タンパク質の製造方法
【課題】 タンパク質のアミノ酸配列（当該タンパク質遺伝子／ｃＤＮＡの開始コドンから終止コドンまででコードされる配列）を変えることなく、機能性糖鎖が付加され得るペプチド、あるいは機能性糖鎖が付加されないペプチドをタンパク質に連結し、分泌生産性、各種機能、安定性などを向上させた目的タンパク質を製造すること。
【解決手段】 分泌タンパク質をコードするＤＮＡに、少なくとも１つのＡｓｎを含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡを連結してなるＤＮＡを含む組換えベクターを含む形質転換体を培養することを特徴とする、そのアミノ酸配列を付加した分泌タンパク質であって本来の活性を損なうことなく分泌生産量が増大した分泌タンパク質の製造方法を提供する。
【解決手段】 分泌タンパク質をコードするＤＮＡに、少なくとも１つのＡｓｎを含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡを連結してなるＤＮＡを含む組換えベクターを含む形質転換体を培養することを特徴とする、そのアミノ酸配列を付加した分泌タンパク質であって本来の活性を損なうことなく分泌生産量が増大した分泌タンパク質の製造方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はタンパク質に新たな性質を付与することを特徴とするペプチドを付加したタンパク質の製造方法に関する。タンパク質に新たな性質を付与するとは、タンパク質の分泌生産性の向上、タンパク質の生理活性等の向上、タンパク質の安定性の向上などを意味する。
【０００２】
詳細には、少なくとも１つのＡｓｎを含むアミノ酸配列を付加した分泌タンパク質であって本来の活性を損なうことなく分泌生産量が増大した分泌タンパク質の製造方法、および下記（１）のアミノ酸配列モチーフを付加した目的のタンパク質であって本来の活性を損なうことなく新たな性質を付与した目的のタンパク質の製造方法、およびＴｈｒまたはＳｅｒを少なくとも１つ有するペプチドにおいて、Ｔｈｒ／ＳｅｒにＯ結合型糖鎖が結合したそのアミノ酸配列を付加した目的のタンパク質であって本来の活性を損なうことなく新たな性質を付与した目的のタンパク質の製造方法に関する。
（１）Ａｓｎ Ｘａａ Ｔｈｒ／Ｓｅｒ
（ただし、（１）でＸａａは任意のアミノ酸を示す。）
【背景技術】
【０００３】
多くのタンパク質には翻訳後修飾として糖鎖付加がなされている。糖鎖付加の様式には２種類あって、タンパク質中のＮ（Ａｓｎ）−Ｘ（Ｐｒｏ以外のアミノ酸）−Ｓ（Ｓｅｒ）／Ｔ（Ｔｈｒ）という配列中のＡｓｎに糖鎖が付加される場合はＮ結合型糖鎖、タンパク質中のＳｅｒ、Ｔｈｒの水酸基を介して糖鎖が付加される場合はＯ結合型糖鎖とよぶ。一般に、Ｎ結合型糖鎖には上記のようなコンセンサス配列があるため、糖鎖付加の予測や制御が容易であるといえる。
【０００４】
糖鎖はタンパク質が適正なｆｏｌｄｉｎｇをとる際に必要であったり、当該タンパク質の分泌促進、機能発現、血中での安定化、分子間相互作用などにも関与していたりする。このような機能性糖鎖をタンパク質に効率よく付加させるために、タンパク質中にあるＮ結合型糖鎖付加のコンセンサス配列を改変したり、これをタンパク質中に人為的に導入して、タンパク質に結合する糖鎖の数を増やすことが検討されてきている（特許文献１、非特許文献１参照）。
【０００５】
例えば、コンセンサス配列ＮＸＳ／Ｔにおいて、Ｘ部分のアミノ酸を置換することによって糖鎖付加効率を改善することが可能である（非特許文献１参照）。しかし、置換するアミノ酸の種類によっては立体構造変化が大きくなり、タンパク質機能に影響を及ぼす恐れがある。また、目的にあった糖鎖付加効率を追求するためには、Ｘ部分に関してもともとのアミノ酸とプロリンを除く１８種類のアミノ酸について検討する必要があり、手間がかかる。
【０００６】
新たにＮ結合型糖鎖付加のコンセンサス配列をタンパク質中に導入する場合でも、置換するアミノ酸の種類や位置によっては本来のタンパク質機能を損ねる恐れがあり、至適な変異導入条件を検討する必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平５−８６０９９号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｓｕｓａｎ Ｈ． Ｓｈａｋｉｎ−Ｅｓｈｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１， ６３６３−６３６６ （１９９６）
【非特許文献２】Ｌｏｒｅｎｚｏ Ｆｒｉｇｅｒｉｏ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ． １３， １１０９−１１２６ （２００１）
【非特許文献３】Ｔｅｔｓｕｒｏ Ｏｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １１５， ３４５−３５０ （１９９４）
【非特許文献４】Ｅｒｎｓｔ Ｂａｕｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． １９５， ６３９−６４４ （１９８１）
【非特許文献５】Ｇｅｒｒｙ Ａ． Ｆ． Ｎｉｃｏｌａｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８， １３５８４−１３５９１ （１９９９）
【非特許文献６】Ａｔｓｕｓｈｉ Ｎｉｓｈｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ３５５， ２４５−２４８ （２００１）
【非特許文献７】Ｌａｋｓｈｍｉ Ｋａｓｔｕｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ３２３， ４１５−４１９ （１９９７）
【非特許文献８】Ｍｅｌｉｎｄａ Ｂｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｊ． ２７８， ４３３８−４３５０ （２０１１）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、目的タンパク質のアミノ酸配列（当該タンパク質遺伝子／ｃＤＮＡの開始コドンから終止コドンまででコードされる配列）を変えることなく、ペプチドまたは糖鎖が付加したペプチドを連結したタンパク質を合成し、分泌生産性、各種機能、安定性などを向上させた目的タンパク質を製造することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、Ｎ結合型糖鎖付加のコンセンサス配列であるＮＸＴ／Ｓ配列（ＸはＰｒｏ以外のアミノ酸）を含むペプチド、および類似のペプチドをタンパク質に連結した場合に、タンパク質にどのような影響があらわれるのかを検討した。その結果、驚くべきことに、糖鎖が付加されたペプチドがタンパク質に連結されたことによって、タンパク質の分泌生産量が著しく増大することを見出した。さらに驚くべきことに、糖鎖が付加しないペプチドでも同様な効果を見出し、特に、アスパラギンが配列に含まれることが重要であることを突き止め、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は下記＜１＞〜＜４＞のタンパク質の製造方法である。
＜１＞ 分泌タンパク質をコードするＤＮＡに、少なくとも１つのＡｓｎを含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡを連結してなるＤＮＡを含む組換えベクターを含む形質転換体を培養することを特徴とする、そのアミノ酸配列を付加した分泌タンパク質であって本来の活性を損なうことなく分泌生産量が増大した分泌タンパク質の製造方法。
【００１２】
＜２＞ 目的のタンパク質をコードするＤＮＡに、下記（１）のアミノ酸配列モチーフを少なくとも１つ有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡを連結してなるＤＮＡを含む組換えベクターを含む形質転換体を培養することを特徴とする、そのアミノ酸配列を付加した目的のタンパク質であって本来の活性を損なうことなく新たな性質を付与した目的のタンパク質の製造方法。
（１）Ａｓｎ Ｘａａ Ｔｈｒ／Ｓｅｒ
（ただし、（１）でＸａａは任意のアミノ酸を示す。）
【００１３】
＜３＞ 目的のタンパク質をコードするＤＮＡに、ＴｈｒまたはＳｅｒを少なくとも１つ有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡを連結してなるＤＮＡを含む組換えベクターを含む形質転換体を培養することを特徴とする、ＴｈｒまたはＳｅｒにＯ結合型糖鎖が結合したそのアミノ酸配列を付加した目的のタンパク質であって本来の活性を損なうことなく新たな性質を付与した目的のタンパク質の製造方法。
【００１４】
＜４＞ そのアミノ酸配列がプロテアーゼ切断配列を有するものであり、製造したタンパク質にそのプロテアーゼを反応させて、製造したタンパク質からそのアミノ酸配列を切断することを特徴とする＜１＞から＜３＞に記載のタンパク質の製造方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明者らは、タンパク質にＮ結合型糖鎖付加のコンセンサス配列であるＮＸＴ／Ｓ配列（ＸはＰｒｏ以外のアミノ酸）を含むペプチドやそれに類似のペプチドを連結した場合、当該タンパク質の分泌生産量が増大することを見出した。この原因としては、ペプチド付加の単独効果、あるいは糖鎖が付加されたペプチドがタンパク質に連結された効果が考えられる。従来、タンパク質に機能性糖鎖を効率よく付加させるためには、タンパク質の糖鎖付加部位周辺配列を改変したり、新たにＮ結合型糖鎖付加のコンセンサス配列を導入したりするなど、タンパク質への変異導入が必要であった。そのため、野生型タンパク質の諸性質を損ねる恐れがあった。本発明では、タンパク質のアミノ酸配列（当該タンパク質遺伝子／ｃＤＮＡの開始コドンから終止コドンまででコードされる配列）を変えることなくペプチドや糖鎖を付加することが可能で、必要に応じて、後から付加したペプチドおよび糖鎖を除去することもできることから、より野生型に近いタンパク質を効率よく調製できる。
【００１６】
糖鎖のないペプチド付加の効果として、ある種のペプチドをタンパク質に連結することにより、目的タンパク質の諸性質が変化する場合があることが知られている。例えば小胞体局在シグナルであるＫＤＥＬというアミノ酸配列（この配列には糖鎖は付加されない）をタンパク質のＣ末端に連結すると、当該タンパク質が小胞体に局在するようになる（非特許文献２参照）。本発明では、糖鎖が付加されないペプチドをタンパク質に連結させたときにおいても、場合によっては分泌生産性の向上が認められることを見出した。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】実施例１に用いたヒトＩＬ−６組換え体の構造の特徴を示す模式図。
【図２】ＩＬ−６に存在する各Ｎ結合型糖鎖付加のコンセンサス配列を改変した変異体の分泌状況を示すブロット。
【図３】ＩＬ−６（ＷＴ）、ＩＬ−６（ＡＡ）の分泌におけるペプチド付加の効果を示すブロット。
【図４】ＩＬ−６（ＡＡ）に、糖鎖が結合しないペプチドを付加した場合の効果。
【図５】Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ切断配列入りペプチドを付加したＩＬ−６に対してＰＮＧａｓｅ Ｆ処理、Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ処理を施した際の状況を示すブロット。矢印が示すバンドはＮ型糖鎖の結合したペプチドが切断除去された分子を示す。
【図６】実施例２に用いたヒトＮＧＡＬの構造の特徴を示す模式図。
【図７】ＮＧＡＬの分泌におけるペプチド付加の効果を示すズロット。
【図８】実施例３に用いたヒトキモトリプシンＣの構造の特徴を示す模式図。
【図９】キモトリプシンＣ、ＣＴＲＣ（Ｎ５２Ｓ）の分泌におけるペプチド付加の効果を示すブロット。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明のタンパク質製造方法は、下記＜１＞〜＜４＞である。
＜１＞ 分泌タンパク質をコードするＤＮＡに、少なくとも１つのＡｓｎを含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡを連結してなるＤＮＡを含む組換えベクターを含む形質転換体を培養することを特徴とする、そのアミノ酸配列を付加した分泌タンパク質であって本来の活性を損なうことなく分泌生産量が増大した分泌タンパク質の製造方法。
【００１９】
＜２＞ 目的のタンパク質をコードするＤＮＡに、下記（１）のアミノ酸配列モチーフを少なくとも１つ有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡを連結してなるＤＮＡを含む組換えベクターを含む形質転換体を培養することを特徴とする、そのアミノ酸配列を付加した目的のタンパク質であって本来の活性を損なうことなく新たな性質を付与した目的のタンパク質の製造方法。
（１）Ａｓｎ Ｘａａ Ｔｈｒ／Ｓｅｒ
（ただし、（１）でＸａａは任意のアミノ酸を示す。）
【００２０】
＜３＞ 目的のタンパク質をコードするＤＮＡに、ＴｈｒまたはＳｅｒを少なくとも１つ有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡを連結してなるＤＮＡを含む組換えベクターを含む形質転換体を培養することを特徴とする、ＴｈｒまたはＳｅｒにＯ結合型糖鎖が結合したそのアミノ酸配列を付加した目的のタンパク質であって本来の活性を損なうことなく新たな性質を付与した目的のタンパク質の製造方法。
【００２１】
＜４＞ そのアミノ酸配列がプロテアーゼ切断配列を有するものであり、製造したタンパク質にそのプロテアーゼを反応させて、製造したタンパク質からそのアミノ酸配列を切断することを特徴とする＜１＞から＜３＞に記載のタンパク質の製造方法。
【００２２】
本発明に用いるペプチドとしては、上記＜１＞〜＜４＞のアミノ酸配列モチーフを有するペプチドであれば特に限定はないが、例えばＮＳＴ、ＮＳＴＮＳＴ、ＡＮＳＴＮＳＴＮＳＴ、ＮＳＡ、ＮＮＳＴ、ＮＳＡＮＳＡ、ＮＱＳＴ、ＱＮＳＴ、ＮＮＳＴＮＮＳＴ、ＮＮＳＡ、ＡＮＳＴ、ＮＡＳＴ、ＮＮＡＴ、ＰＮＳＴ、ＷＮＳＴ、ＮＮＴＴ、ＮＡＴＳ、ＮＳＴＮＳＡ、ＮＳＡＮＳＴといったペプチドが挙げられる。より好ましくは、糖鎖が付加されたＮＳＴ、ＮＳＴＮＳＴ、ＡＮＳＴＮＳＴＮＳＴ、ＮＮＳＴ、ＮＱＳＴ、ＱＮＳＴ、ＮＮＳＴＮＮＳＴ、ＮＮＳＡ、ＡＮＳＴ、ＮＡＳＴ、ＮＮＡＴ、ＰＮＳＴ、ＷＮＳＴ、ＮＮＴＴ、ＮＡＴＳ、ＮＳＴＮＳＡ、ＮＳＡＮＳＴである。また、プロテアーゼ切断部位を有するペプチドとしては、ＩＥＧＲＮＳＴ、ＩＥＧＲＮＳＴＮＳＴ、ＩＥＧＲＩＥＧＲＮＳＴＮＳＴ、ＩＥＧＲＩＥＧＲＮＳＡＮＳＡ、ＩＥＧＲＩＥＧＲＡＡＡＮＳＴＮＳＴ（以上、 Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ切断部位入りペプチド）、ＤＤＤＤＫＮＳＴ、ＤＤＤＤＫＮＳＴＮＳＴ、ＤＤＤＤＫＤＤＤＤＫＮＳＴＮＳＴ（以上、エンテロキナーゼ切断部位入りペプチド）、ＬＥＶＬＦＱＧＰＮＳＴＮＳＴ（ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅａｓｅ切断部位入りペプチド）などである。（配列表配列番号１〜２６）
【００２３】
さらに目的タンパク質とペプチドの間には、スペーサーとしてのアミノ酸や制限酵素サイトによってコードされるアミノ酸などが連結していてもよい。また、連結したペプチドの後続には検出のためのタグが結合してもよい。
【００２４】
Ｎ結合型糖鎖の結合の確認は、特に限定しないが、糖鎖除去反応前後の分子量変化を観察することにより行うことができる。糖鎖除去反応に用いる酵素として、例えばペプチド：Ｎ−グリコシダーゼＦ（Ｐｅｐｔｉｄｅ：Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ Ｆ、ＰＮＧａｓｅ Ｆ）が好ましい。
【００２５】
本発明においてペプチドをコードするＤＮＡは、上記＜１＞〜＜４＞のアミノ酸配列モチーフを有するペプチドをコードする塩基配列のＤＮＡ、およびその相補鎖を、アニールさせることにより合成し、Ｔ４リガーゼを用いて各種組換えベクターに挿入するが、ペプチドをコードするＤＮＡの組換えベクターへの挿入法はこの方法に限定されるものではない。また、ベクター挿入時に制限酵素サイトを利用する場合は、制限酵素サイトによってコードされるアミノ酸もペプチドに連結される。
【００２６】
本発明における組換えベクターは、特にその種類は限定されず、例えば、自立的に複製するベクター（例えばプラスミドやファージベクター）でもよいし、あるいは、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。
【００２７】
好ましくは、本発明で用いるベクターは発現ベクターである。発現ベクターにおいて本発明のＤＮＡは、タンパク質をコードするＤＮＡ、およびプロモーター等の転写に必要な要素が機能的に連結されている。プロモーターは宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。また、これらの発現ベクターはアンピシリン耐性遺伝子などの適当な選択マーカー遺伝子を含んでいてもよい。発現ベクターの例としては、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II ＳＫ＋ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ ｖｅｒ．Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などが挙げられるが、本発明に用いる発現ベクターはこれらに限定されるものではない。
【００２８】
本発明で用いるＤＮＡは、遺伝子導入試薬、例えばリン酸カルシウムやリポソームを利用するもの、あるいはＦｕＧｅｎｅ ６ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（従来はＲｏｃｈｅ、現在はＰｒｏｍｅｇａ）などの非リポソーム系トランスフェクション試薬などを用いて、あるいはエレクトロポレーション法やマイクロインジェクション法などにより、宿主細胞へ導入する。
【００２９】
本発明における形質転換体として、細胞は糖鎖付加能を有する細胞、例えば、原核生物ではカンピロバクターやオリゴサッカリルトランスフェラーゼ遺伝子を導入された大腸菌など、また真核生物では、酵母、糸状菌、植物細胞、昆虫細胞、哺乳類由来培養細胞などが挙げられるが、遺伝子導入のしやすさ、タンパク質生産量の高さ、哺乳類型糖鎖が付加できる点などで、哺乳類由来培養細胞のうち、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ−７細胞などを用いるのが特に好ましい。
【００３０】
本発明の形質転換体を用いて本発明のタンパク質を製造する方法として、形質転換体の培養、タンパク質の取得、精製などの工程が挙げられる。形質転換体の培養は、３７℃のＣＯ２インキュベーター内で、遺伝子導入後一定時間（５〜１５時間）までは１０％牛血清含有培地にて行い、その後は目的タンパク質の精製を容易にするために無血清培地に交換して継続培養する（＋９〜４８時間）。目的タンパク質の取得は、当該タンパク質が分泌タンパク質で、培地中に分泌されているようであれば、培地を回収してタンパク質源とし、これをアフィニティークロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィーに供して精製する。目的タンパク質が培地中に分泌されず、細胞内に蓄積している場合には、細胞を回収し、ここに細胞溶解剤を加えるとともに超音波破砕により細胞を破砕して目的タンパク質を細胞溶解剤中に放出させ、これを適当な緩衝液などで希釈するなどしたものをタンパク質源として、上記と同様にして各種クロマトグラフィーにより精製する。
【００３１】
本発明のタンパク質を製造する方法は、細胞を用いる方法に限定されるものではなく、無細胞タンパク質合成系によって製造することもできる。無細胞タンパク質合成系としては、例えば、コムギ胚芽、大腸菌、ウサギ網状赤血球、昆虫細胞などから調製したものが挙げられる。目的タンパク質をコードするＤＮＡを逆転写が可能なベクターに組み込み、これより逆転写反応によって合成したｍＲＮＡを適当な無細胞タンパク質合成系に加えて目的タンパク質を合成する。そして、その反応液より目的タンパク質を上記と同様にして精製する。
【００３２】
本発明のタンパク質から付加したペプチドを除去するには、Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ、エンテロキナーゼ、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅａｓｅなどのプロテアーゼを利用するが、これらのプロテアーゼに限定されるものではない。またプロテアーゼ処理後において、配列によっては付加したペプチドの一部がタンパク質に連結されたままになる場合もある。
【実施例】
【００３３】
以下に記載する実施例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこの実施例によって限定されるものではない。
【実施例１】
【００３４】
ヒトインターロイキン−６（ＩＬ−６）の場合
本実施例ではヒト胸腺由来のＩＬ−６をモデルとして、ペプチドの付加がＩＬ−６の分泌生産量へ及ぼす影響を調べた。ＩＬ−６には、Ｎ結合型糖鎖付加のコンセンサス配列であるＮＸＳ／Ｔ配列が２カ所に存在するが（Ｎ７３：ＮＫＳ、Ｎ１７２：ＮＡＳ）（図１）、Ｎ１７２には通常、糖鎖は結合していない。またＯ結合型糖鎖がＴ１６６に結合することが報告されている（非特許文献３参照）。
【００３５】
まず、ヒト胸腺由来ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を鋳型として、プライマーＮＧ５２６＋、ＮＧ５２７−（配列表配列番号２７、２８）とＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ここで増幅したＩＬ−６の全長ｃＤＮＡをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II ＳＫ＋ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＥｃｏＲＶサイトにクローニングした。これよりＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩで切り出したＤＮＡ断片をｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ ｖｅｒ．Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩサイトに挿入したものを、野生型ＩＬ−６（ＷＴ）の発現ベクターとした。
【００３６】
つぎに、ＩＬ−６の糖鎖付加状況を改善した際の分泌への影響をみるため、Ｎ７３：ＮＫＳのＳｅｒをＴｈｒに交換した変異体（ＩＬ−６変異体Ｓ７５Ｔ）、Ｎ１７２：ＮＡＳのＳｅｒをＴｈｒに交換した変異体（ＩＬ−６変異体Ｓ１７４Ｔ）、およびそれら両方をＴｈｒに交換した変異体（ＩＬ−６変異体Ｓ７５Ｔ／Ｓ１７４Ｔ）を作製した。Ｎ７３：ＮＫＳのＳｅｒをＴｈｒに交換するためにはプライマーＮＧ５２８＋、ＮＧ５２９−（配列表配列番号２９、３０）の各プライマーの組み合わせと、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて、上記ＩＬ−６ｃＤＮＡを含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ IIプラスミドを鋳型としてＰＣＲによる変異導入でＳ／Ｔ交換を行った。また、Ｎ１７２：ＮＡＳのＳｅｒをＴｈｒに交換するためにはプライマーＮＧ５３０＋、ＮＧ５３１−（配列表配列番号３１、３２）の各プライマーの組み合わせを用いて、上記と同様にしてＰＣＲによる変異導入でＳ／Ｔ交換を行った。
【００３７】
さらに、両コンセンサス配列のＳ部分をＡｌａに置換して糖鎖が付加されないようにした変異体（ＡＡ）は、プライマーＮＧ５４４＋、ＮＧ５４５−（配列表配列番号３３、３４、Ｎ７３：ＮＫＡ用）、プライマーＮＧ５４６＋、ＮＧ５４７−（配列表配列番号３５、３６、Ｎ１７２：ＮＡＡ）の各プライマーの組み合わせを用いて、上記と同様にＰＣＲによる変異導入を順次行って作製した。いずれの変異導入断片もＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩで切り出した後、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ ｖｅｒ．ＡのＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩサイトに挿入して発現ベクターとした。
【００３８】
また、Ａｓｎ Ｘａａ Ｔｈｒ／Ｓｅｒのアミノ酸モチーフを含むペプチドがＩＬ−６の分泌に及ぼす影響を調べるため、各種ペプチドつきＩＬ−６の発現ベクターを構築した。ペプチドＮＳＴをコードするＤＮＡは、プライマーＮＧ４０４＋、ＮＧ４０５−（配列表配列番号３７、３８）をアニーリングさせて作製した。ペプチドＮＮＳＴ（配列表配列番号３）をコードするＤＮＡは、プライマーＮＧ４５１＋、ＮＧ４５２−（配列表配列番号３９、４０）をアニーリングさせて作製した。ペプチドＮＳＴＮＳＴ（配列表配列番号１）をコードするＤＮＡは、プライマーＮＧ４５３＋、ＮＧ４５４−（配列表配列番号４１、４２）をアニーリングさせて作製した。ペプチドＮＮＳＴＮＮＳＴ（配列表配列番号７）をコードするＤＮＡは、プライマーＮＧ４６８＋、ＮＧ４６９−（配列表配列番号４３、４４）をアニーリングさせて作製した。ペプチドＡＮＳＴＮＳＴＮＳＴ（配列表配列番号２）をコードするＤＮＡは、プライマーＮＧ４９３＋、ＮＧ４９４−（配列表配列番号４５、４６）をアニーリングさせて作製した。
【００３９】
また、糖鎖がつかないペプチドＮＳＡＮＳＡ（配列表配列番号４）をコードするＤＮＡは、プライマーＮＧ４５５＋、ＮＧ４５６−（配列表配列番号４７、４８）をアニーリングさせて作製した。Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ切断配列入りペプチドＩＥＧＲＩＥＧＲＮＳＴＮＳＴ（配列表配列番号２０）をコードするＤＮＡは、プライマーＮＧ９４８＋、ＮＧ９４９−（配列表配列番号４９、５０）をアニーリングさせて作製した。なお、いずれのペプチドをコードするＤＮＡにも、ＩＬ−６への連結とベクターへの挿入のためにＸｈｏＩ、ＸｂａＩの制限酵素サイトがそれぞれ５’側、３’側に存在するため、実際のペプチドにはＮ末端側にはＬｅｕ Ｇｌｕが、Ｃ末端側にはＳｅｒ Ａｒｇが付加される。これらのＤＮＡを野生型ＩＬ−６の発現ベクター、あるいはＮ結合型糖鎖が付加されないようにした変異体ＩＬ−６（ＡＡ）の発現ベクターに組み込み、各ペプチドつきＩＬ−６の発現ベクターとした。
【００４０】
それぞれの発現ベクターはＦｕＧｅｎｅ ６ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いてＨＥＫ２９３細胞、あるいはＣＯＳ−７細胞に導入した。トランスフェクション後、これらの細胞は３７℃のＣＯ２インキュベーターで一晩培養し、ここで培地交換を行って（３．５ｃｍ ｄｉｓｈ、ＭＥＭ培地＋１０％牛血清２ｍｌをＭＥＭ培地１ｍｌに交換）、さらに一定時間培養を行った（トランスフェクションから４８時間後まで）。培養終了後、培養上清を回収して少量のＮＴＡ Ａｇａｒｏｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）を添加し、４℃で２時間撹拌して培養上清中に分泌された組換え体ＩＬ−６をこれに吸着させ回収した。分泌生産量を解析する場合は、このＮＴＡ ＡｇａｒｏｓｅをＰＢＳ緩衝液で洗浄後、ＳＤＳ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒと混合し、煮沸処理後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供した。
【００４１】
ＩＬ−６の細胞増殖活性を調べる場合は、このＮＴＡ ＡｇａｒｏｓｅからＩＬ−６を０．２Ｍイミダゾールにて溶出し、これをアミコンウルトラ−４（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にて脱塩濃縮した。この試料に対して、必要に応じてＦａｃｔｏｒ Ｘａなどの特異的プロテアーゼによる処理を施して連結したペプチドを除去し、さらにＮＴＡ Ａｇａｒｏｓｅカラム（スルー画分を採取）、抗ＩＬ−６抗体カラムの組み合わせによりペプチドを除去したＩＬ−６の再精製を行った。このようにして調製したＩＬ−６を用いてマウスハイブリドーマ細胞株７ＴＤ１細胞を刺激し、その増殖への影響を細胞増殖キットII（ＸＴＴアッセイ、Ｒｏｃｈｅ）により測定した。
【００４２】
分泌生産量を解析する場合は、泳動終了後、ウェスタンブロットを行うため、ゲル中のタンパク質はブロッティング装置を用いてＰＶＤＦメンブレン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に転写し、これを３％スキムミルク含有ＴＢＳ−Ｔ緩衝液内で室温１時間震盪してブロッキング処理を行った。つぎにこのメンブレンを一次抗体溶液（抗ｍｙｃ−ｔａｇ抗体、ＭＢＬを３％スキムミルク含有ＴＢＳ−Ｔ緩衝液で１０００倍希釈したもの）に浸漬させ、室温で１時間震盪した。その後、メンブレンを３％スキムミルク含有ＴＢＳ−Ｔ緩衝液で２回洗浄し、二次抗体溶液（ＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ抗マウスＩｇＧ抗体、Ｚｙｍｅｄを３％スキムミルク含有ＴＢＳ−Ｔ緩衝液で５０００倍希釈したもの）に浸漬させ、室温で１時間震盪した。そして、メンブレンを３％スキムミルク含有ＴＢＳ−Ｔ緩衝液で２回洗浄し、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いて化学発光反応を行い、Ｃｈｅｍｉｄｏｃ ＸＲＳ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で陽性バンドを検出した。
＜比較例１＞
【００４３】
まず、ＩＬ−６のＮ結合型糖鎖に何らかの機能があるのかを検討するため、野生型ＩＬ−６、Ｓ７５Ｔ変異体、Ｓ１７４Ｔ変異体、Ｓ７５Ｔ／Ｓ１７４Ｔ変異体をＨＥＫ２９３細胞で発現させてみた。これらの変異体はＮ結合型糖鎖付加のコンセンサス配列中にあるＳｅｒをＴｈｒに変えることにより、各糖鎖付加部位の糖鎖付加効率を増大させることを期待したものである（非特許文献４〜７参照）。その結果、野生型ＩＬ−６の分泌量を１としたとき、各変異体分子の分泌量は、Ｓ７５Ｔ変異体で２．４倍、Ｓ１７４Ｔ変異体で１．４倍、Ｓ７５Ｔ／Ｓ１７４Ｔ変異体で２．５倍となった(図２)。Ｓ７５Ｔ変異体およびＳ７５Ｔ／Ｓ１７４Ｔ変異体では糖鎖付加型のＩＬ−６の割合も増加していた。この結果より、ＩＬ−６の分泌には糖鎖が重要な役割を果たしていることが示唆された。
【００４４】
＜実施例１．１＞
そこで、野生型ＩＬ−６のＣ末端にＮ結合型糖鎖が付加し得る、Ａｓｎ Ｘａａ Ｔｈｒ／Ｓｅｒのアミノ酸モチーフを含む各種ペプチドを連結し、分泌におけるその効果を調べた。その結果、いずれのペプチドを連結した場合でも、野生型にくらべると分泌量の増大が認められた（図３Ａ）。野生型ＩＬ−６の分泌量を１としたとき、ペプチドを連結した分子の分泌量は、ＮＳＴペプチドの連結で１．５倍、ＮＮＳＴペプチド（配列表配列番号３）の連結で１．９倍、ＮＳＴＮＳＴペプチド（配列表配列番号１）の連結で７．１倍、ＮＮＳＴＮＮＳＴペプチド（配列表配列番号７）の連結で５．０倍、ＡＮＳＴＮＳＴＮＳＴペプチド（配列表配列番号２）の連結で５．６倍になった。ＡＮＳＴＮＳＴＮＳＴペプチドを連結した場合では、Ｎ結合型糖鎖付加型のＩＬ−６が顕著に増加したが、他のペプチドを連結した場合も含めて糖鎖が付加していないＩＬ−６の分泌も増加している。このペプチドを連結したＩＬ−６全体の分泌量の増大効果は、比較例１の変異体による糖鎖付加率増加による効果と同等かそれを上回った。
【００４５】
Ｎ７３、Ｎ１７２に糖鎖がつかなくした変異体ＩＬ−６（ＡＡ）にＡＮＳＴＮＳＴＮＳＴペプチドを連結した分子をＨＥＫ２９３細胞に発現させたとき、分泌されてきた分子に対してＰＮＧａｓｅ Ｆ処理を施したところ、処理前後で分子量変化が認められたことから、挿入したペプチドに実際にＮ結合型糖鎖が結合していたことが示された（図３Ｂ）。
【００４６】
いずれのペプチドを連結した場合でも、Ｎ結合型糖鎖非付加型ＩＬ−６の分泌量も増大しているが、これはペプチドへの糖鎖付加の有無にかかわらず、ペプチドを連結したこと自体の単独効果で分泌が促進される可能性、あるいはＮ結合型糖鎖付加型分子の存在がＮ結合型糖鎖非付加型分子の分泌を促進している可能性が考えられる。実際、驚くべきことに、糖鎖が結合しないペプチドＮＳＡＮＳＡ（配列表配列番号４）をＩＬ−６（ＡＡ）に連結した場合でも、ＩＬ−６（ＡＡ）や野生型ＩＬ−６にくらべて分泌量が１．５倍に増加することが判明した（図４）。
【００４７】
＜実施例１．２＞
ＩＬ−６の場合、各種ペプチドの連結で分泌量を増大させることができたが、分泌してきたタンパク質の挿入ペプチド部分に糖鎖がついたままだと、タンパク質の機能発現を阻害する場合も想定される。また、連結したペプチドの存在自体が同様の問題を引き起こす可能性もある。そこで、Ｎ結合型糖鎖が付加し得る、Ａｓｎ Ｘａａ Ｔｈｒ／Ｓｅｒのアミノ酸モチーフを含むペプチドを連結して分泌させたタンパク質から、連結したペプチド部分を除去することを検討した。ＮＳＴＮＳＴペプチドの前部に特異的プロテアーゼＦａｃｔｏｒ Ｘａの切断認識配列ＩＥＧＲを２つ挿入したペプチドＩＥＧＲＩＥＧＲＮＳＴＮＳＴ（配列表配列番号２０）を作製し、これをＩＬ−６に連結してＨＥＫ２９３細胞に分泌生産させた。このペプチド付きＩＬ−６を回収し、Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ処理を施したところ、ペプチド部分以降（ｍｙｃタグを含む）が切断除去されたＩＬ−６が検出された（図５矢印）。従って、連結するペプチドの配列を工夫すれば、後からこれを除去して、野生型のアミノ酸配列を含む目的タンパク質を得ることが可能であることが示された。
【００４８】
なお、本発明により製造したＩＬ−６から連結したペプチドを特異的プロテアーゼ処理により除去したＩＬ−６は、野生型ＩＬ−６と同等の細胞増殖活性を保持していた。
【実施例２】
【００４９】
ヒトＮｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｌｉｐｏｃａｌｉｎ（ＮＧＡＬ）の場合
本実施例ではヒトＮＧＡＬをモデルとして、ペプチドの付加がＮＧＡＬの分泌生産量へ及ぼす影響を調べた。ＮＧＡＬには、Ｎ結合型糖鎖付加のコンセンサス配列であるＮＸＳ／Ｔ配列が１カ所存在する（Ｎ８５：ＮＶＴ）（図６）。
【００５０】
まず、ヒト膵がん細胞ＫＬＭ−１のｔｏｔａｌ ＲＮＡより調製したｃＤＮＡを鋳型として、プライマーＮＧ２８＋、ＮＧ２９−（配列表配列番号５１、５２）とＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ここで増幅したＮＧＡＬの全長ｃＤＮＡをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II ＳＫ＋ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＥｃｏＲＶサイトにクローニングした。これよりＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩで切り出したＤＮＡ断片をｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ ｖｅｒ．Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩサイトに挿入したものを、野生型ＮＧＡＬ（ＷＴ）の発現ベクターとした。
【００５１】
またＡｓｎ Ｘａａ Ｔｈｒ／Ｓｅｒのアミノ酸モチーフを含むペプチドがＮＧＡＬの分泌に及ぼす影響を調べるため、各種ペプチドつきＮＧＡＬの発現ベクターを構築した。ペプチドＮＳＴをコードするＤＮＡは、プライマーＮＧ４０４＋、ＮＧ４０５−（配列表配列番号３７、３８）をアニーリングさせて作製した。ペプチドＮＮＳＴ（配列表配列番号３）をコードするＤＮＡは、プライマーＮＧ４５１＋、ＮＧ４５２−（配列表配列番号３９、４０）をアニーリングさせて作製した。ペプチドＮＳＴＮＳＴ（配列表配列番号１）をコードするＤＮＡは、プライマーＮＧ４５３＋、ＮＧ４５４−（配列表配列番号４１、４２）をアニーリングさせて作製した。ペプチドＮＮＳＴＮＮＳＴ（配列表配列番号７）をコードするＤＮＡは、プライマーＮＧ４６８＋、ＮＧ４６９−（配列表配列番号４３、４４）をアニーリングさせて作製した。ペプチドＡＮＳＴＮＳＴＮＳＴ（配列表配列番号２）をコードするＤＮＡは、プライマーＮＧ４９３＋、ＮＧ４９４−（配列表配列番号４５、４６）をアニーリングさせて作製した。
【００５２】
なお、いずれのペプチドをコードするＤＮＡにも、ＮＧＡＬへの連結とベクターへの挿入のためにＸｈｏＩ、ＸｂａＩの制限酵素サイトがそれぞれ５’側、３’側に存在するため、実際のペプチドにはＮ末端側にはＬｅｕ Ｇｌｕが、Ｃ末端側にはＳｅｒ Ａｒｇが付加される。これらのＤＮＡを野生型ＮＧＡＬの発現ベクターに組み込み、各ペプチドつきＮＧＡＬの発現ベクターとした。
【００５３】
それぞれの発現ベクターはＦｕＧｅｎｅ ６ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いてＨＥＫ２９３細胞に導入した。トランスフェクション後、これらの細胞は３７℃のＣＯ２インキュベーターで一晩培養し、ここで培地交換を行って（３．５ｃｍ ｄｉｓｈ、ＭＥＭ培地＋１０％牛血清２ｍｌをＭＥＭ培地１ｍｌに交換）、さらに一定時間培養を行った（トランスフェクションから４８時間後まで）。培養終了後、培養上清を回収して少量のＮＴＡ Ａｇａｒｏｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）を添加し、４℃で２時間撹拌して培養上清中に分泌された組換え体ＮＧＡＬをこれに吸着させ回収した。分泌生産量を解析する場合は、このＮＴＡ ＡｇａｒｏｓｅをＰＢＳ緩衝液で洗浄後、ＳＤＳ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒと混合し、煮沸処理後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供した。
【００５４】
分泌生産量を解析する場合は、泳動終了後、ウェスタンブロットを行うため、ゲル中のタンパク質はブロッティング装置を用いてＰＶＤＦメンブレン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に転写し、これを３％スキムミルク含有ＴＢＳ−Ｔ緩衝液内で室温１時間震盪してブロッキング処理を行った。つぎにこのメンブレンを一次抗体溶液（抗ｍｙｃ−ｔａｇ抗体、ＭＢＬを３％スキムミルク含有ＴＢＳ−Ｔ緩衝液で１０００倍希釈したもの）に浸漬させ、室温で１時間震盪した。その後、メンブレンを３％スキムミルク含有ＴＢＳ−Ｔ緩衝液で２回洗浄し、二次抗体溶液（ＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ抗マウスＩｇＧ抗体、Ｚｙｍｅｄを３％スキムミルク含有ＴＢＳ−Ｔ緩衝液で５０００倍希釈したもの）に浸漬させ、室温で１時間震盪した。そして、メンブレンを３％スキムミルク含有ＴＢＳ−Ｔ緩衝液で２回洗浄し、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いて化学発光反応を行い、Ｃｈｅｍｉｄｏｃ ＸＲＳ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で陽性バンドを検出した。
【００５５】
＜実施例２＞
野生型ＮＧＡＬのＣ末端にＮ結合型糖鎖が付加し得る、Ａｓｎ Ｘａａ Ｔｈｒ／Ｓｅｒのアミノ酸モチーフを含む各種ペプチドを連結し、分泌におけるその効果を調べた。その結果、いずれのペプチドを連結した場合でも、野生型にくらべると分泌量の増大が認められた（図７）。野生型ＮＧＡＬの分泌量を１としたとき、ペプチドを連結した分子の分泌量は、ＮＳＴペプチドの連結で１．４倍、ＮＮＳＴペプチド（配列表配列番号３）の連結で２．６倍、ＮＳＴＮＳＴペプチド（配列表配列番号１）の連結で２．４倍、ＮＮＳＴＮＮＳＴペプチド（配列表配列番号７）の連結で３．８倍、ＡＮＳＴＮＳＴＮＳＴペプチド（配列表配列番号２）の連結で６．８倍になった。
【実施例３】
【００５６】
ヒトキモトリプシンＣ（ＣＴＲＣ）の場合
本実施例ではヒトＣＴＲＣをモデルとして、ペプチドの付加がＣＴＲＣの分泌生産量へ及ぼす影響を調べた。ＣＴＲＣには、Ｎ結合型糖鎖付加のコンセンサス配列であるＮＸＳ／Ｔ配列が３カ所に存在するが（Ｎ２５：ＮＬＳ、Ｎ５２：ＮＤＴ、Ｎ２２６：ＮＧＳ）（図８）、Ｎ２５とＮ２２６には通常、糖鎖は結合していない。またＮ５２に結合する糖鎖が分泌に重要な役割を果たしており、糖鎖が結合しないＮ５２Ｓ変異体では分泌が低下することが報告されている（非特許文献８参照）。
【００５７】
まず、ヒト膵臓由来ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を鋳型として、プライマーＮＧ１０６４＋、ＮＧ１０６５−（配列表配列番号５３、５４）とＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ここで増幅したＣＴＲＣの全長ｃＤＮＡをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II ＳＫ＋ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＥｃｏＲＶサイトにクローニングした。これよりＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩで切り出したＤＮＡ断片をｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ ｖｅｒ．Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩサイトに挿入したものを、野生型ＣＴＲＣ（ＷＴ）の発現ベクターとした。
【００５８】
つぎに、ＣＴＲＣの糖鎖付加状況を改善した際の分泌への影響をみるため、Ｎ５２：ＮＤＴのＡｓｎをＳｅｒに交換した変異体（ＣＴＲＣ変異体Ｎ５２Ｓ：ＣＴＲＣ（Ｎ５２Ｓ））を作製した。Ｎ５２：ＮＤＴのＡｓｎをＳｅｒに交換するためにはプライマーＮＧ１０６６＋、ＮＧ１０６７−（配列表配列番号５５、５６）の各プライマーの組み合わせと、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて、上記ＣＴＲＣｃＤＮＡを含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ IIプラスミドを鋳型としてＰＣＲによる変異導入でＮ／Ｓ交換を行った。
【００５９】
また、Ａｓｎ Ｘａａ Ｔｈｒ／Ｓｅｒのアミノ酸モチーフを含むペプチドがＣＴＲＣの分泌に及ぼす影響を調べるため、ＮＳＴＮＳＴ（配列表配列番号１）、ＡＮＳＴＮＳＴＮＳＴ（配列表配列番号２）の各ペプチドつきＣＴＲＣ、およびＡＮＳＴＮＳＴＮＳＴ（配列表配列番号２）ペプチドつきＣＴＲＣ（Ｎ５２Ｓ）の発現ベクターを構築した。ペプチドＮＳＴＮＳＴ（配列表配列番号１）をコードするＤＮＡは、プライマーＮＧ４５３＋、ＮＧ４５４−（配列表配列番号４１、４２）をアニーリングさせて作製した。ペプチドＡＮＳＴＮＳＴＮＳＴ（配列表配列番号２）をコードするＤＮＡは、プライマーＮＧ４９３＋、ＮＧ４９４−（配列表配列番号４５、４６）をアニーリングさせて作製した。
【００６０】
なお、ＮＳＴＮＳＴペプチドおよびＡＮＳＴＮＳＴＮＳＴペプチドをコードするＤＮＡには、ＣＴＲＣへの連結とベクターへの挿入のためにＸｈｏＩ、ＸｂａＩの制限酵素サイトがそれぞれ５’側、３’側に存在するため、実際のペプチドにはＮ末端側にはＬｅｕ Ｇｌｕが、Ｃ末端側にはＳｅｒ Ａｒｇが付加される。これらＤＮＡをＣＴＲＣおよびＣＴＲＣ（Ｎ５２Ｓ）の発現ベクターに組み込み、ペプチドつきＣＴＲＣとペプチドつきＣＴＲＣ（Ｎ５２Ｓ）の発現ベクターとした。
【００６１】
それぞれの発現ベクターはＦｕＧｅｎｅ ６ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いてＨＥＫ２９３細胞に導入した。トランスフェクション後、これらの細胞は３７℃のＣＯ２インキュベーターで一晩培養し、ここで培地交換を行って（３．５ｃｍ ｄｉｓｈ、ＭＥＭ培地＋１０％牛血清２ｍｌをＭＥＭ培地１ｍｌに交換）、さらに一定時間培養を行った（トランスフェクションから４８時間後まで）。培養終了後、培養上清を回収して少量のＮＴＡ Ａｇａｒｏｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）を添加し、４℃で２時間撹拌して培養上清中に分泌された組換え体ＣＴＲＣおよびその変異体をこれに吸着させ回収した。分泌生産量を解析する場合は、このＮＴＡ ＡｇａｒｏｓｅをＰＢＳ緩衝液で洗浄後、ＳＤＳ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒと混合し、煮沸処理後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供した。
【００６２】
分泌生産量を解析する場合は、泳動終了後、ウェスタンブロットを行うため、ゲル中のタンパク質はブロッティング装置を用いてＰＶＤＦメンブレン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に転写し、これを３％スキムミルク含有ＴＢＳ−Ｔ緩衝液内で室温１時間震盪してブロッキング処理を行った。つぎにこのメンブレンを一次抗体溶液（抗ｍｙｃ−ｔａｇ抗体、ＭＢＬを３％スキムミルク含有ＴＢＳ−Ｔ緩衝液で１０００倍希釈したもの）に浸漬させ、室温で１時間震盪した。その後、メンブレンを３％スキムミルク含有ＴＢＳ−Ｔ緩衝液で２回洗浄し、二次抗体溶液（ＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ抗マウスＩｇＧ抗体、Ｚｙｍｅｄを３％スキムミルク含有ＴＢＳ−Ｔ緩衝液で５０００倍希釈したもの）に浸漬させ、室温で１時間震盪した。そして、メンブレンを３％スキムミルク含有ＴＢＳ−Ｔ緩衝液で２回洗浄し、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いて化学発光反応を行い、Ｃｈｅｍｉｄｏｃ ＸＲＳ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で陽性バンドを検出した。
【００６３】
＜実施例３＞
ＣＴＲＣおよびＣＴＲＣ（Ｎ５２Ｓ）のＣ末端にＮ結合型糖鎖が付加し得る、Ａｓｎ Ｘａａ Ｔｈｒ／Ｓｅｒのアミノ酸モチーフを含むＮＳＴＮＳＴ（配列表配列番号１）ペプチド、またはＡＮＳＴＮＳＴＮＳＴペプチド（配列表配列番号２）を連結し、分泌におけるその効果を調べた。その結果、ＣＴＲＣ（Ｎ５２Ｓ）は野生型ＣＴＲＣにくらべて分泌量が低下したが、これにＡＮＳＴＮＳＴＮＳＴペプチド（配列表配列番号２）を連結したところ、野生型より分泌量の増大が認められた（図９）。また、野生型ＣＴＲＣにＮＳＴＮＳＴ（配列表配列番号１）ペプチド、あるいはＡＮＳＴＮＳＴＮＳＴペプチド（配列表配列番号２）を連結した場合でも、分泌量の増大が認められた（図９）。野生型ＣＴＲＣの分泌量を１としたとき、ＣＴＲＣ（Ｎ５２Ｓ）の分泌量は０．５〜０．７、これにＡＮＳＴＮＳＴＮＳＴペプチド（配列表配列番号２）を連結した分子の分泌量は７．４倍になった。また、野生型ＣＴＲＣにＮＳＴＮＳＴ（配列表配列番号１）ペプチドを連結した分子の分泌量は１．６倍、ＡＮＳＴＮＳＴＮＳＴペプチド（配列表配列番号２）を連結した分子の分泌量は１．５倍になった。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明のタンパク質製造方法は、有用タンパク質の分泌生産の増大や、糖鎖付加により機能改変や新機能が付与されたタンパク質の製造、あるいは血中安定性が増大したタンパク質の製造などに利用できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明はタンパク質に新たな性質を付与することを特徴とするペプチドを付加したタンパク質の製造方法に関する。タンパク質に新たな性質を付与するとは、タンパク質の分泌生産性の向上、タンパク質の生理活性等の向上、タンパク質の安定性の向上などを意味する。
【０００２】
詳細には、少なくとも１つのＡｓｎを含むアミノ酸配列を付加した分泌タンパク質であって本来の活性を損なうことなく分泌生産量が増大した分泌タンパク質の製造方法、および下記（１）のアミノ酸配列モチーフを付加した目的のタンパク質であって本来の活性を損なうことなく新たな性質を付与した目的のタンパク質の製造方法、およびＴｈｒまたはＳｅｒを少なくとも１つ有するペプチドにおいて、Ｔｈｒ／ＳｅｒにＯ結合型糖鎖が結合したそのアミノ酸配列を付加した目的のタンパク質であって本来の活性を損なうことなく新たな性質を付与した目的のタンパク質の製造方法に関する。
（１）Ａｓｎ Ｘａａ Ｔｈｒ／Ｓｅｒ
（ただし、（１）でＸａａは任意のアミノ酸を示す。）
【背景技術】
【０００３】
多くのタンパク質には翻訳後修飾として糖鎖付加がなされている。糖鎖付加の様式には２種類あって、タンパク質中のＮ（Ａｓｎ）−Ｘ（Ｐｒｏ以外のアミノ酸）−Ｓ（Ｓｅｒ）／Ｔ（Ｔｈｒ）という配列中のＡｓｎに糖鎖が付加される場合はＮ結合型糖鎖、タンパク質中のＳｅｒ、Ｔｈｒの水酸基を介して糖鎖が付加される場合はＯ結合型糖鎖とよぶ。一般に、Ｎ結合型糖鎖には上記のようなコンセンサス配列があるため、糖鎖付加の予測や制御が容易であるといえる。
【０００４】
糖鎖はタンパク質が適正なｆｏｌｄｉｎｇをとる際に必要であったり、当該タンパク質の分泌促進、機能発現、血中での安定化、分子間相互作用などにも関与していたりする。このような機能性糖鎖をタンパク質に効率よく付加させるために、タンパク質中にあるＮ結合型糖鎖付加のコンセンサス配列を改変したり、これをタンパク質中に人為的に導入して、タンパク質に結合する糖鎖の数を増やすことが検討されてきている（特許文献１、非特許文献１参照）。
【０００５】
例えば、コンセンサス配列ＮＸＳ／Ｔにおいて、Ｘ部分のアミノ酸を置換することによって糖鎖付加効率を改善することが可能である（非特許文献１参照）。しかし、置換するアミノ酸の種類によっては立体構造変化が大きくなり、タンパク質機能に影響を及ぼす恐れがある。また、目的にあった糖鎖付加効率を追求するためには、Ｘ部分に関してもともとのアミノ酸とプロリンを除く１８種類のアミノ酸について検討する必要があり、手間がかかる。
【０００６】
新たにＮ結合型糖鎖付加のコンセンサス配列をタンパク質中に導入する場合でも、置換するアミノ酸の種類や位置によっては本来のタンパク質機能を損ねる恐れがあり、至適な変異導入条件を検討する必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平５−８６０９９号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｓｕｓａｎ Ｈ． Ｓｈａｋｉｎ−Ｅｓｈｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１， ６３６３−６３６６ （１９９６）
【非特許文献２】Ｌｏｒｅｎｚｏ Ｆｒｉｇｅｒｉｏ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ． １３， １１０９−１１２６ （２００１）
【非特許文献３】Ｔｅｔｓｕｒｏ Ｏｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １１５， ３４５−３５０ （１９９４）
【非特許文献４】Ｅｒｎｓｔ Ｂａｕｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． １９５， ６３９−６４４ （１９８１）
【非特許文献５】Ｇｅｒｒｙ Ａ． Ｆ． Ｎｉｃｏｌａｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８， １３５８４−１３５９１ （１９９９）
【非特許文献６】Ａｔｓｕｓｈｉ Ｎｉｓｈｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ３５５， ２４５−２４８ （２００１）
【非特許文献７】Ｌａｋｓｈｍｉ Ｋａｓｔｕｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ３２３， ４１５−４１９ （１９９７）
【非特許文献８】Ｍｅｌｉｎｄａ Ｂｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｊ． ２７８， ４３３８−４３５０ （２０１１）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、目的タンパク質のアミノ酸配列（当該タンパク質遺伝子／ｃＤＮＡの開始コドンから終止コドンまででコードされる配列）を変えることなく、ペプチドまたは糖鎖が付加したペプチドを連結したタンパク質を合成し、分泌生産性、各種機能、安定性などを向上させた目的タンパク質を製造することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、Ｎ結合型糖鎖付加のコンセンサス配列であるＮＸＴ／Ｓ配列（ＸはＰｒｏ以外のアミノ酸）を含むペプチド、および類似のペプチドをタンパク質に連結した場合に、タンパク質にどのような影響があらわれるのかを検討した。その結果、驚くべきことに、糖鎖が付加されたペプチドがタンパク質に連結されたことによって、タンパク質の分泌生産量が著しく増大することを見出した。さらに驚くべきことに、糖鎖が付加しないペプチドでも同様な効果を見出し、特に、アスパラギンが配列に含まれることが重要であることを突き止め、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は下記＜１＞〜＜４＞のタンパク質の製造方法である。
＜１＞ 分泌タンパク質をコードするＤＮＡに、少なくとも１つのＡｓｎを含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡを連結してなるＤＮＡを含む組換えベクターを含む形質転換体を培養することを特徴とする、そのアミノ酸配列を付加した分泌タンパク質であって本来の活性を損なうことなく分泌生産量が増大した分泌タンパク質の製造方法。
【００１２】
＜２＞ 目的のタンパク質をコードするＤＮＡに、下記（１）のアミノ酸配列モチーフを少なくとも１つ有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡを連結してなるＤＮＡを含む組換えベクターを含む形質転換体を培養することを特徴とする、そのアミノ酸配列を付加した目的のタンパク質であって本来の活性を損なうことなく新たな性質を付与した目的のタンパク質の製造方法。
（１）Ａｓｎ Ｘａａ Ｔｈｒ／Ｓｅｒ
（ただし、（１）でＸａａは任意のアミノ酸を示す。）
【００１３】
＜３＞ 目的のタンパク質をコードするＤＮＡに、ＴｈｒまたはＳｅｒを少なくとも１つ有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡを連結してなるＤＮＡを含む組換えベクターを含む形質転換体を培養することを特徴とする、ＴｈｒまたはＳｅｒにＯ結合型糖鎖が結合したそのアミノ酸配列を付加した目的のタンパク質であって本来の活性を損なうことなく新たな性質を付与した目的のタンパク質の製造方法。
【００１４】
＜４＞ そのアミノ酸配列がプロテアーゼ切断配列を有するものであり、製造したタンパク質にそのプロテアーゼを反応させて、製造したタンパク質からそのアミノ酸配列を切断することを特徴とする＜１＞から＜３＞に記載のタンパク質の製造方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明者らは、タンパク質にＮ結合型糖鎖付加のコンセンサス配列であるＮＸＴ／Ｓ配列（ＸはＰｒｏ以外のアミノ酸）を含むペプチドやそれに類似のペプチドを連結した場合、当該タンパク質の分泌生産量が増大することを見出した。この原因としては、ペプチド付加の単独効果、あるいは糖鎖が付加されたペプチドがタンパク質に連結された効果が考えられる。従来、タンパク質に機能性糖鎖を効率よく付加させるためには、タンパク質の糖鎖付加部位周辺配列を改変したり、新たにＮ結合型糖鎖付加のコンセンサス配列を導入したりするなど、タンパク質への変異導入が必要であった。そのため、野生型タンパク質の諸性質を損ねる恐れがあった。本発明では、タンパク質のアミノ酸配列（当該タンパク質遺伝子／ｃＤＮＡの開始コドンから終止コドンまででコードされる配列）を変えることなくペプチドや糖鎖を付加することが可能で、必要に応じて、後から付加したペプチドおよび糖鎖を除去することもできることから、より野生型に近いタンパク質を効率よく調製できる。
【００１６】
糖鎖のないペプチド付加の効果として、ある種のペプチドをタンパク質に連結することにより、目的タンパク質の諸性質が変化する場合があることが知られている。例えば小胞体局在シグナルであるＫＤＥＬというアミノ酸配列（この配列には糖鎖は付加されない）をタンパク質のＣ末端に連結すると、当該タンパク質が小胞体に局在するようになる（非特許文献２参照）。本発明では、糖鎖が付加されないペプチドをタンパク質に連結させたときにおいても、場合によっては分泌生産性の向上が認められることを見出した。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】実施例１に用いたヒトＩＬ−６組換え体の構造の特徴を示す模式図。
【図２】ＩＬ−６に存在する各Ｎ結合型糖鎖付加のコンセンサス配列を改変した変異体の分泌状況を示すブロット。
【図３】ＩＬ−６（ＷＴ）、ＩＬ−６（ＡＡ）の分泌におけるペプチド付加の効果を示すブロット。
【図４】ＩＬ−６（ＡＡ）に、糖鎖が結合しないペプチドを付加した場合の効果。
【図５】Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ切断配列入りペプチドを付加したＩＬ−６に対してＰＮＧａｓｅ Ｆ処理、Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ処理を施した際の状況を示すブロット。矢印が示すバンドはＮ型糖鎖の結合したペプチドが切断除去された分子を示す。
【図６】実施例２に用いたヒトＮＧＡＬの構造の特徴を示す模式図。
【図７】ＮＧＡＬの分泌におけるペプチド付加の効果を示すズロット。
【図８】実施例３に用いたヒトキモトリプシンＣの構造の特徴を示す模式図。
【図９】キモトリプシンＣ、ＣＴＲＣ（Ｎ５２Ｓ）の分泌におけるペプチド付加の効果を示すブロット。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明のタンパク質製造方法は、下記＜１＞〜＜４＞である。
＜１＞ 分泌タンパク質をコードするＤＮＡに、少なくとも１つのＡｓｎを含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡを連結してなるＤＮＡを含む組換えベクターを含む形質転換体を培養することを特徴とする、そのアミノ酸配列を付加した分泌タンパク質であって本来の活性を損なうことなく分泌生産量が増大した分泌タンパク質の製造方法。
【００１９】
＜２＞ 目的のタンパク質をコードするＤＮＡに、下記（１）のアミノ酸配列モチーフを少なくとも１つ有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡを連結してなるＤＮＡを含む組換えベクターを含む形質転換体を培養することを特徴とする、そのアミノ酸配列を付加した目的のタンパク質であって本来の活性を損なうことなく新たな性質を付与した目的のタンパク質の製造方法。
（１）Ａｓｎ Ｘａａ Ｔｈｒ／Ｓｅｒ
（ただし、（１）でＸａａは任意のアミノ酸を示す。）
【００２０】
＜３＞ 目的のタンパク質をコードするＤＮＡに、ＴｈｒまたはＳｅｒを少なくとも１つ有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡを連結してなるＤＮＡを含む組換えベクターを含む形質転換体を培養することを特徴とする、ＴｈｒまたはＳｅｒにＯ結合型糖鎖が結合したそのアミノ酸配列を付加した目的のタンパク質であって本来の活性を損なうことなく新たな性質を付与した目的のタンパク質の製造方法。
【００２１】
＜４＞ そのアミノ酸配列がプロテアーゼ切断配列を有するものであり、製造したタンパク質にそのプロテアーゼを反応させて、製造したタンパク質からそのアミノ酸配列を切断することを特徴とする＜１＞から＜３＞に記載のタンパク質の製造方法。
【００２２】
本発明に用いるペプチドとしては、上記＜１＞〜＜４＞のアミノ酸配列モチーフを有するペプチドであれば特に限定はないが、例えばＮＳＴ、ＮＳＴＮＳＴ、ＡＮＳＴＮＳＴＮＳＴ、ＮＳＡ、ＮＮＳＴ、ＮＳＡＮＳＡ、ＮＱＳＴ、ＱＮＳＴ、ＮＮＳＴＮＮＳＴ、ＮＮＳＡ、ＡＮＳＴ、ＮＡＳＴ、ＮＮＡＴ、ＰＮＳＴ、ＷＮＳＴ、ＮＮＴＴ、ＮＡＴＳ、ＮＳＴＮＳＡ、ＮＳＡＮＳＴといったペプチドが挙げられる。より好ましくは、糖鎖が付加されたＮＳＴ、ＮＳＴＮＳＴ、ＡＮＳＴＮＳＴＮＳＴ、ＮＮＳＴ、ＮＱＳＴ、ＱＮＳＴ、ＮＮＳＴＮＮＳＴ、ＮＮＳＡ、ＡＮＳＴ、ＮＡＳＴ、ＮＮＡＴ、ＰＮＳＴ、ＷＮＳＴ、ＮＮＴＴ、ＮＡＴＳ、ＮＳＴＮＳＡ、ＮＳＡＮＳＴである。また、プロテアーゼ切断部位を有するペプチドとしては、ＩＥＧＲＮＳＴ、ＩＥＧＲＮＳＴＮＳＴ、ＩＥＧＲＩＥＧＲＮＳＴＮＳＴ、ＩＥＧＲＩＥＧＲＮＳＡＮＳＡ、ＩＥＧＲＩＥＧＲＡＡＡＮＳＴＮＳＴ（以上、 Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ切断部位入りペプチド）、ＤＤＤＤＫＮＳＴ、ＤＤＤＤＫＮＳＴＮＳＴ、ＤＤＤＤＫＤＤＤＤＫＮＳＴＮＳＴ（以上、エンテロキナーゼ切断部位入りペプチド）、ＬＥＶＬＦＱＧＰＮＳＴＮＳＴ（ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅａｓｅ切断部位入りペプチド）などである。（配列表配列番号１〜２６）
【００２３】
さらに目的タンパク質とペプチドの間には、スペーサーとしてのアミノ酸や制限酵素サイトによってコードされるアミノ酸などが連結していてもよい。また、連結したペプチドの後続には検出のためのタグが結合してもよい。
【００２４】
Ｎ結合型糖鎖の結合の確認は、特に限定しないが、糖鎖除去反応前後の分子量変化を観察することにより行うことができる。糖鎖除去反応に用いる酵素として、例えばペプチド：Ｎ−グリコシダーゼＦ（Ｐｅｐｔｉｄｅ：Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ Ｆ、ＰＮＧａｓｅ Ｆ）が好ましい。
【００２５】
本発明においてペプチドをコードするＤＮＡは、上記＜１＞〜＜４＞のアミノ酸配列モチーフを有するペプチドをコードする塩基配列のＤＮＡ、およびその相補鎖を、アニールさせることにより合成し、Ｔ４リガーゼを用いて各種組換えベクターに挿入するが、ペプチドをコードするＤＮＡの組換えベクターへの挿入法はこの方法に限定されるものではない。また、ベクター挿入時に制限酵素サイトを利用する場合は、制限酵素サイトによってコードされるアミノ酸もペプチドに連結される。
【００２６】
本発明における組換えベクターは、特にその種類は限定されず、例えば、自立的に複製するベクター（例えばプラスミドやファージベクター）でもよいし、あるいは、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。
【００２７】
好ましくは、本発明で用いるベクターは発現ベクターである。発現ベクターにおいて本発明のＤＮＡは、タンパク質をコードするＤＮＡ、およびプロモーター等の転写に必要な要素が機能的に連結されている。プロモーターは宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。また、これらの発現ベクターはアンピシリン耐性遺伝子などの適当な選択マーカー遺伝子を含んでいてもよい。発現ベクターの例としては、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II ＳＫ＋ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ ｖｅｒ．Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などが挙げられるが、本発明に用いる発現ベクターはこれらに限定されるものではない。
【００２８】
本発明で用いるＤＮＡは、遺伝子導入試薬、例えばリン酸カルシウムやリポソームを利用するもの、あるいはＦｕＧｅｎｅ ６ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（従来はＲｏｃｈｅ、現在はＰｒｏｍｅｇａ）などの非リポソーム系トランスフェクション試薬などを用いて、あるいはエレクトロポレーション法やマイクロインジェクション法などにより、宿主細胞へ導入する。
【００２９】
本発明における形質転換体として、細胞は糖鎖付加能を有する細胞、例えば、原核生物ではカンピロバクターやオリゴサッカリルトランスフェラーゼ遺伝子を導入された大腸菌など、また真核生物では、酵母、糸状菌、植物細胞、昆虫細胞、哺乳類由来培養細胞などが挙げられるが、遺伝子導入のしやすさ、タンパク質生産量の高さ、哺乳類型糖鎖が付加できる点などで、哺乳類由来培養細胞のうち、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ−７細胞などを用いるのが特に好ましい。
【００３０】
本発明の形質転換体を用いて本発明のタンパク質を製造する方法として、形質転換体の培養、タンパク質の取得、精製などの工程が挙げられる。形質転換体の培養は、３７℃のＣＯ２インキュベーター内で、遺伝子導入後一定時間（５〜１５時間）までは１０％牛血清含有培地にて行い、その後は目的タンパク質の精製を容易にするために無血清培地に交換して継続培養する（＋９〜４８時間）。目的タンパク質の取得は、当該タンパク質が分泌タンパク質で、培地中に分泌されているようであれば、培地を回収してタンパク質源とし、これをアフィニティークロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィーに供して精製する。目的タンパク質が培地中に分泌されず、細胞内に蓄積している場合には、細胞を回収し、ここに細胞溶解剤を加えるとともに超音波破砕により細胞を破砕して目的タンパク質を細胞溶解剤中に放出させ、これを適当な緩衝液などで希釈するなどしたものをタンパク質源として、上記と同様にして各種クロマトグラフィーにより精製する。
【００３１】
本発明のタンパク質を製造する方法は、細胞を用いる方法に限定されるものではなく、無細胞タンパク質合成系によって製造することもできる。無細胞タンパク質合成系としては、例えば、コムギ胚芽、大腸菌、ウサギ網状赤血球、昆虫細胞などから調製したものが挙げられる。目的タンパク質をコードするＤＮＡを逆転写が可能なベクターに組み込み、これより逆転写反応によって合成したｍＲＮＡを適当な無細胞タンパク質合成系に加えて目的タンパク質を合成する。そして、その反応液より目的タンパク質を上記と同様にして精製する。
【００３２】
本発明のタンパク質から付加したペプチドを除去するには、Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ、エンテロキナーゼ、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅａｓｅなどのプロテアーゼを利用するが、これらのプロテアーゼに限定されるものではない。またプロテアーゼ処理後において、配列によっては付加したペプチドの一部がタンパク質に連結されたままになる場合もある。
【実施例】
【００３３】
以下に記載する実施例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこの実施例によって限定されるものではない。
【実施例１】
【００３４】
ヒトインターロイキン−６（ＩＬ−６）の場合
本実施例ではヒト胸腺由来のＩＬ−６をモデルとして、ペプチドの付加がＩＬ−６の分泌生産量へ及ぼす影響を調べた。ＩＬ−６には、Ｎ結合型糖鎖付加のコンセンサス配列であるＮＸＳ／Ｔ配列が２カ所に存在するが（Ｎ７３：ＮＫＳ、Ｎ１７２：ＮＡＳ）（図１）、Ｎ１７２には通常、糖鎖は結合していない。またＯ結合型糖鎖がＴ１６６に結合することが報告されている（非特許文献３参照）。
【００３５】
まず、ヒト胸腺由来ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を鋳型として、プライマーＮＧ５２６＋、ＮＧ５２７−（配列表配列番号２７、２８）とＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ここで増幅したＩＬ−６の全長ｃＤＮＡをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II ＳＫ＋ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＥｃｏＲＶサイトにクローニングした。これよりＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩで切り出したＤＮＡ断片をｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ ｖｅｒ．Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩサイトに挿入したものを、野生型ＩＬ−６（ＷＴ）の発現ベクターとした。
【００３６】
つぎに、ＩＬ−６の糖鎖付加状況を改善した際の分泌への影響をみるため、Ｎ７３：ＮＫＳのＳｅｒをＴｈｒに交換した変異体（ＩＬ−６変異体Ｓ７５Ｔ）、Ｎ１７２：ＮＡＳのＳｅｒをＴｈｒに交換した変異体（ＩＬ−６変異体Ｓ１７４Ｔ）、およびそれら両方をＴｈｒに交換した変異体（ＩＬ−６変異体Ｓ７５Ｔ／Ｓ１７４Ｔ）を作製した。Ｎ７３：ＮＫＳのＳｅｒをＴｈｒに交換するためにはプライマーＮＧ５２８＋、ＮＧ５２９−（配列表配列番号２９、３０）の各プライマーの組み合わせと、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて、上記ＩＬ−６ｃＤＮＡを含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ IIプラスミドを鋳型としてＰＣＲによる変異導入でＳ／Ｔ交換を行った。また、Ｎ１７２：ＮＡＳのＳｅｒをＴｈｒに交換するためにはプライマーＮＧ５３０＋、ＮＧ５３１−（配列表配列番号３１、３２）の各プライマーの組み合わせを用いて、上記と同様にしてＰＣＲによる変異導入でＳ／Ｔ交換を行った。
【００３７】
さらに、両コンセンサス配列のＳ部分をＡｌａに置換して糖鎖が付加されないようにした変異体（ＡＡ）は、プライマーＮＧ５４４＋、ＮＧ５４５−（配列表配列番号３３、３４、Ｎ７３：ＮＫＡ用）、プライマーＮＧ５４６＋、ＮＧ５４７−（配列表配列番号３５、３６、Ｎ１７２：ＮＡＡ）の各プライマーの組み合わせを用いて、上記と同様にＰＣＲによる変異導入を順次行って作製した。いずれの変異導入断片もＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩで切り出した後、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ ｖｅｒ．ＡのＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩサイトに挿入して発現ベクターとした。
【００３８】
また、Ａｓｎ Ｘａａ Ｔｈｒ／Ｓｅｒのアミノ酸モチーフを含むペプチドがＩＬ−６の分泌に及ぼす影響を調べるため、各種ペプチドつきＩＬ−６の発現ベクターを構築した。ペプチドＮＳＴをコードするＤＮＡは、プライマーＮＧ４０４＋、ＮＧ４０５−（配列表配列番号３７、３８）をアニーリングさせて作製した。ペプチドＮＮＳＴ（配列表配列番号３）をコードするＤＮＡは、プライマーＮＧ４５１＋、ＮＧ４５２−（配列表配列番号３９、４０）をアニーリングさせて作製した。ペプチドＮＳＴＮＳＴ（配列表配列番号１）をコードするＤＮＡは、プライマーＮＧ４５３＋、ＮＧ４５４−（配列表配列番号４１、４２）をアニーリングさせて作製した。ペプチドＮＮＳＴＮＮＳＴ（配列表配列番号７）をコードするＤＮＡは、プライマーＮＧ４６８＋、ＮＧ４６９−（配列表配列番号４３、４４）をアニーリングさせて作製した。ペプチドＡＮＳＴＮＳＴＮＳＴ（配列表配列番号２）をコードするＤＮＡは、プライマーＮＧ４９３＋、ＮＧ４９４−（配列表配列番号４５、４６）をアニーリングさせて作製した。
【００３９】
また、糖鎖がつかないペプチドＮＳＡＮＳＡ（配列表配列番号４）をコードするＤＮＡは、プライマーＮＧ４５５＋、ＮＧ４５６−（配列表配列番号４７、４８）をアニーリングさせて作製した。Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ切断配列入りペプチドＩＥＧＲＩＥＧＲＮＳＴＮＳＴ（配列表配列番号２０）をコードするＤＮＡは、プライマーＮＧ９４８＋、ＮＧ９４９−（配列表配列番号４９、５０）をアニーリングさせて作製した。なお、いずれのペプチドをコードするＤＮＡにも、ＩＬ−６への連結とベクターへの挿入のためにＸｈｏＩ、ＸｂａＩの制限酵素サイトがそれぞれ５’側、３’側に存在するため、実際のペプチドにはＮ末端側にはＬｅｕ Ｇｌｕが、Ｃ末端側にはＳｅｒ Ａｒｇが付加される。これらのＤＮＡを野生型ＩＬ−６の発現ベクター、あるいはＮ結合型糖鎖が付加されないようにした変異体ＩＬ−６（ＡＡ）の発現ベクターに組み込み、各ペプチドつきＩＬ−６の発現ベクターとした。
【００４０】
それぞれの発現ベクターはＦｕＧｅｎｅ ６ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いてＨＥＫ２９３細胞、あるいはＣＯＳ−７細胞に導入した。トランスフェクション後、これらの細胞は３７℃のＣＯ２インキュベーターで一晩培養し、ここで培地交換を行って（３．５ｃｍ ｄｉｓｈ、ＭＥＭ培地＋１０％牛血清２ｍｌをＭＥＭ培地１ｍｌに交換）、さらに一定時間培養を行った（トランスフェクションから４８時間後まで）。培養終了後、培養上清を回収して少量のＮＴＡ Ａｇａｒｏｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）を添加し、４℃で２時間撹拌して培養上清中に分泌された組換え体ＩＬ−６をこれに吸着させ回収した。分泌生産量を解析する場合は、このＮＴＡ ＡｇａｒｏｓｅをＰＢＳ緩衝液で洗浄後、ＳＤＳ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒと混合し、煮沸処理後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供した。
【００４１】
ＩＬ−６の細胞増殖活性を調べる場合は、このＮＴＡ ＡｇａｒｏｓｅからＩＬ−６を０．２Ｍイミダゾールにて溶出し、これをアミコンウルトラ−４（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にて脱塩濃縮した。この試料に対して、必要に応じてＦａｃｔｏｒ Ｘａなどの特異的プロテアーゼによる処理を施して連結したペプチドを除去し、さらにＮＴＡ Ａｇａｒｏｓｅカラム（スルー画分を採取）、抗ＩＬ−６抗体カラムの組み合わせによりペプチドを除去したＩＬ−６の再精製を行った。このようにして調製したＩＬ−６を用いてマウスハイブリドーマ細胞株７ＴＤ１細胞を刺激し、その増殖への影響を細胞増殖キットII（ＸＴＴアッセイ、Ｒｏｃｈｅ）により測定した。
【００４２】
分泌生産量を解析する場合は、泳動終了後、ウェスタンブロットを行うため、ゲル中のタンパク質はブロッティング装置を用いてＰＶＤＦメンブレン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に転写し、これを３％スキムミルク含有ＴＢＳ−Ｔ緩衝液内で室温１時間震盪してブロッキング処理を行った。つぎにこのメンブレンを一次抗体溶液（抗ｍｙｃ−ｔａｇ抗体、ＭＢＬを３％スキムミルク含有ＴＢＳ−Ｔ緩衝液で１０００倍希釈したもの）に浸漬させ、室温で１時間震盪した。その後、メンブレンを３％スキムミルク含有ＴＢＳ−Ｔ緩衝液で２回洗浄し、二次抗体溶液（ＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ抗マウスＩｇＧ抗体、Ｚｙｍｅｄを３％スキムミルク含有ＴＢＳ−Ｔ緩衝液で５０００倍希釈したもの）に浸漬させ、室温で１時間震盪した。そして、メンブレンを３％スキムミルク含有ＴＢＳ−Ｔ緩衝液で２回洗浄し、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いて化学発光反応を行い、Ｃｈｅｍｉｄｏｃ ＸＲＳ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で陽性バンドを検出した。
＜比較例１＞
【００４３】
まず、ＩＬ−６のＮ結合型糖鎖に何らかの機能があるのかを検討するため、野生型ＩＬ−６、Ｓ７５Ｔ変異体、Ｓ１７４Ｔ変異体、Ｓ７５Ｔ／Ｓ１７４Ｔ変異体をＨＥＫ２９３細胞で発現させてみた。これらの変異体はＮ結合型糖鎖付加のコンセンサス配列中にあるＳｅｒをＴｈｒに変えることにより、各糖鎖付加部位の糖鎖付加効率を増大させることを期待したものである（非特許文献４〜７参照）。その結果、野生型ＩＬ−６の分泌量を１としたとき、各変異体分子の分泌量は、Ｓ７５Ｔ変異体で２．４倍、Ｓ１７４Ｔ変異体で１．４倍、Ｓ７５Ｔ／Ｓ１７４Ｔ変異体で２．５倍となった(図２)。Ｓ７５Ｔ変異体およびＳ７５Ｔ／Ｓ１７４Ｔ変異体では糖鎖付加型のＩＬ−６の割合も増加していた。この結果より、ＩＬ−６の分泌には糖鎖が重要な役割を果たしていることが示唆された。
【００４４】
＜実施例１．１＞
そこで、野生型ＩＬ−６のＣ末端にＮ結合型糖鎖が付加し得る、Ａｓｎ Ｘａａ Ｔｈｒ／Ｓｅｒのアミノ酸モチーフを含む各種ペプチドを連結し、分泌におけるその効果を調べた。その結果、いずれのペプチドを連結した場合でも、野生型にくらべると分泌量の増大が認められた（図３Ａ）。野生型ＩＬ−６の分泌量を１としたとき、ペプチドを連結した分子の分泌量は、ＮＳＴペプチドの連結で１．５倍、ＮＮＳＴペプチド（配列表配列番号３）の連結で１．９倍、ＮＳＴＮＳＴペプチド（配列表配列番号１）の連結で７．１倍、ＮＮＳＴＮＮＳＴペプチド（配列表配列番号７）の連結で５．０倍、ＡＮＳＴＮＳＴＮＳＴペプチド（配列表配列番号２）の連結で５．６倍になった。ＡＮＳＴＮＳＴＮＳＴペプチドを連結した場合では、Ｎ結合型糖鎖付加型のＩＬ−６が顕著に増加したが、他のペプチドを連結した場合も含めて糖鎖が付加していないＩＬ−６の分泌も増加している。このペプチドを連結したＩＬ−６全体の分泌量の増大効果は、比較例１の変異体による糖鎖付加率増加による効果と同等かそれを上回った。
【００４５】
Ｎ７３、Ｎ１７２に糖鎖がつかなくした変異体ＩＬ−６（ＡＡ）にＡＮＳＴＮＳＴＮＳＴペプチドを連結した分子をＨＥＫ２９３細胞に発現させたとき、分泌されてきた分子に対してＰＮＧａｓｅ Ｆ処理を施したところ、処理前後で分子量変化が認められたことから、挿入したペプチドに実際にＮ結合型糖鎖が結合していたことが示された（図３Ｂ）。
【００４６】
いずれのペプチドを連結した場合でも、Ｎ結合型糖鎖非付加型ＩＬ−６の分泌量も増大しているが、これはペプチドへの糖鎖付加の有無にかかわらず、ペプチドを連結したこと自体の単独効果で分泌が促進される可能性、あるいはＮ結合型糖鎖付加型分子の存在がＮ結合型糖鎖非付加型分子の分泌を促進している可能性が考えられる。実際、驚くべきことに、糖鎖が結合しないペプチドＮＳＡＮＳＡ（配列表配列番号４）をＩＬ−６（ＡＡ）に連結した場合でも、ＩＬ−６（ＡＡ）や野生型ＩＬ−６にくらべて分泌量が１．５倍に増加することが判明した（図４）。
【００４７】
＜実施例１．２＞
ＩＬ−６の場合、各種ペプチドの連結で分泌量を増大させることができたが、分泌してきたタンパク質の挿入ペプチド部分に糖鎖がついたままだと、タンパク質の機能発現を阻害する場合も想定される。また、連結したペプチドの存在自体が同様の問題を引き起こす可能性もある。そこで、Ｎ結合型糖鎖が付加し得る、Ａｓｎ Ｘａａ Ｔｈｒ／Ｓｅｒのアミノ酸モチーフを含むペプチドを連結して分泌させたタンパク質から、連結したペプチド部分を除去することを検討した。ＮＳＴＮＳＴペプチドの前部に特異的プロテアーゼＦａｃｔｏｒ Ｘａの切断認識配列ＩＥＧＲを２つ挿入したペプチドＩＥＧＲＩＥＧＲＮＳＴＮＳＴ（配列表配列番号２０）を作製し、これをＩＬ−６に連結してＨＥＫ２９３細胞に分泌生産させた。このペプチド付きＩＬ−６を回収し、Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ処理を施したところ、ペプチド部分以降（ｍｙｃタグを含む）が切断除去されたＩＬ−６が検出された（図５矢印）。従って、連結するペプチドの配列を工夫すれば、後からこれを除去して、野生型のアミノ酸配列を含む目的タンパク質を得ることが可能であることが示された。
【００４８】
なお、本発明により製造したＩＬ−６から連結したペプチドを特異的プロテアーゼ処理により除去したＩＬ−６は、野生型ＩＬ−６と同等の細胞増殖活性を保持していた。
【実施例２】
【００４９】
ヒトＮｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｌｉｐｏｃａｌｉｎ（ＮＧＡＬ）の場合
本実施例ではヒトＮＧＡＬをモデルとして、ペプチドの付加がＮＧＡＬの分泌生産量へ及ぼす影響を調べた。ＮＧＡＬには、Ｎ結合型糖鎖付加のコンセンサス配列であるＮＸＳ／Ｔ配列が１カ所存在する（Ｎ８５：ＮＶＴ）（図６）。
【００５０】
まず、ヒト膵がん細胞ＫＬＭ−１のｔｏｔａｌ ＲＮＡより調製したｃＤＮＡを鋳型として、プライマーＮＧ２８＋、ＮＧ２９−（配列表配列番号５１、５２）とＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ここで増幅したＮＧＡＬの全長ｃＤＮＡをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II ＳＫ＋ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＥｃｏＲＶサイトにクローニングした。これよりＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩで切り出したＤＮＡ断片をｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ ｖｅｒ．Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩサイトに挿入したものを、野生型ＮＧＡＬ（ＷＴ）の発現ベクターとした。
【００５１】
またＡｓｎ Ｘａａ Ｔｈｒ／Ｓｅｒのアミノ酸モチーフを含むペプチドがＮＧＡＬの分泌に及ぼす影響を調べるため、各種ペプチドつきＮＧＡＬの発現ベクターを構築した。ペプチドＮＳＴをコードするＤＮＡは、プライマーＮＧ４０４＋、ＮＧ４０５−（配列表配列番号３７、３８）をアニーリングさせて作製した。ペプチドＮＮＳＴ（配列表配列番号３）をコードするＤＮＡは、プライマーＮＧ４５１＋、ＮＧ４５２−（配列表配列番号３９、４０）をアニーリングさせて作製した。ペプチドＮＳＴＮＳＴ（配列表配列番号１）をコードするＤＮＡは、プライマーＮＧ４５３＋、ＮＧ４５４−（配列表配列番号４１、４２）をアニーリングさせて作製した。ペプチドＮＮＳＴＮＮＳＴ（配列表配列番号７）をコードするＤＮＡは、プライマーＮＧ４６８＋、ＮＧ４６９−（配列表配列番号４３、４４）をアニーリングさせて作製した。ペプチドＡＮＳＴＮＳＴＮＳＴ（配列表配列番号２）をコードするＤＮＡは、プライマーＮＧ４９３＋、ＮＧ４９４−（配列表配列番号４５、４６）をアニーリングさせて作製した。
【００５２】
なお、いずれのペプチドをコードするＤＮＡにも、ＮＧＡＬへの連結とベクターへの挿入のためにＸｈｏＩ、ＸｂａＩの制限酵素サイトがそれぞれ５’側、３’側に存在するため、実際のペプチドにはＮ末端側にはＬｅｕ Ｇｌｕが、Ｃ末端側にはＳｅｒ Ａｒｇが付加される。これらのＤＮＡを野生型ＮＧＡＬの発現ベクターに組み込み、各ペプチドつきＮＧＡＬの発現ベクターとした。
【００５３】
それぞれの発現ベクターはＦｕＧｅｎｅ ６ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いてＨＥＫ２９３細胞に導入した。トランスフェクション後、これらの細胞は３７℃のＣＯ２インキュベーターで一晩培養し、ここで培地交換を行って（３．５ｃｍ ｄｉｓｈ、ＭＥＭ培地＋１０％牛血清２ｍｌをＭＥＭ培地１ｍｌに交換）、さらに一定時間培養を行った（トランスフェクションから４８時間後まで）。培養終了後、培養上清を回収して少量のＮＴＡ Ａｇａｒｏｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）を添加し、４℃で２時間撹拌して培養上清中に分泌された組換え体ＮＧＡＬをこれに吸着させ回収した。分泌生産量を解析する場合は、このＮＴＡ ＡｇａｒｏｓｅをＰＢＳ緩衝液で洗浄後、ＳＤＳ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒと混合し、煮沸処理後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供した。
【００５４】
分泌生産量を解析する場合は、泳動終了後、ウェスタンブロットを行うため、ゲル中のタンパク質はブロッティング装置を用いてＰＶＤＦメンブレン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に転写し、これを３％スキムミルク含有ＴＢＳ−Ｔ緩衝液内で室温１時間震盪してブロッキング処理を行った。つぎにこのメンブレンを一次抗体溶液（抗ｍｙｃ−ｔａｇ抗体、ＭＢＬを３％スキムミルク含有ＴＢＳ−Ｔ緩衝液で１０００倍希釈したもの）に浸漬させ、室温で１時間震盪した。その後、メンブレンを３％スキムミルク含有ＴＢＳ−Ｔ緩衝液で２回洗浄し、二次抗体溶液（ＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ抗マウスＩｇＧ抗体、Ｚｙｍｅｄを３％スキムミルク含有ＴＢＳ−Ｔ緩衝液で５０００倍希釈したもの）に浸漬させ、室温で１時間震盪した。そして、メンブレンを３％スキムミルク含有ＴＢＳ−Ｔ緩衝液で２回洗浄し、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いて化学発光反応を行い、Ｃｈｅｍｉｄｏｃ ＸＲＳ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で陽性バンドを検出した。
【００５５】
＜実施例２＞
野生型ＮＧＡＬのＣ末端にＮ結合型糖鎖が付加し得る、Ａｓｎ Ｘａａ Ｔｈｒ／Ｓｅｒのアミノ酸モチーフを含む各種ペプチドを連結し、分泌におけるその効果を調べた。その結果、いずれのペプチドを連結した場合でも、野生型にくらべると分泌量の増大が認められた（図７）。野生型ＮＧＡＬの分泌量を１としたとき、ペプチドを連結した分子の分泌量は、ＮＳＴペプチドの連結で１．４倍、ＮＮＳＴペプチド（配列表配列番号３）の連結で２．６倍、ＮＳＴＮＳＴペプチド（配列表配列番号１）の連結で２．４倍、ＮＮＳＴＮＮＳＴペプチド（配列表配列番号７）の連結で３．８倍、ＡＮＳＴＮＳＴＮＳＴペプチド（配列表配列番号２）の連結で６．８倍になった。
【実施例３】
【００５６】
ヒトキモトリプシンＣ（ＣＴＲＣ）の場合
本実施例ではヒトＣＴＲＣをモデルとして、ペプチドの付加がＣＴＲＣの分泌生産量へ及ぼす影響を調べた。ＣＴＲＣには、Ｎ結合型糖鎖付加のコンセンサス配列であるＮＸＳ／Ｔ配列が３カ所に存在するが（Ｎ２５：ＮＬＳ、Ｎ５２：ＮＤＴ、Ｎ２２６：ＮＧＳ）（図８）、Ｎ２５とＮ２２６には通常、糖鎖は結合していない。またＮ５２に結合する糖鎖が分泌に重要な役割を果たしており、糖鎖が結合しないＮ５２Ｓ変異体では分泌が低下することが報告されている（非特許文献８参照）。
【００５７】
まず、ヒト膵臓由来ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を鋳型として、プライマーＮＧ１０６４＋、ＮＧ１０６５−（配列表配列番号５３、５４）とＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ここで増幅したＣＴＲＣの全長ｃＤＮＡをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II ＳＫ＋ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＥｃｏＲＶサイトにクローニングした。これよりＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩで切り出したＤＮＡ断片をｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ ｖｅｒ．Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩサイトに挿入したものを、野生型ＣＴＲＣ（ＷＴ）の発現ベクターとした。
【００５８】
つぎに、ＣＴＲＣの糖鎖付加状況を改善した際の分泌への影響をみるため、Ｎ５２：ＮＤＴのＡｓｎをＳｅｒに交換した変異体（ＣＴＲＣ変異体Ｎ５２Ｓ：ＣＴＲＣ（Ｎ５２Ｓ））を作製した。Ｎ５２：ＮＤＴのＡｓｎをＳｅｒに交換するためにはプライマーＮＧ１０６６＋、ＮＧ１０６７−（配列表配列番号５５、５６）の各プライマーの組み合わせと、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて、上記ＣＴＲＣｃＤＮＡを含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ IIプラスミドを鋳型としてＰＣＲによる変異導入でＮ／Ｓ交換を行った。
【００５９】
また、Ａｓｎ Ｘａａ Ｔｈｒ／Ｓｅｒのアミノ酸モチーフを含むペプチドがＣＴＲＣの分泌に及ぼす影響を調べるため、ＮＳＴＮＳＴ（配列表配列番号１）、ＡＮＳＴＮＳＴＮＳＴ（配列表配列番号２）の各ペプチドつきＣＴＲＣ、およびＡＮＳＴＮＳＴＮＳＴ（配列表配列番号２）ペプチドつきＣＴＲＣ（Ｎ５２Ｓ）の発現ベクターを構築した。ペプチドＮＳＴＮＳＴ（配列表配列番号１）をコードするＤＮＡは、プライマーＮＧ４５３＋、ＮＧ４５４−（配列表配列番号４１、４２）をアニーリングさせて作製した。ペプチドＡＮＳＴＮＳＴＮＳＴ（配列表配列番号２）をコードするＤＮＡは、プライマーＮＧ４９３＋、ＮＧ４９４−（配列表配列番号４５、４６）をアニーリングさせて作製した。
【００６０】
なお、ＮＳＴＮＳＴペプチドおよびＡＮＳＴＮＳＴＮＳＴペプチドをコードするＤＮＡには、ＣＴＲＣへの連結とベクターへの挿入のためにＸｈｏＩ、ＸｂａＩの制限酵素サイトがそれぞれ５’側、３’側に存在するため、実際のペプチドにはＮ末端側にはＬｅｕ Ｇｌｕが、Ｃ末端側にはＳｅｒ Ａｒｇが付加される。これらＤＮＡをＣＴＲＣおよびＣＴＲＣ（Ｎ５２Ｓ）の発現ベクターに組み込み、ペプチドつきＣＴＲＣとペプチドつきＣＴＲＣ（Ｎ５２Ｓ）の発現ベクターとした。
【００６１】
それぞれの発現ベクターはＦｕＧｅｎｅ ６ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いてＨＥＫ２９３細胞に導入した。トランスフェクション後、これらの細胞は３７℃のＣＯ２インキュベーターで一晩培養し、ここで培地交換を行って（３．５ｃｍ ｄｉｓｈ、ＭＥＭ培地＋１０％牛血清２ｍｌをＭＥＭ培地１ｍｌに交換）、さらに一定時間培養を行った（トランスフェクションから４８時間後まで）。培養終了後、培養上清を回収して少量のＮＴＡ Ａｇａｒｏｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）を添加し、４℃で２時間撹拌して培養上清中に分泌された組換え体ＣＴＲＣおよびその変異体をこれに吸着させ回収した。分泌生産量を解析する場合は、このＮＴＡ ＡｇａｒｏｓｅをＰＢＳ緩衝液で洗浄後、ＳＤＳ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒと混合し、煮沸処理後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供した。
【００６２】
分泌生産量を解析する場合は、泳動終了後、ウェスタンブロットを行うため、ゲル中のタンパク質はブロッティング装置を用いてＰＶＤＦメンブレン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に転写し、これを３％スキムミルク含有ＴＢＳ−Ｔ緩衝液内で室温１時間震盪してブロッキング処理を行った。つぎにこのメンブレンを一次抗体溶液（抗ｍｙｃ−ｔａｇ抗体、ＭＢＬを３％スキムミルク含有ＴＢＳ−Ｔ緩衝液で１０００倍希釈したもの）に浸漬させ、室温で１時間震盪した。その後、メンブレンを３％スキムミルク含有ＴＢＳ−Ｔ緩衝液で２回洗浄し、二次抗体溶液（ＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ抗マウスＩｇＧ抗体、Ｚｙｍｅｄを３％スキムミルク含有ＴＢＳ−Ｔ緩衝液で５０００倍希釈したもの）に浸漬させ、室温で１時間震盪した。そして、メンブレンを３％スキムミルク含有ＴＢＳ−Ｔ緩衝液で２回洗浄し、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いて化学発光反応を行い、Ｃｈｅｍｉｄｏｃ ＸＲＳ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で陽性バンドを検出した。
【００６３】
＜実施例３＞
ＣＴＲＣおよびＣＴＲＣ（Ｎ５２Ｓ）のＣ末端にＮ結合型糖鎖が付加し得る、Ａｓｎ Ｘａａ Ｔｈｒ／Ｓｅｒのアミノ酸モチーフを含むＮＳＴＮＳＴ（配列表配列番号１）ペプチド、またはＡＮＳＴＮＳＴＮＳＴペプチド（配列表配列番号２）を連結し、分泌におけるその効果を調べた。その結果、ＣＴＲＣ（Ｎ５２Ｓ）は野生型ＣＴＲＣにくらべて分泌量が低下したが、これにＡＮＳＴＮＳＴＮＳＴペプチド（配列表配列番号２）を連結したところ、野生型より分泌量の増大が認められた（図９）。また、野生型ＣＴＲＣにＮＳＴＮＳＴ（配列表配列番号１）ペプチド、あるいはＡＮＳＴＮＳＴＮＳＴペプチド（配列表配列番号２）を連結した場合でも、分泌量の増大が認められた（図９）。野生型ＣＴＲＣの分泌量を１としたとき、ＣＴＲＣ（Ｎ５２Ｓ）の分泌量は０．５〜０．７、これにＡＮＳＴＮＳＴＮＳＴペプチド（配列表配列番号２）を連結した分子の分泌量は７．４倍になった。また、野生型ＣＴＲＣにＮＳＴＮＳＴ（配列表配列番号１）ペプチドを連結した分子の分泌量は１．６倍、ＡＮＳＴＮＳＴＮＳＴペプチド（配列表配列番号２）を連結した分子の分泌量は１．５倍になった。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明のタンパク質製造方法は、有用タンパク質の分泌生産の増大や、糖鎖付加により機能改変や新機能が付与されたタンパク質の製造、あるいは血中安定性が増大したタンパク質の製造などに利用できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分泌タンパク質をコードするＤＮＡに、少なくとも１つのＡｓｎを含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡを連結してなるＤＮＡを含む組換えベクターを含む形質転換体を培養することを特徴とする、そのアミノ酸配列を付加した分泌タンパク質であって本来の活性を損なうことなく分泌生産量が増大した分泌タンパク質の製造方法。
【請求項２】
目的のタンパク質をコードするＤＮＡに、下記（１）のアミノ酸配列モチーフを少なくとも１つ有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡを連結してなるＤＮＡを含む組換えベクターを含む形質転換体を培養することを特徴とする、そのアミノ酸配列を付加した目的のタンパク質であって本来の活性を損なうことなく新たな性質を付与した目的のタンパク質の製造方法。
（１）Ａｓｎ Ｘａａ Ｔｈｒ／Ｓｅｒ
（ただし、（１）でＸａａは任意のアミノ酸を示す。）
【請求項３】
目的のタンパク質をコードするＤＮＡに、ＴｈｒまたはＳｅｒを少なくとも１つ有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡを連結してなるＤＮＡを含む組換えベクターを含む形質転換体を培養することを特徴とする、ＴｈｒまたはＳｅｒにＯ結合型糖鎖が結合したそのアミノ酸配列を付加した目的のタンパク質であって本来の活性を損なうことなく新たな性質を付与した目的のタンパク質の製造方法。
【請求項４】
そのアミノ酸配列がプロテアーゼ切断配列を有するものであり、製造したタンパク質にそのプロテアーゼを反応させて、製造したタンパク質からそのアミノ酸配列を切断することを特徴とする請求項１から３に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項１】
分泌タンパク質をコードするＤＮＡに、少なくとも１つのＡｓｎを含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡを連結してなるＤＮＡを含む組換えベクターを含む形質転換体を培養することを特徴とする、そのアミノ酸配列を付加した分泌タンパク質であって本来の活性を損なうことなく分泌生産量が増大した分泌タンパク質の製造方法。
【請求項２】
目的のタンパク質をコードするＤＮＡに、下記（１）のアミノ酸配列モチーフを少なくとも１つ有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡを連結してなるＤＮＡを含む組換えベクターを含む形質転換体を培養することを特徴とする、そのアミノ酸配列を付加した目的のタンパク質であって本来の活性を損なうことなく新たな性質を付与した目的のタンパク質の製造方法。
（１）Ａｓｎ Ｘａａ Ｔｈｒ／Ｓｅｒ
（ただし、（１）でＸａａは任意のアミノ酸を示す。）
【請求項３】
目的のタンパク質をコードするＤＮＡに、ＴｈｒまたはＳｅｒを少なくとも１つ有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡを連結してなるＤＮＡを含む組換えベクターを含む形質転換体を培養することを特徴とする、ＴｈｒまたはＳｅｒにＯ結合型糖鎖が結合したそのアミノ酸配列を付加した目的のタンパク質であって本来の活性を損なうことなく新たな性質を付与した目的のタンパク質の製造方法。
【請求項４】
そのアミノ酸配列がプロテアーゼ切断配列を有するものであり、製造したタンパク質にそのプロテアーゼを反応させて、製造したタンパク質からそのアミノ酸配列を切断することを特徴とする請求項１から３に記載のタンパク質の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２０１３−５５９３５（Ｐ２０１３−５５９３５Ａ）
【公開日】平成２５年３月２８日（２０１３．３．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１８１１７３（Ｐ２０１２−１８１１７３）
【出願日】平成２４年８月１７日（２０１２．８．１７）
【出願人】（０００１７３９２４）公益財団法人野口研究所 (108)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年３月２８日（２０１３．３．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年８月１７日（２０１２．８．１７）
【出願人】（０００１７３９２４）公益財団法人野口研究所 (108)
【Ｆターム（参考）】
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