ポリペプチド内部の１つ以上の結合部位を部位特異的に遮蔽する方法が開示されている。方法では、該ポリペプチドに少なくとも１つの低分子量水溶性ポリマーを、結合部位が該ポリマーによって隠蔽されるように付着させる。開示した方法による結合部位（例えば、エピトープ）の遮蔽は、該結合部位とその対応受容体との相互作用によって誘導される生物応答を排除するかまたは実質的に減退させ、生物応答をポリペプチドの非隠蔽部分に集中させる。本文中の方法によって製造される医薬製品（例えば、ポリマー修飾抗原およびそれらを含むワクチン組成物）およびそれらの使用は、脊椎動物生体組織、好ましくはヒトまたはヒト以外の商業用もしくは飼育用の獣医学的に重要な哺乳動物のような哺乳類宿主に直接導入されたときに非隠蔽部分に対して特異的免疫応答を誘導し、該哺乳動物体内で選択的免疫防御を発生する。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、結合部位がポリマーによって選択的に隠蔽されるように少なくとも１つの低分子量水溶性ポリマーを部位特異的にポリペプチドに付着させる処理を含むポリペプチド内部の１つ以上の結合部位の遮蔽方法に関する。１つの実施態様では、隠蔽された結合部位がポリペプチド抗原内部のエピトープである。開示された方法による結合部位（例えば、エピトープ）の遮蔽は、該結合部位とその対応受容体との相互作用によって誘導される生物応答を排除するかまたは実質的に減退させる効果を有しており、ポリペプチドの非隠蔽部分に生物応答が集中することを援助する。本発明はさらに、本文中に開示された方法によって製造された医薬製品（例えば、ポリマー修飾抗原およびそれらを含むワクチン組成物）およびそれらの使用に関する。これらは脊椎動物生体組織、好ましくはヒトまたは商業用もしくは飼育用の獣医学的に重要なヒト以外の哺乳動物のような哺乳類宿主に直接的に導入されると、ポリペプチドの非隠蔽部分に特異的免疫応答を誘導し、該哺乳動物体内で選択的免疫防御を生じる。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質内部の生物活性部位またはドメイン（例えば、免疫原性エピトープ）の選択的隠蔽または“遮蔽”の自然発生は、宿主免疫応答を破壊するために病原体が使用する戦略であると説明されてきた。例えば、インフルエンザウイルスの赤血球凝集素（ＨＡ）中で、モノクローナル抗体のエピトープはＮ−結合オリゴ糖鎖によって遮蔽されている（Ｗｉｌｅｙ，Ｄ．Ｃ．ら，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ２８９：３７３−８）。Ｓｋｅｈｅｌおよび共同研究者らは、抗体エピトープの極めて近傍に付加Ｎ−結合オリゴ糖を含むＨＡをもつ変種に対して選択された抗体の存在下のウイルス増殖を証明した（１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：１７７９−８３）。また、ＨＩＶのエンベロープ糖タンパク質のｇｐ１２０サブユニットについては、宿主免疫系による中和を逃れるメカニズムであるグリコシル化によって重要なエピトープが掩蔽されることが詳細に記載されている（たとえば，Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．ら，２００４，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：２３３−６；Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｗ．Ｅ．ａｎｄ Ｒ．Ｃ．Ｄｅｓｒｏｓｉｅｒｓ，２００２，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．５３：４９９−５１８；Ｋｗｏｎｇ，Ｐ．Ｄ．ら，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ ３９３：６４８−５９；およびＷｅｉ，Ｘ．ら，２００３，Ｎａｔｕｒｅ ４２２：３０７−１２）。また、他のＨＩＶエピトープについては構造的隠蔽によって同じ効果が達成されている（Ｋｗｏｎｇ，Ｐ．Ｄ．ら，２００２，Ｎａｔｕｒｅ ４２０：６７８−８２）。この“免疫回避”メカニズムはしばしば、デコイとして作用する免疫優性エピトープの慢性提示という結果を生み、ふつうなら最適防御を確保するより強力な防御エピトープ（“中和”エピトープ）に免疫系が集中することを妨害する。最終的にこのメカニズムはワクチン効果を低下させる一因となるであろう。
【０００３】
糖質もまた非抗原性受容体結合部位を隠蔽できる。例えば、Ｇｏｔｏ，Ｈ．およびＫ．Ｋａｗａｏｋａ（１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：１０２２４−８）は、インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼタンパク質の特異的部化をオリゴ糖側鎖によって隠蔽し、該タンパク質へのプラスミノーゲンの結合を阻止することを提案した。空間的に近接したウイルスの赤血球凝集素を開裂し融合受容能を与えるためにはプラスミノーゲンが必要なので、糖質側鎖はウイルスの感染力を大きく変質させる。
【０００４】
ポリマー遮蔽は、医薬タンパク質の免疫原性を減退させ、望ましくない免疫原性副作用を最小に抑制し、腎濾過経由のクリアランスを減少させることによって最終的に治療効果を改善するために広く使用されている方法である（総説：Ｓｃｈｅｌｌｅｋｅｎｓ，Ｈ．，２００２，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ２４：１７２０−４０参照）。広範囲に応用された治療用タンパク質遮蔽方法では、高分子量（“ＨＭＷ”）の線状または分枝状ポリエチレングリコール（“ＰＥＧ”）鎖を該タンパク質に付着させる（Ｈａｒｒｉｓ，Ｊ．Ｍ．ａｎｄ Ｒ．Ｂ．Ｃｈｅｓｓ，２００３，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．２：２１４−２１；米国特許番号４，１７９，３３７、Ｄａｖｉｓらに許諾）。所望効果はタンパク質の完全隠蔽なので、治療用タンパク質の修飾に使用するＰＥＧ部分は付着対象タンパク質と同等のサイズを有している。
【０００５】
もっと最近には、選択エピトープ特異的にタンパク質を遮蔽する構想が提案され、“イムノフォーカシング”と命名された。この戦略は、タンパク質抗原または免疫原の内部の免疫優性の非中和性エピトープの選択的遮蔽であり、その結果として免疫応答がより強力な中和エピトープに指向および／または集中する（参照：Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．ら，２００４，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：２３３−６；Ｄｅｌｖｅｓ，ＰＪ．ら，１９９７，Ｍｏｌ． Ｍｅｄ．Ｔｏｄａｙ ３：５５−６０；およびＰａｎｔｏｐｈｌｅｔ，Ｒ．ａｎｄ Ｄ．Ｒ．Ｂｕｒｔｏｎ，２００３，Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．９：４６８−７３）。この方法は、上記のような持続性病原体感染症に好都合に展開する複合的免疫回避戦略の対策として開発された。特定例として、Ｇａｒｒｉｔｙ，Ｒ．Ｒ．は、ＨＩＶ ｇｐ１２０のＶ３超可変ループに付加Ｎ−結合グリコシリーション部位を組込んで、該タンパク質に対する抗体応答をかなりシフトさせた（１９９７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：２７９−８９）。Ｐａｎｔｏｐｈｌｅｔ，Ｒ．らによって行われたもっと体系的な研究は、モノマーｇｐ１２０内部に７つのＮ−グリコシレーションモチーフを付加すると、広範な非中和抗体パネルへの結合は完全に排除されるが、中和モノクローナル抗体ｍＡＢ ｂ１２への結合は低効率で維持されることを示した（Ｐａｎｔｏｐｈｌｅｔ，Ｒ．ａｎｄ Ｄ．Ｒ．Ｂｕｒｔｏｎ，２００３，前出 ９：４６８−７３；Ｐａｎｔｏｐｈｌｅｔ，Ｒ．ら，２００３，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：５８８９−９０１）。しかしながら重要なことは、グリコシレーションがＴ細胞認識を必ずしも排除しないことである。実際、Ｔ細胞がグリコシル化ペプチドに結合することは多くの文献に記載されており（参照：たとえば，Ｃｕｄｉｃ，Ｍ．ら，２００２，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１０：３８５９−７０；Ｇｌｉｔｈｅｒｏ， ＡＪ．ら，１９９９，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １０：６３−７４；Ｈａｕｒｕｍ，Ｊ．Ｓ．ら，１９９９，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９０：１４５−５０；Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｄ．Ｃ．ら， １９９４，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９：４２２−３０；およびＲｕｄｄ，Ｐ．Ｍ．ら，２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９１：２３７０−６）、特に、糖質側鎖が短い場合もある（Ｃｕｄｉｃら，２００２，前出；Ｊａｃｋｓｏｎら，１９９４，前出）。従って本発明は、ＳＭＷ ＰＥＧ部分を非限定例とする糖質側鎖以外の低分子量（“ＳＭＷ”）ポリマー部分を結合部位の内部または近傍のペプチド／タンパク質に結合させること（“ＰＥＧ付加”）によるペプチドまたはタンパク質内部の受容体の結合部位の選択的遮蔽に関する。
【０００６】
１９９１年８月２０日付けでＧｅｔｈｉｎｇらに許諾された米国特許番号５，０４１，３７６は、オリゴヌクレオチド突然変異誘発を使用して補足Ｎ−結合オリゴ糖側鎖を部位特異的場所に組込むことによってタンパク質のエピトープを遮蔽する一般的方法を開示している。
【０００７】
それぞれ１９９６年１２月１７日および１９９８年１２月１９日付けでＧａｒｒｉｔｙらに許諾された米国特許番号５，５８５，２５０および５，８５３，７２４は、中和抗体応答がＶ３ループから逸れてタンパク質のより強力な中和部分を指向するようにしたＨＩＶ−１ ｇｐ１２０／１６０のＶ３ループのエピトープ鎮静方法を開示している。
【発明の開示】
【０００８】
本発明は、結合部位がポリマーによって選択的に隠蔽されるように少なくとも１つの低分子量（“ＳＭＷ”）水溶性ポリマーを部位特異的にポリペプチドに付着させる処理を含むポリペプチド内部の１つ以上の結合部位の遮蔽方法に関する。本発明の１つの実施態様では、本文中の方法によって遮蔽される結合部位（すなわち、機能部位）はポリペプチド抗原内部の免疫原性または抗原性エピトープである。選択された結合部位（例えば、エピトープ）の隠蔽は、結合部位とそれらの対応受容体との相互作用によって誘導される望ましくない生物応答（例えば、免疫応答）を排除または減退させ、生物応答を該ポリマー修飾ポリペプチドの非隠蔽部分に集中させる。従って本発明は、少なくとも１つのＳＭＷ水溶性ポリマーを部位特異的にペプチド／ポリペプチドに付着させ、該結合部位／エピトープをポリマーによって選択的に隠蔽するペプチドまたはポリペプチドの結合部位またはエピトープの遮蔽方法に関する。この場合、ペプチド／ポリペプチドは１つ以上の結合部位／エピトープを内包している。ＳＭＷ水溶性ポリマーは、遮蔽すべき結合部位／エピトープの内部または近傍の場所（例えば、アミノ酸）でポリペプチドに付着する。本発明の１つの実施態様では、ポリペプチドへの部位特異的付着によってポリペプチド内部の結合部位を選択的に遮蔽するために使用される低分子量ポリマーが、ポリアルキレンオキシド、ポリアミドアルキレンオキシドおよびそれらの誘導体から選択される。別の実施態様では、低分子量水溶性ポリマーがＰＥＧである。
【０００９】
本発明はさらに、より有益な応答（例えば、中和応答）をタンパク質／ペプチド内部の択一的エピトープに向けさせるために、ポリペプチド抗原内部に存在する免疫優性および／または有益でないエピトープを免疫減衰する方法に関する。この場合、免疫優性および／または有益でないエピトープは抗原に付着した少なくとも１つの低分子量水溶性ポリマーによって選択的に隠蔽される。従って本文中の方法は、免疫応答が免疫由来細胞またはタンパク質による認識がほぼ不可能になった隠蔽エピトープから逸れて、１つ以上の非隠蔽エピトープに集中するという結果を得るために使用される。抗原への部位特異的付着によって抗原内部の有益でないエピトープを選択的に遮蔽するために使用される低分子量ポリマーは、ポリアルキレンオキシド、ポリアミドアルキレンオキシドおよびそれらの誘導体から選択できる。別の実施態様では、低分子量水溶性ポリマーがＰＥＧである。
【００１０】
本発明の１つの特定実施態様は、エピトープがポリマーによって選択的に隠蔽されるように抗原内部の少なくとも１つのアミノ酸残基にＳＭＷ ＰＥＧを非限定例とする少なくとも１つのＳＭＷ水溶性ポリマーを部位特異的に付着させる処理を含むポリペプチド抗原のエピトープ遮蔽方法に関する。この場合、該エピトープは、エンベロープウイルス膜融合タンパク質の内部三量体コイルドコイルモチーフの全部または少なくとも一部分を模倣する共有結合安定化三量体コイルドコイル構造のスカフォールドドメイン内部に局在している。該コイルドコイル構造は、ペプチド間の１つ以上の共有結合によって共有結合的に安定化された３つのキメラペプチドを含み、キメラペプチドのおのおのは、エンベロープウイルス膜融合タンパク質のＮＨ_２−末端ヘプタッドリピートドメインの全部または一部分にらせん相で融合したコイルドコイルの可溶性三量体形態またはその修飾形態を含むスカフォールドドメインを含んでいる。本発明のこの部分の具体的実施態様で、エンベロープウイルス膜融合タンパク質はＨＩＶ ｇｐ４１である。
【００１１】
従って本発明の１つの実施態様は、エピトープがポリマーで選択的に隠蔽されるように少なくとも１つの低分子量水溶性ポリマーをコイルドコイル構造に部位特異的に付着させる処理を含む、ＨＩＶ ｇｐ４１の内部三量体コイルドコイルモチーフの全部または一部分を模倣する共有結合安定化三量体コイルドコイル構造のエピトープの遮蔽方法に関する。別の実施態様で、隠蔽エピトープは、コイルドコイル構造のスカフォールドドメイン内部に局在し、該コイルドコイル構造は３つのキメラペプチドを含み、キメラペプチドのおのおのは、ＨＩＶ ｇｐ４１ ＮＨ_２−末端ヘプタッドリピートドメインの全部または一部分にらせん相で融合したコイルドコイルの可溶性三量体形態またはその修飾形態を含む“スカフォールドドメイン”を有しており、該ペプチドはジスルフィド結合を非限定例とする１つ以上の共有結合または化学選択的結合反応から生じる共有結合のいずれかによって共有結合的に安定化されている。
【００１２】
本発明はまた、本文中の方法によって製造されたポリマー修飾ペプチドまたはタンパク質、それらを含有する医薬／ワクチン組成物、および、哺乳動物体内で選択的免疫防御を誘導するための該医薬／ワクチン組成物による哺乳動物を非限定例とする動物の疾病状態に対する免疫方法に関する。
【００１３】
従って本発明の１つの実施態様は、本文中の方法によってポリマー修飾されたキメラペプチドに関する。該ペプチドは、三量体コイルドコイル構造を生成するように共有結合的に安定化でき、ＨＩＶ ｇｐ４１を非限定例とするエンベロープウイルス膜融合タンパク質（“Ｎ−ペプチド”部分）のＮＨ_２−末端ヘプタッドリピートドメインの全部または一部分にらせん相で融合した三量体コイルドコイル（“スカフォールド”部分）を形成できるα−ヘリカルスカフォールドタンパク質を含むアルファ（“α”）−ヘリカルドメインを含む。ＰＥＧを非限定例とする１つ以上の低分子量ポリマーをスカフォールドドメイン配列内部に局在する選択アミノ酸残基に付着させることによって部位特異的に遮蔽されるのは、少なくとも１つ以上のエピトープを含むこのスカフォールドドメインである。本発明はさらに、本文中に記載した方法によって製造したポリマー修飾キメラペプチドから成る共有結合安定化三量体コイルドコイル構造に関する。該ポリマー修飾コイルドコイルの非限定例は（ＣＣＩＰＮ１７）_３、Ｃ（チオＥＰＮ１７）_３およびＣ（チオＥＰ１７ＧｌｕＮ１７）_３である。
【００１４】
本発明はさらに、特定の疾患または状態（非限定的にヒト免疫不全ウイルス−１感染／ＡＩＤＳを含む）を特異的に認識する免疫応答を誘導するために、脊椎動物生体組織、好ましくはヒトまたは商業用または飼育用の獣医学的に重要なヒト以外の哺乳動物のような哺乳類宿主に直接的に導入できる医薬製品（例えば、ワクチン）、その製造および使用に関する。該医薬製品および／またはその抗原性接合体は、本文中の方法によって製造したポリマー修飾ポリペプチド抗原を含む。
【００１５】
本文中に使用した“ＨＩＶ”は、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２またはＨＩＶ−１および／またはＨＩＶ−２を表す。
【００１６】
本文中に使用した“中和性”はｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞／ウイルスベースアッセイでウイルス感染を防止する抗体の能力を表すために当業界で使用されている。中和活性は該特異的抗体に対するＩＣ_５０値として定量的に測定できる。“中和抗体”または“ＨＩＶ中和抗体”は、少なくとも１つのＨＩＶ単離物を中和するための当業界で承認された感染力アッセイで証明できる。
【００１７】
本文中に使用した“ＰＥＧ”は−ポリエチレングリコール−を表す。
【００１８】
本文中に使用した“ＳＭＷ”は低分子量を表し、“ＨＭＷ”は高分子量を表し、“ＭＷ”は分子量を表す。
【００１９】
本文中に使用した“ＳＰＰＳ”は固相ペプチド合成を表す。
【００２０】
本文中に使用した“Ｍｉｃｈａｅｌ受容体”は求核種（例えば、Ｏ⁻、Ｃ⁻またはＳ⁻）と反応できる分極した求電子性炭素炭素二重結合を含有する化学部分を表す。
【００２１】
本発明は概括的には、特定受容体によって正常に認識されるペプチドまたはタンパク質内部の機能部位の選択的隠蔽または遮蔽方法を記載する。本発明の１つの実施態様では、開示された方法によって隠蔽すべき機能部位（すなわち、結合部位）は、免疫原性または抗原性エピトープ、例えばＴ細胞またはＢ細胞エピトープであり、該エピトープを認識することを阻害される受容体はＴ細胞の抗原受容体または免疫グロブリン分子である。選択されたエピトープの隠蔽は、ペプチド／タンパク質内部の択一的エピトープおよび一般にペプチド／タンパク質の残りの部分全部の免疫原性を損なうことなくペプチド／タンパク質の一部分に対する望ましくない免疫反応性を排除する。ペプチドまたはタンパク質の内部の１つ以上の結合部位（例えば、エピトープ）の選択的隠蔽は、本文中に記載したように、ペプチド／タンパク質内部の１つ以上の適正場所、すなわち、隠蔽すべき結合部位の内部または極めて近傍に１つ以上の低分子量（“ＳＭＷ”）ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）を付着させることによって得られる。本発明の１つの実施態様では、ＳＭＷポリマーは、隠蔽すべき結合部位の内部または極めて近傍の１つ以上のアミノ酸残基に付着できる。該アミノ酸はコード化または非コード化残基でよい。従って本発明は、結合部位がポリマーによって選択的に隠蔽されるように少なくとも１つの低分子量水溶性ポリマーを部位特異的にポリペプチドに付着させる処理を含む、ポリペプチド内部の結合部位の遮蔽方法に関する。結合部位の非限定例はポリペプチド抗原のエピトープである。
【００２２】
上述のように、本文中の方法は、ペプチドまたはタンパク質の内部に局在する受容体結合部位の選択的遮蔽に広く応用できるが、本文中では、免疫グロブリン分子またはＴ細胞受容体によって認識されるペプチドまたはタンパク質内部のエピトープ（すなわち、Ｂ−またはＴ−細胞エピトープ）の選択的遮蔽について本発明を詳細に記載し、その具体例を後述する。しかしながらこの記載は、記載したエピトープの選択的隠蔽方法に本発明を限定するものではない。当業者は、本文中に詳細に記載された方法が、対応受容体による結合部位の認識を防止する目的で対象ペプチドまたはポリペプチド内部の特異的結合部位を選択的に遮蔽するためにどのように修正できるかを理解されるであろう。従って、本文中に使用した“結合部位”は他のタンパク質（例えば、抗体または細胞性受容体）によって認識されるおよび／または相互作用するアミノ酸残基またはそれに付着した糖側鎖を含むペプチドまたはポリペプチドの領域を表す。従って、本発明の一部として記載した方法によって隠蔽された抗原性／免疫原性エピトープは、本文中に定義した“結合部位”を表す。タンパク質性結合部位は、（例えば、触媒活性部位でしばしば観察される）選択的非連続アミノ酸によって生成された適切に折り畳まれたペプチド／ポリペプチドの三次元コンホメーショナル領域または連続アミノ酸の線状エピトープ（例えば、Ｔ細胞エピトープ）を含み得る。
【００２３】
本発明は、機能部位がポリマーによって選択的に隠蔽されるように少なくとも１つの低分子量水溶性ポリマーをペプチド／ポリペプチドに部位特異的に付着させる処理を含むペプチドまたはポリペプチドの機能部位（すなわち、結合部位）の遮蔽方法に関する。本発明の１つの実施態様で、機能部位はポリペプチド抗原内部のエピトープである。従って、本発明の１つの実施態様は、エピトープがポリマーによって選択的に隠蔽されるように少なくとも１つの低分子量水溶性ポリマーを抗原に部位特異的に付着させる処理を含むポリペプチド抗原のエピトープの遮蔽方法に関する。本文中に使用した“エピトープ”という用語は、従来の免疫原性（すなわち、体液性または細胞性応答を誘発する能力）および／または抗原性（すなわち、Ｔ細胞受容体の抗体と特異的に結合する能力）応答を誘発できるタンパク質決定基を包含する。従って、免疫原性エピトープは本発明の一部として記載された方法によって選択的に隠蔽できる多くの種類の結合部位のひとつにすぎない。エピトープが通常はアミノ酸または糖側鎖のような分子の化学的活性表面の集まりから成り、しばしば特異的三次元構造特性および特異的電荷特性を有していることは公知である。コンホメーショナルエピトープとノンコンホメーショナルエピトープとは、変性用溶媒の存在下で前者の結合は消失するが後者の結合は消失しないことによって識別される。
【００２４】
ペプチド／ポリペプチドのエピトープの選択的遮蔽方法は、該ペプチド／ポリペプチドが２つ以上のエピトープを内包し、該エピトープの１つ以上に対する特異的免疫応答が望ましくそれ以外の免疫応答は排除したい場合に特に有用である。従って、本文中の方法は、免疫応答が免疫由来細胞による認識が不能になった隠蔽エピトープから逸れて、１つ以上の望ましい非隠蔽エピトープに集中するという結果を得るために使用される。ペプチド／ポリペプチド内部の適切な場所に低分子量ポリマー分子を付着させて隠蔽エピトープとその免疫細胞受容体（例えば、免疫グロブリン分子）との会合を阻止することによって、エピトープは物理的にも機能的にも有効に遮蔽される。例えば、ポリペプチド抗原（例えば、合成ペプチドまたは病原性タンパク質）は、宿主生物体内で免疫応答を選択的に誘発し該抗原内部の他のエピトープを実質的に排除するような１つ以上の免疫優性エピトープを含有し得る。このような免疫優性エピトープが有益でない免疫応答（例えば、非中和抗体または非保存中和抗体）を誘発し、同じペプチド／タンパク質内部に局在する免疫刺激性の低いエピトープに対する有益な免疫応答が失われるような場合、免疫刺激性の低いエピトープに免疫応答を集中させ、免疫優性エピトープから逸れるようにすることが重要である。従って、本発明の１つの実施態様は、より有益な免疫応答（例えば、中和応答または保存中和応答）がタンパク質／ペプチド内部の択一的エピトープを指向するように有益でない免疫優性エピトープを免疫減衰させることに関する。重要なことは、有益でない免疫応答を誘導するエピトープの遮蔽による無益な免疫応答の免疫減衰が望ましくない応答の完全な排除を必ずしも意味しないことである。
【００２５】
本発明はさらに、本文中の方法によって作製したポリマー修飾ペプチドまたはタンパク質、それらを含有する医薬／ワクチン組成物、哺乳動物体内で選択的免疫防御を誘導するための医薬／ワクチン組成物による疾患状態に対する哺乳動物の免疫方法に関する。従って本発明は、免疫応答を１つのポリペプチドに集中させる方法に関する。この場合、ポリペプチドは免疫応答を誘導できる１つ以上のエピトープを含んでおり、方法は、少なくとも１つのエピトープがポリマーによって選択的に隠蔽され該ポリペプチドに対する免疫応答が該ポリペプチド内部の非遮蔽領域を指向するように、少なくとも１つの低分子量水溶性ポリマーを部位特異的にポリペプチドに付着させる処理を含む。従って本発明は、本文中の方法で少なくとも１つの低分子量水溶性ポリマーをポリペプチドに部位特異的に付着させることによって該ポリペプチド内部の１つ以上のエピトープを選択的に遮蔽することによってポリペプチドに対する免疫応答を変質させる方法に関する。
【００２６】
後出の実施例の項のポリエチレングリコール（“ＰＥＧ”）の使用によって証明されるように、本文中の方法で結合部位またはエピトープを選択的に隠蔽するために使用したポリマーは実質的に直鎖状のポリマーであり、実質的に非免疫原性、無毒性、高度に可溶性で生物活性を有していない。本文中の方法で結合部位またはエピトープを選択的に遮蔽するために使用したポリマーの好ましい実施態様としてＰＥＧを選択した。しかしながらこのポリマーは限定でなく例示目的で使用しただけである。水溶性ポリマーの例は、メトキシポリエチレングリコールのようなポリアルキレングリコールおよびその誘導体、ポリエチレングリコールホモポリマー、ポリプロピレングリコールホモポリマーおよびエチレングリコール−プロピレングリコールコポリマー（ポリマーおよびコポリマーは未置換であるかまたは一端がアルキル基で置換されている）、ヘパリンおよびヘパリンフラグメント、ポリビニルアルコールおよびポリビニルエチルエーテル、ポリビニルピロリドン、アスパルタミド、デキストランおよびデキストリン誘導体、デキストリンおよびデキストリン誘導体でポリオキシエチル化されたポリオールを含む。具体的に記述した水溶性ポリマーの様々な誘導体も本文中の方法に使用できると考えてよい。上記のような水溶性ポリマー、特にＰＥＧのようなポリアルキレンオキシド基材のポリマーは公知である（参照：たとえば，Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｅｄ．Ｊ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，１９９２；Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｅｄｓ．Ｊ．Ｍ． Ｈａｒｒｉｓ ａｎｄ Ｓ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ，ＡＣＳ，１９９７；以下の公開番号を有する国際特許出願公開：ＷＯ ９０／１３５４０，ＷＯ ９２／００７４８，ＷＯ ９２／１６５５５，ＷＯ ９４／０４１９３，ＷＯ９４／１４７５８，ＷＯ ９４／１７０３９，ＷＯ ９４／１８２４７，ＷＯ ９４／２８９３７，ＷＯ ９５／１１９２４，ＷＯ ９６／０００８０，ＷＯ ９６／２３７９４，ＷＯ ９８／０７７１３，ＷＯ ９８／４１５６２，ＷＯ ９８／４８８３７，ＷＯ ９９／３０７２７，ＷＯ ９９／３２１３４，ＷＯ ９９／３３４８３，ＷＯ ９９／５３９５１，ＷＯ ０１／２６６９２，ＷＯ ９５／１３３１２，ＷＯ ９６／２１４６９，ＷＯ ９７／０３１０６，ＷＯ ９９／４５９６４；次の米国特許：４，１７９，３３７；５，０７５，０４６；５，０８９，２６１；５，１００，９９２；５，１３４，１９２；５，１６６，３０９；５，１７１，２６４；５，２１３，８９１；５，２１９，５６４；５，２７５，８３８；５，２８１，６９８；５，２９８，６４３；５，３１２，８０８；５，３２１，０９５；５，３２４，８４４；５，３４９，００１；５，３５２，７５６；５，４０５，８７７；５，４５５０２７；５，４４６，０９０；５，４７０，８２９；５，４７８，８０５；５，５６７，４２２；５，６０５，９７６；５，６１２，４６０；５，６１４，５４９；５，６１８，５２８；５，６７２，６６２；５，６３７，７４９；５，６４３，５７５；５，６５０，３８８；５，６８１，５６７；５，６８６，１１０；５，７３０，９９０；５，７３９，２０８；５，７５６，５９３；５，８０８，０９６；５，８２４，７７８；５，８２４，７８４；５，８４０，９００；５，８７４，５００；５，８８０，１３１；５，９００，４６１；５，９０２，５８８；５，９１９，４４２；５，９１９，４５５；５，９３２，４６２；５，９６５，１１９；５，９６５，５６６；５，９８５，２６３；５，９９０，２３７；６，０１１，０４２；６，０１３，２８３；６，０７７，９３９；６，１１３，９０６；６，１２７，３５５；６，１７７，０８７；６，１８０，０９５；６，１９４，５８０；および６，２１４，９６６）。
【００２７】
本発明の１つの実施態様で、ポリペプチド抗原のエピトープを非限定例とするポリペプチド内部の結合部位を該ポリペプチドへの部位特異的付着によって選択的に遮蔽するために使用した低分子量ポリマーは、ポリアルキレンオキシド、ポリアミドアルキレンオキシドおよびそれらの誘導体から成るグループから選択される。別の実施態様で、該低分子量水溶性ポリマーは、（ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）−から成る水溶性反復単位をもつＰＥＧである。ＰＥＧが有利な理由は、ポリエーテル主鎖が生物環境および大抵の化学反応条件下で不活性であり、修飾すべきペプチド／タンパク質の特定反応基に共有結合付着できる官能基を含むＰＥＧ誘導体（すなわち、“活性化”ＰＥＧ）を生成するために必要な化学修飾を受入れ易い末端を有しているからである。様々な活性化ＰＥＧポリマーが当業界で公知であり、その官能基の非限定例は、カーボネート、活性エステル、アルデヒド、トレシラート、アクリレート、ケトン、アミノオキシ、アミン、カルボン酸、エステル、チオエステル、ハロゲン、チオール、シアノアセテート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、エポキシド、ヒドラジド、アジド、イソシアナート、マレイミド、メタクリレート、ニトロフェニル、オルトピリジルジスルフィド、シラン、スルフヒドリル、ビニルスルホン、スクシニミジルグルタレート、スクシニミジルスクシネートおよびコハク酸である。官能基は、修飾すべきポリペプチドの可用な反応基の種類に基づいて選択できる。さらに、１つのＰＥＧポリマーが２つ以上のポリペプチドに付着して生じるポリペプチド架橋をできるだけ少なくしこれによって改善された均質性を与えるために誘導体化可能な末端を１つだけ有している一官能ＰＥＧ誘導体（“ｍＰＥＧ”）を使用できる。ポリペプチドの最も普遍的な反応部位は、リシン残基のα−もしくはε−アミノ基または他のアミノ酸のＮＨ_２−末端アミノ基である。他の典型的な反応部位のリストは、システイン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、チロシンなどのアミノ酸およびアミノ酸のＣＯＯＨ−末端カルボン酸を含む。あるいは、ＰＥＧを非限定例とする本発明のＳＭＷポリマー分子をコード化または非コード化アミノ酸内部に存在する反応基以外の反応基との相互作用を介してターゲットポリペプチドまたはペプチドに部位特異的に付着させることもできる。例えば、糖質部分または合成リンカーがターゲットポリペプチド／ペプチド構造の一成分であるときにＳＭＷポリマーは該糖質部分または合成リンカー内部の反応基と相互作用を介して付着できる。
【００２８】
本文中の方法によってポリペプチドを選択的に修飾するために使用されるＰＥＧを非限定例とする様々なポリマーは、低分子量ポリマーを包含する。一般に、本文中に使用した“低分子量”ポリマーは、約１０００Ｄａ以下の分子量のポリマー、特にＰＥＧポリマー（例えば、≦ＰＥＧ１０００）を表す。付着したポリマー部分の水溶性反復単位の数は様々な値を有し得る。しかしながら、例えば、付着ＰＥＧ部分の場合、このような単位−（ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）−）のより好ましい数は２０単位までの範囲である。本発明に概説したペプチドまたはポリペプチド内部の選択結合部位またはエピトープの隠蔽に使用したＰＥＧのような低分子量ポリマーは約１０００Ｄａ以下の分子量を有すると予測されるが、ペプチド／タンパク質の修飾に使用できるポリマーのサイズ範囲が隠蔽すべき結合部位またはエピトープのサイズに大きく左右されることは当業者に理解されよう。このため、結合部位／エピトープの完全遮蔽または実質的遮蔽に高分子量ポリマーの付着が必要な場合には本発明は分子量約１０００Ｄａ以下のポリマーの使用に限定されない。しかしながら、本文中の方法の最終目標は、隠蔽すべき結合部位／エピトープが含まれているペプチド／ポリペプチドの一部分だけを遮蔽することであって、タンパク質内部に存在するすべての結合部位／エピトープを全体的に遮蔽することではないと銘記するのが重要である。
【００２９】
本発明は、１つ以上のエピトープ（例えば、望まない免疫応答を生じるエピトープ）または結合部位が選択的に隠蔽され、治療用物質の残部はより有益な択一的免疫応答または活性を誘導し易いように維持されているポリマー修飾した治療用ペプチドまたはポリペプチドに関する。従って、本発明の最終目標は、特定の結合部位／エピトープを隠蔽するために必要な程度にだけ治療用タンパク質を遮蔽することであるから、本発明方法の使用には低分子量非分枝状ポリマーがもっとも好ましい。ポリマー修飾タンパク質はこれまでにも記載されているが、本発明のポリマー修飾の性質、方法および目的はこのような従来の研究とは顕著に異なっている。従来技術で開示されたポリマー修飾生物活性接合体の大半は約１０００Ｄａを上回るサイズのＰＥＧ部分の付着によって修飾されている。例えば、食品医薬品局によって認可された６つのＰＥＧ付加製品（Ａｄａｇｅｎ^（Ｒ）、Ｏｎｃａｓｐａｒ^（Ｒ）、ＰＥＧ−Ｉｎｔｒｏｎ^（Ｒ）、Ｐｅｇａｓｙｓ^（Ｒ）、Ｓｏｍａｖｅｒｔ^（Ｒ）およびＮｅｕｌａｓｔａ^（Ｒ））のおのおのは、５，０００−４０，０００Ｄａの範囲の分子量をもつＰＥＧポリマーによって修飾されている。本発明では、所望する以上のペプチド／ポリペプチドが隠蔽される可能性があり従って有益な結合部位／エピトープの認識が妨害される可能性があるので高分子量（“ＨＭＷ”）ポリマーの使用は好ましくない。過去においては、治療用タンパク質または化学的化合物をＨＭＷポリマーと結合させることに伴って治療薬が与える生物活性がある程度犠牲になることは容認されていた。付着したＨＭＷ ＰＥＧポリマーはしばしば治療薬の全体または実質部分を覆い隠す（例えば、遮蔽する）が、薬剤の活性部位があらわれると（例えば接近可能になると）ＰＥＧ分子の高度な可撓性が所期の生物応答を実行するためのモーメントを提供できる。従って、修飾の結果として治療薬の比活性は低下するが、腎臓および細網内皮系（“ＲＥＳ”）のクリアランス減少およびタンパク質分解酵素からの遮蔽の双方によって治療薬の体内利用効率は向上する。最終的に、この体内利用効率の向上が治療薬の投与に対して全体的にはより有益な生物応答を提供する。いわば、本発明の意図はタンパク質／ペプチドの所与の活性に対する全体的に改善された応答を誘発することではない。むしろ、本文中に記載の修飾によってタンパク質／ポリペプチドの所与の活性を選択的に変質させることである。ポリエーテル主鎖の高度な可撓性およびその水分子結合能力が理由で、ＰＥＧ分子は同等の分子量の可溶性タンパク質の５−１０×の大きさであるかのように作用する。従って、本発明の発明者らは、エピトープまたは結合部位の選択的遮蔽がより小さい分子量（例えば、約１０００Ｄａ未満の分子量）の水溶性ポリマーの部位特異的付着によって達成でき、タンパク質の残りの部分およびその内部の結合部位／エピトープは可用であり、制約されることなく対応受容体と相互作用して所望の応答を発生および／または促進すると推測した。
【００３０】
従って、本発明の好ましい実施態様は、ペプチド／ポリペプチドが２つ以上のエピトープまたは結合部位を内包しており、１つのエピトープ／結合部位がポリマーによって選択的に隠蔽されるように少なくとも１つの低分子量水溶性ポリマーをペプチド／ポリペプチドに部位特異的に付着させるペプチドまたはポリペプチドのエピトープまたは結合部位の遮蔽方法に関する。ペプチド／ポリペプチドのポリマー修飾の結果として、生物に（例えば、ワクチンの形態で）投与されたときにペプチド／ポリペプチドによって誘導される生物応答はペプチド／ポリペプチドの非隠蔽エピトープまたは結合部位の活性の結果である。従って本発明は、低分子量水溶性ポリマーをペプチド／ポリペプチドに共有結合的に付着させることによってペプチドまたはポリペプチドを修飾し、生物に（例えば、ワクチンの形態）で投与したときに付着ポリマーによって遮蔽されないペプチド／ポリペプチドの１つ以上の領域に特異的な生物応答を誘導するための方法に関する。本発明の１つの実施態様では、対象ペプチドまたはポリペプチドが１つ以上のエピトープを、単独で含むかまたは免疫系に由来しないタンパク質もしくは化合物の１つ以上の結合部位と共に含む。本発明の１つの実施態様の目的は、アミノ酸配列の１つの部分または領域の免疫原性を減退させる（すなわち、別の免疫応答の利益となるように特定の免疫応答を減退させる）ために特定のエピトープを選択的に遮蔽することである。従って、ペプチド／ポリペプチドの生物活性は、タンパク質の異なる（すなわち、非隠蔽）部分に集中し、これが該ペプチド／タンパク質への特異的応答を変化させる。本発明の１つの実施態様では、選択的に隠蔽されたエピトープは、ペプチド間の１つ以上の共有結合によって共有結合的に安定化された３つのキメラペプチドを含むエンベロープウイルス膜融合タンパク質の内部三量体コイルドコイルモチーフの全部または一部分を模倣する共有結合安定化三量体コイルドコイル構造内部に局在する“スカフォールド”ドメインである。該コイルドコイルのキメラペプチドのおのおのは、該エンベロープウイルス膜融合タンパク質のＮＨ_２−末端ヘプタッドリピートドメインの全部または一部分にアルファ−らせん相で融合したコイルドコイルの可溶性三量体形態またはその修飾形態を含むスカフォールドドメインを含んでいる。本発明のこの部分の１つの実施態様では、該エンベロープウイルス膜融合タンパク質がＨＩＶ ｇｐ４１である。
【００３１】
従って本発明は、ＳＭＷ ＰＥＧを非限定例とする少なくとも１つの低分子量水溶性ポリマーを抗原内部の少なくとも１つのアミノ酸残基に部位特異的に付着させるポリペプチド抗原のエピトープの遮蔽方法に関する。エピトープはポリマーによって選択的に隠蔽され、選択的に隠蔽されたエピトープは、ペプチド間の１つ以上の共有結合によって共有結合的に安定化された３つのキメラペプチドを含むエンベロープウイルス膜融合タンパク質の内部三量体コイルドコイルモチーフの全部または一部分を模倣する共有結合安定化三量体コイルドコイル構造内部のスカフォールドドメイン内部に局在する。キメラペプチドのおのおのは、該エンベロープウイルス膜融合タンパク質のＮＨ_２−末端ヘプタッドリピートドメインの全部または一部分にらせん相で融合したコイルドコイルの可溶性三量体形態またはその修飾形態を含むスカフォールドドメインを含んでいる。本発明のこの部分の具体的な実施態様では、エンベロープウイルス膜融合タンパク質がＨＩＶ ｇｐ４１である。
【００３２】
本発明の代表的な用途では、発明者らは、ＨＩＶ ｇｐ４１の内部三量体コイルドコイルモチーフの全部または一部分を模倣する共有結合安定化三量体コイルドコイル構造を含むワクチン構築物の一部分の選択的隠蔽が（暫定米国特許出願番号６０／５７６，０６２，出願日２００４．７．１、および、番号６０／６３６，７２４，出願日２００４．１２．１６に記載）、２つの低分子量ＰＥＧ部分の付着によって実現し、この隠蔽は、免疫応答をペプチドミメティクスのＨＩＶ部分に選択的に集中させる（すなわち、ｇｐ４１膜融合中間体のこのミメティクスの非ＨＩＶ部分の免疫原性を減退させる）ために有効であることを知見した。これは後出の実施例１に詳細に記載する。コイルドコイル構造は、おのおのが非ＨＩＶ由来スカフォールドドメインを含む３つのアルファ（“α”）−ヘリカルポリペプチドから成り、該ドメインはＨＩＶ Ｎ−ペプチドドメインにらせん相で融合したα−ヘリカル構造の安定化を助ける。共有結合的に安定化されたコイルドコイル構造内部に含まれた３つのポリペプチドのおのおののスカフォールドドメインのアミノ酸配列内部に局在する２つのリシンアミノ酸はＰＥＧ２３６部分の共有結合付着によって修飾されている（図３参照）。各ペプチドの修飾の結果として、共有結合付着した合計６個のＳＭＷ ＰＥＧ分子をもつコイルドコイル構造が形成される。実施例１に示すように、該ＳＭＷ ＰＥＧ分子はスカフォールドドメインに対する抗体の産生を効果的に遮蔽し、免疫応答を構造のＨＩＶ部分に集中させる。この例は、対象ペプチド／タンパク質の１つの領域を選択的に遮蔽するためにＳＭＷ ＰＥＧ分子、特にＰＥＧ２３６を使用することを初めて開示したものである。
【００３３】
従って本発明の１つの実施態様は、エピトープがポリマーによって選択的に隠蔽されるように少なくとも１つの低分子量水溶性ポリマーをコイルドコイル構造に部位特異的に付着させる処理を含む、ＨＩＶ ｇｐ４１の内部三量体コイルドコイルモチーフの全部または一部分を模倣する共有結合安定化三量体コイルドコイル構造のエピトープ遮蔽方法に関する。別の実施態様で、隠蔽されたエピトープは、コイルドコイル構造のスカフォールドドメインに局在し、該コイルドコイル構造は、ＨＩＶ ｇｐ４１ ＮＨ_２−末端ヘプタッドリピートドメインの全部または一部分にらせん相で融合したコイルドコイルの可溶性三量体形態またはその修飾形態を含む“スカフォールド”ドメインをおのおのが有している３つのキメラペプチドを含み、該ペプチドは１つ以上の共有結合によって共有結合的に安定化されている。スカフォールドドメインは、該ドメイン内部の１つ以上のアミノ酸残基に１つ以上の低分子量水溶性ポリマーを付着させることによって修飾でき、該水溶性ポリマーは、ポリアルキレンオキシド、ポリアミドアルキレンオキシドおよびそれらの誘導体から選択され、より特定的にはＰＥＧポリマー（例えば、ＰＥＧ２３６）である。
【００３４】
本文中の方法によって選択的に遮蔽できる三量体コイルドコイル構造は、暫定米国特許出願番号６０／５７６，０６２，出願日２００４．７．１、および番号６０／６３６，７２４，出願日２００４．１２．１６、に詳細に記載されている。双方の特許は参照によって本発明に含まれるものとする。これらの出願に記載された三量体コイルドコイル構造はエンベロープウイルス膜融合のミメティクスであり、特にＨＩＶ ｇｐ４１を非限定例とするエンベロープウイルスの膜タンパク質の融合中間体のミメティクスを表す。多くのエンベロープウイルスによって使用される膜融合イベントの一例として、ＨＩＶ ｇｐ４１−媒介膜融合は、ｇｐ４１糖タンパク質のエクトドメインに局在する３つの必須成分：ＮＨ_２−末端融合ペプチド、ＮＨ_２−末端ヘプタッドリピート（“Ｎ−ヘリックス”）およびＣＯＯＨ−末端ヘプタッドリピート（“Ｃ−ヘリックス”）が関与する複合プロセスである。２つのヘプタッドリピート領域（ＮＨ_２：ＨＲ１およびＣＯＯＨ：ＨＲ２）は、糖タンパク質に周期的疎水性を付与し、多くのエンベロープウイルスの融合メカニズムに関与する共通構造モチーフである“ヘアピン三量体”と呼ばれるｇｐ４１の融合発生（すなわち融合活性）コンホメーションを形成するために互いに相互作用するα−ヘリカル構造を予測させる。ヘアピン三量体構造は６つのα−ヘリックスの束である。３つのｇｐ４１エクトドメインのＣ−ヘリックス領域によって形成された３つのα−ヘリックスが、３つのｇｐ４１エクトドメインのＮ−ヘリックス領域によって形成された中央の三重鎖コイルドコイルに逆平行にパックされている。融合プロセスは、Ｎ−ヘリックスコイルドコイルが露出したＮＨ_２−末端融合ペプチドをターゲット細胞膜の近傍／内部に配置する“プレヘアピン”コンホメーションの形成を経由して進行する。３つのＣ−ヘリックスが折り返されてこの中央Ｎ−ヘリックスコイルドコイルに会合し、ウイルスおよび宿主の細胞膜が膜融合の準備として近接状態に引っ張られるとヘアピン三量体が形成される。ウイルス／宿主細胞膜融合を防止する抗ＨＩＶ薬は、プレヘアピンまたはヘアピン三量体複合体に結合する中和抗体を含む。中央Ｎ−ヘリックスコイルドコイルによって形成されたｇｐ４１エクトドメインのヘプタッドリピート１（ＨＲ１）領域内部の疎水性ポケットは、広い交差反応性のＨＩＶ中和抗体を誘導するための好ましいターゲットであると考えられている（参照：暫定米国特許出願番号６０／５７６，０６２，出願日２００４．７．１：この疎水性ポケット領域に結合する中和抗体を記載している）。“プレヘアピン”構造は多くのエンベロープウイルス膜融合タンパク質の共通特徴なので（参照：Ｓｉｎｇｈら，１９９９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９０：１０３１−１０４１）、ポリマー修飾された膜融合のミメティクスは、本文中の方法を使用し様々なエンベロープウイルスに特異的なワクチン構築物を製造するために作製できる。従って、本文中に例示した方法はＨＩＶに特異的なワクチン構築物の製造を目標としているが、他のエンベロープウイルスをターゲットとするワクチン構築物を製造するためにこの同じ基本戦略を使用できることが当業者には理解されよう。
【００３５】
従って、本発明の１つの実施態様は、３つのキメラペプチドを含むＨＩＶ ｇｐ４１ Ｎ−ペプチドコイルドコイルの全部または一部分を模倣するポリマー修飾され共有結合的に安定化された三量体コイルドコイルに関する。キメラペプチドのおのおのは、ＨＩＶ ｇｐ４１ Ｎ−ペプチドの全部または一部分にらせん相に融合したコイルドコイルの可溶性三量体形態またはその修飾形態を含むスカフォールドドメインを含み、該スカフォールドドメイン内部に局在するエピトープは該スカフォールドドメインの内部または極めて近傍の少なくとも１つのアミノ酸残基に部位特異的に付着した少なくとも１つの低分子量水溶性ポリマーによって選択的に隠蔽されている。該三量体コイルドコイルｇｐ４１ミメティクスは、例えばジスルフィド結合または化学選択的結合反応のいずれかから生じた共有結合のようなキメラペプチド間に形成された共有結合を介して安定化されたホモ三量体構造またはヘテロ三量体構造を示し得る。該コイルドコイル構造のスカフォールド部分の内部に局在するエピトープは、ポリアルキレンオキシド、ポリアミドアルキレンオキシドおよびそれらの誘導体から成るグループから選択された分子量約１０００Ｄａ未満のＰＥＧポリマーを非限定例とするＳＭＷ水溶性ポリマーの付着によって遮蔽できる。
【００３６】
従って、本発明の１つの実施態様では、ＨＩＶ ｇｐ４１を非限定例とするエンベロープウイルス膜融合タンパク質の内部三量体コイルドコイルモチーフの全部または一部分を模倣するポリマー修飾三量体コイルドコイル構造が、コイルドコイル構造内部に含まれた並列α−ヘリカルペプチドのシステイン残基間の共有ジスルフィド結合の形成を介して共有結合的に安定化されているコイルドコイルミメティクスを含み、該コイルドコイル構造の１つの領域（エピトープ含有）は該領域の内部または近傍の１つ以上のアミノ酸へのＳＭＷポリマーの付着によって遮蔽されている。本発明のこの実施態様で、共有結合形成に参加するシステインアミノ酸残基は、個々のα−ヘリカルペプチドのα−ヘリカルドメインの外部に位置するように操作されている。従ってコイルドコイル構造に内包されている個別ペプチドのおのおのは、ＨＩＶ ｇｐ４１を非限定例とするエンベロープウイルス膜融合タンパク質のＮＨ_２−末端ヘプタッドリピートドメイン（“Ｎ−ペプチド”ドメイン）の全部または一部分にらせん相で融合したコイルドコイルの可溶性三量体形態（“スカフォールド”ドメイン）またはその修飾形態を含むα−ヘリカルドメインと、該α−ヘリカルドメインの外部に局在する少なくとも２つのシステイン残基とを有している。複数の該可溶性キメラペプチドを三量体コイルドコイル構造が形成される濃度でインキュベートし次いで該構造を酸化させることによって、コイルドコイルの並列キメラペプチドのシステイン残基間に共有ジスルフィド結合が形成される。前述したように、本文中に開示の方法によって遮蔽すべき好ましいエピトープはスカフォールドドメイン内部に局在している。
【００３７】
本発明の別の実施態様では、ＨＩＶ ｇｐ４１を非限定例とするエンベロープウイルス膜融合タンパク質の内部三量体コイルドコイルモチーフの全部または一部分を模倣するポリマー修飾三量体コイルドコイル構造が、化学選択的結合反応から生じたコイルドコイル構造に内包されたα−ヘリカルペプチド間の共有化学結合の形成を介して共有結合的に安定化されたコイルドコイルミメティクスを含み、コイルドコイル構造の１つの領域（少なくとも１つのエピトープ含有）は該領域の内部または近傍の１つ以上のアミノ酸へのＳＭＷポリマーの付着によって遮蔽されている。この実施態様で、該コイルドコイル構造は、ＨＩＶ ｇｐ４１を非限定例とするエンベロープウイルス膜融合タンパク質のＮＨ_２−末端ヘプタッドリピートドメイン（“Ｎ−ペプチド”ドメイン）の全部または一部分にらせん相で融合したコイルドコイルの可溶性三量体形態（“スカフォールド”ドメイン）またはその修飾形態を含むα−ヘリカルドメインをおのおのが有している３つのキメラペプチドを含む。３つのキメラペプチドは、チオエーテル結合の形成を非限定例とする化学選択的反応によって生じた共有化学結合の形成を介してコイルドコイル構造中で安定化されている。例えば、本発明に従ってポリマー修飾できるヘテロ三量体コイルドコイル構造は、該ペプチドのα−ヘリカルドメインの外部に局在する少なくとも２つのシステイン残基をさらに含む１つのキメラペプチドと、おのおのが求電子部分を組込むように誘導体化される２つのキメラペプチドとを含み、第一キメラペプチドの各システイン残基の求核スルフヒドリルが２つの誘導体化キメラペプチドのおのおのの求電子部分と共にチオエーテル結合を形成する。詳細は、暫定米国特許出願番号６０／５７６，０６２（前出）に記載されている。
【００３８】
コイルドコイル構造を安定化するために使用できる化学選択的結合反応の非限定例は、以下の化学種間の反応であり、これらの化学種は得られる三量体構造内部に内包された個々のキメラペプチド内部に組込まれる：（ｉ）アルデヒド／ケトンとヒドラジドによるヒドラジンの形成；（ｉｉ）ケトンとアミノキシ基によるオキシムの形成；（ｉｉｉ）ケトンとチオセミカルバジドによるチオセミカルバゾンの形成；（ｉｖ）アルデヒドとβ−アミノチオールによるチアゾリジンの形成；（ｖ）チオカルボキシレートとα−ハロカルボニルによるチオエステルの形成；（ｖｉ）チオエステルとＮ−末端ペプチドシステインによるアミドの形成；（ｖｉｉ）アルキルハライドとチオールによるチオエーテルの形成；および（ｖｉｉｉ）マレイミドとチオールによるチオエーテルの形成。
【００３９】
従って本発明の１つの実施態様は、本文の方法によってポリマー修飾されたキメラペプチドに関する。該ペプチドは共有結合的に安定化されて三量体コイルドコイル構造を形成できる。該キメラペプチドは、ＨＩＶ ｇｐ４１を非限定例とするエンベロープウイルス膜融合タンパク質のＮＨ_２−末端ヘプタッドリピートドメイン（“Ｎ−ペプチド”部分）の全部または一部分にらせん相で融合した三量体コイルドコイルを形成できるα−ヘリカルスカフォールドタンパク質（“スカフォールド”部分）を含むアルファ（“α”）−ヘリカルドメインを含む。ＰＥＧを非限定例とする１つ以上の低分子量ポリマーがスカフォールドドメイン配列の内部または極めて近傍に局在する選択されたアミノ酸残基に付着することによって部位特異的に遮蔽される少なくとも１つまたは複数のエピトープはこのスカフォールドドメインに内包されている。前述のように、このポリマー修飾が免疫応答を三量体コイルドコイルのウイルスＮ−ペプチド部分に集中させる。
【００４０】
暫定米国特許出願番号６０／５７６，０６２および番号６０／６３６，７２４（前出）に詳細に記載されているように、三量体コイルドコイルコンホメーションを獲得できるα−ヘリカルスカフォールドタンパク質に融合したＨＩＶ ｇｐ４１のＮＨ_２−末端ヘプタッドリピートドメイン（Ｎ−ヘリックス）の全部または一部分を含むキメラペプチドは当業界で公知である（Ｅｃｋｅｒｔ ａｎｄ Ｋｉｍ，２００１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９８：１１１８７−１１１９２）。この普遍構造を有しているペプチドを本文では“キメラＮ−ペプチド”と呼ぶが、これはＨＩＶ−由来ペプチドに限定されない。ＨＩＶによって使用される融合メカニズムと同様の融合メカニズム（すなわち、ヘアピン三量体）を利用することが判っているエンベロープウイルス膜融合タンパク質のＮＨ_２−末端ヘプタッドリピートドメインを、本発明に使用するキメラＮ−ペプチドの作製に使用できる。本発明の１つの実施態様では、本文中の方法によってポリマー修飾できホモ三量体もしくはヘテロ三量体コイルドコイル構造内部で共有結合的に安定化される可溶性キメラペプチドはこれらのキメラＮ−ペプチドの誘導体を表す。本文中に記載のようにしてポリマー修飾できるこのようなキメラＮ−ペプチドの一例を“ＣＣ−キメラＮ−ペプチド”と呼ぶ。ＣＣ−キメラＮ−ペプチドは以下の成分を含む：（１）三量体コイルドコイルコンホメーションを獲得できるα−ヘリカルスカフォールドタンパク質（“スカフォールド”部分）；（２）ＨＩＶ ｇｐ４１のＮ−ヘリックス領域の全部または一部分を非限定例とするエンベロープウイルス膜タンパク質（“Ｎ−ペプチド”部分）のＮＨ_２−末端ヘプタッドリピートドメイン（“Ｎ−ヘリックス”）の全部または一部分；および（３）可撓性を強化するために場合によってはリンカー／スペーサー領域によってコアキメラペプチド配列から隔てられたキメラペプチド配列のＮＨ_２−またはＣＯＯＨ−末端に局在する少なくとも２つのシステイン残基（“システイン部分”）。スカフォールド部分は上記Ｎ−ペプチド部分にらせん相で融合し、システイン部分（場合によってはリンカー／スペーサー領域を含む）はキメラペプチドのこのα−ヘリカルコアの外部に局在する。該ペプチドは、可溶性三量体コイルドコイル構造を形成でき、この構造では、３つの等しい（すなわち、ホモ三量体コイルドコイルを形成する）または実質的に類似の（すなわち、ヘテロ三量体コイルドコイルを形成する）キメラペプチド鎖がパラレル配向で物理的に会合している。該領域の免疫原性を減衰させ三量体コイルドコイル構造のＮ−ペプチド部分に免疫応答を集中させるために、該ドメインの内部または近傍に局在する１つ以上のアミノ酸残基にＰＥＧを非限定例とする１つ以上の低分子量ポリマー部分を付着させることによって選択的に遮蔽されるのはスカフォールドドメインおよびその内部に局在するエピトープである。
【００４１】
従って本発明の１つの実施態様は、（ａ）コイルドコイルの可溶性三量体形態を含むスカフォールド部分と、（ｂ）ＨＩＶ ｇｐ４１のＮ−ペプチドまたはその修飾形態の全部または一部分を含むＮ−ペプチド部分と、（ｃ）少なくとも２つのシステイン残基を含むシステイン部分とを含むポリマー修飾された可溶性キメラペプチドに関する。（ａ）のスカフォールド部分は（ｂ）のＮ−ペプチド部分にらせん相で融合してα−ヘリカルドメインを形成しており、（ｃ）のシステイン部分はα−ヘリカルドメインの外部に局在しており、該スカフォールド部分の内部に局在している１つ以上のエピトープは該スカフォールド部分の内部の少なくとも１つのアミノ酸残基に部位特異的に付着した少なくとも１つの低分子量水溶性ポリマーによって選択的に隠蔽されている。
【００４２】
“ＣＣＩＺＮ１７”は本発明の一部としてポリマー修飾できる（すなわち、スカフォールドドメイン内部のエピトープを選択的に遮蔽できる）１つのＣＣ−キメラＮ−ペプチドである。ＣＣＩＺＮ１７のコアα−ヘリカルドメインは、Ｅｃｋｅｒｔ ａｎｄ Ｋｉｍ，２００１（前出）に開示されたキメラＮ−ペプチド“ＩＺＮ１７”である。ＩＺＮ１７（ＩＫＫＥＩＥＡＩＫＫＥＱＥＡＩＫＫＫＩＥＡＩＥＫＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ：配列１）はＥｃｋｅｒｔ ａｎｄ Ｋｉｍ， ２００１（前出）によって、ＨＩＶ ｇｐ４１のＮ−ヘリックスドメインの一部分の非凝集性三量体コイルドコイルが形成できるように設計された。このキメラペプチドは、ＨＩＶ ｇｐ ４１（“Ｎ１７”Ｎ−ペプチドドメイン；配列３２；上記の下線部分）のＮ−ヘリックスの一部分のＮＨ_２−末端にらせん相で融合した三量体コイルドコイル（“ＩＺ”スカフォールドドメイン；配列１４；上記のイタリック体）を形成できる可溶性α−ヘリカルドメインから成り、長さ４１アミノ酸の連続コイルドコイルを創製する。ＩＺドメインはＳｕｚｕｋｉら（１９９８，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１１：１０５１−１０５５）によって記載された設計に基づく修飾されたイソロイシンジッパーであり、溶液中ではヘリカルで三量体である。Ｎ１７ドメインは、ｇｐ４１エクトドメインのタンパク質分析によって同定されたＨＩＶ ｇｐ４１のＮ−ヘリックス領域に由来の３６アミノ酸ペプチド（“Ｎ３６”）の先端欠失部分である。暫定米国特許出願番号６０／５７６，０６２および番号６０／６３６，７２４（前出）に詳細に記載されているように、ＣＣＩＺＮ１７はＩＺＮ１７のＮＨ_２−末端にアミノ酸配列Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列：１０）を付加することによって作製した。従ってＣＣＩＺＮ１７は以下のアミノ酸配列から構成されている：ＣＣＧＧＩＫＫＥＩＥＡＩＫＫＥＱＥＡＩＫＫＫＩＥＡＩＥＫＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ（配列：２）。ＣＣＩＺＮ１７を作製するためにＩＺＮ１７に付加したシステイン残基は、このＣＣ−キメラＮ−ペプチドに共有結合安定化三量体コイルドコイル形成能力を与える（ジスルフィド結合安定化ＣＣＩＺＮ１７由来コイルドコイルについては図１参照；チオエーテル結合安定化ＣＣＩＺＮ１７−由来コイルドコイルについては図８参照）。ＣＣＩＺＮ１７中の付加グリシン残基はキメラＩＺＮ１７ペプチドのα−ヘリカルコアからシステイン残基を隔てるスペーサー領域を表し、該システイン残基にジスルフィドまたは化学選択的（例えば、チオエーテル）結合を形成するためにコンホメーション的により大きい自由を与える。３つのＣＣＩＺＮ１７キメラペプチド間の共有ジスルフィド結合の存在は共有結合的に安定化された三量体コイルドコイル（ＣＣＩＺＮ１７）_３を生じる（図１参照）。このコイルドコイルではは、三量体の存続がモノマー鎖の濃度にもはや依存しないので出発ＩＺＮ１７三量体コイルドコイルよりも安定である（参照：暫定米国特許出願番号６０／５７６，０６２および番号６０／６３６，７２４（前出））。
【００４３】
キメラＮ−ペプチド（例えばＩＺＮ１７）はまた、共有結合的、化学選択的反応に参加できる求電子部分を組込むように誘導体化することもでき、“誘導体化キメラＮ−ペプチド”と呼ばれる。従って本発明の別の実施態様は、（例えば、スカフォールドドメイン内部のエピトープを選択的に遮蔽するために）本文の方法によってポリマー修飾されて三量体コイルドコイル構造内部で共有結合的に安定化できる誘導体化キメラＮ−ペプチドに関する。証明として、化学選択的反応を介して共有結合的に安定化されている三量体コイルドコイル構造は、単一のＣＣ−キメラＮ−ペプチド（例えばＣＣＣＩＺＮ１７；配列：７６）および２つの誘導体化キメラＮ−ペプチド（例えばブロモアセチル−ＧＧＧＩＺＮ１７；配列：７７）を含み、後者のおのおのは、等しいかまたは実質的に等しいα−コアドメイン（例えばＩＺＮ１７；配列：１）を有しており、該キメラペプチド間で共有チオエーテル結合が生じる。これらの３つのキメラペプチドのおのおののスカフォールド部分内部のエピトープは、該スカフォールドドメイン内部の１つ以上のアミノ酸に低分子量ポリマー部分（例えばＳＭＷ ＰＥＧ）を付着させることによって選択的に遮蔽できる。“ＮＨ_２−Ｃ（Ｆｍ）（チオＩＺＮ１７）_３”と命名された共有結合安定化三量体コイルドコイルは、本発明の一部として記載した方法によってポリマー修飾され得るチオエーテル結合安定化コイルドコイルの一例を表す（図８、参照：暫定米国特許出願番号６０／５７６，０６２および番号６０／６３６，７２４（前出））。ＮＨ_２−Ｃ（Ｆｍ）（チオＩＺＮ１７）_３は１つのＣＣ−キメラＮ−ペプチドすなわちＣＣＣＩＺＮ１７ペプチド（配列：７６）および２つの誘導体化キメラＮ−ペプチドすなわちブロモアセチル−ＧＧＧＩＺＮ１７（配列：７７）から成り、誘導体化キメラＮ−ペプチドのＮＨ_２−末端に局在するブロモアセチル部分のおのおのはＣＣ−キメラＮ−ペプチドの“システイン部分”に局在するシステイン残基と共にチオエーテル結合を形成する。この特定のコイルドコイル中で、ＮＨ_２−末端システイン残基は最初はＦｍ基によって保護され、２つの内部システイン残基をブロモ部分とのチオエーテル結合形成に参加させる。誘導体化キメラＮ−ペプチドすなわちブロモアセチル−ＧＧＧＩＺＮ１７（配列：７７）で証明されるように、誘導体化キメラＮ−ペプチドの求電子部分は、キメラペプチドのコイルドコイル形成と得られたコイルドコイルを安定化する共有結合形成との間の干渉を最小にするために可撓性リンカー領域（たとえば、２つ以上の連続したグリシン残基）によってキメラＮ−ペプチドのα−ヘリカル部分から隔てられる。
【００４４】
さらに、ＩＱＮ１７（ＲＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫＱＫＫＩＥＮＥＩＡＲＩＫＫＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ：配列：１１）はＩＺＮ１７と同様の設計図をもつキメラＮ−ペプチドである。しかしながらＮ１７ドメイン（下線部分）は酵母転写アクチベーターＧＣＮ４に由来の代替的三量体コイルドコイルモチーフにらせん相で融合している（“ＩＱ”ドメイン；配列：１７；上記イタリック体）。コアＩＱＮ１７ペプチドを含む上記同様の共有結合安定化三量体コイルドコイルを作製し本発明の一部としてポリマー修飾できる。
【００４５】
本文中で“スカフォールド部分”と互換的に使用され本発明の一部として選択的に遮蔽されるＣＣ−および誘導体化−キメラＮ−ペプチドの“スカフォールドドメイン”は、非−ＨＩＶアミノ酸残基を含んでおり、コイルドコイルの可溶性三量体形態を表す。スカフォールドドメインは上述のＮ−ペプチド領域のＮＨ_２−末端またはＣＯＯＨ−末端に融合できるか、または、該ドメインがＮ−ペプチド領域のＮＨ_２−およびＣＯＯＨ−末端の双方に局在するように分割できる。一部分がＮ−ペプチド部分の両端に局在するようにスカフォールドドメインが分割されているとき、この分割されたスカフォールドドメインと分割部分の一方または双方に内包されているエピトープとを適正に遮蔽するために、少なくとも１つのポリマー部分が分割スカフォールド領域の各部分（すなわち、ＮＨ_２−末端部分とＣＯＯＨ−末端部分）に存在するアミノ酸残基に付着するであろう。コイルドコイルタンパク質は文字“ａ”から“ｇ”によって表されるアミノ酸の特徴的ヘプタッドリピートから構成され、ヘプタッドリピートの第一および第四の位置すなわち“ａ”および“ｄ”の位置はそれぞれコイルドコイルの相互作用鎖の内部を形成し一般に疎水性である。本文に記載のポリマー修飾三量体コイルドコイル構造のスカフォールドドメインを表すコイルドコイルモチーフは、以下を非限定例とする様々なソースから単離できる：Ｓｕｚｕｋｉらによって開示されたイソロイシンジッパーモチーフ（１９９８（前出）；以後の本文中では“Ｓｕｚｕｋｉ−ＩＺ”；ＹＧＧＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫＫＩＥＡ；配列：１２）およびＥｃｋｅｒｔらによって開示されたＧＣＮ４−ｐＩ_ＱＩコイルドコイルモチーフ、（１９９８，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８４：８５９−８６５および国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０１／２９６３７，国際公開ＷＯ０２／２４７３５；ＲＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＬＳＫＱＹＨＩＥＮＥＩＡＲＩＫＫＬＩＧＥＲ（配列：１３））およびそれらの先端欠失および／または修飾形態。Ｓｕｚｕｋｉ−ＩＺまたはＧＣＮ４−ｐＩ_ＱＩコイルドコイルモチーフは、１つのアミノ酸残基の付加、置換、修飾および／または欠失によって改変できる。例えば、該スカフォールドタンパク質内部のアミノ酸残基を該特定場所のＳＭＷポリマーの付着を容易にするために修飾してもよい。スカフォールドドメインは短縮、修飾またはその双方が可能であるが、得られるＣＣ−または誘導体化−キメラＮ−ペプチドがＮ−ペプチドコイルドコイル領域を適正に提示する能力を維持する（すなわち、Ｎ−ヘリックス三量体コイルドコイルの安定で忠実なミメティクスを生成する能力を維持する）ことが重要である。これは、暫定米国特許出願番号６０／５７６，０６２および番号６０／６３６，７２４（前出）に開示された実験によって判断できる。先端欠失および／または修飾されたＳｕｚｕｋｉ−ＩＺ−様およびＧＣＮ４−ｐＩ_ＱＩ−様スカフォールドドメインの様々な多数の実施例が、暫定米国特許出願番号６０／５７６，０６２および番号６０／６３６，７２４（前出）に開示されている。これらの文献のおのおのは参照によって本発明に含まれるものとする。Ｓｕｚｕｋｉ−ＩＺ−様およびＧＣＮ４−ｐＩ_ＱＩ−様スカフォールドタンパク質の例を表１に示す。しかしながらこの記述は表１に示したＣＣ−または誘導体化−キメラＮ−ペプチドに内包されたスカフォールドタンパク質の選択的な遮蔽方法に本発明を限定するものではない。
【００４６】
【表１】

【００４７】
本発明の１つの実施態様では、本文中に記載のＣＣ−および誘導体化−キメラＮ−ペプチドのスカフォールドドメインは、免疫原性担体またはアフィニティ樹脂へのそれらの接合および／または得られたコイルドコイル構造の接合を容易にするために特異的に修飾されてもよい。例えば、アミノ酸配列ＩＥＫＫＩＥＥＩＥＫＫＩＥＥＩＥＫＫＩＥＥＩＥＫ（配列：３２；“ａ”位置は下線部分）から成る“ＥＺ”スカフォールドは、暫定米国特許出願番号６０／５７６，０６２および番号６０／６３６，７２４（前出）に記載の共有結合安定化三量体コイルドコイルと免疫原性担体であるＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜プロテオソーム複合体（“ＯＭＰＣ”）粒子との接合を容易にするために設計した。担体へのペプチドの共有結合付加（すなわち、担体−ペプチド接合体）は接合体の不可逆的沈殿を生じることが多いが、ＯＭＰＣ−ペプチド接合体の場合も同様である。これを防止するために、１モルのＯＭＰＣに組込むペプチドの最大モル数（通常は、ペプチド“負荷”と呼ぶ）を慎重にコントロールしなければならない。何らかの配列のペプチドをＯＭＰＣに直接接合し、ペプチドエピトープに対して十分な免疫応答を得るために必要な閾値以上のペプチド負荷を確保できる戦略が最近開発された（参照：Ｂｉａｎｃｈｉら，暫定米国特許出願番号６０／５３０，８６７“Ａ Ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ Ｍａｋｅ ａ Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｃａｒｒｉｅｒ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｗｉｔｈ ａ Ｈｉｇｈ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ，”出願日２００３．１２．１８）。該方法はペプチド配列のｐＩ（等電点）の操作を含み、その値を約３．５−５．０の範囲内で最適に調節する。ｐＩがこの範囲内の値になるように、ペプチドを活性の免疫原性ドメインの外部で修飾し、ペプチドの免疫特性の維持を確保する。例えば、ＩＺＮ１７（配列：１）は１０．７という極めて高いｐＩを有しているが、その理由は恐らくＩＺスカフォールド内部に多数の塩基性アミノ酸残基が存在するからであろう。ＥＺスカフォールドドメインは、スカフォールドを含むキメラペプチドやそれらに内包されたコイルドコイル構造がＯＭＰＣとの接合を容易に行うことができるように、もっと酸性に設計した。ＩＺスカフォールドを作製するために使用したＳｕｚｕｋｉ−ＩＺスカフォールドはＳｕｚｕｋｉら，１９９８（前出）によって設計された（ＩＥＫＫＩＥＡ）_ｎ（配列：９９）のヘプタッドリピート配列を有している。ＥＺスカフォールド中では、Ｓｕｚｕｋｉ−ＩＺのヘプタッドリピートの“ｃ”のアラニン残基がグルタミン酸残基に突然変異することによってこのヘプタッドリピート配列が修飾され、（ＩＥＫＫＩＥＥ）_ｎ（配列：１００）となる。得られたキメラＮ−ペプチドＥＺＮ１７（ＩＥＫＫＩＥＥＩＥＫＫＩＥＥＩＥＫＫＩＥＥＩＥＫＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ；配列：９８）の５．２というｐＩは効率的なＯＭＰＣ接合に最も有利な範囲に近い。
【００４８】
前述のように、本発明の一部として記載した上記の方法によってポリマー修飾できる様々なキメラペプチドを作製するときには適正なヘリカル構造の維持が極めて重要である。例えば、Ｎ１７よりも長い（例えば、“Ｎ２３”または“Ｎ３６”）ＨＩＶ Ｎ−ペプチド配列セグメントを有しているＩＺＮ−キメラペプチドおよびそのＣＣＩＺＮ−誘導体は、ＩＺと長いＨＩＶ Ｎ−ペプチドとを接合する融合イベント中にα−ヘリカルヘプタッドリピートが確実に維持されるように、１個から数個のアミノ酸で延長された修飾ＩＺドメインを含み得る。ＩＺＮ２３およびＩＺＮ３６はやはりＥｃｋｅｒｔ ａｎｄ Ｋｉｍ，２００１（前出）に開示されたキメラＮ−ペプチドであり、本発明に記載したようにスカフォールドドメイン内部のエピトープを選択的に隠蔽するために三量体コイルドコイル内部で共有結合的に安定化されポリマー修飾され得る。ＩＺＮ２３およびＩＺＮ３６はそれぞれ以下のアミノ酸配列を有している：ＩＫＫＥＩＥＡＩＫＫＥＱＥＡＩＫＫＫＩＥＡＩＥＫＥＩＥＡＱＱＨＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ（配列：２３）およびＩＫＫＥＩＥＡＩＫＫＥＱＥＡＩＫＫＫＩＥＡＩＥＫＥＩＳＧＩＶＱＱＱＮＮＬＬＲＡＩＥＡＱＱＨＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ（配列：２４）。ＩＺＮ２３およびＩＺＮ３６のスカフォールドドメインはイタリック体で示し、ペプチドの“ａ”位置は下線を付けて示す。ＩＺＮ１７およびそのＣＣＩＺＮ−誘導体であるＣＣＩＺＮ１７の作製に使用したＩＺスカフォールドに比較すると、ＩＺＮ２３およびＩＺＮ３６のスカフォールドドメインは、安定なα−ヘリカルコンホメーションの生成を容易にする適正な“ａ”−“ｇ”スペーシングを維持するために１つ（ＩＺＮ２３）または２つの（ＩＺＮ３６）アミノ酸残基で延長されている。このようにしてスカフォールドドメインを延長するために選択されたアミノ酸は隣接ヘリックス間で静電相互作用し得る（Ｓｕｚｕｋｉら，１９９８，（前出））。
【００４９】
本発明は、既刊文献（参照：暫定米国特許出願番号６０／５７６，０６２および番号６０／６３６，７２４（前出））に詳細に記載された共有結合安定化三量体コイルドコイルのコア構造を有しており、タンパク質構造内部の１つ以上のエピトープを隠蔽しその結果として当該構築物に対して生じる免疫応答を非遮蔽領域に集中および／または集結させるために、ＳＭＷ ＰＥＧ部分を非限定例とする１つ以上の低分子量ポリマーの選択的付着によって修飾されたワクチン構築物に関する。上述のように、本発明の１つの実施態様では、該ワクチン構築物が３つのキメラペプチドを含み、おのおのはＨＩＶ ｇｐ４１エクトドメインのＮ−ヘリックスヘプタッド領域の全部または一部分（“Ｎ−ペプチド”部分）にらせん相で融合した可溶性スカフォールドタンパク質を含む。ＨＩＶ ｇｐ４１エクトドメインは、約１６９アミノ酸残基（ＨＩＶ−１ ｇｐ１６０エンベロープタンパク質中の位置に準拠して残基５１２−６８１）を表す。エクトドメインのＮＨ_２−およびＣＯＯＨ−末端部分の内部に局在する２つの４−３ヘプタッドリピート領域はそれぞれＮ−およびＣ−ヘリックス領域と呼ばれるα−ヘリックスを形成すると予測される。Ｎ−ヘリックスおよびＣ−ヘリックスはそれぞれｇｐ１６０のほぼ５４１−５９２位および６２３−６６３位のアミノ酸に局在する（参照：たとえば，Ｃａｆｆｒｅｙら，１９９８，ＥＭＢＯ Ｊ．１７：４５７２−４５８４）。ｇｐ４１エクトドメインのコア融合−活性構造（すなわち、“ヘアピン三量体”）は、それぞれＮ−ヘリックスおよびＣ−ヘリックス領域に局在する２つの相互作用性ペプチド、Ｎ３６（ＳＧＩＶＱＱＱＮＮＬＬＲＡＩＥＡＱＱＨＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ；配列：２９）およびＣ３４（ＷＭＥＷＤＲＥＩＮＮＹＴＳＬＩＨＳＬＩＥＥＳＱＮＱＱＥＫＮＥＱＥＬＬ；配列：３０）の三量体から成る（参照：Ｃｈａｎら，１９９７，Ｃｅｌｌ ８９：２６３−２７３；および、米国特許番号６，５０６，５５４）。Ｎ３６は、ＨＩＶ−１ ｇｐ１６０の位置に準拠してアミノ酸残基５４６−５８１（両端のアミノ酸を含む)を含む。他のグループは、Ｃｈａｎらによって開示されたものよりもやや大きい安定な６−ヘリックス束を形成するＨＩＶ−１ ｇｐ４１の結晶化ヘリカルドメインを有している。例えば、Ｗｅｉｓｓｅｎｈｏｒｎら（１９９７，Ｎａｔｕｒｅ ３８７：４２６−４３０）は、Ｎ３６配列のＮＨ_２−末端の５つの追加アミノ酸残基とＣＯＯＨ−末端の７つの追加アミノ酸残基とを含むＮ３６よりも長いＮ−ペプチド領域を同定した：ＡＲＱＬＬＳＧＩＶＱＱＱＮＮＬＬＲＡＩＥＡＱＱＨＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬＡＶＥＲＹＬＫ（配列：３１）。従って、本発明によってポリマー修飾され得るＣＣ−および誘導体化−キメラＮ−ペプチドのＮ−ペプチド領域は、上記に開示されたＮ３６領域の全部または一部分に必ずしも限定されない。従って１つの実施態様では、そのスカフォールドドメインが本文中に記載のようにポリマー修飾されたＣＣ−および誘導体化−キメラＮ−ペプチドは、Ｎ３６のＣＯＯＨ−末端側の半分に局在しＨＩＶ−１ ｇｐ１６０配列の残基５６５−５８１に対応する少なくとも１７のアミノ酸（“Ｎ１７”）（ＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ；配列：３２）を含み得る。別の実施態様では、Ｎ１７よりも長いまたは短いＮ−ペプチド領域のセグメントは上述のようなポリマー修飾スカフォールドドメインに融合し得る（例えば、“Ｎ−２３”−ＩＥＡＱＱＨＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ；配列：３３）。Ｎ−ペプチドドメインの延長は、Ｎ１７内部で同定された推定免疫原性エッジ効果を克服するために有用であろう（参照：暫定米国特許出願番号６０／５７６，０６２および番号６０／６３６，７２４（前出））。ヘアピン三量体構造はまた、疎水性ポケットと呼ばれる深い空洞を備えている。１つのこのような空洞はＮ３６α−ヘリックスの各溝の底部（すなわち、ＣＯＯＨ−末端側の半分）に局在し、並列したＣ３４ヘリックスのノブ状突起で充填され、ボール−ソケットアレンジメントを形成する（参照：Ｃａｏら，１９９３，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：２７４７−２７５５）。従って、ＣＣ−および誘導体化−キメラＮ−ペプチドは、Ｎ−ヘリックスα−ヘリカルドメインのＣＯＯＨ−末端側の半分に存在する中央Ｎ−ヘリッスクコイルドコイルの疎水性ポケットまたは空洞を形成するアミノ酸残基を含むｇｐ４１ Ｎ−ヘリックスの一部分を含み得る。
【００５０】
本文中に記載したワクチン構築物のＨＩＶ Ｎ−ペプチド領域はまた、野生型アミノ酸配列に比べて修飾されてもよい。例えば、Ｎ１７のＣＯＯＨ−末端内部に局在する免疫優性非中和エピトープはＩＺＮ１７ペプチドのアラニン走査によって同定された（暫定米国特許出願番号６０／５７６，０６２および番号６０／６３６，７２４）。この望ましくない免疫優性応答は、非中和エピトープの原因であると考えられるＮ１７の１つ以上のアミノ酸残基（ロイシン−５８１，アルギニン−５７９，グルタミン−５７７および／またはグルタミン−５７５）を突然変異させることによって克服できる。一例では、免疫優性エピトープの原因であると考えられる４つのアミノ酸残基のおのおのがアラニン残基で置換され、アミノ酸配列：ＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＡＬＡＡＡＩ（配列：３４）から成る“Ｎ１７Ａｌａ４”が生じるようにＮ１７を修飾し得る。あるいは、有益でない抗原応答を排除するために該非中和免疫優性領域の先端を欠失させるかまたは完全に除去してもよい（例えば“Ｎ１３”−ＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱ；配列：３５）。本発明のキメラペプチドのＮ−ペプチド部分はまた、ペプチド全体がいっそう安定するように修飾することもできる。例えば、Ｎ−ペプチドドメインは、配列中により安定性のイソロイシン残基を組込むことによって修飾できる（例えば“Ｎ１７Ｉｌｅ”−ＬＩＱＬＩＶＷＧＩＫＱＩＱＡＲＩＬ；配列：３６）。
【００５１】
上述のように、本文中の方法によってポリマー修飾された三量体コイルドコイルワクチン構築物の好ましい実施態様は、α−ヘリカル安定性スカフォールドドメインにらせん相で融合したＨＩＶ ｇｐ４１ Ｎ−ヘリックス領域の一部分を有しているＨＩＶ融合中間体のミメティクスとなる。ＨＩＶ ｇｐ４１のこのＮ−ヘリックス部分は、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、別のＨＩＶ菌株または別のレンチウイルス種の菌株（例えば、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＴＶ）またはビスナウイルス）から単離できる。このために同様のＨＩＶ菌株および／または他の種の免疫不全ウイルス中の対応するＮ−ペプチド配列を同定することは容易であり、当業界で公知である。例えば、ＨＩＶ−１ ｇｐ４１のＮ３６ Ｎ−ペプチド配列に位置合せする他のレンチウイルスＮＨ_２−末端α−ヘリカルドメインのアミノ酸配列を表２に示す。さらに、他のエンベロープウイルスの膜−融合タンパク質中のα−ヘリカルコイルドコイルドメインが同定された（参照：Ｓｉｎｇｈら，１９９９（前出））。
【００５２】
【表２】

【００５３】
本文中で定義したキメラＮ−ペプチド（例えばＩＺＮ１７）の作製については詳細に上述した。暫定米国特許出願番号６０／５７６，０６２および番号６０／６３６，７２４（前出）にはもっと詳細に記載されている。該キメラＮ−ペプチドは、安定なジスルフィドおよび／またはチオエーテル結合をそれぞれ形成する能力を該ペプチドに与えて共有結合安定化三量体コイルドコイル構造を得るために、コアキメラペプチド配列のＮＨ_２−またはＣＯＯＨ−末端に少なくとも２つのシステイン残基（すなわち“ＣＣ−キメラＮ−ペプチド”）または求電子部分（すなわち“誘導体化−キメラＮ−ペプチド”）を付加することによって修飾できる。１つの実施態様では、少なくとも２つのシステインアミノ酸残基がキメラＮ−ペプチドのコアα−ヘリカルドメインの外側に付加されて、酸化性条件下で隣接のＣＣ−キメラＮ−ペプチドと共にジスルフィドブリッドを形成できる“ＣＣ−キメラＮ−ペプチド”を生成する。付加システイン残基をヘリカル外側に配置するのは、該ペプチドのコイルドコイルコンホメーションと安定性ジスルフィド結合との干渉を最小にするためである。並列配向の３つのＣＣ−キメラＮ−ペプチドが物理的に会合すると、個々のポリペプチドモノマーのα−ヘリカル構造の結果としてシステイン残基が緊密に接近する。酸化性条件下でこれらの並列システイン残基は３つの鎖間で自発的にジスルフィドブリッジを形成する。別の実施態様では、ＣＣ−キメラＮ−ペプチドの操作されたシステインアミノ酸残基に存在するチオール−反応性官能基が隣接の誘導体化Ｎ−ペプチドの求電子部分（たとえば、アルキルハライド部分またはＭｉｃｈａｅｌ受容体）と共に共有結合的化学選択的結合を形成できる。該求電子部分は、キメラＮ−ペプチドの末端およびそのα−ヘリカルドメインの外側に付加される。これらのシステイン残基または求電子部分は、コアキメラＮ−ペプチドのＮＨ_２−末端に付加されてもＣＯＯＨ−末端に付加されてもよい。ＣＣ−および誘導体化−キメラＮ−ペプチドの付加システイン残基または求電子部分はそれぞれ、リンカーまたはスペーサー領域によってキメラペプチドのα−ヘリカル部分から隔てられる。スペーサー領域はキメラＮ−ペプチドのヘリカル構造を破壊し、末端システイン残基または求電子部分が共有結合形成に参加するためにコンホメーション的により大きい自由を与える。スペーサー／リンカー領域は、α−ヘリカル二次構造を破壊する能力をもつことが知られた短いアミノ酸配列（例えば、グリシンまたはプロリン残基；または、単一Ｄ−アミノ酸、アミノ酸の右旋性異性体）を含み得る。α−ヘリカル構造の破壊に必要な最少数の残基をスペーサーとして使用するのが好ましい。あるいは、スペーサー／リンカー領域が、化学的または合成リンカー、例えば、アミノペンタン酸、アミノヘキサン酸、または、Ｃ−アルファ側鎖のない何らかのアミノ酸を含むこともできる。
【００５４】
スカフォールドドメインの内部に局在する１つ以上のアミノ酸残基に１つ以上の低分子量ポリマー分子を付着させることによってポリマー修飾でき、該スカフォールドドメイン内部の１つ以上のエピトープを効果的に遮蔽し、免疫応答をキメラペプチドの非遮蔽部分（例えばＨＩＶ部分）に集中させる好ましい共有結合安定化三量体コイルドコイルは（ＣＣＩＺＮ１７）_３（配列：２）_３である。図１参照。このコイルドコイル構造は、以下のアミノ酸配列をもつ３つの等しいＣＣＩＺＮ１７キメラペプチドから成る：ＣＣＧＧＩＫＫＥＩＥＡＩＫＫＥＱＥＡＩＫＫＫＩＥＡＩＥＫＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ（配列：２）。前述のようにＣＣＩＺＮ１７は、コアキメラペプチド配列“ＩＺＮ１７”がＮ１７（配列：３２）のＮＨ_２−末端に融合したＩＺスカフォールドドメイン（上記配列の下線部分）から構成されているＣＣ−キメラＮ−ペプチドを表す。ＣＣＩＺＮ１７はさらに、コアキメラペプチドのＮＨ_２−末端に付加された安定なＣｙｓ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列：１０）を含む。２つの連続システイン残基は、ペプチドの酸化によって形成される緊密に会合したＣＣ−キメラＮ−ペプチドの並列システイン残基と共にジスルフィド結合形成に参加する。２つの連続グリシン残基は、システイン残基をコアキメラペプチド配列のα−ヘリカルドメインから隔てるスペーサー領域を表す。グリシンスペーサー領域は、システイン残基がコアペプチド配列のヘリカル二次構造に巻き込まれないことを確保し、この遊離システイン残基がジスルフィド結合形成に参加することを援助する。
【００５５】
従って、本発明の１つの実施態様は、（ＣＣＩＺＮ１７）_３のコア構造を有している共有結合安定化三量体コイルドコイルである。該コイルドコイル構造のスカフォールドドメインおよび該ドメインに内包されたエピトープは、該ドメインの内部または近傍に局在する１つ以上のアミノ酸残基に１つ以上の低分子量水溶性ポリマーを共有結合付着させた結果として選択的に遮蔽されている。後出の実施例１に詳細に記載する代表的ワクチン構築物では、スカフォールドドメイン内部に局在する２つのリシンアミノ酸残基が、市販のＰＥＧ２３６部分によってＰＥＧ付加され、本文中で“ＣＣＩＰＮ１７”と呼ぶペプチドが作製される。ＣＣＩＰＮ１７はＣＣＩＺＮ１７と同じアミノ酸配列（ＣＣＧＧＩＫＫＥＩＥＡＩＫＫＥＱＥＡＩＫＫＫＩＥＡＩＥＫＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ；配列：２）を有している。しかしながら上述のように、スカフォールドドメイン（イタリック体）の内部に局在する２つのリシン残基（下線部分）はＰＥＧ２３６によって共有結合的に修飾されている（図２参照）。従って、得られる（ＣＣＩＰＮ１７）_３ワクチン構築物のスカフォールドドメインは、各ペプチドモノマーに２つずつ存在する６つのＰＥＧ２３６部分によって遮蔽されている。ＨＩＶ ｇｐ４１融合中間体のミメティクスを表す低分子量ポリマー修飾（ＰＥＧ修飾を非限定例とする）されたコイルドコイル構造は、本文中に記載の種々のキメラペプチドおよび暫定米国特許出願番号６０／５７６，０６２および番号６０／６３６，７２４（前出）に記載のペプチドを使用して同様に作製し得る。
【００５６】
ペプチド間に形成されたジスルフィド結合を介して共有結合安定化される３つのＣＣ−キメラＮ−ペプチドをおのおのが含み本発明の一部として記載された方法によってポリマー修飾できる三量体コイルドコイル構造の例を表３に示す。表３の共有結合安定化三量体コイルドコイルの記述もまた、本発明方法がこれらの例に含まれたスカフォールドドメインの選択的遮蔽方法に限定されることを意味しない。
【００５７】
【表３】


【００５８】
上述のように、表３の共有結合安定化三量体コイルドコイルのおのおのはコアペプチド構造のα−ヘリカルドメイン外部に局在するシステイン残基間のジスルフィド結合の形成によって共有結合的に安定化されている３つのＣＣ−キメラＮ−ペプチドから成る。あるいは、前述のように、本発明によってポリマー修飾できる三量体コイルドコイルワクチン構造は、化学選択的結合の形成を介して共有結合的に安定化できる。例えば、２つの誘導体化キメラＮ−ペプチドの求電子部分と１つのＣＣ−キメラＮ−ペプチドの２つの付加システインアミノ酸残基のおのおののチオール官能基との間で２つの化学選択的結合が形成されて２つのチオエーテル共有結合が形成される。例えば、暫定米国特許出願番号６０／５７６，０６２および番号６０／６３６，７２４（前出）に詳細に記載されているＮＨ_２−Ｃ（Ｆｍ）（チオールＩＺＮ１７）_３と命名された三量体コイルドコイルミメティクスを本発明によってポリマー修飾できる。この三量体コイルドコイルは、以下のペプチドモノマーから成る：
１）ＮＨ_２−Ｃ（Ｆｍ）Ｔｔｄｓ−ＣＣＩＺＮ１７（表４のペプチド１）：可撓性スペーサー（−ＧＧ−；他の可撓性スペーサーも好適）を介してスカフォールドドメインから隔てられた２つのシステイン残基と以後の接合用の保護チオール基（フルオロメトキシ（Ｆｍ）保護基を使用するが他の保護基も適当）をもつ第三のシステイン残基とを有するペプチド：
２）ブロモアセチル−ＧＧＧＩＺＮ１７（表４のペプチド２）：可撓性リンカー（−ＧＧＧ−；２つの誘導体化キメラＮ−ペプチド鎖と１つのＣＣ−キメラＮ−ペプチドとの間の２つのチオエーテル結合の形成に適合性であるならば他の可撓性スペーサーも適当である）を介してスカフォールドドメインから隔てられたブロモアセチル部分を有するペプチド。
【００５９】
２つのペプチド前駆体ＮＨ_２−Ｃ（Ｆｍ）Ｔｔｄｓ−ＣＣＩＺＮ１７（表４のペプチド１）およびＢｒ−アセチル−ＧＧＧＩＺＮ１７（表４のペプチド２）をそれぞれ約１：２の濃度比でインキュベートして１つのＣＣ−キメラＮ−ペプチド（ペプチド１）と２つの誘導体化Ｎ−ペプチド（ペプチド２）とを有する三量体コイルドコイルを作製できる。化学選択的結合反応は、２つのチオエーテル結合の形成を伴って進行し、この反応で２つのＢｒ−アセチル−ＧＧＧＩＺＮ１７ペプチドの各ブロモ誘導体がＮＨ_２−Ｃ（Ｆｍ）Ｔｔｄｓ−ＣＣＩＺＮ１７ペプチドの２つの非保護システイン残基の１つと反応する（図８参照）。共有結合安定化三量体コイルドコイルの形成後、該三量体コイルドコイルの（例えば、精製樹脂またはＯＭＰＣへの）接合を容易にするために保護基を除去できる。
【００６０】
本発明の方法によってポリマー修飾できる化学選択的結合の形成を介して共有結合安定化三量体コイルドコイルを作製するために使用し得る追加のペプチドモノマーを単なる例として表４に示す。例えば、“ａｃ−Ｃ（チオＩＺＮ１７）_３”と命名された安定化コイルドコイルは、１つのａｃ−Ｃ（Ａｃｍ）Ｔｔｄｓ−ＣＣＩＺＮ１７ペプチド（表４のペプチド３）と２つのＢｒ−アセチル−ＧＧＧＩＺＮ１７ペプチド（表４のペプチド２）とを含むように合成し得る。得られる三量体コイルドコイルはＮＨ_２−末端システイン残基の保護基としてＡｃｍ（アセタミドメチル基）を有しており、これは以後の接合を容易にするために除去できる。
【００６１】
【表４】


【００６２】
ＰＥＧおよび類縁ポリマーのようなポリマー部分をタンパク質に見出される反応性基に付着させるために様々な手段が使用されてきた。参照：たとえば，米国特許番号４，１７９，３３７，Ｄａｖｉｓらに許諾、および、米国特許番号４，００２，５３１，Ｒｏｙｅｒに許諾。総説についてはＡｂｕｃｈｏｗｓｋｉら，Ｅｎｚｙｍｅｓ ａｓ Ｄｒｕｇｓ，Ｅｄｓ．Ｊ．Ｓ．Ｈｏｌｃｅｒｂｅｒｇ ａｎｄ Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８，ｐｐ．３６７−３８３およびＺａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ，１９９５，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．６：１５０−１６５を参照するとよい。タンパク質を修飾するためのＰＥＧおよび他のポリマーの使用はまた、以下の文献でも検討されている：Ｃｈｅｎｇ，Ｔ．Ｌ．ら，１９９９，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１０：５２０−５２８；Ｂｅｌｃｈｅｖａ，Ｎ．ら，１９９９，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１０：９３２−９３７；Ｂｅｔｔｉｎｇｅｒ，Ｔ．ら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．９：８４２−８４６；Ｈｕａｎｇ，Ｓ．−Ｙ．ら，１９９８，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．９：６１２−６１７；Ｓｃｈｗａｒｚ，Ｊ．Ｂ．ら，１９９９，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２１：２６６２−２６７３；Ｒｅｕｔｅｒ，Ｊ．Ｄ．ら，１９９９，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１０：２７１−２７８；およびＣｈａｎ，Ｔ．−Ｈ．ら，１９９７，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６２：３５００−３５０４。前述したように、タンパク質中の典型的なポリマー付着部位はリシン残基またはＮＨ_２−末端に存在する一次アミノ基、システイン側鎖に存在するチオール基、グルタメートもしくはアスパルテート残基、または、ＣＯＯＨ−末端に存在するカルボキシル基、などを含む。（例えば、循環半減期を改善するため、タンパク質分解および免疫原性を抑制するために）ＰＥＧのような水溶性ポリマーを対象ポリペプチドに付着させる場合、ポリマー部分をユーザーの定めた精度でコントロール的に付着させるのが難しいならば、一様でない結果が得られることになる。過去には、付着の推計的特性および水溶性ポリマーのヘテロ分散的特性を理由としてポリマー−タンパク質コンジュゲートの精製および分析キャラクタリゼーションが困難であった。
【００６３】
本文中に記載のようなＳＭＷポリマー修飾ポリペプチドの好ましい作製方法では、１つ以上のＳＭＷポリマーを対象タンパク質内部の部位特異的場所に付着させる。これは、本発明のように所期の生物応答（例えば、免疫応答）を誘導または促進できるように択一的部位を可用状態に維持しながらタンパク質内部の特定の（１つ以上の）生物活性部位を付着ポリマーによって遮蔽する予定であるときに特に重要である。ポリマーがタンパク質に部位特異的に結合した低分子量ポリマー誘導体化タンパク質（例えば、ＳＭＷ ＰＥＧ付加タンパク質）の調製は、付着鎖の個数および場所を完全にコントロールできる種々の方法によって達成される。例えば、ポリマーのランダムな付着を減少させる１つの試みでは、天然のリシンまたはシステインアミノ酸残基を除去し、同時に所望のポリマー付着部位にリシン／システインアミノ酸を再度付加したタンパク質を作製した（参照：たとえば，米国特許番号４，９０４，５８４）。あるいは、後出の実施例１に例示したワクチン構築物（ＣＣＩＰＮ１７）_３を固相ペプチド合成（“ＳＰＰＳ”）によって作製した。従って、本発明方法によって修飾すべきペプチドおよび／またはポリペプチドの合成は、標準全自動ペプチドシンセサイザーを使用する段階的標準Ｂｏｃおよび／またはＦｍｏｃ固相ペプチド合成で行うか、または、販売業者に注文し購入した標準プロトコルに従って手動操作で行う。参照：たとえば，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ，Ｅｄ．Ｇ．Ａ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９２；Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｅｄ．Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１９９３；Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｅｄｓ．Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｚｌｋｙ ａｎｄ Ａ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１９９４；Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ，Ｅｄ．Ｐ．Ｊ．Ｋｏｃｉｅｎｓｋｉ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ：Ｇｅｏｒｇ Ｔｈｉｅｍｅ Ｖｅｒｌａｇ，１９９４；およびＦｍｏｃ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅｄｓ．Ｗ．Ｃ．Ｃｈａｎ ａｎｄ Ｐ．Ｄ．Ｗｈｉｔｅ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０００。
【００６４】
天然型化学結合（Ｄａｗｓｏｎ，Ｐ．Ｅ．ａｎｄ Ｓ．Ｂ．Ｋｅｎｔ，２０００，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６９：９２３−６０）のような化学選択的方法を使用すると、全化学合成によってもっと大きいポリマー修飾タンパク質も容易に得られる。その優れた代表例は、Ｋｏｃｈｅｎｄｏｅｒｆｅｒ，Ｇ．Ｇ．ら（２００３，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９９：８８４−８７）によって示されており、Ｋｏｃｈｅｎｄｏｅｒｆｅｒ，Ｇ．Ｇ．ら，米国非暫定出願番号１０／３３２，３８５，ＵＳ公開番号ＵＳ２００４／０１１５７７４にいっそう詳細に記載されている。該文献では著者／発明者らが２つの部位特異的ＨＷＭ分枝状ＰＥＧ分子を含む１６６アミノ酸のタンパク質を累積収率２５−４０％で作製した。この文献に記載されたＨＭＷ分枝状ＰＥＧの付着に関する化学理論はＳＭＷ ＰＥＧ部分の導入に容易に応用できる。しかしまた、利用可能な多くの他の選択肢も存在しており（Ｈａｒｒｉｓ，Ｊ．Ｍ．ａｎｄ Ｒ．Ｂ．Ｃｈｅｓｓ，２００３，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．２：２１４−２２１）、それらは当業者に公知である。Ｋｏｃｈｅｎｄｏｅｒｆｅｒら，２００３（前出）で作製されたタンパク質ＳＥＰのサイズは、ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質のｇｐ１２０サブユニットのサイズと同等であり、糖残基の選択的付加に基づいて該タンパク質のエピトープを隠蔽する戦略が提案されている。従って、特定の免疫反応性を減退させるかまたは完全に除去して別の免疫反応性の利益になるようにＳＭＷ ＰＥＧで選択的に誘導体化されるｇｐ１２０に基づくＨＩＶワクチンが完全に化学的な合成方法で得られることは明らかである。
【００６５】
本文中に記載したようなポリマー修飾タンパク質の代替的作製方法では、組換えＤＮＡ方法によって産生された適当な前駆体タンパク質にＳＭＷポリマー（例えばＰＥＧ）を化学選択的に付着させる。より具体的に、Ｂｅｒｔｏｚｚｉおよび共同研究者らは、組換えタンパク質内部の任意の位置にアジド基を組込む普遍的に応用できる戦略を開発した（Ｋｉｉｃｋ，Ｋ．Ｌ．ら，２００２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９：１９−２４）。該方法は、細胞の先天的翻訳装置によってプロセスされる非天然アミノ酸の利用から成る。アジドホモアラニン（メチオニン代用物）を大腸菌のメチオニル−ｔＲＮＡシンテターゼによって活性化し、メチオニン欠失細菌培養物中で発現されたタンパク質のメチオニンを置換する。アジドはＳｔａｕｄｉｎｇｅｒ結合と呼ばれる極めて化学選択的な反応にホスファンと共に参加して、最終的にタンパク質とホスファン付着部分とを接合する安定なアミド結合を形成する（参照：Ｋｏｈｎ，Ｍ．ａｎｄ Ｒ．Ｂｒｅｉｎｂａｕｅｒ，２００４，Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．４３：３１０６−１６；Ｓａｘｏｎ，Ｅ．ら，２０００，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２：２１４１−３；Ｓａｘｏｎ，Ｅ．ａｎｄ ＣＲ．Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，２０００，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：２００７−１０）。例えば、ＣＣＩＰＮ１７（実施例１参照）に使用したＳＭＷ ＰＥＧすなわちＰＥＧ２３６のＳｔａｕｄｉｎｇｅｒ結合は、対応するホスフィノチオエステル１と共に行うことができ、後者は以下の反応スキーム１に従ってアジドホモアラニンに結合するであろう：
【００６６】
【化１】

【００６７】
もっと長鎖のＰＥＧのホスフィノチオエステルの合成が記載されている（Ｓｏｅｌｌｎｅｒ，Ｍ．Ｂ．ら，２００３，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５：１１７９０−１）。アジドホモアラニンを含有する組換えタンパク質を作製するためのタンパク質サイズの制限は先験的には存在しないので、一次配列内部のいずれかの選択的場所に付着したＳＭＷポリマー鎖によって任意の長さのタンパク質を作製する方法は従来技術に存在している。
【００６８】
本発明のポリマー修飾ポリペプチドを設計するとき、先ず、ターゲットタンパク質のアミノ酸配列を、典型的には遺伝子および／またはタンパク質のデータベースのようなデータベースを含む様々なソースのいずれか１つ以上から入手するかまたは例えば新しい対象タンパク質ターゲットのタンパク質同定によって新規に獲得する。このようなデータベースの非限定例は、ＧｅｎｅＢａｎｋ（Ｂｅｎｓｏｎら，１９９８，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６：１−７；ＵＳＡ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，ＵＳＡ），ＴＩＧＲ Ｄａｔａｂａｓｅ（Ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．，ＵＳＡ），Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＵＳＡ）およびＥｘＰＡＳｙ ａｎｄ Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ（Ｓｗｉｓｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，Ｇｅｎｅｖｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を含む。設計戦略に使用されるポリペプチド主鎖は、ターゲット配列（例えば、ポリペプチド鎖の成熟形態）の一部分（例えば、ドメイン）または全部を表すことができる。次に、所与のターゲットタンパク質について所望のポリマー修飾ポリペプチド構造を設計する。この設計戦略は、ポリペプチドの修飾に使用する水溶性ポリマーの選択、ポリペプチド内部の（１つ以上の）ポリマー付着部位、使用する付着戦略を含む。本発明では特に、ＳＭＷポリマーの付着によってどの部位を特異的に遮蔽すべき／できるかを同定および査定するために、最初にポリペプチドアミノ酸配列について１つ以上の機能部位（例えば、グリコシレーション部位、免疫原性部位またはプロテアーゼ感受性部位）の存在を調べる。生物活性部位はしばしば、ヘリックスまたはベータ−シート二次構造；典型的にはループおよびターン領域が実質的に存在しない領域を表す。従って、本文中に記載したようにＳＭＷポリマーの付着を介して隠蔽すべき機能部位は、モデリング方法を使用して同定できる。モデリングは、ターゲットタンパク質の所与の核酸またはアミノ酸配列の部分または全部について、対象ポリペプチドに関する二次元構造情報、対象タンパク質に関する三次元構造情報、またはそれらの組合せを比較できるホモロジーモデリングソフトウェアアルゴリズムまたはプログラムの使用のようなバイオコンピューター処理を含む。いくつかのソフトウェアプログラムおよびデータベースが公知でありこの目的に可用である。これらの方法を組込んだソフトウェアプログラムの一例は、“ＭＡＸＶＥＣＴＯＲ”（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒｏｕｐ）であり、これは多重タンパク質分析ツールを内蔵し、二次構造（Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ ａｎｄ Ｒｏｂｓｏｎ−Ｇａｒｎｉｅｒ ｍｅｔｈｏｄｓ）；親水性（Ｈｏｐｐ−Ｗｏｏｄｓ，Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｇｏｌｄｍａｎ−Ｅｎｇｅｌｍａｎ−Ｓｔｅｉｔｚ（ＧＥＳ） ａｎｄ ｖｏｎ−Ｈｅｉｊｎｅ ｍｅｔｈｏｄｓ）；疎水性（Ｆａｕｃｈｅｒｅ−Ｐｌｉｓｋａ，Ｊａｎｉｎ，Ｍａｎａｖａｌａｎ，Ｓｗｅｅｔ−Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ ｍｅｔｈｏｄｓ）；抗原性（Ｈｏｐｐ−Ｗｏｏｄｓ，Ｐａｒｋｅｒ，Ｐｒｏｔｒｕｓｉｏｎ Ｉｎｄｅｘ（Ｔｈｏｒｎｔｏｎ），Ｗｅｌｌｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ）；表面確率（Ｋａｒｐｌｕｓ ＆ Ｓｃｈｕｌｔｚ’ｓ ｍｅｔｈｏｄｓ）；可撓性（Ｊａｎｉｎ ａｎｄ Ｅｍｉｎｉ ｍｅｔｈｏｄｓ）；両親媒性（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ ｍｅｔｈｏｄ）；ＰＲＯＳＩＴＥ−に基づくサブ配列データベースおよびユーザーの定めたサブ配列；カスタム化配列セット；プロテアーゼ部位とタンパク質分解性消化の予測値、などを予測する。このようにして、ターゲット天然タンパク質またはミメティクスの三次元構造および化学的性質を考慮することはポリマー付着場所の選択に役立つであろう。
【００６９】
例えば、タンパク質中の免疫原性部位を予測するために以下の方法を使用できる。タンパク質配列の二次構造を最初に予測し、無秩序領域、特にターンを同定する。この目的にはＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎパラメーターが特に役立つ（Ｃｈｏｕら，１９７８，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ４７：４５−１４８；Ｑｉａｎら，１９８８，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０２：８６５−８８４；およびＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．の“ＰＥＰＥＰＬＯＴ”プログラム）。また、タンパク質配列の疎水性は、典型的には標準方法（たとえば，Ｆａｕｃｈｅｒｅ−ＰｌｉｓｋａまたはＨｏｐｐ−Ｗｏｏｄｓの疎水性予測法；またはＢｕｌｌ−Ｂｒｅｅｓｅ）による６残基の走行平均を使用して走査する。より親水性の領域はターンである領域に特に注意して同定する。同時に、Ｎ−結合部位およびＯ−結合部位を含むグリコシル化部位を同定する。タンパク質中の最も親水性の部位は、それがターンに存在しグリコシル化されていると予測されていないならば免疫原性の確率が高いのでポリマー修飾部位として使用できるであろう。親水性が順次に低くなる親水性領域に同じ基本法則を応用し二次的なポリマー修飾用部位を同定する。
【００７０】
また、生物学的および化学的分析も本発明によるポリマー付着が効果的な特異的場所を同定するために使用し得る。例えば、アラニン走査は、免疫原性部位、プロテアーゼ感受性部位またはポリマー修飾に適した他の部位を同定するために使用でき、生物活性に必要な不変残基を同定するために特に有用である。アラニン走査はまた、上記のような他のタンパク質分析ツールと併用することもできる。別の方法は、修飾用水溶性ポリマー分子が各分子のポリペプチド鎖中の異なる部位に局在している合成した対象タンパク質のライブラリーを体系的に作製することである。ポリマー修飾ポリペプチド鎖のライブラリーのフォールデイング後、例えば、フォールドした分子をフォールドしない分子からまたは受容体結合分子を非結合分子から分離するために機能性選択／アッセイを実行できる。次いで機能性分子についてポリマー修飾部位の好ましい場所を決定できる。このような方法では、非干渉性ポリマー修飾部位の同定を容易にするために“ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ａｎａｌｙｓｉｓ”の原則を利用できる（Ｍｕｉｒら，１９９６，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．３：８１７−８２５）。上述のような様々な付着化学が存在するので、水溶性ポリマーとターゲットペプチドまたはポリペプチドとの間に形成される結合は、カーボネート、エステル、ウレタン、オルトエステル、アミド、アミン、オキシム、イミド、ウレア、チオウレア、チオエーテル、チオウレタン、チオエステル、エーテル、チアゾリジン、ヒドラゾン、オキサゾリジンなどから選択された結合を含むことができる。
【００７１】
本発明の１つの目的は、特定の疾患または状態（非限定例としてＨＩＶ感染／ＡＩＤＳを含む）に対する患者の免疫防御を誘発したりおよび／または患者体内でこのような状態の原因となる病理発生を抑制するためにヒトまたはヒト以外の哺乳類患者に投与できるワクチンに関する。一般に、本発明のワクチンは、真菌類、原生動物、細菌およびウイルス（例えばインフルエンザウイルス、特にＨＩＶ）を非限定例とする多くの病原性生物に対する免疫防御を与えることができる。本発明の１つの実施態様で、ワクチンは、本文中に記載しかつ暫定米国特許出願６０／５７６，０６２および６０／６３６，７２４（前出）により詳細に記載された共有結合安定化三量体コイルドコイル構造のポリマー修飾形態を含み、これはＨＩＶ ｇｐ４１を非限定例とするエンベロープウイルスタンパク質の融合中間体のミメティクスを表す。本発明の１つの実施態様では、共有結合安定化コイルドコイルミメティクス内部に含まれた個々のキメラペプチドの１つ以上が、ＰＥＧを非限定例とする低分子量水溶性ポリマーによって修飾され、その結果としてコイルドコイルの安定性スカフォールドドメインの全部または一部分、従って該ドメインに内包されている１つ以上のエピトープが免疫由来受容体／細胞と相互作用しないようにポリマーによって遮蔽されている。従って本発明は、本文中に記載のポリマー修飾ワクチン構築物を治療有効量（後記に定義）で投与する哺乳動物の免疫方法または病原性生物に対する防御免疫応答の誘導方法に関する。方法は、単独で存在するかまたは非天然型ポリペプチド成分（例えば、前述のようなスカフォールドコイルドコイル）に結合して（例えば、融合ペプチド／タンパク質として）存在する天然型病原性抗原の全部または一部分のポリマー修飾形態（例えば、１つ以上のＳＭＥ ＰＥＧ部分によって修飾）を含むワクチンを哺乳動物に投与する段階を含む。ポリマーの付加は、該ポリマーの存在によって遮蔽された領域を免疫減衰し、免疫応答を抗原の非隠蔽部分に集中させる。従って、本発明の１つの実施態様は、脊椎動物の生体組織、好ましくはヒトまたはヒト以外の商業用もしくは飼育用の獣医学的に重要な哺乳動物のような哺乳類宿主に直接導入されるとヒト免疫不全ウイルス−１（ＨＩＶ−１）を特異的に認識する細胞性免疫応答を誘導するＨＩＶ医薬製品、その製造および使用（本文中に記載）に関する。
【００７２】
従って、本発明のポリマー修飾ポリペプチドの好ましい用途は、治療有効量のワクチン形態のポリペプチドを哺乳動物に投与する段階を含む、哺乳動物の疾患状態、例えばＨＩＶ感染の治療である。これは、ヒトまたはヒト以外の哺乳類の疾患個体のいかなる治療も包含し、例えば：（ｉ）当該疾患への素因はあるけれども罹患していると診断されたことがない個体の発症予防；（ｉｉ）疾患の進行の阻害および／または停止；または、疾患の軽減、すなわち疾患の退行の惹起、を含む。本文中に使用した“治療有効量”という用語は、哺乳動物に投与したとき治療効果を生じるため、例えば哺乳動物のＨＩＶ−１感染を阻害するために十分な本発明のポリマー修飾ポリペプチドおよび／または該ポリペプチドを含有するワクチン組成物の量を意味する。“治療有効量”を構成する量は、ポリペプチド、状態または疾患の種類とその重篤度、治療される哺乳動物の体重、年齢、などに従って変更されるが、平均的な当業者は現状の知識およびこの開示に基づいてその量を容易に決定できるであろう。
【００７３】
ペプチドのような低分子は免疫原性に乏しく、従って、該分子に対する実体的な免疫応答を誘発するためにより大きい巨大分子（担体）とのペプチド接合体を調製することがしばしば必要である。従って、本発明のポリマー修飾ポリペプチドはさらに免疫原性担体に接合し得る。本文中に記載したコイルドコイル構造の場合、個々のポリマー修飾α−ヘリカルキメラペプチド（例えば、ＣＣＩＰＮ１７）を最初に免疫原性担体に接合し、次いで、個別に接合した３つのペプチドから成る共有結合安定化ホモ三量体またはヘテロ三量体コイルドコイル構造の形成に導く条件を作用させる。あるいは、本発明のキメラペプチドから成る共有結合安定化ポリマー修飾ホモ三量体またはヘテロ三量体コイルドコイル構造を免疫原性担体にコンジュゲートさせてもよい。通常はヘテロロガスタンパク質から成る担体分子は、コイルドコイルの非隠蔽部分（例えば、ＨＩＶ部分）に対する免疫応答の誘発および／または増進を援助する。ポリマー修飾ポリペプチドは、非特異的架橋剤、一属性（ｍｏｎｏｇｅｎｅｒｉｃ）スペーサーまたは二属性（ｂｉｇｅｎｅｒｉｃ）スペーサーによって免疫原性担体に連結できる。本発明のポリマー修飾ポリペプチドがコンジュゲートできる多くの免疫原性担体分子が当業界で公知である（参照：たとえば，Ｓｈｏｄｅｌら，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４４：９１−９６；Ｌａｎｇ ａｎｄ Ｋｏｒｈｏｎｅｎ，１９９７，Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｉｎｓｔ．Ｍｉｔｔ．９８：４００−４０９；Ｂｒｅｎｎａｎら，２００１，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：１５−２６；Ｐｕｍｐｅｎｓ ａｎｄ Ｇｒｅｎｓ，２２０１，Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ ４４：９８−１１４；およびＳｉｍｐｓｏｎら， １９９９，Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．５６：４７−６１）。このような潜在能力をもつ免疫原性分子の非限定例は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ ＯＭＰＣ粒子、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、オボアルブミン（ＯＶＡ）、チログロブリン（ＴＧ）、ＨＢＶ−コア抗原、ＨＢＶ−表面抗原や、破傷風毒素、ジフテリア毒素またはロタウイルスＶＰ６のような免疫原性タンパク質、および、ｐ２４含有ＨＩＶキャプシド粒子である。
【００７４】
従って本発明の１つの実施態様では、本文中に記載のポリマー修飾ＨＩＶ−特異的ペプチドミメティクスをＨＩＶ感染の防止または防御（例えば予防または治療）用ワクチンの成分として使用し、ＨＩＶに対して免疫活性のＨＩＶ−特異的中和抗体を生成させることができる。ワクチンはＭＰＬ−Ａのような当業界で公知のアジュバントに配合し、ミョウバンまたはリン酸アルミニウムに吸着させる。抗原性接合体はまた、より強力なヘルパーＴ細胞応答を実現するために、合成の非天然ｐａｎ ＨＬＡ ＤＲ−結合エピトープ（ＰＡＤＲＥ）を非限定例とするＴ細胞ヘルパーエピトープを含み得る（参照：たとえば，Ａｌｅｘａｎｄｅｒら，２０００，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６４：１６２５−１６３３およびｄｅｌ Ｇｕｅｒｃｉｏら，１９９７，Ｖａｃｃｉｎｅ １５：４４１−４４８）。本文中に記載のポリマー修飾ポリペプチドの免疫原性接合体は、それらの構成成分パーツ（ポリマー修飾ポリペプチドと担体）を単離、合成および精製し、次いで２つの成分を接合することによって調製し得る。所望ならばその後にコンジュゲート混合物の精製を行ってもよい。ポリマー修飾ポリペプチドと適当な免疫原性担体との抗原性接合体は、構成成分パーツ（すなわち、ポリマー修飾ポリペプチドと担体）間に少なくとも１つの共有結合連結を有しており、典型的には２つ以上のポリマー修飾ポリペプチド分子が担体分子のおのおのに共有結合している。構成成分を別々に調製するならば、その後、非特異的架橋剤、一属性スペーサーまたは二属性スペーサーによって連結できる。非特異的架橋の方法は当業界で公知であり、その非限定例は、グルタルアルデヒドとの反応、スクシニル化担体添加または不添加で行うＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドとの反応、グリコシル化置換基のペルヨージド酸化次いでホウ水素化ナトリウムまたはシアノホウ水素化ナトリウムの存在下で行うタンパク質担体の遊離アミノ基への結合、芳香族アミノ基のジアゾ化次いでタンパク質のチロシン側鎖残基への結合、イソシアナートとの反応、または、混合無水物との反応を含む。概要についてはＢｒｉａｎｄら，１９８５，Ｊ．Ｉｍｍ．Ｍｅｔｈ．７８：５９−６９を参照するとよい。
【００７５】
本文中に記載のキメラペプチドと例えば樹脂または担体との接合を容易にするために、本発明のポリマー修飾ポリペプチド、例えばＣＣＩＰＮ１７をさらに修飾して、追加のシステイン残基を含有させてもよい。ＣＣＩＺＮ１７／ＣＣＩＰＮ１７の場合、これはペプチドのＮＨ_２−末端に１個の追加システインアミノ酸残基を組込むことである（たとえば，“ＣＣＣＩＺＮ１７”−ＣＣＣＧＧＩＫＫＥＩＥＡＩＫＫＥＱＥＡＩＫＫＫＩＥＡＩＥＫＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ；配列：７６）。場合によっては、奇数番号の末端システイン残基を可撓性化学リンカー、例えば、Ｔｔｄｓ（１−アミノ−４，７，１０−トリオキサ−１３−トリデカミンコハク酸；−ＮＨ−（ＣＨ_２）_３−Ｏ−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−（ＣＨ_２）_３−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ_２）_２−ＣＯ−を用いて残りの連続システイン残基から分離してもよい。暫定米国特許出願６０／５７６，０６２および６０／６３６，７２４（前出）参照。奇数番号のシステイン残基は、本文中に記載のようなポリマー修飾ＣＣ−および／または誘導体化キメラＮ−ペプチドを含む共有結合安定化三量体の形成後に、共有結合安定化三量体あたり少なくとも１つの反応性チオール基がマレイミジルのようなチオール−反応性基とさらに反応するために可用であることを確保する。リンカーは、三量体化ドメインとシステイン残基とのジスルフィドブリッジ間に接合／誘導体化に適した可撓性、可溶性および間隔を提供する。追加のシステイン残基は、該システイン残基がジスルフィド結合または化学選択的結合の形成（例えば、チオエーテル結合形成）および／またはポリマー付着に参加することを防止するために保護チオール基を有していてもよい。保護基（非限定例はフルオレニルメトキシ（“Ｆｍ”）またはアセタミドメチル（“Ａｃｍ”）基を含む）は共有結合安定化三量体コイルドコイルの形成後に除去することができ、新しく露出したチオール基が以後の接合反応に可用である。
【００７６】
本発明のワクチンは、宿主に投与するための医薬的に有効な配合物に配合し得る。このような配合物は例えば、リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）のような生理的塩類溶液でよい。本発明のワクチン構築物に長期間安定性も与えるような医薬的に許容される配合物の使用が有用であろう。様々な保存条件（例えば、ｐＨ、バッファの種類、塩濃度、光照射、高温度、低イオン強度）はペプチドワクチンの安定性を最適にするように配合物中でコントロールし得る。ワクチンは、それぞれのワクチン配合物にアジュバントを添加するかまたは不添加で投与し得る。従って本発明のペプチドワクチンはまた、本発明のワクチン構築物の免疫原性を増強する１種以上のアジュバントと配合し得る。数多くのこのようなアジュバントが当業界で公知である。本発明のワクチンに使用するためのアジュバントの２つの例は、１つ以上の形態のリン酸アルミニウム基剤のアジュバントおよびサポニンアジュバントＱＳ２１（サポニンと３Ｄ−モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）の精製形態、リポ多糖（ＬＰＳ）の無毒誘導体）であり、おのおのが多くの動物モデル体内でワクチンに対して有効な体液性および細胞性応答を示す。熟練の当業者は最適免疫応答を与えるようにペプチドワクチン対アジユバント比を調整し得る。別のアジュバントは、ＰＯＥ−ＰＯＰ−ＰＯＥブロックコポリマーのようなポリオキシエチレン（ＰＯＥ）およびポリオキシプロピレン（ＰＯＰ）のブロックを含む非イオン性ブロックコポリマーである（Ｎｅｗｍａｎら，１９９８，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ １５（２）：８９−１４２）。基本構造は、ＰＯＥ−ＰＯＰ−ＰＯＥブロックコポリマーのようなポリオキシエチレン（ＰＯＥ）およびポリオキシプロピレン（ＰＯＰ）のブロックを含む。Ｎｅｗｍａｎら（同書）は、ある種のＰＯＥ−ＰＯＰ−ＰＯＥブロックコポリマーがインフルエンザタンパク質基剤のワクチンにアジュバントとして有用であろうと開示している。すなわち、約９０００ドルトンから約２０，０００ドルトンの範囲の分子量を有している中央ＰＯＰブロックとコポリマーの全分子量の約２０％までを含むフランキングＰＯＥブロックとを含む高分子量ＰＯＥ−ＰＯＰ−ＰＯＥブロックコポリマーである（参照：米国再発行特許番号３６，６６５，米国特許番号５，５６７，８５９，番号５，６９１，３８７，番号５，６９６，２９８および番号５，９９０，２４１、すべてＥｍａｎｕｅｌｅらに許諾、これらのＰＯＥ−ＰＯＰ−ＰＯＥブロックコポリマー関連）。ＷＯ９６／０４９３２はさらに、界面活性剤特性を有しておりワクチンアジュバントとして生物効果を示す高分子量ＰＯＥ／ＰＯＰブロックコポリマーを開示している。この文節に引用した上記文献はそれらの記載内容全部が参照によって本発明に含まれるものとする。従って、アジュバント不添加ワクチン投与に比べて本発明のワクチン構築物の免疫応答を増強するために有効なアジュバントの利用は当業者の認識範囲に入っている。
【００７７】
本発明のワクチン構築物は、経腸的および非経口的経路のような当業界で公知の手段のいずれかによって投与できる。これらのデリバリー経路は非限定的に、筋肉内注射、腹腔内注射、静脈内注射、吸入または鼻腔内デリバリー、経口デリバリー、舌下投与、皮下投与、経皮投与（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ，ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ，ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、または何らかの形態の粒子衝撃または何らかの可用な無針注入デバイスを含む。ワクチンレシピエントに導入すべきポリマー修飾ポリペプチド構築物の量は、ポリペプチドの免疫原性に従属するであろう。また、本発明のワクチンに対する全体的免疫応答を最適にするようにブースターワクチンを接種することも考察される。
【００７８】
本文中で言及したすべての刊行物は本発明に関連して使用する方法および材料を記載および開示する目的で引用した。本発明が従来発明によるこれらの開示に先行する権利がないと是認したと解釈すべきではない。
【００７９】
本発明の好ましい実施態様を添付図面と共に記載したが、本発明がこれらの具体的な実施態様に限定されないこと、特許請求の範囲に記載の本発明の範囲または要旨を逸脱することなく様々な変更および修正が当業者に可能であることを理解されたい。従って、以下の実施例は本発明の例示であるが本発明の限定ではない。
【実施例１】
【００８０】
望ましくないエピトープを遮蔽するためのＳＭＷ ＰＥＧの使用：
ＳＭＷ ＰＥＧ−誘導体化ＨＩＶワクチンの設計
この実施例はＨＩＶワクチンの分野に役立つ本発明の１つの用途を示す。ＨＩＶ ｇｐ４１のＮ−ヘリックスの三量体コイルドコイルのミメティクスを表すサブユニットワクチンとして使用するように操作したペプチドを予め設計した（参照：暫定米国特許出願番号６０／５７６，０６２および６０／６３６，７２４（前出））。これらのサブユニットワクチンは、設計した可溶性三量体コイルドコイル（“スカフォールド”領域）と、ＨＩＶ ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルの一部分と、鎖間共有結合形成用共有結合安定化部分とを含むキメラペプチドである。このようなミメティクスの一例を図１Ａに概略的に示す。これは“（ＣＣＩＺＮ１７）_３”と命名した共有結合安定化三量体コイルドコイルを表す。（ＣＣＩＺＮ１７）_３［配列：２］_３内部の３つのキメラＣＣＩＺＮ１７ペプチドを共有結合安定化するジスルフィド結合の化学構造図を図１Ｂに示す。３つのジスルフィド結合がＮＨ_２−末端システイン残基のチオール（−ＳＨ）基間に局在している。システイン残基のカルボキシ末端に局在する連続アミノ酸は一文字命名法の活字体で示す（図１Ｂ）。ｇｐ４１のプレヘパリン複合体を模倣する三量体コイルドコイルのＨＩＶ部分（Ｎ−ペプチド部分；例えば（ＣＣＩＺＮ１７）_３中の“Ｎ１７”）の安定な提示には、スカフォールド領域および鎖間共有結合の双方が必須である。ｇｐ４１のＮ１７領域によって生成されるコンホメーションエピトープをターゲットする抗体は、Ｎ１７を内包する三量体コイルドコイルすなわち疎水性ポケット内部に拘束されたとき、単一サイクル感染力アッセイでＨＩＶ−１に対する抗ウイルス活性を示す（参照：暫定米国特許出願、出願日２００４．６．１）。ＨＩＶ ｇｐ４１の三量体コイルドコイルＮ−ペプチド部分を特異的にターゲットする抗体を増感するこのクラスのペプチドワクチンの使用を容易にするために、本発明の発明者らは、スカフォールドと鎖間共有結合とを含む部分を免疫認識から遮蔽しながらペプチドミメティクスのＨＩＶ部分に選択的に集中した免疫応答を誘導する戦略を計画した。
【００８１】
ＣＣＩＺＮ１７（配列：２）の合成−
ペプチドＣＣＩＺＮ１７（配列：２）は、Ｐｉｏｎｅｅｒペプチドシンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でＦｍｏｃ／ｔ−Ｂｕ化学を使用して固相合成した。使用した樹脂は、Ｆｍｏｃ−Ｌｉｎｋｅｒ ＡＭ−Ｃｈａｍｐｉｏｎ、１％架橋（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）であり、これは、修飾Ｒｉｎｋリンカーｐ−［（Ｒ，Ｓ）−α−［９Ｈ−フルオレン−９−イル−メトキシホルムアミド］−２，４−ジメトキシベンジル］−フェノキシ酢酸（Ｒｉｎｋ，Ｈ．，１９８７，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２８：３７８７−３７８９；Ｂｅｒｎａｔｏｗｉｃｚ，Ｍ．Ｓ．ら，１９８９，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３０：４６４５−４６６７）によって誘導体化したＰＥＧ−ＰＳ基材樹脂である。すべてのアシル化反応は樹脂遊離アミノ基の４倍過剰量の活性化アミノ酸で６０−１２０分行った。アミノ酸は、等モル量のＨＢＴＵ（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）および２倍モル過剰量のＤＩＥＡ（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン）で活性化した。側鎖保護基は以下を使用した：グルタミン酸（Ｇｌｕ）およびトレオニン（Ｔｈｒ）にｔｅｒｔ−ブチル；システイン（Ｃｙｓ）およびグルタミン（Ｇｌｎ）にトリチル；リシン（Ｌｙｓ）およびトリプトファン（Ｔｒｐ）にｔｅｒｔ−ブトキシ−カルボニル；アルギニン（Ａｒｇ）に２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル。アセチル化反応は、ペプチド組立の終了後、１０倍過剰量の無水酢酸とＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で反応させることによって行った。合成の終了後、乾燥ペプチド−樹脂を、８８％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、５％フェノール、２％トリイソプロピルシランおよび５％水（Ｓｏｌｅ，Ｎ．Ａ．ａｎｄ Ｇ．Ｂａｒａｎｙ，１９９２（前出））によって室温で１．５時間処理した。樹脂を濾過し、溶液を低温メチル−ｔ−ブチルエーテルに加えてペプチドを沈殿させた。遠心後、ペプチドペレットを新しい低温メチル−ｔ−ブチルエーテルで洗浄して有機スカベンジャーを除去した。このプロセスを２回繰返した。最終ペレットを乾燥し、Ｈ_２Ｏ、２０％アセトニトリルに再懸濁させ、凍結乾燥した。
【００８２】
粗ペプチドＣＣＩＺＮ１７（配列：２）をＴｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ−５０Ｓ樹脂を詰めた７００×２６ｍｍカラムで、３０％アセトニトリルを含む水、０．１％ＴＦＡを溶出剤として使用し、ゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって精製した。典型的な処理では、３００ｍｇの粗ペプチドを１２ｍＬの溶出剤に溶解し、流速１ｍＬ／分でカラムに直接充填した。溶出画分の分析用ＨＰＬＣは、Ｂｅｃｋｍａｎ ＨＰＬＣで、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ_４カラム（１５０×４．６ｍｍ，５μｍ）を用い、溶出剤Ｂ（上記）の以下の勾配：４０％−６０％のＢ（２０分）−８０％（３分）、流速１ｍＬ／分を使用して行った。純度に基づいて画分をプールし、セミ・プレパラティブＷａｔｅｒｓ ＲＣＭ Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ^ＴＭ Ｃ_４カートリッジ（４０×２００ｍｍ，１５μｍ）を用い、溶出剤として（Ａ）水中の０．１％のＴＦＡ、（Ｂ）アセトニトリル中の０．１％のＴＦＡを使用する逆相ＨＰＬＣによってさらに精製した。溶出剤Ｂの以下の勾配を使用した：３５％−５０％，２０分超，流速８０ｍＬ／分。Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＬＣＺ ｐｌａｔｆｏｒｍ質量分析計でエレクトロスプレー質量分析法によって精製ペプチドのキャラクタリゼーションを行った。理論的平均分子量（ＭＷ））は５１７５Ｄａであり、測定ＭＷは５１７５Ｄａである。
【００８３】
ＣＣＩＺＮ１７から（ＣＣＩＺＮ１７）_３への酸化−
精製ペプチド前駆体（１２ｍｇ）、ＣＣＩＺＮ１７（配列：２）を０．１ＭのＨｅｐｅｓ，ｐＨ７．３（ＵＳＢ Ｃｏｒｐ．）に１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した。この条件下で、ＣＣＩＺＮ１７は空気によってゆっくりと酸化して共有結合三量体（ＣＣＩＺＮ１７）_３（［配列：２］_３）になる。図１Ｂ参照。酸化反応は、Ｗａｔｅｒｓ−Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＬＣＺ Ｐｌａｔｆｏｒｍで、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ_４カラム（１５０×４．６ｍｍ，５μｍ）を用い、溶出剤として（Ａ）水中の０．１％ＴＦＡおよび（Ｂ）アセトニトリル中の０．１％ＴＦＡを使用するＬＣ−ＭＳ分析によってモニターした。溶出剤Ｂの以下の勾配を使用した：４０％−６０％Ｂ（２０分）−８０％（３分）、流速１ｍＬ／分。これらのクロマトグラフィー条件で、ＣＣＩＺＮ１７はｔ_Ｒ＝１３．２５’に溶出する。酸化反応は３時間円滑に進行しｔ_Ｒ＝１５’に溶出する主生成物が形成される。生成物の質量は、３つのジスルフィドブリッジの形成に合致する質量減を有する３つのＣＣＩＺＮ１７ペプチド鎖（［ＣＣＩＺＮ１７］_３）を含む１分子の質量に対応する。酸化反応の総収率は８０％超である。溶液（１２ｍＬ）に２４μＬのＴＦＡを添加し、溶液をＴＳＫｇｅｌ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ−５０Ｓ樹脂を詰めた７００×２６カラムに充填し、溶出剤としてＨ_２Ｏ／アセトニトリル７０／３０、０．１％ＴＦＡ、流速１ｍＬ／分を使用した。溶出分画をＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ_４カラム（１５０×４．６ｍｍ，５μｍ）で、溶出剤として：（Ａ）水中の０．１％ＴＦＡおよび（Ｂ）アセトニトリル中の０．１％ＴＦＡを使用し、ＨＰＬＣによって分析した。ＬＣ−ＭＳ Ｗａｔｅｒｓ−Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＬＣＺ Ｐｌａｔｆｏｒｍで溶出剤Ｂの以下の勾配を使用した：４０％−６０％Ｂ（２０分）−８０％（３分）、流速１ｍＬ／分。共有結合三量体に対応するプール画分を、ＥＳＩ−ＱｑＴｏＦ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、正モード（ＥＳ^＋）、ナノスプレー１μｌ注入、を用いる質量分析法によってさらに分析した。予想ＭＷは１５５２０．２Ｄａであり、測定ＭＷは１５５２０．１Ｄａである。
【００８４】
ＣＣＩＰＮ１７の合成−
ペプチドＣＣＩＰＮ１７（図２Ｂ参照）は上記のＣＣＩＺＮ１７（配列：２）の場合と同じプロトコルに従って合成した。固相配列組立中に、ＩＺ部分（図２Ｂおよび以下に示した配列の下線部分）の２つのリシン残基にアリルオキシカルボニル（ａｌｏｃ）のε−ＮＨ保護を導入した。他のリシン残基はすべて標準Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ化学に従ってＢｏｃで保護した：ＣＣＧＧＩＫＫＥＩＥＡＩＫＫＥＱＥＡＩＫＫＫＩＥＡＩＥＫＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ（配列：２；スカフォールドドメインはイタリック体）。ＣＣＩＰＮ１７のアミノ酸配列はＣＣＩＺＮ１７のアミノ酸配列と同じであるが、ＰＥＧ付加ＣＣＩＺＮ１７ペプチドを“ＣＣＩＰＮ１７”と表す。ペプチド組立の終了後、ＮＨ_２−末端を１０倍過剰量の無水酢酸とＤＨＦ中で反応させることによってアセチル化した。保護ペプチド樹脂を０．２５当量のテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウムＰｄ（ＰＰｈ_３）_４および２４当量のフェニルシランで３０分間処理して２つのリシン残基からＡｌｏｃ保護基を除去した。他の残基側鎖はすべて保護された状態に維持した。２つの脱保護リシン鎖をＤＩＰＣ（ジイソプロピルカルボジイミド）およびＨＯＢｔ（ヒドロキシベンゾトリアゾール）と３時間反応させたＭＷ２３６Ｄａのポリエチレングリコール酸誘導体（ｍ−ｄＰＥＧ酸，Ｑｕａｎｔａ ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ）によってさらに誘導体化した。
【００８５】
粗ペプチドＣＣＩＰＮ１７をＣＣＩＺＮ１７（上記）の精製の場合と同様のゲル透過クロマトグラフィーによって精製した。ＧＰＣによって得られたプール画分（純度７０％）を上記のＣＣＩＺＮ１７場合と同様の逆相ＨＰＬＣによってさらに＞９５％純度まで精製した。溶出剤Ｂの以下の勾配を使用した：４０−５５％、２５分超、流速８０ｍＬ／分。粗ペプチド、溶出画分および精製プールの分析は、ＣＣＩＺＮ１７の場合と同様に、Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ_４カラム（１５０×４．６ｍｍ，５μｍ，３００Ａ，Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を用いた分析用ＨＰＬＣによって行った。精製ペプチドのキャラクタリゼーションはＭｉｃｒｏｍａｓｓ ＬＣＺ ｐｌａｔｆｏｒｍ ＥＳ^＋を用いた質量分析法によって行った。測定ＭＷは５６１２．０Ｄａであり計算した平均ＭＷは５６１１．８Ｄａである。
【００８６】
ＣＣＩＰＮ１７から（ＣＣＩＰＮ１７）_３への酸化−
精製ペプチド前駆体（２６ｍｇ）、ＣＣＩＰＮ１７をバッファに溶解し、空気によってゆっくりと酸化して共有結合三量体（ＣＣＩＰＮ１７）_３とした（ＣＣＩＺＮ１７の酸化の場合と同様）。酸化反応は、Ｗａｔｅｒｓ−Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＬＣＺ Ｐｌａｔｆｏｒｍを使用するＬＣ−ＭＳ分析によって上記同様にモニターした。これらのクロマトグラフィー条件下で、ＣＣＩＰＮ１７はｔ_Ｒ＝１５．６’に溶出する。酸化反応は円滑に進行し一夜でｔ_Ｒ＝１８．７’に溶出する１つの主生成物が形成される。生成物の質量は、３つのジスルフィドブリッジの形成に合致する質量減を有する３つのＣＣＩＰＮ１７ペプチド鎖（［ＣＣＩＰＮ１７］_３）を含む１分子の質量に対応する。酸化反応の総収率は８０％超である。溶液に４５μＬのＴＦＡを添加し、溶液を、ＴＳＫｇｅｌ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ−５０Ｓ樹脂を詰めた７００×２６ｍｍカラムに直接充填し、溶出剤としてＨ_２Ｏ／アセトニトリル４０／６０，０．１％ＴＦＡ，流速１ｍＬ／分を使用した。溶出画分をＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ_４カラム（１５０×４．６ｍｍ，５μｍ）を用い、溶出剤として：（Ａ）水中の０．１％ＴＦＡおよび（Ｂ）アセトニトリル中の０．１％ＴＦＡを使用するＨＰＬＣによって分析した。ＬＣ−ＭＳ Ｗａｔｅｒｓ−Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＬＣＺ Ｐｌａｔｆｏｒｍ、正イオンモード（ＥＳ^＋）で溶出剤Ｂの以下の勾配を使用した：３５％−５５％Ｂ（２０分）−８０％（３分），流速１ｍＬ／分。予想ＭＷは１６８２９．５７Ｄａであり、測定ＭＷは１６８３０Ｄａである。
【００８７】
ビオチン−ＣＣＩＺ（ビオチン−配列：３）の合成−
ペプチド−ＣＣＩＺ（ビオチン−ＧＣＣＧＧＩＫＫＥＩＥＡＩＫＫＥＱＥＡＩＫＫＫＩＥＡＩＥＫＥ；配列：３）はＣＣＩＺＮ１７（配列：２）の場合と同じプロトコルで合成した。ビオチンとの反応は、ペプチド組立プロセスの終了後、等モル量のＤＩＰＣ（Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド）およびＨＯＡｔ（７−アザ−１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）によって活性化した４倍過剰量のビオチンと一夜反応させることによって行った。粗ペプチドビオチン−ＣＣＩＺ（配列：３）を、セミ・プレパラティブＷａｔｅｒｓ ＲＣＭ Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ^ＴＭ Ｃ_４カートリッジ（４０×２００ｍｍ，１５μｍ）、流速８０ｍＬ／分を用い、溶出剤として（Ａ）水中の０．１％のＴＦＡと（Ｂ）アセトニトリル中の０．１％のＴＦＡを使用する逆相ＨＰＬＣによって精製した。溶出剤Ｂの以下の勾配を使用した：２５％−３５％，３０分超，流速８０ｍＬ／分。粗ペプチド、溶出画分および精製プールの分析は、Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ Ｃ_１８カラム（２５０×４．６ｍｍ，５μｍ，８０Ａ，Ｂｅｃｋｍａｎ），流速１ｍＬ／分を用い、溶出剤として（Ａ）水中の０．１％ＴＦＡおよび（Ｂ）アセトニトリル中の０．１％ＴＦＡを使用する分析用ＨＰＬＣによって行った。溶出剤Ｂの以下の勾配を使用した：２５％−４０％（２０分超）−８０％（３分超）。予想ＭＷは３５７０．０Ｄａであり、測定ＭＷは３５７０．５Ｄａである。
【００８８】
ビオチン−ＣＣＩＺから（ビオチン−ＣＣＩＺ）_３への酸化−
精製ペプチド前駆体（１５ｍｇ）、ビオチン−ＣＣＩＺ（ビオチン−配列：３）を０．１ＭのＨｅｐｅｓ，ｐＨ７．３（ＵＳＢ Ｃｏｒｐ．）に５ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した。ビオチン−ＣＣＩＺＮは空気によってゆっくりと酸化して一夜で共有結合三量体（ビオチン−ＣＣＩＺＮ）_３となる。酸化反応は上記同様にＷａｔｅｒｓ−Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＬＣＺ Ｐｌａｔｆｏｒｍを使用するＬＣ−ＭＳ分析によってモニターした。これらのクロマトグラフィー条件で、ビオチン−ＣＣＩＺはｔ_Ｒ＝１６．４’に溶出する。酸化反応は円滑に進行し一夜でｔ_Ｒ＝１６．９’に溶出する主生成物が形成される。生成物の質量は、３つのジスルフィドブリッジの形成に合致する質量減を有する３つのビオチン−ＣＣＩＺペプチド鎖（［ビオチン−ＣＣＩＺ］_３）を含む１分子の質量に対応する。酸化反応の総収率は８０％超である。溶液を水に透析し、次いで凍結乾燥した。生成物を、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ_４カラム（１５０×４．６ｍｍ，５μｍ）を用い、溶出剤として：（Ａ）水中の０．１％ＴＦＡおよび（Ｂ）アセトニトリル中の０．１％ＴＦＡを使用し、ＬＣ−ＭＳ Ｗａｔｅｒｓ−Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＬＣＺ Ｐｌａｔｆｏｒｍ、正モード（ＥＳ^＋）で行うＨＰＬＣによって分析した。予想ＭＷは１０７０４．９４Ｄａであり、測定ＭＷは１０７０４．０Ｄａである。
【００８９】
ビオチン−ＣＣＩＺＮ１７（ビオチン−配列：８２）の合成−
ビオチン−ＣＣＩＺＮ１７（ビオチン−ＧＣＣＧＧＩＫＫＥＩＥＡＩＫＫＥＱＥＡＩＫＫＫＩＥＡＩＥＫＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ；配列：８２）はＣＣＩＺＮ１７（配列：２）の場合と同じプロトコルで合成した。ビオチンとの反応はペプチド組立プロセスの終了後、上記のビオチン−ＣＣＩＺの場合と同様に行った。粗ペプチド、ビオチン−ＣＣＩＺＮ１７の精製は、上記のＣＣＩＺＮ１７精製の場合と同様にゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって行った。ＧＰＣによって得られたプール画分（純度７０％）を上記同様の逆相ＨＰＬＣによってさらに＞９５％純度まで精製した。溶出剤Ｂの以下の勾配を使用した：３５％−５５％、２５分超、流速８０ｍＬ／分。粗ペプチド、溶出画分および精製プールの分析は、Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ_４カラム（１５０×４．６ｍｍ，５μｍ，３００Ａ，Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）、流速１ｍＬ／分を用い、溶出剤として：（Ａ）水中の０．１％ＴＦＡおよび（Ｂ）アセトニトリル中の０．１％ＴＦＡを使用する分析用ＨＰＬＣによって行った。溶出剤Ｂの以下の勾配を使用した：４０％−６０％Ｂ（２０分）−８０％（３分）。精製ペプチドのキャラクタリゼーションはＭｉｃｒｏｍａｓｓ ＬＣＺ ｐｌａｔｆｏｒｍ ＥＳ^＋で質量分析法によって行った。測定ＭＷは５４１６．０Ｄａであり計算した平均ＭＷは５４１６Ｄａである。
【００９０】
ビオチン−ＣＣＩＺＮ１７から（ビオチン−ＣＣＩＺＮ１７）_３への酸化−
精製ペプチド前駆体（２０ｍｇ）、ビオチン−ＣＣＩＺ１７を０．１ＭのＨｅｐｅｓ，ｐＨ７．３（ＵＳＢ Ｃｏｒｐ．）に２ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した。この条件下でビオチン−ＣＣＩＺＮ１７は空気によってゆっくりと酸化して共有結合三量体（ビオチン−ＣＣＩＺＮ１７）_３となる。酸化反応は上記同様にＷａｔｅｒｓ−Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＬＣＺ Ｐｌａｔｆｏｒｍを使用するＬＣ−ＭＳ分析によって、溶出剤Ｂの勾配：４０％−６０％Ｂ（２０分）−８０％（３分），流速１ｍＬ／分を使用してモニターした。これらのクロマトグラフィー条件下で、ビオチン−ＣＣＩＺ１７はｔ_Ｒ＝１２．８７’に溶出する。酸化反応は円滑に進行し一夜でｔ_Ｒ＝１４．９’に溶出する１つの主生成物が形成される。生成物の質量は、３つのジスルフィドブリッジの形成に合致する質量減を有する３つのビオチン−ＣＣＩＺ１７ペプチド鎖（ビオチン−ＣＣＩＺＮ１７）_３を含む１分子の質量に対応する。酸化反応の総収率は８０％超である。溶液に４５μＬのＴＦＡを添加し、ＴＳＫｇｅｌ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ−５０Ｓ樹脂を詰めた７００×２６ｍｍカラムに溶液を直接充填し、溶出剤Ｈ_２Ｏ／アセトニトリル４０／６０、０．１％ＴＦＡ、流速１ｍＬ／分を使用した。プールした画分をセミ・プレパラティブＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｃ_４カラム（１０×２５０ｍｍ，１５μｍ）、流速２０ｍＬ／分を用い、溶出剤として（Ａ）水中の０．１％ＴＦＡおよび（Ｂ）アセトニトリル中の０．１％ＴＦＡを使用する逆相ＨＰＬＣによってさらに精製した。溶出剤Ｂの以下の勾配を使用した：３５％−５０％，２０分超，流速８０ｍＬ／分。溶出した画分を、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ_４カラム（１５０×４．６ｍｍ，５μｍ）で溶出剤として（Ａ）水中の０．１％ＴＦＡおよび（Ｂ）アセトニトリル中の０．１％ＴＦＡを使用するＨＰＬＣによって分析した。ＬＣ−ＭＳ Ｗａｔｅｒｓ−Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＬＣＺ Ｐｌａｔｆｏｒｍ、正モード（ＥＳ^＋）で溶出剤Ｂの以下の勾配を使用した：４０％−６０％Ｂ（２０分）−８０％（３分）、流速１ｍＬ／分。予想ＭＷは１６２４４Ｄａであり測定ＭＷは１６２４５Ｄａである。
【００９１】
ビオチン−ＣＣＩＰＮ１７の合成−
このペプチドは上記のビオチン−ＣＣＩＺＮ１７（配列：８２）の場合と同じプロトコルに従って合成した。固相配列組立中に、ＩＺ部分（下記配列の下線部分）の２つのリシン残基にアリルオキシカルボニル（ａｌｏｃ）のε−ＮＨ保護を導入し、他のリシンはすべて標準Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ化学に従ってＢｏｃ保護した：ビオチン−ＧＣＣＧＧＩＫＫＥＩＥＡＩＫＫＥＱＥＡＩＫＫＫＩＥＡＩＥＫＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ（配列：８２；スカフォールドドメインはイタリック体）。ＰＥＧ付加ビオチン−ＣＣＩＺＮ１７ペプチドを“ビオチン−ＣＣＩＰＮ１７”と命名するが、ビオチン−ＣＣＩＰＮ１７のアミノ酸配列はビオチン−ＣＣＩＺＮ１７のアミノ酸配列と同じである。ペプチド組立の終了後、上記のビオチン−ＣＣＩＺの場合と同様にビオチンと反応させた。保護ペプチド樹脂を０．２５当量のテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウムＰｄ（ＰＰｈ_３）_４および２４当量のフェニルシランで３０分間処理して２つのリシン残基からＡｌｏｃ保護基を除去し、他の残基側鎖はすべて保護された状態に維持した。２つの脱保護リシン鎖を、ＤＩＰＣ（ジイソプロピルカルボジイミド）およびＨＯＢｔ（ヒドロキシベンゾトリアゾール）と３時間反応させたＭＷ２３６Ｄａのポリエチレングリコール酸誘導体（ｍ−ｄ ＰＥＧ酸，Ｑｕａｎｔａ ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ）によってさらに誘導体化した。
【００９２】
粗ペプチドビオチン−ＣＣＩＰＮ１７を上記同様にＴＳＫｇｅｌ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ−５０Ｓ樹脂（７００×２６ｍｍカラム）上のゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって精製した。ＧＰＣによって得られたプール画分（純度７０％）を、上記同様のセミ・プレパラティブＷａｔｅｒｓ ＲＣＭ Ｄｅｌｔａ−ＰａｋＴＭ Ｃ_４カートリッジを用いる逆相ＨＰＬＣによって、溶出剤Ｂの勾配：３５−５５％、２５分超、流速８０ｍＬ／分を使用して、さらに＞９５％純度まで精製した。。粗ペプチド、溶出画分および精製プールの分析は、上記同様にＪｕｐｉｔｅｒ Ｃ_４カラム（１５０×４．６ｍｍ，５μｍ，３００Ａ，Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を用いる分析用ＨＰＬＣによって行った。精製ペプチドのキャラクタリゼーションはＭｉｃｒｏｍａｓｓ ＬＣＺ ｐｌａｔｆｏｒｍ ＥＳ^＋の質量分析法によって行った。測定ＭＷは５７９６Ｄａであり、計算した平均ＭＷは５７９６Ｄａである。
【００９３】
ビオチン−ＣＣＩＰ１７から（ビオチン−ＣＣＩＰＮ１７）_３への酸化−
精製したペプチド前駆体（２０ｍｇ）、ビオチン−ＣＣＩＰＮ１７を０．１ＭのＨｅｐｅｓ，ｐＨ７．３（ＵＳＢ Ｃｏｒｐ．）に濃度２ｍｇ／ｍＬで溶解した。この条件下で、ビオチン−ＣＣＩＰＮ１７は空気によってゆっくりと酸化して一夜で（ビオチン−ＣＣＩＰＮ１７）_３となる。酸化反応は、Ｗａｔｅｒｓ−Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＬＣＺ ＰｌａｔｆｏｒｍをＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ_４カラム（１５０×４．６ｍｍ，５μｍ）を用いるＬＣ−ＭＳ分析によって、溶出剤として（Ａ）水中の０．１％ＴＦＡおよび（Ｂ）アセトニトリル中の０．１％ＴＦＡを使用してモニターした。溶出剤Ｂの以下の勾配を使用した：４５％−６０％ Ｂ（２０分）−８０％（３分）、流速１ｍＬ／分。これらのクロマトグラフィー条件下で、ビオチン−ＣＣＩＰＮ１７はｔ_Ｒ＝１１．９’に溶出する。酸化反応は円滑に進行し一夜でｔ_Ｒ＝１７．８’に溶出する１つの主生成物が形成される。生成物の質量は、３つのジスルフィドブリッジの形成に合致する質量減を有する３つのＣビオチン−ＣＩＰＮ１７ペプチド鎖（［ビオチン−ＣＣＩＰＮ１７］_３）を含む１分子の質量に対応する。酸化反応の総収率は８０％超である。溶液にグアニジニウムクロリドを最終濃度６Ｍまで添加し、溶液をＴＳＫｇｅｌ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ−５０Ｓ樹脂を詰めた７００×２６ｍｍカラムに直接充填し、溶出剤としてＨ_２Ｏ／アセトニトリル４０／６０、０．１％ ＴＦＡ、流速１ｍＬ／分を使用した。溶出した画分をＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ_４カラム（１５０×４．６ｍｍ，５μｍ）を用いるＨＰＬＣによって、溶出剤として（Ａ）水中の０．１％ＴＦＡおよび（Ｂ）アセトニトリル中の０．１％ＴＦＡを使用して分析した。溶出剤Ｂを以下の勾配で使用した：４５％−６０％ Ｂ（２０分）−８０％（３分）、流速１ｍＬ／分、ＬＣ−ＭＳ Ｗａｔｅｒｓ−Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＬＣＺ Ｐｌａｔｆｏｒｍ、正モード（ＥＳ^＋）。予測ＭＷは１７３８３Ｄａであり、計算ＭＷは１７３８４Ｄａである。
【００９４】
ビオチン−ＣＣＩＰの合成−
このペプチドは上記のビオチン−ＣＣＩＺ（配列：３）の場合と同じプロトコルに従って合成した。固相配列組立中、ＩＺ部分（下記配列の下線部分）の２つのリシン残基にアリルオキシカルボニル（ａｌｏｃ）のε−ＮＨ保護を導入し、他のリシンはすべて標準Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ化学に従ってＢｏｃで保護した：ビオチン−ＧＣＣＧＧＩＫＫＥＩＥＡＩＫＫＥＱＥＡＩＫＫＫＩＥＡＩＥＫ（配列：３；スカフォールドドメインはイタリック体）。ＰＥＧ付加ビオチン−ＣＣＩＺペプチドを“ビオチン−ＣＣＩＰ”と命名するが、ビオチン−ＣＣＩＰのアミノ酸配列はビオチン−ＣＣＩＺのアミノ酸配列と同じである。ペプチド組立の終了後、上記のビオチン−ＣＣＩＺの場合と同様にビオチンと反応させた。保護されたペプチド−樹脂をさらに０．２５当量のテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウムＰｄ（ＰＰｈ_３）_４および２４当量のフェニルシランで３０分間処理して２つのリシン残基からＡｌｏｃ保護基を除去し、他の残基側鎖はすべて保護された状態に維持した。２つの脱保護リシン鎖を、ＤＩＰＣ（ジイソプロピルカルボジイミド）およびＨＯＢｔ（ヒドロキシベンゾトリアゾール）と３時間反応させたＭＷ２３６Ｄａのポリエチレングリコール酸誘導体（ｍ−ｄ ＰＥＧ酸，Ｑｕａｎｔａ ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ）によってさらに誘導体化した。
【００９５】
粗ペプチド、ビオチン−ＣＣＩＰをＴＳＫｇｅｌ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ−５０Ｓ樹脂（７００×２６ｍｍカラム）上で溶出剤として水中の３０％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ、流速１ｍＬ／分を使用するゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって精製した。ＧＰＣによって得られたプール画分（純度７０％）をセミ・プレパラティブＷａｔｅｒｓ ＲＣＭ Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ^ＴＭ Ｃ_４カートリッジ（４×２００ｍｍ，１５μｍ）を用いる逆相ＨＰＬＣによって、溶出剤として（Ａ）水中の０．１％ＴＦＡおよび（Ｂ）アセトニトリル中の０．１％ＴＦＡを使用して＞９５％純度までさらに精製した。溶出剤Ｂの以下の勾配を使用した：２０−３５％、３０分超、流速８０ｍＬ／分。粗ペプチド、溶出画分および精製プールの分析は、Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ_４カラム（１５０×４．６ｍｍ，５μｍ，３００Ａ，Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）、流速１ｍＬ／分、を用いる分析用ＨＰＬＣによって、溶出剤として（Ａ）水中の０．１％ＴＦＡおよび（Ｂ）アセトニトリル中の０．１％ＴＦＡを使用して行った。溶出剤Ｂの以下の勾配を使用した：２０−４０％（２０分超）−８０％（３分超）。予測ＭＷは３８２１Ｄａであり、測定ＭＷは３８２１Ｄａである。
【００９６】
ビオチン−ＣＣＩＰから（ビオチン−ＣＣＩＰＮ）_３への酸化−
精製したペプチド前駆体（２０ｍｇ）、ビオチン−ＣＣＩＰＮ１７を０．１ＭのＨｅｐｅｓ，ｐＨ７．３（ＵＳＢ Ｃｏｒｐ．）に濃度２ｍｇ／ｍＬで溶解した。この条件下で、ビオチン−ＣＣＩＰは空気によってゆっくりと酸化して一夜で共有結合三量体（ビオチン−ＣＣＩＰ）_３となる。酸化反応は、Ｗａｔｅｒｓ−Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＬＣＺ ＰｌａｔｆｏｒｍをＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ_４カラム（１５０×４．６ｍｍ，５μｍ）を用いたＬＣ−ＭＳ分析によって、溶出剤として（Ａ）水中の０．１％ＴＦＡおよび（Ｂ）アセトニトリル中の０．１％ＴＦＡを使用してモニターした。溶出剤Ｂの以下の勾配を使用した：２５％−４０％ Ｂ（２０分）−８０％（３分）、流速１ｍＬ／分。これらのクロマトグラフィー条件下で、ビオチン−ＣＣＩＰはｔ_Ｒ＝１５．５’に溶出する。酸化反応は円滑に進行し一夜でｔ_Ｒ＝１８．４’に溶出する１つの主生成物が形成される。生成物の質量は、３つのジスルフィドブリッジの形成に合致する質量減を有する３つのビオチン−ＣＣＩＰＮペプチド鎖（［ビオチン−ＣＣＩＰ］_３）を含む１分子の質量に対応する。酸化反応の総収率は８０％超である。溶液にトリフルオロ酢酸を最終濃度０．２％までおよびグアニジニウムクロリドを最終濃度６Ｍまで添加し、溶液を、ＴＳＫｇｅｌ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ−５０Ｓ樹脂を詰めた７００×２６ｍｍカラムに直接充填し、溶出剤としてＨ_２Ｏ／アセトニトリル４０／６０、０．１％ ＴＦＡ、流速１ｍＬ／分を使用した。溶出した画分は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ_４カラム（１５０×４．６ｍｍ，５μｍ）を用いるＨＰＬＣによって、溶出剤として（Ａ）水中の０．１％ＴＦＡおよび（Ｂ）アセトニトリル中の０．１％ＴＦＡを使用して分析した。溶出剤Ｂを以下の勾配で使用した：２５％−４０％ Ｂ（２０分）−８０％（３分）、流速１ ｍＬ／分、ＬＣ−ＭＳ Ｗａｔｅｒｓ−Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＬＣＺ Ｐｌａｔｆｏｒｍ、正モード（ＥＳ^＋）。予測ＭＷは１１４５６Ｄａであり、測定ＭＷは１１４５６Ｄａである。
【００９７】
ワクチン設計−公称サイズ約１５．６オングストロームのポリエチレングリコール部分をＣＣＩＺＮ１７（配列２）のスカフォールドドメインに、該ＰＥＧ部分が三量体コイルドコイル形成を少しは妨害するとしても妨害が最小になるように戦略的に付着させた。この小さいポリエチレングリコール部分ｍ−ｄＰＥＧ^ＴＭ酸（ＭＷ＝２３６）（Ｑｕａｎｔａ ＢＩＯＤＥＳＩＧＮ，Ｐｏｗｅｌｌ，Ｏｈｉｏ）は分子量約２３６Ｄａであり、以下の構造：
【００９８】
【化２】

を有している。
【００９９】
最初に、三量体コイルドコイルのヘプタッドリピートのより外側の“ｆ”位置に局在する３つのリシン残基のイプシロンアミンをＩＺスカフォールドへのポリエチレングリコール部分の付着に適した位置として同定した（図２Ａ）。これらのリシン残基の２つをｍ−ｄＰＥＧ^ＴＭ酸（ＭＷ＝２３６）による誘導体化のために最終的に選択した（図２Ｂ参照、誘導体化リシン（“Ｋ”）残基は下線付き）。図２Ｂに示すように、このポリマー修飾ＣＣ−キメラＮ−ペプチドの名称は、ＣＣＩＺＮ１７からＣＣＩＰＮ１７に変更されており、３つのＣＣＩＰＮ１７キメラポリマー修飾ペプチドを含む共有結合安定化（ＣＣＩＰＮ１７）_３三量体コイルドコイルを生成できる。このワクチン構築物（ＣＣＩＰＮ１７）_３の概略モデルを図３に示す。三量体コイルドコイルを形成するヘリックスは、長さ約６２オングストロームの円筒として示されている。各円筒の暗い灰色部分は長さ約３６オングストロームのＩＺスカフォールドドメインを表し、明るい灰色部分は長さ約２５オングストロームのＨＩＶ ｇｐ４１のＮ１７領域を表す。ｍ−ｄＰＥＧ^ＴＭ酸（ＭＷ＝２３６）部分は長さ約１５オングストロームの長方形として表されている。ポリマー修飾用に選択された２つの指定リシン残基の目的はＩＺスカフォールドだけを遮蔽することである。実際、コイルドコイルのＮ１７ドメインに近いほうのリシン残基はＮ１７コイルドコイル部分から約２２オングストロームであり、１５オングストロームのｍ−ｄＰＥＧ^ＴＭ酸部分がこのドメインのいずれかの部分を遮蔽できないことを確保する。
【０１００】
ＳＭＷ−ＰＥＧ付加ワクチンの免疫原性−
動物実験はＰＥＧを付加しないワクチン（ＣＣＩＺＮ１７）_３およびＰＥＧ付加ワクチン（ＣＣＩＰＮ１７）_３によって誘発されたモルモットの抗体応答の比較によって行った。試験にはホモロガス方式（すなわち、抗原によるプライミング注射、次いで同じ抗原による２回のブースト注射）およびヘテロロガス方式（すなわち、ＰＥＧを付加しない抗原（ＣＣＩＺＮ１７）_３によるプライミング注射、次いでＰＥＧ付加抗原（ＣＣＩＰＮ１７）_３による２回のブースト注射）の双方を使用した（図４参照）。ＰＥＧ付加抗原はＱＳ２１アジュバント（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ；Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）と共に動物に投与した。免疫応答の分析はＥＬＩＳＡによって行った。ＥＬＩＳＡプレートへの抗原の吸着能力の違いに起因するバイアスを除去するために、すべての捕獲抗原をビオチニル化し、捕獲ビオチニル化分子を添加する前にＥＬＩＳＡプレートをストレプトアビジンで被覆した。このようにすると各抗原に対するＥＬＩＳＡ幾何平均力価（ＧＭＴ）が、血清中に存在する対応特異性をもつ抗体の相対量を正確に反映する。免疫分子のビオチニル化形態（ビオチン−ＣＣＩＺＮ１７）_３および（ビオチン−ＣＣＩＰＮ１７）_３ならびにスカフォールド分子単独のビオチニル化形態（ビオチン−ＣＣＩＺ）_３および（ビオチン−ＣＣＩＰ）_３をＥＬＩＳＡアッセイの捕獲抗原として使用した。ＰＥＧを付加しないワクチン（ＣＣＩＺＮ１７）_３で予防接種した動物の血清中には全抗原およびスカフォールド部分単独と同等の量の抗体が存在する。しかしながらＰＥＧ付加ワクチンによる免疫は、ホモロガス方式でもヘテロロガス方式でも、スカフォールド（（ＣＣＩＺ）_３でもＰＥＧ付加（ＣＣＩＰ）_３でもない）に対しては有意に減退した応答が生じるが、Ｎ−ペプチド部分に対しては極めて高い力価が誘発される。これは（ＣＣＩＺＮ１７）_３および（ＣＣＩＰＮ１７）_３の双方で等しく、従って、どちらの抗原に対して測定したときもＧＭＴ測定値が等しい。
【０１０１】
この実験は、タンパク質抗原の特定領域を選択的に隠蔽するＳＭＷ ＰＥＧ部分の付着が、ペプチド／タンパク質の残りの部分の免疫原性を遮蔽することなく該領域の免疫反応性を除去できることを証明する。
【実施例２】
【０１０２】
アルツハイマー病の免疫療法
ＰＥＧ２３６−Ａβ１−４２（配列：４；図５Ｃ参照）の合成−
ＡＢＩ４３３シンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で標準Ｆｍｏｃ／ｔ−Ｂｕ化学に従ってペプチドを固相合成した。使用した樹脂は予め誘導体化したＦｍｏｃ−Ａｌａ−ＡＬＨ−Ｃｈａｍｐｉｏｎ，１％架橋（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）であり、これはカルボキシル化アラニンを産生する誘導体化ＰＥＧ−ＰＳ基材樹脂である。すべてのアシル化反応は８倍過剰量の活性化アミノ酸で樹脂の遊離アミノ基に６０分間行った。アミノ酸は等モル量のＨＡＴＵ（Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）および２倍モル過剰量のＤＩＥＡ（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン）で活性化した。側鎖保護基は以下を用いた：グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン酸（Ａ）、チロシン（Ｙ）およびセリン（Ｓ）にｔｅｒｔ−ブチル；ヒスチジン（Ｈ）、アスパラギン（Ｎ）およびグルタミン（Ｑ）にトリチル；リシン（Ｋ）にｔｅｒｔ−ブトキシ−カルボニル；アルギニン（Ｒ）に２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル。Ｆｍｏｃ保護基を除去するためには、（８−４２）残基アセンブリにＤＭＦ中の２％ＤＢＵ（ジアザ−ビシクロ−ウンデセン）、（１−８）残基アセンブリにジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の２０％ピペリジンを使用した。アミノ酸組立の終了後、ＤＩＰＣ（ジイソプロピルカルボジイミド）およびＨＯＢｔ（ヒドロキシベンゾトリアゾール）と３時間反応させたＭＷ２３６Ｄａのポリエチレングリコール酸誘導体（ｍ−ｄＰＥＧ酸，Ｑｕａｎｔａ ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ）でＮＨ_２−末端をさらに誘導体化した。
【０１０３】
乾燥ペプチド樹脂を８８％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、５％フェノール、２％トリイソプロピルシランおよび５％水（Ｓｏｌｅ，Ｎ．Ａ．ａｎｄ Ｇ．Ｂａｒａｎｙ，１９９２，（前出））によって室温で１．５時間処理した。樹脂を濾過し、溶液を低温メチル−ｔ−ブチルエーテルに加えてペプチドを沈殿させた。遠心後、沈殿ペレットを新しい低温メチル−ｔ−ブチルエーテルで洗浄して有機スカベンジャーを除去した。このプロセスを２回繰返した。最終ペレットを乾燥し、Ｈ_２Ｏ、２０％アセトニトリルに再懸濁させて凍結乾燥した。
【０１０４】
粗ペプチドＰＥＧ２３６−Ａβ１−４２
（ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡ；配列：４）は、セミ・プレパラティブＷａｔｅｒｓ ＲＣＭ Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ^ＴＭ Ｃ_４カートリッジ（４０×２００ｍｍ，１５μｍ）を用い、溶出剤として（Ａ）水および（Ｂ）０．１％ＮＨ_４ＯＨを含むアセトニトリルを使用する逆相ＨＰＬＣによって精製した。溶出剤Ｂの以下の勾配を使用した：１０％−３０％、２０分超、流速８０ｍＬ／分。溶出画分の分析用ＨＰＬＣは、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ_４カラム（１５０×４．６ｍｍ，５μｍ）を用いるＢｅｃｋｍａｎ ＨＰＬＣで、溶出剤Ｂ（上記）の以下の勾配：１５％−３５％ Ｂ（２０分）−８０％（３分）、流速１ｍＬ／分で行った。精製ペプチドのキャラクタリゼーションは、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＬＣＺ ｐｌａｔｆｏｒｍスペクトロメーターでＨＰＬＣ−ＭＳによって行った。理論的平均分子量（ＭＷ）は４７３１．０Ｄａであり、測定ＭＷは４７３１．０Ｄａである。
【０１０５】
結果
本発明の１つの具体的用途は、アルツハイマー病（ＡＤ）の予防および治療処置のための改良ワクチンの開発である。最近の報告は、Ｅｌａｎ／Ｗｙｅｔｈ ＡＮ−１７９２ Ａβ １−４２ワクチン（図５Ｂ参照）の臨床試験の中断に導いた重篤な脳の炎症の問題が、Ｔ細胞応答に起因することを示唆している（Ｍｏｎｓｏｎｅｇｏ，Ａ．ａｎｄ Ｈ．Ｌ．Ｗｅｉｎｅｒ，２００３，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０２：８３４−８；Ｎｉｃｏｌｌ，Ｊ．Ａ．ら，２００３，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：４４８−５２）。この応答はＡβペプチドのＣＯＯＨ−末端を特異的に指向している（Ｍｏｎｓｏｇｅｏ，Ａ．ら，２００３，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１２：４１５−２２）。しかしながら注目すべきは、同じ臨床試験が、高いＡβ抗体価をもつ患者でプラークの減少およびある程度限られた記憶の安定化を示したことであり、これはワクチンが治療効果を発揮していたことを表す。特に、Ａβ１−４２ワクチンを接種した患者の大半では病理形態のＡβに特異的な抗体が誘発されたことが知見された（Ｈｏｃｋ，Ｃ．ら，２００２，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：１２７０−５）。これらの治療用抗体は、ペプチドのＮＨ_２−末端領域、すなわち残基４−１０のエピトープを認識する（ＭｃＬａｕｒｉｎ，Ｊ．ら，２００２，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：１２６３−９；図５Ａ参照）。これらの知見は疾病動物モデルでも確認された（Ｂａｒｄ，Ｆ．ら，２００３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００：２０２３−８）。そこでＥｌａｎ／Ｗｙｅｔｈらは、接合したＮ−末端（１−１６）Ａβペプチドに基づく第二世代のワクチンＡＣＣ−００１の臨床試験に進んでいる（図５Ｂ参照）。
【０１０６】
ＣＯＯＨ−末端領域が欠失でなくＳＭＷポリマー（例えばＳＭＷ ＰＥＧ）によって遮蔽されている遊離形態またはコンジュゲート形態のＡβペプチドの使用は、Ｅｌａｎ／Ｗｙｅｔｈワクチンの有力な代替物である（図５Ｃ参照）。例えばＳＭＷ ＰＥＧはアミノ酸１６−３０に局在し上述の重篤な副作用の原因になると思われるＡβのＣＯＯＨ−末端Ｔ細胞エピトープの内部または極めて近傍で単一または多数コピーに付着できるが（Ｍｏｎｓｏｎｅｇｏ，Ａ．ら，２００３（前出））、ＮＨ_２−末端領域のアミノ酸１−１６またはもっと短い領域のアミノ酸４−１０の免疫原性は元のまま維持される。双方の領域は有益なエピトープを内包すると考えられている（ＭｃＬａｕｒｉｎ，Ｊ．Ｒ．ら，２００２（前出））。同じ分子が、ＳＭＷ ＰＥＧ付加Ａβペプチドによる免疫後の従来のハイブリドーマテクノロジーによって、または、固定化ＳＭＷ ＰＥＧ付加Ａβペプチドに関するファージディスプレイライブラリーをパニングすることによって受動免疫療法の抗体開発に使用できる。
【０１０７】
本発明の別の具体的用途は、Ａβタンパク質の異なる凝集状態を識別する潜在能力を有している治療用抗体、例えば、Ａβ誘発病理の原因と見做される小オリゴマーに特異的な抗体の開発である。（Ｃｌｅａｒｙ，Ｊ．Ｐ．ら，２００５，Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．８：７９−８４）。ＡβのＮＨ_２−末端領域は低分子量オリゴマー、高分子量オリゴマーおよびフィブリルへのＡβの凝集には関与しないが、このＮＨ_２−末端は免疫優性であり、多様な形態に共通のエピトープに特異的なのでそれらの識別ができない抗体の優先的なｉｎ ｖｉｖｏ形成を指令する。ＮＨ_２−末端領域が欠失でなくＳＭＷポリマー（例えばＳＭＷ ＰＥＧ）で遮蔽されている遊離形態またはコンジュゲート形態のＡβペプチドを使用することによって所望の特異性をもつ抗体を得ることができる。このペプチドは正常Ａβの潜在的凝集能力は維持しているが、Ｎ−末端領域に対する免疫応答はＰＥＧ遮蔽によって抑制されている。
【実施例３】
【０１０８】
ＨＩＶ−１の４Ｅ１０／Ｔｒｐ−富化領域をターゲットする低分子量ＰＥＧ付加ワクチン
中和抗体４Ｅ１０（Ｓａｌｚｗｅｄｅｌ，Ｋ．ら，１９９９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：２４６９−８０）に結合するＨＩＶ−１ ｇｐ４１内部のＴｒｐ−富化領域の構造は、脂質模擬環境でＳｃｈｉｂｌｉ，ＤＪ．らによって決定された（２００１，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４０：９５７０−８）。最近にはまた、４Ｅ１０抗体に接触するアミノ酸残基が開示された（Ｃａｒｄｏｓｏ，Ｒ．ら，２００４（前出））。これらの接触残基は、構造内のペプチドの水に面する側を構成する（図６Ａ参照）。図６Ａで、４Ｅ１０結合残基は下線部分で示し、６７２および６８０位のＴｒｐ残基を含むが、膜に面するＴｒｐ残基は二重下線部分で示し、６６６、６７０および６７８位に局在する。
【０１０９】
４Ｅ１０エピトープの所望のα−ヘリカルコンホメーションは、４Ｅ１０エピトープをＧＣＮ４ロイシンジッパーの表面にグラフトすることによって得ることができ（Ｏ’Ｓｈｅａ，Ｅ．Ｋ．ら，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４５：６４６−８）、また、Ｓｉａ，Ｓ．Ｋ．ａｎｄ Ｐ．Ｓ．Ｋｉｍ（２００３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００：９７５６−６１）に類似である。図６Ａに示すＴｒｐ−富化領域の構造に基づいて、膜に面する残基のいくつかに突然変異を導入し（図６Ｂの“４Ｅ１０コイル”の一部として下線を付けたアミノ酸）、ＧＣＮ４ペプチド（“ＧＣＮ４コイル”）に適合性のダイマー化表面をもつ４Ｅ１０ペプチド（“４Ｅ１０コイル”）を作製できる（図６Ｂ参照）。このコイルドコイルは、４Ｅ１０領域を適正なヘリカル構造に拘束するであろう。ＧＣＮ４／４Ｅ１０コイルドコイルの安定性は、ジスルフィド結合の付加（Ｓｉａ，Ｓ．Ｋ．ａｎｄ Ｐ．Ｓ．Ｋｉｍ，２００３（前出））、および、ＧＣＮ４と４Ｅ１０との“ａ”および“ｄ”位の残基をロイシンまたはイソロイシンに突然変異させることによってさらに強化できる（Ｌｕ，Ｓ．Ｍ．ａｎｄ Ｒ．Ｓ．Ｈｏｄｇｅｓ，２００２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２３５１５−２４）。該構造（すなわちＧＣＮ４コイル）のスカフォールド性部分に対する免疫応答を回避するために、ＧＣＮ４コイルの表面に沿って適切なリシン残基（例えば、図７の二重下線を付けた残基）をＰＥＧ２３６で誘導体化できる（図７）。
【実施例４】
【０１１０】
ＯＭＰＣに接合する酸性スカフォールドをもつＰＥＧ付加キメラＮ１７ペプチド
Ｂｒ−アセチル−ＧＧＧＥＰ１７ＧｌｕＮ１７（表５のペプチド１）の合成−
このペプチドは、Ｐｉｏｎｅｅｒペプチドシンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で固相合成した。使用した樹脂はＦｍｏｃ−Ｌｉｎｋｅｒ ＡＭ−Ｃｈａｍｐｉｏｎ，１％架橋（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、修飾Ｒｉｎｋリンカーｐ−［（Ｒ，Ｓ）−α−［９Ｈ−フルオレン−９−イル−メトキシホルムアミド］−２，４−ジメトキシベンジル］−フェノキシ酢酸で誘導体化したＰＥＧ−ＰＳ基材樹脂であった（Ｒｉｎｋ，Ｈ．，１９８７，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２８：３７８７−３７８９；Ｂｅｒｎａｔｏｗｉｃｚ，Ｍ．Ｓ．ら，１９８９，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３０：４６４５−４６６７）。すべてのアシル化反応は樹脂遊離アミノ基の４倍過剰量の活性化アミノ酸で９０分間行った。アミノ酸は等モル量のＨＢＴＵ（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）および２倍モル過剰量のＤＩＥＡ（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミン）で活性化した。ペプチド配列：ＫＩＥＥＩＥＥＫＩＥＥＩＥＫＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ（配列：９３；非−ＨＩＶ残基はイタリック体）の最初の３１残基部分については、標準Ｆｍｏｃ／ｔ−Ｂｕ化学を使用した。側鎖保護基は以下を用いた：グルタミン酸（Ｇｌｕ）およびトレオニン（Ｔｈｒ）にｔｅｒｔ−ブチル；システイン（Ｃｙｓ）およびグルタミン（Ｇｌｎ）にトリチル；リシン（Ｌｙｓ）およびトリプトファン（Ｔｒｐ）にｔｅｒｔ−ブトキシ−カルボニル；アルギニン（Ａｒｇ）に２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル。最初の３１残基の組立後、Ｄｄｅ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ，Ｎ−α−１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキシ−１−イリデン）エチル−Ｎ−ε−Ｆｍｏｃ−Ｌ−リシンを３２番目の残基としてアシル化した。ε−アミノ基のＦｍｏｃ−保護基を２０％ピペリジン含有ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液で処理することによって除去した。この条件下でＤｄｅ保護基は完全に安定である。脱保護したリシン側鎖をさらにＤＩＰＣ（ジイソプロピルカルボジイミド）およびＨＯＢｔ（ヒドロキシベンゾトリアゾール）と３時間反応させたＭＷ２３６Ｄａのポリエチレングリコール酸誘導体（ｍ−ｄＰＥＧ酸，Ｑｕａｎｔａ ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ）でさらに誘導体化した。次にペプチド樹脂を１％ヒドラジン含有ＤＭＦ溶液で処理してリシンのα−アミノ基からＤｄｅ−基を除去した。ペプチド樹脂ＧＧＩＥＫＫＩＥＥＩＥＥＫＩＥＥＩＥＫＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ（配列：９４；非−ＨＩＶ残基はイタリック体；ＰＥＧ化リシン残基は下線部分）を得るために組立を継続した。次にペプチド樹脂を２つの部分に分割した。全体の２／３にあたる大きいほうの部分を使用して別のグリシン残基を組込むために組立を継続し、ＤＭＦ中で１０倍過剰量の無水ブロモ酢酸と反応させることによってさらにブロモアセチル化した。ＧＧＩＥＫＫＩＥＥＩＥＥＫＩＥＥＩＥＫＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ（配列：９４）−樹脂の残りの１／３を使用してＡｃ−Ｃ（Ａｃｍ）−ＴｔｄｓＣＣＥＰ１７ＧｌｕＮ１７（下記参照）の合成を継続した。
【０１１１】
Ｂｒ−アセチル−ＥＰ１７ＧｌｕＮ１７の合成終了後、乾燥ペプチド−樹脂を８８％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、５％フェノール、２％トリイソプロピルシランおよび５％水（Ｓｏｌｅ，Ｎ．Ａ．ａｎｄ Ｇ．Ｂａｒａｎｙ，１９９２（前出））によって室温で１．５時間処理した。樹脂を濾過し、溶液を低温メチル−ｔ−ブチルエーテルに加えてペプチドを沈殿させた。遠心後、ペプチドペレットを新しい低温メチル−ｔ−ブチルエーテルで洗浄して有機スカベンジャーを除去した。このプロセスを２回繰返した。最終ペレットを乾燥し、Ｈ_２Ｏ、２０％アセトニトリルに再懸濁させて凍結乾燥した。
【０１１２】
粗ペプチドＢｒ−アセチル−ＧＧＧＥＰ１７ＧｌｕＮ１７（表５のペプチド１）の精製は、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ−５０Ｓ樹脂を詰めた７００×２６ｍｍカラム上で水中の６０％のアセトニトリル、０．１％ＴＦＡを溶出剤として使用するゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって行った。典型的な処理では、９００ｍｇの粗ペプチドを２５ｍＬの溶出剤に溶解し、流速１ｍＬ／分でカラムに直接充填した。溶出画分の分析用ＨＰＬＣは、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ_４カラム（１５０×４．６ｍｍ，５μｍ）を用いたＢｅｃｋｍａｎ ＨＰＬＣで溶出剤Ｂ（上記）の以下の勾配：４５％−６５％ Ｂ（２０分）−８０％（３分）、流速１ｍＬ／分を使用した。純度に基づいて画分をプールし、セミ・プレパラティブＷａｔｅｒｓ ＲＣＭ Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ^ＴＭ Ｃ_４カートリッジ（４０×２００ｍｍ，１５μｍ）を用いる逆相ＨＰＬＣによって、溶出剤として（Ａ）水中の０．１％ＴＦＡおよび（Ｂ）アセトニトリル中の０．１％ＴＦＡを使用してさらに精製した。溶出剤Ｂの以下の勾配を使用した：４５％−６０％、２０分超、流速８０ｍＬ／分。精製ペプチドのキャラクタリゼーションは、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＬＣＺ ｐｌａｔｆｏｒｍスペクトロメーターでエレクトロスプレー質量分析法によって行った。理論的平均分子量（ＭＷ）は４６１３．３Ｄａであり、測定ＭＷは４６１３．０Ｄａである。
【０１１３】
Ａｃ−Ｃ（Ａｃｍ）−Ｔｔｄｓ−ＣＣＥＰ１７ＧｌｕＮ１７（表５のペプチド２）の合成−
上記アセンブリからＧＧＩＥＫＫＩＥＥＩＥＥＫＩＥＥＩＥＫＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ（配列：９４−樹脂（上記同様に作製）の１／３を使用してＡｃ−Ｃ（Ａｃｍ）Ｔｔｄｓ−ＣＣ−部分の合成を継続した。トリチル側鎖で保護された最初の（カルボキシ末端配列）の２つのシステインは上記のβ−アセチル−ＧＧＧＥＰ１７ＧｌｕＮ１７（表５のペプチド１）同様に標準Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ化学によって組立てた。Ｔｔｄｓ（１−アミノ−４，７，１０−トリオキサ−１３−トリデカミンコハク酸（−ＮＨ−（ＣＨ_２）_３−Ｏ−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−（ＣＨ_２）_３−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ_２）_２−ＣＯ−）との反応は、等モル量のＨＢＴＵおよび２倍モル過剰量のＤＩＥＡで２時間活性化した４倍過剰量のＴｔｄｓとの反応によって行った。Ｎ−末端残基Ｃ（Ａｃｍ）をＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＯＨ（上記）と同じ条件下でアシル化し、次いでＦｍｏｃ脱保護後にＤＭＦ中の１０倍過剰量の無水酢酸と反応させることによってアセチル化した。先行実施例の記載と同様にして樹脂から分離後、粗ペプチドＡｃ−Ｃ（Ａｃｍ）−ＴｔｄｓＣＣＥＰ１７ＧｌｕＮ１７（表５のペプチド２）を、ＴＳＫ−ｇｅｌ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ−５０Ｓ樹脂（７００×２６ｍｍカラム）で、水中の６０％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ、流速１ｍＬ／分を使用するゲル透過クロマトグラフイー（ＧＰＣ）によって精製した。ＧＰＣによって得られたプール画分（純度７０％）をセミ・プレパラティブＷａｔｅｒｓ ＲＣＭ Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ^ＴＭ Ｃ_４カートリッジ（４０×２００ｍｍ，１５μｍ）を用いた逆相ＨＰＬＣによって、溶出剤として（Ａ）水中の０．１％ＴＦＡおよび（Ｂ）アセトニトリル中の０．１％ＴＦＡを使用して、＞９５％までさらに精製した。溶出剤Ｂの以下の勾配を使用した：４５％−６０％、２０分超、流速８０ｍＬ／分。粗ペプチド、溶出画分および精製プールの分析は、Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ_４カラム（１５０×４．６ｍｍ，５μｍ，５μｍ，３００Ａ，Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）、流速１ｍＬ／分を用いた分析用ＨＰＬＣによって、溶出剤として（Ａ）水中の０．１％ＴＦＡ、および、（Ｂ）アセトニトリル中の０．１％ＴＦＡを使用して行った。溶出剤Ｂの以下の勾配を使用した：４５−６５％（２０分超）−８０％（３分超）。精製ペプチドのキャラクタリゼーションは、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＬＣＺ ｐｌａｔｆｏｒｍでエレクトロスプレー質量分析法によって行った。理論的平均分子量（ＭＷ）は５１６１．２Ｄａであり、測定ＭＷは５１６１．０Ｄａである。
【０１１４】
Ａｃ−Ｃ（Ａｃｍ）−（チオＥＰ１７ＧｌｕＮ１７）_３の合成−
チオエーテル結合の形成による共有結合的三量体化−
精製ペプチド前駆体（１０．１ｍｇ）、Ｂｒ−アセチル−ＧＧＧＥＰ１７ＧｌｕＮ１７（表５のペプチド１）を、６Ｍのグアニジウムクロリド、０．２５ＭのＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ８．５、２ｍＭのＥＤＴＡに５ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した。この溶液に他のペプチド前駆体Ａｃ−Ｃ（Ａｃｍ）Ｔｔｄｓ−ＣＣＥＰ１７ＧｌｕＮ１７（表５のペプチド２）（５．３ｍｇ；１ｍｇ／ｍＬ）を添加した。２つのペプチド前駆体の実効モル比は２．２：１のＢｒ−アセチル−ＧＧＧＥＰ１７ＧｌｕＮ１７：Ａｃ−Ｃ（Ａｃｍ）Ｔｔｄｓ−ＣＣＥＰ１７ＧｌｕＮ１７であった。三量体化反応のモニターは、Ｗａｔｅｒｓ−Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＬＣＺ Ｐｌａｔｆｏｒｍを使用するＬＣ−ＭＳ分析によって、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ_４カラム（１５０×４．６ｍｍ，５μｍ）で溶出剤として（Ａ）水中の０．１％ＴＦＡおよび（Ｂ）アセトニトリル中の０．１％ＴＦＡを使用して行った。溶出剤Ｂを以下の勾配で使用した：４５％−６５％ Ｂ（２０分）−８０％（３分）、流速１ｍＬ／分。チオエーテル形成反応は円滑に進行した。２時間後、１つの生成物が形成され、その質量は、２つのチオエーテル結合を介して２つのＢｒ−アセチル−ＧＧＧＥＰ１７ＧｌｕＮ１７ペプチド鎖に連結された１つのＡｃ−Ｃ（Ａｃｍ）Ｔｔｄｓ−ＣＣＥＰ１７ＧｌｕＮ１７ペプチド鎖に相当する。溶液に２０μＬのＴＦＡを添加し、溶液を、ＴＳＫ−ｇｅｌ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ−５０Ｓ樹脂（７００×２６ｍｍカラム）で水中の６０％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ、流量１ｍＬ／分の溶出剤を使用するゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって直接精製した。溶出画分の分析は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ_４カラム（１５０×４．６ｍｍ，５μｍ）で溶出剤として（Ａ）水中の０．１％ＴＦＡおよび（Ｂ）アセトニトリル中の０．１％ＴＦＡを使用するＨＰＬＣによって行った。溶出剤Ｂを以下の勾配で使用した：４５％−６５％ Ｂ（２０分）−８０％（３分）、流速１ｍＬ／分、ＬＣ−ＭＳ Ｗａｔｅｒｓ−Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＬＣＺ Ｐｌａｔｆｏｒｍ、正モード（ＥＳ^＋）。予想ＭＷは１４２２５Ｄａであり、測定ＭＷは１４２２６Ｄａであった。
【０１１５】
Ａｃ−Ｃ（Ａｃｍ）（チオＥＰ１７ＧｌｕＮ１７）_３のアセチル化システインの脱保護によるＡｃ−Ｃ（チオＥＰ１７ＧｌｕＮ１７）_３の形成−
精製したコイルドコイル前駆体ａｃ−Ｃ（Ａｃｍ）（チオＥＰ１７ＧｌｕＮ１７）_３を２０ｍｇ／ｍｌの濃度でＴＦＡ、アニソール２％および５０当量のＡｇＯＴｆ（トリフルオロメタンスルホン酸銀）に４０℃で３時間溶解した。氷冷した無水エーテルを反応混合物に添加し、沈殿物を遠心によって単離した。沈殿物を氷冷した無水エーテルで２回洗浄した。ペプチドをＨ_２Ｏ／アセトニトリル、０．１％ＴＦＡに再溶解し、ＴＳＫ−ｇｅｌ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ−５０Ｓ樹脂（７００×２６ｍｍカラム）で溶出剤として水中の６０％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ、流速１ｍＬ／分を使用するゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって精製した。精製したペプチドのキャラクタリゼーションは、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＬＣＺ ｐｌａｔｆｏｒｍでエレクトロスプレー質量分析法によって行った。理論的平均ＭＷは１４１５７Ｄａであり、測定ＭＷは１４１５７Ｄａであった。
【０１１６】
Ｂｒ−アセチル−ＧＧＧＥＰＮ１７（表５のペプチド３）の合成−
このペプチドは、Ｐｉｏｎｅｅｒペプチドシンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で固相合成した。使用した樹脂はＦｍｏｃ−Ｌｉｎｋｅｒ ＡＭ−Ｃｈａｍｐｉｏｎ，１％架橋（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、修飾Ｒｉｎｋリンカーｐ−［（Ｒ，Ｓ）−α−［９Ｈ−フルオレン−９−イル−メトキシホルムアミド］−２，４−ジメトキシベンジル］−フェノキシ酢酸で誘導体化したＰＥＧ−ＰＳ基材樹脂であった（Ｒｉｎｋ，Ｈ．，１９８７，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２８：３７８７−３７８９；Ｂｅｒｎａｔｏｗｉｃｚ，Ｍ．Ｓ．ら，１９８９，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３０：４６４５−４６６７）。すべてのアシル化反応は樹脂遊離アミノ基の４倍過剰量の活性化アミノ酸で９０分間行った。アミノ酸は等モル量のＨＢＴＵ（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）および２倍モル過剰量のＤＩＥＡ（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミン）で活性化した。ペプチド配列：ＫＩＥＥＩＥＫＫＩＥＥＩＥＫＬＬＱＬＴＹＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ（配列：９５；非−ＨＩＶ残基はイタリック体）の最初の３１残基部分については、標準Ｆｍｏｃ／ｔ−Ｂｕ化学を使用した。側鎖保護基は以下を用いた：グルタミン酸（Ｇｌｕ）およびトレオニン（Ｔｈｒ）にｔｅｒｔ−ブチル；システイン（Ｃｙｓ）およびグルタミン（Ｇｌｎ）にトリチル；リシン（Ｌｙｓ）およびトリプトファン（Ｔｒｐ）にｔｅｒｔ−ブトキシ−カルボニル；アルギニン（Ａｒｇ）に２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル。最初の３１残基の組立後、Ｄｄｅ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ，Ｎ−α−１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキシ−１−イリデン）エチル−Ｎ−ε−Ｆｍｏｃ−Ｌ−リシンを３２番目の残基としてアシル化した。ε−アミノ基のＦｍｏｃ−保護基を２０％ピペリジン含有ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液で処理することによって除去した。この条件下でＤｄｅ保護基は完全に安定である。脱保護したリシン側鎖をさらにＤＩＰＣ（ジイソプロピルカルボジイミド）およびＨＯＢｔ（ヒドロキシベンゾトリアゾール）と３時間反応させたＭＷ２３６Ｄａのポリエチレングリコール酸誘導体（ｍ−ｄＰＥＧ酸，Ｑｕａｎｔａ ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ）でさらに誘導体化した。次にペプチド樹脂を１％ヒドラジン含有ＤＭＦ溶液で処理してリシンのα−アミノ基からＤｄｅ−基を除去した。組立を継続してスカフォールドの他の６つの残基、非ＨＩＶドメインすなわち配列ＫＩＥＥＩＥ（配列：９６）をペプチド樹脂に組込んだ。次いで、Ｄｄｅ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ，Ｎ−α−１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキサ−１−イリデン）エチル−Ｎ−ε−Ｆｍｏｃ−Ｌ−リシンをアシル化した。ε−アミノ基のＦｍｏｃ−保護基はジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の２０％ピペリジン溶液によって選択的に除去した。この条件下でＤｄｅ−保護基は完全に安定である。脱保護したリシン側鎖を、ＤＩＰＣ（ジイソプロピルカルボジイミド）およびＨＯＢｔ（ヒドロキシベンゾトリアゾール）と３時間反応させたＭＷ２３６Ｄａのポリエチレングリコール酸誘導体（ｍ−ｄ ＰＥＧ酸， Ｑｕａｎｔａ ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ）によってさらに誘導体化した。ペプチド樹脂ＧＧＩＥＫＫＩＥＥＩＥＫＫＩＥＥＩＥＫＫＩＥＥＩＥＫＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ（配列：９７；非−ＨＩＶ残基はイタリック体；ＰＥＧ化リシン残基は下線部分）を得るために組立を継続した。次にペプチド樹脂を２つの部分に分割した。全体の２／３にあたる大きいほうの部分を使用して別のグリシン残基を組込むために組立を継続し、ＤＭＦ中で１０倍過剰量の無水ブロモ酢酸と反応させることによってさらにブロモアセチル化した。ペプチド−樹脂の残りの１／３を使用してＡｃ−Ｃ（Ａｃｍ）−ＴｔｄｓＣＣＥＰＮ１７（下記参照）の合成を継続した。
【０１１７】
Ｂｒ−アセチル−ＥＰＮ１７の合成終了後、乾燥ペプチド−樹脂を８８％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、５％フェノール、２％トリイソプロピルシランおよび５％水（Ｓｏｌｅ，Ｎ．Ａ．ａｎｄ Ｇ．Ｂａｒａｎｙ，１９９２（前出））によって室温で１．５時間処理した。樹脂を濾過し、溶液を低温メチル−ｔ−ブチルエーテルに加えてペプチドを沈殿させた。遠心後、ペプチドペレットを新しい低温メチル−ｔ−ブチルエーテルで洗浄して有機スカベンジャーを除去した。このプロセスを２回繰返した。最終ペレットを乾燥し、Ｈ_２Ｏ、２０％アセトニトリルに再懸濁させて凍結乾燥した。
【０１１８】
粗ペプチドＢｒ−アセチル−ＧＧＧＥＰＮ１７（表５のペプチド３）の精製は、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ−５０Ｓ樹脂を詰めた７００×２６ｍｍカラム上で水中の６０％のアセトニトリル、０．１％ＴＦＡを溶出剤として使用するゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって行った。典型的な処理では、９００ｍｇの粗ペプチドを２５ｍＬの溶出剤に溶解し、流速１ｍＬ／分でカラムに直接充填した。溶出画分の分析用ＨＰＬＣは、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ_４カラム（１５０×４．６ｍｍ，５μｍ）を用いたＢｅｃｋｍａｎ ＨＰＬＣで溶出剤Ｂ（上記）の以下の勾配：４５％−６５％ Ｂ（２０分）−８０％（３分）、流速１ｍＬ／分を使用した。純度に基づいて画分をプールし、セミ・プレパラティブＷａｔｅｒｓ ＲＣＭ Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ^ＴＭ Ｃ_４カートリッジ（４０×２００ｍｍ，１５μｍ）を用いる逆相ＨＰＬＣによって、溶出剤として（Ａ）水中の０．１％ＴＦＡおよび（Ｂ）アセトニトリル中の０．１％ＴＦＡを使用してさらに精製した。溶出剤Ｂの以下の勾配を使用した：４５％−６０％、２０分超、流速８０ｍＬ／分。精製ペプチドのキャラクタリゼーションは、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＬＣＺ ｐｌａｔｆｏｒｍスペクトロメーターでエレクトロスプレー質量分析法によって行った。理論的平均分子量（ＭＷ）は５６９９Ｄａであり、測定ＭＷは５７００Ｄａである。
【０１１９】
Ａｃ−Ｃ（Ａｃｍ）−Ｔｔｄｓ−ＣＣＥＰＮ１７（表５のペプチド４）の合成−
上記アセンブリからＧＧＩＥＫＫＩＥＥＩＥＫＫＩＥＥＩＥＫＫＩＥＥＩＥＫＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ（配列：９７）−樹脂（詳細は上記参照）の１／３を使用してＡｃ−Ｃ（Ａｃｍ）Ｔｔｄｓ−ＣＣ−部分の合成を継続した。トリチル側鎖で保護された最初の（カルボキシ末端配列）の２つのシステインは標準Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ化学によって組立てた。Ｔｔｄｓ（１−アミノ−４，７，１０−トリオキサ−１３−トリデカミンコハク酸（−ＮＨ−（ＣＨ_２）_３−Ｏ−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−（ＣＨ_２）_３−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ_２）_２−ＣＯ−）との反応は、等モル量のＨＢＴＵおよび２倍モル過剰量のＤＩＥＡで２時間活性化した４倍過剰量のＴｔｄｓとの反応によって行った。Ｎ−末端残基Ｃ（Ａｃｍ）をＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＯＨと同じ条件下でアシル化し、次いでＦｍｏｃ脱保護後にＤＭＦ中の１０倍過剰量の無水酢酸との反応によってアセチル化した。
【０１２０】
先行実施例の記載と同様にして樹脂から分離後、粗ペプチド、アセチル−Ｃ（Ａｃｍ）−ＴｔｄｓＣＣＥＰＮ１７を、ＴＳＫ−ｇｅｌ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ−５０Ｓ樹脂（７００×２６ｍｍカラム）で、溶出剤として水中の６０％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ、流速１ｍＬ／分を使用するゲル透過クロマトグラフイー（ＧＰＣ）によって精製した。ＧＰＣによって得られたプール画分（純度７０％）をセミ・プレパラティブＷａｔｅｒｓ ＲＣＭ Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ^ＴＭ Ｃ_４カートリッジ（４０×２００ｍｍ，１５μｍ）を用いた逆相ＨＰＬＣによって、溶出剤として（Ａ）水中の０．１％ＴＦＡおよび（Ｂ）アセトニトリル中の０．１％ＴＦＡを使用して、＞９５％純度までさらに精製した。溶出剤Ｂの以下の勾配を使用した：４５％−６０％、２０分超、流速８０ｍＬ／分。粗ペプチド、溶出画分および精製プールの分析は、Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ_４カラム（１５０×４．６ｍｍ，５μｍ，３００Ａ，Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）、流速１ｍＬ／分を用いた分析用ＨＰＬＣによって、溶出剤として（Ａ）水中の０．１％ＴＦＡおよび（Ｂ）アセトニトリル中の０．１％ＴＦＡを使用して行った。溶出剤Ｂの以下の勾配を使用した：４５−６５％（２０分超）−８０％（３分超）。精製ペプチドのキャラクタリゼーションは、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＬＣＺ ｐｌａｔｆｏｒｍでエレクトロスプレー質量分析法によって行った。理論的平均分子量（ＭＷ）は６２４８Ｄａであり、測定ＭＷは６２４７Ｄａであった。
【０１２１】
アセチル−Ｃ（Ａｃｍ）（チオＥＰＮ１７）_３の合成−
チオエーテル結合の形成による共有結合的三量体化−
精製ペプチド前駆体（１２ｍｇ）、Ｂｒ−アセチル−ＧＧＧＥＰＮ１７（表５のペプチド３）を、６Ｍのグアニジウムクロリド、０．２５ＭのＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ８．５、２ｍＭのＥＤＴＡに５ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した。この溶液に他のペプチド前駆体アセチル−Ｃ（Ａｃｍ）Ｔｔｄｓ−ＣＣＥＰＮ１７（表５のペプチド４）（６ｍｇ；１ｍｇ／ｍＬ）を添加した。２つのペプチド前駆体の実効モル比は２．２：１のＢｒ−アセチル−ＧＧＧＥＰ１Ｎ１７：Ａｃ−Ｃ（Ａｃｍ）Ｔｔｄｓ−ＣＣＥＰＮ１７であった。三量体化反応のモニターは、Ｗａｔｅｒｓ−Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＬＣＺ Ｐｌａｔｆｏｒｍを使用するＬＣ−ＭＳ分析によって、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ_４カラム（１５０×４．６ｍｍ，５μｍ）で溶出剤として（Ａ）水中の０．１％ＴＦＡおよび（Ｂ）アセトニトリル中の０．１％ＴＦＡを使用して行った。溶出剤Ｂを以下の勾配で使用した：３５％−７０％ Ｂ（２０分）−８０％（３分）、流速１ｍＬ／分。チオエーテル形成反応は円滑に進行した。２時間後、１つの生成物が形成され、その質量は、２つのチオエーテル結合を介して２つのＢｒ−アセチル−ＧＧＧＥＰ１Ｎ１７ペプチド鎖に連結された１つのＡｃ−Ｃ（Ａｃｍ）Ｔｔｄｓ−ＣＣＥＰＮ１７ペプチド鎖に相当する。溶液に２０μＬのＴＦＡを添加し、溶液を、ＴＳＫ−ｇｅｌ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ−５０Ｓ樹脂（７００×２６ｍｍカラム）で水中の６０％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ、流量１ｍＬ／分の溶出剤を使用するゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって直接精製した。溶出画分の分析は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ_４カラム（１５０×４．６ｍｍ，５μｍ）で溶出剤として（Ａ）水中の０．１％ＴＦＡおよび（Ｂ）アセトニトリル中の０．１％ＴＦＡを使用するＨＰＬＣによって行った。溶出剤Ｂを以下の勾配で使用した：４５％−６５％ Ｂ（２０分）−８０％（３分）、流速１ｍＬ／分、ＬＣ−ＭＳ Ｗａｔｅｒｓ−Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＬＣＺ Ｐｌａｔｆｏｒｍ、正モード（ＥＳ^＋）。予想ＭＷは１７４８９Ｄａであり、測定ＭＷは１７４８９Ｄａであった。
【０１２２】
Ａｃ−Ｃ（Ａｃｍ）（チオＥＰＮ１７）_３のアセチル化システインの脱保護によるＡｃ−Ｃ（チオＥＰＮ１７）_３の形成−
精製したコイルドコイル前駆体ａｃ−Ｃ（Ａｃｍ）（チオＥＰＮ１７）_３を２０ｍｇ／ｍｌの濃度でＴＦＡ、アニソール２％および５０当量のＡｇＯＴｆ（トリフルオロメタンスルホン酸銀）に４０℃で３時間溶解した。氷冷した無水エーテルを反応混合物に添加し、沈殿物を遠心によって単離した。沈殿物を氷冷した無水エーテルで２回洗浄した。ペプチドをＨ_２Ｏ／アセトニトリル、０．１％ＴＦＡに再溶解し、ＴＳＫ−ｇｅｌ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ−５０Ｓ樹脂（７００×２６ｍｍカラム）で溶出剤として水中の６０％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ、流速１ｍＬ／分を使用するゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって精製した。精製したペプチドのキャラクタリゼーションは、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＬＣＺ ｐｌａｔｆｏｒｍでエレクトロスプレー質量分析法によって行った。理論的平均ＭＷは１７４１５Ｄａであり、測定ＭＷは１７４１６Ｄａであった。
【０１２３】
ａｃ−Ｃ（チオＥＰ１７ＧｌｕＮ１７）_３およびａｃ−Ｃ（チオＥＰＮ１７）_３とＯＭＰＣの接合−
グラム陰性細菌からＯＭＰＣを精製する様々な方法が計画されている（Ｆｒａｓｃｈら，１９９７，Ｊ Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４０：８７；Ｆｒａｓｃｈら，１９７８，Ｊ Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４７：６２９；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．番号４，７０７，５４３；Ｈｅｌｔｉｎｇら，１９８１．Ａｃｔａ Ｐａｔｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．Ｓｅｃｔ．Ｃ．８９：６９；およびＵ．Ｓ．Ｐａｔ．番号４，２７１，１４７）。Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｂの改良外膜タンパク質複合体（ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｏｕｔｅｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ（ｉＯＭＰＣ））は、Ｆｕが米国特許番号５，４９４，８０８に記載したような当業界で公知の技術を使用して得られる。
【０１２４】
１．３６ｍＬのＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの改良外膜タンパク質複合体（ｉＯＭＰＣ）溶液（７．１３ｍｇ／ｍｌ）に、０．５ＭのＮａＨＣＯ_３（０．１５１ｍＬ）を最終濃度５０ｍＭ，ｐＨ８．５まで添加した。この溶液に、０．４０７ｍＬのヘテロ二官能性架橋剤スルホスクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ｓＳＭＣＣ，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）の２０μＭ溶液を２倍過剰量で滴下した（ＯＭＰＣのリシン残基に対して、０．４２μｍｏｌのリシン／ｍｇのＯＭＰＣタンパク質）。０．０４５ｍＬの０．５ＭのＮａＨＣＯ_３をさらに添加することによってｐＨを再調整した。溶液を暗中、４℃で１時間熟成後、１ＭのＮａＨ_２ＰＯ_４溶液（１６μｌ）を添加してｐＨを中性まで低下させた。溶液を４℃で３００Ｋ ＭＷＣＯ ＤｉｓｐｏＤｉａｌｙｓｅｒ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，ＣＡ）を使用し、バッファを６回交換し（２時間毎）、２Ｌの２０ｍＭのＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．３、（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸）、２ｍＭのＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）に透析して余剰の試薬を除去した。透析後に合計１．９ｍＬの活性化ＯＭＰＣ（ａＯＭＰＣ）を回収した。
【０１２５】
２つのＣｙｓ−含有ペプチド、ａｃ−Ｃ（チオＥＰ１７ＧｌｕＮ１７）_３およびａｃ−Ｃ（チオＥＰＮ１７）_３の０．５ｍｇ／ｍｌの予製液を０．１ＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＥＤＴＡ，ｐＨ７．３の脱ガス溶液中で調製した。沈殿を生じることなくａＯＭＰＣに安全に組込めるペプチドリガンドの最大量を確定するために、先ずａＯＭＰＣを漸増量のペプチドリガンドとインキュベートする小規模試験で接合反応を追跡した。ＯＭＰＣに組込めるマレイミド基の最大数は１ｍｇのＯＭＰＣあたりのリシン残基総数によって限定され、０．４２μＭのリシン／ｍｇのＯＭＰＣである。ＯＭＰＣの平均ＭＷが４０×１０^６であると考えると、これは１６，０００モルのリシン／１モルのＯＭＰＣに相当する。これらのうちの一部分だけがｓＳＭＣＣによって活性化され（３５％以下）、これは達成可能な最大ペプチド負荷約５０００モルに対応する。この場合にはａＯＭＰＣをＯＭＰＣ１モルあたり１０００、２０００および３０００モル過剰量のペプチドリガンドとインキュベートした。１時間後、サンプルをａＯＭＰＣサンプルに比較して沈殿の存在または濁りの増加を点検した。ａｃ−Ｃ（チオＥＰ１７ＧｌｕＮ１７）_３の場合には、３０００モルのリガンド／１モルのＯＭＰＣという最大モル過剰量の使用まで沈殿または濁りの増加は全く観察されなかったが、ａｃ−Ｃ（チオＥＰＮ１７）_３の場合には、３０００モル／ＯＭＰＣモルで多少の沈殿が観察され、２５００モル／ＯＭＰＣモルでは完全溶解であった。
【０１２６】
これらの観察に基づいて大規模反応を行った。２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＥＤＴＡ，ｐＨ７．３中の０．７５ｍＬ（３．８ｍｇ）のａＯＭＰＣに７ｍＬのａｃ−Ｃ（チオＥＰ１７ＧｌｕＮ１７）_３ペプチド予製液を、緩やかに渦流させながら滴下した。これは３０００モル過剰量のペプチドモル数／ＯＭＰＣモルに対応する。ａｃ−Ｃ（チオＥＰＮ１７）_３の場合は、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＥＤＴＡ，ｐＨ７．３中の０．４５ｍＬ（２．３ｍｇ）のａＯＭＰＣに９ｍＬのａｃ−Ｃ（チオＥＰＮ１７）_３ペプチド予製液を緩やかに渦流させながら滴下した。これは２５００モル過剰量のペプチドモル数／ＯＭＰＣモルに対応する。最終コンジュゲートのペプチド負荷を定量するためにマレイミド活性化ＯＭＰＣのサンプルをブランクとして維持した。接合反応混合物を暗中、４℃で１７時間熟成した。次いで、最終濃度１５ｍＭまでのμ−メルカプトエタノール（総添加量１０−１２μＬ）を、暗中、４℃で１時間使用してＯＭＰＣの残留マレイミド基を反応停止させた。溶液を３００Ｋ ＭＷＣＯ ＤｉｓｐｏＤｉａｌｙｓｅｒで１Ｌの２０ｍＭのＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．３を４℃で４時間毎に４回交換して透析し、接合しなかったペプチドおよびβ−メルカプトエタノールを除去した。Ｌｏｗｒｙアッセイ（Ｌｏｗｒｙら，１９５１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９３：２６５）によって濃度を測定すると、０．４１ｍｇ／ｍＬのＯＭＰＣ−（チオＥＰ１７ＧｌｕＮ１７）_３および０．３２ｍｇ／ｍＬのＯＭＰＣ−（チオＥＰＮ１７）_３が存在した。コンジュゲートおよびａＯＭＰＣサンプルを、排気した密封ガラス管に入れ共沸ＨＣｌと共に１１０℃で７０時間加水分解した。アミノ酸解析によってアミノ酸組成を決定した。ＯＭＰＣタンパク質へのペプチド接合負荷は、コンジュゲートアミノ酸組成をＯＭＰＣ担体およびペプチドリガンドの双方の組成に比較し、データの重回帰最小二乗分析によって決定した（Ｓｈｕｌｅｒら，１９９２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １５６：１３７−１４９）。コンジュゲートＯＭＰＣ−（チオＥＰ１７ＧｌｕＮ１７）_３では得られたペプチド対ＯＭＰＣモル比は５４１であり、ＯＭＰＣ−（チオＥＰＮ１７）_３では得られたペプチド対ＯＭＰＣモル比は４４３であった。
【０１２７】
結果−
この実施例は、ＣＣＥＺＮ１７配列（配列：４４）に基づく２つのチオエーテル結合安定化キメラペプチドの設計を記載している。第一の三量体コイルドコイルＡｃ−Ｃ（Ａｃｍ）−（チオＥＰ１７ＧｌｕＮ１７）_３は１７アミノ酸のＥＺ−様スカフォールドに基づき、第二のコイルドコイルＡｃ−Ｃ（Ａｃｍ）−（チオＥＰＮ１７）_３は２４アミノ酸のＥＺスカフォールドに基づく。２つの構築物は詳細に前述したように個々のキメラペプチド間のチオエーテル結合の形成によって共有結合的に安定化されている。設計したコイルドコイルのスカフォールド配列内部の様々な場所に、変化すなわち突然変異または側鎖の誘導体化を導入し、表５に“下線を付けて”示す。
【０１２８】
【表５】

【０１２９】
Ｃ（Ａｃｍ）−（チオＥＰ１７ＧｌｕＮ１７）_３は１つのＣＣ−キメラＮ−ペプチドすなわちＣＣＣＥ１７Ｎ１７（配列：８８；表５のペプチド２）および２つの誘導体化キメラＮ−ペプチドすなわちブロモアセチル−ＧＧＧＥ１７ＧｌｕＮ１７（配列：８７；表５のペプチド１）から成る。ＣＣＣＥ１７ＧｌｕＮ１７のＮＨ_２−末端システイン残基は、Ａｃｍ（アセタミドメチル）基で保護され、残りの非保護システイン残基のおのおのは各誘導体化キメラＮ−ペプチドのブロモ−アセチル部分と共に化学選択的チオエーテル結合を形成する。Ｃ（Ａｃｍ）−（チオＥＰ１７ＧｌｕＮ１７）_３に内包された各キメラペプチドのスカフォールドドメインは、ＥＺスカフォールド（配列：１５）の２４アミノ酸の代わりに１７アミノ酸およびリシンからグルタミン酸への突然変異を含む短縮ＥＺコイルドコイル（“Ｅ１７Ｇｌｕ”スカフォールド；配列：８４）から成る。Ｃ（Ａｃｍ）−（チオＥＰ１７ＧｌｕＮ１７）_３のスカフォールドドメインは、三量体コイルドコイルに内包された個別ペプチドのおのおののスカフォールド領域内部の１つのリシン残基へのＰＥＧ２３６部分の付着によって選択的に遮蔽されている（表５のペプチド１および２の下線部分）。各ペプチドのＰＥＧ付加リシン残基は、スカフォールドヘリックスのヘプタッドリピートの“ｆ”位置に局在し、該残基のε−アミノ基を介してＰＥＧ部分が付着している。２４アミノ酸から１７アミノ酸へのスカフォールドの短縮は、得られるコイルドコイルＣ（Ａｃｍ）−（チオＥＰ１７ＧｌｕＮ１７）_３とＯＭＰＣ担体との接合を促進し、また、接合に使用した水性バッファ中のペプチドの可溶化を、コイルドコイルの等電点（“ｐＩ”）を下げることによって促進する。ＰＥＧ２３６によるリシン残基のεアミノ基の誘導体化に伴う遊離アミノ基の除去、および、ＬｙｓからＧｌｕへの突然変異はいずれも、得られるコイルドコイルのｐＩをいっそう低下させる。この実施例に記載したＨＩＶ ｇｐ４１融合中間体の種々のミメティクスの等電点の比較については表６を参照するとよい。マレイミド活性化ＯＭＰＣ担体へのＣ（Ａｃｍ）−（チオＥＰ１７ＧｌｕＮ１７）_３の接合は、Ｃ−（チオＥＰ１７ＧｌｕＮ１７）_３を形成するチオール化ペプチドを得るために脱保護されたＮＨ_２−末端システイン残基を介して惹起される。
【０１３０】
Ｃ（Ａｃｍ）−（チオＥＰＮ１７）_３は１つのＣＣ−キメラＮ−ペプチドすなわちＣＣＣＥＺＮ１７（配列：９０；表５のペプチド４）と２つの誘導体化キメラＮ−ペプチドすなわちブロモアセチル−ＧＧＧＥＺＮ１７（配列：８９；表５のペプチド３）とから成る。ＣＣＣＥＺＮ１７のＮＨ_２−末端システイン残基はＡｃｍ（アセタミドメチル）基によって保護され、残りの非保護システイン残基のおのおのは各誘導体化キメラＮ−ペプチドのブロモ−アセチル部分と共に化学選択的チオエーテル結合を形成する。Ｃ（Ａｃｍ）−（チオＥＰＮ１７）_３に内包された各キメラペプチドのスカフォールドドメインは、ＥＺスカフォールド（配列：１５）の２４アミノ酸から成る。Ｃ（Ａｃｍ）−（チオＥＰＮ１７）_３のスカフォールドドメインは、三量体コイルドコイルに内包された個別ペプチドのおのおののスカフォールド領域内部の２つのリシン残基へのＰＥＧ２３６部分の付着によって選択的に遮蔽されている（表５のペプチド３および４の下線部分）。各ペプチドのＰＥＧ付加リシン残基は、スカフォールドヘリックスのヘプタッドリピートの“ｆ”位置に局在し、該残基のε−アミノ基を介してＰＥＧ部分が付着している。ＰＥＧ２３６によるリシン残基のεアミノ基の誘導体化は遊離アミノ基を除去し、得られるコイルドコイルのｐＩ低下を助ける（表６）。マレイミド活性化ＯＭＰＣ担体へのＣ（Ａｃｍ）−（チオＥＰＮ１７）_３の接合は、Ｃ−（チオＥＰＮ１７）_３を形成するチオール化ペプチドを得るために脱保護されたＮＨ_２−末端システイン残基を介して惹起される。
【０１３１】
【表６】

【図面の簡単な説明】
【０１３２】
【図１】図１Ａは、共有結合安定化ホモ三量体コイルドコイル（ＣＣＩＺＮ１７）_３を生じる酸化反応の概略図である。三量体コイルドコイルを安定化する３つのジスルフィド結合が各ペプチド鎖間に１つずつ存在する。図１Ｂは、（ＣＣＩＺＮ１７）_３（［配列２］_３）を安定化するジスルフィド結合の化学構造図である。３つのジスルフィド結合がＮＨ_２−末端システインアミノ酸残基のチオール（−ＳＨ）基の間に局在しており、その化学構造が図示されている。２つのシステイン残基の下流に局在するアミノ酸は大文字の一文字記号で示されている。
【図２】図２Ａは三量体“ＩＺ”スカフォールドのヘリカルホイール表示である。ヘプタッドリピートの“ｆ”位に局在する３つのリシンアミノ酸（“Ｋ”）がコイルドコイルの外側に近い位置に存在する状態で示されている。図２Ｂの（ＣＣＩＰＮ１７）_３の配列表示からわかるように、これらのリシン残基の２つが、側鎖のε−アミノ基をｍ−ｄＰＥＧ^ＴＭ酸（ＭＷ＝２３６）で誘導体化して選択的に遮蔽された三量体コイルドコイル（ＣＣＩＰＮ１７）_３を生成するために選択された。ＩＺスカフォールドドメイン（イタリック体）のＰＥＧ付加リシン残基は下線を付けて示す。ＨＩＶ Ｎ１７ドメインは大文字で示す。
【図３】（ＣＣＩＰＮ１７）_３ペプチドワクチンの概略モデルである。個々のキメラペプチドＣＣＩＰＮ１７は長さ約６２オングストロームの円筒として示されている。暗い灰色部分は長さ約３６オングストロームのＩＺスカフォールドドメインを表し、明るい灰色部分は長さ約２５オングストロームのＨＩＶ ｇｐ４１ Ｎ−ペプチドのＮ１７領域を表す。ｍ−ｄＰＥＧ^ＴＭ酸（ＭＷ＝２３６）部分は長さ約１５オングストロームの長方形として示されている。
【図４】（ＣＣＩＰＮ１７）_３によるホモロガスおよびヘテロロガスプライム／ブースト免疫方式で行ったモルモット試験のＥＬＩＳＡ結果を示す。プライム／ブーストの組合せは各棒グラフ群の下部に示す。各抗原に対するＥＬＩＳＡ幾何平均力価（ＧＭＴ）は血清中に存在する対応特異性所有抗体の相対量を正確に反映する。
【図５】図５Ａは、アミロイドβ−ペプチド（Ａβ）１−４２ペプチドのアミノ酸配列を示す。免疫優性Ｔ細胞エピトープ（Ｍｏｎｓｏｇｅｏ，Ａ．ら，２００３，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１２：４１５−２２）は一本の下線で示し、防御Ｂ細胞エピトープ（ＭｃＬａｕｒｉｎ，Ｊ．ら，２００２，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：１２６３−９）は二重下線で示す。図５Ｂは、Ｅｌａｎ／Ｗｙｅｔｈ，ＡＮ−１７９２（Ａβ１−４２）およびＡＣＣ−００１（（Ａβ１−１６）の２つのＡβペプチドワクチンのアミノ酸配列を示す。図５Ｃは、本発明で提案したＡβ１−４２ペプチドワクチンの概略図であり、２つのリシンアミノ酸残基（下線部分）をｍ−ｄＰＥＧ^ＴＭ酸（ＭＷ＝２３６）部分で誘導体化して免疫優性Ｔ細胞エピトープを選択的に遮蔽し、ペプチドのＮＨ_２−末端部分の防御Ｂ細胞エピトープを認識し易くしている。
【図６】図６Ａは、ＨＩＶ−１ ｇｐ４１エクトドメイン（配列６）中のトリプトファン（Ｔｒｐ）−富化モチーフのアミノ酸配列、および、Ｓｃｈｉｂｌｉ，ＤＪ．ら（２００１，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４０：９５７０−８）によって同定されたその二次構造の概略図を示す。一本下線で示したアミノ酸残基（Ｗ６７２、Ｆ６７３、１６７５、Ｔ６７６およびＷ６８０）がＨＩＶ−中和抗体４Ｅ１０と相互作用することは最近になって確認された（Ｃａｒｄｏｓｏ，Ｒ．Ｍ．Ｆ．ら，２００５，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｖｏｌ．２２：１６３−１７３）。二重下線で示したアミノ酸残基（Ｗ６６６、Ｗ３７０およびＷ６７８）は膜に面したＴｒｐ残基である。図６Ｂは、ロイシンジッパーＧＣＮ４に基づく提案４Ｅ１０ターゲット化ワクチンの概略図を示す。下線を付けたアミノ酸残基は、“ＧＣＮ４コイル”ペプチド（配列８）に適合性のダイマー化表面を有しているペプチド“４Ｅ１０コイル”（配列７）を作製するために、４Ｅ１０結合性アミノ酸を含有するＴｒｐ富化領域のいくつかの膜対面残基に導入した突然変異を表す。ジスルフィド結合がＧＣＮ４／４Ｅ１０コイルドコイルをさらに強化する。
【図７】リシン残基（二重下線）にｍ−ｄＰＥＧ^ＴＭ酸（ＭＷ＝２３６）部分を付着させることによってＰＥＧ修飾した図６Ｂの提案４Ｅ１０ターゲット化ワクチンの概略図である。
【図８】チオエーテル化学選択的結合によって共有結合的に安定化され本発明によってポリマー修飾できる三量体コイルドコイル構造ＮＨ_２−Ｃ（Ｆｍ）（チオＩＺＮ１７）_３の化学構造図を表す。三量体コイルドコイルは、１つのＣＣキメラＮ−ペプチドすなわちＮＨ_２−Ｃ（Ｆｍ）Ｔｔｄｓ−ＣＣＩＺＮ１７（配列７６）の２つのシステインアミノ酸残基のおのおののチオール（−ＳＨ）基間に局在する２つのチオエーテル結合と、２つの誘導体化キメラペプチドすなわちＢｒ−アセチル−ＧＧＧＩＺＮ１７（配列７７）のおのおのの求電子性ブロモ部分とによって形成される。結合システイン残基のＣＯＯＨ−末端に局在するアミノ酸残基は一文字記号で示している。このコイルドコイル構造は、ＣＣ−キメラＮ−ペプチドのＮＨ_２−末端システイン残基のチオールを遮蔽するフルオレニルメトキシ（“Ｆｍ”）保護基およびＮＨ_２−末端の遊離アミノ基を有している。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチド内部の結合部位の遮蔽方法であり、少なくとも１つの低分子量水溶性ポリマーを結合部位が前記ポリマーによって選択的に隠蔽されるように部位特異的に前記ポリペプチドに付着させる、遮蔽方法。
【請求項２】
前記結合部位がポリペプチド抗原のエピトープである請求項１の方法。
【請求項３】
前記低分子量水溶性ポリマーが前記ポリペプチドの１つのアミノ酸残基に部位特異的に付着する請求項２の方法。
【請求項４】
前記低分子量水溶性ポリマーが、ポリアルキレンオキシド、ポリアミドアルキレンオキシドおよびそれらの誘導体から成るグループから選択される請求項３の方法。
【請求項５】
前記低分子量水溶性ポリマーがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である請求項４の方法。
【請求項６】
前記ＰＥＧポリマーが約１０００Ｄａ未満の分子量を有している請求項５の方法。
【請求項７】
前記エピトープが、前記ペプチド間の１つ以上の共有結合によって共有結合的に安定化された３つのキメラペプチドを含むエンベロープウイルス膜融合タンパク質の内部三量体コイルドコイルモチーフの全部または一部分を模倣する共有結合安定化三量体コイルドコイル構造のスカフォールドドメイン内部に局在しており、各キメラペプチドが前記エンベロープウイルス膜融合タンパク質のＮＨ_２−末端ヘプタッドリピートドメインの全部または一部分にらせん相で融合したコイルドコイルの可溶性三量体形態またはその修飾形態を含むスカフォールドドメインを含んでいる請求項６の方法。
【請求項８】
前記エンベロープウイルス膜融合タンパク質がＨＩＶ ｇｐ４１である請求項７の方法。
【請求項９】
ポリペプチド抗原のエピトープの遮蔽方法であり、少なくとも１つの低分子量水溶性ポリマーをエピトープが前記ポリマーによって選択的に隠蔽されるように前記ポリペプチド内部の少なくとも１つのアミノ酸残基に部位特異的に付着させる、遮蔽方法。
【請求項１０】
前記低分子量水溶性ポリマーが、ポリアルキレンオキシド、ポリアミドアルキレンオキシドおよびそれらの誘導体から成るグループから選択される請求項９の方法。
【請求項１１】
前記低分子量水溶性ポリマーが約１０００Ｄａ未満の分子量をもつポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である請求項１０の方法。
【請求項１２】
ＨＩＶ ｇｐ４１の内部三量体コイルドコイルモチーフの全部または一部分を模倣する共有結合安定化三量体コイルドコイル構造のエピトープを遮蔽する方法であって、少なくとも１つの低分子量水溶性ポリマーを前記エピトープが前記ポリマーによって選択的に隠蔽されるようにコイルドコイル構造の少なくとも１つのアミノ酸残基に部位特異的に付着させることを含み、前記コイルドコイル構造が３つのキメラペプチド（前記ペプチド間の１つ以上の共有結合によって共有結合的に安定化される）を含み、各キメラペプチドがＨＩＶ ｇｐ４１のＮ−ペプチドの全部または一部分にらせん相で融合したコイルドコイルの可溶性三量体形態またはその修飾形態を含むスカフォールドドメインを含んでおり、ならびに前記選択的に隠蔽されたエピトープが前記キメラペプチドのスカフォールドドメインに局在している方法。
【請求項１３】
前記低分子量水溶性ポリマーが、ポリアルキレンオキシド、ポリアミドアルキレンオキシドおよびそれらの誘導体から成るグループから選択される請求項１２の方法。
【請求項１４】
前記低分子量水溶性ポリマーが約１０００Ｄａ未満の分子量を有しているポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である請求項１３の方法。
【請求項１５】
３つのキメラペプチドを含むＨＩＶ ｇｐ４１ Ｎ−ペプチドのコイルドコイルの全部または一部分を模倣するポリマー修飾された共有結合安定化三量体コイルドコイルであって、各キメラペプチドが、ＨＩＶ ｇｐ４１ Ｎ−ペプチドの全部または一部分にらせん相で融合したコイルドコイルの可溶性三量体形態またはその修飾形態を含むスカフォールドドメインを含んでおり、スカフォールドドメイン内部に局在するエピトープが前記スカフォールドドメイン内部の少なくとも１つのアミノ酸残基に部位特異的に付着した少なくとも１つの低分子量水溶性ポリマーによって隠蔽されている前記三量体コイルドコイル。
【請求項１６】
前記低分子量水溶性ポリマーが、ポリアルキレンオキシド、ポリアミドアルキレンオキシドおよびそれらの誘導体から成るグループから選択される請求項１５に記載のコイルドコイル。
【請求項１７】
前記低分子量水溶性ポリマーが約１０００Ｄａ未満の分子量を有しているポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である請求項１６に記載のコイルドコイル。
【請求項１８】
前記コイルドコイル内部の３つのキメラペプチドのおのおのがさらに、前記ペプチドのヘリカルドメインの外部に局在する少なくとも２つのシステイン残基を含み、および並列したペプチド上の前記システイン残基間のジスルフィド結合によってコイルドコイルが共有結合的に安定化されている請求項１７に記載のコイルドコイル。
【請求項１９】
前記コイルドコイル内部の３つのキメラペプチドのうちの第一キメラペプチドがさらに、前記ペプチドのヘリカルドメインの外部に局在する少なくとも２つのシステイン残基を含み、ならびに前記コイルドコイル内部の３つのキメラペプチドのうちの第二および第三のキメラペプチドがさらに、前記ペプチドのヘリカルドメインの外部に局在しチオエーテル結合を形成し得る求電子部分を含み、ならびにコイルドコイルが第一キメラペプチドの各システイン残基の求核性スルフヒドリルと各第二および第三キメラペプチドの求電子部分との間のチオエーテル結合を介して共有結合的に安定化されている請求項１７に記載のコイルドコイル。
【請求項２０】
（ＣＣＩＺＮ１７）_３、Ｃ（チオＥＺＮ１７）_３およびＣ（チオＥ１７ＧｌｕＮ１７）_３から成るグループから選択されたＨＩＶ ｇｐ４１ Ｎ−ペプチドコイルドコイルの全部または一部分を模倣するコイルドコイルであって、前記コイルドコイルのスカフォールドドメイン内部に局在するエピトープが前記スカフォールドドメイン内部の少なくとも１つのアミノ酸残基に部位特異的に付着した少なくとも１つの低分子量水溶性ポリマーによって選択的に隠蔽されているポリマー修飾された共有結合安定化三量体コイルドコイル。
【請求項２１】
前記低分子量水溶性ポリマーが、ポリアルキレンオキシド、ポリアミドアルキレンオキシドおよびそれらの誘導体から成るグループから選択される請求項２０に記載のコイルドコイル。
【請求項２２】
前記低分子量水溶性ポリマーが約１０００Ｄａ未満の分子量を有しているポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である請求項２１に記載のコイルドコイル。
【請求項２３】
（ａ）コイルドコイルの可溶性三量体形態を含むスカフォールド部分と、
（ｂ）ＨＩＶ ｇｐ４１ Ｎ−ペプチドの全部または一部分を含むＮ−ペプチド部分またはその修飾形態と、
（ｃ）少なくとも２つのシステイン残基を含むシステイン部分と、
を含み、（ａ）の前記スカフォールド部分が（ｂ）の前記Ｎ−ペプチド部分にらせん相で融合してα−ヘリカルドメインを形成し、（ｃ）の前記システイン部分が前記α−ヘリカルドメインの外部に局在し、および前記スカフォールド部分の内部に局在するエピトープが前記スカフォールド部分内部の少なくとも１つのアミノ酸残基に部位特異的に付着した少なくとも１つの低分子量水溶性ポリマーによって選択的に隠蔽されているポリマー修飾された可溶性キメラペプチド。
【請求項２４】
前記低分子量水溶性ポリマーが、ポリアルキレンオキシド、ポリアミドアルキレンオキシドおよびそれらの誘導体から成るグループから選択される請求項２３に記載のキメラペプチド。
【請求項２５】
前記低分子量水溶性ポリマーが約１０００Ｄａ未満の分子量を有しているポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である請求項２４に記載のキメラペプチド。
【請求項２６】
前記Ｎ−ペプチド部分がＮ−ヘリックス疎水性ポケットを形成するアミノ酸残基を内包するのに十分なＨＩＶ ｇｐ４１ Ｎ−ペプチドの部分を含む請求項２５に記載のキメラペプチド。
【請求項２７】
ＣＣＩＰＮ１７であるポリマー修飾キメラペプチド。
【請求項２８】
免疫原性担体分子に共有結合的に連結されている請求項２３に記載の可溶性キメラペプチドの抗原性接合体。
【請求項２９】
前記担体分子がＯＭＰＣである請求項２８に記載の抗原性接合体。
【請求項３０】
免疫原性担体分子に共有結合的に連結されている請求項１５に記載の共有結合安定化三量体コイルドコイルの抗原性接合体。
【請求項３１】
前記担体分子がＯＭＰＣである請求項３０に記載の抗原性接合体。
【請求項３２】
生物学的に有効なアジュバント、タンパク質、または、免疫応答を増進し得る他の成分と混合した請求項３０に記載の抗原性接合体を有効量で含み、哺乳動物体内でＨＩＶ特異的中和抗体を誘発し得る免疫原として有用な医薬組成物。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【公表番号】特表２００８−５３４６４０（Ｐ２００８−５３４６４０Ａ）
【公表日】平成２０年８月２８日（２００８．８．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５０４７０３（Ｐ２００８−５０４７０３）
【出願日】平成１８年３月３１日（２００６．３．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／００３３６１
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１０５９９３
【国際公開日】平成１８年１０月１２日（２００６．１０．１２）
【出願人】（５０１２０９４２７）イステイチユート・デイ・リチエルケ・デイ・ビオロジア・モレコラーレ・ピ・アンジエレツテイ・エツセ・ピー・アー (90)
【Ｆターム（参考）】