タンパク質のリフォールディング剤及びタンパク質の製造方法
【課題】 凝集しやすいタンパク質をリフォールディングするリフォールディング剤およびタンパク質の製造方法を提供する。
【解決手段】
一般式（１）で示される基を有するリン含有化合物（Ａ）と非イオン性界面活性剤（Ｂ）を必須成分とするリフォールディング剤（Ｉ）、またはカルボキシル基、カルボキシレートアニオン基及びエステル基からなる群から選ばれる１種以上の基を有するオキシカルボニル基含有化合物（Ｃ）と非イオン性界面活性剤（Ｂ）を必須成分とするリフォールディング剤（ＩＩ）を使用する。
【化１】
【解決手段】
一般式（１）で示される基を有するリン含有化合物（Ａ）と非イオン性界面活性剤（Ｂ）を必須成分とするリフォールディング剤（Ｉ）、またはカルボキシル基、カルボキシレートアニオン基及びエステル基からなる群から選ばれる１種以上の基を有するオキシカルボニル基含有化合物（Ｃ）と非イオン性界面活性剤（Ｂ）を必須成分とするリフォールディング剤（ＩＩ）を使用する。
【化１】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質のリフォールディング剤及び製造方法に関し、詳しくはアンフォールディングされたタンパク質を活性のあるタンパク質構造へと巻き戻すために使用されるリフォールディング剤及びタンパク質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の機能・構造の解明・解析は、例えば、病気の治療や創薬に直結し、極めて重要である。このため、種々のタンパク質を様々な方法で合成・生産し、それらの構造を調べ、生体内における作用機構と役割を解明することが活発に行われている。そして、今や、タンパク質の機能は、それらを構成するアミノ酸の配列・鎖長のみならず、それらの取る秩序だった立体構造（高次構造）によって決まることは周知のこととなっている。
【０００３】
工業的にも、遺伝子工学の発展により、さまざまなタンパク質を組換え体として大量に調製し、医薬品製造や食品加工、臨床診断等の多岐にわたる産業に利用されてきた。ベクター技術の開発によって大腸菌や酵母の菌体内で、標的とするタンパク質を大量に産生させる技術が、少ない資源で簡単に再現性良く実行できるようになってきた。
しかし、組換え体で発現させたタンパク質の多くは立体構造に秩序が無く、高次構造が制御されておらず、不活性な封入体（インクルージョンボディ）と呼ばれる小粒子顆粒を形成することが多い。このため、大腸菌による生産プロセスでは、インクルージョンボディを解きほぐし（アンフォールディング）、高次構造を整え、秩序だった立体構造を持つ可溶性タンパク質に変換する操作、すなわち、インクルージョンボディをアンフォールディングし、さらにリフォールディング（巻き戻し）することが必要である。
【０００４】
この種のリフォールディングは、大腸菌や酵母による生産タンパク質のみならず、熱履歴等の、ある種の原因で失活したタンパク質の再生にも応用でき、極めて重要な技術である。したがって、従来から、このリフォールディングは透析法や希釈法を中心に盛んに研究され、種々の方法が提案されているが、それらのほとんどは、リフォールディング率が低いうえに、ある限定されたタンパク質（特に、分子量の低い特定タンパク質）に対して偶発的に好ましい結果が得られたに過ぎないことが多く、現在、このリフォールディングは、種々のタンパク質に適用可能な、一般性、普遍性のある、しかも、リフォールディング率の高い効率的で経済的な方法とはなっていない。
【０００５】
発明者は、特定のリン酸塩もしくはカルボン酸塩をリフォールディング剤として使用することで、高い生産性を得ることができるリフォールディング方法を既に見いだした（特許文献１、２）。
【０００６】
しかしながら、この方法では、リパーゼなどの構造が比較的単純なタンパク質は巻き戻るものの、リゾチームなどの分子内にＳ−Ｓ結合を含むタンパク質に対して使用すると、リフォールディング中にＳ−Ｓ結合が正しく再結合されずに誤った３次元構造となり、タンパク質が凝集することが頻繁に起こる。その結果、活性を持つタンパク質の収量が極端に減少する場合がある。
【特許文献１】特開２００７−１２６３９１号公報
【特許文献２】特開２００７−１４５８０１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、分子内にＳ−Ｓ結合を含むタンパク質に対して使用しても、タンパク質の凝集が起こりにくいリフォールディング剤及びタンパク質の製造方法を提供し、活性を持つタンパク質の収量を向上させることが課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は以上の問題点を解決するため鋭意検討した結果、本発明に到達した。
すなわち、本発明は、アンフォールディングされたタンパク質のリフォールディング剤であって、一般式（１）で示される基を有するリン含有化合物（Ａ）と非イオン性界面活性剤（Ｂ）を必須成分とするリフォールディング剤（Ｉ）；アンフォールディングされたタンパク質のリフォールディング剤であって、カルボキシル基、カルボキシレートアニオン基及びエステル基からなる群から選ばれる１種以上の基を有するオキシカルボニル基含有化合物（Ｃ）と非イオン性界面活性剤（Ｂ）を必須成分とするリフォールディング剤（ＩＩ）；タンパク質を前記リフォールディング剤（Ｉ）又は（ＩＩ）でリフォールディングする工程を含むタンパク質の製造方法である。
【０００９】
【化１】
【発明の効果】
【００１０】
本発明のリフォールディング剤を使用すると、従来よりもリフォールディング時のタンパク質の凝集を抑制することができ、活性のあるタンパク質を多く得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明のリフォールディング剤は、アンフォールディングされたタンパク質のリフォールディング剤であり、大別して、リン含有化合物（Ａ）と非イオン性界面活性剤（Ｂ）を必須成分とするリフォールディング剤（Ｉ）と、オキシカルボニル基含有化合物（Ｃ）と非イオン性界面活性剤（Ｂ）を必須成分とするリフォールディング剤（ＩＩ）の２種である。すなわち、下記一般式（１）で示される基を有する化合物（Ａ）からなるリン含有化合物（Ａ）と非イオン性界面活性剤（Ｂ）を必須成分とするリフォールディング剤（Ｉ）と、カルボキシル基、カルボキシレートアニオン基及びエステル基からなる群から選ばれる１種以上の基を有する化合物（Ｃ）と非イオン性界面活性剤（Ｂ）を必須成分とするリフォールディング剤（ＩＩ）である。
【００１２】
本願の第１の発明のリフォールディング剤（Ｉ）は、リン含有化合物（Ａ）と非イオン性界面活性剤（Ｂ）を必須成分とし、このリン含有化合物（Ａ）は、下記一般式（１）で示される基を有する化合物である。
【００１３】
【化２】
【００１４】
一般式（１）におけるＰはリン原子を表し、リン含有化合物（Ａ）としては、無機リン酸及びその塩（Ａ１）；アルキルリン酸エステル及びその塩（Ａ２）；並びに糖リン酸エステル及びその塩（Ａ３）などが挙げられる。
リン含有化合物（Ａ）は、１種であってもよく、２種以上を併用してもよい。
【００１５】
無機リン酸及びその塩（Ａ１）としては、リン酸、次亜リン酸、亜リン酸、次リン酸、ピロリン酸、ピロ亜リン酸、メタリン酸、トリポリリン酸、ポリリン酸、およびこれらの塩が挙げられる。
塩としてはアルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩など）、アルカリ土類金属塩（カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩など）、アンモニウム塩、アミン塩（１級アミン塩、２級アミン塩、３級アミン塩）、および４級アンモニウム塩（テトラアルキルアンモニウム塩など）が挙げられる。
【００１６】
塩としては、（Ａ１）が含有する酸基が複数の場合は、酸基の全てが塩になっていてもよく、酸基の一部が塩になっていてもよい。
【００１７】
（Ａ１）のうちの塩の具体例としては、リン酸１水素２ナトリウム塩、リン酸２水素１ナトリウム塩、リン酸１水素２カリウム塩、リン酸２水素１カリウム塩、リン酸アンモニウム塩、リン酸テトラメチルアンモニウム塩、リン酸テトラエチルアンモニウム塩、リン酸トリエチルアミン塩及びリン酸トリエタノールアミン塩などのリン酸塩；亜リン酸ナトリウム、亜リン酸カリウム、亜リン酸アンモニウム塩、亜リン酸テトラメチルアンモニウム塩、亜リン酸テトラエチルアンモニウム塩、亜リン酸トリエチルアミン塩及び亜リン酸トリエタノールアミン塩などの亜リン酸塩；ピロリン酸ナトリウム塩、ピロリン酸カリウム塩、ピロリン酸テトラメチルアンモニウム塩、ピロリン酸テトラエチルアンモニウム塩、ピロリン酸トリエチルアミン塩及びピロリン酸トリエタノールアミン塩などのピロリン酸塩などが挙げられる。
【００１８】
アルキルリン酸エステル及びその塩（Ａ２）としては、炭素数１〜１２のアルキル基を有するアルキルリン酸エステル（Ａ２１）、アルキルピロリン酸エステル（Ａ２２）若しくはアルキルトリポリリン酸エステル（Ａ２３）などが挙げられる。
炭素数１〜１２のアルキル基を有するアルキルリン酸エステル（Ａ２１）としては、モノアルキルリン酸エステル、ジアルキルリン酸エステル、トリアルキルリン酸エステルが含まれる。モノアルキルリン酸エステルとしては、メチルリン酸エステル、エチルリン酸エステル、プロピルリン酸エステル、２−プロピルリン酸エステル、ブチルリン酸エステル、２−ブチルリン酸エステル、ｔ−ブチルリン酸エステル、ペンチルリン酸エステル、ヘキシルリン酸エステル、シクロヘキシルリン酸エステル、オクチルリン酸エステル、ノニルリン酸エステル、デシルリン酸エステルなどが挙げられる。ジアルキルリン酸エステルとしては上記アルキルリン酸エステルのジエステルが挙げられ、トリアルキルリン酸エステルとしては上記アルキルリン酸エステルのトリエステルが挙げられる。
【００１９】
炭素数１〜１２のアルキル基を有するアルキルピロリン酸エステル（Ａ２２）としては、モノアルキルピロリン酸エステル、ジアルキルピロリン酸エステル、トリアルキルピロリン酸エステルが含まれる。モノアルキルピロリン酸エステルとしては、メチルピロリン酸エステル、エチルピロリン酸エステル、プロピルピロリン酸エステル、２−プロピルピロリン酸エステル、ブチルピロリン酸エステル、２−ブチルピロリン酸エステル、ｔ−ブチルピロリン酸エステル、ペンチルピロリン酸エステル、ヘキシルピロリン酸エステル、シクロヘキシルピロリン酸エステル、オクチルピロリン酸エステル、ノニルピロリン酸エステル、デシルピロリン酸エステルなどが挙げられる。ジアルキルピロリン酸エステルとしては上記アルキルピロリン酸エステルのジエステルが挙げられ、トリアルキルピロリン酸エステルとしては上記アルキルピロリン酸エステルのトリエステルが挙げられる。
【００２０】
炭素数１〜１２のアルキル基を有するアルキルトリポリリン酸エステル（Ａ２３）としては、モノアルキルトリポリリン酸エステル、ジアルキルトリポリリン酸エステル、トリアルキルトリポリリン酸エステルが含まれる。モノアルキルトリポリリン酸エステルとしては、メチルトリポリリン酸エステル、エチルトリポリリン酸エステル、プロピルトリポリリン酸エステル、２−プロピルトリポリリン酸エステル、ブチルトリポリリン酸エステル、２−ブチルトリポリリン酸エステル、ｔ−ブチルトリポリリン酸エステル、ペンチルトリポリリン酸エステル、ヘキシルトリポリリン酸エステル、シクロヘキシルトリポリリン酸エステル、オクチルトリポリリン酸エステル、ノニルトリポリリン酸エステル、デシルトリポリリン酸エステルなどが挙げられる。ジアルキルトリポリリン酸エステルとしては上記アルキルトリポリリン酸エステルのジエステルが挙げられ、トリアルキルトリポリリン酸エステルとしては上記アルキルトリポリリン酸エステルのトリエステルが挙げられる。
【００２１】
上記（Ａ２１）〜（Ａ２３）の塩としては、前述の（Ａ１）で挙げた塩と同様のアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、アミン塩及び４級アンモニウム塩が挙げられる。
塩としては、（Ａ２１）〜（Ａ２３）が含有する酸基が複数の場合は、酸基の全てが塩になっていてもよく、酸基の一部が塩になっていてもよい。
【００２２】
糖リン酸エステル及びその塩（Ａ３）としては、アデノシン３リン酸（ＡＴＰ）、アデノシン２リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン１リン酸（ＡＭＰ）及び環状アデノシンモノリン酸（ｃ−ＡＭＰ）並びにそれらのナトリウム塩、カリウム塩、トリエチルアミン塩、トリエタノールアミン塩などが挙げられる。
【００２３】
リン含有化合物（Ａ）のうち、タンパク質の凝集低減及び／又は活性タンパク質の収量
向上の観点から、（Ａ１）及び（Ａ３）が好ましく、さらに好ましいのは、リン酸、ピロリン酸、ポリリン酸、アデノシン３リン酸、アデノシン２リン酸、アデノシン１リン酸及びそれらの塩である。
【００２４】
リフォールディング工程において、系中の（Ａ）の濃度は、タンパク質の凝集低減及び／又は活性タンパク質の収量向上の観点から、０．１〜６モル／Ｌが好ましく、さらに好ましくは０．２〜６モル／Ｌで使用される。
【００２５】
ここで系とは、水、タンパク質、変性剤及びリフォールディング剤が混合された状態を指し、系中の濃度とは、水、タンパク質、変性剤及びリフォールディング剤の混合溶液の容量に対するリフォールディング剤の濃度を指し、以下の記載において同様である。
なお、変性剤とは、ミスフォールディング状態のタンパク質の３次元構造を解きほぐすための薬剤のことを指し、タンパク質の水素結合及びジスルフィド結合を切断する物質が用いられる。具体的には６モル／Ｌ塩酸グアニジン水溶液や８モル／Ｌ尿素水溶液が挙げられる。ジスルフィド結合を完全に切断するためにメルカプトエタノールやジチオスレイトール等を添加して使用しても良い。
【００２６】
本発明のリフォールディング剤（Ｉ）におけるもう１つの必須成分である非イオン性界面活性剤（Ｂ）としては、高級アルコールのアルキレンオキサイド（以下、ＡＯと略記する。）付加物（Ｂ１）、炭素数６〜２４のアルキル基を有するアルキルフェノールのＡＯ付加物（Ｂ２）、ポリプロピレングリコールエチレンオキサイド（以下、ＥＯと略記する。）付加物（Ｂ３）、ポリエチレングリコールプロピレンオキサイド（以下、ＰＯと略記する。）付加物（Ｂ４）、脂肪酸ＡＯ付加物（Ｂ５）、および多価アルコール型非イオン性界面活性剤（Ｂ６）などが含まれる。
【００２７】
ここでＡＯとは、アルキレンオキサイドを指し、具体的にエチレンオキサイド（ＥＯ）、プロピレンオキサイド（ＰＯ）及びブチレンオキサイド等が挙げられる。
【００２８】
高級アルコールのＡＯ付加物（Ｂ１）としては、炭素数８〜２４の高級アルコール（デシルアルコール、ドデシルアルコール、ヤシ油アルキルアルコール、オクタデシルアルコール及びオレイルアルコールなど）のＥＯ１〜２０モル付加物などや、同じく炭素数８〜２４の高級アルコールのＰＯ１〜４０モル付加物などが挙げられる。タンパク質の凝集及び／又はタンパク質の収量向上の観点で、炭素数８〜２４の高級アルコールのＥＯ１〜２０モル付加物が好ましく、さらに好ましくはオレイルアルコールのＥＯ１８モルである。
【００２９】
アルキルフェノールのＡＯ付加物（Ｂ２）としては、炭素数７〜３６のアルキルフェノール（ノニルフェノール及びセチルフェノールなど）のＥＯ１〜４０モル付加物などや、同じく炭素数７〜３６のアルキルフェノールのＰＯ１〜４０モル付加物などが挙げられる。タンパク質の凝集及び／又はタンパク質の収量向上の観点で、炭素数７〜３６のアルキルフェノールのＥＯ１〜４０モル付加物が好ましく、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ３００などが容易に入手できる。
【００３０】
ポリプロピレングリコールＥＯ付加物（Ｂ３）としては、プルロニック型界面活性剤が挙げられ、プロピレンオキシドの繰り返し単位が１０〜１００個のポリプロピレングリコールのＥＯ２〜４０モル付加物が挙げられる。タンパク質の凝集防止及び／又はタンパク質の収率向上の観点で、プロピレンオキシドの繰り返し単位が２０〜５０個のポリプロピレングリコールＥＯ１０モル付加物、プロピレンオキシドの繰り返し単位が２０〜５０個のポリプロピレングリコールＥＯ２５モル付加物が好ましい。
【００３１】
ポリエチレングリコールＰＯ付加物（Ｂ４）としては、エチレンオキシドの繰り返し単位が１０〜１００個のポリエチレングリコールのＰＯ２〜２０モル付加物が挙げられ、タンパク質の凝集防止及び／又はタンパク質の収率向上の観点で、エチレンオキシドの繰り返し単位が１０〜５０個のポリエチレングリコールＰＯ１０モル付加物が好ましい。
【００３２】
脂肪酸ＡＯ付加物（Ｂ５）としては、炭素数８〜２４の高級脂肪酸（ラウリル酸、ステアリン酸、オレイン酸など）のＥＯ１〜２５モル付加物などが挙げられる。タンパク質の凝集防止及び／又はタンパク質の収率向上の観点で、ラウリル酸ＥＯ１０モル付加物、ステアリン酸ＥＯ２０モル付加物及びオレイン酸ＥＯ２０モル付加物が好ましい。
なお（Ｂ５）は、オキシカルボニル基含有化合物（Ｃ）と併用する際には（Ｃ）として取り扱い、それ以外の場合には（Ｂ５）として取り扱うものとする。
【００３３】
多価アルコール型非イオン性界面活性剤（Ｂ６）としては、分子内に水酸基を２個以上含むアルコールのＥＯ付加物等が挙げられる。タンパク質の凝集防止及び／又はタンパク質の収率向上の観点で、ソルビタンアルキルエステルＥＯ６〜４０モル付加物やグリセリンアルキルエステルＥＯ２〜４０モル付加物が好ましく、さらに好ましくはソルビタンアルキルエステルＥＯ６〜４０モル付加物であり、ＴＷＥＥＮ２０、ＴＷＥＥＮ４０、ＴＷＥＥＮ６０、ＴＷＥＥＮ８０などが容易に入手できる。
【００３４】
これらの中で、タンパク質の凝集防止の観点で、高級アルコールのＡＯ付加物（Ｂ１）、および多価アルコールのＡＯ付加物（Ｂ６）が好ましく、さらに好ましくは（Ｂ１）である。
好ましい具体例としては、炭素数８〜２４の高級アルコール（オレイルアルコール、デシルアルコール、ドデシルアルコール、ヤシ油アルキルアルコール、オクタデシルアルコールなど）のＥＯ１〜２０モル付加物；ソルビタンアルキルエステルＥＯ付加物などが挙げられる。
【００３５】
リフォールディング剤（Ｉ）を使用するリフォールディング工程において、タンパク質の凝集防止の観点から、系中の非イオン性界面活性剤（Ｂ）の濃度は、０．００１〜１０重量％が好ましく、さらに好ましくは０．０１〜１重量％である。
【００３６】
リフォールディング工程において系中の（Ｂ）の濃度（重量％）に対する（Ａ）の濃度（重量％）の比率は、タンパク質の凝集防止の観点から、０．０５〜５０，０００（重量％／重量％）が好ましく、さらに好ましくは１〜５，０００（重量％／重量％）である。
【００３７】
本願の第２の発明のリフォールディング剤（ＩＩ）は、オキシカルボニル基含有化合物（Ｃ）と非イオン性界面活性剤（Ｂ）を必須成分とし、このオキシカルボニル基含有化合物（Ｃ）はカルボキシル基、カルボキシレートアニオン基及びエステル基からなる群から選ばれる１種以上の基を有する化合物である。
このオキシカルボニル基含有化合物（Ｃ）は、いずれも分子内にオキシカルボニル基（−ＣＯＯ−）を有する。
【００３８】
オキシカルボニル基含有化合物（Ｃ）としては、分子内に少なくとも１個のカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）もしくは少なくとも１個のカルボキシレートアニオン基（−ＣＯＯ-）を有する化合物（Ｃ１）、並びに、分子内に少なくとも１個のエステル基（−ＣＯＯＲ）を有する化合物（Ｃ２）が挙げられる。なお、これらのオキシカルボニル基と水酸基を同時に有する乳酸等のオキシカルボン酸も、本発明のオキシカルボニル基含有化合物（Ｃ）に含まれる。
【００３９】
分子内に少なくとも１個のカルボキシル基もしくはカルボキシレートアニオン基を有する化合物（Ｃ１）としては、ポリオキシアルキレン基を分子内に有しない通常のカルボン酸（Ｃ１１）、ポリオキシアルキレン基含有カルボン酸（Ｃ１２）；およびそれらの塩が挙げられる。
【００４０】
カルボン酸（Ｃ１１）としては、炭素数１〜３６（カルボニル基の炭素原子も含む。以下同様）の脂肪族カルボン酸（Ｃ１１１）及び炭素数７〜３６の芳香族カルボン酸（Ｃ１１２）等が挙げられる。
【００４１】
脂肪族カルボン酸（Ｃ１１１）としては、炭素数１〜３６の脂肪族飽和モノカルボン酸（蟻酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、吉草酸、カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、ベラルゴン酸、ラウリル酸、ミリスチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、２−エチルヘキサン酸など）；炭素数３〜３６の脂肪族不飽和モノカルボン酸（アクリル酸、メタクリル酸、オレイン酸など）；炭素数３〜３６の脂肪族ヒドロキシモノカルボン酸（グリコール酸、乳酸、酒石酸、グルコン酸など）；炭素数２〜３６の脂肪族飽和ジカルボン酸（シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸など）及びそれらのモノアルキルエステル；炭素数４〜３６の脂肪族不飽和ジカルボン酸（マレイン酸、フマール酸、イタコン酸など）；並びに、３価以上（好ましくは３〜１２価）の脂肪族多価カルボン酸（クエン酸、ブタンテトラカルボン酸、シクロペンタンテトラカルボン酸、エチレンジアミン四酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸など）；などが挙げられる。
【００４２】
芳香族カルボン酸（Ｃ１１２）としては、炭素数７〜３６の芳香族モノカルボン酸（安息香酸、桂皮酸、ヒドロキシ安息香酸など）；炭素数８〜３６の芳香族ジカルボン酸（フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸など）；炭素数９〜３６の芳香族トリカルボン酸及びテトラカルボン酸（トリメリット酸、ピロメリット酸など）；芳香族ヒドロキシカルボン酸（サリチル酸等）等が挙げられる。
【００４３】
カルボン酸（Ｃ１１）としては、さらに、上記のジカルボン酸又は３価以上の多価カルボン酸の部分アルキル（アルキル基としては炭素数１〜１２のもの）エステル（シュウ酸モノメチル、コハク酸モノメチル、マレイン酸モノメチル、シュウ酸モノエチル、クエン酸モノメチル、クエン酸ジメチルなど）が挙げられる。
【００４４】
ポリオキシアルキレン基含有カルボン酸（Ｃ１２）としては、一般式（２）で示されるエーテルカルボン酸化合物が挙げられる。
【００４５】
Ｒ1−Ｏ−（Ｒ2Ｏ）ｐ−Ｒ3ＣＯＯＨ （２）
（式中、Ｒ1は炭素数１〜３６の炭化水素基、Ｒ2は炭素数２〜４のアルキレン基、Ｒ3は炭素数１〜３のアルキレン基、ｐは１〜５０の整数を表す。）
【００４６】
Ｒ1は炭素数１〜３６の炭化水素基であって、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、２−プロピル基、ｎ−ブチル基、２−ブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、シクロヘキシル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ドデシル基などが挙げられる。
なお、Ｒ1の水素の一部が水酸基で置換されていてもよい。
Ｒ2は、炭素数２〜４のアルキレン基であって、エチレン基、１，２−プロピレン基、１，３−プロピレン基、１，２−ブチレン基、１，４−ブチレン基などが挙げられる。
Ｒ3は、炭素数１〜３のアルキレン基であって、メチレン基、エチレン基、１，３−プロピレン基、１，２−プロピレン基が挙げられる。ｐは１〜５０の整数であって、タンパク質の収率向上の観点から、１〜２０が好ましく、さらに好ましくは１〜１０、特に好ましくは１〜４である。
【００４７】
エーテルカルボン酸の具体例としては、ポリオキシエチレンヘキシルエーテル酢酸、ポリオキシエチレンオクチルエーテル酢酸、ポリオキシエチレンノニルエーテル酢酸、ポリオキシエチレンデシルエーテル酢酸、ポリオキシエチレンドデシルエーテル酢酸、ポリオキシプロピレンヘキシルエーテル酢酸、ポリオキシプロピレンオクチルエーテル酢酸、ポリオキシプロピレンノニルエーテル酢酸、ポリオキシプロピレンデシルエーテル酢酸、ポリオキシプロピレンドデシルエーテル酢酸などが挙げられる。
なお、エーテルカルボン酸は、高級アルコールにアルキレンオキサイドを付加した後、モノクロルカルボン酸を反応させて製造することができる。
【００４８】
分子内に少なくとも１個のカルボキシレートアニオン基を有する化合物（Ｃ１）としては、カルボン酸（Ｃ１１）又はポリオキシアルキレン基含有カルボン酸（Ｃ１２）の塩も含まれる。
塩としては、（Ａ１）で挙げた塩と同様のアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、アミン塩、および４級アンモニウム塩が挙げられる。
【００４９】
カルボン酸（Ｃ１１）の塩の具体例としては、上記の炭素数１〜３６の脂肪族飽和モノカルボン酸塩（ギ酸ナトリウム、ギ酸アンモニウム、ギ酸グアニジウム、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、酢酸グアニジウム、プロピオン酸ナトリウム、プロピオン酸アンモニウム、プロピオン酸グアニジウム、酪酸ナトリウム、カプロン酸ナトリウムなど）；炭素数３〜３６の脂肪族不飽和モノカルボン酸（アクリル酸ナトリウムなど）；炭素数３〜３６の脂肪族ヒドロキシモノカルボン酸塩（グリコール酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、乳酸アンモニウム、乳酸グアニジウム、酒石酸ナトリウム、酒石酸カリウム、酒石酸アンモニウム、酒石酸グアニジウム、グルコン酸ナトリウムなど）；炭素数２〜３６の脂肪族飽和ジカルボン酸塩（シュウ酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム、グルタル酸ナトリウムなど）；炭素数４〜３６の脂肪族不飽和ジカルボン酸塩（マレイン酸ナトリウムなど）；上記のジカルボン酸又は３価以上の多価カルボン酸の部分アルキルエステルの塩（シュウ酸モノメチルナトリウム、コハク酸モノメチルナトリウム、マレイン酸モノメチルカリウム、シュウ酸モノエチルナトリウム、クエン酸モノメチルナトリウム、クエン酸ジメチルナトリウムなど）が挙げられる。
【００５０】
ポリオキシアルキレン基含有カルボン酸（Ｃ１２）の塩の具体例としては、ポリオキシエチレンヘキシルエーテル酢酸ナトリウム、ポリオキシエチレンオクチルエーテル酢酸ナトリウム、ポリオキシエチレンノニルエーテル酢酸ナトリウム、ポリオキシエチレンデシルエーテル酢酸ナトリウム、ポリオキシエチレンドデシルエーテル酢酸ナトリウム、ポリオキシプロピレンヘキシルエーテル酢酸ナトリウム、ポリオキシプロピレンオクチルエーテル酢酸ナトリウム、ポリオキシプロピレンノニルエーテル酢酸ナトリウム、ポリオキシプロピレンデシルエーテル酢酸ナトリウム、ポリオキシプロピレンドデシルエーテル酢酸ナトリウムなどが挙げられる。
【００５１】
本発明のオキシカルボニル基含有化合物（Ｃ）のうちのもう１つの、分子内に少なくとも１個のエステル基を有する化合物（Ｃ２）としては、カルボン酸アルキルエステル（Ｃ２１）、カルボン酸のアルキレンオキサイド付加物（Ｃ２２）などが含まれる。
【００５２】
カルボン酸アルキルエステル（Ｃ２１）を構成するカルボン酸としては、前述の分子内に少なくとも１個のカルボキシル基もしくはカルボキシレートアニオン基を有する化合物（Ｃ１）として例示したのと同様のカルボン酸が挙げられる。
また、アルキルエステル基を構成するアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、２−プロピル基、ｎ−ブチル基、２−ブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、シクロヘキシル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ドデシル基などの炭素数１〜１２の直鎖もしくは分岐の脂肪族アルキル基が挙げられる。
【００５３】
カルボン酸アルキルエステル（Ｃ２１）の具体例としては、モノカルボン酸アルキルエステル（蟻酸メチル、酢酸メチル、蟻酸エチル、酢酸エチル、酢酸ｎ−ブチル、ステアリン酸メチル及びステアリン酸ｎ−ブチルなど）；ジカルボン酸ジアルキルエステル（シュウ酸ジメチル、コハク酸ジメチル、マレイン酸ジメチル、シュウ酸ジエチル、コハク酸ジエチル及びアジピン酸ジメチルなど）；３価以上の脂肪族多価カルボン酸の全てのカルボキシル基がエステル化されているもの（クエン酸トリメチル及びエチレンジアミン四酢酸テトラメチルなど）などが挙げられる。
【００５４】
カルボン酸のアルキレンオキサイド付加物（Ｃ２２）としては、前述の（Ｃ１）で挙げたカルボン酸の炭素数２〜４のアルキレンオキサイド１〜５０モル付加物などが挙げられる。
アルキレンオキサイドとしては、エチレンオキサイド、プロピレンオキサイド及びブチレンオキサイドが挙げられる。
【００５５】
カルボン酸のアルキレンオキサイド付加物の具体例としては、モノカルボン酸のＥＯ付加物（ギ酸ＥＯ１〜１０モル付加物、酢酸ＥＯ１〜１０モル付加物、プロピオン酸ＥＯ１０モル付加物、酪酸ＥＯ１〜１０モル付加物、カプロン酸ＥＯ２〜２０モル付加物、ラウリル酸ＥＯ１〜２０モル付加物など）；オキシカルボン酸のＥＯ付加物（グリコール酸ＥＯ１〜２０モル付加物、乳酸ＥＯ１〜２０モル付加物、酒石酸ＰＯ１〜５モル付加物など）；脂肪族多価カルボン酸のＥＯ付加物（シュウ酸ＥＯ１〜２０モル付加物、マロン酸ＥＯ１〜２０モル付加物、コハク酸ＥＯ１〜２０モル付加物、グルタル酸ＥＯ１〜２０モル付加物、クエン酸ＥＯ１〜２０モル付加物、マレイン酸ＥＯ１〜２０モル付加物など）；芳香族多価カルボン酸のＥＯ付加物（フタル酸ＥＯ１〜３０モル付加物、テレフタル酸ＥＯ１〜３０モル付加物など）；が挙げられる。
【００５６】
これら化合物（Ｃ）のうち、タンパク質の凝集防止及び／又はタンパク質の収率向上の観点から、（Ｃ１）及びこの塩が好ましく、さらに好ましくは脂肪族カルボン酸（Ｃ１１）及びこの塩、特に好ましくは炭素数１〜８の脂肪族カルボン酸（例えばギ酸、酢酸、プロピオン酸、乳酸、酒石酸）及びこの塩である。
【００５７】
リフォールディング工程において、系中の（Ｃ）の濃度は、タンパク質の凝集防止及び／又はタンパク質の収率向上の観点から、０．００１〜６モル／Ｌが好ましく、さらに好ましくは０．０１〜６モル／Ｌで使用される。
【００５８】
本発明のリフォールディング剤（ＩＩ）における必須成分の非イオン性界面活性剤（Ｂ）は、前述のリフォールディング剤（Ｉ）で示した非イオン性界面活性剤（Ｂ）と同様のものが使用でき、好ましいものも同様である。
【００５９】
リフォールディング剤（ＩＩ）を使用するリフォールディング工程において、系中の（Ｂ）の濃度は、タンパク質の凝集防止の観点から、０．００１〜１０重量％が好ましく、さらに好ましくは０．０１〜１重量％である。
【００６０】
リフォールディング工程において系中の（Ｂ）の濃度に対する（Ｃ）の濃度の割合は、タンパク質の凝集防止の観点から、０．０１〜６０，０００（重量％／重量％）が好ましく、さらに好ましくは１〜６，０００（重量％／重量％）である。
【００６１】
本発明のリフォールディング剤（Ｉ）又は（ＩＩ）には、必要に応じて水、塩、緩衝剤及びグルタチオン等を含有させることもできる。
水を含有する場合、その含有量は特に限定されないが、化合物（Ａ）及び（Ｂ）の合計重量、または（Ｃ）及び（Ｂ）の合計重量に対し、操作性の観点から、１００〜１０，０００重量％が好ましく、さらに好ましくは２００〜５，０００重量％である。
塩としては、塩化ナトリウム、塩化アンモニウム、塩化カリウム等が挙げられ、その含有量は、化合物（Ａ）及び（Ｂ）の合計重量、または（Ｃ）及び（Ｂ）の合計重量に対し、タンパク質の収率向上の観点で１〜１０重量％が好ましく、さらに好ましくは１〜３重量％である。
緩衝剤としては、トリスバッファー、ＨＥＰＥＳバッファー等が挙げられ、その含有量は、化合物（Ａ）及び（Ｂ）の合計重量、または（Ｃ）及び（Ｂ）の合計重量に対し、タンパク質の収率向上の観点で１〜３０重量％が好ましく、さらに好ましくは１〜１０重量％である。
グルタチオンを含有する場合、その含有量は、化合物（Ａ）及び（Ｂ）の合計重量、または（Ｃ）及び（Ｂ）の合計重量に対し、タンパク質の収率向上の観点で０．００１〜０．５重量％が好ましく、さらに好ましくは０．０１〜０．１重量％である。
【００６２】
対象とするタンパク質は、分子内にＳ−Ｓ結合を含むタンパク質（例えばリゾチームなど）である場合が本発明の効果が顕著であるので好ましく、その場合リフォールディングされるものは塩酸グアニジンまたは尿素と共に、さらに２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、シスチン、チオフェノール等の還元剤を加えてアンフォールディングされたタンパク質である。
【００６３】
本発明におけるタンパク質は分子内にジスルフィド結合を含むタンパク質（Ｐ１）と分子内にジスルフィド結合を含まないタンパク質（Ｐ２）に分類できる。
分子内にジスルフィド結合を含むタンパク質（Ｐ１）として、リゾチーム、βラクトグロブリン、アルカリ性フォスファターゼ、リボヌクレアーゼ、トリプシン、キモトリプシン、インターフェロン、インスリン、ナトリウム利尿ペプチド及び抗体等が挙げられる。
分子内にジスルフィド結合を含まないタンパク質（Ｐ２）として、リパーゼ、ホスホリパーゼ及び２〜１０個のアミノ酸で構成されたペプチド等が挙げられる。
これらのうち、本発明の対象となるタンパク質としては、本発明の効果が顕著である点から、分子内にＳ−Ｓ結合を含むタンパク質（Ｐ１）が好ましい。分子内のＳ−Ｓ結合の個数はタンパク質の凝集に大きく関与し、一般的に個数が大きいほど凝集しやすい。本発明の対象となるタンパク質分子内のＳ−Ｓ結合の数は１個〜１０個が好ましく、さらに好ましくは２個〜４個である。具体的にはリゾチーム（４個）、βラクトグロブリン（２〜３個）、トリプシン（２個）等が挙げられる。
【００６４】
本発明におけるタンパク質の分子量は１，０００〜３００，０００であり、リフォールディングのしやすさの観点から好ましくは１０，０００〜２５０，０００である。ここで分子量とはＳＤＳゲル電気泳動法によって推定された分子量を指す。
一般に分子量の大きさとリフォールディングのしにくさには相関があり、分子量の大きなタンパク（分子量１０，０００以上程度）になるとリフォールディングが著しく困難になるとされている。本発明のリフォールディング方法はリフォールディング効果が優れるので、分子量１０，０００以上の高分子量タンパク質に対しても非常に有効な方法となる。
【００６５】
本発明における「リフォールディング工程」とは、タンパク質とリフォールディング剤とを撹拌・混合する工程であり、その後、リフォールディングをより充分に進めるために必要により一定時間静置することも含まれる。タンパク質とリフォールディング剤を撹拌・混合する際には、ほとんど不均一部分が無くなるまで撹拌混合することが好ましい。静置時間は特に限定されないが、例えば１〜５０時間である。また処理工程時の温度は、特に限定されないが、例えば４〜３０℃である。
【００６６】
本発明のリフォールディング剤を使用してリフォールディングする工程は、リフォールディング剤で処理する工程において、さらにｐＨ調整剤（Ｄ）、タンパク質安定化剤（Ｅ）を使用してもよい。
ｐＨ調整剤（Ｄ）としては、Ｔｒｉｓ（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノエタンスルホン酸）、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸）などが挙げられる。
【００６７】
なお、従来のリン酸緩衝剤（例えば、リン酸１水素２ナトリウム＋塩酸水溶液、またはリン酸２水素１ナトリウム＋水酸化ナトリウム水溶液）を使用する場合は、リン酸緩衝剤がリン酸塩であるため本発明における（Ａ）と重複する。しかし、従来のｐＨ調整が目的で使用するリン酸緩衝剤の添加濃度の上限は高くても０．０５モル／Ｌであり、本発明のリフォールディング剤としてのリン系化合物（Ａ）と従来のｐＨ調整が目的のリン酸緩衝剤とは使用する際の濃度が明確に異なる。従来のリン酸緩衝剤は、本発明においては、リン含有化合物（Ａ）として取り扱う。
【００６８】
一般的にリフォールディング操作はｐＨ７〜８で行われ、ｐＨ調整剤（Ｄ）の使用量は、この範囲に調整するためであれば、特に限定されないが、（Ａ）又は（Ｃ）の重量に対し、タンパク質の凝集防止の観点から、２０重量％以下が好ましく、さらに好ましくは０．００１〜２０重量％、次にさらに好ましくは０．０１〜２０重量％である。
【００６９】
タンパク質安定化剤（Ｅ）としては酸化還元剤、ポリオール、金属イオン、キレート試薬などが挙げられる。
酸化還元剤としては２−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール、アスコルビン酸、酸化型グルタチオン、還元型グルタチオン、システイン及びシスチンなどが挙げられる。
ポリオールとしてはグリセリン、ブドウ糖、ショ糖、エチレングリコール、ソルビトール及びマンニトールなどが挙げられる。
金属イオンとしてはマグネシウムイオン、マンガンイオン及びカルシウムイオンなどの２価金属イオンが挙げらる。
キレート試薬としてはエチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）及びグリコールエーテルジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−４酢酸（ＥＧＴＡ）などが挙げられる。
【００７０】
タンパク質安定化剤（Ｅ）の使用量は、（Ａ）又は（Ｃ）の重量に対し、タンパク質の凝集防止及び／又はタンパク質の収率向上の観点から、１０重量％以下が好ましく、さらに好ましくは０．００１〜１０重量％、次にさらに好ましくは０．０１〜５重量％である。
【００７１】
本発明のリフォールディング方法において、タンパク質の系中の濃度は、０．２〜３０ｍｇ／ｍＬが好ましく、さらに好ましくは０．２〜２０ｍｇ／ｍＬ、特に好ましくは０．２５〜５ｍｇ／ｍＬである。０．２ｍｇ／ｍＬ以上であればタンパク質の生産効率の観点から好ましく、３０ｍｇ／ｍＬ以下であれば系内の粘度が高くなりすぎることが少ないため生産効率が低下しないので好ましい。
また、（Ａ）又は（Ｃ）の、タンパク質の重量に対する使用量（重量）は、タンパク質の凝集防止及び／又はタンパク質の収率向上の観点から、タンパク質１部に対して５〜２，０００部が好ましく、さらに好ましくは１０〜１，０００部である。
【００７２】
本発明のタンパク質の製造方法は、上記のリフォールディング剤でリフォールディングする工程を含むタンパク質の製造方法である。
本発明のタンパク質の製造方法で得られるタンパク質は、上記のリフォールディング剤を使用して得られるため、リフォールディング工程中の凝集が少なく、収率が著しく向上する。
本発明のタンパク質の産生方法としては、例えば、以下のような順序の工程による産生方法が挙げられる。
（１）タンパク質の培養工程：大腸菌などのタンパク質生産体に酵素又は組み換えタンパク質を培養させる。
（２）溶菌工程：溶菌剤などの使用によってタンパク質生産体内のインクルージョンボディを取り出す。
（３）アンフォールディング工程：インクルージョンボディ懸濁液（例えば１０ｍｇタンパク質／ｍＬ）に０．５モル／Ｌ以上のアンフォールディング剤及び２０ミリモル／Ｌ以下の還元剤を加え軽くかきまぜ室温で数時間放置する。
（４）リフォールディング工程：アンフォールディングされたタンパク質溶液に、（Ｉ）又は（ＩＩ）を加えて軽くかき混ぜ、室温で１晩放置しリフォールディングを行う。
（５）分離・取り出し工程：懸濁液から目的とするリフォールディングされたタンパク質をカラムクロマトグラフィーなどによって分離して取り出す。
【００７３】
上記の（１）のタンパク質の培養工程におけるタンパク質生産体としては、以下の細菌細胞、エシェリヒア属菌およびバチルス属菌などが挙げられる。
細菌細胞としては、連鎖球菌属（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）、ブドウ球菌属（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）、エシェリヒア属菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ストレプトミセス属菌（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）及びバチルス属菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞、真菌細胞：例えば酵母細胞及びアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞、昆虫細胞：例えばドロソフィラＳ２（ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａＳ２）、スポドプテラＳｆ９（ＳｐｏｄｏｐｔｅｒａＳｆ９）細胞、動物細胞：例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、Ｈｅｌａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、２９３及びボウズ（Ｂｏｗｓ）メラノーマ細胞、並びに植物細胞等が挙げられる。
エシェリヒア属菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２ＤＨ１〔プロシージング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）６０巻、１６０頁（１９６８年）を参照〕、ＪＭ１０３〔ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）９巻、３０９頁（１９８１年）を参照〕、ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）１２０巻、５１７頁（１９７８年）を参照〕、ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）４１巻、４５９頁（１９６９年）を参照〕、Ｃ６００〔ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）３９巻、４４０頁（１９５４年）を参照〕、ＭＭ２９４〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２１７巻、１１１０頁（１９６８年）を参照〕などが挙げられる。
バチルス属菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）としては、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４〔ジーン、２４巻、２５５頁（１９８３年）を参照〕、２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）９５巻、８７頁（１９８４年）を参照〕などが挙げられる。
【００７４】
組み換えタンパク質の培養方法として、目的タンパク質をコードするｃＤＮＡを含有する発現ベクターは、
（ｉ）目的タンパク産生細胞からメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分離し、該ｍＲＮＡから単鎖のｃＤＮＡを、次に二重鎖ＤＮＡを合成し、該相補ＤＮＡをファージまたはプラスミドに組み込む。
（ｉｉ）得られた組み換えファージ又はプラスミドで宿主を形質転換し、培養後、目的タンパクの一部をコードするＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション、あるいは抗体を用いたイムノアッセイ法により目的とするＤＮＡを含有するファージあるいはプラスミドを単離する。
（ｉｉｉ）その組み換えＤＮＡから目的とするクローン化ＤＮＡを切りだし、該クローン化ＤＮＡ又はその一部を発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することによって製造することができる。
その後、適当な方法により、宿主を発現ベクターで形質転換し培養する。培養は通常１５〜４３℃で３〜２４時間行い、必要により通気、攪拌を加えることもできる。
【００７５】
溶菌工程における溶菌方法としては、超音波による物理的破砕、リゾチーム等の溶菌酵素による処理、界面活性剤等の溶菌剤による処理などのいずれもが使用でき、生産性の観点から溶菌剤による処理が好ましく、有用タンパクを変性させないといった観点から特に特開２００６−３２０３１３号公報記載の溶菌剤による処理が好ましい。
【００７６】
タンパク質の分離・取り出し工程におけるカラムクロマトグラフィーに使用される充填剤としてはシリカ、デキストラン、アガロース、セルロース、アクリルアミド、ビニルポリマーなどが挙げられ、市販品ではＳｅｐｈａｄｅｘシリーズ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌシリーズ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅシリーズ（以上、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、Ｂｉｏ−Ｇｅｌシリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）等があり入手可能である。
【実施例】
【００７７】
以下の実施例により本発明をさらに説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００７８】
製造例１ （アンフォールディング溶液の調製）
タンパク質を一旦アンフォールディングさせるアンフォールディング溶液は、６モル／Ｌの塩酸グアニジン、１０ミリモル／Ｌのジチオスレイトール、１５０ミリモル／Ｌの塩化ナトリウム、５０ミリモル／Ｌのトリス緩衝液（ｐＨ＝８）、１ミリモル／Ｌのエチレンジアミン４酢酸ナトリウムとなるようにそれぞれ加え、滅菌水で溶解し調製した。
【００７９】
実施例１ （リフォールディング剤の調製１）
２０ｍＬ容の滅菌済みバイアル瓶に、１．０モル／Ｌ酢酸ナトリウム、０．１０重量％オレイルアルコールエチレンオキサイド１８モル付加物（「エマルミン１８０」：三洋化成工業製）、５０ミリモル／Ｌのトリス緩衝液（ｐＨ＝８）、３００マイクロモル／Ｌの酸化型グルタチオン、１５０ミリモル／Ｌの還元型グルタチオン（ともに和光純薬製）となるようにそれぞれ加え、滅菌水で溶解しリフォールディング剤（Ｒ−１）を調製した。
【００８０】
実施例２ （リフォールディング剤の調製２）
実施例１において、０．１０重量％オレイルアルコールエチレンオキサイド１８モル付加物の代わりに、０．１０重量％ソルビタンモノオレエートＥＯ付加物（「ＴＷＥＥＮ８０」：和光純薬製）を使用する以外は実施例１と同様に行い、リフォールディング剤（Ｒ−２）を調製した。
【００８１】
実施例３ （リフォールディング剤の調製３）
実施例１において、１．０モル／Ｌ酢酸ナトリウムの代わりに、１．０モル／Ｌリン酸水素２ナトリウム（和光純薬製）を使用する以外は実施例１と同様に行い、リフォールディング剤（Ｒ−３）を調製した。
【００８２】
実施例４ （リフォールディング剤の調製４）
実施例１において、１．０モル／Ｌ酢酸ナトリウムの代わりに、８．０モル／Ｌ酢酸ナトリウムを使用する以外は実施例１と同様に行い、リフォールディング剤（Ｒ−４）を調製した。
【００８３】
実施例５ （リフォールディング剤の調製５）
実施例１において、１．０モル／Ｌ酢酸ナトリウムの代わりに、０．０１３モル／Ｌ酢酸ナトリウムを使用する以外は実施例１と同様に行い、リフォールディング剤（Ｒ−５）を調製した。
【００８４】
実施例６ （リフォールディング剤の調製６）
実施例３において、１．０モル／Ｌリン酸水素２ナトリウムの代わりに、８．０モル／Ｌリン酸水素２ナトリウムを使用する以外は実施例３と同様に行い、リフォールディング剤（Ｒ−６）を調製した。
【００８５】
実施例７ （リフォールディング剤の調製７）
実施例３において、１．０モル／Ｌリン酸水素２ナトリウムの代わりに、０．２７モル／Ｌリン酸水素２ナトリウムを使用する以外は実施例３と同様に行い、リフォールディング剤（Ｒ−７）を調製した。
【００８６】
実施例８ （リフォールディング剤の調製８）
実施例１において、１．０モル／Ｌ酢酸ナトリウムの代わりに１．０モル／Ｌギ酸ナトリウム、０．１０重量％オレイルアルコールエチレンオキサイド１８モル付加物の代わりに０．１０重量％ソルビタンモノラウレートＥＯ付加物（「ＴＷＥＥＮ２０」：和光純薬製）を使用する以外は実施例１と同様に行い、リフォールディング剤（Ｒ−８）を調製した。
【００８７】
実施例９ （リフォールディング剤の調製９）
実施例３において、１．０モル／Ｌリン酸水素２ナトリウムの代わりに１．０モル／Ｌアデノシン１リン酸ナトリウム塩（「ＡＭＰ」：和光純薬製）、０．１０重量％オレイルアルコールエチレンオキサイド１８モル付加物の代わりに０．１０重量％ラウリルアルコールＥＯ１１モル付加物（「エマルミンＮＬ−１１０」：三洋化成工業製）を使用する以外は実施例３と同様に行い、リフォールディング剤（Ｒ−９）を調製した。
【００８８】
実施例１０ （リフォールディング剤の調製１０）
実施例１において、０．１０重量％オレイルアルコールエチレンオキサイド１８モル付加物の代わりに１．３３重量％オレイルアルコールエチレンオキサイド１８モル付加物を使用する以外は実施例１と同様に行い、リフォールディング剤（Ｒ−１０）を調製した。
【００８９】
実施例１１ （リフォールディング剤の調製１１）
実施例１において、０．１０重量％オレイルアルコールエチレンオキサイド１８モル付加物の代わりに０．０１３重量％オレイルアルコールエチレンオキサイド１８モル付加物を使用する以外は実施例１と同様に行い、リフォールディング剤（Ｒ−１１）を調製した。
【００９０】
実施例１２ （リフォールディング剤の調製１２）
実施例３において、０．１０重量％ソルビタンモノオレエートＥＯ付加物の代わりに１．３３重量％ソルビタンモノオレエートＥＯ付加物を使用する以外は実施例１と同様に行い、リフォールディング剤（Ｒ−１２）を調製した。
【００９１】
実施例１３ （リフォールディング剤の調製１３）
実施例３において、０．１０重量％ソルビタンモノオレエートＥＯ付加物の代わりに０．０１３重量％ソルビタンモノオレエートＥＯ付加物を使用する以外は実施例１と同様に行い、リフォールディング剤（Ｒ−１３）を調製した。
【００９２】
比較例１ （比較のリフォールディング剤の調製１）
２０ｍＬ容の滅菌済みバイアル瓶に、１．０モル／Ｌ酢酸ナトリウム、５０ミリモル／Ｌのトリス緩衝液（ｐＨ＝８）となるようにそれぞれ加え、滅菌水で溶解しリフォールディング剤（Ｒ’−１）を調製した。
【００９３】
比較例２ （比較のリフォールディング剤の調製２）
２０ｍＬ容の滅菌済みバイアル瓶に、１．０モル／Ｌリン酸水素２ナトリウム、５０ミリモル／Ｌのトリス緩衝液（ｐＨ＝８）となるようにそれぞれ加え、滅菌水で溶解しリフォールディング剤（Ｒ’−２）を調製した。
【００９４】
比較例３ （比較のリフォールディング剤の調製３）
２０ｍＬ容の滅菌済みバイアル瓶に、０．１０重量％オレイルアルコールエチレンオキサイド１８モル付加物（「エマルミン１８０」：三洋化成工業製）、５０ミリモル／Ｌのトリス緩衝液（ｐＨ＝８）となるようにそれぞれ加え、滅菌水で溶解しリフォールディング剤（Ｒ’−３）を調製した。
【００９５】
比較例４ （比較のリフォールディング剤の調製４）
２０ｍＬ容の滅菌済みバイアル瓶に、１．０モル／Ｌ酢酸ナトリウム、０．１０重量％ラウリル硫酸ナトリウム（和光純薬工業製）、５０ミリモル／Ｌのトリス緩衝液（ｐＨ＝８）となるようにそれぞれ加え、滅菌水で溶解しリフォールディング剤（Ｒ’−４）を調製した。
【００９６】
比較例５ （比較のリフォールディング剤の調製５）
２０ｍＬ容の滅菌済みバイアル瓶に、１．０モル／Ｌ酢酸ナトリウム、０．１０重量％ヤシ油脂肪酸アミドプロピルベタイン（「レボン２０００」：三洋化成工業製）、５０ミリモル／Ｌのトリス緩衝液（ｐＨ＝８）となるようにそれぞれ加え、滅菌水で溶解しリフォールディング剤（Ｒ’−５）を調製した。
【００９７】
比較例６ （比較のリフォールディング剤の調製５）
２０ｍＬ容の滅菌済みバイアル瓶に、１．０モル／Ｌ酢酸ナトリウム、０．１０重量％セチルトリメチルアンモニウム（和光純薬工業製）、５０ミリモル／Ｌのトリス緩衝液（ｐＨ＝８）となるようにそれぞれ加え、滅菌水で溶解しリフォールディング剤（Ｒ’−６）を調製した。
【００９８】
実施例１４
１．５ｍＬ容の滅菌済みエッペンドルフチューブに、２ｍｇのリゾチーム（「塩化リゾチーム」ナカライテスク社製：以下、同様のものを使用）及び製造例１で調整したアンフォールディング溶液を１ｍＬ加えて、４℃で１晩放置しリゾチームをアンフォールディングさせた。
このアンフォールディングされたタンパク質溶液０．２５ｍＬに、実施例１で調整したリフォールディング剤（Ｒ−１）を０．７５ｍＬ加えて｛系中の化合物（Ｃ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ；系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０．０７５重量％｝、４℃で１晩放置してリフォールディングを行った。
【００９９】
実施例１５
実施例１４において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ−２）を使用する以外は実施例１４と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ｃ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０．０７５重量％）
【０１００】
実施例１６
実施例１４において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ−３）を使用する以外は実施例１４と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ａ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０．０７５重量％）
【０１０１】
実施例１７
実施例１４において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ−４）を使用する以外は実施例１４と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ｃ）の濃度＝６．０モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０．０７５重量％）
【０１０２】
実施例１８
実施例１４において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ−５）を使用する以外は実施例１４と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ｃ）の濃度＝０．０１モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０．０７５重量％）
【０１０３】
実施例１９
実施例１４において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ−６）を使用する以外は実施例１４と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ａ）の濃度＝６．０モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０．０７５重量％）
【０１０４】
実施例２０
実施例１４において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ−７）を使用する以外は実施例１４と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ａ）の濃度＝０．２モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０．０７５重量％）
【０１０５】
実施例２１
実施例１４において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ−８）を使用する以外は実施例１４と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ｃ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０．０７５重量％）
【０１０６】
実施例２２
実施例１４において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ−９）を使用する以外は実施例１４と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ａ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０．０７５重量％）
【０１０７】
実施例２３
実施例１４において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ−１０）を使用する以外は実施例１４と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ｃ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝１．０重量％）
【０１０８】
実施例２４
実施例１４において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ−１０）を使用する以外は実施例１４と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ｃ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０．０１重量％）
【０１０９】
実施例２５
実施例１４において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ−１０）を使用する以外は実施例１４と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ａ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝１．０重量％）
【０１１０】
実施例２６
実施例１４において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ−１０）を使用する以外は実施例１４と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ａ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０．０１重量％）
【０１１１】
比較例７
実施例１４において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ’−１）を使用する以外は実施例１４と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ｃ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０重量％）
【０１１２】
比較例８
実施例１４において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ’−２）を使用する以外は実施例１４と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ａ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０重量％）
【０１１３】
比較例９
実施例１４において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ’−３）を使用する以外は実施例１４と同様におこないリフォールディングを行った。系中の化合物（Ａ）と（Ｃ）の濃度＝０モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０．０７５重量％）
【０１１４】
比較例１０
実施例１４において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ’−４）を使用する以外は実施例１４と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ｃ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０重量％）
【０１１５】
比較例１１
実施例１４において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ’−５）を使用する以外は実施例１４と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ｃ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０重量％）
【０１１６】
比較例１２
実施例１４において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ’−６）を使用する以外は実施例１４と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ｃ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０重量％）
【０１１７】
＜リゾチーム酵素活性の測定＞
１０ｍｌの滅菌済み試験管に０．５重量％濃度の枯草菌溶液を３ｍｌ入れ、実施例１４〜２６又は比較例７〜１２で得られたタンパク質溶液を１０μｌマイクロピペットで加えて軽くかき混ぜた。タンパク質を加えた直後の４５０ｎｍにおける吸光度（Ａ0）を吸光度（４５０ｎｍ）を紫外可視分光光度計（島津製作所製、ＵＶ−２５５０）で測定し、さらにＡ0）を測定して５分後にもう一度吸光度（Ａ5）を測定し、これらの数値から４５０ｎｍにおける５分間の吸光度変化ＤＡ＝Ａ0−Ａ5を算出した。
また、実施例１４〜２６及び比較例７〜１２のリゾチーム濃度と同濃度の市販品「リゾチーム」で他に添加剤を加えないブランクの水溶液を調製し、これを用いて上記と同様に、４５０ｎｍにおける５分間の吸光度変化（ＤＡb）を算出した。
【０１１８】
リフォールディング後の酵素活性は以下の式を用いて算出した。
酵素活性（％）＝（ＤＡ／ＤＡb） ×１００
【０１１９】
上記実施例１４〜２６及び比較例７〜１２の酵素活性を表１に示す。
【０１２０】
【表１】
【０１２１】
表１によると、比較例８のリン含有化合物（Ａ）のみや、比較例７のカルボキシル基含有化合物（Ｃ）のみではリゾチームの凝集を抑えることができない。また、比較例９の非イオン性界面活性剤（Ｂ）のみでは、リゾチームの凝集は抑制できるが、リゾチームがリフォールディングせず活性を示さないため使用できないことが表１からわかる。さらに、比較例１０〜１２のように非イオン性界面活性剤ではなくアニオン性界面活性剤や両性界面活性剤及びカチオン性界面活性剤とカルボキシル基含有化合物との組み合わせでもリゾチームの凝集は抑制できない、もしくは活性が低い。
一方、非イオン性界面活性剤と組み合わせた実施例１４〜２６の本発明のリフォールディング剤は、タンパク質としてのリゾチームの凝集が起きず、高効率にリフォールディングできることがわかる。
【０１２２】
実施例２７
１．５ｍＬ容の滅菌済みエッペンドルフチューブに、２ｍｇのトリプシン（ナカライテスク社製：以下、同様のものを使用）及び製造例１で調整したアンフォールディング溶液を１ｍＬ加えて、４℃で１晩放置しリゾチームをアンフォールディングさせた。
このアンフォールディングされたタンパク質溶液０．２５ｍＬに、実施例１で調整したリフォールディング剤（Ｒ−１）を０．７５ｍＬ加えて｛系中の化合物（Ｃ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ；系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０．０７５重量％｝、４℃で１晩放置してリフォールディングを行った。
【０１２３】
実施例２８
実施例２７において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ−２）を使用する以外は実施例２７と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ｃ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０．０７５重量％）
【０１２４】
実施例２９
実施例２７において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ−３）を使用する以外は実施例２７と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ａ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０．０７５重量％）
【０１２５】
実施例３０
実施例２７において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ−４）を使用する以外は実施例２７と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ｃ）の濃度＝６．０モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０．０７５重量％）
【０１２６】
実施例３１
実施例２７において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ−５）を使用する以外は実施例２７と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ｃ）の濃度＝０．０１モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０．０７５重量％）
【０１２７】
実施例３２
実施例２７において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ−６）を使用する以外は実施例２７と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ａ）の濃度＝６．０モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０．０７５重量％）
【０１２８】
実施例３３
実施例２７において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ−７）を使用する以外は実施例２７と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ａ）の濃度＝０．２モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０．０７５重量％）
【０１２９】
実施例３４
実施例２７において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ−８）を使用する以外は実施例２７と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ｃ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０．０７５重量％）
【０１３０】
実施例３５
実施例２７において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ−９）を使用する以外は実施例２７と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ａ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０．０７５重量％）
【０１３１】
実施例３６
実施例２７において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ−１０）を使用する以外は実施例２７と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ｃ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝１．０重量％）
【０１３２】
実施例３７
実施例２７において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ−１０）を使用する以外は実施例２７と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ｃ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０．０１重量％）
【０１３３】
実施例３８
実施例２７において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ−１０）を使用する以外は実施例２７と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ａ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝１．０重量％）
【０１３４】
実施例３９
実施例２７において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ−１０）を使用する以外は実施例２７と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ａ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０．０１重量％）
【０１３５】
比較例１３
実施例２７において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ’−１）を使用する以外は実施例２７と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ｃ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０重量％）
【０１３６】
比較例１４
実施例２７において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ’−２）を使用する以外は実施例２７と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ａ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０重量％）
【０１３７】
比較例１５
実施例２７において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ’−３）を使用する以外は実施例２７と同様におこないリフォールディングを行った。系中の化合物（Ａ）と（Ｃ）の濃度＝０モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０．０７５重量％）
【０１３８】
比較例１６
実施例２７において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ’−４）を使用する以外は実施例２７と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ｃ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０重量％）
【０１３９】
比較例１７
実施例２７において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ’−５）を使用する以外は実施例２７と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ｃ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０重量％）
【０１４０】
比較例１８
実施例２７において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ’−６）を使用する以外は実施例２７と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ｃ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０重量％）
【０１４１】
＜トリプシン酵素活性の測定＞
１０ｍｌの滅菌済み試験管に０．３５ミリモル／Ｌのアゾコール（東京化成製）溶液を３ｍｌ入れ、実施例２７〜３９又は比較例１３〜１８で得られたタンパク質溶液を１０μｌマイクロピペットで加えて軽くかき混ぜた。タンパク質を加えた直後の５４０ｎｍにおける吸光度（Ａ0）を吸光度（５４０ｎｍ）を紫外可視分光光度計（島津製作所製、ＵＶ−２５５０）で測定し、さらにＡ0を測定して５分後にもう一度吸光度（Ａ5）を測定し、これらの数値から５４０ｎｍにおける５分間の吸光度変化ＤＡ＝Ａ5−Ａ0を算出した。
また、実施例２７〜３９及び比較例１３〜１８のトリプシン濃度と同濃度の市販品「トリプシン」で他に添加剤を加えないブランクの水溶液を調製し、これを用いて上記と同様に、４５０ｎｍにおける５分間の吸光度変化（ＤＡb）を算出した。
【０１４２】
リフォールディング後の酵素活性は以下の式を用いて算出した。
酵素活性（％）＝（ＤＡ／ＤＡb） ×１００
【０１４３】
上記実施例２７〜３９及び比較例１３〜１８の酵素活性を表２に示す。
【０１４４】
【表２】
【０１４５】
表２によると、比較例１４のリン含有化合物（Ａ）のみや、比較例１３のカルボキシル基含有化合物（Ｃ）のみではリゾチームの凝集を抑えることができない。また、比較例１５の非イオン性界面活性剤（Ｂ）のみでは、リゾチームの凝集は抑制できるが、リゾチームがリフォールディングせず活性を示さないため使用できないことが表１からわかる。さらに、比較例１６〜１８のように非イオン性界面活性剤ではなくアニオン性界面活性剤や両性界面活性剤及びカチオン性界面活性剤とカルボキシル基含有化合物との組み合わせでもリゾチームの凝集は抑制できない、もしくは活性が低い。
一方、非イオン性界面活性剤と組み合わせた実施例２７〜３９の本発明のリフォールディング剤は、タンパク質としてのリゾチームの凝集が起きず、高効率にリフォールディングできることがわかる。
【０１４６】
実施例４０
１．５ｍＬ容の滅菌済みエッペンドルフチューブに、２ｍｇのβラクトグロブリン（和光純薬社製：以下、同様のものを使用）及び製造例１で調整したアンフォールディング溶液を１ｍＬ加えて、４℃で１晩放置しβラクトグロブリンをアンフォールディングさせた。
このアンフォールディングされたタンパク質溶液０．２５ｍＬに、実施例１で調整したリフォールディング剤（Ｒ−１）を０．７５ｍＬ加えて｛系中の化合物（Ｃ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ；系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０．０７５重量％｝、４℃で１晩放置してリフォールディングを行った。
【０１４７】
実施例４１
実施例４０において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ−２）を使用する以外は実施例４０と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ｃ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０．０７５重量％）
【０１４８】
実施例４２
実施例４０において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ−３）を使用する以外は実施例４０と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ａ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０．０７５重量％）
【０１４９】
実施例４３
実施例４０において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ−４）を使用する以外は実施例４０と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ｃ）の濃度＝６．０モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０．０７５重量％）
【０１５０】
実施例４４
実施例４０において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ−５）を使用する以外は実施例４０と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ｃ）の濃度＝０．０１モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０．０７５重量％）
【０１５１】
実施例４５
実施例４０において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ−６）を使用する以外は実施例４０と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ａ）の濃度＝６．０モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０．０７５重量％）
【０１５２】
実施例４６
実施例４０において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ−７）を使用する以外は実施例４０と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ａ）の濃度＝０．２モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０．０７５重量％）
【０１５３】
実施例４７
実施例４０において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ−８）を使用する以外は実施例４０と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ｃ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０．０７５重量％）
【０１５４】
実施例４８
実施例４０において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ−９）を使用する以外は実施例４０と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ａ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０．０７５重量％）
【０１５５】
実施例４９
実施例４０において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ−１０）を使用する以外は実施例４０と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ｃ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝１．０重量％）
【０１５６】
実施例５０
実施例４０において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ−１０）を使用する以外は実施例４０と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ｃ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０．０１重量％）
【０１５７】
実施例５１
実施例４０において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ−１０）を使用する以外は実施例４０と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ａ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝１．０重量％）
【０１５８】
実施例５２
実施例４０において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ−１０）を使用する以外は実施例４０と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ａ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０．０１重量％）
【０１５９】
比較例１９
実施例４０において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ’−１）を使用する以外は実施例４０と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ｃ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０重量％）
【０１６０】
比較例２０
実施例４０において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ’−２）を使用する以外は実施例４０と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ａ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０重量％）
【０１６１】
比較例２１
実施例４０において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ’−３）を使用する以外は実施例４０と同様におこないリフォールディングを行った。系中の化合物（Ａ）と（Ｃ）の濃度＝０モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０．０７５重量％）
【０１６２】
比較例２２
実施例４０において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ’−４）を使用する以外は実施例４０と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ｃ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０重量％）
【０１６３】
比較例２３
実施例４０において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ’−５）を使用する以外は実施例４０と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ｃ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０重量％）
【０１６４】
比較例２４
実施例４０において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ’−６）を使用する以外は実施例４０と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ｃ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０重量％）
【０１６５】
＜βラクトグロブリンのリフォールディング率の測定＞
実施例４０〜５２又は比較例１９〜２４で得られたタンパク質溶液を４℃で簡易ゲルろ過カラム（「ＰＤ−１０」：ＧＥライフサイエンス社製）を通し精製した。
その後、４℃で陽イオン交換クロマトグラフィー（「ＡＫＴＡエクスプローラー」：ＧＥライフサイエンス社製）にかけ、タンパク質の分離をおこなった。２つピークが出てくる（はじめの活性βＬＧのピークをＰ１、あとの変性βＬＧのピークをＰ２とする）ので、それぞれの２つのピーク面積｛Ｐ１とＰ２のピーク面積（ＳP1、ＳP2）｝を算出した。
【０１６６】
リフォールディング率は以下の式を用いて算出した。
酵素活性（％）＝｛ＳP1／（ＳP1＋ＳP2）｝ ×１００
【０１６７】
上記実施例４０〜５２及び比較例１９〜２４の酵素活性を表３に示す。
【０１６８】
【表３】
【０１６９】
表３によると、比較例２０のリン含有化合物（Ａ）のみや、比較例１９のカルボキシル基含有化合物（Ｃ）のみではリゾチームの凝集を抑えることができない。また、比較例２１の非イオン性界面活性剤（Ｂ）のみでは、リゾチームの凝集は抑制できるが、リゾチームがリフォールディングせず活性を示さないため使用できないことが表１からわかる。さらに、比較例２２〜２４のように非イオン性界面活性剤ではなくアニオン性界面活性剤や両性界面活性剤及びカチオン性界面活性剤とカルボキシル基含有化合物との組み合わせでもリゾチームの凝集は抑制できない、もしくは活性が低い。
一方、非イオン性界面活性剤と組み合わせた実施例４０〜５２の本発明のリフォールディング剤は、タンパク質としてのリゾチームの凝集が起きず、高効率にリフォールディングできることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【０１７０】
本発明のリフォールディング剤、およびタンパク質の製造方法を用いると、有用な各種のタンパク質を、凝集させること無く、高収率で、かつ効率よく産生することができる。
本発明のタンパク質産生方法で得られるタンパク質としては、酵素、組み換えタンパク質などが挙げられる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質のリフォールディング剤及び製造方法に関し、詳しくはアンフォールディングされたタンパク質を活性のあるタンパク質構造へと巻き戻すために使用されるリフォールディング剤及びタンパク質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の機能・構造の解明・解析は、例えば、病気の治療や創薬に直結し、極めて重要である。このため、種々のタンパク質を様々な方法で合成・生産し、それらの構造を調べ、生体内における作用機構と役割を解明することが活発に行われている。そして、今や、タンパク質の機能は、それらを構成するアミノ酸の配列・鎖長のみならず、それらの取る秩序だった立体構造（高次構造）によって決まることは周知のこととなっている。
【０００３】
工業的にも、遺伝子工学の発展により、さまざまなタンパク質を組換え体として大量に調製し、医薬品製造や食品加工、臨床診断等の多岐にわたる産業に利用されてきた。ベクター技術の開発によって大腸菌や酵母の菌体内で、標的とするタンパク質を大量に産生させる技術が、少ない資源で簡単に再現性良く実行できるようになってきた。
しかし、組換え体で発現させたタンパク質の多くは立体構造に秩序が無く、高次構造が制御されておらず、不活性な封入体（インクルージョンボディ）と呼ばれる小粒子顆粒を形成することが多い。このため、大腸菌による生産プロセスでは、インクルージョンボディを解きほぐし（アンフォールディング）、高次構造を整え、秩序だった立体構造を持つ可溶性タンパク質に変換する操作、すなわち、インクルージョンボディをアンフォールディングし、さらにリフォールディング（巻き戻し）することが必要である。
【０００４】
この種のリフォールディングは、大腸菌や酵母による生産タンパク質のみならず、熱履歴等の、ある種の原因で失活したタンパク質の再生にも応用でき、極めて重要な技術である。したがって、従来から、このリフォールディングは透析法や希釈法を中心に盛んに研究され、種々の方法が提案されているが、それらのほとんどは、リフォールディング率が低いうえに、ある限定されたタンパク質（特に、分子量の低い特定タンパク質）に対して偶発的に好ましい結果が得られたに過ぎないことが多く、現在、このリフォールディングは、種々のタンパク質に適用可能な、一般性、普遍性のある、しかも、リフォールディング率の高い効率的で経済的な方法とはなっていない。
【０００５】
発明者は、特定のリン酸塩もしくはカルボン酸塩をリフォールディング剤として使用することで、高い生産性を得ることができるリフォールディング方法を既に見いだした（特許文献１、２）。
【０００６】
しかしながら、この方法では、リパーゼなどの構造が比較的単純なタンパク質は巻き戻るものの、リゾチームなどの分子内にＳ−Ｓ結合を含むタンパク質に対して使用すると、リフォールディング中にＳ−Ｓ結合が正しく再結合されずに誤った３次元構造となり、タンパク質が凝集することが頻繁に起こる。その結果、活性を持つタンパク質の収量が極端に減少する場合がある。
【特許文献１】特開２００７−１２６３９１号公報
【特許文献２】特開２００７−１４５８０１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、分子内にＳ−Ｓ結合を含むタンパク質に対して使用しても、タンパク質の凝集が起こりにくいリフォールディング剤及びタンパク質の製造方法を提供し、活性を持つタンパク質の収量を向上させることが課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は以上の問題点を解決するため鋭意検討した結果、本発明に到達した。
すなわち、本発明は、アンフォールディングされたタンパク質のリフォールディング剤であって、一般式（１）で示される基を有するリン含有化合物（Ａ）と非イオン性界面活性剤（Ｂ）を必須成分とするリフォールディング剤（Ｉ）；アンフォールディングされたタンパク質のリフォールディング剤であって、カルボキシル基、カルボキシレートアニオン基及びエステル基からなる群から選ばれる１種以上の基を有するオキシカルボニル基含有化合物（Ｃ）と非イオン性界面活性剤（Ｂ）を必須成分とするリフォールディング剤（ＩＩ）；タンパク質を前記リフォールディング剤（Ｉ）又は（ＩＩ）でリフォールディングする工程を含むタンパク質の製造方法である。
【０００９】
【化１】
【発明の効果】
【００１０】
本発明のリフォールディング剤を使用すると、従来よりもリフォールディング時のタンパク質の凝集を抑制することができ、活性のあるタンパク質を多く得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明のリフォールディング剤は、アンフォールディングされたタンパク質のリフォールディング剤であり、大別して、リン含有化合物（Ａ）と非イオン性界面活性剤（Ｂ）を必須成分とするリフォールディング剤（Ｉ）と、オキシカルボニル基含有化合物（Ｃ）と非イオン性界面活性剤（Ｂ）を必須成分とするリフォールディング剤（ＩＩ）の２種である。すなわち、下記一般式（１）で示される基を有する化合物（Ａ）からなるリン含有化合物（Ａ）と非イオン性界面活性剤（Ｂ）を必須成分とするリフォールディング剤（Ｉ）と、カルボキシル基、カルボキシレートアニオン基及びエステル基からなる群から選ばれる１種以上の基を有する化合物（Ｃ）と非イオン性界面活性剤（Ｂ）を必須成分とするリフォールディング剤（ＩＩ）である。
【００１２】
本願の第１の発明のリフォールディング剤（Ｉ）は、リン含有化合物（Ａ）と非イオン性界面活性剤（Ｂ）を必須成分とし、このリン含有化合物（Ａ）は、下記一般式（１）で示される基を有する化合物である。
【００１３】
【化２】
【００１４】
一般式（１）におけるＰはリン原子を表し、リン含有化合物（Ａ）としては、無機リン酸及びその塩（Ａ１）；アルキルリン酸エステル及びその塩（Ａ２）；並びに糖リン酸エステル及びその塩（Ａ３）などが挙げられる。
リン含有化合物（Ａ）は、１種であってもよく、２種以上を併用してもよい。
【００１５】
無機リン酸及びその塩（Ａ１）としては、リン酸、次亜リン酸、亜リン酸、次リン酸、ピロリン酸、ピロ亜リン酸、メタリン酸、トリポリリン酸、ポリリン酸、およびこれらの塩が挙げられる。
塩としてはアルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩など）、アルカリ土類金属塩（カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩など）、アンモニウム塩、アミン塩（１級アミン塩、２級アミン塩、３級アミン塩）、および４級アンモニウム塩（テトラアルキルアンモニウム塩など）が挙げられる。
【００１６】
塩としては、（Ａ１）が含有する酸基が複数の場合は、酸基の全てが塩になっていてもよく、酸基の一部が塩になっていてもよい。
【００１７】
（Ａ１）のうちの塩の具体例としては、リン酸１水素２ナトリウム塩、リン酸２水素１ナトリウム塩、リン酸１水素２カリウム塩、リン酸２水素１カリウム塩、リン酸アンモニウム塩、リン酸テトラメチルアンモニウム塩、リン酸テトラエチルアンモニウム塩、リン酸トリエチルアミン塩及びリン酸トリエタノールアミン塩などのリン酸塩；亜リン酸ナトリウム、亜リン酸カリウム、亜リン酸アンモニウム塩、亜リン酸テトラメチルアンモニウム塩、亜リン酸テトラエチルアンモニウム塩、亜リン酸トリエチルアミン塩及び亜リン酸トリエタノールアミン塩などの亜リン酸塩；ピロリン酸ナトリウム塩、ピロリン酸カリウム塩、ピロリン酸テトラメチルアンモニウム塩、ピロリン酸テトラエチルアンモニウム塩、ピロリン酸トリエチルアミン塩及びピロリン酸トリエタノールアミン塩などのピロリン酸塩などが挙げられる。
【００１８】
アルキルリン酸エステル及びその塩（Ａ２）としては、炭素数１〜１２のアルキル基を有するアルキルリン酸エステル（Ａ２１）、アルキルピロリン酸エステル（Ａ２２）若しくはアルキルトリポリリン酸エステル（Ａ２３）などが挙げられる。
炭素数１〜１２のアルキル基を有するアルキルリン酸エステル（Ａ２１）としては、モノアルキルリン酸エステル、ジアルキルリン酸エステル、トリアルキルリン酸エステルが含まれる。モノアルキルリン酸エステルとしては、メチルリン酸エステル、エチルリン酸エステル、プロピルリン酸エステル、２−プロピルリン酸エステル、ブチルリン酸エステル、２−ブチルリン酸エステル、ｔ−ブチルリン酸エステル、ペンチルリン酸エステル、ヘキシルリン酸エステル、シクロヘキシルリン酸エステル、オクチルリン酸エステル、ノニルリン酸エステル、デシルリン酸エステルなどが挙げられる。ジアルキルリン酸エステルとしては上記アルキルリン酸エステルのジエステルが挙げられ、トリアルキルリン酸エステルとしては上記アルキルリン酸エステルのトリエステルが挙げられる。
【００１９】
炭素数１〜１２のアルキル基を有するアルキルピロリン酸エステル（Ａ２２）としては、モノアルキルピロリン酸エステル、ジアルキルピロリン酸エステル、トリアルキルピロリン酸エステルが含まれる。モノアルキルピロリン酸エステルとしては、メチルピロリン酸エステル、エチルピロリン酸エステル、プロピルピロリン酸エステル、２−プロピルピロリン酸エステル、ブチルピロリン酸エステル、２−ブチルピロリン酸エステル、ｔ−ブチルピロリン酸エステル、ペンチルピロリン酸エステル、ヘキシルピロリン酸エステル、シクロヘキシルピロリン酸エステル、オクチルピロリン酸エステル、ノニルピロリン酸エステル、デシルピロリン酸エステルなどが挙げられる。ジアルキルピロリン酸エステルとしては上記アルキルピロリン酸エステルのジエステルが挙げられ、トリアルキルピロリン酸エステルとしては上記アルキルピロリン酸エステルのトリエステルが挙げられる。
【００２０】
炭素数１〜１２のアルキル基を有するアルキルトリポリリン酸エステル（Ａ２３）としては、モノアルキルトリポリリン酸エステル、ジアルキルトリポリリン酸エステル、トリアルキルトリポリリン酸エステルが含まれる。モノアルキルトリポリリン酸エステルとしては、メチルトリポリリン酸エステル、エチルトリポリリン酸エステル、プロピルトリポリリン酸エステル、２−プロピルトリポリリン酸エステル、ブチルトリポリリン酸エステル、２−ブチルトリポリリン酸エステル、ｔ−ブチルトリポリリン酸エステル、ペンチルトリポリリン酸エステル、ヘキシルトリポリリン酸エステル、シクロヘキシルトリポリリン酸エステル、オクチルトリポリリン酸エステル、ノニルトリポリリン酸エステル、デシルトリポリリン酸エステルなどが挙げられる。ジアルキルトリポリリン酸エステルとしては上記アルキルトリポリリン酸エステルのジエステルが挙げられ、トリアルキルトリポリリン酸エステルとしては上記アルキルトリポリリン酸エステルのトリエステルが挙げられる。
【００２１】
上記（Ａ２１）〜（Ａ２３）の塩としては、前述の（Ａ１）で挙げた塩と同様のアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、アミン塩及び４級アンモニウム塩が挙げられる。
塩としては、（Ａ２１）〜（Ａ２３）が含有する酸基が複数の場合は、酸基の全てが塩になっていてもよく、酸基の一部が塩になっていてもよい。
【００２２】
糖リン酸エステル及びその塩（Ａ３）としては、アデノシン３リン酸（ＡＴＰ）、アデノシン２リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン１リン酸（ＡＭＰ）及び環状アデノシンモノリン酸（ｃ−ＡＭＰ）並びにそれらのナトリウム塩、カリウム塩、トリエチルアミン塩、トリエタノールアミン塩などが挙げられる。
【００２３】
リン含有化合物（Ａ）のうち、タンパク質の凝集低減及び／又は活性タンパク質の収量
向上の観点から、（Ａ１）及び（Ａ３）が好ましく、さらに好ましいのは、リン酸、ピロリン酸、ポリリン酸、アデノシン３リン酸、アデノシン２リン酸、アデノシン１リン酸及びそれらの塩である。
【００２４】
リフォールディング工程において、系中の（Ａ）の濃度は、タンパク質の凝集低減及び／又は活性タンパク質の収量向上の観点から、０．１〜６モル／Ｌが好ましく、さらに好ましくは０．２〜６モル／Ｌで使用される。
【００２５】
ここで系とは、水、タンパク質、変性剤及びリフォールディング剤が混合された状態を指し、系中の濃度とは、水、タンパク質、変性剤及びリフォールディング剤の混合溶液の容量に対するリフォールディング剤の濃度を指し、以下の記載において同様である。
なお、変性剤とは、ミスフォールディング状態のタンパク質の３次元構造を解きほぐすための薬剤のことを指し、タンパク質の水素結合及びジスルフィド結合を切断する物質が用いられる。具体的には６モル／Ｌ塩酸グアニジン水溶液や８モル／Ｌ尿素水溶液が挙げられる。ジスルフィド結合を完全に切断するためにメルカプトエタノールやジチオスレイトール等を添加して使用しても良い。
【００２６】
本発明のリフォールディング剤（Ｉ）におけるもう１つの必須成分である非イオン性界面活性剤（Ｂ）としては、高級アルコールのアルキレンオキサイド（以下、ＡＯと略記する。）付加物（Ｂ１）、炭素数６〜２４のアルキル基を有するアルキルフェノールのＡＯ付加物（Ｂ２）、ポリプロピレングリコールエチレンオキサイド（以下、ＥＯと略記する。）付加物（Ｂ３）、ポリエチレングリコールプロピレンオキサイド（以下、ＰＯと略記する。）付加物（Ｂ４）、脂肪酸ＡＯ付加物（Ｂ５）、および多価アルコール型非イオン性界面活性剤（Ｂ６）などが含まれる。
【００２７】
ここでＡＯとは、アルキレンオキサイドを指し、具体的にエチレンオキサイド（ＥＯ）、プロピレンオキサイド（ＰＯ）及びブチレンオキサイド等が挙げられる。
【００２８】
高級アルコールのＡＯ付加物（Ｂ１）としては、炭素数８〜２４の高級アルコール（デシルアルコール、ドデシルアルコール、ヤシ油アルキルアルコール、オクタデシルアルコール及びオレイルアルコールなど）のＥＯ１〜２０モル付加物などや、同じく炭素数８〜２４の高級アルコールのＰＯ１〜４０モル付加物などが挙げられる。タンパク質の凝集及び／又はタンパク質の収量向上の観点で、炭素数８〜２４の高級アルコールのＥＯ１〜２０モル付加物が好ましく、さらに好ましくはオレイルアルコールのＥＯ１８モルである。
【００２９】
アルキルフェノールのＡＯ付加物（Ｂ２）としては、炭素数７〜３６のアルキルフェノール（ノニルフェノール及びセチルフェノールなど）のＥＯ１〜４０モル付加物などや、同じく炭素数７〜３６のアルキルフェノールのＰＯ１〜４０モル付加物などが挙げられる。タンパク質の凝集及び／又はタンパク質の収量向上の観点で、炭素数７〜３６のアルキルフェノールのＥＯ１〜４０モル付加物が好ましく、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ３００などが容易に入手できる。
【００３０】
ポリプロピレングリコールＥＯ付加物（Ｂ３）としては、プルロニック型界面活性剤が挙げられ、プロピレンオキシドの繰り返し単位が１０〜１００個のポリプロピレングリコールのＥＯ２〜４０モル付加物が挙げられる。タンパク質の凝集防止及び／又はタンパク質の収率向上の観点で、プロピレンオキシドの繰り返し単位が２０〜５０個のポリプロピレングリコールＥＯ１０モル付加物、プロピレンオキシドの繰り返し単位が２０〜５０個のポリプロピレングリコールＥＯ２５モル付加物が好ましい。
【００３１】
ポリエチレングリコールＰＯ付加物（Ｂ４）としては、エチレンオキシドの繰り返し単位が１０〜１００個のポリエチレングリコールのＰＯ２〜２０モル付加物が挙げられ、タンパク質の凝集防止及び／又はタンパク質の収率向上の観点で、エチレンオキシドの繰り返し単位が１０〜５０個のポリエチレングリコールＰＯ１０モル付加物が好ましい。
【００３２】
脂肪酸ＡＯ付加物（Ｂ５）としては、炭素数８〜２４の高級脂肪酸（ラウリル酸、ステアリン酸、オレイン酸など）のＥＯ１〜２５モル付加物などが挙げられる。タンパク質の凝集防止及び／又はタンパク質の収率向上の観点で、ラウリル酸ＥＯ１０モル付加物、ステアリン酸ＥＯ２０モル付加物及びオレイン酸ＥＯ２０モル付加物が好ましい。
なお（Ｂ５）は、オキシカルボニル基含有化合物（Ｃ）と併用する際には（Ｃ）として取り扱い、それ以外の場合には（Ｂ５）として取り扱うものとする。
【００３３】
多価アルコール型非イオン性界面活性剤（Ｂ６）としては、分子内に水酸基を２個以上含むアルコールのＥＯ付加物等が挙げられる。タンパク質の凝集防止及び／又はタンパク質の収率向上の観点で、ソルビタンアルキルエステルＥＯ６〜４０モル付加物やグリセリンアルキルエステルＥＯ２〜４０モル付加物が好ましく、さらに好ましくはソルビタンアルキルエステルＥＯ６〜４０モル付加物であり、ＴＷＥＥＮ２０、ＴＷＥＥＮ４０、ＴＷＥＥＮ６０、ＴＷＥＥＮ８０などが容易に入手できる。
【００３４】
これらの中で、タンパク質の凝集防止の観点で、高級アルコールのＡＯ付加物（Ｂ１）、および多価アルコールのＡＯ付加物（Ｂ６）が好ましく、さらに好ましくは（Ｂ１）である。
好ましい具体例としては、炭素数８〜２４の高級アルコール（オレイルアルコール、デシルアルコール、ドデシルアルコール、ヤシ油アルキルアルコール、オクタデシルアルコールなど）のＥＯ１〜２０モル付加物；ソルビタンアルキルエステルＥＯ付加物などが挙げられる。
【００３５】
リフォールディング剤（Ｉ）を使用するリフォールディング工程において、タンパク質の凝集防止の観点から、系中の非イオン性界面活性剤（Ｂ）の濃度は、０．００１〜１０重量％が好ましく、さらに好ましくは０．０１〜１重量％である。
【００３６】
リフォールディング工程において系中の（Ｂ）の濃度（重量％）に対する（Ａ）の濃度（重量％）の比率は、タンパク質の凝集防止の観点から、０．０５〜５０，０００（重量％／重量％）が好ましく、さらに好ましくは１〜５，０００（重量％／重量％）である。
【００３７】
本願の第２の発明のリフォールディング剤（ＩＩ）は、オキシカルボニル基含有化合物（Ｃ）と非イオン性界面活性剤（Ｂ）を必須成分とし、このオキシカルボニル基含有化合物（Ｃ）はカルボキシル基、カルボキシレートアニオン基及びエステル基からなる群から選ばれる１種以上の基を有する化合物である。
このオキシカルボニル基含有化合物（Ｃ）は、いずれも分子内にオキシカルボニル基（−ＣＯＯ−）を有する。
【００３８】
オキシカルボニル基含有化合物（Ｃ）としては、分子内に少なくとも１個のカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）もしくは少なくとも１個のカルボキシレートアニオン基（−ＣＯＯ-）を有する化合物（Ｃ１）、並びに、分子内に少なくとも１個のエステル基（−ＣＯＯＲ）を有する化合物（Ｃ２）が挙げられる。なお、これらのオキシカルボニル基と水酸基を同時に有する乳酸等のオキシカルボン酸も、本発明のオキシカルボニル基含有化合物（Ｃ）に含まれる。
【００３９】
分子内に少なくとも１個のカルボキシル基もしくはカルボキシレートアニオン基を有する化合物（Ｃ１）としては、ポリオキシアルキレン基を分子内に有しない通常のカルボン酸（Ｃ１１）、ポリオキシアルキレン基含有カルボン酸（Ｃ１２）；およびそれらの塩が挙げられる。
【００４０】
カルボン酸（Ｃ１１）としては、炭素数１〜３６（カルボニル基の炭素原子も含む。以下同様）の脂肪族カルボン酸（Ｃ１１１）及び炭素数７〜３６の芳香族カルボン酸（Ｃ１１２）等が挙げられる。
【００４１】
脂肪族カルボン酸（Ｃ１１１）としては、炭素数１〜３６の脂肪族飽和モノカルボン酸（蟻酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、吉草酸、カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、ベラルゴン酸、ラウリル酸、ミリスチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、２−エチルヘキサン酸など）；炭素数３〜３６の脂肪族不飽和モノカルボン酸（アクリル酸、メタクリル酸、オレイン酸など）；炭素数３〜３６の脂肪族ヒドロキシモノカルボン酸（グリコール酸、乳酸、酒石酸、グルコン酸など）；炭素数２〜３６の脂肪族飽和ジカルボン酸（シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸など）及びそれらのモノアルキルエステル；炭素数４〜３６の脂肪族不飽和ジカルボン酸（マレイン酸、フマール酸、イタコン酸など）；並びに、３価以上（好ましくは３〜１２価）の脂肪族多価カルボン酸（クエン酸、ブタンテトラカルボン酸、シクロペンタンテトラカルボン酸、エチレンジアミン四酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸など）；などが挙げられる。
【００４２】
芳香族カルボン酸（Ｃ１１２）としては、炭素数７〜３６の芳香族モノカルボン酸（安息香酸、桂皮酸、ヒドロキシ安息香酸など）；炭素数８〜３６の芳香族ジカルボン酸（フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸など）；炭素数９〜３６の芳香族トリカルボン酸及びテトラカルボン酸（トリメリット酸、ピロメリット酸など）；芳香族ヒドロキシカルボン酸（サリチル酸等）等が挙げられる。
【００４３】
カルボン酸（Ｃ１１）としては、さらに、上記のジカルボン酸又は３価以上の多価カルボン酸の部分アルキル（アルキル基としては炭素数１〜１２のもの）エステル（シュウ酸モノメチル、コハク酸モノメチル、マレイン酸モノメチル、シュウ酸モノエチル、クエン酸モノメチル、クエン酸ジメチルなど）が挙げられる。
【００４４】
ポリオキシアルキレン基含有カルボン酸（Ｃ１２）としては、一般式（２）で示されるエーテルカルボン酸化合物が挙げられる。
【００４５】
Ｒ1−Ｏ−（Ｒ2Ｏ）ｐ−Ｒ3ＣＯＯＨ （２）
（式中、Ｒ1は炭素数１〜３６の炭化水素基、Ｒ2は炭素数２〜４のアルキレン基、Ｒ3は炭素数１〜３のアルキレン基、ｐは１〜５０の整数を表す。）
【００４６】
Ｒ1は炭素数１〜３６の炭化水素基であって、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、２−プロピル基、ｎ−ブチル基、２−ブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、シクロヘキシル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ドデシル基などが挙げられる。
なお、Ｒ1の水素の一部が水酸基で置換されていてもよい。
Ｒ2は、炭素数２〜４のアルキレン基であって、エチレン基、１，２−プロピレン基、１，３−プロピレン基、１，２−ブチレン基、１，４−ブチレン基などが挙げられる。
Ｒ3は、炭素数１〜３のアルキレン基であって、メチレン基、エチレン基、１，３−プロピレン基、１，２−プロピレン基が挙げられる。ｐは１〜５０の整数であって、タンパク質の収率向上の観点から、１〜２０が好ましく、さらに好ましくは１〜１０、特に好ましくは１〜４である。
【００４７】
エーテルカルボン酸の具体例としては、ポリオキシエチレンヘキシルエーテル酢酸、ポリオキシエチレンオクチルエーテル酢酸、ポリオキシエチレンノニルエーテル酢酸、ポリオキシエチレンデシルエーテル酢酸、ポリオキシエチレンドデシルエーテル酢酸、ポリオキシプロピレンヘキシルエーテル酢酸、ポリオキシプロピレンオクチルエーテル酢酸、ポリオキシプロピレンノニルエーテル酢酸、ポリオキシプロピレンデシルエーテル酢酸、ポリオキシプロピレンドデシルエーテル酢酸などが挙げられる。
なお、エーテルカルボン酸は、高級アルコールにアルキレンオキサイドを付加した後、モノクロルカルボン酸を反応させて製造することができる。
【００４８】
分子内に少なくとも１個のカルボキシレートアニオン基を有する化合物（Ｃ１）としては、カルボン酸（Ｃ１１）又はポリオキシアルキレン基含有カルボン酸（Ｃ１２）の塩も含まれる。
塩としては、（Ａ１）で挙げた塩と同様のアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、アミン塩、および４級アンモニウム塩が挙げられる。
【００４９】
カルボン酸（Ｃ１１）の塩の具体例としては、上記の炭素数１〜３６の脂肪族飽和モノカルボン酸塩（ギ酸ナトリウム、ギ酸アンモニウム、ギ酸グアニジウム、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、酢酸グアニジウム、プロピオン酸ナトリウム、プロピオン酸アンモニウム、プロピオン酸グアニジウム、酪酸ナトリウム、カプロン酸ナトリウムなど）；炭素数３〜３６の脂肪族不飽和モノカルボン酸（アクリル酸ナトリウムなど）；炭素数３〜３６の脂肪族ヒドロキシモノカルボン酸塩（グリコール酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、乳酸アンモニウム、乳酸グアニジウム、酒石酸ナトリウム、酒石酸カリウム、酒石酸アンモニウム、酒石酸グアニジウム、グルコン酸ナトリウムなど）；炭素数２〜３６の脂肪族飽和ジカルボン酸塩（シュウ酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム、グルタル酸ナトリウムなど）；炭素数４〜３６の脂肪族不飽和ジカルボン酸塩（マレイン酸ナトリウムなど）；上記のジカルボン酸又は３価以上の多価カルボン酸の部分アルキルエステルの塩（シュウ酸モノメチルナトリウム、コハク酸モノメチルナトリウム、マレイン酸モノメチルカリウム、シュウ酸モノエチルナトリウム、クエン酸モノメチルナトリウム、クエン酸ジメチルナトリウムなど）が挙げられる。
【００５０】
ポリオキシアルキレン基含有カルボン酸（Ｃ１２）の塩の具体例としては、ポリオキシエチレンヘキシルエーテル酢酸ナトリウム、ポリオキシエチレンオクチルエーテル酢酸ナトリウム、ポリオキシエチレンノニルエーテル酢酸ナトリウム、ポリオキシエチレンデシルエーテル酢酸ナトリウム、ポリオキシエチレンドデシルエーテル酢酸ナトリウム、ポリオキシプロピレンヘキシルエーテル酢酸ナトリウム、ポリオキシプロピレンオクチルエーテル酢酸ナトリウム、ポリオキシプロピレンノニルエーテル酢酸ナトリウム、ポリオキシプロピレンデシルエーテル酢酸ナトリウム、ポリオキシプロピレンドデシルエーテル酢酸ナトリウムなどが挙げられる。
【００５１】
本発明のオキシカルボニル基含有化合物（Ｃ）のうちのもう１つの、分子内に少なくとも１個のエステル基を有する化合物（Ｃ２）としては、カルボン酸アルキルエステル（Ｃ２１）、カルボン酸のアルキレンオキサイド付加物（Ｃ２２）などが含まれる。
【００５２】
カルボン酸アルキルエステル（Ｃ２１）を構成するカルボン酸としては、前述の分子内に少なくとも１個のカルボキシル基もしくはカルボキシレートアニオン基を有する化合物（Ｃ１）として例示したのと同様のカルボン酸が挙げられる。
また、アルキルエステル基を構成するアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、２−プロピル基、ｎ−ブチル基、２−ブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、シクロヘキシル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ドデシル基などの炭素数１〜１２の直鎖もしくは分岐の脂肪族アルキル基が挙げられる。
【００５３】
カルボン酸アルキルエステル（Ｃ２１）の具体例としては、モノカルボン酸アルキルエステル（蟻酸メチル、酢酸メチル、蟻酸エチル、酢酸エチル、酢酸ｎ−ブチル、ステアリン酸メチル及びステアリン酸ｎ−ブチルなど）；ジカルボン酸ジアルキルエステル（シュウ酸ジメチル、コハク酸ジメチル、マレイン酸ジメチル、シュウ酸ジエチル、コハク酸ジエチル及びアジピン酸ジメチルなど）；３価以上の脂肪族多価カルボン酸の全てのカルボキシル基がエステル化されているもの（クエン酸トリメチル及びエチレンジアミン四酢酸テトラメチルなど）などが挙げられる。
【００５４】
カルボン酸のアルキレンオキサイド付加物（Ｃ２２）としては、前述の（Ｃ１）で挙げたカルボン酸の炭素数２〜４のアルキレンオキサイド１〜５０モル付加物などが挙げられる。
アルキレンオキサイドとしては、エチレンオキサイド、プロピレンオキサイド及びブチレンオキサイドが挙げられる。
【００５５】
カルボン酸のアルキレンオキサイド付加物の具体例としては、モノカルボン酸のＥＯ付加物（ギ酸ＥＯ１〜１０モル付加物、酢酸ＥＯ１〜１０モル付加物、プロピオン酸ＥＯ１０モル付加物、酪酸ＥＯ１〜１０モル付加物、カプロン酸ＥＯ２〜２０モル付加物、ラウリル酸ＥＯ１〜２０モル付加物など）；オキシカルボン酸のＥＯ付加物（グリコール酸ＥＯ１〜２０モル付加物、乳酸ＥＯ１〜２０モル付加物、酒石酸ＰＯ１〜５モル付加物など）；脂肪族多価カルボン酸のＥＯ付加物（シュウ酸ＥＯ１〜２０モル付加物、マロン酸ＥＯ１〜２０モル付加物、コハク酸ＥＯ１〜２０モル付加物、グルタル酸ＥＯ１〜２０モル付加物、クエン酸ＥＯ１〜２０モル付加物、マレイン酸ＥＯ１〜２０モル付加物など）；芳香族多価カルボン酸のＥＯ付加物（フタル酸ＥＯ１〜３０モル付加物、テレフタル酸ＥＯ１〜３０モル付加物など）；が挙げられる。
【００５６】
これら化合物（Ｃ）のうち、タンパク質の凝集防止及び／又はタンパク質の収率向上の観点から、（Ｃ１）及びこの塩が好ましく、さらに好ましくは脂肪族カルボン酸（Ｃ１１）及びこの塩、特に好ましくは炭素数１〜８の脂肪族カルボン酸（例えばギ酸、酢酸、プロピオン酸、乳酸、酒石酸）及びこの塩である。
【００５７】
リフォールディング工程において、系中の（Ｃ）の濃度は、タンパク質の凝集防止及び／又はタンパク質の収率向上の観点から、０．００１〜６モル／Ｌが好ましく、さらに好ましくは０．０１〜６モル／Ｌで使用される。
【００５８】
本発明のリフォールディング剤（ＩＩ）における必須成分の非イオン性界面活性剤（Ｂ）は、前述のリフォールディング剤（Ｉ）で示した非イオン性界面活性剤（Ｂ）と同様のものが使用でき、好ましいものも同様である。
【００５９】
リフォールディング剤（ＩＩ）を使用するリフォールディング工程において、系中の（Ｂ）の濃度は、タンパク質の凝集防止の観点から、０．００１〜１０重量％が好ましく、さらに好ましくは０．０１〜１重量％である。
【００６０】
リフォールディング工程において系中の（Ｂ）の濃度に対する（Ｃ）の濃度の割合は、タンパク質の凝集防止の観点から、０．０１〜６０，０００（重量％／重量％）が好ましく、さらに好ましくは１〜６，０００（重量％／重量％）である。
【００６１】
本発明のリフォールディング剤（Ｉ）又は（ＩＩ）には、必要に応じて水、塩、緩衝剤及びグルタチオン等を含有させることもできる。
水を含有する場合、その含有量は特に限定されないが、化合物（Ａ）及び（Ｂ）の合計重量、または（Ｃ）及び（Ｂ）の合計重量に対し、操作性の観点から、１００〜１０，０００重量％が好ましく、さらに好ましくは２００〜５，０００重量％である。
塩としては、塩化ナトリウム、塩化アンモニウム、塩化カリウム等が挙げられ、その含有量は、化合物（Ａ）及び（Ｂ）の合計重量、または（Ｃ）及び（Ｂ）の合計重量に対し、タンパク質の収率向上の観点で１〜１０重量％が好ましく、さらに好ましくは１〜３重量％である。
緩衝剤としては、トリスバッファー、ＨＥＰＥＳバッファー等が挙げられ、その含有量は、化合物（Ａ）及び（Ｂ）の合計重量、または（Ｃ）及び（Ｂ）の合計重量に対し、タンパク質の収率向上の観点で１〜３０重量％が好ましく、さらに好ましくは１〜１０重量％である。
グルタチオンを含有する場合、その含有量は、化合物（Ａ）及び（Ｂ）の合計重量、または（Ｃ）及び（Ｂ）の合計重量に対し、タンパク質の収率向上の観点で０．００１〜０．５重量％が好ましく、さらに好ましくは０．０１〜０．１重量％である。
【００６２】
対象とするタンパク質は、分子内にＳ−Ｓ結合を含むタンパク質（例えばリゾチームなど）である場合が本発明の効果が顕著であるので好ましく、その場合リフォールディングされるものは塩酸グアニジンまたは尿素と共に、さらに２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、シスチン、チオフェノール等の還元剤を加えてアンフォールディングされたタンパク質である。
【００６３】
本発明におけるタンパク質は分子内にジスルフィド結合を含むタンパク質（Ｐ１）と分子内にジスルフィド結合を含まないタンパク質（Ｐ２）に分類できる。
分子内にジスルフィド結合を含むタンパク質（Ｐ１）として、リゾチーム、βラクトグロブリン、アルカリ性フォスファターゼ、リボヌクレアーゼ、トリプシン、キモトリプシン、インターフェロン、インスリン、ナトリウム利尿ペプチド及び抗体等が挙げられる。
分子内にジスルフィド結合を含まないタンパク質（Ｐ２）として、リパーゼ、ホスホリパーゼ及び２〜１０個のアミノ酸で構成されたペプチド等が挙げられる。
これらのうち、本発明の対象となるタンパク質としては、本発明の効果が顕著である点から、分子内にＳ−Ｓ結合を含むタンパク質（Ｐ１）が好ましい。分子内のＳ−Ｓ結合の個数はタンパク質の凝集に大きく関与し、一般的に個数が大きいほど凝集しやすい。本発明の対象となるタンパク質分子内のＳ−Ｓ結合の数は１個〜１０個が好ましく、さらに好ましくは２個〜４個である。具体的にはリゾチーム（４個）、βラクトグロブリン（２〜３個）、トリプシン（２個）等が挙げられる。
【００６４】
本発明におけるタンパク質の分子量は１，０００〜３００，０００であり、リフォールディングのしやすさの観点から好ましくは１０，０００〜２５０，０００である。ここで分子量とはＳＤＳゲル電気泳動法によって推定された分子量を指す。
一般に分子量の大きさとリフォールディングのしにくさには相関があり、分子量の大きなタンパク（分子量１０，０００以上程度）になるとリフォールディングが著しく困難になるとされている。本発明のリフォールディング方法はリフォールディング効果が優れるので、分子量１０，０００以上の高分子量タンパク質に対しても非常に有効な方法となる。
【００６５】
本発明における「リフォールディング工程」とは、タンパク質とリフォールディング剤とを撹拌・混合する工程であり、その後、リフォールディングをより充分に進めるために必要により一定時間静置することも含まれる。タンパク質とリフォールディング剤を撹拌・混合する際には、ほとんど不均一部分が無くなるまで撹拌混合することが好ましい。静置時間は特に限定されないが、例えば１〜５０時間である。また処理工程時の温度は、特に限定されないが、例えば４〜３０℃である。
【００６６】
本発明のリフォールディング剤を使用してリフォールディングする工程は、リフォールディング剤で処理する工程において、さらにｐＨ調整剤（Ｄ）、タンパク質安定化剤（Ｅ）を使用してもよい。
ｐＨ調整剤（Ｄ）としては、Ｔｒｉｓ（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノエタンスルホン酸）、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸）などが挙げられる。
【００６７】
なお、従来のリン酸緩衝剤（例えば、リン酸１水素２ナトリウム＋塩酸水溶液、またはリン酸２水素１ナトリウム＋水酸化ナトリウム水溶液）を使用する場合は、リン酸緩衝剤がリン酸塩であるため本発明における（Ａ）と重複する。しかし、従来のｐＨ調整が目的で使用するリン酸緩衝剤の添加濃度の上限は高くても０．０５モル／Ｌであり、本発明のリフォールディング剤としてのリン系化合物（Ａ）と従来のｐＨ調整が目的のリン酸緩衝剤とは使用する際の濃度が明確に異なる。従来のリン酸緩衝剤は、本発明においては、リン含有化合物（Ａ）として取り扱う。
【００６８】
一般的にリフォールディング操作はｐＨ７〜８で行われ、ｐＨ調整剤（Ｄ）の使用量は、この範囲に調整するためであれば、特に限定されないが、（Ａ）又は（Ｃ）の重量に対し、タンパク質の凝集防止の観点から、２０重量％以下が好ましく、さらに好ましくは０．００１〜２０重量％、次にさらに好ましくは０．０１〜２０重量％である。
【００６９】
タンパク質安定化剤（Ｅ）としては酸化還元剤、ポリオール、金属イオン、キレート試薬などが挙げられる。
酸化還元剤としては２−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール、アスコルビン酸、酸化型グルタチオン、還元型グルタチオン、システイン及びシスチンなどが挙げられる。
ポリオールとしてはグリセリン、ブドウ糖、ショ糖、エチレングリコール、ソルビトール及びマンニトールなどが挙げられる。
金属イオンとしてはマグネシウムイオン、マンガンイオン及びカルシウムイオンなどの２価金属イオンが挙げらる。
キレート試薬としてはエチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）及びグリコールエーテルジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−４酢酸（ＥＧＴＡ）などが挙げられる。
【００７０】
タンパク質安定化剤（Ｅ）の使用量は、（Ａ）又は（Ｃ）の重量に対し、タンパク質の凝集防止及び／又はタンパク質の収率向上の観点から、１０重量％以下が好ましく、さらに好ましくは０．００１〜１０重量％、次にさらに好ましくは０．０１〜５重量％である。
【００７１】
本発明のリフォールディング方法において、タンパク質の系中の濃度は、０．２〜３０ｍｇ／ｍＬが好ましく、さらに好ましくは０．２〜２０ｍｇ／ｍＬ、特に好ましくは０．２５〜５ｍｇ／ｍＬである。０．２ｍｇ／ｍＬ以上であればタンパク質の生産効率の観点から好ましく、３０ｍｇ／ｍＬ以下であれば系内の粘度が高くなりすぎることが少ないため生産効率が低下しないので好ましい。
また、（Ａ）又は（Ｃ）の、タンパク質の重量に対する使用量（重量）は、タンパク質の凝集防止及び／又はタンパク質の収率向上の観点から、タンパク質１部に対して５〜２，０００部が好ましく、さらに好ましくは１０〜１，０００部である。
【００７２】
本発明のタンパク質の製造方法は、上記のリフォールディング剤でリフォールディングする工程を含むタンパク質の製造方法である。
本発明のタンパク質の製造方法で得られるタンパク質は、上記のリフォールディング剤を使用して得られるため、リフォールディング工程中の凝集が少なく、収率が著しく向上する。
本発明のタンパク質の産生方法としては、例えば、以下のような順序の工程による産生方法が挙げられる。
（１）タンパク質の培養工程：大腸菌などのタンパク質生産体に酵素又は組み換えタンパク質を培養させる。
（２）溶菌工程：溶菌剤などの使用によってタンパク質生産体内のインクルージョンボディを取り出す。
（３）アンフォールディング工程：インクルージョンボディ懸濁液（例えば１０ｍｇタンパク質／ｍＬ）に０．５モル／Ｌ以上のアンフォールディング剤及び２０ミリモル／Ｌ以下の還元剤を加え軽くかきまぜ室温で数時間放置する。
（４）リフォールディング工程：アンフォールディングされたタンパク質溶液に、（Ｉ）又は（ＩＩ）を加えて軽くかき混ぜ、室温で１晩放置しリフォールディングを行う。
（５）分離・取り出し工程：懸濁液から目的とするリフォールディングされたタンパク質をカラムクロマトグラフィーなどによって分離して取り出す。
【００７３】
上記の（１）のタンパク質の培養工程におけるタンパク質生産体としては、以下の細菌細胞、エシェリヒア属菌およびバチルス属菌などが挙げられる。
細菌細胞としては、連鎖球菌属（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）、ブドウ球菌属（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）、エシェリヒア属菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ストレプトミセス属菌（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）及びバチルス属菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞、真菌細胞：例えば酵母細胞及びアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞、昆虫細胞：例えばドロソフィラＳ２（ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａＳ２）、スポドプテラＳｆ９（ＳｐｏｄｏｐｔｅｒａＳｆ９）細胞、動物細胞：例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、Ｈｅｌａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、２９３及びボウズ（Ｂｏｗｓ）メラノーマ細胞、並びに植物細胞等が挙げられる。
エシェリヒア属菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２ＤＨ１〔プロシージング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）６０巻、１６０頁（１９６８年）を参照〕、ＪＭ１０３〔ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）９巻、３０９頁（１９８１年）を参照〕、ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）１２０巻、５１７頁（１９７８年）を参照〕、ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）４１巻、４５９頁（１９６９年）を参照〕、Ｃ６００〔ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）３９巻、４４０頁（１９５４年）を参照〕、ＭＭ２９４〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２１７巻、１１１０頁（１９６８年）を参照〕などが挙げられる。
バチルス属菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）としては、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４〔ジーン、２４巻、２５５頁（１９８３年）を参照〕、２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）９５巻、８７頁（１９８４年）を参照〕などが挙げられる。
【００７４】
組み換えタンパク質の培養方法として、目的タンパク質をコードするｃＤＮＡを含有する発現ベクターは、
（ｉ）目的タンパク産生細胞からメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分離し、該ｍＲＮＡから単鎖のｃＤＮＡを、次に二重鎖ＤＮＡを合成し、該相補ＤＮＡをファージまたはプラスミドに組み込む。
（ｉｉ）得られた組み換えファージ又はプラスミドで宿主を形質転換し、培養後、目的タンパクの一部をコードするＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション、あるいは抗体を用いたイムノアッセイ法により目的とするＤＮＡを含有するファージあるいはプラスミドを単離する。
（ｉｉｉ）その組み換えＤＮＡから目的とするクローン化ＤＮＡを切りだし、該クローン化ＤＮＡ又はその一部を発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することによって製造することができる。
その後、適当な方法により、宿主を発現ベクターで形質転換し培養する。培養は通常１５〜４３℃で３〜２４時間行い、必要により通気、攪拌を加えることもできる。
【００７５】
溶菌工程における溶菌方法としては、超音波による物理的破砕、リゾチーム等の溶菌酵素による処理、界面活性剤等の溶菌剤による処理などのいずれもが使用でき、生産性の観点から溶菌剤による処理が好ましく、有用タンパクを変性させないといった観点から特に特開２００６−３２０３１３号公報記載の溶菌剤による処理が好ましい。
【００７６】
タンパク質の分離・取り出し工程におけるカラムクロマトグラフィーに使用される充填剤としてはシリカ、デキストラン、アガロース、セルロース、アクリルアミド、ビニルポリマーなどが挙げられ、市販品ではＳｅｐｈａｄｅｘシリーズ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌシリーズ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅシリーズ（以上、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、Ｂｉｏ−Ｇｅｌシリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）等があり入手可能である。
【実施例】
【００７７】
以下の実施例により本発明をさらに説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００７８】
製造例１ （アンフォールディング溶液の調製）
タンパク質を一旦アンフォールディングさせるアンフォールディング溶液は、６モル／Ｌの塩酸グアニジン、１０ミリモル／Ｌのジチオスレイトール、１５０ミリモル／Ｌの塩化ナトリウム、５０ミリモル／Ｌのトリス緩衝液（ｐＨ＝８）、１ミリモル／Ｌのエチレンジアミン４酢酸ナトリウムとなるようにそれぞれ加え、滅菌水で溶解し調製した。
【００７９】
実施例１ （リフォールディング剤の調製１）
２０ｍＬ容の滅菌済みバイアル瓶に、１．０モル／Ｌ酢酸ナトリウム、０．１０重量％オレイルアルコールエチレンオキサイド１８モル付加物（「エマルミン１８０」：三洋化成工業製）、５０ミリモル／Ｌのトリス緩衝液（ｐＨ＝８）、３００マイクロモル／Ｌの酸化型グルタチオン、１５０ミリモル／Ｌの還元型グルタチオン（ともに和光純薬製）となるようにそれぞれ加え、滅菌水で溶解しリフォールディング剤（Ｒ−１）を調製した。
【００８０】
実施例２ （リフォールディング剤の調製２）
実施例１において、０．１０重量％オレイルアルコールエチレンオキサイド１８モル付加物の代わりに、０．１０重量％ソルビタンモノオレエートＥＯ付加物（「ＴＷＥＥＮ８０」：和光純薬製）を使用する以外は実施例１と同様に行い、リフォールディング剤（Ｒ−２）を調製した。
【００８１】
実施例３ （リフォールディング剤の調製３）
実施例１において、１．０モル／Ｌ酢酸ナトリウムの代わりに、１．０モル／Ｌリン酸水素２ナトリウム（和光純薬製）を使用する以外は実施例１と同様に行い、リフォールディング剤（Ｒ−３）を調製した。
【００８２】
実施例４ （リフォールディング剤の調製４）
実施例１において、１．０モル／Ｌ酢酸ナトリウムの代わりに、８．０モル／Ｌ酢酸ナトリウムを使用する以外は実施例１と同様に行い、リフォールディング剤（Ｒ−４）を調製した。
【００８３】
実施例５ （リフォールディング剤の調製５）
実施例１において、１．０モル／Ｌ酢酸ナトリウムの代わりに、０．０１３モル／Ｌ酢酸ナトリウムを使用する以外は実施例１と同様に行い、リフォールディング剤（Ｒ−５）を調製した。
【００８４】
実施例６ （リフォールディング剤の調製６）
実施例３において、１．０モル／Ｌリン酸水素２ナトリウムの代わりに、８．０モル／Ｌリン酸水素２ナトリウムを使用する以外は実施例３と同様に行い、リフォールディング剤（Ｒ−６）を調製した。
【００８５】
実施例７ （リフォールディング剤の調製７）
実施例３において、１．０モル／Ｌリン酸水素２ナトリウムの代わりに、０．２７モル／Ｌリン酸水素２ナトリウムを使用する以外は実施例３と同様に行い、リフォールディング剤（Ｒ−７）を調製した。
【００８６】
実施例８ （リフォールディング剤の調製８）
実施例１において、１．０モル／Ｌ酢酸ナトリウムの代わりに１．０モル／Ｌギ酸ナトリウム、０．１０重量％オレイルアルコールエチレンオキサイド１８モル付加物の代わりに０．１０重量％ソルビタンモノラウレートＥＯ付加物（「ＴＷＥＥＮ２０」：和光純薬製）を使用する以外は実施例１と同様に行い、リフォールディング剤（Ｒ−８）を調製した。
【００８７】
実施例９ （リフォールディング剤の調製９）
実施例３において、１．０モル／Ｌリン酸水素２ナトリウムの代わりに１．０モル／Ｌアデノシン１リン酸ナトリウム塩（「ＡＭＰ」：和光純薬製）、０．１０重量％オレイルアルコールエチレンオキサイド１８モル付加物の代わりに０．１０重量％ラウリルアルコールＥＯ１１モル付加物（「エマルミンＮＬ−１１０」：三洋化成工業製）を使用する以外は実施例３と同様に行い、リフォールディング剤（Ｒ−９）を調製した。
【００８８】
実施例１０ （リフォールディング剤の調製１０）
実施例１において、０．１０重量％オレイルアルコールエチレンオキサイド１８モル付加物の代わりに１．３３重量％オレイルアルコールエチレンオキサイド１８モル付加物を使用する以外は実施例１と同様に行い、リフォールディング剤（Ｒ−１０）を調製した。
【００８９】
実施例１１ （リフォールディング剤の調製１１）
実施例１において、０．１０重量％オレイルアルコールエチレンオキサイド１８モル付加物の代わりに０．０１３重量％オレイルアルコールエチレンオキサイド１８モル付加物を使用する以外は実施例１と同様に行い、リフォールディング剤（Ｒ−１１）を調製した。
【００９０】
実施例１２ （リフォールディング剤の調製１２）
実施例３において、０．１０重量％ソルビタンモノオレエートＥＯ付加物の代わりに１．３３重量％ソルビタンモノオレエートＥＯ付加物を使用する以外は実施例１と同様に行い、リフォールディング剤（Ｒ−１２）を調製した。
【００９１】
実施例１３ （リフォールディング剤の調製１３）
実施例３において、０．１０重量％ソルビタンモノオレエートＥＯ付加物の代わりに０．０１３重量％ソルビタンモノオレエートＥＯ付加物を使用する以外は実施例１と同様に行い、リフォールディング剤（Ｒ−１３）を調製した。
【００９２】
比較例１ （比較のリフォールディング剤の調製１）
２０ｍＬ容の滅菌済みバイアル瓶に、１．０モル／Ｌ酢酸ナトリウム、５０ミリモル／Ｌのトリス緩衝液（ｐＨ＝８）となるようにそれぞれ加え、滅菌水で溶解しリフォールディング剤（Ｒ’−１）を調製した。
【００９３】
比較例２ （比較のリフォールディング剤の調製２）
２０ｍＬ容の滅菌済みバイアル瓶に、１．０モル／Ｌリン酸水素２ナトリウム、５０ミリモル／Ｌのトリス緩衝液（ｐＨ＝８）となるようにそれぞれ加え、滅菌水で溶解しリフォールディング剤（Ｒ’−２）を調製した。
【００９４】
比較例３ （比較のリフォールディング剤の調製３）
２０ｍＬ容の滅菌済みバイアル瓶に、０．１０重量％オレイルアルコールエチレンオキサイド１８モル付加物（「エマルミン１８０」：三洋化成工業製）、５０ミリモル／Ｌのトリス緩衝液（ｐＨ＝８）となるようにそれぞれ加え、滅菌水で溶解しリフォールディング剤（Ｒ’−３）を調製した。
【００９５】
比較例４ （比較のリフォールディング剤の調製４）
２０ｍＬ容の滅菌済みバイアル瓶に、１．０モル／Ｌ酢酸ナトリウム、０．１０重量％ラウリル硫酸ナトリウム（和光純薬工業製）、５０ミリモル／Ｌのトリス緩衝液（ｐＨ＝８）となるようにそれぞれ加え、滅菌水で溶解しリフォールディング剤（Ｒ’−４）を調製した。
【００９６】
比較例５ （比較のリフォールディング剤の調製５）
２０ｍＬ容の滅菌済みバイアル瓶に、１．０モル／Ｌ酢酸ナトリウム、０．１０重量％ヤシ油脂肪酸アミドプロピルベタイン（「レボン２０００」：三洋化成工業製）、５０ミリモル／Ｌのトリス緩衝液（ｐＨ＝８）となるようにそれぞれ加え、滅菌水で溶解しリフォールディング剤（Ｒ’−５）を調製した。
【００９７】
比較例６ （比較のリフォールディング剤の調製５）
２０ｍＬ容の滅菌済みバイアル瓶に、１．０モル／Ｌ酢酸ナトリウム、０．１０重量％セチルトリメチルアンモニウム（和光純薬工業製）、５０ミリモル／Ｌのトリス緩衝液（ｐＨ＝８）となるようにそれぞれ加え、滅菌水で溶解しリフォールディング剤（Ｒ’−６）を調製した。
【００９８】
実施例１４
１．５ｍＬ容の滅菌済みエッペンドルフチューブに、２ｍｇのリゾチーム（「塩化リゾチーム」ナカライテスク社製：以下、同様のものを使用）及び製造例１で調整したアンフォールディング溶液を１ｍＬ加えて、４℃で１晩放置しリゾチームをアンフォールディングさせた。
このアンフォールディングされたタンパク質溶液０．２５ｍＬに、実施例１で調整したリフォールディング剤（Ｒ−１）を０．７５ｍＬ加えて｛系中の化合物（Ｃ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ；系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０．０７５重量％｝、４℃で１晩放置してリフォールディングを行った。
【００９９】
実施例１５
実施例１４において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ−２）を使用する以外は実施例１４と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ｃ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０．０７５重量％）
【０１００】
実施例１６
実施例１４において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ−３）を使用する以外は実施例１４と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ａ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０．０７５重量％）
【０１０１】
実施例１７
実施例１４において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ−４）を使用する以外は実施例１４と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ｃ）の濃度＝６．０モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０．０７５重量％）
【０１０２】
実施例１８
実施例１４において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ−５）を使用する以外は実施例１４と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ｃ）の濃度＝０．０１モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０．０７５重量％）
【０１０３】
実施例１９
実施例１４において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ−６）を使用する以外は実施例１４と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ａ）の濃度＝６．０モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０．０７５重量％）
【０１０４】
実施例２０
実施例１４において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ−７）を使用する以外は実施例１４と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ａ）の濃度＝０．２モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０．０７５重量％）
【０１０５】
実施例２１
実施例１４において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ−８）を使用する以外は実施例１４と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ｃ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０．０７５重量％）
【０１０６】
実施例２２
実施例１４において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ−９）を使用する以外は実施例１４と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ａ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０．０７５重量％）
【０１０７】
実施例２３
実施例１４において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ−１０）を使用する以外は実施例１４と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ｃ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝１．０重量％）
【０１０８】
実施例２４
実施例１４において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ−１０）を使用する以外は実施例１４と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ｃ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０．０１重量％）
【０１０９】
実施例２５
実施例１４において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ−１０）を使用する以外は実施例１４と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ａ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝１．０重量％）
【０１１０】
実施例２６
実施例１４において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ−１０）を使用する以外は実施例１４と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ａ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０．０１重量％）
【０１１１】
比較例７
実施例１４において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ’−１）を使用する以外は実施例１４と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ｃ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０重量％）
【０１１２】
比較例８
実施例１４において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ’−２）を使用する以外は実施例１４と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ａ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０重量％）
【０１１３】
比較例９
実施例１４において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ’−３）を使用する以外は実施例１４と同様におこないリフォールディングを行った。系中の化合物（Ａ）と（Ｃ）の濃度＝０モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０．０７５重量％）
【０１１４】
比較例１０
実施例１４において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ’−４）を使用する以外は実施例１４と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ｃ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０重量％）
【０１１５】
比較例１１
実施例１４において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ’−５）を使用する以外は実施例１４と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ｃ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０重量％）
【０１１６】
比較例１２
実施例１４において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ’−６）を使用する以外は実施例１４と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ｃ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０重量％）
【０１１７】
＜リゾチーム酵素活性の測定＞
１０ｍｌの滅菌済み試験管に０．５重量％濃度の枯草菌溶液を３ｍｌ入れ、実施例１４〜２６又は比較例７〜１２で得られたタンパク質溶液を１０μｌマイクロピペットで加えて軽くかき混ぜた。タンパク質を加えた直後の４５０ｎｍにおける吸光度（Ａ0）を吸光度（４５０ｎｍ）を紫外可視分光光度計（島津製作所製、ＵＶ−２５５０）で測定し、さらにＡ0）を測定して５分後にもう一度吸光度（Ａ5）を測定し、これらの数値から４５０ｎｍにおける５分間の吸光度変化ＤＡ＝Ａ0−Ａ5を算出した。
また、実施例１４〜２６及び比較例７〜１２のリゾチーム濃度と同濃度の市販品「リゾチーム」で他に添加剤を加えないブランクの水溶液を調製し、これを用いて上記と同様に、４５０ｎｍにおける５分間の吸光度変化（ＤＡb）を算出した。
【０１１８】
リフォールディング後の酵素活性は以下の式を用いて算出した。
酵素活性（％）＝（ＤＡ／ＤＡb） ×１００
【０１１９】
上記実施例１４〜２６及び比較例７〜１２の酵素活性を表１に示す。
【０１２０】
【表１】
【０１２１】
表１によると、比較例８のリン含有化合物（Ａ）のみや、比較例７のカルボキシル基含有化合物（Ｃ）のみではリゾチームの凝集を抑えることができない。また、比較例９の非イオン性界面活性剤（Ｂ）のみでは、リゾチームの凝集は抑制できるが、リゾチームがリフォールディングせず活性を示さないため使用できないことが表１からわかる。さらに、比較例１０〜１２のように非イオン性界面活性剤ではなくアニオン性界面活性剤や両性界面活性剤及びカチオン性界面活性剤とカルボキシル基含有化合物との組み合わせでもリゾチームの凝集は抑制できない、もしくは活性が低い。
一方、非イオン性界面活性剤と組み合わせた実施例１４〜２６の本発明のリフォールディング剤は、タンパク質としてのリゾチームの凝集が起きず、高効率にリフォールディングできることがわかる。
【０１２２】
実施例２７
１．５ｍＬ容の滅菌済みエッペンドルフチューブに、２ｍｇのトリプシン（ナカライテスク社製：以下、同様のものを使用）及び製造例１で調整したアンフォールディング溶液を１ｍＬ加えて、４℃で１晩放置しリゾチームをアンフォールディングさせた。
このアンフォールディングされたタンパク質溶液０．２５ｍＬに、実施例１で調整したリフォールディング剤（Ｒ−１）を０．７５ｍＬ加えて｛系中の化合物（Ｃ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ；系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０．０７５重量％｝、４℃で１晩放置してリフォールディングを行った。
【０１２３】
実施例２８
実施例２７において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ−２）を使用する以外は実施例２７と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ｃ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０．０７５重量％）
【０１２４】
実施例２９
実施例２７において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ−３）を使用する以外は実施例２７と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ａ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０．０７５重量％）
【０１２５】
実施例３０
実施例２７において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ−４）を使用する以外は実施例２７と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ｃ）の濃度＝６．０モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０．０７５重量％）
【０１２６】
実施例３１
実施例２７において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ−５）を使用する以外は実施例２７と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ｃ）の濃度＝０．０１モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０．０７５重量％）
【０１２７】
実施例３２
実施例２７において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ−６）を使用する以外は実施例２７と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ａ）の濃度＝６．０モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０．０７５重量％）
【０１２８】
実施例３３
実施例２７において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ−７）を使用する以外は実施例２７と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ａ）の濃度＝０．２モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０．０７５重量％）
【０１２９】
実施例３４
実施例２７において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ−８）を使用する以外は実施例２７と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ｃ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０．０７５重量％）
【０１３０】
実施例３５
実施例２７において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ−９）を使用する以外は実施例２７と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ａ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０．０７５重量％）
【０１３１】
実施例３６
実施例２７において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ−１０）を使用する以外は実施例２７と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ｃ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝１．０重量％）
【０１３２】
実施例３７
実施例２７において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ−１０）を使用する以外は実施例２７と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ｃ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０．０１重量％）
【０１３３】
実施例３８
実施例２７において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ−１０）を使用する以外は実施例２７と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ａ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝１．０重量％）
【０１３４】
実施例３９
実施例２７において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ−１０）を使用する以外は実施例２７と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ａ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０．０１重量％）
【０１３５】
比較例１３
実施例２７において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ’−１）を使用する以外は実施例２７と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ｃ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０重量％）
【０１３６】
比較例１４
実施例２７において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ’−２）を使用する以外は実施例２７と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ａ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０重量％）
【０１３７】
比較例１５
実施例２７において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ’−３）を使用する以外は実施例２７と同様におこないリフォールディングを行った。系中の化合物（Ａ）と（Ｃ）の濃度＝０モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０．０７５重量％）
【０１３８】
比較例１６
実施例２７において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ’−４）を使用する以外は実施例２７と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ｃ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０重量％）
【０１３９】
比較例１７
実施例２７において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ’−５）を使用する以外は実施例２７と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ｃ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０重量％）
【０１４０】
比較例１８
実施例２７において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ’−６）を使用する以外は実施例２７と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ｃ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０重量％）
【０１４１】
＜トリプシン酵素活性の測定＞
１０ｍｌの滅菌済み試験管に０．３５ミリモル／Ｌのアゾコール（東京化成製）溶液を３ｍｌ入れ、実施例２７〜３９又は比較例１３〜１８で得られたタンパク質溶液を１０μｌマイクロピペットで加えて軽くかき混ぜた。タンパク質を加えた直後の５４０ｎｍにおける吸光度（Ａ0）を吸光度（５４０ｎｍ）を紫外可視分光光度計（島津製作所製、ＵＶ−２５５０）で測定し、さらにＡ0を測定して５分後にもう一度吸光度（Ａ5）を測定し、これらの数値から５４０ｎｍにおける５分間の吸光度変化ＤＡ＝Ａ5−Ａ0を算出した。
また、実施例２７〜３９及び比較例１３〜１８のトリプシン濃度と同濃度の市販品「トリプシン」で他に添加剤を加えないブランクの水溶液を調製し、これを用いて上記と同様に、４５０ｎｍにおける５分間の吸光度変化（ＤＡb）を算出した。
【０１４２】
リフォールディング後の酵素活性は以下の式を用いて算出した。
酵素活性（％）＝（ＤＡ／ＤＡb） ×１００
【０１４３】
上記実施例２７〜３９及び比較例１３〜１８の酵素活性を表２に示す。
【０１４４】
【表２】
【０１４５】
表２によると、比較例１４のリン含有化合物（Ａ）のみや、比較例１３のカルボキシル基含有化合物（Ｃ）のみではリゾチームの凝集を抑えることができない。また、比較例１５の非イオン性界面活性剤（Ｂ）のみでは、リゾチームの凝集は抑制できるが、リゾチームがリフォールディングせず活性を示さないため使用できないことが表１からわかる。さらに、比較例１６〜１８のように非イオン性界面活性剤ではなくアニオン性界面活性剤や両性界面活性剤及びカチオン性界面活性剤とカルボキシル基含有化合物との組み合わせでもリゾチームの凝集は抑制できない、もしくは活性が低い。
一方、非イオン性界面活性剤と組み合わせた実施例２７〜３９の本発明のリフォールディング剤は、タンパク質としてのリゾチームの凝集が起きず、高効率にリフォールディングできることがわかる。
【０１４６】
実施例４０
１．５ｍＬ容の滅菌済みエッペンドルフチューブに、２ｍｇのβラクトグロブリン（和光純薬社製：以下、同様のものを使用）及び製造例１で調整したアンフォールディング溶液を１ｍＬ加えて、４℃で１晩放置しβラクトグロブリンをアンフォールディングさせた。
このアンフォールディングされたタンパク質溶液０．２５ｍＬに、実施例１で調整したリフォールディング剤（Ｒ−１）を０．７５ｍＬ加えて｛系中の化合物（Ｃ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ；系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０．０７５重量％｝、４℃で１晩放置してリフォールディングを行った。
【０１４７】
実施例４１
実施例４０において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ−２）を使用する以外は実施例４０と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ｃ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０．０７５重量％）
【０１４８】
実施例４２
実施例４０において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ−３）を使用する以外は実施例４０と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ａ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０．０７５重量％）
【０１４９】
実施例４３
実施例４０において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ−４）を使用する以外は実施例４０と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ｃ）の濃度＝６．０モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０．０７５重量％）
【０１５０】
実施例４４
実施例４０において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ−５）を使用する以外は実施例４０と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ｃ）の濃度＝０．０１モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０．０７５重量％）
【０１５１】
実施例４５
実施例４０において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ−６）を使用する以外は実施例４０と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ａ）の濃度＝６．０モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０．０７５重量％）
【０１５２】
実施例４６
実施例４０において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ−７）を使用する以外は実施例４０と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ａ）の濃度＝０．２モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０．０７５重量％）
【０１５３】
実施例４７
実施例４０において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ−８）を使用する以外は実施例４０と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ｃ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０．０７５重量％）
【０１５４】
実施例４８
実施例４０において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ−９）を使用する以外は実施例４０と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ａ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０．０７５重量％）
【０１５５】
実施例４９
実施例４０において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ−１０）を使用する以外は実施例４０と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ｃ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝１．０重量％）
【０１５６】
実施例５０
実施例４０において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ−１０）を使用する以外は実施例４０と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ｃ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０．０１重量％）
【０１５７】
実施例５１
実施例４０において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ−１０）を使用する以外は実施例４０と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ａ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝１．０重量％）
【０１５８】
実施例５２
実施例４０において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ−１０）を使用する以外は実施例４０と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ａ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０．０１重量％）
【０１５９】
比較例１９
実施例４０において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ’−１）を使用する以外は実施例４０と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ｃ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０重量％）
【０１６０】
比較例２０
実施例４０において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ’−２）を使用する以外は実施例４０と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ａ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０重量％）
【０１６１】
比較例２１
実施例４０において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ’−３）を使用する以外は実施例４０と同様におこないリフォールディングを行った。系中の化合物（Ａ）と（Ｃ）の濃度＝０モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０．０７５重量％）
【０１６２】
比較例２２
実施例４０において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ’−４）を使用する以外は実施例４０と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ｃ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０重量％）
【０１６３】
比較例２３
実施例４０において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ’−５）を使用する以外は実施例４０と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ｃ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０重量％）
【０１６４】
比較例２４
実施例４０において、（Ｒ−１）の代わりに（Ｒ’−６）を使用する以外は実施例４０と同様におこないリフォールディングを行った。（系中の化合物（Ｃ）の濃度＝０．７５モル／Ｌ、系中の化合物（Ｂ）の濃度＝０重量％）
【０１６５】
＜βラクトグロブリンのリフォールディング率の測定＞
実施例４０〜５２又は比較例１９〜２４で得られたタンパク質溶液を４℃で簡易ゲルろ過カラム（「ＰＤ−１０」：ＧＥライフサイエンス社製）を通し精製した。
その後、４℃で陽イオン交換クロマトグラフィー（「ＡＫＴＡエクスプローラー」：ＧＥライフサイエンス社製）にかけ、タンパク質の分離をおこなった。２つピークが出てくる（はじめの活性βＬＧのピークをＰ１、あとの変性βＬＧのピークをＰ２とする）ので、それぞれの２つのピーク面積｛Ｐ１とＰ２のピーク面積（ＳP1、ＳP2）｝を算出した。
【０１６６】
リフォールディング率は以下の式を用いて算出した。
酵素活性（％）＝｛ＳP1／（ＳP1＋ＳP2）｝ ×１００
【０１６７】
上記実施例４０〜５２及び比較例１９〜２４の酵素活性を表３に示す。
【０１６８】
【表３】
【０１６９】
表３によると、比較例２０のリン含有化合物（Ａ）のみや、比較例１９のカルボキシル基含有化合物（Ｃ）のみではリゾチームの凝集を抑えることができない。また、比較例２１の非イオン性界面活性剤（Ｂ）のみでは、リゾチームの凝集は抑制できるが、リゾチームがリフォールディングせず活性を示さないため使用できないことが表１からわかる。さらに、比較例２２〜２４のように非イオン性界面活性剤ではなくアニオン性界面活性剤や両性界面活性剤及びカチオン性界面活性剤とカルボキシル基含有化合物との組み合わせでもリゾチームの凝集は抑制できない、もしくは活性が低い。
一方、非イオン性界面活性剤と組み合わせた実施例４０〜５２の本発明のリフォールディング剤は、タンパク質としてのリゾチームの凝集が起きず、高効率にリフォールディングできることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【０１７０】
本発明のリフォールディング剤、およびタンパク質の製造方法を用いると、有用な各種のタンパク質を、凝集させること無く、高収率で、かつ効率よく産生することができる。
本発明のタンパク質産生方法で得られるタンパク質としては、酵素、組み換えタンパク質などが挙げられる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンフォールディングされたタンパク質のリフォールディング剤であって、一般式（１）で示される基を有するリン含有化合物（Ａ）と非イオン性界面活性剤（Ｂ）を必須成分とするリフォールディング剤（Ｉ）。
【化１】
【請求項２】
リフォールディング工程において系中のリン含有化合物（Ａ）の濃度として０．２〜６モル／Ｌで使用される請求項１に記載のリフォールディング剤。
【請求項３】
リン含有化合物（Ａ）が、無機リン酸、アルキルリン酸エステル、糖リン酸エステル及びそれらの塩からなる群から選ばれる１種以上である請求項１又は２に記載のリフォールディング剤。
【請求項４】
リン含有化合物（Ａ）が、リン酸、ピロリン酸、ポリリン酸、アデノシン３リン酸、アデノシン２リン酸、アデノシン１リン酸及びそれらの塩からなる群から選ばれる１種以上である請求項１〜３のいずれかに記載のリフォールディング剤。
【請求項５】
アンフォールディングされたタンパク質のリフォールディング剤であって、カルボキシル基、カルボキシレートアニオン基及びエステル基からなる群から選ばれる１種以上の基を有するオキシカルボニル基含有化合物（Ｃ）と非イオン性界面活性剤（Ｂ）を必須成分とするリフォールディング剤（ＩＩ）。
【請求項６】
リフォールディング工程において系中のオキシカルボニル基含有化合物（Ｃ）の濃度として０．０１〜６モル／Ｌで使用される請求項５に記載のリフォールディング剤。
【請求項７】
オキシカルボニル基含有化合物（Ｃ）が、分子中に少なくとも１個のカルボキシル基若しくはカルボキシレートアニオン基を有する化合物である請求項５又は６に記載のリフォールディング剤。
【請求項８】
オキシカルボニル基含有化合物（Ｃ）が、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、乳酸、酒石酸及びそれらの塩からなる群から選ばれる１種以上である請求項５〜７のいずれかに記載のリフォールディング剤。
【請求項９】
非イオン性界面活性剤（Ｂ）が高級アルコールアルキレンオキサイド付加物及び／又は多価アルコールのアルキレンオキサイド付加物である請求項１〜８のいずれかに記載のリフォールディング剤。
【請求項１０】
リフォールディング工程において系中の非イオン性界面活性剤（Ｂ）の濃度として０．０１〜１重量％で使用される請求項１〜９のいずれかに記載のリフォールディング剤。
【請求項１１】
タンパク質が、分子内にＳ−Ｓ結合を含むタンパク質である請求項１〜１０のいずれかに記載のリフォールディング剤。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれかに記載のリフォールディング剤でタンパク質をリフォールディングする工程を含むタンパク質の製造方法。
【請求項１】
アンフォールディングされたタンパク質のリフォールディング剤であって、一般式（１）で示される基を有するリン含有化合物（Ａ）と非イオン性界面活性剤（Ｂ）を必須成分とするリフォールディング剤（Ｉ）。
【化１】
【請求項２】
リフォールディング工程において系中のリン含有化合物（Ａ）の濃度として０．２〜６モル／Ｌで使用される請求項１に記載のリフォールディング剤。
【請求項３】
リン含有化合物（Ａ）が、無機リン酸、アルキルリン酸エステル、糖リン酸エステル及びそれらの塩からなる群から選ばれる１種以上である請求項１又は２に記載のリフォールディング剤。
【請求項４】
リン含有化合物（Ａ）が、リン酸、ピロリン酸、ポリリン酸、アデノシン３リン酸、アデノシン２リン酸、アデノシン１リン酸及びそれらの塩からなる群から選ばれる１種以上である請求項１〜３のいずれかに記載のリフォールディング剤。
【請求項５】
アンフォールディングされたタンパク質のリフォールディング剤であって、カルボキシル基、カルボキシレートアニオン基及びエステル基からなる群から選ばれる１種以上の基を有するオキシカルボニル基含有化合物（Ｃ）と非イオン性界面活性剤（Ｂ）を必須成分とするリフォールディング剤（ＩＩ）。
【請求項６】
リフォールディング工程において系中のオキシカルボニル基含有化合物（Ｃ）の濃度として０．０１〜６モル／Ｌで使用される請求項５に記載のリフォールディング剤。
【請求項７】
オキシカルボニル基含有化合物（Ｃ）が、分子中に少なくとも１個のカルボキシル基若しくはカルボキシレートアニオン基を有する化合物である請求項５又は６に記載のリフォールディング剤。
【請求項８】
オキシカルボニル基含有化合物（Ｃ）が、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、乳酸、酒石酸及びそれらの塩からなる群から選ばれる１種以上である請求項５〜７のいずれかに記載のリフォールディング剤。
【請求項９】
非イオン性界面活性剤（Ｂ）が高級アルコールアルキレンオキサイド付加物及び／又は多価アルコールのアルキレンオキサイド付加物である請求項１〜８のいずれかに記載のリフォールディング剤。
【請求項１０】
リフォールディング工程において系中の非イオン性界面活性剤（Ｂ）の濃度として０．０１〜１重量％で使用される請求項１〜９のいずれかに記載のリフォールディング剤。
【請求項１１】
タンパク質が、分子内にＳ−Ｓ結合を含むタンパク質である請求項１〜１０のいずれかに記載のリフォールディング剤。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれかに記載のリフォールディング剤でタンパク質をリフォールディングする工程を含むタンパク質の製造方法。
【公開番号】特開２００９−７３８１５（Ｐ２００９−７３８１５Ａ）
【公開日】平成２１年４月９日（２００９．４．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１９４６９８（Ｐ２００８−１９４６９８）
【出願日】平成２０年７月２９日（２００８．７．２９）
【出願人】（０００００２２８８）三洋化成工業株式会社 (1,719)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年４月９日（２００９．４．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年７月２９日（２００８．７．２９）
【出願人】（０００００２２８８）三洋化成工業株式会社 (1,719)
【Ｆターム（参考）】
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