タグ付け試薬およびＬＣ−ＭＳワークフローを用いた、アミノ酸およびアミン含有化合物の分析
複数の質量差タグ付け試薬を使用して、アミン含有化合物中のアミン官能基を標識する。標識された分析物は、逆相カラム上の明確な保持時間、及び明確な質量を有する。高エネルギー衝突下では、レポーター基を生成することができ、各レポーター基に対して検出された強度又はピーク面積を定量化に使用することができる。試薬の例示的な１セットは、それぞれ（１１３、１１７及び１２１）原子質量単位のレポーター基を有する、それぞれ（１４０）原子質量単位、（１４４）原子質量単位及び（１４８）原子質量単位のタグ付け重量を有する、３種類の質量差試薬からなる１セットを含む。質量差試薬の各々を含むパッケージも提供され、パッケージは、個別の容器、例えば、異なる試薬の各々に対する容器を含むことができる。パッケージは、それぞれ既知濃度のそれぞれ既知のアミン含有化合物を各々含む、１種類以上の標準物質を含むこともできる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は、２００９年１２月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／２８６，４９１号の優先権の利益を主張し、この米国仮特許出願の全体の内容は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
分野
本教示は、質量分析法及び質量分析法に有用であるタグ付け試薬の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
アミン含有化合物を分析する方法は公知であるが、アミン含有化合物の相対及び絶対的定量化方法を提供することが望ましい。以前の方法は、感度が低く、２Ｈ、１５Ｃ又は１５Ｎ同位体含有アミノ酸標準物質を必要とし、及び／又は別の同位体標識標準物質を必要とする。これらの欠点を克服する、アミン含有化合物を定量化する方法が必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
要旨
種々の実施形態によれば、本教示の方法は、アミン含有化合物のアミン官能基を標識する質量差、質量分析法（ＭＳ：ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）タグ付け試薬を利用する。標識された分析物は、逆相カラム上の明確な保持時間、及び明確な質量を有することができる。高エネルギー衝突下では、レポーター基が生成され得る。各レポーター基に対して検出された強度又はピーク面積を定量化に使用することができる。
【０００５】
本教示の種々の実施形態によって提供及び／又は使用することができる複数の例示的な質量差試薬を図１Ａ〜１Ｉに示す。本教示の種々の実施形態によるＭＳタグ付け試薬の例示的１セットは、例えば、タグ付け重量が１４０原子質量単位の第１の試薬、タグ付け重量が１４４原子質量単位の第２の試薬、及びタグ付け重量が１４８原子質量単位の第３の試薬を含む、３種類の質量差試薬からなる１セットを含む。これらのタグのＭＳ／ＭＳにおけるレポーターイオンは、それぞれ１１３、１１７及び１２１原子質量単位である。一部の実施形態においては、かかるセットは、ひとまとめにされた図１Ａ、１Ｅ及び１Ｉに示す試薬を含む。
【０００６】
一部の実施形態においては、異なる試薬の各々を含むパッケージが提供され、パッケージは、個別の容器、例えば、異なる試薬の各々に対する容器を含むことができる。例えば既知濃度の既知アミン含有化合物を各々含む、１種類以上の標準物質を提供することもできる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１Ａ〜１Ｉは、化学的に同一であるが、互いに質量が異なり、１セットのタグ付け試薬を形成するのに使用することができる、９種類の試薬を示す。
【図２】図２は、本教示の種々の実施形態による一般的タグ付け反応を示す反応スキームである。
【図３】図３は、本教示の種々の実施形態による２構成単位（ｔｗｏ−ｐｌｅｘ）アッセイにおける相対及び絶対的定量化に関係した種々のステップを示す模式的フローチャートである。
【図４】図４は、本教示の種々の実施形態による３構成単位（ｔｈｒｅｅ−ｐｌｅｘ）アッセイにおける相対及び絶対的定量化に関係した種々のステップを示す模式的フローチャートである。
【図５】図５は、本教示の種々の実施形態による血漿対照分析の精度及び確度を示す棒グラフである。
【図６】図６は、本教示の種々の実施形態による、乾燥スポット分析プロトコルによる血漿対照と比較した溶液中の血漿対照の比較を示す棒グラフである。
【図７】図７は、本教示の種々の実施形態による、１１５、１１７及び１２１試薬で標識され、次いで内部標準と一緒に混合された３個の同一対照血漿試料の各々の濃度を示す棒グラフである。
【図８】図８は、本教示の種々の実施形態による尿対照分析の精度及び確度を示す棒グラフである。
【図９】図９は、生体アミンのカダベリン、プトレシン、フェニルエチルアミン及びチラミンの量、及びそれらが温度上昇とともに増加して腐敗を示す仕方を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
詳細な説明
種々の実施形態によれば、本教示は、アミン含有化合物の定量化方法を提供する。この方法は、多種多様なアミン含有化合物の定量化に使用することができるが、本教示は、アミノ酸の定量化に関連して特に例示される。一部の実施形態においては、試薬及び方法は、２構成単位、３構成単位及び他の複数構成単位（ｍｕｌｔｉ−ｐｌｅｘ）アッセイにおける相対及び絶対的定量化に使用することができる。
【０００９】
種々の実施形態によれば、複数の質量分析法（ＭＳ）タグ付け試薬が、１種類以上のアミン含有化合物にタグをつけるために提供される。その複数は、セットとしてひとまとめにされても、別々にパッケージされても、又は種々の組合せでパッケージされてもよい。試薬は、ある化学構造と第１の質量を有する、第１のタグ付け試薬を含むことができる。この化学構造は、アミン含有化合物のアミン官能基の窒素原子に結合する反応性を有する部分を含むことができる。例示的な反応性部分は、カルボニル部分とのエステル結合（ｌｉｎｋａｇｅ）を含むことができる。アミノ含有化合物のアミン官能基の窒素原子は、タグの活性エステルと反応して、このタグとのアミド結合（ｌｉｎｋａｇｅ）を形成することができる。水素原子は、第一級又は第二級アミンの水素原子であり得る。この結合の形成（ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｌｉｎｋａｇｅ）は、ヒドロキシル化部分、例えばヒドロキシル化スクシンイミドを含む遊離部分又は脱離基の遊離をもたらし得る。
【００１０】
複数のＭＳタグ付け試薬は、第１のタグ付け試薬と同じ化学構造を有するが第１のタグ付け試薬とは異なる原子質量を有する、第２のタグ付け試薬も含む。第２のタグ付け試薬の質量は、第１のタグ付け試薬の質量とは１原子質量単位以上異なり得る。例示的一実施形態においては、第１のタグ付け試薬は、例えば、炭素原子、窒素原子、水素原子及び／又は酸素原子を含むことができるが、第２のタグ付け試薬においては、同じ炭素原子、窒素原子、水素原子又は酸素原子を２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ又は１８Ｏ同位体で置換することができる。上記化学構造が２個の炭素原子、水素原子及び／又は窒素原子、及び／又は少なくとも１個の酸素原子を含む場合、第２のタグ付け試薬は２個の２Ｈ、１３Ｃ若しくは１５Ｎ同位体又は１個の１８Ｏ同位体を含むことができ、したがって第１のタグ付け試薬の質量よりも２原子単位多い質量を有する。一部の実施形態においては、第１のタグ付け試薬は同位体を含むことができ、第２のタグ付け試薬は該同位体を含まないことができ、第１のタグ付け試薬は、複数のタグ付け試薬のうち最小質量を有する必要はない。一部の実施形態においては、複数の中の各タグ付け試薬は、少なくとも１個の同位体を含む。
【００１１】
複数のＭＳタグ付け試薬は、さらに、１個以上の追加のタグ付け試薬を含むことができ、各々は、第１及び第２のタグ付け試薬と同じ化学構造を有するが、第１のタグ付け試薬の質量及び第２のタグ付け試薬の質量とは１原子質量単位以上異なる質量を有する。例示的な複数のＭＳタグ付け試薬を図１Ａ〜１Ｉに示す。図１Ａ〜１Ｉは、９種類の異なるＭＳタグ付け試薬を示し、各々は、他と同じ化学構造を有するが、他とは異なる原子質量を有する。図１Ａに示す試薬のタグ付け質量は１４０原子質量単位（ａｍｕ）であり、図１Ｂ〜１Ｉに示す試薬のタグ付け質量は、各々１ａｍｕずつ大きくなり、図１Ｉに示す試薬のタグ付け質量は１４８ａｍｕである。図１Ａに示す試薬でタグをつけられた化合物のＭＳ／ＭＳ断片化で生成されるレポーターイオンの質量は１１３原子質量単位（ａｍｕ）であり、図１Ｂ〜１Ｉに示す試薬でタグをつけられた化合物のＭＳ／ＭＳ断片化で生成されるレポーターイオンの質量は各々１ａｍｕずつ大きくなり、図１Ｉに示す試薬から生成されるレポーターイオンのタグ付け質量は１２１ａｍｕである。図から分かるように、異なる重量は、異なる同位体の使用に起因すると考えられる。
【００１２】
種々の実施形態によれば、１種類以上のアミン含有化合物の定量化のためのキットが提供される。キットは、例えば個別の容器に各々貯蔵された、本明細書に記載の１種類以上の、質量が異なるタグ付け試薬を含むことができる。一部の実施形態においては、キットは、箱、覆い（ｅｎｖｅｌｏｐｅ）、バッグ又は他の外装容器を含むことができ、その中に、異なるタグ付け試薬用の貯蔵された個別容器を置くことができる。一部の実施形態においては、キットは、上記方法の実施に有用である緩衝剤及び種々の試薬を含むことができる。一部の実施形態においては、キットは、複数のＭＳタグ付け試薬を含むことができ、タグ付け試薬の各々は、他のタグ付け試薬の原子質量とは２原子質量単位以上異なる原子質量を有する。例として、タグ付け部分の質量がそれぞれ１４０、１４４及び１４８原子質量単位である、図１Ａに示す試薬、図１Ｅに示す試薬及び図１Ｉに示す試薬を含むキットを提供することができる。一部の実施形態においては、複数のタグ付け試薬は、各々が複数の中の他の試薬とは３原子質量単位以上、例えば４原子質量単位以上異なる質量を有する、２種類以上のタグ付け試薬を含むことができる。
【００１３】
図１Ａ〜１Ｉに示すように、複数のＭＳタグ付け試薬は、すべて同じ化学構造を有する、Ｎ−アルキルピペリゼン（ｐｉｐｅｒｉｚｅｎｅ）酢酸の異なる重量のスクシンイミドエステルを含むことができる。示した特定の実施形態においては、タグ付け試薬の各々は、Ｎ−メチルピペリゼン酢酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを含む。タグ付け部分の一例として、上記化学構造のＮ−メチルピペリゼンカルボニル部分は、アミン含有化合物と反応してアミン含有化合物にタグをつけるものである。この例示的タグ付け反応の一般的反応スキームは、種々の実施形態に従って、図２に示される。化学構造の残りは、アミン含有化合物のアミン部分から得られる水素と一緒に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド部分として遊離又は脱離する。タグ付け反応中に遊離する部分は、本明細書では遊離部分と称するものの一例である。アミノ含有化合物のアミン官能基の窒素原子は、タグの活性エステルと反応して、タグとのアミド結合を形成することができる。
【００１４】
本発明の種々の実施形態に従って使用することができる別の例示的なタグ付け試薬、タグ付け部分及び遊離部分としては、例えば、参照によりその全体を本明細書に援用する米国特許第７，１９５，７５１号Ｂ２に記載のものが挙げられる。
【００１５】
使用時、複数の中の第１のタグ付け試薬を、キット中のタグ付け試薬と一緒に含まれても含まれなくてもよい標準物質に接触させることができる。標準物質は、既知のアミン含有化合物、例えば、既知濃度の前もってタグをつけられたアミン含有化合物を含むことができる。接触は、第１のタグ付け試薬と標準物質の反応に有利な条件下で行うことができる。例えば、反応は、標準物質を上記エステルのカルボニルＮ−アルキルピペリゼン部分に結合させる化学反応を含むことができる。反応は、上記エステルのＮ−ヒドロキシスクシンイミド部分の遊離をもたらし得る。
【００１６】
さらに、使用時、複数の中の第２のタグ付け試薬を、未知濃度の同じアミン含有化合物を含む試料と接触させることができる。図３に関して以下に示すように、基準物質と試料とのタグを付けられたアミン含有化合物を混合し、分析して、試料中のアミン含有化合物の濃度を測定することができる。分析は、混合物を分離して、別々の分析物を形成する工程、及び別々の分析物を分析する工程を含むことができる。使用可能な分離方法としては、ガスクロマトグラフ法、液体クロマトグラフ法、ＨＰＬＣ法、他のクロマトグラフ法、電気泳動法、質量差分離法（ｍａｓｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）などが挙げられる。例示的一実施形態においては、液体クロマトグラフィーを使用して、混合物中の種々の分析物を分離し、これによって別々の分析物を形成する。一部の実施形態においては、クロマトグラフ分離は、逆相カラム上で前もって形成することができ、カラムから溶出するピークは後続の分析に供され得る。一部の実施形態においては、後続の分析は、質量分析法、またはより具体的にはＰａｒｅｎｔ Ｄａｕｇｈｔｅｒ Ｉｏｎ Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ（ＰＤＩＴＭ）を含むことができる。ＰＤＩＴＭの結果を比較することによって、図３及び４に関連して以下により詳細に記述されるように、試料中のアミン含有化合物の濃度を測定することができる。ＰＤＩＴＭのより詳細及びその使用は、参照によりその全体を本明細書に援用する米国特許出願公開第２００６／０１８３２３８号Ａ１に見出すことができる。
【００１７】
定量化の例示的一方法を図３に関連して示す。図３は、２構成単位アッセイの相対及び絶対的定量化を示す。図３に記載のように、方法は、既知濃度の既知アミノ酸を含む標準物質の標識化で始めることができる。標準物質は、図１Ａに示す構造を有する第１のタグ付け試薬で標識することができる。Ｎ−メチルピペリゼン部分は、１４０原子質量単位のタグ付け重量を与える。次に、試験試料は、標準物質を標識するのに使用された第１のタグ付け試薬と化学的に同一である第２のタグ付け試薬で標識されるが、第２のタグ付け試薬は異なる質量を有する。図３に示す例では、第２のタグ付け試薬は、図１Ｉに示す試薬を含み、アステリスクで示した位置に同位体１３Ｃ及び１５Ｎを含む。（同位体のない）図１Ａに示す１４０ａｍｕ質量の試薬と（８個の同位体を有する）図１Ｉに示す１４８ａｍｕタグ付け質量の試薬を比較して分かるように、図１Ｉの試薬のタグ付け質量が図１Ａの試薬のタグ付け質量よりも８原子質量単位大きい質量を有する理由を理解することができる。上述したように、図１Ａ〜１Ｉに示すタグ付け試薬のタグ付け質量はそれぞれ１４０から１４８ａｍｕである。
【００１８】
図３に示した方法の次のステップは、標識された標準物質と標識された試験試料を組み合わせて混合物を形成することを含む。続いて、混合物を、例えば逆相カラム上での、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）分離などの分離に供する。種々の実施形態においては、特に固有の質量を有する少数の対象分析物が存在する場合、混合物を質量分析計に直接注入することができる。標識された分析物、ここではタグをつけられた又は標識されたアミノ酸は、カラム上の異なる明確な保持時間のために、カラムから別々の時間で溶出する。逆相カラムから溶出したピークは、標識された分析物及び標識された標準物質を含むピークを含む。次に、カラムから溶出した各ピークをＰａｒｅｎｔ Ｄａｕｇｈｔｅｒ Ｉｏｎ Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ（ＰＤＩＴＭ）に供する。標識された試験試料から生成したレポーターシグナルのピーク面積の信号強度の、標識された標準物質から生成したそれに対する比は、試験試料中の分析物の相対濃度を与える。標識された標準物質の濃度が既知の時には、試料中の分析物の特定の濃度を求めることができる。
【００１９】
種々の実施形態によれば、既知濃度の複数の既知アミノ酸を有する標準物質が使用される、１種類以上のアミノ酸の絶対的定量化に使用することができる方法が提供される。一部の実施形態においては、複数の標準物質、すなわち試料中の試験しようとする複数の異なるアミノ酸の各々に対する標準物質を有するキット又はパッケージが提供される。
【００２０】
相対及び絶対的定量化の別の例示的一方法を図４に関連して示す。図４は、３構成単位アッセイの相対及び絶対的定量化を示す。図４に記載のように、方法は、既知濃度の既知アミノ酸を含む基準又は標準物質の標識化で始めることができる。標準物質は、図１Ａに示す構造を有する第１のタグ付け試薬で標識することができる。Ｎ−メチルピペリゼン部分は、１４０原子質量単位のタグ付け重量を与える。次に、試験しようとする２個のアミン含有試料を、標準物質の標識に使用した第１のタグ付け試薬と化学的に同一であるが、質量が異なる第２及び第３のタグ付け試薬でそれぞれ標識する。図４に示す例では、アミン試料１の標識に使用した第２のタグ付け試薬は、図１Ｉに示す試薬を含み、アステリスクで示した位置に同位体１３Ｃ及び１５Ｎを含む。（同位体のない）図１Ａに示す１４０ａｍｕタグ付け質量の試薬と（８個の同位体を有する）図１Ｉに示す１４８ａｍｕタグ付け質量の試薬を比較して分かるように、図１Ｉの試薬の質量が図１Ａの試薬よりも８原子質量単位大きい理由を理解することができる。アミン試料２の標識に使用した第３のタグ付け試薬は、図１Ｅに示す試薬を含み、アステリスクで示した位置に同位体１３Ｃ及び１５Ｎを含む。（同位体のない）図１Ａに示す１４０ａｍｕタグ付け質量の試薬と（４個の同位体を有する）図１Ｅに示す１４４ａｍｕタグ付け質量の試薬を比較して分かるように、図１Ｅの試薬の質量が図１Ａの試薬よりも４原子質量単位大きい理由を理解することができる。図４に示した方法の次のステップは、標識された標準物質と標識された試験試料を組み合わせて混合物を形成することを含む。続いて、混合物を、例えば逆相カラム上での、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）分離などの分離に供する。種々の実施形態においては、特に固有の質量を有する少数の対象分析物が存在する場合、混合物を質量分析計に直接注入することができる。標識された分析物、ここではタグをつけられた又は標識されたアミノ酸は、カラム上の異なる明確な保持時間のために、カラムから別々の時間で溶出する。逆相カラムから溶出したピークは、標識された分析物及び標識された標準物質を含むピークを含む。次に、カラムから溶出した各ピークをＰａｒｅｎｔ Ｄａｕｇｈｔｅｒ Ｉｏｎ Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ（ＰＤＩＴＭ）に供する。標識された試験試料から生成したレポーターシグナルのピーク面積の信号強度の、標識された標準物質から生成したそれに対する比は、試験試料中の分析物の相対濃度を与える。標識された標準物質の濃度が既知の時には、試料の各々における各分析物の特定の濃度を求めることができる。
【００２１】
本教示のタグ付けケミストリ及び方法は、公知の方法よりも感度を増加させ、２Ｈ含有、１３Ｃ含有、１５Ｎ含有又は１８Ｏ含有アミノ酸標準物質を必要としない。各分析物は、それ自体の内部標準を有することができる。レポーターシグナルは、標準試料及び試験試料に特異的とすることができる。標識された較正標準を試料に直接添加することによって、内因性分析物を含まないマトリックスを得る必要がなくなる。一部の実施形態においては、ＰＤＩＴＭの使用は特異性を増加させ、誤りのリスクを低下させる。試薬の設計は、それをＦｌａｓｈＱｕａｎｔ（商標）システム用の良好なツールにする。
【００２２】
一部の実施形態においては、タグ付けケミストリ及び方法は、任意の三連四重極機器又はＭＡＬＤＩ源を備える任意の機器、例えば、ＭＡＬＤＩ源を備えるＡＢ Ｓｃｉｅｘ ＴｒｉｐｌｅＴＯＦ（商標）５６００システム、５８００ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ／ＴＯＦ（商標）システム、４８００ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ／ＴＯＦ（商標）システム、４７００ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ／ＴＯＦ（商標）システム又はＦｌａｓｈＱｕａｎｔ（商標）システムを含めて、ただしそれだけに限定されない機器で実施することができる。試薬キット、データ解析ソフトウェア及びＭＳプラットホームは、アミノ酸分析の分析計システムとして一緒に使用することができる。方法は、同様に、他のアミン含有化合物にも使用することができる。
【００２３】
本教示の種々の実施形態に従って使用することができる種々の液体クロマトグラフィー及び質量分析法、システム並びにソフトウェアとしては、２００９年５月３１日に出願された米国仮特許出願第６１／１８２，７４８号、及び２００６年８月１７日に公開された米国特許出願公開第２００６／０１８３２３８号Ａ１に記載のものが挙げられる。これらの参考文献の両方を参照によりその全体を本明細書に援用する。
【００２４】
本教示は、以下の実施例に関連してより十分に理解されるであろう。以下の実施例は、本教示を説明するものであって、限定するものではない。
【実施例】
【００２５】
試料調製（試薬標識化プロトコル）
生理学的試料（血漿、血清、尿、脳脊髄液）の標識化
タンパク質の沈殿
生理学的試料４０μＬを管に移した。４０００ｐｍｏｌノルロイシンを含むスルホサリチル酸１０μＬを添加した。管をボルテックス撹拌して混合し、次いで１０，０００×ｇで２分間回転させた。上清１０μＬを清浄な管に移した。
【００２６】
標識化緩衝剤による希釈
８００ｐｍｏｌノルバリンを含む標識化緩衝剤４０μＬを１０μＬ一定分量の上清に上から添加した。管をボルテックス撹拌して混合し、次いで回転させた。上清１０μＬを清浄な管に移した。この試料を第１のタグ付け試薬で標識した（下記の試料の標識化の項を参照されたい。）。残りの上清を冷蔵した。
【００２７】
標識化試薬溶液を調製する
タグ付け試薬Δ８を含む各バイアルを室温で回転させて、溶液をバイアルの底部に移した。各管にすばやく蓋をした。イソプロパノール７０μＬを各々に添加した。各バイアルに日付をつけた。各バイアルをボルテックス撹拌して溶液を混合し、次いで回転させた。
【００２８】
試料の標識化
上記「標識化緩衝剤による希釈」の項の試料希釈上清に、タグ付け試薬Δ８溶液５μＬを添加した。未使用のタグ付け試薬Δ８溶液を−１５℃以下で貯蔵した。管をボルテックス撹拌して混合し、次いで回転させた。管を室温で少なくとも３０分間インキュベートした。次いで、ヒドロキシルアミン５μＬを添加し、管を再度ボルテックス撹拌し、回転させた。非標識アロイソロイシン分析の場合、上記「標識化緩衝剤による希釈」の希釈上清５μＬを添加した。アロイソロイシン分析に使用されるスルホサリチル酸試薬からの非標識内部標準ノルロイシンを試料とそれまでに混合した。試料を遠心減圧濃縮機中で１時間以下で完全に乾燥させた。乾燥させた標識試料を−１５℃以下で貯蔵した。
【００２９】
試料調製（試薬標識化プロトコル）
乾燥血斑試料の標識化
典型的な収集プロトコルに従って全血７５マイクロリットルをＷｈａｔｍａｎ＃９０３試料収集紙上に点在させることによって血液試料を調製した。乾燥血液ろ紙からの１／８インチ打ち抜き（全血当量３μＬ）。
【００３０】
タンパク質の沈殿
８０％アセトニトリル１８７．５μＬを管に添加し、それを３０分間振とうした。上清１００μＬを清浄な管に移し、乾燥させた。
【００３１】
標識化緩衝剤による溶解
１６０ｐｍｏｌノルバリンを含む標識化緩衝剤８μＬを乾燥上清に上から添加した。管をボルテックス撹拌して混合し、次いで回転させた。
【００３２】
標識化試薬溶液を調製する
タグ付け試薬Δ８を含む各バイアルを室温で回転させて、溶液をバイアルの底部に移した。各管にすばやく蓋をした。イソプロパノール７０μＬを各々に添加した。各バイアルに日付をつけた。各バイアルをボルテックス撹拌して溶液を混合し、次いで回転させた。
【００３３】
試料の標識化
上記「標識化緩衝剤による希釈」の項の試料希釈上清に、タグ付け試薬Δ８溶液５μＬを添加した。未使用のタグ付け試薬Δ８溶液を−１５℃以下で貯蔵した。管をボルテックス撹拌して混合し、次いで回転させた。管を室温で少なくとも３０分間インキュベートした。次いで、ヒドロキシルアミン５μＬを添加し、管を再度ボルテックス撹拌し、回転させた。非標識アロイソロイシン分析の場合、上記「標識化緩衝剤による希釈」の希釈上清５μＬを添加した。アロイソロイシン分析に使用されるスルホサリチル酸試薬からの非標識内部標準ノルロイシンを試料とそれまでに混合した。試料を遠心減圧濃縮機中で１時間以下で完全に乾燥させた。乾燥させた標識試料を−１５℃以下で貯蔵した。
【００３４】
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる標識アミノ酸の分析
内部標準溶液の調製
ＡＡ内部標準のバイアルを回転させて、凍結乾燥材料をバイアルの底部に移した。ＡＡ内部標準バイアルラベル上に指定された標準希釈剤量を見つけ（約１．８ｍＬ）、標準希釈剤１ｍＬをＡＡ内部標準バイアルに分注し、すべての材料が溶解するまでバイアルを３０から６０秒増分でボルテックス撹拌し、残りの標準希釈剤（約０．８ｍＬ）を添加し、ボルテックス撹拌して混合することによって、ＡＡ内部標準の１個のバイアルを再構成して、内部標準溶液を調製した。
【００３５】
内部標準溶液の添加
上記「試料の標識化」の項の乾燥試料に、ＡＡ内部標準溶液３２μＬを添加した。管をボルテックス撹拌して混合し、次いで回転させた。標識試料／内部標準混合物を、少量挿入口を備えた自動試料採取装置バイアルに移した。バイアル底部に閉じ込められた潜在的な空気を除去するために、バイアルを軽くたたき、又は回転させた。
【００３６】
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析
試料をＭＳシステム特有の取得方法によって流した。注入液各２μＬは、試料中のタグ付け試薬Δ８で標識されたアミノ酸、及びＡＡ内部標準の（５ピコモルシスチンを除く）各Δ０標識アミノ酸約１０ピコモルを含んだ。試料は、１０ピコモルのノルロイシン及びノルバリンも含んだ。ノルロイシンを沈殿ステップ中に試料に導入し、モニターして、沈殿からのアミノ酸の回収を追跡した。ノルバリンを標識化ステップ中に試料に導入し、モニターして、標識化反応の効率を調べた。
【００３７】
移動相調製
移動相Ａ
移動相Ａ各１リットルの場合、移動相調節剤Ａ１ｍＬを移動相調節剤Ｂ１００μＬ及びＭｉｌｌｉ−Ｑ水９９８．９ｍＬ又は当量のＨＰＬＣ等級の水と混合した。
【００３８】
移動相Ｂ
移動相Ｂ各５００ｍＬの場合、移動相調節剤Ａ０．５ｍＬを移動相調節剤Ｂ５０μＬ及びＨＰＬＣ等級メタノール４９９．５ｍＬと混合した。
【００３９】
ＨＰＬＣ装置及び条件
以下の装置、パラメータ及び条件を使用した。
【００４０】
Ａｇｉｌｅｎｔ１１００システム
バイナリポンプＧ１３１２Ａ
ウェル−プレート自動試料採取装置Ｇ１３６７Ａ
カラムオーブンＧ１３１６Ａ
マイクロ減圧脱気装置Ｇ１３７９Ｂ
Ａｇｉｌｅｎｔ１２００システム
バイナリポンプＧ１３１２Ａ
ウェル−プレート自動試料採取装置Ｇ１３６７Ｂ
カラムオーブンＧ１３１６Ａ
マイクロ減圧脱気装置Ｇ１３７９Ｂ
Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅシステム
システム制御装置ＣＢＭ−２０Ａ
（自動パージキット及びセミミクロ勾配ミキサーＳＵＳ−２０Ａを含む）２台のアイソクラティックポンプＬＣ−２０ＡＤ
オンライン脱気装置ＤＧＵ−２０Ａ３
自動試料採取装置ＳＩＬ−２０ＡＣ
カラムオーブンＣＴＯ−２０ＡＣ
分離カラム
ＡＡＡ Ｃ１８逆相カラム、５μＭ、１５０×４．６ｍｍ
ガードカラム
なし
移動相Ａ
水＋０．１％ギ酸＋０．０１％ヘプタフルオロ酪酸
移動相Ｂ
メタノール＋０．１％ギ酸＋０．０１％ヘプタフルオロ酪酸。
【００４１】
勾配プロファイル−Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ
【００４２】
【表１】
勾配−Ａｇｉｌｅｎｔ１１００及び１２００シリーズ
【００４３】
【表２】
流量：０．８ｍＬ／分
カラムオーブン温度：５０℃
注入体積：２μＬ
ＭＳ／ＭＳ検出
システムＡＰＩ３２００（商標）、ＡＰＩ４０００（商標）、３２００ＱＴＲＡＰ（登録商標）及び４０００ＱＴＲＡＰ（登録商標）ＬＣ／ＭＳ／ＭＳについてＭＳ／ＭＳ検出を最適化した。以下の条件を使用した。
【００４４】
ＴｕｒｂｏＩｏｎＳｐｒａｙ（登録商標）イオン源
正極性
スキャンタイプ：ＭＲＭ
分解能Ｑ１：単位
分解能Ｑ３：単位
イオン源／ガス及び化合物パラメータ
【００４５】
【表３】
ＭＲＭトランジション、保持時間及びＣＥ値
【００４６】
【表４−１】
【００４７】
【表４−２】
【００４８】
【表４−３】
（３２００ＱＴＲＡＰ（登録商標）システム上の）ａＴＲＡＱ（商標）キットを使用したダイナミックレンジ
【００４９】
【表５】
各アミノ酸測定の確度（ａｃｃｕｒａｃｙ）を０．０１μＭから１０，０００μＭまで計算した。ダイナミックレンジを設定した。確度はすべて８０％から１２０％の間であった。ダイナミックレンジは１μＭ以上〜１０，０００μＭ未満であった。
【００５０】
血漿対照分析の精度（ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）と確度
対照血漿試料の特徴を従来のニンヒドリンアミノ酸分析法によって調べて、基準範囲を決定した。ａＴＲＡＱ法は、平均確度１０３．２％、平均％ＣＶ２．９％をもたらした。最も不正確なアミノ酸（Ａｓｎ、Ｍｅｔ及びＴｒｐ）は、従来のアミノ酸分析において時折問題を引き起こし得るものである。得られたデータを図５に示す。データは、１０回の測定からのものである（各試料の２回の標識化と複数回の測定）。
【００５１】
乾燥スポット分析プロトコルによる血漿対照と比較した溶液中の血漿対照
対照血漿を使用して、Ｗｈａｔｍａｎ＃９０３試料収集紙上で乾燥された試料に使用される代わりの試料調製法を確認した（すなわち、小児血斑）。各点状試料（３μｌ）の打ち抜き１／８”円盤を、アミノ酸ごとの内部標準を有するａＴＲＡＱＴＭキットを使用して分析した。標準溶液法と代わりのスポット法を並行して実施した。得られたデータを図６に示す。このデータは、各々ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって３つ組で分析された３個の反復標識化調製物（ｒｅｐｌｉｃａｔｅ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）（３個の打ち抜き）を表す。図６は、各方法に対する各アミノ酸の濃度を示す。このデータは、分析の溶液法とスポット法の良好な相関を示す。
【００５２】
対照血漿の多重分析
３個の同一対照血漿試料を１１５、１１７及び１２１試薬で標識し、次いで１１３試薬で標識された内部標準と一緒に混合した。単一混合試料を分析し、各試料の濃度を測定した。結果を図７に示す。結果は、異なる試薬で標識された試料間の良好な一致を示す。
【００５３】
尿対照分析の精度と確度
尿対照試料は、アミノ酸が既知レベルまで加えられた（ｓｐｉｋｅｄ）尿マトリックスである。ａＴＲＡＱ法は、平均確度１０３．３％、平均％ＣＶ２．７％を与えた。得られたデータを図８に示す。データは、１０回の測定からのものである（各試料の２回の標識化と複数回の測定）。
【００５４】
培地試料中の生体アミン量
【００５５】
【表６】
上記表から分かるように、エタノールアミン、プトレシン及びスペルミンのＣＨＯ試料における理論値は、それぞれ１３．６、０．５４３及び１５．６ｍｇ／Ｌである。
【００５６】
サケ腐敗−異なる貯蔵条件における生体アミン濃度
サケの試料を異なる温度で３日間貯蔵し、次いでａＴＲＡＱＴＭ試薬で標識し、生体アミン量を測定した。結果を図９に示す。図から分かるように、生体アミンの一部（カダベリン、プトレシン、フェニルエチルアミン及びチラミン）の量は、温度上昇とともに増加し、腐敗を示す。
【００５７】
本明細書の考察、及び本明細書に開示する本教示の実施から、本教示の別の実施形態が当業者に明白になるであろう。本明細書及び実施例は、単なる例示とみなすべきものである。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【図１Ｆ】
【図１Ｇ】
【図１Ｈ】
【図１Ｉ】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は、２００９年１２月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／２８６，４９１号の優先権の利益を主張し、この米国仮特許出願の全体の内容は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
分野
本教示は、質量分析法及び質量分析法に有用であるタグ付け試薬の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
アミン含有化合物を分析する方法は公知であるが、アミン含有化合物の相対及び絶対的定量化方法を提供することが望ましい。以前の方法は、感度が低く、２Ｈ、１５Ｃ又は１５Ｎ同位体含有アミノ酸標準物質を必要とし、及び／又は別の同位体標識標準物質を必要とする。これらの欠点を克服する、アミン含有化合物を定量化する方法が必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
要旨
種々の実施形態によれば、本教示の方法は、アミン含有化合物のアミン官能基を標識する質量差、質量分析法（ＭＳ：ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）タグ付け試薬を利用する。標識された分析物は、逆相カラム上の明確な保持時間、及び明確な質量を有することができる。高エネルギー衝突下では、レポーター基が生成され得る。各レポーター基に対して検出された強度又はピーク面積を定量化に使用することができる。
【０００５】
本教示の種々の実施形態によって提供及び／又は使用することができる複数の例示的な質量差試薬を図１Ａ〜１Ｉに示す。本教示の種々の実施形態によるＭＳタグ付け試薬の例示的１セットは、例えば、タグ付け重量が１４０原子質量単位の第１の試薬、タグ付け重量が１４４原子質量単位の第２の試薬、及びタグ付け重量が１４８原子質量単位の第３の試薬を含む、３種類の質量差試薬からなる１セットを含む。これらのタグのＭＳ／ＭＳにおけるレポーターイオンは、それぞれ１１３、１１７及び１２１原子質量単位である。一部の実施形態においては、かかるセットは、ひとまとめにされた図１Ａ、１Ｅ及び１Ｉに示す試薬を含む。
【０００６】
一部の実施形態においては、異なる試薬の各々を含むパッケージが提供され、パッケージは、個別の容器、例えば、異なる試薬の各々に対する容器を含むことができる。例えば既知濃度の既知アミン含有化合物を各々含む、１種類以上の標準物質を提供することもできる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１Ａ〜１Ｉは、化学的に同一であるが、互いに質量が異なり、１セットのタグ付け試薬を形成するのに使用することができる、９種類の試薬を示す。
【図２】図２は、本教示の種々の実施形態による一般的タグ付け反応を示す反応スキームである。
【図３】図３は、本教示の種々の実施形態による２構成単位（ｔｗｏ−ｐｌｅｘ）アッセイにおける相対及び絶対的定量化に関係した種々のステップを示す模式的フローチャートである。
【図４】図４は、本教示の種々の実施形態による３構成単位（ｔｈｒｅｅ−ｐｌｅｘ）アッセイにおける相対及び絶対的定量化に関係した種々のステップを示す模式的フローチャートである。
【図５】図５は、本教示の種々の実施形態による血漿対照分析の精度及び確度を示す棒グラフである。
【図６】図６は、本教示の種々の実施形態による、乾燥スポット分析プロトコルによる血漿対照と比較した溶液中の血漿対照の比較を示す棒グラフである。
【図７】図７は、本教示の種々の実施形態による、１１５、１１７及び１２１試薬で標識され、次いで内部標準と一緒に混合された３個の同一対照血漿試料の各々の濃度を示す棒グラフである。
【図８】図８は、本教示の種々の実施形態による尿対照分析の精度及び確度を示す棒グラフである。
【図９】図９は、生体アミンのカダベリン、プトレシン、フェニルエチルアミン及びチラミンの量、及びそれらが温度上昇とともに増加して腐敗を示す仕方を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
詳細な説明
種々の実施形態によれば、本教示は、アミン含有化合物の定量化方法を提供する。この方法は、多種多様なアミン含有化合物の定量化に使用することができるが、本教示は、アミノ酸の定量化に関連して特に例示される。一部の実施形態においては、試薬及び方法は、２構成単位、３構成単位及び他の複数構成単位（ｍｕｌｔｉ−ｐｌｅｘ）アッセイにおける相対及び絶対的定量化に使用することができる。
【０００９】
種々の実施形態によれば、複数の質量分析法（ＭＳ）タグ付け試薬が、１種類以上のアミン含有化合物にタグをつけるために提供される。その複数は、セットとしてひとまとめにされても、別々にパッケージされても、又は種々の組合せでパッケージされてもよい。試薬は、ある化学構造と第１の質量を有する、第１のタグ付け試薬を含むことができる。この化学構造は、アミン含有化合物のアミン官能基の窒素原子に結合する反応性を有する部分を含むことができる。例示的な反応性部分は、カルボニル部分とのエステル結合（ｌｉｎｋａｇｅ）を含むことができる。アミノ含有化合物のアミン官能基の窒素原子は、タグの活性エステルと反応して、このタグとのアミド結合（ｌｉｎｋａｇｅ）を形成することができる。水素原子は、第一級又は第二級アミンの水素原子であり得る。この結合の形成（ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｌｉｎｋａｇｅ）は、ヒドロキシル化部分、例えばヒドロキシル化スクシンイミドを含む遊離部分又は脱離基の遊離をもたらし得る。
【００１０】
複数のＭＳタグ付け試薬は、第１のタグ付け試薬と同じ化学構造を有するが第１のタグ付け試薬とは異なる原子質量を有する、第２のタグ付け試薬も含む。第２のタグ付け試薬の質量は、第１のタグ付け試薬の質量とは１原子質量単位以上異なり得る。例示的一実施形態においては、第１のタグ付け試薬は、例えば、炭素原子、窒素原子、水素原子及び／又は酸素原子を含むことができるが、第２のタグ付け試薬においては、同じ炭素原子、窒素原子、水素原子又は酸素原子を２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ又は１８Ｏ同位体で置換することができる。上記化学構造が２個の炭素原子、水素原子及び／又は窒素原子、及び／又は少なくとも１個の酸素原子を含む場合、第２のタグ付け試薬は２個の２Ｈ、１３Ｃ若しくは１５Ｎ同位体又は１個の１８Ｏ同位体を含むことができ、したがって第１のタグ付け試薬の質量よりも２原子単位多い質量を有する。一部の実施形態においては、第１のタグ付け試薬は同位体を含むことができ、第２のタグ付け試薬は該同位体を含まないことができ、第１のタグ付け試薬は、複数のタグ付け試薬のうち最小質量を有する必要はない。一部の実施形態においては、複数の中の各タグ付け試薬は、少なくとも１個の同位体を含む。
【００１１】
複数のＭＳタグ付け試薬は、さらに、１個以上の追加のタグ付け試薬を含むことができ、各々は、第１及び第２のタグ付け試薬と同じ化学構造を有するが、第１のタグ付け試薬の質量及び第２のタグ付け試薬の質量とは１原子質量単位以上異なる質量を有する。例示的な複数のＭＳタグ付け試薬を図１Ａ〜１Ｉに示す。図１Ａ〜１Ｉは、９種類の異なるＭＳタグ付け試薬を示し、各々は、他と同じ化学構造を有するが、他とは異なる原子質量を有する。図１Ａに示す試薬のタグ付け質量は１４０原子質量単位（ａｍｕ）であり、図１Ｂ〜１Ｉに示す試薬のタグ付け質量は、各々１ａｍｕずつ大きくなり、図１Ｉに示す試薬のタグ付け質量は１４８ａｍｕである。図１Ａに示す試薬でタグをつけられた化合物のＭＳ／ＭＳ断片化で生成されるレポーターイオンの質量は１１３原子質量単位（ａｍｕ）であり、図１Ｂ〜１Ｉに示す試薬でタグをつけられた化合物のＭＳ／ＭＳ断片化で生成されるレポーターイオンの質量は各々１ａｍｕずつ大きくなり、図１Ｉに示す試薬から生成されるレポーターイオンのタグ付け質量は１２１ａｍｕである。図から分かるように、異なる重量は、異なる同位体の使用に起因すると考えられる。
【００１２】
種々の実施形態によれば、１種類以上のアミン含有化合物の定量化のためのキットが提供される。キットは、例えば個別の容器に各々貯蔵された、本明細書に記載の１種類以上の、質量が異なるタグ付け試薬を含むことができる。一部の実施形態においては、キットは、箱、覆い（ｅｎｖｅｌｏｐｅ）、バッグ又は他の外装容器を含むことができ、その中に、異なるタグ付け試薬用の貯蔵された個別容器を置くことができる。一部の実施形態においては、キットは、上記方法の実施に有用である緩衝剤及び種々の試薬を含むことができる。一部の実施形態においては、キットは、複数のＭＳタグ付け試薬を含むことができ、タグ付け試薬の各々は、他のタグ付け試薬の原子質量とは２原子質量単位以上異なる原子質量を有する。例として、タグ付け部分の質量がそれぞれ１４０、１４４及び１４８原子質量単位である、図１Ａに示す試薬、図１Ｅに示す試薬及び図１Ｉに示す試薬を含むキットを提供することができる。一部の実施形態においては、複数のタグ付け試薬は、各々が複数の中の他の試薬とは３原子質量単位以上、例えば４原子質量単位以上異なる質量を有する、２種類以上のタグ付け試薬を含むことができる。
【００１３】
図１Ａ〜１Ｉに示すように、複数のＭＳタグ付け試薬は、すべて同じ化学構造を有する、Ｎ−アルキルピペリゼン（ｐｉｐｅｒｉｚｅｎｅ）酢酸の異なる重量のスクシンイミドエステルを含むことができる。示した特定の実施形態においては、タグ付け試薬の各々は、Ｎ−メチルピペリゼン酢酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを含む。タグ付け部分の一例として、上記化学構造のＮ−メチルピペリゼンカルボニル部分は、アミン含有化合物と反応してアミン含有化合物にタグをつけるものである。この例示的タグ付け反応の一般的反応スキームは、種々の実施形態に従って、図２に示される。化学構造の残りは、アミン含有化合物のアミン部分から得られる水素と一緒に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド部分として遊離又は脱離する。タグ付け反応中に遊離する部分は、本明細書では遊離部分と称するものの一例である。アミノ含有化合物のアミン官能基の窒素原子は、タグの活性エステルと反応して、タグとのアミド結合を形成することができる。
【００１４】
本発明の種々の実施形態に従って使用することができる別の例示的なタグ付け試薬、タグ付け部分及び遊離部分としては、例えば、参照によりその全体を本明細書に援用する米国特許第７，１９５，７５１号Ｂ２に記載のものが挙げられる。
【００１５】
使用時、複数の中の第１のタグ付け試薬を、キット中のタグ付け試薬と一緒に含まれても含まれなくてもよい標準物質に接触させることができる。標準物質は、既知のアミン含有化合物、例えば、既知濃度の前もってタグをつけられたアミン含有化合物を含むことができる。接触は、第１のタグ付け試薬と標準物質の反応に有利な条件下で行うことができる。例えば、反応は、標準物質を上記エステルのカルボニルＮ−アルキルピペリゼン部分に結合させる化学反応を含むことができる。反応は、上記エステルのＮ−ヒドロキシスクシンイミド部分の遊離をもたらし得る。
【００１６】
さらに、使用時、複数の中の第２のタグ付け試薬を、未知濃度の同じアミン含有化合物を含む試料と接触させることができる。図３に関して以下に示すように、基準物質と試料とのタグを付けられたアミン含有化合物を混合し、分析して、試料中のアミン含有化合物の濃度を測定することができる。分析は、混合物を分離して、別々の分析物を形成する工程、及び別々の分析物を分析する工程を含むことができる。使用可能な分離方法としては、ガスクロマトグラフ法、液体クロマトグラフ法、ＨＰＬＣ法、他のクロマトグラフ法、電気泳動法、質量差分離法（ｍａｓｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）などが挙げられる。例示的一実施形態においては、液体クロマトグラフィーを使用して、混合物中の種々の分析物を分離し、これによって別々の分析物を形成する。一部の実施形態においては、クロマトグラフ分離は、逆相カラム上で前もって形成することができ、カラムから溶出するピークは後続の分析に供され得る。一部の実施形態においては、後続の分析は、質量分析法、またはより具体的にはＰａｒｅｎｔ Ｄａｕｇｈｔｅｒ Ｉｏｎ Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ（ＰＤＩＴＭ）を含むことができる。ＰＤＩＴＭの結果を比較することによって、図３及び４に関連して以下により詳細に記述されるように、試料中のアミン含有化合物の濃度を測定することができる。ＰＤＩＴＭのより詳細及びその使用は、参照によりその全体を本明細書に援用する米国特許出願公開第２００６／０１８３２３８号Ａ１に見出すことができる。
【００１７】
定量化の例示的一方法を図３に関連して示す。図３は、２構成単位アッセイの相対及び絶対的定量化を示す。図３に記載のように、方法は、既知濃度の既知アミノ酸を含む標準物質の標識化で始めることができる。標準物質は、図１Ａに示す構造を有する第１のタグ付け試薬で標識することができる。Ｎ−メチルピペリゼン部分は、１４０原子質量単位のタグ付け重量を与える。次に、試験試料は、標準物質を標識するのに使用された第１のタグ付け試薬と化学的に同一である第２のタグ付け試薬で標識されるが、第２のタグ付け試薬は異なる質量を有する。図３に示す例では、第２のタグ付け試薬は、図１Ｉに示す試薬を含み、アステリスクで示した位置に同位体１３Ｃ及び１５Ｎを含む。（同位体のない）図１Ａに示す１４０ａｍｕ質量の試薬と（８個の同位体を有する）図１Ｉに示す１４８ａｍｕタグ付け質量の試薬を比較して分かるように、図１Ｉの試薬のタグ付け質量が図１Ａの試薬のタグ付け質量よりも８原子質量単位大きい質量を有する理由を理解することができる。上述したように、図１Ａ〜１Ｉに示すタグ付け試薬のタグ付け質量はそれぞれ１４０から１４８ａｍｕである。
【００１８】
図３に示した方法の次のステップは、標識された標準物質と標識された試験試料を組み合わせて混合物を形成することを含む。続いて、混合物を、例えば逆相カラム上での、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）分離などの分離に供する。種々の実施形態においては、特に固有の質量を有する少数の対象分析物が存在する場合、混合物を質量分析計に直接注入することができる。標識された分析物、ここではタグをつけられた又は標識されたアミノ酸は、カラム上の異なる明確な保持時間のために、カラムから別々の時間で溶出する。逆相カラムから溶出したピークは、標識された分析物及び標識された標準物質を含むピークを含む。次に、カラムから溶出した各ピークをＰａｒｅｎｔ Ｄａｕｇｈｔｅｒ Ｉｏｎ Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ（ＰＤＩＴＭ）に供する。標識された試験試料から生成したレポーターシグナルのピーク面積の信号強度の、標識された標準物質から生成したそれに対する比は、試験試料中の分析物の相対濃度を与える。標識された標準物質の濃度が既知の時には、試料中の分析物の特定の濃度を求めることができる。
【００１９】
種々の実施形態によれば、既知濃度の複数の既知アミノ酸を有する標準物質が使用される、１種類以上のアミノ酸の絶対的定量化に使用することができる方法が提供される。一部の実施形態においては、複数の標準物質、すなわち試料中の試験しようとする複数の異なるアミノ酸の各々に対する標準物質を有するキット又はパッケージが提供される。
【００２０】
相対及び絶対的定量化の別の例示的一方法を図４に関連して示す。図４は、３構成単位アッセイの相対及び絶対的定量化を示す。図４に記載のように、方法は、既知濃度の既知アミノ酸を含む基準又は標準物質の標識化で始めることができる。標準物質は、図１Ａに示す構造を有する第１のタグ付け試薬で標識することができる。Ｎ−メチルピペリゼン部分は、１４０原子質量単位のタグ付け重量を与える。次に、試験しようとする２個のアミン含有試料を、標準物質の標識に使用した第１のタグ付け試薬と化学的に同一であるが、質量が異なる第２及び第３のタグ付け試薬でそれぞれ標識する。図４に示す例では、アミン試料１の標識に使用した第２のタグ付け試薬は、図１Ｉに示す試薬を含み、アステリスクで示した位置に同位体１３Ｃ及び１５Ｎを含む。（同位体のない）図１Ａに示す１４０ａｍｕタグ付け質量の試薬と（８個の同位体を有する）図１Ｉに示す１４８ａｍｕタグ付け質量の試薬を比較して分かるように、図１Ｉの試薬の質量が図１Ａの試薬よりも８原子質量単位大きい理由を理解することができる。アミン試料２の標識に使用した第３のタグ付け試薬は、図１Ｅに示す試薬を含み、アステリスクで示した位置に同位体１３Ｃ及び１５Ｎを含む。（同位体のない）図１Ａに示す１４０ａｍｕタグ付け質量の試薬と（４個の同位体を有する）図１Ｅに示す１４４ａｍｕタグ付け質量の試薬を比較して分かるように、図１Ｅの試薬の質量が図１Ａの試薬よりも４原子質量単位大きい理由を理解することができる。図４に示した方法の次のステップは、標識された標準物質と標識された試験試料を組み合わせて混合物を形成することを含む。続いて、混合物を、例えば逆相カラム上での、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）分離などの分離に供する。種々の実施形態においては、特に固有の質量を有する少数の対象分析物が存在する場合、混合物を質量分析計に直接注入することができる。標識された分析物、ここではタグをつけられた又は標識されたアミノ酸は、カラム上の異なる明確な保持時間のために、カラムから別々の時間で溶出する。逆相カラムから溶出したピークは、標識された分析物及び標識された標準物質を含むピークを含む。次に、カラムから溶出した各ピークをＰａｒｅｎｔ Ｄａｕｇｈｔｅｒ Ｉｏｎ Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ（ＰＤＩＴＭ）に供する。標識された試験試料から生成したレポーターシグナルのピーク面積の信号強度の、標識された標準物質から生成したそれに対する比は、試験試料中の分析物の相対濃度を与える。標識された標準物質の濃度が既知の時には、試料の各々における各分析物の特定の濃度を求めることができる。
【００２１】
本教示のタグ付けケミストリ及び方法は、公知の方法よりも感度を増加させ、２Ｈ含有、１３Ｃ含有、１５Ｎ含有又は１８Ｏ含有アミノ酸標準物質を必要としない。各分析物は、それ自体の内部標準を有することができる。レポーターシグナルは、標準試料及び試験試料に特異的とすることができる。標識された較正標準を試料に直接添加することによって、内因性分析物を含まないマトリックスを得る必要がなくなる。一部の実施形態においては、ＰＤＩＴＭの使用は特異性を増加させ、誤りのリスクを低下させる。試薬の設計は、それをＦｌａｓｈＱｕａｎｔ（商標）システム用の良好なツールにする。
【００２２】
一部の実施形態においては、タグ付けケミストリ及び方法は、任意の三連四重極機器又はＭＡＬＤＩ源を備える任意の機器、例えば、ＭＡＬＤＩ源を備えるＡＢ Ｓｃｉｅｘ ＴｒｉｐｌｅＴＯＦ（商標）５６００システム、５８００ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ／ＴＯＦ（商標）システム、４８００ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ／ＴＯＦ（商標）システム、４７００ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ／ＴＯＦ（商標）システム又はＦｌａｓｈＱｕａｎｔ（商標）システムを含めて、ただしそれだけに限定されない機器で実施することができる。試薬キット、データ解析ソフトウェア及びＭＳプラットホームは、アミノ酸分析の分析計システムとして一緒に使用することができる。方法は、同様に、他のアミン含有化合物にも使用することができる。
【００２３】
本教示の種々の実施形態に従って使用することができる種々の液体クロマトグラフィー及び質量分析法、システム並びにソフトウェアとしては、２００９年５月３１日に出願された米国仮特許出願第６１／１８２，７４８号、及び２００６年８月１７日に公開された米国特許出願公開第２００６／０１８３２３８号Ａ１に記載のものが挙げられる。これらの参考文献の両方を参照によりその全体を本明細書に援用する。
【００２４】
本教示は、以下の実施例に関連してより十分に理解されるであろう。以下の実施例は、本教示を説明するものであって、限定するものではない。
【実施例】
【００２５】
試料調製（試薬標識化プロトコル）
生理学的試料（血漿、血清、尿、脳脊髄液）の標識化
タンパク質の沈殿
生理学的試料４０μＬを管に移した。４０００ｐｍｏｌノルロイシンを含むスルホサリチル酸１０μＬを添加した。管をボルテックス撹拌して混合し、次いで１０，０００×ｇで２分間回転させた。上清１０μＬを清浄な管に移した。
【００２６】
標識化緩衝剤による希釈
８００ｐｍｏｌノルバリンを含む標識化緩衝剤４０μＬを１０μＬ一定分量の上清に上から添加した。管をボルテックス撹拌して混合し、次いで回転させた。上清１０μＬを清浄な管に移した。この試料を第１のタグ付け試薬で標識した（下記の試料の標識化の項を参照されたい。）。残りの上清を冷蔵した。
【００２７】
標識化試薬溶液を調製する
タグ付け試薬Δ８を含む各バイアルを室温で回転させて、溶液をバイアルの底部に移した。各管にすばやく蓋をした。イソプロパノール７０μＬを各々に添加した。各バイアルに日付をつけた。各バイアルをボルテックス撹拌して溶液を混合し、次いで回転させた。
【００２８】
試料の標識化
上記「標識化緩衝剤による希釈」の項の試料希釈上清に、タグ付け試薬Δ８溶液５μＬを添加した。未使用のタグ付け試薬Δ８溶液を−１５℃以下で貯蔵した。管をボルテックス撹拌して混合し、次いで回転させた。管を室温で少なくとも３０分間インキュベートした。次いで、ヒドロキシルアミン５μＬを添加し、管を再度ボルテックス撹拌し、回転させた。非標識アロイソロイシン分析の場合、上記「標識化緩衝剤による希釈」の希釈上清５μＬを添加した。アロイソロイシン分析に使用されるスルホサリチル酸試薬からの非標識内部標準ノルロイシンを試料とそれまでに混合した。試料を遠心減圧濃縮機中で１時間以下で完全に乾燥させた。乾燥させた標識試料を−１５℃以下で貯蔵した。
【００２９】
試料調製（試薬標識化プロトコル）
乾燥血斑試料の標識化
典型的な収集プロトコルに従って全血７５マイクロリットルをＷｈａｔｍａｎ＃９０３試料収集紙上に点在させることによって血液試料を調製した。乾燥血液ろ紙からの１／８インチ打ち抜き（全血当量３μＬ）。
【００３０】
タンパク質の沈殿
８０％アセトニトリル１８７．５μＬを管に添加し、それを３０分間振とうした。上清１００μＬを清浄な管に移し、乾燥させた。
【００３１】
標識化緩衝剤による溶解
１６０ｐｍｏｌノルバリンを含む標識化緩衝剤８μＬを乾燥上清に上から添加した。管をボルテックス撹拌して混合し、次いで回転させた。
【００３２】
標識化試薬溶液を調製する
タグ付け試薬Δ８を含む各バイアルを室温で回転させて、溶液をバイアルの底部に移した。各管にすばやく蓋をした。イソプロパノール７０μＬを各々に添加した。各バイアルに日付をつけた。各バイアルをボルテックス撹拌して溶液を混合し、次いで回転させた。
【００３３】
試料の標識化
上記「標識化緩衝剤による希釈」の項の試料希釈上清に、タグ付け試薬Δ８溶液５μＬを添加した。未使用のタグ付け試薬Δ８溶液を−１５℃以下で貯蔵した。管をボルテックス撹拌して混合し、次いで回転させた。管を室温で少なくとも３０分間インキュベートした。次いで、ヒドロキシルアミン５μＬを添加し、管を再度ボルテックス撹拌し、回転させた。非標識アロイソロイシン分析の場合、上記「標識化緩衝剤による希釈」の希釈上清５μＬを添加した。アロイソロイシン分析に使用されるスルホサリチル酸試薬からの非標識内部標準ノルロイシンを試料とそれまでに混合した。試料を遠心減圧濃縮機中で１時間以下で完全に乾燥させた。乾燥させた標識試料を−１５℃以下で貯蔵した。
【００３４】
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる標識アミノ酸の分析
内部標準溶液の調製
ＡＡ内部標準のバイアルを回転させて、凍結乾燥材料をバイアルの底部に移した。ＡＡ内部標準バイアルラベル上に指定された標準希釈剤量を見つけ（約１．８ｍＬ）、標準希釈剤１ｍＬをＡＡ内部標準バイアルに分注し、すべての材料が溶解するまでバイアルを３０から６０秒増分でボルテックス撹拌し、残りの標準希釈剤（約０．８ｍＬ）を添加し、ボルテックス撹拌して混合することによって、ＡＡ内部標準の１個のバイアルを再構成して、内部標準溶液を調製した。
【００３５】
内部標準溶液の添加
上記「試料の標識化」の項の乾燥試料に、ＡＡ内部標準溶液３２μＬを添加した。管をボルテックス撹拌して混合し、次いで回転させた。標識試料／内部標準混合物を、少量挿入口を備えた自動試料採取装置バイアルに移した。バイアル底部に閉じ込められた潜在的な空気を除去するために、バイアルを軽くたたき、又は回転させた。
【００３６】
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析
試料をＭＳシステム特有の取得方法によって流した。注入液各２μＬは、試料中のタグ付け試薬Δ８で標識されたアミノ酸、及びＡＡ内部標準の（５ピコモルシスチンを除く）各Δ０標識アミノ酸約１０ピコモルを含んだ。試料は、１０ピコモルのノルロイシン及びノルバリンも含んだ。ノルロイシンを沈殿ステップ中に試料に導入し、モニターして、沈殿からのアミノ酸の回収を追跡した。ノルバリンを標識化ステップ中に試料に導入し、モニターして、標識化反応の効率を調べた。
【００３７】
移動相調製
移動相Ａ
移動相Ａ各１リットルの場合、移動相調節剤Ａ１ｍＬを移動相調節剤Ｂ１００μＬ及びＭｉｌｌｉ−Ｑ水９９８．９ｍＬ又は当量のＨＰＬＣ等級の水と混合した。
【００３８】
移動相Ｂ
移動相Ｂ各５００ｍＬの場合、移動相調節剤Ａ０．５ｍＬを移動相調節剤Ｂ５０μＬ及びＨＰＬＣ等級メタノール４９９．５ｍＬと混合した。
【００３９】
ＨＰＬＣ装置及び条件
以下の装置、パラメータ及び条件を使用した。
【００４０】
Ａｇｉｌｅｎｔ１１００システム
バイナリポンプＧ１３１２Ａ
ウェル−プレート自動試料採取装置Ｇ１３６７Ａ
カラムオーブンＧ１３１６Ａ
マイクロ減圧脱気装置Ｇ１３７９Ｂ
Ａｇｉｌｅｎｔ１２００システム
バイナリポンプＧ１３１２Ａ
ウェル−プレート自動試料採取装置Ｇ１３６７Ｂ
カラムオーブンＧ１３１６Ａ
マイクロ減圧脱気装置Ｇ１３７９Ｂ
Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅシステム
システム制御装置ＣＢＭ−２０Ａ
（自動パージキット及びセミミクロ勾配ミキサーＳＵＳ−２０Ａを含む）２台のアイソクラティックポンプＬＣ−２０ＡＤ
オンライン脱気装置ＤＧＵ−２０Ａ３
自動試料採取装置ＳＩＬ−２０ＡＣ
カラムオーブンＣＴＯ−２０ＡＣ
分離カラム
ＡＡＡ Ｃ１８逆相カラム、５μＭ、１５０×４．６ｍｍ
ガードカラム
なし
移動相Ａ
水＋０．１％ギ酸＋０．０１％ヘプタフルオロ酪酸
移動相Ｂ
メタノール＋０．１％ギ酸＋０．０１％ヘプタフルオロ酪酸。
【００４１】
勾配プロファイル−Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ
【００４２】
【表１】
勾配−Ａｇｉｌｅｎｔ１１００及び１２００シリーズ
【００４３】
【表２】
流量：０．８ｍＬ／分
カラムオーブン温度：５０℃
注入体積：２μＬ
ＭＳ／ＭＳ検出
システムＡＰＩ３２００（商標）、ＡＰＩ４０００（商標）、３２００ＱＴＲＡＰ（登録商標）及び４０００ＱＴＲＡＰ（登録商標）ＬＣ／ＭＳ／ＭＳについてＭＳ／ＭＳ検出を最適化した。以下の条件を使用した。
【００４４】
ＴｕｒｂｏＩｏｎＳｐｒａｙ（登録商標）イオン源
正極性
スキャンタイプ：ＭＲＭ
分解能Ｑ１：単位
分解能Ｑ３：単位
イオン源／ガス及び化合物パラメータ
【００４５】
【表３】
ＭＲＭトランジション、保持時間及びＣＥ値
【００４６】
【表４−１】
【００４７】
【表４−２】
【００４８】
【表４−３】
（３２００ＱＴＲＡＰ（登録商標）システム上の）ａＴＲＡＱ（商標）キットを使用したダイナミックレンジ
【００４９】
【表５】
各アミノ酸測定の確度（ａｃｃｕｒａｃｙ）を０．０１μＭから１０，０００μＭまで計算した。ダイナミックレンジを設定した。確度はすべて８０％から１２０％の間であった。ダイナミックレンジは１μＭ以上〜１０，０００μＭ未満であった。
【００５０】
血漿対照分析の精度（ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）と確度
対照血漿試料の特徴を従来のニンヒドリンアミノ酸分析法によって調べて、基準範囲を決定した。ａＴＲＡＱ法は、平均確度１０３．２％、平均％ＣＶ２．９％をもたらした。最も不正確なアミノ酸（Ａｓｎ、Ｍｅｔ及びＴｒｐ）は、従来のアミノ酸分析において時折問題を引き起こし得るものである。得られたデータを図５に示す。データは、１０回の測定からのものである（各試料の２回の標識化と複数回の測定）。
【００５１】
乾燥スポット分析プロトコルによる血漿対照と比較した溶液中の血漿対照
対照血漿を使用して、Ｗｈａｔｍａｎ＃９０３試料収集紙上で乾燥された試料に使用される代わりの試料調製法を確認した（すなわち、小児血斑）。各点状試料（３μｌ）の打ち抜き１／８”円盤を、アミノ酸ごとの内部標準を有するａＴＲＡＱＴＭキットを使用して分析した。標準溶液法と代わりのスポット法を並行して実施した。得られたデータを図６に示す。このデータは、各々ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって３つ組で分析された３個の反復標識化調製物（ｒｅｐｌｉｃａｔｅ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）（３個の打ち抜き）を表す。図６は、各方法に対する各アミノ酸の濃度を示す。このデータは、分析の溶液法とスポット法の良好な相関を示す。
【００５２】
対照血漿の多重分析
３個の同一対照血漿試料を１１５、１１７及び１２１試薬で標識し、次いで１１３試薬で標識された内部標準と一緒に混合した。単一混合試料を分析し、各試料の濃度を測定した。結果を図７に示す。結果は、異なる試薬で標識された試料間の良好な一致を示す。
【００５３】
尿対照分析の精度と確度
尿対照試料は、アミノ酸が既知レベルまで加えられた（ｓｐｉｋｅｄ）尿マトリックスである。ａＴＲＡＱ法は、平均確度１０３．３％、平均％ＣＶ２．７％を与えた。得られたデータを図８に示す。データは、１０回の測定からのものである（各試料の２回の標識化と複数回の測定）。
【００５４】
培地試料中の生体アミン量
【００５５】
【表６】
上記表から分かるように、エタノールアミン、プトレシン及びスペルミンのＣＨＯ試料における理論値は、それぞれ１３．６、０．５４３及び１５．６ｍｇ／Ｌである。
【００５６】
サケ腐敗−異なる貯蔵条件における生体アミン濃度
サケの試料を異なる温度で３日間貯蔵し、次いでａＴＲＡＱＴＭ試薬で標識し、生体アミン量を測定した。結果を図９に示す。図から分かるように、生体アミンの一部（カダベリン、プトレシン、フェニルエチルアミン及びチラミン）の量は、温度上昇とともに増加し、腐敗を示す。
【００５７】
本明細書の考察、及び本明細書に開示する本教示の実施から、本教示の別の実施形態が当業者に明白になるであろう。本明細書及び実施例は、単なる例示とみなすべきものである。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【図１Ｆ】
【図１Ｇ】
【図１Ｈ】
【図１Ｉ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１種類以上のアミン含有化合物にタグを付けるための複数の質量分析法（ＭＳ）タグ付け試薬であって、前記複数のＭＳタグ付け試薬が、
ある化学構造と第１の質量を有し、前記化学構造がアミン含有化合物のアミン官能基の窒素原子に結合する反応性を有する部分を含む、第１のタグ付け試薬と、
前記第１のタグ付け試薬と同じ化学構造を有し、前記第１の質量とは１原子質量単位以上異なる第２の質量を有する、第２のタグ付け試薬と
を含む、複数の質量分析法（ＭＳ）タグ付け試薬。
【請求項２】
前記第１のタグ付け試薬と同じ化学構造を有し、前記第１の質量及び前記第２の質量とは１原子質量単位以上異なる第３の質量を有する、少なくとも第３のタグ付け試薬をさらに含む、請求項１に記載の複数のＭＳタグ付け試薬。
【請求項３】
前記第１のタグ付け試薬が第１の容器内に配置され、前記第２のタグ付け試薬が前記第１の容器とは分離した第２の容器内に配置され、前記第１の容器と前記第２の容器の両方が第３の容器内に配置される、請求項１に記載の複数のＭＳタグ付け試薬。
【請求項４】
前記第２の質量が前記第１の質量とは２原子質量単位以上異なる、請求項１に記載の複数のＭＳタグ付け試薬。
【請求項５】
前記第２の質量が前記第１の質量とは３原子質量単位以上異なり、前記第３の質量が前記第２の質量とは３原子質量単位以上異なる、請求項１に記載の複数のＭＳタグ付け試薬。
【請求項６】
前記第１のタグ付け試薬が、既知濃度のアミン含有化合物を含む標準物質と接触しており、前記第２のタグ付け試薬が、未知濃度の前記アミン含有化合物を含む試料と接触している、請求項１に記載の複数のＭＳタグ付け試薬。
【請求項７】
前記第１のタグ付け試薬が、Ｎ−アルキルピペリゼン酢酸のスクシンイミドエステルを含む、請求項１に記載の複数のＭＳタグ付け試薬。
【請求項８】
Ｎ−アルキルピペリゼン酢酸の前記スクシンイミドエステルが、Ｎ−メチルピペリゼン酢酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを含む、請求項７に記載の複数のＭＳタグ付け試薬。
【請求項９】
前記第２のタグ付け試薬が、１３Ｃ同位体である少なくとも１個の炭素原子を含む、請求項７に記載の複数のＭＳタグ付け試薬。
【請求項１０】
前記第２のタグ付け試薬が、１５Ｎ同位体である少なくとも１個の窒素原子を含む、請求項７に記載の複数のＭＳタグ付け試薬。
【請求項１１】
前記第２のタグ付け試薬が、１８Ｏ同位体である少なくとも１個の酸素原子を含む、請求項７に記載の複数のＭＳタグ付け試薬。
【請求項１２】
前記第２のタグ付け試薬が、２Ｈ同位体である少なくとも１個の水素原子を含む、請求項７に記載の複数のＭＳタグ付け試薬。
【請求項１３】
既知の構造を有するアミン含有化合物を含む標準物質を第１の質量分析法（ＭＳ）タグ付け試薬と接触させる工程であって、前記第１のＭＳタグ付け試薬はある化学構造と第１の質量を有し、前記化学構造はアミン含有化合物のアミン官能基の窒素原子に結合する反応性を有する部分を含む、工程、
前記アミン含有化合物を含む試料を第２のＭＳタグ付け試薬と接触させる工程であって、前記第２のＭＳタグ付け試薬は前記第１のＭＳタグ付け試薬と同じ化学構造を有し、前記第１の質量とは１原子質量単位以上異なる第２の質量を有する、工程
を含む、方法。
【請求項１４】
前記標準物質が既知濃度の前記アミン含有化合物を含み、前記試料が未知濃度の前記アミン含有化合物を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１のＭＳタグ付け試薬と接触した前記標準物質、又はその反応生成物と、前記第２のＭＳタグ付け試薬と接触した前記試料、又はその反応生成物とを混合して、混合物を形成する工程をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記混合物を液体クロマトグラフィー（ＬＣ）分離に供して、分離された分析物を形成する工程をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記分離された分析物を溶出させて溶出ピークを形成する工程、及び前記溶出ピークを質量分析に供する工程をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記分離された分析物を溶出させて溶出ピークを形成する工程、及び前記溶出ピークを親娘イオン遷移モニタリング（ＰＤＩＴＭ）に供する工程をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＰＤＩＴＭからの結果を比較する工程、及び前記比較に基づいて前記試料中の前記アミン含有化合物の濃度を決定する工程をさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記混合物を２構成単位アッセイに供する工程をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記混合物を複数構成単位アッセイに供する工程をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１３に記載の方法であって、前記化学構造がタグ付け部分と遊離部分とを含み、前記化学構造が前記タグ付け部分と前記遊離部分との間の結合を含み、
前記方法が、前記結合において、前記タグ付け部分を前記アミン含有化合物の窒素原子に結合させる工程、及び前記遊離部分を遊離させる工程をさらに含む、方法。
【請求項２３】
前記混合物を質量分析計に直接注入する工程をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１】
１種類以上のアミン含有化合物にタグを付けるための複数の質量分析法（ＭＳ）タグ付け試薬であって、前記複数のＭＳタグ付け試薬が、
ある化学構造と第１の質量を有し、前記化学構造がアミン含有化合物のアミン官能基の窒素原子に結合する反応性を有する部分を含む、第１のタグ付け試薬と、
前記第１のタグ付け試薬と同じ化学構造を有し、前記第１の質量とは１原子質量単位以上異なる第２の質量を有する、第２のタグ付け試薬と
を含む、複数の質量分析法（ＭＳ）タグ付け試薬。
【請求項２】
前記第１のタグ付け試薬と同じ化学構造を有し、前記第１の質量及び前記第２の質量とは１原子質量単位以上異なる第３の質量を有する、少なくとも第３のタグ付け試薬をさらに含む、請求項１に記載の複数のＭＳタグ付け試薬。
【請求項３】
前記第１のタグ付け試薬が第１の容器内に配置され、前記第２のタグ付け試薬が前記第１の容器とは分離した第２の容器内に配置され、前記第１の容器と前記第２の容器の両方が第３の容器内に配置される、請求項１に記載の複数のＭＳタグ付け試薬。
【請求項４】
前記第２の質量が前記第１の質量とは２原子質量単位以上異なる、請求項１に記載の複数のＭＳタグ付け試薬。
【請求項５】
前記第２の質量が前記第１の質量とは３原子質量単位以上異なり、前記第３の質量が前記第２の質量とは３原子質量単位以上異なる、請求項１に記載の複数のＭＳタグ付け試薬。
【請求項６】
前記第１のタグ付け試薬が、既知濃度のアミン含有化合物を含む標準物質と接触しており、前記第２のタグ付け試薬が、未知濃度の前記アミン含有化合物を含む試料と接触している、請求項１に記載の複数のＭＳタグ付け試薬。
【請求項７】
前記第１のタグ付け試薬が、Ｎ−アルキルピペリゼン酢酸のスクシンイミドエステルを含む、請求項１に記載の複数のＭＳタグ付け試薬。
【請求項８】
Ｎ−アルキルピペリゼン酢酸の前記スクシンイミドエステルが、Ｎ−メチルピペリゼン酢酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを含む、請求項７に記載の複数のＭＳタグ付け試薬。
【請求項９】
前記第２のタグ付け試薬が、１３Ｃ同位体である少なくとも１個の炭素原子を含む、請求項７に記載の複数のＭＳタグ付け試薬。
【請求項１０】
前記第２のタグ付け試薬が、１５Ｎ同位体である少なくとも１個の窒素原子を含む、請求項７に記載の複数のＭＳタグ付け試薬。
【請求項１１】
前記第２のタグ付け試薬が、１８Ｏ同位体である少なくとも１個の酸素原子を含む、請求項７に記載の複数のＭＳタグ付け試薬。
【請求項１２】
前記第２のタグ付け試薬が、２Ｈ同位体である少なくとも１個の水素原子を含む、請求項７に記載の複数のＭＳタグ付け試薬。
【請求項１３】
既知の構造を有するアミン含有化合物を含む標準物質を第１の質量分析法（ＭＳ）タグ付け試薬と接触させる工程であって、前記第１のＭＳタグ付け試薬はある化学構造と第１の質量を有し、前記化学構造はアミン含有化合物のアミン官能基の窒素原子に結合する反応性を有する部分を含む、工程、
前記アミン含有化合物を含む試料を第２のＭＳタグ付け試薬と接触させる工程であって、前記第２のＭＳタグ付け試薬は前記第１のＭＳタグ付け試薬と同じ化学構造を有し、前記第１の質量とは１原子質量単位以上異なる第２の質量を有する、工程
を含む、方法。
【請求項１４】
前記標準物質が既知濃度の前記アミン含有化合物を含み、前記試料が未知濃度の前記アミン含有化合物を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１のＭＳタグ付け試薬と接触した前記標準物質、又はその反応生成物と、前記第２のＭＳタグ付け試薬と接触した前記試料、又はその反応生成物とを混合して、混合物を形成する工程をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記混合物を液体クロマトグラフィー（ＬＣ）分離に供して、分離された分析物を形成する工程をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記分離された分析物を溶出させて溶出ピークを形成する工程、及び前記溶出ピークを質量分析に供する工程をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記分離された分析物を溶出させて溶出ピークを形成する工程、及び前記溶出ピークを親娘イオン遷移モニタリング（ＰＤＩＴＭ）に供する工程をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＰＤＩＴＭからの結果を比較する工程、及び前記比較に基づいて前記試料中の前記アミン含有化合物の濃度を決定する工程をさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記混合物を２構成単位アッセイに供する工程をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記混合物を複数構成単位アッセイに供する工程をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１３に記載の方法であって、前記化学構造がタグ付け部分と遊離部分とを含み、前記化学構造が前記タグ付け部分と前記遊離部分との間の結合を含み、
前記方法が、前記結合において、前記タグ付け部分を前記アミン含有化合物の窒素原子に結合させる工程、及び前記遊離部分を遊離させる工程をさらに含む、方法。
【請求項２３】
前記混合物を質量分析計に直接注入する工程をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２０１３−５１４５３７（Ｐ２０１３−５１４５３７Ａ）
【公表日】平成２５年４月２５日（２０１３．４．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５４４７５８（Ｐ２０１２−５４４７５８）
【出願日】平成２２年１２月１５日（２０１０．１２．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０６０５３９
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０７５５３０
【国際公開日】平成２３年６月２３日（２０１１．６．２３）
【出願人】（５１００７５４５７）ディーエイチ テクノロジーズ デベロップメント プライベート リミテッド (35)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年４月２５日（２０１３．４．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月１５日（２０１０．１２．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０６０５３９
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０７５５３０
【国際公開日】平成２３年６月２３日（２０１１．６．２３）
【出願人】（５１００７５４５７）ディーエイチ テクノロジーズ デベロップメント プライベート リミテッド (35)
【Ｆターム（参考）】
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