タバコ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）からのチトクロムｐ４５０遺伝子のクローニング
【課題】タバコ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）におけるｐ４５０酵素およびｐ４５０酵素をコードする核酸配列、並びにこれらの酵素および核酸配列を用いて、植物表現型を改変する方法を提供する。
【解決手段】トランスジェニック植物を産生する方法であって、前記核酸分子を、前記植物において機能するプロモーターと、機能可能であるように連結して、植物形質転換ベクターを生成し、前記植物を、形質転換し、形質転換植物細胞から形質転換植物を再生する方法。前記核酸分子がＲＮＡ干渉方向である方法。これにより、前期植物におけるノルニコチンレベルを増加させるかまたは減少させる方法。
【解決手段】トランスジェニック植物を産生する方法であって、前記核酸分子を、前記植物において機能するプロモーターと、機能可能であるように連結して、植物形質転換ベクターを生成し、前記植物を、形質転換し、形質転換植物細胞から形質転換植物を再生する方法。前記核酸分子がＲＮＡ干渉方向である方法。これにより、前期植物におけるノルニコチンレベルを増加させるかまたは減少させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タバコ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）植物においてチトクロムＰ４５０酵素（以後、ｐ４５０およびｐ４５０酵素と称する）をコードする核酸配列、およびこうした核酸配列を用いて植物表現型を改変する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
チトクロムｐ４５０は、内因性基質および生体異物基質の酸化代謝、過酸化代謝および還元代謝を含む、多様な範囲の化学的に異なる基質の酵素反応を触媒する。植物において、ｐ４５０は、フェニルプロパノイド、アルカロイド、テルペノイド、脂質、青酸グリコシド、およびグルコシノレートなどの植物産物の合成を含む、生化学的経路に関与する（Ｃｈａｐｐｅｌ， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９８， ４９：３１１−３４３(非特許文献１)）。チトクロムｐ４５０は、ｐ４５０ヘム−チオレート・タンパク質としても知られ、通常、ｐ４５０含有モノオキシゲナーゼ系と呼ばれる多構成要素電子移動連鎖の最後のオキシダーゼとして作用する。触媒される特定の反応には、脱メチル化、水酸化、エポキシ化、Ｎ−酸化、スルホ酸化（ｓｕｌｆｏｏｘｉｄａｔｉｏｎ）、Ｎ−、Ｓ−、およびＯ−脱アルキル化、脱硫酸化、脱アミノ化、並びにアゾ、ニトロ、およびＮ−オキシド基の還元が含まれる。
【０００３】
タバコ属植物ｐ４５０酵素の多様な役割が、フェニルプロパノイド、アルカロイド、テルペノイド、脂質、青酸グリコシド、グルコシノレートおよび多くの他の化学実体などの多様な植物代謝産物を生じるのに関連付けられてきている。近年、いくつかのｐ４５０酵素が、植物において植物代謝産物の組成に影響を及ぼしうることが明らかになってきている。例えば、選択される脂肪酸のプロフィールを、育種を通じて改変することによって、特定の植物のフレーバーおよび香りを改善することが以前から望まれてきた；が、これらの葉の構成要素のレベルを調節するのに関与する機構に関してはほとんどわかっていない。脂肪酸の修飾に関与するｐ４５０酵素を下方制御すると、より好ましい葉の表現型特性を提供する、望ましい脂肪酸の集積が促進されることも可能である。植物構成要素におけるｐ４５０酵素の機能およびその広い役割は、なお発見される途上にある。例えば、特殊な種類のｐ４５０酵素が、脂肪酸を分解して、果物および野菜の「新鮮な緑」のにおいに主に貢献する、揮発性Ｃ６およびＣ９アルデヒドおよびアルコールにするのを触媒することが見出された。タバコ属の葉において、脂質構成要素および関連する分解代謝産物を修飾することによって、標的とされる他の新規ｐ４５０のレベルを改変して、葉の構成要素の品質を増進することも可能である。葉におけるこれらの構成要素のいくつかが、葉の品質特性の成熟を刺激する老化によって影響を受ける。さらに他の報告によって、ｐ４５０酵素が、植物−病原体相互作用および疾患抵抗性に関与する脂肪酸を改変する際に機能的役割を果たすことが示されてきている。
【０００４】
他の例において、ｐ４５０酵素が、アルカロイド生合成に関与することも示唆されてきている。ノルニコチンは、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｅｕｍ）に見られる微量アルカロイドである。ノルニコチンは、ｐ４５０が仲介してニコチンが脱メチル化され、その後、Ｎ位でアシル化およびニトロソ化が起こり、それによって一連のＮ−アシルノニコチン（Ｎ−ａｃｙｌｎｏｎｉｃｏｔｉｎｅｓ）およびＮ−ニトロソノルニコチンが生じることによって産生されると推論されてきている。推定上のｐ４５０脱メチル化酵素（ｄｅｍｅｔｈｙｌａｓｅ）に触媒されるＮ−脱メチル化は、タバコ属におけるノルニコチン生合成の主な供給源であると考えられる。該酵素はミクロソーム性であると考えられ
るが、これまで、ニコチン脱メチル化酵素の精製は成功しておらず、関与する遺伝子も単離されていない。
【０００５】
さらに、ｐ４５０酵素の活性が、遺伝的に調節され、そしてまた、環境要因によって強く影響されると仮定されているが、証明されていない。例えば、タバコ属におけるニコチンの脱メチル化は、植物が成熟段階に達したときに実質的に増加すると考えられている。さらに、ＲＮＡが存在する場合、その翻訳を阻害することも可能な転移可能要素を、脱メチル化酵素遺伝子が含有すると仮定されるが、証明はされていない。
【０００６】
ｐ４５０酵素型が非常に多様であり、構造および機能が異なることから、タバコ属ｐ４５０酵素の研究は、本発明以前には非常に困難であった。さらに、少なくとも部分的に、膜に局在するこれらのｐ４５０酵素が、典型的には存在量が少なく、そしてしばしば、精製するには不安定であるため、これらのタンパク質のクローニングが妨害されてきた。したがって、植物におけるｐ４５０酵素、およびこれらのｐ４５０酵素に関連する核酸配列を同定する必要性が存在する。特に、タバコ属においては、いくつかのチトクロムｐ４５０タンパク質しか報告されてきていない。本明細書に記載する発明は、配列同一性に基づいて、ｐ４５０種のいくつかのグループに対応する、かなりの数のチトクロムｐ４５０断片の発見を含む。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｃｈａｐｐｅｌ， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９８， ４９：３１１−３４３
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
概要
本発明は植物ｐ４５０酵素に関する。本発明はさらに、タバコ属由来の植物ｐ４５０酵素に関する。本発明はまた、その発現がエチレンおよび／または植物老化によって誘導される、植物におけるｐ４５０酵素にも関する。本発明はさらに、酵素活性、例えばオキシゲナーゼ、脱メチル化酵素等、またはその他に分類される酵素活性を有する、植物中の核酸配列、およびこれらの酵素の発現または過剰発現を減少させるかまたはサイレンシングするための、これらの配列の使用にも関する。本発明はまた、より低いノルニコチンレベルを示す植物より、より高いノルニコチンレベルを含有する植物で見られるｐ４５０酵素にも関する。
【０００９】
１つの側面において、本発明は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３、２４５、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２６１、２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、２７３、２７５、２７７、２７９、２８１、２８３、２８５、２８７、２８９、２９１、２９３、２９５および２９７に示す核酸配列に関する。
【００１０】
第二の関連する側面において、核酸配列において７５％を超える同一性を含有する断片を、チトクロムｐ４５０モチーフＧＸＲＸＣＸ（Ｇ／Ａ）に続く最初の核酸から停止コドンまでに対応する領域における同一性に応じたグループに入れた。代表的な核酸グループ
およびそれぞれの種を表Ｉに示す。
【００１１】
第三の側面において、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９４、２９６および２９８に示すアミノ酸配列に関する。
【００１２】
第四の関連する側面において、アミノ酸配列において７１％を超える同一性を含有する断片を、チトクロムｐ４５０モチーフＧＸＲＸＣＸ（Ｇ／Ａ）に続く最初のアミノ酸から停止コドンまでに対応する領域における、互いに対する同一性に応じたグループに入れた。代表的なアミノ酸グループおよびそれぞれの種を表ＩＩに示す。
【００１３】
第五の側面において、本発明は、配列番号１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９４、２９６および２９８に示す全長遺伝子のアミノ酸配列に関する。
【００１４】
第六の関連する側面において、アミノ酸配列において８５％以上の同一性を含有する全長遺伝子を、互いに対する同一性に応じたグループに入れた。代表的なアミノ酸グループおよびそれぞれの種を表ＩＩＩに示す。
【００１５】
第七の側面において、本発明は、配列番号２９９〜３５７に示す断片のアミノ酸配列に関する。
第八の関連する側面において、アミノ酸配列において９０％以上の同一性を含有する断片を、最初のチトクロムｐ４５０ドメイン、ＵＸＸＲＸＸＺから、第三のチトクロム・ドメイン、ＧＸＲＸＯ、ここでＵはＥまたはＫであり、Ｘはアミノ酸いずれかであり、そしてＺはＲ、Ｔ、ＳまたはＭである、までに対応する領域における、互いに対する同一性に応じたグループに入れた。代表的なアミノ酸グループおよびそれぞれの種を表ＩＶに示す。
【００１６】
第九の関連する側面において、ＲＮＡウイルス系を用いて、タバコ属植物におけるｐ４５０酵素の減少または除去または過剰発現を一過性に達成することも可能である。
一般の当業者に通常利用可能な技術を用いて、限定されるわけではないが、内因性ｐ４５０ ＲＮＡ転写物、発現されたｐ４５０ペプチド、および植物代謝産物濃度の解析を含
む、表現型変化に関して、生じた形質転換植物または感染植物を評価する。
【００１７】
第十の重要な側面において、本発明はまた、改変されたｐ４５０酵素活性レベルを有するトランスジェニック・タバコ属系統の生成にも関する。本発明にしたがって、これらのトランスジェニック系統には、特定の酵素の発現を減少させるかまたはサイレンシングするかまたは増加させ、したがってタバコ属内で表現型効果を生じるのに有効である核酸配列が含まれる。こうした核酸配列には、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３、２４５、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２６１、２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、２７３、２７５、２７７、２７９、２８１、２８３、２８５、２８７、２８９、２９１、２９３、２９５および２９７が含まれる。
【００１８】
本発明の非常に重要な第十一の側面において、全長遺伝子またはその断片のいずれかを用いて下方制御能力がある、あるいは全長遺伝子を用いて過剰発現能力がある、本発明の核酸を含む植物品種は、対照植物に比較して、改変された代謝産物プロフィールを有するであろう。
【００１９】
本発明の第十二の側面において、本発明の核酸を含む植物品種は、植物または植物外部に由来する代謝産物の生合成または分解を修飾する際に、全長遺伝子またはその断片のいずれかを用いて、特定の外因性化学薬品または植物疫病に耐容性を示すのに使用を有するであろう。こうした核酸配列には、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３、２４５、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２６１、２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、２７３、２７５、２７７、２７９、２８１、２８３、２８５、２８７、２８９、２９１、２９３、２９５および２９７が含まれる。
【００２０】
第十三の側面において、本発明は、解説される核酸配列に実質的な核酸同一性を有する遺伝子を含有する植物、より好ましくはタバコ属のスクリーニングに関する。本発明の使用は、こうした植物が伝統的な品種またはトランスジェニック品種の育種プログラム、突然変異誘発プログラム、あるいは天然存在の多様な植物集団の一部である場合、厳密なま
たは実質的な同一性を持つ核酸配列を含有する植物を同定し、そして選択するのに好適であろう。実質的な核酸同一性に関する植物のスクリーニングは、限定されるわけではないが、核酸ハイブリダイゼーションおよびＰＣＲ解析を含む核酸検出プロトコルと組み合わせて、核酸プローブを用い、植物核酸物質を評価することによって、達成可能である。核酸プローブは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３、２４５、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２６１、２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、２７３、２７５、２７７、２７９、２８１、２８３、２８５、２８７、２８９、２９１、２９３、２９５および２９７に対応する、解説される核酸配列またはその断片からなることも可能である。
【００２１】
第十四の側面において、本発明は、解説される核酸配列に対応する実質的なアミノ酸同一性を共有する植物遺伝子、より好ましくはタバコ属遺伝子の同定に関する。ｃＤＮＡおよびゲノムクローン両方を含む植物遺伝子、より好ましくはタバコ属由来のｃＤＮＡおよびゲノムクローンを含む植物遺伝子の同定は、限定されるわけではないが、核酸ハイブリダイゼーションおよびＰＣＲ解析を含む核酸検出プロトコルと組み合わせて核酸プローブを用い、植物ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって、達成可能である。核酸プローブは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４３、１４５および１４７に対応する核酸配列またはその断片で構成されることも可能である。
【００２２】
別の第十五の側面において、解説されるアミノ酸配列の一部またはすべてに向けられる抗体を用いて、ペプチドを発現するｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングすることも可能である。こうしたアミノ酸配列には、配列番号２、４、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４４、１４６、１４８が含まれる。
【００２３】
第十六の重要な側面において、本発明はまた、ｐ４５０酵素活性レベルの過剰発現を有するトランスジェニック・タバコ属系統の生成にも関する。本発明にしたがって、これらのトランスジェニック系統には、特定の酵素の発現を増加させるのに有効であり、したがってタバコ属内で表現型効果を生じるのに有効である全長遺伝子のアミノ酸配列をコードするすべての核酸配列が含まれる。こうしたアミノ酸配列には、配列番号１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２
、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９４、２９６および２９８が含まれる。
【００２４】
減少した量のノルニコチンを有するタバコ葉（ラミナおよび／または茎）を含むタバコ製品もまた提供する。タバコ製品には、本明細書記載の配列を含む植物、あるいはタバコ特異的ニトロソアミンをコードする遺伝子が除去または抑制されている植物由来のタバコ（ラミナおよび／または茎を含むタバコ葉）が含まれる。タバコ特異的ニトロソアミンをコードする遺伝子の除去または抑制は、タバコ特異的ニトロソアミンをコードする遺伝子が除去または抑制されていないタバコ植物から作成されたタバコ製品に比較して、タバコ製品中のタバコ特異的ニトロソアミンを、約５〜約１０％、別の側面においては約１０〜２０％、別の側面においては約２０〜３０％、そして別の側面においては３０％を超えて、減少させるのに有効である。本明細書において、タバコ製品は、巻きタバコ、葉巻、パイプタバコ、嗅ぎタバコ、噛みタバコ、タバコ製品とブレンドした製品、およびこれらの混合物を含むことも可能である。
【００２５】
詳細な説明
定義
別に定義しない限り、本明細書で用いるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する当該技術分野の一般の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら（１９９４）Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， 第２版， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ
ａｎｄ Ｓｏｎｓ（ニューヨーク）は、本発明で用いる用語の多くの一般的辞書とともに、技術の１つを提供する。本明細書に引用する特許および刊行物はすべて本明細書に援用される。本発明の目的のため、次の用語を以下に定義する。
【００２６】
「酵素活性」は、脱メチル化、水酸化、エポキシ化、Ｎ−酸化、スルホ酸化、Ｎ−、Ｓ−、およびＯ−脱アルキル化、脱硫酸化、脱アミノ化、並びにアゾ、ニトロ、およびＮ−オキシド基の還元を含むことを意味される。用語「核酸」は、一本鎖または二本鎖型いずれか、あるいはセンスまたはアンチセンスのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指し、そして別に限定されない限り、天然存在ヌクレオチドに似た方式で、核酸にハイブリダイズする天然ヌクレオチドの既知の類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）を含む。別に示さない限り、特定の核酸配列には、その相補配列が含まれる。
【００２７】
用語「機能可能であるように連結される」、「機能可能な組み合わせ」および「機能可能な順序」は、核酸発現調節配列（プロモーター、シグナル配列、または転写因子結合部位の列など）および第二の核酸配列の間の機能する連結を指し、ここで発現調節配列は、第二の配列に対応する核酸の転写および／または翻訳に影響を及ぼす。
【００２８】
用語「組換え」は、細胞に関して用いた場合、細胞が異種核酸を複製するか、前記核酸を発現するか、あるいは異種核酸にコードされるペプチド、異種ペプチド、またはタンパク質を発現することを示す。組換え細胞は、細胞の天然（非組換え）型には見られないセンス型またはアンチセンス型いずれかの遺伝子または遺伝子断片を発現することも可能である。組換え細胞はまた、細胞の天然型に見られるが、修飾され、そして人工的手段によって細胞に再度導入されている遺伝子を発現することもまた可能である。
【００２９】
「構造遺伝子」は、タンパク質、ポリペプチドまたはその一部をコードするＤＮＡセグメントを含み、そして転写開始を駆動する５’配列を除く遺伝子の部分である。あるいは構造遺伝子は翻訳不能産物をコードすることも可能である。構造遺伝子は、細胞に通常見られるもの、あるいは導入される細胞または細胞位置で通常は見られないものであることも可能であり、この場合、該遺伝子は「異種遺伝子」と呼ばれる。異種遺伝子は、細菌ゲノムまたはエピソーム、真核、核またはプラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ウイルスＤＮＡあるいは化学的に合成されたＤＮＡを含む、当該技術分野に知られるいかなる供給源に、すべてまたは一部、由来していることも可能である。構造遺伝子は、生物学的活性またはその特性、発現産物の生物学的活性または化学構造、発現率または発現調節の方式を達成可能な１以上の修飾を含有することも可能である。こうした修飾には、限定されるわけではないが、１以上のヌクレオチドの突然変異、挿入、欠失および置換が含まれる。構造遺伝子は、中断されないコード配列を構成することも可能であるし、または適切なスプライス接合部によって結合される１以上のイントロンを含むことも可能である。構造遺伝子は翻訳可能または翻訳不能であることも可能であり、アンチセンス方向にあるものを含む。構造遺伝子は複数の供給源由来および複数の遺伝子配列（天然存在または合成、ここで合成は化学的に合成されたＤＮＡを指す）由来のセグメントの合成物（ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ）であることも可能である。
【００３０】
「由来する」は、供給源（化学的および／または生物学的）から採取されるか、得られるか、受け取られるか、帰着するか、複製されるか、または伝わる（ｄｅｓｃｅｎｄ）ことを意味するよう用いられる。派生物（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）は、元来の供給源の化学的操作または生物学的操作（限定されるわけではないが、置換、付加、挿入、欠失、抽出、単離、突然変異および複製を含む）によって産生されることも可能である。
【００３１】
「化学的に合成された」は、ＤＮＡの配列に関する場合、構成要素ヌクレオチドの一部がｉｎ ｖｉｔｒｏで組み立てられたことを意味する。よく確立された方法（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ， Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ ｏｆ ＤＮＡ ａｎｄ ＲＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ， （１９８３）， Ｗｅｉｓｓｍａｎ（監修）， Ｐｒａｅｇｅｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， ニューヨーク， 第１章）を用いて、ＤＮＡの手動の化学的合成を達成することも可能であり；いくつかの商業的に入手可能な機械の１つを用いて、自動化化学合成を行うことも可能である。
【００３２】
ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ， Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３（１９７０）の相同性並列アルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８５：２４４４（１９８８）の類似性法に関する検索によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化実行（ウィスコンシン遺伝学ソフトウェアパッケージ、遺伝学コンピュータグループ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または視診によって、比較のための配列の最適並列を行うことも可能である。
【００３３】
ＮＣＢＩ基本的局所並列検索ツール（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０）は、米国生物学情報センター（ＮＣＢＩ、メリーランド州ベセスダ）を含むいくつかの供給源から入手可能であり、そして配列解析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘと関連付けて使用するため、インターネット上で入手可能である。該ツールは、ｈｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／でアクセス可能である。このプログラムを用いて配列同一性を決定する方法の説明が、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ｂｌａｓｔ ｈｅｌｐ．ｈｔｍｌで入手可能である。
【００３４】
用語「実質的なアミノ酸同一性」または「実質的なアミノ酸配列同一性」は、アミノ酸配列に適用した場合、そして本明細書で用いる場合、ペプチドが、翻訳されたペプチドのチトクロムｐ４５０モチーフＧＸＲＸＣＸ（Ｇ／Ａ）に続く最初のアミノ酸から停止コドンまでに対応する領域に渡って、参照群に比較した際、少なくとも７０パーセントの配列同一性、好ましくは８０パーセントのアミノ酸配列同一性、より好ましくは９０パーセントのアミノ酸配列同一性、そして最も好ましくは少なくとも９９〜１００パーセントの配列同一性を有する配列を含む、ポリペプチドの特性を示す。
【００３５】
用語「実質的な核酸同一性」または「実質的な核酸配列同一性」は、核酸配列に適用した場合、そして本明細書で用いる場合、ポリヌクレオチドが、翻訳されたペプチドのチトクロムｐ４５０モチーフＧＸＲＸＣＸ（Ｇ／Ａ）に続く最初の核酸から停止コドンまでに対応する領域に渡って、参照群に比較した際、少なくとも７５パーセントの配列同一性、好ましくは８１パーセントの配列同一性、より好ましくは少なくとも９１パーセントの配列同一性、そして最も好ましくは少なくとも９９〜１００パーセントの配列同一性を有する配列を含む、ポリヌクレオチド配列の特性を示す。
【００３６】
ヌクレオチド配列が実質的に同一であることの別の指標は、２つの分子がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズする場合である。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、そして異なる環境において異なるであろう。一般的に、ストリンジェントな条件は、特定の配列に関する、定義されるイオン強度およびｐＨでの熱融点（Ｔｍ）より約５℃〜約２０℃、通常、約１０℃〜約１５℃低いように選択される。Ｔｍは、（定義されるイオン強度およびｐＨで）標的配列の５０％が、マッチしたプローブにハイブリダイズする温度である。典型的には、ストリンジェントな条件は、ｐＨ７で塩濃度が約０．０２モル濃度であり、そして温度が少なくとも約６０℃であるものであろう。例えば標準的サザンハイブリダイゼーション法において、ストリンジェントな条件は、４２℃の６ｘＳＳＣ中の最初の洗浄、続いて少なくとも約５５℃、典型的には約６０℃、そしてしばしば約６５℃の温度での０．２ｘＳＳＣ中の１以上のさらなる洗浄を含むであろう。
【００３７】
ヌクレオチド配列はまた、コードするポリペプチドおよび／またはタンパク質が実質的に同一である場合、本発明の目的のためには、実質的に同一である。したがって、１つの核酸配列が第二の核酸配列と本質的に同じポリペプチドをコードする場合、遺伝暗号に許容される縮重のため、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズしない場合であっても、２つの核酸配列は実質的に同一である（コドン縮重および遺伝暗号の説明に関しては、Ｄａｒｎｅｌｌら（１９９０）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， 第２版 Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ ニューヨークを参照されたい）。タンパク質試料のポリアクリルアミドゲル電気泳動、その後、染色での視覚化などの、当該技術分野に周知のいくつかの手段によって、タンパク質純度または均一性を示すことも可能である。特定の目的のため、高分解能が必要とされる可能性もあり、そして精製のためにＨＰＬＣまたは類似の手段を利用することも可能である。
【００３８】
本明細書において、細胞にＤＮＡセグメント（単数または複数）をトランスファーする核酸分子に関して、用語「ベクター」を用いる。ベクターはＤＮＡを複製するよう作用することも可能であり、そして宿主細胞において、独立に複製可能である。用語「ビヒクル」は、ときに、「ベクター」と交換可能に用いられる。用語「発現ベクター」は、本明細書において、望ましいコード配列、および特定の宿主生物において、機能可能であるように連結されたコード配列の発現に必要な適切な核酸配列を含有する、組換えＤＮＡ分子を指す。原核生物における発現に必要な核酸配列には、通常、プロモーター、オペレーター（場合による）、およびリボソーム結合部位に、しばしば他の配列が伴って、含まれる。
真核細胞は、プロモーター、エンハンサー、および終結シグナルおよびポリアデニル化シグナルを利用することが知られる。
【００３９】
根がある、完全に遺伝子操作された植物を再生するため、ｉｎ ｖｉｖｏ接種などの技術いずれかによって、または完全な植物に再生可能な形質転換植物細胞を産生する、既知のｉｎ ｖｉｔｒｏ組織培養技術のいずれかによって、核酸を植物細胞に挿入することも可能である。したがって、例えば、植物細胞への挿入は、病原性または非病原性Ａ．ツメファシエンス（Ａ． ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）によるｉｎ ｖｉｔｒｏ接種によることも可能である。他のこうした組織培養技術もまた、使用可能である。
【００４０】
「植物組織」には、植物の分化組織および未分化組織が含まれ、限定されるわけではないが、根、芽、葉、花粉、種子、腫瘍組織および培養中の多様な型の細胞、例えば単細胞、プロトプラスト、胚およびカルス組織が含まれる。植物組織は、植物中（ｉｎ ｐｌａｎｔａ）または器官中にあることも、組織または細胞培養物であることも可能である。
【００４１】
「植物細胞」には、本明細書において、植物中の植物細胞、並びに培養中の植物細胞およびプロトプラストが含まれる。
「ｃＤＮＡ」または「相補ＤＮＡ」は、一般的に、ＲＮＡ分子に相補的なヌクレオチド配列を持つ一本鎖ＤＮＡ分子を指す。ｃＤＮＡは、ＲＮＡテンプレートに対する逆転写酵素の作用によって形成される。
【００４２】
核酸配列を得る戦略
本発明にしたがって、変換（ｃｏｎｖｅｒｔｅｒ）および非変換タバコ属系統のタバコ属組織からＲＮＡを抽出した。次いで、抽出したＲＮＡを用いてｃＤＮＡを生成した。次いで、２つの戦略を用いて、本発明の核酸配列を生成した。
【００４３】
第一の戦略では、植物組織からポリＡ濃縮ＲＮＡを抽出し、そして逆転写ＰＣＲによってｃＤＮＡを作成した。次いで、一本鎖ｃＤＮＡを用い、縮重プライマーに加えて、オリゴｄ（Ｔ）逆方向プライマーを用いて、ｐ４５０特異的ＰＣＲ集団を生成した。プライマー設計は、ｐ４５０の高度に保存されたモチーフに基づいた。特異的縮重プライマーの例を図１に示す。適切なサイズの挿入物を含有するプラスミド由来の配列断片をさらに解析した。これらのサイズの挿入物は、どのプライマーを用いたかに応じて、典型的には、約３００〜約８００ヌクレオチドの範囲であった。
【００４４】
第二の戦略では、まず、ｃＤＮＡライブラリーを構築した。プラスミド中のｃＤＮＡを用い、縮重プライマーに加えて、逆方向プライマーとしてプラスミド上のＴ７プライマーを用いて、ｐ４５０特異的ＰＣＲ集団を生成した。第一の戦略におけるように、適切なサイズの挿入物を含有するプラスミド由来の配列断片をさらに解析した。
【００４５】
高レベルのノルニコチンを生じることが知られるタバコ属植物系統（変換系統）、および検出不能なレベルのノルニコチンを有する植物系統を出発材料として使用することも可能である。
【００４６】
次いで、植物から葉を取り除き、そしてエチレンで処理して、本明細書に定義するｐ４５０酵素活性を活性化することも可能である。当該技術分野に知られる技術を用いて、総ＲＮＡを抽出する。次いで、図１５３に記載するようなオリゴｄ（Ｔ）プライマーを用いたＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて、ｃＤＮＡ断片を生成することも可能である。次いで、本明細書の実施例に、より完全に記載する、ｃＤＮＡライブラリーを構築することも可能である。
【００４７】
ｐ４５０型酵素に保存される領域を縮重プライマーのテンプレートとして用いることも可能である（図７５）。縮重プライマーを用いて、ｐ４５０特異的バンドをＰＣＲによって増幅することも可能である。ｐ４５０様酵素を示すバンドをＤＮＡ配列決定によって同定することも可能である。ＢＬＡＳＴ検索、並列、または適切な候補を同定する他のツールを用いて、ＰＣＲ断片を性質決定することも可能である。
【００４８】
同定された断片からの配列情報を用いて、ＰＣＲプライマーを発展させることも可能である。ｃＤＮＡライブラリー中のプラスミドプライマーと組み合わせてこれらのプライマーを用い、全長ｐ４５０遺伝子をクローニングした。大規模サザン逆解析を行って、得られたすべての断片クローン、およびいくつかの場合、全長クローンに関して、示差発現を調べた。本発明のこの側面において、クローニングされた挿入物すべてをスクリーニングするため、クローニングされたＤＮＡ断片とハイブリダイズするプローブとして、異なる組織由来の標識総ｃＤＮＡを用いて、これらの大規模逆サザンアッセイを行うことも可能である。
【００４９】
非放射性および放射性（Ｐ３２）ノーザンブロッティングアッセイもまた用いて、クローンｐ４５０断片および全長クローンを性質決定した。
全長クローンのアミノ酸配列を得て、そして抗原性であり、そして他のクローンに比較してユニークであるペプチド領域を選択することによって、いくつかの全長クローンに対してペプチド特異的抗体を作成した。キャリアータンパク質にコンジュゲート化した合成ペプチドに対して、ウサギ抗体を作成した。これらの抗体を用いて、植物組織に対して、ウェスタンブロッティング解析または他の免疫学的方法を行った。
【００５０】
ウイルス誘導性遺伝子サイレンシング技術を用いることによって、上述のように同定された核酸配列を調べることも可能である（ＶＩＧＳ， Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １９９９， ２：１０９−１１３）。
【００５１】
全長クローンのアミノ酸配列を得て、そして潜在的に抗原性であり、そして他のクローンに比較してユニークであるペプチド領域を選択することによって、いくつかの全長クローンに対してペプチド特異的抗体を作成した。キャリアータンパク質にコンジュゲート化した合成ペプチドに対して、ウサギ抗体を作成した。これらの抗体を用いて、ウェスタンブロッティング解析を行った。
【００５２】
本発明の別の側面において、本発明のタバコ属植物におけるチトクロムｐ４５０酵素活性をさらに性質決定するため、ＲＮＡ干渉技術（ＲＮＡｉ）を用いる。この技術を説明する以下の参考文献、Ｓｍｉｔｈら， Ｎａｔｕｒｅ， ２０００， ４０７：３１９−３２０；Ｆｉｒｅら， Ｎａｔｕｒｅ， １９９８， ３９１：３０６−３１１；Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら， ＰＮＡＳ， １９９８， ９５：１３９５９−１３９６４；Ｓｔａｌｂｅｒｇら， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １９９３， ２３：６７１−６８３；Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １９９９， ２：１０９−１１３；およびＢｒｉｇｎｅｔｉら， ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ， １９９８， １７（２２）：６７３９−６７４６が本明細書に援用される。ＲＮＡｉ技術、アンチセンス技術、または記載される多様な他の方法を用いて、植物を形質転換することも可能である。
【００５３】
植物細胞に外来（ｆｏｒｅｉｇｎ）遺伝物質を導入するための、そして導入された遺伝子を安定して維持し、そして発現する植物を得るための、いくつかの技術が存在する。こうした技術には、微小粒子上にコーティングした遺伝物質を細胞内に直接加速することが含まれる（Ｃｏｒｎｅｌｌに対する米国特許４，９４５，０５０およびＤｏｗＥｌａｎｃ
ｏに対する５，１４１，１３１）。アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）技術を用いて、植物を形質転換することも可能であり、トレド大学に対する米国特許５，１７７，０１０、Ｔｅｘａｘ Ａ＆Ｍに対する５，１０４，３１０、Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｔに対する欧州特許出願０１３１６２４Ｂ１、欧州特許出願１２０５１６、１５９４１８Ｂ１、欧州特許出願１２０５１６、１５９４１８Ｂ１および１７６，１１２、Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｔに対する米国特許５，１４９，６４５、５，４６９，９７６、５，４６４，７６３および４，９４０，８３８および４，６９３，９７６、すべてＭａｘＰｌａｎｃｋに対する欧州特許出願１１６７１８、２９０７９９、３２０５００、Ｊａｐａｎ Ｎｉｃｏｔｉａｎａに対する欧州特許出願６０４６６２および６２７７５２、すべてＣｉｂａ
Ｇｅｉｇｙに対する欧州特許出願０２６７１５９および０２９２４３５および米国特許５，２３１，０１９、どちらもＣａｌｇｅｎｅに対する米国特許５，４６３，１７４および４，７６２，７８５、並びにどちらもＡｇｒａｃｅｔｕｓに対する米国特許５，００４，８６３および５，１５９，１３５を参照されたい。他の形質転換技術には、ウィスカー技術が含まれ、どちらもＺｅｎｅｃａに対する米国特許５，３０２，５２３および５，４６４，７６５を参照されたい。植物を形質転換するにはエレクトロポレーション技術もまた用いられてきており、Ｂｏｙｃｅ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅに対するＷＯ ８７／０６６１４、どちらもＤｅｋａｌｂに対する５，４７２，８６９および５，３８４，２５３、どちらもＰＧＳに対するＷＯ９２０９６９６およびＷＯ９３２１３３５を参照されたい。これらの形質転換特許および刊行物はすべて、本明細書に援用される。植物を形質転換する多くの技術に加えて、外来遺伝子と接触させる組織の種類もまた、多様であることも可能である。こうした組織には、限定されるわけではないが、胚形成組織、カルス組織Ｉ型およびＩＩ型、胚軸、成長点等が含まれるであろう。当業者の技術内の適切な技術を用いて、脱分化中の、ほぼすべての植物組織を形質転換することも可能である。
【００５４】
植物に導入される外来遺伝物質には、選択可能マーカーが含まれることも可能である。特定のマーカーを優先するのは、当業者の自由裁量であるが、以下の選択可能マーカーのいずれかとともに、選択可能マーカーとして機能可能な、本明細書に列挙されていない他の遺伝子のいずれも使用可能である。こうした選択可能マーカーには、限定されるわけではないが、抗生物質カナマイシン、ネオマイシンおよびＧ４１８に対する抵抗性をコードするトランスポゾンＴｎ５のアミノグリコシド・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ＡｐｈＩＩ）とともに、グリフォセート；ハイグロマイシン；メトトレキセート；フォスフィノスリシン（ｂａｒ）；イミダゾリノン、スルホニル尿素およびトリアゾロピリミジン除草剤、例えばクロロスルフロン；ブロモキシニル、ダラポン等に対する抵抗性または耐性をコードする遺伝子が含まれる。
【００５５】
選択可能マーカーに加えて、レポーター遺伝子を用いることが望ましい可能性もある。いくつかの例において、選択可能マーカーを伴わずに、レポーター遺伝子を用いることも可能である。レポーター遺伝子は、レシピエント生物または組織に典型的には存在しないかまたはこれらで発現されていない遺伝子である。レポーター遺伝子は、典型的には何らかの表現型変化または酵素特性を提供するタンパク質をコードする。こうした遺伝子の例が、本明細書に援用されるＫ． Ｗｅｉｓｉｎｇら Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ２２， ４２１（１９８８）に提供される。好ましいレポーター遺伝子には、限定なしに、グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子およびＧＦＰ遺伝子が含まれる。
【００５６】
植物組織にひとたび導入されたならば、当該技術分野に知られるいかなる手段によって構造遺伝子の発現をアッセイすることも可能であり、そして転写されるｍＲＮＡ、合成されるタンパク質、または生じる遺伝子サイレンシングの量として、発現を測定することも可能である（本明細書に援用される米国特許第５，５８３，０２１号を参照されたい）。植物組織のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養のための技術が知られ、そしていくつかの場合、全植物
への再生の技術が知られる（ＥＰ出願第８８８１０３０９．０）。導入された発現複合体を商業的に有用な品種にトランスファーするための方法が、当業者に知られる。
【００５７】
望ましいレベルのｐ４５０酵素を発現する植物細胞がひとたび得られたら、当該技術分野に周知の方法および技術を用いて、そこから植物組織および全植物を再生することも可能である。次いで、再生された植物を、慣用的手段によって、繁殖させ、そして慣用的な植物育種技術によって、導入された遺伝子を他の系統および品種にトランスファーすることも可能である。
【００５８】
以下の実施例は、本発明を実行する方法を例示し、そして付随する請求項に定義される本発明の範囲を例示するが、これを限定しないことが理解されなければならない。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】図１は、核酸配列番号１およびアミノ酸配列番号２を示す。
【図２】図２は、核酸配列番号３およびアミノ酸配列番号４を示す。
【図３】図３は、核酸配列番号５およびアミノ酸配列番号６を示す。
【図４】図４は、核酸配列番号７およびアミノ酸配列番号８を示す。
【図５】図５は、核酸配列番号９およびアミノ酸配列番号１０を示す。
【図６】図６は、核酸配列番号１１およびアミノ酸配列番号１２を示す。
【図７】図７は、核酸配列番号１３およびアミノ酸配列番号１４を示す。
【図８】図８は、核酸配列番号１５およびアミノ酸配列番号１６を示す。
【図９】図９は、核酸配列番号１７およびアミノ酸配列番号１８を示す。
【図１０】図１０は、核酸配列番号１９およびアミノ酸配列番号２０を示す。
【図１１】図１１は、核酸配列番号２１およびアミノ酸配列番号２２を示す。
【図１２】図１２は、核酸配列番号２３およびアミノ酸配列番号２４を示す。
【図１３】図１３は、核酸配列番号２５およびアミノ酸配列番号２６を示す。
【図１４】図１４は、核酸配列番号２７およびアミノ酸配列番号２８を示す。
【図１５】図１５は、核酸配列番号２９およびアミノ酸配列番号３０を示す。
【図１６】図１６は、核酸配列番号３１およびアミノ酸配列番号３２を示す。
【図１７】図１７は、核酸配列番号３３およびアミノ酸配列番号３４を示す。
【図１８】図１８は、核酸配列番号３５およびアミノ酸配列番号３６を示す。
【図１９】図１９は、核酸配列番号３７およびアミノ酸配列番号３８を示す。
【図２０】図２０は、核酸配列番号３９およびアミノ酸配列番号４０を示す。
【図２１】図２１は、核酸配列番号４１およびアミノ酸配列番号４２を示す。
【図２２】図２２は、核酸配列番号４３およびアミノ酸配列番号４４を示す。
【図２３】図２３は、核酸配列番号４５およびアミノ酸配列番号４６を示す。
【図２４】図２４は、核酸配列番号４７およびアミノ酸配列番号４８を示す。
【図２５】図２５は、核酸配列番号４９およびアミノ酸配列番号５０を示す。
【図２６】図２６は、核酸配列番号５１およびアミノ酸配列番号５２を示す。
【図２７】図２７は、核酸配列番号５３およびアミノ酸配列番号５４を示す。
【図２８】図２８は、核酸配列番号５５およびアミノ酸配列番号５６を示す。
【図２９】図２９は、核酸配列番号５７およびアミノ酸配列番号５８を示す。
【図３０】図３０は、核酸配列番号５９およびアミノ酸配列番号６０を示す。
【図３１】図３１は、核酸配列番号６１およびアミノ酸配列番号６２を示す。
【図３２】図３２は、核酸配列番号６３およびアミノ酸配列番号６４を示す。
【図３３】図３３は、核酸配列番号６５およびアミノ酸配列番号６６を示す。
【図３４】図３４は、核酸配列番号６７およびアミノ酸配列番号６８を示す。
【図３５】図３５は、核酸配列番号６９およびアミノ酸配列番号７０を示す。
【図３６】図３６は、核酸配列番号７１およびアミノ酸配列番号７２を示す。
【図３７】図３７は、核酸配列番号７３およびアミノ酸配列番号７４を示す。
【図３８】図３８は、核酸配列番号７５およびアミノ酸配列番号７６を示す。
【図３９】図３９は、核酸配列番号７７およびアミノ酸配列番号７８を示す。
【図４０】図４０は、核酸配列番号７９およびアミノ酸配列番号８０を示す。
【図４１】図４１は、核酸配列番号８１およびアミノ酸配列番号８２を示す。
【図４２】図４２は、核酸配列番号８３およびアミノ酸配列番号８４を示す。
【図４３】図４３は、核酸配列番号８５およびアミノ酸配列番号８６を示す。
【図４４】図４４は、核酸配列番号８７およびアミノ酸配列番号８８を示す。
【図４５】図４５は、核酸配列番号８９およびアミノ酸配列番号９０を示す。
【図４６】図４６は、核酸配列番号９１およびアミノ酸配列番号９２を示す。
【図４７】図４７は、核酸配列番号９２およびアミノ酸配列番号９３を示す。
【図４８】図４８は、核酸配列番号９５およびアミノ酸配列番号９６を示す。
【図４９】図４９は、核酸配列番号９７およびアミノ酸配列番号９８を示す。
【図５０】図５０は、核酸配列番号９９およびアミノ酸配列番号１００を示す。
【図５１】図５１は、核酸配列番号１０１およびアミノ酸配列番号１０２を示す。
【図５２】図５２は、核酸配列番号１０３およびアミノ酸配列番号１０４を示す。
【図５３】図５３は、核酸配列番号１０５およびアミノ酸配列番号１０６を示す。
【図５４】図５４は、核酸配列番号１０７およびアミノ酸配列番号１０８を示す。
【図５５】図５５は、核酸配列番号１０９およびアミノ酸配列番号１１０を示す。
【図５６】図５６は、核酸配列番号１１１およびアミノ酸配列番号１１２を示す。
【図５７】図５７は、核酸配列番号１１３およびアミノ酸配列番号１１４を示す。
【図５８】図５８は、核酸配列番号１１５およびアミノ酸配列番号１１６を示す。
【図５９】図５９は、核酸配列番号１１７およびアミノ酸配列番号１１８を示す。
【図６０】図６０は、核酸配列番号１１９およびアミノ酸配列番号１２０を示す。
【図６１】図６１は、核酸配列番号１２１およびアミノ酸配列番号１２２を示す。
【図６２】図６２は、核酸配列番号１２３およびアミノ酸配列番号１２４を示す。
【図６３】図６３は、核酸配列番号１２５およびアミノ酸配列番号１２６を示す。
【図６４】図６４は、核酸配列番号１２７およびアミノ酸配列番号１２８を示す。
【図６５】図６５は、核酸配列番号１２９およびアミノ酸配列番号１３０を示す。
【図６６】図６６は、核酸配列番号１３１およびアミノ酸配列番号１３２を示す。
【図６７】図６７は、核酸配列番号１３３およびアミノ酸配列番号１３４を示す。
【図６８】図６８は、核酸配列番号１３５およびアミノ酸配列番号１３６を示す。
【図６９】図６９は、核酸配列番号１３７およびアミノ酸配列番号１３８を示す。
【図７０】図７０は、核酸配列番号１３９およびアミノ酸配列番号１４０を示す。
【図７１】図７１は、核酸配列番号１４１およびアミノ酸配列番号１４２を示す。
【図７２】図７２は、核酸配列番号１４３およびアミノ酸配列番号１４４を示す。
【図７３】図７３は、核酸配列番号１４５およびアミノ酸配列番号１４６を示す。
【図７４】図７４は、核酸配列番号１４７およびアミノ酸配列番号１４８を示す。
【図７５】図７５は、核酸配列番号１４９およびアミノ酸配列番号１５０を示す。
【図７６】図７６は、核酸配列番号１５１およびアミノ酸配列番号１５２を示す。
【図７７】図７７は、核酸配列番号１５３およびアミノ酸配列番号１５４を示す。
【図７８】図７８は、核酸配列番号１５５およびアミノ酸配列番号１５６を示す。
【図７９】図７９は、核酸配列番号１５７およびアミノ酸配列番号１５８を示す。
【図８０】図８０は、核酸配列番号１５９およびアミノ酸配列番号１６０を示す。
【図８１】図８１は、核酸配列番号１６１およびアミノ酸配列番号１６２を示す。
【図８２】図８２は、核酸配列番号１６３およびアミノ酸配列番号１６４を示す。
【図８３】図８３は、核酸配列番号１６５およびアミノ酸配列番号１６６を示す。
【図８４】図８４は、核酸配列番号１６７およびアミノ酸配列番号１６８を示す。
【図８５】図８５は、核酸配列番号１６９およびアミノ酸配列番号１７０を示す。
【図８６】図８６は、核酸配列番号１７１およびアミノ酸配列番号１７２を示す。
【図８７】図８７は、核酸配列番号１７３およびアミノ酸配列番号１７４を示す。
【図８８】図８８は、核酸配列番号１７５およびアミノ酸配列番号１７６を示す。
【図８９】図８９は、核酸配列番号１７７およびアミノ酸配列番号１７８を示す。
【図９０】図９０は、核酸配列番号１７９およびアミノ酸配列番号１８０を示す。
【図９１】図９１は、核酸配列番号１８１およびアミノ酸配列番号１８２を示す。
【図９２】図９２は、核酸配列番号１８３およびアミノ酸配列番号１８４を示す。
【図９３】図９３は、核酸配列番号１８５およびアミノ酸配列番号１８６を示す。
【図９４】図９４は、核酸配列番号１８７およびアミノ酸配列番号１８８を示す。
【図９５】図９５は、核酸配列番号１８９およびアミノ酸配列番号１９０を示す。
【図９６】図９６は、核酸配列番号１９１およびアミノ酸配列番号１９２を示す。
【図９７】図９７は、核酸配列番号１９３およびアミノ酸配列番号１９４を示す。
【図９８】図９８は、核酸配列番号１９５およびアミノ酸配列番号１９６を示す。
【図９９】図９９は、核酸配列番号１９７およびアミノ酸配列番号１９８を示す。
【図１００】図１００は、核酸配列番号１９９およびアミノ酸配列番号２００を示す。
【図１０１】図１０１は、核酸配列番号２０１およびアミノ酸配列番号２０２を示す。
【図１０２】図１０２は、核酸配列番号２０３およびアミノ酸配列番号２０４を示す。
【図１０３】図１０３は、核酸配列番号２０５およびアミノ酸配列番号２０６を示す。
【図１０４】図１０４は、核酸配列番号２０７およびアミノ酸配列番号２０８を示す。
【図１０５】図１０５は、核酸配列番号２０９およびアミノ酸配列番号２１０を示す。
【図１０６】図１０６は、核酸配列番号２１１およびアミノ酸配列番号２１２を示す。
【図１０７】図１０７は、核酸配列番号２１３およびアミノ酸配列番号２１４を示す。
【図１０８】図１０８は、核酸配列番号２１５およびアミノ酸配列番号２１６を示す。
【図１０９】図１０９は、核酸配列番号２１７およびアミノ酸配列番号２１８を示す。
【図１１０】図１１０は、核酸配列番号２１９およびアミノ酸配列番号２２０を示す。
【図１１１】図１１１は、核酸配列番号２２１およびアミノ酸配列番号２２２を示す。
【図１１２】図１１２は、核酸配列番号２２３およびアミノ酸配列番号２２４を示す。
【図１１３】図１１３は、核酸配列番号２２５およびアミノ酸配列番号２２６を示す。
【図１１４】図１１４は、核酸配列番号２２７およびアミノ酸配列番号２２８を示す。
【図１１５】図１１５は、核酸配列番号２２９およびアミノ酸配列番号２３０を示す。
【図１１６】図１１６は、核酸配列番号２３１およびアミノ酸配列番号２３２を示す。
【図１１７】図１１７は、核酸配列番号２３３およびアミノ酸配列番号２３４を示す。
【図１１８】図１１８は、核酸配列番号２３５およびアミノ酸配列番号２３６を示す。
【図１１９】図１１９は、核酸配列番号２３７およびアミノ酸配列番号２３８を示す。
【図１２０】図１２０は、核酸配列番号２３９およびアミノ酸配列番号２４０を示す。
【図１２１】図１２１は、核酸配列番号２４１およびアミノ酸配列番号２４２を示す。
【図１２２】図１２２は、核酸配列番号２４３およびアミノ酸配列番号２４４を示す。
【図１２３】図１２３は、核酸配列番号２４５およびアミノ酸配列番号２４６を示す。
【図１２４】図１２４は、核酸配列番号２４７およびアミノ酸配列番号２４８を示す。
【図１２５】図１２５は、核酸配列番号２４９およびアミノ酸配列番号２５０を示す。
【図１２６】図１２６は、核酸配列番号２５１およびアミノ酸配列番号２５２を示す。
【図１２７】図１２７は、核酸配列番号２５３およびアミノ酸配列番号２５４を示す。
【図１２８】図１２８は、核酸配列番号２５５およびアミノ酸配列番号２５６を示す。
【図１２９】図１２９は、核酸配列番号２５７およびアミノ酸配列番号２５８を示す。
【図１３０】図１３０は、核酸配列番号２５９およびアミノ酸配列番号２６０を示す。
【図１３１】図１３１は、核酸配列番号２６１およびアミノ酸配列番号２６２を示す。
【図１３２】図１３２は、核酸配列番号２６３およびアミノ酸配列番号２６４を示す。
【図１３３】図１３３は、核酸配列番号２６５およびアミノ酸配列番号２６６を示す。
【図１３４】図１３４は、核酸配列番号２６７およびアミノ酸配列番号２６８を示す。
【図１３５】図１３５は、核酸配列番号２６９およびアミノ酸配列番号２７０を示す。
【図１３６】図１３６は、核酸配列番号２７１およびアミノ酸配列番号２７２を示す。
【図１３７】図１３７は、核酸配列番号２７３およびアミノ酸配列番号２７４を示す。
【図１３８】図１３８は、核酸配列番号２７５およびアミノ酸配列番号２７６を示す。
【図１３９】図１３９は、核酸配列番号２７７およびアミノ酸配列番号２７８を示す。
【図１４０】図１４０は、核酸配列番号２７９およびアミノ酸配列番号２８０を示す。
【図１４１】図１４１は、核酸配列番号２８１およびアミノ酸配列番号２８２を示す。
【図１４２】図１４２は、核酸配列番号２８３およびアミノ酸配列番号２８４を示す。
【図１４３】図１４３は、核酸配列番号２８５およびアミノ酸配列番号２８６を示す。
【図１４４】図１４４は、核酸配列番号２８７およびアミノ酸配列番号２８８を示す。
【図１４５】図１４５は、核酸配列番号２８９およびアミノ酸配列番号２９０を示す。
【図１４６】図１４６は、核酸配列番号２９１およびアミノ酸配列番号２９２を示す。
【図１４７】図１４７は、核酸配列番号２９３およびアミノ酸配列番号２９４を示す。
【図１４８】図１４８は、核酸配列番号２９５およびアミノ酸配列番号２９６を示す。
【図１４９】図１４９は、核酸配列番号２９７およびアミノ酸配列番号２９８を示す。
【図１５１−１】図１５１は、配列グループの比較を示す。
【図１５１−２】図１５１は、配列グループの比較を示す。
【図１５１−３】図１５１は、配列グループの比較を示す。
【図１５１−４】図１５１は、配列グループの比較を示す。
【図１５１−５】図１５１は、配列グループの比較を示す。
【図１５１−６】図１５１は、配列グループの比較を示す。
【図１５１−７】図１５１は、配列グループの比較を示す。
【図１５１−８】図１５１は、配列グループの比較を示す。
【図１５１−９】図１５１は、配列グループの比較を示す。
【図１５１−１０】図１５１は、配列グループの比較を示す。
【図１５１−１１】図１５１は、配列グループの比較を示す。
【図１５２−１】図１５２は、全長クローンの並列を例示する。
【図１５２−２】図１５２は、全長クローンの並列を例示する。
【図１５２−３】図１５２は、全長クローンの並列を例示する。
【図１５２−４】図１５２は、全長クローンの並列を例示する。
【図１５２−５】図１５２は、全長クローンの並列を例示する。
【図１５３】図１５３は、ＰＣＲによるチトクロムｐ４５０ ｃＤＮＡのクローニングに用いた方法を示す。
【実施例】
【００６０】
（実施例１）
植物組織の発育およびエチレン処理
植物栽培
植物の種子を植木鉢に蒔き、そして温室で４週間栽培した。４週齢の苗を個々の植木鉢に移植し、そして温室で２ヶ月栽培した。栽培中、植物に１日２回、１５０ｐｐｍ ＮＰＫ肥料を含有する水を与えた。広がった緑の葉を植物から分離して、以下に記載するエチレン処理を行った。
【００６１】
細胞株７８３７９
ケンタッキー大学から譲渡されたバレー種タバコ系統であるタバコ系統７８３７９を、植物材料の供給源として用いた。当該技術分野における標準のように、１００の植物を栽培し、そして移植して、そして別個の番号（１〜１００）でタグ付けした。推奨されるように、受精およびフィールド管理を行った。
【００６２】
１００の植物の４分の３が、ニコチンの２０〜１００％をノルニコチンに変換した。１００の植物の４分の１が、ニコチンの５％未満をノルニコチンに変換した。８７番の植物が最低の変換を有し（２％）、一方、２１番の植物が１００％の変換を有した。３％未満を変換する植物を非変換系統と分類した。８７番の植物および２１番の植物の自家受粉種子とともに交雑（２１ｘ８７および８７ｘ２１）種子を作成して、遺伝子相違および表現型相違を研究した。２１番の自家受粉由来の植物は変換系統であり、そして８７番の自家受粉由来の９９％が非変換系統であった。８７番由来の植物の残り１％は、低変換（５〜１５％）を示した。相互交雑由来の植物は、すべて変換系統であった。
【００６３】
細胞株４４０７
バレー種系統であるタバコ属系統４４０７を植物材料の供給源として用いた。均質でそして代表的な植物（１００）を選択し、そしてタグ付けした。１００の植物のうち９７が非転換系統であり、そして３つが変換系統であった。５６番の植物が最小量の変換を有し（１．２％）、そして５８番の植物が最高レベルの変換を有した（９６％）。これらの２つの植物を用いて、自家受粉種子および交雑種子を作成した。
【００６４】
５８番の自家受粉由来の植物は、変換系統対非変換系統比３：１に分かれた。５８−３３および５８−２５の植物が、それぞれ、ホモ接合体変換植物系統および非変換植物系統と同定された。次世代の子孫を解析することによって、５８−３３が安定変換系統であることが確認された。
【００６５】
細胞株ＰＢＬＢ０１
ＰＢＬＢ０１は、ＰｒｏｆｉＧｅｎ， Ｉｎｃ．に開発されたバレー種系統であり、そ
してこれを植物材料の供給源として用いた。ＰＢＬＢ０１の原種（ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）種子から、変換系統植物を選択した。
【００６６】
エチレン処理法
温室で２〜３ヶ月栽培した植物から緑の葉を分離し、そして０．３％のエチレン溶液（調製商標、エテフォン（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ））をスプレーした。スプレーした葉を各々、加湿器を備えた養生ラックに吊るし、そしてプラスチックで覆った。処理中、試料の葉に定期的にエチレン溶液をスプレーした。エチレン処理のおよそ２４〜４８時間後、ＲＮＡ抽出のため、葉を収集した。代謝構成要素解析のため、別の下位試料を採取して、葉の代謝産物、および多様なアルカロイドなどのより具体的な目的の構成要素の濃度を測定した。
【００６７】
例えば、以下のようにアルカロイド分析を行うことも可能である。試料（０．１ｇ）を、０．５ｍｌの２Ｎ ＮａＯＨ、並びに内部標準としてのキノリン、およびメチルｔ−ブチルエーテルを含有する５ｍｌの抽出溶液とともに、１５０ｒｐｍで振盪した。ＦＩＤ検出装置を備えたＨＰ６８９０ＧＣ上で試料を分析した。検出装置および注入装置には、２５０℃の温度を用いた。１分あたり１０℃、１１０〜１８５℃の温度勾配で、５％フェノールおよび９５％メチルシリコンで架橋した融解石英からなるＨＰカラム（３０ｍ−０．３２ｎｍ−１ｍ）を用いた。キャリアーガスとしてヘリウムを用いて、１００℃、流速１．７ｃｍ３／分、４０：１の分割比、２・１注入体積で、カラムを操作した。
【００６８】
（実施例２）
ＲＮＡ単離
ＲＮＡ抽出のため、２ヶ月齢の温室栽培植物の中央部の葉を、記載するようにエチレン処理した。０時間および２４〜４８時間の試料をＲＮＡ抽出に用いた。いくつかの場合、花頭除去１０日後の植物から、老化過程にある葉の試料を採取した。これらの試料もまた、抽出に用いた。製造者のプロトコルにしたがって、Ｒｎｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ， Ｉｎｃ．、カリフォルニア州バレンシア）を用い、総ＲＮＡを単離した。
【００６９】
液体窒素下で、ＤＥＰＣ処理した乳鉢および乳棒を用いて、組織試料を細かい粉末にすりつぶした。すりつぶした組織およそ１００ミリグラムを、滅菌１．５ｍｌエッペンドルフ試験管に移した。すべての試料を収集し終わるまで、この試料試験管を液体窒素中に入れた。次いで、キットに提供される緩衝液ＲＬＴ ４５０μｌ（メルカプトエタノールを添加したもの）を個々の各試験管に添加した。試料を激しくボルテックスし、そして５６℃で３分間インキュベーションした。次いで、２ｍｌ収集試験管に入れたＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒＴＭスピンカラムに溶解物を適用し、そして最大速度で２分間遠心分離した。フロースルーを収集し、そして透明な溶解物に０．５体積のエタノールを添加した。試料をよく混合し、そして２ｍｌ収集試験管に入れたＲｎｅａｓｙ（登録商標）ミニスピンカラムに移した。試料を１０，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。次に、７００μｌの緩衝液ＲＷ１をＲｎｅａｓｙ（登録商標）カラム上にピペッティングし、そして１０，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。緩衝液ＲＰＥを新しい収集試験管中のＲｎｅａｓｙ（登録商標）カラム上にピペッティングし、そして１０，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。緩衝液ＲＰＥを再びＲｎｅａｓｙ（登録商標）スピンカラム上に添加し、そして最大速度で２分間遠心分離して、膜を乾燥させた。エタノールのキャリー・オーバーをすべて取り除くため、別個の収集試験管中に膜を入れ、そして最大速度でさらに１分間遠心分離した。Ｒｎｅａｓｙ（登録商標）カラムを新しい１．５ｍｌ収集試験管に移し、そして４０μｌのＲｎａｓｅ不含水を、Ｒｎｅａｓｙ（登録商標）膜上に直接ピペッティングした。この最終溶出液試験管を１０，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。変性ホルムアルデヒドゲルおよび分光光度計によって、総ＲＮＡの品質および量を解析した。
【００７０】
製造者のプロトコルにしたがって、ＯｌｉｇｏｔｅｘＴＭポリＡ＋ ＲＮＡ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．）を用いてポリ（Ａ）ＲＮＡを単離した。最大体積２５０μｌ中、約２００μｇの総ＲＮＡを用いた。２５０μｌの体積の緩衝液ＯＢＢおよび１５μｌのＯｌｉｇｏｔｅｘＴＭ懸濁物を２５０μｌの総ＲＮＡに添加した。ピペッティングによって内容物を完全に混合し、そして加熱ブロック上、７０℃で３分間インキュベーションした。次いで、試料をおよそ２０分間室温に置いた。最大速度で２分間遠心分離することによって、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ：ｍＲＮＡ複合体をペレットにした。５０μｌを残してすべての上清を微量遠心管から取り除いた。ＯＢＢ緩衝液によって試料をさらに処理した。ボルテックスによって、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ：ｍＲＮＡペレットを４００μｌの緩衝液ＯＷ２に再懸濁した。新しい試験管に入れた小さいスピンカラム上にこの混合物を移して、そして最大速度で１分間遠心分離した。スピンカラムを新しい試験管に移して、そしてさらに４００μｌの緩衝液ＯＷ２をカラムに添加した。次いで、試験管を最大速度で１分間遠心分離した。スピンカラムを最後の１．５ｍｌ微量遠心管に移した。６０μｌの熱い（７０℃）緩衝液ＯＥＢで試料を溶出した。変性ホルムアルデヒドゲルおよび分光光度解析によって、ポリＡ産物を解析した。
【００７１】
（実施例３）
逆転写−ＰＣＲ
製造者のプロトコル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）にしたがってＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素を用いて、第一鎖ｃＤＮＡを産生した。ポリＡ＋濃縮ＲＮＡ／オリゴｄＴプライマー混合物は、５μｇ未満の総ＲＮＡ、１μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ混合物、１μｌのオリゴｄ（Ｔ）１２−１８（０．５μｇ／μｌ）、および１０μｌまでのＤＥＰＣ処理水からなった。各試料を６５℃で５分間インキュベーションし、次いで氷上に少なくとも１分間置いた。以下の構成要素の各々を順番に添加することによって、反応混合物を調製した：２μｌの１０ｘＲＴ緩衝液、４μｌの２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２μｌの０．１Ｍ ＤＴＴ、および１μｌのＲＮａｓｅ ＯＵＴ組換えＲＮａｓｅ阻害剤。９μｌの反応混合物を各ＲＮＡ／プライマー混合物にピペッティングして添加し、そして穏やかに混合した。これを４２℃で２分間インキュベーションし、そして１μｌのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＴＭ ＲＴを各試験管に添加した。試験管を４２℃で５０分間インキュベーションした。７０℃で１５分間処理して反応を終結させ、そして氷上で冷却した。遠心分離によって試料を収集し、そして１μｌのＲＮａｓｅ Ｈを各試験管に添加し、そして３７℃で２０分間インキュベーションした。２００ｐｍｏｌの順方向プライマー（図７５、配列番号１４９〜１５６に示すような縮重プライマー）および１００ｐｍｏｌの逆方向プライマー（１８ｎｔオリゴｄ（Ｔ）の後に１つのランダム塩基が続く混合物）を用いて、第二のＰＣＲを行った。
【００７２】
反応条件は、９４℃で２分間であり、そして次いで９４℃１分間、４５℃〜６０℃２分間、７２℃３分間の４０サイクルのＰＣＲを行い、７２℃でさらに１０分間伸長を行った。
【００７３】
１％アガロースゲルを用いた電気泳動によって、１０μｌの増幅試料を解析した。アガロースゲルから正しいサイズの断片を精製した。
【００７４】
（実施例４）
ＰＣＲ断片集団の生成
製造者の指示にしたがって、実施例３由来のＰＣＲ断片をｐＧＥＭ−Ｔ（登録商標）Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）に連結した。連結した産物をＪＭ１０９コンピテント細胞に形質転換し、そしてブルー／ホワイトセレクションのため、ＬＢ培地プレート上に蒔いた。コロニーを選択し、そして１．２ｍｌのＬＢ培地
を含む９６ウェルプレート中で３７℃で一晩増殖させた。すべての選択されるコロニーに関して、凍結ストックを生成した。Ｗｉｚａｒｄ ＳＶ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ（登録商標）キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）とともに、ＢｅｃｋｍａｎのＢｉｏｍｅｃｋ ２０００ミニプレップ・ロボットを用いて、プレートからプラスミドＤＮＡを精製した。１００μｌの水でプラスミドＤＮＡを溶出し、そして９６ウェルプレート中に保存した。ＥｃｏＲ１でプラスミドを消化し、そして１％アガロースゲルを用いて解析して、ＤＮＡ量および挿入物のサイズを確認した。ＣＥＱ ２０００配列決定装置（Ｂｅｃｋｍａｎ、カリフォルニア州フラートン）を用いて、４００〜６００ｂｐの挿入物を含有するプラスミドの配列を決定した。ＢＬＡＳＴ検索によって、ＧｅｎＢａｎｋデータベースと該配列を並列した。ｐ４５０関連断片を同定し、そしてさらに解析した。あるいは、サブトラクション・ライブラリーからｐ４５０断片を単離した。これらの断片もまた、上述のように解析した。
【００７５】
（実施例５）
ｃＤＮＡライブラリーの構築
以下のように、エチレン処理した葉から、総ＲＮＡを調製することによって、ｃＤＮＡライブラリーを構築した。まず、修飾した酸フェノールおよびクロロホルム抽出プロトコルを用いて、タバコ系統５８−３３のエチレン処理した葉から、総ＲＮＡを抽出した。１グラムの組織を用いて、これをすりつぶし、そして続いて５ｍｌの抽出緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５；２００ｍＭ ＮａＣｌ；１０ｍＭ ＥＤＴＡ；０．５％ＳＤＳ）中でボルテックスし、これに５ｍｌのフェノール（ｐＨ５．５）および５ｍｌのクロロホルムを添加するように、プロトコルを修飾した。抽出した試料を遠心分離し、そして上清を取り置いた。上清が透明に見えるようになるまで、この抽出工程をさらに２〜３回反復した。およそ５ｍｌのクロロホルムを添加して、微量のフェノールを取り除いた。３倍体積のＥｔＯＨおよび１／１０体積の３Ｍ ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）を添加し、そして−２０℃に１時間保存することによって、合わせた上清分画からＲＮＡを沈殿させた。Ｃｏｒｅｘガラス容器に移した後、ＲＮＡ分画を、４℃、９，０００ＲＰＭで４５分間遠心分離した。ペレットを７０％エタノールで洗浄し、そして４℃、９，０００ＲＰＭで５分間回転させた。ペレットを乾燥させた後、ペレットにしたＲＮＡを０．５ｍｌ
ＲＮａｓｅ不含水に溶解した。ペレットにしたＲＮＡを０．５ｍｌ ＲＮａｓｅ不含水に溶解した。変性ホルムアルデヒドゲルおよび分光光度計によって、それぞれ、総ＲＮＡの品質および量を解析した。
【００７６】
以下のプロトコルによって、オリゴ（ｄＴ）セルロース・プロトコル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および微量遠心分離装置スピンカラム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ポリＡ＋ ＲＮＡに関して、生じた総ＲＮＡを単離した。およそ２０ｍｇの総ＲＮＡを、２回の精製に供して、高品質のポリＡ＋ ＲＮＡを得た。ｍＲＮＡが高品質であることを確実にするため、変性ホルムアルデヒドゲル、そして続いて既知の全長遺伝子のＲＴ−ＰＣＲを行うことによって、ポリＡ＋ ＲＮＡ産物を解析した。
【００７７】
次に、ポリＡ＋ ＲＮＡをテンプレートとして用いて、ｃＤＮＡ合成キット、ＺＡＰ−ｃＤＮＡ（登録商標）合成キット、およびＺＡＰ−ｃＤＮＡ（登録商標）Ｇｉｇａｐａｃｋ（登録商標）ＩＩＩゴールド・クローニングキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホヤ）を使用して、ｃＤＮＡライブラリーを産生した。方法は、明記するような以下の製造者のプロトコルを含んだ。およそ８μｇのポリＡ＋ ＲＮＡを用いて、ｃＤＮＡライブラリーを構築した。一次ライブラリーの解析によって、約２．５ｘ１０６〜１ｘ１０７ｐｆｕであることが明らかになった。ＩＰＴＧおよびＸ−ｇａｌを用いた補完アッセイによって、ライブラリーの品質バックグラウンド試験を完了し、ここで組換えプラークは、バックグラウンド反応より１００倍を超えて発現していた。
【００７８】
ランダムＰＣＲによる、ライブラリーのより定量的な解析によって、挿入ｃＤＮＡの平
均サイズがおよそ１．２ｋｂであることが示された。該方法は、以下のような２工程ＰＣＲ法を用いた。第一の工程のため、ｐ４５０断片から得た予備的配列情報に基づいて、逆プライマーを設計した。設計した逆方向プライマーおよびＴ３（順方向）プライマーを用いて、ｃＤＮＡライブラリーから、対応する遺伝子を増幅した。ＰＣＲ反応をアガロース電気泳動に供して、そして高分子量の対応するバンドを切り出し、精製し、クローニングし、そして配列決定した。第二の工程において、ｐ４５０の５’ＵＴＲまたは開始コード領域から順方向プライマーとして設計した新規プライマーを、逆方向プライマー（ｐ４５０の３’ＵＴＲから設計）とともに、続くＰＣＲで用いて、全長ｐ４５０クローンを得た。
【００７９】
逆方向プライマーを除いて、実施例３に記載するように構築したｃＤＮＡライブラリーから、ＰＣＲ増幅によって、ｐ４５０断片を生成した。プラスミド上でｃＤＮＡ挿入物（図７５を参照されたい）の下流に位置するＴ７プライマーを逆方向プライマーとして用いた。実施例４に記載するように、ＰＣＲ断片を単離し、クローニングし、そして配列決定した。
【００８０】
構築したｃＤＮＡライブラリーから、ＰＣＲ法によって、全長ｐ４５０遺伝子を単離した。遺伝子特異的逆方向プライマー（ｐ４５０断片の下流配列から設計）および順方向プライマー（ライブラリープラスミド上のＴ３）を用いて、全長遺伝子をクローニングした。ＰＣＲ断片を単離し、クローニングし、そして配列決定した。必要であれば、第二の工程のＰＣＲを適用した。第二の工程において、クローニングしたｐ４５０の５’ＵＴＲから設計した新規順方向プライマーとともに、ｐ４５０クローンの３’ＵＴＲから設計した逆方向プライマーを、続くＰＣＲ反応で用いて、全長ｐ４５０クローンを得た。続いてクローンの配列を決定した。
【００８１】
（実施例６）
クローニングした断片の性質決定−逆サザンブロッティング解析
上記実施例で同定したｐ４５０クローンすべてに対して、非放射性大規模逆サザンブロッティングアッセイを行って、示差発現を検出した。異なるｐ４５０クラスターの間で発現レベルが非常に異なることが観察された。高発現のものに対して、さらなるリアルタイム検出を行った。
【００８２】
非放射性サザンブロッティング法を以下のように行った。
１）実施例２に記載するように、Ｑｉａｇｅｎ Ｒｎａｅａｓｙキットを用いて、エチレン処理および非処理変換系統（５８−３３）および非変換系統（５８−２５）の葉から総ＲＮＡを抽出した。
【００８３】
２）上記工程で生成したポリＡ＋濃縮ＲＮＡ由来の一本鎖ｃＤＮＡをビオチン−テール標識することによって、プローブを産生した。ビオチン化オリゴｄＴをプライマーとして（Ｐｒｏｍｅｇａ）用いることを除いて、実施例３に記載するように、変換系統および非変換系統総ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって、この標識一本鎖ｃＤＮＡを生成した。これらをプローブとして用いて、クローニングしたＤＮＡとハイブリダイズさせた。
【００８４】
３）プラスミドＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲ１で消化して、そしてアガロースゲル上で泳動した。ゲルを乾燥させて、そして同時に２つのナイロン膜にトランスファーした（Ｂｉｏｄｙｎｅ Ｂ（登録商標））。一方の膜を変換系統プローブとハイブリダイズさせ、そして他方を非変換系統プローブとハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション前に、膜をＵＶ架橋した（自動架橋セッティング、２５４ｎｍ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ）。
【００８５】
あるいは、ｐ−ＧＥＭプラスミドの両方のアームに位置する配列、Ｔ３およびＳＰ６をプライマーとして用いて、各プラスミドから挿入物をＰＣＲ増幅した。９６ウェルＲｅａｄｙ−ｔｏ−ｒｕｎアガロースゲル上で泳動することによって、ＰＣＲ産物を解析した。確認した挿入物を２つのナイロン膜上にドットした。一方の膜を変換系統プローブとハイブリダイズさせ、そして他方を非変換プローブとハイブリダイズさせた。
【００８６】
４）洗浄ストリンジェンシーを修飾し、製造者の指示にしたがって、膜をハイブリダイズさせ、そして洗浄した（Ｅｎｚｏ ＭａｘＳｅｎｃｅＴＭキット、Ｅｎｚｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， Ｉｎｃ、ニューヨーク州ファーミンデール）。膜を、ハイブリダイゼーション緩衝液（界面活性剤およびハイブリダイゼーション増進剤を含有する、２ｘＳＳＣ緩衝ホルムアミド）と４２℃で３０分間プレハイブリダイズさせ、そして１０μｌ変性プローブと４２℃で一晩ハイブリダイズさせた。次いで、膜を１ｘハイブリダイゼーション洗浄緩衝液で、室温で１０分間１回洗浄し、そして６８℃で１５分間４回洗浄した。膜の検出準備が出来た。
【００８７】
５）製造者の検出法に記載されるように（Ｅｎｚｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， Ｉｎｃ．）、アルカリホスファターゼ標識、その後、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ比色検出によって、洗浄した膜を検出した。１ｘブロッキング溶液を用いて、膜を室温で１時間ブロッキングし、１ｘ検出試薬で１０分間３回洗浄し、１ｘ現像前反応緩衝液で５分間２回洗浄し、そして次いで、ドットが現れるまで、現像溶液中でブロットを３０〜４５分間現像した。すべての試薬は、製造者（Ｅｎｚｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， Ｉｎｃ）に提供された。さらに、製造者の指示にしたがって、ＫＰＬサザンハイブリダイゼーションおよび検出キットＴＭ（ＫＰＬ、メリーランド州ガイザーズバーグ）を用いてもまた、大規模逆サザンアッセイを行った。
【００８８】
（実施例７）
クローンの性質決定−ノーザンブロット解析
サザンブロット解析の代わりに、ノーザンブロッティングアッセイの例に記載されるように、いくつかの膜をハイブリダイズさせ、そして検出した。以下のように、ノーザンハイブリダイゼーションを用いて、タバコ属において、示差発現されるｍＲＮＡを検出した。
【００８９】
ランダムプライミング法を用いて、クローニングしたｐ４５０からプローブを調製した（ＭｅｇａｐｒｉｍｅＴＭ ＤＮＡ標識系、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。
【００９０】
以下の構成要素を混合した：２５ｎｇ変性ＤＮＡテンプレート；各４μｌの非標識ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰ；５μｌの反応緩衝液；Ｐ３２−標識ｄＡＴＰおよび２μｌのクレノウＩ；並びに反応を５０μｌにするＨ２Ｏ。混合物を３７℃で１〜４時間インキュベーションし、次いで２μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡで反応を停止した。使用前にプローブを９５℃で５分間インキュベーションすることによって、変性させた。
【００９１】
いくつかの対のタバコ系統の新鮮なエチレン処理葉および非処理葉から、ＲＮＡ試料を調製した。いくつかの場合、ポリＡ＋濃縮ＲＮＡを用いた。およそ１５μｇの総ＲＮＡまたは１．８μｇのｍＲＮＡ（実施例５に記載するようなＲＮＡおよびｍＲＮＡ抽出法）をＤＥＰＣ Ｈ２Ｏ（５〜１０μｌ）で等体積にした。同体積の装填緩衝液（１ｘＭＯＰＳ；１８．５％ホルムアルデヒド；５０％ホルムアミド；４％ Ｆｉｃｏｌｌ４００；ブロモフェノールブルー）および０．５μｌ ＥｔＢｒ（０．５μｇ／μｌ）を添加した。続いて、電気泳動によってＲＮＡを分離するため、調製物中の試料を変性させた。
【００９２】
１ｘＭＯＰ緩衝液（０．４Ｍモルホリノプロパンスルホン酸；０．１Ｍ Ｎａ−酢酸−３ｘＨ２Ｏ；１０ｍＭ ＥＤＴＡ；ＮａＯＨでｐＨ７．２に調整）を用いて、ホルムアルデヒドゲル（１％アガロース、１ｘＭＯＰＳ、０．６Ｍホルムアルデヒド）上で、試料を電気泳動に供した。１０ｘＳＳＣ緩衝液（１．５Ｍ ＮａＣｌ；０．１５Ｍクエン酸ナトリウム）中で２４時間キャピラリー法を行うことによって、ＲＮＡをＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋膜（ナイロン、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）にトランスファーした。ＲＮＡ試料を含む膜を、ハイブリダイゼーション前にＵＶ架橋した（自動架橋セッティング、２５４ｎｍ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ）。
【００９３】
膜を、５〜１０ｍｌのプレハイブリダイゼーション緩衝液（５ｘＳＳＣ；５０％ホルムアミド；５ｘデンハルト溶液；１％ ＳＤＳ；１００μｇ／ｍｌ熱変性剪断非相同ＤＮＡ）と４２℃で１〜４時間プレハイブリダイズさせた。古いプレハイブリダイゼーション緩衝液を廃棄し、そして新しいプレハイブリダイゼーション緩衝液およびプローブを添加した。ハイブリダイゼーションを４２℃で一晩行った。２ｘＳＳＣで膜を室温で１５分間洗浄し、次いで２ｘＳＳＣで洗浄した。
【００９４】
本発明の主要な焦点は、エチレン処理の結果誘導可能であるか、またはタバコ葉の品質および構成要素に重要な役割を果たすことも可能な、新規遺伝子の発見であった。以下の表に例示するように、ノーザンブロットおよび逆サザンブロットは、非誘導植物に比較して、どの遺伝子がエチレン処理によって誘導されたのかを決定するのに有用であった。興味深いことに、変換系統および非変換系統で、すべての断片が同様に影響を受けるのではなかった。注目されるチトクロムｐ４５０断片を部分的に配列決定して、構造的関連性を決定した。この情報を用いて、注目される全長遺伝子クローンを続いて単離し、そして性質決定した。
【００９５】
【表１】
【００９６】
エチレン処理で誘導した、変換および非変換バレー種系統から得たタバコ組織に対して、全長クローンを用いて、ノーザン解析を行った。目的は、エチレン誘導非変換バレー種系統に比較して、エチレン誘導変換系統に比較して、エチレン誘導変換系統で発現上昇を示す全長クローンを同定することであった。そうすることによって、変換系統および非変換系統間の葉構成要素の生化学的相違を比較することにより、全長クローンの機能的関係を決定することも可能である。以下の表に示すように、＋で示す非変換系統エチレン処理
組織のものより、変換系統エチレン処理組織において、＋＋および＋＋＋で示すように、６つのクローンが有意により高い発現を示した。これらのクローンはすべて、エチレン処理しない変換系統および非変換系統で、ほとんどまたはまったく発現を示さなかった。
【００９７】
【表２】
【００９８】
（実施例８）
クローニングした遺伝子にコードされるｐ４５０の免疫検出
３つのｐ４５０クローンから、１）他のクローンに対してより低い相同性を有するかまたはまったく相同性を持たず、そして２）優れた親水性および抗原性を有する、長さ２０〜２２アミノ酸に対応するペプチド領域を選択した。それぞれのｐ４５０クローンから選択したペプチド領域のアミノ酸配列を以下に列挙する。合成したペプチドをＫＨＬとコンジュゲート化し、そして次いでウサギに注射した。第４回の注射の２週間後および４週間後に抗血清を収集した（Ａｌｐｈａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｔｌ． Ｉｎｃ．、テキサス州サンアントニオ）。
【００９９】
Ｄ２３４−ＡＤ１ ＤＩＤＧＳＫＳＫＬＶＫＡＨＲＫＩＤＥＩＬＧ
Ｄ９０ａ−ＢＢ３ ＲＤＡＦＲＥＫＥＴＦＤＥＮＤＶＥＥＬＮＹ
Ｄ８９−ＡＢ１ ＦＫＮＮＧＤＥＤＲＨＦＳＱＫＬＧＤＬＡＤＫＹ
ウェスタンブロット解析によって、タバコ植物組織由来のタンパク質を標的とする交差反応性に関して、抗血清を調べた。エチレン処理した（０〜４０時間）、変換系統および非変換系統の中央部の葉から、未精製タンパク質抽出物を得た。製造者のプロトコルにしたがって、ＲＣ ＤＣタンパク質アッセイキット（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いて、抽出物のタンパク質濃度を測定した。
【０１００】
各レーンに２マイクログラムのタンパク質を装填し、そしてＬａｅｍｍｌｉ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ系を用いて、１０％〜２０％勾配ゲル上でタンパク質を分離した。Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ（登録商標）セミドライセル（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いて、ＰＲＯＴＲＡＮ（登録商標）ニトロセルロース・トランスファー膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ）にゲルからタンパク質をトランスファーした。ＥＣＬ ＡｄｖａｎｃｅＴＭウェスタンブロッティング検出キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、標的ｐ４５０タンパク質を検出し、そして視覚化した。ウサギにおいて、合成ＫＬＨコンジュゲートに対する一次抗体を作成した。ペルオキシダーゼとカップリングした、ウサギＩｇＧに対する二次抗体をＳｉｇｍａから購入した。一次抗体および二次抗体のどちらも、１：１０００希釈で用いた。抗体は、ウェスタンブロット上で、単一のバンドに強い反応性を示し、抗血清が、目的の標的ペプチドに単一特異的であることを示した。抗血清はまた、ＫＬＨにコンジュゲート化した合成ペプチドとも交差反応性であった。
【０１０１】
（実施例９）
単離核酸断片の核酸同一性および構造関連性
ノーザンブロット解析と組み合わせて、クローニングした１００を超えるｐ４５０断片を配列決定して、構造的関連性を決定した。用いたアプローチは、ｐ４５０遺伝子のカルボキシル末端近くに位置する２つの一般的なｐ４５０モチーフのいずれかに基づく順方向プライマーを利用した。順方向プライマーは、図１に示すような、チトクロムｐ４５０モチーフＦＸＰＥＲＦまたはＧＲＲＸＣＰ（Ａ／Ｇ）に相当した。逆方向プライマーは、プラスミド、ｐＧＥＭＴＭプラスミドの両方のアーム上に位置するＳＰ６またはＴ７、あるいはポリＡテールのいずれか由来の、標準的プライマーを用いた。用いたプロトコルを以下に記載する。
【０１０２】
分光光度測定を用い、製造者のプロトコル（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）にしたがって、出発二本鎖ＤＮＡの濃度を概算した。テンプレートを水で適切な濃度に希釈し、９５℃で２分間加熱し、そして続いて氷上に置くことによって変性させた。０．５〜１０μｌの変性ＤＮＡテンプレート、２μｌの１．６ｐｍｏｌ順方向プライマー、８μｌのＤＴＣＳクイックスタートマスターミックス、および総体積を２０μｌにする水を用いて、配列決定反応物を氷上で調製した。熱周期プログラムは、３０サイクルの以下の周期からなった：９６℃２０秒間、５０℃２０秒間、および６０℃４分間、その後、４℃で維持。
【０１０３】
５μｌの反応停止緩衝液（等体積の３Ｍ ＮａＯＡｃおよび１００ｍＭ ＥＤＴＡ、並びに１μｌの２０ｍｇ／ｍｌグリコーゲン）を添加することによって、配列決定反応を停止した。６０μｌの冷９５％エタノールで試料を沈殿させ、そして６０００ｇで６分間遠心分離した。エタノールを廃棄した。ペレットを２００μｌの冷７０％エタノールで２回洗浄した。ペレットを乾燥させた後、４０μｌのＳＬＳ溶液を添加し、そしてペレットを再懸濁した。ミネラルオイルの層を重層した。次いで、さらに解析するため、試料をＣＥＱ ８０００自動化配列決定装置に入れた。
【０１０４】
核酸配列を検証するため、ｐ４５０遺伝子のＦＸＰＥＲＦまたはＧＲＲＸＣＰ（Ａ／Ｇ）領域に対する順方向プライマー、あるいはプラスミドまたはポリＡテールいずれかに対する逆方向プライマーを用いて、核酸配列を、両方向に再配列決定した。すべての配列決定を、両方向に、少なくとも２回行った。
【０１０５】
チトクロムｐ４５０断片の核酸配列を、ＧＲＲＸＣＰ（Ａ／Ｇ）モチーフをコードする領域の後の最初の核酸から停止コドンまでに対応するコード領域で、互いに比較した。この領域を、ｐ４５０タンパク質間の遺伝子多様性の指標として選択した。他の植物種と同様、多数の遺伝的に別個のｐ４５０遺伝子が７０遺伝子を超えて観察された。核酸配列の比較に際して、配列同一性に基づいて、遺伝子を別個の配列グループに入れることが可能であることが見出された。ｐ４５０メンバーの最適なユニークなグループ分けが、７５％以上の核酸同一性を持つ配列であると決定されることが見出された（表Ｉに示す）。同一性パーセントを減少させると、有意により大きいグループとなった。８１％以上の核酸同一性を持つ配列に関して、好ましいグループ分けが観察され、より好ましいグループ分けは９１％以上の核酸同一性のものであり、そして最も好ましいグループ分けは９９％以上の核酸同一性の配列であった。グループの大部分は少なくとも２つのメンバーを含有し、そしてしばしば３以上のメンバーを含有した。他のものは反復して発見されず、ここで取ったアプローチが、用いた組織で低発現されるｍＲＮＡおよび高発現されるｍＲＮＡの両方を単離可能であったことが示唆される。
【０１０６】
７５％以上の核酸同一性に基づいて、２つのチトクロムｐ４５０グループが、グループ内にあるものとは遺伝的に異なる、先のタバコ・チトクロム遺伝子に核酸配列同一性を含有することが見出された。グループ２３は、表Ｉに用いたパラメーター内で、それぞれＣｚｅｒｎｉｃらおよびＲａｌｓｔｏｎらによる、ＧＩ：１１７１５７９（ＣＡＡ６４６３５）およびＧＩ：１４４２３３２７（またはＡＡＫ６２３４６）の先のＧｅｎＢａｎｋ配列に、核酸同一性を示した。ＧＩ：１１７１５７９は、グループ２３のメンバーに、９６．９％〜９９．５％の範囲の核酸同一性を示し、一方、ＧＩ：１４４２３３２７は、このグループに、９５．４％〜９６．９％の範囲の同一性を有した。グループ３１のメンバーは、ＲａｌｓｔｏｎらによるＧＩ：１４４２３３１９（ＡＡＫ６２３４２）のＧｅｎＢａｎｋに報告された配列に、７６．７％〜９７．８％の範囲の核酸同一性を示した。表１の他のｐ４５０同一性グループはいずれも、Ｒａｌｓｔｏｎら、Ｃｚｅｒｎｉｃら、Ｗａｎｇら、またはＬａＲｏｓａおよびＳｍｉｇｏｃｋｉに報告されるタバコ属ｐ４５０遺伝子に、表１で用いたようなパラメーター同一性を含有しなかった。
【０１０７】
図７６に示すように、グループに関して、適切な核酸縮重プローブとともにコンセンサス配列を得て、タバコ属植物からの各グループのさらなるメンバーを優先的に同定し、そして単離することも可能である。
【０１０８】
【表３−１】
【０１０９】
【表３−２】
【０１１０】
（実施例１０）
単離核酸断片の関連アミノ酸配列同一性
実施例８由来のチトクロムｐ４５０断片に関して得た核酸配列のアミノ酸配列を推定した。推定した領域は、ＧＸＲＸＣＰ（Ａ／Ｇ）配列モチーフの直後のアミノ酸からカルボキシル末端の終わり、または停止コドンまでに相当した。断片の配列同一性の比較に際して、７０％以上のアミノ酸同一性を持つ配列に関して、ユニークなグループ分けが観察された。８０％以上のアミノ酸同一性を持つ配列に関して、好ましいグループ分けが観察され、より好ましいグループ分けは９０％以上のアミノ酸同一性のものであり、そして最も好ましいグループ分けは９９％以上のアミノ酸同一性の配列であった。グループおよびグループメンバーの対応するアミノ酸配列を図２に示す。ユニークな核酸配列のいくつかは、他の断片と完全なアミノ酸同一性を有することが見出され、そしてしたがって、同一アミノ酸を持つ１つのメンバーのみが報告された。
【０１１１】
表ＩＩのグループ１９のアミノ酸同一性は、核酸配列に基づいて、３つの別個のグループに対応した。各グループメンバーのアミノ酸配列およびその同一性を図７７に示す。アミノ酸相違に適切に印を付ける。
【０１１２】
遺伝子クローニングおよび植物を用いた機能研究のため、各アミノ酸同一性グループの少なくとも１つのメンバーを選択した。さらに、ノーザンおよびサザン解析によって評価されるように、エチレン処理または他の生物学的相違によって異なって影響を受けるグループメンバーを、遺伝子クローニングおよび機能研究のため、選択した。遺伝子クローニング、発現研究および全植物評価を補助するため、配列同一性および示差配列に関して、ペプチド特異的抗体が調製されるであろう。
【０１１３】
【表４−１】
【０１１４】
【表４−２】
【０１１５】
（実施例１１）
全長クローンの関連アミノ酸配列同一性
実施例５でクローニングした全長タバコ属遺伝子の核酸配列を、全アミノ酸配列に関して推定した。チトクロムｐ４５０遺伝子は、３つの保存されるｐ４５０ドメインモチーフの存在によって同定され、該モチーフは、カルボキシル末端のＵＸＸＲＸＸＺ、ＰＸＲＦＸＦまたはＧＸＲＸＣ、ここでＵはＥまたはＫであり、Ｘはアミノ酸いずれかであり、そしてＺはＰ、Ｔ、ＳまたはＭである、に対応した。クローンのうち２つ、Ｄ１３０−ＡＡ１およびＤ１０１−ＢＡ２は、ほぼ完全であるようだったが、適切な停止コドンを欠き、しかしどちらも３つのｐ４５０チトクロムドメインすべてを含有した。ＢＬＡＳＴプログラムを用いて、全長配列を互いに、そして既知のタバコ遺伝子に比較して、ｐ４５０遺伝子すべてをアミノ酸同一性に関して性質決定した。該プログラムは、ＮＣＢＩ特別ＢＬＡＳＴツール（２配列並列（ｂ１２ｓｅｑ）、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｂｌ２．ｈｔｍｌ）を用いた。核酸配列に関してはフィルターをかけずにＢＬＡＳＴＮで、そしてアミノ酸配列に関してはＢＬＡＳＴＰで、２つの配列を並列させた。アミノ酸同一性パーセントに基づいて、各配列を同一性グループにグループ分けし、グループ分けは、別のメンバーと少なくとも８５％の同一性を共有するメンバーを含有した。９０％以上のアミノ酸同一性を持つ配列に関して、好ましいグループ分けが観察され、より好ましいグループ分けは９５％以上のアミノ酸同一性のものであり、そして最も好ましいグループ分けは９９％以上のアミノ酸同一性の配列を有した。これらの基準を用いて、２５のユニークなグループが同定され、そしてこれらを表ＩＩＩに示す。
【０１１６】
アミノ酸同一性に関する表ＩＩＩに用いたパラメーター内で、３つのグループが、既知のタバコ遺伝子に対して８５％以上の同一性を含有することが見出された。グループ５のメンバーは、ＲａｌｓｔｏｎらによるＧＩ：１４４２３３２７（またはＡＡＫ６２３４６）の先のＧｅｎＢａｎｋ配列に対して、全長配列に関して最大９６％のアミノ酸同一性を有した。グループ２３は、ＲａｌｓｔｏｎらによるＧＩ：１４４２３３２８（またはＡＡＫ６２３４７）に対して、最大９３％のアミノ酸同一性を有し、そしてグループ２４は、ＲａｌｓｔｏｎらによるＧＩ：１４４２３３１８（またはＡＡＫ６２３４３）に対して、９２％の同一性を有した。
【０１１７】
【表５−１】
【０１１８】
【表５−２】
【０１１９】
カルボキシル末端近くのＵＸＸＲＸＸＺ ｐ４５０ドメインおよびＧＸＲＸＣ ｐ４５０ドメインの間の非常に保存されるアミノ酸相同性に基づいて、全長遺伝子をさらにグループ分けした。図３に示すように、互いに比較して、保存されるドメイン間の配列相同性に関して、個々のクローンを並列させ、そして別個の同一性グループに入れた。いくつかの場合で、クローンの核酸配列はユニークであったが、該領域のアミノ酸配列は同一であった。９０％以上のアミノ酸同一性を持つ配列に関して、好ましいグループ分けが観察され、より好ましいグループは９５％以上のアミノ酸同一性を有し、そして最も好ましいグループ分けは９９％以上のアミノ酸同一性の配列を有した。最後のグループ分けは、クローンの全アミノ酸配列に関する同一性パーセントに基づくものと同様であったが、（表ＩＩＩの）グループ１７だけは例外であり、このグループは２つの別個のグループに分けられた。
【０１２０】
表ＩＶのアミノ酸同一性に関して用いたパラメーター内で、３つのグループが、既知のタバコ属遺伝子に対して９０％以上の同一性を含有することが見出された。グループ５のメンバーは、ＲａｌｓｔｏｎらによるＧＩ：１４４２３３２６（ＡＡＫ６２３４６）の先のＧｅｎＢａｎｋ配列に対して、全長配列に関して最大９３．４％のアミノ酸同一性を有した。グループ２３は、ＲａｌｓｔｏｎらによるＧＩ：１４４２３３２８（またはＡＡＫ６２３４７）に対して、最大９１．８％のアミノ酸同一性を有し、そしてグループ２４は、ＲａｌｓｔｏｎらによるＧＩ：１４４２３３１８（またはＡＡＫ６２３４２）に対して、９８．８％の同一性を有した。
【０１２１】
【表６−１】
【０１２２】
【表６−２】
【０１２３】
（実施例１２）
１以上のタバコ・チトクロムｐ４５０特異的ドメインを欠く、タバコ属チトクロムｐ４５０クローン
４つのクローンは、表ＩＩＩに報告する他のタバコ・チトクロム遺伝子に、９０％〜９９％の核酸相同性の範囲の、高い核酸相同性を有した。４つのクローンには、Ｄ１３６−ＡＤ５、Ｄ１３８−ＡＤ１２、Ｄ２４３−ＡＢ３およびＤ２５０−ＡＣ１１が含まれた。しかし、ヌクレオチド・フレームシフトのため、これらの遺伝子は、３つのＣ末端チトクロムｐ４５０ドメインの１以上を含有せず、そして表ＩＩＩまたは表ＩＶに示す同一性グループからは除外された。
【０１２４】
１つのクローン、Ｄ９５−ＡＧ１のアミノ酸同一性は、表ＩＩＩまたは表ＩＶでｐ４５０タバコ遺伝子をグループ分けするのに用いた、第三のドメイン、ＧＸＲＸＣを含有しなかった。このクローンの核酸相同性は、他のタバコ・チトクロム遺伝子に低い相同性を有した。このクローンは、タバコ属のチトクロムｐ４５０遺伝子の新規のそして異なるグループに相当する。
【０１２５】
（実施例１３）
タバコ特性の制御改変におけるタバコ属チトクロムｐ４５０断片およびクローンの使用
タバコｐ４５０核酸断片または全遺伝子の使用は、改変されたタバコ表現型またはタバコ構成要素、そしてより重要なことに、改変された代謝産物を有する植物を同定し、そして選択する際に有用である。下方制御のため、例えばアンチセンス方向で、または過剰発現のため、例えばセンス方向で、本明細書に報告するものから選択される核酸断片または全長遺伝子を取り込む、多様な形質転換系によって、トランスジェニック・タバコ植物を生成する。全長遺伝子を過剰発現するため、特定の酵素の発現を増加させるのに有効であり、そしてしたがってタバコ属内で表現型効果を生じる、本発明に記載する全長遺伝子のすべてまたは機能する部分またはアミノ酸配列をコードする核酸配列いずれかが望ましい。一連の戻し交雑を通じて、ホモ接合体系統であるタバコ属系統を得て、そして一般の当業者に一般的に利用可能な技術を用いて、限定されるわけではないが、内因性ｐ４５０ ＲＮＡ、転写物、ｐ４５０発現ペプチドおよび植物代謝産物の濃度の解析を含む、表現型変化に関して評価する。タバコ植物で示される変化は、目的の選択される遺伝子の機能的役割に関する情報を提供するか、または好ましいタバコ属植物種として有用性を有する。
【０１２６】
（実施例１４）
エチレン処理した変換系統で誘導される遺伝子の同定
遺伝子発現の定量的で高度に並行の測定のために、高密度オリゴヌクレオチドアレイ技
術であるＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ
Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンタクララ）アレイを用いた。この技術を用いる際、固体表面上でオリゴヌクレオチドを直接合成することによって、核酸アレイを組み立てた。この固相化学反応は、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）と称されるチップ上に、非常に高密度に充填された数十万のオリゴヌクレオチドプローブを含有するアレイを産生可能である。単一のハイブリダイゼーションから、数千の遺伝子を同時にスクリーニングすることも可能である。各遺伝子は、典型的には、サイズに応じて、１１〜２５対のプローブの組によって表される。感度、特異性、および再現性を最大にするようにプローブを設計して、特異的シグナルおよびバックグラウンドシグナル間、並びに緊密に関連する標的配列間の一貫した区別を可能にする。
【０１２７】
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐハイブリダイゼーション実験は、以下の工程を伴う：アレイの設計および産生、生物学的標本から単離したＲＮＡからの蛍光標識標的の調製、ＧｅｎｅＣｈｉｐへの標識した標的のハイブリダイゼーション、アレイのスクリーニング、並びにスキャンした画像の解析および遺伝子発現プロフィールの生成。
【０１２８】
Ａ． Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐの設計およびオーダーメード（ｃｕｓｔｏｍ ｍａｋｉｎｇ）
ＧｅｎｅＣｈｉｐ ＣｕｓｔｏｍＥｘｐｒｅｓｓ Ａｄｖａｎｔａｇｅアレイは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｉｎｃ．（カリフォルニア州サンタクララ）によってオーダーメードされた。チップサイズは１８ミクロンであり、そしてアレイ形式は１００〜２１８７であって、５２８のプローブセット（１１，６２８プローブ）に適応可能である。ＧｅｎＢａｎｋ由来核酸配列を除いて、我々が先に同定したタバコクローンからすべての配列を選択し、そしてプローブはすべてあつらえて設計した。総数４００のタバコ遺伝子または断片がＧｅｎｅＣｈｉｐ上に含まれるように選択した。選択したオリゴヌクレオチドの配列は、遺伝子の３’端のユニークな領域に基づいた。選択した核酸配列は、（特許出願）に記載される、タバコからクローニングされた、５６の全長ｐ４５０遺伝子および７１のｐ４５０断片からなった。他のタバコ配列には、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ ＳＳＨキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州パロアルト）を用いた抑制サブトラクション・ライブラリーから生成した、２７０のタバコＥＳＴが含まれた。これらの遺伝子の中で、ＧｅｎＢａｎｋに列挙されるチトクロムＰ４５０遺伝子から、いくつかのオリゴヌクレオチド配列を選択した。各全長遺伝子に関して、最大２５のプローブを用い、そして各断片に関して１１のプローブを用いた。いくつかのクローンに関しては、ユニークな高品質のプローブがないため、減少した数のプローブを用いた。適切な対照配列もまた、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）上に含んだ。
【０１２９】
プローブアレイは、２５量体オリゴヌクレオチドであり、半導体に基づくフォトリソグラフィーおよび固相化学合成技術の組み合わせによって、ガラス・ウェハー上に直接合成された。各アレイは、最大１００，０００の異なるオリゴヌクレオチドプローブを含有した。オリゴヌクレオチドプローブは、アレイ上の既知の位置で合成されるため、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｕｉｔｅ（登録商標）ソフトウェアによって、ハイブリダイゼーションパターンおよびシグナル強度を、遺伝子同一性および相対発現レベルに関して解釈することも可能である。各プローブ対は、完全マッチオリゴヌクレオチドおよびミスマッチオリゴヌクレオチドからなる。完全マッチプローブは、特定の遺伝子に正確に相補的な配列を有し、そしてしたがって遺伝子の発現を測定する。ミスマッチプローブは、中央の塩基位での単一塩基置換によって、完全マッチプローブとは異なり、この塩基置換が標的遺伝子転写物の結合を妨げる。ミスマッチは、非特異的ハイブリダイゼーションシグナルまたはバックグラウンドシグナルを生じ、これを、完全マッチオリゴヌクレオチドに関して測定されるシグナルに比較した。
【０１３０】
Ｂ．試料調製
Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎｓ， Ｉｎｃ．（テネシー州メンフィス）によって、ハイブリダイゼーション実験を行った。ハイブリダイゼーションで用いるＲＮＡ試料は、エチレン処理によって誘導される、６対の非変換／変換同系系統からなった。試料には、１対の４４０７−２５／４４０７−３３非処理バレー種タバコ試料、３対のエチレン処理４４０７−２５／４４０７−３３試料、１対のエチレン処理した黒（ｄａｒｋ）タバコＮＬ Ｍａｄｏｌｅ／１８１および１対のエチレン処理バレー品種ＰＢＬＢ０１／１７８が含まれた。エチレン処理は、実施例１に記載するとおりであった。
【０１３１】
修飾した酸フェノールおよびクロロホルム抽出プロトコルを用いて、上述のエチレン処理葉および非処理葉から、総ＲＮＡを抽出した。１グラムの組織を用いて、これをすりつぶし、そして続いて５ｍｌの抽出緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５；２００ｍＭ ＮａＣｌ；１０ｍＭ ＥＤＴＡ；０．５％ＳＤＳ）中でボルテックスし、これに５ｍｌのフェノール（ｐＨ５．５）および５ｍｌのクロロホルムを添加するように、プロトコルを修飾した。抽出した試料を遠心分離し、そして上清を取り置いた。上清が透明に見えるようになるまで、この抽出工程をさらに２〜３回反復した。およそ５ｍｌのクロロホルムを添加して、微量のフェノールを取り除いた。３倍体積のＥｔＯＨおよび１／１０体積の３Ｍ ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）を添加し、そして−２０℃に１時間保存することによって、合わせた上清分画からＲＮＡを沈殿させた。Ｃｏｒｅｘガラス容器に移した後、ＲＮＡ分画を、４℃、９，０００ＲＰＭで４５分間遠心分離した。ペレットを７０％エタノールで洗浄し、そして４℃、９，０００ＲＰＭで５分間回転させた。ペレットを乾燥させた後、ペレットにしたＲＮＡを０．５ｍｌ ＲＮａｓｅ不含水に溶解した。ペレットにしたＲＮＡを０．５ｍｌ ＲＮａｓｅ不含水に溶解した。変性ホルムアルデヒドゲルおよび分光光度計によって、それぞれ、総ＲＮＡの品質および量を解析した。３〜５μｇ／μｌの総ＲＮＡ試料をＧｅｎｏｍｅ Ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎｓ， Ｉｎｃ．に送ってハイブリダイゼーションを行った。
【０１３２】
Ｃ．ハイブリダイゼーション、検出およびデータ・アウトプット
標識ｃＲＮＡ物質の調製を以下のように行った。製造者の指示にしたがって、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ二本鎖ｃＤＮＡ合成キット（Ｇｉｂｃｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびオリゴ−ｄＴ２４−Ｔ７（５’− ＧＧＣ ＣＡＧ ＴＧＡ ＡＴＴ ＧＴＡ ＡＴＡ ＣＧＡ ＣＴＣ ＡＣＴ ＡＴＡ ＧＧＧ ＡＧＧ ＣＧＧ−３’）プライマーを用いて、５〜１５μｇの総ＲＮＡから、第一鎖および第二鎖ｃＤＮＡを合成した。
【０１３３】
Ｔ７プロモーターがカップリングした二本鎖ｃＤＮＡをテンプレートとして、そしてＴ７ ＲＮＡ転写物標識キット（ＥＮＺＯ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ．）を用いた、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって、ｃＲＮＡを合成し、そして同時にビオチン化ＵＴＰおよびＣＴＰで標識化した。簡潔には、先の工程から合成した二本鎖ｃＤＮＡを７０％エタノールで２回洗浄し、そして２２μｌのＲｎａｓｅ不含Ｈ２Ｏに再懸濁した。ｃＤＮＡを４μｌの１０ｘ各反応緩衝液、ビオチン標識リボヌクレオチド、ＤＴＴ、Ｒｎａｓｅ阻害剤混合物、および２μｌの２０ｘＴ７ ＲＮＡポリメラーゼと３７℃で５時間インキュベーションした。ＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮ−１００カラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を通過させ、そして−２０℃で１時間〜一晩沈殿させることによって、取り込まれていないリボヌクレオチドから、標識ｃＲＮＡを分離した。
【０１３４】
オリゴヌクレオチドアレイ・ハイブリダイゼーションおよび解析を以下のように行った。ｃＲＮＡペレットを１０μｌのＲｎａｓｅ不含Ｈ２Ｏに再懸濁し、そして２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢酸、ｐＨ８．１、５００ｍＭ ＫＯＡｃ、１５０ｍＭ ＭｇＯＡｃ中で９５℃で３５分間、熱およびイオンが仲介する加水分解によって、１０．０μｇを断片化した
。断片化したｃＲＮＡを、〜１２，５００のアノテートした全長遺伝子とともに、ＥＳＴ配列に相当するように設計されたさらなるプローブセットを含有する、ＨＧ Ｕ９５Ａｖ２オリゴヌクレオチドアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）に４５℃で１６時間ハイブリダイズさせた。６ｘＳＳＰＥ（０．９Ｍ ＮａＣｌ、６０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、６ｍＭ ＥＤＴＡ＋０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０）を用いてアレイを２５℃で洗浄し、次いで１００ｍＭ ＭＥＳ、０．１Ｍ［Ｎａ＋］、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０を用いて、５０℃でストリンジェントな洗浄を行った。アレイをフィコエリトリン・コンジュゲート化ストレプトアビジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で染色し、そしてレーザー共焦点スキャナー（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）を用いて、蛍光強度を測定した。Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙソフトウェア（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いて、スキャンした画像を解析した。用いたすべてのアレイに関して、アレイ上のすべての遺伝子の蛍光強度の平均を、一定の標的強度（２５０）にスケーリングすることによって、試料装填および染色における変動を標準化した。ユーザー指針にしたがって、Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｕｉｔｅ ５．０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いて、データ解析を行った。［Σ（ＰＭ−ＭＭ）／（プローブ対の数）］、式中、ＰＭおよびＭＭは完全マッチおよび不完全マッチを示す、に表される、平均強度相違として各遺伝子のシグナル強度を計算した。
【０１３５】
Ｄ．データ解析および結果
Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎｓの検出装置を用いて生成した発現レポートに立証されるように、１２組のハイブリダイゼーションに成功した。レポートの主なパラメーターには、ノイズ、スケール係数、バックグラウンド、総プローブセット、存在および非存在プローブセットの数およびパーセンテージ、ハウスキーピング対照のシグナル強度が含まれた。続いて、他のＭｉｃｒｏｓｏｆｔソフトウェアと組み合わせてソフトフェアＧＣＯＳを用いて、データを解析し、そして提示した。処理対間のシグナル比較を解析した。複製を含む、異なる処理各々の遺伝子および断片に対応するそれぞれのプローブすべてに関する全体のデータをコンパイルし、そしてコンパイルした発現データ、例えば変化のコールおよびシグナルｌｏｇ２比の変化を解析した。
【０１３６】
ＧｅｎｅＣｈｉｐ技術の典型的な適用は、異なる組織で差次的に発現される遺伝子を発見することである。本出願において、４４０７−２５／４４０７−３３バレー品種、ＰＢＬＢ０１／１７８バレー品種、およびＮＬ Ｍａｄｏｌｅ／１８１黒タバコ品種を含む、変換および非変換タバコ系統対に関して、エチレン処理によって引き起こされる遺伝子発現変動を決定した。これらの解析によって、生物学的変動のため、発現が有意に改変されている遺伝子のみが検出された。これらの解析は、誘導された遺伝子を同定する主な基準として、倍変化（シグナル比）を使用した。他のパラメーター、例えばシグナル強度、存在／非存在コールもまた、考慮した。
【０１３７】
およそ４００遺伝子に関して、変換および非変換対の試料の発現相違に関して、データを解析した後、シグナル強度に基づく結果によって、２つの遺伝子、Ｄ１２１−ＡＡ８、およびＤ１２０−ＡＨ４、並びに１つの断片、Ｄ１２１−ＡＡ８の部分的断片であるＤ３５−ＢＧ１１のみが、エチレン処理変換系統対非変換系統において、再現可能な誘導を有した。これらの遺伝子の示差発現を例示すると、データは以下のように示された。表Ｖに示すように、変換系統、例えばバレー種タバコ品種、４４０７−３３の遺伝子のシグナルを、関連する非変換同系系統、４４０７−２５のシグナルに対する比として決定した。エチレン処理なしでは、すべての遺伝子の変換系統対非変換系統のシグナルの比は、１．００に近づいた。エチレン処理すると、同系バレー系統を用いた３回の独立の解析によって決定されるように、非変換系統に比較して、変換系統において、２つの遺伝子、Ｄ１２１−ＡＡ８およびＤ１２０−ＡＨ４が誘導された。これらの遺伝子は、互いに非常に高い相同性を有し、およそ９９．８％以上の核酸配列相同性を有した。表Ｖに示すように、変換品種における相対的ハイブリダイゼーションシグナルは、変換系統において、非変換対応
物におけるシグナルのおよそ２〜１２倍高い範囲であった。これと比較して、内部対照である２つのアクチン様対照クローンは、標準化した比に基づくと、変換系統で誘導されていないことが見出された。さらに、コード領域中の配列が完全にＤ１２１−ＡＡ８およびＤ１２０−ＡＨ４遺伝子両方に含有される断片（Ｄ３５−ＢＧ１１）は、対の同系変換系統および非変換系統の同じ試料で、高度に誘導された。バレー種タバコ品種、ＰＢＬＢ０１および１７８の別の同系対が、エチレン誘導下、変換系統試料で誘導される、同じ遺伝子、Ｄ１２１−ＡＡ８およびＤ１２０−ＡＨ４を有することが示された。さらに、Ｄ１２１−ＡＡ８およびＤ１２０−ＡＨ４遺伝子は、同系黒タバコ対、ＮＬ Ｍａｄｏｌｅおよび１８１の変換系統で優先的に誘導され、変換系統におけるこれらの遺伝子のエチレン誘導が、バレー種タバコ品種に限定されないことが立証された。すべての場合で、Ｄ３５−ＢＧ１１断片が、非変換対系統に比較して、変換系統で、最も高く誘導された。
【０１３８】
【表７】
【０１３９】
（実施例１５）
タバコ変換系統におけるミクロソーム・ニコチン脱メチル化酵素のエチレン誘導
変換および非変換タバコ系統のエチレン処理および非処理対のミクロソーム濃縮分画において、脱メチル化酵素活性の生化学的解析を、以下のように行った。
【０１４０】
Ａ．ミクロソームの調製
ミクロソームを４℃で単離した。５０ｍＭ Ｎ−（２−ヒドロオキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）、ｐＨ７．５、３ｍＭ ＤＬ−ジチオスレイトール（ＤＴＴ）およびプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を１錠剤／５０ｍｌからなる緩衝液中で、タバコ葉を抽出した。四層のチーズクロスを通じて未精製抽出物をろ過して、破壊されていない組織を取り除き、そしてろ液を２０，０００ｘｇで２０分間遠心分離して、細胞破片を取り除いた。上清を１００，０００ｘｇで６０分間、超遠心に供して、そして生じたペレットはミクロソーム分画を含有した。抽出緩衝液にミクロソーム分画を懸濁し、そして超遠心工程に適用し、ここで抽出緩衝液中の０．５Ｍスクロースの不連続スクロース勾配を用いた。凍結保護剤として１０％（ｗ／ｖ）グリセロールを補った抽出緩衝液に、精製ミクロソームを再懸濁した。ミクロソーム調製物を使用
するまで液体窒素フリーザー中に保存した。
【０１４１】
Ｂ．タンパク質濃度測定
アセトン中の１０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）（ｗ／ｖ）を用いて、ミクロソームタンパク質を沈殿させ、そして製造者のプロトコルにしたがってＲＣ ＤＣタンパク質アッセイキット（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いて、ミクロソームのタンパク質濃度を測定した。
【０１４２】
３）ニコチン脱メチル化酵素活性アッセイ
Ｍｏｒａｖｅｋ ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓからＤＬ−ニコチン（ピロリジン−２−１４Ｃ）を得て、そしてこれは５４ｍＣｉ／ｍｍｏｌの比活性を有した。どちらもｐ４５０阻害剤であるクロルプロマジン（ＣＰＺ）および酸化チトクロムｃ（ｃｙｔ．Ｃ）を、Ｓｉｇｍａから購入した。ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェートの還元型（ＮＡＤＰＨ）は、ＮＡＤＰＨ：チトクロムＰ４５０還元酵素を介したチトクロムＰ４５０の典型的な電子供与体である。対照インキュベーションに関してはＮＡＤＰＨを省いた。日常的な酵素アッセイは、ミクロソームタンパク質（およそ２ｍｇ／ｍｌ）、６ｍＭ ＮＡＤＰＨ、５５μＭ １４Ｃ標識ニコチンからなった。ＣＰＺおよびＣｙｔ．Ｃの濃度は、これらを用いる場合には、それぞれ１ｍＭおよび１００μＭであった。２５℃で１時間反応を行い、そして各２５μｌ反応混合物に３００μｌメタノールを添加して反応を停止した。回転後、メタノール抽出物の２０μｌをＶａｒｉａｎのＩｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３ ３μ（１５０ｘ４．６ｍｍ）カラムを用いて、逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）系（Ａｇｉｌｅｎｔ）で分離した。アイソクラチック可動相は、６０：４０（ｖ／ｖ）の比のメタノールおよび５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．２５の混合物であり、そして流速は１ｍｌ／分であった。真性の非標識ノルニコチンとの比較によって決定されるようなノルニコチンピークを収集し、そして定量化のため、２９００ ｔｒｉ−ｃａｒｂ液体シンチレーションカウンター（ＬＳＣ）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）に供した。１時間インキュベーションに渡る、１４Ｃ標識ノルニコチンの産生に基づいて、ニコチン脱メチル化酵素の活性を計算する。
【０１４３】
エチレン処理したかまたはしなかった、バレー種変換（系統４４０７−３３）および非変換（系統４４０７−２５）タバコ系統の対から試料を得た。すべての未処理試料は、検出可能なミクロソーム・ニコチン脱メチル化酵素活性をまったく持たなかった。対照的に、エチレン処理した変換系統から得たミクロソーム試料は、有意なレベルのニコチン脱メチル化酵素活性を含有することが見出された。ニコチン脱メチル化酵素活性は、Ｐ４５０特異的阻害剤によって阻害されることが示され、脱メチル化酵素活性が、Ｐ４５０ミクロソーム由来酵素に一致することが立証された。バレー種変換タバコ系統に関して得られる、典型的な酵素アッセイ結果の組を表ＶＩに示す。対照的に、エチレン処理した非変換系統タバコから得た試料は、ニコチン脱メチル化酵素活性をまったく含有しなかった。これらの結果によって、ニコチン脱メチル化酵素活性は、変換系統においてエチレン処理で誘導されたが、対応する同系非変換系統では誘導されないことが立証された。同系黒タバコ品種対に関しても同様の結果が得られ、この場合、ミクロソーム・ニコチン脱メチル化酵素活性は、変換系統では誘導され、そして非変換対系統では検出不能であった。これらの実験を総合すると、ミクロソーム・ニコチン脱メチル化酵素活性は、変換系統でエチレン処理に際して誘導される一方、対の同系非変換系統では誘導されないことが立証された。Ｐ４５０由来遺伝子であり、そして対の非変換系統に比較して、変換系統で優先的に誘導される遺伝子は、ニコチン脱メチル化酵素をコードする遺伝子の候補である。
【０１４４】
【表８】
【０１４５】
（実施例１６）
ニコチン脱メチル化酵素としてのＤ１２１−ＡＡ８の機能的同定
酵母細胞において、異種発現されるＰ４５０の酵素活性をアッセイすることによって、ニコチン脱メチル化酵素のコード遺伝子としての候補クローン（Ｄ１２１−ＡＡ８）の機能を確認した。
【０１４６】
１．酵母発現ベクターの構築
Ｐ４５０コードｃＤＮＡ（１２１ＡＡ８）の推定上のタンパク質コード配列を、酵母発現ベクターｐＹｅＤＰ６０にクローニングした。適切なＢａｍＨＩおよびＭｆｅＩ部位（下線）を含有するＰＣＲプライマーを介して、これらの配列を、翻訳開始コドン（ＡＴＧ）の上流または停止コドン（ＴＡＡ）の下流に導入した。増幅されたＰＣＲ産物上のＭｆｅＩは、ベクター上のＥｃｏＲＩ部位と適合する。１２１ＡＡ８ ｃＤＮＡを増幅するのに用いたプライマーは、
【０１４７】
【化１】
【０１４８】
であった。６つのヒスチジンを含めて、タンパク質のＣ末端に９つの余分なアミノ酸をコードする配列セグメントを逆方向プライマーに取り込んだ。これによって、誘導に際して、６ｘＨｉｓをタグ付けしたＰ４５０の発現が促進される。酵素消化した後、ＰＣＲ産物をＧＡＬ１０−ＣＹＣ１プロモーターに関してセンス方向でｐＹｅＤＰ６０ベクターに連結した。酵素制限およびＤＮＡ配列決定によって、構築物を確認した。
【０１４９】
２．酵母形質転換
シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＮＡＤＰＨ−チトクロムＰ４５０還元酵素ＡＴＲ１を発現するように修飾したＷＡＴ１１酵母株を、構築物ｐＹｅＤＰ６０−Ｐ４５０ ｃＤＮＡプラスミドで形質転換した。０．２ｃｍ電極ギャップのキュベット中で、５０マイクロリットルのＷＡＴ１１酵母細胞懸濁物を〜１μｇのプラスミドＤＮＡと混合した。Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆエレクトロポレーション装置（モデル２５１０）によって、２
．０ｋＶでパルスを１回適用した。ＳＧＩプレート（５ｇ／ｌバクトカザミノ酸、６．７ｇ／ｌのアミノ酸不含酵母窒素基剤、２０ｇ／ｌグルコース、４０ｍｇ／ｌ ＤＬ−トリプトファン、２０ｇ／ｌ寒天）上に細胞を広げた。ランダムに選択したコロニーに対して、ＰＣＲ解析を直接行うことによって、形質転換体を確認した。
【０１５０】
３．形質転換酵母細胞におけるＰ４５０発現
単一酵母コロニーを用いて、３０ｍｌ ＳＧＩ培地（５ｇ／ｌバクトカザミノ酸、６．７ｇ／ｌのアミノ酸不含酵母窒素基剤、２０ｇ／ｌグルコース、４０ｍｇ／ｌ ＤＬ−トリプトファン）に接種し、そして３０℃で約２４時間増殖させた。この培養物のアリコットを、１０００ｍｌのＹＰＧＥ培地（１０ｇ／ｌ酵母エキス、２０ｇ／ｌバクトペプトン、５ｇ／ｌグルコース、３０ｍｌ／ｌエタノール）に１：５０で希釈し、そしてＤｉａｓｔｉｘ検尿試薬紙（Ｂａｙｅｒ、インディアナ州エルクハート）の色変化によって示されるように、グルコースが完全に消費されるまで増殖させた。最終濃度２％までＤＬ−ガラクトースを添加することによって、クローニングしたＰ４５０の誘導を開始した。ｉｎ ｖｉｖｏ活性アッセイまたはミクロソーム調製に用いる前に、培養物をさらに２０時間増殖させた。
【０１５１】
ｐＹｅＤＰ６０−ＣＹＰ７１Ｄ２０（タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）の５−エピ−アリストロチェンおよび１−デオキシカプシジオールの水酸化を触媒するＰ４５０）を発現するＷＡＴ１１酵母細胞を、Ｐ４５０発現および酵素活性アッセイの対照として用いた。
【０１５２】
４． ｉｎ ｖｉｖｏ酵素活性
酵母培養物にＤＬ−ニコチン（ピロリジン−２−１４Ｃ）を供給することによって、形質転換酵母細胞におけるニコチン脱メチル化酵素活性をアッセイした。７５μｌのガラクトース誘導培養物に、１４Ｃ標識ニコチン（５４ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）を最終濃度５５μＭまで添加した。１４ｍｌポリプロピレン試験管中、アッセイ培養物を振盪しながら６時間インキュベーションし、そして９００μｌメタノールで抽出した。回転後、２０μｌのメタノール抽出物をｒｐ−ＨＰＬＣで分離して、そしてＬＳＣによってノルニコチン分画を定量化した。
【０１５３】
ＷＡＴ１１（ｐＹｅＤＰ６０−ＣＹＰ７１Ｄ２０）の対照培養物はニコチンをノルニコチンに変換せず、ＷＡＴ１１酵母株が、ニコチンをノルニコチンに生物変換する工程を触媒可能な内因性酵素活性を含有しないことが示された。対照的に、１２１ＡＡ８遺伝子を発現する酵母は、検出可能な量のノルニコチンを産生し、このＰ４５０酵素がニコチン脱メチル化酵素活性を持つことが示された。
【０１５４】
５．酵母ミクロソーム調製
ガラクトースで２０時間誘導した後、遠心分離によって酵母細胞を収集し、そしてＴＥＳ−Ｍ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．６Ｍソルビトール、１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール）で２回洗浄した。ペレットを抽出懸濁液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．６Ｍソルビトール、２ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１％ウシ血清アルブミン、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）１錠剤／５０ｍｌ）に再懸濁した。次いで、細胞をガラスビーズ（直径０．５ｍｍ、Ｓｉｇｍａ）で破壊した。細胞抽出物を２０，０００ｘｇで２０分間遠心分離して、細胞破片を取り除いた。上清を１００，０００ｘｇ、６０分間の超遠心に供して、そして生じたペレットはミクロソーム分画を含有した。ミクロソーム分画をＴＥＧ−Ｍ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０％グリセロールおよび１．５ｍＭ ２−メルカプトエタノール）に、タンパク質濃度１ｍｇ／ｍｌで懸濁した。ミクロソーム調製物を使用するまで液体窒素フリーザー中に保存し
た。
【０１５５】
６．酵母ミクロソーム調製物における酵素活性アッセイ
酵母ミクロソーム調製物を用いて、タンパク質濃度が１ｍｇ／ｍｌで一定であったことを除いて、タバコ葉からのミクロソーム調製物と同じ方式で（実施例１５）、ニコチン脱メチル化酵素活性アッセイを行った。
【０１５６】
ＣＹＰ７１Ｄ２０を発現する対照酵母細胞由来のミクロソーム調製物は、検出可能なミクロソーム・ニコチン脱メチル化酵素活性をまったく持たなかった。対照的に、１２１ＡＡ８遺伝子を発現する酵母細胞から得たミクロソーム試料は、有意なレベルのニコチン脱メチル化酵素活性を示した。ニコチン脱メチル化酵素活性は、ＮＡＤＰＨに必要であり、そしてＰ４５０特異的阻害剤によって阻害されることが示されており、これは研究中のＰ４５０に一致する。酵母細胞に関して得られる、典型的な酵素アッセイ結果の組を表ＶＩＩに示す。
【０１５７】
【表９】
【０１５８】
これらの実験を総合すると、クローニングされた全長遺伝子Ｄ１２１−ＡＡ８が、酵母で発現させた際、ニコチンのノルニコチンへの変換を触媒するチトクロムＰ４５０タンパク質をコードすることが立証された。
【０１５９】
本発明の実施にあたり、本発明の前述の詳細な説明を考慮すると、多くの修飾および変動が当業者には思い浮かぶと期待される。その結果、こうした修飾および変動は、付随する請求項の範囲内に含まれると意図される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タバコ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）植物においてチトクロムＰ４５０酵素（以後、ｐ４５０およびｐ４５０酵素と称する）をコードする核酸配列、およびこうした核酸配列を用いて植物表現型を改変する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
チトクロムｐ４５０は、内因性基質および生体異物基質の酸化代謝、過酸化代謝および還元代謝を含む、多様な範囲の化学的に異なる基質の酵素反応を触媒する。植物において、ｐ４５０は、フェニルプロパノイド、アルカロイド、テルペノイド、脂質、青酸グリコシド、およびグルコシノレートなどの植物産物の合成を含む、生化学的経路に関与する（Ｃｈａｐｐｅｌ， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９８， ４９：３１１−３４３(非特許文献１)）。チトクロムｐ４５０は、ｐ４５０ヘム−チオレート・タンパク質としても知られ、通常、ｐ４５０含有モノオキシゲナーゼ系と呼ばれる多構成要素電子移動連鎖の最後のオキシダーゼとして作用する。触媒される特定の反応には、脱メチル化、水酸化、エポキシ化、Ｎ−酸化、スルホ酸化（ｓｕｌｆｏｏｘｉｄａｔｉｏｎ）、Ｎ−、Ｓ−、およびＯ−脱アルキル化、脱硫酸化、脱アミノ化、並びにアゾ、ニトロ、およびＮ−オキシド基の還元が含まれる。
【０００３】
タバコ属植物ｐ４５０酵素の多様な役割が、フェニルプロパノイド、アルカロイド、テルペノイド、脂質、青酸グリコシド、グルコシノレートおよび多くの他の化学実体などの多様な植物代謝産物を生じるのに関連付けられてきている。近年、いくつかのｐ４５０酵素が、植物において植物代謝産物の組成に影響を及ぼしうることが明らかになってきている。例えば、選択される脂肪酸のプロフィールを、育種を通じて改変することによって、特定の植物のフレーバーおよび香りを改善することが以前から望まれてきた；が、これらの葉の構成要素のレベルを調節するのに関与する機構に関してはほとんどわかっていない。脂肪酸の修飾に関与するｐ４５０酵素を下方制御すると、より好ましい葉の表現型特性を提供する、望ましい脂肪酸の集積が促進されることも可能である。植物構成要素におけるｐ４５０酵素の機能およびその広い役割は、なお発見される途上にある。例えば、特殊な種類のｐ４５０酵素が、脂肪酸を分解して、果物および野菜の「新鮮な緑」のにおいに主に貢献する、揮発性Ｃ６およびＣ９アルデヒドおよびアルコールにするのを触媒することが見出された。タバコ属の葉において、脂質構成要素および関連する分解代謝産物を修飾することによって、標的とされる他の新規ｐ４５０のレベルを改変して、葉の構成要素の品質を増進することも可能である。葉におけるこれらの構成要素のいくつかが、葉の品質特性の成熟を刺激する老化によって影響を受ける。さらに他の報告によって、ｐ４５０酵素が、植物−病原体相互作用および疾患抵抗性に関与する脂肪酸を改変する際に機能的役割を果たすことが示されてきている。
【０００４】
他の例において、ｐ４５０酵素が、アルカロイド生合成に関与することも示唆されてきている。ノルニコチンは、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｅｕｍ）に見られる微量アルカロイドである。ノルニコチンは、ｐ４５０が仲介してニコチンが脱メチル化され、その後、Ｎ位でアシル化およびニトロソ化が起こり、それによって一連のＮ−アシルノニコチン（Ｎ−ａｃｙｌｎｏｎｉｃｏｔｉｎｅｓ）およびＮ−ニトロソノルニコチンが生じることによって産生されると推論されてきている。推定上のｐ４５０脱メチル化酵素（ｄｅｍｅｔｈｙｌａｓｅ）に触媒されるＮ−脱メチル化は、タバコ属におけるノルニコチン生合成の主な供給源であると考えられる。該酵素はミクロソーム性であると考えられ
るが、これまで、ニコチン脱メチル化酵素の精製は成功しておらず、関与する遺伝子も単離されていない。
【０００５】
さらに、ｐ４５０酵素の活性が、遺伝的に調節され、そしてまた、環境要因によって強く影響されると仮定されているが、証明されていない。例えば、タバコ属におけるニコチンの脱メチル化は、植物が成熟段階に達したときに実質的に増加すると考えられている。さらに、ＲＮＡが存在する場合、その翻訳を阻害することも可能な転移可能要素を、脱メチル化酵素遺伝子が含有すると仮定されるが、証明はされていない。
【０００６】
ｐ４５０酵素型が非常に多様であり、構造および機能が異なることから、タバコ属ｐ４５０酵素の研究は、本発明以前には非常に困難であった。さらに、少なくとも部分的に、膜に局在するこれらのｐ４５０酵素が、典型的には存在量が少なく、そしてしばしば、精製するには不安定であるため、これらのタンパク質のクローニングが妨害されてきた。したがって、植物におけるｐ４５０酵素、およびこれらのｐ４５０酵素に関連する核酸配列を同定する必要性が存在する。特に、タバコ属においては、いくつかのチトクロムｐ４５０タンパク質しか報告されてきていない。本明細書に記載する発明は、配列同一性に基づいて、ｐ４５０種のいくつかのグループに対応する、かなりの数のチトクロムｐ４５０断片の発見を含む。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｃｈａｐｐｅｌ， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９８， ４９：３１１−３４３
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
概要
本発明は植物ｐ４５０酵素に関する。本発明はさらに、タバコ属由来の植物ｐ４５０酵素に関する。本発明はまた、その発現がエチレンおよび／または植物老化によって誘導される、植物におけるｐ４５０酵素にも関する。本発明はさらに、酵素活性、例えばオキシゲナーゼ、脱メチル化酵素等、またはその他に分類される酵素活性を有する、植物中の核酸配列、およびこれらの酵素の発現または過剰発現を減少させるかまたはサイレンシングするための、これらの配列の使用にも関する。本発明はまた、より低いノルニコチンレベルを示す植物より、より高いノルニコチンレベルを含有する植物で見られるｐ４５０酵素にも関する。
【０００９】
１つの側面において、本発明は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３、２４５、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２６１、２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、２７３、２７５、２７７、２７９、２８１、２８３、２８５、２８７、２８９、２９１、２９３、２９５および２９７に示す核酸配列に関する。
【００１０】
第二の関連する側面において、核酸配列において７５％を超える同一性を含有する断片を、チトクロムｐ４５０モチーフＧＸＲＸＣＸ（Ｇ／Ａ）に続く最初の核酸から停止コドンまでに対応する領域における同一性に応じたグループに入れた。代表的な核酸グループ
およびそれぞれの種を表Ｉに示す。
【００１１】
第三の側面において、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９４、２９６および２９８に示すアミノ酸配列に関する。
【００１２】
第四の関連する側面において、アミノ酸配列において７１％を超える同一性を含有する断片を、チトクロムｐ４５０モチーフＧＸＲＸＣＸ（Ｇ／Ａ）に続く最初のアミノ酸から停止コドンまでに対応する領域における、互いに対する同一性に応じたグループに入れた。代表的なアミノ酸グループおよびそれぞれの種を表ＩＩに示す。
【００１３】
第五の側面において、本発明は、配列番号１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９４、２９６および２９８に示す全長遺伝子のアミノ酸配列に関する。
【００１４】
第六の関連する側面において、アミノ酸配列において８５％以上の同一性を含有する全長遺伝子を、互いに対する同一性に応じたグループに入れた。代表的なアミノ酸グループおよびそれぞれの種を表ＩＩＩに示す。
【００１５】
第七の側面において、本発明は、配列番号２９９〜３５７に示す断片のアミノ酸配列に関する。
第八の関連する側面において、アミノ酸配列において９０％以上の同一性を含有する断片を、最初のチトクロムｐ４５０ドメイン、ＵＸＸＲＸＸＺから、第三のチトクロム・ドメイン、ＧＸＲＸＯ、ここでＵはＥまたはＫであり、Ｘはアミノ酸いずれかであり、そしてＺはＲ、Ｔ、ＳまたはＭである、までに対応する領域における、互いに対する同一性に応じたグループに入れた。代表的なアミノ酸グループおよびそれぞれの種を表ＩＶに示す。
【００１６】
第九の関連する側面において、ＲＮＡウイルス系を用いて、タバコ属植物におけるｐ４５０酵素の減少または除去または過剰発現を一過性に達成することも可能である。
一般の当業者に通常利用可能な技術を用いて、限定されるわけではないが、内因性ｐ４５０ ＲＮＡ転写物、発現されたｐ４５０ペプチド、および植物代謝産物濃度の解析を含
む、表現型変化に関して、生じた形質転換植物または感染植物を評価する。
【００１７】
第十の重要な側面において、本発明はまた、改変されたｐ４５０酵素活性レベルを有するトランスジェニック・タバコ属系統の生成にも関する。本発明にしたがって、これらのトランスジェニック系統には、特定の酵素の発現を減少させるかまたはサイレンシングするかまたは増加させ、したがってタバコ属内で表現型効果を生じるのに有効である核酸配列が含まれる。こうした核酸配列には、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３、２４５、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２６１、２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、２７３、２７５、２７７、２７９、２８１、２８３、２８５、２８７、２８９、２９１、２９３、２９５および２９７が含まれる。
【００１８】
本発明の非常に重要な第十一の側面において、全長遺伝子またはその断片のいずれかを用いて下方制御能力がある、あるいは全長遺伝子を用いて過剰発現能力がある、本発明の核酸を含む植物品種は、対照植物に比較して、改変された代謝産物プロフィールを有するであろう。
【００１９】
本発明の第十二の側面において、本発明の核酸を含む植物品種は、植物または植物外部に由来する代謝産物の生合成または分解を修飾する際に、全長遺伝子またはその断片のいずれかを用いて、特定の外因性化学薬品または植物疫病に耐容性を示すのに使用を有するであろう。こうした核酸配列には、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３、２４５、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２６１、２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、２７３、２７５、２７７、２７９、２８１、２８３、２８５、２８７、２８９、２９１、２９３、２９５および２９７が含まれる。
【００２０】
第十三の側面において、本発明は、解説される核酸配列に実質的な核酸同一性を有する遺伝子を含有する植物、より好ましくはタバコ属のスクリーニングに関する。本発明の使用は、こうした植物が伝統的な品種またはトランスジェニック品種の育種プログラム、突然変異誘発プログラム、あるいは天然存在の多様な植物集団の一部である場合、厳密なま
たは実質的な同一性を持つ核酸配列を含有する植物を同定し、そして選択するのに好適であろう。実質的な核酸同一性に関する植物のスクリーニングは、限定されるわけではないが、核酸ハイブリダイゼーションおよびＰＣＲ解析を含む核酸検出プロトコルと組み合わせて、核酸プローブを用い、植物核酸物質を評価することによって、達成可能である。核酸プローブは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３、２４５、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２６１、２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、２７３、２７５、２７７、２７９、２８１、２８３、２８５、２８７、２８９、２９１、２９３、２９５および２９７に対応する、解説される核酸配列またはその断片からなることも可能である。
【００２１】
第十四の側面において、本発明は、解説される核酸配列に対応する実質的なアミノ酸同一性を共有する植物遺伝子、より好ましくはタバコ属遺伝子の同定に関する。ｃＤＮＡおよびゲノムクローン両方を含む植物遺伝子、より好ましくはタバコ属由来のｃＤＮＡおよびゲノムクローンを含む植物遺伝子の同定は、限定されるわけではないが、核酸ハイブリダイゼーションおよびＰＣＲ解析を含む核酸検出プロトコルと組み合わせて核酸プローブを用い、植物ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって、達成可能である。核酸プローブは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４３、１４５および１４７に対応する核酸配列またはその断片で構成されることも可能である。
【００２２】
別の第十五の側面において、解説されるアミノ酸配列の一部またはすべてに向けられる抗体を用いて、ペプチドを発現するｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングすることも可能である。こうしたアミノ酸配列には、配列番号２、４、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４４、１４６、１４８が含まれる。
【００２３】
第十六の重要な側面において、本発明はまた、ｐ４５０酵素活性レベルの過剰発現を有するトランスジェニック・タバコ属系統の生成にも関する。本発明にしたがって、これらのトランスジェニック系統には、特定の酵素の発現を増加させるのに有効であり、したがってタバコ属内で表現型効果を生じるのに有効である全長遺伝子のアミノ酸配列をコードするすべての核酸配列が含まれる。こうしたアミノ酸配列には、配列番号１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２
、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９４、２９６および２９８が含まれる。
【００２４】
減少した量のノルニコチンを有するタバコ葉（ラミナおよび／または茎）を含むタバコ製品もまた提供する。タバコ製品には、本明細書記載の配列を含む植物、あるいはタバコ特異的ニトロソアミンをコードする遺伝子が除去または抑制されている植物由来のタバコ（ラミナおよび／または茎を含むタバコ葉）が含まれる。タバコ特異的ニトロソアミンをコードする遺伝子の除去または抑制は、タバコ特異的ニトロソアミンをコードする遺伝子が除去または抑制されていないタバコ植物から作成されたタバコ製品に比較して、タバコ製品中のタバコ特異的ニトロソアミンを、約５〜約１０％、別の側面においては約１０〜２０％、別の側面においては約２０〜３０％、そして別の側面においては３０％を超えて、減少させるのに有効である。本明細書において、タバコ製品は、巻きタバコ、葉巻、パイプタバコ、嗅ぎタバコ、噛みタバコ、タバコ製品とブレンドした製品、およびこれらの混合物を含むことも可能である。
【００２５】
詳細な説明
定義
別に定義しない限り、本明細書で用いるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する当該技術分野の一般の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら（１９９４）Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， 第２版， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ
ａｎｄ Ｓｏｎｓ（ニューヨーク）は、本発明で用いる用語の多くの一般的辞書とともに、技術の１つを提供する。本明細書に引用する特許および刊行物はすべて本明細書に援用される。本発明の目的のため、次の用語を以下に定義する。
【００２６】
「酵素活性」は、脱メチル化、水酸化、エポキシ化、Ｎ−酸化、スルホ酸化、Ｎ−、Ｓ−、およびＯ−脱アルキル化、脱硫酸化、脱アミノ化、並びにアゾ、ニトロ、およびＮ−オキシド基の還元を含むことを意味される。用語「核酸」は、一本鎖または二本鎖型いずれか、あるいはセンスまたはアンチセンスのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指し、そして別に限定されない限り、天然存在ヌクレオチドに似た方式で、核酸にハイブリダイズする天然ヌクレオチドの既知の類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）を含む。別に示さない限り、特定の核酸配列には、その相補配列が含まれる。
【００２７】
用語「機能可能であるように連結される」、「機能可能な組み合わせ」および「機能可能な順序」は、核酸発現調節配列（プロモーター、シグナル配列、または転写因子結合部位の列など）および第二の核酸配列の間の機能する連結を指し、ここで発現調節配列は、第二の配列に対応する核酸の転写および／または翻訳に影響を及ぼす。
【００２８】
用語「組換え」は、細胞に関して用いた場合、細胞が異種核酸を複製するか、前記核酸を発現するか、あるいは異種核酸にコードされるペプチド、異種ペプチド、またはタンパク質を発現することを示す。組換え細胞は、細胞の天然（非組換え）型には見られないセンス型またはアンチセンス型いずれかの遺伝子または遺伝子断片を発現することも可能である。組換え細胞はまた、細胞の天然型に見られるが、修飾され、そして人工的手段によって細胞に再度導入されている遺伝子を発現することもまた可能である。
【００２９】
「構造遺伝子」は、タンパク質、ポリペプチドまたはその一部をコードするＤＮＡセグメントを含み、そして転写開始を駆動する５’配列を除く遺伝子の部分である。あるいは構造遺伝子は翻訳不能産物をコードすることも可能である。構造遺伝子は、細胞に通常見られるもの、あるいは導入される細胞または細胞位置で通常は見られないものであることも可能であり、この場合、該遺伝子は「異種遺伝子」と呼ばれる。異種遺伝子は、細菌ゲノムまたはエピソーム、真核、核またはプラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ウイルスＤＮＡあるいは化学的に合成されたＤＮＡを含む、当該技術分野に知られるいかなる供給源に、すべてまたは一部、由来していることも可能である。構造遺伝子は、生物学的活性またはその特性、発現産物の生物学的活性または化学構造、発現率または発現調節の方式を達成可能な１以上の修飾を含有することも可能である。こうした修飾には、限定されるわけではないが、１以上のヌクレオチドの突然変異、挿入、欠失および置換が含まれる。構造遺伝子は、中断されないコード配列を構成することも可能であるし、または適切なスプライス接合部によって結合される１以上のイントロンを含むことも可能である。構造遺伝子は翻訳可能または翻訳不能であることも可能であり、アンチセンス方向にあるものを含む。構造遺伝子は複数の供給源由来および複数の遺伝子配列（天然存在または合成、ここで合成は化学的に合成されたＤＮＡを指す）由来のセグメントの合成物（ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ）であることも可能である。
【００３０】
「由来する」は、供給源（化学的および／または生物学的）から採取されるか、得られるか、受け取られるか、帰着するか、複製されるか、または伝わる（ｄｅｓｃｅｎｄ）ことを意味するよう用いられる。派生物（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）は、元来の供給源の化学的操作または生物学的操作（限定されるわけではないが、置換、付加、挿入、欠失、抽出、単離、突然変異および複製を含む）によって産生されることも可能である。
【００３１】
「化学的に合成された」は、ＤＮＡの配列に関する場合、構成要素ヌクレオチドの一部がｉｎ ｖｉｔｒｏで組み立てられたことを意味する。よく確立された方法（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ， Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ ｏｆ ＤＮＡ ａｎｄ ＲＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ， （１９８３）， Ｗｅｉｓｓｍａｎ（監修）， Ｐｒａｅｇｅｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， ニューヨーク， 第１章）を用いて、ＤＮＡの手動の化学的合成を達成することも可能であり；いくつかの商業的に入手可能な機械の１つを用いて、自動化化学合成を行うことも可能である。
【００３２】
ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ， Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３（１９７０）の相同性並列アルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８５：２４４４（１９８８）の類似性法に関する検索によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化実行（ウィスコンシン遺伝学ソフトウェアパッケージ、遺伝学コンピュータグループ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または視診によって、比較のための配列の最適並列を行うことも可能である。
【００３３】
ＮＣＢＩ基本的局所並列検索ツール（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０）は、米国生物学情報センター（ＮＣＢＩ、メリーランド州ベセスダ）を含むいくつかの供給源から入手可能であり、そして配列解析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘと関連付けて使用するため、インターネット上で入手可能である。該ツールは、ｈｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／でアクセス可能である。このプログラムを用いて配列同一性を決定する方法の説明が、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ｂｌａｓｔ ｈｅｌｐ．ｈｔｍｌで入手可能である。
【００３４】
用語「実質的なアミノ酸同一性」または「実質的なアミノ酸配列同一性」は、アミノ酸配列に適用した場合、そして本明細書で用いる場合、ペプチドが、翻訳されたペプチドのチトクロムｐ４５０モチーフＧＸＲＸＣＸ（Ｇ／Ａ）に続く最初のアミノ酸から停止コドンまでに対応する領域に渡って、参照群に比較した際、少なくとも７０パーセントの配列同一性、好ましくは８０パーセントのアミノ酸配列同一性、より好ましくは９０パーセントのアミノ酸配列同一性、そして最も好ましくは少なくとも９９〜１００パーセントの配列同一性を有する配列を含む、ポリペプチドの特性を示す。
【００３５】
用語「実質的な核酸同一性」または「実質的な核酸配列同一性」は、核酸配列に適用した場合、そして本明細書で用いる場合、ポリヌクレオチドが、翻訳されたペプチドのチトクロムｐ４５０モチーフＧＸＲＸＣＸ（Ｇ／Ａ）に続く最初の核酸から停止コドンまでに対応する領域に渡って、参照群に比較した際、少なくとも７５パーセントの配列同一性、好ましくは８１パーセントの配列同一性、より好ましくは少なくとも９１パーセントの配列同一性、そして最も好ましくは少なくとも９９〜１００パーセントの配列同一性を有する配列を含む、ポリヌクレオチド配列の特性を示す。
【００３６】
ヌクレオチド配列が実質的に同一であることの別の指標は、２つの分子がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズする場合である。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、そして異なる環境において異なるであろう。一般的に、ストリンジェントな条件は、特定の配列に関する、定義されるイオン強度およびｐＨでの熱融点（Ｔｍ）より約５℃〜約２０℃、通常、約１０℃〜約１５℃低いように選択される。Ｔｍは、（定義されるイオン強度およびｐＨで）標的配列の５０％が、マッチしたプローブにハイブリダイズする温度である。典型的には、ストリンジェントな条件は、ｐＨ７で塩濃度が約０．０２モル濃度であり、そして温度が少なくとも約６０℃であるものであろう。例えば標準的サザンハイブリダイゼーション法において、ストリンジェントな条件は、４２℃の６ｘＳＳＣ中の最初の洗浄、続いて少なくとも約５５℃、典型的には約６０℃、そしてしばしば約６５℃の温度での０．２ｘＳＳＣ中の１以上のさらなる洗浄を含むであろう。
【００３７】
ヌクレオチド配列はまた、コードするポリペプチドおよび／またはタンパク質が実質的に同一である場合、本発明の目的のためには、実質的に同一である。したがって、１つの核酸配列が第二の核酸配列と本質的に同じポリペプチドをコードする場合、遺伝暗号に許容される縮重のため、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズしない場合であっても、２つの核酸配列は実質的に同一である（コドン縮重および遺伝暗号の説明に関しては、Ｄａｒｎｅｌｌら（１９９０）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， 第２版 Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ ニューヨークを参照されたい）。タンパク質試料のポリアクリルアミドゲル電気泳動、その後、染色での視覚化などの、当該技術分野に周知のいくつかの手段によって、タンパク質純度または均一性を示すことも可能である。特定の目的のため、高分解能が必要とされる可能性もあり、そして精製のためにＨＰＬＣまたは類似の手段を利用することも可能である。
【００３８】
本明細書において、細胞にＤＮＡセグメント（単数または複数）をトランスファーする核酸分子に関して、用語「ベクター」を用いる。ベクターはＤＮＡを複製するよう作用することも可能であり、そして宿主細胞において、独立に複製可能である。用語「ビヒクル」は、ときに、「ベクター」と交換可能に用いられる。用語「発現ベクター」は、本明細書において、望ましいコード配列、および特定の宿主生物において、機能可能であるように連結されたコード配列の発現に必要な適切な核酸配列を含有する、組換えＤＮＡ分子を指す。原核生物における発現に必要な核酸配列には、通常、プロモーター、オペレーター（場合による）、およびリボソーム結合部位に、しばしば他の配列が伴って、含まれる。
真核細胞は、プロモーター、エンハンサー、および終結シグナルおよびポリアデニル化シグナルを利用することが知られる。
【００３９】
根がある、完全に遺伝子操作された植物を再生するため、ｉｎ ｖｉｖｏ接種などの技術いずれかによって、または完全な植物に再生可能な形質転換植物細胞を産生する、既知のｉｎ ｖｉｔｒｏ組織培養技術のいずれかによって、核酸を植物細胞に挿入することも可能である。したがって、例えば、植物細胞への挿入は、病原性または非病原性Ａ．ツメファシエンス（Ａ． ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）によるｉｎ ｖｉｔｒｏ接種によることも可能である。他のこうした組織培養技術もまた、使用可能である。
【００４０】
「植物組織」には、植物の分化組織および未分化組織が含まれ、限定されるわけではないが、根、芽、葉、花粉、種子、腫瘍組織および培養中の多様な型の細胞、例えば単細胞、プロトプラスト、胚およびカルス組織が含まれる。植物組織は、植物中（ｉｎ ｐｌａｎｔａ）または器官中にあることも、組織または細胞培養物であることも可能である。
【００４１】
「植物細胞」には、本明細書において、植物中の植物細胞、並びに培養中の植物細胞およびプロトプラストが含まれる。
「ｃＤＮＡ」または「相補ＤＮＡ」は、一般的に、ＲＮＡ分子に相補的なヌクレオチド配列を持つ一本鎖ＤＮＡ分子を指す。ｃＤＮＡは、ＲＮＡテンプレートに対する逆転写酵素の作用によって形成される。
【００４２】
核酸配列を得る戦略
本発明にしたがって、変換（ｃｏｎｖｅｒｔｅｒ）および非変換タバコ属系統のタバコ属組織からＲＮＡを抽出した。次いで、抽出したＲＮＡを用いてｃＤＮＡを生成した。次いで、２つの戦略を用いて、本発明の核酸配列を生成した。
【００４３】
第一の戦略では、植物組織からポリＡ濃縮ＲＮＡを抽出し、そして逆転写ＰＣＲによってｃＤＮＡを作成した。次いで、一本鎖ｃＤＮＡを用い、縮重プライマーに加えて、オリゴｄ（Ｔ）逆方向プライマーを用いて、ｐ４５０特異的ＰＣＲ集団を生成した。プライマー設計は、ｐ４５０の高度に保存されたモチーフに基づいた。特異的縮重プライマーの例を図１に示す。適切なサイズの挿入物を含有するプラスミド由来の配列断片をさらに解析した。これらのサイズの挿入物は、どのプライマーを用いたかに応じて、典型的には、約３００〜約８００ヌクレオチドの範囲であった。
【００４４】
第二の戦略では、まず、ｃＤＮＡライブラリーを構築した。プラスミド中のｃＤＮＡを用い、縮重プライマーに加えて、逆方向プライマーとしてプラスミド上のＴ７プライマーを用いて、ｐ４５０特異的ＰＣＲ集団を生成した。第一の戦略におけるように、適切なサイズの挿入物を含有するプラスミド由来の配列断片をさらに解析した。
【００４５】
高レベルのノルニコチンを生じることが知られるタバコ属植物系統（変換系統）、および検出不能なレベルのノルニコチンを有する植物系統を出発材料として使用することも可能である。
【００４６】
次いで、植物から葉を取り除き、そしてエチレンで処理して、本明細書に定義するｐ４５０酵素活性を活性化することも可能である。当該技術分野に知られる技術を用いて、総ＲＮＡを抽出する。次いで、図１５３に記載するようなオリゴｄ（Ｔ）プライマーを用いたＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて、ｃＤＮＡ断片を生成することも可能である。次いで、本明細書の実施例に、より完全に記載する、ｃＤＮＡライブラリーを構築することも可能である。
【００４７】
ｐ４５０型酵素に保存される領域を縮重プライマーのテンプレートとして用いることも可能である（図７５）。縮重プライマーを用いて、ｐ４５０特異的バンドをＰＣＲによって増幅することも可能である。ｐ４５０様酵素を示すバンドをＤＮＡ配列決定によって同定することも可能である。ＢＬＡＳＴ検索、並列、または適切な候補を同定する他のツールを用いて、ＰＣＲ断片を性質決定することも可能である。
【００４８】
同定された断片からの配列情報を用いて、ＰＣＲプライマーを発展させることも可能である。ｃＤＮＡライブラリー中のプラスミドプライマーと組み合わせてこれらのプライマーを用い、全長ｐ４５０遺伝子をクローニングした。大規模サザン逆解析を行って、得られたすべての断片クローン、およびいくつかの場合、全長クローンに関して、示差発現を調べた。本発明のこの側面において、クローニングされた挿入物すべてをスクリーニングするため、クローニングされたＤＮＡ断片とハイブリダイズするプローブとして、異なる組織由来の標識総ｃＤＮＡを用いて、これらの大規模逆サザンアッセイを行うことも可能である。
【００４９】
非放射性および放射性（Ｐ３２）ノーザンブロッティングアッセイもまた用いて、クローンｐ４５０断片および全長クローンを性質決定した。
全長クローンのアミノ酸配列を得て、そして抗原性であり、そして他のクローンに比較してユニークであるペプチド領域を選択することによって、いくつかの全長クローンに対してペプチド特異的抗体を作成した。キャリアータンパク質にコンジュゲート化した合成ペプチドに対して、ウサギ抗体を作成した。これらの抗体を用いて、植物組織に対して、ウェスタンブロッティング解析または他の免疫学的方法を行った。
【００５０】
ウイルス誘導性遺伝子サイレンシング技術を用いることによって、上述のように同定された核酸配列を調べることも可能である（ＶＩＧＳ， Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １９９９， ２：１０９−１１３）。
【００５１】
全長クローンのアミノ酸配列を得て、そして潜在的に抗原性であり、そして他のクローンに比較してユニークであるペプチド領域を選択することによって、いくつかの全長クローンに対してペプチド特異的抗体を作成した。キャリアータンパク質にコンジュゲート化した合成ペプチドに対して、ウサギ抗体を作成した。これらの抗体を用いて、ウェスタンブロッティング解析を行った。
【００５２】
本発明の別の側面において、本発明のタバコ属植物におけるチトクロムｐ４５０酵素活性をさらに性質決定するため、ＲＮＡ干渉技術（ＲＮＡｉ）を用いる。この技術を説明する以下の参考文献、Ｓｍｉｔｈら， Ｎａｔｕｒｅ， ２０００， ４０７：３１９−３２０；Ｆｉｒｅら， Ｎａｔｕｒｅ， １９９８， ３９１：３０６−３１１；Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら， ＰＮＡＳ， １９９８， ９５：１３９５９−１３９６４；Ｓｔａｌｂｅｒｇら， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １９９３， ２３：６７１−６８３；Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １９９９， ２：１０９−１１３；およびＢｒｉｇｎｅｔｉら， ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ， １９９８， １７（２２）：６７３９−６７４６が本明細書に援用される。ＲＮＡｉ技術、アンチセンス技術、または記載される多様な他の方法を用いて、植物を形質転換することも可能である。
【００５３】
植物細胞に外来（ｆｏｒｅｉｇｎ）遺伝物質を導入するための、そして導入された遺伝子を安定して維持し、そして発現する植物を得るための、いくつかの技術が存在する。こうした技術には、微小粒子上にコーティングした遺伝物質を細胞内に直接加速することが含まれる（Ｃｏｒｎｅｌｌに対する米国特許４，９４５，０５０およびＤｏｗＥｌａｎｃ
ｏに対する５，１４１，１３１）。アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）技術を用いて、植物を形質転換することも可能であり、トレド大学に対する米国特許５，１７７，０１０、Ｔｅｘａｘ Ａ＆Ｍに対する５，１０４，３１０、Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｔに対する欧州特許出願０１３１６２４Ｂ１、欧州特許出願１２０５１６、１５９４１８Ｂ１、欧州特許出願１２０５１６、１５９４１８Ｂ１および１７６，１１２、Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｔに対する米国特許５，１４９，６４５、５，４６９，９７６、５，４６４，７６３および４，９４０，８３８および４，６９３，９７６、すべてＭａｘＰｌａｎｃｋに対する欧州特許出願１１６７１８、２９０７９９、３２０５００、Ｊａｐａｎ Ｎｉｃｏｔｉａｎａに対する欧州特許出願６０４６６２および６２７７５２、すべてＣｉｂａ
Ｇｅｉｇｙに対する欧州特許出願０２６７１５９および０２９２４３５および米国特許５，２３１，０１９、どちらもＣａｌｇｅｎｅに対する米国特許５，４６３，１７４および４，７６２，７８５、並びにどちらもＡｇｒａｃｅｔｕｓに対する米国特許５，００４，８６３および５，１５９，１３５を参照されたい。他の形質転換技術には、ウィスカー技術が含まれ、どちらもＺｅｎｅｃａに対する米国特許５，３０２，５２３および５，４６４，７６５を参照されたい。植物を形質転換するにはエレクトロポレーション技術もまた用いられてきており、Ｂｏｙｃｅ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅに対するＷＯ ８７／０６６１４、どちらもＤｅｋａｌｂに対する５，４７２，８６９および５，３８４，２５３、どちらもＰＧＳに対するＷＯ９２０９６９６およびＷＯ９３２１３３５を参照されたい。これらの形質転換特許および刊行物はすべて、本明細書に援用される。植物を形質転換する多くの技術に加えて、外来遺伝子と接触させる組織の種類もまた、多様であることも可能である。こうした組織には、限定されるわけではないが、胚形成組織、カルス組織Ｉ型およびＩＩ型、胚軸、成長点等が含まれるであろう。当業者の技術内の適切な技術を用いて、脱分化中の、ほぼすべての植物組織を形質転換することも可能である。
【００５４】
植物に導入される外来遺伝物質には、選択可能マーカーが含まれることも可能である。特定のマーカーを優先するのは、当業者の自由裁量であるが、以下の選択可能マーカーのいずれかとともに、選択可能マーカーとして機能可能な、本明細書に列挙されていない他の遺伝子のいずれも使用可能である。こうした選択可能マーカーには、限定されるわけではないが、抗生物質カナマイシン、ネオマイシンおよびＧ４１８に対する抵抗性をコードするトランスポゾンＴｎ５のアミノグリコシド・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ＡｐｈＩＩ）とともに、グリフォセート；ハイグロマイシン；メトトレキセート；フォスフィノスリシン（ｂａｒ）；イミダゾリノン、スルホニル尿素およびトリアゾロピリミジン除草剤、例えばクロロスルフロン；ブロモキシニル、ダラポン等に対する抵抗性または耐性をコードする遺伝子が含まれる。
【００５５】
選択可能マーカーに加えて、レポーター遺伝子を用いることが望ましい可能性もある。いくつかの例において、選択可能マーカーを伴わずに、レポーター遺伝子を用いることも可能である。レポーター遺伝子は、レシピエント生物または組織に典型的には存在しないかまたはこれらで発現されていない遺伝子である。レポーター遺伝子は、典型的には何らかの表現型変化または酵素特性を提供するタンパク質をコードする。こうした遺伝子の例が、本明細書に援用されるＫ． Ｗｅｉｓｉｎｇら Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ２２， ４２１（１９８８）に提供される。好ましいレポーター遺伝子には、限定なしに、グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子およびＧＦＰ遺伝子が含まれる。
【００５６】
植物組織にひとたび導入されたならば、当該技術分野に知られるいかなる手段によって構造遺伝子の発現をアッセイすることも可能であり、そして転写されるｍＲＮＡ、合成されるタンパク質、または生じる遺伝子サイレンシングの量として、発現を測定することも可能である（本明細書に援用される米国特許第５，５８３，０２１号を参照されたい）。植物組織のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養のための技術が知られ、そしていくつかの場合、全植物
への再生の技術が知られる（ＥＰ出願第８８８１０３０９．０）。導入された発現複合体を商業的に有用な品種にトランスファーするための方法が、当業者に知られる。
【００５７】
望ましいレベルのｐ４５０酵素を発現する植物細胞がひとたび得られたら、当該技術分野に周知の方法および技術を用いて、そこから植物組織および全植物を再生することも可能である。次いで、再生された植物を、慣用的手段によって、繁殖させ、そして慣用的な植物育種技術によって、導入された遺伝子を他の系統および品種にトランスファーすることも可能である。
【００５８】
以下の実施例は、本発明を実行する方法を例示し、そして付随する請求項に定義される本発明の範囲を例示するが、これを限定しないことが理解されなければならない。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】図１は、核酸配列番号１およびアミノ酸配列番号２を示す。
【図２】図２は、核酸配列番号３およびアミノ酸配列番号４を示す。
【図３】図３は、核酸配列番号５およびアミノ酸配列番号６を示す。
【図４】図４は、核酸配列番号７およびアミノ酸配列番号８を示す。
【図５】図５は、核酸配列番号９およびアミノ酸配列番号１０を示す。
【図６】図６は、核酸配列番号１１およびアミノ酸配列番号１２を示す。
【図７】図７は、核酸配列番号１３およびアミノ酸配列番号１４を示す。
【図８】図８は、核酸配列番号１５およびアミノ酸配列番号１６を示す。
【図９】図９は、核酸配列番号１７およびアミノ酸配列番号１８を示す。
【図１０】図１０は、核酸配列番号１９およびアミノ酸配列番号２０を示す。
【図１１】図１１は、核酸配列番号２１およびアミノ酸配列番号２２を示す。
【図１２】図１２は、核酸配列番号２３およびアミノ酸配列番号２４を示す。
【図１３】図１３は、核酸配列番号２５およびアミノ酸配列番号２６を示す。
【図１４】図１４は、核酸配列番号２７およびアミノ酸配列番号２８を示す。
【図１５】図１５は、核酸配列番号２９およびアミノ酸配列番号３０を示す。
【図１６】図１６は、核酸配列番号３１およびアミノ酸配列番号３２を示す。
【図１７】図１７は、核酸配列番号３３およびアミノ酸配列番号３４を示す。
【図１８】図１８は、核酸配列番号３５およびアミノ酸配列番号３６を示す。
【図１９】図１９は、核酸配列番号３７およびアミノ酸配列番号３８を示す。
【図２０】図２０は、核酸配列番号３９およびアミノ酸配列番号４０を示す。
【図２１】図２１は、核酸配列番号４１およびアミノ酸配列番号４２を示す。
【図２２】図２２は、核酸配列番号４３およびアミノ酸配列番号４４を示す。
【図２３】図２３は、核酸配列番号４５およびアミノ酸配列番号４６を示す。
【図２４】図２４は、核酸配列番号４７およびアミノ酸配列番号４８を示す。
【図２５】図２５は、核酸配列番号４９およびアミノ酸配列番号５０を示す。
【図２６】図２６は、核酸配列番号５１およびアミノ酸配列番号５２を示す。
【図２７】図２７は、核酸配列番号５３およびアミノ酸配列番号５４を示す。
【図２８】図２８は、核酸配列番号５５およびアミノ酸配列番号５６を示す。
【図２９】図２９は、核酸配列番号５７およびアミノ酸配列番号５８を示す。
【図３０】図３０は、核酸配列番号５９およびアミノ酸配列番号６０を示す。
【図３１】図３１は、核酸配列番号６１およびアミノ酸配列番号６２を示す。
【図３２】図３２は、核酸配列番号６３およびアミノ酸配列番号６４を示す。
【図３３】図３３は、核酸配列番号６５およびアミノ酸配列番号６６を示す。
【図３４】図３４は、核酸配列番号６７およびアミノ酸配列番号６８を示す。
【図３５】図３５は、核酸配列番号６９およびアミノ酸配列番号７０を示す。
【図３６】図３６は、核酸配列番号７１およびアミノ酸配列番号７２を示す。
【図３７】図３７は、核酸配列番号７３およびアミノ酸配列番号７４を示す。
【図３８】図３８は、核酸配列番号７５およびアミノ酸配列番号７６を示す。
【図３９】図３９は、核酸配列番号７７およびアミノ酸配列番号７８を示す。
【図４０】図４０は、核酸配列番号７９およびアミノ酸配列番号８０を示す。
【図４１】図４１は、核酸配列番号８１およびアミノ酸配列番号８２を示す。
【図４２】図４２は、核酸配列番号８３およびアミノ酸配列番号８４を示す。
【図４３】図４３は、核酸配列番号８５およびアミノ酸配列番号８６を示す。
【図４４】図４４は、核酸配列番号８７およびアミノ酸配列番号８８を示す。
【図４５】図４５は、核酸配列番号８９およびアミノ酸配列番号９０を示す。
【図４６】図４６は、核酸配列番号９１およびアミノ酸配列番号９２を示す。
【図４７】図４７は、核酸配列番号９２およびアミノ酸配列番号９３を示す。
【図４８】図４８は、核酸配列番号９５およびアミノ酸配列番号９６を示す。
【図４９】図４９は、核酸配列番号９７およびアミノ酸配列番号９８を示す。
【図５０】図５０は、核酸配列番号９９およびアミノ酸配列番号１００を示す。
【図５１】図５１は、核酸配列番号１０１およびアミノ酸配列番号１０２を示す。
【図５２】図５２は、核酸配列番号１０３およびアミノ酸配列番号１０４を示す。
【図５３】図５３は、核酸配列番号１０５およびアミノ酸配列番号１０６を示す。
【図５４】図５４は、核酸配列番号１０７およびアミノ酸配列番号１０８を示す。
【図５５】図５５は、核酸配列番号１０９およびアミノ酸配列番号１１０を示す。
【図５６】図５６は、核酸配列番号１１１およびアミノ酸配列番号１１２を示す。
【図５７】図５７は、核酸配列番号１１３およびアミノ酸配列番号１１４を示す。
【図５８】図５８は、核酸配列番号１１５およびアミノ酸配列番号１１６を示す。
【図５９】図５９は、核酸配列番号１１７およびアミノ酸配列番号１１８を示す。
【図６０】図６０は、核酸配列番号１１９およびアミノ酸配列番号１２０を示す。
【図６１】図６１は、核酸配列番号１２１およびアミノ酸配列番号１２２を示す。
【図６２】図６２は、核酸配列番号１２３およびアミノ酸配列番号１２４を示す。
【図６３】図６３は、核酸配列番号１２５およびアミノ酸配列番号１２６を示す。
【図６４】図６４は、核酸配列番号１２７およびアミノ酸配列番号１２８を示す。
【図６５】図６５は、核酸配列番号１２９およびアミノ酸配列番号１３０を示す。
【図６６】図６６は、核酸配列番号１３１およびアミノ酸配列番号１３２を示す。
【図６７】図６７は、核酸配列番号１３３およびアミノ酸配列番号１３４を示す。
【図６８】図６８は、核酸配列番号１３５およびアミノ酸配列番号１３６を示す。
【図６９】図６９は、核酸配列番号１３７およびアミノ酸配列番号１３８を示す。
【図７０】図７０は、核酸配列番号１３９およびアミノ酸配列番号１４０を示す。
【図７１】図７１は、核酸配列番号１４１およびアミノ酸配列番号１４２を示す。
【図７２】図７２は、核酸配列番号１４３およびアミノ酸配列番号１４４を示す。
【図７３】図７３は、核酸配列番号１４５およびアミノ酸配列番号１４６を示す。
【図７４】図７４は、核酸配列番号１４７およびアミノ酸配列番号１４８を示す。
【図７５】図７５は、核酸配列番号１４９およびアミノ酸配列番号１５０を示す。
【図７６】図７６は、核酸配列番号１５１およびアミノ酸配列番号１５２を示す。
【図７７】図７７は、核酸配列番号１５３およびアミノ酸配列番号１５４を示す。
【図７８】図７８は、核酸配列番号１５５およびアミノ酸配列番号１５６を示す。
【図７９】図７９は、核酸配列番号１５７およびアミノ酸配列番号１５８を示す。
【図８０】図８０は、核酸配列番号１５９およびアミノ酸配列番号１６０を示す。
【図８１】図８１は、核酸配列番号１６１およびアミノ酸配列番号１６２を示す。
【図８２】図８２は、核酸配列番号１６３およびアミノ酸配列番号１６４を示す。
【図８３】図８３は、核酸配列番号１６５およびアミノ酸配列番号１６６を示す。
【図８４】図８４は、核酸配列番号１６７およびアミノ酸配列番号１６８を示す。
【図８５】図８５は、核酸配列番号１６９およびアミノ酸配列番号１７０を示す。
【図８６】図８６は、核酸配列番号１７１およびアミノ酸配列番号１７２を示す。
【図８７】図８７は、核酸配列番号１７３およびアミノ酸配列番号１７４を示す。
【図８８】図８８は、核酸配列番号１７５およびアミノ酸配列番号１７６を示す。
【図８９】図８９は、核酸配列番号１７７およびアミノ酸配列番号１７８を示す。
【図９０】図９０は、核酸配列番号１７９およびアミノ酸配列番号１８０を示す。
【図９１】図９１は、核酸配列番号１８１およびアミノ酸配列番号１８２を示す。
【図９２】図９２は、核酸配列番号１８３およびアミノ酸配列番号１８４を示す。
【図９３】図９３は、核酸配列番号１８５およびアミノ酸配列番号１８６を示す。
【図９４】図９４は、核酸配列番号１８７およびアミノ酸配列番号１８８を示す。
【図９５】図９５は、核酸配列番号１８９およびアミノ酸配列番号１９０を示す。
【図９６】図９６は、核酸配列番号１９１およびアミノ酸配列番号１９２を示す。
【図９７】図９７は、核酸配列番号１９３およびアミノ酸配列番号１９４を示す。
【図９８】図９８は、核酸配列番号１９５およびアミノ酸配列番号１９６を示す。
【図９９】図９９は、核酸配列番号１９７およびアミノ酸配列番号１９８を示す。
【図１００】図１００は、核酸配列番号１９９およびアミノ酸配列番号２００を示す。
【図１０１】図１０１は、核酸配列番号２０１およびアミノ酸配列番号２０２を示す。
【図１０２】図１０２は、核酸配列番号２０３およびアミノ酸配列番号２０４を示す。
【図１０３】図１０３は、核酸配列番号２０５およびアミノ酸配列番号２０６を示す。
【図１０４】図１０４は、核酸配列番号２０７およびアミノ酸配列番号２０８を示す。
【図１０５】図１０５は、核酸配列番号２０９およびアミノ酸配列番号２１０を示す。
【図１０６】図１０６は、核酸配列番号２１１およびアミノ酸配列番号２１２を示す。
【図１０７】図１０７は、核酸配列番号２１３およびアミノ酸配列番号２１４を示す。
【図１０８】図１０８は、核酸配列番号２１５およびアミノ酸配列番号２１６を示す。
【図１０９】図１０９は、核酸配列番号２１７およびアミノ酸配列番号２１８を示す。
【図１１０】図１１０は、核酸配列番号２１９およびアミノ酸配列番号２２０を示す。
【図１１１】図１１１は、核酸配列番号２２１およびアミノ酸配列番号２２２を示す。
【図１１２】図１１２は、核酸配列番号２２３およびアミノ酸配列番号２２４を示す。
【図１１３】図１１３は、核酸配列番号２２５およびアミノ酸配列番号２２６を示す。
【図１１４】図１１４は、核酸配列番号２２７およびアミノ酸配列番号２２８を示す。
【図１１５】図１１５は、核酸配列番号２２９およびアミノ酸配列番号２３０を示す。
【図１１６】図１１６は、核酸配列番号２３１およびアミノ酸配列番号２３２を示す。
【図１１７】図１１７は、核酸配列番号２３３およびアミノ酸配列番号２３４を示す。
【図１１８】図１１８は、核酸配列番号２３５およびアミノ酸配列番号２３６を示す。
【図１１９】図１１９は、核酸配列番号２３７およびアミノ酸配列番号２３８を示す。
【図１２０】図１２０は、核酸配列番号２３９およびアミノ酸配列番号２４０を示す。
【図１２１】図１２１は、核酸配列番号２４１およびアミノ酸配列番号２４２を示す。
【図１２２】図１２２は、核酸配列番号２４３およびアミノ酸配列番号２４４を示す。
【図１２３】図１２３は、核酸配列番号２４５およびアミノ酸配列番号２４６を示す。
【図１２４】図１２４は、核酸配列番号２４７およびアミノ酸配列番号２４８を示す。
【図１２５】図１２５は、核酸配列番号２４９およびアミノ酸配列番号２５０を示す。
【図１２６】図１２６は、核酸配列番号２５１およびアミノ酸配列番号２５２を示す。
【図１２７】図１２７は、核酸配列番号２５３およびアミノ酸配列番号２５４を示す。
【図１２８】図１２８は、核酸配列番号２５５およびアミノ酸配列番号２５６を示す。
【図１２９】図１２９は、核酸配列番号２５７およびアミノ酸配列番号２５８を示す。
【図１３０】図１３０は、核酸配列番号２５９およびアミノ酸配列番号２６０を示す。
【図１３１】図１３１は、核酸配列番号２６１およびアミノ酸配列番号２６２を示す。
【図１３２】図１３２は、核酸配列番号２６３およびアミノ酸配列番号２６４を示す。
【図１３３】図１３３は、核酸配列番号２６５およびアミノ酸配列番号２６６を示す。
【図１３４】図１３４は、核酸配列番号２６７およびアミノ酸配列番号２６８を示す。
【図１３５】図１３５は、核酸配列番号２６９およびアミノ酸配列番号２７０を示す。
【図１３６】図１３６は、核酸配列番号２７１およびアミノ酸配列番号２７２を示す。
【図１３７】図１３７は、核酸配列番号２７３およびアミノ酸配列番号２７４を示す。
【図１３８】図１３８は、核酸配列番号２７５およびアミノ酸配列番号２７６を示す。
【図１３９】図１３９は、核酸配列番号２７７およびアミノ酸配列番号２７８を示す。
【図１４０】図１４０は、核酸配列番号２７９およびアミノ酸配列番号２８０を示す。
【図１４１】図１４１は、核酸配列番号２８１およびアミノ酸配列番号２８２を示す。
【図１４２】図１４２は、核酸配列番号２８３およびアミノ酸配列番号２８４を示す。
【図１４３】図１４３は、核酸配列番号２８５およびアミノ酸配列番号２８６を示す。
【図１４４】図１４４は、核酸配列番号２８７およびアミノ酸配列番号２８８を示す。
【図１４５】図１４５は、核酸配列番号２８９およびアミノ酸配列番号２９０を示す。
【図１４６】図１４６は、核酸配列番号２９１およびアミノ酸配列番号２９２を示す。
【図１４７】図１４７は、核酸配列番号２９３およびアミノ酸配列番号２９４を示す。
【図１４８】図１４８は、核酸配列番号２９５およびアミノ酸配列番号２９６を示す。
【図１４９】図１４９は、核酸配列番号２９７およびアミノ酸配列番号２９８を示す。
【図１５１−１】図１５１は、配列グループの比較を示す。
【図１５１−２】図１５１は、配列グループの比較を示す。
【図１５１−３】図１５１は、配列グループの比較を示す。
【図１５１−４】図１５１は、配列グループの比較を示す。
【図１５１−５】図１５１は、配列グループの比較を示す。
【図１５１−６】図１５１は、配列グループの比較を示す。
【図１５１−７】図１５１は、配列グループの比較を示す。
【図１５１−８】図１５１は、配列グループの比較を示す。
【図１５１−９】図１５１は、配列グループの比較を示す。
【図１５１−１０】図１５１は、配列グループの比較を示す。
【図１５１−１１】図１５１は、配列グループの比較を示す。
【図１５２−１】図１５２は、全長クローンの並列を例示する。
【図１５２−２】図１５２は、全長クローンの並列を例示する。
【図１５２−３】図１５２は、全長クローンの並列を例示する。
【図１５２−４】図１５２は、全長クローンの並列を例示する。
【図１５２−５】図１５２は、全長クローンの並列を例示する。
【図１５３】図１５３は、ＰＣＲによるチトクロムｐ４５０ ｃＤＮＡのクローニングに用いた方法を示す。
【実施例】
【００６０】
（実施例１）
植物組織の発育およびエチレン処理
植物栽培
植物の種子を植木鉢に蒔き、そして温室で４週間栽培した。４週齢の苗を個々の植木鉢に移植し、そして温室で２ヶ月栽培した。栽培中、植物に１日２回、１５０ｐｐｍ ＮＰＫ肥料を含有する水を与えた。広がった緑の葉を植物から分離して、以下に記載するエチレン処理を行った。
【００６１】
細胞株７８３７９
ケンタッキー大学から譲渡されたバレー種タバコ系統であるタバコ系統７８３７９を、植物材料の供給源として用いた。当該技術分野における標準のように、１００の植物を栽培し、そして移植して、そして別個の番号（１〜１００）でタグ付けした。推奨されるように、受精およびフィールド管理を行った。
【００６２】
１００の植物の４分の３が、ニコチンの２０〜１００％をノルニコチンに変換した。１００の植物の４分の１が、ニコチンの５％未満をノルニコチンに変換した。８７番の植物が最低の変換を有し（２％）、一方、２１番の植物が１００％の変換を有した。３％未満を変換する植物を非変換系統と分類した。８７番の植物および２１番の植物の自家受粉種子とともに交雑（２１ｘ８７および８７ｘ２１）種子を作成して、遺伝子相違および表現型相違を研究した。２１番の自家受粉由来の植物は変換系統であり、そして８７番の自家受粉由来の９９％が非変換系統であった。８７番由来の植物の残り１％は、低変換（５〜１５％）を示した。相互交雑由来の植物は、すべて変換系統であった。
【００６３】
細胞株４４０７
バレー種系統であるタバコ属系統４４０７を植物材料の供給源として用いた。均質でそして代表的な植物（１００）を選択し、そしてタグ付けした。１００の植物のうち９７が非転換系統であり、そして３つが変換系統であった。５６番の植物が最小量の変換を有し（１．２％）、そして５８番の植物が最高レベルの変換を有した（９６％）。これらの２つの植物を用いて、自家受粉種子および交雑種子を作成した。
【００６４】
５８番の自家受粉由来の植物は、変換系統対非変換系統比３：１に分かれた。５８−３３および５８−２５の植物が、それぞれ、ホモ接合体変換植物系統および非変換植物系統と同定された。次世代の子孫を解析することによって、５８−３３が安定変換系統であることが確認された。
【００６５】
細胞株ＰＢＬＢ０１
ＰＢＬＢ０１は、ＰｒｏｆｉＧｅｎ， Ｉｎｃ．に開発されたバレー種系統であり、そ
してこれを植物材料の供給源として用いた。ＰＢＬＢ０１の原種（ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）種子から、変換系統植物を選択した。
【００６６】
エチレン処理法
温室で２〜３ヶ月栽培した植物から緑の葉を分離し、そして０．３％のエチレン溶液（調製商標、エテフォン（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ））をスプレーした。スプレーした葉を各々、加湿器を備えた養生ラックに吊るし、そしてプラスチックで覆った。処理中、試料の葉に定期的にエチレン溶液をスプレーした。エチレン処理のおよそ２４〜４８時間後、ＲＮＡ抽出のため、葉を収集した。代謝構成要素解析のため、別の下位試料を採取して、葉の代謝産物、および多様なアルカロイドなどのより具体的な目的の構成要素の濃度を測定した。
【００６７】
例えば、以下のようにアルカロイド分析を行うことも可能である。試料（０．１ｇ）を、０．５ｍｌの２Ｎ ＮａＯＨ、並びに内部標準としてのキノリン、およびメチルｔ−ブチルエーテルを含有する５ｍｌの抽出溶液とともに、１５０ｒｐｍで振盪した。ＦＩＤ検出装置を備えたＨＰ６８９０ＧＣ上で試料を分析した。検出装置および注入装置には、２５０℃の温度を用いた。１分あたり１０℃、１１０〜１８５℃の温度勾配で、５％フェノールおよび９５％メチルシリコンで架橋した融解石英からなるＨＰカラム（３０ｍ−０．３２ｎｍ−１ｍ）を用いた。キャリアーガスとしてヘリウムを用いて、１００℃、流速１．７ｃｍ３／分、４０：１の分割比、２・１注入体積で、カラムを操作した。
【００６８】
（実施例２）
ＲＮＡ単離
ＲＮＡ抽出のため、２ヶ月齢の温室栽培植物の中央部の葉を、記載するようにエチレン処理した。０時間および２４〜４８時間の試料をＲＮＡ抽出に用いた。いくつかの場合、花頭除去１０日後の植物から、老化過程にある葉の試料を採取した。これらの試料もまた、抽出に用いた。製造者のプロトコルにしたがって、Ｒｎｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ， Ｉｎｃ．、カリフォルニア州バレンシア）を用い、総ＲＮＡを単離した。
【００６９】
液体窒素下で、ＤＥＰＣ処理した乳鉢および乳棒を用いて、組織試料を細かい粉末にすりつぶした。すりつぶした組織およそ１００ミリグラムを、滅菌１．５ｍｌエッペンドルフ試験管に移した。すべての試料を収集し終わるまで、この試料試験管を液体窒素中に入れた。次いで、キットに提供される緩衝液ＲＬＴ ４５０μｌ（メルカプトエタノールを添加したもの）を個々の各試験管に添加した。試料を激しくボルテックスし、そして５６℃で３分間インキュベーションした。次いで、２ｍｌ収集試験管に入れたＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒＴＭスピンカラムに溶解物を適用し、そして最大速度で２分間遠心分離した。フロースルーを収集し、そして透明な溶解物に０．５体積のエタノールを添加した。試料をよく混合し、そして２ｍｌ収集試験管に入れたＲｎｅａｓｙ（登録商標）ミニスピンカラムに移した。試料を１０，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。次に、７００μｌの緩衝液ＲＷ１をＲｎｅａｓｙ（登録商標）カラム上にピペッティングし、そして１０，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。緩衝液ＲＰＥを新しい収集試験管中のＲｎｅａｓｙ（登録商標）カラム上にピペッティングし、そして１０，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。緩衝液ＲＰＥを再びＲｎｅａｓｙ（登録商標）スピンカラム上に添加し、そして最大速度で２分間遠心分離して、膜を乾燥させた。エタノールのキャリー・オーバーをすべて取り除くため、別個の収集試験管中に膜を入れ、そして最大速度でさらに１分間遠心分離した。Ｒｎｅａｓｙ（登録商標）カラムを新しい１．５ｍｌ収集試験管に移し、そして４０μｌのＲｎａｓｅ不含水を、Ｒｎｅａｓｙ（登録商標）膜上に直接ピペッティングした。この最終溶出液試験管を１０，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。変性ホルムアルデヒドゲルおよび分光光度計によって、総ＲＮＡの品質および量を解析した。
【００７０】
製造者のプロトコルにしたがって、ＯｌｉｇｏｔｅｘＴＭポリＡ＋ ＲＮＡ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．）を用いてポリ（Ａ）ＲＮＡを単離した。最大体積２５０μｌ中、約２００μｇの総ＲＮＡを用いた。２５０μｌの体積の緩衝液ＯＢＢおよび１５μｌのＯｌｉｇｏｔｅｘＴＭ懸濁物を２５０μｌの総ＲＮＡに添加した。ピペッティングによって内容物を完全に混合し、そして加熱ブロック上、７０℃で３分間インキュベーションした。次いで、試料をおよそ２０分間室温に置いた。最大速度で２分間遠心分離することによって、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ：ｍＲＮＡ複合体をペレットにした。５０μｌを残してすべての上清を微量遠心管から取り除いた。ＯＢＢ緩衝液によって試料をさらに処理した。ボルテックスによって、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ：ｍＲＮＡペレットを４００μｌの緩衝液ＯＷ２に再懸濁した。新しい試験管に入れた小さいスピンカラム上にこの混合物を移して、そして最大速度で１分間遠心分離した。スピンカラムを新しい試験管に移して、そしてさらに４００μｌの緩衝液ＯＷ２をカラムに添加した。次いで、試験管を最大速度で１分間遠心分離した。スピンカラムを最後の１．５ｍｌ微量遠心管に移した。６０μｌの熱い（７０℃）緩衝液ＯＥＢで試料を溶出した。変性ホルムアルデヒドゲルおよび分光光度解析によって、ポリＡ産物を解析した。
【００７１】
（実施例３）
逆転写−ＰＣＲ
製造者のプロトコル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）にしたがってＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素を用いて、第一鎖ｃＤＮＡを産生した。ポリＡ＋濃縮ＲＮＡ／オリゴｄＴプライマー混合物は、５μｇ未満の総ＲＮＡ、１μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ混合物、１μｌのオリゴｄ（Ｔ）１２−１８（０．５μｇ／μｌ）、および１０μｌまでのＤＥＰＣ処理水からなった。各試料を６５℃で５分間インキュベーションし、次いで氷上に少なくとも１分間置いた。以下の構成要素の各々を順番に添加することによって、反応混合物を調製した：２μｌの１０ｘＲＴ緩衝液、４μｌの２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２μｌの０．１Ｍ ＤＴＴ、および１μｌのＲＮａｓｅ ＯＵＴ組換えＲＮａｓｅ阻害剤。９μｌの反応混合物を各ＲＮＡ／プライマー混合物にピペッティングして添加し、そして穏やかに混合した。これを４２℃で２分間インキュベーションし、そして１μｌのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＴＭ ＲＴを各試験管に添加した。試験管を４２℃で５０分間インキュベーションした。７０℃で１５分間処理して反応を終結させ、そして氷上で冷却した。遠心分離によって試料を収集し、そして１μｌのＲＮａｓｅ Ｈを各試験管に添加し、そして３７℃で２０分間インキュベーションした。２００ｐｍｏｌの順方向プライマー（図７５、配列番号１４９〜１５６に示すような縮重プライマー）および１００ｐｍｏｌの逆方向プライマー（１８ｎｔオリゴｄ（Ｔ）の後に１つのランダム塩基が続く混合物）を用いて、第二のＰＣＲを行った。
【００７２】
反応条件は、９４℃で２分間であり、そして次いで９４℃１分間、４５℃〜６０℃２分間、７２℃３分間の４０サイクルのＰＣＲを行い、７２℃でさらに１０分間伸長を行った。
【００７３】
１％アガロースゲルを用いた電気泳動によって、１０μｌの増幅試料を解析した。アガロースゲルから正しいサイズの断片を精製した。
【００７４】
（実施例４）
ＰＣＲ断片集団の生成
製造者の指示にしたがって、実施例３由来のＰＣＲ断片をｐＧＥＭ−Ｔ（登録商標）Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）に連結した。連結した産物をＪＭ１０９コンピテント細胞に形質転換し、そしてブルー／ホワイトセレクションのため、ＬＢ培地プレート上に蒔いた。コロニーを選択し、そして１．２ｍｌのＬＢ培地
を含む９６ウェルプレート中で３７℃で一晩増殖させた。すべての選択されるコロニーに関して、凍結ストックを生成した。Ｗｉｚａｒｄ ＳＶ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ（登録商標）キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）とともに、ＢｅｃｋｍａｎのＢｉｏｍｅｃｋ ２０００ミニプレップ・ロボットを用いて、プレートからプラスミドＤＮＡを精製した。１００μｌの水でプラスミドＤＮＡを溶出し、そして９６ウェルプレート中に保存した。ＥｃｏＲ１でプラスミドを消化し、そして１％アガロースゲルを用いて解析して、ＤＮＡ量および挿入物のサイズを確認した。ＣＥＱ ２０００配列決定装置（Ｂｅｃｋｍａｎ、カリフォルニア州フラートン）を用いて、４００〜６００ｂｐの挿入物を含有するプラスミドの配列を決定した。ＢＬＡＳＴ検索によって、ＧｅｎＢａｎｋデータベースと該配列を並列した。ｐ４５０関連断片を同定し、そしてさらに解析した。あるいは、サブトラクション・ライブラリーからｐ４５０断片を単離した。これらの断片もまた、上述のように解析した。
【００７５】
（実施例５）
ｃＤＮＡライブラリーの構築
以下のように、エチレン処理した葉から、総ＲＮＡを調製することによって、ｃＤＮＡライブラリーを構築した。まず、修飾した酸フェノールおよびクロロホルム抽出プロトコルを用いて、タバコ系統５８−３３のエチレン処理した葉から、総ＲＮＡを抽出した。１グラムの組織を用いて、これをすりつぶし、そして続いて５ｍｌの抽出緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５；２００ｍＭ ＮａＣｌ；１０ｍＭ ＥＤＴＡ；０．５％ＳＤＳ）中でボルテックスし、これに５ｍｌのフェノール（ｐＨ５．５）および５ｍｌのクロロホルムを添加するように、プロトコルを修飾した。抽出した試料を遠心分離し、そして上清を取り置いた。上清が透明に見えるようになるまで、この抽出工程をさらに２〜３回反復した。およそ５ｍｌのクロロホルムを添加して、微量のフェノールを取り除いた。３倍体積のＥｔＯＨおよび１／１０体積の３Ｍ ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）を添加し、そして−２０℃に１時間保存することによって、合わせた上清分画からＲＮＡを沈殿させた。Ｃｏｒｅｘガラス容器に移した後、ＲＮＡ分画を、４℃、９，０００ＲＰＭで４５分間遠心分離した。ペレットを７０％エタノールで洗浄し、そして４℃、９，０００ＲＰＭで５分間回転させた。ペレットを乾燥させた後、ペレットにしたＲＮＡを０．５ｍｌ
ＲＮａｓｅ不含水に溶解した。ペレットにしたＲＮＡを０．５ｍｌ ＲＮａｓｅ不含水に溶解した。変性ホルムアルデヒドゲルおよび分光光度計によって、それぞれ、総ＲＮＡの品質および量を解析した。
【００７６】
以下のプロトコルによって、オリゴ（ｄＴ）セルロース・プロトコル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および微量遠心分離装置スピンカラム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ポリＡ＋ ＲＮＡに関して、生じた総ＲＮＡを単離した。およそ２０ｍｇの総ＲＮＡを、２回の精製に供して、高品質のポリＡ＋ ＲＮＡを得た。ｍＲＮＡが高品質であることを確実にするため、変性ホルムアルデヒドゲル、そして続いて既知の全長遺伝子のＲＴ−ＰＣＲを行うことによって、ポリＡ＋ ＲＮＡ産物を解析した。
【００７７】
次に、ポリＡ＋ ＲＮＡをテンプレートとして用いて、ｃＤＮＡ合成キット、ＺＡＰ−ｃＤＮＡ（登録商標）合成キット、およびＺＡＰ−ｃＤＮＡ（登録商標）Ｇｉｇａｐａｃｋ（登録商標）ＩＩＩゴールド・クローニングキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホヤ）を使用して、ｃＤＮＡライブラリーを産生した。方法は、明記するような以下の製造者のプロトコルを含んだ。およそ８μｇのポリＡ＋ ＲＮＡを用いて、ｃＤＮＡライブラリーを構築した。一次ライブラリーの解析によって、約２．５ｘ１０６〜１ｘ１０７ｐｆｕであることが明らかになった。ＩＰＴＧおよびＸ−ｇａｌを用いた補完アッセイによって、ライブラリーの品質バックグラウンド試験を完了し、ここで組換えプラークは、バックグラウンド反応より１００倍を超えて発現していた。
【００７８】
ランダムＰＣＲによる、ライブラリーのより定量的な解析によって、挿入ｃＤＮＡの平
均サイズがおよそ１．２ｋｂであることが示された。該方法は、以下のような２工程ＰＣＲ法を用いた。第一の工程のため、ｐ４５０断片から得た予備的配列情報に基づいて、逆プライマーを設計した。設計した逆方向プライマーおよびＴ３（順方向）プライマーを用いて、ｃＤＮＡライブラリーから、対応する遺伝子を増幅した。ＰＣＲ反応をアガロース電気泳動に供して、そして高分子量の対応するバンドを切り出し、精製し、クローニングし、そして配列決定した。第二の工程において、ｐ４５０の５’ＵＴＲまたは開始コード領域から順方向プライマーとして設計した新規プライマーを、逆方向プライマー（ｐ４５０の３’ＵＴＲから設計）とともに、続くＰＣＲで用いて、全長ｐ４５０クローンを得た。
【００７９】
逆方向プライマーを除いて、実施例３に記載するように構築したｃＤＮＡライブラリーから、ＰＣＲ増幅によって、ｐ４５０断片を生成した。プラスミド上でｃＤＮＡ挿入物（図７５を参照されたい）の下流に位置するＴ７プライマーを逆方向プライマーとして用いた。実施例４に記載するように、ＰＣＲ断片を単離し、クローニングし、そして配列決定した。
【００８０】
構築したｃＤＮＡライブラリーから、ＰＣＲ法によって、全長ｐ４５０遺伝子を単離した。遺伝子特異的逆方向プライマー（ｐ４５０断片の下流配列から設計）および順方向プライマー（ライブラリープラスミド上のＴ３）を用いて、全長遺伝子をクローニングした。ＰＣＲ断片を単離し、クローニングし、そして配列決定した。必要であれば、第二の工程のＰＣＲを適用した。第二の工程において、クローニングしたｐ４５０の５’ＵＴＲから設計した新規順方向プライマーとともに、ｐ４５０クローンの３’ＵＴＲから設計した逆方向プライマーを、続くＰＣＲ反応で用いて、全長ｐ４５０クローンを得た。続いてクローンの配列を決定した。
【００８１】
（実施例６）
クローニングした断片の性質決定−逆サザンブロッティング解析
上記実施例で同定したｐ４５０クローンすべてに対して、非放射性大規模逆サザンブロッティングアッセイを行って、示差発現を検出した。異なるｐ４５０クラスターの間で発現レベルが非常に異なることが観察された。高発現のものに対して、さらなるリアルタイム検出を行った。
【００８２】
非放射性サザンブロッティング法を以下のように行った。
１）実施例２に記載するように、Ｑｉａｇｅｎ Ｒｎａｅａｓｙキットを用いて、エチレン処理および非処理変換系統（５８−３３）および非変換系統（５８−２５）の葉から総ＲＮＡを抽出した。
【００８３】
２）上記工程で生成したポリＡ＋濃縮ＲＮＡ由来の一本鎖ｃＤＮＡをビオチン−テール標識することによって、プローブを産生した。ビオチン化オリゴｄＴをプライマーとして（Ｐｒｏｍｅｇａ）用いることを除いて、実施例３に記載するように、変換系統および非変換系統総ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって、この標識一本鎖ｃＤＮＡを生成した。これらをプローブとして用いて、クローニングしたＤＮＡとハイブリダイズさせた。
【００８４】
３）プラスミドＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲ１で消化して、そしてアガロースゲル上で泳動した。ゲルを乾燥させて、そして同時に２つのナイロン膜にトランスファーした（Ｂｉｏｄｙｎｅ Ｂ（登録商標））。一方の膜を変換系統プローブとハイブリダイズさせ、そして他方を非変換系統プローブとハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション前に、膜をＵＶ架橋した（自動架橋セッティング、２５４ｎｍ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ）。
【００８５】
あるいは、ｐ−ＧＥＭプラスミドの両方のアームに位置する配列、Ｔ３およびＳＰ６をプライマーとして用いて、各プラスミドから挿入物をＰＣＲ増幅した。９６ウェルＲｅａｄｙ−ｔｏ−ｒｕｎアガロースゲル上で泳動することによって、ＰＣＲ産物を解析した。確認した挿入物を２つのナイロン膜上にドットした。一方の膜を変換系統プローブとハイブリダイズさせ、そして他方を非変換プローブとハイブリダイズさせた。
【００８６】
４）洗浄ストリンジェンシーを修飾し、製造者の指示にしたがって、膜をハイブリダイズさせ、そして洗浄した（Ｅｎｚｏ ＭａｘＳｅｎｃｅＴＭキット、Ｅｎｚｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， Ｉｎｃ、ニューヨーク州ファーミンデール）。膜を、ハイブリダイゼーション緩衝液（界面活性剤およびハイブリダイゼーション増進剤を含有する、２ｘＳＳＣ緩衝ホルムアミド）と４２℃で３０分間プレハイブリダイズさせ、そして１０μｌ変性プローブと４２℃で一晩ハイブリダイズさせた。次いで、膜を１ｘハイブリダイゼーション洗浄緩衝液で、室温で１０分間１回洗浄し、そして６８℃で１５分間４回洗浄した。膜の検出準備が出来た。
【００８７】
５）製造者の検出法に記載されるように（Ｅｎｚｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， Ｉｎｃ．）、アルカリホスファターゼ標識、その後、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ比色検出によって、洗浄した膜を検出した。１ｘブロッキング溶液を用いて、膜を室温で１時間ブロッキングし、１ｘ検出試薬で１０分間３回洗浄し、１ｘ現像前反応緩衝液で５分間２回洗浄し、そして次いで、ドットが現れるまで、現像溶液中でブロットを３０〜４５分間現像した。すべての試薬は、製造者（Ｅｎｚｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， Ｉｎｃ）に提供された。さらに、製造者の指示にしたがって、ＫＰＬサザンハイブリダイゼーションおよび検出キットＴＭ（ＫＰＬ、メリーランド州ガイザーズバーグ）を用いてもまた、大規模逆サザンアッセイを行った。
【００８８】
（実施例７）
クローンの性質決定−ノーザンブロット解析
サザンブロット解析の代わりに、ノーザンブロッティングアッセイの例に記載されるように、いくつかの膜をハイブリダイズさせ、そして検出した。以下のように、ノーザンハイブリダイゼーションを用いて、タバコ属において、示差発現されるｍＲＮＡを検出した。
【００８９】
ランダムプライミング法を用いて、クローニングしたｐ４５０からプローブを調製した（ＭｅｇａｐｒｉｍｅＴＭ ＤＮＡ標識系、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。
【００９０】
以下の構成要素を混合した：２５ｎｇ変性ＤＮＡテンプレート；各４μｌの非標識ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰ；５μｌの反応緩衝液；Ｐ３２−標識ｄＡＴＰおよび２μｌのクレノウＩ；並びに反応を５０μｌにするＨ２Ｏ。混合物を３７℃で１〜４時間インキュベーションし、次いで２μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡで反応を停止した。使用前にプローブを９５℃で５分間インキュベーションすることによって、変性させた。
【００９１】
いくつかの対のタバコ系統の新鮮なエチレン処理葉および非処理葉から、ＲＮＡ試料を調製した。いくつかの場合、ポリＡ＋濃縮ＲＮＡを用いた。およそ１５μｇの総ＲＮＡまたは１．８μｇのｍＲＮＡ（実施例５に記載するようなＲＮＡおよびｍＲＮＡ抽出法）をＤＥＰＣ Ｈ２Ｏ（５〜１０μｌ）で等体積にした。同体積の装填緩衝液（１ｘＭＯＰＳ；１８．５％ホルムアルデヒド；５０％ホルムアミド；４％ Ｆｉｃｏｌｌ４００；ブロモフェノールブルー）および０．５μｌ ＥｔＢｒ（０．５μｇ／μｌ）を添加した。続いて、電気泳動によってＲＮＡを分離するため、調製物中の試料を変性させた。
【００９２】
１ｘＭＯＰ緩衝液（０．４Ｍモルホリノプロパンスルホン酸；０．１Ｍ Ｎａ−酢酸−３ｘＨ２Ｏ；１０ｍＭ ＥＤＴＡ；ＮａＯＨでｐＨ７．２に調整）を用いて、ホルムアルデヒドゲル（１％アガロース、１ｘＭＯＰＳ、０．６Ｍホルムアルデヒド）上で、試料を電気泳動に供した。１０ｘＳＳＣ緩衝液（１．５Ｍ ＮａＣｌ；０．１５Ｍクエン酸ナトリウム）中で２４時間キャピラリー法を行うことによって、ＲＮＡをＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋膜（ナイロン、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）にトランスファーした。ＲＮＡ試料を含む膜を、ハイブリダイゼーション前にＵＶ架橋した（自動架橋セッティング、２５４ｎｍ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ）。
【００９３】
膜を、５〜１０ｍｌのプレハイブリダイゼーション緩衝液（５ｘＳＳＣ；５０％ホルムアミド；５ｘデンハルト溶液；１％ ＳＤＳ；１００μｇ／ｍｌ熱変性剪断非相同ＤＮＡ）と４２℃で１〜４時間プレハイブリダイズさせた。古いプレハイブリダイゼーション緩衝液を廃棄し、そして新しいプレハイブリダイゼーション緩衝液およびプローブを添加した。ハイブリダイゼーションを４２℃で一晩行った。２ｘＳＳＣで膜を室温で１５分間洗浄し、次いで２ｘＳＳＣで洗浄した。
【００９４】
本発明の主要な焦点は、エチレン処理の結果誘導可能であるか、またはタバコ葉の品質および構成要素に重要な役割を果たすことも可能な、新規遺伝子の発見であった。以下の表に例示するように、ノーザンブロットおよび逆サザンブロットは、非誘導植物に比較して、どの遺伝子がエチレン処理によって誘導されたのかを決定するのに有用であった。興味深いことに、変換系統および非変換系統で、すべての断片が同様に影響を受けるのではなかった。注目されるチトクロムｐ４５０断片を部分的に配列決定して、構造的関連性を決定した。この情報を用いて、注目される全長遺伝子クローンを続いて単離し、そして性質決定した。
【００９５】
【表１】
【００９６】
エチレン処理で誘導した、変換および非変換バレー種系統から得たタバコ組織に対して、全長クローンを用いて、ノーザン解析を行った。目的は、エチレン誘導非変換バレー種系統に比較して、エチレン誘導変換系統に比較して、エチレン誘導変換系統で発現上昇を示す全長クローンを同定することであった。そうすることによって、変換系統および非変換系統間の葉構成要素の生化学的相違を比較することにより、全長クローンの機能的関係を決定することも可能である。以下の表に示すように、＋で示す非変換系統エチレン処理
組織のものより、変換系統エチレン処理組織において、＋＋および＋＋＋で示すように、６つのクローンが有意により高い発現を示した。これらのクローンはすべて、エチレン処理しない変換系統および非変換系統で、ほとんどまたはまったく発現を示さなかった。
【００９７】
【表２】
【００９８】
（実施例８）
クローニングした遺伝子にコードされるｐ４５０の免疫検出
３つのｐ４５０クローンから、１）他のクローンに対してより低い相同性を有するかまたはまったく相同性を持たず、そして２）優れた親水性および抗原性を有する、長さ２０〜２２アミノ酸に対応するペプチド領域を選択した。それぞれのｐ４５０クローンから選択したペプチド領域のアミノ酸配列を以下に列挙する。合成したペプチドをＫＨＬとコンジュゲート化し、そして次いでウサギに注射した。第４回の注射の２週間後および４週間後に抗血清を収集した（Ａｌｐｈａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｔｌ． Ｉｎｃ．、テキサス州サンアントニオ）。
【００９９】
Ｄ２３４−ＡＤ１ ＤＩＤＧＳＫＳＫＬＶＫＡＨＲＫＩＤＥＩＬＧ
Ｄ９０ａ−ＢＢ３ ＲＤＡＦＲＥＫＥＴＦＤＥＮＤＶＥＥＬＮＹ
Ｄ８９−ＡＢ１ ＦＫＮＮＧＤＥＤＲＨＦＳＱＫＬＧＤＬＡＤＫＹ
ウェスタンブロット解析によって、タバコ植物組織由来のタンパク質を標的とする交差反応性に関して、抗血清を調べた。エチレン処理した（０〜４０時間）、変換系統および非変換系統の中央部の葉から、未精製タンパク質抽出物を得た。製造者のプロトコルにしたがって、ＲＣ ＤＣタンパク質アッセイキット（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いて、抽出物のタンパク質濃度を測定した。
【０１００】
各レーンに２マイクログラムのタンパク質を装填し、そしてＬａｅｍｍｌｉ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ系を用いて、１０％〜２０％勾配ゲル上でタンパク質を分離した。Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ（登録商標）セミドライセル（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いて、ＰＲＯＴＲＡＮ（登録商標）ニトロセルロース・トランスファー膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ）にゲルからタンパク質をトランスファーした。ＥＣＬ ＡｄｖａｎｃｅＴＭウェスタンブロッティング検出キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、標的ｐ４５０タンパク質を検出し、そして視覚化した。ウサギにおいて、合成ＫＬＨコンジュゲートに対する一次抗体を作成した。ペルオキシダーゼとカップリングした、ウサギＩｇＧに対する二次抗体をＳｉｇｍａから購入した。一次抗体および二次抗体のどちらも、１：１０００希釈で用いた。抗体は、ウェスタンブロット上で、単一のバンドに強い反応性を示し、抗血清が、目的の標的ペプチドに単一特異的であることを示した。抗血清はまた、ＫＬＨにコンジュゲート化した合成ペプチドとも交差反応性であった。
【０１０１】
（実施例９）
単離核酸断片の核酸同一性および構造関連性
ノーザンブロット解析と組み合わせて、クローニングした１００を超えるｐ４５０断片を配列決定して、構造的関連性を決定した。用いたアプローチは、ｐ４５０遺伝子のカルボキシル末端近くに位置する２つの一般的なｐ４５０モチーフのいずれかに基づく順方向プライマーを利用した。順方向プライマーは、図１に示すような、チトクロムｐ４５０モチーフＦＸＰＥＲＦまたはＧＲＲＸＣＰ（Ａ／Ｇ）に相当した。逆方向プライマーは、プラスミド、ｐＧＥＭＴＭプラスミドの両方のアーム上に位置するＳＰ６またはＴ７、あるいはポリＡテールのいずれか由来の、標準的プライマーを用いた。用いたプロトコルを以下に記載する。
【０１０２】
分光光度測定を用い、製造者のプロトコル（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）にしたがって、出発二本鎖ＤＮＡの濃度を概算した。テンプレートを水で適切な濃度に希釈し、９５℃で２分間加熱し、そして続いて氷上に置くことによって変性させた。０．５〜１０μｌの変性ＤＮＡテンプレート、２μｌの１．６ｐｍｏｌ順方向プライマー、８μｌのＤＴＣＳクイックスタートマスターミックス、および総体積を２０μｌにする水を用いて、配列決定反応物を氷上で調製した。熱周期プログラムは、３０サイクルの以下の周期からなった：９６℃２０秒間、５０℃２０秒間、および６０℃４分間、その後、４℃で維持。
【０１０３】
５μｌの反応停止緩衝液（等体積の３Ｍ ＮａＯＡｃおよび１００ｍＭ ＥＤＴＡ、並びに１μｌの２０ｍｇ／ｍｌグリコーゲン）を添加することによって、配列決定反応を停止した。６０μｌの冷９５％エタノールで試料を沈殿させ、そして６０００ｇで６分間遠心分離した。エタノールを廃棄した。ペレットを２００μｌの冷７０％エタノールで２回洗浄した。ペレットを乾燥させた後、４０μｌのＳＬＳ溶液を添加し、そしてペレットを再懸濁した。ミネラルオイルの層を重層した。次いで、さらに解析するため、試料をＣＥＱ ８０００自動化配列決定装置に入れた。
【０１０４】
核酸配列を検証するため、ｐ４５０遺伝子のＦＸＰＥＲＦまたはＧＲＲＸＣＰ（Ａ／Ｇ）領域に対する順方向プライマー、あるいはプラスミドまたはポリＡテールいずれかに対する逆方向プライマーを用いて、核酸配列を、両方向に再配列決定した。すべての配列決定を、両方向に、少なくとも２回行った。
【０１０５】
チトクロムｐ４５０断片の核酸配列を、ＧＲＲＸＣＰ（Ａ／Ｇ）モチーフをコードする領域の後の最初の核酸から停止コドンまでに対応するコード領域で、互いに比較した。この領域を、ｐ４５０タンパク質間の遺伝子多様性の指標として選択した。他の植物種と同様、多数の遺伝的に別個のｐ４５０遺伝子が７０遺伝子を超えて観察された。核酸配列の比較に際して、配列同一性に基づいて、遺伝子を別個の配列グループに入れることが可能であることが見出された。ｐ４５０メンバーの最適なユニークなグループ分けが、７５％以上の核酸同一性を持つ配列であると決定されることが見出された（表Ｉに示す）。同一性パーセントを減少させると、有意により大きいグループとなった。８１％以上の核酸同一性を持つ配列に関して、好ましいグループ分けが観察され、より好ましいグループ分けは９１％以上の核酸同一性のものであり、そして最も好ましいグループ分けは９９％以上の核酸同一性の配列であった。グループの大部分は少なくとも２つのメンバーを含有し、そしてしばしば３以上のメンバーを含有した。他のものは反復して発見されず、ここで取ったアプローチが、用いた組織で低発現されるｍＲＮＡおよび高発現されるｍＲＮＡの両方を単離可能であったことが示唆される。
【０１０６】
７５％以上の核酸同一性に基づいて、２つのチトクロムｐ４５０グループが、グループ内にあるものとは遺伝的に異なる、先のタバコ・チトクロム遺伝子に核酸配列同一性を含有することが見出された。グループ２３は、表Ｉに用いたパラメーター内で、それぞれＣｚｅｒｎｉｃらおよびＲａｌｓｔｏｎらによる、ＧＩ：１１７１５７９（ＣＡＡ６４６３５）およびＧＩ：１４４２３３２７（またはＡＡＫ６２３４６）の先のＧｅｎＢａｎｋ配列に、核酸同一性を示した。ＧＩ：１１７１５７９は、グループ２３のメンバーに、９６．９％〜９９．５％の範囲の核酸同一性を示し、一方、ＧＩ：１４４２３３２７は、このグループに、９５．４％〜９６．９％の範囲の同一性を有した。グループ３１のメンバーは、ＲａｌｓｔｏｎらによるＧＩ：１４４２３３１９（ＡＡＫ６２３４２）のＧｅｎＢａｎｋに報告された配列に、７６．７％〜９７．８％の範囲の核酸同一性を示した。表１の他のｐ４５０同一性グループはいずれも、Ｒａｌｓｔｏｎら、Ｃｚｅｒｎｉｃら、Ｗａｎｇら、またはＬａＲｏｓａおよびＳｍｉｇｏｃｋｉに報告されるタバコ属ｐ４５０遺伝子に、表１で用いたようなパラメーター同一性を含有しなかった。
【０１０７】
図７６に示すように、グループに関して、適切な核酸縮重プローブとともにコンセンサス配列を得て、タバコ属植物からの各グループのさらなるメンバーを優先的に同定し、そして単離することも可能である。
【０１０８】
【表３−１】
【０１０９】
【表３−２】
【０１１０】
（実施例１０）
単離核酸断片の関連アミノ酸配列同一性
実施例８由来のチトクロムｐ４５０断片に関して得た核酸配列のアミノ酸配列を推定した。推定した領域は、ＧＸＲＸＣＰ（Ａ／Ｇ）配列モチーフの直後のアミノ酸からカルボキシル末端の終わり、または停止コドンまでに相当した。断片の配列同一性の比較に際して、７０％以上のアミノ酸同一性を持つ配列に関して、ユニークなグループ分けが観察された。８０％以上のアミノ酸同一性を持つ配列に関して、好ましいグループ分けが観察され、より好ましいグループ分けは９０％以上のアミノ酸同一性のものであり、そして最も好ましいグループ分けは９９％以上のアミノ酸同一性の配列であった。グループおよびグループメンバーの対応するアミノ酸配列を図２に示す。ユニークな核酸配列のいくつかは、他の断片と完全なアミノ酸同一性を有することが見出され、そしてしたがって、同一アミノ酸を持つ１つのメンバーのみが報告された。
【０１１１】
表ＩＩのグループ１９のアミノ酸同一性は、核酸配列に基づいて、３つの別個のグループに対応した。各グループメンバーのアミノ酸配列およびその同一性を図７７に示す。アミノ酸相違に適切に印を付ける。
【０１１２】
遺伝子クローニングおよび植物を用いた機能研究のため、各アミノ酸同一性グループの少なくとも１つのメンバーを選択した。さらに、ノーザンおよびサザン解析によって評価されるように、エチレン処理または他の生物学的相違によって異なって影響を受けるグループメンバーを、遺伝子クローニングおよび機能研究のため、選択した。遺伝子クローニング、発現研究および全植物評価を補助するため、配列同一性および示差配列に関して、ペプチド特異的抗体が調製されるであろう。
【０１１３】
【表４−１】
【０１１４】
【表４−２】
【０１１５】
（実施例１１）
全長クローンの関連アミノ酸配列同一性
実施例５でクローニングした全長タバコ属遺伝子の核酸配列を、全アミノ酸配列に関して推定した。チトクロムｐ４５０遺伝子は、３つの保存されるｐ４５０ドメインモチーフの存在によって同定され、該モチーフは、カルボキシル末端のＵＸＸＲＸＸＺ、ＰＸＲＦＸＦまたはＧＸＲＸＣ、ここでＵはＥまたはＫであり、Ｘはアミノ酸いずれかであり、そしてＺはＰ、Ｔ、ＳまたはＭである、に対応した。クローンのうち２つ、Ｄ１３０−ＡＡ１およびＤ１０１−ＢＡ２は、ほぼ完全であるようだったが、適切な停止コドンを欠き、しかしどちらも３つのｐ４５０チトクロムドメインすべてを含有した。ＢＬＡＳＴプログラムを用いて、全長配列を互いに、そして既知のタバコ遺伝子に比較して、ｐ４５０遺伝子すべてをアミノ酸同一性に関して性質決定した。該プログラムは、ＮＣＢＩ特別ＢＬＡＳＴツール（２配列並列（ｂ１２ｓｅｑ）、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｂｌ２．ｈｔｍｌ）を用いた。核酸配列に関してはフィルターをかけずにＢＬＡＳＴＮで、そしてアミノ酸配列に関してはＢＬＡＳＴＰで、２つの配列を並列させた。アミノ酸同一性パーセントに基づいて、各配列を同一性グループにグループ分けし、グループ分けは、別のメンバーと少なくとも８５％の同一性を共有するメンバーを含有した。９０％以上のアミノ酸同一性を持つ配列に関して、好ましいグループ分けが観察され、より好ましいグループ分けは９５％以上のアミノ酸同一性のものであり、そして最も好ましいグループ分けは９９％以上のアミノ酸同一性の配列を有した。これらの基準を用いて、２５のユニークなグループが同定され、そしてこれらを表ＩＩＩに示す。
【０１１６】
アミノ酸同一性に関する表ＩＩＩに用いたパラメーター内で、３つのグループが、既知のタバコ遺伝子に対して８５％以上の同一性を含有することが見出された。グループ５のメンバーは、ＲａｌｓｔｏｎらによるＧＩ：１４４２３３２７（またはＡＡＫ６２３４６）の先のＧｅｎＢａｎｋ配列に対して、全長配列に関して最大９６％のアミノ酸同一性を有した。グループ２３は、ＲａｌｓｔｏｎらによるＧＩ：１４４２３３２８（またはＡＡＫ６２３４７）に対して、最大９３％のアミノ酸同一性を有し、そしてグループ２４は、ＲａｌｓｔｏｎらによるＧＩ：１４４２３３１８（またはＡＡＫ６２３４３）に対して、９２％の同一性を有した。
【０１１７】
【表５−１】
【０１１８】
【表５−２】
【０１１９】
カルボキシル末端近くのＵＸＸＲＸＸＺ ｐ４５０ドメインおよびＧＸＲＸＣ ｐ４５０ドメインの間の非常に保存されるアミノ酸相同性に基づいて、全長遺伝子をさらにグループ分けした。図３に示すように、互いに比較して、保存されるドメイン間の配列相同性に関して、個々のクローンを並列させ、そして別個の同一性グループに入れた。いくつかの場合で、クローンの核酸配列はユニークであったが、該領域のアミノ酸配列は同一であった。９０％以上のアミノ酸同一性を持つ配列に関して、好ましいグループ分けが観察され、より好ましいグループは９５％以上のアミノ酸同一性を有し、そして最も好ましいグループ分けは９９％以上のアミノ酸同一性の配列を有した。最後のグループ分けは、クローンの全アミノ酸配列に関する同一性パーセントに基づくものと同様であったが、（表ＩＩＩの）グループ１７だけは例外であり、このグループは２つの別個のグループに分けられた。
【０１２０】
表ＩＶのアミノ酸同一性に関して用いたパラメーター内で、３つのグループが、既知のタバコ属遺伝子に対して９０％以上の同一性を含有することが見出された。グループ５のメンバーは、ＲａｌｓｔｏｎらによるＧＩ：１４４２３３２６（ＡＡＫ６２３４６）の先のＧｅｎＢａｎｋ配列に対して、全長配列に関して最大９３．４％のアミノ酸同一性を有した。グループ２３は、ＲａｌｓｔｏｎらによるＧＩ：１４４２３３２８（またはＡＡＫ６２３４７）に対して、最大９１．８％のアミノ酸同一性を有し、そしてグループ２４は、ＲａｌｓｔｏｎらによるＧＩ：１４４２３３１８（またはＡＡＫ６２３４２）に対して、９８．８％の同一性を有した。
【０１２１】
【表６−１】
【０１２２】
【表６−２】
【０１２３】
（実施例１２）
１以上のタバコ・チトクロムｐ４５０特異的ドメインを欠く、タバコ属チトクロムｐ４５０クローン
４つのクローンは、表ＩＩＩに報告する他のタバコ・チトクロム遺伝子に、９０％〜９９％の核酸相同性の範囲の、高い核酸相同性を有した。４つのクローンには、Ｄ１３６−ＡＤ５、Ｄ１３８−ＡＤ１２、Ｄ２４３−ＡＢ３およびＤ２５０−ＡＣ１１が含まれた。しかし、ヌクレオチド・フレームシフトのため、これらの遺伝子は、３つのＣ末端チトクロムｐ４５０ドメインの１以上を含有せず、そして表ＩＩＩまたは表ＩＶに示す同一性グループからは除外された。
【０１２４】
１つのクローン、Ｄ９５−ＡＧ１のアミノ酸同一性は、表ＩＩＩまたは表ＩＶでｐ４５０タバコ遺伝子をグループ分けするのに用いた、第三のドメイン、ＧＸＲＸＣを含有しなかった。このクローンの核酸相同性は、他のタバコ・チトクロム遺伝子に低い相同性を有した。このクローンは、タバコ属のチトクロムｐ４５０遺伝子の新規のそして異なるグループに相当する。
【０１２５】
（実施例１３）
タバコ特性の制御改変におけるタバコ属チトクロムｐ４５０断片およびクローンの使用
タバコｐ４５０核酸断片または全遺伝子の使用は、改変されたタバコ表現型またはタバコ構成要素、そしてより重要なことに、改変された代謝産物を有する植物を同定し、そして選択する際に有用である。下方制御のため、例えばアンチセンス方向で、または過剰発現のため、例えばセンス方向で、本明細書に報告するものから選択される核酸断片または全長遺伝子を取り込む、多様な形質転換系によって、トランスジェニック・タバコ植物を生成する。全長遺伝子を過剰発現するため、特定の酵素の発現を増加させるのに有効であり、そしてしたがってタバコ属内で表現型効果を生じる、本発明に記載する全長遺伝子のすべてまたは機能する部分またはアミノ酸配列をコードする核酸配列いずれかが望ましい。一連の戻し交雑を通じて、ホモ接合体系統であるタバコ属系統を得て、そして一般の当業者に一般的に利用可能な技術を用いて、限定されるわけではないが、内因性ｐ４５０ ＲＮＡ、転写物、ｐ４５０発現ペプチドおよび植物代謝産物の濃度の解析を含む、表現型変化に関して評価する。タバコ植物で示される変化は、目的の選択される遺伝子の機能的役割に関する情報を提供するか、または好ましいタバコ属植物種として有用性を有する。
【０１２６】
（実施例１４）
エチレン処理した変換系統で誘導される遺伝子の同定
遺伝子発現の定量的で高度に並行の測定のために、高密度オリゴヌクレオチドアレイ技
術であるＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ
Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンタクララ）アレイを用いた。この技術を用いる際、固体表面上でオリゴヌクレオチドを直接合成することによって、核酸アレイを組み立てた。この固相化学反応は、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）と称されるチップ上に、非常に高密度に充填された数十万のオリゴヌクレオチドプローブを含有するアレイを産生可能である。単一のハイブリダイゼーションから、数千の遺伝子を同時にスクリーニングすることも可能である。各遺伝子は、典型的には、サイズに応じて、１１〜２５対のプローブの組によって表される。感度、特異性、および再現性を最大にするようにプローブを設計して、特異的シグナルおよびバックグラウンドシグナル間、並びに緊密に関連する標的配列間の一貫した区別を可能にする。
【０１２７】
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐハイブリダイゼーション実験は、以下の工程を伴う：アレイの設計および産生、生物学的標本から単離したＲＮＡからの蛍光標識標的の調製、ＧｅｎｅＣｈｉｐへの標識した標的のハイブリダイゼーション、アレイのスクリーニング、並びにスキャンした画像の解析および遺伝子発現プロフィールの生成。
【０１２８】
Ａ． Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐの設計およびオーダーメード（ｃｕｓｔｏｍ ｍａｋｉｎｇ）
ＧｅｎｅＣｈｉｐ ＣｕｓｔｏｍＥｘｐｒｅｓｓ Ａｄｖａｎｔａｇｅアレイは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｉｎｃ．（カリフォルニア州サンタクララ）によってオーダーメードされた。チップサイズは１８ミクロンであり、そしてアレイ形式は１００〜２１８７であって、５２８のプローブセット（１１，６２８プローブ）に適応可能である。ＧｅｎＢａｎｋ由来核酸配列を除いて、我々が先に同定したタバコクローンからすべての配列を選択し、そしてプローブはすべてあつらえて設計した。総数４００のタバコ遺伝子または断片がＧｅｎｅＣｈｉｐ上に含まれるように選択した。選択したオリゴヌクレオチドの配列は、遺伝子の３’端のユニークな領域に基づいた。選択した核酸配列は、（特許出願）に記載される、タバコからクローニングされた、５６の全長ｐ４５０遺伝子および７１のｐ４５０断片からなった。他のタバコ配列には、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ ＳＳＨキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州パロアルト）を用いた抑制サブトラクション・ライブラリーから生成した、２７０のタバコＥＳＴが含まれた。これらの遺伝子の中で、ＧｅｎＢａｎｋに列挙されるチトクロムＰ４５０遺伝子から、いくつかのオリゴヌクレオチド配列を選択した。各全長遺伝子に関して、最大２５のプローブを用い、そして各断片に関して１１のプローブを用いた。いくつかのクローンに関しては、ユニークな高品質のプローブがないため、減少した数のプローブを用いた。適切な対照配列もまた、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）上に含んだ。
【０１２９】
プローブアレイは、２５量体オリゴヌクレオチドであり、半導体に基づくフォトリソグラフィーおよび固相化学合成技術の組み合わせによって、ガラス・ウェハー上に直接合成された。各アレイは、最大１００，０００の異なるオリゴヌクレオチドプローブを含有した。オリゴヌクレオチドプローブは、アレイ上の既知の位置で合成されるため、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｕｉｔｅ（登録商標）ソフトウェアによって、ハイブリダイゼーションパターンおよびシグナル強度を、遺伝子同一性および相対発現レベルに関して解釈することも可能である。各プローブ対は、完全マッチオリゴヌクレオチドおよびミスマッチオリゴヌクレオチドからなる。完全マッチプローブは、特定の遺伝子に正確に相補的な配列を有し、そしてしたがって遺伝子の発現を測定する。ミスマッチプローブは、中央の塩基位での単一塩基置換によって、完全マッチプローブとは異なり、この塩基置換が標的遺伝子転写物の結合を妨げる。ミスマッチは、非特異的ハイブリダイゼーションシグナルまたはバックグラウンドシグナルを生じ、これを、完全マッチオリゴヌクレオチドに関して測定されるシグナルに比較した。
【０１３０】
Ｂ．試料調製
Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎｓ， Ｉｎｃ．（テネシー州メンフィス）によって、ハイブリダイゼーション実験を行った。ハイブリダイゼーションで用いるＲＮＡ試料は、エチレン処理によって誘導される、６対の非変換／変換同系系統からなった。試料には、１対の４４０７−２５／４４０７−３３非処理バレー種タバコ試料、３対のエチレン処理４４０７−２５／４４０７−３３試料、１対のエチレン処理した黒（ｄａｒｋ）タバコＮＬ Ｍａｄｏｌｅ／１８１および１対のエチレン処理バレー品種ＰＢＬＢ０１／１７８が含まれた。エチレン処理は、実施例１に記載するとおりであった。
【０１３１】
修飾した酸フェノールおよびクロロホルム抽出プロトコルを用いて、上述のエチレン処理葉および非処理葉から、総ＲＮＡを抽出した。１グラムの組織を用いて、これをすりつぶし、そして続いて５ｍｌの抽出緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５；２００ｍＭ ＮａＣｌ；１０ｍＭ ＥＤＴＡ；０．５％ＳＤＳ）中でボルテックスし、これに５ｍｌのフェノール（ｐＨ５．５）および５ｍｌのクロロホルムを添加するように、プロトコルを修飾した。抽出した試料を遠心分離し、そして上清を取り置いた。上清が透明に見えるようになるまで、この抽出工程をさらに２〜３回反復した。およそ５ｍｌのクロロホルムを添加して、微量のフェノールを取り除いた。３倍体積のＥｔＯＨおよび１／１０体積の３Ｍ ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）を添加し、そして−２０℃に１時間保存することによって、合わせた上清分画からＲＮＡを沈殿させた。Ｃｏｒｅｘガラス容器に移した後、ＲＮＡ分画を、４℃、９，０００ＲＰＭで４５分間遠心分離した。ペレットを７０％エタノールで洗浄し、そして４℃、９，０００ＲＰＭで５分間回転させた。ペレットを乾燥させた後、ペレットにしたＲＮＡを０．５ｍｌ ＲＮａｓｅ不含水に溶解した。ペレットにしたＲＮＡを０．５ｍｌ ＲＮａｓｅ不含水に溶解した。変性ホルムアルデヒドゲルおよび分光光度計によって、それぞれ、総ＲＮＡの品質および量を解析した。３〜５μｇ／μｌの総ＲＮＡ試料をＧｅｎｏｍｅ Ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎｓ， Ｉｎｃ．に送ってハイブリダイゼーションを行った。
【０１３２】
Ｃ．ハイブリダイゼーション、検出およびデータ・アウトプット
標識ｃＲＮＡ物質の調製を以下のように行った。製造者の指示にしたがって、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ二本鎖ｃＤＮＡ合成キット（Ｇｉｂｃｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびオリゴ−ｄＴ２４−Ｔ７（５’− ＧＧＣ ＣＡＧ ＴＧＡ ＡＴＴ ＧＴＡ ＡＴＡ ＣＧＡ ＣＴＣ ＡＣＴ ＡＴＡ ＧＧＧ ＡＧＧ ＣＧＧ−３’）プライマーを用いて、５〜１５μｇの総ＲＮＡから、第一鎖および第二鎖ｃＤＮＡを合成した。
【０１３３】
Ｔ７プロモーターがカップリングした二本鎖ｃＤＮＡをテンプレートとして、そしてＴ７ ＲＮＡ転写物標識キット（ＥＮＺＯ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ．）を用いた、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって、ｃＲＮＡを合成し、そして同時にビオチン化ＵＴＰおよびＣＴＰで標識化した。簡潔には、先の工程から合成した二本鎖ｃＤＮＡを７０％エタノールで２回洗浄し、そして２２μｌのＲｎａｓｅ不含Ｈ２Ｏに再懸濁した。ｃＤＮＡを４μｌの１０ｘ各反応緩衝液、ビオチン標識リボヌクレオチド、ＤＴＴ、Ｒｎａｓｅ阻害剤混合物、および２μｌの２０ｘＴ７ ＲＮＡポリメラーゼと３７℃で５時間インキュベーションした。ＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮ−１００カラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を通過させ、そして−２０℃で１時間〜一晩沈殿させることによって、取り込まれていないリボヌクレオチドから、標識ｃＲＮＡを分離した。
【０１３４】
オリゴヌクレオチドアレイ・ハイブリダイゼーションおよび解析を以下のように行った。ｃＲＮＡペレットを１０μｌのＲｎａｓｅ不含Ｈ２Ｏに再懸濁し、そして２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢酸、ｐＨ８．１、５００ｍＭ ＫＯＡｃ、１５０ｍＭ ＭｇＯＡｃ中で９５℃で３５分間、熱およびイオンが仲介する加水分解によって、１０．０μｇを断片化した
。断片化したｃＲＮＡを、〜１２，５００のアノテートした全長遺伝子とともに、ＥＳＴ配列に相当するように設計されたさらなるプローブセットを含有する、ＨＧ Ｕ９５Ａｖ２オリゴヌクレオチドアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）に４５℃で１６時間ハイブリダイズさせた。６ｘＳＳＰＥ（０．９Ｍ ＮａＣｌ、６０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、６ｍＭ ＥＤＴＡ＋０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０）を用いてアレイを２５℃で洗浄し、次いで１００ｍＭ ＭＥＳ、０．１Ｍ［Ｎａ＋］、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０を用いて、５０℃でストリンジェントな洗浄を行った。アレイをフィコエリトリン・コンジュゲート化ストレプトアビジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で染色し、そしてレーザー共焦点スキャナー（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）を用いて、蛍光強度を測定した。Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙソフトウェア（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いて、スキャンした画像を解析した。用いたすべてのアレイに関して、アレイ上のすべての遺伝子の蛍光強度の平均を、一定の標的強度（２５０）にスケーリングすることによって、試料装填および染色における変動を標準化した。ユーザー指針にしたがって、Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｕｉｔｅ ５．０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いて、データ解析を行った。［Σ（ＰＭ−ＭＭ）／（プローブ対の数）］、式中、ＰＭおよびＭＭは完全マッチおよび不完全マッチを示す、に表される、平均強度相違として各遺伝子のシグナル強度を計算した。
【０１３５】
Ｄ．データ解析および結果
Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎｓの検出装置を用いて生成した発現レポートに立証されるように、１２組のハイブリダイゼーションに成功した。レポートの主なパラメーターには、ノイズ、スケール係数、バックグラウンド、総プローブセット、存在および非存在プローブセットの数およびパーセンテージ、ハウスキーピング対照のシグナル強度が含まれた。続いて、他のＭｉｃｒｏｓｏｆｔソフトウェアと組み合わせてソフトフェアＧＣＯＳを用いて、データを解析し、そして提示した。処理対間のシグナル比較を解析した。複製を含む、異なる処理各々の遺伝子および断片に対応するそれぞれのプローブすべてに関する全体のデータをコンパイルし、そしてコンパイルした発現データ、例えば変化のコールおよびシグナルｌｏｇ２比の変化を解析した。
【０１３６】
ＧｅｎｅＣｈｉｐ技術の典型的な適用は、異なる組織で差次的に発現される遺伝子を発見することである。本出願において、４４０７−２５／４４０７−３３バレー品種、ＰＢＬＢ０１／１７８バレー品種、およびＮＬ Ｍａｄｏｌｅ／１８１黒タバコ品種を含む、変換および非変換タバコ系統対に関して、エチレン処理によって引き起こされる遺伝子発現変動を決定した。これらの解析によって、生物学的変動のため、発現が有意に改変されている遺伝子のみが検出された。これらの解析は、誘導された遺伝子を同定する主な基準として、倍変化（シグナル比）を使用した。他のパラメーター、例えばシグナル強度、存在／非存在コールもまた、考慮した。
【０１３７】
およそ４００遺伝子に関して、変換および非変換対の試料の発現相違に関して、データを解析した後、シグナル強度に基づく結果によって、２つの遺伝子、Ｄ１２１−ＡＡ８、およびＤ１２０−ＡＨ４、並びに１つの断片、Ｄ１２１−ＡＡ８の部分的断片であるＤ３５−ＢＧ１１のみが、エチレン処理変換系統対非変換系統において、再現可能な誘導を有した。これらの遺伝子の示差発現を例示すると、データは以下のように示された。表Ｖに示すように、変換系統、例えばバレー種タバコ品種、４４０７−３３の遺伝子のシグナルを、関連する非変換同系系統、４４０７−２５のシグナルに対する比として決定した。エチレン処理なしでは、すべての遺伝子の変換系統対非変換系統のシグナルの比は、１．００に近づいた。エチレン処理すると、同系バレー系統を用いた３回の独立の解析によって決定されるように、非変換系統に比較して、変換系統において、２つの遺伝子、Ｄ１２１−ＡＡ８およびＤ１２０−ＡＨ４が誘導された。これらの遺伝子は、互いに非常に高い相同性を有し、およそ９９．８％以上の核酸配列相同性を有した。表Ｖに示すように、変換品種における相対的ハイブリダイゼーションシグナルは、変換系統において、非変換対応
物におけるシグナルのおよそ２〜１２倍高い範囲であった。これと比較して、内部対照である２つのアクチン様対照クローンは、標準化した比に基づくと、変換系統で誘導されていないことが見出された。さらに、コード領域中の配列が完全にＤ１２１−ＡＡ８およびＤ１２０−ＡＨ４遺伝子両方に含有される断片（Ｄ３５−ＢＧ１１）は、対の同系変換系統および非変換系統の同じ試料で、高度に誘導された。バレー種タバコ品種、ＰＢＬＢ０１および１７８の別の同系対が、エチレン誘導下、変換系統試料で誘導される、同じ遺伝子、Ｄ１２１−ＡＡ８およびＤ１２０−ＡＨ４を有することが示された。さらに、Ｄ１２１−ＡＡ８およびＤ１２０−ＡＨ４遺伝子は、同系黒タバコ対、ＮＬ Ｍａｄｏｌｅおよび１８１の変換系統で優先的に誘導され、変換系統におけるこれらの遺伝子のエチレン誘導が、バレー種タバコ品種に限定されないことが立証された。すべての場合で、Ｄ３５−ＢＧ１１断片が、非変換対系統に比較して、変換系統で、最も高く誘導された。
【０１３８】
【表７】
【０１３９】
（実施例１５）
タバコ変換系統におけるミクロソーム・ニコチン脱メチル化酵素のエチレン誘導
変換および非変換タバコ系統のエチレン処理および非処理対のミクロソーム濃縮分画において、脱メチル化酵素活性の生化学的解析を、以下のように行った。
【０１４０】
Ａ．ミクロソームの調製
ミクロソームを４℃で単離した。５０ｍＭ Ｎ−（２−ヒドロオキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）、ｐＨ７．５、３ｍＭ ＤＬ−ジチオスレイトール（ＤＴＴ）およびプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を１錠剤／５０ｍｌからなる緩衝液中で、タバコ葉を抽出した。四層のチーズクロスを通じて未精製抽出物をろ過して、破壊されていない組織を取り除き、そしてろ液を２０，０００ｘｇで２０分間遠心分離して、細胞破片を取り除いた。上清を１００，０００ｘｇで６０分間、超遠心に供して、そして生じたペレットはミクロソーム分画を含有した。抽出緩衝液にミクロソーム分画を懸濁し、そして超遠心工程に適用し、ここで抽出緩衝液中の０．５Ｍスクロースの不連続スクロース勾配を用いた。凍結保護剤として１０％（ｗ／ｖ）グリセロールを補った抽出緩衝液に、精製ミクロソームを再懸濁した。ミクロソーム調製物を使用
するまで液体窒素フリーザー中に保存した。
【０１４１】
Ｂ．タンパク質濃度測定
アセトン中の１０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）（ｗ／ｖ）を用いて、ミクロソームタンパク質を沈殿させ、そして製造者のプロトコルにしたがってＲＣ ＤＣタンパク質アッセイキット（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いて、ミクロソームのタンパク質濃度を測定した。
【０１４２】
３）ニコチン脱メチル化酵素活性アッセイ
Ｍｏｒａｖｅｋ ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓからＤＬ−ニコチン（ピロリジン−２−１４Ｃ）を得て、そしてこれは５４ｍＣｉ／ｍｍｏｌの比活性を有した。どちらもｐ４５０阻害剤であるクロルプロマジン（ＣＰＺ）および酸化チトクロムｃ（ｃｙｔ．Ｃ）を、Ｓｉｇｍａから購入した。ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェートの還元型（ＮＡＤＰＨ）は、ＮＡＤＰＨ：チトクロムＰ４５０還元酵素を介したチトクロムＰ４５０の典型的な電子供与体である。対照インキュベーションに関してはＮＡＤＰＨを省いた。日常的な酵素アッセイは、ミクロソームタンパク質（およそ２ｍｇ／ｍｌ）、６ｍＭ ＮＡＤＰＨ、５５μＭ １４Ｃ標識ニコチンからなった。ＣＰＺおよびＣｙｔ．Ｃの濃度は、これらを用いる場合には、それぞれ１ｍＭおよび１００μＭであった。２５℃で１時間反応を行い、そして各２５μｌ反応混合物に３００μｌメタノールを添加して反応を停止した。回転後、メタノール抽出物の２０μｌをＶａｒｉａｎのＩｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３ ３μ（１５０ｘ４．６ｍｍ）カラムを用いて、逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）系（Ａｇｉｌｅｎｔ）で分離した。アイソクラチック可動相は、６０：４０（ｖ／ｖ）の比のメタノールおよび５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．２５の混合物であり、そして流速は１ｍｌ／分であった。真性の非標識ノルニコチンとの比較によって決定されるようなノルニコチンピークを収集し、そして定量化のため、２９００ ｔｒｉ−ｃａｒｂ液体シンチレーションカウンター（ＬＳＣ）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）に供した。１時間インキュベーションに渡る、１４Ｃ標識ノルニコチンの産生に基づいて、ニコチン脱メチル化酵素の活性を計算する。
【０１４３】
エチレン処理したかまたはしなかった、バレー種変換（系統４４０７−３３）および非変換（系統４４０７−２５）タバコ系統の対から試料を得た。すべての未処理試料は、検出可能なミクロソーム・ニコチン脱メチル化酵素活性をまったく持たなかった。対照的に、エチレン処理した変換系統から得たミクロソーム試料は、有意なレベルのニコチン脱メチル化酵素活性を含有することが見出された。ニコチン脱メチル化酵素活性は、Ｐ４５０特異的阻害剤によって阻害されることが示され、脱メチル化酵素活性が、Ｐ４５０ミクロソーム由来酵素に一致することが立証された。バレー種変換タバコ系統に関して得られる、典型的な酵素アッセイ結果の組を表ＶＩに示す。対照的に、エチレン処理した非変換系統タバコから得た試料は、ニコチン脱メチル化酵素活性をまったく含有しなかった。これらの結果によって、ニコチン脱メチル化酵素活性は、変換系統においてエチレン処理で誘導されたが、対応する同系非変換系統では誘導されないことが立証された。同系黒タバコ品種対に関しても同様の結果が得られ、この場合、ミクロソーム・ニコチン脱メチル化酵素活性は、変換系統では誘導され、そして非変換対系統では検出不能であった。これらの実験を総合すると、ミクロソーム・ニコチン脱メチル化酵素活性は、変換系統でエチレン処理に際して誘導される一方、対の同系非変換系統では誘導されないことが立証された。Ｐ４５０由来遺伝子であり、そして対の非変換系統に比較して、変換系統で優先的に誘導される遺伝子は、ニコチン脱メチル化酵素をコードする遺伝子の候補である。
【０１４４】
【表８】
【０１４５】
（実施例１６）
ニコチン脱メチル化酵素としてのＤ１２１−ＡＡ８の機能的同定
酵母細胞において、異種発現されるＰ４５０の酵素活性をアッセイすることによって、ニコチン脱メチル化酵素のコード遺伝子としての候補クローン（Ｄ１２１−ＡＡ８）の機能を確認した。
【０１４６】
１．酵母発現ベクターの構築
Ｐ４５０コードｃＤＮＡ（１２１ＡＡ８）の推定上のタンパク質コード配列を、酵母発現ベクターｐＹｅＤＰ６０にクローニングした。適切なＢａｍＨＩおよびＭｆｅＩ部位（下線）を含有するＰＣＲプライマーを介して、これらの配列を、翻訳開始コドン（ＡＴＧ）の上流または停止コドン（ＴＡＡ）の下流に導入した。増幅されたＰＣＲ産物上のＭｆｅＩは、ベクター上のＥｃｏＲＩ部位と適合する。１２１ＡＡ８ ｃＤＮＡを増幅するのに用いたプライマーは、
【０１４７】
【化１】
【０１４８】
であった。６つのヒスチジンを含めて、タンパク質のＣ末端に９つの余分なアミノ酸をコードする配列セグメントを逆方向プライマーに取り込んだ。これによって、誘導に際して、６ｘＨｉｓをタグ付けしたＰ４５０の発現が促進される。酵素消化した後、ＰＣＲ産物をＧＡＬ１０−ＣＹＣ１プロモーターに関してセンス方向でｐＹｅＤＰ６０ベクターに連結した。酵素制限およびＤＮＡ配列決定によって、構築物を確認した。
【０１４９】
２．酵母形質転換
シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＮＡＤＰＨ−チトクロムＰ４５０還元酵素ＡＴＲ１を発現するように修飾したＷＡＴ１１酵母株を、構築物ｐＹｅＤＰ６０−Ｐ４５０ ｃＤＮＡプラスミドで形質転換した。０．２ｃｍ電極ギャップのキュベット中で、５０マイクロリットルのＷＡＴ１１酵母細胞懸濁物を〜１μｇのプラスミドＤＮＡと混合した。Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆエレクトロポレーション装置（モデル２５１０）によって、２
．０ｋＶでパルスを１回適用した。ＳＧＩプレート（５ｇ／ｌバクトカザミノ酸、６．７ｇ／ｌのアミノ酸不含酵母窒素基剤、２０ｇ／ｌグルコース、４０ｍｇ／ｌ ＤＬ−トリプトファン、２０ｇ／ｌ寒天）上に細胞を広げた。ランダムに選択したコロニーに対して、ＰＣＲ解析を直接行うことによって、形質転換体を確認した。
【０１５０】
３．形質転換酵母細胞におけるＰ４５０発現
単一酵母コロニーを用いて、３０ｍｌ ＳＧＩ培地（５ｇ／ｌバクトカザミノ酸、６．７ｇ／ｌのアミノ酸不含酵母窒素基剤、２０ｇ／ｌグルコース、４０ｍｇ／ｌ ＤＬ−トリプトファン）に接種し、そして３０℃で約２４時間増殖させた。この培養物のアリコットを、１０００ｍｌのＹＰＧＥ培地（１０ｇ／ｌ酵母エキス、２０ｇ／ｌバクトペプトン、５ｇ／ｌグルコース、３０ｍｌ／ｌエタノール）に１：５０で希釈し、そしてＤｉａｓｔｉｘ検尿試薬紙（Ｂａｙｅｒ、インディアナ州エルクハート）の色変化によって示されるように、グルコースが完全に消費されるまで増殖させた。最終濃度２％までＤＬ−ガラクトースを添加することによって、クローニングしたＰ４５０の誘導を開始した。ｉｎ ｖｉｖｏ活性アッセイまたはミクロソーム調製に用いる前に、培養物をさらに２０時間増殖させた。
【０１５１】
ｐＹｅＤＰ６０−ＣＹＰ７１Ｄ２０（タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）の５−エピ−アリストロチェンおよび１−デオキシカプシジオールの水酸化を触媒するＰ４５０）を発現するＷＡＴ１１酵母細胞を、Ｐ４５０発現および酵素活性アッセイの対照として用いた。
【０１５２】
４． ｉｎ ｖｉｖｏ酵素活性
酵母培養物にＤＬ−ニコチン（ピロリジン−２−１４Ｃ）を供給することによって、形質転換酵母細胞におけるニコチン脱メチル化酵素活性をアッセイした。７５μｌのガラクトース誘導培養物に、１４Ｃ標識ニコチン（５４ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）を最終濃度５５μＭまで添加した。１４ｍｌポリプロピレン試験管中、アッセイ培養物を振盪しながら６時間インキュベーションし、そして９００μｌメタノールで抽出した。回転後、２０μｌのメタノール抽出物をｒｐ−ＨＰＬＣで分離して、そしてＬＳＣによってノルニコチン分画を定量化した。
【０１５３】
ＷＡＴ１１（ｐＹｅＤＰ６０−ＣＹＰ７１Ｄ２０）の対照培養物はニコチンをノルニコチンに変換せず、ＷＡＴ１１酵母株が、ニコチンをノルニコチンに生物変換する工程を触媒可能な内因性酵素活性を含有しないことが示された。対照的に、１２１ＡＡ８遺伝子を発現する酵母は、検出可能な量のノルニコチンを産生し、このＰ４５０酵素がニコチン脱メチル化酵素活性を持つことが示された。
【０１５４】
５．酵母ミクロソーム調製
ガラクトースで２０時間誘導した後、遠心分離によって酵母細胞を収集し、そしてＴＥＳ−Ｍ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．６Ｍソルビトール、１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール）で２回洗浄した。ペレットを抽出懸濁液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．６Ｍソルビトール、２ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１％ウシ血清アルブミン、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）１錠剤／５０ｍｌ）に再懸濁した。次いで、細胞をガラスビーズ（直径０．５ｍｍ、Ｓｉｇｍａ）で破壊した。細胞抽出物を２０，０００ｘｇで２０分間遠心分離して、細胞破片を取り除いた。上清を１００，０００ｘｇ、６０分間の超遠心に供して、そして生じたペレットはミクロソーム分画を含有した。ミクロソーム分画をＴＥＧ−Ｍ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０％グリセロールおよび１．５ｍＭ ２−メルカプトエタノール）に、タンパク質濃度１ｍｇ／ｍｌで懸濁した。ミクロソーム調製物を使用するまで液体窒素フリーザー中に保存し
た。
【０１５５】
６．酵母ミクロソーム調製物における酵素活性アッセイ
酵母ミクロソーム調製物を用いて、タンパク質濃度が１ｍｇ／ｍｌで一定であったことを除いて、タバコ葉からのミクロソーム調製物と同じ方式で（実施例１５）、ニコチン脱メチル化酵素活性アッセイを行った。
【０１５６】
ＣＹＰ７１Ｄ２０を発現する対照酵母細胞由来のミクロソーム調製物は、検出可能なミクロソーム・ニコチン脱メチル化酵素活性をまったく持たなかった。対照的に、１２１ＡＡ８遺伝子を発現する酵母細胞から得たミクロソーム試料は、有意なレベルのニコチン脱メチル化酵素活性を示した。ニコチン脱メチル化酵素活性は、ＮＡＤＰＨに必要であり、そしてＰ４５０特異的阻害剤によって阻害されることが示されており、これは研究中のＰ４５０に一致する。酵母細胞に関して得られる、典型的な酵素アッセイ結果の組を表ＶＩＩに示す。
【０１５７】
【表９】
【０１５８】
これらの実験を総合すると、クローニングされた全長遺伝子Ｄ１２１−ＡＡ８が、酵母で発現させた際、ニコチンのノルニコチンへの変換を触媒するチトクロムＰ４５０タンパク質をコードすることが立証された。
【０１５９】
本発明の実施にあたり、本発明の前述の詳細な説明を考慮すると、多くの修飾および変動が当業者には思い浮かぶと期待される。その結果、こうした修飾および変動は、付随する請求項の範囲内に含まれると意図される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１８１である、タバコ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）由来の単離核酸分子。
【請求項２】
配列番号１８１に少なくとも８１％の配列同一性を有する、タバコ属由来の単離核酸分子。
【請求項３】
配列番号１８１に少なくとも９１％の配列同一性を有する、タバコ属由来の単離核酸分子。
【請求項４】
配列番号１８２を含む、タバコ属由来の単離タンパク質。
【請求項５】
配列番号１８２に少なくとも８０パーセントの配列同一性を有する、タバコ属由来の単離タンパク質。
【請求項６】
配列番号１８２に少なくとも９０パーセントの配列同一性を有する、タバコ属由来の単離タンパク質。
【請求項７】
請求項１、２または３の核酸分子を含む、トランスジェニック植物。
【請求項８】
タバコ植物である、請求項７のトランスジェニック植物。
【請求項９】
トランスジェニック植物を産生する方法であって：
（ｉ）請求項１、２または３の前記核酸分子を、前記植物において機能するプロモーターと、機能可能であるように連結して、植物形質転換ベクターを生成し；
（ｉｉ）前記植物を、工程（ｉ）の前記植物形質転換ベクターで形質転換し；
（ｉｉｉ）前記形質転換ベクターで形質転換された植物細胞を選択し；そして
（ｉｖ）前記形質転換植物細胞から形質転換植物を再生する；
工程を含む、前記方法。
【請求項１０】
植物が、減少したレベルのノルニコチンを有する、請求項９の方法。
【請求項１１】
前記核酸分子がアンチセンス方向である、請求項９の方法。
【請求項１２】
前記核酸分子がセンス方向である、請求項９の方法。
【請求項１３】
前記核酸分子がＲＮＡ干渉方向である、請求項９の方法。
【請求項１４】
前記核酸分子が二本鎖ＲＮＡ分子として発現される、請求項９の方法。
【請求項１５】
前記トランスジェニック植物がタバコ植物である、請求項９の方法。
【請求項１６】
核酸分子を含有する植物を選択する方法であって、請求項１、２または３の核酸配列の存在に関して、前記植物を解析する、前記方法。
【請求項１７】
前記植物をＤＮＡハイブリダイゼーションによって解析する、請求項１６の植物を選択する方法。
【請求項１８】
前記ＤＮＡハイブリダイゼーションがサザンブロット解析である、請求項１７の植物を選択する方法。
【請求項１９】
前記ＤＮＡハイブリダイゼーションがノーザンブロット解析である、請求項１７の植物を選択する方法。
【請求項２０】
前記植物をＰＣＲ検出によって解析する、請求項１６の植物を選択する方法。
【請求項２１】
前記植物がタバコ植物である、請求項１６の方法。
【請求項２２】
植物におけるノルニコチンレベルを増加させるかまたは減少させる方法であって：
（ｉ）請求項１、２または３の前記核酸分子を、前記植物において機能するプロモーターと、機能可能であるように連結して、植物形質転換ベクターを生成し；
（ｉｉ）前記植物を、工程（ｉ）の前記植物形質転換ベクターで形質転換し；
（ｉｉｉ）前記形質転換ベクターで形質転換された植物細胞を選択し；そして
（ｉｖ）前記形質転換植物細胞から形質転換植物を再生する
工程を含む、前記方法。
【請求項２３】
前記核酸分子がアンチセンス方向である、請求項２２の方法。
【請求項２４】
前記核酸分子がセンス方向である、請求項２２の方法。
【請求項２５】
前記核酸分子がＲＮＡ干渉方向である、請求項２２の方法。
【請求項２６】
前記核酸分子が二本鎖ＲＮＡ分子として発現される、請求項２２の方法。
【請求項２７】
前記トランスジェニック植物がタバコ植物である、請求項２２の方法。
【請求項２８】
減少した量のノルニコチンレベルを有するタバコ製品であって、請求項７の植物由来のタバコを含む、前記タバコ製品。
【請求項２９】
タバコ製品が、巻きタバコ、葉巻、パイプタバコ、嗅ぎタバコ、噛みタバコ、タバコ製品とブレンドした製品、およびこれらの混合物からなる群より選択される、請求項２７のタバコ製品。
【請求項３０】
ノルニコチンレベルが、約５〜約１０％減少している、請求項２８のタバコ製品。
【請求項３１】
ノルニコチンレベルが、約１０〜約２０％減少している、請求項２８のタバコ製品。
【請求項３２】
ノルニコチンレベルが、約２０〜約３０％減少している、請求項２８のタバコ製品。
【請求項３３】
ノルニコチンレベルが、約３０％を超えて減少している、請求項２８のタバコ製品。
【請求項３４】
請求項７の植物由来のタバコ葉を含む、減少した量のノルニコチンレベルを有するタバコ葉。
【請求項３５】
タバコ製品が形成される請求項３４のタバコ葉であって、該タバコ製品が、巻きタバコ、葉巻、パイプタバコ、嗅ぎタバコ、噛みタバコ、タバコ製品とブレンドした製品、およびこれらの混合物からなる群より選択される、前記タバコ葉。
【請求項３６】
請求項１、２または３の単離核酸を用いて、植物から遺伝子を単離する方法。
【請求項１】
配列番号１８１である、タバコ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）由来の単離核酸分子。
【請求項２】
配列番号１８１に少なくとも８１％の配列同一性を有する、タバコ属由来の単離核酸分子。
【請求項３】
配列番号１８１に少なくとも９１％の配列同一性を有する、タバコ属由来の単離核酸分子。
【請求項４】
配列番号１８２を含む、タバコ属由来の単離タンパク質。
【請求項５】
配列番号１８２に少なくとも８０パーセントの配列同一性を有する、タバコ属由来の単離タンパク質。
【請求項６】
配列番号１８２に少なくとも９０パーセントの配列同一性を有する、タバコ属由来の単離タンパク質。
【請求項７】
請求項１、２または３の核酸分子を含む、トランスジェニック植物。
【請求項８】
タバコ植物である、請求項７のトランスジェニック植物。
【請求項９】
トランスジェニック植物を産生する方法であって：
（ｉ）請求項１、２または３の前記核酸分子を、前記植物において機能するプロモーターと、機能可能であるように連結して、植物形質転換ベクターを生成し；
（ｉｉ）前記植物を、工程（ｉ）の前記植物形質転換ベクターで形質転換し；
（ｉｉｉ）前記形質転換ベクターで形質転換された植物細胞を選択し；そして
（ｉｖ）前記形質転換植物細胞から形質転換植物を再生する；
工程を含む、前記方法。
【請求項１０】
植物が、減少したレベルのノルニコチンを有する、請求項９の方法。
【請求項１１】
前記核酸分子がアンチセンス方向である、請求項９の方法。
【請求項１２】
前記核酸分子がセンス方向である、請求項９の方法。
【請求項１３】
前記核酸分子がＲＮＡ干渉方向である、請求項９の方法。
【請求項１４】
前記核酸分子が二本鎖ＲＮＡ分子として発現される、請求項９の方法。
【請求項１５】
前記トランスジェニック植物がタバコ植物である、請求項９の方法。
【請求項１６】
核酸分子を含有する植物を選択する方法であって、請求項１、２または３の核酸配列の存在に関して、前記植物を解析する、前記方法。
【請求項１７】
前記植物をＤＮＡハイブリダイゼーションによって解析する、請求項１６の植物を選択する方法。
【請求項１８】
前記ＤＮＡハイブリダイゼーションがサザンブロット解析である、請求項１７の植物を選択する方法。
【請求項１９】
前記ＤＮＡハイブリダイゼーションがノーザンブロット解析である、請求項１７の植物を選択する方法。
【請求項２０】
前記植物をＰＣＲ検出によって解析する、請求項１６の植物を選択する方法。
【請求項２１】
前記植物がタバコ植物である、請求項１６の方法。
【請求項２２】
植物におけるノルニコチンレベルを増加させるかまたは減少させる方法であって：
（ｉ）請求項１、２または３の前記核酸分子を、前記植物において機能するプロモーターと、機能可能であるように連結して、植物形質転換ベクターを生成し；
（ｉｉ）前記植物を、工程（ｉ）の前記植物形質転換ベクターで形質転換し；
（ｉｉｉ）前記形質転換ベクターで形質転換された植物細胞を選択し；そして
（ｉｖ）前記形質転換植物細胞から形質転換植物を再生する
工程を含む、前記方法。
【請求項２３】
前記核酸分子がアンチセンス方向である、請求項２２の方法。
【請求項２４】
前記核酸分子がセンス方向である、請求項２２の方法。
【請求項２５】
前記核酸分子がＲＮＡ干渉方向である、請求項２２の方法。
【請求項２６】
前記核酸分子が二本鎖ＲＮＡ分子として発現される、請求項２２の方法。
【請求項２７】
前記トランスジェニック植物がタバコ植物である、請求項２２の方法。
【請求項２８】
減少した量のノルニコチンレベルを有するタバコ製品であって、請求項７の植物由来のタバコを含む、前記タバコ製品。
【請求項２９】
タバコ製品が、巻きタバコ、葉巻、パイプタバコ、嗅ぎタバコ、噛みタバコ、タバコ製品とブレンドした製品、およびこれらの混合物からなる群より選択される、請求項２７のタバコ製品。
【請求項３０】
ノルニコチンレベルが、約５〜約１０％減少している、請求項２８のタバコ製品。
【請求項３１】
ノルニコチンレベルが、約１０〜約２０％減少している、請求項２８のタバコ製品。
【請求項３２】
ノルニコチンレベルが、約２０〜約３０％減少している、請求項２８のタバコ製品。
【請求項３３】
ノルニコチンレベルが、約３０％を超えて減少している、請求項２８のタバコ製品。
【請求項３４】
請求項７の植物由来のタバコ葉を含む、減少した量のノルニコチンレベルを有するタバコ葉。
【請求項３５】
タバコ製品が形成される請求項３４のタバコ葉であって、該タバコ製品が、巻きタバコ、葉巻、パイプタバコ、嗅ぎタバコ、噛みタバコ、タバコ製品とブレンドした製品、およびこれらの混合物からなる群より選択される、前記タバコ葉。
【請求項３６】
請求項１、２または３の単離核酸を用いて、植物から遺伝子を単離する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【図４３】
【図４４】
【図４５】
【図４６】
【図４７】
【図４８】
【図４９】
【図５０】
【図５１】
【図５２】
【図５３】
【図５４】
【図５５】
【図５６】
【図５７】
【図５８】
【図５９】
【図６０】
【図６１】
【図６２】
【図６３】
【図６４】
【図６５】
【図６６】
【図６７】
【図６８】
【図６９】
【図７０】
【図７１】
【図７２】
【図７３】
【図７４】
【図７５】
【図７６】
【図７７】
【図７８】
【図７９】
【図８０】
【図８１】
【図８２】
【図８３】
【図８４】
【図８５】
【図８６】
【図８７】
【図８８】
【図８９】
【図９０】
【図９１】
【図９２】
【図９３】
【図９４】
【図９５】
【図９６】
【図９７】
【図９８】
【図９９】
【図１００】
【図１０１】
【図１０２】
【図１０３】
【図１０４】
【図１０５】
【図１０６】
【図１０７】
【図１０８】
【図１０９】
【図１１０】
【図１１１】
【図１１２】
【図１１３】
【図１１４】
【図１１５】
【図１１６】
【図１１７】
【図１１８】
【図１１９】
【図１２０】
【図１２１】
【図１２２】
【図１２３】
【図１２４】
【図１２５】
【図１２６】
【図１２７】
【図１２８】
【図１２９】
【図１３０】
【図１３１】
【図１３２】
【図１３３】
【図１３４】
【図１３５】
【図１３６】
【図１３７】
【図１３８】
【図１３９】
【図１４０】
【図１４１】
【図１４２】
【図１４３】
【図１４４】
【図１４５】
【図１４６】
【図１４７】
【図１４８】
【図１４９】
【図１５１−１】
【図１５１−２】
【図１５１−３】
【図１５１−４】
【図１５１−５】
【図１５１−６】
【図１５１−７】
【図１５１−８】
【図１５１−９】
【図１５１−１０】
【図１５１−１１】
【図１５２−１】
【図１５２−２】
【図１５２−３】
【図１５２−４】
【図１５２−５】
【図１５３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【図４３】
【図４４】
【図４５】
【図４６】
【図４７】
【図４８】
【図４９】
【図５０】
【図５１】
【図５２】
【図５３】
【図５４】
【図５５】
【図５６】
【図５７】
【図５８】
【図５９】
【図６０】
【図６１】
【図６２】
【図６３】
【図６４】
【図６５】
【図６６】
【図６７】
【図６８】
【図６９】
【図７０】
【図７１】
【図７２】
【図７３】
【図７４】
【図７５】
【図７６】
【図７７】
【図７８】
【図７９】
【図８０】
【図８１】
【図８２】
【図８３】
【図８４】
【図８５】
【図８６】
【図８７】
【図８８】
【図８９】
【図９０】
【図９１】
【図９２】
【図９３】
【図９４】
【図９５】
【図９６】
【図９７】
【図９８】
【図９９】
【図１００】
【図１０１】
【図１０２】
【図１０３】
【図１０４】
【図１０５】
【図１０６】
【図１０７】
【図１０８】
【図１０９】
【図１１０】
【図１１１】
【図１１２】
【図１１３】
【図１１４】
【図１１５】
【図１１６】
【図１１７】
【図１１８】
【図１１９】
【図１２０】
【図１２１】
【図１２２】
【図１２３】
【図１２４】
【図１２５】
【図１２６】
【図１２７】
【図１２８】
【図１２９】
【図１３０】
【図１３１】
【図１３２】
【図１３３】
【図１３４】
【図１３５】
【図１３６】
【図１３７】
【図１３８】
【図１３９】
【図１４０】
【図１４１】
【図１４２】
【図１４３】
【図１４４】
【図１４５】
【図１４６】
【図１４７】
【図１４８】
【図１４９】
【図１５１−１】
【図１５１−２】
【図１５１−３】
【図１５１−４】
【図１５１−５】
【図１５１−６】
【図１５１−７】
【図１５１−８】
【図１５１−９】
【図１５１−１０】
【図１５１−１１】
【図１５２−１】
【図１５２−２】
【図１５２−３】
【図１５２−４】
【図１５２−５】
【図１５３】
【公開番号】特開２０１０−９９０７４（Ｐ２０１０−９９０７４Ａ）
【公開日】平成２２年５月６日（２０１０．５．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２７６０２０（Ｐ２００９−２７６０２０）
【出願日】平成２１年１２月４日（２００９．１２．４）
【分割の表示】特願２００６−５３５３７８（Ｐ２００６−５３５３７８）の分割
【原出願日】平成１６年１０月１５日（２００４．１０．１５）
【出願人】（３９８０６９２２９）ユーエス スモークレス タバコ カンパニー (20)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年５月６日（２０１０．５．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１２月４日（２００９．１２．４）
【分割の表示】特願２００６−５３５３７８（Ｐ２００６−５３５３７８）の分割
【原出願日】平成１６年１０月１５日（２００４．１０．１５）
【出願人】（３９８０６９２２９）ユーエス スモークレス タバコ カンパニー (20)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]