タモギタケ抽出物を有効成分とする抗カンジダ菌剤ならびにカンジダ症予防および／または治療剤
【課題】 菌の増殖抑制効果を備えるなどの優れた抗菌活性を有し、かつ、食用キノコであるタモギタケ由来であることから高い安全性を有する抗菌剤、ヒトにおいて各種ヒトβディフェンシンの産生を促進することができるβディフェンシン産生促進剤、ならびにカンジダ症予防および／または治療剤を提供する。
【解決手段】 タモギタケの水系溶媒抽出物、タモギタケから抽出されるグルコシルセラミド、タモギタケから抽出されるエルゴチオネインおよびタモギタケから抽出されるエルゴステロールパーオキサイドからなる群から選択される１または２以上の物質を有効成分とする。
【解決手段】 タモギタケの水系溶媒抽出物、タモギタケから抽出されるグルコシルセラミド、タモギタケから抽出されるエルゴチオネインおよびタモギタケから抽出されるエルゴステロールパーオキサイドからなる群から選択される１または２以上の物質を有効成分とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タモギタケ抽出物を有効成分とする抗菌剤、βディフェンシン産生促進剤ならびにカンジダ症予防および／または治療剤に関し、より詳細には、タモギタケの水系溶媒抽出物、タモギタケから抽出されるグルコシルセラミド、タモギタケから抽出されるエルゴチオネインおよびタモギタケから抽出されるエルゴステロールパーオキサイドの少なくともいずれかを有効成分とする、抗菌剤、βディフェンシン産生促進剤ならびにカンジダ症予防および／または治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
タモギタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｃｏｒｎｕｃｏｐｉａｅ ｖａｒ． ｃｉｔｒｉｎｏｐｉｌｅａｔｕｓ）はキシメジ科ヒラタケ属に属するキノコである。タモギタケは主に北海道や東北において自生し、食用に用いられており、近年は人工栽培品も販売されている。
【０００３】
タモギタケは食品産業、健康産業、化粧品産業、医薬品産業などにおいて有用な種々の成分を有することが知られており、例えば、特許文献１にはタモギタケの水抽出物を有効成分とする抗菌剤が、特許文献２および特許文献３には本発明者らによりタモギタケの熱水抽出物を有効成分とする抗腫瘍性免疫賦活剤ならびにタモギタケ由来のセラミドを有効成分とする皮膚炎治療剤および皮膚保湿剤が、特許文献４にはタモギタケ由来のエルゴチオネインを有効成分とする抗酸化剤、チロシナーゼ活性阻害剤、リパーゼ活性阻害剤、５α−レダクターゼ活性阻害剤、抗老化剤および抗メタボリックシンドローム剤が、特許文献５にはタモギタケ由来のエルゴステロールパーオキサイドを有効成分とする食品用の変色防止・酸化防止剤がそれぞれ開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００７−１９６１号
【特許文献２】国際公開ＷＯ２００６／０３８５２７号パンフレット
【特許文献３】特開２００７−３０８３９４号
【特許文献４】特開２００９−１２６８６３号
【特許文献５】特開２００９−１８３２６６号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、特許文献１に開示されているタモギタケの水抽出物を有効成分とする抗菌剤は、培養培地において菌の増殖を抑制することが示されているに過ぎず、動物個体で菌の増殖を抑制することは示されていない。また、特許文献２〜特許文献５に記載のタモギタケ熱水抽出物、タモギタケ由来のセラミド、タモギタケ由来のエルゴチオネインおよびタモギタケ由来のエルゴステロールパーオキサイドはいずれも、抗菌剤、βディフェンシン産生促進剤ならびにカンジダ症予防および／または治療剤として用いられているものではない。
【０００６】
本発明は、上述の問題点を解決するためになされたものであって、菌の増殖抑制効果を備えるなどの優れた抗菌活性を有し、かつ、食用キノコであるタモギタケ由来であることから高い安全性を有する抗菌剤、ヒトにおいて各種ヒトβディフェンシンの産生を促進することができるβディフェンシン産生促進剤、ならびにカンジダ症予防および／または治療剤を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、鋭意研究の結果、タモギタケの熱水抽出物が培養培地および口腔カンジダ症モデルマウスの口腔内においてカンジダ菌の増殖を抑制すること、ならびにタモギタケの水系溶媒抽出物、タモギタケから抽出されるグルコシルセラミド、タモギタケから抽出されるエルゴチオネインおよびタモギタケから抽出されるエルゴステロールパーオキサイドがβディフェンシンの産生を促進することを見出し、下記の各発明を完成した。
【０００８】
（１）タモギタケの水系溶媒抽出物、タモギタケから抽出されるグルコシルセラミド、タモギタケから抽出されるエルゴチオネインおよびタモギタケから抽出されるエルゴステロールパーオキサイドからなる群から選択される１または２以上の物質を有効成分とする抗菌剤。
【０００９】
（２）水系溶媒抽出物が熱水抽出物である、（１）に記載の抗菌剤。
【００１０】
（３）タモギタケの水系溶媒抽出物、タモギタケから抽出されるグルコシルセラミド、タモギタケから抽出されるエルゴチオネインおよびタモギタケから抽出されるエルゴステロールパーオキサイドからなる群から選択される１または２以上の物質を有効成分とするβディフェンシン産生促進剤。
【００１１】
（４）βディフェンシンがヒトβディフェンシン−１、ヒトβディフェンシン−２およびヒトβディフェンシン−３からなる群から選択される１または２以上のβディフェンシンである、（３）に記載のβディフェンシン産生促進剤。
【００１２】
（５）水系溶媒抽出物が熱水抽出物である、（３）または（４）に記載のβディフェンシン産生促進剤。
【００１３】
（６）タモギタケの水系溶媒抽出物、タモギタケから抽出されるグルコシルセラミド、タモギタケから抽出されるエルゴチオネインおよびタモギタケから抽出されるエルゴステロールパーオキサイドからなる群から選択される１または２以上の物質を有効成分とするカンジダ症予防および／または治療剤。
【００１４】
（７）口腔乾燥症の患者に用いる、（６）に記載のカンジダ症予防および／または治療剤。
【００１５】
（８）水系溶媒抽出物が熱水抽出物である、（６）または（７）に記載のカンジダ症予防および／または治療剤。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、菌の増殖抑制効果を備えるなどの優れた抗菌活性を有し、かつ、食用キノコであるタモギタケ由来であることから高い安全性を有する抗菌剤、ヒトにおいて各種ヒトβディフェンシンの産生を促進することができるβディフェンシン産生促進剤、ならびにカンジダ症予防および／または治療剤を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】タモギタケ熱水抽出物を添加した培地でカンジダ菌を培養した後、培地の濁度を測定した結果を示す図である。縦軸は濁度（６００ｎｍにおける吸光度）を、横軸はタモギタケ熱水抽出物の添加濃度を変えた各サンプルを示す。
【図２】タモギタケ熱水抽出物を添加した培地で２４時間培養したＨａＣａＴ細胞における、ｈＢＤ−１、ｈＢＤ−２およびｈＢＤ−３のｍＲＮＡ相対発現量を示す図である。縦軸はｍＲＮＡの相対発現量を、横軸はタモギタケ熱水抽出物の添加濃度を変えた各サンプルを示す。
【図３】タモギタケ熱水抽出物の濾液、濾物およびタモギタケ熱水抽出物を添加した培地で２４時間培養したＨａＣａＴ細胞における、ｈＢＤ−３のｍＲＮＡ相対発現量を示す図である。縦軸はｍＲＮＡの相対発現量を、横軸は交換培地にタモギタケ熱水抽出物の濾液、濾物およびタモギタケ熱水抽出物を添加した各サンプルを示す。
【図４】タモギタケ水抽出物を添加した培地で２４時間培養したＨａＣａＴ細胞における、ｈＢＤ−１、ｈＢＤ−２およびｈＢＤ−３のｍＲＮＡ相対発現量を示す図である。縦軸はｍＲＮＡの相対発現量を、横軸はタモギタケ水抽出物の添加濃度を変えた各サンプルを示す。
【図５】タモギタケ酸性水系溶媒抽出物を添加した培地で２４時間培養したＨａＣａＴ細胞における、ｈＢＤ−１、ｈＢＤ−２およびｈＢＤ−３のｍＲＮＡ相対発現量を示す図である。縦軸はｍＲＮＡの相対発現量を、横軸はタモギタケ酸性水系溶媒抽出物の添加濃度を変えた各サンプルを示す。
【図６】タモギタケ塩基性水系溶媒抽出物を添加した培地で２４時間培養したＨａＣａＴ細胞における、ｈＢＤ−１、ｈＢＤ−２およびｈＢＤ−３のｍＲＮＡ相対発現量を示す図である。縦軸はｍＲＮＡの相対発現量を、横軸はタモギタケ塩基性水系溶媒抽出物の添加濃度を変えた各サンプルを示す。
【図７】タモギタケ由来エルゴチオネインを添加した培地で２４時間培養したＨａＣａＴ細胞における、ｈＢＤ−１、ｈＢＤ−２およびｈＢＤ−３のｍＲＮＡ相対発現量を示す図である。縦軸はｍＲＮＡの相対発現量を、横軸はタモギタケ由来エルゴチオネインの添加濃度を変えた各サンプルを示す。
【図８】タモギタケ由来エルゴステロールパーオキサイドを添加した培地で２４時間培養したＨａＣａＴ細胞における、ｈＢＤ−１、ｈＢＤ−２およびｈＢＤ−３のｍＲＮＡ相対発現量を示す図である。縦軸はｍＲＮＡの相対発現量を、横軸はタモギタケ由来エルゴステロールパーオキサイドの添加濃度を変えた各サンプルを示す。
【図９】タモギタケ由来グルコシルセラミドを添加した培地で２４時間培養したＨａＣａＴ細胞における、ｈＢＤ−１、ｈＢＤ−２およびｈＢＤ−３のｍＲＮＡ相対発現量を示す図である。縦軸はｍＲＮＡの相対発現量を、横軸はタモギタケ由来グルコシルセラミドの添加濃度を変えた各サンプルを示す。
【図１０】タモギタケ熱水抽出物を添加した培地で２４時間培養したＮＨＥＫ細胞における、ｈＢＤ−２およびｈＢＤ−３のｍＲＮＡ相対発現量を示す図である。縦軸はｍＲＮＡの相対発現量を、横軸はタモギタケ熱水抽出物の添加濃度を変えた各サンプルを示す。
【図１１】タモギタケ熱水抽出物を添加した培地で２時間培養したＨａＣａＴ細胞における、ｈＢＤ−２およびｈＢＤ−３のｍＲＮＡ相対発現量を示す図である。縦軸はｍＲＮＡの相対発現量を、横軸はタモギタケ熱水抽出物の添加濃度を変えた各サンプルを示す。
【図１２】タモギタケ熱水抽出物の濾液、濾物およびタモギタケ熱水抽出物を添加した培地で２時間培養したＨａＣａＴ細胞における、ｈＢＤ−３のｍＲＮＡ相対発現量を示す図である。縦軸はｍＲＮＡの相対発現量を、横軸は交換培地にタモギタケ熱水抽出物の濾液、濾物およびタモギタケ熱水抽出物を添加した各サンプルを示す。
【図１３】タモギタケ熱水抽出物の超音波処理物を添加した培地で２時間培養したＨａＣａＴ細胞における、ｈＢＤ−３のｍＲＮＡ相対発現量を示す図である。縦軸はｍＲＮＡの相対発現量を、横軸はタモギタケ熱水抽出物の超音波処理物の添加濃度を変えた各サンプルを示す。
【図１４】タモギタケ水抽出物を添加した培地で２時間培養したＨａＣａＴ細胞における、ｈＢＤ−１、ｈＢＤ−２およびｈＢＤ−３のｍＲＮＡ相対発現量を示す図である。縦軸はｍＲＮＡの相対発現量を、横軸はタモギタケ水抽出物の添加濃度を変えた各サンプルを示す。
【図１５】タモギタケ酸性水系溶媒抽出物を添加した培地で２時間培養したＨａＣａＴ細胞における、ｈＢＤ−１、ｈＢＤ−２およびｈＢＤ−３のｍＲＮＡ相対発現量を示す図である。縦軸はｍＲＮＡの相対発現量を、横軸はタモギタケ酸性水系溶媒抽出物の添加濃度を変えた各サンプルを示す。
【図１６】タモギタケ塩基性水系溶媒抽出物を添加した培地で２時間培養したＨａＣａＴ細胞における、ｈＢＤ−１、ｈＢＤ−２およびｈＢＤ−３のｍＲＮＡ相対発現量を示す図である。縦軸はｍＲＮＡの相対発現量を、横軸はタモギタケ塩基性水系溶媒抽出物の添加濃度を変えた各サンプルを示す。
【図１７】タモギタケ由来エルゴチオネインを添加した培地で２時間培養したＨａＣａＴ細胞における、ｈＢＤ−１、ｈＢＤ−２およびｈＢＤ−３のｍＲＮＡ相対発現量を示す図である。縦軸はｍＲＮＡの相対発現量を、横軸はタモギタケ由来エルゴチオネインの添加濃度を変えた各サンプルを示す。
【図１８】スエヒロタケ由来βグルカンまたはマイコプラズマ由来ジアシルリポペプチド（ＦＳＬ−１）と共にタモギタケ熱水抽出物を添加した培地で２時間培養したＮＨＥＫ細胞における、ｈＢＤ−２およびｈＢＤ−３のｍＲＮＡ相対発現量を示す図である。縦軸はｍＲＮＡの相対発現量を、横軸は交換培地にスエヒロタケ由来βグルカン、大麦由来βグルカン、ＦＳＬ−１、タモギタケ熱水抽出物、タモギタケ熱水抽出物＋スエヒロタケ由来βグルカン、ＦＳＬ−１＋スエヒロタケ由来βグルカンおよびタモギタケ熱水抽出物＋ＦＳＬ−１を添加した各サンプルを示す。
【図１９】タモギタケ熱水抽出物を含有する口腔用ジェルを投与した口腔カンジダ症モデルマウスの舌における、カンジダ菌の生菌数を示すグラフである。縦軸はカンジダ菌の生菌数を、横軸は口腔用ジェルを投与しなかった群（コントロール群）および口腔用ジェルを投与した群（ジェル投与群）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明に係る抗菌剤、βディフェンシン産生促進剤ならびにカンジダ症予防および／または治療剤について詳細に説明する。本発明に係る抗菌剤は、タモギタケの水系溶媒抽出物、タモギタケから抽出されるグルコシルセラミド、タモギタケから抽出されるエルゴチオネインおよびタモギタケから抽出されるエルゴステロールパーオキサイドからなる群から選択される１または２以上の物質を有効成分とする。
【００１９】
本発明において、タモギタケは天然に自生しているものでもよく、人工栽培されたものでもよい。また、生のタモギタケでもよく、乾燥させたものや、乾燥させた上で粉末にしたものなど、採取した後に加工を施されたものでもよい。
【００２０】
本発明において、タモギタケの水系溶媒抽出物とは、水系溶媒によりタモギタケから抽出された成分を含有する液体状、半固体状または固体状の物質、もしくはこれらの物質から選択される１または２以上の物質の混合物をいう。ここで、本発明において、水系溶媒とは極性溶媒を主体とした溶媒であれば特に限定されず、１種類の溶媒からなるものでもよく、２種類以上の溶媒を混合したものでもよい。そのような極性溶媒としては、例えば、水、メタノール、エタノール、酢酸、ギ酸、１−ブタノール、１−プロパノール、２−プロパノールなどを挙げることができるが、水が好ましい。
【００２１】
また、本発明において、水系溶媒は、水または水系溶媒に予め適当な溶質を混合または溶解させて水系溶媒としてもよく、そのような水系溶媒としては、例えば、水にクエン酸を混合または溶解させたもの、水に重曹を混合または溶解させたもの、食塩を酢酸に混合または溶解させたものなどを挙げることができるが、クエン酸水溶液、重曹水溶液および食塩酢酸溶液が好ましい。
【００２２】
また、本発明において、水系溶媒は、酸性、中性および塩基性のいずれでもよく、水系溶媒の温度もまた、その機能が損なわれない限りにおいて特に限定されず、低温の他、常温、高温でもよい。なお、本発明においては、熱水を好適な水系溶媒として用いることができる。
【００２３】
本発明において、タモギタケの水系溶媒抽出物は定法に従い製造することができ、例えば、水系溶媒にタモギタケを投入し、加熱または粉砕・攪拌した後、濾過などにより固液分離し、液体成分を回収することにより製造することができる。製造されたタモギタケの水系溶媒抽出物は、さらに、限外濾過や超音波処理などを行ってもよく、そのような限外濾過物（濾液および濾物）や超音波処理物などもまた、タモギタケの水系溶媒抽出物であり、本発明に包含される。
【００２４】
本発明において、タモギタケから抽出されるグルコシルセラミドは、当業者が適宜選択することができる公知あるいは新たな手法に従って製造することができ、例えば、茹でたタモギタケを乾燥させ、粉砕して粉末としたものをエタノールに入れて加熱・抽出し、得られた抽出液をＮａＯＨ水溶液によりケン化した後、希塩酸によりｐＨを調整し、遠心分離を行って上清を除去したものにエタノールを添加して沈殿物を回収し、この沈殿物について、シリカゲルカラムとクロロホルム／メタノール溶液とを用いてカラムクロマトグラフィーによる精製を繰り返すという方法を挙げることができる。
【００２５】
本発明において、タモギタケから抽出されるエルゴチオネインもまた、当業者により適宜選択することができる公知あるいは新たな手法に従って製造することができ、例えば、タモギタケを煮出して得た煮汁をイオン交換樹脂に供した後、その樹脂から陽イオン性化合物を溶出し、溶出液を濃縮し、これを高速液体クロマトグラフィーにより分離・精製し、凍結乾燥するという方法を挙げることができる。
【００２６】
本発明において、タモギタケから抽出されるエルゴチステロールパーオキサイドもまた、当業者により適宜選択することができる公知あるいは新たな手法に従って製造することができ、例えば、上述のグルコシルセラミドを製造する方法と同様の方法を行い、カラムクロマトグラフィーによる精製の際に、グルコシルセラミドに代えてエルゴステロールパーオキサイドを含む溶出液を選択するという方法を挙げることができる。
【００２７】
本発明において、タモギタケの水系溶媒抽出物、タモギタケから抽出されるグルコシルセラミド、タモギタケから抽出されるエルゴチオネインおよびタモギタケから抽出されるエルゴステロールパーオキサイドの製造の際には、必要とする純度や形状などに応じて、粉砕、精製、濃縮、乾燥、滅菌などを行ってもよい。
【００２８】
粉砕方法としては、例えば、ロール式粉砕機などにより押しつぶす方法、フードプロセッサーなどにより切断する方法、ボールミル粉砕機などにより磨り潰す方法、ハンマー式粉砕機などにより打撃を与えて粉砕する方法などを、精製方法としては、例えば、濾過法、蒸留法、再結晶法、再沈殿法、各種のクロマトグラフィーを用いた方法などを、濃縮方法としては、例えば、煮沸濃縮法、エバポレーターなどによる真空濃縮（減圧濃縮）法、凍結濃縮法、逆浸透膜などを用いた膜濃縮法などを、滅菌方法としては、例えば、オートクレーブを用いた方法、高周波法、フィルター濾過法などを、それぞれ挙げることができる。
【００２９】
本発明に係る抗菌剤は、微生物の増殖を抑制する作用を有しているが、本発明において、「微生物の増殖を抑制する」とは、微生物の分裂を抑制することにより増殖を抑制する場合のほか、微生物を殺傷することにより増殖を抑制する場合が含まれる。
【００３０】
また、「微生物の増殖を抑制する作用」には、微生物に直接的に働きかけることにより微生物の増殖を抑制する作用（直接的作用）のほか、生体の抗菌ペプチド産生細胞に作用して抗菌ペプチドの産生を促進させ、産生された抗菌ペプチドが微生物の増殖を抑制する作用（間接的作用）が含まれる。
【００３１】
なお、本発明において「増殖を抑制する」は、「増殖を阻害する」、「増殖を阻止する」、「増殖を予防する」と、「産生を促進する」は、「産生を増大させる」、「産生を増強させる」、「産生を増進する」、「産生を亢進する」、「産生を刺激する」、「産生能を賦活する」と交換可能に用いられる。
【００３２】
抗菌ペプチドとは、微生物からヒトを含めた動物や植物まで、幅広い生物の細胞において産生され、微生物に対する殺傷作用、あるいは分裂の抑制、阻害などのような静菌的作用を有するペプチドの総称である。なお、本発明において抗菌ペプチドは特に限定されず、例えば、αディフェンシン、βディフェンシン、θディフェンシン、Ｃａｔｈｅｌｉｃｉｄｉｎ、ダームシジン、Ｈｅｐｃｉｄｉｎ／ＬＥＡＰ−１、ヒスタチンなどを挙げることができる。
【００３３】
すなわち、本発明に係る抗菌剤は、微生物の増殖抑制や、微生物により引き起こされる疾病の予防や治療に有効であり、例えば、ヒトを含む動物に対して医薬品や医薬部外品に添加、配合して用いることができるほか、農作物などの植物の疫病を防ぐ農薬に用いることができる。また、微生物は、細菌や真菌のみならず、例えば、ウイルス、ウイロイド、リケッチア、クラミジア、マイコプラズマ、スピロヘータ、原虫、蠕虫など、あらゆる微生物を挙げることができる。このような微生物により引き起こされる疾病としては、微生物の感染による感染症のほか、微生物の生産する毒素による中毒症やアレルギー症などを挙げることができ、例えば、カンジダ症、クリプトコッカス感染症、アスペルギルス症、ニューモシスチス肺炎、う蝕、食中毒、ＨＩＶ感染症、白癬（水虫、たむし、しらくもなど）、とびひ、水痘、ヘルペスウィルス感染症、サイトメガロウイルス感染症、ＭＲＳＡ感染症、緑膿菌感染症、レジオネラ肺炎、セラチア感染症、トキソプラズマ症、クリプトスポリジウム症などを挙げることができる。
【００３４】
本発明に係る抗菌剤はまた、食品や化粧料に添加して、その保存性を高めるために用いることができるほか、物品に添加、配合して腐食を防ぐため、衛生的状態を保持するため、あるいは悪臭を防ぐために用いることができる。
【００３５】
次に、本発明は、βディフェンシン産生促進剤を提供する。本発明に係るβディフェンシン産生促進剤は、タモギタケの水系溶媒抽出物、タモギタケから抽出されるグルコシルセラミド、タモギタケから抽出されるエルゴチオネインおよびタモギタケから抽出されるエルゴステロールパーオキサイドからなる群から選択される１または２以上の物質を有効成分とする。
【００３６】
抗菌ペプチドの一種であるディフェンシンは、分子内にシステイン残基を有し、それがジスルフィド結合により高次構造を形成していることを特徴とする抗菌ペプチドのファミリーのひとつであり、αディフェンシン、βディフェンシンおよびθディフェンシンに大別される。ディフェンシンは、陽性荷電しているため、陰性に荷電した菌体膜に挿入されて小孔を形成し、菌体内容物が小孔から流出することにより抗菌作用を発揮することが知られている。
【００３７】
βディフェンシンは、生体内において主に白血球や上皮細胞から産生されるディフェンシンであり、近年、局所の感染防御のみならず、上皮組織の組織修復や樹状細胞、Ｔリンパ球、単球などを遊走させることによる獲得免疫にも関与していることが報告されている（Ｙａｎｇ Ｄ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２８６巻、第５２５頁、１９９９年；Ｔｅｒｒｉｔｏ Ｍ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．第８４巻、第２０１７頁、１９８９年；Ｌｉｌｌａｒｄ Ｊ．Ｗ．Ｊｒ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、第９６巻、第６５１頁、１９９９年；長岡 功ら、臨床免疫、第３３巻、第５７７頁、２０００年）。また、腫瘍免疫を誘導して、抗腫瘍効果を発揮することやガン細胞で増殖抑制作用があることも報告されている（長岡 功ら、臨床免疫、第４０巻、第４号、第４２４頁、２００３年；Ｂｙｒａｇｙｎ Ａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第１６７巻、第６６４４頁、２００１年）。
【００３８】
すなわち、本発明に係るβディフェンシン産生促進剤は、微生物により引き起こされる疾病の予防や治療に有効であり、例えば、ヒトを含む動物に対して医薬品や医薬部外品に添加、配合して用いることができるほか、農作物などの植物の疫病を防ぐ農薬に用いることができる。また、本発明に係るβディフェンシン産生促進剤は、感染、炎症その他の傷害からの回復、癌の治療、免疫増強、荒れ肌・乾燥肌・手荒れなどのスキンケア、口臭防止、足臭防止などのために用いることができる。
【００３９】
本発明において、βディフェンシンの種類としては、例えば、βディフェンシン−１、βディフェンシン−２、βディフェンシン−３、βディフェンシン−４などを挙げることができ、由来する生物としては、例えば、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓなどの細菌、アシタバ、カラシナなどの植物、クロチャワンタケなどの菌類、クモ、サソリ、トンボなどの昆虫、イガイなどの軟体動物、イセエビなどの甲殻類、ニワトリなどの鳥類、カエルなどの両生類、ヒト、サル（ヒトを除く霊長目）、牛、ブタ、羊、ヤギ、イヌ、ネコなどの哺乳類などを挙げることができるが、ヒトが好ましい。
【００４０】
次に、本発明は、カンジダ症予防および／または治療剤を提供する。本発明に係るカンジダ症予防および／または治療剤は、タモギタケの水系溶媒抽出物、タモギタケから抽出されるグルコシルセラミド、タモギタケから抽出されるエルゴチオネインおよびタモギタケから抽出されるエルゴステロールパーオキサイドからなる群から選択される１または２以上の物質を有効成分とする。
【００４１】
カンジダ症はＣ．ａｌｂｉｃａｎｓに代表されるカンジダ菌により引き起こされる感染症である。カンジダ菌はヒトの体表や消化管、膣粘膜などに常時生息しており、健常人には特に何の影響も与えないが、体調が悪いときや免疫力が低下しているときなどに、疾病を引き起こす日和見感染菌である。本発明に係るカンジダ症予防および／または治療剤は、カンジダ菌に直接的に働きかけることによってその増殖を抑制する作用（直接的作用）のほか、生体の抗菌ペプチド産生細胞に作用して抗菌ペプチドの産生を促進させ、産生された抗菌ペプチドがカンジダ菌の増殖を抑制する作用（間接的作用）を有している。
【００４２】
本発明におけるカンジダ症としては、例えば、皮膚カンジダ症、口腔カンジダ症、性器カンジダ症、口内炎、口角炎、胃鼓脹症、カンジダ敗血症などを挙げることができ、このうちの口腔カンジダ症は、口腔乾燥症（ドライマウス）の患者に頻発することが知られている。口腔乾燥症（ドライマウス）は口腔内が乾燥して、喉や口の渇き、痛み、口臭、味覚異常などの症状を呈する疾病であるが、口腔内の乾燥は、粘膜上皮の抵抗力低下や口腔内常在菌のバランスの崩れを招くことから、カンジダ菌が口腔上皮内に侵入して口腔カンジダ症を引き起こすと考えられている。本発明に係るカンジダ症および／または治療剤は、このような口腔カンジダ症に、特に有効である。
【００４３】
本発明に係る抗菌剤、βディフェンシン産生促進剤ならびにカンジダ症予防および／または治療剤の製剤化には、当業者に公知の方法を用いることができる。投与形態もまた、当業者によって適宜選択することができる投与形態でよく、そのような投与形態としては、例えば、経口投与製剤として調製する場合の、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、コーティング剤、液剤、懸濁剤などの形態を挙げることができ、非経口投与製剤にする場合の、ジェル剤、吸入剤、注射剤、点滴剤、座薬、塗布剤、噴霧剤、貼付剤、軟膏、クリームなどの形態を挙げることができる。また、その投与量は、医薬組成物の製剤形態、投与方法、使用目的およびこれに適用される投与対象の年齢、体重、症状によって適宜設定することができる。
【００４４】
皮膚外用剤として用いられる場合は、その剤型は適宜選択することができ、例えば、溶液系、可溶化系、乳化系、粉末分散系、水−油二層系、水−油−粉末三層系、ジェル、ミスト、スプレー、ムース、ロールオン、スティックなどの他、不織布などのシートに含浸ないし塗布した製剤などを挙げることができる。また、本発明に係る抗菌剤、βディフェンシン産生促進剤ならびにカンジダ症予防および／または治療剤に、例えば、植物油などの油脂類、ラノリンやミツロウなどのロウ類、炭化水素類、脂肪酸、高級アルコール類、エステル類、各種界面活性剤、色素、香料、ビタミン類、植物や動物の抽出成分、紫外線吸収剤、抗酸化剤、防腐剤、殺菌剤などの、通常の皮膚外用剤の原料として使用されているものを適宜配合し、皮膚外用剤を製造することができる。また、抗炎症性の皮膚外用剤原料であるグリチルレチン酸などの甘草抽出成分、塩酸ジフェンヒドラミン、アズレン、ｄｌ−α−トコフェロールおよびその誘導体、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６などとともに用いることができる。
【００４５】
食品添加物として用いられる場合は、その形態は適宜選択することができ、例えば、本発明に係る抗菌剤、βディフェンシン産生促進剤ならびにカンジダ症予防および／または治療剤をそのまま食品として調製したもの、他の食品に添加したもの、あるいは、カプセル、錠剤等、食品または健康食品に通常用いられる任意の形態を挙げることができる。また、食品中に配合して摂取あるいは投与する場合には、適宜、賦形剤、増量剤、結合剤、増粘剤、乳化剤、着色料、香料、食品添加物、調味料などと混合し、用途に応じて、粉末、顆粒、錠剤等の形に成形することができる。さらには、食品原料中に混合して食品を調製し、機能性食品として製品化することによって摂取することができる。
【００４６】
以下、本発明に係る抗菌剤、βディフェンシン産生促進剤ならびにカンジダ症予防および／または治療剤について、実施例に基づいて説明する。なお、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。
【実施例】
【００４７】
＜実施例１＞カンジダ菌増殖抑制効果の確認
（１）タモギタケ熱水抽出物の調製
生のタモギタケ１５０ｋｇ〜２００ｋｇを水２００Ｌに入れて加熱し、沸騰させた状態で５分間煮出した後、濾過して１５０Ｌの濾液を得ることにより、タモギタケ熱水抽出物を調製した。
【００４８】
（２）サンプルの調製
６ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ社）の各ウェルにブレインハートフュージョン培地（ＢＨＩ培地；栄研化学社）を入れたものを４枚準備し、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤとして、計４サンプルを調製した。各サンプルの各ウェルに、カンジダ菌（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ ＡＴＣＣ９００２８株）を、培養液の６００ｎｍにおける吸光度が０．０１〜０．０５となるよう植菌した後、Ｂ、ＣおよびＤの各ウェルに、本実施例（１）で調製したタモギタケ熱水抽出物を、それぞれ、６％（ｖ／ｖ）、８％（ｖ／ｖ）および６０％（ｖ／ｖ）となるように添加した。なお、何も添加しないＡのウェルをコントロールとした。
【００４９】
（３）カンジダ菌の培養および濁度の測定
本実施例（２）のＡ、Ｂ、ＣおよびＤを２５℃にて１６時間培養した。次に、カンジダ菌生菌数の指標として、培養後の培地について、分光光度計（ＢｉｏＲａｄ社）を用いて波長６００ｎｍにおける吸光度を測定することにより、濁度を求めた。続いて、サンプルごとに各ウェルにおける濁度の平均値と標準偏差を算出した。また、算出したＢ、ＣおよびＤにおける結果について、Ａにおける結果との間でマンホイットニーのＵ検定を行った。その結果を図１に示す。図中の＊は、検定の結果、統計的に有意であることを示す（ｐ＜０．０５）。
【００５０】
図１に示すように、濁度の大きさはＡ＞Ｂ＞Ｃ＞Ｄであり、Ａにおける濁度を１００％とすると、Ｂ、ＣおよびＤにおける濁度はそれぞれ約９２％、約８２％および５８〜７１％であった。すなわち、培地に添加したタモギタケ熱水抽出物の濃度が大きい場合ほど、カンジダ菌の生菌数が小さいことが確認された。
【００５１】
これらの結果から、タモギタケ熱水抽出物はカンジダ菌の増殖を抑制することが明らかになった。
【００５２】
＜実施例２＞ヒトβ−ディフェンシン産生促進効果の検討
（１）タモギタケ熱水抽出物のヒトβ−ディフェンシン産生促進効果の検討
［１−１］サンプルの調製および培養
ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社）およびペニシリン・ストレプトマイシン（シグマ社）をそれぞれ１０％（ｖ／ｖ）および２％（ｖ／ｖ）の終濃度で含むＤＭＥＭ培地（シグマ社）を調製し、Ｆ−Ｐ−ＤＭＥＭ培地とした。Ｆ−Ｐ−ＤＭＥＭ培地に、ヒト不死化ケラチノサイト細胞（ＨａＣａＴ細胞；東京歯科大学病理学講座村松敬氏提供）を１×１０５個／ｍＬとなるよう添加して、細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液３ｍＬを６０ｍｍディッシュ（ＩＷＡＫＩ社）に入れたものを５枚準備し、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥとして、計５サンプルを調製した。続いて、各サンプルを３７℃、ＣＯ２５％（ｖ／ｖ）の環境下にて、８０％コンフルエントに達するまで、約３日間培養した。
【００５３】
［１−２］タモギタケ熱水抽出物を添加した培地での培養
実施例１（１）で調製したタモギタケ熱水抽出物を、ＤＤＷを用いて希釈して、それぞれ、２％（ｖ／ｖ）、２０％（ｖ／ｖ）および４０％（ｖ／ｖ）の熱水抽出物水溶液を調製した。次に、ＤＤＷ、２％（ｖ／ｖ）、２０％（ｖ／ｖ）、４０％（ｖ／ｖ）の熱水抽出物水溶液および実施例１（１）で調製したタモギタケ熱水抽出物をそれぞれ２５％（ｖ／ｖ）となるようＦ−Ｐ−ＤＭＥＭ培地に添加して、コントロール用交換培地とタモギタケ熱水抽出物を下記の終濃度で含む交換培地とを調製した。本実施例（１）［１−１］の各サンプルの培地を、調製した交換培地に下記のとおり交換した後、本実施例（１）［１−１］に記載の環境下にて、さらに２４時間培養した。
【００５４】
交換培地に添加したものおよびタモギタケ熱水抽出物の終濃度
Ａ ：ＤＤＷ （コントロール用交換培地）
Ｂ ：タモギタケ熱水抽出物 終濃度０．５％（ｖ／ｖ）
Ｃ ：タモギタケ熱水抽出物 終濃度 ５％（ｖ／ｖ）
Ｄ ：タモギタケ熱水抽出物 終濃度 １０％（ｖ／ｖ）
Ｅ ：タモギタケ熱水抽出物 終濃度 ２５％（ｖ／ｖ）
【００５５】
［１−３］ＲＮＡの抽出およびｃＤＮＡの作製
本実施例（１）［１−２］の各サンプルから細胞を回収した後、ＴＲＩｚｏｌ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて細胞中の全ＲＮＡを抽出した。続いて、抽出した全ＲＮＡの１０％（ｖ／ｖ）容量のクロロホルムを添加して、１３０００ｒｐｍ、４℃の条件下で１０分間遠心分離を行った後、水層を回収した。次に、等量のイソプロパノールを添加して、１３０００ｒｐｍ、４℃の条件下で１０分間遠心分離を行った後、上清を除去し、７０％（ｖ／ｖ）エタノール６００μＬを添加して沈殿物を洗浄した。その後、沈殿物を滅菌ＤＥＰＣ処理水に溶解し、全ＲＮＡ溶液を得た。この全ＲＮＡ溶液から適量を分取し、分光光度計ＮａｎｏＤｒｏｐ ＮＤ−１０００（ＮａｎｏＤｒｏｐ ｐｒｏｄｕｃｔｓ社）を用いて波長２６０ｎｍにおける吸光度を測定することにより、濃度を測定した。
【００５６】
続いて、全ＲＮＡ２μｇを含む全ＲＮＡ溶液を鋳型として、オリゴｄＴ１２−１８プライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）およびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、付属の使用書に従い、ｃＤＮＡを作製した。
【００５７】
［１−４］定量ＰＣＲ法によるヒトβ−ディフェンシンｍＲＮＡの定量
本実施例（１）［１−３］のｃＤＮＡを鋳型として、ヒトβ−ディフェンシン−１（ｈＢＤ−１）、ヒトβ−ディフェンシン−２（ｈＢＤ−２）、ヒトβ−ディフェンシン−３（ｈＢＤ−３）およびグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）について、Ｔａｑ Ｍａｎ ７３００ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）およびＴａｑ Ｍａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、付属の使用書に従い、定量ＰＣＲ法を行い、一定の増幅産物量になるサイクル数（Ｃｔ値）を測定した。定量ＰＣＲ法に用いたプライマーおよびプローブは下記のとおりである。
【００５８】
定量ＰＣＲに用いたプライマー・プローブ
Ｔａｑ Ｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）；
ｈＢＤ−１の増幅に用いたプライマー・プローブ：ＡｓｓａｙＩＤ Ｈｓ００６０８３４５＿ｍ１
ｈＢＤ−２の増幅に用いたプライマー・プローブ：ＡｓｓａｙＩＤ Ｈｓ００８２３６３８＿ｍ１
ｈＢＤ−３の増幅に用いたプライマー・プローブ：ＡｓｓａｙＩＤ Ｈｓ００２１８６７８＿ｍ１
ＧＡＰＤＨの増幅に用いたプライマー・プローブ：ＡｓｓａｙＩＤ Ｈｓ９９９９９９０５＿ｍ１
【００５９】
続いて、測定した結果に基づき、ＡにおけるＣｔ値を基準値とし、ＧＡＰＤＨのＣｔ値を内在コントロールとして比較Ｃｔ法を行うことにより、ｈＢＤ−１、ｈＢＤ−２およびｈＢＤ−３のｍＲＮＡ相対発現量を算出した。
【００６０】
本実施例（１）［１−１］〜［１−４］の実験を３回以上繰り返し、各サンプルにおけるｈＢＤ−１、ｈＢＤ−２およびｈＢＤ−３のｍＲＮＡ相対発現量について、平均値および標準偏差を算出した。また、算出したＢ、ＣおよびＤにおける結果について、Ａにおける結果との間でマンホイットニーのＵ検定を行った。その結果を図２に示す。図中の＊は、検定の結果、統計的に有意であることを示す（ｐ＜０．０５）。
【００６１】
図２上段に示すように、ｈＢＤ−１のｍＲＮＡ相対発現量について、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥのいずれも、Ａとほとんど変わらなかった。
【００６２】
また、図２中段に示すように、ｈＢＤ−２のｍＲＮＡ相対発現量について、ＢはＡと比較してほとんど変わらなかったが、ＣおよびＥは、Ａと比較して大きい傾向があり、ＤはＡと比較して有意に大きかった。すなわち、タモギタケ熱水抽出物を添加した培地でＨａＣａＴ細胞を培養した場合は、それを添加しないで培養した場合と比較して、ｈＢＤ−２のｍＲＮＡ発現量が増加することが確認された。
【００６３】
また、図２下段に示すように、ｈＢＤ−３のｍＲＮＡ相対発現量について、ＢおよびＥは、Ａと比較して大きい傾向があり、ＣおよびＤは、Ａと比較して有意に大きかった。すなわち、タモギタケ熱水抽出物を添加した培地でＨａＣａＴ細胞を培養した場合は、それを添加しないで培養した場合と比較して、ｈＢＤ−３のｍＲＮＡ発現量が増加することが確認された。
【００６４】
これらの結果から、タモギタケ熱水抽出物は、ＨａＣａＴ細胞に２４時間作用させた場合に、ｈＢＤ−２およびｈＢＤ−３の産生を促進することが明らかになった。
【００６５】
（２）タモギタケ熱水抽出物の濾液および濾物のヒトβ−ディフェンシン産生促進効果の検討
［２−１］タモギタケ熱水抽出物の濾液および濾物の調製
実施例１（１）で調製したタモギタケ熱水抽出物１５０ｍＬについて、分画分子量１０００の限外濾過膜を用いて限外濾過を行い、２５ｍＬの濾液および濾物（乾燥重量；０．２ｇ）を得た。
【００６６】
［２−２］サンプルの調製および培養
本実施例（１）［１−１］に記載の方法により、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤの計４サンプルをを調製し、培養した。
【００６７】
［２−３］タモギタケ熱水抽出物の濾液および濾物を添加した培地での培養
本実施例（２）［２−１］の濾物をＤＤＷに溶解し、１ｍｇ／ｍＬの濾物水溶液を調製した。次に、ＤＤＷ、本実施例（２）［２−１］の濾液、濾物水溶液および実施例１（１）で調製した熱水抽出物をそれぞれ１０％（ｖ／ｖ）となるようＦ−Ｐ−ＤＭＥＭ培地に添加して、コントロール用交換培地と濾液、濾物およびタモギタケ熱水抽出物を含む交換培地とを調製した。本実施例（２）［２−２］のＡ、Ｂ、ＣおよびＤの培地を、調製した交換培地に下記のとおり交換した後、本実施例（１）［１−１］に記載の環境下にて、さらに２４時間培養した。
【００６８】
交換培地に添加したもの
Ａ ：ＤＤＷ（コントロール用交換培地）
Ｂ ：濾液
Ｃ ：濾物
Ｄ ：タモギタケ熱水抽出物
【００６９】
［２−４］ＲＮＡの抽出およびｃＤＮＡの作製、ならびに定量ＰＣＲ法によるｈＢＤ−３ｍＲＮＡの定量
本実施例（２）［２−３］の各サンプルについて、本実施例（１）［１−３］に記載の方法によりＲＮＡの抽出およびｃＤＮＡの作製を行った後、本実施例（１）［１−４］に記載の方法により定量ＰＣＲ法を行い、ｈＢＤ−３ｍＲＮＡの定量を行った。また、算出したＢ、ＣおよびＤにおける結果について、Ａにおける結果との間でマンホイットニーのＵ検定を行った。その結果を図３に示す。図中の＊は、Ｕ検定の結果、統計的に有意であることを示す（ｐ＜０．０５）。
【００７０】
図３に示すように、ｈＢＤ−３のｍＲＮＡ相対発現量について、その大きさはＡ＜Ｂ＜Ｃ＜Ｄであり、Ｂ、ＣおよびＤは、Ａと比較していずれも有意に大きかった。
【００７１】
これらの結果から、タモギタケ熱水抽出物について、分画分子量１０００の限外濾過膜を通過した画分（濾液）とそれを通過しなかった画分（濾物）とは、いずれもＨａＣａＴ細胞に２４時間作用させた場合に、ｈＢＤ−３の産生を促進することが明らかになった。
【００７２】
（３）タモギタケ水抽出物のヒトβ−ディフェンシン産生促進効果の検討
［３−１］タモギタケ水抽出物の調製
フードプロセッサーに生のタモギタケ１００ｇと水１００ｇとを投入し、粉砕した後、濾布を用いて濾過し、７０ｍＬの濾液を得た。得られた濾液のｐＨを測定したところ、ｐＨ６．０８であった。続いて、オートクレーブ装置を用いて、濾液を１２０℃で１５分間滅菌処理した。
【００７３】
［３−２］サンプルの調製および培養、ならびにタモギタケ水抽出物を添加した培地での培養
本実施例（１）［１−１］に記載の方法により、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥの計５サンプルを調製し、培養した。続いて、実施例１（１）で調製したタモギタケ熱水抽出物に代えて、本実施例（３）［３−１］で調製したタモギタケ水抽出物を用いて、本実施例（１）［１−２］に記載の方法により、タモギタケ水抽出物を添加した培地での培養を行った。
【００７４】
［３−３］ＲＮＡの抽出およびｃＤＮＡの作製、ならびに定量ＰＣＲ法によるヒトβ−ディフェンシンｍＲＮＡの定量
本実施例（３）［３−２］の各サンプルについて、本実施例（１）［１−３］に記載の方法により、ＲＮＡの抽出およびｃＤＮＡの作製を行った後、本実施例（１）［１−４］に記載の方法により定量ＰＣＲ法を行い、ヒトβ−ディフェンシンｍＲＮＡの定量を行った。また、算出したＢ、Ｃ、ＤおよびＥにおける結果について、Ａにおける結果との間でマンホイットニーのＵ検定を行った。その結果を図４に示す。図中の＊は、Ｕ検定の結果、統計的に有意であることを示す（ｐ＜０．０５）。
【００７５】
図４上段に示すように、ｈＢＤ−１のｍＲＮＡ相対発現量について、ＢはＡと比較してほとんど変わらなかったが、Ｃ、ＤおよびＥは、Ａと比較して有意に大きかった。すなわち、タモギタケ水抽出物を添加した培地でＨａＣａＴ細胞を培養した場合は、それを添加しないで培養した場合と比較して、ｈＢＤ−１のｍＲＮＡ発現量が増加することが確認された。
【００７６】
また、図４中段に示すように、ｈＢＤ−２のｍＲＮＡ相対発現量について、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥのいずれも、Ａと比較してほとんど変わらなかった。
【００７７】
また、図４下段に示すように、ｈＢＤ−３のｍＲＮＡ相対発現量について、ＢおよびＣは、Ａと比較してほとんど変わらなかったが、ＤおよびＥは、Ａと比較して有意に大きかった。すなわち、タモギタケ水抽出物を添加した培地でＨａＣａＴ細胞を培養した場合は、それを添加しないで培養した場合と比較して、ｈＢＤ−３のｍＲＮＡ発現量が増加することが確認された。
【００７８】
これらの結果から、タモギタケ水抽出物は、ＨａＣａＴ細胞に２４時間作用させた場合に、ｈＢＤ−１およびｈＢＤ−３の産生を促進することが明らかになった。
【００７９】
（４）タモギタケ酸性溶媒抽出物のヒトβ−ディフェンシン産生促進効果の検討
［４−１］タモギタケ酸性溶媒抽出物の調製
水を０．４％（ｗ／ｗ）クエン酸水溶液に代えて、本実施例（３）［３−１］に記載の方法によりタモギタケの抽出物を調製し、これをタモギタケ酸性溶媒抽出物とした。なお、オートクレーブによる滅菌処理を行う前の濾液のｐＨは、ｐＨ４．６１であった。
【００８０】
［４−２］サンプルの調製および培養、ならびにタモギタケ酸性溶媒抽出物を添加した培地での培養
本実施例（１）［１−１］に記載の方法により、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥの計５サンプルをを調製し、培養した。続いて、実施例１（１）で調製したタモギタケ熱水抽出物に代えて、本実施例（４）［４−１］で調製したタモギタケ酸性溶媒抽出物を用いて、本実施例（１）［１−２］に記載の方法により、タモギタケ酸性溶媒抽出物を添加した培地での培養を行った。
【００８１】
［４−３］ＲＮＡの抽出およびｃＤＮＡの作製、ならびに定量ＰＣＲ法によるヒトβ−ディフェンシンｍＲＮＡの定量
本実施例（４）［４−２］の各サンプルについて、本実施例（１）［１−３］に記載の方法により、ＲＮＡの抽出およびｃＤＮＡの作製を行った後、本実施例（１）［１−４］に記載の方法により定量ＰＣＲ法を行い、ヒトβ−ディフェンシンｍＲＮＡの定量を行った。また、算出したＢ、Ｃ、ＤおよびＥにおける結果について、Ａにおける結果との間でマンホイットニーのＵ検定を行った。その結果を図５に示す。図中の＊は、Ｕ検定の結果、統計的に有意であることを示す（ｐ＜０．０５）。
【００８２】
図５上段に示すように、ｈＢＤ−１のｍＲＮＡ相対発現量について、Ｂ、ＣおよびＤは、Ａと比較してほとんど変わらなかったが、ＥはＡと比較して有意に大きかった。すなわち、タモギタケ酸性溶媒抽出物を添加した培地でＨａＣａＴ細胞を培養した場合は、それを添加しないで培養した場合と比較して、ｈＢＤ−１のｍＲＮＡ発現量が増加することが確認された。
【００８３】
また、図５中段に示すように、ｈＢＤ−２のｍＲＮＡ相対発現量について、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥのいずれも、Ａと比較してほとんど変わらなかった。
【００８４】
また、図５下段に示すように、ｈＢＤ−３のｍＲＮＡ相対発現量について、ＢおよびＣは、Ａと比較してほとんど変わらなかったが、ＤおよびＥは、Ａと比較して有意に大きかった。すなわち、タモギタケ酸性溶媒抽出物を添加した培地でＨａＣａＴ細胞を培養した場合は、それを添加しないで培養した場合と比較して、ｈＢＤ−３のｍＲＮＡ発現量が増加することが確認された。
【００８５】
これらの結果から、タモギタケ酸性溶媒抽出物は、ＨａＣａＴ細胞に２４時間作用させた場合に、ｈＢＤ−１およびｈＢＤ−３の産生を促進することが明らかになった。
【００８６】
（５）タモギタケ塩基性溶媒抽出物のヒトβ−ディフェンシン産生促進効果の検討
［５−１］タモギタケ塩基性溶媒抽出物の調製
水を１％（ｗ／ｗ）重曹水溶液に代えて、本実施例（３）［３−１］に記載の方法により、タモギタケの抽出物を調製し、これをタモギタケ塩基性溶媒抽出物とした。なお、オートクレーブによる滅菌処理を行う前の濾液のｐＨは、ｐＨ７．６であった。
【００８７】
［５−２］サンプルの調製および培養、ならびにタモギタケ塩基性溶媒抽出物を添加した培地での培養
本実施例（１）［１−１］に記載の方法により、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥの計５サンプルを調製し、培養した。続いて、実施例１（１）で調製したタモギタケ熱水抽出物に代えて、本実施例（５）［５−１］で調製したタモギタケ塩基性溶媒抽出物を用いて、本実施例（１）［１−２］に記載の方法により、タモギタケ塩基性溶媒抽出物を添加した培地での培養を行った。
【００８８】
［５−３］ＲＮＡの抽出およびｃＤＮＡの作製、ならびに定量ＰＣＲ法によるヒトβ−ディフェンシンｍＲＮＡの定量
本実施例（５）［５−２］の各サンプルについて、本実施例（１）［１−３］に記載の方法により、ＲＮＡの抽出およびｃＤＮＡの作製を行った後、本実施例（１）［１−４］に記載の方法により定量ＰＣＲ法を行い、ヒトβ−ディフェンシンｍＲＮＡの定量を行った。また、算出したＢ、Ｃ、ＤおよびＥにおける結果について、Ａにおける結果との間でマンホイットニーのＵ検定を行った。その結果を図６に示す。図中の＊は、Ｕ検定の結果、統計的に有意であることを示す（ｐ＜０．０５）。
【００８９】
図６上段に示すように、ｈＢＤ−１のｍＲＮＡ相対発現量について、ＢはＡと比較してほとんど変わらなかったが、Ｃ、ＤおよびＥは、Ａと比較して有意に大きかった。すなわち、タモギタケ塩基性溶媒抽出物を添加した培地でＨａＣａＴ細胞を培養した場合は、それを添加しないで培養した場合と比較して、ｈＢＤ−１のｍＲＮＡ発現量が増加することが確認された。
【００９０】
また、図６中段に示すように、ｈＢＤ−２のｍＲＮＡ相対発現量について、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥのいずれも、Ａと比較してほとんど変わらなかった。
【００９１】
また、図６下段に示すように、ｈＢＤ−３のｍＲＮＡ相対発現量について、Ｂ、Ｃ、Ｄのいずれも、Ａと比較して有意に大きかった。すなわち、タモギタケ塩基性溶媒抽出物を添加した培地でＨａＣａＴ細胞を培養した場合は、それを添加しないで培養した場合と比較して、ｈＢＤ−３のｍＲＮＡ発現量が増加することが確認された。
【００９２】
これらの結果から、タモギタケ塩基性溶媒抽出物は、ＨａＣａＴ細胞に２４時間作用させた場合に、ｈＢＤ−１およびｈＢＤ−３の産生を促進することが明らかになった。
【００９３】
（６）タモギタケ由来エルゴチオネインのヒトβ−ディフェンシン産生促進効果の検討
［６−１］タモギタケ由来エルゴチオネインの調製
生のタモギタケ１５０ｋｇ〜２００ｋｇを水２００Ｌに入れて加熱し、沸騰させた状態で５分間煮出した後、濾過して１５０Ｌの濾液を得た。この濾液について、５０００ｒｐｍ、１０℃の条件下で３０分間遠心分離を行って１３５Ｌの上清を回収した。５×３０ｃｍのカラムに充填したイオン交換樹脂（アンバーライトＩＲ１２０Ｂ Ｈ型；オルガノ社）に、回収した上清のうちの７．５Ｌを入れ、一晩自然落下させた。続いて、イオン交換樹脂を回収し、蒸留水２．５Ｌを用いて洗浄して糖質成分を除去した後、０．２８％（ｗ／ｗ）アンモニア水１０Ｌを用いて溶出し、イオン交換樹脂に吸着していた陽イオン性化合物を含む溶出液１０ｍＬを得た。ロータリーエバポレーターを用いてこの溶出液を濃縮した後、下記の条件により定法に従って高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を行い、流出開始３〜４分に検出されるピークの画分を分取した。
【００９４】
ＨＰＬＣの条件
ＨＰＬＣシステム；日立高速液体クロマトグラフＬａＣｈｒｏｍ Ｅｌｉｔｅ
溶離溶媒；０〜１％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液
カラム；Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−ＳＰ（ジーエルサイエンス社）
検出器；ＵＶ検出器
検出条件；２５０ｎｍ
【００９５】
分取した画分を合わせた後、凍結乾燥機を用いて凍結乾燥し、粉末状のタモギタケ由来エルゴチオネイン１．７ｇ（７．４ｍｍｏｌ）を得た。
【００９６】
［６−２］サンプルの調製および培養
本実施例（１）［１−１］に記載の方法により、Ａ、Ｂ、およびＣの計３サンプルを調製し、培養した。
【００９７】
［６−３］タモギタケ由来エルゴチオネインを添加した培地での培養
本実施例（６）［６−１］で調製したタモギタケ由来エルゴチオネインをＤＤＷに溶解して、それぞれ、１０ｍｍｏｌ／Ｌおよび１００ｍｍｏｌ／Ｌのエルゴチオネイン水溶液を調製した。次に、ＤＤＷ、１０ｍｍｏｌ／Ｌおよび５００ｍｍｏｌ／Ｌのエルゴチオネイン水溶液をそれぞれ１％（ｖ／ｖ）となるようＦ−Ｐ−ＤＭＥＭ培地に添加して、コントロール用交換培地とタモギタケ由来エルゴチオネインを下記の終濃度で含む交換培地とを調製した。本実施例（６）［６−２］の各サンプルの培地を、調製した交換培地に下記のとおり交換した後、本実施例（１）［１−１］に記載の環境下にて、さらに２４時間培養した。
【００９８】
交換培地に添加したものおよびタモギタケ由来エルゴチオネインの終濃度
Ａ ：ＤＤＷ （コントロール用交換培地）
Ｂ ：タモギタケ由来エルゴチオネイン 終濃度１００μｍｏｌ／Ｌ
Ｃ ：タモギタケ由来エルゴチオネイン 終濃度 ５ｍｍｏｌ／Ｌ
【００９９】
［６−４］ＲＮＡの抽出およびｃＤＮＡの作製、ならびに定量ＰＣＲ法によるヒトβ−ディフェンシンｍＲＮＡの定量
本実施例（６）［６−３］の各サンプルについて、本実施例（１）［１−３］に記載の方法により、ＲＮＡの抽出およびｃＤＮＡの作製を行った後、本実施例（１）［１−４］に記載の方法により定量ＰＣＲ法を行い、ヒトβ−ディフェンシンｍＲＮＡの定量を行った。また、算出したＢおよびＣにおける結果について、Ａにおける結果との間でマンホイットニーのＵ検定を行った。その結果を図７に示す。図中の＊は、Ｕ検定の結果、統計的に有意であることを示す（ｐ＜０．０５）。
【０１００】
図７上段に示すように、ｈＢＤ−１のｍＲＮＡ相対発現量について、ＢおよびＣは、Ａと比較して有意に大きかった。すなわち、タモギタケ由来エルゴチオネインを添加した培地でＨａＣａＴ細胞を培養した場合は、それを添加しないで培養した場合と比較して、ｈＢＤ−１のｍＲＮＡ発現量が増加することが確認された。
【０１０１】
また、図７中段に示すように、ｈＢＤ−２のｍＲＮＡ相対発現量について、ＢおよびＣのいずれも、Ａと比較してほとんど変わらなかった。
【０１０２】
また、図７下段に示すように、ｈＢＤ−３のｍＲＮＡ相対発現量について、ＢおよびＣのいずれも、Ａと比較して有意に大きかった。すなわち、タモギタケ由来エルゴチオネインを添加した培地でＨａＣａＴ細胞を培養した場合は、それを添加しないで培養した場合と比較して、ｈＢＤ−３のｍＲＮＡ発現量が増加することが確認された。
【０１０３】
これらの結果から、タモギタケ由来エルゴチオネインは、ＨａＣａＴ細胞に２４時間作用させた場合に、ｈＢＤ−１およびｈＢＤ−３の産生を促進することが明らかになった。
【０１０４】
（７）タモギタケ由来エルゴステロールパーオキサイドのヒトβ−ディフェンシン産生促進効果の検討
［７−１］タモギタケ由来エルゴステロールパーオキサイドの調製
生のタモギタケ１５０ｋｇ〜２００ｋｇを水２００Ｌに入れて加熱し、沸騰させた状態で５分間煮出した後、濾過して濾物（残渣）を得た。この濾物を加熱して乾燥させた後、粉砕機を用いて粒子径が０．１ｍｍとなるまで粉砕し、１２ｋｇの粉末を得た。９９．５％（ｖ／ｖ）エタノールを、この粉末１００ｇ当たりに５００ｍＬ〜１０００ｍＬ添加して加熱し、粉末に含まれる成分を溶解させた。この溶液を冷却した後、５０００ｒｐｍ、１０℃の条件下で３０分間遠心分離を行って上清を回収し、１ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨ水溶液を等量添加して室温下で２時間攪拌することによりケン化反応を行った。続いて、６ｍｏｌ／Ｌの塩酸水溶液を適量添加することによりｐＨを５〜６に調整した後、５０００ｒｐｍ、１０℃の条件下で３０分間遠心分離を行った。上清を除去した後、沈殿物に１００ｍＬのエタノールを添加して攪拌し、減圧下でエタノールを留去して、白色の沈殿物１０〜５０ｇを得て、これを脂質粗抽出物とした。
【０１０５】
次に、脂質粗抽出物１０〜５０ｇをクロロホルム／メタノール｛クロロホルム：メタノール＝９５：５（ｖ／ｖ）｝３０ｍＬに溶解した後、粒子径１００〜２１０μｍのシリカゲル６０（関東化学社）を充填した８×８０ｃｍのシリカゲルカラムに注入した。続いて、クロロホルム／メタノール｛クロロホルム：メタノール＝９０：１０（ｖ／ｖ）｝１０００ｍＬにより溶出して、溶出液を５００ｍＬずつ分取した。分取した各溶出液から適量を採取して、定法に従い薄層クロマトグラフィー｛展開溶媒；クロロホルム：メタノール：水＝８０：２０：０．２（ｖ／ｖ）｝に供し、エルゴステロールパーオキサイドを含む溶出液を選択した後、選択した溶出液の溶媒を減圧下で留去し、エルゴステロールパーオキサイド粗精製物を得た。
【０１０６】
続いて、エルゴステロールパーオキサイド粗精製物をクロロホルム／メタノール｛クロロホルム：メタノール＝９５：５（ｖ／ｖ）｝に溶解した後、粒子径４０〜１００μｍのシリカゲル６０（関東化学社）を充填した３×６０ｃｍのシリカゲルカラムに注入した。クロロホルム／メタノール｛クロロホルム：メタノール＝９５：５（ｖ／ｖ）｝１０００ｍＬ、クロロホルム／メタノール｛クロロホルム：メタノール＝９０：１０（ｖ／ｖ）｝１０００ｍＬ、クロロホルム／メタノール｛クロロホルム：メタノール＝８５：１５（ｖ／ｖ）｝１０００ｍＬおよびクロロホルム／メタノール｛クロロホルム：メタノール＝８０：２０（ｖ／ｖ）｝１０００ｍＬにより溶出して、溶出液を１８〜５０ｍＬずつ分取した。分取した各溶出液から適量を採取して、定法に従い薄層クロマトグラフィー｛展開溶媒；クロロホルム：メタノール：水＝８０：２０：０．２（ｖ／ｖ）｝に供し、エルゴステロールパーオキサイドを含む溶出液を選択した後、選択した画分の溶媒を減圧下で留去し、精製されたタモギタケ由来エルゴステロールパーオキサイド３〜４ｇ（７．０〜９．３ｍｍｏｌ）を得た。
【０１０７】
［７−２］サンプルの調製および培養
本実施例（１）［１−１］に記載の方法により、Ａ、Ｂ、およびＣの計３サンプルを調製し、培養した。
【０１０８】
［７−３］タモギタケ由来エルゴステロールパーオキサイドを添加した培地での培養
本実施例（７）［７−１］で調製したタモギタケ由来エルゴステロールパーオキサイドをジメチルスルホキシドに溶解して、それぞれ、１００μｍｏｌ／Ｌおよび１ｍｍｏｌ／Ｌのエルゴステロールパーオキサイド水溶液を調製した。次に、ジメチルスルホキシド、１００μｍｏｌ／Ｌおよび１ｍｍｏｌ／Ｌのエルゴステロールパーオキサイド水溶液をそれぞれ１％（ｖ／ｖ）となるようＦ−Ｐ−ＤＭＥＭ培地に添加して、コントロール用交換培地とタモギタケ由来エルゴステロールパーオキサイドを下記の終濃度で含む交換培地とを調製した。本実施例（７）［７−２］の各サンプルの培地を、調製した交換培地に下記のとおり交換した後、本実施例（１）［１−１］に記載の環境下にて、さらに２４時間培養した。
【０１０９】
交換培地に添加したものおよびタモギタケ由来エルゴステロールパーオキサイドの終濃度
Ａ ：ジメチルスルホキシド （コントロール用交換培地）
Ｂ ：タモギタケ由来エルゴステロールパーオキサイド 終濃度 １μｍｏｌ／Ｌ
Ｃ ：タモギタケ由来エルゴステロールパーオキサイド 終濃度１０μｍｏｌ／Ｌ
【０１１０】
［７−４］ＲＮＡの抽出およびｃＤＮＡの作製、ならびに定量ＰＣＲ法によるヒトβ−ディフェンシンｍＲＮＡの定量
本実施例（７）［７−３］の各サンプルについて、本実施例（１）［１−３］に記載の方法により、ＲＮＡの抽出およびｃＤＮＡの作製を行った後、本実施例（１）［１−４］に記載の方法により、定量ＰＣＲ法を行い、ヒトβ−ディフェンシンｍＲＮＡの定量を行った。また、算出したＢおよびＣにおける結果について、Ａにおける結果との間でマンホイットニーのＵ検定を行った。その結果を図８に示す。図中の＊は、Ｕ検定の結果、統計的に有意であることを示す（ｐ＜０．０５）。
【０１１１】
図８上段に示すように、ｈＢＤ−１のｍＲＮＡ相対発現量について、ＢおよびＣのいずれも、Ａと比較してほとんど変わらなかった。
【０１１２】
また、図８中段に示すように、ｈＢＤ−２のｍＲＮＡ相対発現量について、ＢおよびＣのいずれも、Ａと比較して有意に大きかった。すなわち、タモギタケ由来エルゴステロールパーオキサイドを添加した培地でＨａＣａＴ細胞を培養した場合は、それを添加しないで培養した場合と比較して、ｈＢＤ−２のｍＲＮＡ発現量が増加することが確認された。
【０１１３】
また、図８下段に示すように、ｈＢＤ−３のｍＲＮＡ相対発現量について、ＣはＡと比較して大きい傾向があり、ＢはＡと比較して有意に大きかった。すなわち、タモギタケ由来エルゴステロールパーオキサイドを添加した培地でＨａＣａＴ細胞を培養した場合は、それを添加しないで培養した場合と比較して、ｈＢＤ−３のｍＲＮＡ発現量が増加することが確認された。
【０１１４】
これらの結果から、タモギタケ由来エルゴステロールパーオキサイドは、ＨａＣａＴ細胞に２４時間作用させた場合に、ｈＢＤ−２およびｈＢＤ−３の産生を促進することが明らかになった。
【０１１５】
（８）タモギタケ由来グルコシルセラミドのヒトβ−ディフェンシン産生促進効果の検討
［８−１］タモギタケ由来グルコシルセラミドの調製
シリカゲルカラムからの各溶出液について、薄層クロマトグラフィーにより含有成分を確認し、選択する際に、エルゴステロールパーオキサイドに代えてグルコシルセラミドを含む溶出液を選択して、本実施例（７）［７−１］に記載の方法を行うことにより、精製されたタモギタケ由来グルコシルセラミド２０〜２５ｇ（０．０２８〜０．０３４ｍｏｌ）を得た。
【０１１６】
［８−２］サンプルの調製および培養
本実施例（１）［１−１］に記載の方法により、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥの計５サンプルを調製し、培養した。
【０１１７】
［８−３］タモギタケ由来グルコシルセラミドを添加した培地での培養
本実施例（８）［８−１］で調製したタモギタケ由来グルコシルセラミドをジメチルスルホキシドに溶解して、それぞれ、１００μｍｏｌ／Ｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌおよび１００ｍｍｏｌ／Ｌのグルコシルセラミド水溶液を調製した。次に、ジメチルスルホキシド、１００μｍｏｌ／Ｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌおよび１００ｍｍｏｌ／Ｌのグルコシルセラミド水溶液をそれぞれ０．１％（ｖ／ｖ）となるようＦ−Ｐ−ＤＭＥＭ培地に添加して、コントロール用交換培地とタモギタケ由来グルコシルセラミドを下記の終濃度で含む交換培地とを調製した。本実施例（８）［８−２］の各サンプルの培地を、調製した交換培地に下記のとおり交換した後、本実施例（１）［１−１］に記載の環境下にて、さらに２４時間培養した。
【０１１８】
交換した培地に添加したものおよびタモギタケ由来グルコシルセラミドの終濃度
Ａ ：ジメチルスルホキシド （コントロール用交換培地）
Ｂ ：タモギタケ由来グルコシルセラミド 終濃度０．１μｍｏｌ／Ｌ
Ｃ ：タモギタケ由来グルコシルセラミド 終濃度 １μｍｏｌ／Ｌ
Ｄ ：タモギタケ由来グルコシルセラミド 終濃度 １０μｍｏｌ／Ｌ
Ｅ ：タモギタケ由来グルコシルセラミド 終濃度１００μｍｏｌ／Ｌ
【０１１９】
［８−４］ＲＮＡの抽出およびｃＤＮＡの作製、ならびに定量ＰＣＲ法によるヒトβ−ディフェンシンｍＲＮＡの定量
本実施例（８）［８−２］の各サンプルについて、本実施例（１）［１−３］に記載の方法により、ＲＮＡの抽出およびｃＤＮＡの作製を行った後、本実施例（１）［１−４］に記載の方法により、定量ＰＣＲ法を行い、ヒトβ−ディフェンシンｍＲＮＡの定量を行った。また、算出したＢ、Ｃ、ＤおよびＥにおける結果について、Ａにおける結果との間でマンホイットニーのＵ検定を行った。その結果を図９に示す。図中の＊は、Ｕ検定の結果、統計的に有意であることを示す（ｐ＜０．０５）。
【０１２０】
図９上段に示すように、ｈＢＤ−１のｍＲＮＡ相対発現量について、Ｂ、ＣおよびＤは、Ａと比較して有意差は見られず、ＥにおけるｍＲＮＡ相対発現量は、ＡにおけるｍＲＮＡ相対発現量と比較して有意に小さかった。
【０１２１】
また、図９中段に示すように、ｈＢＤ−２のｍＲＮＡ相対発現量について、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥのいずれも、Ａと比較して有意差は見られなかった。
【０１２２】
また、図９下段に示すように、ｈＢＤ−３のｍＲＮＡ相対発現量について、ＢはＡと比較してほとんど変わらなかったが、ＣおよびＤは、Ａと比較して大きい傾向があり、ＥはＡと比較して有意に大きかった。すなわち、タモギタケ由来グルコシルセラミドを添加した培地でＨａＣａＴ細胞を培養した場合は、それを添加しないで培養した場合と比較して、ｈＢＤ−３のｍＲＮＡ発現量が増加することが確認された。
【０１２３】
これらの結果から、タモギタケ由来グルコシルセラミドは、ＨａＣａＴ細胞に２４時間作用させた場合に、ｈＢＤ−３の産生を促進することが明らかになった。
【０１２４】
＜実施例３＞ＮＨＥＫ細胞におけるヒトβ−ディフェンシン産生促進効果の検討
（１）サンプルの調製および培養
実施例２（１）［１−１］に記載の方法により、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤの計４サンプルを調製した。ただし、ＨａＣａＴ細胞に代えて正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ細胞；三光純薬社）を用い、培養時間は３日間に代えて２日間とした。
【０１２５】
（２）タモギタケ熱水抽出物を添加した培地での培養
本実施例（１）の各サンプルについて、実施例２（１）［１−２］に記載の方法により、タモギタケ熱水抽出物を添加した培地での培養を行った。ただし、各サンプルに用いた交換培地は下記のとおりとした。
【０１２６】
交換培地に添加したものおよびタモギタケ熱水抽出物の終濃度
Ａ ：ＤＤＷ （コントロール用交換培地）
Ｂ ：タモギタケ熱水抽出物 終濃度０．５％（ｖ／ｖ）
Ｃ ：タモギタケ熱水抽出物 終濃度 ５％（ｖ／ｖ）
Ｄ ：タモギタケ熱水抽出物 終濃度 ２５％（ｖ／ｖ）
【０１２７】
（３）ＲＮＡの抽出およびｃＤＮＡの作製、ならびに定量ＰＣＲ法によるｈＢＤ−２ｍＲＮＡおよびｈＢＤ−３ｍＲＮＡの定量
本実施例（２）の各サンプルについて、実施例２（１）［１−３］に記載の方法により、ＲＮＡの抽出およびｃＤＮＡの作製を行った後、実施例２（１）［１−４］に記載の方法により定量ＰＣＲ法を行い、ｈＢＤ−２ｍＲＮＡおよびｈＢＤ−３ｍＲＮＡの定量を行った。また、算出したＢ、ＣおよびＤにおける結果について、Ａにおける結果との間でマンホイットニーのＵ検定を行った。その結果を図１０に示す。図中の＊は、Ｕ検定の結果、統計的に有意であることを示す（ｐ＜０．０５）。
【０１２８】
図１０上段に示すように、ｈＢＤ−２のｍＲＮＡ相対発現量について、ＢはＡと比較してほとんど変わらなかったが、ＣおよびＤは、Ａと比較して有意に大きかった。
【０１２９】
また、図１０下段に示すように、ｈＢＤ−３のｍＲＮＡ相対発現量についても、ＢはＡと比較してほとんど変わらなかったが、ＣおよびＤは、Ａと比較して有意に大きかった。すなわち、タモギタケ熱水抽出物を添加した培地でＮＨＥＫ細胞を培養した場合は、それを添加しないで培養した場合と比較して、ｈＢＤ−２およびｈＢＤ−３のｍＲＮＡ発現量が増加することが確認された。
【０１３０】
これらの結果から、タモギタケ熱水抽出物は、ＨａＣａＴ細胞のみならずＮＨＥＫ細胞においても、ｈＢＤ−２およびｈＢＤ−３の産生を促進することが明らかになった。
【０１３１】
＜実施例４＞ヒトβ−ディフェンシン産生促進効果を奏する時間の検討
（１）タモギタケ熱水抽出物
実施例２（１）［１−１］〜［１−４］に記載の方法により、実験を行った。ただし、タモギタケ熱水抽出物を添加した培地での培養時間は２４時間に代えて２時間とし、定量ＰＣＲ法によるヒトβ−ディフェンシンｍＲＮＡの定量は、ｈＢＤ−２およびｈＢＤ−３について行った。また、算出したＢ、Ｃ、ＤおよびＥにおける結果について、Ａにおける結果との間でマンホイットニーのＵ検定を行った。その結果を図１１に示す。図中の＊は、Ｕ検定の結果、統計的に有意であることを示す（ｐ＜０．０５）。
【０１３２】
図１１上段に示すように、ｈＢＤ−２のｍＲＮＡ相対発現量について、ＢおよびＣは、Ａと比較してほとんど変わらなかったが、ＤおよびＥは、Ａと比較して有意に大きかった。
【０１３３】
また、図１１下段に示すように、ｈＢＤ−３のｍＲＮＡ相対発現量について、ＢはＡと比較してほとんど変わらなかったが、Ｃ、ＤおよびＥは、Ａと比較して有意に大きかった。
【０１３４】
これらの結果から、タモギタケ熱水抽出物は、ＨａＣａＴ細胞に２時間作用させた場合は、２４時間作用させた場合と同様に、ｈＢＤ−２およびｈＢＤ−３の産生を促進することが明らかになった。また、タモギタケ熱水抽出物がｈＢＤ−２およびｈＢＤ−３の産生を促進する程度は、２４時間作用させた場合と比較して、２時間作用させた場合の方が大きいことが明らかになった。
【０１３５】
（２）タモギタケ熱水抽出物の濾液および濾物
実施例２（２）［２−１］〜［２−４］に記載の方法により、実験を行った。ただし、タモギタケ熱水抽出物の濾液および濾物を添加した培地での培養時間は２４時間に代えて２時間とした。また、算出したＢ、ＣおよびＤにおける結果について、Ａにおける結果との間でマンホイットニーのＵ検定を行った。その結果を図１２に示す。図中の＊は、Ｕ検定の結果、統計的に有意であることを示す（ｐ＜０．０５）。
【０１３６】
図１２に示すように、ｈＢＤ−３のｍＲＮＡ相対発現量について、ＢはＡと比較して大きい傾向があり、ＣおよびＤは、Ａと比較して有意に大きかった。
【０１３７】
これらの結果から、タモギタケ熱水抽出物の濾液は、ＨａＣａＴ細胞に２時間作用させた場合は、２４時間作用させた場合と同様にｈＢＤ−３の産生を促進する傾向があることが明らかになった。また、タモギタケ熱水抽出物の濾物も、ＨａＣａＴ細胞に２時間作用させた場合は、２４時間作用させた場合と同様にｈＢＤ−３の産生を促進することが明らかになった。またタモギタケ熱水抽出物の濾液および濾物がｈＢＤ−３の産生を促進する程度は、２４時間作用させた場合と比較して、２４間作用させた場合の方がやや大きいことが明らかになった。
【０１３８】
（３）タモギタケ熱水抽出物の超音波処理物
［３−１］タモギタケ熱水抽出物の超音波処理物の調製
実施例１（１）で調製したタモギタケ熱水抽出物２０ｍＬをネジ口瓶に入れ、超音波発生器を用いて、４０ｋＨｚの超音波を５０分間照射することにより、タモギタケ熱水抽出物の超音波処理物を得た。
【０１３９】
［３−２］サンプルの調製および培養
実施例２（１）［１−１］に記載の方法により、Ａ、Ｂ、およびＣの計３サンプルを調製し、培養した。
【０１４０】
［３−３］タモギタケ熱水抽出物の超音波処理物を添加した培地での培養
ＤＤＷを用いて本実施例（３）［３−１］のタモギタケ熱水抽出物の超音波処理物を希釈して、１０％（ｖ／ｖ）の超音波処理物水溶液を調製した。次に、ＤＤＷ、１０％（ｖ／ｖ）の超音波処理物水溶液および本実施例（３）［３−１］のタモギタケ熱水抽出物の超音波処理物を、それぞれ１０％（ｖ／ｖ）となるようＦ−Ｐ−ＤＭＥＭ培地に添加して、コントロール用交換培地と、タモギタケ熱水抽出物の超音波処理物を下記の終濃度で含む交換培地とを調製した。本実施例（３）［３−２］の培地を、調製した交換培地に下記のとおり交換した後、実施例２（１）［１−１］に記載の環境下にて、さらに２時間培養した。
【０１４１】
交換培地に添加したものおよびタモギタケ熱水抽出物の超音波処理物の終濃度
Ａ ：ＤＤＷ （コントロール用交換培地）
Ｂ ：タモギタケ熱水抽出物の超音波処理物 終濃度 １％（ｖ／ｖ）
Ｃ ：タモギタケ熱水抽出物の超音波処理物 終濃度１０％（ｖ／ｖ）
【０１４２】
［３−４］ＲＮＡの抽出およびｃＤＮＡの作製、ならびに定量ＰＣＲ法によるｈＢＤ−３ｍＲＮＡの定量
本実施例（３）［３−３］の各サンプルについて、実施例２（１）［１−３］に記載の方法によりＲＮＡの抽出およびｃＤＮＡの作製を行った後、実施例２（１）［１−４］に記載の方法により定量ＰＣＲ法を行い、ｈＢＤ−３ｍＲＮＡの定量を行った。また、算出したＢおよびＣにおける結果について、Ａにおける結果との間でマンホイットニーのＵ検定を行った。その結果を図１３に示す。図中の＊は、Ｕ検定の結果、統計的に有意であることを示す（ｐ＜０．０５）。
【０１４３】
図１３に示すように、ｈＢＤ−３のｍＲＮＡ相対発現量について、ＢおよびＣは、Ａと比較していずれも大きく、ｍＲＮＡ相対発現量の大きさの順はＡ＜Ｂ＜Ｃであった。
【０１４４】
これらの結果から、タモギタケ熱水抽出物の超音波処理物は、ＨａＣａＴ細胞に２時間作用させた場合に、ｈＢＤ−３の産生を促進することが明らかになった。
【０１４５】
（４）タモギタケ水抽出物
実施例２（３）［３−１］〜［３−３］に記載の方法により、実験を行った。ただし、タモギタケ水抽出物を添加した培地での培養時間は２４時間に代えて２時間とした。また、算出したＢ、Ｃ、ＤおよびＥにおける結果について、Ａにおける結果との間でマンホイットニーのＵ検定を行った。その結果を図１４に示す。図中の＊は、Ｕ検定の結果、統計的に有意であることを示す（ｐ＜０．０５）。
【０１４６】
図１４上段に示すように、ｈＢＤ−１のｍＲＮＡ相対発現量について、ＢおよびＤは、Ａと比較してほとんど変わらなかったが、ＣおよびＥは、Ａと比較して有意に大きかった。
【０１４７】
また、図１４中段に示すように、ｈＢＤ−２のｍＲＮＡ相対発現量について、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥのいずれも、Ａと比較してほとんど変わらなかった。
【０１４８】
また、図１４下段に示すように、ｈＢＤ−３のｍＲＮＡ相対発現量について、ＢおよびＣは、Ａと比較してほとんど変わらなかったが、ＣおよびＥは、Ａと比較して有意に大きかった。
【０１４９】
これらの結果から、タモギタケ水抽出物は、ＨａＣａＴ細胞に２時間作用させた場合は、２４時間作用させた場合と同様に、ｈＢＤ−１およびｈＢＤ−３の産生を促進することが明らかになった。また、タモギタケ水抽出物がｈＢＤ−１およびｈＢＤ−３の産生を促進する程度は、２時間作用させた場合と比較して、２４時間作用させた場合の方が大きいことが明らかになった。
【０１５０】
（５）タモギタケ酸性溶媒抽出物
実施例２（４）［４−１］〜［４−３］に記載の方法により、実験を行った。ただし、タモギタケ酸性溶媒抽出物を添加した培地での培養時間は２４時間に代えて２時間とした。また、算出したＢ、Ｃ、ＤおよびＥにおける結果について、Ａにおける結果との間でマンホイットニーのＵ検定を行った。その結果を図１５に示す。図中の＊は、Ｕ検定の結果、統計的に有意であることを示す（ｐ＜０．０５）。
【０１５１】
図１５上段に示すように、ｈＢＤ−１のｍＲＮＡ相対発現量について、ＢおよびＣは、Ａと比較してほとんど変わらなかったが、ＤおよびＥは、Ａと比較して有意に大きかった。
【０１５２】
また、図１５中段に示すように、ｈＢＤ−２のｍＲＮＡ相対発現量について、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥのいずれも、Ａと比較してほとんど変わらなかった。
【０１５３】
また、図１５下段に示すように、ｈＢＤ−３のｍＲＮＡ相対発現量について、ＣおよびＥは、Ａと比較してほとんど変わらなかったが、ＢおよびＤは、Ａと比較して有意に大きかった。
【０１５４】
これらの結果から、タモギタケ酸性溶媒抽出物は、ＨａＣａＴ細胞に２時間作用させた場合は、２４時間作用させた場合と同様に、ｈＢＤ−１およびｈＢＤ−３の産生を促進することが明らかになった。また、タモギタケ酸性溶媒抽出物がｈＢＤ−１の産生を促進する程度は、２時間作用させた場合と２４時間作用させた場合とで同程度であり、ｈＢＤ−３の産生を促進する程度は、２時間作用させた場合と比較して、２４時間作用させた場合の方が大きいことが明らかになった。
【０１５５】
（６）タモギタケ塩基性溶媒抽出物
実施例２（５）［５−１］〜［５−３］に記載の方法により、実験を行った。ただし、タモギタケ塩基性溶媒抽出物を添加した培地での培養時間は２４時間に代えて２時間とした。また、算出したＢ、Ｃ、ＤおよびＥにおける結果について、Ａにおける結果との間でマンホイットニーのＵ検定を行った。その結果を図１６に示す。図中の＊は、Ｕ検定の結果、統計的に有意であることを示す（ｐ＜０．０５）。
【０１５６】
図１６上段に示すように、ｈＢＤ−１のｍＲＮＡ相対発現量について、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥは、Ａと比較して有意に大きかった。
【０１５７】
また、図１６中段に示すように、ｈＢＤ−２のｍＲＮＡ相対発現量について、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥのいずれも、Ａと比較してほとんど変わらなかった。
【０１５８】
また、図１６下段に示すように、ｈＢＤ−３のｍＲＮＡ相対発現量について、ＢおよびＤは、Ａと比較してほとんど変わらなかったが、ＣおよびＥは、Ａと比較して有意に大きかった。
【０１５９】
これらの結果から、タモギタケ塩基性溶媒抽出物は、ＨａＣａＴ細胞に２時間作用させた場合は、２４時間作用させた場合と同様に、ｈＢＤ−１およびｈＢＤ−３の産生を促進することが明らかになった。また、タモギタケ塩基性溶媒抽出物がｈＢＤ−１およびｈＢＤ−３の産生を促進する程度は、２時間作用させた場合と２４時間作用させた場合とでは、ほとんど変わらないことが明らかになった。
【０１６０】
（７）タモギタケ由来エルゴチオネイン
実施例２（６）［６−１］〜［６−４］に記載の方法により、実験を行った。ただし、タモギタケ由来エルゴチオネインを添加した培地での培養時間は２４時間に代えて２時間とした。また、算出したＢおよびＣにおける結果について、Ａにおける結果との間でマンホイットニーのＵ検定を行った。その結果を図１７に示す。図中の＊は、Ｕ検定の結果、統計的に有意であることを示す（ｐ＜０．０５）。
【０１６１】
図１７上段、中段および下段に示すように、ｈＢＤ−１、ｈＢＤ−２およびｈＢＤ−３のｍＲＮＡ相対発現量のいずれについても、ＢおよびＣは、Ａと比較して有意に大きかった。
【０１６２】
これらの結果から、タモギタケ由来エルゴチオネインは、ＨａＣａＴ細胞に２時間作用させた場合は、２４時間作用させた場合と同様にｈＢＤ−１およびｈＢＤ−３の産生を促進するのみならず、２４時間作用させた場合には促進しなかったｈＢＤ−２の産生も促進することが明らかになった。また、タモギタケ由来エルゴチオネインがｈＢＤ−１およびｈＢＤ−３の産生を促進する程度は、２時間作用させた場合と比較して、２４時間作用させた場合の方がやや大きいことが明らかになった。
【０１６３】
＜実施例５＞βグルカンまたはマイコプラズマ由来ジアシルリポペプチド（ＦＳＬ−１）と共にタモギタケ熱水抽出物を添加した場合のヒトβ−ディフェンシン産生促進効果の検討
（１）サンプルの調製および培養
実施例２（１）［１−１］に記載の方法により、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨの計８サンプルを調製した。ただし、ＨａＣａＴ細胞に代えてＮＨＥＫ細胞（三光純薬社）を用い、培養時間は３日間に代えて２日間とした。
【０１６４】
（２）βグルカン、ＦＳＬ−１およびタモギタケ熱水抽出物を添加した培地での培養
スエヒロタケ由来βグルカン（ソニフィラン；科研製薬社）、大麦由来βグルカン（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社）、Ｔｏｌｌ Ｌｉｋｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴＬＲ）−２およびＴＬＲ−６のアゴニストであるマイコプラズマ由来ジアシルリポペプチド（ＦＳＬ−１；ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社）および実施例１（１）で調製したタモギタケ熱水抽出物を、ＤＤＷを用いて希釈またはＤＤＷに溶解し、下記のｂ、ｃ、ｄ、ｅおよびｇの水溶液を調製した。また、タモギタケ熱水抽出物にスエヒロタケ由来βグルカンまたはＦＳＬ−１を溶解することにより、下記のｆおよびｈのタモギタケ熱水抽出物溶液を調製した。
【０１６５】
水溶液およびタモギタケ熱水抽出物溶液の濃度
ｂ：スエヒロタケ由来βグルカン １００μｇ／ｍＬ
ｃ：大麦由来βグルカン １００μｇ／ｍＬ
ｄ：ＦＳＬ−１ １００ｎｇ／ｍＬ
ｅ：タモギタケ熱水抽出物 ５０％（ｖ／ｖ）
ｆ：タモギタケ熱水抽出物 １００％（ｖ／ｖ）＋スエヒロタケ由来βグルカン ２００μｇ／ｍＬ
ｇ：ＦＳＬ−１ ２００μｇ／ｍＬ＋スエヒロタケ由来βグルカン ２００μｇ／ｍＬ
ｈ：タモギタケ熱水抽出物 １００％（ｖ／ｖ）＋ＦＳＬ−１ ２００μｇ／ｍＬ
【０１６６】
次に、ＤＤＷ、調製した各水溶液および各タモギタケ熱水抽出物溶液をそれぞれ５％（ｖ／ｖ）となるようＦ−Ｐ−ＤＭＥＭ培地に添加して、スエヒロタケ由来βグルカン（ソニフィラン；科研製薬社）、大麦由来βグルカン（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社）、ＦＳＬ−１（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）およびタモギタケ熱水抽出物を下記の終濃度で含む交換培地とコントロール用交換培地とを調製した。本実施例（１）の培地を、調製した交換培地に下記のとおり交換した後、実施例２（１）［１−１］に記載の環境下にて、さらに２時間培養した。
【０１６７】
交換培地に添加したものおよびその終濃度
Ａ：ＤＤＷ （コントロール用交換培地）
Ｂ：スエヒロタケ由来βグルカン 終濃度１０μｇ／ｍＬ
Ｃ：大麦由来βグルカン 終濃度１０μｇ／ｍＬ
Ｄ：ＦＳＬ−１ 終濃度１０ｎｇ／ｍＬ
Ｅ：タモギタケ熱水抽出物 終濃度 ５％（ｖ／ｖ）
Ｆ：タモギタケ熱水抽出物 終濃度５％（ｖ／ｖ）＋スエヒロタケ由来βグルカン 終濃度１０μｇ／ｍＬ
Ｇ：ＦＳＬ−１ 終濃度１０ｎｇ／ｍＬ＋スエヒロタケ由来βグルカン 終濃度１０μｇ／ｍＬ
Ｈ：タモギタケ熱水抽出物 終濃度５％（ｖ／ｖ）＋ＦＳＬ−１ 終濃度１０ｎｇ／ｍＬ
【０１６８】
（３）ＲＮＡの抽出およびｃＤＮＡの作製、ならびに定量ＰＣＲ法によるｈＢＤ−２ｍＲＮＡおよびｈＢＤ−３ｍＲＮＡの定量
本実施例（２）の各サンプルについて、実施例２（１）［１−３］に記載の方法によりＲＮＡの抽出およびｃＤＮＡの作製を行った後、実施例２（１）［１−４］に記載の方法により定量ＰＣＲ法を行い、ｈＢＤ−２ｍＲＮＡおよびｈＢＤ−３ｍＲＮＡの定量を行った。また、算出したＢ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨにおける結果について、Ａにおける結果との間でマンホイットニーのＵ検定を行った。その結果を図１８に示す。図中の＊は、Ｕ検定の結果、統計的に有意であることを示す（ｐ＜０．０５）。
【０１６９】
図１８上段に示すように、ｈＢＤ−２のｍＲＮＡ相対発現量について、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＨのいずれも、Ａと比較してやや大きく、ＦおよびＧは、Ａと比較して顕著に大きかった。
【０１７０】
また、図１８下段に示すように、ｈＢＤ−３のｍＲＮＡ相対発現量についても、ｈＢＤ−２と同様、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅのいずれも、Ａと比較してやや大きく、ＦおよびＧは、Ａと比較して顕著に大きかった。
【０１７１】
これらの結果から、タモギタケ熱水抽出物は、βグルカンと共に作用させることにより、ｈＢＤ−２およびｈＢＤ−３の産生を促進する効果が向上することが明らかになった。
【０１７２】
＜実施例６＞口腔カンジダ症モデルマウスにおける抗菌効果の確認
（１）タモギタケ熱水抽出物を含有する口腔用ジェルの調製 実施例１（１）で調製したタモギタケ熱水抽出物と白色ワセリン（ヤクハン製薬社）とを歯科用ダッペングラスに入れ、プラスチックのセメントスパチュラを用いて攪拌・混合することにより、タモギタケ熱水抽出物を６０％（ｗ／ｗ）含有する口腔用ジェルを調製した。
【０１７３】
（２）口腔カンジダ症モデルマウスの作製
既報（Ｔａｋａｋｕｒａら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第４７巻、第５号、第３２１−３２６頁、２００３年）に従い、口腔カンジダ症モデルマウスを作製した。具体的には、６週齢のＣ３Ｈ／ＨｅＪＪｃｌ雄マウス（日本クレア社）１５匹に、マウス体重１ｋｇ当たり１００ｍｇの量のプレドニゾロンを皮下注射した。続いて、滅菌した水道水に塩酸クロルテトラサイクリンを０．８３ｍｇ／ｍＬとなるよう添加したものを飲料水として自由摂取させながら２４時間飼育した後、マウス１個体あたり、２ｍｇ／ｍＬのクロルプロマジン塩酸塩水溶液５０ｍＬを大腿部に筋肉注射した。３０分経過後、１×１０８ｃｆｕ／ｍＬのカンジダ菌（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ ＡＴＣＣ９００２８株）懸濁液を滅菌綿棒に付着させ、これを用いてマウスの舌と口腔内へカンジダ菌の播種を行った。
【０１７４】
（３）タモギタケ熱水抽出物を含有する口腔用ジェルの投与
本実施例（２）のマウス１５匹を７匹と８匹とに分け、７匹からなる群をコントロール群、８匹からなる群をジェル投与群として、各群のマウスを３日間飼育した。この間、ジェル投与群にのみ、本実施例（１）の口腔用ジェルを１匹当たり０．０５ｇ、口腔内に塗布することを１日３回行った。
【０１７５】
（４）カンジダ菌数の測定
本実施例（３）の各群のマウスから舌を摘出し、舌の重量１００ｍｇあたり１ｍＬの生理食塩水を添加してホモジナイズし、懸濁液とした。この懸濁液１００μＬについて、ＣＨＩＲＯＭａｇａｒ選択培地（ＣＨＩＲＯＭａｇａｒ社）を用いて定法に従い平板法を行うことにより、カンジダ菌生菌数を測定し、群ごとに生菌数の平均値と標準偏差を求めた。また、算出したジェル投与群における結果について、コントロール群における結果との間でマンホイットニーのＵ検定を行った。その結果を図１９に示す。図中の＊は、検定の結果、統計的に有意であることを示す（ｐ＜０．０５）。
【０１７６】
図１９に示すように、ジェル投与群におけるカンジダ菌の生菌数は、コントロール群におけるカンジダ菌の生菌数と比較して顕著に少なく、コントロール群におけるカンジダ菌の生菌数を１００％とすると、ジェル投与群におけるカンジダ菌の生菌数は７７．５％であった。すなわち、タモギタケ熱水抽出物を含有する口腔用ジェルは、口腔カンジダ症モデルマウスの口腔内におけるカンジダ菌の増殖を抑制することが確認された。
【０１７７】
この結果から、タモギタケ熱水抽出物を含有する口腔用ジェルは、口腔カンジダ症の予防または治療に有効であることが明らかになった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タモギタケ抽出物を有効成分とする抗菌剤、βディフェンシン産生促進剤ならびにカンジダ症予防および／または治療剤に関し、より詳細には、タモギタケの水系溶媒抽出物、タモギタケから抽出されるグルコシルセラミド、タモギタケから抽出されるエルゴチオネインおよびタモギタケから抽出されるエルゴステロールパーオキサイドの少なくともいずれかを有効成分とする、抗菌剤、βディフェンシン産生促進剤ならびにカンジダ症予防および／または治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
タモギタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｃｏｒｎｕｃｏｐｉａｅ ｖａｒ． ｃｉｔｒｉｎｏｐｉｌｅａｔｕｓ）はキシメジ科ヒラタケ属に属するキノコである。タモギタケは主に北海道や東北において自生し、食用に用いられており、近年は人工栽培品も販売されている。
【０００３】
タモギタケは食品産業、健康産業、化粧品産業、医薬品産業などにおいて有用な種々の成分を有することが知られており、例えば、特許文献１にはタモギタケの水抽出物を有効成分とする抗菌剤が、特許文献２および特許文献３には本発明者らによりタモギタケの熱水抽出物を有効成分とする抗腫瘍性免疫賦活剤ならびにタモギタケ由来のセラミドを有効成分とする皮膚炎治療剤および皮膚保湿剤が、特許文献４にはタモギタケ由来のエルゴチオネインを有効成分とする抗酸化剤、チロシナーゼ活性阻害剤、リパーゼ活性阻害剤、５α−レダクターゼ活性阻害剤、抗老化剤および抗メタボリックシンドローム剤が、特許文献５にはタモギタケ由来のエルゴステロールパーオキサイドを有効成分とする食品用の変色防止・酸化防止剤がそれぞれ開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００７−１９６１号
【特許文献２】国際公開ＷＯ２００６／０３８５２７号パンフレット
【特許文献３】特開２００７−３０８３９４号
【特許文献４】特開２００９−１２６８６３号
【特許文献５】特開２００９−１８３２６６号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、特許文献１に開示されているタモギタケの水抽出物を有効成分とする抗菌剤は、培養培地において菌の増殖を抑制することが示されているに過ぎず、動物個体で菌の増殖を抑制することは示されていない。また、特許文献２〜特許文献５に記載のタモギタケ熱水抽出物、タモギタケ由来のセラミド、タモギタケ由来のエルゴチオネインおよびタモギタケ由来のエルゴステロールパーオキサイドはいずれも、抗菌剤、βディフェンシン産生促進剤ならびにカンジダ症予防および／または治療剤として用いられているものではない。
【０００６】
本発明は、上述の問題点を解決するためになされたものであって、菌の増殖抑制効果を備えるなどの優れた抗菌活性を有し、かつ、食用キノコであるタモギタケ由来であることから高い安全性を有する抗菌剤、ヒトにおいて各種ヒトβディフェンシンの産生を促進することができるβディフェンシン産生促進剤、ならびにカンジダ症予防および／または治療剤を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、鋭意研究の結果、タモギタケの熱水抽出物が培養培地および口腔カンジダ症モデルマウスの口腔内においてカンジダ菌の増殖を抑制すること、ならびにタモギタケの水系溶媒抽出物、タモギタケから抽出されるグルコシルセラミド、タモギタケから抽出されるエルゴチオネインおよびタモギタケから抽出されるエルゴステロールパーオキサイドがβディフェンシンの産生を促進することを見出し、下記の各発明を完成した。
【０００８】
（１）タモギタケの水系溶媒抽出物、タモギタケから抽出されるグルコシルセラミド、タモギタケから抽出されるエルゴチオネインおよびタモギタケから抽出されるエルゴステロールパーオキサイドからなる群から選択される１または２以上の物質を有効成分とする抗菌剤。
【０００９】
（２）水系溶媒抽出物が熱水抽出物である、（１）に記載の抗菌剤。
【００１０】
（３）タモギタケの水系溶媒抽出物、タモギタケから抽出されるグルコシルセラミド、タモギタケから抽出されるエルゴチオネインおよびタモギタケから抽出されるエルゴステロールパーオキサイドからなる群から選択される１または２以上の物質を有効成分とするβディフェンシン産生促進剤。
【００１１】
（４）βディフェンシンがヒトβディフェンシン−１、ヒトβディフェンシン−２およびヒトβディフェンシン−３からなる群から選択される１または２以上のβディフェンシンである、（３）に記載のβディフェンシン産生促進剤。
【００１２】
（５）水系溶媒抽出物が熱水抽出物である、（３）または（４）に記載のβディフェンシン産生促進剤。
【００１３】
（６）タモギタケの水系溶媒抽出物、タモギタケから抽出されるグルコシルセラミド、タモギタケから抽出されるエルゴチオネインおよびタモギタケから抽出されるエルゴステロールパーオキサイドからなる群から選択される１または２以上の物質を有効成分とするカンジダ症予防および／または治療剤。
【００１４】
（７）口腔乾燥症の患者に用いる、（６）に記載のカンジダ症予防および／または治療剤。
【００１５】
（８）水系溶媒抽出物が熱水抽出物である、（６）または（７）に記載のカンジダ症予防および／または治療剤。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、菌の増殖抑制効果を備えるなどの優れた抗菌活性を有し、かつ、食用キノコであるタモギタケ由来であることから高い安全性を有する抗菌剤、ヒトにおいて各種ヒトβディフェンシンの産生を促進することができるβディフェンシン産生促進剤、ならびにカンジダ症予防および／または治療剤を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】タモギタケ熱水抽出物を添加した培地でカンジダ菌を培養した後、培地の濁度を測定した結果を示す図である。縦軸は濁度（６００ｎｍにおける吸光度）を、横軸はタモギタケ熱水抽出物の添加濃度を変えた各サンプルを示す。
【図２】タモギタケ熱水抽出物を添加した培地で２４時間培養したＨａＣａＴ細胞における、ｈＢＤ−１、ｈＢＤ−２およびｈＢＤ−３のｍＲＮＡ相対発現量を示す図である。縦軸はｍＲＮＡの相対発現量を、横軸はタモギタケ熱水抽出物の添加濃度を変えた各サンプルを示す。
【図３】タモギタケ熱水抽出物の濾液、濾物およびタモギタケ熱水抽出物を添加した培地で２４時間培養したＨａＣａＴ細胞における、ｈＢＤ−３のｍＲＮＡ相対発現量を示す図である。縦軸はｍＲＮＡの相対発現量を、横軸は交換培地にタモギタケ熱水抽出物の濾液、濾物およびタモギタケ熱水抽出物を添加した各サンプルを示す。
【図４】タモギタケ水抽出物を添加した培地で２４時間培養したＨａＣａＴ細胞における、ｈＢＤ−１、ｈＢＤ−２およびｈＢＤ−３のｍＲＮＡ相対発現量を示す図である。縦軸はｍＲＮＡの相対発現量を、横軸はタモギタケ水抽出物の添加濃度を変えた各サンプルを示す。
【図５】タモギタケ酸性水系溶媒抽出物を添加した培地で２４時間培養したＨａＣａＴ細胞における、ｈＢＤ−１、ｈＢＤ−２およびｈＢＤ−３のｍＲＮＡ相対発現量を示す図である。縦軸はｍＲＮＡの相対発現量を、横軸はタモギタケ酸性水系溶媒抽出物の添加濃度を変えた各サンプルを示す。
【図６】タモギタケ塩基性水系溶媒抽出物を添加した培地で２４時間培養したＨａＣａＴ細胞における、ｈＢＤ−１、ｈＢＤ−２およびｈＢＤ−３のｍＲＮＡ相対発現量を示す図である。縦軸はｍＲＮＡの相対発現量を、横軸はタモギタケ塩基性水系溶媒抽出物の添加濃度を変えた各サンプルを示す。
【図７】タモギタケ由来エルゴチオネインを添加した培地で２４時間培養したＨａＣａＴ細胞における、ｈＢＤ−１、ｈＢＤ−２およびｈＢＤ−３のｍＲＮＡ相対発現量を示す図である。縦軸はｍＲＮＡの相対発現量を、横軸はタモギタケ由来エルゴチオネインの添加濃度を変えた各サンプルを示す。
【図８】タモギタケ由来エルゴステロールパーオキサイドを添加した培地で２４時間培養したＨａＣａＴ細胞における、ｈＢＤ−１、ｈＢＤ−２およびｈＢＤ−３のｍＲＮＡ相対発現量を示す図である。縦軸はｍＲＮＡの相対発現量を、横軸はタモギタケ由来エルゴステロールパーオキサイドの添加濃度を変えた各サンプルを示す。
【図９】タモギタケ由来グルコシルセラミドを添加した培地で２４時間培養したＨａＣａＴ細胞における、ｈＢＤ−１、ｈＢＤ−２およびｈＢＤ−３のｍＲＮＡ相対発現量を示す図である。縦軸はｍＲＮＡの相対発現量を、横軸はタモギタケ由来グルコシルセラミドの添加濃度を変えた各サンプルを示す。
【図１０】タモギタケ熱水抽出物を添加した培地で２４時間培養したＮＨＥＫ細胞における、ｈＢＤ−２およびｈＢＤ−３のｍＲＮＡ相対発現量を示す図である。縦軸はｍＲＮＡの相対発現量を、横軸はタモギタケ熱水抽出物の添加濃度を変えた各サンプルを示す。
【図１１】タモギタケ熱水抽出物を添加した培地で２時間培養したＨａＣａＴ細胞における、ｈＢＤ−２およびｈＢＤ−３のｍＲＮＡ相対発現量を示す図である。縦軸はｍＲＮＡの相対発現量を、横軸はタモギタケ熱水抽出物の添加濃度を変えた各サンプルを示す。
【図１２】タモギタケ熱水抽出物の濾液、濾物およびタモギタケ熱水抽出物を添加した培地で２時間培養したＨａＣａＴ細胞における、ｈＢＤ−３のｍＲＮＡ相対発現量を示す図である。縦軸はｍＲＮＡの相対発現量を、横軸は交換培地にタモギタケ熱水抽出物の濾液、濾物およびタモギタケ熱水抽出物を添加した各サンプルを示す。
【図１３】タモギタケ熱水抽出物の超音波処理物を添加した培地で２時間培養したＨａＣａＴ細胞における、ｈＢＤ−３のｍＲＮＡ相対発現量を示す図である。縦軸はｍＲＮＡの相対発現量を、横軸はタモギタケ熱水抽出物の超音波処理物の添加濃度を変えた各サンプルを示す。
【図１４】タモギタケ水抽出物を添加した培地で２時間培養したＨａＣａＴ細胞における、ｈＢＤ−１、ｈＢＤ−２およびｈＢＤ−３のｍＲＮＡ相対発現量を示す図である。縦軸はｍＲＮＡの相対発現量を、横軸はタモギタケ水抽出物の添加濃度を変えた各サンプルを示す。
【図１５】タモギタケ酸性水系溶媒抽出物を添加した培地で２時間培養したＨａＣａＴ細胞における、ｈＢＤ−１、ｈＢＤ−２およびｈＢＤ−３のｍＲＮＡ相対発現量を示す図である。縦軸はｍＲＮＡの相対発現量を、横軸はタモギタケ酸性水系溶媒抽出物の添加濃度を変えた各サンプルを示す。
【図１６】タモギタケ塩基性水系溶媒抽出物を添加した培地で２時間培養したＨａＣａＴ細胞における、ｈＢＤ−１、ｈＢＤ−２およびｈＢＤ−３のｍＲＮＡ相対発現量を示す図である。縦軸はｍＲＮＡの相対発現量を、横軸はタモギタケ塩基性水系溶媒抽出物の添加濃度を変えた各サンプルを示す。
【図１７】タモギタケ由来エルゴチオネインを添加した培地で２時間培養したＨａＣａＴ細胞における、ｈＢＤ−１、ｈＢＤ−２およびｈＢＤ−３のｍＲＮＡ相対発現量を示す図である。縦軸はｍＲＮＡの相対発現量を、横軸はタモギタケ由来エルゴチオネインの添加濃度を変えた各サンプルを示す。
【図１８】スエヒロタケ由来βグルカンまたはマイコプラズマ由来ジアシルリポペプチド（ＦＳＬ−１）と共にタモギタケ熱水抽出物を添加した培地で２時間培養したＮＨＥＫ細胞における、ｈＢＤ−２およびｈＢＤ−３のｍＲＮＡ相対発現量を示す図である。縦軸はｍＲＮＡの相対発現量を、横軸は交換培地にスエヒロタケ由来βグルカン、大麦由来βグルカン、ＦＳＬ−１、タモギタケ熱水抽出物、タモギタケ熱水抽出物＋スエヒロタケ由来βグルカン、ＦＳＬ−１＋スエヒロタケ由来βグルカンおよびタモギタケ熱水抽出物＋ＦＳＬ−１を添加した各サンプルを示す。
【図１９】タモギタケ熱水抽出物を含有する口腔用ジェルを投与した口腔カンジダ症モデルマウスの舌における、カンジダ菌の生菌数を示すグラフである。縦軸はカンジダ菌の生菌数を、横軸は口腔用ジェルを投与しなかった群（コントロール群）および口腔用ジェルを投与した群（ジェル投与群）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明に係る抗菌剤、βディフェンシン産生促進剤ならびにカンジダ症予防および／または治療剤について詳細に説明する。本発明に係る抗菌剤は、タモギタケの水系溶媒抽出物、タモギタケから抽出されるグルコシルセラミド、タモギタケから抽出されるエルゴチオネインおよびタモギタケから抽出されるエルゴステロールパーオキサイドからなる群から選択される１または２以上の物質を有効成分とする。
【００１９】
本発明において、タモギタケは天然に自生しているものでもよく、人工栽培されたものでもよい。また、生のタモギタケでもよく、乾燥させたものや、乾燥させた上で粉末にしたものなど、採取した後に加工を施されたものでもよい。
【００２０】
本発明において、タモギタケの水系溶媒抽出物とは、水系溶媒によりタモギタケから抽出された成分を含有する液体状、半固体状または固体状の物質、もしくはこれらの物質から選択される１または２以上の物質の混合物をいう。ここで、本発明において、水系溶媒とは極性溶媒を主体とした溶媒であれば特に限定されず、１種類の溶媒からなるものでもよく、２種類以上の溶媒を混合したものでもよい。そのような極性溶媒としては、例えば、水、メタノール、エタノール、酢酸、ギ酸、１−ブタノール、１−プロパノール、２−プロパノールなどを挙げることができるが、水が好ましい。
【００２１】
また、本発明において、水系溶媒は、水または水系溶媒に予め適当な溶質を混合または溶解させて水系溶媒としてもよく、そのような水系溶媒としては、例えば、水にクエン酸を混合または溶解させたもの、水に重曹を混合または溶解させたもの、食塩を酢酸に混合または溶解させたものなどを挙げることができるが、クエン酸水溶液、重曹水溶液および食塩酢酸溶液が好ましい。
【００２２】
また、本発明において、水系溶媒は、酸性、中性および塩基性のいずれでもよく、水系溶媒の温度もまた、その機能が損なわれない限りにおいて特に限定されず、低温の他、常温、高温でもよい。なお、本発明においては、熱水を好適な水系溶媒として用いることができる。
【００２３】
本発明において、タモギタケの水系溶媒抽出物は定法に従い製造することができ、例えば、水系溶媒にタモギタケを投入し、加熱または粉砕・攪拌した後、濾過などにより固液分離し、液体成分を回収することにより製造することができる。製造されたタモギタケの水系溶媒抽出物は、さらに、限外濾過や超音波処理などを行ってもよく、そのような限外濾過物（濾液および濾物）や超音波処理物などもまた、タモギタケの水系溶媒抽出物であり、本発明に包含される。
【００２４】
本発明において、タモギタケから抽出されるグルコシルセラミドは、当業者が適宜選択することができる公知あるいは新たな手法に従って製造することができ、例えば、茹でたタモギタケを乾燥させ、粉砕して粉末としたものをエタノールに入れて加熱・抽出し、得られた抽出液をＮａＯＨ水溶液によりケン化した後、希塩酸によりｐＨを調整し、遠心分離を行って上清を除去したものにエタノールを添加して沈殿物を回収し、この沈殿物について、シリカゲルカラムとクロロホルム／メタノール溶液とを用いてカラムクロマトグラフィーによる精製を繰り返すという方法を挙げることができる。
【００２５】
本発明において、タモギタケから抽出されるエルゴチオネインもまた、当業者により適宜選択することができる公知あるいは新たな手法に従って製造することができ、例えば、タモギタケを煮出して得た煮汁をイオン交換樹脂に供した後、その樹脂から陽イオン性化合物を溶出し、溶出液を濃縮し、これを高速液体クロマトグラフィーにより分離・精製し、凍結乾燥するという方法を挙げることができる。
【００２６】
本発明において、タモギタケから抽出されるエルゴチステロールパーオキサイドもまた、当業者により適宜選択することができる公知あるいは新たな手法に従って製造することができ、例えば、上述のグルコシルセラミドを製造する方法と同様の方法を行い、カラムクロマトグラフィーによる精製の際に、グルコシルセラミドに代えてエルゴステロールパーオキサイドを含む溶出液を選択するという方法を挙げることができる。
【００２７】
本発明において、タモギタケの水系溶媒抽出物、タモギタケから抽出されるグルコシルセラミド、タモギタケから抽出されるエルゴチオネインおよびタモギタケから抽出されるエルゴステロールパーオキサイドの製造の際には、必要とする純度や形状などに応じて、粉砕、精製、濃縮、乾燥、滅菌などを行ってもよい。
【００２８】
粉砕方法としては、例えば、ロール式粉砕機などにより押しつぶす方法、フードプロセッサーなどにより切断する方法、ボールミル粉砕機などにより磨り潰す方法、ハンマー式粉砕機などにより打撃を与えて粉砕する方法などを、精製方法としては、例えば、濾過法、蒸留法、再結晶法、再沈殿法、各種のクロマトグラフィーを用いた方法などを、濃縮方法としては、例えば、煮沸濃縮法、エバポレーターなどによる真空濃縮（減圧濃縮）法、凍結濃縮法、逆浸透膜などを用いた膜濃縮法などを、滅菌方法としては、例えば、オートクレーブを用いた方法、高周波法、フィルター濾過法などを、それぞれ挙げることができる。
【００２９】
本発明に係る抗菌剤は、微生物の増殖を抑制する作用を有しているが、本発明において、「微生物の増殖を抑制する」とは、微生物の分裂を抑制することにより増殖を抑制する場合のほか、微生物を殺傷することにより増殖を抑制する場合が含まれる。
【００３０】
また、「微生物の増殖を抑制する作用」には、微生物に直接的に働きかけることにより微生物の増殖を抑制する作用（直接的作用）のほか、生体の抗菌ペプチド産生細胞に作用して抗菌ペプチドの産生を促進させ、産生された抗菌ペプチドが微生物の増殖を抑制する作用（間接的作用）が含まれる。
【００３１】
なお、本発明において「増殖を抑制する」は、「増殖を阻害する」、「増殖を阻止する」、「増殖を予防する」と、「産生を促進する」は、「産生を増大させる」、「産生を増強させる」、「産生を増進する」、「産生を亢進する」、「産生を刺激する」、「産生能を賦活する」と交換可能に用いられる。
【００３２】
抗菌ペプチドとは、微生物からヒトを含めた動物や植物まで、幅広い生物の細胞において産生され、微生物に対する殺傷作用、あるいは分裂の抑制、阻害などのような静菌的作用を有するペプチドの総称である。なお、本発明において抗菌ペプチドは特に限定されず、例えば、αディフェンシン、βディフェンシン、θディフェンシン、Ｃａｔｈｅｌｉｃｉｄｉｎ、ダームシジン、Ｈｅｐｃｉｄｉｎ／ＬＥＡＰ−１、ヒスタチンなどを挙げることができる。
【００３３】
すなわち、本発明に係る抗菌剤は、微生物の増殖抑制や、微生物により引き起こされる疾病の予防や治療に有効であり、例えば、ヒトを含む動物に対して医薬品や医薬部外品に添加、配合して用いることができるほか、農作物などの植物の疫病を防ぐ農薬に用いることができる。また、微生物は、細菌や真菌のみならず、例えば、ウイルス、ウイロイド、リケッチア、クラミジア、マイコプラズマ、スピロヘータ、原虫、蠕虫など、あらゆる微生物を挙げることができる。このような微生物により引き起こされる疾病としては、微生物の感染による感染症のほか、微生物の生産する毒素による中毒症やアレルギー症などを挙げることができ、例えば、カンジダ症、クリプトコッカス感染症、アスペルギルス症、ニューモシスチス肺炎、う蝕、食中毒、ＨＩＶ感染症、白癬（水虫、たむし、しらくもなど）、とびひ、水痘、ヘルペスウィルス感染症、サイトメガロウイルス感染症、ＭＲＳＡ感染症、緑膿菌感染症、レジオネラ肺炎、セラチア感染症、トキソプラズマ症、クリプトスポリジウム症などを挙げることができる。
【００３４】
本発明に係る抗菌剤はまた、食品や化粧料に添加して、その保存性を高めるために用いることができるほか、物品に添加、配合して腐食を防ぐため、衛生的状態を保持するため、あるいは悪臭を防ぐために用いることができる。
【００３５】
次に、本発明は、βディフェンシン産生促進剤を提供する。本発明に係るβディフェンシン産生促進剤は、タモギタケの水系溶媒抽出物、タモギタケから抽出されるグルコシルセラミド、タモギタケから抽出されるエルゴチオネインおよびタモギタケから抽出されるエルゴステロールパーオキサイドからなる群から選択される１または２以上の物質を有効成分とする。
【００３６】
抗菌ペプチドの一種であるディフェンシンは、分子内にシステイン残基を有し、それがジスルフィド結合により高次構造を形成していることを特徴とする抗菌ペプチドのファミリーのひとつであり、αディフェンシン、βディフェンシンおよびθディフェンシンに大別される。ディフェンシンは、陽性荷電しているため、陰性に荷電した菌体膜に挿入されて小孔を形成し、菌体内容物が小孔から流出することにより抗菌作用を発揮することが知られている。
【００３７】
βディフェンシンは、生体内において主に白血球や上皮細胞から産生されるディフェンシンであり、近年、局所の感染防御のみならず、上皮組織の組織修復や樹状細胞、Ｔリンパ球、単球などを遊走させることによる獲得免疫にも関与していることが報告されている（Ｙａｎｇ Ｄ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２８６巻、第５２５頁、１９９９年；Ｔｅｒｒｉｔｏ Ｍ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．第８４巻、第２０１７頁、１９８９年；Ｌｉｌｌａｒｄ Ｊ．Ｗ．Ｊｒ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、第９６巻、第６５１頁、１９９９年；長岡 功ら、臨床免疫、第３３巻、第５７７頁、２０００年）。また、腫瘍免疫を誘導して、抗腫瘍効果を発揮することやガン細胞で増殖抑制作用があることも報告されている（長岡 功ら、臨床免疫、第４０巻、第４号、第４２４頁、２００３年；Ｂｙｒａｇｙｎ Ａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第１６７巻、第６６４４頁、２００１年）。
【００３８】
すなわち、本発明に係るβディフェンシン産生促進剤は、微生物により引き起こされる疾病の予防や治療に有効であり、例えば、ヒトを含む動物に対して医薬品や医薬部外品に添加、配合して用いることができるほか、農作物などの植物の疫病を防ぐ農薬に用いることができる。また、本発明に係るβディフェンシン産生促進剤は、感染、炎症その他の傷害からの回復、癌の治療、免疫増強、荒れ肌・乾燥肌・手荒れなどのスキンケア、口臭防止、足臭防止などのために用いることができる。
【００３９】
本発明において、βディフェンシンの種類としては、例えば、βディフェンシン−１、βディフェンシン−２、βディフェンシン−３、βディフェンシン−４などを挙げることができ、由来する生物としては、例えば、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓなどの細菌、アシタバ、カラシナなどの植物、クロチャワンタケなどの菌類、クモ、サソリ、トンボなどの昆虫、イガイなどの軟体動物、イセエビなどの甲殻類、ニワトリなどの鳥類、カエルなどの両生類、ヒト、サル（ヒトを除く霊長目）、牛、ブタ、羊、ヤギ、イヌ、ネコなどの哺乳類などを挙げることができるが、ヒトが好ましい。
【００４０】
次に、本発明は、カンジダ症予防および／または治療剤を提供する。本発明に係るカンジダ症予防および／または治療剤は、タモギタケの水系溶媒抽出物、タモギタケから抽出されるグルコシルセラミド、タモギタケから抽出されるエルゴチオネインおよびタモギタケから抽出されるエルゴステロールパーオキサイドからなる群から選択される１または２以上の物質を有効成分とする。
【００４１】
カンジダ症はＣ．ａｌｂｉｃａｎｓに代表されるカンジダ菌により引き起こされる感染症である。カンジダ菌はヒトの体表や消化管、膣粘膜などに常時生息しており、健常人には特に何の影響も与えないが、体調が悪いときや免疫力が低下しているときなどに、疾病を引き起こす日和見感染菌である。本発明に係るカンジダ症予防および／または治療剤は、カンジダ菌に直接的に働きかけることによってその増殖を抑制する作用（直接的作用）のほか、生体の抗菌ペプチド産生細胞に作用して抗菌ペプチドの産生を促進させ、産生された抗菌ペプチドがカンジダ菌の増殖を抑制する作用（間接的作用）を有している。
【００４２】
本発明におけるカンジダ症としては、例えば、皮膚カンジダ症、口腔カンジダ症、性器カンジダ症、口内炎、口角炎、胃鼓脹症、カンジダ敗血症などを挙げることができ、このうちの口腔カンジダ症は、口腔乾燥症（ドライマウス）の患者に頻発することが知られている。口腔乾燥症（ドライマウス）は口腔内が乾燥して、喉や口の渇き、痛み、口臭、味覚異常などの症状を呈する疾病であるが、口腔内の乾燥は、粘膜上皮の抵抗力低下や口腔内常在菌のバランスの崩れを招くことから、カンジダ菌が口腔上皮内に侵入して口腔カンジダ症を引き起こすと考えられている。本発明に係るカンジダ症および／または治療剤は、このような口腔カンジダ症に、特に有効である。
【００４３】
本発明に係る抗菌剤、βディフェンシン産生促進剤ならびにカンジダ症予防および／または治療剤の製剤化には、当業者に公知の方法を用いることができる。投与形態もまた、当業者によって適宜選択することができる投与形態でよく、そのような投与形態としては、例えば、経口投与製剤として調製する場合の、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、コーティング剤、液剤、懸濁剤などの形態を挙げることができ、非経口投与製剤にする場合の、ジェル剤、吸入剤、注射剤、点滴剤、座薬、塗布剤、噴霧剤、貼付剤、軟膏、クリームなどの形態を挙げることができる。また、その投与量は、医薬組成物の製剤形態、投与方法、使用目的およびこれに適用される投与対象の年齢、体重、症状によって適宜設定することができる。
【００４４】
皮膚外用剤として用いられる場合は、その剤型は適宜選択することができ、例えば、溶液系、可溶化系、乳化系、粉末分散系、水−油二層系、水−油−粉末三層系、ジェル、ミスト、スプレー、ムース、ロールオン、スティックなどの他、不織布などのシートに含浸ないし塗布した製剤などを挙げることができる。また、本発明に係る抗菌剤、βディフェンシン産生促進剤ならびにカンジダ症予防および／または治療剤に、例えば、植物油などの油脂類、ラノリンやミツロウなどのロウ類、炭化水素類、脂肪酸、高級アルコール類、エステル類、各種界面活性剤、色素、香料、ビタミン類、植物や動物の抽出成分、紫外線吸収剤、抗酸化剤、防腐剤、殺菌剤などの、通常の皮膚外用剤の原料として使用されているものを適宜配合し、皮膚外用剤を製造することができる。また、抗炎症性の皮膚外用剤原料であるグリチルレチン酸などの甘草抽出成分、塩酸ジフェンヒドラミン、アズレン、ｄｌ−α−トコフェロールおよびその誘導体、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６などとともに用いることができる。
【００４５】
食品添加物として用いられる場合は、その形態は適宜選択することができ、例えば、本発明に係る抗菌剤、βディフェンシン産生促進剤ならびにカンジダ症予防および／または治療剤をそのまま食品として調製したもの、他の食品に添加したもの、あるいは、カプセル、錠剤等、食品または健康食品に通常用いられる任意の形態を挙げることができる。また、食品中に配合して摂取あるいは投与する場合には、適宜、賦形剤、増量剤、結合剤、増粘剤、乳化剤、着色料、香料、食品添加物、調味料などと混合し、用途に応じて、粉末、顆粒、錠剤等の形に成形することができる。さらには、食品原料中に混合して食品を調製し、機能性食品として製品化することによって摂取することができる。
【００４６】
以下、本発明に係る抗菌剤、βディフェンシン産生促進剤ならびにカンジダ症予防および／または治療剤について、実施例に基づいて説明する。なお、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。
【実施例】
【００４７】
＜実施例１＞カンジダ菌増殖抑制効果の確認
（１）タモギタケ熱水抽出物の調製
生のタモギタケ１５０ｋｇ〜２００ｋｇを水２００Ｌに入れて加熱し、沸騰させた状態で５分間煮出した後、濾過して１５０Ｌの濾液を得ることにより、タモギタケ熱水抽出物を調製した。
【００４８】
（２）サンプルの調製
６ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ社）の各ウェルにブレインハートフュージョン培地（ＢＨＩ培地；栄研化学社）を入れたものを４枚準備し、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤとして、計４サンプルを調製した。各サンプルの各ウェルに、カンジダ菌（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ ＡＴＣＣ９００２８株）を、培養液の６００ｎｍにおける吸光度が０．０１〜０．０５となるよう植菌した後、Ｂ、ＣおよびＤの各ウェルに、本実施例（１）で調製したタモギタケ熱水抽出物を、それぞれ、６％（ｖ／ｖ）、８％（ｖ／ｖ）および６０％（ｖ／ｖ）となるように添加した。なお、何も添加しないＡのウェルをコントロールとした。
【００４９】
（３）カンジダ菌の培養および濁度の測定
本実施例（２）のＡ、Ｂ、ＣおよびＤを２５℃にて１６時間培養した。次に、カンジダ菌生菌数の指標として、培養後の培地について、分光光度計（ＢｉｏＲａｄ社）を用いて波長６００ｎｍにおける吸光度を測定することにより、濁度を求めた。続いて、サンプルごとに各ウェルにおける濁度の平均値と標準偏差を算出した。また、算出したＢ、ＣおよびＤにおける結果について、Ａにおける結果との間でマンホイットニーのＵ検定を行った。その結果を図１に示す。図中の＊は、検定の結果、統計的に有意であることを示す（ｐ＜０．０５）。
【００５０】
図１に示すように、濁度の大きさはＡ＞Ｂ＞Ｃ＞Ｄであり、Ａにおける濁度を１００％とすると、Ｂ、ＣおよびＤにおける濁度はそれぞれ約９２％、約８２％および５８〜７１％であった。すなわち、培地に添加したタモギタケ熱水抽出物の濃度が大きい場合ほど、カンジダ菌の生菌数が小さいことが確認された。
【００５１】
これらの結果から、タモギタケ熱水抽出物はカンジダ菌の増殖を抑制することが明らかになった。
【００５２】
＜実施例２＞ヒトβ−ディフェンシン産生促進効果の検討
（１）タモギタケ熱水抽出物のヒトβ−ディフェンシン産生促進効果の検討
［１−１］サンプルの調製および培養
ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社）およびペニシリン・ストレプトマイシン（シグマ社）をそれぞれ１０％（ｖ／ｖ）および２％（ｖ／ｖ）の終濃度で含むＤＭＥＭ培地（シグマ社）を調製し、Ｆ−Ｐ−ＤＭＥＭ培地とした。Ｆ−Ｐ−ＤＭＥＭ培地に、ヒト不死化ケラチノサイト細胞（ＨａＣａＴ細胞；東京歯科大学病理学講座村松敬氏提供）を１×１０５個／ｍＬとなるよう添加して、細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液３ｍＬを６０ｍｍディッシュ（ＩＷＡＫＩ社）に入れたものを５枚準備し、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥとして、計５サンプルを調製した。続いて、各サンプルを３７℃、ＣＯ２５％（ｖ／ｖ）の環境下にて、８０％コンフルエントに達するまで、約３日間培養した。
【００５３】
［１−２］タモギタケ熱水抽出物を添加した培地での培養
実施例１（１）で調製したタモギタケ熱水抽出物を、ＤＤＷを用いて希釈して、それぞれ、２％（ｖ／ｖ）、２０％（ｖ／ｖ）および４０％（ｖ／ｖ）の熱水抽出物水溶液を調製した。次に、ＤＤＷ、２％（ｖ／ｖ）、２０％（ｖ／ｖ）、４０％（ｖ／ｖ）の熱水抽出物水溶液および実施例１（１）で調製したタモギタケ熱水抽出物をそれぞれ２５％（ｖ／ｖ）となるようＦ−Ｐ−ＤＭＥＭ培地に添加して、コントロール用交換培地とタモギタケ熱水抽出物を下記の終濃度で含む交換培地とを調製した。本実施例（１）［１−１］の各サンプルの培地を、調製した交換培地に下記のとおり交換した後、本実施例（１）［１−１］に記載の環境下にて、さらに２４時間培養した。
【００５４】
交換培地に添加したものおよびタモギタケ熱水抽出物の終濃度
Ａ ：ＤＤＷ （コントロール用交換培地）
Ｂ ：タモギタケ熱水抽出物 終濃度０．５％（ｖ／ｖ）
Ｃ ：タモギタケ熱水抽出物 終濃度 ５％（ｖ／ｖ）
Ｄ ：タモギタケ熱水抽出物 終濃度 １０％（ｖ／ｖ）
Ｅ ：タモギタケ熱水抽出物 終濃度 ２５％（ｖ／ｖ）
【００５５】
［１−３］ＲＮＡの抽出およびｃＤＮＡの作製
本実施例（１）［１−２］の各サンプルから細胞を回収した後、ＴＲＩｚｏｌ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて細胞中の全ＲＮＡを抽出した。続いて、抽出した全ＲＮＡの１０％（ｖ／ｖ）容量のクロロホルムを添加して、１３０００ｒｐｍ、４℃の条件下で１０分間遠心分離を行った後、水層を回収した。次に、等量のイソプロパノールを添加して、１３０００ｒｐｍ、４℃の条件下で１０分間遠心分離を行った後、上清を除去し、７０％（ｖ／ｖ）エタノール６００μＬを添加して沈殿物を洗浄した。その後、沈殿物を滅菌ＤＥＰＣ処理水に溶解し、全ＲＮＡ溶液を得た。この全ＲＮＡ溶液から適量を分取し、分光光度計ＮａｎｏＤｒｏｐ ＮＤ−１０００（ＮａｎｏＤｒｏｐ ｐｒｏｄｕｃｔｓ社）を用いて波長２６０ｎｍにおける吸光度を測定することにより、濃度を測定した。
【００５６】
続いて、全ＲＮＡ２μｇを含む全ＲＮＡ溶液を鋳型として、オリゴｄＴ１２−１８プライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）およびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、付属の使用書に従い、ｃＤＮＡを作製した。
【００５７】
［１−４］定量ＰＣＲ法によるヒトβ−ディフェンシンｍＲＮＡの定量
本実施例（１）［１−３］のｃＤＮＡを鋳型として、ヒトβ−ディフェンシン−１（ｈＢＤ−１）、ヒトβ−ディフェンシン−２（ｈＢＤ−２）、ヒトβ−ディフェンシン−３（ｈＢＤ−３）およびグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）について、Ｔａｑ Ｍａｎ ７３００ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）およびＴａｑ Ｍａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、付属の使用書に従い、定量ＰＣＲ法を行い、一定の増幅産物量になるサイクル数（Ｃｔ値）を測定した。定量ＰＣＲ法に用いたプライマーおよびプローブは下記のとおりである。
【００５８】
定量ＰＣＲに用いたプライマー・プローブ
Ｔａｑ Ｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）；
ｈＢＤ−１の増幅に用いたプライマー・プローブ：ＡｓｓａｙＩＤ Ｈｓ００６０８３４５＿ｍ１
ｈＢＤ−２の増幅に用いたプライマー・プローブ：ＡｓｓａｙＩＤ Ｈｓ００８２３６３８＿ｍ１
ｈＢＤ−３の増幅に用いたプライマー・プローブ：ＡｓｓａｙＩＤ Ｈｓ００２１８６７８＿ｍ１
ＧＡＰＤＨの増幅に用いたプライマー・プローブ：ＡｓｓａｙＩＤ Ｈｓ９９９９９９０５＿ｍ１
【００５９】
続いて、測定した結果に基づき、ＡにおけるＣｔ値を基準値とし、ＧＡＰＤＨのＣｔ値を内在コントロールとして比較Ｃｔ法を行うことにより、ｈＢＤ−１、ｈＢＤ−２およびｈＢＤ−３のｍＲＮＡ相対発現量を算出した。
【００６０】
本実施例（１）［１−１］〜［１−４］の実験を３回以上繰り返し、各サンプルにおけるｈＢＤ−１、ｈＢＤ−２およびｈＢＤ−３のｍＲＮＡ相対発現量について、平均値および標準偏差を算出した。また、算出したＢ、ＣおよびＤにおける結果について、Ａにおける結果との間でマンホイットニーのＵ検定を行った。その結果を図２に示す。図中の＊は、検定の結果、統計的に有意であることを示す（ｐ＜０．０５）。
【００６１】
図２上段に示すように、ｈＢＤ−１のｍＲＮＡ相対発現量について、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥのいずれも、Ａとほとんど変わらなかった。
【００６２】
また、図２中段に示すように、ｈＢＤ−２のｍＲＮＡ相対発現量について、ＢはＡと比較してほとんど変わらなかったが、ＣおよびＥは、Ａと比較して大きい傾向があり、ＤはＡと比較して有意に大きかった。すなわち、タモギタケ熱水抽出物を添加した培地でＨａＣａＴ細胞を培養した場合は、それを添加しないで培養した場合と比較して、ｈＢＤ−２のｍＲＮＡ発現量が増加することが確認された。
【００６３】
また、図２下段に示すように、ｈＢＤ−３のｍＲＮＡ相対発現量について、ＢおよびＥは、Ａと比較して大きい傾向があり、ＣおよびＤは、Ａと比較して有意に大きかった。すなわち、タモギタケ熱水抽出物を添加した培地でＨａＣａＴ細胞を培養した場合は、それを添加しないで培養した場合と比較して、ｈＢＤ−３のｍＲＮＡ発現量が増加することが確認された。
【００６４】
これらの結果から、タモギタケ熱水抽出物は、ＨａＣａＴ細胞に２４時間作用させた場合に、ｈＢＤ−２およびｈＢＤ−３の産生を促進することが明らかになった。
【００６５】
（２）タモギタケ熱水抽出物の濾液および濾物のヒトβ−ディフェンシン産生促進効果の検討
［２−１］タモギタケ熱水抽出物の濾液および濾物の調製
実施例１（１）で調製したタモギタケ熱水抽出物１５０ｍＬについて、分画分子量１０００の限外濾過膜を用いて限外濾過を行い、２５ｍＬの濾液および濾物（乾燥重量；０．２ｇ）を得た。
【００６６】
［２−２］サンプルの調製および培養
本実施例（１）［１−１］に記載の方法により、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤの計４サンプルをを調製し、培養した。
【００６７】
［２−３］タモギタケ熱水抽出物の濾液および濾物を添加した培地での培養
本実施例（２）［２−１］の濾物をＤＤＷに溶解し、１ｍｇ／ｍＬの濾物水溶液を調製した。次に、ＤＤＷ、本実施例（２）［２−１］の濾液、濾物水溶液および実施例１（１）で調製した熱水抽出物をそれぞれ１０％（ｖ／ｖ）となるようＦ−Ｐ−ＤＭＥＭ培地に添加して、コントロール用交換培地と濾液、濾物およびタモギタケ熱水抽出物を含む交換培地とを調製した。本実施例（２）［２−２］のＡ、Ｂ、ＣおよびＤの培地を、調製した交換培地に下記のとおり交換した後、本実施例（１）［１−１］に記載の環境下にて、さらに２４時間培養した。
【００６８】
交換培地に添加したもの
Ａ ：ＤＤＷ（コントロール用交換培地）
Ｂ ：濾液
Ｃ ：濾物
Ｄ ：タモギタケ熱水抽出物
【００６９】
［２−４］ＲＮＡの抽出およびｃＤＮＡの作製、ならびに定量ＰＣＲ法によるｈＢＤ−３ｍＲＮＡの定量
本実施例（２）［２−３］の各サンプルについて、本実施例（１）［１−３］に記載の方法によりＲＮＡの抽出およびｃＤＮＡの作製を行った後、本実施例（１）［１−４］に記載の方法により定量ＰＣＲ法を行い、ｈＢＤ−３ｍＲＮＡの定量を行った。また、算出したＢ、ＣおよびＤにおける結果について、Ａにおける結果との間でマンホイットニーのＵ検定を行った。その結果を図３に示す。図中の＊は、Ｕ検定の結果、統計的に有意であることを示す（ｐ＜０．０５）。
【００７０】
図３に示すように、ｈＢＤ−３のｍＲＮＡ相対発現量について、その大きさはＡ＜Ｂ＜Ｃ＜Ｄであり、Ｂ、ＣおよびＤは、Ａと比較していずれも有意に大きかった。
【００７１】
これらの結果から、タモギタケ熱水抽出物について、分画分子量１０００の限外濾過膜を通過した画分（濾液）とそれを通過しなかった画分（濾物）とは、いずれもＨａＣａＴ細胞に２４時間作用させた場合に、ｈＢＤ−３の産生を促進することが明らかになった。
【００７２】
（３）タモギタケ水抽出物のヒトβ−ディフェンシン産生促進効果の検討
［３−１］タモギタケ水抽出物の調製
フードプロセッサーに生のタモギタケ１００ｇと水１００ｇとを投入し、粉砕した後、濾布を用いて濾過し、７０ｍＬの濾液を得た。得られた濾液のｐＨを測定したところ、ｐＨ６．０８であった。続いて、オートクレーブ装置を用いて、濾液を１２０℃で１５分間滅菌処理した。
【００７３】
［３−２］サンプルの調製および培養、ならびにタモギタケ水抽出物を添加した培地での培養
本実施例（１）［１−１］に記載の方法により、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥの計５サンプルを調製し、培養した。続いて、実施例１（１）で調製したタモギタケ熱水抽出物に代えて、本実施例（３）［３−１］で調製したタモギタケ水抽出物を用いて、本実施例（１）［１−２］に記載の方法により、タモギタケ水抽出物を添加した培地での培養を行った。
【００７４】
［３−３］ＲＮＡの抽出およびｃＤＮＡの作製、ならびに定量ＰＣＲ法によるヒトβ−ディフェンシンｍＲＮＡの定量
本実施例（３）［３−２］の各サンプルについて、本実施例（１）［１−３］に記載の方法により、ＲＮＡの抽出およびｃＤＮＡの作製を行った後、本実施例（１）［１−４］に記載の方法により定量ＰＣＲ法を行い、ヒトβ−ディフェンシンｍＲＮＡの定量を行った。また、算出したＢ、Ｃ、ＤおよびＥにおける結果について、Ａにおける結果との間でマンホイットニーのＵ検定を行った。その結果を図４に示す。図中の＊は、Ｕ検定の結果、統計的に有意であることを示す（ｐ＜０．０５）。
【００７５】
図４上段に示すように、ｈＢＤ−１のｍＲＮＡ相対発現量について、ＢはＡと比較してほとんど変わらなかったが、Ｃ、ＤおよびＥは、Ａと比較して有意に大きかった。すなわち、タモギタケ水抽出物を添加した培地でＨａＣａＴ細胞を培養した場合は、それを添加しないで培養した場合と比較して、ｈＢＤ−１のｍＲＮＡ発現量が増加することが確認された。
【００７６】
また、図４中段に示すように、ｈＢＤ−２のｍＲＮＡ相対発現量について、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥのいずれも、Ａと比較してほとんど変わらなかった。
【００７７】
また、図４下段に示すように、ｈＢＤ−３のｍＲＮＡ相対発現量について、ＢおよびＣは、Ａと比較してほとんど変わらなかったが、ＤおよびＥは、Ａと比較して有意に大きかった。すなわち、タモギタケ水抽出物を添加した培地でＨａＣａＴ細胞を培養した場合は、それを添加しないで培養した場合と比較して、ｈＢＤ−３のｍＲＮＡ発現量が増加することが確認された。
【００７８】
これらの結果から、タモギタケ水抽出物は、ＨａＣａＴ細胞に２４時間作用させた場合に、ｈＢＤ−１およびｈＢＤ−３の産生を促進することが明らかになった。
【００７９】
（４）タモギタケ酸性溶媒抽出物のヒトβ−ディフェンシン産生促進効果の検討
［４−１］タモギタケ酸性溶媒抽出物の調製
水を０．４％（ｗ／ｗ）クエン酸水溶液に代えて、本実施例（３）［３−１］に記載の方法によりタモギタケの抽出物を調製し、これをタモギタケ酸性溶媒抽出物とした。なお、オートクレーブによる滅菌処理を行う前の濾液のｐＨは、ｐＨ４．６１であった。
【００８０】
［４−２］サンプルの調製および培養、ならびにタモギタケ酸性溶媒抽出物を添加した培地での培養
本実施例（１）［１−１］に記載の方法により、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥの計５サンプルをを調製し、培養した。続いて、実施例１（１）で調製したタモギタケ熱水抽出物に代えて、本実施例（４）［４−１］で調製したタモギタケ酸性溶媒抽出物を用いて、本実施例（１）［１−２］に記載の方法により、タモギタケ酸性溶媒抽出物を添加した培地での培養を行った。
【００８１】
［４−３］ＲＮＡの抽出およびｃＤＮＡの作製、ならびに定量ＰＣＲ法によるヒトβ−ディフェンシンｍＲＮＡの定量
本実施例（４）［４−２］の各サンプルについて、本実施例（１）［１−３］に記載の方法により、ＲＮＡの抽出およびｃＤＮＡの作製を行った後、本実施例（１）［１−４］に記載の方法により定量ＰＣＲ法を行い、ヒトβ−ディフェンシンｍＲＮＡの定量を行った。また、算出したＢ、Ｃ、ＤおよびＥにおける結果について、Ａにおける結果との間でマンホイットニーのＵ検定を行った。その結果を図５に示す。図中の＊は、Ｕ検定の結果、統計的に有意であることを示す（ｐ＜０．０５）。
【００８２】
図５上段に示すように、ｈＢＤ−１のｍＲＮＡ相対発現量について、Ｂ、ＣおよびＤは、Ａと比較してほとんど変わらなかったが、ＥはＡと比較して有意に大きかった。すなわち、タモギタケ酸性溶媒抽出物を添加した培地でＨａＣａＴ細胞を培養した場合は、それを添加しないで培養した場合と比較して、ｈＢＤ−１のｍＲＮＡ発現量が増加することが確認された。
【００８３】
また、図５中段に示すように、ｈＢＤ−２のｍＲＮＡ相対発現量について、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥのいずれも、Ａと比較してほとんど変わらなかった。
【００８４】
また、図５下段に示すように、ｈＢＤ−３のｍＲＮＡ相対発現量について、ＢおよびＣは、Ａと比較してほとんど変わらなかったが、ＤおよびＥは、Ａと比較して有意に大きかった。すなわち、タモギタケ酸性溶媒抽出物を添加した培地でＨａＣａＴ細胞を培養した場合は、それを添加しないで培養した場合と比較して、ｈＢＤ−３のｍＲＮＡ発現量が増加することが確認された。
【００８５】
これらの結果から、タモギタケ酸性溶媒抽出物は、ＨａＣａＴ細胞に２４時間作用させた場合に、ｈＢＤ−１およびｈＢＤ−３の産生を促進することが明らかになった。
【００８６】
（５）タモギタケ塩基性溶媒抽出物のヒトβ−ディフェンシン産生促進効果の検討
［５−１］タモギタケ塩基性溶媒抽出物の調製
水を１％（ｗ／ｗ）重曹水溶液に代えて、本実施例（３）［３−１］に記載の方法により、タモギタケの抽出物を調製し、これをタモギタケ塩基性溶媒抽出物とした。なお、オートクレーブによる滅菌処理を行う前の濾液のｐＨは、ｐＨ７．６であった。
【００８７】
［５−２］サンプルの調製および培養、ならびにタモギタケ塩基性溶媒抽出物を添加した培地での培養
本実施例（１）［１−１］に記載の方法により、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥの計５サンプルを調製し、培養した。続いて、実施例１（１）で調製したタモギタケ熱水抽出物に代えて、本実施例（５）［５−１］で調製したタモギタケ塩基性溶媒抽出物を用いて、本実施例（１）［１−２］に記載の方法により、タモギタケ塩基性溶媒抽出物を添加した培地での培養を行った。
【００８８】
［５−３］ＲＮＡの抽出およびｃＤＮＡの作製、ならびに定量ＰＣＲ法によるヒトβ−ディフェンシンｍＲＮＡの定量
本実施例（５）［５−２］の各サンプルについて、本実施例（１）［１−３］に記載の方法により、ＲＮＡの抽出およびｃＤＮＡの作製を行った後、本実施例（１）［１−４］に記載の方法により定量ＰＣＲ法を行い、ヒトβ−ディフェンシンｍＲＮＡの定量を行った。また、算出したＢ、Ｃ、ＤおよびＥにおける結果について、Ａにおける結果との間でマンホイットニーのＵ検定を行った。その結果を図６に示す。図中の＊は、Ｕ検定の結果、統計的に有意であることを示す（ｐ＜０．０５）。
【００８９】
図６上段に示すように、ｈＢＤ−１のｍＲＮＡ相対発現量について、ＢはＡと比較してほとんど変わらなかったが、Ｃ、ＤおよびＥは、Ａと比較して有意に大きかった。すなわち、タモギタケ塩基性溶媒抽出物を添加した培地でＨａＣａＴ細胞を培養した場合は、それを添加しないで培養した場合と比較して、ｈＢＤ−１のｍＲＮＡ発現量が増加することが確認された。
【００９０】
また、図６中段に示すように、ｈＢＤ−２のｍＲＮＡ相対発現量について、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥのいずれも、Ａと比較してほとんど変わらなかった。
【００９１】
また、図６下段に示すように、ｈＢＤ−３のｍＲＮＡ相対発現量について、Ｂ、Ｃ、Ｄのいずれも、Ａと比較して有意に大きかった。すなわち、タモギタケ塩基性溶媒抽出物を添加した培地でＨａＣａＴ細胞を培養した場合は、それを添加しないで培養した場合と比較して、ｈＢＤ−３のｍＲＮＡ発現量が増加することが確認された。
【００９２】
これらの結果から、タモギタケ塩基性溶媒抽出物は、ＨａＣａＴ細胞に２４時間作用させた場合に、ｈＢＤ−１およびｈＢＤ−３の産生を促進することが明らかになった。
【００９３】
（６）タモギタケ由来エルゴチオネインのヒトβ−ディフェンシン産生促進効果の検討
［６−１］タモギタケ由来エルゴチオネインの調製
生のタモギタケ１５０ｋｇ〜２００ｋｇを水２００Ｌに入れて加熱し、沸騰させた状態で５分間煮出した後、濾過して１５０Ｌの濾液を得た。この濾液について、５０００ｒｐｍ、１０℃の条件下で３０分間遠心分離を行って１３５Ｌの上清を回収した。５×３０ｃｍのカラムに充填したイオン交換樹脂（アンバーライトＩＲ１２０Ｂ Ｈ型；オルガノ社）に、回収した上清のうちの７．５Ｌを入れ、一晩自然落下させた。続いて、イオン交換樹脂を回収し、蒸留水２．５Ｌを用いて洗浄して糖質成分を除去した後、０．２８％（ｗ／ｗ）アンモニア水１０Ｌを用いて溶出し、イオン交換樹脂に吸着していた陽イオン性化合物を含む溶出液１０ｍＬを得た。ロータリーエバポレーターを用いてこの溶出液を濃縮した後、下記の条件により定法に従って高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を行い、流出開始３〜４分に検出されるピークの画分を分取した。
【００９４】
ＨＰＬＣの条件
ＨＰＬＣシステム；日立高速液体クロマトグラフＬａＣｈｒｏｍ Ｅｌｉｔｅ
溶離溶媒；０〜１％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液
カラム；Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−ＳＰ（ジーエルサイエンス社）
検出器；ＵＶ検出器
検出条件；２５０ｎｍ
【００９５】
分取した画分を合わせた後、凍結乾燥機を用いて凍結乾燥し、粉末状のタモギタケ由来エルゴチオネイン１．７ｇ（７．４ｍｍｏｌ）を得た。
【００９６】
［６−２］サンプルの調製および培養
本実施例（１）［１−１］に記載の方法により、Ａ、Ｂ、およびＣの計３サンプルを調製し、培養した。
【００９７】
［６−３］タモギタケ由来エルゴチオネインを添加した培地での培養
本実施例（６）［６−１］で調製したタモギタケ由来エルゴチオネインをＤＤＷに溶解して、それぞれ、１０ｍｍｏｌ／Ｌおよび１００ｍｍｏｌ／Ｌのエルゴチオネイン水溶液を調製した。次に、ＤＤＷ、１０ｍｍｏｌ／Ｌおよび５００ｍｍｏｌ／Ｌのエルゴチオネイン水溶液をそれぞれ１％（ｖ／ｖ）となるようＦ−Ｐ−ＤＭＥＭ培地に添加して、コントロール用交換培地とタモギタケ由来エルゴチオネインを下記の終濃度で含む交換培地とを調製した。本実施例（６）［６−２］の各サンプルの培地を、調製した交換培地に下記のとおり交換した後、本実施例（１）［１−１］に記載の環境下にて、さらに２４時間培養した。
【００９８】
交換培地に添加したものおよびタモギタケ由来エルゴチオネインの終濃度
Ａ ：ＤＤＷ （コントロール用交換培地）
Ｂ ：タモギタケ由来エルゴチオネイン 終濃度１００μｍｏｌ／Ｌ
Ｃ ：タモギタケ由来エルゴチオネイン 終濃度 ５ｍｍｏｌ／Ｌ
【００９９】
［６−４］ＲＮＡの抽出およびｃＤＮＡの作製、ならびに定量ＰＣＲ法によるヒトβ−ディフェンシンｍＲＮＡの定量
本実施例（６）［６−３］の各サンプルについて、本実施例（１）［１−３］に記載の方法により、ＲＮＡの抽出およびｃＤＮＡの作製を行った後、本実施例（１）［１−４］に記載の方法により定量ＰＣＲ法を行い、ヒトβ−ディフェンシンｍＲＮＡの定量を行った。また、算出したＢおよびＣにおける結果について、Ａにおける結果との間でマンホイットニーのＵ検定を行った。その結果を図７に示す。図中の＊は、Ｕ検定の結果、統計的に有意であることを示す（ｐ＜０．０５）。
【０１００】
図７上段に示すように、ｈＢＤ−１のｍＲＮＡ相対発現量について、ＢおよびＣは、Ａと比較して有意に大きかった。すなわち、タモギタケ由来エルゴチオネインを添加した培地でＨａＣａＴ細胞を培養した場合は、それを添加しないで培養した場合と比較して、ｈＢＤ−１のｍＲＮＡ発現量が増加することが確認された。
【０１０１】
また、図７中段に示すように、ｈＢＤ−２のｍＲＮＡ相対発現量について、ＢおよびＣのいずれも、Ａと比較してほとんど変わらなかった。
【０１０２】
また、図７下段に示すように、ｈＢＤ−３のｍＲＮＡ相対発現量について、ＢおよびＣのいずれも、Ａと比較して有意に大きかった。すなわち、タモギタケ由来エルゴチオネインを添加した培地でＨａＣａＴ細胞を培養した場合は、それを添加しないで培養した場合と比較して、ｈＢＤ−３のｍＲＮＡ発現量が増加することが確認された。
【０１０３】
これらの結果から、タモギタケ由来エルゴチオネインは、ＨａＣａＴ細胞に２４時間作用させた場合に、ｈＢＤ−１およびｈＢＤ−３の産生を促進することが明らかになった。
【０１０４】
（７）タモギタケ由来エルゴステロールパーオキサイドのヒトβ−ディフェンシン産生促進効果の検討
［７−１］タモギタケ由来エルゴステロールパーオキサイドの調製
生のタモギタケ１５０ｋｇ〜２００ｋｇを水２００Ｌに入れて加熱し、沸騰させた状態で５分間煮出した後、濾過して濾物（残渣）を得た。この濾物を加熱して乾燥させた後、粉砕機を用いて粒子径が０．１ｍｍとなるまで粉砕し、１２ｋｇの粉末を得た。９９．５％（ｖ／ｖ）エタノールを、この粉末１００ｇ当たりに５００ｍＬ〜１０００ｍＬ添加して加熱し、粉末に含まれる成分を溶解させた。この溶液を冷却した後、５０００ｒｐｍ、１０℃の条件下で３０分間遠心分離を行って上清を回収し、１ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨ水溶液を等量添加して室温下で２時間攪拌することによりケン化反応を行った。続いて、６ｍｏｌ／Ｌの塩酸水溶液を適量添加することによりｐＨを５〜６に調整した後、５０００ｒｐｍ、１０℃の条件下で３０分間遠心分離を行った。上清を除去した後、沈殿物に１００ｍＬのエタノールを添加して攪拌し、減圧下でエタノールを留去して、白色の沈殿物１０〜５０ｇを得て、これを脂質粗抽出物とした。
【０１０５】
次に、脂質粗抽出物１０〜５０ｇをクロロホルム／メタノール｛クロロホルム：メタノール＝９５：５（ｖ／ｖ）｝３０ｍＬに溶解した後、粒子径１００〜２１０μｍのシリカゲル６０（関東化学社）を充填した８×８０ｃｍのシリカゲルカラムに注入した。続いて、クロロホルム／メタノール｛クロロホルム：メタノール＝９０：１０（ｖ／ｖ）｝１０００ｍＬにより溶出して、溶出液を５００ｍＬずつ分取した。分取した各溶出液から適量を採取して、定法に従い薄層クロマトグラフィー｛展開溶媒；クロロホルム：メタノール：水＝８０：２０：０．２（ｖ／ｖ）｝に供し、エルゴステロールパーオキサイドを含む溶出液を選択した後、選択した溶出液の溶媒を減圧下で留去し、エルゴステロールパーオキサイド粗精製物を得た。
【０１０６】
続いて、エルゴステロールパーオキサイド粗精製物をクロロホルム／メタノール｛クロロホルム：メタノール＝９５：５（ｖ／ｖ）｝に溶解した後、粒子径４０〜１００μｍのシリカゲル６０（関東化学社）を充填した３×６０ｃｍのシリカゲルカラムに注入した。クロロホルム／メタノール｛クロロホルム：メタノール＝９５：５（ｖ／ｖ）｝１０００ｍＬ、クロロホルム／メタノール｛クロロホルム：メタノール＝９０：１０（ｖ／ｖ）｝１０００ｍＬ、クロロホルム／メタノール｛クロロホルム：メタノール＝８５：１５（ｖ／ｖ）｝１０００ｍＬおよびクロロホルム／メタノール｛クロロホルム：メタノール＝８０：２０（ｖ／ｖ）｝１０００ｍＬにより溶出して、溶出液を１８〜５０ｍＬずつ分取した。分取した各溶出液から適量を採取して、定法に従い薄層クロマトグラフィー｛展開溶媒；クロロホルム：メタノール：水＝８０：２０：０．２（ｖ／ｖ）｝に供し、エルゴステロールパーオキサイドを含む溶出液を選択した後、選択した画分の溶媒を減圧下で留去し、精製されたタモギタケ由来エルゴステロールパーオキサイド３〜４ｇ（７．０〜９．３ｍｍｏｌ）を得た。
【０１０７】
［７−２］サンプルの調製および培養
本実施例（１）［１−１］に記載の方法により、Ａ、Ｂ、およびＣの計３サンプルを調製し、培養した。
【０１０８】
［７−３］タモギタケ由来エルゴステロールパーオキサイドを添加した培地での培養
本実施例（７）［７−１］で調製したタモギタケ由来エルゴステロールパーオキサイドをジメチルスルホキシドに溶解して、それぞれ、１００μｍｏｌ／Ｌおよび１ｍｍｏｌ／Ｌのエルゴステロールパーオキサイド水溶液を調製した。次に、ジメチルスルホキシド、１００μｍｏｌ／Ｌおよび１ｍｍｏｌ／Ｌのエルゴステロールパーオキサイド水溶液をそれぞれ１％（ｖ／ｖ）となるようＦ−Ｐ−ＤＭＥＭ培地に添加して、コントロール用交換培地とタモギタケ由来エルゴステロールパーオキサイドを下記の終濃度で含む交換培地とを調製した。本実施例（７）［７−２］の各サンプルの培地を、調製した交換培地に下記のとおり交換した後、本実施例（１）［１−１］に記載の環境下にて、さらに２４時間培養した。
【０１０９】
交換培地に添加したものおよびタモギタケ由来エルゴステロールパーオキサイドの終濃度
Ａ ：ジメチルスルホキシド （コントロール用交換培地）
Ｂ ：タモギタケ由来エルゴステロールパーオキサイド 終濃度 １μｍｏｌ／Ｌ
Ｃ ：タモギタケ由来エルゴステロールパーオキサイド 終濃度１０μｍｏｌ／Ｌ
【０１１０】
［７−４］ＲＮＡの抽出およびｃＤＮＡの作製、ならびに定量ＰＣＲ法によるヒトβ−ディフェンシンｍＲＮＡの定量
本実施例（７）［７−３］の各サンプルについて、本実施例（１）［１−３］に記載の方法により、ＲＮＡの抽出およびｃＤＮＡの作製を行った後、本実施例（１）［１−４］に記載の方法により、定量ＰＣＲ法を行い、ヒトβ−ディフェンシンｍＲＮＡの定量を行った。また、算出したＢおよびＣにおける結果について、Ａにおける結果との間でマンホイットニーのＵ検定を行った。その結果を図８に示す。図中の＊は、Ｕ検定の結果、統計的に有意であることを示す（ｐ＜０．０５）。
【０１１１】
図８上段に示すように、ｈＢＤ−１のｍＲＮＡ相対発現量について、ＢおよびＣのいずれも、Ａと比較してほとんど変わらなかった。
【０１１２】
また、図８中段に示すように、ｈＢＤ−２のｍＲＮＡ相対発現量について、ＢおよびＣのいずれも、Ａと比較して有意に大きかった。すなわち、タモギタケ由来エルゴステロールパーオキサイドを添加した培地でＨａＣａＴ細胞を培養した場合は、それを添加しないで培養した場合と比較して、ｈＢＤ−２のｍＲＮＡ発現量が増加することが確認された。
【０１１３】
また、図８下段に示すように、ｈＢＤ−３のｍＲＮＡ相対発現量について、ＣはＡと比較して大きい傾向があり、ＢはＡと比較して有意に大きかった。すなわち、タモギタケ由来エルゴステロールパーオキサイドを添加した培地でＨａＣａＴ細胞を培養した場合は、それを添加しないで培養した場合と比較して、ｈＢＤ−３のｍＲＮＡ発現量が増加することが確認された。
【０１１４】
これらの結果から、タモギタケ由来エルゴステロールパーオキサイドは、ＨａＣａＴ細胞に２４時間作用させた場合に、ｈＢＤ−２およびｈＢＤ−３の産生を促進することが明らかになった。
【０１１５】
（８）タモギタケ由来グルコシルセラミドのヒトβ−ディフェンシン産生促進効果の検討
［８−１］タモギタケ由来グルコシルセラミドの調製
シリカゲルカラムからの各溶出液について、薄層クロマトグラフィーにより含有成分を確認し、選択する際に、エルゴステロールパーオキサイドに代えてグルコシルセラミドを含む溶出液を選択して、本実施例（７）［７−１］に記載の方法を行うことにより、精製されたタモギタケ由来グルコシルセラミド２０〜２５ｇ（０．０２８〜０．０３４ｍｏｌ）を得た。
【０１１６】
［８−２］サンプルの調製および培養
本実施例（１）［１−１］に記載の方法により、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥの計５サンプルを調製し、培養した。
【０１１７】
［８−３］タモギタケ由来グルコシルセラミドを添加した培地での培養
本実施例（８）［８−１］で調製したタモギタケ由来グルコシルセラミドをジメチルスルホキシドに溶解して、それぞれ、１００μｍｏｌ／Ｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌおよび１００ｍｍｏｌ／Ｌのグルコシルセラミド水溶液を調製した。次に、ジメチルスルホキシド、１００μｍｏｌ／Ｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌおよび１００ｍｍｏｌ／Ｌのグルコシルセラミド水溶液をそれぞれ０．１％（ｖ／ｖ）となるようＦ−Ｐ−ＤＭＥＭ培地に添加して、コントロール用交換培地とタモギタケ由来グルコシルセラミドを下記の終濃度で含む交換培地とを調製した。本実施例（８）［８−２］の各サンプルの培地を、調製した交換培地に下記のとおり交換した後、本実施例（１）［１−１］に記載の環境下にて、さらに２４時間培養した。
【０１１８】
交換した培地に添加したものおよびタモギタケ由来グルコシルセラミドの終濃度
Ａ ：ジメチルスルホキシド （コントロール用交換培地）
Ｂ ：タモギタケ由来グルコシルセラミド 終濃度０．１μｍｏｌ／Ｌ
Ｃ ：タモギタケ由来グルコシルセラミド 終濃度 １μｍｏｌ／Ｌ
Ｄ ：タモギタケ由来グルコシルセラミド 終濃度 １０μｍｏｌ／Ｌ
Ｅ ：タモギタケ由来グルコシルセラミド 終濃度１００μｍｏｌ／Ｌ
【０１１９】
［８−４］ＲＮＡの抽出およびｃＤＮＡの作製、ならびに定量ＰＣＲ法によるヒトβ−ディフェンシンｍＲＮＡの定量
本実施例（８）［８−２］の各サンプルについて、本実施例（１）［１−３］に記載の方法により、ＲＮＡの抽出およびｃＤＮＡの作製を行った後、本実施例（１）［１−４］に記載の方法により、定量ＰＣＲ法を行い、ヒトβ−ディフェンシンｍＲＮＡの定量を行った。また、算出したＢ、Ｃ、ＤおよびＥにおける結果について、Ａにおける結果との間でマンホイットニーのＵ検定を行った。その結果を図９に示す。図中の＊は、Ｕ検定の結果、統計的に有意であることを示す（ｐ＜０．０５）。
【０１２０】
図９上段に示すように、ｈＢＤ−１のｍＲＮＡ相対発現量について、Ｂ、ＣおよびＤは、Ａと比較して有意差は見られず、ＥにおけるｍＲＮＡ相対発現量は、ＡにおけるｍＲＮＡ相対発現量と比較して有意に小さかった。
【０１２１】
また、図９中段に示すように、ｈＢＤ−２のｍＲＮＡ相対発現量について、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥのいずれも、Ａと比較して有意差は見られなかった。
【０１２２】
また、図９下段に示すように、ｈＢＤ−３のｍＲＮＡ相対発現量について、ＢはＡと比較してほとんど変わらなかったが、ＣおよびＤは、Ａと比較して大きい傾向があり、ＥはＡと比較して有意に大きかった。すなわち、タモギタケ由来グルコシルセラミドを添加した培地でＨａＣａＴ細胞を培養した場合は、それを添加しないで培養した場合と比較して、ｈＢＤ−３のｍＲＮＡ発現量が増加することが確認された。
【０１２３】
これらの結果から、タモギタケ由来グルコシルセラミドは、ＨａＣａＴ細胞に２４時間作用させた場合に、ｈＢＤ−３の産生を促進することが明らかになった。
【０１２４】
＜実施例３＞ＮＨＥＫ細胞におけるヒトβ−ディフェンシン産生促進効果の検討
（１）サンプルの調製および培養
実施例２（１）［１−１］に記載の方法により、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤの計４サンプルを調製した。ただし、ＨａＣａＴ細胞に代えて正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ細胞；三光純薬社）を用い、培養時間は３日間に代えて２日間とした。
【０１２５】
（２）タモギタケ熱水抽出物を添加した培地での培養
本実施例（１）の各サンプルについて、実施例２（１）［１−２］に記載の方法により、タモギタケ熱水抽出物を添加した培地での培養を行った。ただし、各サンプルに用いた交換培地は下記のとおりとした。
【０１２６】
交換培地に添加したものおよびタモギタケ熱水抽出物の終濃度
Ａ ：ＤＤＷ （コントロール用交換培地）
Ｂ ：タモギタケ熱水抽出物 終濃度０．５％（ｖ／ｖ）
Ｃ ：タモギタケ熱水抽出物 終濃度 ５％（ｖ／ｖ）
Ｄ ：タモギタケ熱水抽出物 終濃度 ２５％（ｖ／ｖ）
【０１２７】
（３）ＲＮＡの抽出およびｃＤＮＡの作製、ならびに定量ＰＣＲ法によるｈＢＤ−２ｍＲＮＡおよびｈＢＤ−３ｍＲＮＡの定量
本実施例（２）の各サンプルについて、実施例２（１）［１−３］に記載の方法により、ＲＮＡの抽出およびｃＤＮＡの作製を行った後、実施例２（１）［１−４］に記載の方法により定量ＰＣＲ法を行い、ｈＢＤ−２ｍＲＮＡおよびｈＢＤ−３ｍＲＮＡの定量を行った。また、算出したＢ、ＣおよびＤにおける結果について、Ａにおける結果との間でマンホイットニーのＵ検定を行った。その結果を図１０に示す。図中の＊は、Ｕ検定の結果、統計的に有意であることを示す（ｐ＜０．０５）。
【０１２８】
図１０上段に示すように、ｈＢＤ−２のｍＲＮＡ相対発現量について、ＢはＡと比較してほとんど変わらなかったが、ＣおよびＤは、Ａと比較して有意に大きかった。
【０１２９】
また、図１０下段に示すように、ｈＢＤ−３のｍＲＮＡ相対発現量についても、ＢはＡと比較してほとんど変わらなかったが、ＣおよびＤは、Ａと比較して有意に大きかった。すなわち、タモギタケ熱水抽出物を添加した培地でＮＨＥＫ細胞を培養した場合は、それを添加しないで培養した場合と比較して、ｈＢＤ−２およびｈＢＤ−３のｍＲＮＡ発現量が増加することが確認された。
【０１３０】
これらの結果から、タモギタケ熱水抽出物は、ＨａＣａＴ細胞のみならずＮＨＥＫ細胞においても、ｈＢＤ−２およびｈＢＤ−３の産生を促進することが明らかになった。
【０１３１】
＜実施例４＞ヒトβ−ディフェンシン産生促進効果を奏する時間の検討
（１）タモギタケ熱水抽出物
実施例２（１）［１−１］〜［１−４］に記載の方法により、実験を行った。ただし、タモギタケ熱水抽出物を添加した培地での培養時間は２４時間に代えて２時間とし、定量ＰＣＲ法によるヒトβ−ディフェンシンｍＲＮＡの定量は、ｈＢＤ−２およびｈＢＤ−３について行った。また、算出したＢ、Ｃ、ＤおよびＥにおける結果について、Ａにおける結果との間でマンホイットニーのＵ検定を行った。その結果を図１１に示す。図中の＊は、Ｕ検定の結果、統計的に有意であることを示す（ｐ＜０．０５）。
【０１３２】
図１１上段に示すように、ｈＢＤ−２のｍＲＮＡ相対発現量について、ＢおよびＣは、Ａと比較してほとんど変わらなかったが、ＤおよびＥは、Ａと比較して有意に大きかった。
【０１３３】
また、図１１下段に示すように、ｈＢＤ−３のｍＲＮＡ相対発現量について、ＢはＡと比較してほとんど変わらなかったが、Ｃ、ＤおよびＥは、Ａと比較して有意に大きかった。
【０１３４】
これらの結果から、タモギタケ熱水抽出物は、ＨａＣａＴ細胞に２時間作用させた場合は、２４時間作用させた場合と同様に、ｈＢＤ−２およびｈＢＤ−３の産生を促進することが明らかになった。また、タモギタケ熱水抽出物がｈＢＤ−２およびｈＢＤ−３の産生を促進する程度は、２４時間作用させた場合と比較して、２時間作用させた場合の方が大きいことが明らかになった。
【０１３５】
（２）タモギタケ熱水抽出物の濾液および濾物
実施例２（２）［２−１］〜［２−４］に記載の方法により、実験を行った。ただし、タモギタケ熱水抽出物の濾液および濾物を添加した培地での培養時間は２４時間に代えて２時間とした。また、算出したＢ、ＣおよびＤにおける結果について、Ａにおける結果との間でマンホイットニーのＵ検定を行った。その結果を図１２に示す。図中の＊は、Ｕ検定の結果、統計的に有意であることを示す（ｐ＜０．０５）。
【０１３６】
図１２に示すように、ｈＢＤ−３のｍＲＮＡ相対発現量について、ＢはＡと比較して大きい傾向があり、ＣおよびＤは、Ａと比較して有意に大きかった。
【０１３７】
これらの結果から、タモギタケ熱水抽出物の濾液は、ＨａＣａＴ細胞に２時間作用させた場合は、２４時間作用させた場合と同様にｈＢＤ−３の産生を促進する傾向があることが明らかになった。また、タモギタケ熱水抽出物の濾物も、ＨａＣａＴ細胞に２時間作用させた場合は、２４時間作用させた場合と同様にｈＢＤ−３の産生を促進することが明らかになった。またタモギタケ熱水抽出物の濾液および濾物がｈＢＤ−３の産生を促進する程度は、２４時間作用させた場合と比較して、２４間作用させた場合の方がやや大きいことが明らかになった。
【０１３８】
（３）タモギタケ熱水抽出物の超音波処理物
［３−１］タモギタケ熱水抽出物の超音波処理物の調製
実施例１（１）で調製したタモギタケ熱水抽出物２０ｍＬをネジ口瓶に入れ、超音波発生器を用いて、４０ｋＨｚの超音波を５０分間照射することにより、タモギタケ熱水抽出物の超音波処理物を得た。
【０１３９】
［３−２］サンプルの調製および培養
実施例２（１）［１−１］に記載の方法により、Ａ、Ｂ、およびＣの計３サンプルを調製し、培養した。
【０１４０】
［３−３］タモギタケ熱水抽出物の超音波処理物を添加した培地での培養
ＤＤＷを用いて本実施例（３）［３−１］のタモギタケ熱水抽出物の超音波処理物を希釈して、１０％（ｖ／ｖ）の超音波処理物水溶液を調製した。次に、ＤＤＷ、１０％（ｖ／ｖ）の超音波処理物水溶液および本実施例（３）［３−１］のタモギタケ熱水抽出物の超音波処理物を、それぞれ１０％（ｖ／ｖ）となるようＦ−Ｐ−ＤＭＥＭ培地に添加して、コントロール用交換培地と、タモギタケ熱水抽出物の超音波処理物を下記の終濃度で含む交換培地とを調製した。本実施例（３）［３−２］の培地を、調製した交換培地に下記のとおり交換した後、実施例２（１）［１−１］に記載の環境下にて、さらに２時間培養した。
【０１４１】
交換培地に添加したものおよびタモギタケ熱水抽出物の超音波処理物の終濃度
Ａ ：ＤＤＷ （コントロール用交換培地）
Ｂ ：タモギタケ熱水抽出物の超音波処理物 終濃度 １％（ｖ／ｖ）
Ｃ ：タモギタケ熱水抽出物の超音波処理物 終濃度１０％（ｖ／ｖ）
【０１４２】
［３−４］ＲＮＡの抽出およびｃＤＮＡの作製、ならびに定量ＰＣＲ法によるｈＢＤ−３ｍＲＮＡの定量
本実施例（３）［３−３］の各サンプルについて、実施例２（１）［１−３］に記載の方法によりＲＮＡの抽出およびｃＤＮＡの作製を行った後、実施例２（１）［１−４］に記載の方法により定量ＰＣＲ法を行い、ｈＢＤ−３ｍＲＮＡの定量を行った。また、算出したＢおよびＣにおける結果について、Ａにおける結果との間でマンホイットニーのＵ検定を行った。その結果を図１３に示す。図中の＊は、Ｕ検定の結果、統計的に有意であることを示す（ｐ＜０．０５）。
【０１４３】
図１３に示すように、ｈＢＤ−３のｍＲＮＡ相対発現量について、ＢおよびＣは、Ａと比較していずれも大きく、ｍＲＮＡ相対発現量の大きさの順はＡ＜Ｂ＜Ｃであった。
【０１４４】
これらの結果から、タモギタケ熱水抽出物の超音波処理物は、ＨａＣａＴ細胞に２時間作用させた場合に、ｈＢＤ−３の産生を促進することが明らかになった。
【０１４５】
（４）タモギタケ水抽出物
実施例２（３）［３−１］〜［３−３］に記載の方法により、実験を行った。ただし、タモギタケ水抽出物を添加した培地での培養時間は２４時間に代えて２時間とした。また、算出したＢ、Ｃ、ＤおよびＥにおける結果について、Ａにおける結果との間でマンホイットニーのＵ検定を行った。その結果を図１４に示す。図中の＊は、Ｕ検定の結果、統計的に有意であることを示す（ｐ＜０．０５）。
【０１４６】
図１４上段に示すように、ｈＢＤ−１のｍＲＮＡ相対発現量について、ＢおよびＤは、Ａと比較してほとんど変わらなかったが、ＣおよびＥは、Ａと比較して有意に大きかった。
【０１４７】
また、図１４中段に示すように、ｈＢＤ−２のｍＲＮＡ相対発現量について、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥのいずれも、Ａと比較してほとんど変わらなかった。
【０１４８】
また、図１４下段に示すように、ｈＢＤ−３のｍＲＮＡ相対発現量について、ＢおよびＣは、Ａと比較してほとんど変わらなかったが、ＣおよびＥは、Ａと比較して有意に大きかった。
【０１４９】
これらの結果から、タモギタケ水抽出物は、ＨａＣａＴ細胞に２時間作用させた場合は、２４時間作用させた場合と同様に、ｈＢＤ−１およびｈＢＤ−３の産生を促進することが明らかになった。また、タモギタケ水抽出物がｈＢＤ−１およびｈＢＤ−３の産生を促進する程度は、２時間作用させた場合と比較して、２４時間作用させた場合の方が大きいことが明らかになった。
【０１５０】
（５）タモギタケ酸性溶媒抽出物
実施例２（４）［４−１］〜［４−３］に記載の方法により、実験を行った。ただし、タモギタケ酸性溶媒抽出物を添加した培地での培養時間は２４時間に代えて２時間とした。また、算出したＢ、Ｃ、ＤおよびＥにおける結果について、Ａにおける結果との間でマンホイットニーのＵ検定を行った。その結果を図１５に示す。図中の＊は、Ｕ検定の結果、統計的に有意であることを示す（ｐ＜０．０５）。
【０１５１】
図１５上段に示すように、ｈＢＤ−１のｍＲＮＡ相対発現量について、ＢおよびＣは、Ａと比較してほとんど変わらなかったが、ＤおよびＥは、Ａと比較して有意に大きかった。
【０１５２】
また、図１５中段に示すように、ｈＢＤ−２のｍＲＮＡ相対発現量について、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥのいずれも、Ａと比較してほとんど変わらなかった。
【０１５３】
また、図１５下段に示すように、ｈＢＤ−３のｍＲＮＡ相対発現量について、ＣおよびＥは、Ａと比較してほとんど変わらなかったが、ＢおよびＤは、Ａと比較して有意に大きかった。
【０１５４】
これらの結果から、タモギタケ酸性溶媒抽出物は、ＨａＣａＴ細胞に２時間作用させた場合は、２４時間作用させた場合と同様に、ｈＢＤ−１およびｈＢＤ−３の産生を促進することが明らかになった。また、タモギタケ酸性溶媒抽出物がｈＢＤ−１の産生を促進する程度は、２時間作用させた場合と２４時間作用させた場合とで同程度であり、ｈＢＤ−３の産生を促進する程度は、２時間作用させた場合と比較して、２４時間作用させた場合の方が大きいことが明らかになった。
【０１５５】
（６）タモギタケ塩基性溶媒抽出物
実施例２（５）［５−１］〜［５−３］に記載の方法により、実験を行った。ただし、タモギタケ塩基性溶媒抽出物を添加した培地での培養時間は２４時間に代えて２時間とした。また、算出したＢ、Ｃ、ＤおよびＥにおける結果について、Ａにおける結果との間でマンホイットニーのＵ検定を行った。その結果を図１６に示す。図中の＊は、Ｕ検定の結果、統計的に有意であることを示す（ｐ＜０．０５）。
【０１５６】
図１６上段に示すように、ｈＢＤ−１のｍＲＮＡ相対発現量について、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥは、Ａと比較して有意に大きかった。
【０１５７】
また、図１６中段に示すように、ｈＢＤ−２のｍＲＮＡ相対発現量について、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥのいずれも、Ａと比較してほとんど変わらなかった。
【０１５８】
また、図１６下段に示すように、ｈＢＤ−３のｍＲＮＡ相対発現量について、ＢおよびＤは、Ａと比較してほとんど変わらなかったが、ＣおよびＥは、Ａと比較して有意に大きかった。
【０１５９】
これらの結果から、タモギタケ塩基性溶媒抽出物は、ＨａＣａＴ細胞に２時間作用させた場合は、２４時間作用させた場合と同様に、ｈＢＤ−１およびｈＢＤ−３の産生を促進することが明らかになった。また、タモギタケ塩基性溶媒抽出物がｈＢＤ−１およびｈＢＤ−３の産生を促進する程度は、２時間作用させた場合と２４時間作用させた場合とでは、ほとんど変わらないことが明らかになった。
【０１６０】
（７）タモギタケ由来エルゴチオネイン
実施例２（６）［６−１］〜［６−４］に記載の方法により、実験を行った。ただし、タモギタケ由来エルゴチオネインを添加した培地での培養時間は２４時間に代えて２時間とした。また、算出したＢおよびＣにおける結果について、Ａにおける結果との間でマンホイットニーのＵ検定を行った。その結果を図１７に示す。図中の＊は、Ｕ検定の結果、統計的に有意であることを示す（ｐ＜０．０５）。
【０１６１】
図１７上段、中段および下段に示すように、ｈＢＤ−１、ｈＢＤ−２およびｈＢＤ−３のｍＲＮＡ相対発現量のいずれについても、ＢおよびＣは、Ａと比較して有意に大きかった。
【０１６２】
これらの結果から、タモギタケ由来エルゴチオネインは、ＨａＣａＴ細胞に２時間作用させた場合は、２４時間作用させた場合と同様にｈＢＤ−１およびｈＢＤ−３の産生を促進するのみならず、２４時間作用させた場合には促進しなかったｈＢＤ−２の産生も促進することが明らかになった。また、タモギタケ由来エルゴチオネインがｈＢＤ−１およびｈＢＤ−３の産生を促進する程度は、２時間作用させた場合と比較して、２４時間作用させた場合の方がやや大きいことが明らかになった。
【０１６３】
＜実施例５＞βグルカンまたはマイコプラズマ由来ジアシルリポペプチド（ＦＳＬ−１）と共にタモギタケ熱水抽出物を添加した場合のヒトβ−ディフェンシン産生促進効果の検討
（１）サンプルの調製および培養
実施例２（１）［１−１］に記載の方法により、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨの計８サンプルを調製した。ただし、ＨａＣａＴ細胞に代えてＮＨＥＫ細胞（三光純薬社）を用い、培養時間は３日間に代えて２日間とした。
【０１６４】
（２）βグルカン、ＦＳＬ−１およびタモギタケ熱水抽出物を添加した培地での培養
スエヒロタケ由来βグルカン（ソニフィラン；科研製薬社）、大麦由来βグルカン（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社）、Ｔｏｌｌ Ｌｉｋｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴＬＲ）−２およびＴＬＲ−６のアゴニストであるマイコプラズマ由来ジアシルリポペプチド（ＦＳＬ−１；ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社）および実施例１（１）で調製したタモギタケ熱水抽出物を、ＤＤＷを用いて希釈またはＤＤＷに溶解し、下記のｂ、ｃ、ｄ、ｅおよびｇの水溶液を調製した。また、タモギタケ熱水抽出物にスエヒロタケ由来βグルカンまたはＦＳＬ−１を溶解することにより、下記のｆおよびｈのタモギタケ熱水抽出物溶液を調製した。
【０１６５】
水溶液およびタモギタケ熱水抽出物溶液の濃度
ｂ：スエヒロタケ由来βグルカン １００μｇ／ｍＬ
ｃ：大麦由来βグルカン １００μｇ／ｍＬ
ｄ：ＦＳＬ−１ １００ｎｇ／ｍＬ
ｅ：タモギタケ熱水抽出物 ５０％（ｖ／ｖ）
ｆ：タモギタケ熱水抽出物 １００％（ｖ／ｖ）＋スエヒロタケ由来βグルカン ２００μｇ／ｍＬ
ｇ：ＦＳＬ−１ ２００μｇ／ｍＬ＋スエヒロタケ由来βグルカン ２００μｇ／ｍＬ
ｈ：タモギタケ熱水抽出物 １００％（ｖ／ｖ）＋ＦＳＬ−１ ２００μｇ／ｍＬ
【０１６６】
次に、ＤＤＷ、調製した各水溶液および各タモギタケ熱水抽出物溶液をそれぞれ５％（ｖ／ｖ）となるようＦ−Ｐ−ＤＭＥＭ培地に添加して、スエヒロタケ由来βグルカン（ソニフィラン；科研製薬社）、大麦由来βグルカン（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社）、ＦＳＬ−１（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）およびタモギタケ熱水抽出物を下記の終濃度で含む交換培地とコントロール用交換培地とを調製した。本実施例（１）の培地を、調製した交換培地に下記のとおり交換した後、実施例２（１）［１−１］に記載の環境下にて、さらに２時間培養した。
【０１６７】
交換培地に添加したものおよびその終濃度
Ａ：ＤＤＷ （コントロール用交換培地）
Ｂ：スエヒロタケ由来βグルカン 終濃度１０μｇ／ｍＬ
Ｃ：大麦由来βグルカン 終濃度１０μｇ／ｍＬ
Ｄ：ＦＳＬ−１ 終濃度１０ｎｇ／ｍＬ
Ｅ：タモギタケ熱水抽出物 終濃度 ５％（ｖ／ｖ）
Ｆ：タモギタケ熱水抽出物 終濃度５％（ｖ／ｖ）＋スエヒロタケ由来βグルカン 終濃度１０μｇ／ｍＬ
Ｇ：ＦＳＬ−１ 終濃度１０ｎｇ／ｍＬ＋スエヒロタケ由来βグルカン 終濃度１０μｇ／ｍＬ
Ｈ：タモギタケ熱水抽出物 終濃度５％（ｖ／ｖ）＋ＦＳＬ−１ 終濃度１０ｎｇ／ｍＬ
【０１６８】
（３）ＲＮＡの抽出およびｃＤＮＡの作製、ならびに定量ＰＣＲ法によるｈＢＤ−２ｍＲＮＡおよびｈＢＤ−３ｍＲＮＡの定量
本実施例（２）の各サンプルについて、実施例２（１）［１−３］に記載の方法によりＲＮＡの抽出およびｃＤＮＡの作製を行った後、実施例２（１）［１−４］に記載の方法により定量ＰＣＲ法を行い、ｈＢＤ−２ｍＲＮＡおよびｈＢＤ−３ｍＲＮＡの定量を行った。また、算出したＢ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨにおける結果について、Ａにおける結果との間でマンホイットニーのＵ検定を行った。その結果を図１８に示す。図中の＊は、Ｕ検定の結果、統計的に有意であることを示す（ｐ＜０．０５）。
【０１６９】
図１８上段に示すように、ｈＢＤ−２のｍＲＮＡ相対発現量について、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＨのいずれも、Ａと比較してやや大きく、ＦおよびＧは、Ａと比較して顕著に大きかった。
【０１７０】
また、図１８下段に示すように、ｈＢＤ−３のｍＲＮＡ相対発現量についても、ｈＢＤ−２と同様、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅのいずれも、Ａと比較してやや大きく、ＦおよびＧは、Ａと比較して顕著に大きかった。
【０１７１】
これらの結果から、タモギタケ熱水抽出物は、βグルカンと共に作用させることにより、ｈＢＤ−２およびｈＢＤ−３の産生を促進する効果が向上することが明らかになった。
【０１７２】
＜実施例６＞口腔カンジダ症モデルマウスにおける抗菌効果の確認
（１）タモギタケ熱水抽出物を含有する口腔用ジェルの調製 実施例１（１）で調製したタモギタケ熱水抽出物と白色ワセリン（ヤクハン製薬社）とを歯科用ダッペングラスに入れ、プラスチックのセメントスパチュラを用いて攪拌・混合することにより、タモギタケ熱水抽出物を６０％（ｗ／ｗ）含有する口腔用ジェルを調製した。
【０１７３】
（２）口腔カンジダ症モデルマウスの作製
既報（Ｔａｋａｋｕｒａら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第４７巻、第５号、第３２１−３２６頁、２００３年）に従い、口腔カンジダ症モデルマウスを作製した。具体的には、６週齢のＣ３Ｈ／ＨｅＪＪｃｌ雄マウス（日本クレア社）１５匹に、マウス体重１ｋｇ当たり１００ｍｇの量のプレドニゾロンを皮下注射した。続いて、滅菌した水道水に塩酸クロルテトラサイクリンを０．８３ｍｇ／ｍＬとなるよう添加したものを飲料水として自由摂取させながら２４時間飼育した後、マウス１個体あたり、２ｍｇ／ｍＬのクロルプロマジン塩酸塩水溶液５０ｍＬを大腿部に筋肉注射した。３０分経過後、１×１０８ｃｆｕ／ｍＬのカンジダ菌（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ ＡＴＣＣ９００２８株）懸濁液を滅菌綿棒に付着させ、これを用いてマウスの舌と口腔内へカンジダ菌の播種を行った。
【０１７４】
（３）タモギタケ熱水抽出物を含有する口腔用ジェルの投与
本実施例（２）のマウス１５匹を７匹と８匹とに分け、７匹からなる群をコントロール群、８匹からなる群をジェル投与群として、各群のマウスを３日間飼育した。この間、ジェル投与群にのみ、本実施例（１）の口腔用ジェルを１匹当たり０．０５ｇ、口腔内に塗布することを１日３回行った。
【０１７５】
（４）カンジダ菌数の測定
本実施例（３）の各群のマウスから舌を摘出し、舌の重量１００ｍｇあたり１ｍＬの生理食塩水を添加してホモジナイズし、懸濁液とした。この懸濁液１００μＬについて、ＣＨＩＲＯＭａｇａｒ選択培地（ＣＨＩＲＯＭａｇａｒ社）を用いて定法に従い平板法を行うことにより、カンジダ菌生菌数を測定し、群ごとに生菌数の平均値と標準偏差を求めた。また、算出したジェル投与群における結果について、コントロール群における結果との間でマンホイットニーのＵ検定を行った。その結果を図１９に示す。図中の＊は、検定の結果、統計的に有意であることを示す（ｐ＜０．０５）。
【０１７６】
図１９に示すように、ジェル投与群におけるカンジダ菌の生菌数は、コントロール群におけるカンジダ菌の生菌数と比較して顕著に少なく、コントロール群におけるカンジダ菌の生菌数を１００％とすると、ジェル投与群におけるカンジダ菌の生菌数は７７．５％であった。すなわち、タモギタケ熱水抽出物を含有する口腔用ジェルは、口腔カンジダ症モデルマウスの口腔内におけるカンジダ菌の増殖を抑制することが確認された。
【０１７７】
この結果から、タモギタケ熱水抽出物を含有する口腔用ジェルは、口腔カンジダ症の予防または治療に有効であることが明らかになった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タモギタケの水系溶媒抽出物、タモギタケから抽出されるグルコシルセラミド、タモギタケから抽出されるエルゴチオネインおよびタモギタケから抽出されるエルゴステロールパーオキサイドからなる群から選択される１または２以上の物質を有効成分とする抗菌剤。
【請求項２】
水系溶媒抽出物が熱水抽出物である、請求項１に記載の抗菌剤。
【請求項３】
タモギタケの水系溶媒抽出物、タモギタケから抽出されるグルコシルセラミド、タモギタケから抽出されるエルゴチオネインおよびタモギタケから抽出されるエルゴステロールパーオキサイドからなる群から選択される１または２以上の物質を有効成分とするβディフェンシン産生促進剤。
【請求項４】
βディフェンシンがヒトβディフェンシン−１、ヒトβディフェンシン−２およびヒトβディフェンシン−３からなる群から選択される１または２以上のβディフェンシンである、請求項３に記載のβディフェンシン産生促進剤。
【請求項５】
水系溶媒抽出物が熱水抽出物である、請求項３または請求項４に記載のβディフェンシン産生促進剤。
【請求項６】
タモギタケの水系溶媒抽出物、タモギタケから抽出されるグルコシルセラミド、タモギタケから抽出されるエルゴチオネインおよびタモギタケから抽出されるエルゴステロールパーオキサイドからなる群から選択される１または２以上の物質を有効成分とするカンジダ症予防および／または治療剤。
【請求項７】
口腔乾燥症の患者に用いる、請求項６に記載のカンジダ症予防および／または治療剤。
【請求項８】
水系溶媒抽出物が熱水抽出物である、請求項６または請求項７に記載のカンジダ症予防および／または治療剤。
【請求項１】
タモギタケの水系溶媒抽出物、タモギタケから抽出されるグルコシルセラミド、タモギタケから抽出されるエルゴチオネインおよびタモギタケから抽出されるエルゴステロールパーオキサイドからなる群から選択される１または２以上の物質を有効成分とする抗菌剤。
【請求項２】
水系溶媒抽出物が熱水抽出物である、請求項１に記載の抗菌剤。
【請求項３】
タモギタケの水系溶媒抽出物、タモギタケから抽出されるグルコシルセラミド、タモギタケから抽出されるエルゴチオネインおよびタモギタケから抽出されるエルゴステロールパーオキサイドからなる群から選択される１または２以上の物質を有効成分とするβディフェンシン産生促進剤。
【請求項４】
βディフェンシンがヒトβディフェンシン−１、ヒトβディフェンシン−２およびヒトβディフェンシン−３からなる群から選択される１または２以上のβディフェンシンである、請求項３に記載のβディフェンシン産生促進剤。
【請求項５】
水系溶媒抽出物が熱水抽出物である、請求項３または請求項４に記載のβディフェンシン産生促進剤。
【請求項６】
タモギタケの水系溶媒抽出物、タモギタケから抽出されるグルコシルセラミド、タモギタケから抽出されるエルゴチオネインおよびタモギタケから抽出されるエルゴステロールパーオキサイドからなる群から選択される１または２以上の物質を有効成分とするカンジダ症予防および／または治療剤。
【請求項７】
口腔乾燥症の患者に用いる、請求項６に記載のカンジダ症予防および／または治療剤。
【請求項８】
水系溶媒抽出物が熱水抽出物である、請求項６または請求項７に記載のカンジダ症予防および／または治療剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【公開番号】特開２０１２−５６９１４（Ｐ２０１２−５６９１４Ａ）
【公開日】平成２４年３月２２日（２０１２．３．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２０３８０３（Ｐ２０１０−２０３８０３）
【出願日】平成２２年９月１１日（２０１０．９．１１）
【特許番号】特許第４８３１７１１号（Ｐ４８３１７１１）
【特許公報発行日】平成２３年１２月７日（２０１１．１２．７）
【出願人】（５００４５１６３２）株式会社スリービー (4)
【出願人】（５０５１１６７８１）学校法人東日本学園・北海道医療大学 (13)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年３月２２日（２０１２．３．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年９月１１日（２０１０．９．１１）
【特許番号】特許第４８３１７１１号（Ｐ４８３１７１１）
【特許公報発行日】平成２３年１２月７日（２０１１．１２．７）
【出願人】（５００４５１６３２）株式会社スリービー (4)
【出願人】（５０５１１６７８１）学校法人東日本学園・北海道医療大学 (13)
【Ｆターム（参考）】
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