タンパク質のグリコシル化の制御、ならびにそれに関する組成物および方法

【課題】タンパク質のグリコシル化を制御するための新規な方法、およびそれによって産生させたタンパク質の提供。
【解決手段】グリコシル化阻害剤の存在下で宿主細胞を培養することによって、グリコシル化部位を含むタンパク質を産生させるステップを含み、生成したタンパク質はグリコシル化部位において、より少ないグリカンまたはより少ない糖を含む、タンパク質の製造方法。タンパク質の生物学的特徴がグリコシル化レベルの減少によって変化し、例えばタンパク質とその標的リガンドとの結合が改変される。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質のグリコシル化レベルを減少させるための方法であって、グリコシル化阻害量のグリコシル化阻害剤の存在下、培地中で増殖させる宿主細胞中で、少なくとも１つのグリコシル化部位を含むタンパク質を発現させるステップを含み、前記阻害剤が存在しない点以外は同一の条件下で増殖させた、それ以外は同一の宿主細胞中で産生させた、それ以外は同一のタンパク質と比較して、前記タンパク質は、より低いレベルのグリコシル化を含み、それによって、前記タンパク質のグリコシル化レベルを制御する方法。
【請求項２】
前記グリコシル化部位が、リガンド結合部位中または抗原結合部位中にある、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記グリコシル化レベルが、前記グリコシル化部位におけるグリカン部位の占有および前記グリコシル化部位におけるグリコシル化の程度からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記グリコシル化部位が、Ｏ−連結性グリコシル化部位およびＮ−連結性グリコシル化部位からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記グリコシル化部位が、Ｎ−連結性グリコシル化部位であり、さらに、前記グリコシル化部位は、アスパラギン−Ｘ−セリンまたはアスパラギン−Ｘ−スレオニン（式中、Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸である）のアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記グリコシル化阻害剤は、ツニカマイシン、ツニカマイシン相同体、ストレプトビルジン、マイコスポシジン、アンフォマイシン、ツシマイシン、抗生物質２４０１０、抗生物質ＭＭ１９２９０、バシトラシン、コリネトキシン、ショードマイシン、ジュイマイシン、１−デオキシマンノノジリマイシン、デオキシノジリマイシン、Ｎ−メチル−１−デオキシマンノノジリマイシン、ブレフェルジンＡ、グルコース類似体、マンノース類似体、２−デオキシ−Ｄ−グルコース、２−デオキシグルコース、Ｄ−（＋）−マンノース、Ｄ−（＋）ガラクトース、２−デオキシ−２−フルオロ−Ｄ−グルコース、１，４−ジデオキシ−１，４−イミノ−Ｄ−マンニトール（ＤＩＭ）、フルオログルコース、フルオロマンノース、ＵＤＰ−２−デオキシグルコース、ＧＤＰ−２−デオキシグルコース、ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤、２５−ヒドロキシコレステロール、ヒドロキシコレステロール、スウェインソニン、シクロヘキシミド、ピューロマイシン、アクチノマイシンＤ、モネンシン、ｍ−クロロカルボニル−シアニドフェニルヒドラゾン（ＣＣＣＰ）、コンパクチン、ドリチル−ホスホリル−２−デオキシグルコース、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、ヒポキサンチン、チミジン、コレステロール、グルコサミン、マンノサミン、カスタノスペルミン、グルタミン、ブロモコンズリトール、コンズリトールエポキシド、コンズリトール誘導体、グリコシルメチル−ｐ−ニトロフェニルトリアゼン、β−ヒドロキシノルバリン、スレオ−β−フルオロアスパラギン、Ｄ−（＋）−グルコン酸δ−ラクトン、リン酸ジ（２−エチルヘキシル）、リン酸トリブチル、リン酸ドデシル、（ジフェニルメチル）−リン酸の２−ジメチルアミノエチルエステル、ヨウ化［２−（ジフェニルホスフィニルオキシ）エチル］トリメチルアンモニウム、ヨード酢酸、およびフルオロアセテートからなる群から選択される少なくとも１つの阻害剤である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記グリコシル化阻害剤が、２−デオキシ−Ｄ−グルコースである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記グリコシル化阻害量が、約０．５ｇ／Ｌ〜３ｇ／Ｌの範囲である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記培地中のグルコース濃度を約０．０５ｇ／Ｌ〜１０ｇ／Ｌの範囲の量に維持するステップをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
宿主細胞が、酵母細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記哺乳動物の宿主細胞が、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＮＳ０／１、Ｓｐ２／０、ヒト細胞、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、ＣＯＳ、ＨｅｐＧ２、ＰＥＲ．Ｃ６、ＣＯＳ−７、ＴＭ４、ＣＶ１、ＶＥＲＯ−７６、ＭＤＣＫ、ＢＲＬ３Ａ、Ｗ１３８、ＭＭＴ０６０５６２、ＴＲ１、ＭＲＣ５、およびＦＳ４からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記宿主細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記グリコシル化部位が、アスパラギン−イソロイシン−スレオニン（ＮＩＴ）、アスパラギン−グリシン−セリン（ＮＧＳ）、アスパラギン−セリン−スレオニン（ＮＳＴ）、およびアスパラギン−スレオニン−セリン（ＮＴＳ）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのグリコシル化部位である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１０に記載の方法に従って産生させたタンパク質。
【請求項１５】
請求項１３に記載の方法に従って産生させたタンパク質。
【請求項１６】
抗体またはその抗原結合部分であり、さらに、前記抗体は抗ヒトＩｇＥ抗体である、請求項１５に記載のタンパク質。
【請求項１７】
前記抗体が、配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含むヒト抗体である、請求項１６に記載のタンパク質。
【請求項１８】
前記抗体が、占有されておらず、かつ／または前記グリコシル化阻害剤の非存在下で産生させた点以外は同一の前記抗体よりも少なくとも１つ少ない炭水化物部分を含む、少なくとも１つのＮ−連結性グリコシル化部位を含み、前記部位は、配列番号８のアミノ酸配列に関する重鎖のアスパラギン７３（Ｎ７３）におけるグリコシル化部位およびアスパラギン３０１（Ｎ３０１）におけるグリコシル化部位からなる群から選択される、請求項１７に記載のタンパク質。
【請求項１９】
前記抗体が、占有されていない、アスパラギン７３におけるＮ−連結性グリコシル化部位を含む、請求項１８に記載のタンパク質。
【請求項２０】
前記タンパク質が、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ）のリガンド結合部位（ＬＢＳ）を含む、請求項１５に記載のタンパク質。
【請求項２１】
アミノ酸残基１からアミノ酸残基番号２３までを含むシグナル配列を有さない配列番号１のアミノ酸配列を含むＲＡＧＥ融合タンパク質であり、前記融合タンパク質は、末端のリシン残基（Ｌｙｓ４３８）を欠く、請求項２０に記載のタンパク質。
【請求項２２】
前記ＲＡＧＥ融合タンパク質が、占有されておらず、かつ／または前記グリコシル化阻害剤の非存在下で産生させた点以外は同一のＲＡＧＥ融合タンパク質よりも少なくとも１つ少ない炭水化物部分を含む、少なくとも１つのＮ−連結性グリコシル化部位を含み、前記部位は、いずれもシグナル配列（アミノ酸１から２３まで）を有しない配列番号１のアミノ酸配列に関する、アミノ酸残基番号２におけるアスパラギン（Ｎ２）、アミノ酸残基番号５８におけるアスパラギン（Ｎ５８）、およびアミノ酸残基番号２８８におけるアスパラギン（Ｎ２８８）からなる群から選択される少なくとも１つの部位である、請求項２１に記載のタンパク質。
【請求項２３】
占有されておらず、かつ／または少なくとも１つ少ない炭水化物部分を含む、少なくとも２つのＮ−連結性グリコシル化部位を含む、請求項２２に記載のタンパク質。
【請求項２４】
３つのＮ−連結性グリコシル化部位を含み、それらのうちの少なくとも１つが、占有されておらず、かつ／または少なくとも１つ少ない炭水化物部分を含む、請求項２２に記載のタンパク質。
【請求項２５】
前記阻害剤の非存在下で産生させた点以外は同一の前記タンパク質と比較して、抗原との結合の増加を示す、請求項１８に記載のタンパク質。
【請求項２６】
前記阻害剤の非存在下で産生させた点以外は同一の前記タンパク質と比較して、ＲＡＧＥリガンドとの結合の増加を示す、請求項２２に記載のタンパク質。
【請求項２７】
約３４℃〜３９℃の範囲の温度から、約２８℃〜３３℃の範囲の温度への温度シフトをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項２８】
約３４℃〜３７℃の範囲の温度から、約３０．５℃〜３１．５℃の範囲の温度への温度シフトを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
請求項１４に記載のタンパク質および薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物。
【請求項３０】
請求項１５に記載のタンパク質および薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物。
【請求項３１】
ある量の融合タンパク質を含む組成物であって、前記融合タンパク質は、免疫グロブリンポリペプチドに連結しているＲＡＧＥポリペプチドを含み、
ａ）前記ＲＡＧＥポリペプチドは、ヒトＲＡＧＥ（配列番号３）の断片を含み、ヒトＲＡＧＥの前記断片は、リガンド結合部位、およびグリコシル化され得る少なくとも１つのアミノ酸残基を含み、
ｂ）前記免疫グロブリンポリペプチドは、免疫グロブリンのＣ_Ｈ２ドメインまたはＣ_Ｈ２ドメインの一部、および免疫グロブリンのＣ_Ｈ３ドメインを含み、
ｃ）前記免疫グロブリンポリペプチドのＮ末端残基が、前記ＲＡＧＥポリペプチドのＣ末端残基に連結しており、
前記融合タンパク質の前記量の少なくとも０．５％がアグリコシル化されている組成物。
【請求項３２】
前記融合タンパク質の総量の少なくとも３０％がアグリコシル化されている、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
完全グリコシル化形態の前記融合タンパク質の量のパーセントが、非完全グリコシル化形態全ての前記融合タンパク質の量のパーセントよりも少ない、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３４】
前記融合タンパク質が、グリコシル化され得る少なくとも３つのアミノ酸残基を含み、グリコシル化の第１の潜在的な部位が前記ＲＡＧＥのリガンド結合部位のアミノ酸残基であり、グリコシル化の第２の潜在的な部位が前記ＲＡＧＥポリペプチドのアミノ酸残基であり、グリコシル化の第３の潜在的な部位が前記免疫グロブリンポリペプチドのアミノ酸残基である、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３５】
少なくとも１つの潜在的なグリコシル化部位を含むタンパク質を含む組成物であって、完全グリコシル化タンパク質の量が、完全にはグリコシル化されていないタンパク質の量よりも少なく、薬学的に許容できる担体をさらに含む組成物。
【請求項３６】
前記タンパク質が、２つの潜在的なグリコシル化部位を含み、完全グリコシル化タンパク質の量が、グリコシル化されていない１つの部位および／またはより低いレベルのグリコシル化を含む１つの部位を含むタンパク質の量と、グリコシル化されていない２つの部位および／またはより低いレベルのグリコシル化を含む２つの部位を含むタンパク質の量とを組み合わせた量よりも少ない、請求項３５に記載の組成物。

【図１】