タンパク質の検出・定量方法及びタンパク質の検出・定量用試薬キット
【課題】
生化学や化学実験の経験の乏しい測定者であっても簡易に実施でき、また屋外や現場でも実施できる簡便な手段で、微量のタンパク質の存在を検出し、定量することができる作業性に優れた、簡易で迅速で鋭敏な再現性の高いタンパク質の検出・定量方法を提供することを目的とする。
【解決手段】
測定する試料液にタンパク質変性剤とＴｂイオンを加えて混合してＴｂイオンとタンパク質を配位させ、次いでＣｅイオンを加えて混合した試料溶液を近紫外線で励起したときにタンパク質が存在すると発する可視光部の蛍光で測定する。
生化学や化学実験の経験の乏しい測定者であっても簡易に実施でき、また屋外や現場でも実施できる簡便な手段で、微量のタンパク質の存在を検出し、定量することができる作業性に優れた、簡易で迅速で鋭敏な再現性の高いタンパク質の検出・定量方法を提供することを目的とする。
【解決手段】
測定する試料液にタンパク質変性剤とＴｂイオンを加えて混合してＴｂイオンとタンパク質を配位させ、次いでＣｅイオンを加えて混合した試料溶液を近紫外線で励起したときにタンパク質が存在すると発する可視光部の蛍光で測定する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微量のタンパク質を検出・定量する方法、及びそれらの方法を使ったタンパク質の検出・定量用試薬キットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質とは多数のアミノ酸がアミノ結合によって直線状に繋がったものであり、そのアミノ酸の種類、アミノ酸の数、アミノ酸の配列によってそれぞれが異なる性質をもつ多くの分子種の総称である。タンパク質はそれぞれ固有の機能を有しており、個々のタンパク質の存在の有無やその量を調べることが、疾病の検査や治療など医薬医療分野だけでなく農林畜産水産分野や食品分野においても基礎技術として重要とされてきた。そのためそれらの多くの分子種が混在した試料の中から個々のタンパク質を分離して、検出し、定量する方法が多数考案されてきた。個々のたんぱく質に分離するとそれだけ検出対象であるタンパク質の量は減少する。近年のタンパク質分離技術の発展によりナノグラムレベルの微量のタンパク質を鋭敏に検出・定量できる方法が必要とされるようになり、これまでにいくつかの方策が考案されてきた。
タンパク質の検出方法で一般的な技術の一つはそのアミド結合による２８０ｎｍ近傍の紫外線の吸収（ＵＶ法）で測定する方法である。またタンパク質を特異的に染める染料で染めて透過光あるいは蛍光で検出する方法（ＣＢＢ染色法、銀染色法、ＳＹＰＲＯ Ｒｕｂｂｙ法など）も採られる。また抗原抗体反応を使って特定のたんぱく質を捕捉した後で、その抗体に結合する別の分子種に酵素反応できる機能を付加してその酵素反応によって検出する方法もよく用いられる（イムノアッセイ法、イムノ染色法）。いずれの方法もその感度や操作の煩雑さに問題があり、簡便で、鋭敏な検出方法の開発が望まれている。
【０００３】
鋭敏にタンパク質を検出する技術としては、特許文献１及び特許文献２に記載のタンパク質を蛍光性プローブで標識して蛍光時間分解によって検出する方法がある。さらにビオチン固定化酵素とその基質との特異的結合を利用して検出する方法が特許文献３に記載されている。また簡便にタンパク質を検出する技術としては非特許文献１に記載のＴｂイオンとＧｄイオンとアニオン系界面活性剤を試料に加えてその蛍光を測定する方法、及び非特許文献２に記載ＴｂイオンとＧｄイオンとカチオン系界面活性剤を試料に加えてその蛍光を測定する方法がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】ＷＯ２００３／０７６９３８
【特許文献２】ＷＯ２００７／０２６８０８
【特許文献３】特開２００８−２３７１６３
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Chemical Physics Letters Vol.398 No.4/6 P.343-350(2004)
【非特許文献２】Talanta Vol.76 No.5 P.1047-1052(2008)
【非特許文献３】Dojin News No.116,P.1-7(2005)
【非特許文献４】Inorganic Chemistry Vol.45 No.10,P.4088−4096（2006）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら上記従来の技術においては、以下のような課題を有していた。
（１）（特許文献１）乃至(特許文献３)に記載の技術は、実施するには相当な生化学実験に対する技術素養と熟練と特殊な機器が必要であり、簡便な利用は不可能であるという課題を有していた。
（２）（非特許文献１）及び（非特許文献２）に記載の技術は、その蛍光強度がタンパク質の量に対して一定せず、タンパク質の定量には適さないという課題を有していた。またナノグラム／ｍＬレベルの低いタンパク質濃度に対してはシグナルの強度が低く正確な測定が難しいという課題を有していた。
（３）（非特許文献３）及び（非特許文献４）に記載の技術は希土類のＥｕを用いて生体分子を標識して検出する方法であるが実施するには相当な生化学実験に対する技術素養と熟練と特殊な機器が必要であり、簡便な利用は不可能であるという課題を有していた。
【０００７】
本発明は上記従来の課題を解決するもので、簡単な操作で鋭敏により微量のタンパク質を検出、定量できるタンパク質の検出・定量方法とそれを用いたタンパク質の検出・定量用試薬キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記従来の課題を解決するために本発明のタンパク質の検出方法・定量方法及びそれを用いたタンパク質の検出・定量用試薬キットは、以下の構成を有している。
本発明の請求項１に記載のタンパク質の検出・定量方法は、測定する試料液にタンパク質変性剤とＴｂイオンとＣｅイオンを加えて、近紫外線で励起したときに発する蛍光で測定することを特徴とする構成を有している。
この構成により、以下のような作用が得られる。
（１）タンパク質変性剤によってタンパク質の高次構造が破壊されて、測定試料溶液の中での形状の自由度が増して、加えられたＴｂイオンに配位しやすくなる。タンパク質と配位したＴｂイオンの濃度は測定試料中のタンパク質の濃度に比例する。
（２）Ｔｂイオンはタンパク質と配位することで波長３５０ｎｍ近傍の光線を吸収して可視光領域の蛍光（最大波長５４３ｎｍ）を発するようになる。
（３）Ｃｅイオンは測定試料中で変性したタンパク質とＴｂイオンと同様に配位する。タンパク質と配位したＣｅイオンの濃度は測定試料中のタンパク質の濃度に比例する。
（４）タンパク質と配位したＣｅイオンは波長２５５ｎｍ近傍の紫外線を吸収して３５０ｎｍを最大波長と蛍光を発する。これはタンパク質と配位したＴｂイオンの最大吸収波長（３５０ｎｍ）と同じであるためにＣｅイオンが吸収した励起エネルギーはタンパク質と配位したＴｂイオンに渡される。これによりタンパク質と配位したＴｂイオンは高効率で蛍光を発することができる。
（５）タンパク質が存在すると、近紫外線（波長２２０ｎｍ以上３９０ｎｍ以下）での励起により、高効率で可視光領域に蛍光（最大波長５４３ｎｍ）を発する。この蛍光と励起光の最大波長が離れているために、測定シグナルの分離が容易で、装置を簡略化しやすい上に、測定のノイズが低くなり、精度の高い測定ができる。
（６）測定試料が発する可視光領域の蛍光の強度は試料液中のタンパク質の濃度に比例する。このため蛍光の強度を測定することで微量なタンパク質の検出・定量が可能となる。
【０００９】
ここで測定するタンパク質は測定時の最終濃度で１．０×１０-9ｇ／ｍＬ以上１．０×１０-3ｇ／ｍＬ未満になるように適宜、濃縮あるいは希釈して使用する。１．０×１０-9ｇ／ｍＬ未満では蛍光シグナルが低く測定誤差が大きくなって実用的でない。１．０×１０-3ｇ／ｍＬ以上では液の散乱による測定誤差が大きくなって実用的でない。また測定試料はＴｒｉｓ塩酸やリン酸カリウム／リン酸ナトリウムなどの緩衝液を用いてｐＨを６〜８の中性に保つのが好ましい。測定は０℃〜３０℃で実施するのが好ましい。
【００１０】
ここで、タンパク質変性剤とはタンパク質の高次構造を破壊する薬剤である。タンパク質は個々の種類毎に特有の形状にコンパクトに折り畳まれた構造（高次構造）をとり、その機能を果たしている。しかしタンパク質の検出や定量においてはタンパク質の種類による差異を無くすために、タンパク質の高次構造を壊してその個性を剥ぎ取る必要がある。このタンパク質の高次構造を壊すことをタンパク質の変性と称し、それを起こす薬剤をタンパク質変性剤と称する。酸やアルカリ、塩類、アルコール、界面活性剤など多くの物質に変成作用があることが知られている。
【００１１】
ここで、ＴｂやＣｅは解離したイオンの形で測定試料に加えることができればよく、試料溶液に可溶であれば、塩あるいは水酸化物、酸化物などのいずれの形態で測定試料に加えてもよい。Ｔｂイオンの濃度は１×１０-6Ｍ以上１×１０-3Ｍ以下が好ましい。またＣｅイオンとＴｂイオンの測定試料中のモル濃度比は（Ｔｂイオン１に対して）５以上２０以下が好ましい。
【００１２】
ここで、近紫外線とは波長２００ｎｍ以上３８０ｎｍ未満の光線を指す。配位したＣｅイオンの吸収スペクトルの最大波長が２５５ｎｍであり、発する蛍光の最大波長が３５０ｎｍであるることから励起に用いる近紫外線は波長３５０ｎｍ未満であることが望ましい。また測定したい配位したＴｂイオンの蛍光のピークが５４３ｎｍであることから、励起光の倍光による影響を避けるためは２７０ｎｍ付近での励起は望ましくない。よって好ましくは波長２３０ｎｍ以上２６０ｎｍ未満または波長２８０ｎｍ以上３２０ｎｍ未満の光線で励起することがよい。
【００１３】
本発明の請求項２に記載の発明は、請求項１に記載のタンパク質の検出・定量方法であって、前記タンパク質変性剤がアルキルベンゼンスルホン酸塩又はアルファオレインスルホン酸塩の内いずれか１以上のアニオン系界面活性剤である構成を有している。
この構成により、請求項１の作用に加えて、以下のような作用が得られる。
請求項２に記載のタンパク質変性剤はそのアルキル鎖がタンパク質を安定化する効果をもち、過度な変性を抑え、この測定に適した変性状態とする。タンパク質の変性が不十分であると、その高次構造が保持され、イオンがうまく配位できなくて蛍光強度が下がってしまう。また配位する数が一定せず、その測定誤差が大きくなる。一方、変性が強すぎても、タンパク質の構造が硬直化し、イオンがうまく配位できなくなり蛍光強度が下がる。
このタンパク質変性剤はそのスルホン酸基に由来するマイナス電荷により、タンパク質変性剤が結合したタンパク質の近傍にＴｂイオンやＣｅイオンが近づき易くなり、結果としてこれらのイオンとタンパク質の配位を形成し易くする。
さらにこのタンパク質変性剤がもつベンゼン環が試料溶液中で疎水結合により周りのタンパク分子を集める働きをして、タンパク質の濃度が薄い試料でも十分な数がイオンに配位できるようにする。
【００１４】
ここで、アルキルベンゼンスルホン酸塩としてはドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＳＤＢＳ）などの炭素数１０以上２５以下のアルキル基を有し、ナトリウム塩やカリウム塩が使用できる。アルファオレインスルホン酸塩としてはテトラデセンスルホン酸ナトリウムなどの炭素数１０以上２５以下のナトリウム塩やカリウム塩が使用できる。アニオン系界面活性剤の濃度は測定試料の最終濃度として１×１０-5Ｍ以上１×１０-3Ｍ未満が好ましい。１×１０-3Ｍ以上では蛍光ノイズが増加して測定に適さない。また１×１０-5Ｍ未満では変成作用が十分に作用せず、Ｔｂイオンとタンパク質の配位が少なくなり、蛍光強度が下がるために、測定感度が下がり実用的でない。
【００１５】
本発明の請求項３に記載の発明は、請求項１に記載のタンパク質の検出・定量方法であって、前記タンパク質変性剤がハロゲン化アルキルピリジニウムを含有するカチオン系界面活性剤である構成を有している。
この構成により、請求項１の作用に加え、以下のような作用が得られる。
（１）請求項３に記載のタンパク質変性剤はそのアルキル鎖がタンパク質を安定化する効果をもち、過度な変性を抑え、この測定に適した変性状態とする。タンパク質の変性が不十分であると、その高次構造が保持され、イオンがうまく配位できなくて蛍光強度が下がってしまう。また配位する数が一定せず、その測定誤差が大きくなる。一方、変性が強すぎても、タンパク質の構造が硬直化し、イオンがうまく配位できなくなり蛍光強度が下がる。
（２）このタンパク質変性剤由来のハロゲンイオンの強い電気陰性度により、タンパク質変性剤が結合したタンパク質（プラスに荷電）とともにカチオンであるＴｂイオンやＣｅイオンを集め、これらのイオンを配位し易くする。
（３）生体由来の測定試料には脂質などマイナス電荷を帯びた物質が多く含まれており、タンパク質に付着して相互作用をしていることが多い。このタンパク質変性剤のプラス電荷がそれらのマイナス電荷を帯びた物質と結合するためにタンパク質への付着物が減り、ＴｂイオンやＣｅイオンと配位しやすくなる。
（４）タンパク質の研究ではその実験に応じて様々な界面活性剤を使用するため、測定試料も様々な界面活性剤を含みうる。タンパク質変性剤の使用できる範囲が広がることで適用できる試料の範囲が拡大する。
【００１６】
ここで、ハロゲン化アルキルピリジニウムとしては塩化物、臭化物などが使用できる。またアルキル基としては炭素数１０以上２５以下のものが望ましい。例えば臭化ヘキサデシルピリジニウム（ＨＤＰ）などが使用できる。カチオン系界面活性剤の濃度は測定試料の最終濃度として１×１０-5Ｍ以上１×１０-3Ｍ未満が好ましい。１×１０-3Ｍ以上では蛍光ノイズが増加して測定に適さない。また１×１０-5Ｍ未満では変成作用が十分に作用せず、Ｔｂイオンとタンパク質の配位が少なくなり、測定感度が下がり実用的でない。
【００１７】
この構成は非特許文献２とは異なり、Ｔｂイオンに加えるイオンがＣｅイオンである。配位したＣｅイオンの発する蛍光の波長は配位したＧｄイオンの発する蛍光の波長よりも配位したＴｂイオンの吸収波長に近い。そのため、励起光のエネルギーが効率よくＴｂイオンに渡される。結果として非特許文献２よりも蛍光シグナルが大きくなり、測定感度と定量精度が高くなる。
【００１８】
本発明の請求項４に記載の発明は、請求項１乃至請求項３の内のいずれか１に記載のタンパク質の検出・定量方法であって、エチルアルコール又はプロピルアルコールなど炭素数２以上６以下のアルコールを加えて蛍光強度を増強して感度を上げた構成を有している。
この構成により、請求項１乃至請求項３の内のいずれか１の作用に加え、以下のような作用が得られる。
（１）アルコールの添加により水とタンパク質の間の相互作用が弱まる。これにより、タンパク質の構造の自由度がさらに高まり、ＴｂイオンやＣｅイオンとの配位がさらに容易となる。またアルコールが測定試料中の水分子を抱え込み、タンパク質とイオン類の濃度が相対的に上昇したこととなる。これらの相乗作用によってシグナルの強度が上昇し検出感度と検出精度が上る。
【００１９】
ここで、添加するアルコールの量は測定時の最終濃度で１×１０-6Ｍ以上５×１０-4Ｍ未満が好ましい。アルコールの濃度が１×１０-6Ｍ未満ではアルコールの添加の効果はほとんど見られなくなる。しまう。またアルコール濃度５×１０-4Ｍ以上ではタンパク質の変性が過剰に起こり、Ｔｂイオンとの相互作用が阻害されるため蛍光強度は下がってしまう。
【００２０】
本発明の請求項５に記載の発明は、請求項４に記載のタンパク質の検出・定量の方法であって、前記Ｃｅイオンに代えてＧｄイオンを用いた構成を有している。
この構成より請求項４の作用に加えて以下のような作用が得られる。
（１）加えられたアルコールによりタンパク質と水分子との相互作用が弱まり、残存していた２次構造が破壊され、ペプチド鎖の自由度が高まる。これによりタンパク質がＴｂイオンやＣｅイオンと配位しやすくなる。そのためにタンパク質を検出するシグナル強度が増大し、検出感度と検出精度が上る。
【００２１】
ここで、Ｇｄは解離したイオンの形で測定試料に加えることができればよく、試料溶液に可溶であれば、塩あるいは水酸化物、酸化物などのいずれの形態で測定試料に加えてもよい。またＧｄイオンとＴｂイオンの測定試料中の濃度比は（Ｔｂイオン１に対して）５以上２０以下が好ましい。
非特許文献１の構成もＴｂイオンとＳＤＢＳであり、感度増強のために使うイオンがＧｄイオンである。Ｇｄイオンの蛍光最大波長３１０ｎｍがＣｅイオンの蛍光最大波長３５０ｎｍと比べてＴｂイオンの吸収最大波長３５０ｎｍから離れているためにエネルギーの受け渡し効率が低くなりタンパク質検出感度が低かった。本発明では、アルコール添加により検出感度を１．５倍から３倍に増強しその感度低下を補っている。
【００２２】
本発明の請求項６に記載の発明は、請求項１乃至請求項５の内のいずれか１に記載のタンパク質の検出・定量の方法であって、試薬の混合順序が、最初にタンパク質変性剤とＴｂイオンを混合し十分に配位させる配位工程と、次いでＣｅイオン又はＧｄイオンを加えて蛍光強度を増強して感度を上げる増感工程とを備えた構成を有している。
この構成により、請求項１乃至請求項５の内いずれか１で得られる作用に加え、以下のような作用が得られる。
（１）Ｔｂイオンが変性したタンパク質と十分に配位したあとで、ＣｅイオンあるいはＧｄイオンが加えられるので、Ｔｂイオンとタンパク質の配位が競合阻害を受けない。これにより後から加えたＣｅイオンあるいはＧｄイオンがその感度増強作用を最大限に果たすことができる。
【００２３】
ここでＴｂイオンを混合した後のタンパク質との配位工程に要する時間は，試料１０ｍｌの場合１０秒以上の混合であればよく、その後で感度増強用のＣｅイオンまたはＧｄイオンを加えればよい。アルコールの添加時期は感度増強用のＣｅイオンまたはＧｄイオンの添加と同時あるいはその後であれば適宜に決めることができる。
【００２４】
本発明の請求項７に記載の発明は、タンパク質の検出・定量用の試薬キットであってタンパク質変性剤として界面活性剤を含む変性液と、Ｔｂイオンを含む配位液と、Ｃｅイオンをを含む増感液との３種類の液を備えた構成を有している。
この構成により、以下のような作用が得られる。
（１）測定者が個別に試薬類を調製することなく、測定試料とキットに含まれる液を指示に従って加えていくだけで、測定準備が完了するので、生化学的な経験や知識が乏しい測定者であっても非常に簡便にタンパク質の検出ができる。
（２）測定の都度に試薬液を調製しないので、毎回同じ条件で測定できる。
（３）標準試料として既知の濃度のタンパク質溶液があれば、それとの比較で簡便にタンパク質の定量ができる。
【００２５】
ここで界面活性剤としては炭素数１０以上２５以下のアルキル基を有するアルキルベンゼンスルホン酸塩や炭素数１０以上２５以下のアルファオレインスルホン酸塩、炭素数１０以上２５以下のハロゲン化アルキルピリジニウムなどが使用できる。例えばドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＳＤＢＳ）、テトラデセンスルホン酸カリウム、臭化ヘキサデシルピリジニウム（ＨＤＰ）などが使用できる。界面活性剤の濃度は測定試料の最終濃度として１×１０-5Ｍ以上１×１０-3Ｍ未満となることが好ましい。
【００２６】
ここでＴｂイオンの濃度は測定試料の最終濃度として１×１０-6Ｍ以上１×１０-3Ｍ以下となることが好ましい。ＣｅイオンとＴｂイオンの測定試料中のモル濃度比は（Ｔｂイオン１に対して）５以上２０以下となることが好ましい。
【００２７】
本発明の請求項８に記載の発明は、請求項７に記載のタンパク質の検出・定量用の試薬キットであって、変性液と配位液と増感液との３種類の液の内のいずれか２以上があらかじめ混合されていることを特徴とする構成を有している。
この構成により、以下のような作用が得られる。
（１）液の種類が少ないため、経験の乏しい作業者でも混合ミスが少なくなる。
（２）試薬の混合比が一定となるため、再現性の高い結果を得やすくなる。
【００２８】
ここで変性液と配位液を混合したものを測定セルに封入したり、測定基材片に塗布させたものを使用してもよい。測定試料を加えて、増感液を添加するとそのまま測定することが可能となる。
【発明の効果】
【００２９】
以上のように、本発明のタンパク質の検出・定量方法及びそれを用いたタンパク質の検出・定量用試薬キットによれば、以下のような有利な効果が得られる。
請求項１に記載の発明によれば、
（１）簡便な操作で迅速にタンパク質の検出をする方法を提供することができるので、医療・医薬・食品など様々な分野の検査を簡便化できる。
（２）試料中の微量のタンパク質の有無を検出できる方法を提供することができるので人の手や細菌などによる工業製品の汚染の有無の検査が簡便に可能となる。
（３）既存およびこれから開発されるであろうタンパク質の分離技術に対して、その分離された個々のタンパク質を迅速かつ鋭敏に検出・定量できる方法を提供することができるのでライフサイエンス分野の研究開発を促進できる。この発明を用いて病理検査機器や、疾病の検査キットや食品の検査キットなど様々な機器やキットの設計が可能となる。
【００３０】
請求項２に記載の発明によれば、請求項１の効果に加え、
（１）高感度で、迅速なタンパク質の検出・定量の方法とそれに用いる試薬キットを提供することができるので、熟練をした技術者でなくても再現性よく微量なタンパク質の検出・定量が可能となる。
（２）迅速な測定方法とそれに用いる試薬キットを提供することができるので医療や食品など様々な分野での検査が迅速化できる。
【００３１】
請求項３に記載の発明によれば、請求項１の効果に加え、
（１）カチオン系界面活性剤は殺菌作用があるため、医療分野でよく用いられている。そのため細菌検査など感染性の試料に対する測定方法を提供することができる。
【００３２】
請求項４に記載の発明によれば、請求項１乃至３の内の１の効果に加え、
（１）より感度の高いタンパク質の検出・定量の方法を提供することができる。また医療分野などで殺菌・消毒のためにアルコールが含まれている試料も簡便に測定できる方法を提供できる。
【００３３】
請求項５に記載の発明によれば、請求項４の効果に加え、
（１）類似の系で異なる測定方法を提供することができる。これによりさらに別の蛍光シグナルを用いる測定と組み合わせることが可能となり、より高度な研究開発や医療分野での応用が可能となる。
【００３４】
請求項６に記載の発明によれば、請求項１乃至５の内いずれか１の効果に加え、
（１）より高感度で、精度の高い測定方法を提供することができる。この発明を自動化
測定器の設計に組み込めば広く産業界での利用が可能となる。
【００３５】
請求項７に記載の発明によれば、
（１）生化学的手法に不慣れな作業者であっても簡便に、タンパク質の検出・定量が現場等で簡易・迅速に実施できる。これにより製品汚染の検査など広い分野での利用が可能となる。
【００３６】
請求項８に記載の発明よれば、
（１）分析や測定などの細かい作業に不慣れな作業者であっても、簡便に再現性よくタンパク質の検出・定量が実施できる。液数が少ないので携帯するのも楽であり、屋外などでも検査が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】Ｔｂイオン：ＳＤＢＳ：Ｃｅイオン系によるコラーゲン検出時の蛍光スペクトル
【図２】Ｔｂイオン：ＳＤＢＳ：Ｃｅイオン系によるエラスチン検出時の蛍光スペクトル
【図３】Ｔｂイオン：ＳＤＢＳ：Ｃｅイオン系による牛血清アルブミン検出時の蛍光スペクトル
【図４】Ｔｂイオン：ＨＤＰ：Ｃｅイオン系によるタンパク質の検出時の蛍光スペクトル
【図５】Ｔｂイオン：ＳＤＢＳ：Ｇｄイオン：エチルアルコール系によるコラーゲンの検出時の蛍光スペクトル
【図６】Ｔｂイオン：ＳＤＢＳ：Ｃｅイオン系によるコラーゲンの検出時の蛍光スペクトル
【図７】タンパク質の濃度と蛍光強度の関係を示すグラフ
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本発明は微量のタンパク質を検出するものであるので、濃厚な試料の場合は水または緩衝液で適宜希釈して測定する。タンパク質濃度は測定時の最終濃度で１ｎｇ／ｍＬ以上１ｍｇ／ｍＬ以下が望ましい。
本発明で添加するＴｂイオンや界面活性剤、感度増強用のイオン、アルコールは予め最終濃度の５倍から１０００倍濃度で調製しておくと使い易い。
測定用の試料セルに測定試料を一定量入れ、ここに残りの試薬類を添加してよく混合した後で、紫外線で励起し、Ｔｂイオンによる５４３ｎｍの蛍光を測定する。
【実施例】
【００３９】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（実施例１）Ｔｂ：ＳＤＢＳ：Ｃｅ系によるコラーゲンの検出
精製されたタンパク質として安価で手に入れ易いコラーゲン（牛アキレス腱由来）の水溶液を用いた場合について記載する。
コラーゲンを１．０×１０-4ｇ／ｍＬの濃度に溶かしたタンパク質溶液１００μＬを２０ｍＬ試験管に取り、そこに蒸留水７７４０μＬとＴｒｉｓ塩酸緩衝液（５．０×１０-4Ｍ、ｐＨ７．０）１０００μＬと、アニオン系界面活性剤のドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＳＤＢＳ）の水溶液（濃度１．０×１０-3Ｍ）１０００μＬと、ＴｂＣｌ3水溶液（濃度１．０×１０-2Ｍ）１０μＬと、ＣｅＣｌ3水溶液（濃度１．０×１０-2Ｍ）１５０μＬを加えて、ゴム栓をして１０秒間振り混ぜ、蛍光測定セルに移して分光蛍光光度計（ＨＩＴＡＣＨＩ Ｆ−４５００）で蛍光スペクトルを測定した。励起波長は２９０ｎｍを用いた。試料溶液の主要構成要素の最終組成を表1に示す。結果を図1の線１に示す。
【００４０】
（比較例１）実施例１でＳＤＢＳとＣｅイオンを欠いた場合
実施例1に記載の実験条件から表１に記載のとおり構成要素のうちＳＤＢＳとＣｅイオンを欠いた場合について実施例１と同様にして蛍光スペクトルを測定した。試料溶液の主要構成要素の最終組成を表1に示す。結果を図１の線２に示す。
【００４１】
（比較例２）実施例１でコラーゲンとＣｅイオンを欠いた場合
実施例1に記載の実験条件から表１に記載のとおり構成要素のうちコラーゲンとＣｅイオンを欠いた場合について実施例１と同様にして蛍光スペクトルを測定した。試料溶液の主要構成要素の最終組成を表1に示す。結果を図１の線３に示す。
【００４２】
（比較例３）実施例１でＣｅイオンを欠いた場合
実施例1に記載の実験条件から表１に記載のとおり構成要素のうちＣｅイオンを欠いた場合について実施例１と同様にして蛍光スペクトルを測定した。試料溶液の主要構成要素の最終組成を表1に示す。結果を図１の線４に示す。
【００４３】
【表１】
【００４４】
図１の線１に示したようにＴｂ：ＳＤＢＳ：Ｃｅ系ではコラーゲンが存在すると配位したＴｂイオンに由来する４９０ｎｍと５４３ｎｍの蛍光が観察された（実施例１）。一方で構成要素を欠いた比較例１（線２：ＳＤＢＳとＣｅイオンを欠いた場合）、比較例２（線３：タンパク質とＣｅイオンを欠いた場合）、比較例３（線４：Ｃｅイオンを欠いた場合）では４９０ｎｍと５３４ｎｍのどちらにも蛍光のピークは見られなかった。
【００４５】
（実施例２）Ｔｂ：ＳＤＢＳ：Ｃｅ系によるエラスチンの検出
タンパク質としてコラーゲン同様に安価で手に入り易いエラスチン（牛頚部靭帯由来）の水溶液を用いた場合に実施例１と同じ方法で表２に記載の最終濃度実験条件で蛍光スペクトルを測定した。結果を図２の線５に示す。
【００４６】
（比較例４）実施例２でＳＤＢＳとＣｅイオンを欠いた場合
実施例２に記載の実験条件から表２に記載のとおり構成要素のうちＳＤＢＳとＣｅイオンを欠いた場合について実施例２と同様にして蛍光スペクトルを測定した。試料溶液の主要構成要素の最終組成を表２に示す。結果を図２の線６に示す。
【００４７】
（比較例５）実施例２でコラーゲンとＣｅイオンを欠いた場合
実施例２に記載の実験条件から表２に記載のとおり構成要素のうちコラーゲンとＣｅイオンを欠いた場合について実施例２と同様にして蛍光スペクトルを測定した。試料溶液の主要構成要素の最終組成を表２に示す。結果を図２の線７に示す。
【００４８】
（比較例６）実施例２でＣｅイオンを欠いた場合
実施例２に記載の実験条件から表２に記載のとおり構成要素のうちＣｅイオンを欠いた場合について実施例１と同様にして蛍光スペクトルを測定した。試料溶液の主要構成要素の最終組成を表２に示す。結果を図２の線８に示す。
【００４９】
【表２】
【００５０】
図２の線５から明らかなようにＴｂ：ＳＤＢＳ：Ｃｅ系ではタンパク質をエラスチンに代えてもコラーゲンの場合と同じように配位したＴｂイオンに由来する４９０ｎｍと５４３ｎｍにピークをもつ蛍光が観察された（実施例２）。一方で構成要素を欠いた比較例４（線６：界面活性剤とＣｅイオンを欠いた場合）、比較例５（線７：タンパク質とＣｅイオンを欠いた場合）、比較例６（線８：Ｃｅイオンを欠いた場合）では４９０ｎｍと５３４ｎｍのどちらにも蛍光のピークは見られなかった。
【００５１】
（実施例３）Ｔｂ：ＳＤＢＳ：Ｃｅ系による牛血清アルブミンの検出
タンパク質としてコラーゲン同様に安価で手に入り易い牛血清アルブミン（ＢＳＡ）の水溶液を用いた場合に実施例１と同じ方法で表３に記載の最終濃度実験条件で蛍光スペクトルを測定した。結果を図３の線９に示す。
【００５２】
（比較例７）実施例３でＳＤＢＳとＣｅイオンを欠いた場合
実施例３に記載の実験条件から表３に記載のとおり構成要素のうちＳＤＢＳとＣｅイオンを欠いた場合について実施例３と同様にして蛍光スペクトルを測定した。試料溶液の主要構成要素の最終組成を表３に示す。結果を図３の線１０に示す。
【００５３】
（比較例８）実施例３でコラーゲンとＣｅイオンを欠いた場合
実施例３に記載の実験条件から表３に記載のとおり構成要素のうちコラーゲンとＣｅイオンを欠いた場合について実施例３と同様にして蛍光スペクトルを測定した。試料溶液の主要構成要素の最終組成を表３に示す。結果を図３の線１１に示す。
【００５４】
（比較例９）実施例３でＣｅイオンを欠いた場合
実施例３に記載の実験条件から表３に記載のとおり構成要素のうちＣｅイオンを欠いた場合について実施例３と同様にして蛍光スペクトルを測定した。試料溶液の主要構成要素の最終組成を表３に示す。結果を図３の線１２に示す。
【００５５】
【表３】
【００５６】
図３の線９から明らかなようにＴｂ：ＳＤＢＳ：Ｃｅ系ではタンパク質をＢＳＡに代えてもコラーゲンやエラスチンと同じように配位したＴｂイオンに由来する４９０ｎｍと５４３ｎｍにピークをもつ蛍光が観察された（実施例３）。一方で構成要素を欠いた比較例７（線１０：界面活性剤とＣｅイオンを欠いた場合）、比較例８（線１１：タンパク質とＣｅイオンを欠いた場合）、比較例９（線１２：Ｃｅイオンを欠いた場合）では４９０ｎｍと５３４ｎｍのどちらにも蛍光のピークは見られなかった。
【００５７】
Ｔｂ：ＨＤＰ：Ｃｅ系によるたんぱく質の検出
（実施例４）実施例１の界面活性剤をカチオン系界面活性剤臭化ヘキサデシルピリジニウム（ＨＤＰ）に変更して実施例１と同様にＢＳＡの水溶液について蛍光スペクトルを測定した。試料溶液の主要構成要素の最終組成を表４に示す。結果を図４の線１３に示す。
（実施例５）実施例４のタンパク質をＢＳＡからエラスチンに変更して実施例４と同様にして蛍光スペクトルを測定した。試料溶液の主要構成要素の最終組成を表４に示す。結果を図４の線１４に示す。
（実施例６）実施例４のタンパク質をＢＳＡからコラーゲンに変更して実施例４と同様にして蛍光スペクトルを測定した。試料溶液の主要構成要素の最終組成を表４に示す。結果を図４の線１５に示す。
【００５８】
【表４】
【００５９】
図４の線１３（実施例４：ＢＳＡの場合）、線１４（実施例５：エラスチンの場合）、線１５（実施例６コラーゲンの場合）から明らかなように界面活性剤をカチオン系のＨＤＰに変更したＴｂ：ＨＤＰ：Ｃｅ系においてもタンパク質が存在すると配位したＴｂイオンに由来する５４３ｎｍにピークをもつ蛍光が観察され、この系がタンパク質の検出・定量に使用できることが示された。４９０ｎｍの蛍光のピークはＢＳＡでのみ観察された。Ｔｂイオンへのエネルギーの伝達においてＳＤＢＳの場合と違いがあるためと考えられる。
【００６０】
（実施例７）Ｔｂイオン：ＳＤＢＳ：Ｇｄイオン：アルコール系によるコラーゲンの検出
コラーゲン溶液にＴｂイオンと界面活性剤ＳＤＢＳとＧｄイオンを加え混合し、次いでエチルアルコールを最終濃度１．０×１０-4Ｍとなるように加えて混合し、励起波長２９０ｎｍによる蛍光スペクトルを測定した。試料の主要構成要素の最終濃度組成を表５に示す。結果を図５の線１６に示す。
【００６１】
（比較例１０）実施例７からアルコールを欠いた場合
実施例７の実験条件から表５に記載のとおりエチルアルコールを欠いた場合について実施例７と同様に蛍光スペクトルを測定した。主要構成要素の最終濃度組成を表５に示す。結果を図５の線１７に示す。
（比較例１１）実施例７より過剰にアルコールを入れた場合
実施例７の実験条件よりも表５に記載のとおりエチルアルコール過剰に加えた場合について実施例７と同様に蛍光スペクトルを測定した。主要構成要素の最終濃度組成を表５に示す。結果を図５の線１８に示す。
【００６２】
【表５】
【００６３】
図５の線１６で明らかなようにＴｂイオン：ＳＤＢＳ：Ｇｄイオンの系においてエチルアルコールを添加すると（線１６：実施例７）、エチルアルコールを加えない場合（比較線１７：例１０）に比べてＴｂイオンによる５４３ｎｍの蛍光ピークはおよそ３割増大する。エチルアルコールがコラーゲンから水分子を奪うことで未変性で残っていたコラーゲンの高次構造を破壊したことで、ＴｂイオンやＧｄイオンなどと配位できる部位が増えたためと考えられる。
過剰にエチルアルコールを加えた場合（線１８：比較例１１）では逆にＴｂイオンによる５４３ｎｍの蛍光強度は減少した。過剰のエチルアルコールを加えると水分子を奪われた結果としてペプチド鎖の自由度が下がり、ＴｂイオンやＧｄイオンなどに配位できる部位が減るために蛍光強度が下がったと考えられる。この系でコラーゲンの検出の感度を増大するためのエチルアルコールの最適濃度は５．０×１０-5Ｍから５．０×１０-4Ｍの間にあった。
【００６４】
（実施例８）Ｔｂイオン：ＳＤＢＳ：Ｃｅイオン系によるコラーゲン検出に対する試薬の添加順序の効果
コラーゲン溶液にＴｂイオンと界面活性剤ＳＤＢＳを加えて混合した。そのまま２０秒静置してからＣｅイオンを加えて混合して励起波長は２９０ｎｍで蛍光スペクトルを測定した。試料溶液の最終組成を表６に示す。結果を図６の線１９に示す。
（比較例１２）
実施例８とまったく同じ試料と同じ濃度条件において、Ｔｂイオンと界面活性剤を加えるときに同時にＣｅイオンを加えて混合し、そのまま２０秒静置してから実施例８と同様に蛍光スペクトルを測定した。試料溶液の最終組成を表６に示す。結果を図６の線２０に示す。
【００６５】
【表６】
【００６６】
図６の線１９と線２０で明らかなように、Ｔｂイオンとタンパク質の配位を最初にさせて、次いで増強用のＣｅイオンを加えた場合（線１９：実施例８）の方が試薬を同時に混合して測定した場合（線２０：比較例１２）に比べて、配位したＴｂイオンによる５４３ｎｍの蛍光は増大した。先にＴｂイオンとタンパク質を配位させておくと、Ｔｂイオンがタンパク質の殻に覆われたようになり、増強用のＣｅイオンが加えられても、イオンの交換反応が起こりにくなる。そのためタンパク質との配位においてＴｂイオンとＣｅイオンが競合して、配位したＴｂイオンの濃度を下げることがないため蛍光強度が高くなるのに対して、試薬を同時に混合するとタンパク質との配位においてＴｂイオンとＣｅイオンが競合して、配位したＴｂイオンの濃度が下がってしまい蛍光強度が低くなるのだと考えられる。
【００６７】
タンパク質の濃度と蛍光強度の関係
（実施例９）濃度を１．０×１０-6ｇ／ｍＬ、２．０×１０-6ｇ／ｍＬ、４．０×１０-6ｇ／ｍＬと３段階に調製したコラーゲン水溶液を使って実施例１と同様にして波長５４３ｎｍの蛍光強度を測定した。試料溶液の最終濃度組成を表７に示す。測定結果を図７の線２１に示す。
（実施例１０）実施例９においてタンパク質をコラーゲンからエラスチンに変更して、実施例１０と同様にして波長５４３ｎｍの蛍光強度を測定した。試料溶液の最終濃度組成を表７に示す。測定結果を図７の線２２に示す。
（実施例１１）実施例９においてタンパク質をコラーゲンからＢＳＡに変更して、実施例１０と同様にして波長５４３ｎｍの蛍光強度を測定した。試料溶液の最終濃度組成を表７に示す。測定結果を図７の線２３に示す。
（実施例１２）実施例９においてタンパク質をコラーゲンから合成ペプチド１に変更して、実施例１０と同様にして波長５４３ｎｍの蛍光強度を測定した。試料溶液の最終濃度組成を表７に示す。測定結果を図７の線２４に示す。合成ペプチド１のアミノ酸配列はＤＳＲＭＩＡＧＬＫＴＬＨＤである。
（実施例１３）実施例９においてタンパク質をコラーゲンから合成ペプチド２に変更して、実施例１０と同様にして波長５４３ｎｍの蛍光強度を測定した。試料溶液の最終濃度組成を表７に示す。測定結果を図７の線２５に示す。合成ペプチド２のアミノ酸配列はＴＴＴＰＧＴＴＴＡＧＴＴＴＳＲである。
【００６８】
【表７】
【００６９】
図７の線２１から線２５で明らかなように３種のタンパク質と２種の合成ペプチドは、本発明による方法でその濃度に比例した蛍光を発した（線２１：コラーゲンの場合：実施例９）（線２２：エラスチンの場合：実施例１０）（線２３：ＢＳＡの場合：実施例１１）（線２４：合成ペプチド１の場合：実施例１２）（線２５：合成ペプチド２の場合：実施例１３）。タンパク種による違いは明確には認めらず、合成ペプチドからコラーゲンまでほぼ同じ蛍光強度とタンパク質濃度の比例関係を示した。したがってこの測定に用いた試験液をあらかじめ調製してキットとすれば簡便に迅速に再現性よくタンパク質の検出と定量ができることが示された。
【符号の説明】
【００７０】
１ 実施例１の蛍光スペクトル
２ 比較例１の蛍光スペクトル
３ 比較例２の蛍光スペクトル
４ 比較例３の蛍光スペクトル
５ 実施例２の蛍光スペクトル
６ 比較例４の蛍光スペクトル
７ 比較例５の蛍光スペクトル
８ 比較例６の蛍光スペクトル
９ 実施例３の蛍光スペクトル
１０ 比較例７の蛍光スペクトル
１１ 比較例８の蛍光スペクトル
１２ 比較例９の蛍光スペクトル
１３ 実施例４の蛍光スペクトル
１４ 実施例５の蛍光スペクトル
１５ 実施例６の蛍光スペクトル
１６ 実施例７の蛍光スペクトル
１７ 比較例１０の蛍光スペクトル
１８ 比較例１１の蛍光スペクトル
１９ 実施例８の蛍光スペクトル
２０ 比較例１２の蛍光スペクトル
２１ 実施例９の蛍光強度
２２ 実施例１０の蛍光強度
２３ 実施例１１の蛍光強度
２４ 実施例１２の蛍光強度
２５ 実施例１３の蛍光強度
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微量のタンパク質を検出・定量する方法、及びそれらの方法を使ったタンパク質の検出・定量用試薬キットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質とは多数のアミノ酸がアミノ結合によって直線状に繋がったものであり、そのアミノ酸の種類、アミノ酸の数、アミノ酸の配列によってそれぞれが異なる性質をもつ多くの分子種の総称である。タンパク質はそれぞれ固有の機能を有しており、個々のタンパク質の存在の有無やその量を調べることが、疾病の検査や治療など医薬医療分野だけでなく農林畜産水産分野や食品分野においても基礎技術として重要とされてきた。そのためそれらの多くの分子種が混在した試料の中から個々のタンパク質を分離して、検出し、定量する方法が多数考案されてきた。個々のたんぱく質に分離するとそれだけ検出対象であるタンパク質の量は減少する。近年のタンパク質分離技術の発展によりナノグラムレベルの微量のタンパク質を鋭敏に検出・定量できる方法が必要とされるようになり、これまでにいくつかの方策が考案されてきた。
タンパク質の検出方法で一般的な技術の一つはそのアミド結合による２８０ｎｍ近傍の紫外線の吸収（ＵＶ法）で測定する方法である。またタンパク質を特異的に染める染料で染めて透過光あるいは蛍光で検出する方法（ＣＢＢ染色法、銀染色法、ＳＹＰＲＯ Ｒｕｂｂｙ法など）も採られる。また抗原抗体反応を使って特定のたんぱく質を捕捉した後で、その抗体に結合する別の分子種に酵素反応できる機能を付加してその酵素反応によって検出する方法もよく用いられる（イムノアッセイ法、イムノ染色法）。いずれの方法もその感度や操作の煩雑さに問題があり、簡便で、鋭敏な検出方法の開発が望まれている。
【０００３】
鋭敏にタンパク質を検出する技術としては、特許文献１及び特許文献２に記載のタンパク質を蛍光性プローブで標識して蛍光時間分解によって検出する方法がある。さらにビオチン固定化酵素とその基質との特異的結合を利用して検出する方法が特許文献３に記載されている。また簡便にタンパク質を検出する技術としては非特許文献１に記載のＴｂイオンとＧｄイオンとアニオン系界面活性剤を試料に加えてその蛍光を測定する方法、及び非特許文献２に記載ＴｂイオンとＧｄイオンとカチオン系界面活性剤を試料に加えてその蛍光を測定する方法がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】ＷＯ２００３／０７６９３８
【特許文献２】ＷＯ２００７／０２６８０８
【特許文献３】特開２００８−２３７１６３
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Chemical Physics Letters Vol.398 No.4/6 P.343-350(2004)
【非特許文献２】Talanta Vol.76 No.5 P.1047-1052(2008)
【非特許文献３】Dojin News No.116,P.1-7(2005)
【非特許文献４】Inorganic Chemistry Vol.45 No.10,P.4088−4096（2006）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら上記従来の技術においては、以下のような課題を有していた。
（１）（特許文献１）乃至(特許文献３)に記載の技術は、実施するには相当な生化学実験に対する技術素養と熟練と特殊な機器が必要であり、簡便な利用は不可能であるという課題を有していた。
（２）（非特許文献１）及び（非特許文献２）に記載の技術は、その蛍光強度がタンパク質の量に対して一定せず、タンパク質の定量には適さないという課題を有していた。またナノグラム／ｍＬレベルの低いタンパク質濃度に対してはシグナルの強度が低く正確な測定が難しいという課題を有していた。
（３）（非特許文献３）及び（非特許文献４）に記載の技術は希土類のＥｕを用いて生体分子を標識して検出する方法であるが実施するには相当な生化学実験に対する技術素養と熟練と特殊な機器が必要であり、簡便な利用は不可能であるという課題を有していた。
【０００７】
本発明は上記従来の課題を解決するもので、簡単な操作で鋭敏により微量のタンパク質を検出、定量できるタンパク質の検出・定量方法とそれを用いたタンパク質の検出・定量用試薬キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記従来の課題を解決するために本発明のタンパク質の検出方法・定量方法及びそれを用いたタンパク質の検出・定量用試薬キットは、以下の構成を有している。
本発明の請求項１に記載のタンパク質の検出・定量方法は、測定する試料液にタンパク質変性剤とＴｂイオンとＣｅイオンを加えて、近紫外線で励起したときに発する蛍光で測定することを特徴とする構成を有している。
この構成により、以下のような作用が得られる。
（１）タンパク質変性剤によってタンパク質の高次構造が破壊されて、測定試料溶液の中での形状の自由度が増して、加えられたＴｂイオンに配位しやすくなる。タンパク質と配位したＴｂイオンの濃度は測定試料中のタンパク質の濃度に比例する。
（２）Ｔｂイオンはタンパク質と配位することで波長３５０ｎｍ近傍の光線を吸収して可視光領域の蛍光（最大波長５４３ｎｍ）を発するようになる。
（３）Ｃｅイオンは測定試料中で変性したタンパク質とＴｂイオンと同様に配位する。タンパク質と配位したＣｅイオンの濃度は測定試料中のタンパク質の濃度に比例する。
（４）タンパク質と配位したＣｅイオンは波長２５５ｎｍ近傍の紫外線を吸収して３５０ｎｍを最大波長と蛍光を発する。これはタンパク質と配位したＴｂイオンの最大吸収波長（３５０ｎｍ）と同じであるためにＣｅイオンが吸収した励起エネルギーはタンパク質と配位したＴｂイオンに渡される。これによりタンパク質と配位したＴｂイオンは高効率で蛍光を発することができる。
（５）タンパク質が存在すると、近紫外線（波長２２０ｎｍ以上３９０ｎｍ以下）での励起により、高効率で可視光領域に蛍光（最大波長５４３ｎｍ）を発する。この蛍光と励起光の最大波長が離れているために、測定シグナルの分離が容易で、装置を簡略化しやすい上に、測定のノイズが低くなり、精度の高い測定ができる。
（６）測定試料が発する可視光領域の蛍光の強度は試料液中のタンパク質の濃度に比例する。このため蛍光の強度を測定することで微量なタンパク質の検出・定量が可能となる。
【０００９】
ここで測定するタンパク質は測定時の最終濃度で１．０×１０-9ｇ／ｍＬ以上１．０×１０-3ｇ／ｍＬ未満になるように適宜、濃縮あるいは希釈して使用する。１．０×１０-9ｇ／ｍＬ未満では蛍光シグナルが低く測定誤差が大きくなって実用的でない。１．０×１０-3ｇ／ｍＬ以上では液の散乱による測定誤差が大きくなって実用的でない。また測定試料はＴｒｉｓ塩酸やリン酸カリウム／リン酸ナトリウムなどの緩衝液を用いてｐＨを６〜８の中性に保つのが好ましい。測定は０℃〜３０℃で実施するのが好ましい。
【００１０】
ここで、タンパク質変性剤とはタンパク質の高次構造を破壊する薬剤である。タンパク質は個々の種類毎に特有の形状にコンパクトに折り畳まれた構造（高次構造）をとり、その機能を果たしている。しかしタンパク質の検出や定量においてはタンパク質の種類による差異を無くすために、タンパク質の高次構造を壊してその個性を剥ぎ取る必要がある。このタンパク質の高次構造を壊すことをタンパク質の変性と称し、それを起こす薬剤をタンパク質変性剤と称する。酸やアルカリ、塩類、アルコール、界面活性剤など多くの物質に変成作用があることが知られている。
【００１１】
ここで、ＴｂやＣｅは解離したイオンの形で測定試料に加えることができればよく、試料溶液に可溶であれば、塩あるいは水酸化物、酸化物などのいずれの形態で測定試料に加えてもよい。Ｔｂイオンの濃度は１×１０-6Ｍ以上１×１０-3Ｍ以下が好ましい。またＣｅイオンとＴｂイオンの測定試料中のモル濃度比は（Ｔｂイオン１に対して）５以上２０以下が好ましい。
【００１２】
ここで、近紫外線とは波長２００ｎｍ以上３８０ｎｍ未満の光線を指す。配位したＣｅイオンの吸収スペクトルの最大波長が２５５ｎｍであり、発する蛍光の最大波長が３５０ｎｍであるることから励起に用いる近紫外線は波長３５０ｎｍ未満であることが望ましい。また測定したい配位したＴｂイオンの蛍光のピークが５４３ｎｍであることから、励起光の倍光による影響を避けるためは２７０ｎｍ付近での励起は望ましくない。よって好ましくは波長２３０ｎｍ以上２６０ｎｍ未満または波長２８０ｎｍ以上３２０ｎｍ未満の光線で励起することがよい。
【００１３】
本発明の請求項２に記載の発明は、請求項１に記載のタンパク質の検出・定量方法であって、前記タンパク質変性剤がアルキルベンゼンスルホン酸塩又はアルファオレインスルホン酸塩の内いずれか１以上のアニオン系界面活性剤である構成を有している。
この構成により、請求項１の作用に加えて、以下のような作用が得られる。
請求項２に記載のタンパク質変性剤はそのアルキル鎖がタンパク質を安定化する効果をもち、過度な変性を抑え、この測定に適した変性状態とする。タンパク質の変性が不十分であると、その高次構造が保持され、イオンがうまく配位できなくて蛍光強度が下がってしまう。また配位する数が一定せず、その測定誤差が大きくなる。一方、変性が強すぎても、タンパク質の構造が硬直化し、イオンがうまく配位できなくなり蛍光強度が下がる。
このタンパク質変性剤はそのスルホン酸基に由来するマイナス電荷により、タンパク質変性剤が結合したタンパク質の近傍にＴｂイオンやＣｅイオンが近づき易くなり、結果としてこれらのイオンとタンパク質の配位を形成し易くする。
さらにこのタンパク質変性剤がもつベンゼン環が試料溶液中で疎水結合により周りのタンパク分子を集める働きをして、タンパク質の濃度が薄い試料でも十分な数がイオンに配位できるようにする。
【００１４】
ここで、アルキルベンゼンスルホン酸塩としてはドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＳＤＢＳ）などの炭素数１０以上２５以下のアルキル基を有し、ナトリウム塩やカリウム塩が使用できる。アルファオレインスルホン酸塩としてはテトラデセンスルホン酸ナトリウムなどの炭素数１０以上２５以下のナトリウム塩やカリウム塩が使用できる。アニオン系界面活性剤の濃度は測定試料の最終濃度として１×１０-5Ｍ以上１×１０-3Ｍ未満が好ましい。１×１０-3Ｍ以上では蛍光ノイズが増加して測定に適さない。また１×１０-5Ｍ未満では変成作用が十分に作用せず、Ｔｂイオンとタンパク質の配位が少なくなり、蛍光強度が下がるために、測定感度が下がり実用的でない。
【００１５】
本発明の請求項３に記載の発明は、請求項１に記載のタンパク質の検出・定量方法であって、前記タンパク質変性剤がハロゲン化アルキルピリジニウムを含有するカチオン系界面活性剤である構成を有している。
この構成により、請求項１の作用に加え、以下のような作用が得られる。
（１）請求項３に記載のタンパク質変性剤はそのアルキル鎖がタンパク質を安定化する効果をもち、過度な変性を抑え、この測定に適した変性状態とする。タンパク質の変性が不十分であると、その高次構造が保持され、イオンがうまく配位できなくて蛍光強度が下がってしまう。また配位する数が一定せず、その測定誤差が大きくなる。一方、変性が強すぎても、タンパク質の構造が硬直化し、イオンがうまく配位できなくなり蛍光強度が下がる。
（２）このタンパク質変性剤由来のハロゲンイオンの強い電気陰性度により、タンパク質変性剤が結合したタンパク質（プラスに荷電）とともにカチオンであるＴｂイオンやＣｅイオンを集め、これらのイオンを配位し易くする。
（３）生体由来の測定試料には脂質などマイナス電荷を帯びた物質が多く含まれており、タンパク質に付着して相互作用をしていることが多い。このタンパク質変性剤のプラス電荷がそれらのマイナス電荷を帯びた物質と結合するためにタンパク質への付着物が減り、ＴｂイオンやＣｅイオンと配位しやすくなる。
（４）タンパク質の研究ではその実験に応じて様々な界面活性剤を使用するため、測定試料も様々な界面活性剤を含みうる。タンパク質変性剤の使用できる範囲が広がることで適用できる試料の範囲が拡大する。
【００１６】
ここで、ハロゲン化アルキルピリジニウムとしては塩化物、臭化物などが使用できる。またアルキル基としては炭素数１０以上２５以下のものが望ましい。例えば臭化ヘキサデシルピリジニウム（ＨＤＰ）などが使用できる。カチオン系界面活性剤の濃度は測定試料の最終濃度として１×１０-5Ｍ以上１×１０-3Ｍ未満が好ましい。１×１０-3Ｍ以上では蛍光ノイズが増加して測定に適さない。また１×１０-5Ｍ未満では変成作用が十分に作用せず、Ｔｂイオンとタンパク質の配位が少なくなり、測定感度が下がり実用的でない。
【００１７】
この構成は非特許文献２とは異なり、Ｔｂイオンに加えるイオンがＣｅイオンである。配位したＣｅイオンの発する蛍光の波長は配位したＧｄイオンの発する蛍光の波長よりも配位したＴｂイオンの吸収波長に近い。そのため、励起光のエネルギーが効率よくＴｂイオンに渡される。結果として非特許文献２よりも蛍光シグナルが大きくなり、測定感度と定量精度が高くなる。
【００１８】
本発明の請求項４に記載の発明は、請求項１乃至請求項３の内のいずれか１に記載のタンパク質の検出・定量方法であって、エチルアルコール又はプロピルアルコールなど炭素数２以上６以下のアルコールを加えて蛍光強度を増強して感度を上げた構成を有している。
この構成により、請求項１乃至請求項３の内のいずれか１の作用に加え、以下のような作用が得られる。
（１）アルコールの添加により水とタンパク質の間の相互作用が弱まる。これにより、タンパク質の構造の自由度がさらに高まり、ＴｂイオンやＣｅイオンとの配位がさらに容易となる。またアルコールが測定試料中の水分子を抱え込み、タンパク質とイオン類の濃度が相対的に上昇したこととなる。これらの相乗作用によってシグナルの強度が上昇し検出感度と検出精度が上る。
【００１９】
ここで、添加するアルコールの量は測定時の最終濃度で１×１０-6Ｍ以上５×１０-4Ｍ未満が好ましい。アルコールの濃度が１×１０-6Ｍ未満ではアルコールの添加の効果はほとんど見られなくなる。しまう。またアルコール濃度５×１０-4Ｍ以上ではタンパク質の変性が過剰に起こり、Ｔｂイオンとの相互作用が阻害されるため蛍光強度は下がってしまう。
【００２０】
本発明の請求項５に記載の発明は、請求項４に記載のタンパク質の検出・定量の方法であって、前記Ｃｅイオンに代えてＧｄイオンを用いた構成を有している。
この構成より請求項４の作用に加えて以下のような作用が得られる。
（１）加えられたアルコールによりタンパク質と水分子との相互作用が弱まり、残存していた２次構造が破壊され、ペプチド鎖の自由度が高まる。これによりタンパク質がＴｂイオンやＣｅイオンと配位しやすくなる。そのためにタンパク質を検出するシグナル強度が増大し、検出感度と検出精度が上る。
【００２１】
ここで、Ｇｄは解離したイオンの形で測定試料に加えることができればよく、試料溶液に可溶であれば、塩あるいは水酸化物、酸化物などのいずれの形態で測定試料に加えてもよい。またＧｄイオンとＴｂイオンの測定試料中の濃度比は（Ｔｂイオン１に対して）５以上２０以下が好ましい。
非特許文献１の構成もＴｂイオンとＳＤＢＳであり、感度増強のために使うイオンがＧｄイオンである。Ｇｄイオンの蛍光最大波長３１０ｎｍがＣｅイオンの蛍光最大波長３５０ｎｍと比べてＴｂイオンの吸収最大波長３５０ｎｍから離れているためにエネルギーの受け渡し効率が低くなりタンパク質検出感度が低かった。本発明では、アルコール添加により検出感度を１．５倍から３倍に増強しその感度低下を補っている。
【００２２】
本発明の請求項６に記載の発明は、請求項１乃至請求項５の内のいずれか１に記載のタンパク質の検出・定量の方法であって、試薬の混合順序が、最初にタンパク質変性剤とＴｂイオンを混合し十分に配位させる配位工程と、次いでＣｅイオン又はＧｄイオンを加えて蛍光強度を増強して感度を上げる増感工程とを備えた構成を有している。
この構成により、請求項１乃至請求項５の内いずれか１で得られる作用に加え、以下のような作用が得られる。
（１）Ｔｂイオンが変性したタンパク質と十分に配位したあとで、ＣｅイオンあるいはＧｄイオンが加えられるので、Ｔｂイオンとタンパク質の配位が競合阻害を受けない。これにより後から加えたＣｅイオンあるいはＧｄイオンがその感度増強作用を最大限に果たすことができる。
【００２３】
ここでＴｂイオンを混合した後のタンパク質との配位工程に要する時間は，試料１０ｍｌの場合１０秒以上の混合であればよく、その後で感度増強用のＣｅイオンまたはＧｄイオンを加えればよい。アルコールの添加時期は感度増強用のＣｅイオンまたはＧｄイオンの添加と同時あるいはその後であれば適宜に決めることができる。
【００２４】
本発明の請求項７に記載の発明は、タンパク質の検出・定量用の試薬キットであってタンパク質変性剤として界面活性剤を含む変性液と、Ｔｂイオンを含む配位液と、Ｃｅイオンをを含む増感液との３種類の液を備えた構成を有している。
この構成により、以下のような作用が得られる。
（１）測定者が個別に試薬類を調製することなく、測定試料とキットに含まれる液を指示に従って加えていくだけで、測定準備が完了するので、生化学的な経験や知識が乏しい測定者であっても非常に簡便にタンパク質の検出ができる。
（２）測定の都度に試薬液を調製しないので、毎回同じ条件で測定できる。
（３）標準試料として既知の濃度のタンパク質溶液があれば、それとの比較で簡便にタンパク質の定量ができる。
【００２５】
ここで界面活性剤としては炭素数１０以上２５以下のアルキル基を有するアルキルベンゼンスルホン酸塩や炭素数１０以上２５以下のアルファオレインスルホン酸塩、炭素数１０以上２５以下のハロゲン化アルキルピリジニウムなどが使用できる。例えばドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＳＤＢＳ）、テトラデセンスルホン酸カリウム、臭化ヘキサデシルピリジニウム（ＨＤＰ）などが使用できる。界面活性剤の濃度は測定試料の最終濃度として１×１０-5Ｍ以上１×１０-3Ｍ未満となることが好ましい。
【００２６】
ここでＴｂイオンの濃度は測定試料の最終濃度として１×１０-6Ｍ以上１×１０-3Ｍ以下となることが好ましい。ＣｅイオンとＴｂイオンの測定試料中のモル濃度比は（Ｔｂイオン１に対して）５以上２０以下となることが好ましい。
【００２７】
本発明の請求項８に記載の発明は、請求項７に記載のタンパク質の検出・定量用の試薬キットであって、変性液と配位液と増感液との３種類の液の内のいずれか２以上があらかじめ混合されていることを特徴とする構成を有している。
この構成により、以下のような作用が得られる。
（１）液の種類が少ないため、経験の乏しい作業者でも混合ミスが少なくなる。
（２）試薬の混合比が一定となるため、再現性の高い結果を得やすくなる。
【００２８】
ここで変性液と配位液を混合したものを測定セルに封入したり、測定基材片に塗布させたものを使用してもよい。測定試料を加えて、増感液を添加するとそのまま測定することが可能となる。
【発明の効果】
【００２９】
以上のように、本発明のタンパク質の検出・定量方法及びそれを用いたタンパク質の検出・定量用試薬キットによれば、以下のような有利な効果が得られる。
請求項１に記載の発明によれば、
（１）簡便な操作で迅速にタンパク質の検出をする方法を提供することができるので、医療・医薬・食品など様々な分野の検査を簡便化できる。
（２）試料中の微量のタンパク質の有無を検出できる方法を提供することができるので人の手や細菌などによる工業製品の汚染の有無の検査が簡便に可能となる。
（３）既存およびこれから開発されるであろうタンパク質の分離技術に対して、その分離された個々のタンパク質を迅速かつ鋭敏に検出・定量できる方法を提供することができるのでライフサイエンス分野の研究開発を促進できる。この発明を用いて病理検査機器や、疾病の検査キットや食品の検査キットなど様々な機器やキットの設計が可能となる。
【００３０】
請求項２に記載の発明によれば、請求項１の効果に加え、
（１）高感度で、迅速なタンパク質の検出・定量の方法とそれに用いる試薬キットを提供することができるので、熟練をした技術者でなくても再現性よく微量なタンパク質の検出・定量が可能となる。
（２）迅速な測定方法とそれに用いる試薬キットを提供することができるので医療や食品など様々な分野での検査が迅速化できる。
【００３１】
請求項３に記載の発明によれば、請求項１の効果に加え、
（１）カチオン系界面活性剤は殺菌作用があるため、医療分野でよく用いられている。そのため細菌検査など感染性の試料に対する測定方法を提供することができる。
【００３２】
請求項４に記載の発明によれば、請求項１乃至３の内の１の効果に加え、
（１）より感度の高いタンパク質の検出・定量の方法を提供することができる。また医療分野などで殺菌・消毒のためにアルコールが含まれている試料も簡便に測定できる方法を提供できる。
【００３３】
請求項５に記載の発明によれば、請求項４の効果に加え、
（１）類似の系で異なる測定方法を提供することができる。これによりさらに別の蛍光シグナルを用いる測定と組み合わせることが可能となり、より高度な研究開発や医療分野での応用が可能となる。
【００３４】
請求項６に記載の発明によれば、請求項１乃至５の内いずれか１の効果に加え、
（１）より高感度で、精度の高い測定方法を提供することができる。この発明を自動化
測定器の設計に組み込めば広く産業界での利用が可能となる。
【００３５】
請求項７に記載の発明によれば、
（１）生化学的手法に不慣れな作業者であっても簡便に、タンパク質の検出・定量が現場等で簡易・迅速に実施できる。これにより製品汚染の検査など広い分野での利用が可能となる。
【００３６】
請求項８に記載の発明よれば、
（１）分析や測定などの細かい作業に不慣れな作業者であっても、簡便に再現性よくタンパク質の検出・定量が実施できる。液数が少ないので携帯するのも楽であり、屋外などでも検査が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】Ｔｂイオン：ＳＤＢＳ：Ｃｅイオン系によるコラーゲン検出時の蛍光スペクトル
【図２】Ｔｂイオン：ＳＤＢＳ：Ｃｅイオン系によるエラスチン検出時の蛍光スペクトル
【図３】Ｔｂイオン：ＳＤＢＳ：Ｃｅイオン系による牛血清アルブミン検出時の蛍光スペクトル
【図４】Ｔｂイオン：ＨＤＰ：Ｃｅイオン系によるタンパク質の検出時の蛍光スペクトル
【図５】Ｔｂイオン：ＳＤＢＳ：Ｇｄイオン：エチルアルコール系によるコラーゲンの検出時の蛍光スペクトル
【図６】Ｔｂイオン：ＳＤＢＳ：Ｃｅイオン系によるコラーゲンの検出時の蛍光スペクトル
【図７】タンパク質の濃度と蛍光強度の関係を示すグラフ
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本発明は微量のタンパク質を検出するものであるので、濃厚な試料の場合は水または緩衝液で適宜希釈して測定する。タンパク質濃度は測定時の最終濃度で１ｎｇ／ｍＬ以上１ｍｇ／ｍＬ以下が望ましい。
本発明で添加するＴｂイオンや界面活性剤、感度増強用のイオン、アルコールは予め最終濃度の５倍から１０００倍濃度で調製しておくと使い易い。
測定用の試料セルに測定試料を一定量入れ、ここに残りの試薬類を添加してよく混合した後で、紫外線で励起し、Ｔｂイオンによる５４３ｎｍの蛍光を測定する。
【実施例】
【００３９】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（実施例１）Ｔｂ：ＳＤＢＳ：Ｃｅ系によるコラーゲンの検出
精製されたタンパク質として安価で手に入れ易いコラーゲン（牛アキレス腱由来）の水溶液を用いた場合について記載する。
コラーゲンを１．０×１０-4ｇ／ｍＬの濃度に溶かしたタンパク質溶液１００μＬを２０ｍＬ試験管に取り、そこに蒸留水７７４０μＬとＴｒｉｓ塩酸緩衝液（５．０×１０-4Ｍ、ｐＨ７．０）１０００μＬと、アニオン系界面活性剤のドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＳＤＢＳ）の水溶液（濃度１．０×１０-3Ｍ）１０００μＬと、ＴｂＣｌ3水溶液（濃度１．０×１０-2Ｍ）１０μＬと、ＣｅＣｌ3水溶液（濃度１．０×１０-2Ｍ）１５０μＬを加えて、ゴム栓をして１０秒間振り混ぜ、蛍光測定セルに移して分光蛍光光度計（ＨＩＴＡＣＨＩ Ｆ−４５００）で蛍光スペクトルを測定した。励起波長は２９０ｎｍを用いた。試料溶液の主要構成要素の最終組成を表1に示す。結果を図1の線１に示す。
【００４０】
（比較例１）実施例１でＳＤＢＳとＣｅイオンを欠いた場合
実施例1に記載の実験条件から表１に記載のとおり構成要素のうちＳＤＢＳとＣｅイオンを欠いた場合について実施例１と同様にして蛍光スペクトルを測定した。試料溶液の主要構成要素の最終組成を表1に示す。結果を図１の線２に示す。
【００４１】
（比較例２）実施例１でコラーゲンとＣｅイオンを欠いた場合
実施例1に記載の実験条件から表１に記載のとおり構成要素のうちコラーゲンとＣｅイオンを欠いた場合について実施例１と同様にして蛍光スペクトルを測定した。試料溶液の主要構成要素の最終組成を表1に示す。結果を図１の線３に示す。
【００４２】
（比較例３）実施例１でＣｅイオンを欠いた場合
実施例1に記載の実験条件から表１に記載のとおり構成要素のうちＣｅイオンを欠いた場合について実施例１と同様にして蛍光スペクトルを測定した。試料溶液の主要構成要素の最終組成を表1に示す。結果を図１の線４に示す。
【００４３】
【表１】
【００４４】
図１の線１に示したようにＴｂ：ＳＤＢＳ：Ｃｅ系ではコラーゲンが存在すると配位したＴｂイオンに由来する４９０ｎｍと５４３ｎｍの蛍光が観察された（実施例１）。一方で構成要素を欠いた比較例１（線２：ＳＤＢＳとＣｅイオンを欠いた場合）、比較例２（線３：タンパク質とＣｅイオンを欠いた場合）、比較例３（線４：Ｃｅイオンを欠いた場合）では４９０ｎｍと５３４ｎｍのどちらにも蛍光のピークは見られなかった。
【００４５】
（実施例２）Ｔｂ：ＳＤＢＳ：Ｃｅ系によるエラスチンの検出
タンパク質としてコラーゲン同様に安価で手に入り易いエラスチン（牛頚部靭帯由来）の水溶液を用いた場合に実施例１と同じ方法で表２に記載の最終濃度実験条件で蛍光スペクトルを測定した。結果を図２の線５に示す。
【００４６】
（比較例４）実施例２でＳＤＢＳとＣｅイオンを欠いた場合
実施例２に記載の実験条件から表２に記載のとおり構成要素のうちＳＤＢＳとＣｅイオンを欠いた場合について実施例２と同様にして蛍光スペクトルを測定した。試料溶液の主要構成要素の最終組成を表２に示す。結果を図２の線６に示す。
【００４７】
（比較例５）実施例２でコラーゲンとＣｅイオンを欠いた場合
実施例２に記載の実験条件から表２に記載のとおり構成要素のうちコラーゲンとＣｅイオンを欠いた場合について実施例２と同様にして蛍光スペクトルを測定した。試料溶液の主要構成要素の最終組成を表２に示す。結果を図２の線７に示す。
【００４８】
（比較例６）実施例２でＣｅイオンを欠いた場合
実施例２に記載の実験条件から表２に記載のとおり構成要素のうちＣｅイオンを欠いた場合について実施例１と同様にして蛍光スペクトルを測定した。試料溶液の主要構成要素の最終組成を表２に示す。結果を図２の線８に示す。
【００４９】
【表２】
【００５０】
図２の線５から明らかなようにＴｂ：ＳＤＢＳ：Ｃｅ系ではタンパク質をエラスチンに代えてもコラーゲンの場合と同じように配位したＴｂイオンに由来する４９０ｎｍと５４３ｎｍにピークをもつ蛍光が観察された（実施例２）。一方で構成要素を欠いた比較例４（線６：界面活性剤とＣｅイオンを欠いた場合）、比較例５（線７：タンパク質とＣｅイオンを欠いた場合）、比較例６（線８：Ｃｅイオンを欠いた場合）では４９０ｎｍと５３４ｎｍのどちらにも蛍光のピークは見られなかった。
【００５１】
（実施例３）Ｔｂ：ＳＤＢＳ：Ｃｅ系による牛血清アルブミンの検出
タンパク質としてコラーゲン同様に安価で手に入り易い牛血清アルブミン（ＢＳＡ）の水溶液を用いた場合に実施例１と同じ方法で表３に記載の最終濃度実験条件で蛍光スペクトルを測定した。結果を図３の線９に示す。
【００５２】
（比較例７）実施例３でＳＤＢＳとＣｅイオンを欠いた場合
実施例３に記載の実験条件から表３に記載のとおり構成要素のうちＳＤＢＳとＣｅイオンを欠いた場合について実施例３と同様にして蛍光スペクトルを測定した。試料溶液の主要構成要素の最終組成を表３に示す。結果を図３の線１０に示す。
【００５３】
（比較例８）実施例３でコラーゲンとＣｅイオンを欠いた場合
実施例３に記載の実験条件から表３に記載のとおり構成要素のうちコラーゲンとＣｅイオンを欠いた場合について実施例３と同様にして蛍光スペクトルを測定した。試料溶液の主要構成要素の最終組成を表３に示す。結果を図３の線１１に示す。
【００５４】
（比較例９）実施例３でＣｅイオンを欠いた場合
実施例３に記載の実験条件から表３に記載のとおり構成要素のうちＣｅイオンを欠いた場合について実施例３と同様にして蛍光スペクトルを測定した。試料溶液の主要構成要素の最終組成を表３に示す。結果を図３の線１２に示す。
【００５５】
【表３】
【００５６】
図３の線９から明らかなようにＴｂ：ＳＤＢＳ：Ｃｅ系ではタンパク質をＢＳＡに代えてもコラーゲンやエラスチンと同じように配位したＴｂイオンに由来する４９０ｎｍと５４３ｎｍにピークをもつ蛍光が観察された（実施例３）。一方で構成要素を欠いた比較例７（線１０：界面活性剤とＣｅイオンを欠いた場合）、比較例８（線１１：タンパク質とＣｅイオンを欠いた場合）、比較例９（線１２：Ｃｅイオンを欠いた場合）では４９０ｎｍと５３４ｎｍのどちらにも蛍光のピークは見られなかった。
【００５７】
Ｔｂ：ＨＤＰ：Ｃｅ系によるたんぱく質の検出
（実施例４）実施例１の界面活性剤をカチオン系界面活性剤臭化ヘキサデシルピリジニウム（ＨＤＰ）に変更して実施例１と同様にＢＳＡの水溶液について蛍光スペクトルを測定した。試料溶液の主要構成要素の最終組成を表４に示す。結果を図４の線１３に示す。
（実施例５）実施例４のタンパク質をＢＳＡからエラスチンに変更して実施例４と同様にして蛍光スペクトルを測定した。試料溶液の主要構成要素の最終組成を表４に示す。結果を図４の線１４に示す。
（実施例６）実施例４のタンパク質をＢＳＡからコラーゲンに変更して実施例４と同様にして蛍光スペクトルを測定した。試料溶液の主要構成要素の最終組成を表４に示す。結果を図４の線１５に示す。
【００５８】
【表４】
【００５９】
図４の線１３（実施例４：ＢＳＡの場合）、線１４（実施例５：エラスチンの場合）、線１５（実施例６コラーゲンの場合）から明らかなように界面活性剤をカチオン系のＨＤＰに変更したＴｂ：ＨＤＰ：Ｃｅ系においてもタンパク質が存在すると配位したＴｂイオンに由来する５４３ｎｍにピークをもつ蛍光が観察され、この系がタンパク質の検出・定量に使用できることが示された。４９０ｎｍの蛍光のピークはＢＳＡでのみ観察された。Ｔｂイオンへのエネルギーの伝達においてＳＤＢＳの場合と違いがあるためと考えられる。
【００６０】
（実施例７）Ｔｂイオン：ＳＤＢＳ：Ｇｄイオン：アルコール系によるコラーゲンの検出
コラーゲン溶液にＴｂイオンと界面活性剤ＳＤＢＳとＧｄイオンを加え混合し、次いでエチルアルコールを最終濃度１．０×１０-4Ｍとなるように加えて混合し、励起波長２９０ｎｍによる蛍光スペクトルを測定した。試料の主要構成要素の最終濃度組成を表５に示す。結果を図５の線１６に示す。
【００６１】
（比較例１０）実施例７からアルコールを欠いた場合
実施例７の実験条件から表５に記載のとおりエチルアルコールを欠いた場合について実施例７と同様に蛍光スペクトルを測定した。主要構成要素の最終濃度組成を表５に示す。結果を図５の線１７に示す。
（比較例１１）実施例７より過剰にアルコールを入れた場合
実施例７の実験条件よりも表５に記載のとおりエチルアルコール過剰に加えた場合について実施例７と同様に蛍光スペクトルを測定した。主要構成要素の最終濃度組成を表５に示す。結果を図５の線１８に示す。
【００６２】
【表５】
【００６３】
図５の線１６で明らかなようにＴｂイオン：ＳＤＢＳ：Ｇｄイオンの系においてエチルアルコールを添加すると（線１６：実施例７）、エチルアルコールを加えない場合（比較線１７：例１０）に比べてＴｂイオンによる５４３ｎｍの蛍光ピークはおよそ３割増大する。エチルアルコールがコラーゲンから水分子を奪うことで未変性で残っていたコラーゲンの高次構造を破壊したことで、ＴｂイオンやＧｄイオンなどと配位できる部位が増えたためと考えられる。
過剰にエチルアルコールを加えた場合（線１８：比較例１１）では逆にＴｂイオンによる５４３ｎｍの蛍光強度は減少した。過剰のエチルアルコールを加えると水分子を奪われた結果としてペプチド鎖の自由度が下がり、ＴｂイオンやＧｄイオンなどに配位できる部位が減るために蛍光強度が下がったと考えられる。この系でコラーゲンの検出の感度を増大するためのエチルアルコールの最適濃度は５．０×１０-5Ｍから５．０×１０-4Ｍの間にあった。
【００６４】
（実施例８）Ｔｂイオン：ＳＤＢＳ：Ｃｅイオン系によるコラーゲン検出に対する試薬の添加順序の効果
コラーゲン溶液にＴｂイオンと界面活性剤ＳＤＢＳを加えて混合した。そのまま２０秒静置してからＣｅイオンを加えて混合して励起波長は２９０ｎｍで蛍光スペクトルを測定した。試料溶液の最終組成を表６に示す。結果を図６の線１９に示す。
（比較例１２）
実施例８とまったく同じ試料と同じ濃度条件において、Ｔｂイオンと界面活性剤を加えるときに同時にＣｅイオンを加えて混合し、そのまま２０秒静置してから実施例８と同様に蛍光スペクトルを測定した。試料溶液の最終組成を表６に示す。結果を図６の線２０に示す。
【００６５】
【表６】
【００６６】
図６の線１９と線２０で明らかなように、Ｔｂイオンとタンパク質の配位を最初にさせて、次いで増強用のＣｅイオンを加えた場合（線１９：実施例８）の方が試薬を同時に混合して測定した場合（線２０：比較例１２）に比べて、配位したＴｂイオンによる５４３ｎｍの蛍光は増大した。先にＴｂイオンとタンパク質を配位させておくと、Ｔｂイオンがタンパク質の殻に覆われたようになり、増強用のＣｅイオンが加えられても、イオンの交換反応が起こりにくなる。そのためタンパク質との配位においてＴｂイオンとＣｅイオンが競合して、配位したＴｂイオンの濃度を下げることがないため蛍光強度が高くなるのに対して、試薬を同時に混合するとタンパク質との配位においてＴｂイオンとＣｅイオンが競合して、配位したＴｂイオンの濃度が下がってしまい蛍光強度が低くなるのだと考えられる。
【００６７】
タンパク質の濃度と蛍光強度の関係
（実施例９）濃度を１．０×１０-6ｇ／ｍＬ、２．０×１０-6ｇ／ｍＬ、４．０×１０-6ｇ／ｍＬと３段階に調製したコラーゲン水溶液を使って実施例１と同様にして波長５４３ｎｍの蛍光強度を測定した。試料溶液の最終濃度組成を表７に示す。測定結果を図７の線２１に示す。
（実施例１０）実施例９においてタンパク質をコラーゲンからエラスチンに変更して、実施例１０と同様にして波長５４３ｎｍの蛍光強度を測定した。試料溶液の最終濃度組成を表７に示す。測定結果を図７の線２２に示す。
（実施例１１）実施例９においてタンパク質をコラーゲンからＢＳＡに変更して、実施例１０と同様にして波長５４３ｎｍの蛍光強度を測定した。試料溶液の最終濃度組成を表７に示す。測定結果を図７の線２３に示す。
（実施例１２）実施例９においてタンパク質をコラーゲンから合成ペプチド１に変更して、実施例１０と同様にして波長５４３ｎｍの蛍光強度を測定した。試料溶液の最終濃度組成を表７に示す。測定結果を図７の線２４に示す。合成ペプチド１のアミノ酸配列はＤＳＲＭＩＡＧＬＫＴＬＨＤである。
（実施例１３）実施例９においてタンパク質をコラーゲンから合成ペプチド２に変更して、実施例１０と同様にして波長５４３ｎｍの蛍光強度を測定した。試料溶液の最終濃度組成を表７に示す。測定結果を図７の線２５に示す。合成ペプチド２のアミノ酸配列はＴＴＴＰＧＴＴＴＡＧＴＴＴＳＲである。
【００６８】
【表７】
【００６９】
図７の線２１から線２５で明らかなように３種のタンパク質と２種の合成ペプチドは、本発明による方法でその濃度に比例した蛍光を発した（線２１：コラーゲンの場合：実施例９）（線２２：エラスチンの場合：実施例１０）（線２３：ＢＳＡの場合：実施例１１）（線２４：合成ペプチド１の場合：実施例１２）（線２５：合成ペプチド２の場合：実施例１３）。タンパク種による違いは明確には認めらず、合成ペプチドからコラーゲンまでほぼ同じ蛍光強度とタンパク質濃度の比例関係を示した。したがってこの測定に用いた試験液をあらかじめ調製してキットとすれば簡便に迅速に再現性よくタンパク質の検出と定量ができることが示された。
【符号の説明】
【００７０】
１ 実施例１の蛍光スペクトル
２ 比較例１の蛍光スペクトル
３ 比較例２の蛍光スペクトル
４ 比較例３の蛍光スペクトル
５ 実施例２の蛍光スペクトル
６ 比較例４の蛍光スペクトル
７ 比較例５の蛍光スペクトル
８ 比較例６の蛍光スペクトル
９ 実施例３の蛍光スペクトル
１０ 比較例７の蛍光スペクトル
１１ 比較例８の蛍光スペクトル
１２ 比較例９の蛍光スペクトル
１３ 実施例４の蛍光スペクトル
１４ 実施例５の蛍光スペクトル
１５ 実施例６の蛍光スペクトル
１６ 実施例７の蛍光スペクトル
１７ 比較例１０の蛍光スペクトル
１８ 比較例１１の蛍光スペクトル
１９ 実施例８の蛍光スペクトル
２０ 比較例１２の蛍光スペクトル
２１ 実施例９の蛍光強度
２２ 実施例１０の蛍光強度
２３ 実施例１１の蛍光強度
２４ 実施例１２の蛍光強度
２５ 実施例１３の蛍光強度
【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定する試料液にタンパク質変性剤とＴｂイオンとＣｅイオンを加えて、近紫外線で励起したときに発する蛍光で測定することを特徴とするタンパク質の検出・定量方法。
【請求項２】
請求項１に記載のタンパク質の検出及び定量の方法であって、前記タンパク質変性剤がアルキルベンゼンスルホン酸塩又はアルファオレインスルホン酸塩の内いずれか1以上のアニオン系界面活性剤であることを特徴とするタンパク質の検出・定量方法。
【請求項３】
請求項１に記載のタンパク質の検出及び定量の方法であって、前記タンパク質変性剤がハロゲン化アルキルピリジニウムを含有するカチオン系界面活性剤であることを特徴とするタンパク質の検出・定量方法。
【請求項４】
請求項１乃至請求項３のいずれか１に記載のタンパク質の検出及び定量の方法であって、エチルアルコール又はプロピルアルコールなど炭素数２以上６以下のアルコールを加えて蛍光強度を増強して感度を上げたことを特徴とするタンパク質の検出・定量方法。
【請求項５】
請求項４に記載のタンパク質の検出及び定量の方法であって、前記Ｃｅイオンに代えてＧｄイオンを用いたことを特徴とするタンパク質の検出および定量の方法。
【請求項６】
請求項１乃至請求項５の内いずれか１に記載のタンパク質の検出及び定量の方法であって、試薬の混合順序が、最初にタンパク質変性剤とＴｂイオンを混合し十分に配位させる配位工程と、次いでＣｅイオンあるいはＧｄイオンを加えて蛍光強度を増強して感度を上げる増感工程とを備えていることを特徴とするタンパク質の検出・定量方法。
【請求項７】
タンパク質変性剤として界面活性剤を含む変性液と、Ｔｂイオンを含む配位液と、Ｃｅイオンを含む増感液との３種類の液を備えることを特徴とするタンパク質の検出・定量用試薬キット。
【請求項８】
請求項７に記載のタンパク質の検出及び定量の試薬キットであって、前記変性液と前記配位液と前記増感液との３種類の液の内のいずれか２以上があらかじめ混合されていることを特徴とするタンパク質の検出・定量用試薬キット。
【請求項１】
測定する試料液にタンパク質変性剤とＴｂイオンとＣｅイオンを加えて、近紫外線で励起したときに発する蛍光で測定することを特徴とするタンパク質の検出・定量方法。
【請求項２】
請求項１に記載のタンパク質の検出及び定量の方法であって、前記タンパク質変性剤がアルキルベンゼンスルホン酸塩又はアルファオレインスルホン酸塩の内いずれか1以上のアニオン系界面活性剤であることを特徴とするタンパク質の検出・定量方法。
【請求項３】
請求項１に記載のタンパク質の検出及び定量の方法であって、前記タンパク質変性剤がハロゲン化アルキルピリジニウムを含有するカチオン系界面活性剤であることを特徴とするタンパク質の検出・定量方法。
【請求項４】
請求項１乃至請求項３のいずれか１に記載のタンパク質の検出及び定量の方法であって、エチルアルコール又はプロピルアルコールなど炭素数２以上６以下のアルコールを加えて蛍光強度を増強して感度を上げたことを特徴とするタンパク質の検出・定量方法。
【請求項５】
請求項４に記載のタンパク質の検出及び定量の方法であって、前記Ｃｅイオンに代えてＧｄイオンを用いたことを特徴とするタンパク質の検出および定量の方法。
【請求項６】
請求項１乃至請求項５の内いずれか１に記載のタンパク質の検出及び定量の方法であって、試薬の混合順序が、最初にタンパク質変性剤とＴｂイオンを混合し十分に配位させる配位工程と、次いでＣｅイオンあるいはＧｄイオンを加えて蛍光強度を増強して感度を上げる増感工程とを備えていることを特徴とするタンパク質の検出・定量方法。
【請求項７】
タンパク質変性剤として界面活性剤を含む変性液と、Ｔｂイオンを含む配位液と、Ｃｅイオンを含む増感液との３種類の液を備えることを特徴とするタンパク質の検出・定量用試薬キット。
【請求項８】
請求項７に記載のタンパク質の検出及び定量の試薬キットであって、前記変性液と前記配位液と前記増感液との３種類の液の内のいずれか２以上があらかじめ混合されていることを特徴とするタンパク質の検出・定量用試薬キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２０１０−２８６３２６（Ｐ２０１０−２８６３２６Ａ）
【公開日】平成２２年１２月２４日（２０１０．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１３９６８８（Ｐ２００９−１３９６８８）
【出願日】平成２１年６月１０日（２００９．６．１０）
【出願人】（８０２００００３１）財団法人北九州産業学術推進機構 (187)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１２月２４日（２０１０．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年６月１０日（２００９．６．１０）
【出願人】（８０２００００３１）財団法人北九州産業学術推進機構 (187)
【Ｆターム（参考）】
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