、ピチウム・マミアラツム（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｍａｍｉａｌｌａｔｕｍ）、ピチウム・シルバチクム（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｓｙｌｖａｔｉｃｕｍ）、バーティシリウム・ダリアエ（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌ ｉａｅ）、バーティシリウム ｓｐ．（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．）、ペニシリウム ミニオルテウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍｉｎｉｏｌｕｔｅｕｍ）、フィトフトラ・ラテラリス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｌａｔｅｒａｌｉｓ）、シトスポラ・シンクタ（Ｃｙｔｏｓｐｏｒａ ｃｉｎｃｔａ）、シトスポラ・リューコストーマ（Ｃｙｔｏｓｐｏｒａ ｌｅｕｃｏｓｔｏｍａ）、アルターナリア・ブラッシシコラ（Ａlｔｅｒｎａｒｉａ ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａ）、アルターナリア・ソラニ(Ａlｔｅｒｎａｒｉａ ｓｏｌａｎｉ)、アルターナリア・ククメリナ（Ａlｔｅｒｎａｒｉａ ｃｕｃｕｍｅｒｉｎａ）、ボトリチス・スクアモサ（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｓｑｕａｍｏｓａ）、コクリオポラス・ヘテロストロフス（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ）、コレトトリクム・トリホリイ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｔｒｉｆｏｌｉｉ）、コレトトリクム・オルビキュラレ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｏｒｂｉｃｕｌａｒｅ）、コレトトリクム・グラミニコ−ラ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）、コレトトリクム・グロエオスポリオイデス（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ）、シリンドロクラジウム・フロリダヌム（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃｌａｄｉｕｍ ｆｌｏｒｉｄａｎｕｍ）、フザリウム・クロオクウェレンス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウム・ヘテロスポリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｉｕｍ）、フザリウム・オキシスポラム ｆ．ｓｐ．コングルチナンス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ．ｓｐ．ｃｏｎｇｌｕｔｉｎａｎｓ）、フザリウム・オキシスポラム ｆ．ｓｐ．リコペルシシ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ．ｓｐ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ）、フザリウム・オキシスポラム ｆ．ｓｐ．ピジ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ．ｓｐ．ｐｉｓｉ）、ギべレラ・ゼアエ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｚｅａｅ）、ガエウマンノミセス・グラミニス バ−ル．トリチシ（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ ｇｒａｍｉｎｉｓ ｖａｒ．ｔｒｉｔｉｃｉ）、ジエオトリクム ｓｐ．（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐ．）、レプトスファエリア・コラエ（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ Ｋｏｒｒａｅ）、ネクトリア・ハエマトコッカ ＭＰＶＩ（Ｎｅｃｔｒｉａ ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃａ ＭＰＶＩ）、ミコスファエレラ・ピノデス（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｉａ ｐｉｎｏｄｅｓ）、オフィオストーマ・ウルミ（Ｏｐｈｉｏｓｔｏｍａ ｕｌｍｉ）、ホーマ・リンガム（Ｐｈｏｍａ ｌｉｎｇａｍ）、ホーマ・ピノデラ（Ｐｈｏｍａ ｐｉｎｏｄｅｌｌａ）、フィトフトーラ・インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）、フィチウム・アリストスポルム（Ｐｙｔｈｉｕｍ ａｒｉｓｔｏｓｐｏｒｕｍ）、フィチウム・グラミニコ−ラ（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）、フィチウム・ウルチムム（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｕｌｔｉｍｕｍ）、リゾクトニア・ソラーニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）、スクレロチニア ｓｐ．（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｐ．）、Ｓ．ノドルムＤ−４５（Ｓ．ｎｏｄｏｒｕｍ Ｄ−４５）、トラメテス・ベルシコロール（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、ウスチラゴ・マイディス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓ）、およびベンテュリア・イネクワリス（Ｖｅｎｔｕｒｉａ ｉｎｅｑｕａｌｉｓ）が挙げられる。生物エリシター類のうち、微生物フラクション又は生産物としては、キトサン（Ｃｈｉｔｏｓａｎ）、リケナン（Ｌｉｃｈｅｎａｎ）、グルコマンナン（Ｇｌｕｃｏｍａｎｎａｎ）、プルラン（Ｐｌｅｕｒａｎ）、グルカン（Ｇｌｕｃａｎ）、カルボキシメチルグルカン、ヒドロキシメチルグルカン、スルホエチルグルカン、マンナン（Ｍａｎｎａｎ）、キシラン（Ｘｙｌａｎ）、マンノビオース（Ｍａｎｎｏｂｉｏｓｅ）、マンノトリオース（Ｍａｎｎｏｔｒｉｏｓｅ）、マンノペンタオース（Ｍａｎｎｏｐｅｎｔａｏｓｅ）、マンノテトラオース（Ｍａｎｎｏｔｅｔｒａｏｓｅ）、セルリシン（Ｃｅｌｌｕｌｙｓｉｎ）、マルチフェクト ＸＬ（Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ ＸＬ）、マルチフェクト ＣＬ（Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ ＣＬ）、レジナーゼ（Ｒｅｓｉｎａｓｅ）、パルプキシム（Ｐｕｌｐｘｙｍｅ）、ＳＰ４３１、ペクチノール（Ｐｅｃｔｉｎｏｌ）、ラピダーゼ（Ｒａｐｉｄａｓｅ）、クレルザイム（Ｋｌｅｒｚｙｍｅ）、およびキチナーゼ（Ｃｈｉ ｔｉｎａｓｅ）が挙げられる。非生物エリシター類としては、アラキドン酸、エライジン酸、サイクリックＡＭＰ（Ｃｙｃｌｉｃ ＡＭＰ）、ジプチリル環状ＡＭＰ（Ｄｉｂｕｔｙｒｙｌ Ｃｙｃｌｉｃ ＡＭＰ）、メチルジャスモネート、シス−ジャスモン、ミコナゾ−ル（Ｍｉｃｏｎａｚｏｌ）、フェルラ酸（Ｆｅｒｕｌｉｃ ａｃｉｄ）、ＡＭＯ−１６１８、トリトン Ｘ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）、安息香酸、サリチル酸、没食子酸プロピル、セサモール（Ｓｅｓａｍｏｌ）、塩化クロロコリン（Ｃｈｌｏｒｏｃｈｏｌｉｎｅ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、３，４−ジクロロフェノキシトリエチル（アミン）、クロロエチルホスホン酸、ジエチルジチオカルバミン酸、ノルジヒドログアセレト酸（Ｎｏｒｄｉｈｙｄｒｏｇｕａｉａｒｅｔｉｃ ａｃｉｄ）、ジチオトレイトール（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）、メタ重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸カリウム、β−アミノ−ＤＬ−フェニルアラニン、硫酸バナジル（Ｖａｎａｄｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ）、ユニコナゾ−ル（Ｕｎｉｃｏｎａｚｏｌ）、バクロブトラゾ−ル（Ｐａｃｌｏｂｕｔｒａｚｏｌ）、スペルミン（Ｓｐｅｒｍｉｎｅ）、スペルミジン（Ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ）、プトレシン（Ｐｕｔｒｅｓｃｉｎｅ）、カダバリン（Ｃａｄａｖａｒｉｎｅ）、硫酸プロタミン（Ｐｒｏｔａｍｉｎｅ Ｓａｌｆａｔｅ）、ＳＫＰ−７９９７、ＭＥＲ ２９、アンシミド−ル（Ａｎｃｙｍｉｄｏｌ）、トリアジメフォン（Ｔｒｉａｄｉｍｅｆｏｎ）、フォスフォン Ｄ（Ｐｈｏｓｐｈｏｎ Ｄ）、チオ尿素（Ｔｈｉｏｕｒｅａ）、硫酸デキストラン（Ｄｅｘｔｒａｎ Ｓｕｌｆａｔｅ）、ハイドロキノン、グルタミン酸キトサン（Ｃｈｉｔｏｓａｎ ｇｌｕｔａｍａｔｅ）、フェンプロペモルフ（Ｆｅｎｐｒｏｐｅｍｏｒｐｈ）、プロクロラズ（Ｐｒｏｃｈｌｏｒａｚ）、ナプチフィン（Ｎａｐｔｉｆｉｎｅ）、ＥＤＵ、ＨＴＡ、ＭＰＴＡ、グルタチオン、ＥＧＴＡ、ジベレリン類（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎｓ）、アプシジン酸、１，３−ジフェニル尿素、ジアゾリジニル尿素（Ｄｉａｚｏｌｉｄｉｎｙｌ ｕｒｅａ）、フロログルシノール（Ｐｈｌｏｒｏｇｌｕｃｉｎｏｌ）、アルギン酸ナトリウム、およびカラギーナン（Ｃａｒｒａｇｅｎａｎ）が挙げられる。
【００４３】
これら他の植物ホルモンは、１種のみを単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。また、植物ホルモン等を含有する微細気泡を通気させる前の液体培地に添加してもよく、微細気泡を通気させた後の培養液に添加してもよい。
【００４４】
エリシター類は、溶存ガスと相互作用する場合があり、このため、培養液に通気させるガスの種類によっては、懸濁培地中にガスが留まっていることができず、このため、エチレンガス等の有効成分含有ガスを培養液に通気させたとしても、当該ガスによる効果を十分に発揮できないという問題があった。本発明においては、有効成分含有ガスを微細気泡として培養液中に存在させるため、ジャスモン酸等のエリシターが培養液中に存在したとしても、有効成分含有ガスによる十分な効果が得られる。
【００４５】
微細気泡に含有させる植物ホルモンとしてエチレンを用いる場合には、培養液にさらにエリシターとしてジャスモン酸またはその誘導体を添加することが好ましい。培養液中にエチレンガスを含有した微細気泡と、ジャスモン酸またはその誘導体が含まれている場合には、カルス細胞によるタキサン類の生産がより増大する。これは、エチレンとジャスモン酸またはその誘導体との組み合わせが、カルス細胞の代謝経路で代謝を繰り返し、細胞の二次代謝に影響を与えるためと考えられる。
【００４６】
ジャスモン酸またはその誘導体としては、下記一般式（１）〜（４）で表される化合物が挙げられる。
【００４７】
【化１】
［一般式（１）〜（４）中、Ｒ１は、アルキル基またはアルケニル基であり；Ｒ２は水素原子またはアルキル基であり；Ｒ３ａ、Ｒ３ｂ、Ｒ３ｃ、およびＲ３ｄは、それぞれ独立して、水素原子、水酸基、アルキル基、またはアルコキシ基であり；ｎは、１〜７の整数を表す。］
【００４８】
一般式（Ｉ）〜（４）中、Ｒ１はアルキル基またはアルケニル基である。アルキル基またはアルケニル基は、直鎖状であってもよく、分岐鎖状であってもよい。
Ｒ１のアルキル基としては、炭素数１〜２０のアルキル基であることが好ましく、炭素数１〜６のアルキル基であることがより好ましい。具体的には、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、２−メチルブチル基、ネオペンチル基、１−エチルプロピル基、ｎ−ヘキシル基、イソヘキシル基、４−メチルペンチル基、３−メチルペンチル基、２−メチルペンチル基、１−メチルペンチル基、３，３−ジメチルブチル基、２，２−ジメチルブチル基、１，１−ジメチルブチル基、１，２−ジメチルブチル基、１，３−ジメチルブチル基、２，３−ジメチルブチル基、２−エチルブチル基等が挙げられる。
Ｒ１のアルケニル基としては、炭素数２〜２０のアルケニル基であることが好ましく、炭素数２〜６のアルケニル基であることがより好ましい。具体的には、ビニル基、アリル基、２−ブテニル基、３−ブテニル基、イソブテニル基、１−ペンテニル基、２−ペンテニル基、３−ペンテニル基、４−ペンテニル基、３−メチル−２−ペンテニル基、２−ヘキセニル基、３−ヘキセニル基、５−ヘキセニル基等が挙げられる。
【００４９】
一般式（Ｉ）〜（４）中、Ｒ２は水素原子またはアルキル基である。Ｒ２のアルキル基としては、Ｒ１のアルキル基と同様のものが挙げられる。
【００５０】
一般式（Ｉ）〜（４）中、Ｒ３ａ、Ｒ３ｂ、Ｒ３ｃ、およびＲ３ｄは、それぞれ独立して、水素原子、水酸基、アルキル基、またはアルコキシ基である。
Ｒ３ａ、Ｒ３ｂ、Ｒ３ｃ、およびＲ３ｄのアルキル基としては、Ｒ１のアルキル基と同様のものが挙げられる。
Ｒ３ａ、Ｒ３ｂ、Ｒ３ｃ、およびＲ３ｄのアルコキシ基としては、炭素数１〜２０のアルコキシ基であることが好ましく、炭素数１〜６のアルコキシ基であることがより好ましい。具体的には、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基、エトキシカルボニルプロポキシ基、ｓｅｃ−ブトキシ基、ｎ−ペンチルオキシ基、ｎ−ヘキシルオキシ基、ｎ−ヘプチルオキシ基等が挙げられる。
【００５１】
一般式（Ｉ）〜（４）中、ｎは１〜７の整数を表す。本発明においては、ｎは１〜３の整数であることが好ましく、１または２であることがより好ましく、１であることがさらに好ましい。
【００５２】
ジャスモン酸またはその誘導体は、塩として培養液に添加してもよい。塩としては、ジャスモン酸またはその誘導体の効果を損なわず、かつカルス細胞の培養に影響しないものであれば特に限定されず、無機塩であってもよく、有機塩であってもよい。例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、グルコサミン塩、トリエチルアミン塩、ジエタノールアミン塩等のアミン塩等を挙げることができる。
【００５３】
本発明においては、培養液に添加するエリシターが、ジャスモン酸（上記一般式（１）において、Ｒ１が（Ｚ）−２−ペンテニル基であり、ｎが１であり、Ｒ２が水素原子である化合物。）またはジャスモン酸アルキルエステル（上記一般式（１）において、Ｒ１が（Ｚ）−２−ペンテニル基であり、ｎが１であり、Ｒ２がアルキル基である化合物。）であることが好ましく、ジャスモン酸または炭素数１〜６のアルキル基を有するジャスモン酸アルキルエステルであることがより好ましく、ジャスモン酸またはメチルジャスモン酸であることがさらに好ましい。
【００５４】
例えば、エチレンガス含有微細気泡とメチルジャスモン酸とを含む培養液は、液体培地に、エチレンガス含有微細気泡を通気し、フィルターろ過等により除菌し、メチルジャスモン酸を加えることにより、製造することができる。
【００５５】
本発明のタキサン類の生産方法において、植物ホルモン等を含有する微細気泡を含む培養液中でカルス細胞を懸濁培養する際の培養条件は、カルス細胞の種類に応じて適宜設定することができる。例えば、培養温度は１０〜４０℃であり、２０〜３７℃であることが好ましい。また、ｐＨは、植物ホルモン等を含有する微細気泡を発生させる前の培養液のｐＨを予め調整しておいてもよく、植物ホルモン等を含有する微細気泡を発生させた後に培養液のｐＨを調整してもよい。溶存酸素濃度（ＤＯ）は、植物ホルモン等を含有する微細気泡を発生させる有効成分含有ガスに予め所定の濃度で酸素を含有させておいてもよく、培養液中に酸素を別途供給するようにしてもよい。
【００５６】
また、培養中の光照射量、攪拌、振とう等の条件についても、培養するカルス細胞の種類に応じて、適宜条件を選択でき、通常の植物材料やカルス細胞の培養と比べて、特別な条件を設定する必要はない。特に、本発明における培養液では、植物材料やカルス細胞の培養に通常採用される条件で攪拌または振とうを行った場合でも、植物ホルモン等を含有する微細気泡の安定性はほとんど低下しないため。植物ホルモンによる効果を安定して充分に得ることが可能である。
【００５７】
懸濁培養により、カルス細胞によってタキサン類が生産される。このため、懸濁培養後のカルス細胞からタキサン類を回収することができる。また、本発明のタキサン類の生産方法においては、タキサン類は細胞内に存在するだけでなく、培養液中にも分泌される。このため、タキサン類を連続的に生産することが可能である。さらに、培養液中への分泌量自体も、従来法よりも多い傾向がある。このため、懸濁培養後の培養液からも、分泌されたタキサン類を回収することができる。
【００５８】
懸濁培養後のカルス細胞または培養液からのタキサン類の回収は、通例の方法を用いることができる。
例えば、懸濁培養を行った培養液を遠心分離して、細胞からなる沈殿物と、培養濾液からなる上清とに分離する。
沈殿物は、凍結乾燥した後、微粉化し、有機溶媒を使って抽出を行う。有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール等のアルコール類、ジクロロメタン、ベンゼン、クロロホルム、ジオキサン、アセトン等をあげることができる。これらは２種以上を併用してもよい。タキサン類が抽出された溶媒は、エバポレータを使用して溶媒を除去することにより、タキサン類を含む抽出物を得ることができる。これらの抽出物を少量のメタノールに溶解させ、その抽出物中のタキサン類を定量することができる。
【００５９】
一方、本発明のタキサン類の生産方法では、前述の通り、培養液中に大量にタキソールまたはタキサン類が分泌される。このため、遠心分離後の上清（培養液）からもタキサン類を回収することができる。例えば、上清は、前述した有機溶媒のいずれかを使って抽出を行う。特に、ジクロロメタンが好ましい。その後の抽出物を得るプロセスは、沈殿物の場合と同じプロセスで行うことができる。
【００６０】
回収されたタキサン類は、高速クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）法や、タキソール抗体を用いて抗原抗体反応を利用する方法により、定量することができる。さらに、定量結果から、乾燥細胞重量あたりのタキサン類の収量を見積もることもできる。
【００６１】
ＨＰＬＣ法では、タキサン類の標準品のピークと抽出物中に含まれるタキサン類のピークが、同じ保持期間に現れるか否かを調べることにより、生産されたタキサン類を同定し、定量することができる。
タキソール抗体を用いる方法としては、例えば、抗−タキソール・モノクローナル抗体および抗−タキソール・モノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏ Ｓｏｌｖｅｎｔ Ａｓｓａｙ）法を用いることができる。
【００６２】
＜カルス誘導方法＞
本発明のカルス誘導方法は、植物材料からカルスを誘導する際の、植物材料の殺菌方法に関する。具体的には、本発明のカルス誘導方法は、植物細胞または植物組織片を、二酸化塩素溶液を用いて殺菌処理する表面殺菌工程と、前記表面殺菌工程後に、当該植物細胞または植物組織片をカルス誘導固体培地で培養し、カルス化を誘導することによりカルス細胞を形成する培養工程と、を有することを特徴とする。カルス誘導前の植物材料の殺菌処理を、二酸化塩素溶液を用いて行うことにより、次亜塩素酸を用いる従来法に比べて、より安定かつ確実にカルス細胞を得ることができる。
【００６３】
本発明のカルス誘導方法に供される植物材料は、一般的にカルス誘導に用いられるものであれば特に限定されるものではなく、樹皮、形成層、茎、枝、葉、種子、きゅう果、根を含む任意の組織から採取された植物細胞または植物組織片であればよい。また、当該植物材料は、いずれの植物種由来のものであってもよい。例えば、本発明のカルス誘導方法に供される植物材料としては、イチイ（Ｔａｘａｌｅｓ）目、ハナシノブ目（Ｐｏｌｅｍｏｎｉａｌｅｓ）、アカネ目（Ｒｕｂｉａｌｅｓ）、ムラサキ目（Ｂｏｒａｇｉｎａｌｅｓ）、キンポウゲ目（Ｒａｎｕｎｃｕｌａｌｅｓ）、イチョウ目（Ｇｉｎｋｇｏａｌｅｓ）、ウリ目（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｌｅｓ）、ミズキ目（Ｃｏｒｎａｌｅｓ）、セリ目（Ｕｍｂｅｌｌａｌｅｓ）、アカザ目（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｌｅｓ）、ヒガンバナ目（Ａｍａｒｙｌｌｉｄａｌｅｓ）、トウダイグサ目（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｌｅｓ）またはユリ目（Ｌｉｌｉａｌｅｓ）に属する植物が挙げられる。イチイ目に属する植物の中では、イチイ科（Ｔａｘａｃｅａｅ）植物が好ましく、イチイ属植物がより好ましい。
【００６４】
ハナシノブ目に属する植物の中では、ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）植物およびゴマノハグサ科（Ｓｃｒｏｐｈｕｌａｒｉａｃｅａｅ）植物が好ましい。ナス科植物の中では、ズボイシア・ミオポロイダス（Ｄｕｂｏｉｓｉａ ｍｙｏｐｏｒｏｉｄｅｓ）などを含むズボイシア（Ｄｕｂｏｉｓｉａ）属植物、およびヒヨス（Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ ｎｉｇｅｒ）などを含むヒヨスチアムス（Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ）属植物がさらに好ましい。ゴマノハグサ科植物の中では、ジギタリス（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ ｐｕｒｐｕｒｅａ）、ケジギタリス（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ ｌａｎａｔａ）などを含むジギタリス（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ）属植物がさらに好ましい。
【００６５】
アカネ目に属する植物の中では、アカネ科（Ｒｕｂｉａｃｅａｅ）植物が好ましく、その中でもアカネ（Ｒｕｂｉａ ａｋａｎｅ）などを含むルビア（Ｒｕｂｉａ）属植物がさらに好ましい。ムラサキ目に属する植物の中では、ムラサキ科（Ｂｏｒａｇｉｎａｃｅａｅ）植物が好ましく、その中でもムラサキ（Ｌｉｔｈｏｓｐｅｒｍｕｍ ｅｒｙｔｈｒｏｒｈｉｚｏｎ）などを含むリソスペルマム（Ｌｉｔｈｏｓｐｅｒｍｕｍ）属植物がさらに好ましい。
【００６６】
キンポウゲ目に属する植物の中では、キンポウゲ科（Ｒａｎｕｎｃｕｌａｃｅａｅ）植物、メギ科（Ｂｅｒｂｅｒｉｄａｃｅａｅ）植物、およびツヅラフジ科（Ｍｅｎｉｓｐｅｒｍａｃｅａｅ）植物が好ましい。キンポウゲ科植物の中では、オウレン（Ｃｏｐｔｉｓ ｊａｐｏｎｉｃａ）などを含むコプチス（Ｃｏｐｔｉｓ）属植物がさらに好ましい。メギ科植物の中では、メギ（Ｂｅｒｂｅｒｉｓ ｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉ）などを含むベルベリス（Ｂｅｒｂｅｒｉｓ）属植物、およびポドフィルム・ペルタツム（Ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｕｍ ｐｅｌｔａｔｕｍ）などを含むポドフィルム（Ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｕｍ）属植物がさらに好ましい。ツヅラフジ科植物の中では、タマサキツヅラフジ（Ｓｔｅｐｈａｎｉａ ｃｅｐｈａｒａｎｔｈａ）などを含むステファニア（Ｓｔｅｐｈａｎｉａ）属植物がさらに好ましい。
【００６７】
イチョウ目に属する植物の中では、イチョウ（Ｇｉｎｋｇｏ ｂｉｌｏｂａ）が好ましい。ウリ目に属する植物の中では、ウリ科（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ） 植物が好ましく、その中でもヘチマ（Ｌｕｆｆａ ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａ）などを含むルファ（Ｌｕｆｆａ）属植物、メロン（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｍｅｌｏ）などを含むククミス（Ｃｕｃｕｍｉｓ）属植物、およびスイカ（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）などを含むキトルルス（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ）属植物がさらに好ましい。
【００６８】
ミズキ目に属する植物の中では、ニッサ科（Ｎｙｓｓａｃｅａｅ）植物が好ましく、その中でもキジュ（Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａ ａｃｕｍｉｎａｔａ）などを含むカンプトテカ（Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａ）属植物がさらに好ましい。セリ目に属する植物の中では、ウコギ科（Ａｒａｌｉａｃｅａｅ）植物が好ましく、その中でもオタネニンジン（Ｐａｎａｘ ｇｉｎｓｅｎｇ）などを含むパナクス（Ｐａｎａｘ）属植物がさらに好ましい。
【００６９】
アカザ目に属する植物の中では、ヤマゴボウ科（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａｃｅａｅ）植物、およびアカザ科（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｃｅａｅ）植物が好ましい。ヤマゴボウ科植物の中では、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）などを含むフィトラッカ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ）属植物がさらに好ましい。アカザ科植物の中では、ビート（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）などを含むベータ（Ｂｅｔａ）属植物がさらに好ましい。
【００７０】
ヒガンバナ目に属する植物の中では、ヤマノイモ科（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａｃｅａｅ）植物が好ましく、その中でもジオスコリア・コンポジータ（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ ｃｏｍｐｏｓｉｔａ）などを含むジオスコリア（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ）属植物、およびオニドコロ（Ａｓｐｉｄｉｓｔｒａ ｅｌａｔｉｏｒ）などを含むアスピディストラ（Ａｓｐｉｄｉｓｔｒａ）属植物がさらに好ましい。トウダイグサ目に属する植物の中では、トウダイグサ科（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｃｅａｅ） 植物が好ましく、その中でもハナキリン（Ｅｕｈｐｒｂｉａ ｍｉｌｌｉｉ）などを含むユーフォルビア（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ）属植物がさらに好ましい。
【００７１】
ユリ目に属する植物の中ではユリ科（ｌｉｌｉａｃｅａｅ）植物が好ましく、その中でもイヌサフラン（Ｃｏｌｃｈｉｃｕｍ ａｎｔｕｍｎａｌｅ）などを含むコルキカム（Ｃｏｌｃｈｉｃｕｍ）属植物がさらに好ましい。
【００７２】
上記植物の中でも、イチイ属植物、ズボイシア属植物、ルビア属植物、リソスペルマム属植物、コプチス属植物、イチョウ、ベルベリス属植物、ポドフィルム属植物、ステファニア属植物、ルファ属植物、ククミス属植物、キトルルス属植物、カンプトテカ属植物、パナクス属植物、フィトラッカ属植物、ベータ属植物、およびコルキカム属植物がよりさらに好ましい。
【００７３】
本発明のカルス誘導方法に供される植物材料としては、特にイチイ属植物の植物材料であることが好ましい。イチイ属植物は、次亜塩素酸による影響を受けやすく、このため、次亜塩素酸により殺菌処理がなされた植物材料は、カルス誘導が不安定であり、確実性に乏しい。これに対して、二酸化塩素溶液を用いて殺菌処理を行うことにより、イチイ属植物の植物材料に対する誘導効率が安定し、一度の処理で確実にカルス細胞が形成できる。
【００７４】
二酸化塩素溶液を用いた殺菌処理は、二酸化塩素溶液に植物材料を浸漬させることにより行われる。二酸化塩素溶液中の二酸化塩素の濃度や浸漬時間は、植物材料の種類に応じて適宜調整することができる。例えば、イチイ属植物の植物材料の場合には、１０〜１０００ｐｐｍの二酸化塩素溶液に１０〜８０分間浸漬させることが好ましく、３０〜１００ｐｐｍの二酸化塩素溶液に２０〜４０分間浸漬させることがより好ましい。殺菌力の高い二酸化塩素溶液を低濃度で使用するため、確実にカルス誘導を実現できる。
【００７５】
表面殺菌工程では、二酸化塩素溶液による処理と二酸化塩素溶液以外の消毒剤や殺菌剤とを併用することもできる。例えば、二酸化塩素溶液に、界面活性剤、エタノール溶液、次亜塩素酸ナトリウム溶液等を適宜組み合わせて、消毒または表面殺菌することができる。次亜塩素酸ナトリウム溶液のみを用いる場合よりも、二酸化塩素溶液を組み合わせることにより、よりカルス誘導の効率を改善することができる。また、各処理を終了するごとに、滅菌水により洗浄することも好ましい。
【００７６】
本発明においては、中でも、界面活性剤と、エタノール溶液と、二酸化塩素溶液とを組み合わせて消毒または表面殺菌することが好ましい。これらの処理はそれぞれ別個に行い、各処理が終了するごとに滅菌水により洗浄する。
【００７７】
本発明のカルス誘導方法では、表面殺菌工程後、培養工程として、表面殺菌処理後の植物材料をカルス誘導固体培地で培養し、カルス化を誘導することによりカルス細胞を形成する。当該培養工程は、植物材料の種類等を考慮し、公知のいずれのカルス誘導方法により行ってもよい。
【００７８】
本発明のカルス誘導方法により形成されたカルスおよびカルス細胞は、その他のカルス誘導方法により得られたカルス等と同様に、有用物質を生産させることや、再分化させることができる。
【実施例】
【００７９】
以下、実施例および比較例を示して本発明を詳細に説明する。ただし、本発明は以下の記載によっては限定されない。なお、本実施例においては特に明記しない限り「％」は「質量％」を意味する。
【００８０】
＜エチレン含有気泡の安定性＞
エチレン含有気泡を含む培養液を製造し、該培養液中におけるエチレン含有気泡の安定性を評価した。
【００８１】
［製造例１］
培養液製造装置は、気泡発生部として、多孔質ガラス膜（平均孔径０．０８μｍ、ＳＰＧテクノ社製）を用いた膜透過方式を採用した気泡発生部を有する図１の培養液製造装置３（以下、「製造装置３Ａ」という。）を用いた。
また、通気前の培養液は、ＧａｍｂｏｒｇＢ５培地に界面活性剤としてＴｗｅｅｎ８０（和光純薬工業社製）を０．０２％添加した培養液（ａ１）を用い、液温は２５℃に設定した。
製造装置３Ａにおいて、気泡発生部内部に培養液（ａ１）を循環（液流量１．３Ｌ／分）させ、該気泡発生部において培養液（ａ１）中に、窒素で希釈したエチレン濃度５．０体積％のエチレン含有ガスを３．５ＭＰａの圧力で多孔質ガラス膜を介して１０分間通気し、エチレン含有気泡を含む培養液（Ａ１）を製造した。
培養液（Ａ１）の作成直後に培養液（Ａ１）中に残存するエチレン含有気泡の平均気泡径および気泡数をＭｕｌｔｉｓｉｚｅｒ３（検出限界０．４μｍ、ベックマンコールター社製）で測定したところ、平均気泡径は１．０μｍ、気泡数（測定気泡径：０．４〜２μｍ）は培養液（Ａ１）１ｍＬあたり約５７，０００個であった。
【００８２】
［比較製造例１］
製造例１の前記培養液（ａ１）に、窒素で希釈したエチレン濃度５．０体積％のエチレン含有ガスを、内径５ｍｍのチューブ管を用いて１０分間通気して培養液（Ｂ１）を製造した。
培養液（Ｂ１）の作成直後に培養液（Ｂ１）中に残存するエチレン含有気泡の平均気泡径および気泡数をＭｕｌｔｉｓｉｚｅｒ３（ベックマンコールター製）で測定したところ、平均気泡径は約５１μｍ、培養液（Ｂ１）１ｍＬあたりの気泡数（測定気泡径：２〜８０μｍ）は、約３００個であった。通気時に生成する気泡径が数ｍｍ〜数ｃｍの気泡は、すぐに浮上して気相中に放散されてしまい、測定できなかった。
【００８３】
［評価方法］
製造例１および比較製造例１で得られたエチレン含有気泡を含む培養液（Ａ１）、（Ｂ１）について、１時間、３時間、２４時間、および７２時間静置したときの、培養液（Ａ１）、（Ｂ１）がそれぞれ含有するエチレン濃度をガスクロマトグラフィー（ＧＣ−１８Ａ、島津製作所製、カラム：Ｐｏｒａｐａｃｋ Ｑ（Ｍｅｓｈ６０／８０）、測定温度７５℃）により測定した。その結果を図３に示す。
図３に示すように、製造例１の培養液（Ａ１）では、７２時間経過後においてもエチレン濃度が５ｍｇ／ｋｇに維持されており、エチレンを含有する微細気泡を用いることで培養液（Ａ１）中にエチレンが長時間保持された。
一方、比較製造例１の培養液（Ｂ１）は、２４時間後にはすでにエチレン濃度がほぼ０ｍｇ／Ｌとなっており、７２時間後には培養液（Ｂ１）中のエチレン含有気泡が全て空気中に放散していた。
【００８４】
＜カルス細胞の誘導＞
［実施例１］
イチイ（タキサス・カスピダータ）の種子を植物材料とし、カルス誘導を行った。イチイの種子は、筑波大学実験植物園、森林総合研究所林木育種センターなどから入手し、使用するまで４℃で保存した。
最初に、種子と各薬品との接触を向上させる目的で、種子を、界面活性剤としてＴｗｅｅｎ８０（和光純薬工業社製）を０．２％添加した溶液に、１０分間浸漬させた。次いで、当該種子を、７０％エタノール（和光純薬工業製）水溶液に５分間浸漬して消毒した。さらに、当該種子を、５０ｐｐｍ二酸化塩素溶液に３０分間浸漬して殺菌を行った。その後、当該種子を滅菌水に３分間浸漬することを３回繰り返し、すすぎを行った。
そして、当該種子を取り出し、半分に切断した中身を固体培地５０ｍｌあたり３〜５個、固体培地上に置き、２５℃の明所で静置培養を行った。培地の観察は毎日実施し、カビや微生物等による汚染の有無を観察した。１〜２週間後には、種子表面にカルス形成が認められ、１〜２ケ月後には、半分に切断した種子の２〜５倍量のカルスが形成された。
なお、固体培地の組成は、ＷＰ培地に、ゲランガム（和光純薬工業製）を０．２％添加した水溶液、ナフタレン酢酸を２ｍｇ／ｌ、グルコースを２０ｇ／ｌ、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸を０．５ｍｇ／ｌを添加したものとした。
また滅菌水は、蒸留水を１２１℃で２０分間、オートクレーブ滅菌したものを用いた。
【００８５】
［実施例２］
実施例１と同じ種子を植物材料として使用し、カルス誘導を行った。
最初に、種子と各薬品との接触を向上させる目的で、種子を、界面活性剤としてＴｗｅｅｎ８０（和光純薬工業社製）を０．２％添加した溶液に、１０分間浸漬させた。次いで、当該種子を、７０％エタノール（和光純薬工業製）水溶液に５分間浸漬して消毒した。さらに、当該種子を、５ｐｐｍ二酸化塩素溶液に１時間浸漬して殺菌を行った。その後、当該種子を滅菌水に３分間浸漬することを３回繰り返し、すすぎを行った。
そして、当該種子を取り出し、半分に切断し中身を固体培地５０ｍｌあたり３〜５個、固体培地に置き、２５℃の明所で静置培養を行った。培地の観察は毎日実施し、カビや微生物等による汚染の有無を観察した。この結果、幾つかの種子から、カルスが形成された。
【００８６】
［比較例１］
実施例１と同じ種子を植物材料として使用し、カルス誘導を行った。
最初に、種子と各薬品との接触を向上させる目的で、種子を、界面活性剤としてＴｗｅｅｎ８０（和光純薬工業社製）を０．２％添加した溶液に、１０分間浸漬させた。次いで、当該種子を、７０％エタノール（和光純薬工業製）水溶液に５分間浸漬して消毒した。さらに、当該種子を、１．５％次亜塩素酸ナトリウム溶液に１時間浸漬して殺菌を行った。その後、当該種子を滅菌水に３分間浸漬することを３回繰り返し、すすぎを行った。
そして、当該種子を取り出し、半分に切断し中身を固体培地５０ｍｌあたり３〜５個、固体培地に置き、２５℃の明所で静置培養を行った。培地の観察は毎日実施し、カビや微生物等による汚染の有無を観察した。この結果、１週間経過してもカルスは形成されなかった。殺菌時に種子にダメージを与えたものと考えられた。
【００８７】
［比較例２］
実施例１と同じ種子を植物材料として使用し、カルス誘導を行った。
最初に、種子と各薬品との接触を向上させる目的で、種子を、界面活性剤としてＴｗｅｅｎ８０（和光純薬工業社製）を０．２％添加した溶液に、１０分間浸漬させた。次いで、当該種子を、７０％エタノール（和光純薬工業製）水溶液に５分間浸漬して消毒した。さらに、当該種子を、１．５％次亜塩素酸ナトリウム溶液に２０分間浸漬して殺菌を行った。その後、当該種子を滅菌水に３分間浸漬することを３回繰り返した後、さらに滅菌水に１２時間浸漬し、すすぎを行った。さらに、当該種子を、１．５％次亜塩素酸ナトリウム溶液に１０分間浸漬して２回目の殺菌を行った。その後、当該種子を滅菌水に３分間浸漬することを３回繰り返し、すすぎを行った。
そして、当該種子を取り出し、半分に切断し中身を固体培地５０ｍｌあたり３〜５個、固体培地に置き、２５℃の明所で静置培養を行った。培地の観察は毎日実施し、カビや微生物等による汚染の有無を観察した。この結果、１週間後、種子のほぼ全面にカビの発生が見られ、カルスの形成は確認できず、十分な殺菌ができていなかったことが確認された。
【００８８】
＜タキサン類の生産＞
［実施例３］
実施例１で得られたカルス細胞を用いて、懸濁培養を行い、タキサン類の生産を行った。
（培養）
培養液は、ＷＰ培地に界面活性剤としてＴｗｅｅｎ８０（和光純薬工業社製）を０．０２％添加した培養液（ａ２）を用い、液温は２５℃に設定した。製造装置３Ａにおいて、気泡発生部内部に培養液（ａ２）を循環（液流量１．３Ｌ／分）させ、該気泡発生部において培養液（ａ２）中に、窒素で希釈したエチレン濃度５．０体積％のエチレン含有ガスを３．５ＭＰａの圧力で多孔質ガラス膜を介して１０分間通気し、エチレン含有気泡を含む培養液（Ａ２）を製造した。これをさらに、孔径０．８μｍのフィルター（アドバンテック社製）で濾過して除菌を行った。この培養液２５ｍｌを含む１００ｍｌ容の三角フラスコに、実施例１で得たカルスを湿重量（ｆｒｅｓｈ ｗｅｉｇｈｔ）２ｇ投入した後、エリシターとしてメチルジャスモン酸（和光純薬工業製）を培養液中の濃度が１００μＭになるように添加し、２５℃、１１０ｒｐｍ、暗黒下で回転振とう培養を行った。その後７日間培養を行い、下記の方法でタキサン類を抽出した。
【００８９】
（抽出）
抽出方法は、まず培養液を遠心分離（遠心効果８００Ｇ、１５分間）して、沈殿物（細胞）と上清（培養瀘液）とに分離した。沈殿物は凍結乾燥した後、凍結乾燥物の全重量を測定した（全細胞量）。その後、微粉化し、１５０ｍｇを１００ｍｌメタノールを溶媒として２０℃、２４時間でタキサン類の抽出を行った。そして、当該溶媒を遠心分離（１７００Ｇ、１０分間）して、上清のみを回収して残査を除去した。当該上清をエバボレートした後、ジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２、和光純薬工業製）２０ｍｌと水２０ｍｌを１:１で分液ロートを用いて分配し、ジクロロメタン画分を回収し、さらにエバボレートした後、メタノール（和光純薬工業製）１ｍｌに再懸濁し、分析用サンプルとした。
一方、初期の遠心分離で得られた上清（培養瀘液）は、上清１５ｍｌに対してジクロロメタン（和光純薬工業製）１５ｍｌを加え、分液ロートを用いて３０秒間、激しく攪拌した後、分配し、ジクロロメタン画分を回収し、エバボレートした後、メタノール（和光純薬工業製）１ｍｌに再懸濁し、分析用サンプルとした。
【００９０】
（評価）
得られた分析用サンプルは、ＨＰＬＣにより、標準タキソールとの比較と、タキソールイムノアッセイキット（Ｃａｒｄａｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．， Ｈａｗａｉｉ）とを用いて定量を行った。
ＨＰＬＣでは、カラム（東ソー製、ＴＳＫ−ｇｅｌ ＯＤＳ−８０Ｔｓ：Φ４．６ｘ２５０ ｍｍ）に、流速１ｍｌ／分で、分析用サンプルと標準タキサン類（和光純薬工業製）をそれぞれ流して比較した。双方とも、ピークの検出波長２２０ｎｍが同一の保持時間（４０分）で出現することが示され、これらの化合物が同じであることが示唆された。
タキソールイムノアッセイキットによる定量は、商品の取扱説明書に記載の手順に従って、分析用サンプルと標準タキソールとを処理した。そして、標準タキソールと吸光度との検量線を導き、分析用サンプル中の吸光度からタキサン類の量を見積もった。その結果、沈殿物からは乾燥細胞１ｇあたり０．１３ｍｇ、上清からは乾燥細胞１ｇあたり２．７８ｍｇ、合計で乾燥細胞１ｇあたり２．９ｍｇのタキサン類が得られた。特に、上清が９５％を占めており、タキサン類が細胞外へ効率よく分泌されており、連続的に生産できる可能性があることが示唆された。
【００９１】
［実施例４］
実施例１で得られたカルス細胞を用いて、懸濁培養を行い、タキサン類の生産を行った。
（培養・抽出）
実施例３で製造されたエチレン含有気泡を含む培養液（Ａ２）に対して、さらに、孔径０．８μｍのフィルター（アドバンテック社製）で濾過して除菌を行った。この培養液２５ｍｌを含む１００ｍｌ容の三角フラスコに、実施例１で得たカルスを湿重量（ｆｒｅｓｈ ｗｅｉｇｈｔ）２ｇ投入し、２５℃、１１０ｒｐｍ、暗黒下で回転振とう培養を行った。その後１０日間培養を行い、実施例３と同様の方法でタキサン類を抽出した。
【００９２】
（評価）
得られた分析用サンプルに対して、実施例３と同様にして、ＨＰＬＣにより、標準タキソールとの比較と、およびタキソールイムノアッセイキットとを用いた定量を行った。
この結果、ＨＰＬＣでは、実施例１と同様に、分析用サンプルと標準タキサン類のピークの検出波長２２０ｎｍが、同一の保持時間（４０分）で出現することが示された。
また、タキソールイムノアッセイキットによる定量の結果、沈殿物からは乾燥細胞１ｇあたり０．６４ｍｇ、上清からは乾燥細胞１ｇあたり１．４４ｍｇ、合計で乾燥細胞１ｇあたり２．０８ｍｇのタキサン類が得られた。全生産量のうち、上清中のタキサン類が占める割合は６９％であった。
【００９３】
実験例３と実験例４の結果を比較すると、メチルジャスモン酸が含まれている培養液中で懸濁培養した実施例３のほうが、メチルジャスモン酸が含まれていない培養液中で懸濁培養した実験例４よりも、乾燥細胞重量あたりのタキサン類の生産量が多く、また、培養液へ分泌されるタキサン類の割合も多いことがわかった。
【００９４】
［比較例３］
実施例１で得られたカルス細胞中のタキサン類を定量した。
具体的には、実施例１で得たカルスの湿重量（ｆｒｅｓｈ ｗｅｉｇｈｔ）２ｇを凍結乾燥した後、凍結乾燥物の全重量を測定した（全細胞量）。当該凍結乾燥物から、実施例１と同様にして、タキサン類を抽出し、分析用サンプルを調製した。
【００９５】
（評価）
得られた分析用サンプルに対して、実施例３と同様にして、ＨＰＬＣにより、標準タキソールとの比較と、およびタキソールイムノアッセイキットとを用いた定量を行った。
この結果、ＨＰＬＣでは、実施例１と同様に、分析用サンプルと標準タキサン類のピークの検出波長２２０ｎｍが、同一の保持時間（４０分）で出現することが示された。
また、タキソールイムノアッセイキットによる定量の結果、沈殿物からは乾燥細胞１ｇあたり０ｍｇ、上清からは乾燥細胞１ｇあたり０．３ｍｇ、合計で乾燥細胞１ｇあたり０．３ｍｇのタキサン類が得られた。
【００９６】
［比較例４］
実施例１で得られたカルス細胞を用いて、懸濁培養を行い、タキサン類の生産を行った。
（培養）
培養液は、ＷＰ培地に界面活性剤としてＴｗｅｅｎ８０（和光純薬工業社製）を０．０２％添加した培養液（ａ２）を用い、液温は２５℃に設定した。この培養液２５ｍｌを含む１００ｍｌ容の三角フラスコに、実施例１で得たカルスを湿重量（ｆｒｅｓｈ ｗｅｉｇｈｔ）２ｇ投入し、その後７日間培養を行い、実施例３と同様の方法でタキサン類を抽出した。
【００９７】
（評価）
得られた分析用サンプルに対して、実施例３と同様にして、ＨＰＬＣにより、標準タキソールとの比較と、およびタキソールイムノアッセイキットとを用いた定量を行った。
この結果、ＨＰＬＣでは、実施例１と同様に、分析用サンプルと標準タキサン類のピークの検出波長２２０ｎｍが、同一の保持時間（４０分）で出現することが示された。
また、タキソールイムノアッセイキットによる定量の結果、沈殿物からは乾燥細胞１ｇあたり０ｍｇ、上清からは乾燥細胞１ｇあたり０．３ｍｇ、合計で乾燥細胞１ｇあたり０．３ｍｇのタキサン類が得られた。
比較例３の結果と比較して明らかなように、比較例４では、懸濁培養によりカルス細胞が生産するタキサン類はほとんど増大していなかった。
【００９８】
［比較例５］
実施例１で得られたカルス細胞を用いて、懸濁培養を行い、タキサン類の生産を行った。
（培養）
培養液は、ＷＰ培地に界面活性剤としてＴｗｅｅｎ８０（和光純薬工業社製）を０．０２％添加した培養液（ａ２）を用い、液温は２５℃に設定した。この培養液２５ｍｌを含む１００ｍｌ容の三角フラスコに、実施例１で得たカルスを湿重量（ｆｒｅｓｈ ｗｅｉｇｈｔ）２ｇ投入し、その後１０日間培養を行い、実施例３と同様の方法でタキサン類を抽出した。
【００９９】
（評価）
得られた分析用サンプルに対して、実施例３と同様にして、ＨＰＬＣにより、標準タキソールとの比較と、およびタキソールイムノアッセイキットとを用いた定量を行った。
この結果、ＨＰＬＣでは、実施例１と同様に、分析用サンプルと標準タキサン類のピークの検出波長２２０ｎｍが、同一の保持時間（４０分）で出現することが示された。
また、タキソールイムノアッセイキットによる定量の結果、沈殿物からは乾燥細胞１ｇあたり０．５ｍｇ、上清からは乾燥細胞１ｇあたり１．０ｍｇ、合計で乾燥細胞１ｇあたり１．５ｍｇのタキサン類しか得られなかった。
実施例４、比較例３、および比較例４の結果と比較して明らかなように、懸濁培養時間がより長かった比較例５では、比較例４よりも懸濁培養によりカルス細胞が生産するタキサン類は増えていたものの、同じ培養時間であった実施例４と比べて明らかに少なかった。
【産業上の利用可能性】
【０１００】
本発明のタキサン類の生産方法により、従来になく大量のタキサン類を生産することができるため、当該方法は、タキサン類を有効成分とする医薬品の製造分野等で特に有用である。
また、本発明のカルス誘導方法により、効率よくカルス細胞を形成することができるため、当該方法は、カルス細胞を利用する多くの分野において有用である。
【符号の説明】
【０１０１】
３ 培養液製造装置、１１ 培養液貯留部、１２ 有効成分含有ガス貯留部、１３ 有効成分含有気泡発生部、１４ 培養液供給部、１５ ポンプ、１６ 気泡発生ノズル、２１、２２、２７、２８ 配管
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イチイ（Ｔａｘｕｓ）属植物の植物細胞または植物組織片から形成されたカルス細胞を、植物ホルモン、水素ガス、および一酸化窒素ガスからなる群より選択される１種以上のガスを含有する微細気泡を含む培養液中で懸濁培養し、培養後のカルス細胞または培養液からタキサン類を回収することを特徴とする、タキサン類の生産方法。
【請求項２】
前記微細気泡の平均気泡径が１０μｍ以下である、請求項１に記載のタキサン類の生産方法。
【請求項３】
前記微細気泡の気泡数が、培養液１ｍＬあたり１，０００個以上である、請求項１または２に記載のタキサン類の生産方法。
【請求項４】
前記微細気泡がエチレンを含有するガスを含む微細気泡である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のタキサン類の生産方法。
【請求項５】
前記培養液が、さらにエリシターを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のタキサン類の生産方法。
【請求項６】
前記エリシターが、ジャスモン酸またはその誘導体である、請求項５に記載のタキサン類の生産方法。
【請求項７】
カルス細胞から分泌されたタキサン類を、培養後の培養液から回収する、請求項１〜６のいずれか一項に記載のタキサン類の生産方法。
【請求項８】
回収されるタキサン類がタキソールである、請求項１〜６のいずれか一項に記載のタキサン類の生産方法。
【請求項９】
前記カルス細胞が、イチイ属植物の植物細胞または植物組織片を、二酸化塩素溶液を用いて殺菌処理した後に、カルス化が誘導されて形成された、請求項１〜８のいずれか一項に記載のタキサン類の生産方法。
【請求項１０】
植物細胞または植物組織片を、二酸化塩素溶液を用いて殺菌処理する表面殺菌工程と、
前記表面殺菌工程後に、当該植物細胞または植物組織片をカルス誘導固体培地で培養し、カルス化を誘導することによりカルス細胞を形成する培養工程と、
を有することを特徴とするカルス誘導方法。
【請求項１１】
前記植物細胞または植物組織片が、イチイ属植物の植物細胞または植物組織片である、請求項１０に記載のカルス誘導方法。
【請求項１】
イチイ（Ｔａｘｕｓ）属植物の植物細胞または植物組織片から形成されたカルス細胞を、植物ホルモン、水素ガス、および一酸化窒素ガスからなる群より選択される１種以上のガスを含有する微細気泡を含む培養液中で懸濁培養し、培養後のカルス細胞または培養液からタキサン類を回収することを特徴とする、タキサン類の生産方法。
【請求項２】
前記微細気泡の平均気泡径が１０μｍ以下である、請求項１に記載のタキサン類の生産方法。
【請求項３】
前記微細気泡の気泡数が、培養液１ｍＬあたり１，０００個以上である、請求項１または２に記載のタキサン類の生産方法。
【請求項４】
前記微細気泡がエチレンを含有するガスを含む微細気泡である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のタキサン類の生産方法。
【請求項５】
前記培養液が、さらにエリシターを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のタキサン類の生産方法。
【請求項６】
前記エリシターが、ジャスモン酸またはその誘導体である、請求項５に記載のタキサン類の生産方法。
【請求項７】
カルス細胞から分泌されたタキサン類を、培養後の培養液から回収する、請求項１〜６のいずれか一項に記載のタキサン類の生産方法。
【請求項８】
回収されるタキサン類がタキソールである、請求項１〜６のいずれか一項に記載のタキサン類の生産方法。
【請求項９】
前記カルス細胞が、イチイ属植物の植物細胞または植物組織片を、二酸化塩素溶液を用いて殺菌処理した後に、カルス化が誘導されて形成された、請求項１〜８のいずれか一項に記載のタキサン類の生産方法。
【請求項１０】
植物細胞または植物組織片を、二酸化塩素溶液を用いて殺菌処理する表面殺菌工程と、
前記表面殺菌工程後に、当該植物細胞または植物組織片をカルス誘導固体培地で培養し、カルス化を誘導することによりカルス細胞を形成する培養工程と、
を有することを特徴とするカルス誘導方法。
【請求項１１】
前記植物細胞または植物組織片が、イチイ属植物の植物細胞または植物組織片である、請求項１０に記載のカルス誘導方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１２−２１７４４１（Ｐ２０１２−２１７４４１Ａ）
【公開日】平成２４年１１月１２日（２０１２．１１．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−９００１８（Ｐ２０１１−９００１８）
【出願日】平成２３年４月１４日（２０１１．４．１４）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２２年度、独立行政法人科学技術振興機構、研究成果最適展開支援事業、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（３０１０５０９２４）株式会社ハウステック (234)
【出願人】（５０４１７１１３４）国立大学法人 筑波大学 (510)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１１月１２日（２０１２．１１．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年４月１４日（２０１１．４．１４）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２２年度、独立行政法人科学技術振興機構、研究成果最適展開支援事業、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（３０１０５０９２４）株式会社ハウステック (234)
【出願人】（５０４１７１１３４）国立大学法人 筑波大学 (510)
【Ｆターム（参考）】
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