タプシガルジンにより誘導される細胞死の阻害剤
小胞体（ＥＲ）ストレスの阻害剤をスクリーニングする方法を提供する。これらの方法は、ＥＲストレスを誘導するタプシガルジン、および試験薬剤を、マルチウェルプレート内の哺乳類細胞に添加することを含む。生物発光試薬を使用して細胞内ＡＴＰ含有量を測定することによって、細胞生存を容易にモニターすることができる。商業的に入手可能な５０，０００の化合物ライブラリをスクリーニングすることにより、二次アッセイに供された９３のヒット化合物を特定するに至り、これらがタプシガルジンにより誘導される細胞死から細胞を守る能力を確認した。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の権利の声明
本発明は、米国立衛生研究所によって授与されたＲＯ３ ＤＡ０２４８８７およびＵ０１ ＡＩ０７８０４８の下、米国政府の支援により成された。米国政府は、本発明に関する一定の権利を有する。
【０００２】
本発明は、折り畳まれていないタンパク質の応答によって引き起こされる細胞死の阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００３】
小胞体（ＥＲ）は、複数の細胞機能を果たす（Ｓｃｈｒｏｄｅｒ ａｎｄ Ｋａｕｆｍａｎ，Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．，５６９：２９−６３，２００５、Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｎｅｕｒｏａｎａｔ．２８：７９−９２，２００４、Ｒａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．１１：３７２−３８０，２００４、Ｂｒｅｃｋｅｎｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２２：８６０８−８６１８，２００３にて総説）。ＥＲの内腔は、特異な環境である。ＥＲの内腔は、Ｃａ２＋−ＡＴＰアーゼによるカルシウムイオンのＥＲへの能動輸送により、細胞内に最高濃度のＣａ２＋を含有する。この内腔は、酸化環境を有しており、ジスルフィド結合の形成、ならびに細胞表面で分泌および表示されるタンパク質の適切な折り畳みに重要である。タンパク質の折り畳みおよび輸送における役割から、ＥＲは、タンパク質折り畳み中間体の安定化に役立つ、Ｇｒｐ７８、Ｇｒｐ９４、およびカルレティキュリン等のＣａ２＋依存性分子シャペロンが豊富でもある（Ｓｃｈｒｏｄｅｒ ａｎｄ Ｋａｕｆｍａｎ，Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．５６９：２９−６３，２００５、Ｏｒｒｅｎｉｕｓ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．４：５５２−５６５，２００３、Ｍａ ａｎｄ Ｈｅｎｄｅｒｓｈｏｔ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｎｅｕｒｏａｎａｔ．２８：５１−６５，２００４、Ｒｉｚｚｕｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．ＳＴＫＥ，２００４：ｒｅ１，２００４にて総説）。
【０００４】
無数の種類の障害が、折り畳まれていないタンパク質のＥＲでの蓄積を生じ、折り畳まれていないタンパク質応答（ＵＰＲ）と称される進化的に保存された応答を引き起こす。低酸素または酸化体または還元剤によって生じる細胞酸化還元調整における障害は、ＥＲの内腔でのジスルフィド結合を妨害し、タンパク質のアンフォールディングおよびミスフォールディングにつながる（Ｆｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０：２０３−２１０，２０００）。グルコース欠乏も、恐らくＥＲでのＮ結合型タンパク質のグリコシル化を妨害することによって、ＥＲストレスにつながる。ＥＲにおけるＣａ２＋調整の異常は、Ｇｒｐ７８、Ｇｒｐ９４、およびカルレティキュリン等のＥＲタンパク質のＣａ２＋依存性の性質により、タンパク質のアンフォールディングを引き起こす（Ｍａ ａｎｄ Ｈｅｎｄｅｒｓｈｏｔ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｎｅｕｒｏａｎａｔ．２８：５１−６５，２００４）。ウイルス感染も、ウイルスによりコードされるタンパク質によるＥＲの過負荷のため、ＵＰＲを引き起こし得る。これは、恐らく、ウイルスの複製と蔓延を回避するために、ＥＲストレスを細胞自殺に関連付ける古代の進化的圧力の１つであろう。また、ある量の基底タンパク質のミスフォールディングがＥＲで生じることから（通常、プロテアソームに依存した分解のため、サイトゾルへのミスフォールドされたタンパク質の逆輸送によって改善される）、プロテアソームの機能を損なう状況は、神経変性に関連する封入体疾患を含む、タンパク質の交通渋滞を形成し得る（Ｐａｓｃｈｅｎ，Ｃｅｌｌ Ｃａｌｃｉｕｍ ３４：３６５−３８３，２００３）。高脂肪食もＥＲストレスを引き起こすことに関連している（Ｏｚｃａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０６：４５７−４６１，２００４）。
【０００５】
ＵＰＲの最初の目的は、変化する環境に適合し、恒常性および正常なＥＲ機能を確立することである。これらの適合機構は主に、ＥＲタンパク質の折り畳み能力を増強する遺伝子の発現を誘導し、ＥＲ関連タンパク質の分解を促進して、ミスフォールドしたタンパク質を除去する、転写プログラムの活性化を伴う。ｍＲＮＡの翻訳も、最初に阻害され、これによって、ＵＰＲタンパク質をコードするｍＲＮＡが生成されるまで、数時間、新たなタンパク質のＥＲへの流入が低減される。適合に失敗した場合、ＥＲによって開始された経路は、宿主防衛におけるメディエータをコードする遺伝子の活性化を誘導する転写因子であるＮＦκＢ、ならびにストレスキナーゼ（ｐ３８ ＭＡＰＫおよびＪＮＫ）を活性化することによって、警報を伝える。過剰かつ延長されたＥＲストレスは、通常、動物細胞においてアポトーシスの形態で、機能不全の細胞を排除するための多細胞生命体の最後の手段である細胞自殺を引き起こす。ＥＲストレスは、虚血再かん流障害（特に、脳卒中）、神経変性、および糖尿病を含む広範な疾患に関連している（Ｏｙａｄｏｍａｒｉ ａｎｄ Ｍｏｒｉ，Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．１１：３８１−３８９，２００４、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔ．１１５：２６５６−２６６４，２００５、Ｒａｏ ａｎｄ Ｂｒｅｄｅｓｅｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１６：６５３−６６２，２００４にて総説）。
【０００６】
折り畳まれていないタンパク質がＥＲ内に蓄積する際、内在するシャペロンが占領され、ＵＰＲの誘導に関与する膜貫通ＥＲタンパク質が放出される。これらのＵＰＲ開始タンパク質は、ＥＲ膜に位置し、それらのＮ末端はＥＲの内腔に、それらのＣ末端はサイトゾルにあり、これらの２つの細胞内コンパートメントを接続するブリッジを形成する。通常、これらの膜貫通ＥＲタンパク質のＮ末端は、ＥＲシャペロンＧｒｐ７８（ＢｉＰ）によって保持され、それらの凝集が阻止される。しかし、ミスフォールドしたタンパク質が蓄積する際、Ｇｒｐ７８が放出され、これらの膜貫通信号伝達タンパク質の凝集が可能となり、ＵＰＲが開始される。とりわけ、重要な膜貫通ＥＲ信号伝達タンパク質は、ＰＥＲＫ、Ｉｒｅ１、およびＡＴＦ６である。（Ｓｃｈｒｏｄｅｒ ａｎｄ Ｋａｕｆｍａｎ，Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．５６９：２９−６３，２００５、Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｎｅｕｒｏａｎａｔ．２８：７９−９２，２００４、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔ．１１５：２６５６−２６６４，２００５、Ｒａｏ ａｎｄ Ｂｒｅｄｅｓｅｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１６：６５３−６６２，２００４にて総説）。
【０００７】
ＰＥＲＫ（ＰＫＲ様ＥＲキナーゼ）は、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−タンパク質キナーゼであり、この触媒ドメインは、他のｅｌＦ２αファミリーのキナーゼと相当な相同性を共有する（Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１８：７４９９−７５０９，１９９８、Ｈａｒｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３９７：２７１−２７４，１９９９）。Ｇｒｐ７８が除去されると、ＰＥＲＫはＥＲ膜でオリゴマー化し、これによって、自己リン酸化を誘導し、キナーゼドメインを活性化させる。ＰＥＲＫは、真核生物の翻訳開始因子２アルファ（ｅＩＦ２α）をリン酸化および不活性化し、これによって、ｍＲＮＡ翻訳を全体的に遮断し、ＥＲへのタンパク質負荷を低減する。しかしながら、転写因子ＡＴＦ４をコードするｍＲＮＡを含むあるｍＲＮＡは、これらの状態下、翻訳に対する選択的利点を得る。３９ｋＤａ ＡＴＦ４タンパク質は、転写因子ｂＺＩＰ−ファミリーの一員であり、これは、ＵＰＲに関与するいくつかの遺伝子のプロモータを制御する。ＥＲストレスに対する保護のためにＰＥＲＫによって開始された信号の重要性は、ｐｅｒｋ−／−細胞、および非リン酸化型ｅＩＦ２α（Ｓｅｒ５１Ａｌａ）を発現するノックイン細胞の研究により文書化されており、双方は、ＥＲストレスに対する過敏性を呈する（Ｈａｒｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，５：８９７−９０４，２０００、Ｓｃｈｅｕｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ７：１１６５−１１７６，２００１）。Ｉｒｅ１は、Ｇｒｐ７８によって放出される際、同様にＥＲ膜でオリゴマー化する。約１００ｋＤａ Ｉｒｅ１αタンパク質は、Ｉ型膜貫通タンパク質であり、これは、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−キナーゼドメインおよびエンドリボヌクレアーゼドメインの両方を含有し、後者は、Ｘボックス結合タンパク質１（ＸＢＰ−１）ｍＲＮＡからイントロンを除去し、翻訳可能なものにして、ｂＺＩＰ−ファミリーの転写因子である、４１ｋＤａ ＸＢＰ−１タンパク質を生成する。ＸＢＰ−１は、主に、ＥＲからサイトゾルへのミスフォールドしたタンパク質の逆輸送、ならびにＥＲによって誘導されたタンパク質の分解に関与する、いくつかの遺伝子のプロモータに結合する（Ｒａｏ ａｎｄ Ｂｒｅｄｅｓｅｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１６：６５３−６６２，２００４にて総説）。Ｉｒｅ１もまた、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体ファミリーの多くの成員と、アダプタータンパク質ＴＲＡＦ２に結合する能力を共有する。
【０００８】
ＴＲＡＦ２は、Ｕｂｃ１３に結合するＥ３リガーゼであり、結合部位として標準的なリジン４８ではなく、リジン６３を伴う基質の非標準ポリユビキチン化をもたらす（Ｈａｂｅｌｈａｈ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．２３：３２２−３３２，２００４）。ＴＲＡＦ２は、これまで、Ｊｕｎ−Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）を活性化するＡｓｋ１を含む、免疫および炎症に関与したタンパク質キナーゼ、およびＮＦκＢ活性化に関連するキナーゼを活性化させる。ＡＴＦ６のＮ末端からのＧｒｐ７８の放出は、ＰＥＲＫおよびＩｒｅ１と比較して、異なるタンパク質活性化の機構を誘発する。オリゴマー化の代わりに、Ｇｒｐ７８の放出は、ＡＴＦ６を解放して、ゴルジ体へ移動させ、ここでは、内在するプロテアーゼが膜近傍部位でＡＴＦ６を切断し、この転写因子をサイトゾルに放出し、これが核に移動することにより、遺伝子発現を制御する（Ｙｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ６：１３５５−１３６４，２０００）。
【０００９】
ＥＲストレスにより誘導されるこれらの種々の信号伝達経路が、どのようにして細胞死を引き起こすのかということは、不明である。これは、多くの可能性が概略された、我々が著した最近の総説の主題である（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔ．１１５：２６５６−２６６４，２００５）。ＥＲストレス（他の細胞死経路ではない）の結果として特異的に誘導された細胞死を遮断する化合物は、内在する機構を問いただすため、ならびにＥＲストレスが細胞死および組織障害に関与する事象を引き起こす動物モデルにおける生体内での解明に有用であろう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｓｃｈｒｏｄｅｒ ａｎｄ Ｋａｕｆｍａｎ，Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．，５６９：２９−６３，２００５
【非特許文献２】Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｎｅｕｒｏａｎａｔ．２８：７９−９２，２００４
【非特許文献３】Ｒａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．１１：３７２−３８０，２００４
【非特許文献４】Ｂｒｅｃｋｅｎｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２２：８６０８−８６１８，２００３
【非特許文献５】Ｏｒｒｅｎｉｕｓ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．４：５５２−５６５，２００３
【非特許文献６】Ｍａ ａｎｄ Ｈｅｎｄｅｒｓｈｏｔ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｎｅｕｒｏａｎａｔ．２８：５１−６５，２００４
【非特許文献７】Ｒｉｚｚｕｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．ＳＴＫＥ，２００４：ｒｅ１，２００４
【非特許文献８】Ｆｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０：２０３−２１０，２０００
【非特許文献９】Ｐａｓｃｈｅｎ，Ｃｅｌｌ Ｃａｌｃｉｕｍ ３４：３６５−３８３，２００３
【非特許文献１０】Ｏｚｃａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０６：４５７−４６１，２００４
【非特許文献１１】Ｏｙａｄｏｍａｒｉ ａｎｄ Ｍｏｒｉ，Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．１１：３８１−３８９，２００４
【非特許文献１２】Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔ．１１５：２６５６−２６６４，２００５
【非特許文献１３】Ｒａｏ ａｎｄ Ｂｒｅｄｅｓｅｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１６：６５３−６６２，２００４
【非特許文献１４】Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１８：７４９９−７５０９，１９９８
【非特許文献１５】Ｈａｒｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３９７：２７１−２７４，１９９９
【非特許文献１６】Ｈａｒｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，５：８９７−９０４，２０００
【非特許文献１７】Ｓｃｈｅｕｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ７：１１６５−１１７６，２００１
【非特許文献１８】Ｈａｂｅｌｈａｈ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．２３：３２２−３３２，２００４
【非特許文献１９】Ｙｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ６：１３５５−１３６４，２０００
【発明の概要】
【００１１】
我々は、小胞体（ＥＲ）ストレス阻害剤のスクリーニングを行うための新規のハイスループット方法を開発した。これらの方法は、ＥＲストレスを誘導するタプシガルジン（タプシガルギン）、および、マルチウェルプレート内の哺乳類細胞への試験薬剤の添加を含む。生物発光試薬を用いて細胞内ＡＴＰ含有量を測定することによって、細胞生存は容易にモニタリングすることができる。商業的に入手可能な５０，０００の化合物のライブラリに対してスクリーニングを行うことにより、二次アッセイに供された９３のヒット化合物を特定するに至り、これらがタプシガルジンにより誘導される細胞死から細胞を守る能力を確認した。
【００１２】
本発明の一実施形態によると、方法は、小胞体ストレスに起因する細胞死の阻害剤を特定するために提供され、（ａ）哺乳類細胞をタプシガルジンに接触させ、これによって、前記細胞に小胞体ストレスを引き起こすステップと、（ｂ）前記細胞を試験薬剤に接触させるステップと、（ｃ）前記試験薬剤が小胞体ストレスによって引き起こされる前記細胞の死を阻害するかどうかを判断するステップと、を含む。１つのこのような実施形態によると、前記哺乳類細胞は、ＣＳＭ１４．１ラット線条体神経前駆細胞である。別のこのような実施形態によると、該方法は、該細胞の細胞内ＡＴＰ含有量を測定することによって、該試験薬剤が、小胞体ストレスにより引き起こされる該細胞の死を阻害するかどうかを判断するステップをさらに含む。別のこのような実施形態によると、該方法は、該細胞の生物発光を測定することによって、該細胞の細胞内ＡＴＰ含有量を測定するステップをさらに含む。別のこのような実施形態によると、該方法は、該試験薬剤が、約５０％以上、もしくは約６０％以上、もしくは約７０％以上、もしくは約８０％以上、もしくは約９０％以上、もしくは約９５％以上、該細胞の死を阻害するかどうかを判断するステップを含む。別のこのような実施形態によると、該方法は、該試験薬剤が、約２５μＭ以下、もしくは約２０μＭ以下、もしくは約１５μＭ以下、もしくは約１０μＭ以下のＩＣ５０を有するかどうかを判断するステップを含む。別のこのような実施形態によると、該方法は、該細胞をタプシガルジンに接触させた後、該細胞を、該試験薬剤に接触させるステップを含む。別のこのような実施形態によると、該方法は、マルチウェルプレートのウェルに該細胞を提供するステップを含む。別のこのような実施形態によると、該方法は自動化される。
【００１３】
別の実施形態によると、タプシガルジンにより誘導される小胞体ストレスに起因する哺乳類細胞の死を阻害する化合物を有効量含む組成物を提供する。１つのこのような実施形態によると、該哺乳類細胞は、ＣＳＭ１４．１ラット線条体神経前駆細胞である。別のこのような実施形態によると、かかる組成物は、約５０パーセント以上、もしくは６０パーセント以上、もしくは７０パーセント以上、もしくは８０パーセント以上、もしくは９０パーセント以上、もしくは９５パーセント以上、ＣＳＭ１４．１ラット線条体神経前駆細胞の死を阻害する。別のこのような実施形態によると、該組成物は、約２５μＭ以下、もしくは約２０μＭ以下、もしくは約１５μＭ以下のＩＣ５０を有する。別のこのような実施形態によると、該組成物は、約５０パーセント以上、ＣＳＭ１４．１ラット線条体神経前駆細胞の死を阻害し、約２５μＭ以下のＩＣ５０を有する。
【００１４】
別のこのような実施形態によると、該組成物は、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ ＩＤ番号５２３０７０７、５３９７３７２、５６６７６８１、５７０６５３２、５８０３８８４、５８４３８７３、５８５０９７０、５８９７０２７、５９２３４８１、５９２６３７７、５９３１３３５、５９３３６９０、５９４７２５２、５９４８３６５、５９５１６１３、５９５４１７９、５９５４６９３、５９５４７５４、５９５５７３４、５９６２２６３、５９６３９５８、５９７４２１９、５９７４５５４、５９７６２２８、５９７９２０７、５９８０７５０、５９８１２６９、５９８４８２１、５９８６９９４、５９９００４１、５９９０１３７、５９９３０４８、５９９８７３４、６０００３９８、６０１５０９０、６０３３３５２、６０３４３９７、６０３４６７４、６０３５０９８、６０３５７２８、６０３７３６０、６０３８３９１、６０４３８１５、６０４４３５０、６０４４５２５、６０４４６２６、６０４４６７３、６０４４８６０、６０４５０１２、６０４６０７０、６０４６８１８、６０４８３０６、６０４８９３５、６０４９０１０、６０４９１８４、６０４９４４８、６０５６５９２、６０６０８４８、６０６２５０５、６０６５７５７、６０６６９３６、６０６８１８９、６０６８６０２、６０６９４７４、６０７０３７９、６０７３８７５、６０７４２５９、６０７４５３２、６０７４８９１、６０８１０２８、６０８４６５２、６０９４９５７、６０９５５７７、６０９５９７０、６１０３９８３、６１０４９３９、６１４１５７６、６２３７７３５、６２３７８７７、６２３７９７３、６２３７９９２、６２３８１９０、６２３８２４６、６２３８４７５、６２３８７６７、６２３９０４８、６２３９２５２、６２３９５０７、６２３９５３８、６２３９９３９、６２４１３７６、６３６８９３１、および６３７０７１０からなる群より選択される化合物を含む。別のこのような実施形態によると、該組成物は、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ ＩＤ番号６２３９５０７、６２３７７３５、６２３８４７５、６２３７８７７、６２３９５３８、６２３８７６７、６０４９４４８、５９６３９５８、６２３７９７３、および６０４４６７３が含まれるが、これらに限定されない、式Ｉの化合物を含む。別のこのような実施形態によると、該組成物は、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ ＩＤ番号５９９８７３４、５９５５７３４、５９９００４１、６０３５０９８、および５９９０１３７が含まれるが、これらに限定されない、式ＩＩ−１の化合物を含む。別のこのような実施形態によると、該組成物は、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ ＩＤ番号５３９７３７２、６０３３３５２、６０３４６７４、および５９５１６１３が挙げられるが、これらに限定されない、式ＩＩ−２の化合物を含む。別のこのような実施形態によると、該組成物は、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ ＩＤ番号５９４８３６５、５９７６２２８、５９８０７５０、５８０３８８４、６０４９１８４、５９７９２０７、および６１４１５７６からなる群より選択される化合物を含む。別のこのような実施形態によると、該組成物は、薬剤として許容される担体を含む。
【００１５】
別の実施形態によると、（ａ）前述の組成物のうちの１つと、（２）好適な包装材料と、を含むキットを提供する。
【００１６】
別の実施形態によると、小胞体ストレスに起因する哺乳類細胞の死を阻害するための方法を提供し、前述の組成物のうちのいずれかにより、細胞を治療・処置するステップを含む。
【００１７】
別の実施形態によると、小胞体ストレスに関連する、哺乳類（ヒトを含むがこれに限定されない）の疾患、症状、もしくは傷害を治療するための方法を提供し、治療を必要とする哺乳類に、前述の組成物のうちのいずれかを投与するステップを含む。１つのこのような実施形態によると、該疾患、もしくは症状、もしくは傷害は、神経疾患、代謝性疾患、虚血障害、心臓および循環系損傷、ウイルス感染、アテローム性動脈硬化、双極性疾患、およびバッテン病からなる群より選択される。別のこのような実施形態によると、該神経疾患は、家族性アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、球脊髄性筋萎縮症／ケネディ病、脊髄小脳失調症３型／マシャド・ジョセフ病、プリオン病、筋萎縮性側索硬化症、およびＧＭ１ガングリオシドーシスからなる群より選択される。別のこのような実施形態によると、該代謝性疾患は、糖尿病、ウォルコツト・ラリソン症候群、ウォフラム症候群、２型糖尿病、ホモシステイン血症、Ｚα１−抗トリプシン欠乏症封入体筋炎、および遺伝性チロシン血症１型からなる群より選択される。別のこのような実施形態によると、該心臓および循環系損傷は、心肥大、低酸素性障害、および家族性高コレステロール血症からなる群より選択される。
【００１８】
別の実施形態によると、本発明は、ＥＲストレス阻害化合物を必要とする個体に投与するための薬剤を調製するための、ＥＲストレス阻害化合物の使用を提供する。
【００１９】
本発明の前述および他の態様は、以下の発明を実施するための形態、添付の図面、ならびに請求項からより明らかとなる。
【００２０】
別途定義されない限り、本明細書で使用するすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書に説明されるものと同様または同等の方法および材料を、本発明の実践または試験に使用することができるが、好適な方法および材料を以下に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】第１群の化合物に基づき、第１群および式Ｉからのヒット化合物の構造を示す図。
【図２Ａ】第２群からのヒット化合物の構造を示す図。
【図２Ｂ】式２−１（第２−１群の化合物に基づく）および式２−２（第２−２群の化合物に基づく）を示す図。
【図３】第１群または第２群に分類されない５つの独立したヒット化合物の構造を示す図。
【図４】ＥＲストレス誘導細胞死を研究するためのＣＳＭ１４．１神経細胞を使用するためのパイロット・スタディの結果を示す図。（Ａ）細胞密度の評価。（Ｂ）タプシガルジン（Ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ（ＴＧ））に対する用量反応。（Ｃ）サルブリナル（Ｓａｌｕｂｒｉｎａｌ（Ｓａｌ））に対する用量反応。
【図５】未分化（図５Ａ）および分化（図５Ｂ）ＣＳＭ１４．１細胞を、ＴＧが殺滅し、Ｓａｌが保護することを示す図。
【図６】ＡＴＰ含有量アッセイの再現性の評価を示す図。
【図７】アッセイ品質管理解析を示す図。
【図８】スクリーニングからヒット化合物の同定までのフローチャートを示す図。
【図９】５０，０００の化合物のインハウスライブラリの標準的なスクリーニングからの、（Ａ）未加工データの解析結果、（Ｂ）および正規化された相対生存率の算出結果を示す図。Ｇ行の８列に、９８．９％の生存率に相当する、１つの有効なヒット化合物（太字）を示す。
【図１０】データの正規化後のスクリーニング結果の一例のグラフを示す図。相対ＡＴＰ含有量（ｙ軸）が、ウェル番号（１−９６［Ａ１からＨ１２］）（ｘ軸）に対してプロットされる。
【図１１】ヒット化合物によるＥＲストレス誘導細胞死の用量依存的阻害を示す図。未分化のＣＳＭ１４．１細胞を、タプシガルジン（１５μＭ）および様々な濃度の４種のヒット化合物（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）で処理した。細胞内ＡＴＰレベルを測定し（ｙ軸）、化合物濃度（ｘ軸）に対してプロットした。データは、３つの独立した実験を表す。
【図１２】サルブリナルが、我々のヒット化合物よりも有効性の低いタプシガルジンにより誘導される細胞死を阻害することを示す図。
【図１３】我々のヒット化合物が、タプシガルジンに匹敵する効率を有するツニカマイシンにより誘導される細胞死を阻害することを示す図。
【図１４】未分化ＣＳＭ１４．１対神経細胞に分化したＣＳＭ１４．１を用いて、化合物の細胞保護活性の比較を示す図。白いバー＝対照のＤＭＳＯ、黒いバー＝分化細胞と未分化細胞の両方を保護する化合物、グレーのバー＝未分化のニューロンを保護するが分化したニューロンを保護しない化合物。
【図１５】ＥＲストレスから保護する際の、化合物の細胞型特異性を示す図。ＣＳＭ１４．１（左）細胞およびＪｕｒｋａｔ（ジャーカット）（右）細胞をそれぞれ、９６ウェルプレート中で、ウェルあたり３，０００の細胞またはウェルあたり３０，０００の細胞で、一晩培養した。ウェルに、ＤＭＳＯのみ（白いバー）またはＤＭＳＯに溶解させた２５μＭの化合物（Ａ〜Ｃ）を加え、次いで、ウェルをＴＧ（１５μＭ）あり（＋）またはなし（−）で処理した。２４時間培養した後、ＡＴＰ含有量を判定し、対照であるＤＭＳＯでのみ処理された細胞に対する割合（平均＋標準偏差、ｎ＝３）として、データを示した。
【図１６】化合物の細胞保護活性を評価するための二次アッセイの結果を示す図。未分化ＣＳＭ１４．１細胞を、２４ウェルプレートのウェルあたり１０４の数の細胞で培養した。翌日、ＤＭＳＯ（ａ、ｂ）（１％の最終容積）、１００μＭのサルブリナル（ｃ、ｄ）、あるいは２５μＭのヒット化合物（１％の最終ＤＭＳＯ）を加えた。２時間後、１５μＭのＴＧを、ａおよびｃを除くすべてのウェルに加えた。従前のＡＴＰアッセイを行い、生存率を測定した。処理：ａ：１％ ＤＭＳＯ、ｂ：１％ ＤＭＳＯ、１５μＭのＴＧ、ｃ：１００μＭのＳａｌ、ｄ：１００μＭのＳａｌ、１５μＭのＴＧ、化合物（ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ ＩＤ番号の化合物）：図中のＩＤ番号と、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅの化合物のＩＤ番号との関係を、下記表１９に示す。
【表１９】
【図１７】化合物の細胞保護活性を評価するための二次アッセイの結果を示す図。未分化ＣＳＭ１４．１細胞を、図１６と同様に培養した。翌日、ＤＭＳＯ（ａ、ｂ）（１％の最終容積）、１００μＭのサルブリナル（ｃ、ｄ）、あるいは２５μＭのヒット化合物（１％の最終ＤＭＳＯ）を加えた。２時間後、１５μＭのＴＧをａおよびｃを除くすべてのウェルに加えた。プレートを再度２４時間培養し、その後、細胞を、トリプシン処理により回収し、１．５ｍｌの微小遠心管に移し、０．５ｍＬのアネクシンＶ結合溶液に再懸濁した。アネクシンＶ陰性細胞の割合は、フローサイトメトリー（ｙ軸）により判断した。処理および化合物は、図１６と同様である。
【図１８】ヒット化合物の経路選択性を示す図。未分化ＣＳＭ１４．１細胞を、９６ウェルプレート（ＡＴＰアッセイ用）中でウェルあたり３，０００の細胞、または２４ウェルプレート（フローサイトメトリー用）中でウェルあたり１×１０４の細胞を播種した。翌日、細胞を、ＤＭＳＯ（０．５％）または０．５％の最終濃度を有するＤＭＳＯ中の２５μＭのヒット化合物で２時間処理し、次いで、１５μＭのタプシガルジン（ＴＧ）で２４時間、１０μｇ／ｍＬのツニカマイシン（ＴＵ）で７２時間、２．５μＭのスタウロスポリン（ＳＴＳ）で２４時間、５０μＭのＶＰ１６で４８時間、あるいは３０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ＋１０μｇ／ｍＬのシクロヘキサミド（ＣＨＸ）で２４時間、を含む、様々な細胞死を誘導する試薬で処理した。細胞内ＡＴＰ含有量は、スタウロスポリンの試料およびＴＮＦ／ＣＨＸ試料に対して測定し、ＤＭＳＯのみ（対照）で処置した細胞に対してデータを正規化し、対照の割合として示した。ツニカマイシンおよびＶＰ１６による処理から起因する細胞死を測定するために、フローサイトメトリーを用いた。すべてのアッセイを３回行った（平均±標準偏差）。
【図１９】ＥＲストレス阻害化合物が、Ｉｒｅ１経路のＴＧにより誘導されるマーカーを阻害することを示す図。ＣＳＭ１４．１細胞を、ＤＭＳＯまたは２５μＭのヒット化合物を用いて２時間培養し、次いで、タプシガルジン（１５μＭ）で処理した。細胞溶解物を調製し、リン酸化−ｃ−Ｊｕｎ、リン酸化−ｅＩＦ２α、リン酸化−ｐ３８ ＭＡＰＫ、およびチューブリン（量の対照）に対して特異的な抗体を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／免疫ブロット法により解析した。対照レーンを、ＤＭＳＯのみ、またはＤＭＳＯ＋ＴＧで処理した。別の実験において、ＣＳＭ１４．１細胞を、ＤＭＳＯ、または１μＭ、５μＭ、および１０μＭの活性化合物のうちの１つで培養し、次いで、２時間後、１５μＭのＴＧで培養した。２時間後、細胞溶解物を調製し、タンパク質含有量に対して正規化し、ｐａｎ−ｒｅａｃｔｉｖｅな抗−ｐ３８−ＭＡＰＫ抗体またはリン酸化型特異的抗体を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ／免疫ブロット法により、ＥＣＬベースで検出し、次いで、ｘ線フィルムのデンシトメトリー解析を行い、ｐ３８ ＭＡＰＫの合計に対してリン酸化ｐ３８ ＭＡＰＫを正規化するか、あるいは、すべてのｐ３８ ＭＡＰＫをプレート上で捕捉する手順を用いてＭＳＤからのメソスケール機器で解析し、リン酸化タンパク質の相対量をリン酸化型特異的抗体（ＭＳＤカタログ番号Ｋ１５１１２Ｄ１）を用いて測定した。
【図２０】ＣＩＤ−２８７８７４６の再合成およびＭＬＳ−０２９２１２６の合成経路を示す図。
【図２１】変性タンパク質応答（ＵＰＲ）のシグナル伝達経路を示す図。
【図２２】化合物６２３９５０７を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイの結果を示す図。
【図２３】ＡＳＫ１のセリン９６７のリン酸化部位が、ＥＲストレスを阻害する化合物６２３９５０７により増強されたことを示す図。様々な部位でＡＳＫ１のリン酸化を検査した。２９３Ｔ細胞を、ｐｃＤＮＡ−ＡＳＫ１−ＨＡでトランスフェクションションした。１日後、細胞を、ＤＭＳＯ（０．４％）または１００μＭの化合物６２３９５０７（＃１）で、２時間インキュベートした。細胞抽出物を、溶解緩衝液を用いて調製し、（Ａ）に示されるように、抗リン酸化ＡＳＫ１抗体または抗ＨＡ抗体を用いて免疫ブロット法に供した。それぞれのリン酸化ＡＳＫバンドの相対密度は、イメージＪソフトウェアにより算出した。（Ｂ）では、（Ａ）からの化合物を、タプシガルジンにより誘導される細胞死に対する活性において比較した。陰性の対照には、ヒット化合物＃１４を使用した（左のグレーのバー）。化合物＃１４は、細胞死の強力な阻害剤であるが、化合物６２３９５０７とは異なる構造を有する。別の陰性の対照として、化合物６０４８１６３を使用した（右のグレーのバー）。それは、該ヒット化合物と同一の骨格を共有するが、細胞死の阻害剤としては効果がない。２９３Ｔ細胞を、ｐｃＤＮＡ−ＡＳＫ１−ＨＡおよびｐＥＢＧ−ＧＳＴ−１４−３−３でトランスフェクションションした。１日後、細胞を、ＤＭＳＯ（０．４％）または１００μＭの示された化合物で２時間インキュベートした。その後、細胞を、示された時間、タプシガルジン（２０μＭ）で処理した。細胞抽出物を、溶解緩衝液を用いて調製し、１４−３−３タンパク質を、グルタチオンＳトランスフェラーゼ４Ｂセファロースビーズで免疫沈降した。１４−３−３タンパク質に結合するＡＳＫ１タンパク質は、抗ＨＡ抗体を用いた免疫ブロット法により可視化した。抗リン酸化ＡＳＫ１（ｓｅｒ９６７）抗体を用いて、それぞれの時点でＡＳＫ１のリン酸化を検出した。
【図２４】ヒットしたベンゾジアゼピン化合物が、ＡＳＫ１ ｓｅｒ９６７脱リン酸化の阻害剤であるという仮説を示す図。したがって、当該化合物は、ＡＳＫ１からの１４−３−３タンパク質の解離を阻害し、ＡＳＫ１を不活性にする。
【図２５】化合物６２３９５０７が、初代マウス神経細胞において、ＥＲストレス誘導細胞死を阻害することができることを示す図。初代皮質ニューロン細胞は、マウスの中脳から調製した。成熟してから１４日後、該細胞を、ＤＭＳＯ（０．２％）または２５μＭの化合物６２３９５０７で２時間プレインキュベートした。該細胞を、その後、タプシガルジン（ＴＧ）で２４時間処理した。該細胞を、アルデヒド溶液で固定し、神経体および神経軸索ネットワークを染色するためにＮｅｕＮおよびＭＡＰ２抗体を用いて免疫染色に供した。ヘキスト染色を用いて、核を染色した。タプシガルジンにより軸索ネットワークの喪失を示すために、広視野を、蛍光顕微鏡により確保した。縮合核および萎縮性神経炎を示す細胞は、細胞死を評定するために死亡と見なした。
【図２６】様々なヒット化合物で処理されたＣＳＭ１４．１細胞の相対生存を示す図。ＣＳＭ１４．１細胞を、９６ウェルプレート中でウェルあたり１，５００の細胞で播種し、３９℃（非許容温度）で７日間培養した。ヒット化合物を２５μＭの最終濃度で加え、２時間後、１５μＭの最終濃度でタプシガルジン（ＴＧ）を加えた。ＡＴＰ含有量を測定し、データを、わずか１％のＤＭＳＯで処理した対照細胞に対する割合として示した（平均±標準偏差、ｎ＝３）。
【図２７】ＥＲストレス阻害化合物は、タプシガルジンにより誘導される、Ｉｒｅ１経路のマーカーを阻害することを示す図。ＣＳＭ１４．１細胞を、ＤＭＳＯまたは１μＭ、５μＭ、および１０μＭの示された化合物で培養し、次いで、タプシガルジン（１５μＭ）で処理した。２時間後、細胞溶解物を調製し、タンパク質含有量に対して正規化し、電気化学ルミネセンスを基にした検出を伴うｐａｎ−ｒｅａｃｔｉｖｅな抗−ｐ３８−ＭＡＰＫ抗体またはリン酸化型特異的抗体を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ／免疫ブロット法により解析し（上）、次いで、ｘ線フィルムのデンシトメトリー解析を行い、ｐ３８ ＭＡＰＫの合計に対してリン酸化ｐ３８ ＭＡＰＫを正規化する（中）か、あるいは、ＭＳＤからのメソスケール機器およびすべてのｐ３８ ＭＡＰＫをプレート上で捕捉する手順を用いて解析し、リン酸化タンパク質の相対量をリン酸化型特異的抗体（ＭＳＤカタログ番号Ｋ１５１１２Ｄ１）を用いて測定した（下）。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、ＥＲストレスを阻害する化合物にスクリーニングを行うための方法、スクリーニング等を用いて同定される化合物、ならびに関連組成物および方法を提供する。
【００２３】
定義
本明細書で使用する「ＥＲストレス阻害化合物」とは、「ＥＲストレス阻害活性」を有する化合物を指す。すなわち、かかる化合物は、好適なアッセイにより測定された場合、好ましくは、約５０％以上、もしくは６０％以上、もしくは７０％以上、もしくは８０％以上、もしくは９０％以上、ＥＲストレスから起因する細胞死を阻害する。好ましくは、該ＥＲストレス阻害化合物は、ＥＲストレスに関連する、いずれかの疾患、または疾病、または症状、または傷害を処置・治療する際に有効である。好ましくは、該ＥＲストレス阻害化合物は、約２５μＭ以下、もしくは２０μＭ以下、もしくは１５μＭ以下、もしくは１０μＭ以下のＩＣ５０を有する。５０，０００の化合物ライブラリのハイスループットスクリーニングで、我々は、タプシガルジン処理に起因するＥＲストレスによる細胞死を阻害する、９３のＥＲストレス阻害化合物（「ヒット」）を同定した。これらの９３のヒットのうちの３０は、２５μＭ以下のＩＣ５０を有すると判断された。本発明のＥＲストレス阻害化合物はまた、薬剤として許容されうる、本明細書で提供されるＥＲストレス阻害化合物の類似体（アナログ）、またはプロドラッグ、または塩、または溶媒和物を含む。また、本明細書で提供されるＥＲストレス阻害化合物のいずれかに構造的に関連する化合物、およびＥＲストレス阻害活性を有する化合物も含まれ、表３および表６〜１１に記載される化合物も含まれるが、これらに限定されない。
【００２４】
本明細書では、特定のＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ化合物ＩＤ番号を有する化合物は、単に「化合物＜番号＞」として、または番号のみでも称され得る。例えば、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ化合物ＩＤ５２３０７０７は、「化合物５２３０７０７」または「５２３０７０７」として称され得る。化学構造、化学名、分子量等を含む、個別の化合物に関するさらなる情報は、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ社のウェブサイト：ｗｗｗ．ｈｉｔ２ｌｅａｄ．ｃｏｍで、化合物毎に開示されている。
【００２５】
ＥＲストレス阻害化合物には、下記表１に記載される化合物が含まれるが、これらに限定されない。かかる化合物は、タプシガルジンにより誘導される細胞死からＣＳＭ１４．１細胞を保護する。
【表１−１】
【表１−２】
【表１−３】
【００２６】
いくつかのヒット化合物は、関連した構造を有する群に分類される。ＥＲストレス阻害化合物には、式Ｉの化合物（図１に示す）が含まれるが、これらに限定されない。式中、
Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、水素、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、アリールオキシ、およびヘテロアリールオキシからなる群から選択され、
Ｒ２は、水素、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、アリールオキシ、およびヘテロアリールオキシからなる群から選択され、
Ｒ３〜Ｒ７はそれぞれ独立して、水素、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、ハロ、およびハロアルキルからなる群から選択される。
【００２７】
式Ｉには、下記表２に記載される（本明細書において第１群の化合物とも称される）ベンゾジアゼピノン化合物が含まれるが、これらに限定されない。
【００２８】
（ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ化合物ＩＤ番号により記載される）第Ｉ群の化合物およびそれらの効力データを、ＩＣ５０（μＭ）として下記表２に提供する。式Ｉの化合物に対する置換基Ｒ１〜Ｒ７も、表２に提供する。
【表２】
【００２９】
ＥＲストレス阻害化合物にはまた、第１群の化合物に構造的に類似する化合物が含まれるが、これらに限定されない。このような類似する化合物には、下記表３に記載される化合物が含まれるが、これらに限定されない。
【表３−１】
【表３−２】
【表３−３】
【表３−４】
【表３−５】
【表３−６】
【表３−７】
【００３０】
ＥＲストレス阻害化合物には、図２Ｂに示されるような式ＩＩ−１の化合物（第２−１群化合物）および式ＩＩ−２（第２−２群化合物）が含まれるが、これらに限定されない（第２−１群化合物および第２−２群化合物は、本明細書において集合的に第２群の化合物と称される。）。
【００３１】
式ＩＩ−１に関しては、Ｒ１〜Ｒ７はそれぞれ独立して、水素、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、ハロ、およびハロアルキルからなる群から選択される。
【００３２】
式ＩＩ−２に関しては、Ｒは、水素、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、ハロ、およびハロアルキルからなる群から選択される。
【００３３】
（ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ化合物ＩＤ番号により記載される）第２−１群および第２−２群の代表的な化合物およびそれらの効力データ［ＩＣ５０（μＭ）］は、下記表４および表５に提供される。これらの選択された式ＩＩ−１（第２−１群）の化合物に関しては、それぞれの化合物に対する置換基Ｒ１〜Ｒ７を、表４に提供する。これらの選択された式ＩＩ−２（第２−２群）の化合物に関しては、それぞれの化合物に対する置換基Ｒを、表５に提供する。
【表４】
【表５】
【００３４】
第２群の化合物と構造的に類似する化合物の例を表６に提供する。
【表６−１】
【表６−２】
【表６−３】
【００３５】
図３は、式Ｉあるいは式ＩＩの化合物に含まれない５つの独立した化合物の構造を示す。これらの化合物を、以下に示す（ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ化合物ＩＤ番号により記載する）。
５９８０７５０
５８０３８８４
６０４９１８４
５９７９２０７
６１４１５７６
【００３６】
これらの化合物と構造的に類似する化合物の例を下記表７〜１１に提供する。
【表７】
【表８】
【表９】
【表１０】
【表１１】
【００３７】
本明細書で使用する「細胞」とは、いずれかの動物細胞、組織、または全生物を指し、哺乳類細胞には、例えば、ウシ亜科の動物細胞、齧歯類細胞（例えば、マウス、またはラット、またはミンク、またはハムスター細胞等）、ウマ細胞、またはブタ細胞、またはヤギ細胞、またはヒツジ細胞、またはネコ細胞、またはイヌ細胞、またはサル細胞、またはヒト細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３８】
本明細書で使用する「薬剤」とは、所望の生物学的活性を有するいずれの物質を指す。「ＥＲストレス阻害剤」は、宿主における、細胞死を阻害する、またはＥＲストレスと関連する疾患、症状もしくは傷害を治療・処置する際に、検出可能な生物学的活性を有する。
【００３９】
本明細書で使用する「有効量」とは、観察できる生物学的効果の検出可能な差異を生じる組成物の量、例えば、このような効果の統計的に有意な差異を生じる組成物の量、特に、ＥＲストレス阻害活性を生じる組成物の量を指す。該検出可能な差異は、該組成物における単一物質、該組成物における物質の組み合わせ、または２つ以上の組成物の投与の併用効果に起因し得る。例えば、ＥＲストレス阻害化合物を含む組成物の「有効量」は、ＥＲストレスに起因する細胞死、または、例えば、宿主における、ＥＲストレスの症状を緩和する、または、ＥＲストレスまたは別の疾患もしくは疾病と関連する、またはそれらに起因する疾患、症状もしくは障害を治療もしくは予防する等の別の所望の効果を検出可能に阻害する、組成物の量を指し得る。所与の組成物または治療におけるＥＲストレス阻害化合物と別の物質の組み合わせは、相乗的な組み合わせであり得る。Ｃｈｏｕ ａｎｄ Ｔａｌａｌａｙ，Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇｕｌ．２２：２７−５５（１９８４）による例に記載されるように、相乗効果は、組み合わせで投与される場合の該化合物の効果が、単一薬剤としてのみ投与される場合の該化合物の相加効果よりも大きい場合に、生じる。一般に、相乗効果は、該化合物の準最適濃度で、最も明確に示される。相乗効果は、個別の成分と比較して、細胞毒性の低下、または活性の増加、またはいくつかの他の組み合わせの有益な効果を示す。
【００４０】
本明細書で使用する「治療」または「治療する」とは、（ｉ）病態が発生するのを防ぐ（例えば、予防法）、（ｉｉ）病態を阻害する、もしくはその発達を抑える、（ｉｉｉ）病態を緩和する、および／または病態と関連する症状を軽減することを含む。
【００４１】
本明細書で使用する「患者」という用語は、本発明の組成物および方法により治療される生命体を指す。このような生命体としては、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウマ、ラット、マウス等の哺乳動物が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の文脈において、「被検体」という用語は、一般に、ＥＲストレス、または関連疾患、症状もしくは障害に起因する細胞死のための治療（例えば、本発明の化合物、および任意に１つもしくは複数の他の薬剤の投与）を受ける個体・個人を指す。
【００４２】
本明細書で使用される「薬剤として許容される塩」とは、ＥＲストレス阻害化合物、またはその酸塩または塩基塩を作製することによって親化合物が改変された開示された化合物の他の誘導体を指す。薬剤として許容される塩の例としては、アミン等の塩基性残基の鉱酸塩もしくは有機酸塩、カルボン酸等の酸性残基のアルカリ塩もしくは有機塩が挙げられるが、これらに限定されない。薬剤として許容される塩としては、例えば、無毒性の無機酸または有機酸から形成された、親化合物の無毒性塩または第４級アンモニウム塩も挙げられる。例えば、このような無毒性塩としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸等の無機酸から誘導された塩；および酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パモ酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、２−アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホトン酸、シュウ酸、イセチオン酸等の有機酸から調製された塩が挙げられる。
【００４３】
ＥＲストレス阻害化合物または本発明に有用な他の化合物の薬剤として許容される塩は、親化合物から合成され得、従来の化学的手法により、塩基性部分または酸性部分を含む。一般に、このような塩は、水中もしくは有機溶媒、または両者の混合液中で、これらの化合物の遊離酸または遊離塩基型と、化学量論量の適切な塩基または酸を反応させることによって、調製することができる。一般に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリル等の非水媒体が好ましい。好適な塩の一覧表は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，ｐ．１４１８（１９８５）に見い出され、その開示は、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００４４】
「薬剤として許容される」という語句は、妥当なベネフィット／リスク比に見合った、過剰毒性、または刺激、またはアレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を有しない、ヒトおよび動物の組織と接触して使用するのに好適な、適切な医療判断の範囲内の化合物、材料、組成物、および／または剤形を指すために、本明細書では使用される。
【００４５】
本明細書に開示される化合物のあるジアステレオマーは、他と比較して優れた活性を示し得る。必要な場合に、ラセミ材料の分離は、キラルカラムを用いたＨＰＬＣによって、またはＴｈｏｍａｓ Ｊ．Ｔｕｃｋｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２４３７−２４４４，１９９４にあるような、カンファン酸クロリド等の分割剤を用いた分離によって、達成することができる。式Ｉのキラル化合物はまた、例えば、Ｍａｒｋ Ａ．Ｈｕｆｆｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６０：１５９０−１５９４，１９９５のキラル触媒またはキラルリガンドを用いて、直接合成され得る。
【００４６】
「安定化合物」および「安定構造」は、反応混合物から有用な程度の純度への単離、および治療薬の有効な処方に耐えうる十分に強固な化合物を意味する。安定化合物のみが、本発明により企図される。
【００４７】
「置換される（Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ）」とは、「置換される（Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ）」を用いる表現において示された原子上の１つもしくは複数の水素が、指示された群からの選択肢と置き換えられることを意図する。但し、指示された原子の通常の価数は超えず、置換は安定化合物をもたらす。好適な指示された群としては、例えば、アルキル、アルケニル、アルキリデニル、アルケニルイデニル（ａｌｋｅｎｙｌｉｄｅｎｙｌ）、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、ＮＲｘＲｙおよび／またはＣＯＯＲｘが挙げられる。ここで、各ＲｘおよびＲｙは独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、またはヒドロキシである。置換基が、ケト（すなわち、＝Ｏ）またはチオキソ（すなわち、＝Ｓ）基の場合、該原子上の２つの水素が、置き換えられる。
【００４８】
「割り込まれる（Ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｅｄ）」とは、２つ以上の隣接炭素原子と、それらが結合する水素原子との間（例えば、メチル（ＣＨ３）、メチレン（ＣＨ２）またはメチン（ＣＨ））に、「割り込まれる（Ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｅｄ）」という表現で示された群からの選択肢が挿入されることを意図する。但し、示された原子の通常の価数は超過せず、割り込みは安定化合物をもたらす。このような好適な示された群としては、例えば、非過酸化物オキシ（−Ｏ−）、またはチオ（−Ｓ−）、またはカルボニル（−Ｃ（＝Ｏ）−）、またはカルボキシ（−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−）、またはイミン（Ｃ＝ＮＨ）、またはスルホニル（ＳＯ）、またはスルホキシド（ＳＯ２）が挙げられる。
【００４９】
ラジカル、置換基、および範囲のために以下に記載した特定かつ好ましい値は、例示するためのみであり、他の定義された値、またはラジカルおよび置換基に対して定義された範囲内の他の値を除外しない。
【００５０】
「アルキル」とは、通常、第２級炭素原子、または第３級炭素原子、または環状炭素原子を含む、Ｃ１−Ｃ１８炭化水素を指す。例としては、メチル（Ｍｅ、−ＣＨ３）、エチル（Ｅｔ、−ＣＨ２ＣＨ３）、１−プロピル（ｎ−Ｐｒ、ｎ−プロピル、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、２−プロピル（ｉ−Ｐｒ、ｉ−プロピル、−ＣＨ（ＣＨ３）２）、１−ブチル（ｎ−Ｂｕ、ｎ−ブチル、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、２−メチル−１−プロピル（ｉ−Ｂｕ、ｉ−ブチル、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２）、２−ブチル（ｓ−Ｂｕ、ｓ−ブチル、−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３）、２−メチル−２−プロピル（ｔ−Ｂｕ、ｔ−ブチル、−Ｃ（ＣＨ３）３）、１−ペンチル（ｎ−ペンチル、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、２−ペンチル（−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、３−ペンチル（−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）２）、２−メチル−２−ブチル（−Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２ＣＨ３）、３−メチル−２−ブチル（−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）２）、３−メチル−１−ブチル（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２）、２−メチル−１−ブチル（−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３）、１−ヘキシル（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、２−ヘキシル（−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、３−ヘキシル（−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３））、２−メチル−２−ペンチル（−Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、３−メチル−２−ペンチル（−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３）、４−メチル−２−ペンチル（−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２）、３−メチル−３−ペンチル（−Ｃ（ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ３）２）、２−メチル−３−ペンチル（−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）２）、２，３−ジメチル−２−ブチル（−Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ（ＣＨ３）２）、３，３−ジメチル−２−ブチル（−ＣＨ（ＣＨ３）Ｃ（ＣＨ３）３が挙げられる。
【００５１】
アルキルは、任意に、１つもしくは複数のアルケニル、アルキリデニル、アルケニルイデニル（ａｌｋｅｎｙｌｉｄｅｎｙｌ）、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、ＮＲｘＲｙおよび／またはＣＯＯＲｘと置換できる。ここで、各ＲｘおよびＲｙは独立して、Ｈ、またはアルキル、またはアルケニル、またはアリール、またはヘテロアリール、または複素環、またはシクロアルキル、またはヒドロキシルである。該アルキルには、任意に、１つもしくは複数の非過酸化物オキシ（−Ｏ−）、またはチオ（−Ｓ−）、またはカルボニル（−Ｃ（＝Ｏ）−）、またはカルボキシ（−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−）、またはスルホニル（ＳＯ）、またはスルホキシド（ＳＯ２）を割り込ませることができる。さらに、該アルキルは、任意に、少なくとも部分的に不飽和であり得、それによって、アルケニルを提供することができる。
【００５２】
「アルケニル」とは、通常、少なくとも１つの不飽和部位、すなわち、炭素−炭素ｓｐ２二重結合を有する、第２級炭素原子、第３級炭素原子、または環状炭素原子を含む、Ｃ２−Ｃ１８炭化水素を指す。例としては、エチレンまたはビニル（−ＣＨ=ＣＨ２）、アリル（−ＣＨ２ＣＨ=ＣＨ２）、シクロペンテニル（−Ｃ５Ｈ７）、および５−ヘキセニル（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ=ＣＨ２）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５３】
該アルケニルは、任意に、１つもしくは複数のアルキル、アルキリデニル、アルケニルイデニル（ａｌｋｅｎｙｌｉｄｅｎｙｌ）、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、ＮＲｘＲｙおよび／またはＣＯＯＲｘと置換できる。ここで、各ＲｘおよびＲｙは独立して、Ｈ、またはアルキル、またはアルケニル、またはアリール、またはヘテロアリール、または複素環、またはシクロアルキル、またはヒドロキシルである。さらに、該アルケニルに、任意に、１つもしくは複数の非過酸化物オキシ（−Ｏ−）、またはチオ（−Ｓ−）、またはカルボニル（−Ｃ（＝Ｏ）−）、またはカルボキシ（−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−）、またはスルホニル（ＳＯ）、またはスルホキシド（ＳＯ２）を割り込ませることができる。
【００５４】
「アルキリデニル」とは、通常、第２級炭素原子、第３級炭素原子、または環状炭素原子を含む、Ｃ１−Ｃ１８炭化水素を指す。例としては、メチリデニル（＝ＣＨ２）、エチリデニル（＝ＣＨＣＨ３）、１−プロピリデニル（＝ＣＨＣＨ２ＣＨ３）、２−プロピリデニル（＝Ｃ（ＣＨ３）２）、１−ブチリデニル（＝ＣＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、２−メチル−１−プロピリデニル（＝ＣＨＣＨ（ＣＨ３）２）、２−ブチリデニル（＝Ｃ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３）、１−ペンチル（＝ＣＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、２−ペンチリデニル（＝Ｃ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、３−ペンチリデニル（＝Ｃ（ＣＨ２ＣＨ３）２）、３−メチル−２−ブチリデニル（＝Ｃ（ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）２）、３−メチル−１−ブチリデニル（＝ＣＨＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２）、２−メチル−１−ブチリデニル（＝ＣＨＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３）、１−ヘキシリデニル（＝ＣＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、２−ヘキシリデニル（＝Ｃ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、３−ヘキシリデニル（＝Ｃ（ＣＨ２ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３））、３−メチル−２−ペンチリデニル（＝Ｃ（ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３）、４−メチル−２−ペンチリデニル（＝Ｃ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２）、２−メチル−３−ペンチリデニル（＝Ｃ（ＣＨ２ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）２）、および３，３−ジメチル−２−ブチリデニル（＝Ｃ（ＣＨ３）Ｃ（ＣＨ３）３が挙げられる。
【００５５】
該アルキリデニルは、任意に、１つもしくは複数のアルキル、アルケニル、アルケニルイデニル（ａｌｋｅｎｙｌｉｄｅｎｙｌ）、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、ＮＲｘＲｙおよび／またはＣＯＯＲｘと置換できる。ここで、各ＲｘおよびＲｙは独立して、Ｈ、またはアルキル、またはアルケニル、またはアリール、またはヘテロアリール、または複素環、またはシクロアルキル、またはヒドロキシルである。さらに、該アルキリデニルに、任意に、１つもしくは複数の非過酸化物オキシ（−Ｏ−）、またはチオ（−Ｓ−）、またはカルボニル（−Ｃ（＝Ｏ）−）、またはカルボキシ（−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−）、またはスルホニル（ＳＯ）、またはスルホキシド（ＳＯ２）を割り込ませることができる。
【００５６】
「アルケニルイデニル（ａｌｋｅｎｙｌｉｄｅｎｙｌ）」とは、通常、少なくとも１つの不飽和部位、すなわち、炭素−炭素ｓｐ２二重結合を有する、第２級炭素原子、第３級炭素原子、または環状炭素原子を含む、Ｃ２−Ｃ１８炭化水素を指す。例としては、アリルイデニル（ａｌｌｙｌｉｄｅｎｙｌ）（＝ＣＨＣＨ=ＣＨ２）、および５−ヘキセニルイデニル（ｈｅｘｅｎｙｌｉｄｅｎｙｌ）（＝ＣＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ=ＣＨ２）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５７】
該アルケニルイデニル（ａｌｋｅｎｙｌｉｄｅｎｙｌ）は、任意に、１つもしくは複数のアルキル、アルケニル、アルキリデニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、ＮＲｘＲｙおよび／またはＣＯＯＲｘと置換できる。ここで、各ＲｘおよびＲｙは独立して、Ｈ、またはアルキル、またはアルケニル、またはアリール、またはヘテロアリール、または複素環、またはシクロアルキル、またはヒドロキシルである。さらに、該アルケニルイデニル（ａｌｋｅｎｙｌｉｄｅｎｙｌ）に、任意に、１つもしくは複数の非過酸化物オキシ（−Ｏ−）、またはチオ（−Ｓ−）、またはカルボニル（−Ｃ（＝Ｏ）−）、またはカルボキシ（−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−）、またはスルホニル（ＳＯ）、またはスルホキシド（ＳＯ２）を割り込ませることができる。
【００５８】
「アルキレン」とは、飽和鎖、分枝鎖もしくは直鎖、または環状の１〜１８個の炭素原子を有し、親アルカンの同一のもしくは異なる炭素原子から２つの水素原子の除去によって得られる２つの一価のラジカル中心を有する、炭化水素基を指す。典型的なアルキレン基は、メチレン（−ＣＨ２−）１，２−エチル（−ＣＨ２ＣＨ２−）、１，３−プロピル（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、１，４−ブチル（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５９】
該アルキレンは、任意に、１つもしくは複数のアルキル、アルケニル、アルキリデニル、アルケニルイデニル（ａｌｋｅｎｙｌｉｄｅｎｙｌ）、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、ＮＲｘＲｙおよび／またはＣＯＯＲｘと置換できでる。ここで、各ＲｘおよびＲｙは独立して、Ｈ、またはアルキル、またはアルケニル、またはアリール、またはヘテロアリール、または複素環、またはシクロアルキル、またはヒドロキシルである。さらに、該アルキレンに、任意に、１つもしくは複数の非過酸化物オキシ（−Ｏ−）、またはチオ（−Ｓ−）、またはカルボニル（−Ｃ（＝Ｏ）−）、またはカルボキシ（−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−）、またはスルホニル（ＳＯ）、またはスルホキシド（ＳＯ２）を割り込ませることができる。また、該アルキレンは、任意に、少なくとも部分的に不飽和であり得、それによって、アルケニレンを提供することができる。
【００６０】
「アルケニレン」とは、不飽和鎖、分枝鎖もしくは直鎖、または環状の２〜１８個の炭素原子を有し、親アルケンの同一のもしくは異なる炭素原子から２つの水素原子の除去によって得られる２つの一価のラジカル中心を有する、炭化水素基を指す。典型的なアルケニレン基としては、１，２−エチレン（−ＣＨ=ＣＨ−）が挙げられるが、これに限定されない。
【００６１】
該アルケニレンは、任意に、１つもしくは複数のアルキル、アルケニル、アルキリデニル、アルケニルイデニル（ａｌｋｅｎｙｌｉｄｅｎｙｌ）、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、ＮＲｘＲｙおよび／またはＣＯＯＲｘと置換できる。ここで、各ＲｘおよびＲｙは独立して、Ｈ、またはアルキル、またはアルケニル、またはアリール、またはヘテロアリール、または複素環、またはシクロアルキル、またはヒドロキシルである。さらに、該アルケニレンに、任意に、１つもしくは複数の非過酸化物オキシ（−Ｏ−）、またはチオ（−Ｓ−）、またはカルボニル（−Ｃ（＝Ｏ）−）、またはカルボキシ（−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−）、またはスルホニル（ＳＯ）、またはスルホキシド（ＳＯ２）を割り込ませることができる。
【００６２】
「アルコキシ」という用語は、アルキル−Ｏ−の基を指し、ここでのアルキルは、前述したように定義される。好ましいアルコキシ基としては、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、ｉｓｏ−プロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｎ−ペンとキシ、ｎ−ヘキソキシ、１，２−ジメチルブトキシ等が挙げられる。
【００６３】
該アルコキシは、任意に、１つもしくは複数のアルキル、アルキリデニル、アルケニルイデニル（ａｌｋｅｎｙｌｉｄｅｎｙｌ）、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、ＮＲｘＲｙおよびＣＯＯＲｘと置換できる。ここで、各ＲｘおよびＲｙは独立して、Ｈ、またはアルキル、またはアリール、またはヘテロアリール、または複素環、またはシクロアルキル、またはヒドロキシルである。
【００６４】
「アリール」という用語は、単環（例えば、フェニル）または多数の縮合（融合）環を有する６個から２０個の炭素原子からなる不飽和芳香族炭素環基を指し、少なくとも１つの環は、芳香族（例えば、ナフチル、ジヒドロフェナントレニル、フルオレニル、またはアントリル）である。好ましいアリールとしては、フェニル、ナフチル等が挙げられる。
【００６５】
該アリールは、任意に、１つもしくは複数のアルキル、アルケニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、ＮＲｘＲｙおよびＣＯＯＲｘと置換できる。ここで、各ＲｘおよびＲｙは独立して、Ｈ、またはアルキル、またはアリール、またはヘテロアリール、または複素環、またはシクロアルキル、またはヒドロキシルである。
【００６６】
「シクロアルキル」という用語は、単一の環状基または多数の縮合環を有する、３個から２０個の炭素原子からなる環状アルキル基を指す。このようなシクロアルキル基としては、例として、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロオクチル等の単一の環状構造、またはアダマンタニル等の多数の環状構造が挙げられる。
【００６７】
該シクロアルキルは、任意に、１つもしくは複数のアルキル、アルケニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、ＮＲｘＲｙおよびＣＯＯＲｘと置換できる。ここで、各ＲｘおよびＲｙは独立して、Ｈ、またはアルキル、またはアリール、またはヘテロアリール、または複素環、またはシクロアルキル、またはヒドロキシルである。
【００６８】
該シクロアルキルは、任意に、少なくとも部分的に不飽和であり得、それによって、シクロアルケニルを提供することができる。
【００６９】
「ハロ」という用語は、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードを指す。同様に、「ハロゲン」という用語は、フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素を指す。
【００７０】
「ハロアルキル」とは、本明細書に定義される１〜４個のハロ基によって置換される本明細書に定義されるアルキルを指し、各ハロ基は、同一または異なり得る。代表的なハロアルキル基としては、例として、トリフルオロメチル、３−フルオロドデシル、１２，１２，１２−トリフルオロドデシル、２−ブロモオクチル、３−ブロモ−６−クロロヘプチル等が挙げられる。
【００７１】
「ヘテロアリール」という用語は、本明細書では、１つ、または２つ、または３つの芳香環を含み、芳香環が少なくとも１つの窒素、または酸素、または硫黄原子を含む、単環式系、または二環式系、または三環式環系として定義される。また、芳香環は、例えば、１つもしくは複数の、特に、ハロ、アルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ハロアルキル、ニトロ、アミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、およびアルキルスルホニル等の１個から３個の置換基で、非置換または置換することができる。ヘテロアリール基の例としては、２Ｈ−ピロリル、３Ｈ−インドリル、４Ｈ−キノリジニル、４ｎＨ−カルバゾリル、アクリジニル、ベンゾ［ｂ］チエニル、ベンゾチアゾリル、β−カルボリニル、カルバゾリル、クロメニル、シンナオリニル、ジベンゾ［ｂ，ｄ］フラニル、フラザニル、フリル、イミダゾリル、イミジゾリル、インダゾリル、インドリシニル、インドリル、イソベンゾフラニル、イソインドリル、イソキノリル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、ナフチリジニル、ナフサ［２，３−ｂ］、オキサゾリル、ペリミジニル、フェナントリジニル、フェナントロリニル、フェナルサジニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサチイニル、フェノキサジニル、フタラジニル、プテリジニル、プリニル、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリジル、ピリミジニル、ピリミジニル、ピロリル、キナゾリニル、キノリル、キノキサリニル、チアジアゾリル、チアントレニル、チアゾリル、チエニル、トリアゾリル、およびキサンテニルが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、該「ヘテロアリール」という用語は、炭素を含み、また、非過酸化物酸素、硫黄、およびＮ（Ｚ）の群から独立して選択される１個、または２個、または３個、または４個のヘテロ原子を含み、５個または６個の環原子を含む単環式芳香族環を示す。ここで、Ｚは、不在またはＨ、またはＯ、またはアルキル、またはフェニル、またはベンジルである。別の実施形態において、ヘテロアリールは、その中から得られる約８個から１０個の環原子のオルト縮合した二環式複素環、特に、ベンズ誘導体、またはそれにプロピレンもしくはテトラメチレンジラジカルを縮合することによって得られたものを示す。
【００７２】
該ヘテロアリールは、任意に、１つもしくは複数のアルキル、アルケニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、ＮＲｘＲｙおよびＣＯＯＲｘと置換できる。ここで、各ＲｘおよびＲｙは独立して、Ｈ、またはアルキル、またはアリール、またはヘテロアリール、または複素環、またはシクロアルキル、またはヒドロキシルである。
【００７３】
「複素環」という用語は、飽和、一部不飽和の環系を指し、酸素、窒素、および硫黄からなる群から選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含み、任意に、アルキルまたはＣ（＝Ｏ）ＯＲｂと置換しうる。ここで、Ｒｂは、水素またはアルキルである。一般に、複素環は、酸素、窒素、および硫黄からなる群から選択される１つもしくは複数のヘテロ原子を含む、単環式基、または二環式基、または三環式基である。複素環基はまた、該環に結合されるオキソ基（＝Ｏ）も含むことができる。複素環基の限定されない例としては、１，３−ジヒドロベンゾフラン、１，３−ジオキソラン、１，４−ジオキサン、１，４−ジチアン、２Ｈ−ピラン、２−ピラゾリン、４Ｈ−ピラン、クロマニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、インドリニル、イソクロマニル、イソインドリニル、モルホリン、ピペラジニル、ピペリジン、ピペリジル、ピラゾリジン、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピロリジン、ピロリン、キヌクリジン、およびチオモルホリンが挙げられる。
【００７４】
該複素環は、任意に、１つもしくは複数のアルキル、アルケニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、ＮＲｘＲｙおよびＣＯＯＲｘと置換できる。ここで、各ＲｘおよびＲｙは独立して、Ｈ、またはアルキル、またはアリール、またはヘテロアリール、または複素環、またはシクロアルキル、またはヒドロキシルである。
【００７５】
窒素複素環およびヘテロアリールの例としては、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インドリジン、イソインドール、インドール、インダゾール、プリン、キノリジン、イソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチルピリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、プテリジン、カルバゾール、カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、フェナントロリン、イソチアゾール、フェナジン、イソオキサゾール、フェノキサジン、フェノチアジン、イミダゾリジン、イミダゾリン、ピペリジン、ピペラジン、インドリン、モルホリノ、ピペリジニル、テトラヒドロフラニル等、ならびに複素環を含むＮ−アルコキシ−窒素が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の１つの特定の実施形態において、該窒素複素環は、３−メチル−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−ピラジノ［３，２，１−ｊｋ］カルバゾール−３−イウムヨージドであり得る。
【００７６】
別の種類の複素環は、式［−（ＣＨ２−）ａＡ−］の１つもしくは複数の反復単位を有する、特定の種類の複素環式化合物を指し、「クラウン化合物」として知られる。ここで、ａは、２もしくはそれ以上であり、Ａは、それぞれ別々に、Ｏ、またはＮ、またはＳ、またはＰであり得る。クラウン化合物の例としては、ほんの一例として、［−（ＣＨ２）３−ＮＨ−］３、［−（（ＣＨ２）２−Ｏ）４−（（ＣＨ２）２−ＮＨ）２］等が挙げられる。一般的に、このようなクラウン化合物は、４個から１０個のヘテロ原子および８個から４０個の炭素原子を有することができる。
【００７７】
「アルカノイル」という用語は、Ｃ（＝Ｏ）Ｒを指し、ここでのＲは、前述したように定義されたアルキル基である。
【００７８】
「アシルオキシ」という用語は、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）Ｒを指し、ここでのＲは、前述したように定義されたアルキル基である。アシルオキシ基の例としては、アセトキシ、プロパノイルオキシ、ブタノイルオキシ、およびペンタノイルオキシが挙げられるが、これらに限定されない。上記に定義された任意のアルキル基を使用して、アシルオキシ基を形成することができる。
【００７９】
「アルコキシカルボニル」という用語は、Ｃ（＝Ｏ）ＯＲを指し、ここでのＲは、前述したように定義されたアルキル基である。
【００８０】
「アミノ」という用語は、−ＮＨ２を指し、「アルキルアミノ」という用語は、−ＮＲ２を指す。ここで、少なくとも１つのＲは、アルキルであり、第２のＲは、アルキルまたは水素である。「アシルアミノ」という用語は、ＲＣ（＝Ｏ）Ｎを指し、ここでのＲは、アルキルまたはアリールである。
【００８１】
「イミノ」という用語は、−Ｃ＝ＮＨを指す。
【００８２】
「ニトロ」という用語は、−ＮＯ２を指す。
【００８３】
「トリフルオロメチル」という用語は、−ＣＦ３を指す。
【００８４】
「トリフルオロメトキシ」という用語は、−ＯＣＦ３を指す。
【００８５】
「シアノ」という用語は、−ＣＮを指す。
【００８６】
「ヒドロキシ」または「ヒドロキシル」という用語は、–ＯＨを指す。
【００８７】
「オキシ」という用語は、−Ｏ−を指す。
【００８８】
「チオ」という用語は、−Ｓ−を指す。
【００８９】
「チオキソ」という用語は、（＝Ｓ）を指す。
【００９０】
「ケト」という用語は、（＝Ｏ）を指す。
【００９１】
上記の基のいずれかについては、１つもしくは複数の置換基を含み、当然ながら、このような基は、立体的に現実的でない、および／または合成的に実現可能でない、いずれの置換または置換型を含まないことが理解される。また、本発明の化合物は、これらの化合物の置換から生じるすべての立体化学的な異性体を含む。
【００９２】
本明細書に記載される化合物内の選択された置換基は、再帰的な程度まで存在する。この文脈では、「再帰的な置換基」とは、ある置換基がそれ自身で再帰的な程度まで存在する別の例を列挙し得ることを意味する。このような置換基の再帰的特性のために、理論上は、多数が任意の所与の特許請求項に存在し得る。医化学分野の当業者は、このような置換基の総数は意図する化合物の所望の性質によって合理的に制限されると理解している。このような性質には、例えば、分子量、または溶解性、またはｌｏｇＰ等の物理的性質、意図する標的に対する活性等の適用性、および合成の容易さ等の実用性が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９３】
再帰的な置換基は、本発明の意図する態様である。医薬および有機化学の分野の当業者は、このような置換基の汎用性を理解している。再帰的な置換基が本発明の請求項に存在する程度まで、上記のように総数を決定する。
【００９４】
本明細書に記載される化合物は、親化合物、または親化合物のプロドラッグ、または親化合物の活性代謝物として、投与することができる。
【００９５】
「プロドラッグ」は、このようなプロドラッグが哺乳類の被検体に投与される場合、生体内で本発明の活性親ドラッグまたは他の製剤または化合物を放出するあらゆる共有結合した物質を含むことを意図する。本発明の化合物のプロドラッグは、例えば、生体内の作用で、親化合物が切断されるような方法で、化合物に存在する官能基を変性することにより調製される。プロドラッグは、本発明の化合物を含み、カルボニル基、またはカルボン酸基、またはヒドロキシ基、またはアミノ基が、プロドラッグが哺乳類の被検体に投与される場合、遊離のカルボニル基、またはカルボン酸基、またはヒドロキシ基、またはアミノ基を形成するために切断されるいずれかの基に結合する。プロドラッグの例としては、本発明の化合物中のアルコールまたはアミン官能基への酢酸誘導体の塩・エステル、ギ酸誘導体の塩・エステル、および安息香酸誘導体の塩・エステル等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９６】
「代謝物」とは、本発明のこのような活性親ドラッグまたは他の製剤または化合物が哺乳類の被検体に投与される場合、生体細胞が、生体内で本発明の活性親ドラッグまたは他の製剤または化合物と相互に作用する生化学過程に起因するあらゆる物質を指す。代謝物は、任意の代謝経路からの生成物または媒介物を含む。
【００９７】
「代謝経路」とは、１つの化合物を別の化合物に変換し、細胞機能のために媒介物・中間体およびエネルギーを提供する一連の酵素媒介反応を指す。代謝経路は、線状または環状であり得る。
【００９８】
明らかに、本発明の多数の変性および変化が、上記の教示を考慮に入れると可能である。したがって、添付の請求項の範囲内で、本発明は、本明細書に具体的に記載される以外にも実行され得る。
【００９９】
医学的適応
ＥＲストレス誘導細胞死を阻害する、本発明の化合物は、次のＥＲストレス関連疾患、症状、および障害の治療に用いられうる：神経疾患、代謝性疾患、虚血障害、心臓および循環系損傷、ウイルス感染、アテローム性動脈硬化、双極性疾患、およびバッテン病。神経疾患には、家族性アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病（ｐｏｌｙＱ疾患）、球脊髄性筋萎縮症／ケネディ病（ｐｏｌｙＱ疾患）、脊髄小脳失調症３型／マシャド・ジョセフ病（ｐｏｌｙＱ疾患）、プリオン病、筋萎縮性側索硬化症、およびＧＭ１ガングリオシドーシスが含まれるが、これらに限定されない。代謝性疾患には、糖尿病、ウォルコツト・ラリソン症候群、ウォフラム症候群、２型糖尿病、ホモシステイン血症、Ｚα１−抗トリプシン欠乏症封入体筋炎、および遺伝性チロシン血症１型が含まれるが、これらに限定されない。心臓および循環系損傷には、心肥大、低酸素性障害、および家族性高コレステロール血症が含まれるが、これらに限定されない。
【０１００】
医薬組成物
本発明の化合物は、医薬組成物として処方され得、選ばれた投与経路、すなわち、経口または非経口で、筋肉内、静脈内、局所、または皮下経路に適応した様々な形態で、ヒト患者等、哺乳類の宿主に投与され得る。
【０１０１】
本化合物は、例えば、不活性希釈剤または吸収可能な食用の担体等の薬剤として許容される媒体と併用して、経口で全身に投与されてもよい。それらは、硬質または軟質ゼラチンカプセルに充填し、錠剤に圧縮し、または患者の食事の食物と共に直接取り込んでもよい。経口投与に関しては、該活性化合物は、１つもしくは複数の賦形剤と組み合わせて、および摂取可能な錠剤、口腔錠、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、ウエハース等の形態で使用されてもよい。このような組成物および調製物は、少なくとも０．１％の活性化合物を含まなければならない。該組成物および調製物の割合は、当然ながら、異なり、適宜に、所与の単位剤形の重量の約２％から約６０％の間にあり得る。このような有用な組成物における活性化合物の量は、有効な用量レベルが得られるようなものである。
【０１０２】
錠剤、トローチ、ピル、カプセル等はまた、トラガカント、アカシア、コーンスターチ、またはゼラチン等の結合剤；リン酸二カルシウム等の賦形剤；コーンスターチ、デンプン、アルギン酸等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤；およびスクロース、もしくはフルクトース、もしくはラクトース、もしくはアスパルテーム等の甘味剤を含有してもよく、ペパーミント、もしくは冬緑油、もしくはチェリー風味等の香味剤を加えてもよい。単位剤形がカプセルである場合は、上記のタイプの材料のほかに、植物油またはポリエチレングリコール等の液体担体を含有してもよい。様々な他の材料が、コーティングとして、または固体単位剤形の物理的形態を変化させるために存在する可能性がある。例えば、錠剤、またはピル、またはカプセルは、ゼラチン、またはワックス、またはシェラック、または糖等でコーティングされてもよい。シロップ剤もしくはエリキシル剤は、該活性化合物、甘味剤としてスクロースもしくはフルクトース、保存剤としてメチルおよびプロピルパラベン、染料およびチェリーまたはオレンジフレーバー等の香味料を含有してもよい。当然ながら、任意の単位剤形を調製する際に使用されるあらゆる物質は、用いた量で薬剤として許容され得るかつ実質的に非毒性であるべきである。さらに、該活性化合物は、徐放性剤および装置に導入されてもよい。
【０１０３】
該活性化合物はまた、点滴または注射によって、静脈もしくは腹膜に投与され得る。該活性化合物またはその塩の溶液は、水で調製され得、任意に、非毒性界面活性剤と混合され得る。分散剤はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、トリアセチン、およびそれらの混合物中、および油中で調製され得る。貯蔵および使用に関する通常の条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防御するために保存剤を含有し得る。
【０１０４】
注射または点滴のために好適な医薬剤形は、滅菌注射剤もしくは点滴剤または分散剤の即席調製物に適合され、任意に、リポソームで封入された活性成分を含む滅菌水性溶液または分散剤または滅菌粉末を含むことができる。すべてのケースにおいて、最終的な剤形は、製造および貯蔵の条件下で、滅菌、液状および安定であるべきである。液体担体または媒体は、溶媒または液体分散媒、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）、植物油、非毒性グリセリルエステルおよびそれらの好適な混合物であり得る。適当な液体性は、例えば、リポソームの形成によって、分散剤の場合において所望の粒子サイズの維持によって、または界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用を防止することは、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロザール等によって得られる。多くの場合、等張剤、例えば、糖または緩衝液または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射し得る組成物の長期吸収は、吸収を遅延する剤、例えば、ステアリン酸アルミニウム（Ｉ）およびゼラチンを組成物に使用することによってもたらされ得る。
【０１０５】
滅菌注射剤は、上記列挙した様々な他の成分と共に適当な溶媒中に所望の量で、活性化合物を導入することによって調製され、必要に応じ、滅菌濾過され得る。滅菌注射剤の調製のための滅菌粉末の場合では、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥技術であり、これにより、活性成分、ならびに先の滅菌濾過溶液中に存在するあらゆる追加の所望の成分の粉末が得られる。
【０１０６】
局所投与のために、本化合物が液体である場合、純粋な形態で適用され得る。しかしながら、広く、それらは、組成物または配合物として、皮膚化学的に許容される担体と併用して、皮膚に投与することが望まれ、これは、固体または液体で存在してもよい。
【０１０７】
有用な固体担体は、細かく分割された固体、例えば、タルク、クレイ、微小結晶性セルロース、シリカ、アルミナ等を含む。有用な液体担体は、水またはアルコールまたはグリコール、または水−アルコール／グリコール混合物を含み、この中で本化合物は、有効レベルで、任意に非毒性界面活性剤の助けによって、溶解され得るか、分散され得る。香料等の佐剤および追加の抗菌剤は、所与の使用に対して性質を最適化するために添加することができる。得られる液体組成物は、包帯および他の包帯剤を浸透するため吸収パッドに適用されるか、または、ポンプタイプまたはエアゾールスプレーを用いて罹患箇所に噴霧され得る。
【０１０８】
増粘剤、例えば、合成ポリマー、または脂肪酸、または脂肪酸塩およびエステル、または脂肪アルコール、または修飾されたセルロースまたは修飾された天然物質はまた、使用者の皮膚に直接適用するために、散布可能なペースト、ゲル、軟膏、石鹸等を形成するように、液体担体と共に用いることができる。
【０１０９】
本発明の化合物の有用な用量は、動物モデルにおける生体内活性と体外活性とを比較することによって決定され得る。マウスおよび他の動物における有効用量のヒトへの外挿法が、例えば、米国特許第４，９３８，９４９号で、当業者に知られている。
【０１１０】
一般的に、ローション等の液体組成物中の、本発明の化合物の濃度は、約０．１〜２５重量％、好ましくは、約０．５〜１０重量％である。半固体または固体組成物中の濃度は、約０．１〜５重量％、好ましくは約０．５〜２．５重量％である。
【０１１１】
単独または他の化合物と共に使用するのに必要な、該化合物の量、またはその活性塩もしくは誘導体の量は、選択される特定の塩によってだけでなく、投与の経路、治療される病気の特性および患者の年齢および健康状態によっても変化し、最終的には内科医または臨床医の裁量による。
【０１１２】
しかしながら、一般的には、好適な用量は、１日あたり、体重の約０．５〜約１００ｍｇ／ｋｇ、例えば、１日あたり、患者の体重の約１０〜約７５ｍｇ／ｋｇ、１日あたり、３〜約５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、６〜９０ｍｇ／ｋｇ／日、最も好ましくは１５〜６０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。
【０１１３】
本化合物は、単位剤形で投与されるのが便利であり得る、例えば、単位剤形あたり、活性成分が５〜１０００ｍｇ、有利には１０〜７５０ｍｇ、最も有利には５０〜５００ｍｇ存在する。
【０１１４】
該活性成分は、該活性化合物のピーク血漿濃度、約０．５〜約７５μＭ、好ましくは、約１〜５０μＭ、最も好ましくは、約２〜約３０μＭを達成するために投与され得る。これは、例えば、該活性成分の０．０５〜５％の溶液、任意に、生理食塩水中で静脈注射によって達成されるか、または約１〜１００ｍｇの活性成分を含むボーラス投与として経口投与され得る。所望の血液レベルは、約０．０１〜５．０ｍｇ／ｋｇ／時間を供する持続注入によって維持されるか、約０．４〜１５ｍｇ／ｋｇの活性成分を含む間欠性の点滴によって維持され得る。
【０１１５】
所望の用量は、単回用量、または適切な間隔、例えば、１日あたり、２、または３、または４、またはそれ以上の分割投与量として投与される分割用量として、適切に与えられ得る。分割投与量それ自身は、吸入器からの複数回吸入または眼への複数回滴の用途によっては、さらなる分割、例えば、いくつかの不連続な間隔をおいての投与であってもよい。
【０１１６】
本発明は、以下の限定されない実施例によってさらに詳細に説明される。
【実施例１】
【０１１７】
ＥＲストレス（他の細胞死経路ではない）の結果として特異的に誘導された細胞死を遮断する化合物は、内在する機構を問いただすため、ならびにＥＲストレスが細胞死および組織障害に関与する事象を引き起こす動物モデルにおいて生体内で解明するために、有用であろう。この取り組みにより、最近、ツニカマイシン（ＥＲストレスを誘導するＮ結合型糖鎖合成の阻害剤）により誘導される神経細胞死の化学阻害剤に対するスクリーニングが行われ、セリン５１上でｅＩＦ２αの脱リン酸化に関与するタンパク質ホスファターゼを抑制する化合物が同定された。さらには、この化合物がリン酸化されたｅＩＦ２αの蓄積を増加し、ＥＲストレスのいくつかの誘導剤により誘導されるアポトーシスからの保護を提供することが、刊行物に示された（Ｂｏｙｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０７：９３５−９３９，２００５）。興味深いことに、明白に特徴付けられたプロトタイプ化合物（サルブリナル）は、ホスファターゼの活性部位阻害剤ではないがむしろ、ＧＡＤＤ３５およびタンパク質ホスファターゼ−１（ＰＰ１）を含む複合体を特異的に阻害し、それによって、基質リン−ｅＩＦ２αへのＰＰ１のＧＡＤＤ３４媒介標的を阻止する。
【０１１８】
我々は、ＥＲストレスにより誘導される細胞死を遮断する化合物の同定のための代替スクリーニングアッセイを考案し、化合物のライブラリにスクリーニングを行い、それによって、このアプローチを検証した。
【０１１９】
ＥＲストレスに関連する細胞死が、いくつかの神経系疾患の顕著な特徴であるため、我々は、神経細胞を利用する一次化学ライブラリスクリーニングアッセイを開発することに焦点を当てた。ＣＳＭ１４．１は、ＳＶ４０大型Ｔ抗原の温度感受性変異体を用いて、不死化により構築されたラット線条体神経前駆細胞株である（Ｚｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：４５３３−４５３７，１９９３、Ｈａａｓ ａｎｄ Ｗｒｅｅ，Ｊ．Ａｎａｔ．，２０１：６１−６９，２００２）。許容温度（最適３２℃で）で該細胞が増殖し、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）アッセイ用の標準培地中で、容易に増殖させることができる。３９℃の非許容温度で培養した場合、大型Ｔ抗原は不活性であり、該細胞は増殖を停止し、分化して成熟ドーパミン作動性ニューロンの性質を有するニューロンを生成する（Ｚｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：４５３３−４５３７，１９９３、Ｈａａｓ ａｎｄ Ｗｒｅｅ，Ｊ．Ａｎａｔ．，２０１：６１−６９， ２００２）。
【０１２０】
大規模なスクリーニング実験と関連し得る温度の一時的な低下は、大型Ｔ活性を修復することができるため、我々は、未分化ＣＳＭ１４．１細胞を用いて、まずＨＴＳを開発し、その後、分化細胞を用いてヒットを確認するための計画を選んだ。細胞死をモニタリングするために、複雑な細胞処理過程を必要としない、細胞内ＡＴＰ含有量を測定する商業的に入手可能な生物発光試薬を用いた（ＡＴＰｌｉｔｅ，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）。したがって、ＡＴＰは、一次アッセイの細胞生存の指示薬として用いた。ＥＲストレスを誘導することで知られる刺激物を用いて細胞死を引き起こすために、我々は、タプシガルジン（ＴＧ）を選択した。これは、ＥＲのＣａ２＋−ＡＴＰａｓｅを不可逆的に阻害するセスキテルペンラクトンである（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．，２１２：８４−９２，１９９４、Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ ａｎｄ Ｋａｎｅｋｏ，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔ．，１７：９６９−９７０，１９９３）。
【０１２１】
パイロット実験において、未分化ＣＳＭ１４．１細胞を、９６ウェルプレートのウェル中に、様々な密度で播種し、一晩培養し、その後、細胞のＡＴＰ含有量を、発光性のＡＴＰｌｉｔｅ試薬を用いて測定した（図４Ａ）。また、ウェルあたり３，０００の細胞で、ＣＳＭ１４．１細胞を培養し、その後、様々な濃度のＴＧまたはＳａｌで細胞を処理し、１８時間培養した後、ＡＴＰ含有量を測定することによって、タプシガルジンに対する用量反応実験を行った（図４Ｂ）、（平均＋標準偏差；ｎ＝３）。同様に、サルブリナル（Ｓａｌ）に対する用量反応実験を行った。上記のように細胞を播種、培養し、その後、様々な濃度のサルブリナル、次いで２時間後、１５ｕＭのＴＧで、細胞を処理した。細胞を１８時間培養し、その後、ＡＴＰ含有量を測定した（平均＋標準偏差；ｎ＝３）（図４Ｃ）。ウェル（９６ウェル、平底、ポリスチレンプラスチックプレート）あたり３，０００の細胞は、十分なシグナルを提供し、１５μＭのタプシガルジン（ＴＧ）は、ウェルあたり約９５％のＡＴＰの低下をもたらすと判断された。これは、独立した生体染色色素排除アッセイを用いて、約９５％の細胞殺滅と相関することが確認された。対照（コントロール）として、我々は、サルブリナルを利用した。これは、ＥＲストレス誘導細胞死を遮断することが報告されていた（Ｂｏｙｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０７：９３５−９３９，２００５）。細胞の生存量を見るため、未分化ＣＳＭ１４．１細胞を用いてＡＴＰを測定したところ、サルブリナル（１００μＭ）は、ＴＧにより誘導される細胞死から細胞を有意に保護した（図４）。
【０１２２】
我々は、ＴＧにより誘導される細胞死に対するサルブリナルによる保護について、未分化と分化ＣＳＭ１４．１ニューロンを比較した。図５は、ＴＧがＣＳＭ１４．１細胞を殺滅し、サルブリナルがＣＳＭ１４．１細胞を保護することを示す。未分化または分化ＣＳＭ１４．１細胞を、ポリスチレン（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ Ｏｎｅ、ポリスチレン、白壁、平底、ｌｕｍｉｔｒａｃ、高結合）製の９６ウェル平底マイクロタイタープレート中の４０μＬのＤＭＥＭ培地（１０％の血清、１ｍＭのＬ−グルタミン、および抗生物質を含有する）内に、３，０００細胞／ウェルの密度で播種した。３２℃で一晩インキュベーションした後、ＤＭＳＯ（０．５％ｖ／ｖ）またはＤＭＳＯ中の１００μＭのサルブリナル（Ｓａｌ）を与えた。２時間後、ＤＭＥＭ培地内の１５０μＭのＴＧ中５ｕＬの原液に、０．７５％（ｖ：ｖ）ＤＭＳＯを含有させ、約１５μＭの最終濃度を達成した。２４時間培養した後、細胞内ＡＴＰ含有量を、ＡＴＰｌｉｔｅ溶液（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）をウェルあたり２０μＬ加え、プレートを室温で３分間インキュベートし、その後、Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ Ｍｏｏｎｌｉｇｈｔモデル３０９６）で読み込むことにより測定した。ＤＭＳＯのみで処理した細胞中のＡＴＰ含有量は、比較の対照として用いられ、この対照に対する相対的な割合として結果を示した。
【０１２３】
ＡＴＰ含有量アッセイの再現性を判定するために、９６ウェルプレートを調製し、そのうちのウェルの半分に、ＴＧ＋ＤＭＳＯ（アッセイの最小）を添加し、別の半分に、ＴＧ＋サルブリナル（アッセイの最大）を添加し、その後、未分化ＣＳＭ１４．１細胞を用いて、ＡＴＰ含有量試験を行った（図６）。ＣＳＭ１４．１細胞を、９６ウェル平底プレート中のウェルあたり３，０００の細胞で一晩培養し、その後、ＤＭＳＯ（最終濃度０．５％）あるいはＤＭＳＯ（最終濃度０．５％）中のサルブリナル（１００μＭ）のいずれかをウェルの半分に加えた（それぞれ４８）。２時間後、ＴＧをすべてのウェルに加えた（最終１５μＭ）。細胞を２４時間培養し、その後、該ＡＴＰ含有量をＡＴＰｌｉｔｅ ｌｕｍｉｎｏｇｅｎｉｃアッセイを用いて測定した。その後、９６ウェルプレートのマイクロウェルにアッセイ成分を自動添加するために、Ｂｉｏｍｅｘ（商標） ＦＸリキッドハンドラーを用いて、ハイスループット環境にこのアッセイを適応させた。第１に、未分化ＣＳＭ１４．１細胞は、約３×１０６細胞を生成させるために、１５０ｍｍ×２５ｍｍのポリスチレン培養ディッシュ中に、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１％のペニシリン／ストレプトマイシン、および１％のＬ−グルタミンで補完したＤＭＥＭ培地で、３２℃で生育させた。第２に、ＣＳＭ１４．１細胞は、８０〜９０％コンフルエンスになったとき、トリプシン処理によって培地から取り出し、２％のＦＢＳ、１ｍＭのＬ−グルタミン、ペニシリン１００ＩＵ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを抗生物質として含有するＤＭＥＭ培地内に、７．５×１０４細胞／ｍＬで懸濁した。第３に、該細胞懸濁液は、その後、９６ウェルプラスチックマイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ Ｏｎｅ、ポリスチレン、白壁、平底、ｌｕｍｉｔｒａｃ、高結合、ｃａｔ＃６５５０７４）にウェルあたり４０μＬで与え、該プレートを、９５％大気：５％ＣＯ２中で、湿気環境下、３２℃で一晩培養した。第４に、自動リキッドハンドラーを用いて、１０％ＤＭＳＯ中の５μＬの試験化合物を、９６ウェルプレートの２〜１１列（１および１２列はそのまま）のウェルに加え、ほぼ最終濃度の１５μｇ／ｍＬの試験化合物および最終濃度１％のＤＭＳＯを達成した。第５に、１０％ ＤＭＳＯ：９０％ ＤＭＥＭの溶液中の５μＬの１ｍＭのサルブリナルを、それぞれのプレートの１列／Ａ〜Ｄ行のウェルに加える一方で、５μＬの１０％ ＤＭＳＯ：９０％ ＤＭＥＭ溶液を、１列／Ｅ〜Ｈ行に対応するウェルおよび１２列のすべてのウェル加えた。第６に、該プレートを培養に戻した。第７に、２時間後、自動リキッドハンドラーを用いて、０．７５％ＤＭＳＯを含有させ、ＤＭＥＭ内で１５０μＭのＴＧの原液をウェルあたり５μＬで分注した。したがって、１〜１１列で最終濃度の約１５μＭのＴＧを達成し、データ比較の対照として、１２列を残した（１％ＤＭＳＯ／ＴＧなし）。第８に、該プレートを、該インキュベーターに戻し、２４時間培養した。第９に、液体ディスペンサー（Ｗｅｌｌ ＭａｔｅＴＭ ［Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ］）を用いて、２０μＬのＡＴＰｌｉｔｅ溶液をウェルごとに分注した。第１０に、プレートを、Ｃｒｉｔｅｒｉｏ−Ａｎａｌｙｓｔ（商標） ＨＴマイクロプレートレコーダーを用いて、３０分以内に読み込んだ。典型的に、シグナル：ノイズ比は、＞７：１であり、Ｚ’因子は、＞０．７であり、該アッセイ方法は、ＨＴＳに好適であることが示唆された。
【０１２４】
スクリーニングデータの質を評価するために、Ｚ’因子を、確立された式（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎ．４：６７−７３，１９９９）を用いて、それぞれのプレート、および全実験に対して算出し、すべてのプレートに対する最小対照（ＤＭＳＯのみ）および最大対照（サルブリナル）の結果を総計した。
【０１２５】
図７は、２０のプレートでのアッセイ品質対照解析のデータの一例を示し、ＤＭＳＯ対照のウェル（ｘ軸）およびサルブリナル対照のウェル（ｘ軸）に対して相対発光強度単位（ＲＬＵ）（ｙ軸）として測定されたＡＴＰｌｉｔｅの結果をプロットし、ＨＴＳアッセイの最小対照および最大対照を示す。すべてのウェルに、ＴＧを添加した。これらの２０のプレートに関して、平均シグナル：ノイズ比は、３１であり、Ｚ’因子は、０．７４であった。
【０１２６】
化学ライブラリをスクリーニングするための基本的方法は、以下のとおりであった。１日目に、不死化されたＣＳＭ１４．１細胞を、２％のＦＢＳおよび抗生物質で補完した４０μｌのＤＭＥＭ中で、白９６ウェルプレート中にウェルあたり３×１０３の細胞を播種し、次いで、一晩インキュベーションした。２日目に、自動リキッドハンドラーを用いて、５μｌの化合物をプレートに加えた（１％のＤＭＳＯ中最終１５ｍｇ／ｍｌ）。２時間後、細胞をタプシガルジンで処理した（最終１５ｍＭ）。２４時間後、発光アッセイを用いて、細胞質ＡＴＰレベルを測定した。細胞質ＡＴＰ活性は、未処理の対照細胞と比較した相対生存率として解釈された。スクリーニングの質を評価するために、それぞれのプレートのＺプライム（Ｚ’）因子が算出された。
【０１２７】
本アッセイを用いて、５０，０００の化合物（ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ）のインハウスライブラリをスクリーニングした。典型的なプレートに対する結果を図９ａに提供する。この図は、５０，０００の化合物（ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ）のインハウスライブラリの典型的なスクリーニングからの未加工データを示し、１つの有効なヒット化合物（太字）を示す。ＣＳＭ１４．１細胞を、ＤＭＳＯ（最終１％）（１２列）、またはタプシガルジン（１列Ｅ〜Ｈ行）と組み合わせたＤＭＳＯ、またはタプシガルジン（１列Ａ〜Ｄ行）と組み合わせた１００ｍＭのサルブリナルで処理した。８列Ｇ行でウェル中の化合物は、生存率９８．９％に相当する。未加工データの正規化は、１２列の（相対発光強度単位中の）ＡＴＰｌｉｔｅシグナルを平均化することにより達成され、１％のＤＭＳＯを与えられたがＴＧを与えられなかった細胞からの値を１００と設定した。他のすべての未加工データ値を、その後、この平均数（１２列で得た）で除し、１００を乗じた。図９ｂは、データの正規化後、典型的なアッセイプレートに対するスクリーニング結果の一例を示す。
【０１２８】
図１０は、データの正規化後のスクリーニング結果の一例を表示するグラフである。相対ＡＴＰ含有量（ｙ軸）は、ウェル番号（１−９６［Ａ１からＨ１２］）（ｘ軸）に対してプロットされる。ウェルＡ１からＤ１は、アッセイ最大対照（サルブリナル＋ＴＧを与えられた）であり、ウェルＥ１〜Ｈ１は、アッセイ最小対照（ＤＭＳＯ＋ＴＧを与えられた）であり、ウェルＡ１２〜Ｈ１２（１２列）は、正規化対照（ＴＧなしでＤＭＳＯを与えられた）である。ウェルＡ１２〜Ｈ１２の平均ＡＴＰ含有量を算出し、データの正規化に用いた。算出されたＺ’因子は、本プレートに対して０．８７であった（Ｚ’因子が０．５より大きく１．０未満である場合、アッセイは、非常に安定していると見なされる）。ヒット化合物は、ウェルＧ８（矢印）に認められる。ｚプライム因子を評価するために、ＤＭＳＯ対照試料の未加工値を「対照」として用い、タプシガルジンで処理された試料（１列Ｅ〜Ｈ行）の未加工値を、ｚプライム因子の等式において、「試料」として用いた。該Ｚ値が０．５を超え、１．０より下回る場合、アッセイが非常に安定していると見なす。
【０１２９】
５０，０００の化合物のスクリーニングから、９３の化合物が、＞５０％の生存率でＣＳＭ１４．１を守ったことを確認した（前記表１）。その後、これらの９３ヒットに対して同一の一次アッセイを用いて、用量反応実験を行い、適切な用量反応挙動を示す、＜２５μＭのＩＣ５０（５０％のＡＴＰ含有量を守るための有効量）を有する２６の化合物を同定した（表１２）。
【表１２】
【０１３０】
図１１は、弱活性（Ｃ）または部分阻害（Ｄ）のため、処分された２つの化合物と共に、２つのヒット化合物によりＥＲストレス誘導細胞死の用量依存的阻害を示す。未分化ＣＳＭ１４．１細胞は、タプシガルジン（１５μＭ）および様々な濃度の４種のヒット化合物（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）で処理された。データは、３つの独立した実験を代表する。
【０１３１】
図１２は、サルブリナルが、タプシガルジンにより誘導される細胞死を阻害するに際して、我々のヒット化合物よりも有効性が低いことを示す。ＣＳＭ１４．１細胞を、９６ウェルプレート中で、ウェルあたり３×１０３細胞の密度で播種し、一晩インキュベートした。指示された濃度のサルブリナルで該細胞を２時間プレインキュベートし、次いで、７．５ｍＭのタプシガルジンで処理した。１８時間後、細胞死率を、ＭＴＳアッセイにより測定した。ＭＴＳアッセイのために、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６（登録商標）Ａｑｕｅｏｕｓ Ｎｏｎ−ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた。製造業者のプロトコルにより反応溶液を作製し、９６ウェルプレートの処理されたそれぞれのウェルは、２０μｌの反応溶液でインキュベートされた。プレートは、３７℃で、５％ ＣＯ２を有する加湿細胞インキュベーターで２時間インキュベートし、それぞれのウェルの吸光度を、４９０ｎｍの波長で、ＥＬＩＳＡプレートリーダーにより読み込んだ。バックグラウンドの吸光度レベルを判定するために、同一体積の培地（細胞を含まないＤＭＥＭ）を、ＭＴＳ溶液でインキュベートした。バックグラウンド値は、それぞれのウェルの値から減じた。対照処理（ＴＧなし、Ｓａｌなし）ウェルからのバックグラウンド値を、１００％の生存として設定し、実験のウェル値を、対照値に対する割合として評価した。
【０１３２】
図１３は、我々のヒット化合物がツニカマイシンにより誘導される細胞死を阻害する効率をサルブリナルと比較する。ＣＳＭ１４．１細胞を、９６ウェルプレート中で３×１０３細胞／ウェルの密度で播種し、一晩インキュベートした。細胞を、２５μＭのそれぞれの化合物または１００μＭのサルブリナルで２時間プレインキュベートし、次いで、１０ｍｇ／ｍｌのツニカマイシンで処理した。７２時間後、細胞死率を、フローサイトメトリー解析により測定した。アネクシンＶ陰性集団は、生存者と見なされた。図１３において、白いバーは、０．５％のＤＭＳＯ対照を示し、２４％の生存率を示した。グレーのバーは、１００μＭのサルブリナルを示す。黒いバーは、それぞれの化合物（２５μＭ）からのデータである（化合物番号は、表１２中の化合物を指す）。１００μＭの濃度のサルブリナルは、ＴＧにより誘導される細胞死を７５％阻害し、我々のスクリーニングにより同定されたヒット化合物のいくつかは、３倍低い濃度で同等以上の阻害をした。
【０１３３】
表１２に示される２６の化合物のうち１６は、その後、ＴＧにより誘導される細胞死から分化ＣＳＭ１４．１細胞を保護することが確認された。これらのアッセイのために、ＣＳＭ１４．１細胞を、３９℃の非許容温度で、２％のＦＢＳ中で７日間培養することにより、分化させた。図１４は、未分化ＣＳＭ１４．１神経細胞対分化ＣＳＭ１４．１神経細胞を用いた、化合物の細胞保護活性の比較を示す。ＣＳＭ１４．１細胞を、９６ウェルプレート中にウェルあたり１，５００の細胞で播種し、３２℃（許容温度、図１４、左）または３９℃（非許容温度、図１４、右）で、７日間一晩培養した。様々なヒット化合物を、２５μＭの最終濃度で加え、次いで、２時間後、１５μＭの最終濃度でＴＧを加えた。ＡＴＰ含有量を測定し、データは、１％のＤＭＳＯ（平均＋標準偏差；ｎ＝３）でのみ処理された対照細胞に対する割合として表した。２パーセントのＦＢＳが、分化中用いられたが、すべてのアッセイは、１０％のＦＢＳ中で行われた。
【０１３４】
化合物が様々な系統の細胞を広く、または神経細胞のみを保護するかを調査するために、ＴＧにより誘導される細胞死からＣＳＭ１４．１（神経細胞）およびＪｕｒｋａｔ（リンパ細胞）細胞株を守る能力を、２６のヒットすべてで試験した。ＣＳＭ１４．１細胞およびＪｕｒｋａｔ細胞で試験された２６の化合物のうち、３つの化合物が、両方の細胞株に対する保護を示した。図１５は、ＣＳＭ１４．１細胞対Ｊｕｒｋａｔ細胞の細胞保護活性に対する２６の化合物のうちの３つを比較するデータの一例を示す。ＣＳＭ１４．１細胞（図１５、左）およびＪｕｒｋａｔ細胞（図１５、右）をそれぞれ、９６ウェルプレート中で、ウェルあたり３，０００の細胞またはウェルあたり３０，０００の細胞で、一晩培養した。ウェルには、ＤＭＳＯのみ、またはＤＭＳＯ中の２５μＭの化合物を与え、次いで、ＴＧ（１５μＭ）の有りまたは無しで処理した。２４時間培養した後、ＡＴＰ含有量を測定し、ＤＭＳＯ（平均＋標準偏差、ｎ＝３）でのみ処理された細胞に対する対照の割合としてのデータを表した。該データは、化合物のうちの１つは、ＴＧにより誘導される細胞死からＣＳＭ１４．１を保護するが、Ｊｕｒｋａｔ細胞は保護しないことを明らかにする（ＡＴＰｌｉｔｅアッセイにより測定された）。２６の化合物のうち３つのみが、３つの細胞系統をすべて保護したので、本明細書で利用されたアッセイは、活性における組織特異性の差異を有する化合物を同定する能力（考慮すべき利益および実用性の性質）を有し得る。あるいは、該化合物は、ＣＳＭ１４．１細胞が、ラット起源だが、ＨｅＬａ細胞およびＪｕｒｋａｔ細胞はヒト起源であるため、種特異性の差異を検出し得る。
【０１３５】
細胞の生存を評価するためのいくつかの代替的方法は、生物発光ＡＴＰアッセイの特性のため、ヒットが、本当に細胞保護であり、偽陽性を示さないことを確認するための二次アッセイとして利用され得る。例えば、ＴＧ誘導殺戮に対する保護を確認するために、ＡＴＰ含有量アッセイとは独立した方法により細胞の生存割合を評価すべく、我々が利用している１つの方法は、蛍光色素接合したアネクシンＶを用いたフローサイトメトリー解析である。
【０１３６】
図１６および１７は、化合物の細胞保護活性を評価するための二次アッセイの結果を示す。図１６では、未分化ＣＳＭ１４．１細胞を、２４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ Ｏｎｅ）でウェルあたり１０４細胞で培養した。翌日、ＤＭＳＯ（ａ、ｂ）（１％の最終容積）、１００μＭのサルブリナル（ｃ、ｄ）、あるいは２５μＭのヒット化合物（１％の最終ＤＭＳＯ）を加えた。２時間後、１５μＭのＴＧを、ａおよびｃを除く全てのウェルに加えた。従来のＡＴＰアッセイを行い、生存率を測定した。図１７では、未分化ＣＳＭ１４．１細胞を、２４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ Ｏｎｅ）でウェルあたり１０４細胞で培養した。翌日、ＤＭＳＯ（ａ、ｂ）（１％の最終容積）、１００μＭのサルブリナル（ｃ、ｄ）、あるいは２５μＭのヒット化合物（１％の最終ＤＭＳＯ）を加えた。２時間後、１５μＭのＴＧをａおよびｃを除く全てのウェルに加えた。該プレートを再度２４時間培養し、その後、細胞を、トリプシン処理により回収し、１．５ｍｌの微小遠心管に移し、０．２５μｇ／ｍＬのアネクシンＶ−ＦＩＴＣ（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ）およびヨウ化プロピジウムを含有する、０．５ｍＬのアネクシンＶ結合溶液中に再懸濁した。アネクシンＶ陰性細胞の割合は、ＦＡＣＳｏｒｔ装置（Ｂｅｃｋｔｏｎ–Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて、フローサイトメトリー（ｙ軸）により決定した。該化合物のうちの２つ（＃３および＃１４）は、活性が少なかったが、すべての２６の化合物は、アネクシンＶ染色で測定されたように、ＴＧにより誘導される細胞死を保護した。
【０１３７】
ＥＲストレスにより誘導される細胞死の抑制に対する化合物の選択性は、ＥＲストレス経路（タプシガルジン、ツニカマイシン）、またはミトコンドリア経路（ＶＰ１６）、または死受容体経路（ＴＮＦ＋シクロヘキシミド［ＣＨＸ］）を介してアポトーシスを誘導する様々な薬剤で未分化ＣＳＭ１４．１細胞を処理することにより、判定された。試験した２６のヒット化合物のうちの１９のヒット化合物が、タプシガルジンおよびツニカマイシンにより誘導される細胞死を減少させたが、ＶＰ１６またはＴＮＦ／ＣＨＸにより誘導される細胞死は減少させなかった。
【０１３８】
図１８は、表１３に記載された様々なヒット化合物の結果の例を示す。
【表１３】
【０１３９】
図１８に示された実験のために、未分化ＣＳＭ１４．１細胞を、９６ウェルプレート（ＡＴＰアッセイ用）中でウェルあたり３，０００の細胞、または２４ウェルプレート（フローサイトメトリー用）中でウェルあたり１×１０４細胞で播種した。翌日、細胞を、ＤＭＳＯ（０．５％）または０．５％ＤＭＳＯ（最終濃度）中の２５μＭのヒット化合物で２時間処理し、次いで、１５μＭのタプシガルジン（ＴＧ）で２４時間、１０μｇ／ｍＬのツニカマイシン（ＴＵ）で７２時間、２．５μＭのスタウロスポリン（ＳＴＳ）で２４時間、５０μＭのＶＰ１６で４８時間、あるいは３０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ＋１０μｇ／ｍＬのシクロヘキサミド（ＣＨＸ）で２４時間を含む、細胞死を誘導する様々な試薬で処理した。細胞内ＡＴＰ含有量は、スタウロスポリンの試料およびＴＮＦ／ＣＨＸ試料に対して測定し、ＤＭＳＯのみ（対照）で処置した細胞に対してデータを正規化し、対照に対する割合として示した。ツニカマイシンおよびＶＰ１６による処理に起因する細胞死を測定するために、フローサイトメトリーを用いた。すべてのアッセイを３回（平均±標準偏差）行った。
【０１４０】
化合物の経路選択性を確認した後、さらにダウンストリームアッセイを行い、該化合物により阻害される特定のシグナル伝達経路をマッピングすることができる。この件については、ＥＲストレスにより活性化されることで知られる３つの主要経路：（１）ＰＥＲＫ、（２）Ｉｒｅ１、および（３）ＡＴＦ６の状態を評価するために、様々な抗体試薬が商業的に利用可能である（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔ．，１１５：２６５６−２６６４，２００５）。免疫ブロット法の実験を行い、これらの経路におけるマーカータンパク質の発現またはリン酸化（リン酸化型特異的抗体を用いる）を評価することができる。例えば、図１９に示されるように、インハウスライブラリの一次スクリーニングからの我々のヒット化合物のいくつかは、Ｉｒｅ１経路のマーカーであるｃ−ＪＵＮおよびｐ３８ ＭＡＰＫのＴＧ誘導リン酸化を抑制することが認められた。図１９において試験された化合物は、上記表９に記載されたものである。ＣＳＭ１４．１細胞を、ＤＭＳＯまたは２５μＭのヒット化合物を用いて２時間培養し、次いで、タプシガルジン（１５μＭ）で処理した。細胞溶解物を調製し、リン酸化−ｃ−Ｊｕｎ、リン酸化−ｅＩＦ２α、リン酸化−ｐ３８ ＭＡＰＫ、およびチューブリン（ローディングコントロール）に対する特異的な抗体を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／免疫ブロット法により解析した。ＣＳＭ１４．１細胞を、ＤＭＳＯ、または１μＭ、５μＭ、および１０μＭの活性化合物のうちの１つで培養し、次いで、２時間後、１５μＭのＴＧを加えて培養した。２時間後、細胞溶解物を調製し、タンパク質含有量を基にロード量を基準化し、抗−ｐ３８−ＭＡＰＫ ｐａｎ−ｒｅａｃｔｉｖｅ抗体またはリン酸化型特異的抗体を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ／免疫ブロット法を用いてＥＣＬベースの検出により解析し、次いで、ｘ線フィルムをデンシトメトリー解析を行い、すべてのｐ３８ ＭＡＰＫに対してリン酸化ｐ３８ ＭＡＰＫを正規化するか、あるいは、ＭＳＤからのメソスケールの計器およびすべてのｐ３８ ＭＡＰＫをプレート上で捕捉する手順を用いて解析し、リン酸化タンパク質の相対量をリン酸化型特異的抗体（ＭＳＤカタログ番号Ｋ１５１１２Ｄ１）を用いて決定した。図１９に示されるデータは、これらのヒット化合物は、Ｉｒｅ１経路に作用することを示唆している。Ｉｒｅ１経路は、Ａｓｋ１キナーゼの活性化を引き起こし、そのキナーゼＡｓｋ１が次に、ＪＮＫおよびｐ３８ ＭＡＰＫを活性化することが知られている。ｐ３８ ＭＡＰＫおよびｃ−Ｊｕｎのリン酸化の抑制は、用量依存的であり、これらのタンパク質が全レベルにおいて減少することを説明できなかった。さらに、ＴＧで処理された細胞において、化合物によるｐ３８ ＭＡＰＫリン酸化の阻害が、２つの独立した方法：（１）リン酸化型特異的抗体を用いた免疫ブロット法、および（２）ＭＵＬＴＩ ＳＰＯＴマイクロプレートの電極表面で開始した電気化学的刺激で発光するＳＵＬＦｏ−ＴＡＧ（ＴＭ）標識を用いるＭＳＤからメソスケールの計器を利用するプレートベースの方法によって、実証された。サルブリナルとは異なり、我々の化合物は、ｅＩＦ−２αのリン酸化に影響を及ぼさず、ＰＥＲＫ経路内で作用しないことが示唆された。ＡＴＦ６のタンパク質分解過程はまた、我々のヒット化合物により阻害されなかった。したがって、５０，０００の化合物のインハウスライブラリから得られたヒットのうちのすべてが、Ｉｒｅ１経路上にマッピングされ、ＪＮＫおよびｐ３８ＭＡＰＫの活性化を抑制することが認められた。他のライブラリ（ＮＩＨ化合物コレクション等）のスクリーニングは、異なる機構を有する細胞保護化合物を産出し得る。
【０１４１】
一次ＨＴＳアッセイプロトコル。我々の一次ＨＴＳアッセイプロトコルは、以下のとおりである。
【０１４２】
１）未分化ＣＳＭ１４．１細胞を、約３×１０６細胞／ディッシュを生成するために、１５０ｍｍ×２５ｍｍのポリスチレン培養ディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ）中で、１０％のＦＢＳ、１％のペニシリン／ストレプトマイシン（作用濃度：１００Ｉ．Ｕ．ペニシリン／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２５０ｎｇ／ｍｌのアンフォテリシン（Ｍｅｄｉａ Ｔｅｃｈ））、１％のＬ−グルタミン、で補完したＤＭＥＭ中に、３２℃で維持する。
【０１４３】
２）ＣＳＭ１４．１細胞を、８０〜９０％のコンフルエンスのとき、トリプシン処理によって培地から回収し、４００ｘｇで遠心分離し、ステップ１にあるように２％のＦＢＳを含有し、同一濃度の抗生物質を含有するＤＭＥＭ培地内に、７．５×１０º細胞／ｍＬの密度で懸濁する。
【０１４４】
３）該細胞懸濁液を、その後、９６ウェルプラスチックマイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ Ｏｎｅ、ポリスチレン、白壁、平底、ｌｕｍｉｔｒａｃ、高結合）にウェルあたり４０μＬで与え、Ｗｅｌｌ Ｍａｔｅ液体ディスペンサー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、該プレートを、９５％大気：５％ＣＯ２中で、湿気環境下、３２℃で一晩培養する。
【０１４５】
４）ライブラリ化合物を、１０％のＤＭＳＯ＋９０％の滅菌された蒸留水中で、約１５０μｇ／ｍＬで調製する。
【０１４６】
５）自動リキッドハンドラー（Ｂｉｏｍｅｋ（商標） ＦＸリキッドハンドラー、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて、１０％のＤＭＳＯ中の５μＬの試験化合物を、９６ウェルプレートの２〜１１列（１列および１２列はそのまま）のウェルに加え、この時点でほぼ最終濃度１５μｇ／ｍＬの試験化合物、および１．１％のＤＭＳＯの最終濃度を達成する。
【０１４７】
６）それぞれのプレートの１列／Ａ〜Ｄ行のウェルに、１０％ＤＭＳＯ＋９０％ＤＭＥＭの溶液中で５μＬの１ｍＭサルブリナル（ＤＭＳＯ中の１００ｍＭのサルブリナルをＤＭＳＯで１０倍希釈することにより調製した後、ＤＭＳＯ中の１０ｍＭのサルブリナルを同一のＤＭＥＭで１０倍希釈する）を加える。
【０１４８】
７）１列／Ｅ〜Ｈ行および１２列／Ａ〜Ｈ行のウェルに、５μＬの１０％ＤＭＳＯ＋９０％ＤＭＥＭ溶液を加える。
【０１４９】
８）プレートを再び２時間培養する。
【０１５０】
９）ＤＭＥＭ内のＴＧ原液（調製：５μｌのＴＧ溶液は、２０ｍＭのＴＧ ０．０３７５μｌ＋２％のＦＢＳおよび前記と同一濃度の抗生物質を含むＤＭＥＭ ４．９６２５μｌからなる）を、ウェルあたり５μＬで１〜１１列に分注し、最終濃度約１５μＭのＴＧを達成する。データ比較の対照として、１２列を残す（ＤＭＳＯのみ／ＴＧなし）。「Ｗｅｌｌ Ｍａｔｅ」液体ディスペンサー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いる。
【０１５１】
１０）１２列に、０．０３７５μＬのＤＭＳＯを含む５μＬのＤＭＥＭ（２％のＦＢＳおよび前記と同一濃度の抗生物質を含む）を加える。
【０１５２】
１１）該プレートをインキュベーターに戻して、２４時間培養する。
【０１５３】
１２）使用する約３０分前に、ＡＴＰアッセイ粉末を、製造業者のプロトコル［Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ］に従って、アッセイ緩衝液（製造業者により供給される）に溶解させる。
【０１５４】
１３）ウェルあたり２０μＬのＡＴＰｌｉｔｅ溶液を、例えば、「Ｗｅｌｌ Ｍａｔｅ」ディスペンサー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、分注する。
【０１５５】
１４）３０分以内に、発光を測定する。発光モードにおいて、Ｃｒｉｔｅｒｉｏ解析ソフトウェアと共に、Ａｎａｌｙｓｔ（商標） ＨＴ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いた。
【０１５６】
１５）プレートリーダーから記録された相対発光強度単位（ＲＬＵ）を、ＥＸＣＥＬファイルに取り込む。それぞれのウェルの未加工値を、１２列のすべてのウェルからの未加工値の平均（最大制御ＤＭＳＯのみ／ＴＧなし）で除し、１００を乗じ、対照に対する割合として示す。
【０１５７】
細胞（ステップ３）、ＴＨＳ（ステップ９）、またはＡＴＰｌｉｔｅ溶液（ステップ１３）の液体分注のために、小型ノズル管（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた。使用前に、管を、７０％のエタノールで滅菌し、滅菌された器具洗浄機で集中的に洗浄した。
【０１５８】
二次アッセイ 分化ＣＳＭ１４．１細胞および他の指標細胞、さらには細胞生存の指標としてＡＴＰ含有量を用いて、化合物が、広範囲の細胞保護活性対狭い範囲の細胞保護活性を示すことを確認する。また、ＥＲストレス経路、またはミトコンドリア経路、または死受容体経路を活性化することで知られる薬剤により細胞死を誘導し、選択される経路の解析を行う。この解析には、最終的にはＡＴＰ含有量を用いて行い、これによって、どのヒット化合物がＥＲ経路に対して選択的であるかを判定する。また、上記に示すようなアネクシンＶ染色等の代替アッセイまたはＭＴＴまたはＸＴＴ等の比色ミトコンドリア依存性染色還元試薬を用いて、ＥＣ５０＜２５μＭを有し適切な用量反応の相関を示すヒットのために、細胞生存アッセイを行う。代替として、または、追加として、異なる細胞生存アッセイを用いてもよい。最終的に、抗体ベースの方法を用いて、ｃ−Ｊｕｎ、ｐ３８ＭＡＰＫ、およびｅＩＦ２αのリン酸化を測定し、また（化合物の作用機構を問いただすための初期マーカーである）ＡＴＦ６のタンパク質分解を測定して、ＥＲストレスにより活性化されることが知られる特定の経路に化合物をマッピングする。当該二次アッセイプロトコルは、以下のとおりである。
【０１５９】
（ａ）アネクシン−Ｖ染色 生存アッセイ：
１）未分化ＣＳＭ１４．１細胞を、上記のように、２％のＦＢＳおよび抗生物質を含有する４００μＬのＤＭＥＭを用いて、２４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ ｏｎｅ）のウェルあたり１０４の細胞で、培養した。
【０１６０】
２）翌日、ＤＭＳＯ（ａ、ｂ）（１％の最終容積）、あるいは１００μＭのサルブリナル（ｃ、ｄ）、あるいは２５μＭのヒット化合物（１％の最終ＤＭＳＯ）を加えた。つまり、５μＬのＤＭＳＯを含有する５０μＬのＤＭＥＭ、およびＤＭＳＯに１０ｍＭのサルブリナル（または２．５ｍＭの化合物）を５μＬ含有する５０μＬのＤＭＥＭを、指示されたウェルに加えた。
【０１６１】
３）２時間後、１５μＭのＴＧを、ａおよびｃを除くすべてのウェルに加え、ＤＭＳＯ内に０．３７５μＬの２０ｍＭ ＴＧを含有する５０μＬのＤＭＥＭを加えた。
【０１６２】
４）該プレートを再度２４時間培養した。
【０１６３】
５）２４時間後、ウェル中のすべての細胞を、培地移送およびトリプシン処理により回収した。すべての回収した細胞は、ＤＭＥＭ−トリプシン溶液と共に、１．５ｍＬの微小管中で、６，０００ｒｐｍで、２分間遠心分離した。
【０１６４】
６）液体の吸引後、細胞を、低温ＰＢＳで滑らかに洗浄した。６，０００ｒｐｍで遠心分離した後、細胞は、０．２５ｍｇ／ｍＬのアネクシンＶ ＦＩＴＣ（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ １００１−１０００）およびヨウ化プロピジウム（５０μｇ／ｍＬ）を含有する、５００μＬの１×アネクシンＶ結合緩衝液（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ １０３５−１００）中に再懸濁した。
【０１６５】
７）アネクシンＶ陰性細胞の割合は、ＢｕｒｎｈａｍのＦＡＣＳｏｒｔ（Ｂｅｃｋｔｏｎ ＆ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）解析施設を用いて、フローサイトメトリー（ｙ軸）により決定した。
【０１６６】
（ｂ）免疫ブロット法：
１）ＣＳＭ１４．１細胞を、２％のＦＢＳおよび抗生物質を含有するＤＭＥＭ内で、６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ ｏｎｅ）に２×１０５細胞／ウェルの密度で、播種した。
【０１６７】
２）一晩インキュベーションした後、細胞を、ＤＭＳＯ（０．５％）または化合物（２５μＭ）で２時間処理し、次いで、ＴＧ（１５μＭ）で処理した。
【０１６８】
３）２時間後、細胞を、２５０μＬの溶解緩衝液中に溶解し、タンパク質濃度決定、およびリン酸化ｐ３８ ＭＡＰＫ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ９２１１）、ｐ３８ ＭＡＰＫ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ−Ｃ２０）、リン酸化ｃ−Ｊｕｎ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ９１６４）、ｃ−Ｊｕｎ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ−ＳＣ１６９４）、リン酸化ｅＩＦ２α（細胞Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ３５９７）、およびα−チューブリンに特異的な抗体を用いて、ＳＤＳ ＰＡＧＥ／ウエスタンブロット法に供した。
【０１６９】
（ｃ）ＭＳＤ電気化学的アッセイ：
細胞を溶解緩衝液（ＭＳＤ Ｃｏｍｐａｎｙ）中に溶解することを除いて、免疫ブロット法に利用される同一のスキームを用いた。細胞溶解物のうちの半分をウエスタンブロット法／デンシトメトリー解析のために用い、半分をＭＳＤプレートベースのアッセイのために用いた。ＭＳＤアッセイは、製造業者のプロトコルを用いて行った。
【０１７０】
１）細胞を、提供された溶解緩衝液を用いて溶解した。細胞抽出物を、提供された希釈緩衝液で希釈し、１２０μＬの希釈緩衝液に対して６μｇを定量化した。
【０１７１】
２）ｐ３８／ｐ−ｐ３８の二重プレート（ＭＳＤ ｃｏｍｐａｎｙ−Ｃａｔ ＃Ｋ１５１１２Ｄ−１）は、供給されたブロッキング緩衝液により１時間ブロッキングした。
【０１７２】
３）１２０μＬの細胞抽出物を、それぞれのウェルに加え、振とうしながら室温で一晩インキュベートした。
【０１７３】
４）インキュベーション後、ウェルをＴｒｉｓ洗浄緩衝液（提供された）で４回洗浄し、検出抗体溶液（提供された）で１時間インキュベートし、洗浄緩衝液で再度４回洗浄した。
【０１７４】
５）最終的に、それぞれのウェルに、１５０μＬの読み込み緩衝液（提供された）を加え、発光値を、ＭＳＤ Ｓｅｃｔｏｒ（商標）装置により読み取った。
【０１７５】
６）該装置は、ｐ３８およびリン酸化−ｐ３８（ｐ−ｐ３８）の発光値を示した。ｐ−ｐ３８の値は、それぞれのウェル中で、ｐ−３８の値で除した。対照（ＤＭＳＯ処理、タプシガルジン処理なし）ウェルのｐ−ｐ３８／ｐ３８値は、対照を１として設定し、他のウェルは、対照の倍数として算出した。最終的に、ＤＭＳＯ対照におけるｐ−ｐ３８のバックグラウンド発現レベルがないため、各値−１を本図において報告した。該グラフは、それぞれの試料の「ｐ−ｐ３８／ｐ３８」の比に基づいて作製した。
【０１７６】
ＳＡＲ解析 どのヒット化合物が、ＥＲストレスにより誘導される死を選択的に遮断することを立証すること、およびＥＲストレスにより引き起こされる３つの既知の経路（または３つの既知の経路のいずれも抑制されない場合、同定されていない経路）のうちの１つを事前にマッピングすることに加えて、該化合物の効力および選択性を「探索」状態に進めることを目標とし、ＳＡＲ解析を選択されたヒットに対して行う。
【実施例２】
【０１７７】
Ｃｈｅｍｂｒｉｄｇｅ化合物ＩＤ番号５９６２１２３の化学名および商業的な入手可能性 化合物５９６２１２３の化学名は、６−（４−ジエチルアミノフェニル）−９−フェニル−５，６，８，９，１０，１１−ヘキサヒドロベンゾ［ｃ］［１，５］ベンゾジアゼピン−７−オンである。化合物５９６２１２３は、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅから入手可能である。推奨される負の対照化合物（ネガティブコントロール）は、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ ６０７５８４１または６０４８１６３を含む。これらのベンゾジアゼピンは、一次スクリーニングに用いられた細胞死アッセイに不活性であり、タプシガルジンにより誘導されるＪｕｎのリン酸化を抑制することができない。
【０１７８】
生物学的活性の説明 化合物５９６２１２３は、未分化および分化両方のラット神経細胞株ＣＳＭ１４．１に対して、タプシガルジン（ＥＲストレスの誘起剤）による誘導死を阻害する。また、化合物５９６２１２３は、２つの異なる細胞生存の指標：（ａ）ＡＴＰ含有量アッセイ、および（ｂ）アネクシンＶ染色によるフローサイトメトリーベースのアッセイでは、約１０μＭのＩＣ５０を有する。化合物５９６２１２３はまた、ツニカマイシン（ＥＲストレスの別の阻害剤）により誘導されるＣＳＭ１４．１の細胞死を阻害するが、死受容体（外因性）細胞死経路のアゴニストであるＴＮＦ−α（＋シクロヘキシミド）により、または、ＶＰ−１６あるいはスタウロスポリン（ミトコンドリア細胞死経路のアゴニスト）により誘導されるＣＳＭ１４．１の細胞死は阻害しない。これは、化合物５９６２１２３が、ＥＲストレス誘導細胞死の選択的阻害剤（すなわち経路特異的）であることを示唆する。
【０１７９】
ＣＳＭ１４．１細胞に加えて、２５μＭで試験した場合、化合物５９６２１２３は、ＡＴＰ含有量アッセイで判定されたように、いくつかの腫瘍細胞株（ＨｅＬａヒト子宮頸癌、ＳＷ１メラノーマ細胞、ＰＰＣ１、ヒト前立腺癌）、マウス神経幹細胞Ｃ１７．２（分化［神経表現型］および未分化［幹細胞表現型］の両方）で、タプシガルジンにより誘導される死を、＞５０％で保護した。また、化合物５９６２１２３は、正常あるいはアポトーシスの核形態（ヘキスト染色）を伴うＮｅｕＮ−免疫陽性細胞の割合を測定する顕微鏡アッセイにより判定されたように、一次ラット皮質ニューロンで、タプシガルジンにより誘導される死を、＞５０％で保護した。しかしながら、化合物５９６２１２３は、２５μＭで、ＡＴＰ含有量アッセイで判定されたように、タプシガルジンにより誘導される細胞死から、ＪｕｒｋａｔヒトＴ−白血病細胞、または未分化あるいは分化（神経表現型）ＰＣ１２ラットクロム親和性細胞腫を保護しなかった。実際に、化合物５９６２１２３で、タプシガルジンで処理された未分化ＰＣ１２細胞を試験した際、奇異だが、細胞死を促進する活性を示した。
【０１８０】
概して、いくつかの細胞型選択性を示すが、化合物５９６２１２３は、その細胞保護活性において合理的に広範囲であり、試験した８つの細胞株または細胞型（初代神経細胞）のうち６つを保護した。
【０１８１】
タプシガルジンにより誘起されたＣＳＭ１４．１細胞の試験では、１０μＭの化合物５９６２１２３が、ＵＰＲ信号伝達経路を阻害した。その結果、ｃ−Ｊｕｎの基質であるＪＮＫ（リン酸化型特異的抗体を用いた免疫ブロット法により測定された）のリン酸化、およびｐ３８ＭＡＰＫのリン酸化（リン酸化型特異的抗体を用いた免疫ブロット法および定量的ＥＬＩＳＡベースのアッセイ（ＭＳＤアッセイ）により判定された）がもたらされた。しかしながら、ＰＥＲＫ媒介によるｅＩＦ２αのリン酸化（リン酸化型特的抗体を用いた免疫ブロット法により測定された）、またはタプシガルジンにより誘導されるＡＴＦ４の発現（免疫ブロット法により測定された）、またはＡＴＦ６の切断（切断型を検出するために免疫ブロット法によりアッセイされた）、またはＸＢＰ１ ｍＲＮＡのスプライシング（未スプライスｍＲＮＡ：スプライスされたｍＲＮＡの比率を測定するためにＲＴ−ＰＣＲにより検査された）、またはＩｒｅ１自己リン酸化（ｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイにより測定された）、またはＡＳＫ１自己リン酸化（ｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイにより測定される）、またはタプシガルジンにより誘導される細胞中のＡＳＫ１の活性化（ＭＫＫ６およびｐ３８ＭＡＰＫを含み、化合物処理された細胞から免疫沈降により回収したＡＳＫ１が加えられた、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合キナーゼアッセイを用いて測定された）、またはタプシガルジンにより誘導されるＣＨＯＰの発現を含む、ＵＰＲ経路を、化合物５９６２１２３が、阻害しないことを示した。
【０１８２】
化合物５９６２１２３は、５０μＭで、ＡＳＫ１の９６７部位のセリンにおいて、タプシガルジンにより誘起される脱リン酸化を阻害した。これは、リン酸化型特異的抗体を用いた免疫ブロット法によって、ＡＳＫ１でトランスフェクションされ、タプシガルジンにより刺激されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞で測定された。また、化合物５９６２１２３は、ＡＳＫ１に結合する１４−３−３タンパク質を増加させた。これは、タプシガルジンで誘起され、上記と同様にトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いて、免疫共沈降アッセイにより判定された。したがって、これらの事象から、ＡＳＫ１キナーゼ活性を直接阻害しないが、生体内でＡＳＫ１のキナーゼ活性を減少させることが予測される。化合物５９６２１２３は、９６７部位のセリンのリン酸化を制御するタンパク質ホスファターゼを阻害することが可能である。
【０１８３】
二次スクリーニングの説明 化合物５９６２１２３の性質を明らかにするために用いられた二次スクリーニング（それらの多くを用いて、すべての１１のベンゾジアゼピンの性質を明らかにした）は、上述した。これまで３１の二次スクリーニングを用いて、化合物５９６２１２３の性質を明らかにした。該化合物は、ＡＴＰ含有量により測定されたように、タプシガルジンにより誘導される未分化ＣＳＭ１４．１細胞の細胞死の阻害剤として、およびツニカマイシンにより誘導される未分化ＣＳＭ１４．１細胞の細胞死の阻害剤として、約１０μＭのＩＣ５０で活性である。ＥＲストレス誘導細胞死に対する化合物の活性は、タプシガルジンあるいはツニカマイシンで処理されたＣＳＭ１４．１細胞をアネクシンＶで染色して、フローサイトメトリーで測定、分析することにより、確認された。ＡＴＰ含有量アッセイにより未分化ＣＳＭ１４．１細胞に対して２５μＭで試験した場合、２５μＭの化合物５９６２１２３は、ＴＮＦα＋シクロヘキシミド、ＶＰ−１６、およびスタウロスポリンにより誘導される細胞死に対して活性ではなかった。神経細胞に対する化合物５９６２１２３の活性は、１０μＭのタプシガルジンで処理された分化ラット神経ＣＳＭ１４．１細胞を用いて、さらにはタプシガルジンで処理された分化神経Ｃ１７．２細胞を用いて、ＡＴＰ含有量アッセイを用いて、２５μＭで確認された。しかしながら、ＡＴＰ含有量アッセイによって、タプシガルジンで処理された分化ラットクロム親和性細胞腫ＰＣ１２細胞では、化合物５９６２１２３の活性は確認されなかった。該化合物は、タプシガルジンで処理された未分化ＰＣ１２細胞に対して、奇異だが細胞死を促進する活性を示した。最後に、化合物２８７８７４６は、ラット初代皮質神経細胞でタプシガルジンにより誘導される細胞死を阻害する（ＮｅｕＮを用いて染色することにより同定された）。これは、アポトーシスおよび神経突起退縮の証拠を示す、凝縮された核形態で細胞を同定するために、ＤＮＡ結合蛍光色素であるヘキスト染料を用いて染色されたアポトーシス神経フィラメント（ＮｅｕＮ）陽性細胞を数えることにより判定された。
【０１８４】
化合物５９６２１２３の細胞保護活性はまた、ＡＴＰ含有量アッセイを用い、タプシガルジンで処理された非神経ヒト腫瘍細胞株のいくつかの細胞種（子宮頚癌ＨｅＬａ細胞、ヒト前立腺癌ＰＰＣ−１細胞、およびヒトメラノーマＳＷ１細胞を含む）によって、実証された。しかしながら、該化合物は、ＡＴＰ含有量アッセイにより判定されたように、タプシガルジン処理されたＪｕｒｋａｔＴ白血病細胞に対して不活性であった。
【０１８５】
機構に関して、ＣＳＭ１４．１細胞中において、リン酸化型特異的抗体（リン酸化−ｃ−Ｊｕｎ Ｓｅｒ ６３、リン酸化ｐ３８ＭＡＰＫ Ｔｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２）を用いた免疫ブロット法により判定されたように、該化合物は、タプシガルジンにより誘導されるｃ−Ｊｕｎおよびｐ３８ＭＡＰＫのリン酸化を阻害する。タプシガルジンにより誘導されるｐ３８ＭＡＰＫのリン酸化の抑制はまた、定量的ＥＬＩＳＡ法により測定され、ｐ３８ＭＡＰＫリン酸化に対してＩＣ５０が＜５μＭであると推定された。その一方、タプシガルジンにより誘導される、ＣＨＯＰの発現、またはＡＴＦ４の発現、またはＡＴＦ６の切断、またはｅＩＦ２ａ（Ｓｅｒ５１）のリン酸化、またはＩｒｅ１ａの自己リン酸化、またはＡＳＫ１の自己リン酸化は、ｐ３２−γ−ＡＴＰ基質を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイにより試験したところ、５０μＭの濃度でも、ＣＩＤ−２８７８７４６によって直接阻害されなかった。化合物５９６２１２３はまた、ＡＳＫ１の細胞内活性化を阻害することができなかった。これは、結合アッセイに加える前に、ＡＳＫ１プラスミドでトランスフェクションし、１００μＭの化合物＋１５μｇ／ｍＬのタプシガルジンでインキュベートしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞から得られ、免疫沈降されたＡＳＫ１と共に、精製されたＭＡＰＫＫ６（ＭＫＫ６／ＳＫＫ３）および精製されたｐ３８ ＭＡＰＫを含むｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイの組み合わせにより判定された。ＡＳＫ１でトランスフェクションされた２９３Ｔ細胞では、ＡＳＫ１のセリン９６７部位で、タプシガルジンにより誘導されるリン酸化の減少は、５０〜１００μＭの濃度で、化合物５９６２１２３によって阻害された。これは、抗リン酸化型特異的（ｓｅｒ９６７）抗体を用いた免疫ブロット法により判定された。しかしながら、タプシガルジンにより誘導される、ＡＳＫ１の８３部位のセリンおよび８４５部位のトレオニンのリン酸化は、ＡＳＫ１でトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞では、１００μＭの濃度でも、化合物５９６２１２３により調節されなかった。化合物５９６２１２３はまた、１００μＭの濃度で、ＡＳＫ１の１４−３−３タンパク質への結合を増加させる。これは、タプシガルジンにより刺激され、ＡＳＫ１でトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いて、免疫共沈降アッセイに判定された。化合物５９６２１２３は、１００μＭの濃度で、タンパク質ホスファターゼ２Ｂ（カルシニューリン）の活性に影響を及ぼさなかった。これは、基質として免疫沈降されたＡＳＫ１（９６７部位のセリン）を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏホスファターゼアッセイにより試験された。
【０１８６】
化合物５９６２１２３と同一性をもたらすする化学戦略。化合物５９６２１２３のＳＡＲ解析を行った。これによって、１１の活性ベンゾジアゼピンヒットを明らかにした一次スクリーニングデータに内在的なＳＡＲに加えて、４１の類似体（アナログ）のデータを分析することにより、３つの機能・官能基に傾注した。化合物の活性を比較するために用いられたアッセイは、一次ＨＴＳアッセイと同一であり、未分化ＣＳＭ１４．１細胞をタプシガルジンでチャレンジし、細胞の生存を、ＡＴＰ含有量アッセイを用いて評価した。類似体の効力データを、表１４（Ｒ群Ｒ１〜Ｒ７は、式Ｉの構造に対して置換基である）に示し、これらのデータから化合物５９６２１２３を、効力および細胞内活性プロフィールに基づいて選択した。
【表１４−１】
【表１４−２】
【０１８７】
化合物５９６２１２３を製造するための合成経路。化合物５９６２１２３は、再合成された（図２０）。解析データおよび生物学的活性は、購入した化合物と同一であり、従って、その構造および効力を確認した。解析データは、購入した試料および合成した試料の両方において、４つの可能な立体異性体の存在を示す。さらに、別の化合物、ＭＬＳ−０２９２１２６は、同一経路を介して合成され、１６．５μＭのＩＣ５０を示した。
【０１８８】
明らかにされた性質 化合物５９６２１２３の性質の要約を、下記表１５に提供する。
【表１５】
【０１８９】
上記表１５において、＋は、≦２５μＭの化合物濃度で、タプシガルジンにさらされない未処理細胞と比較した細胞の生存率が、＞５０％であることを示す。ＡＴＰは、細胞のＡＴＰ含有量を測定するＡＴＰｌｉｔｅアッセイ。アネクシンＶ染色は、フローサイトメトリーで判定されるように、ＦＩＴＣ−アネクシンＶ陽性細胞の割合を測定するステップを含む。
【表１６】
【０１９０】
上記表１６において、＋は、≦２５μＭの化合物濃度で、タプシガルジンにさらされない未処理細胞と比較した細胞の生存率が、＞５０％であることを示す。タプシガルジン濃度は、Ｃ１７．２細胞に対して１０μＭであり、他のすべてに対して１５μＭであった。Ｅは、タプシガルジン誘導死を増強した化合物を示す。分化：ＰＣ１２に関しては、細胞を、２０ｎｇ／ｍｌのＮＧＦで、５日間刺激した。Ｃ１７．２に関しては、細胞を、血清減少によって刺激し、１％ Ｎ２インキュベーションを３日間行った。ＣＳＭ１４．１に関しては、細胞を、３９℃で５〜７日間培養した。
【０１９１】
化合物２８７８７４６の性質 ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中の化合物５９６２１２３の溶解性は、２５ｍＭの濃度で優れている。培養培地に化合物を加えるために、少なくとも０．２％（ｖ／ｖ）最終ＤＭＳＯ濃度が、目に見えるような濁った沈殿物を生成することを避けるために、必要であった。２５ｍＭを超える濃度で、ＤＭＳＯ中の化合物は、黄色を示す。負の対照化合物６０４８１６３および６０７５８４１は、ＤＭＳＯ中で６２３９５０７と類似の溶解性を示す。２５ｍＭの濃度で、化合物６０４８１６３は、淡黄色を示したが、化合物６０７５８４１は、無色であった。
【実施例３】
【０１９２】
第２−１群および第２−２群の様々な化合物の効力データを、上記に記載したように得、表１７および１８に、それぞれ提供する（Ｒ群は、式ＩＩおよびＩＩＩの構造に対する置換基である）。
【表１７】
【表１８】
【０１９３】
化合物５９４８３６５のＩＣ５０が、１９．５４±０．１７６９であると測定されたことに留意されたい。
【実施例４】
【０１９４】
ＣＳＭ１４．１細胞を、ＤＭＳＯまたは２５μＭのヒット化合物とともに２時間培養し、次いで、タプシガルジン（１５μＭ）で処理した。細胞溶解物を調製し、ｃ−Ｊｕｎ、リン酸化−ｃ−Ｊｕｎ（ｓｅｒ７３）、ｅＩＦ２α、リン酸化−ｅＩＦ２α（ｓｅｒ５１）、ｐ３８ＭＡＰＫ、リン酸化−ｐ３８ＭＡＰＫ（Ｔｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２）、ＡＴＦ−６、ＣＨＯＰ、およびチューブリン（ローディングコントロール）に対して特異的な抗体を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／免疫ブロット法により解析した。Ｃ−Ｊｕｎおよびｐ３８ ＭＡＰＫのＥＲストレスにより誘導される活性化は、１１のヒット化合物により抑制された。
【０１９５】
Ｃ−Ｊｕｎおよびｐ３８ＭＡＰＫは、Ｉｒｅ１経路の下流（ダウンストリーム、図２１参照）で機能するので、我々のヒット化合物のうちの１つ（６２３９５０７）が、このＩｒｅ１−ＡＳＫ１−ＪＮＫ／ｐ３８ ＭＡＰＫ経路における、すべてのキナーゼの自己リン酸化を阻害するかどうか試験した。図２２は、化合物６２３９５０７を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイの結果を示す。Ｉｒｅ１自己リン酸化アッセイを行った。免疫沈降されたＩｒｅ１を、ＤＭＳＯ（２％）、または５０μＭの化合物６２３９５０７、または陽性対照（ポジティブコントロール）であるスタウロスポリン（２０μＭ、ＳＴＳ）で、３０℃で２０分間インキュベートし、次いで、氷上で冷却した。０．５μＣｉの３２Ｐ−γ−ＡＴＰを、それぞれの管に加え、３０℃で指示された時間インキュベートした。キナーゼ反応は、試料緩衝液を加えることにより完了した。３２Ｐ−γ−ＡＴＰの取り込み値を、シンチレーションカウンターにより評価した。また、ＡＳＫ１−ＭＫＫ６−ｐ３８結合アッセイを行った。免疫沈降されたＡＳＫ１を、１μｇのＭＫＫ６（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）および１μｇのｐ３８ ＭＡＰＫ（Ｓｉｇｍａ）と混合した。キナーゼを、管内で、２％のＤＭＳＯ、または５０μＭの化合物６２３９５０７、または２０μＭのスタウロスポリン（ＳＴＳ）で、３０℃で２０分間インキュベートし、次いで、氷上で冷却した。０．５μＣｉの３２Ｐ−γ−ＡＴＰを、それぞれの管に加え、３０℃で指示された時間インキュベートした。キナーゼ反応は、試料緩衝液を加えることにより完了した。３２Ｐ−γ−ＡＴＰの取り込み値を、シンチレーションカウンターにより評価した。精製されたＪｎｋ−１およびＪｎｋ−２（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によるＣ−Ｊｕｎの活性化は、同一の手順で確認した。該結果は、ヒット化合物６２３９５０７が、Ｉｒｅ１の自己リン酸化活性、または下流のキナーゼＭＫＫ６およびｐ３８ ＭＡＰＫに関するＡｓｋ１の活性、またはｃ−Ｊｕｎに対するＪＮＫの活性を調節しないことを示す。
【０１９６】
また、化合物６２３９５０７が、ＥＲストレス誘導（すなわちタプシガルジン処理）の前後に、９６７部位のセリンで、ＡＳＫ１のリン酸化を増強するかどうかを判定するために、諸実験を実施した。２９３Ｔ細胞を、ｐｃＤＮＡ−ＡＳＫ１−ＨＡでトランスフェクションした。１日後、細胞を、ＤＭＳＯ（０．４％）または１００μＭの化合物６２３９５０７（＃１）で、２時間インキュベートした。その後、細胞を、指示された時間、タプシガルジン（２０μＭ）で処理した。細胞抽出物を、溶解緩衝液によって調製し、抗リン酸化ＡＳＫ１ Ｓｅｒ９６７抗体または抗ＨＡ抗体を用いた免疫ブロット法に供した。リン酸化ｓｅｒ９６７バンドの相対密度は、イメージＪソフトウェアにより算出した（平均±標準偏差）。化合物６２３９５０７は、ＥＲストレス誘導の前後に、９６７部位のセリンでＡＳＫ１のリン酸化を増強することが認められた。
【０１９７】
ＡＳＫ１の９６７部位のセリンは、１４−３−３タンパク質の結合を介して、リン酸化によりＡＳＫ１活性を下方制御することが知られている（Ｇｏｌｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：１０４４２−１０４４９，２００４）。我々のヒット化合物が、セリン９６７部位のみまたは別のリン酸化部位のリン酸化を増強するかどうか、試験した。２９３Ｔ細胞を、ｐｃＤＮＡ−ＡＳＫ１−ＨＡでトランスフェクションした。１日後、細胞を、ＤＭＳＯ（０．４％）または１００μＭの化合物６２３９５０７（＃１）で、２時間インキュベートした。細胞抽出物を、溶解緩衝液を用いて調製し、上述した抗リン酸化ＡＳＫ１抗体または抗ＨＡ抗体を用いて免疫ブロット法に供した。それぞれのリン酸化ＡＳＫバンドの相対密度は、イメージＪソフトウェアにより算出した。該化合物を、タプシガルジンにより誘導された細胞死に対する活性において比較した。２９３Ｔ細胞を、ｐｃＤＮＡ−ＡＳＫ１−ＨＡおよびｐＥＢＧ−ＧＳＴ−１４−３−３でトランスフェクションした。１日後、細胞を、ＤＭＳＯ（０．４％）または１００μＭの指示された化合物で２時間インキュベートした。その後、細胞を、指示された時間、タプシガルジン（２０μＭ）で処理した。細胞抽出物を、溶解緩衝液を用いて調製し、１４−３−３タンパク質を、グルタチオンＳトランスフェラーゼ４Ｂセファロースビーズで免疫沈降した。１４−３−３タンパク質に結合したＡＳＫ１タンパク質は、抗ＨＡ抗体を用いた免疫ブロット法により可視化した。抗リン酸化ＡＳＫ１（ｓｅｒ９６７）抗体を用いて、それぞれの時点でＡＳＫ１のリン酸化を検出した。図２３に示されるように、我々のヒット化合物（１、２、９、１０、および１２として印のある）が、９６７部位のセリンのみのリン酸化を増強し、８３部位のセリンあるいは８４５部位のトレオニンのリン酸化を増強しなかった。ＴＰ１４は、１、２、９、１０、および１２と異なる構造を有する別のヒット化合物である。６０４８１６３は、これらのヒット化合物と同一の構造的骨格を共有する化合物であるが、細胞保護において不活性である（図２３Ｂ）。化合物６２３９５０７（図２３ＡおよびＢにおいて、＃１として示される）は、タプシガルジン処理した後、リン酸化に依存した挙動で、ＡＳＫ１からの１４−３−３タンパク質の解離を阻害する。
【０１９８】
図２４は、本機構について我々の仮説を示す。ヒットしたベンゾジアゼピン化合物は、ＡＳＫ１ ｓｅｒ９６７脱リン酸化の阻害剤である。したがって、当該化合物は、１４−３−３タンパク質のＡＳＫ１からの解離を阻害し、ＡＳＫ１を不活性にする。
【０１９９】
図２５は、化合物６２３９５０７が、マウス初代神経細胞において、ＥＲストレスにより誘導される細胞死を阻害できることを示す。初代皮質ニューロン細胞を、マウスの中脳から調製した。成熟してから１４日後、該細胞を、ＤＭＳＯ（０．２％）または２５μＭの化合物６２３９５０７で２時間プレインキュベートした。該細胞を、その後、タプシガルジン（ＴＧ）で２４時間処理した。細胞を、アルデヒド溶液で固定し、神経体および神経軸索ネットワークを染色するために、ＮｅｕＮおよびＭＡＰ２抗体を用いて免疫染色に供した。ヘキスト染料を用いて、核を染色した。蛍光顕微鏡法を用いて、タプシガルジンによる神経軸索ネットワークの喪失が示された。縮合核および萎縮性神経炎を示した細胞は、細胞死を評定する際死亡と見なした。
【０２００】
図２６は、様々なヒット化合物で処理したＣＳＭ１４．１細胞に対する相対的な生存を示す。ＣＳＭ１４．１細胞を、９６ウェルプレート中にウェルあたり１，５００の細胞で播種し、３９℃（非許容温度）で７日間培養した。ヒット化合物を２５μＭの最終濃度で加え、２時間後、１５μＭの最終濃度でタプシガルジンを加えた。ＡＴＰ含有量を測定し、データを、わずか１％のＤＭＳＯで処理した対照細胞に対する割合として表した。
【０２０１】
化合物６２３７８７７および６２３７７３５で処理した＿後、用量依存的なｃ−Ｊｕｎリン酸化の減少を観察した。ＣＳＭ細胞を、漸増用量で、２つの化合物で処理した。プレインキュベーション時間、タプシガルジン処理、細胞抽出物の調製、および免疫ブロット法のプロトコルは、前述に記載した通りであった。用量依存的なｃ−Ｊｕｎリン酸化の減少が、抗リン酸化−ｃ−Ｊｕｎ（ｓｅｒ７３）抗体により確認された。
【０２０２】
図２７は、ＥＲストレス阻害化合物が、タプシガルジンにより誘導される、Ｉｒｅ１経路のマーカーを阻害することを示す。ＣＳＭ１４．１細胞を、ＤＭＳＯまたは１μＭ、５μＭ、および１０μＭの指示化合物と共に培養し、次いで、タプシガルジン（１５μＭ）で処理した。２時間後、細胞溶解物を調製し、タンパク質含有量に対して標準化し、抗−ｐ３８−ＭＡＰＫ ｐａｎ−ｒｅａｃｔｉｖｅ抗体またはＥＣＬベースで検出するリン酸化型特異的抗体を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ／免疫ブロット法により解析した。次いで、ｘ線フィルムのデンシトメトリー解析を行い、すべてのｐ３８ ＭＡＰＫに対してリン酸化ｐ３８ ＭＡＰＫを正規化した（図２７、上）。あるいは、リン酸化型特異的抗体（ＭＳＤカタログ番号＃Ｋ１５１１２Ｄ１）を用いて、ＭＳＤからのメソスケールの計器およびすべてのｐ３８ ＭＡＰＫをプレート上で捕捉する手順を用いて解析し、リン酸化タンパク質の相対量を判定した（図２７、下）。
【０２０３】
すべての刊行物、特許および特許出願は、参照することにより本明細書に組み込まれる。本明細書では、本発明が、ある好ましい実施形態に関して記載され、多くの詳細が例証目的のために説明されているが、本発明が、追加の実施形態を許容する余地があり、本明細書に記載される特定の説明が、本発明の基本原理から逸脱することなく、大幅に変更され得ることが、当業者には明らかである。
【技術分野】
【０００１】
政府の権利の声明
本発明は、米国立衛生研究所によって授与されたＲＯ３ ＤＡ０２４８８７およびＵ０１ ＡＩ０７８０４８の下、米国政府の支援により成された。米国政府は、本発明に関する一定の権利を有する。
【０００２】
本発明は、折り畳まれていないタンパク質の応答によって引き起こされる細胞死の阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００３】
小胞体（ＥＲ）は、複数の細胞機能を果たす（Ｓｃｈｒｏｄｅｒ ａｎｄ Ｋａｕｆｍａｎ，Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．，５６９：２９−６３，２００５、Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｎｅｕｒｏａｎａｔ．２８：７９−９２，２００４、Ｒａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．１１：３７２−３８０，２００４、Ｂｒｅｃｋｅｎｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２２：８６０８−８６１８，２００３にて総説）。ＥＲの内腔は、特異な環境である。ＥＲの内腔は、Ｃａ２＋−ＡＴＰアーゼによるカルシウムイオンのＥＲへの能動輸送により、細胞内に最高濃度のＣａ２＋を含有する。この内腔は、酸化環境を有しており、ジスルフィド結合の形成、ならびに細胞表面で分泌および表示されるタンパク質の適切な折り畳みに重要である。タンパク質の折り畳みおよび輸送における役割から、ＥＲは、タンパク質折り畳み中間体の安定化に役立つ、Ｇｒｐ７８、Ｇｒｐ９４、およびカルレティキュリン等のＣａ２＋依存性分子シャペロンが豊富でもある（Ｓｃｈｒｏｄｅｒ ａｎｄ Ｋａｕｆｍａｎ，Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．５６９：２９−６３，２００５、Ｏｒｒｅｎｉｕｓ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．４：５５２−５６５，２００３、Ｍａ ａｎｄ Ｈｅｎｄｅｒｓｈｏｔ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｎｅｕｒｏａｎａｔ．２８：５１−６５，２００４、Ｒｉｚｚｕｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．ＳＴＫＥ，２００４：ｒｅ１，２００４にて総説）。
【０００４】
無数の種類の障害が、折り畳まれていないタンパク質のＥＲでの蓄積を生じ、折り畳まれていないタンパク質応答（ＵＰＲ）と称される進化的に保存された応答を引き起こす。低酸素または酸化体または還元剤によって生じる細胞酸化還元調整における障害は、ＥＲの内腔でのジスルフィド結合を妨害し、タンパク質のアンフォールディングおよびミスフォールディングにつながる（Ｆｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０：２０３−２１０，２０００）。グルコース欠乏も、恐らくＥＲでのＮ結合型タンパク質のグリコシル化を妨害することによって、ＥＲストレスにつながる。ＥＲにおけるＣａ２＋調整の異常は、Ｇｒｐ７８、Ｇｒｐ９４、およびカルレティキュリン等のＥＲタンパク質のＣａ２＋依存性の性質により、タンパク質のアンフォールディングを引き起こす（Ｍａ ａｎｄ Ｈｅｎｄｅｒｓｈｏｔ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｎｅｕｒｏａｎａｔ．２８：５１−６５，２００４）。ウイルス感染も、ウイルスによりコードされるタンパク質によるＥＲの過負荷のため、ＵＰＲを引き起こし得る。これは、恐らく、ウイルスの複製と蔓延を回避するために、ＥＲストレスを細胞自殺に関連付ける古代の進化的圧力の１つであろう。また、ある量の基底タンパク質のミスフォールディングがＥＲで生じることから（通常、プロテアソームに依存した分解のため、サイトゾルへのミスフォールドされたタンパク質の逆輸送によって改善される）、プロテアソームの機能を損なう状況は、神経変性に関連する封入体疾患を含む、タンパク質の交通渋滞を形成し得る（Ｐａｓｃｈｅｎ，Ｃｅｌｌ Ｃａｌｃｉｕｍ ３４：３６５−３８３，２００３）。高脂肪食もＥＲストレスを引き起こすことに関連している（Ｏｚｃａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０６：４５７−４６１，２００４）。
【０００５】
ＵＰＲの最初の目的は、変化する環境に適合し、恒常性および正常なＥＲ機能を確立することである。これらの適合機構は主に、ＥＲタンパク質の折り畳み能力を増強する遺伝子の発現を誘導し、ＥＲ関連タンパク質の分解を促進して、ミスフォールドしたタンパク質を除去する、転写プログラムの活性化を伴う。ｍＲＮＡの翻訳も、最初に阻害され、これによって、ＵＰＲタンパク質をコードするｍＲＮＡが生成されるまで、数時間、新たなタンパク質のＥＲへの流入が低減される。適合に失敗した場合、ＥＲによって開始された経路は、宿主防衛におけるメディエータをコードする遺伝子の活性化を誘導する転写因子であるＮＦκＢ、ならびにストレスキナーゼ（ｐ３８ ＭＡＰＫおよびＪＮＫ）を活性化することによって、警報を伝える。過剰かつ延長されたＥＲストレスは、通常、動物細胞においてアポトーシスの形態で、機能不全の細胞を排除するための多細胞生命体の最後の手段である細胞自殺を引き起こす。ＥＲストレスは、虚血再かん流障害（特に、脳卒中）、神経変性、および糖尿病を含む広範な疾患に関連している（Ｏｙａｄｏｍａｒｉ ａｎｄ Ｍｏｒｉ，Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．１１：３８１−３８９，２００４、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔ．１１５：２６５６−２６６４，２００５、Ｒａｏ ａｎｄ Ｂｒｅｄｅｓｅｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１６：６５３−６６２，２００４にて総説）。
【０００６】
折り畳まれていないタンパク質がＥＲ内に蓄積する際、内在するシャペロンが占領され、ＵＰＲの誘導に関与する膜貫通ＥＲタンパク質が放出される。これらのＵＰＲ開始タンパク質は、ＥＲ膜に位置し、それらのＮ末端はＥＲの内腔に、それらのＣ末端はサイトゾルにあり、これらの２つの細胞内コンパートメントを接続するブリッジを形成する。通常、これらの膜貫通ＥＲタンパク質のＮ末端は、ＥＲシャペロンＧｒｐ７８（ＢｉＰ）によって保持され、それらの凝集が阻止される。しかし、ミスフォールドしたタンパク質が蓄積する際、Ｇｒｐ７８が放出され、これらの膜貫通信号伝達タンパク質の凝集が可能となり、ＵＰＲが開始される。とりわけ、重要な膜貫通ＥＲ信号伝達タンパク質は、ＰＥＲＫ、Ｉｒｅ１、およびＡＴＦ６である。（Ｓｃｈｒｏｄｅｒ ａｎｄ Ｋａｕｆｍａｎ，Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．５６９：２９−６３，２００５、Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｎｅｕｒｏａｎａｔ．２８：７９−９２，２００４、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔ．１１５：２６５６−２６６４，２００５、Ｒａｏ ａｎｄ Ｂｒｅｄｅｓｅｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１６：６５３−６６２，２００４にて総説）。
【０００７】
ＰＥＲＫ（ＰＫＲ様ＥＲキナーゼ）は、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−タンパク質キナーゼであり、この触媒ドメインは、他のｅｌＦ２αファミリーのキナーゼと相当な相同性を共有する（Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１８：７４９９−７５０９，１９９８、Ｈａｒｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３９７：２７１−２７４，１９９９）。Ｇｒｐ７８が除去されると、ＰＥＲＫはＥＲ膜でオリゴマー化し、これによって、自己リン酸化を誘導し、キナーゼドメインを活性化させる。ＰＥＲＫは、真核生物の翻訳開始因子２アルファ（ｅＩＦ２α）をリン酸化および不活性化し、これによって、ｍＲＮＡ翻訳を全体的に遮断し、ＥＲへのタンパク質負荷を低減する。しかしながら、転写因子ＡＴＦ４をコードするｍＲＮＡを含むあるｍＲＮＡは、これらの状態下、翻訳に対する選択的利点を得る。３９ｋＤａ ＡＴＦ４タンパク質は、転写因子ｂＺＩＰ−ファミリーの一員であり、これは、ＵＰＲに関与するいくつかの遺伝子のプロモータを制御する。ＥＲストレスに対する保護のためにＰＥＲＫによって開始された信号の重要性は、ｐｅｒｋ−／−細胞、および非リン酸化型ｅＩＦ２α（Ｓｅｒ５１Ａｌａ）を発現するノックイン細胞の研究により文書化されており、双方は、ＥＲストレスに対する過敏性を呈する（Ｈａｒｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，５：８９７−９０４，２０００、Ｓｃｈｅｕｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ７：１１６５−１１７６，２００１）。Ｉｒｅ１は、Ｇｒｐ７８によって放出される際、同様にＥＲ膜でオリゴマー化する。約１００ｋＤａ Ｉｒｅ１αタンパク質は、Ｉ型膜貫通タンパク質であり、これは、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−キナーゼドメインおよびエンドリボヌクレアーゼドメインの両方を含有し、後者は、Ｘボックス結合タンパク質１（ＸＢＰ−１）ｍＲＮＡからイントロンを除去し、翻訳可能なものにして、ｂＺＩＰ−ファミリーの転写因子である、４１ｋＤａ ＸＢＰ−１タンパク質を生成する。ＸＢＰ−１は、主に、ＥＲからサイトゾルへのミスフォールドしたタンパク質の逆輸送、ならびにＥＲによって誘導されたタンパク質の分解に関与する、いくつかの遺伝子のプロモータに結合する（Ｒａｏ ａｎｄ Ｂｒｅｄｅｓｅｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１６：６５３−６６２，２００４にて総説）。Ｉｒｅ１もまた、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体ファミリーの多くの成員と、アダプタータンパク質ＴＲＡＦ２に結合する能力を共有する。
【０００８】
ＴＲＡＦ２は、Ｕｂｃ１３に結合するＥ３リガーゼであり、結合部位として標準的なリジン４８ではなく、リジン６３を伴う基質の非標準ポリユビキチン化をもたらす（Ｈａｂｅｌｈａｈ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．２３：３２２−３３２，２００４）。ＴＲＡＦ２は、これまで、Ｊｕｎ−Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）を活性化するＡｓｋ１を含む、免疫および炎症に関与したタンパク質キナーゼ、およびＮＦκＢ活性化に関連するキナーゼを活性化させる。ＡＴＦ６のＮ末端からのＧｒｐ７８の放出は、ＰＥＲＫおよびＩｒｅ１と比較して、異なるタンパク質活性化の機構を誘発する。オリゴマー化の代わりに、Ｇｒｐ７８の放出は、ＡＴＦ６を解放して、ゴルジ体へ移動させ、ここでは、内在するプロテアーゼが膜近傍部位でＡＴＦ６を切断し、この転写因子をサイトゾルに放出し、これが核に移動することにより、遺伝子発現を制御する（Ｙｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ６：１３５５−１３６４，２０００）。
【０００９】
ＥＲストレスにより誘導されるこれらの種々の信号伝達経路が、どのようにして細胞死を引き起こすのかということは、不明である。これは、多くの可能性が概略された、我々が著した最近の総説の主題である（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔ．１１５：２６５６−２６６４，２００５）。ＥＲストレス（他の細胞死経路ではない）の結果として特異的に誘導された細胞死を遮断する化合物は、内在する機構を問いただすため、ならびにＥＲストレスが細胞死および組織障害に関与する事象を引き起こす動物モデルにおける生体内での解明に有用であろう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｓｃｈｒｏｄｅｒ ａｎｄ Ｋａｕｆｍａｎ，Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．，５６９：２９−６３，２００５
【非特許文献２】Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｎｅｕｒｏａｎａｔ．２８：７９−９２，２００４
【非特許文献３】Ｒａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．１１：３７２−３８０，２００４
【非特許文献４】Ｂｒｅｃｋｅｎｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２２：８６０８−８６１８，２００３
【非特許文献５】Ｏｒｒｅｎｉｕｓ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．４：５５２−５６５，２００３
【非特許文献６】Ｍａ ａｎｄ Ｈｅｎｄｅｒｓｈｏｔ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｎｅｕｒｏａｎａｔ．２８：５１−６５，２００４
【非特許文献７】Ｒｉｚｚｕｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．ＳＴＫＥ，２００４：ｒｅ１，２００４
【非特許文献８】Ｆｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０：２０３−２１０，２０００
【非特許文献９】Ｐａｓｃｈｅｎ，Ｃｅｌｌ Ｃａｌｃｉｕｍ ３４：３６５−３８３，２００３
【非特許文献１０】Ｏｚｃａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０６：４５７−４６１，２００４
【非特許文献１１】Ｏｙａｄｏｍａｒｉ ａｎｄ Ｍｏｒｉ，Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．１１：３８１−３８９，２００４
【非特許文献１２】Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔ．１１５：２６５６−２６６４，２００５
【非特許文献１３】Ｒａｏ ａｎｄ Ｂｒｅｄｅｓｅｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１６：６５３−６６２，２００４
【非特許文献１４】Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１８：７４９９−７５０９，１９９８
【非特許文献１５】Ｈａｒｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３９７：２７１−２７４，１９９９
【非特許文献１６】Ｈａｒｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，５：８９７−９０４，２０００
【非特許文献１７】Ｓｃｈｅｕｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ７：１１６５−１１７６，２００１
【非特許文献１８】Ｈａｂｅｌｈａｈ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．２３：３２２−３３２，２００４
【非特許文献１９】Ｙｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ６：１３５５−１３６４，２０００
【発明の概要】
【００１１】
我々は、小胞体（ＥＲ）ストレス阻害剤のスクリーニングを行うための新規のハイスループット方法を開発した。これらの方法は、ＥＲストレスを誘導するタプシガルジン（タプシガルギン）、および、マルチウェルプレート内の哺乳類細胞への試験薬剤の添加を含む。生物発光試薬を用いて細胞内ＡＴＰ含有量を測定することによって、細胞生存は容易にモニタリングすることができる。商業的に入手可能な５０，０００の化合物のライブラリに対してスクリーニングを行うことにより、二次アッセイに供された９３のヒット化合物を特定するに至り、これらがタプシガルジンにより誘導される細胞死から細胞を守る能力を確認した。
【００１２】
本発明の一実施形態によると、方法は、小胞体ストレスに起因する細胞死の阻害剤を特定するために提供され、（ａ）哺乳類細胞をタプシガルジンに接触させ、これによって、前記細胞に小胞体ストレスを引き起こすステップと、（ｂ）前記細胞を試験薬剤に接触させるステップと、（ｃ）前記試験薬剤が小胞体ストレスによって引き起こされる前記細胞の死を阻害するかどうかを判断するステップと、を含む。１つのこのような実施形態によると、前記哺乳類細胞は、ＣＳＭ１４．１ラット線条体神経前駆細胞である。別のこのような実施形態によると、該方法は、該細胞の細胞内ＡＴＰ含有量を測定することによって、該試験薬剤が、小胞体ストレスにより引き起こされる該細胞の死を阻害するかどうかを判断するステップをさらに含む。別のこのような実施形態によると、該方法は、該細胞の生物発光を測定することによって、該細胞の細胞内ＡＴＰ含有量を測定するステップをさらに含む。別のこのような実施形態によると、該方法は、該試験薬剤が、約５０％以上、もしくは約６０％以上、もしくは約７０％以上、もしくは約８０％以上、もしくは約９０％以上、もしくは約９５％以上、該細胞の死を阻害するかどうかを判断するステップを含む。別のこのような実施形態によると、該方法は、該試験薬剤が、約２５μＭ以下、もしくは約２０μＭ以下、もしくは約１５μＭ以下、もしくは約１０μＭ以下のＩＣ５０を有するかどうかを判断するステップを含む。別のこのような実施形態によると、該方法は、該細胞をタプシガルジンに接触させた後、該細胞を、該試験薬剤に接触させるステップを含む。別のこのような実施形態によると、該方法は、マルチウェルプレートのウェルに該細胞を提供するステップを含む。別のこのような実施形態によると、該方法は自動化される。
【００１３】
別の実施形態によると、タプシガルジンにより誘導される小胞体ストレスに起因する哺乳類細胞の死を阻害する化合物を有効量含む組成物を提供する。１つのこのような実施形態によると、該哺乳類細胞は、ＣＳＭ１４．１ラット線条体神経前駆細胞である。別のこのような実施形態によると、かかる組成物は、約５０パーセント以上、もしくは６０パーセント以上、もしくは７０パーセント以上、もしくは８０パーセント以上、もしくは９０パーセント以上、もしくは９５パーセント以上、ＣＳＭ１４．１ラット線条体神経前駆細胞の死を阻害する。別のこのような実施形態によると、該組成物は、約２５μＭ以下、もしくは約２０μＭ以下、もしくは約１５μＭ以下のＩＣ５０を有する。別のこのような実施形態によると、該組成物は、約５０パーセント以上、ＣＳＭ１４．１ラット線条体神経前駆細胞の死を阻害し、約２５μＭ以下のＩＣ５０を有する。
【００１４】
別のこのような実施形態によると、該組成物は、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ ＩＤ番号５２３０７０７、５３９７３７２、５６６７６８１、５７０６５３２、５８０３８８４、５８４３８７３、５８５０９７０、５８９７０２７、５９２３４８１、５９２６３７７、５９３１３３５、５９３３６９０、５９４７２５２、５９４８３６５、５９５１６１３、５９５４１７９、５９５４６９３、５９５４７５４、５９５５７３４、５９６２２６３、５９６３９５８、５９７４２１９、５９７４５５４、５９７６２２８、５９７９２０７、５９８０７５０、５９８１２６９、５９８４８２１、５９８６９９４、５９９００４１、５９９０１３７、５９９３０４８、５９９８７３４、６０００３９８、６０１５０９０、６０３３３５２、６０３４３９７、６０３４６７４、６０３５０９８、６０３５７２８、６０３７３６０、６０３８３９１、６０４３８１５、６０４４３５０、６０４４５２５、６０４４６２６、６０４４６７３、６０４４８６０、６０４５０１２、６０４６０７０、６０４６８１８、６０４８３０６、６０４８９３５、６０４９０１０、６０４９１８４、６０４９４４８、６０５６５９２、６０６０８４８、６０６２５０５、６０６５７５７、６０６６９３６、６０６８１８９、６０６８６０２、６０６９４７４、６０７０３７９、６０７３８７５、６０７４２５９、６０７４５３２、６０７４８９１、６０８１０２８、６０８４６５２、６０９４９５７、６０９５５７７、６０９５９７０、６１０３９８３、６１０４９３９、６１４１５７６、６２３７７３５、６２３７８７７、６２３７９７３、６２３７９９２、６２３８１９０、６２３８２４６、６２３８４７５、６２３８７６７、６２３９０４８、６２３９２５２、６２３９５０７、６２３９５３８、６２３９９３９、６２４１３７６、６３６８９３１、および６３７０７１０からなる群より選択される化合物を含む。別のこのような実施形態によると、該組成物は、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ ＩＤ番号６２３９５０７、６２３７７３５、６２３８４７５、６２３７８７７、６２３９５３８、６２３８７６７、６０４９４４８、５９６３９５８、６２３７９７３、および６０４４６７３が含まれるが、これらに限定されない、式Ｉの化合物を含む。別のこのような実施形態によると、該組成物は、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ ＩＤ番号５９９８７３４、５９５５７３４、５９９００４１、６０３５０９８、および５９９０１３７が含まれるが、これらに限定されない、式ＩＩ−１の化合物を含む。別のこのような実施形態によると、該組成物は、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ ＩＤ番号５３９７３７２、６０３３３５２、６０３４６７４、および５９５１６１３が挙げられるが、これらに限定されない、式ＩＩ−２の化合物を含む。別のこのような実施形態によると、該組成物は、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ ＩＤ番号５９４８３６５、５９７６２２８、５９８０７５０、５８０３８８４、６０４９１８４、５９７９２０７、および６１４１５７６からなる群より選択される化合物を含む。別のこのような実施形態によると、該組成物は、薬剤として許容される担体を含む。
【００１５】
別の実施形態によると、（ａ）前述の組成物のうちの１つと、（２）好適な包装材料と、を含むキットを提供する。
【００１６】
別の実施形態によると、小胞体ストレスに起因する哺乳類細胞の死を阻害するための方法を提供し、前述の組成物のうちのいずれかにより、細胞を治療・処置するステップを含む。
【００１７】
別の実施形態によると、小胞体ストレスに関連する、哺乳類（ヒトを含むがこれに限定されない）の疾患、症状、もしくは傷害を治療するための方法を提供し、治療を必要とする哺乳類に、前述の組成物のうちのいずれかを投与するステップを含む。１つのこのような実施形態によると、該疾患、もしくは症状、もしくは傷害は、神経疾患、代謝性疾患、虚血障害、心臓および循環系損傷、ウイルス感染、アテローム性動脈硬化、双極性疾患、およびバッテン病からなる群より選択される。別のこのような実施形態によると、該神経疾患は、家族性アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、球脊髄性筋萎縮症／ケネディ病、脊髄小脳失調症３型／マシャド・ジョセフ病、プリオン病、筋萎縮性側索硬化症、およびＧＭ１ガングリオシドーシスからなる群より選択される。別のこのような実施形態によると、該代謝性疾患は、糖尿病、ウォルコツト・ラリソン症候群、ウォフラム症候群、２型糖尿病、ホモシステイン血症、Ｚα１−抗トリプシン欠乏症封入体筋炎、および遺伝性チロシン血症１型からなる群より選択される。別のこのような実施形態によると、該心臓および循環系損傷は、心肥大、低酸素性障害、および家族性高コレステロール血症からなる群より選択される。
【００１８】
別の実施形態によると、本発明は、ＥＲストレス阻害化合物を必要とする個体に投与するための薬剤を調製するための、ＥＲストレス阻害化合物の使用を提供する。
【００１９】
本発明の前述および他の態様は、以下の発明を実施するための形態、添付の図面、ならびに請求項からより明らかとなる。
【００２０】
別途定義されない限り、本明細書で使用するすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書に説明されるものと同様または同等の方法および材料を、本発明の実践または試験に使用することができるが、好適な方法および材料を以下に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】第１群の化合物に基づき、第１群および式Ｉからのヒット化合物の構造を示す図。
【図２Ａ】第２群からのヒット化合物の構造を示す図。
【図２Ｂ】式２−１（第２−１群の化合物に基づく）および式２−２（第２−２群の化合物に基づく）を示す図。
【図３】第１群または第２群に分類されない５つの独立したヒット化合物の構造を示す図。
【図４】ＥＲストレス誘導細胞死を研究するためのＣＳＭ１４．１神経細胞を使用するためのパイロット・スタディの結果を示す図。（Ａ）細胞密度の評価。（Ｂ）タプシガルジン（Ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ（ＴＧ））に対する用量反応。（Ｃ）サルブリナル（Ｓａｌｕｂｒｉｎａｌ（Ｓａｌ））に対する用量反応。
【図５】未分化（図５Ａ）および分化（図５Ｂ）ＣＳＭ１４．１細胞を、ＴＧが殺滅し、Ｓａｌが保護することを示す図。
【図６】ＡＴＰ含有量アッセイの再現性の評価を示す図。
【図７】アッセイ品質管理解析を示す図。
【図８】スクリーニングからヒット化合物の同定までのフローチャートを示す図。
【図９】５０，０００の化合物のインハウスライブラリの標準的なスクリーニングからの、（Ａ）未加工データの解析結果、（Ｂ）および正規化された相対生存率の算出結果を示す図。Ｇ行の８列に、９８．９％の生存率に相当する、１つの有効なヒット化合物（太字）を示す。
【図１０】データの正規化後のスクリーニング結果の一例のグラフを示す図。相対ＡＴＰ含有量（ｙ軸）が、ウェル番号（１−９６［Ａ１からＨ１２］）（ｘ軸）に対してプロットされる。
【図１１】ヒット化合物によるＥＲストレス誘導細胞死の用量依存的阻害を示す図。未分化のＣＳＭ１４．１細胞を、タプシガルジン（１５μＭ）および様々な濃度の４種のヒット化合物（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）で処理した。細胞内ＡＴＰレベルを測定し（ｙ軸）、化合物濃度（ｘ軸）に対してプロットした。データは、３つの独立した実験を表す。
【図１２】サルブリナルが、我々のヒット化合物よりも有効性の低いタプシガルジンにより誘導される細胞死を阻害することを示す図。
【図１３】我々のヒット化合物が、タプシガルジンに匹敵する効率を有するツニカマイシンにより誘導される細胞死を阻害することを示す図。
【図１４】未分化ＣＳＭ１４．１対神経細胞に分化したＣＳＭ１４．１を用いて、化合物の細胞保護活性の比較を示す図。白いバー＝対照のＤＭＳＯ、黒いバー＝分化細胞と未分化細胞の両方を保護する化合物、グレーのバー＝未分化のニューロンを保護するが分化したニューロンを保護しない化合物。
【図１５】ＥＲストレスから保護する際の、化合物の細胞型特異性を示す図。ＣＳＭ１４．１（左）細胞およびＪｕｒｋａｔ（ジャーカット）（右）細胞をそれぞれ、９６ウェルプレート中で、ウェルあたり３，０００の細胞またはウェルあたり３０，０００の細胞で、一晩培養した。ウェルに、ＤＭＳＯのみ（白いバー）またはＤＭＳＯに溶解させた２５μＭの化合物（Ａ〜Ｃ）を加え、次いで、ウェルをＴＧ（１５μＭ）あり（＋）またはなし（−）で処理した。２４時間培養した後、ＡＴＰ含有量を判定し、対照であるＤＭＳＯでのみ処理された細胞に対する割合（平均＋標準偏差、ｎ＝３）として、データを示した。
【図１６】化合物の細胞保護活性を評価するための二次アッセイの結果を示す図。未分化ＣＳＭ１４．１細胞を、２４ウェルプレートのウェルあたり１０４の数の細胞で培養した。翌日、ＤＭＳＯ（ａ、ｂ）（１％の最終容積）、１００μＭのサルブリナル（ｃ、ｄ）、あるいは２５μＭのヒット化合物（１％の最終ＤＭＳＯ）を加えた。２時間後、１５μＭのＴＧを、ａおよびｃを除くすべてのウェルに加えた。従前のＡＴＰアッセイを行い、生存率を測定した。処理：ａ：１％ ＤＭＳＯ、ｂ：１％ ＤＭＳＯ、１５μＭのＴＧ、ｃ：１００μＭのＳａｌ、ｄ：１００μＭのＳａｌ、１５μＭのＴＧ、化合物（ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ ＩＤ番号の化合物）：図中のＩＤ番号と、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅの化合物のＩＤ番号との関係を、下記表１９に示す。
【表１９】
【図１７】化合物の細胞保護活性を評価するための二次アッセイの結果を示す図。未分化ＣＳＭ１４．１細胞を、図１６と同様に培養した。翌日、ＤＭＳＯ（ａ、ｂ）（１％の最終容積）、１００μＭのサルブリナル（ｃ、ｄ）、あるいは２５μＭのヒット化合物（１％の最終ＤＭＳＯ）を加えた。２時間後、１５μＭのＴＧをａおよびｃを除くすべてのウェルに加えた。プレートを再度２４時間培養し、その後、細胞を、トリプシン処理により回収し、１．５ｍｌの微小遠心管に移し、０．５ｍＬのアネクシンＶ結合溶液に再懸濁した。アネクシンＶ陰性細胞の割合は、フローサイトメトリー（ｙ軸）により判断した。処理および化合物は、図１６と同様である。
【図１８】ヒット化合物の経路選択性を示す図。未分化ＣＳＭ１４．１細胞を、９６ウェルプレート（ＡＴＰアッセイ用）中でウェルあたり３，０００の細胞、または２４ウェルプレート（フローサイトメトリー用）中でウェルあたり１×１０４の細胞を播種した。翌日、細胞を、ＤＭＳＯ（０．５％）または０．５％の最終濃度を有するＤＭＳＯ中の２５μＭのヒット化合物で２時間処理し、次いで、１５μＭのタプシガルジン（ＴＧ）で２４時間、１０μｇ／ｍＬのツニカマイシン（ＴＵ）で７２時間、２．５μＭのスタウロスポリン（ＳＴＳ）で２４時間、５０μＭのＶＰ１６で４８時間、あるいは３０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ＋１０μｇ／ｍＬのシクロヘキサミド（ＣＨＸ）で２４時間、を含む、様々な細胞死を誘導する試薬で処理した。細胞内ＡＴＰ含有量は、スタウロスポリンの試料およびＴＮＦ／ＣＨＸ試料に対して測定し、ＤＭＳＯのみ（対照）で処置した細胞に対してデータを正規化し、対照の割合として示した。ツニカマイシンおよびＶＰ１６による処理から起因する細胞死を測定するために、フローサイトメトリーを用いた。すべてのアッセイを３回行った（平均±標準偏差）。
【図１９】ＥＲストレス阻害化合物が、Ｉｒｅ１経路のＴＧにより誘導されるマーカーを阻害することを示す図。ＣＳＭ１４．１細胞を、ＤＭＳＯまたは２５μＭのヒット化合物を用いて２時間培養し、次いで、タプシガルジン（１５μＭ）で処理した。細胞溶解物を調製し、リン酸化−ｃ−Ｊｕｎ、リン酸化−ｅＩＦ２α、リン酸化−ｐ３８ ＭＡＰＫ、およびチューブリン（量の対照）に対して特異的な抗体を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／免疫ブロット法により解析した。対照レーンを、ＤＭＳＯのみ、またはＤＭＳＯ＋ＴＧで処理した。別の実験において、ＣＳＭ１４．１細胞を、ＤＭＳＯ、または１μＭ、５μＭ、および１０μＭの活性化合物のうちの１つで培養し、次いで、２時間後、１５μＭのＴＧで培養した。２時間後、細胞溶解物を調製し、タンパク質含有量に対して正規化し、ｐａｎ−ｒｅａｃｔｉｖｅな抗−ｐ３８−ＭＡＰＫ抗体またはリン酸化型特異的抗体を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ／免疫ブロット法により、ＥＣＬベースで検出し、次いで、ｘ線フィルムのデンシトメトリー解析を行い、ｐ３８ ＭＡＰＫの合計に対してリン酸化ｐ３８ ＭＡＰＫを正規化するか、あるいは、すべてのｐ３８ ＭＡＰＫをプレート上で捕捉する手順を用いてＭＳＤからのメソスケール機器で解析し、リン酸化タンパク質の相対量をリン酸化型特異的抗体（ＭＳＤカタログ番号Ｋ１５１１２Ｄ１）を用いて測定した。
【図２０】ＣＩＤ−２８７８７４６の再合成およびＭＬＳ−０２９２１２６の合成経路を示す図。
【図２１】変性タンパク質応答（ＵＰＲ）のシグナル伝達経路を示す図。
【図２２】化合物６２３９５０７を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイの結果を示す図。
【図２３】ＡＳＫ１のセリン９６７のリン酸化部位が、ＥＲストレスを阻害する化合物６２３９５０７により増強されたことを示す図。様々な部位でＡＳＫ１のリン酸化を検査した。２９３Ｔ細胞を、ｐｃＤＮＡ−ＡＳＫ１−ＨＡでトランスフェクションションした。１日後、細胞を、ＤＭＳＯ（０．４％）または１００μＭの化合物６２３９５０７（＃１）で、２時間インキュベートした。細胞抽出物を、溶解緩衝液を用いて調製し、（Ａ）に示されるように、抗リン酸化ＡＳＫ１抗体または抗ＨＡ抗体を用いて免疫ブロット法に供した。それぞれのリン酸化ＡＳＫバンドの相対密度は、イメージＪソフトウェアにより算出した。（Ｂ）では、（Ａ）からの化合物を、タプシガルジンにより誘導される細胞死に対する活性において比較した。陰性の対照には、ヒット化合物＃１４を使用した（左のグレーのバー）。化合物＃１４は、細胞死の強力な阻害剤であるが、化合物６２３９５０７とは異なる構造を有する。別の陰性の対照として、化合物６０４８１６３を使用した（右のグレーのバー）。それは、該ヒット化合物と同一の骨格を共有するが、細胞死の阻害剤としては効果がない。２９３Ｔ細胞を、ｐｃＤＮＡ−ＡＳＫ１−ＨＡおよびｐＥＢＧ−ＧＳＴ−１４−３−３でトランスフェクションションした。１日後、細胞を、ＤＭＳＯ（０．４％）または１００μＭの示された化合物で２時間インキュベートした。その後、細胞を、示された時間、タプシガルジン（２０μＭ）で処理した。細胞抽出物を、溶解緩衝液を用いて調製し、１４−３−３タンパク質を、グルタチオンＳトランスフェラーゼ４Ｂセファロースビーズで免疫沈降した。１４−３−３タンパク質に結合するＡＳＫ１タンパク質は、抗ＨＡ抗体を用いた免疫ブロット法により可視化した。抗リン酸化ＡＳＫ１（ｓｅｒ９６７）抗体を用いて、それぞれの時点でＡＳＫ１のリン酸化を検出した。
【図２４】ヒットしたベンゾジアゼピン化合物が、ＡＳＫ１ ｓｅｒ９６７脱リン酸化の阻害剤であるという仮説を示す図。したがって、当該化合物は、ＡＳＫ１からの１４−３−３タンパク質の解離を阻害し、ＡＳＫ１を不活性にする。
【図２５】化合物６２３９５０７が、初代マウス神経細胞において、ＥＲストレス誘導細胞死を阻害することができることを示す図。初代皮質ニューロン細胞は、マウスの中脳から調製した。成熟してから１４日後、該細胞を、ＤＭＳＯ（０．２％）または２５μＭの化合物６２３９５０７で２時間プレインキュベートした。該細胞を、その後、タプシガルジン（ＴＧ）で２４時間処理した。該細胞を、アルデヒド溶液で固定し、神経体および神経軸索ネットワークを染色するためにＮｅｕＮおよびＭＡＰ２抗体を用いて免疫染色に供した。ヘキスト染色を用いて、核を染色した。タプシガルジンにより軸索ネットワークの喪失を示すために、広視野を、蛍光顕微鏡により確保した。縮合核および萎縮性神経炎を示す細胞は、細胞死を評定するために死亡と見なした。
【図２６】様々なヒット化合物で処理されたＣＳＭ１４．１細胞の相対生存を示す図。ＣＳＭ１４．１細胞を、９６ウェルプレート中でウェルあたり１，５００の細胞で播種し、３９℃（非許容温度）で７日間培養した。ヒット化合物を２５μＭの最終濃度で加え、２時間後、１５μＭの最終濃度でタプシガルジン（ＴＧ）を加えた。ＡＴＰ含有量を測定し、データを、わずか１％のＤＭＳＯで処理した対照細胞に対する割合として示した（平均±標準偏差、ｎ＝３）。
【図２７】ＥＲストレス阻害化合物は、タプシガルジンにより誘導される、Ｉｒｅ１経路のマーカーを阻害することを示す図。ＣＳＭ１４．１細胞を、ＤＭＳＯまたは１μＭ、５μＭ、および１０μＭの示された化合物で培養し、次いで、タプシガルジン（１５μＭ）で処理した。２時間後、細胞溶解物を調製し、タンパク質含有量に対して正規化し、電気化学ルミネセンスを基にした検出を伴うｐａｎ−ｒｅａｃｔｉｖｅな抗−ｐ３８−ＭＡＰＫ抗体またはリン酸化型特異的抗体を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ／免疫ブロット法により解析し（上）、次いで、ｘ線フィルムのデンシトメトリー解析を行い、ｐ３８ ＭＡＰＫの合計に対してリン酸化ｐ３８ ＭＡＰＫを正規化する（中）か、あるいは、ＭＳＤからのメソスケール機器およびすべてのｐ３８ ＭＡＰＫをプレート上で捕捉する手順を用いて解析し、リン酸化タンパク質の相対量をリン酸化型特異的抗体（ＭＳＤカタログ番号Ｋ１５１１２Ｄ１）を用いて測定した（下）。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、ＥＲストレスを阻害する化合物にスクリーニングを行うための方法、スクリーニング等を用いて同定される化合物、ならびに関連組成物および方法を提供する。
【００２３】
定義
本明細書で使用する「ＥＲストレス阻害化合物」とは、「ＥＲストレス阻害活性」を有する化合物を指す。すなわち、かかる化合物は、好適なアッセイにより測定された場合、好ましくは、約５０％以上、もしくは６０％以上、もしくは７０％以上、もしくは８０％以上、もしくは９０％以上、ＥＲストレスから起因する細胞死を阻害する。好ましくは、該ＥＲストレス阻害化合物は、ＥＲストレスに関連する、いずれかの疾患、または疾病、または症状、または傷害を処置・治療する際に有効である。好ましくは、該ＥＲストレス阻害化合物は、約２５μＭ以下、もしくは２０μＭ以下、もしくは１５μＭ以下、もしくは１０μＭ以下のＩＣ５０を有する。５０，０００の化合物ライブラリのハイスループットスクリーニングで、我々は、タプシガルジン処理に起因するＥＲストレスによる細胞死を阻害する、９３のＥＲストレス阻害化合物（「ヒット」）を同定した。これらの９３のヒットのうちの３０は、２５μＭ以下のＩＣ５０を有すると判断された。本発明のＥＲストレス阻害化合物はまた、薬剤として許容されうる、本明細書で提供されるＥＲストレス阻害化合物の類似体（アナログ）、またはプロドラッグ、または塩、または溶媒和物を含む。また、本明細書で提供されるＥＲストレス阻害化合物のいずれかに構造的に関連する化合物、およびＥＲストレス阻害活性を有する化合物も含まれ、表３および表６〜１１に記載される化合物も含まれるが、これらに限定されない。
【００２４】
本明細書では、特定のＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ化合物ＩＤ番号を有する化合物は、単に「化合物＜番号＞」として、または番号のみでも称され得る。例えば、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ化合物ＩＤ５２３０７０７は、「化合物５２３０７０７」または「５２３０７０７」として称され得る。化学構造、化学名、分子量等を含む、個別の化合物に関するさらなる情報は、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ社のウェブサイト：ｗｗｗ．ｈｉｔ２ｌｅａｄ．ｃｏｍで、化合物毎に開示されている。
【００２５】
ＥＲストレス阻害化合物には、下記表１に記載される化合物が含まれるが、これらに限定されない。かかる化合物は、タプシガルジンにより誘導される細胞死からＣＳＭ１４．１細胞を保護する。
【表１−１】
【表１−２】
【表１−３】
【００２６】
いくつかのヒット化合物は、関連した構造を有する群に分類される。ＥＲストレス阻害化合物には、式Ｉの化合物（図１に示す）が含まれるが、これらに限定されない。式中、
Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、水素、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、アリールオキシ、およびヘテロアリールオキシからなる群から選択され、
Ｒ２は、水素、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、アリールオキシ、およびヘテロアリールオキシからなる群から選択され、
Ｒ３〜Ｒ７はそれぞれ独立して、水素、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、ハロ、およびハロアルキルからなる群から選択される。
【００２７】
式Ｉには、下記表２に記載される（本明細書において第１群の化合物とも称される）ベンゾジアゼピノン化合物が含まれるが、これらに限定されない。
【００２８】
（ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ化合物ＩＤ番号により記載される）第Ｉ群の化合物およびそれらの効力データを、ＩＣ５０（μＭ）として下記表２に提供する。式Ｉの化合物に対する置換基Ｒ１〜Ｒ７も、表２に提供する。
【表２】
【００２９】
ＥＲストレス阻害化合物にはまた、第１群の化合物に構造的に類似する化合物が含まれるが、これらに限定されない。このような類似する化合物には、下記表３に記載される化合物が含まれるが、これらに限定されない。
【表３−１】
【表３−２】
【表３−３】
【表３−４】
【表３−５】
【表３−６】
【表３−７】
【００３０】
ＥＲストレス阻害化合物には、図２Ｂに示されるような式ＩＩ−１の化合物（第２−１群化合物）および式ＩＩ−２（第２−２群化合物）が含まれるが、これらに限定されない（第２−１群化合物および第２−２群化合物は、本明細書において集合的に第２群の化合物と称される。）。
【００３１】
式ＩＩ−１に関しては、Ｒ１〜Ｒ７はそれぞれ独立して、水素、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、ハロ、およびハロアルキルからなる群から選択される。
【００３２】
式ＩＩ−２に関しては、Ｒは、水素、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、ハロ、およびハロアルキルからなる群から選択される。
【００３３】
（ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ化合物ＩＤ番号により記載される）第２−１群および第２−２群の代表的な化合物およびそれらの効力データ［ＩＣ５０（μＭ）］は、下記表４および表５に提供される。これらの選択された式ＩＩ−１（第２−１群）の化合物に関しては、それぞれの化合物に対する置換基Ｒ１〜Ｒ７を、表４に提供する。これらの選択された式ＩＩ−２（第２−２群）の化合物に関しては、それぞれの化合物に対する置換基Ｒを、表５に提供する。
【表４】
【表５】
【００３４】
第２群の化合物と構造的に類似する化合物の例を表６に提供する。
【表６−１】
【表６−２】
【表６−３】
【００３５】
図３は、式Ｉあるいは式ＩＩの化合物に含まれない５つの独立した化合物の構造を示す。これらの化合物を、以下に示す（ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ化合物ＩＤ番号により記載する）。
５９８０７５０
５８０３８８４
６０４９１８４
５９７９２０７
６１４１５７６
【００３６】
これらの化合物と構造的に類似する化合物の例を下記表７〜１１に提供する。
【表７】
【表８】
【表９】
【表１０】
【表１１】
【００３７】
本明細書で使用する「細胞」とは、いずれかの動物細胞、組織、または全生物を指し、哺乳類細胞には、例えば、ウシ亜科の動物細胞、齧歯類細胞（例えば、マウス、またはラット、またはミンク、またはハムスター細胞等）、ウマ細胞、またはブタ細胞、またはヤギ細胞、またはヒツジ細胞、またはネコ細胞、またはイヌ細胞、またはサル細胞、またはヒト細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３８】
本明細書で使用する「薬剤」とは、所望の生物学的活性を有するいずれの物質を指す。「ＥＲストレス阻害剤」は、宿主における、細胞死を阻害する、またはＥＲストレスと関連する疾患、症状もしくは傷害を治療・処置する際に、検出可能な生物学的活性を有する。
【００３９】
本明細書で使用する「有効量」とは、観察できる生物学的効果の検出可能な差異を生じる組成物の量、例えば、このような効果の統計的に有意な差異を生じる組成物の量、特に、ＥＲストレス阻害活性を生じる組成物の量を指す。該検出可能な差異は、該組成物における単一物質、該組成物における物質の組み合わせ、または２つ以上の組成物の投与の併用効果に起因し得る。例えば、ＥＲストレス阻害化合物を含む組成物の「有効量」は、ＥＲストレスに起因する細胞死、または、例えば、宿主における、ＥＲストレスの症状を緩和する、または、ＥＲストレスまたは別の疾患もしくは疾病と関連する、またはそれらに起因する疾患、症状もしくは障害を治療もしくは予防する等の別の所望の効果を検出可能に阻害する、組成物の量を指し得る。所与の組成物または治療におけるＥＲストレス阻害化合物と別の物質の組み合わせは、相乗的な組み合わせであり得る。Ｃｈｏｕ ａｎｄ Ｔａｌａｌａｙ，Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇｕｌ．２２：２７−５５（１９８４）による例に記載されるように、相乗効果は、組み合わせで投与される場合の該化合物の効果が、単一薬剤としてのみ投与される場合の該化合物の相加効果よりも大きい場合に、生じる。一般に、相乗効果は、該化合物の準最適濃度で、最も明確に示される。相乗効果は、個別の成分と比較して、細胞毒性の低下、または活性の増加、またはいくつかの他の組み合わせの有益な効果を示す。
【００４０】
本明細書で使用する「治療」または「治療する」とは、（ｉ）病態が発生するのを防ぐ（例えば、予防法）、（ｉｉ）病態を阻害する、もしくはその発達を抑える、（ｉｉｉ）病態を緩和する、および／または病態と関連する症状を軽減することを含む。
【００４１】
本明細書で使用する「患者」という用語は、本発明の組成物および方法により治療される生命体を指す。このような生命体としては、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウマ、ラット、マウス等の哺乳動物が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の文脈において、「被検体」という用語は、一般に、ＥＲストレス、または関連疾患、症状もしくは障害に起因する細胞死のための治療（例えば、本発明の化合物、および任意に１つもしくは複数の他の薬剤の投与）を受ける個体・個人を指す。
【００４２】
本明細書で使用される「薬剤として許容される塩」とは、ＥＲストレス阻害化合物、またはその酸塩または塩基塩を作製することによって親化合物が改変された開示された化合物の他の誘導体を指す。薬剤として許容される塩の例としては、アミン等の塩基性残基の鉱酸塩もしくは有機酸塩、カルボン酸等の酸性残基のアルカリ塩もしくは有機塩が挙げられるが、これらに限定されない。薬剤として許容される塩としては、例えば、無毒性の無機酸または有機酸から形成された、親化合物の無毒性塩または第４級アンモニウム塩も挙げられる。例えば、このような無毒性塩としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸等の無機酸から誘導された塩；および酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パモ酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、２−アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホトン酸、シュウ酸、イセチオン酸等の有機酸から調製された塩が挙げられる。
【００４３】
ＥＲストレス阻害化合物または本発明に有用な他の化合物の薬剤として許容される塩は、親化合物から合成され得、従来の化学的手法により、塩基性部分または酸性部分を含む。一般に、このような塩は、水中もしくは有機溶媒、または両者の混合液中で、これらの化合物の遊離酸または遊離塩基型と、化学量論量の適切な塩基または酸を反応させることによって、調製することができる。一般に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリル等の非水媒体が好ましい。好適な塩の一覧表は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，ｐ．１４１８（１９８５）に見い出され、その開示は、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００４４】
「薬剤として許容される」という語句は、妥当なベネフィット／リスク比に見合った、過剰毒性、または刺激、またはアレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を有しない、ヒトおよび動物の組織と接触して使用するのに好適な、適切な医療判断の範囲内の化合物、材料、組成物、および／または剤形を指すために、本明細書では使用される。
【００４５】
本明細書に開示される化合物のあるジアステレオマーは、他と比較して優れた活性を示し得る。必要な場合に、ラセミ材料の分離は、キラルカラムを用いたＨＰＬＣによって、またはＴｈｏｍａｓ Ｊ．Ｔｕｃｋｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２４３７−２４４４，１９９４にあるような、カンファン酸クロリド等の分割剤を用いた分離によって、達成することができる。式Ｉのキラル化合物はまた、例えば、Ｍａｒｋ Ａ．Ｈｕｆｆｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６０：１５９０−１５９４，１９９５のキラル触媒またはキラルリガンドを用いて、直接合成され得る。
【００４６】
「安定化合物」および「安定構造」は、反応混合物から有用な程度の純度への単離、および治療薬の有効な処方に耐えうる十分に強固な化合物を意味する。安定化合物のみが、本発明により企図される。
【００４７】
「置換される（Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ）」とは、「置換される（Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ）」を用いる表現において示された原子上の１つもしくは複数の水素が、指示された群からの選択肢と置き換えられることを意図する。但し、指示された原子の通常の価数は超えず、置換は安定化合物をもたらす。好適な指示された群としては、例えば、アルキル、アルケニル、アルキリデニル、アルケニルイデニル（ａｌｋｅｎｙｌｉｄｅｎｙｌ）、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、ＮＲｘＲｙおよび／またはＣＯＯＲｘが挙げられる。ここで、各ＲｘおよびＲｙは独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、またはヒドロキシである。置換基が、ケト（すなわち、＝Ｏ）またはチオキソ（すなわち、＝Ｓ）基の場合、該原子上の２つの水素が、置き換えられる。
【００４８】
「割り込まれる（Ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｅｄ）」とは、２つ以上の隣接炭素原子と、それらが結合する水素原子との間（例えば、メチル（ＣＨ３）、メチレン（ＣＨ２）またはメチン（ＣＨ））に、「割り込まれる（Ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｅｄ）」という表現で示された群からの選択肢が挿入されることを意図する。但し、示された原子の通常の価数は超過せず、割り込みは安定化合物をもたらす。このような好適な示された群としては、例えば、非過酸化物オキシ（−Ｏ−）、またはチオ（−Ｓ−）、またはカルボニル（−Ｃ（＝Ｏ）−）、またはカルボキシ（−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−）、またはイミン（Ｃ＝ＮＨ）、またはスルホニル（ＳＯ）、またはスルホキシド（ＳＯ２）が挙げられる。
【００４９】
ラジカル、置換基、および範囲のために以下に記載した特定かつ好ましい値は、例示するためのみであり、他の定義された値、またはラジカルおよび置換基に対して定義された範囲内の他の値を除外しない。
【００５０】
「アルキル」とは、通常、第２級炭素原子、または第３級炭素原子、または環状炭素原子を含む、Ｃ１−Ｃ１８炭化水素を指す。例としては、メチル（Ｍｅ、−ＣＨ３）、エチル（Ｅｔ、−ＣＨ２ＣＨ３）、１−プロピル（ｎ−Ｐｒ、ｎ−プロピル、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、２−プロピル（ｉ−Ｐｒ、ｉ−プロピル、−ＣＨ（ＣＨ３）２）、１−ブチル（ｎ−Ｂｕ、ｎ−ブチル、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、２−メチル−１−プロピル（ｉ−Ｂｕ、ｉ−ブチル、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２）、２−ブチル（ｓ−Ｂｕ、ｓ−ブチル、−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３）、２−メチル−２−プロピル（ｔ−Ｂｕ、ｔ−ブチル、−Ｃ（ＣＨ３）３）、１−ペンチル（ｎ−ペンチル、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、２−ペンチル（−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、３−ペンチル（−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）２）、２−メチル−２−ブチル（−Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２ＣＨ３）、３−メチル−２−ブチル（−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）２）、３−メチル−１−ブチル（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２）、２−メチル−１−ブチル（−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３）、１−ヘキシル（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、２−ヘキシル（−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、３−ヘキシル（−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３））、２−メチル−２−ペンチル（−Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、３−メチル−２−ペンチル（−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３）、４−メチル−２−ペンチル（−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２）、３−メチル−３−ペンチル（−Ｃ（ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ３）２）、２−メチル−３−ペンチル（−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）２）、２，３−ジメチル−２−ブチル（−Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ（ＣＨ３）２）、３，３−ジメチル−２−ブチル（−ＣＨ（ＣＨ３）Ｃ（ＣＨ３）３が挙げられる。
【００５１】
アルキルは、任意に、１つもしくは複数のアルケニル、アルキリデニル、アルケニルイデニル（ａｌｋｅｎｙｌｉｄｅｎｙｌ）、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、ＮＲｘＲｙおよび／またはＣＯＯＲｘと置換できる。ここで、各ＲｘおよびＲｙは独立して、Ｈ、またはアルキル、またはアルケニル、またはアリール、またはヘテロアリール、または複素環、またはシクロアルキル、またはヒドロキシルである。該アルキルには、任意に、１つもしくは複数の非過酸化物オキシ（−Ｏ−）、またはチオ（−Ｓ−）、またはカルボニル（−Ｃ（＝Ｏ）−）、またはカルボキシ（−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−）、またはスルホニル（ＳＯ）、またはスルホキシド（ＳＯ２）を割り込ませることができる。さらに、該アルキルは、任意に、少なくとも部分的に不飽和であり得、それによって、アルケニルを提供することができる。
【００５２】
「アルケニル」とは、通常、少なくとも１つの不飽和部位、すなわち、炭素−炭素ｓｐ２二重結合を有する、第２級炭素原子、第３級炭素原子、または環状炭素原子を含む、Ｃ２−Ｃ１８炭化水素を指す。例としては、エチレンまたはビニル（−ＣＨ=ＣＨ２）、アリル（−ＣＨ２ＣＨ=ＣＨ２）、シクロペンテニル（−Ｃ５Ｈ７）、および５−ヘキセニル（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ=ＣＨ２）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５３】
該アルケニルは、任意に、１つもしくは複数のアルキル、アルキリデニル、アルケニルイデニル（ａｌｋｅｎｙｌｉｄｅｎｙｌ）、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、ＮＲｘＲｙおよび／またはＣＯＯＲｘと置換できる。ここで、各ＲｘおよびＲｙは独立して、Ｈ、またはアルキル、またはアルケニル、またはアリール、またはヘテロアリール、または複素環、またはシクロアルキル、またはヒドロキシルである。さらに、該アルケニルに、任意に、１つもしくは複数の非過酸化物オキシ（−Ｏ−）、またはチオ（−Ｓ−）、またはカルボニル（−Ｃ（＝Ｏ）−）、またはカルボキシ（−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−）、またはスルホニル（ＳＯ）、またはスルホキシド（ＳＯ２）を割り込ませることができる。
【００５４】
「アルキリデニル」とは、通常、第２級炭素原子、第３級炭素原子、または環状炭素原子を含む、Ｃ１−Ｃ１８炭化水素を指す。例としては、メチリデニル（＝ＣＨ２）、エチリデニル（＝ＣＨＣＨ３）、１−プロピリデニル（＝ＣＨＣＨ２ＣＨ３）、２−プロピリデニル（＝Ｃ（ＣＨ３）２）、１−ブチリデニル（＝ＣＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、２−メチル−１−プロピリデニル（＝ＣＨＣＨ（ＣＨ３）２）、２−ブチリデニル（＝Ｃ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３）、１−ペンチル（＝ＣＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、２−ペンチリデニル（＝Ｃ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、３−ペンチリデニル（＝Ｃ（ＣＨ２ＣＨ３）２）、３−メチル−２−ブチリデニル（＝Ｃ（ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）２）、３−メチル−１−ブチリデニル（＝ＣＨＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２）、２−メチル−１−ブチリデニル（＝ＣＨＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３）、１−ヘキシリデニル（＝ＣＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、２−ヘキシリデニル（＝Ｃ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、３−ヘキシリデニル（＝Ｃ（ＣＨ２ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３））、３−メチル−２−ペンチリデニル（＝Ｃ（ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３）、４−メチル−２−ペンチリデニル（＝Ｃ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２）、２−メチル−３−ペンチリデニル（＝Ｃ（ＣＨ２ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）２）、および３，３−ジメチル−２−ブチリデニル（＝Ｃ（ＣＨ３）Ｃ（ＣＨ３）３が挙げられる。
【００５５】
該アルキリデニルは、任意に、１つもしくは複数のアルキル、アルケニル、アルケニルイデニル（ａｌｋｅｎｙｌｉｄｅｎｙｌ）、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、ＮＲｘＲｙおよび／またはＣＯＯＲｘと置換できる。ここで、各ＲｘおよびＲｙは独立して、Ｈ、またはアルキル、またはアルケニル、またはアリール、またはヘテロアリール、または複素環、またはシクロアルキル、またはヒドロキシルである。さらに、該アルキリデニルに、任意に、１つもしくは複数の非過酸化物オキシ（−Ｏ−）、またはチオ（−Ｓ−）、またはカルボニル（−Ｃ（＝Ｏ）−）、またはカルボキシ（−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−）、またはスルホニル（ＳＯ）、またはスルホキシド（ＳＯ２）を割り込ませることができる。
【００５６】
「アルケニルイデニル（ａｌｋｅｎｙｌｉｄｅｎｙｌ）」とは、通常、少なくとも１つの不飽和部位、すなわち、炭素−炭素ｓｐ２二重結合を有する、第２級炭素原子、第３級炭素原子、または環状炭素原子を含む、Ｃ２−Ｃ１８炭化水素を指す。例としては、アリルイデニル（ａｌｌｙｌｉｄｅｎｙｌ）（＝ＣＨＣＨ=ＣＨ２）、および５−ヘキセニルイデニル（ｈｅｘｅｎｙｌｉｄｅｎｙｌ）（＝ＣＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ=ＣＨ２）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５７】
該アルケニルイデニル（ａｌｋｅｎｙｌｉｄｅｎｙｌ）は、任意に、１つもしくは複数のアルキル、アルケニル、アルキリデニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、ＮＲｘＲｙおよび／またはＣＯＯＲｘと置換できる。ここで、各ＲｘおよびＲｙは独立して、Ｈ、またはアルキル、またはアルケニル、またはアリール、またはヘテロアリール、または複素環、またはシクロアルキル、またはヒドロキシルである。さらに、該アルケニルイデニル（ａｌｋｅｎｙｌｉｄｅｎｙｌ）に、任意に、１つもしくは複数の非過酸化物オキシ（−Ｏ−）、またはチオ（−Ｓ−）、またはカルボニル（−Ｃ（＝Ｏ）−）、またはカルボキシ（−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−）、またはスルホニル（ＳＯ）、またはスルホキシド（ＳＯ２）を割り込ませることができる。
【００５８】
「アルキレン」とは、飽和鎖、分枝鎖もしくは直鎖、または環状の１〜１８個の炭素原子を有し、親アルカンの同一のもしくは異なる炭素原子から２つの水素原子の除去によって得られる２つの一価のラジカル中心を有する、炭化水素基を指す。典型的なアルキレン基は、メチレン（−ＣＨ２−）１，２−エチル（−ＣＨ２ＣＨ２−）、１，３−プロピル（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、１，４−ブチル（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５９】
該アルキレンは、任意に、１つもしくは複数のアルキル、アルケニル、アルキリデニル、アルケニルイデニル（ａｌｋｅｎｙｌｉｄｅｎｙｌ）、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、ＮＲｘＲｙおよび／またはＣＯＯＲｘと置換できでる。ここで、各ＲｘおよびＲｙは独立して、Ｈ、またはアルキル、またはアルケニル、またはアリール、またはヘテロアリール、または複素環、またはシクロアルキル、またはヒドロキシルである。さらに、該アルキレンに、任意に、１つもしくは複数の非過酸化物オキシ（−Ｏ−）、またはチオ（−Ｓ−）、またはカルボニル（−Ｃ（＝Ｏ）−）、またはカルボキシ（−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−）、またはスルホニル（ＳＯ）、またはスルホキシド（ＳＯ２）を割り込ませることができる。また、該アルキレンは、任意に、少なくとも部分的に不飽和であり得、それによって、アルケニレンを提供することができる。
【００６０】
「アルケニレン」とは、不飽和鎖、分枝鎖もしくは直鎖、または環状の２〜１８個の炭素原子を有し、親アルケンの同一のもしくは異なる炭素原子から２つの水素原子の除去によって得られる２つの一価のラジカル中心を有する、炭化水素基を指す。典型的なアルケニレン基としては、１，２−エチレン（−ＣＨ=ＣＨ−）が挙げられるが、これに限定されない。
【００６１】
該アルケニレンは、任意に、１つもしくは複数のアルキル、アルケニル、アルキリデニル、アルケニルイデニル（ａｌｋｅｎｙｌｉｄｅｎｙｌ）、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、ＮＲｘＲｙおよび／またはＣＯＯＲｘと置換できる。ここで、各ＲｘおよびＲｙは独立して、Ｈ、またはアルキル、またはアルケニル、またはアリール、またはヘテロアリール、または複素環、またはシクロアルキル、またはヒドロキシルである。さらに、該アルケニレンに、任意に、１つもしくは複数の非過酸化物オキシ（−Ｏ−）、またはチオ（−Ｓ−）、またはカルボニル（−Ｃ（＝Ｏ）−）、またはカルボキシ（−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−）、またはスルホニル（ＳＯ）、またはスルホキシド（ＳＯ２）を割り込ませることができる。
【００６２】
「アルコキシ」という用語は、アルキル−Ｏ−の基を指し、ここでのアルキルは、前述したように定義される。好ましいアルコキシ基としては、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、ｉｓｏ−プロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｎ−ペンとキシ、ｎ−ヘキソキシ、１，２−ジメチルブトキシ等が挙げられる。
【００６３】
該アルコキシは、任意に、１つもしくは複数のアルキル、アルキリデニル、アルケニルイデニル（ａｌｋｅｎｙｌｉｄｅｎｙｌ）、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、ＮＲｘＲｙおよびＣＯＯＲｘと置換できる。ここで、各ＲｘおよびＲｙは独立して、Ｈ、またはアルキル、またはアリール、またはヘテロアリール、または複素環、またはシクロアルキル、またはヒドロキシルである。
【００６４】
「アリール」という用語は、単環（例えば、フェニル）または多数の縮合（融合）環を有する６個から２０個の炭素原子からなる不飽和芳香族炭素環基を指し、少なくとも１つの環は、芳香族（例えば、ナフチル、ジヒドロフェナントレニル、フルオレニル、またはアントリル）である。好ましいアリールとしては、フェニル、ナフチル等が挙げられる。
【００６５】
該アリールは、任意に、１つもしくは複数のアルキル、アルケニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、ＮＲｘＲｙおよびＣＯＯＲｘと置換できる。ここで、各ＲｘおよびＲｙは独立して、Ｈ、またはアルキル、またはアリール、またはヘテロアリール、または複素環、またはシクロアルキル、またはヒドロキシルである。
【００６６】
「シクロアルキル」という用語は、単一の環状基または多数の縮合環を有する、３個から２０個の炭素原子からなる環状アルキル基を指す。このようなシクロアルキル基としては、例として、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロオクチル等の単一の環状構造、またはアダマンタニル等の多数の環状構造が挙げられる。
【００６７】
該シクロアルキルは、任意に、１つもしくは複数のアルキル、アルケニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、ＮＲｘＲｙおよびＣＯＯＲｘと置換できる。ここで、各ＲｘおよびＲｙは独立して、Ｈ、またはアルキル、またはアリール、またはヘテロアリール、または複素環、またはシクロアルキル、またはヒドロキシルである。
【００６８】
該シクロアルキルは、任意に、少なくとも部分的に不飽和であり得、それによって、シクロアルケニルを提供することができる。
【００６９】
「ハロ」という用語は、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードを指す。同様に、「ハロゲン」という用語は、フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素を指す。
【００７０】
「ハロアルキル」とは、本明細書に定義される１〜４個のハロ基によって置換される本明細書に定義されるアルキルを指し、各ハロ基は、同一または異なり得る。代表的なハロアルキル基としては、例として、トリフルオロメチル、３−フルオロドデシル、１２，１２，１２−トリフルオロドデシル、２−ブロモオクチル、３−ブロモ−６−クロロヘプチル等が挙げられる。
【００７１】
「ヘテロアリール」という用語は、本明細書では、１つ、または２つ、または３つの芳香環を含み、芳香環が少なくとも１つの窒素、または酸素、または硫黄原子を含む、単環式系、または二環式系、または三環式環系として定義される。また、芳香環は、例えば、１つもしくは複数の、特に、ハロ、アルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ハロアルキル、ニトロ、アミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、およびアルキルスルホニル等の１個から３個の置換基で、非置換または置換することができる。ヘテロアリール基の例としては、２Ｈ−ピロリル、３Ｈ−インドリル、４Ｈ−キノリジニル、４ｎＨ−カルバゾリル、アクリジニル、ベンゾ［ｂ］チエニル、ベンゾチアゾリル、β−カルボリニル、カルバゾリル、クロメニル、シンナオリニル、ジベンゾ［ｂ，ｄ］フラニル、フラザニル、フリル、イミダゾリル、イミジゾリル、インダゾリル、インドリシニル、インドリル、イソベンゾフラニル、イソインドリル、イソキノリル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、ナフチリジニル、ナフサ［２，３−ｂ］、オキサゾリル、ペリミジニル、フェナントリジニル、フェナントロリニル、フェナルサジニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサチイニル、フェノキサジニル、フタラジニル、プテリジニル、プリニル、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリジル、ピリミジニル、ピリミジニル、ピロリル、キナゾリニル、キノリル、キノキサリニル、チアジアゾリル、チアントレニル、チアゾリル、チエニル、トリアゾリル、およびキサンテニルが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、該「ヘテロアリール」という用語は、炭素を含み、また、非過酸化物酸素、硫黄、およびＮ（Ｚ）の群から独立して選択される１個、または２個、または３個、または４個のヘテロ原子を含み、５個または６個の環原子を含む単環式芳香族環を示す。ここで、Ｚは、不在またはＨ、またはＯ、またはアルキル、またはフェニル、またはベンジルである。別の実施形態において、ヘテロアリールは、その中から得られる約８個から１０個の環原子のオルト縮合した二環式複素環、特に、ベンズ誘導体、またはそれにプロピレンもしくはテトラメチレンジラジカルを縮合することによって得られたものを示す。
【００７２】
該ヘテロアリールは、任意に、１つもしくは複数のアルキル、アルケニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、ＮＲｘＲｙおよびＣＯＯＲｘと置換できる。ここで、各ＲｘおよびＲｙは独立して、Ｈ、またはアルキル、またはアリール、またはヘテロアリール、または複素環、またはシクロアルキル、またはヒドロキシルである。
【００７３】
「複素環」という用語は、飽和、一部不飽和の環系を指し、酸素、窒素、および硫黄からなる群から選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含み、任意に、アルキルまたはＣ（＝Ｏ）ＯＲｂと置換しうる。ここで、Ｒｂは、水素またはアルキルである。一般に、複素環は、酸素、窒素、および硫黄からなる群から選択される１つもしくは複数のヘテロ原子を含む、単環式基、または二環式基、または三環式基である。複素環基はまた、該環に結合されるオキソ基（＝Ｏ）も含むことができる。複素環基の限定されない例としては、１，３−ジヒドロベンゾフラン、１，３−ジオキソラン、１，４−ジオキサン、１，４−ジチアン、２Ｈ−ピラン、２−ピラゾリン、４Ｈ−ピラン、クロマニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、インドリニル、イソクロマニル、イソインドリニル、モルホリン、ピペラジニル、ピペリジン、ピペリジル、ピラゾリジン、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピロリジン、ピロリン、キヌクリジン、およびチオモルホリンが挙げられる。
【００７４】
該複素環は、任意に、１つもしくは複数のアルキル、アルケニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、ＮＲｘＲｙおよびＣＯＯＲｘと置換できる。ここで、各ＲｘおよびＲｙは独立して、Ｈ、またはアルキル、またはアリール、またはヘテロアリール、または複素環、またはシクロアルキル、またはヒドロキシルである。
【００７５】
窒素複素環およびヘテロアリールの例としては、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インドリジン、イソインドール、インドール、インダゾール、プリン、キノリジン、イソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチルピリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、プテリジン、カルバゾール、カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、フェナントロリン、イソチアゾール、フェナジン、イソオキサゾール、フェノキサジン、フェノチアジン、イミダゾリジン、イミダゾリン、ピペリジン、ピペラジン、インドリン、モルホリノ、ピペリジニル、テトラヒドロフラニル等、ならびに複素環を含むＮ−アルコキシ−窒素が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の１つの特定の実施形態において、該窒素複素環は、３−メチル−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−ピラジノ［３，２，１−ｊｋ］カルバゾール−３−イウムヨージドであり得る。
【００７６】
別の種類の複素環は、式［−（ＣＨ２−）ａＡ−］の１つもしくは複数の反復単位を有する、特定の種類の複素環式化合物を指し、「クラウン化合物」として知られる。ここで、ａは、２もしくはそれ以上であり、Ａは、それぞれ別々に、Ｏ、またはＮ、またはＳ、またはＰであり得る。クラウン化合物の例としては、ほんの一例として、［−（ＣＨ２）３−ＮＨ−］３、［−（（ＣＨ２）２−Ｏ）４−（（ＣＨ２）２−ＮＨ）２］等が挙げられる。一般的に、このようなクラウン化合物は、４個から１０個のヘテロ原子および８個から４０個の炭素原子を有することができる。
【００７７】
「アルカノイル」という用語は、Ｃ（＝Ｏ）Ｒを指し、ここでのＲは、前述したように定義されたアルキル基である。
【００７８】
「アシルオキシ」という用語は、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）Ｒを指し、ここでのＲは、前述したように定義されたアルキル基である。アシルオキシ基の例としては、アセトキシ、プロパノイルオキシ、ブタノイルオキシ、およびペンタノイルオキシが挙げられるが、これらに限定されない。上記に定義された任意のアルキル基を使用して、アシルオキシ基を形成することができる。
【００７９】
「アルコキシカルボニル」という用語は、Ｃ（＝Ｏ）ＯＲを指し、ここでのＲは、前述したように定義されたアルキル基である。
【００８０】
「アミノ」という用語は、−ＮＨ２を指し、「アルキルアミノ」という用語は、−ＮＲ２を指す。ここで、少なくとも１つのＲは、アルキルであり、第２のＲは、アルキルまたは水素である。「アシルアミノ」という用語は、ＲＣ（＝Ｏ）Ｎを指し、ここでのＲは、アルキルまたはアリールである。
【００８１】
「イミノ」という用語は、−Ｃ＝ＮＨを指す。
【００８２】
「ニトロ」という用語は、−ＮＯ２を指す。
【００８３】
「トリフルオロメチル」という用語は、−ＣＦ３を指す。
【００８４】
「トリフルオロメトキシ」という用語は、−ＯＣＦ３を指す。
【００８５】
「シアノ」という用語は、−ＣＮを指す。
【００８６】
「ヒドロキシ」または「ヒドロキシル」という用語は、–ＯＨを指す。
【００８７】
「オキシ」という用語は、−Ｏ−を指す。
【００８８】
「チオ」という用語は、−Ｓ−を指す。
【００８９】
「チオキソ」という用語は、（＝Ｓ）を指す。
【００９０】
「ケト」という用語は、（＝Ｏ）を指す。
【００９１】
上記の基のいずれかについては、１つもしくは複数の置換基を含み、当然ながら、このような基は、立体的に現実的でない、および／または合成的に実現可能でない、いずれの置換または置換型を含まないことが理解される。また、本発明の化合物は、これらの化合物の置換から生じるすべての立体化学的な異性体を含む。
【００９２】
本明細書に記載される化合物内の選択された置換基は、再帰的な程度まで存在する。この文脈では、「再帰的な置換基」とは、ある置換基がそれ自身で再帰的な程度まで存在する別の例を列挙し得ることを意味する。このような置換基の再帰的特性のために、理論上は、多数が任意の所与の特許請求項に存在し得る。医化学分野の当業者は、このような置換基の総数は意図する化合物の所望の性質によって合理的に制限されると理解している。このような性質には、例えば、分子量、または溶解性、またはｌｏｇＰ等の物理的性質、意図する標的に対する活性等の適用性、および合成の容易さ等の実用性が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９３】
再帰的な置換基は、本発明の意図する態様である。医薬および有機化学の分野の当業者は、このような置換基の汎用性を理解している。再帰的な置換基が本発明の請求項に存在する程度まで、上記のように総数を決定する。
【００９４】
本明細書に記載される化合物は、親化合物、または親化合物のプロドラッグ、または親化合物の活性代謝物として、投与することができる。
【００９５】
「プロドラッグ」は、このようなプロドラッグが哺乳類の被検体に投与される場合、生体内で本発明の活性親ドラッグまたは他の製剤または化合物を放出するあらゆる共有結合した物質を含むことを意図する。本発明の化合物のプロドラッグは、例えば、生体内の作用で、親化合物が切断されるような方法で、化合物に存在する官能基を変性することにより調製される。プロドラッグは、本発明の化合物を含み、カルボニル基、またはカルボン酸基、またはヒドロキシ基、またはアミノ基が、プロドラッグが哺乳類の被検体に投与される場合、遊離のカルボニル基、またはカルボン酸基、またはヒドロキシ基、またはアミノ基を形成するために切断されるいずれかの基に結合する。プロドラッグの例としては、本発明の化合物中のアルコールまたはアミン官能基への酢酸誘導体の塩・エステル、ギ酸誘導体の塩・エステル、および安息香酸誘導体の塩・エステル等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９６】
「代謝物」とは、本発明のこのような活性親ドラッグまたは他の製剤または化合物が哺乳類の被検体に投与される場合、生体細胞が、生体内で本発明の活性親ドラッグまたは他の製剤または化合物と相互に作用する生化学過程に起因するあらゆる物質を指す。代謝物は、任意の代謝経路からの生成物または媒介物を含む。
【００９７】
「代謝経路」とは、１つの化合物を別の化合物に変換し、細胞機能のために媒介物・中間体およびエネルギーを提供する一連の酵素媒介反応を指す。代謝経路は、線状または環状であり得る。
【００９８】
明らかに、本発明の多数の変性および変化が、上記の教示を考慮に入れると可能である。したがって、添付の請求項の範囲内で、本発明は、本明細書に具体的に記載される以外にも実行され得る。
【００９９】
医学的適応
ＥＲストレス誘導細胞死を阻害する、本発明の化合物は、次のＥＲストレス関連疾患、症状、および障害の治療に用いられうる：神経疾患、代謝性疾患、虚血障害、心臓および循環系損傷、ウイルス感染、アテローム性動脈硬化、双極性疾患、およびバッテン病。神経疾患には、家族性アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病（ｐｏｌｙＱ疾患）、球脊髄性筋萎縮症／ケネディ病（ｐｏｌｙＱ疾患）、脊髄小脳失調症３型／マシャド・ジョセフ病（ｐｏｌｙＱ疾患）、プリオン病、筋萎縮性側索硬化症、およびＧＭ１ガングリオシドーシスが含まれるが、これらに限定されない。代謝性疾患には、糖尿病、ウォルコツト・ラリソン症候群、ウォフラム症候群、２型糖尿病、ホモシステイン血症、Ｚα１−抗トリプシン欠乏症封入体筋炎、および遺伝性チロシン血症１型が含まれるが、これらに限定されない。心臓および循環系損傷には、心肥大、低酸素性障害、および家族性高コレステロール血症が含まれるが、これらに限定されない。
【０１００】
医薬組成物
本発明の化合物は、医薬組成物として処方され得、選ばれた投与経路、すなわち、経口または非経口で、筋肉内、静脈内、局所、または皮下経路に適応した様々な形態で、ヒト患者等、哺乳類の宿主に投与され得る。
【０１０１】
本化合物は、例えば、不活性希釈剤または吸収可能な食用の担体等の薬剤として許容される媒体と併用して、経口で全身に投与されてもよい。それらは、硬質または軟質ゼラチンカプセルに充填し、錠剤に圧縮し、または患者の食事の食物と共に直接取り込んでもよい。経口投与に関しては、該活性化合物は、１つもしくは複数の賦形剤と組み合わせて、および摂取可能な錠剤、口腔錠、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、ウエハース等の形態で使用されてもよい。このような組成物および調製物は、少なくとも０．１％の活性化合物を含まなければならない。該組成物および調製物の割合は、当然ながら、異なり、適宜に、所与の単位剤形の重量の約２％から約６０％の間にあり得る。このような有用な組成物における活性化合物の量は、有効な用量レベルが得られるようなものである。
【０１０２】
錠剤、トローチ、ピル、カプセル等はまた、トラガカント、アカシア、コーンスターチ、またはゼラチン等の結合剤；リン酸二カルシウム等の賦形剤；コーンスターチ、デンプン、アルギン酸等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤；およびスクロース、もしくはフルクトース、もしくはラクトース、もしくはアスパルテーム等の甘味剤を含有してもよく、ペパーミント、もしくは冬緑油、もしくはチェリー風味等の香味剤を加えてもよい。単位剤形がカプセルである場合は、上記のタイプの材料のほかに、植物油またはポリエチレングリコール等の液体担体を含有してもよい。様々な他の材料が、コーティングとして、または固体単位剤形の物理的形態を変化させるために存在する可能性がある。例えば、錠剤、またはピル、またはカプセルは、ゼラチン、またはワックス、またはシェラック、または糖等でコーティングされてもよい。シロップ剤もしくはエリキシル剤は、該活性化合物、甘味剤としてスクロースもしくはフルクトース、保存剤としてメチルおよびプロピルパラベン、染料およびチェリーまたはオレンジフレーバー等の香味料を含有してもよい。当然ながら、任意の単位剤形を調製する際に使用されるあらゆる物質は、用いた量で薬剤として許容され得るかつ実質的に非毒性であるべきである。さらに、該活性化合物は、徐放性剤および装置に導入されてもよい。
【０１０３】
該活性化合物はまた、点滴または注射によって、静脈もしくは腹膜に投与され得る。該活性化合物またはその塩の溶液は、水で調製され得、任意に、非毒性界面活性剤と混合され得る。分散剤はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、トリアセチン、およびそれらの混合物中、および油中で調製され得る。貯蔵および使用に関する通常の条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防御するために保存剤を含有し得る。
【０１０４】
注射または点滴のために好適な医薬剤形は、滅菌注射剤もしくは点滴剤または分散剤の即席調製物に適合され、任意に、リポソームで封入された活性成分を含む滅菌水性溶液または分散剤または滅菌粉末を含むことができる。すべてのケースにおいて、最終的な剤形は、製造および貯蔵の条件下で、滅菌、液状および安定であるべきである。液体担体または媒体は、溶媒または液体分散媒、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）、植物油、非毒性グリセリルエステルおよびそれらの好適な混合物であり得る。適当な液体性は、例えば、リポソームの形成によって、分散剤の場合において所望の粒子サイズの維持によって、または界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用を防止することは、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロザール等によって得られる。多くの場合、等張剤、例えば、糖または緩衝液または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射し得る組成物の長期吸収は、吸収を遅延する剤、例えば、ステアリン酸アルミニウム（Ｉ）およびゼラチンを組成物に使用することによってもたらされ得る。
【０１０５】
滅菌注射剤は、上記列挙した様々な他の成分と共に適当な溶媒中に所望の量で、活性化合物を導入することによって調製され、必要に応じ、滅菌濾過され得る。滅菌注射剤の調製のための滅菌粉末の場合では、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥技術であり、これにより、活性成分、ならびに先の滅菌濾過溶液中に存在するあらゆる追加の所望の成分の粉末が得られる。
【０１０６】
局所投与のために、本化合物が液体である場合、純粋な形態で適用され得る。しかしながら、広く、それらは、組成物または配合物として、皮膚化学的に許容される担体と併用して、皮膚に投与することが望まれ、これは、固体または液体で存在してもよい。
【０１０７】
有用な固体担体は、細かく分割された固体、例えば、タルク、クレイ、微小結晶性セルロース、シリカ、アルミナ等を含む。有用な液体担体は、水またはアルコールまたはグリコール、または水−アルコール／グリコール混合物を含み、この中で本化合物は、有効レベルで、任意に非毒性界面活性剤の助けによって、溶解され得るか、分散され得る。香料等の佐剤および追加の抗菌剤は、所与の使用に対して性質を最適化するために添加することができる。得られる液体組成物は、包帯および他の包帯剤を浸透するため吸収パッドに適用されるか、または、ポンプタイプまたはエアゾールスプレーを用いて罹患箇所に噴霧され得る。
【０１０８】
増粘剤、例えば、合成ポリマー、または脂肪酸、または脂肪酸塩およびエステル、または脂肪アルコール、または修飾されたセルロースまたは修飾された天然物質はまた、使用者の皮膚に直接適用するために、散布可能なペースト、ゲル、軟膏、石鹸等を形成するように、液体担体と共に用いることができる。
【０１０９】
本発明の化合物の有用な用量は、動物モデルにおける生体内活性と体外活性とを比較することによって決定され得る。マウスおよび他の動物における有効用量のヒトへの外挿法が、例えば、米国特許第４，９３８，９４９号で、当業者に知られている。
【０１１０】
一般的に、ローション等の液体組成物中の、本発明の化合物の濃度は、約０．１〜２５重量％、好ましくは、約０．５〜１０重量％である。半固体または固体組成物中の濃度は、約０．１〜５重量％、好ましくは約０．５〜２．５重量％である。
【０１１１】
単独または他の化合物と共に使用するのに必要な、該化合物の量、またはその活性塩もしくは誘導体の量は、選択される特定の塩によってだけでなく、投与の経路、治療される病気の特性および患者の年齢および健康状態によっても変化し、最終的には内科医または臨床医の裁量による。
【０１１２】
しかしながら、一般的には、好適な用量は、１日あたり、体重の約０．５〜約１００ｍｇ／ｋｇ、例えば、１日あたり、患者の体重の約１０〜約７５ｍｇ／ｋｇ、１日あたり、３〜約５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、６〜９０ｍｇ／ｋｇ／日、最も好ましくは１５〜６０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。
【０１１３】
本化合物は、単位剤形で投与されるのが便利であり得る、例えば、単位剤形あたり、活性成分が５〜１０００ｍｇ、有利には１０〜７５０ｍｇ、最も有利には５０〜５００ｍｇ存在する。
【０１１４】
該活性成分は、該活性化合物のピーク血漿濃度、約０．５〜約７５μＭ、好ましくは、約１〜５０μＭ、最も好ましくは、約２〜約３０μＭを達成するために投与され得る。これは、例えば、該活性成分の０．０５〜５％の溶液、任意に、生理食塩水中で静脈注射によって達成されるか、または約１〜１００ｍｇの活性成分を含むボーラス投与として経口投与され得る。所望の血液レベルは、約０．０１〜５．０ｍｇ／ｋｇ／時間を供する持続注入によって維持されるか、約０．４〜１５ｍｇ／ｋｇの活性成分を含む間欠性の点滴によって維持され得る。
【０１１５】
所望の用量は、単回用量、または適切な間隔、例えば、１日あたり、２、または３、または４、またはそれ以上の分割投与量として投与される分割用量として、適切に与えられ得る。分割投与量それ自身は、吸入器からの複数回吸入または眼への複数回滴の用途によっては、さらなる分割、例えば、いくつかの不連続な間隔をおいての投与であってもよい。
【０１１６】
本発明は、以下の限定されない実施例によってさらに詳細に説明される。
【実施例１】
【０１１７】
ＥＲストレス（他の細胞死経路ではない）の結果として特異的に誘導された細胞死を遮断する化合物は、内在する機構を問いただすため、ならびにＥＲストレスが細胞死および組織障害に関与する事象を引き起こす動物モデルにおいて生体内で解明するために、有用であろう。この取り組みにより、最近、ツニカマイシン（ＥＲストレスを誘導するＮ結合型糖鎖合成の阻害剤）により誘導される神経細胞死の化学阻害剤に対するスクリーニングが行われ、セリン５１上でｅＩＦ２αの脱リン酸化に関与するタンパク質ホスファターゼを抑制する化合物が同定された。さらには、この化合物がリン酸化されたｅＩＦ２αの蓄積を増加し、ＥＲストレスのいくつかの誘導剤により誘導されるアポトーシスからの保護を提供することが、刊行物に示された（Ｂｏｙｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０７：９３５−９３９，２００５）。興味深いことに、明白に特徴付けられたプロトタイプ化合物（サルブリナル）は、ホスファターゼの活性部位阻害剤ではないがむしろ、ＧＡＤＤ３５およびタンパク質ホスファターゼ−１（ＰＰ１）を含む複合体を特異的に阻害し、それによって、基質リン−ｅＩＦ２αへのＰＰ１のＧＡＤＤ３４媒介標的を阻止する。
【０１１８】
我々は、ＥＲストレスにより誘導される細胞死を遮断する化合物の同定のための代替スクリーニングアッセイを考案し、化合物のライブラリにスクリーニングを行い、それによって、このアプローチを検証した。
【０１１９】
ＥＲストレスに関連する細胞死が、いくつかの神経系疾患の顕著な特徴であるため、我々は、神経細胞を利用する一次化学ライブラリスクリーニングアッセイを開発することに焦点を当てた。ＣＳＭ１４．１は、ＳＶ４０大型Ｔ抗原の温度感受性変異体を用いて、不死化により構築されたラット線条体神経前駆細胞株である（Ｚｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：４５３３−４５３７，１９９３、Ｈａａｓ ａｎｄ Ｗｒｅｅ，Ｊ．Ａｎａｔ．，２０１：６１−６９，２００２）。許容温度（最適３２℃で）で該細胞が増殖し、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）アッセイ用の標準培地中で、容易に増殖させることができる。３９℃の非許容温度で培養した場合、大型Ｔ抗原は不活性であり、該細胞は増殖を停止し、分化して成熟ドーパミン作動性ニューロンの性質を有するニューロンを生成する（Ｚｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：４５３３−４５３７，１９９３、Ｈａａｓ ａｎｄ Ｗｒｅｅ，Ｊ．Ａｎａｔ．，２０１：６１−６９， ２００２）。
【０１２０】
大規模なスクリーニング実験と関連し得る温度の一時的な低下は、大型Ｔ活性を修復することができるため、我々は、未分化ＣＳＭ１４．１細胞を用いて、まずＨＴＳを開発し、その後、分化細胞を用いてヒットを確認するための計画を選んだ。細胞死をモニタリングするために、複雑な細胞処理過程を必要としない、細胞内ＡＴＰ含有量を測定する商業的に入手可能な生物発光試薬を用いた（ＡＴＰｌｉｔｅ，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）。したがって、ＡＴＰは、一次アッセイの細胞生存の指示薬として用いた。ＥＲストレスを誘導することで知られる刺激物を用いて細胞死を引き起こすために、我々は、タプシガルジン（ＴＧ）を選択した。これは、ＥＲのＣａ２＋−ＡＴＰａｓｅを不可逆的に阻害するセスキテルペンラクトンである（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．，２１２：８４−９２，１９９４、Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ ａｎｄ Ｋａｎｅｋｏ，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔ．，１７：９６９−９７０，１９９３）。
【０１２１】
パイロット実験において、未分化ＣＳＭ１４．１細胞を、９６ウェルプレートのウェル中に、様々な密度で播種し、一晩培養し、その後、細胞のＡＴＰ含有量を、発光性のＡＴＰｌｉｔｅ試薬を用いて測定した（図４Ａ）。また、ウェルあたり３，０００の細胞で、ＣＳＭ１４．１細胞を培養し、その後、様々な濃度のＴＧまたはＳａｌで細胞を処理し、１８時間培養した後、ＡＴＰ含有量を測定することによって、タプシガルジンに対する用量反応実験を行った（図４Ｂ）、（平均＋標準偏差；ｎ＝３）。同様に、サルブリナル（Ｓａｌ）に対する用量反応実験を行った。上記のように細胞を播種、培養し、その後、様々な濃度のサルブリナル、次いで２時間後、１５ｕＭのＴＧで、細胞を処理した。細胞を１８時間培養し、その後、ＡＴＰ含有量を測定した（平均＋標準偏差；ｎ＝３）（図４Ｃ）。ウェル（９６ウェル、平底、ポリスチレンプラスチックプレート）あたり３，０００の細胞は、十分なシグナルを提供し、１５μＭのタプシガルジン（ＴＧ）は、ウェルあたり約９５％のＡＴＰの低下をもたらすと判断された。これは、独立した生体染色色素排除アッセイを用いて、約９５％の細胞殺滅と相関することが確認された。対照（コントロール）として、我々は、サルブリナルを利用した。これは、ＥＲストレス誘導細胞死を遮断することが報告されていた（Ｂｏｙｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０７：９３５−９３９，２００５）。細胞の生存量を見るため、未分化ＣＳＭ１４．１細胞を用いてＡＴＰを測定したところ、サルブリナル（１００μＭ）は、ＴＧにより誘導される細胞死から細胞を有意に保護した（図４）。
【０１２２】
我々は、ＴＧにより誘導される細胞死に対するサルブリナルによる保護について、未分化と分化ＣＳＭ１４．１ニューロンを比較した。図５は、ＴＧがＣＳＭ１４．１細胞を殺滅し、サルブリナルがＣＳＭ１４．１細胞を保護することを示す。未分化または分化ＣＳＭ１４．１細胞を、ポリスチレン（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ Ｏｎｅ、ポリスチレン、白壁、平底、ｌｕｍｉｔｒａｃ、高結合）製の９６ウェル平底マイクロタイタープレート中の４０μＬのＤＭＥＭ培地（１０％の血清、１ｍＭのＬ−グルタミン、および抗生物質を含有する）内に、３，０００細胞／ウェルの密度で播種した。３２℃で一晩インキュベーションした後、ＤＭＳＯ（０．５％ｖ／ｖ）またはＤＭＳＯ中の１００μＭのサルブリナル（Ｓａｌ）を与えた。２時間後、ＤＭＥＭ培地内の１５０μＭのＴＧ中５ｕＬの原液に、０．７５％（ｖ：ｖ）ＤＭＳＯを含有させ、約１５μＭの最終濃度を達成した。２４時間培養した後、細胞内ＡＴＰ含有量を、ＡＴＰｌｉｔｅ溶液（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）をウェルあたり２０μＬ加え、プレートを室温で３分間インキュベートし、その後、Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ Ｍｏｏｎｌｉｇｈｔモデル３０９６）で読み込むことにより測定した。ＤＭＳＯのみで処理した細胞中のＡＴＰ含有量は、比較の対照として用いられ、この対照に対する相対的な割合として結果を示した。
【０１２３】
ＡＴＰ含有量アッセイの再現性を判定するために、９６ウェルプレートを調製し、そのうちのウェルの半分に、ＴＧ＋ＤＭＳＯ（アッセイの最小）を添加し、別の半分に、ＴＧ＋サルブリナル（アッセイの最大）を添加し、その後、未分化ＣＳＭ１４．１細胞を用いて、ＡＴＰ含有量試験を行った（図６）。ＣＳＭ１４．１細胞を、９６ウェル平底プレート中のウェルあたり３，０００の細胞で一晩培養し、その後、ＤＭＳＯ（最終濃度０．５％）あるいはＤＭＳＯ（最終濃度０．５％）中のサルブリナル（１００μＭ）のいずれかをウェルの半分に加えた（それぞれ４８）。２時間後、ＴＧをすべてのウェルに加えた（最終１５μＭ）。細胞を２４時間培養し、その後、該ＡＴＰ含有量をＡＴＰｌｉｔｅ ｌｕｍｉｎｏｇｅｎｉｃアッセイを用いて測定した。その後、９６ウェルプレートのマイクロウェルにアッセイ成分を自動添加するために、Ｂｉｏｍｅｘ（商標） ＦＸリキッドハンドラーを用いて、ハイスループット環境にこのアッセイを適応させた。第１に、未分化ＣＳＭ１４．１細胞は、約３×１０６細胞を生成させるために、１５０ｍｍ×２５ｍｍのポリスチレン培養ディッシュ中に、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１％のペニシリン／ストレプトマイシン、および１％のＬ−グルタミンで補完したＤＭＥＭ培地で、３２℃で生育させた。第２に、ＣＳＭ１４．１細胞は、８０〜９０％コンフルエンスになったとき、トリプシン処理によって培地から取り出し、２％のＦＢＳ、１ｍＭのＬ−グルタミン、ペニシリン１００ＩＵ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを抗生物質として含有するＤＭＥＭ培地内に、７．５×１０４細胞／ｍＬで懸濁した。第３に、該細胞懸濁液は、その後、９６ウェルプラスチックマイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ Ｏｎｅ、ポリスチレン、白壁、平底、ｌｕｍｉｔｒａｃ、高結合、ｃａｔ＃６５５０７４）にウェルあたり４０μＬで与え、該プレートを、９５％大気：５％ＣＯ２中で、湿気環境下、３２℃で一晩培養した。第４に、自動リキッドハンドラーを用いて、１０％ＤＭＳＯ中の５μＬの試験化合物を、９６ウェルプレートの２〜１１列（１および１２列はそのまま）のウェルに加え、ほぼ最終濃度の１５μｇ／ｍＬの試験化合物および最終濃度１％のＤＭＳＯを達成した。第５に、１０％ ＤＭＳＯ：９０％ ＤＭＥＭの溶液中の５μＬの１ｍＭのサルブリナルを、それぞれのプレートの１列／Ａ〜Ｄ行のウェルに加える一方で、５μＬの１０％ ＤＭＳＯ：９０％ ＤＭＥＭ溶液を、１列／Ｅ〜Ｈ行に対応するウェルおよび１２列のすべてのウェル加えた。第６に、該プレートを培養に戻した。第７に、２時間後、自動リキッドハンドラーを用いて、０．７５％ＤＭＳＯを含有させ、ＤＭＥＭ内で１５０μＭのＴＧの原液をウェルあたり５μＬで分注した。したがって、１〜１１列で最終濃度の約１５μＭのＴＧを達成し、データ比較の対照として、１２列を残した（１％ＤＭＳＯ／ＴＧなし）。第８に、該プレートを、該インキュベーターに戻し、２４時間培養した。第９に、液体ディスペンサー（Ｗｅｌｌ ＭａｔｅＴＭ ［Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ］）を用いて、２０μＬのＡＴＰｌｉｔｅ溶液をウェルごとに分注した。第１０に、プレートを、Ｃｒｉｔｅｒｉｏ−Ａｎａｌｙｓｔ（商標） ＨＴマイクロプレートレコーダーを用いて、３０分以内に読み込んだ。典型的に、シグナル：ノイズ比は、＞７：１であり、Ｚ’因子は、＞０．７であり、該アッセイ方法は、ＨＴＳに好適であることが示唆された。
【０１２４】
スクリーニングデータの質を評価するために、Ｚ’因子を、確立された式（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎ．４：６７−７３，１９９９）を用いて、それぞれのプレート、および全実験に対して算出し、すべてのプレートに対する最小対照（ＤＭＳＯのみ）および最大対照（サルブリナル）の結果を総計した。
【０１２５】
図７は、２０のプレートでのアッセイ品質対照解析のデータの一例を示し、ＤＭＳＯ対照のウェル（ｘ軸）およびサルブリナル対照のウェル（ｘ軸）に対して相対発光強度単位（ＲＬＵ）（ｙ軸）として測定されたＡＴＰｌｉｔｅの結果をプロットし、ＨＴＳアッセイの最小対照および最大対照を示す。すべてのウェルに、ＴＧを添加した。これらの２０のプレートに関して、平均シグナル：ノイズ比は、３１であり、Ｚ’因子は、０．７４であった。
【０１２６】
化学ライブラリをスクリーニングするための基本的方法は、以下のとおりであった。１日目に、不死化されたＣＳＭ１４．１細胞を、２％のＦＢＳおよび抗生物質で補完した４０μｌのＤＭＥＭ中で、白９６ウェルプレート中にウェルあたり３×１０３の細胞を播種し、次いで、一晩インキュベーションした。２日目に、自動リキッドハンドラーを用いて、５μｌの化合物をプレートに加えた（１％のＤＭＳＯ中最終１５ｍｇ／ｍｌ）。２時間後、細胞をタプシガルジンで処理した（最終１５ｍＭ）。２４時間後、発光アッセイを用いて、細胞質ＡＴＰレベルを測定した。細胞質ＡＴＰ活性は、未処理の対照細胞と比較した相対生存率として解釈された。スクリーニングの質を評価するために、それぞれのプレートのＺプライム（Ｚ’）因子が算出された。
【０１２７】
本アッセイを用いて、５０，０００の化合物（ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ）のインハウスライブラリをスクリーニングした。典型的なプレートに対する結果を図９ａに提供する。この図は、５０，０００の化合物（ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ）のインハウスライブラリの典型的なスクリーニングからの未加工データを示し、１つの有効なヒット化合物（太字）を示す。ＣＳＭ１４．１細胞を、ＤＭＳＯ（最終１％）（１２列）、またはタプシガルジン（１列Ｅ〜Ｈ行）と組み合わせたＤＭＳＯ、またはタプシガルジン（１列Ａ〜Ｄ行）と組み合わせた１００ｍＭのサルブリナルで処理した。８列Ｇ行でウェル中の化合物は、生存率９８．９％に相当する。未加工データの正規化は、１２列の（相対発光強度単位中の）ＡＴＰｌｉｔｅシグナルを平均化することにより達成され、１％のＤＭＳＯを与えられたがＴＧを与えられなかった細胞からの値を１００と設定した。他のすべての未加工データ値を、その後、この平均数（１２列で得た）で除し、１００を乗じた。図９ｂは、データの正規化後、典型的なアッセイプレートに対するスクリーニング結果の一例を示す。
【０１２８】
図１０は、データの正規化後のスクリーニング結果の一例を表示するグラフである。相対ＡＴＰ含有量（ｙ軸）は、ウェル番号（１−９６［Ａ１からＨ１２］）（ｘ軸）に対してプロットされる。ウェルＡ１からＤ１は、アッセイ最大対照（サルブリナル＋ＴＧを与えられた）であり、ウェルＥ１〜Ｈ１は、アッセイ最小対照（ＤＭＳＯ＋ＴＧを与えられた）であり、ウェルＡ１２〜Ｈ１２（１２列）は、正規化対照（ＴＧなしでＤＭＳＯを与えられた）である。ウェルＡ１２〜Ｈ１２の平均ＡＴＰ含有量を算出し、データの正規化に用いた。算出されたＺ’因子は、本プレートに対して０．８７であった（Ｚ’因子が０．５より大きく１．０未満である場合、アッセイは、非常に安定していると見なされる）。ヒット化合物は、ウェルＧ８（矢印）に認められる。ｚプライム因子を評価するために、ＤＭＳＯ対照試料の未加工値を「対照」として用い、タプシガルジンで処理された試料（１列Ｅ〜Ｈ行）の未加工値を、ｚプライム因子の等式において、「試料」として用いた。該Ｚ値が０．５を超え、１．０より下回る場合、アッセイが非常に安定していると見なす。
【０１２９】
５０，０００の化合物のスクリーニングから、９３の化合物が、＞５０％の生存率でＣＳＭ１４．１を守ったことを確認した（前記表１）。その後、これらの９３ヒットに対して同一の一次アッセイを用いて、用量反応実験を行い、適切な用量反応挙動を示す、＜２５μＭのＩＣ５０（５０％のＡＴＰ含有量を守るための有効量）を有する２６の化合物を同定した（表１２）。
【表１２】
【０１３０】
図１１は、弱活性（Ｃ）または部分阻害（Ｄ）のため、処分された２つの化合物と共に、２つのヒット化合物によりＥＲストレス誘導細胞死の用量依存的阻害を示す。未分化ＣＳＭ１４．１細胞は、タプシガルジン（１５μＭ）および様々な濃度の４種のヒット化合物（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）で処理された。データは、３つの独立した実験を代表する。
【０１３１】
図１２は、サルブリナルが、タプシガルジンにより誘導される細胞死を阻害するに際して、我々のヒット化合物よりも有効性が低いことを示す。ＣＳＭ１４．１細胞を、９６ウェルプレート中で、ウェルあたり３×１０３細胞の密度で播種し、一晩インキュベートした。指示された濃度のサルブリナルで該細胞を２時間プレインキュベートし、次いで、７．５ｍＭのタプシガルジンで処理した。１８時間後、細胞死率を、ＭＴＳアッセイにより測定した。ＭＴＳアッセイのために、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６（登録商標）Ａｑｕｅｏｕｓ Ｎｏｎ−ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた。製造業者のプロトコルにより反応溶液を作製し、９６ウェルプレートの処理されたそれぞれのウェルは、２０μｌの反応溶液でインキュベートされた。プレートは、３７℃で、５％ ＣＯ２を有する加湿細胞インキュベーターで２時間インキュベートし、それぞれのウェルの吸光度を、４９０ｎｍの波長で、ＥＬＩＳＡプレートリーダーにより読み込んだ。バックグラウンドの吸光度レベルを判定するために、同一体積の培地（細胞を含まないＤＭＥＭ）を、ＭＴＳ溶液でインキュベートした。バックグラウンド値は、それぞれのウェルの値から減じた。対照処理（ＴＧなし、Ｓａｌなし）ウェルからのバックグラウンド値を、１００％の生存として設定し、実験のウェル値を、対照値に対する割合として評価した。
【０１３２】
図１３は、我々のヒット化合物がツニカマイシンにより誘導される細胞死を阻害する効率をサルブリナルと比較する。ＣＳＭ１４．１細胞を、９６ウェルプレート中で３×１０３細胞／ウェルの密度で播種し、一晩インキュベートした。細胞を、２５μＭのそれぞれの化合物または１００μＭのサルブリナルで２時間プレインキュベートし、次いで、１０ｍｇ／ｍｌのツニカマイシンで処理した。７２時間後、細胞死率を、フローサイトメトリー解析により測定した。アネクシンＶ陰性集団は、生存者と見なされた。図１３において、白いバーは、０．５％のＤＭＳＯ対照を示し、２４％の生存率を示した。グレーのバーは、１００μＭのサルブリナルを示す。黒いバーは、それぞれの化合物（２５μＭ）からのデータである（化合物番号は、表１２中の化合物を指す）。１００μＭの濃度のサルブリナルは、ＴＧにより誘導される細胞死を７５％阻害し、我々のスクリーニングにより同定されたヒット化合物のいくつかは、３倍低い濃度で同等以上の阻害をした。
【０１３３】
表１２に示される２６の化合物のうち１６は、その後、ＴＧにより誘導される細胞死から分化ＣＳＭ１４．１細胞を保護することが確認された。これらのアッセイのために、ＣＳＭ１４．１細胞を、３９℃の非許容温度で、２％のＦＢＳ中で７日間培養することにより、分化させた。図１４は、未分化ＣＳＭ１４．１神経細胞対分化ＣＳＭ１４．１神経細胞を用いた、化合物の細胞保護活性の比較を示す。ＣＳＭ１４．１細胞を、９６ウェルプレート中にウェルあたり１，５００の細胞で播種し、３２℃（許容温度、図１４、左）または３９℃（非許容温度、図１４、右）で、７日間一晩培養した。様々なヒット化合物を、２５μＭの最終濃度で加え、次いで、２時間後、１５μＭの最終濃度でＴＧを加えた。ＡＴＰ含有量を測定し、データは、１％のＤＭＳＯ（平均＋標準偏差；ｎ＝３）でのみ処理された対照細胞に対する割合として表した。２パーセントのＦＢＳが、分化中用いられたが、すべてのアッセイは、１０％のＦＢＳ中で行われた。
【０１３４】
化合物が様々な系統の細胞を広く、または神経細胞のみを保護するかを調査するために、ＴＧにより誘導される細胞死からＣＳＭ１４．１（神経細胞）およびＪｕｒｋａｔ（リンパ細胞）細胞株を守る能力を、２６のヒットすべてで試験した。ＣＳＭ１４．１細胞およびＪｕｒｋａｔ細胞で試験された２６の化合物のうち、３つの化合物が、両方の細胞株に対する保護を示した。図１５は、ＣＳＭ１４．１細胞対Ｊｕｒｋａｔ細胞の細胞保護活性に対する２６の化合物のうちの３つを比較するデータの一例を示す。ＣＳＭ１４．１細胞（図１５、左）およびＪｕｒｋａｔ細胞（図１５、右）をそれぞれ、９６ウェルプレート中で、ウェルあたり３，０００の細胞またはウェルあたり３０，０００の細胞で、一晩培養した。ウェルには、ＤＭＳＯのみ、またはＤＭＳＯ中の２５μＭの化合物を与え、次いで、ＴＧ（１５μＭ）の有りまたは無しで処理した。２４時間培養した後、ＡＴＰ含有量を測定し、ＤＭＳＯ（平均＋標準偏差、ｎ＝３）でのみ処理された細胞に対する対照の割合としてのデータを表した。該データは、化合物のうちの１つは、ＴＧにより誘導される細胞死からＣＳＭ１４．１を保護するが、Ｊｕｒｋａｔ細胞は保護しないことを明らかにする（ＡＴＰｌｉｔｅアッセイにより測定された）。２６の化合物のうち３つのみが、３つの細胞系統をすべて保護したので、本明細書で利用されたアッセイは、活性における組織特異性の差異を有する化合物を同定する能力（考慮すべき利益および実用性の性質）を有し得る。あるいは、該化合物は、ＣＳＭ１４．１細胞が、ラット起源だが、ＨｅＬａ細胞およびＪｕｒｋａｔ細胞はヒト起源であるため、種特異性の差異を検出し得る。
【０１３５】
細胞の生存を評価するためのいくつかの代替的方法は、生物発光ＡＴＰアッセイの特性のため、ヒットが、本当に細胞保護であり、偽陽性を示さないことを確認するための二次アッセイとして利用され得る。例えば、ＴＧ誘導殺戮に対する保護を確認するために、ＡＴＰ含有量アッセイとは独立した方法により細胞の生存割合を評価すべく、我々が利用している１つの方法は、蛍光色素接合したアネクシンＶを用いたフローサイトメトリー解析である。
【０１３６】
図１６および１７は、化合物の細胞保護活性を評価するための二次アッセイの結果を示す。図１６では、未分化ＣＳＭ１４．１細胞を、２４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ Ｏｎｅ）でウェルあたり１０４細胞で培養した。翌日、ＤＭＳＯ（ａ、ｂ）（１％の最終容積）、１００μＭのサルブリナル（ｃ、ｄ）、あるいは２５μＭのヒット化合物（１％の最終ＤＭＳＯ）を加えた。２時間後、１５μＭのＴＧを、ａおよびｃを除く全てのウェルに加えた。従来のＡＴＰアッセイを行い、生存率を測定した。図１７では、未分化ＣＳＭ１４．１細胞を、２４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ Ｏｎｅ）でウェルあたり１０４細胞で培養した。翌日、ＤＭＳＯ（ａ、ｂ）（１％の最終容積）、１００μＭのサルブリナル（ｃ、ｄ）、あるいは２５μＭのヒット化合物（１％の最終ＤＭＳＯ）を加えた。２時間後、１５μＭのＴＧをａおよびｃを除く全てのウェルに加えた。該プレートを再度２４時間培養し、その後、細胞を、トリプシン処理により回収し、１．５ｍｌの微小遠心管に移し、０．２５μｇ／ｍＬのアネクシンＶ−ＦＩＴＣ（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ）およびヨウ化プロピジウムを含有する、０．５ｍＬのアネクシンＶ結合溶液中に再懸濁した。アネクシンＶ陰性細胞の割合は、ＦＡＣＳｏｒｔ装置（Ｂｅｃｋｔｏｎ–Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて、フローサイトメトリー（ｙ軸）により決定した。該化合物のうちの２つ（＃３および＃１４）は、活性が少なかったが、すべての２６の化合物は、アネクシンＶ染色で測定されたように、ＴＧにより誘導される細胞死を保護した。
【０１３７】
ＥＲストレスにより誘導される細胞死の抑制に対する化合物の選択性は、ＥＲストレス経路（タプシガルジン、ツニカマイシン）、またはミトコンドリア経路（ＶＰ１６）、または死受容体経路（ＴＮＦ＋シクロヘキシミド［ＣＨＸ］）を介してアポトーシスを誘導する様々な薬剤で未分化ＣＳＭ１４．１細胞を処理することにより、判定された。試験した２６のヒット化合物のうちの１９のヒット化合物が、タプシガルジンおよびツニカマイシンにより誘導される細胞死を減少させたが、ＶＰ１６またはＴＮＦ／ＣＨＸにより誘導される細胞死は減少させなかった。
【０１３８】
図１８は、表１３に記載された様々なヒット化合物の結果の例を示す。
【表１３】
【０１３９】
図１８に示された実験のために、未分化ＣＳＭ１４．１細胞を、９６ウェルプレート（ＡＴＰアッセイ用）中でウェルあたり３，０００の細胞、または２４ウェルプレート（フローサイトメトリー用）中でウェルあたり１×１０４細胞で播種した。翌日、細胞を、ＤＭＳＯ（０．５％）または０．５％ＤＭＳＯ（最終濃度）中の２５μＭのヒット化合物で２時間処理し、次いで、１５μＭのタプシガルジン（ＴＧ）で２４時間、１０μｇ／ｍＬのツニカマイシン（ＴＵ）で７２時間、２．５μＭのスタウロスポリン（ＳＴＳ）で２４時間、５０μＭのＶＰ１６で４８時間、あるいは３０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ＋１０μｇ／ｍＬのシクロヘキサミド（ＣＨＸ）で２４時間を含む、細胞死を誘導する様々な試薬で処理した。細胞内ＡＴＰ含有量は、スタウロスポリンの試料およびＴＮＦ／ＣＨＸ試料に対して測定し、ＤＭＳＯのみ（対照）で処置した細胞に対してデータを正規化し、対照に対する割合として示した。ツニカマイシンおよびＶＰ１６による処理に起因する細胞死を測定するために、フローサイトメトリーを用いた。すべてのアッセイを３回（平均±標準偏差）行った。
【０１４０】
化合物の経路選択性を確認した後、さらにダウンストリームアッセイを行い、該化合物により阻害される特定のシグナル伝達経路をマッピングすることができる。この件については、ＥＲストレスにより活性化されることで知られる３つの主要経路：（１）ＰＥＲＫ、（２）Ｉｒｅ１、および（３）ＡＴＦ６の状態を評価するために、様々な抗体試薬が商業的に利用可能である（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔ．，１１５：２６５６−２６６４，２００５）。免疫ブロット法の実験を行い、これらの経路におけるマーカータンパク質の発現またはリン酸化（リン酸化型特異的抗体を用いる）を評価することができる。例えば、図１９に示されるように、インハウスライブラリの一次スクリーニングからの我々のヒット化合物のいくつかは、Ｉｒｅ１経路のマーカーであるｃ−ＪＵＮおよびｐ３８ ＭＡＰＫのＴＧ誘導リン酸化を抑制することが認められた。図１９において試験された化合物は、上記表９に記載されたものである。ＣＳＭ１４．１細胞を、ＤＭＳＯまたは２５μＭのヒット化合物を用いて２時間培養し、次いで、タプシガルジン（１５μＭ）で処理した。細胞溶解物を調製し、リン酸化−ｃ−Ｊｕｎ、リン酸化−ｅＩＦ２α、リン酸化−ｐ３８ ＭＡＰＫ、およびチューブリン（ローディングコントロール）に対する特異的な抗体を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／免疫ブロット法により解析した。ＣＳＭ１４．１細胞を、ＤＭＳＯ、または１μＭ、５μＭ、および１０μＭの活性化合物のうちの１つで培養し、次いで、２時間後、１５μＭのＴＧを加えて培養した。２時間後、細胞溶解物を調製し、タンパク質含有量を基にロード量を基準化し、抗−ｐ３８−ＭＡＰＫ ｐａｎ−ｒｅａｃｔｉｖｅ抗体またはリン酸化型特異的抗体を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ／免疫ブロット法を用いてＥＣＬベースの検出により解析し、次いで、ｘ線フィルムをデンシトメトリー解析を行い、すべてのｐ３８ ＭＡＰＫに対してリン酸化ｐ３８ ＭＡＰＫを正規化するか、あるいは、ＭＳＤからのメソスケールの計器およびすべてのｐ３８ ＭＡＰＫをプレート上で捕捉する手順を用いて解析し、リン酸化タンパク質の相対量をリン酸化型特異的抗体（ＭＳＤカタログ番号Ｋ１５１１２Ｄ１）を用いて決定した。図１９に示されるデータは、これらのヒット化合物は、Ｉｒｅ１経路に作用することを示唆している。Ｉｒｅ１経路は、Ａｓｋ１キナーゼの活性化を引き起こし、そのキナーゼＡｓｋ１が次に、ＪＮＫおよびｐ３８ ＭＡＰＫを活性化することが知られている。ｐ３８ ＭＡＰＫおよびｃ−Ｊｕｎのリン酸化の抑制は、用量依存的であり、これらのタンパク質が全レベルにおいて減少することを説明できなかった。さらに、ＴＧで処理された細胞において、化合物によるｐ３８ ＭＡＰＫリン酸化の阻害が、２つの独立した方法：（１）リン酸化型特異的抗体を用いた免疫ブロット法、および（２）ＭＵＬＴＩ ＳＰＯＴマイクロプレートの電極表面で開始した電気化学的刺激で発光するＳＵＬＦｏ−ＴＡＧ（ＴＭ）標識を用いるＭＳＤからメソスケールの計器を利用するプレートベースの方法によって、実証された。サルブリナルとは異なり、我々の化合物は、ｅＩＦ−２αのリン酸化に影響を及ぼさず、ＰＥＲＫ経路内で作用しないことが示唆された。ＡＴＦ６のタンパク質分解過程はまた、我々のヒット化合物により阻害されなかった。したがって、５０，０００の化合物のインハウスライブラリから得られたヒットのうちのすべてが、Ｉｒｅ１経路上にマッピングされ、ＪＮＫおよびｐ３８ＭＡＰＫの活性化を抑制することが認められた。他のライブラリ（ＮＩＨ化合物コレクション等）のスクリーニングは、異なる機構を有する細胞保護化合物を産出し得る。
【０１４１】
一次ＨＴＳアッセイプロトコル。我々の一次ＨＴＳアッセイプロトコルは、以下のとおりである。
【０１４２】
１）未分化ＣＳＭ１４．１細胞を、約３×１０６細胞／ディッシュを生成するために、１５０ｍｍ×２５ｍｍのポリスチレン培養ディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ）中で、１０％のＦＢＳ、１％のペニシリン／ストレプトマイシン（作用濃度：１００Ｉ．Ｕ．ペニシリン／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２５０ｎｇ／ｍｌのアンフォテリシン（Ｍｅｄｉａ Ｔｅｃｈ））、１％のＬ−グルタミン、で補完したＤＭＥＭ中に、３２℃で維持する。
【０１４３】
２）ＣＳＭ１４．１細胞を、８０〜９０％のコンフルエンスのとき、トリプシン処理によって培地から回収し、４００ｘｇで遠心分離し、ステップ１にあるように２％のＦＢＳを含有し、同一濃度の抗生物質を含有するＤＭＥＭ培地内に、７．５×１０º細胞／ｍＬの密度で懸濁する。
【０１４４】
３）該細胞懸濁液を、その後、９６ウェルプラスチックマイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ Ｏｎｅ、ポリスチレン、白壁、平底、ｌｕｍｉｔｒａｃ、高結合）にウェルあたり４０μＬで与え、Ｗｅｌｌ Ｍａｔｅ液体ディスペンサー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、該プレートを、９５％大気：５％ＣＯ２中で、湿気環境下、３２℃で一晩培養する。
【０１４５】
４）ライブラリ化合物を、１０％のＤＭＳＯ＋９０％の滅菌された蒸留水中で、約１５０μｇ／ｍＬで調製する。
【０１４６】
５）自動リキッドハンドラー（Ｂｉｏｍｅｋ（商標） ＦＸリキッドハンドラー、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて、１０％のＤＭＳＯ中の５μＬの試験化合物を、９６ウェルプレートの２〜１１列（１列および１２列はそのまま）のウェルに加え、この時点でほぼ最終濃度１５μｇ／ｍＬの試験化合物、および１．１％のＤＭＳＯの最終濃度を達成する。
【０１４７】
６）それぞれのプレートの１列／Ａ〜Ｄ行のウェルに、１０％ＤＭＳＯ＋９０％ＤＭＥＭの溶液中で５μＬの１ｍＭサルブリナル（ＤＭＳＯ中の１００ｍＭのサルブリナルをＤＭＳＯで１０倍希釈することにより調製した後、ＤＭＳＯ中の１０ｍＭのサルブリナルを同一のＤＭＥＭで１０倍希釈する）を加える。
【０１４８】
７）１列／Ｅ〜Ｈ行および１２列／Ａ〜Ｈ行のウェルに、５μＬの１０％ＤＭＳＯ＋９０％ＤＭＥＭ溶液を加える。
【０１４９】
８）プレートを再び２時間培養する。
【０１５０】
９）ＤＭＥＭ内のＴＧ原液（調製：５μｌのＴＧ溶液は、２０ｍＭのＴＧ ０．０３７５μｌ＋２％のＦＢＳおよび前記と同一濃度の抗生物質を含むＤＭＥＭ ４．９６２５μｌからなる）を、ウェルあたり５μＬで１〜１１列に分注し、最終濃度約１５μＭのＴＧを達成する。データ比較の対照として、１２列を残す（ＤＭＳＯのみ／ＴＧなし）。「Ｗｅｌｌ Ｍａｔｅ」液体ディスペンサー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いる。
【０１５１】
１０）１２列に、０．０３７５μＬのＤＭＳＯを含む５μＬのＤＭＥＭ（２％のＦＢＳおよび前記と同一濃度の抗生物質を含む）を加える。
【０１５２】
１１）該プレートをインキュベーターに戻して、２４時間培養する。
【０１５３】
１２）使用する約３０分前に、ＡＴＰアッセイ粉末を、製造業者のプロトコル［Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ］に従って、アッセイ緩衝液（製造業者により供給される）に溶解させる。
【０１５４】
１３）ウェルあたり２０μＬのＡＴＰｌｉｔｅ溶液を、例えば、「Ｗｅｌｌ Ｍａｔｅ」ディスペンサー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、分注する。
【０１５５】
１４）３０分以内に、発光を測定する。発光モードにおいて、Ｃｒｉｔｅｒｉｏ解析ソフトウェアと共に、Ａｎａｌｙｓｔ（商標） ＨＴ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いた。
【０１５６】
１５）プレートリーダーから記録された相対発光強度単位（ＲＬＵ）を、ＥＸＣＥＬファイルに取り込む。それぞれのウェルの未加工値を、１２列のすべてのウェルからの未加工値の平均（最大制御ＤＭＳＯのみ／ＴＧなし）で除し、１００を乗じ、対照に対する割合として示す。
【０１５７】
細胞（ステップ３）、ＴＨＳ（ステップ９）、またはＡＴＰｌｉｔｅ溶液（ステップ１３）の液体分注のために、小型ノズル管（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた。使用前に、管を、７０％のエタノールで滅菌し、滅菌された器具洗浄機で集中的に洗浄した。
【０１５８】
二次アッセイ 分化ＣＳＭ１４．１細胞および他の指標細胞、さらには細胞生存の指標としてＡＴＰ含有量を用いて、化合物が、広範囲の細胞保護活性対狭い範囲の細胞保護活性を示すことを確認する。また、ＥＲストレス経路、またはミトコンドリア経路、または死受容体経路を活性化することで知られる薬剤により細胞死を誘導し、選択される経路の解析を行う。この解析には、最終的にはＡＴＰ含有量を用いて行い、これによって、どのヒット化合物がＥＲ経路に対して選択的であるかを判定する。また、上記に示すようなアネクシンＶ染色等の代替アッセイまたはＭＴＴまたはＸＴＴ等の比色ミトコンドリア依存性染色還元試薬を用いて、ＥＣ５０＜２５μＭを有し適切な用量反応の相関を示すヒットのために、細胞生存アッセイを行う。代替として、または、追加として、異なる細胞生存アッセイを用いてもよい。最終的に、抗体ベースの方法を用いて、ｃ−Ｊｕｎ、ｐ３８ＭＡＰＫ、およびｅＩＦ２αのリン酸化を測定し、また（化合物の作用機構を問いただすための初期マーカーである）ＡＴＦ６のタンパク質分解を測定して、ＥＲストレスにより活性化されることが知られる特定の経路に化合物をマッピングする。当該二次アッセイプロトコルは、以下のとおりである。
【０１５９】
（ａ）アネクシン−Ｖ染色 生存アッセイ：
１）未分化ＣＳＭ１４．１細胞を、上記のように、２％のＦＢＳおよび抗生物質を含有する４００μＬのＤＭＥＭを用いて、２４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ ｏｎｅ）のウェルあたり１０４の細胞で、培養した。
【０１６０】
２）翌日、ＤＭＳＯ（ａ、ｂ）（１％の最終容積）、あるいは１００μＭのサルブリナル（ｃ、ｄ）、あるいは２５μＭのヒット化合物（１％の最終ＤＭＳＯ）を加えた。つまり、５μＬのＤＭＳＯを含有する５０μＬのＤＭＥＭ、およびＤＭＳＯに１０ｍＭのサルブリナル（または２．５ｍＭの化合物）を５μＬ含有する５０μＬのＤＭＥＭを、指示されたウェルに加えた。
【０１６１】
３）２時間後、１５μＭのＴＧを、ａおよびｃを除くすべてのウェルに加え、ＤＭＳＯ内に０．３７５μＬの２０ｍＭ ＴＧを含有する５０μＬのＤＭＥＭを加えた。
【０１６２】
４）該プレートを再度２４時間培養した。
【０１６３】
５）２４時間後、ウェル中のすべての細胞を、培地移送およびトリプシン処理により回収した。すべての回収した細胞は、ＤＭＥＭ−トリプシン溶液と共に、１．５ｍＬの微小管中で、６，０００ｒｐｍで、２分間遠心分離した。
【０１６４】
６）液体の吸引後、細胞を、低温ＰＢＳで滑らかに洗浄した。６，０００ｒｐｍで遠心分離した後、細胞は、０．２５ｍｇ／ｍＬのアネクシンＶ ＦＩＴＣ（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ １００１−１０００）およびヨウ化プロピジウム（５０μｇ／ｍＬ）を含有する、５００μＬの１×アネクシンＶ結合緩衝液（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ １０３５−１００）中に再懸濁した。
【０１６５】
７）アネクシンＶ陰性細胞の割合は、ＢｕｒｎｈａｍのＦＡＣＳｏｒｔ（Ｂｅｃｋｔｏｎ ＆ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）解析施設を用いて、フローサイトメトリー（ｙ軸）により決定した。
【０１６６】
（ｂ）免疫ブロット法：
１）ＣＳＭ１４．１細胞を、２％のＦＢＳおよび抗生物質を含有するＤＭＥＭ内で、６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ ｏｎｅ）に２×１０５細胞／ウェルの密度で、播種した。
【０１６７】
２）一晩インキュベーションした後、細胞を、ＤＭＳＯ（０．５％）または化合物（２５μＭ）で２時間処理し、次いで、ＴＧ（１５μＭ）で処理した。
【０１６８】
３）２時間後、細胞を、２５０μＬの溶解緩衝液中に溶解し、タンパク質濃度決定、およびリン酸化ｐ３８ ＭＡＰＫ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ９２１１）、ｐ３８ ＭＡＰＫ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ−Ｃ２０）、リン酸化ｃ−Ｊｕｎ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ９１６４）、ｃ−Ｊｕｎ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ−ＳＣ１６９４）、リン酸化ｅＩＦ２α（細胞Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ３５９７）、およびα−チューブリンに特異的な抗体を用いて、ＳＤＳ ＰＡＧＥ／ウエスタンブロット法に供した。
【０１６９】
（ｃ）ＭＳＤ電気化学的アッセイ：
細胞を溶解緩衝液（ＭＳＤ Ｃｏｍｐａｎｙ）中に溶解することを除いて、免疫ブロット法に利用される同一のスキームを用いた。細胞溶解物のうちの半分をウエスタンブロット法／デンシトメトリー解析のために用い、半分をＭＳＤプレートベースのアッセイのために用いた。ＭＳＤアッセイは、製造業者のプロトコルを用いて行った。
【０１７０】
１）細胞を、提供された溶解緩衝液を用いて溶解した。細胞抽出物を、提供された希釈緩衝液で希釈し、１２０μＬの希釈緩衝液に対して６μｇを定量化した。
【０１７１】
２）ｐ３８／ｐ−ｐ３８の二重プレート（ＭＳＤ ｃｏｍｐａｎｙ−Ｃａｔ ＃Ｋ１５１１２Ｄ−１）は、供給されたブロッキング緩衝液により１時間ブロッキングした。
【０１７２】
３）１２０μＬの細胞抽出物を、それぞれのウェルに加え、振とうしながら室温で一晩インキュベートした。
【０１７３】
４）インキュベーション後、ウェルをＴｒｉｓ洗浄緩衝液（提供された）で４回洗浄し、検出抗体溶液（提供された）で１時間インキュベートし、洗浄緩衝液で再度４回洗浄した。
【０１７４】
５）最終的に、それぞれのウェルに、１５０μＬの読み込み緩衝液（提供された）を加え、発光値を、ＭＳＤ Ｓｅｃｔｏｒ（商標）装置により読み取った。
【０１７５】
６）該装置は、ｐ３８およびリン酸化−ｐ３８（ｐ−ｐ３８）の発光値を示した。ｐ−ｐ３８の値は、それぞれのウェル中で、ｐ−３８の値で除した。対照（ＤＭＳＯ処理、タプシガルジン処理なし）ウェルのｐ−ｐ３８／ｐ３８値は、対照を１として設定し、他のウェルは、対照の倍数として算出した。最終的に、ＤＭＳＯ対照におけるｐ−ｐ３８のバックグラウンド発現レベルがないため、各値−１を本図において報告した。該グラフは、それぞれの試料の「ｐ−ｐ３８／ｐ３８」の比に基づいて作製した。
【０１７６】
ＳＡＲ解析 どのヒット化合物が、ＥＲストレスにより誘導される死を選択的に遮断することを立証すること、およびＥＲストレスにより引き起こされる３つの既知の経路（または３つの既知の経路のいずれも抑制されない場合、同定されていない経路）のうちの１つを事前にマッピングすることに加えて、該化合物の効力および選択性を「探索」状態に進めることを目標とし、ＳＡＲ解析を選択されたヒットに対して行う。
【実施例２】
【０１７７】
Ｃｈｅｍｂｒｉｄｇｅ化合物ＩＤ番号５９６２１２３の化学名および商業的な入手可能性 化合物５９６２１２３の化学名は、６−（４−ジエチルアミノフェニル）−９−フェニル−５，６，８，９，１０，１１−ヘキサヒドロベンゾ［ｃ］［１，５］ベンゾジアゼピン−７−オンである。化合物５９６２１２３は、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅから入手可能である。推奨される負の対照化合物（ネガティブコントロール）は、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ ６０７５８４１または６０４８１６３を含む。これらのベンゾジアゼピンは、一次スクリーニングに用いられた細胞死アッセイに不活性であり、タプシガルジンにより誘導されるＪｕｎのリン酸化を抑制することができない。
【０１７８】
生物学的活性の説明 化合物５９６２１２３は、未分化および分化両方のラット神経細胞株ＣＳＭ１４．１に対して、タプシガルジン（ＥＲストレスの誘起剤）による誘導死を阻害する。また、化合物５９６２１２３は、２つの異なる細胞生存の指標：（ａ）ＡＴＰ含有量アッセイ、および（ｂ）アネクシンＶ染色によるフローサイトメトリーベースのアッセイでは、約１０μＭのＩＣ５０を有する。化合物５９６２１２３はまた、ツニカマイシン（ＥＲストレスの別の阻害剤）により誘導されるＣＳＭ１４．１の細胞死を阻害するが、死受容体（外因性）細胞死経路のアゴニストであるＴＮＦ−α（＋シクロヘキシミド）により、または、ＶＰ−１６あるいはスタウロスポリン（ミトコンドリア細胞死経路のアゴニスト）により誘導されるＣＳＭ１４．１の細胞死は阻害しない。これは、化合物５９６２１２３が、ＥＲストレス誘導細胞死の選択的阻害剤（すなわち経路特異的）であることを示唆する。
【０１７９】
ＣＳＭ１４．１細胞に加えて、２５μＭで試験した場合、化合物５９６２１２３は、ＡＴＰ含有量アッセイで判定されたように、いくつかの腫瘍細胞株（ＨｅＬａヒト子宮頸癌、ＳＷ１メラノーマ細胞、ＰＰＣ１、ヒト前立腺癌）、マウス神経幹細胞Ｃ１７．２（分化［神経表現型］および未分化［幹細胞表現型］の両方）で、タプシガルジンにより誘導される死を、＞５０％で保護した。また、化合物５９６２１２３は、正常あるいはアポトーシスの核形態（ヘキスト染色）を伴うＮｅｕＮ−免疫陽性細胞の割合を測定する顕微鏡アッセイにより判定されたように、一次ラット皮質ニューロンで、タプシガルジンにより誘導される死を、＞５０％で保護した。しかしながら、化合物５９６２１２３は、２５μＭで、ＡＴＰ含有量アッセイで判定されたように、タプシガルジンにより誘導される細胞死から、ＪｕｒｋａｔヒトＴ−白血病細胞、または未分化あるいは分化（神経表現型）ＰＣ１２ラットクロム親和性細胞腫を保護しなかった。実際に、化合物５９６２１２３で、タプシガルジンで処理された未分化ＰＣ１２細胞を試験した際、奇異だが、細胞死を促進する活性を示した。
【０１８０】
概して、いくつかの細胞型選択性を示すが、化合物５９６２１２３は、その細胞保護活性において合理的に広範囲であり、試験した８つの細胞株または細胞型（初代神経細胞）のうち６つを保護した。
【０１８１】
タプシガルジンにより誘起されたＣＳＭ１４．１細胞の試験では、１０μＭの化合物５９６２１２３が、ＵＰＲ信号伝達経路を阻害した。その結果、ｃ−Ｊｕｎの基質であるＪＮＫ（リン酸化型特異的抗体を用いた免疫ブロット法により測定された）のリン酸化、およびｐ３８ＭＡＰＫのリン酸化（リン酸化型特異的抗体を用いた免疫ブロット法および定量的ＥＬＩＳＡベースのアッセイ（ＭＳＤアッセイ）により判定された）がもたらされた。しかしながら、ＰＥＲＫ媒介によるｅＩＦ２αのリン酸化（リン酸化型特的抗体を用いた免疫ブロット法により測定された）、またはタプシガルジンにより誘導されるＡＴＦ４の発現（免疫ブロット法により測定された）、またはＡＴＦ６の切断（切断型を検出するために免疫ブロット法によりアッセイされた）、またはＸＢＰ１ ｍＲＮＡのスプライシング（未スプライスｍＲＮＡ：スプライスされたｍＲＮＡの比率を測定するためにＲＴ−ＰＣＲにより検査された）、またはＩｒｅ１自己リン酸化（ｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイにより測定された）、またはＡＳＫ１自己リン酸化（ｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイにより測定される）、またはタプシガルジンにより誘導される細胞中のＡＳＫ１の活性化（ＭＫＫ６およびｐ３８ＭＡＰＫを含み、化合物処理された細胞から免疫沈降により回収したＡＳＫ１が加えられた、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合キナーゼアッセイを用いて測定された）、またはタプシガルジンにより誘導されるＣＨＯＰの発現を含む、ＵＰＲ経路を、化合物５９６２１２３が、阻害しないことを示した。
【０１８２】
化合物５９６２１２３は、５０μＭで、ＡＳＫ１の９６７部位のセリンにおいて、タプシガルジンにより誘起される脱リン酸化を阻害した。これは、リン酸化型特異的抗体を用いた免疫ブロット法によって、ＡＳＫ１でトランスフェクションされ、タプシガルジンにより刺激されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞で測定された。また、化合物５９６２１２３は、ＡＳＫ１に結合する１４−３−３タンパク質を増加させた。これは、タプシガルジンで誘起され、上記と同様にトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いて、免疫共沈降アッセイにより判定された。したがって、これらの事象から、ＡＳＫ１キナーゼ活性を直接阻害しないが、生体内でＡＳＫ１のキナーゼ活性を減少させることが予測される。化合物５９６２１２３は、９６７部位のセリンのリン酸化を制御するタンパク質ホスファターゼを阻害することが可能である。
【０１８３】
二次スクリーニングの説明 化合物５９６２１２３の性質を明らかにするために用いられた二次スクリーニング（それらの多くを用いて、すべての１１のベンゾジアゼピンの性質を明らかにした）は、上述した。これまで３１の二次スクリーニングを用いて、化合物５９６２１２３の性質を明らかにした。該化合物は、ＡＴＰ含有量により測定されたように、タプシガルジンにより誘導される未分化ＣＳＭ１４．１細胞の細胞死の阻害剤として、およびツニカマイシンにより誘導される未分化ＣＳＭ１４．１細胞の細胞死の阻害剤として、約１０μＭのＩＣ５０で活性である。ＥＲストレス誘導細胞死に対する化合物の活性は、タプシガルジンあるいはツニカマイシンで処理されたＣＳＭ１４．１細胞をアネクシンＶで染色して、フローサイトメトリーで測定、分析することにより、確認された。ＡＴＰ含有量アッセイにより未分化ＣＳＭ１４．１細胞に対して２５μＭで試験した場合、２５μＭの化合物５９６２１２３は、ＴＮＦα＋シクロヘキシミド、ＶＰ−１６、およびスタウロスポリンにより誘導される細胞死に対して活性ではなかった。神経細胞に対する化合物５９６２１２３の活性は、１０μＭのタプシガルジンで処理された分化ラット神経ＣＳＭ１４．１細胞を用いて、さらにはタプシガルジンで処理された分化神経Ｃ１７．２細胞を用いて、ＡＴＰ含有量アッセイを用いて、２５μＭで確認された。しかしながら、ＡＴＰ含有量アッセイによって、タプシガルジンで処理された分化ラットクロム親和性細胞腫ＰＣ１２細胞では、化合物５９６２１２３の活性は確認されなかった。該化合物は、タプシガルジンで処理された未分化ＰＣ１２細胞に対して、奇異だが細胞死を促進する活性を示した。最後に、化合物２８７８７４６は、ラット初代皮質神経細胞でタプシガルジンにより誘導される細胞死を阻害する（ＮｅｕＮを用いて染色することにより同定された）。これは、アポトーシスおよび神経突起退縮の証拠を示す、凝縮された核形態で細胞を同定するために、ＤＮＡ結合蛍光色素であるヘキスト染料を用いて染色されたアポトーシス神経フィラメント（ＮｅｕＮ）陽性細胞を数えることにより判定された。
【０１８４】
化合物５９６２１２３の細胞保護活性はまた、ＡＴＰ含有量アッセイを用い、タプシガルジンで処理された非神経ヒト腫瘍細胞株のいくつかの細胞種（子宮頚癌ＨｅＬａ細胞、ヒト前立腺癌ＰＰＣ−１細胞、およびヒトメラノーマＳＷ１細胞を含む）によって、実証された。しかしながら、該化合物は、ＡＴＰ含有量アッセイにより判定されたように、タプシガルジン処理されたＪｕｒｋａｔＴ白血病細胞に対して不活性であった。
【０１８５】
機構に関して、ＣＳＭ１４．１細胞中において、リン酸化型特異的抗体（リン酸化−ｃ−Ｊｕｎ Ｓｅｒ ６３、リン酸化ｐ３８ＭＡＰＫ Ｔｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２）を用いた免疫ブロット法により判定されたように、該化合物は、タプシガルジンにより誘導されるｃ−Ｊｕｎおよびｐ３８ＭＡＰＫのリン酸化を阻害する。タプシガルジンにより誘導されるｐ３８ＭＡＰＫのリン酸化の抑制はまた、定量的ＥＬＩＳＡ法により測定され、ｐ３８ＭＡＰＫリン酸化に対してＩＣ５０が＜５μＭであると推定された。その一方、タプシガルジンにより誘導される、ＣＨＯＰの発現、またはＡＴＦ４の発現、またはＡＴＦ６の切断、またはｅＩＦ２ａ（Ｓｅｒ５１）のリン酸化、またはＩｒｅ１ａの自己リン酸化、またはＡＳＫ１の自己リン酸化は、ｐ３２−γ−ＡＴＰ基質を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイにより試験したところ、５０μＭの濃度でも、ＣＩＤ−２８７８７４６によって直接阻害されなかった。化合物５９６２１２３はまた、ＡＳＫ１の細胞内活性化を阻害することができなかった。これは、結合アッセイに加える前に、ＡＳＫ１プラスミドでトランスフェクションし、１００μＭの化合物＋１５μｇ／ｍＬのタプシガルジンでインキュベートしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞から得られ、免疫沈降されたＡＳＫ１と共に、精製されたＭＡＰＫＫ６（ＭＫＫ６／ＳＫＫ３）および精製されたｐ３８ ＭＡＰＫを含むｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイの組み合わせにより判定された。ＡＳＫ１でトランスフェクションされた２９３Ｔ細胞では、ＡＳＫ１のセリン９６７部位で、タプシガルジンにより誘導されるリン酸化の減少は、５０〜１００μＭの濃度で、化合物５９６２１２３によって阻害された。これは、抗リン酸化型特異的（ｓｅｒ９６７）抗体を用いた免疫ブロット法により判定された。しかしながら、タプシガルジンにより誘導される、ＡＳＫ１の８３部位のセリンおよび８４５部位のトレオニンのリン酸化は、ＡＳＫ１でトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞では、１００μＭの濃度でも、化合物５９６２１２３により調節されなかった。化合物５９６２１２３はまた、１００μＭの濃度で、ＡＳＫ１の１４−３−３タンパク質への結合を増加させる。これは、タプシガルジンにより刺激され、ＡＳＫ１でトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いて、免疫共沈降アッセイに判定された。化合物５９６２１２３は、１００μＭの濃度で、タンパク質ホスファターゼ２Ｂ（カルシニューリン）の活性に影響を及ぼさなかった。これは、基質として免疫沈降されたＡＳＫ１（９６７部位のセリン）を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏホスファターゼアッセイにより試験された。
【０１８６】
化合物５９６２１２３と同一性をもたらすする化学戦略。化合物５９６２１２３のＳＡＲ解析を行った。これによって、１１の活性ベンゾジアゼピンヒットを明らかにした一次スクリーニングデータに内在的なＳＡＲに加えて、４１の類似体（アナログ）のデータを分析することにより、３つの機能・官能基に傾注した。化合物の活性を比較するために用いられたアッセイは、一次ＨＴＳアッセイと同一であり、未分化ＣＳＭ１４．１細胞をタプシガルジンでチャレンジし、細胞の生存を、ＡＴＰ含有量アッセイを用いて評価した。類似体の効力データを、表１４（Ｒ群Ｒ１〜Ｒ７は、式Ｉの構造に対して置換基である）に示し、これらのデータから化合物５９６２１２３を、効力および細胞内活性プロフィールに基づいて選択した。
【表１４−１】
【表１４−２】
【０１８７】
化合物５９６２１２３を製造するための合成経路。化合物５９６２１２３は、再合成された（図２０）。解析データおよび生物学的活性は、購入した化合物と同一であり、従って、その構造および効力を確認した。解析データは、購入した試料および合成した試料の両方において、４つの可能な立体異性体の存在を示す。さらに、別の化合物、ＭＬＳ−０２９２１２６は、同一経路を介して合成され、１６．５μＭのＩＣ５０を示した。
【０１８８】
明らかにされた性質 化合物５９６２１２３の性質の要約を、下記表１５に提供する。
【表１５】
【０１８９】
上記表１５において、＋は、≦２５μＭの化合物濃度で、タプシガルジンにさらされない未処理細胞と比較した細胞の生存率が、＞５０％であることを示す。ＡＴＰは、細胞のＡＴＰ含有量を測定するＡＴＰｌｉｔｅアッセイ。アネクシンＶ染色は、フローサイトメトリーで判定されるように、ＦＩＴＣ−アネクシンＶ陽性細胞の割合を測定するステップを含む。
【表１６】
【０１９０】
上記表１６において、＋は、≦２５μＭの化合物濃度で、タプシガルジンにさらされない未処理細胞と比較した細胞の生存率が、＞５０％であることを示す。タプシガルジン濃度は、Ｃ１７．２細胞に対して１０μＭであり、他のすべてに対して１５μＭであった。Ｅは、タプシガルジン誘導死を増強した化合物を示す。分化：ＰＣ１２に関しては、細胞を、２０ｎｇ／ｍｌのＮＧＦで、５日間刺激した。Ｃ１７．２に関しては、細胞を、血清減少によって刺激し、１％ Ｎ２インキュベーションを３日間行った。ＣＳＭ１４．１に関しては、細胞を、３９℃で５〜７日間培養した。
【０１９１】
化合物２８７８７４６の性質 ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中の化合物５９６２１２３の溶解性は、２５ｍＭの濃度で優れている。培養培地に化合物を加えるために、少なくとも０．２％（ｖ／ｖ）最終ＤＭＳＯ濃度が、目に見えるような濁った沈殿物を生成することを避けるために、必要であった。２５ｍＭを超える濃度で、ＤＭＳＯ中の化合物は、黄色を示す。負の対照化合物６０４８１６３および６０７５８４１は、ＤＭＳＯ中で６２３９５０７と類似の溶解性を示す。２５ｍＭの濃度で、化合物６０４８１６３は、淡黄色を示したが、化合物６０７５８４１は、無色であった。
【実施例３】
【０１９２】
第２−１群および第２−２群の様々な化合物の効力データを、上記に記載したように得、表１７および１８に、それぞれ提供する（Ｒ群は、式ＩＩおよびＩＩＩの構造に対する置換基である）。
【表１７】
【表１８】
【０１９３】
化合物５９４８３６５のＩＣ５０が、１９．５４±０．１７６９であると測定されたことに留意されたい。
【実施例４】
【０１９４】
ＣＳＭ１４．１細胞を、ＤＭＳＯまたは２５μＭのヒット化合物とともに２時間培養し、次いで、タプシガルジン（１５μＭ）で処理した。細胞溶解物を調製し、ｃ−Ｊｕｎ、リン酸化−ｃ−Ｊｕｎ（ｓｅｒ７３）、ｅＩＦ２α、リン酸化−ｅＩＦ２α（ｓｅｒ５１）、ｐ３８ＭＡＰＫ、リン酸化−ｐ３８ＭＡＰＫ（Ｔｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２）、ＡＴＦ−６、ＣＨＯＰ、およびチューブリン（ローディングコントロール）に対して特異的な抗体を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／免疫ブロット法により解析した。Ｃ−Ｊｕｎおよびｐ３８ ＭＡＰＫのＥＲストレスにより誘導される活性化は、１１のヒット化合物により抑制された。
【０１９５】
Ｃ−Ｊｕｎおよびｐ３８ＭＡＰＫは、Ｉｒｅ１経路の下流（ダウンストリーム、図２１参照）で機能するので、我々のヒット化合物のうちの１つ（６２３９５０７）が、このＩｒｅ１−ＡＳＫ１−ＪＮＫ／ｐ３８ ＭＡＰＫ経路における、すべてのキナーゼの自己リン酸化を阻害するかどうか試験した。図２２は、化合物６２３９５０７を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイの結果を示す。Ｉｒｅ１自己リン酸化アッセイを行った。免疫沈降されたＩｒｅ１を、ＤＭＳＯ（２％）、または５０μＭの化合物６２３９５０７、または陽性対照（ポジティブコントロール）であるスタウロスポリン（２０μＭ、ＳＴＳ）で、３０℃で２０分間インキュベートし、次いで、氷上で冷却した。０．５μＣｉの３２Ｐ−γ−ＡＴＰを、それぞれの管に加え、３０℃で指示された時間インキュベートした。キナーゼ反応は、試料緩衝液を加えることにより完了した。３２Ｐ−γ−ＡＴＰの取り込み値を、シンチレーションカウンターにより評価した。また、ＡＳＫ１−ＭＫＫ６−ｐ３８結合アッセイを行った。免疫沈降されたＡＳＫ１を、１μｇのＭＫＫ６（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）および１μｇのｐ３８ ＭＡＰＫ（Ｓｉｇｍａ）と混合した。キナーゼを、管内で、２％のＤＭＳＯ、または５０μＭの化合物６２３９５０７、または２０μＭのスタウロスポリン（ＳＴＳ）で、３０℃で２０分間インキュベートし、次いで、氷上で冷却した。０．５μＣｉの３２Ｐ−γ−ＡＴＰを、それぞれの管に加え、３０℃で指示された時間インキュベートした。キナーゼ反応は、試料緩衝液を加えることにより完了した。３２Ｐ−γ−ＡＴＰの取り込み値を、シンチレーションカウンターにより評価した。精製されたＪｎｋ−１およびＪｎｋ−２（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によるＣ−Ｊｕｎの活性化は、同一の手順で確認した。該結果は、ヒット化合物６２３９５０７が、Ｉｒｅ１の自己リン酸化活性、または下流のキナーゼＭＫＫ６およびｐ３８ ＭＡＰＫに関するＡｓｋ１の活性、またはｃ−Ｊｕｎに対するＪＮＫの活性を調節しないことを示す。
【０１９６】
また、化合物６２３９５０７が、ＥＲストレス誘導（すなわちタプシガルジン処理）の前後に、９６７部位のセリンで、ＡＳＫ１のリン酸化を増強するかどうかを判定するために、諸実験を実施した。２９３Ｔ細胞を、ｐｃＤＮＡ−ＡＳＫ１−ＨＡでトランスフェクションした。１日後、細胞を、ＤＭＳＯ（０．４％）または１００μＭの化合物６２３９５０７（＃１）で、２時間インキュベートした。その後、細胞を、指示された時間、タプシガルジン（２０μＭ）で処理した。細胞抽出物を、溶解緩衝液によって調製し、抗リン酸化ＡＳＫ１ Ｓｅｒ９６７抗体または抗ＨＡ抗体を用いた免疫ブロット法に供した。リン酸化ｓｅｒ９６７バンドの相対密度は、イメージＪソフトウェアにより算出した（平均±標準偏差）。化合物６２３９５０７は、ＥＲストレス誘導の前後に、９６７部位のセリンでＡＳＫ１のリン酸化を増強することが認められた。
【０１９７】
ＡＳＫ１の９６７部位のセリンは、１４−３−３タンパク質の結合を介して、リン酸化によりＡＳＫ１活性を下方制御することが知られている（Ｇｏｌｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：１０４４２−１０４４９，２００４）。我々のヒット化合物が、セリン９６７部位のみまたは別のリン酸化部位のリン酸化を増強するかどうか、試験した。２９３Ｔ細胞を、ｐｃＤＮＡ−ＡＳＫ１−ＨＡでトランスフェクションした。１日後、細胞を、ＤＭＳＯ（０．４％）または１００μＭの化合物６２３９５０７（＃１）で、２時間インキュベートした。細胞抽出物を、溶解緩衝液を用いて調製し、上述した抗リン酸化ＡＳＫ１抗体または抗ＨＡ抗体を用いて免疫ブロット法に供した。それぞれのリン酸化ＡＳＫバンドの相対密度は、イメージＪソフトウェアにより算出した。該化合物を、タプシガルジンにより誘導された細胞死に対する活性において比較した。２９３Ｔ細胞を、ｐｃＤＮＡ−ＡＳＫ１−ＨＡおよびｐＥＢＧ−ＧＳＴ−１４−３−３でトランスフェクションした。１日後、細胞を、ＤＭＳＯ（０．４％）または１００μＭの指示された化合物で２時間インキュベートした。その後、細胞を、指示された時間、タプシガルジン（２０μＭ）で処理した。細胞抽出物を、溶解緩衝液を用いて調製し、１４−３−３タンパク質を、グルタチオンＳトランスフェラーゼ４Ｂセファロースビーズで免疫沈降した。１４−３−３タンパク質に結合したＡＳＫ１タンパク質は、抗ＨＡ抗体を用いた免疫ブロット法により可視化した。抗リン酸化ＡＳＫ１（ｓｅｒ９６７）抗体を用いて、それぞれの時点でＡＳＫ１のリン酸化を検出した。図２３に示されるように、我々のヒット化合物（１、２、９、１０、および１２として印のある）が、９６７部位のセリンのみのリン酸化を増強し、８３部位のセリンあるいは８４５部位のトレオニンのリン酸化を増強しなかった。ＴＰ１４は、１、２、９、１０、および１２と異なる構造を有する別のヒット化合物である。６０４８１６３は、これらのヒット化合物と同一の構造的骨格を共有する化合物であるが、細胞保護において不活性である（図２３Ｂ）。化合物６２３９５０７（図２３ＡおよびＢにおいて、＃１として示される）は、タプシガルジン処理した後、リン酸化に依存した挙動で、ＡＳＫ１からの１４−３−３タンパク質の解離を阻害する。
【０１９８】
図２４は、本機構について我々の仮説を示す。ヒットしたベンゾジアゼピン化合物は、ＡＳＫ１ ｓｅｒ９６７脱リン酸化の阻害剤である。したがって、当該化合物は、１４−３−３タンパク質のＡＳＫ１からの解離を阻害し、ＡＳＫ１を不活性にする。
【０１９９】
図２５は、化合物６２３９５０７が、マウス初代神経細胞において、ＥＲストレスにより誘導される細胞死を阻害できることを示す。初代皮質ニューロン細胞を、マウスの中脳から調製した。成熟してから１４日後、該細胞を、ＤＭＳＯ（０．２％）または２５μＭの化合物６２３９５０７で２時間プレインキュベートした。該細胞を、その後、タプシガルジン（ＴＧ）で２４時間処理した。細胞を、アルデヒド溶液で固定し、神経体および神経軸索ネットワークを染色するために、ＮｅｕＮおよびＭＡＰ２抗体を用いて免疫染色に供した。ヘキスト染料を用いて、核を染色した。蛍光顕微鏡法を用いて、タプシガルジンによる神経軸索ネットワークの喪失が示された。縮合核および萎縮性神経炎を示した細胞は、細胞死を評定する際死亡と見なした。
【０２００】
図２６は、様々なヒット化合物で処理したＣＳＭ１４．１細胞に対する相対的な生存を示す。ＣＳＭ１４．１細胞を、９６ウェルプレート中にウェルあたり１，５００の細胞で播種し、３９℃（非許容温度）で７日間培養した。ヒット化合物を２５μＭの最終濃度で加え、２時間後、１５μＭの最終濃度でタプシガルジンを加えた。ＡＴＰ含有量を測定し、データを、わずか１％のＤＭＳＯで処理した対照細胞に対する割合として表した。
【０２０１】
化合物６２３７８７７および６２３７７３５で処理した＿後、用量依存的なｃ−Ｊｕｎリン酸化の減少を観察した。ＣＳＭ細胞を、漸増用量で、２つの化合物で処理した。プレインキュベーション時間、タプシガルジン処理、細胞抽出物の調製、および免疫ブロット法のプロトコルは、前述に記載した通りであった。用量依存的なｃ−Ｊｕｎリン酸化の減少が、抗リン酸化−ｃ−Ｊｕｎ（ｓｅｒ７３）抗体により確認された。
【０２０２】
図２７は、ＥＲストレス阻害化合物が、タプシガルジンにより誘導される、Ｉｒｅ１経路のマーカーを阻害することを示す。ＣＳＭ１４．１細胞を、ＤＭＳＯまたは１μＭ、５μＭ、および１０μＭの指示化合物と共に培養し、次いで、タプシガルジン（１５μＭ）で処理した。２時間後、細胞溶解物を調製し、タンパク質含有量に対して標準化し、抗−ｐ３８−ＭＡＰＫ ｐａｎ−ｒｅａｃｔｉｖｅ抗体またはＥＣＬベースで検出するリン酸化型特異的抗体を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ／免疫ブロット法により解析した。次いで、ｘ線フィルムのデンシトメトリー解析を行い、すべてのｐ３８ ＭＡＰＫに対してリン酸化ｐ３８ ＭＡＰＫを正規化した（図２７、上）。あるいは、リン酸化型特異的抗体（ＭＳＤカタログ番号＃Ｋ１５１１２Ｄ１）を用いて、ＭＳＤからのメソスケールの計器およびすべてのｐ３８ ＭＡＰＫをプレート上で捕捉する手順を用いて解析し、リン酸化タンパク質の相対量を判定した（図２７、下）。
【０２０３】
すべての刊行物、特許および特許出願は、参照することにより本明細書に組み込まれる。本明細書では、本発明が、ある好ましい実施形態に関して記載され、多くの詳細が例証目的のために説明されているが、本発明が、追加の実施形態を許容する余地があり、本明細書に記載される特定の説明が、本発明の基本原理から逸脱することなく、大幅に変更され得ることが、当業者には明らかである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
小胞体ストレスに起因する細胞死の阻害剤を同定する方法であって、（ａ）哺乳類細胞をタプシガルジンに接触させ、これによって、前記細胞に小胞体ストレスを引き起こすステップと、（ｂ）前記細胞を試験薬剤に接触させるステップと、（ｃ）前記試験薬剤が小胞体ストレスによって引き起こされる前記細胞の死を阻害するかどうか判断するステップと、を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記哺乳類細胞が、ＣＳＭ１４．１ラット線条体神経前駆細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞の細胞内ＡＴＰ含有量を測定することによって、前記試験薬剤が小胞体ストレスによって引き起こされる前記細胞の死を阻害するかどうかを判断する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞の生物発光を測定することによって、前記細胞の細胞内ＡＴＰ含有量を測定する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記試験薬剤が前記細胞の死を約５０％以上阻害するかどうかを判断する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記試験薬剤が前記細胞の死を約６０％以上阻害するかどうかを判断する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記試験薬剤が、前記細胞の死を約７０％以上阻害するかどうかを判断する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記試験薬剤が前記細胞の死を約８０％以上阻害するかどうかを判断する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記試験薬剤が前記細胞の死を約９０％以上阻害するかどうかを判断する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記試験薬剤が前記細胞の死を約９５％以上阻害するかどうかを判断する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記試験薬剤が約２５μＭ以下のＩＣ５０を有するかどうかを判断する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記試験薬剤が約２０μＭ以下のＩＣ５０を有するかどうかを判断する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記試験薬剤が約１５μＭ以下のＩＣ５０を有するかどうかを判断する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記試験薬剤が約１０μＭ以下のＩＣ５０を有するかどうかを判断する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞をタプシガルジンに接触させた後に、前記細胞を前記試験薬剤に接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞を、マルチウェルプレートのウェルに提供する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記哺乳類細胞がヒト細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
自動化された、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
タプシガルジンにより誘導される小胞体ストレスに起因する哺乳類細胞の死を阻害する化合物を有効量含むことを特徴とする組成物。
【請求項２０】
前記哺乳類細胞が、ＣＳＭ１４．１ラット線条体神経前駆細胞である、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記細胞の死を約５０パーセント以上阻害する、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２２】
前記細胞の死を約６０パーセント以上阻害する、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２３】
ＣＳＭ１４．１ラット線条体神経前駆細胞の死を約７０パーセント以上阻害する、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２４】
ＣＳＭ１４．１ラット線条体神経前駆細胞の死を約８０パーセント以上阻害する、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２５】
ＣＳＭ１４．１ラット線条体神経前駆細胞の死を約９０パーセント以上阻害する、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２６】
ＣＳＭ１４．１ラット線条体神経前駆細胞の死を約９５パーセント以上阻害する、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２７】
約２５μＭ以下のＩＣ５０を有する、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２８】
約２０μＭ以下のＩＣ５０を有する、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２９】
約１５μＭ以下のＩＣ５０を有する、請求項１９に記載の組成物。
【請求項３０】
ＣＳＭ１４．１ラット線条体神経前駆細胞の死を約５０パーセント以上阻害し、かつ約２５μＭ以下のＩＣ５０を有する、請求項１９に記載の組成物。
【請求項３１】
前記化合物が、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ ＩＤ番号５２３０７０７、５３９７３７２、５６６７６８１、５７０６５３２、５８０３８８４、５８４３８７３、５８５０９７０、５８９７０２７、５９２３４８１、５９２６３７７、５９３１３３５、５９３３６９０、５９４７２５２、５９４８３６５、５９５１６１３、５９５４１７９、５９５４６９３、５９５４７５４、５９５５７３４、５９６２２６３、５９６３９５８、５９７４２１９、５９７４５５４、５９７６２２８、５９７９２０７、５９８０７５０、５９８１２６９、５９８４８２１、５９８６９９４、５９９００４１、５９９０１３７、５９９３０４８、５９９８７３４、６０００３９８、６０１５０９０、６０３３３５２、６０３４３９７、６０３４６７４、６０３５０９８、６０３５７２８、６０３７３６０、６０３８３９１、６０４３８１５、６０４４３５０、６０４４５２５、６０４４６２６、６０４４６７３、６０４４８６０、６０４５０１２、６０４６０７０、６０４６８１８、６０４８３０６、６０４８９３５、６０４９０１０、６０４９１８４、６０４９４４８、６０５６５９２、６０６０８４８、６０６２５０５、６０６５７５７、６０６６９３６、６０６８１８９、６０６８６０２、６０６９４７４、６０７０３７９、６０７３８７５、６０７４２５９、６０７４５３２、６０７４８９１、６０８１０２８、６０８４６５２、６０９４９５７、６０９５５７７、６０９５９７０、６１０３９８３、６１０４９３９、６１４１５７６、６２３７７３５、６２３７８７７、６２３７９７３、６２３７９９２、６２３８１９０、６２３８２４６、６２３８４７５、６２３８７６７、６２３９０４８、６２３９２５２、６２３９５０７、６２３９５３８、６２３９９３９、６２４１３７６、６３６８９３１、および６３７０７１０からなる群より選択される、請求項１９に記載の組成物。
【請求項３２】
前記化合物が式Ｉの化合物である、請求項１９に記載の組成物。
【請求項３３】
前記化合物が、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ ＩＤ番号６２３９５０７、６２３７７３５、６２３８４７５、６２３７８７７、６２３９５３８、６２３８７６７、６０４９４４８、５９６３９５８、６２３７９７３、および６０４４６７３からなる群より選択される、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
前記化合物が式ＩＩ−１の化合物である、請求項１９に記載の組成物。
【請求項３５】
前記化合物が、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ ＩＤ番号５９９８７３４、５９５５７３４、５９９００４１、６０３５０９８、および５９９０１３７からなる群より選択される、請求項３４に記載の化合物。
【請求項３６】
前記化合物が式ＩＩ−２の化合物である、請求項１９に記載の組成物。
【請求項３７】
前記化合物が、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ ＩＤ番号５３９７３７２、６０３３３５２、６０３４６７４、および５９５１６１３からなる群より選択される、請求項３６に記載の化合物。
【請求項３８】
前記化合物が、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ ＩＤ番号５９４８３６５、５９７６２２８、５９８０７５０、５８０３８８４、６０４９１８４、５９７９２０７、および６１４１５７６からなる群より選択される、請求項１９に記載の組成物。
【請求項３９】
薬剤として許容される担体をさらに含む、請求項１９に記載の組成物。
【請求項４０】
（ａ）請求項１９に記載の組成物と、（２）好適な包装材料と、を含むキット。
【請求項４１】
小胞体ストレスに起因する哺乳類細胞の死を阻害する方法であって、前記細胞を請求項１９に記載の組成物に接触させるステップを含む、方法。
【請求項４２】
小胞体ストレスに関連した、哺乳動物の疾患もしくは症状もしくは傷害を治療する方法であって、治療を必要とする哺乳動物に請求項１９に記載の組成物を投与するステップを含む、方法。
【請求項４３】
前記疾患もしくは症状もしくは傷害が、神経疾患、代謝疾患、虚血障害、心臓および循環系損傷、ウイルス感染、アテローム性動脈硬化、双極性疾患、およびバッテン病からなる群より選択される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記神経疾患が、家族性アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、球脊髄性筋萎縮症／ケネディ病、脊髄小脳失調症３型／マシャド・ジョセフ病、プリオン病、筋萎縮性側索硬化症、およびＧＭ１ガングリオシドーシスからなる群より選択される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記代謝疾患が、糖尿病、ウォルコツト・ラリソン症候群、ウォフラム症候群、２型糖尿病、ホモシステイン血症、Ｚα１−抗トリプシン欠乏症、封入体筋炎、および遺伝性チロシン血症１型からなる群より選択される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記心臓および循環系損傷が、心肥大、低酸素性障害、および家族性高コレステロール血症からなる群より選択される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
前記哺乳動物がヒトである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４８】
ＥＲストレス阻害化合物を必要とする個体に投与するための薬剤を調製する、ＥＲストレス阻害化合物の使用。
【請求項１】
小胞体ストレスに起因する細胞死の阻害剤を同定する方法であって、（ａ）哺乳類細胞をタプシガルジンに接触させ、これによって、前記細胞に小胞体ストレスを引き起こすステップと、（ｂ）前記細胞を試験薬剤に接触させるステップと、（ｃ）前記試験薬剤が小胞体ストレスによって引き起こされる前記細胞の死を阻害するかどうか判断するステップと、を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記哺乳類細胞が、ＣＳＭ１４．１ラット線条体神経前駆細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞の細胞内ＡＴＰ含有量を測定することによって、前記試験薬剤が小胞体ストレスによって引き起こされる前記細胞の死を阻害するかどうかを判断する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞の生物発光を測定することによって、前記細胞の細胞内ＡＴＰ含有量を測定する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記試験薬剤が前記細胞の死を約５０％以上阻害するかどうかを判断する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記試験薬剤が前記細胞の死を約６０％以上阻害するかどうかを判断する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記試験薬剤が、前記細胞の死を約７０％以上阻害するかどうかを判断する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記試験薬剤が前記細胞の死を約８０％以上阻害するかどうかを判断する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記試験薬剤が前記細胞の死を約９０％以上阻害するかどうかを判断する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記試験薬剤が前記細胞の死を約９５％以上阻害するかどうかを判断する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記試験薬剤が約２５μＭ以下のＩＣ５０を有するかどうかを判断する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記試験薬剤が約２０μＭ以下のＩＣ５０を有するかどうかを判断する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記試験薬剤が約１５μＭ以下のＩＣ５０を有するかどうかを判断する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記試験薬剤が約１０μＭ以下のＩＣ５０を有するかどうかを判断する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞をタプシガルジンに接触させた後に、前記細胞を前記試験薬剤に接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞を、マルチウェルプレートのウェルに提供する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記哺乳類細胞がヒト細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
自動化された、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
タプシガルジンにより誘導される小胞体ストレスに起因する哺乳類細胞の死を阻害する化合物を有効量含むことを特徴とする組成物。
【請求項２０】
前記哺乳類細胞が、ＣＳＭ１４．１ラット線条体神経前駆細胞である、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記細胞の死を約５０パーセント以上阻害する、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２２】
前記細胞の死を約６０パーセント以上阻害する、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２３】
ＣＳＭ１４．１ラット線条体神経前駆細胞の死を約７０パーセント以上阻害する、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２４】
ＣＳＭ１４．１ラット線条体神経前駆細胞の死を約８０パーセント以上阻害する、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２５】
ＣＳＭ１４．１ラット線条体神経前駆細胞の死を約９０パーセント以上阻害する、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２６】
ＣＳＭ１４．１ラット線条体神経前駆細胞の死を約９５パーセント以上阻害する、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２７】
約２５μＭ以下のＩＣ５０を有する、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２８】
約２０μＭ以下のＩＣ５０を有する、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２９】
約１５μＭ以下のＩＣ５０を有する、請求項１９に記載の組成物。
【請求項３０】
ＣＳＭ１４．１ラット線条体神経前駆細胞の死を約５０パーセント以上阻害し、かつ約２５μＭ以下のＩＣ５０を有する、請求項１９に記載の組成物。
【請求項３１】
前記化合物が、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ ＩＤ番号５２３０７０７、５３９７３７２、５６６７６８１、５７０６５３２、５８０３８８４、５８４３８７３、５８５０９７０、５８９７０２７、５９２３４８１、５９２６３７７、５９３１３３５、５９３３６９０、５９４７２５２、５９４８３６５、５９５１６１３、５９５４１７９、５９５４６９３、５９５４７５４、５９５５７３４、５９６２２６３、５９６３９５８、５９７４２１９、５９７４５５４、５９７６２２８、５９７９２０７、５９８０７５０、５９８１２６９、５９８４８２１、５９８６９９４、５９９００４１、５９９０１３７、５９９３０４８、５９９８７３４、６０００３９８、６０１５０９０、６０３３３５２、６０３４３９７、６０３４６７４、６０３５０９８、６０３５７２８、６０３７３６０、６０３８３９１、６０４３８１５、６０４４３５０、６０４４５２５、６０４４６２６、６０４４６７３、６０４４８６０、６０４５０１２、６０４６０７０、６０４６８１８、６０４８３０６、６０４８９３５、６０４９０１０、６０４９１８４、６０４９４４８、６０５６５９２、６０６０８４８、６０６２５０５、６０６５７５７、６０６６９３６、６０６８１８９、６０６８６０２、６０６９４７４、６０７０３７９、６０７３８７５、６０７４２５９、６０７４５３２、６０７４８９１、６０８１０２８、６０８４６５２、６０９４９５７、６０９５５７７、６０９５９７０、６１０３９８３、６１０４９３９、６１４１５７６、６２３７７３５、６２３７８７７、６２３７９７３、６２３７９９２、６２３８１９０、６２３８２４６、６２３８４７５、６２３８７６７、６２３９０４８、６２３９２５２、６２３９５０７、６２３９５３８、６２３９９３９、６２４１３７６、６３６８９３１、および６３７０７１０からなる群より選択される、請求項１９に記載の組成物。
【請求項３２】
前記化合物が式Ｉの化合物である、請求項１９に記載の組成物。
【請求項３３】
前記化合物が、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ ＩＤ番号６２３９５０７、６２３７７３５、６２３８４７５、６２３７８７７、６２３９５３８、６２３８７６７、６０４９４４８、５９６３９５８、６２３７９７３、および６０４４６７３からなる群より選択される、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
前記化合物が式ＩＩ−１の化合物である、請求項１９に記載の組成物。
【請求項３５】
前記化合物が、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ ＩＤ番号５９９８７３４、５９５５７３４、５９９００４１、６０３５０９８、および５９９０１３７からなる群より選択される、請求項３４に記載の化合物。
【請求項３６】
前記化合物が式ＩＩ−２の化合物である、請求項１９に記載の組成物。
【請求項３７】
前記化合物が、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ ＩＤ番号５３９７３７２、６０３３３５２、６０３４６７４、および５９５１６１３からなる群より選択される、請求項３６に記載の化合物。
【請求項３８】
前記化合物が、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ ＩＤ番号５９４８３６５、５９７６２２８、５９８０７５０、５８０３８８４、６０４９１８４、５９７９２０７、および６１４１５７６からなる群より選択される、請求項１９に記載の組成物。
【請求項３９】
薬剤として許容される担体をさらに含む、請求項１９に記載の組成物。
【請求項４０】
（ａ）請求項１９に記載の組成物と、（２）好適な包装材料と、を含むキット。
【請求項４１】
小胞体ストレスに起因する哺乳類細胞の死を阻害する方法であって、前記細胞を請求項１９に記載の組成物に接触させるステップを含む、方法。
【請求項４２】
小胞体ストレスに関連した、哺乳動物の疾患もしくは症状もしくは傷害を治療する方法であって、治療を必要とする哺乳動物に請求項１９に記載の組成物を投与するステップを含む、方法。
【請求項４３】
前記疾患もしくは症状もしくは傷害が、神経疾患、代謝疾患、虚血障害、心臓および循環系損傷、ウイルス感染、アテローム性動脈硬化、双極性疾患、およびバッテン病からなる群より選択される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記神経疾患が、家族性アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、球脊髄性筋萎縮症／ケネディ病、脊髄小脳失調症３型／マシャド・ジョセフ病、プリオン病、筋萎縮性側索硬化症、およびＧＭ１ガングリオシドーシスからなる群より選択される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記代謝疾患が、糖尿病、ウォルコツト・ラリソン症候群、ウォフラム症候群、２型糖尿病、ホモシステイン血症、Ｚα１−抗トリプシン欠乏症、封入体筋炎、および遺伝性チロシン血症１型からなる群より選択される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記心臓および循環系損傷が、心肥大、低酸素性障害、および家族性高コレステロール血症からなる群より選択される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
前記哺乳動物がヒトである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４８】
ＥＲストレス阻害化合物を必要とする個体に投与するための薬剤を調製する、ＥＲストレス阻害化合物の使用。
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図４】
【図８】
【図９】
【図１１】
【図２０】
【図２２】
【図２５】
【図２６】
【図１】
【図３】
【図５】
【図６】
【図７】
【図１０】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８−１】
【図１８−２】
【図１９】
【図２１】
【図２３】
【図２４】
【図２７】
【図２Ｂ】
【図４】
【図８】
【図９】
【図１１】
【図２０】
【図２２】
【図２５】
【図２６】
【図１】
【図３】
【図５】
【図６】
【図７】
【図１０】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８−１】
【図１８−２】
【図１９】
【図２１】
【図２３】
【図２４】
【図２７】
【公表番号】特表２０１０−５３０７３６（Ｐ２０１０−５３０７３６Ａ）
【公表日】平成２２年９月１６日（２０１０．９．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５０９３９８（Ｐ２０１０−５０９３９８）
【出願日】平成２０年５月２３日（２００８．５．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００６６３３
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１５３７６０
【国際公開日】平成２０年１２月１８日（２００８．１２．１８）
【出願人】（５０８０８０２４１）バーンハム インスティトゥート フォー メディカル リサーチ (6)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年９月１６日（２０１０．９．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年５月２３日（２００８．５．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００６６３３
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１５３７６０
【国際公開日】平成２０年１２月１８日（２００８．１２．１８）
【出願人】（５０８０８０２４１）バーンハム インスティトゥート フォー メディカル リサーチ (6)
【Ｆターム（参考）】
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