タンパク質を修飾する方法
【課題】タンパク質が有する２以上の特異結合部位の活性を維持可能な、タンパク質の修飾方法を提供すること。
【解決手段】第１の特異的結合部位２１および第２の特異的結合部位２２を有するタンパク質を修飾物質により修飾する方法であって、第１の特異的結合部位２１に特異的に結合する第１の保護剤１に、タンパク質２を接触させる第１工程、タンパク質２に、修飾物質３を供給する第２工程、第１の保護剤１と第１の特異的結合部位２１とを解離させる第３工程、第２の特異的結合部位２２に特異的に結合する第２の保護剤４に、第１〜３工程を順に経たタンパク質２を接触させると共に、修飾物質３によって第２の特異的結合部位２２が不活性化しているタンパク質２を除去する第４工程、および第２の保護剤４と第２の特異的結合部位２２とを解離させる第５工程を有する方法。
【解決手段】第１の特異的結合部位２１および第２の特異的結合部位２２を有するタンパク質を修飾物質により修飾する方法であって、第１の特異的結合部位２１に特異的に結合する第１の保護剤１に、タンパク質２を接触させる第１工程、タンパク質２に、修飾物質３を供給する第２工程、第１の保護剤１と第１の特異的結合部位２１とを解離させる第３工程、第２の特異的結合部位２２に特異的に結合する第２の保護剤４に、第１〜３工程を順に経たタンパク質２を接触させると共に、修飾物質３によって第２の特異的結合部位２２が不活性化しているタンパク質２を除去する第４工程、および第２の保護剤４と第２の特異的結合部位２２とを解離させる第５工程を有する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はタンパク質を修飾する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の濃度を測定する方法として、測定しようとするタンパク質と結合する物質を修飾物質により修飾し、次いでこの修飾物質の濃度を電気化学的または光学的に測定することによって、当該タンパク質の濃度を間接的に測定する方法を例示することができる。
【０００３】
図２は、測定しようとするタンパク質を修飾物質により修飾する具体的な方法を示している。図２ではタンパク質は抗体であり、修飾物質は蛍光物質である。まず、抗体を含む溶液中に蛍光物質を添加する。すると、蛍光物質は抗体と結合する。ここで、図３に示すように、抗体はＹ文字型である。そして、２つのＦａｂ領域および１つのＦｃ領域を有している。これら３つの領域は、いずれも「特異的結合部位」として知られている。
【０００４】
２つのＦａｂ領域には抗原が特異的に結合する。しかし、２つのＦａｂ領域のいずれにも蛍光物質が結合した抗体には、その後、２つのＦａｂ領域のいずれにも抗原が特異的に結合しない。すなわち、そのような抗体は、抗原に対して不活性性を有する。
【０００５】
そこで、２つのＦａｂ領域のいずれにも蛍光物質が結合した抗体を排除する方法が、特許文献１に開示されている。図４に示すように、特許文献１に示された方法では、まず、抗原と抗体とを反応させ、複合体を得る。次に、複合体に修飾物質を結合させる。修飾物質が結合した複合体から、抗原を解離させる。
【０００６】
この方法では、修飾物質は抗体のＦａｂ領域に結合しない。なぜなら、修飾物質が抗体に結合する時には、抗体のＦａｂ領域は抗原と特異的に結合しているからである。よって、Ｆａｂ領域に修飾物質が全く結合していない抗体を得ることができる。
【０００７】
【特許文献１】特開平４−３５５３６９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
典型的なバイオセンサにおいては、図５に示すように、Ｆｃ領域を介して抗体を基板上に固定する。しかし、特許文献１に示される方法では、修飾物質はＦｃ領域にも結合し得る。Ｆｃ領域に蛍光物質が結合した抗体は、Ｆｃ領域に特異的に結合する物質を表面上に有する基板に結合しない。すなわち、そのような抗体もまた、部分的な不活性性を有する。
【０００９】
抗体だけでなく、一般的なタンパク質も、このような不活性性の問題を有する。すなわち、抗体におけるＦａｂ領域およびＦｃ領域のように、タンパク質が有する２以上の特異結合部位が、修飾物質によって不活性化する。
【００１０】
本発明の目的は、タンパク質が有する２以上の特異結合部位の活性を維持可能な、タンパク質の修飾方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記目的を達成する本発明は、タンパク質を修飾物質により修飾する方法であって、
前記タンパク質（２）は、第１の特異的結合部位（２１）および第２の特異的結合部位（２２）を有しており、
前記方法は、以下の工程を順に有する：
前記第１の特異的結合部位（２１）に特異的に結合する第１の保護剤（１）に、前記タンパク質（２）を接触させる第１工程、
前記タンパク質（２）に、前記修飾物質（３）を供給する第２工程、
前記第１の保護剤（１）と第１の特異的結合部位（２１）とを解離させる第３工程、
前記第２の特異的結合部位（２２）に特異的に結合する第２の保護剤（４）に、前記第１〜３工程を順に経たタンパク質（２）を接触させると共に、前記修飾物質（３）によって前記第２の特異的結合部位（２２）が不活性化している前記タンパク質（２）を除去する第４工程、および
前記第２の保護剤（４）と第２の特異的結合部位（２２）とを解離させる第５工程。
前記タンパク質（２）は抗体であり得る。前記第１の特異的結合部位（２１）はＦｃ領域であり、前記第２の特異的結合部位（２２）はＦａｂ領域であり得る。前記第１の保護剤（４）がプロテインＡまたはプロテインＧであり得る。
【００１２】
上記課題を解決する本発明を、図面を参照しながら説明する。
まず、図１（ａ）の左側に示すように、第１の保護剤１を壁面に具備している第１カラム１０を準備する。この第１の保護剤１は、タンパク質２が有する第１の特異的結合部位２１と特異的に結合する。タンパク質２が抗体であって、かつ第１の特異的結合部位２１がそのＦｃ部位である場合、第１の保護剤１として、プロテインＡおよびプロテインＧを挙げることができる。
【００１３】
この第１カラム１０に、タンパク質２を供給する。すると、タンパク質２が有する第１の特異的結合部位２１と、第１の保護剤１とが特異的に結合する（図１（ａ）右側を参照）。これによって、第１の特異的結合部位２１は第１の保護剤１によって保護される。
【００１４】
次に、図１（ｂ）左側に示すように、タンパク質２を修飾物質３によって修飾する。ここでは、修飾物質３としてフェロセンが用いられる。第１カラム１０に修飾物質３を供給する。すると、第１カラム１０内部のタンパク質２が、修飾物質３によって修飾される。ただし、第１の特異的結合部位２１は第１の保護剤１によって保護されているので、第１の特異的結合部位２１は修飾物質３によって修飾されない（図１（ｂ）右側を参照）。
【００１５】
修飾を終了した後、図１（ｃ）に示すように、第１の保護剤１と第１の特異的結合部位２１とを解離させることによって、第１カラム１０からタンパク質２を取り出す。具体的には、０．１Ｍクエン酸ナトリウムバッファ（ｐＨ：４．０）を第１カラム１０に供給する。こうして得られたタンパク質２は修飾物質３によって修飾されている。ただし、その第１の特異的結合部位２１は修飾されていない。
【００１６】
図１（ａ）から図１（ｃ）までによって得られたタンパク質２の中には、全ての第２の特異的結合部位２２が修飾物質３によって修飾されているものがある。ここで、タンパク質２が抗体である場合、第２の特異的結合部位２２とは、２つのＦａｂ部位を意味する。すなわち、図１（ｃ）の右から２つめの抗体は、２つのＦａｂの両者が修飾物質３によって修飾されている。このようなタンパク質２は不要である。なぜなら、このようなタンパク質２は、抗原に対して不活性であるためである。すなわち、このようなタンパク質２は、本来であれば抗原と特異結合反応すべきであるにも関わらず、抗原と特異結合反応しないからである。そのため、得られたタンパク質２から、全ての第２の特異的結合部位２２が修飾物質３によって修飾されているタンパク質２を除去する。なお、図１（ｃ）の左から１番目および２番目の抗体のように、一部の第２の特異的結合部位２２に修飾物質が修飾されている抗体は、残余の第２の特異的結合部位２２が抗原と特異結合反応する。従って、このような抗体は、除去の対象ではない。
以下、この除去方法を説明する。
【００１７】
以下、この除去方法を説明する。図１（ｄ）に示すように、まず、第２の保護剤４を壁面に有している第２カラム１１を準備する。この第２の保護剤４は、タンパク質２が有する第２の特異的結合部位２２と特異的に結合する。タンパク質２が抗体であって、かつ第２の特異的結合部位２２がそのＦａｂ部位である場合、第２の保護剤４としては、抗原を挙げることができる。
【００１８】
次に、図１（ｅ）に示すように、この第２カラム１１に、図１（ａ）〜図１（ｃ）によって得られたタンパク質２を供給する。すると、少なくとも一部の第２の特異的結合部位２２が修飾されていないタンパク質２は、第２の保護剤４と結合し、第２カラム１１内部に留まる。一方、全ての第２の特異的結合部位２２が修飾されているタンパク質８は第２カラム１１に留まることができず、第２カラム１１から排出される（図１（ｅ）右側参照）。
【００１９】
最後に、図１（ｆ）に示すように、第２カラム１１内部に留まっているタンパク質２を第２カラム１１から取り出す。具体的には、第２カラム１１内部に０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ：２．７）を供給することによって、タンパク質２を第２カラム１１から取り出すことができる。
【００２０】
得られたタンパク質２の第１の特異的結合部位２１は修飾されておらず、かつ少なくとも一部の第２の特異的結合部位２２も修飾されていない。すなわち、２つ以上の特異的結合部位が修飾されておらず、それらの活性が維持されている。このようにして、第１の特異的結合部位２１および少なくとも一部の第２の特異的結合部位が修飾されていないタンパク質９を得ることができる。
【発明の効果】
【００２１】
本発明により、２以上の特異結合部位の活性を維持可能な、修飾物質によるタンパク質の修飾方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、実施の形態を用いて、抗体の特異的結合部位であるプロテインA（以下SpAと略す）結合部位及び抗原結合部位の生物活性を維持したまま、抗体の修飾を行う方法について説明する。
【００２３】
抗体には抗HSAマウスモノクローナルIgG1（以下マウスモノクローナル抗体と略す）を用い、修飾物質には、Fe(C5H5)2（以下フェロセンと略す）を用いる。
【００２４】
なお、以下実施の形態に示すバッファーや水溶液の調製には、Milli-Q SP TOC（Millipore製）でろ過した純水を使用する。また、特に記載のない塩やバッファーを調整する試薬は、いずれも和光純薬工業製のものを使用する。
【００２５】
（実施の形態１）
フェロセン結合した抗体の獲得
以下の精製において、化学薬品は使用前に0.045μmのフィルターを通す。また、精製に用いる結合バッファーは0.2 M NaHCO3、0.5MNaCl（pH 8.9）を用い、溶出バッファーは0.1M クエン酸ナトリウム（pH4.0）を用いる。なお、第１の保護剤にはSpAを使用し、ＳｐＡカラムには、HiTrap ProteinA HP 1mL カラム (GE ヘルスケア バイオサイエンス株式会社製)を使用する。カラム内への送液にはペリスタポンプ(IWAKI、PST-100N)を用い、流速1ml/minで送液をおこなう。
【００２６】
まず、結合バッファーでシリンジを満たし、ストッパーを取り除き、シリンジとSpAカラムをつなぐ。次に、ＳｐＡカラムの先端を折り、5mlの純水を流し、エタノール防腐剤を洗い流す。続いて5mlの溶出バッファーを流してＳｐＡカラムを再生し、5〜10mlの結合バッファーを流して平衡させる。
【００２７】
マウスモノクローナル抗体(1 mg/ml)10mlをSpAカラムに流し、SpAに結合させる。ここでSpAカラムから排出される溶液はSpAと結合しなかったマウスモノクローナル抗体を含んでいるため、回収して、3回ＳｐＡカラム内を通過させる。
【００２８】
再び結合バッファーを、ＳｐＡカラム中に全量5ml流してカラム内を満たし、非特異的にSpAに結合した不純物を取り除く。
【００２９】
次に、SpAに結合したマウスモノクローナル抗体とフェロセンを接触させ、マウスモノクローナル抗体をフェロセンで修飾を行う。1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride（EDC、Fluka製）、N-hydroxy succinimide （NHS、Fluka製）がそれぞれ0.1M溶解した水溶液1mlを作成し、それにフェロセンモノカルボン酸（和光純薬工業製）を2mg加えて室温で二時間攪拌させてフェロセンモノカルボン酸を活性化させる。攪拌後、上記SpAカラム内に送液し、25℃のインキュベータで一晩静置し、フェロセンモノカルボン酸とＳｐＡカラム内のマウスモノクローナル抗体を反応させる。翌日、5〜10mlの結合バッファーでＳｐＡカラム内を洗い、不純物を取り除く。続いて、溶出バッファーを3ml流し、排出される溶液を500μlずつ1.5mlのエペンドルフチューブにＳｐＡ結合部位が修飾されていないフェロセン修飾抗体を回収する。回収した溶液は1 M Tris（pH9.0）により直ちに中和する。
【００３０】
（実施の形態２） HSA結合カラムによる抗体精製
以下の精製において、化学薬品は使用前に0.045μmのフィルターを通す。また、精製に用いる洗浄バッファーは0.1 M 酢酸ナトリウム、0.5 M NaCl（pH 4.0）、カップリングバッファーは0.2 M NaHCO3、0.5 M NaCl（pH 8.3）、ブロッキングバッファーは0.5 Mモノエタノールアミン、0.5 M NaCl（pH 8.3）、平衡化バッファーは10ｍMリン酸緩衝生理食塩水（pH7.4）（PBS）を使用し、HSAはシグマ社製 （Lot：111K-7612）を使用する。なお、第2の保護剤にはHSAを使用し、HSA結合カラムには、HiTrap NHS activated HP 1mLカラム(GE ヘルスケア バイオサイエンス株式会社製)を使用する。カラム内への送液にはペリスタポンプ(IWAKI、PST-100N)を用いる。
【００３１】
まずHSA結合カラムにシリンジを接続し、１mM 冷HClを5ml流速200μl/sで送液し、HSA結合カラムを洗浄する。次に、5mg/mlのHSA溶液（0.2 M NaHCO3、0.5 M NaCl、pH8.3）１mlを、流速200μl/秒で送液する。HSA結合カラム出口を付属のストッププラグで密閉し、室温で20分間放置する。そして、カップリングバッファーを、流速200μl/sで3ml送液し、カップリング反応をさせる。 6mlのブロッキングバッファー、6mlの洗浄バッファー、6mlのブロッキングバッファーをそれぞれ流速200μl/sで送液した後、室温で20分間放置して、未反応活性基のブロッキングをする。そして、洗浄バッファー、ブロッキングバッファー、洗浄バッファー、平衡化バッファーをそれぞれ流速200μl/sで６ｍｌ送液して上記ＨＳＡ結合カラムを平衡化する。
【００３２】
上記HSA結合カラムへ0.02M リン酸ナトリウムバッファー（pH 7.0）を、流速1ml/minで2ml流す。次に実施の形態1で作成したＳｐＡ結合部位に修飾が修飾されていないフェロセン修飾抗体溶液10mlを、上記HＳＡ結合カラム中へ流す。HＳＡ結合カラムから排出された溶液はHSAと結合しなかったフェロセン修飾抗体を含んでいるため、回収して、3回カラム内を通過させる。再び上記リン酸ナトリウムバッファーを、ＨＳＡ結合カラム中に10ml流すことにより、抗原結合部位2か所にフェロセンが結合した抗体を排除する。そして、0.1M Glycine-HCl (pH 2.7)をＨＳＡ結合カラム中に3ml流し、500μlずつ1.5mlのエペンドルフチューブにＳｐＡ結合部位及びHSA結合部位が修飾されていないフェロセン修飾抗体を回収する。回収した溶液は、1M Tris（pH 9.0）により直ちに中和する。
【００３３】
（実施の形態３）
フェロセン修飾抗体の電気化学性質評価
電気化学測定には電気化学アナライザー（ALSモデル660A、BAS社）を使用し、サイクリックボルタンメトリー（CV）法により実施する。なお、参照電極にAg/AgCl (飽和KCl)（RE-1C 参照電極、ＢＡＳ社製）、カウンター電極に白金電極（VC-2用Ptカウンター電極、ＢＡＳ社製）作用極に金電極（SAUE金電極、外径3.0mm、内径1.6mm、ＢＡＳ社製）を用いる3極構成とし、25℃で測定を行う。
【００３４】
測定の20分以上前に、サンプルバイアルにPBSバッファーを20mL入れ、サンプルホルダーをセットする。飽和塩化銀参照電極およびカウンター電極（白金電極）をセットする。測定前に作用電極を研磨用アルミナ(BAS社製、PK-3セル研磨キット）で研磨する。ケーブルの接続リード線を作用電極、カウンター電極、参照電極にそれぞれつなぐ。フェロセン溶液をサンプルバイアルに、金電極をサンプルホルダー（9mmφ、ＢＡＳ社製）内に入れ、ポテンシャルスイーパーによって作用電極の電位（0〜600mV）を掃引して電流を測定し、電流−電位曲線を得る。サンプルバイアルを洗浄し、金電極を洗浄および研磨した後、3mg/mlフェロセン修飾抗体溶液をサンプルバイアルに入れ、同様に測定を行う。得られた電流−電位曲線を比較してそのピークが一致していることにより、フェロセン溶液とマウスモノクローナル抗体に結合したフェロセン溶液の酸化還元ピーク位置を比較し、マウスモノクローナル抗体にフェロセンが結合していること、及びフェロセンがマウスモノクローナル抗体に結合することで、フェロセン自身の電気化学性質が変わらないことを確認する。
【００３５】
（実施の形態４） ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)で抗原結合状態を確認
実施の形態2で作成したフェロセン修飾抗体と抗原であるHSA（シグマ社製 Lot：111K-7612）の反応特性について、ELISA法を用いて調べる。
【００３６】
まず、HSAをPBS（8g/lのNaCl、0.2g/lのKCl、0.2g/lのKH2PO4、2.9g/lのNa2HPO4-12H2O ）で2.5μg/mlになるよう希釈し、得られた溶液をマイクロプレート（米国Corning社製のE.I.A.・R.I.A. 8Well Strip）の１穴あたり100μlずつ分注し、室温で一晩静置して抗原を基板にコーティングする。抗原が固相化されていないネガティブコントロールの穴には、何も入れずに室温で一晩静置する。翌日、抗原タンパクで被覆されなかったかもしれない部分を、抗原とは無関係のタンパク質（1％Casein-PBS-Az）で埋める。
【００３７】
アスピレータで抗原溶液を除去した後、1％Casein-PBS-Azを各穴に200μlずつ加え、室温に30分間静置し、プレートのブロッキングを行う。ブロッキング後、固相の洗浄を米国BIO-RAD社製のMICRO PLATE WASHER MODEL 1550を使用し、PBSで３回行う。
【００３８】
次に、実施の形態2で作成したフェロセン修飾抗体と、フェロセン未修飾マウスモノクローナル抗体を、各々1％Casein-PBS-Azを用いて10-6mg/ml、10-5mg/ml、3×10-5mg/ml、10-4mg/ml、3×10-4mg/ml、10-3mg/ml、または10-2mg/mlに希釈し、抗原被覆の穴と抗原被覆が行われていないネガティブコントロール(ブロッキングタンパクのみを被覆した) の穴とに100μlずつ入れ、室温で３時間反応させた後、固相の洗浄を3回行う。バックグラウンド値を得るためのコントロールの穴には、抗体を入れずに、1％Casein-PBS-Azのみ100μlずつ入れ、室温で3時間反応させた後、固相の洗浄を3回行う。
【００３９】
さらに、ペルオキシダーゼ修飾抗マウスIgG-ヤギ抗体（Affinity Purified Antibody Peroxidase Labeled Goat anti-Mouse IgG(H+L) Human Serum Absorbed (Kirkegaard Perry Laboratories社製）)を1％Casein-PBSで0.1mg/mlに希釈して、各穴に100μlずつ入れ、室温で30分間反応させた後、固相の洗浄を3回行う。ついで、基質として、ｏ-フェニレンジアミン（OPD）（和光純薬工業製）を使用し、酵素反応を行った。反応液（80mgのOPD、20mlのPCB（35.8g/lのNa2HPO4、20mlの無水クエン酸（21g/l（pH5.0））、8μlの30%H2O2）を使用直前に調整し、各穴に100μlずつ入れ、室温で3分間反応させる。
【００４０】
マイクロプレートの穴に反応液を入れたときと同じ順序、同じ速さで反応停止液（4NH2SO4)を各穴に25μl入れ、各穴の酵素反応の時間を一定にする。酵素反応停止後、自動吸光度測定器MICRO PLATEREADER MPR A4（TOYO SODＡ社製）で、492nmの吸光度を測定する。そして、フェロセン修飾抗体とフェロセン未修飾マウスモノクローナル抗体の抗原結合曲線を比較することにより、フェロセン修飾抗体がフェロセン結合により抗原結合能が低下していないことを確認する。
【００４１】
（実施の形態５）
SpAに対する抗体の結合能を確認
SpAに対する抗体の結合能はSPR（surface Plasmon resonance）によって確認することができる。測定装置には、BIACORE3000(GEヘルスケア バイオサイエンス株式会社製)を使用し、流量は10μl/分とする。
【００４２】
まず、SpA（ＳＩＧＭＡ社製、０６７Ｋ１３５３１）をセンサーチップ上に固定化する。センサーチップには、金属膜の表面がカルボキシメチルデキストランで覆われたCM5(GEヘルスケア バイオサイエンス株式会社製)を用いる。
【００４３】
PBS（pH7.4）を用い、SpA40μg/mlを調整する。次に、ビアコア用バイアル（Plastic Vials、φ7mm、GEヘルスケア バイオサイエンス株式会社製）にろ過した10mM酢酸（0.1M酢酸、0.1M酢酸ナトリウム）（pH4.5）、EDC/NHS（アミンカップリングキット(GEヘルスケア バイオサイエンス株式会社製)中のN-hydroxysuccinimide（NHS）とN-ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride（EDC）をそれぞれ100mMおよび400mMの濃度で溶解させ、等容量ずつ混合する）、エタノールアミン（1.0M Ethanolamine-HCl pH8.5）(アミンカップリングキット(GEヘルスケア バイオサイエンス株式会社製)をそれぞれ400μl入れ、上記センサーチップをセットする。SPRセンサーにEDC/NHSをインジェクトし、 CMデキストラン中のカルボキシル基を活性化させる。次に、SpAのアミノ基と結合させるため、上記SpA溶液をインジェクトし、最後にNHS基をブロッキングするため、エタノールアミンをインジェクトし、SpAをセンサーチップに固定化する。実施の形態2で作成したフェロセン修飾抗体及びフェロセン未修飾マウスモノクローナル抗体を100nMに調製する。反応における溶媒には10mMリン酸バッファー、0.005重量％TWEEN 20 Detergent（CALBIOCHEM製）（pH7.4）を用いる。これらのフェロセン修飾抗体溶液及びフェロセン未修飾マウスモノクローナル抗体溶液を、ビアコア用バイアル（Plastic Vials、φ7mm、GEヘルスケア バイオサイエンス株式会社製）に各々入れ、セットする。センサーチップ上に上記フェロセン修飾抗体溶液をインジェクトし、SpAに抗体を結合させる。次に、上記溶媒を流してSpAと結合していないフェロセン修飾抗体を取り除き、SpAに結合したフェロセン修飾抗体の量を測定する。フェロセン未修飾マウスモノクローナル抗体でも同様に測定を行う。そして、フェロセン修飾抗体とフェロセン未修飾マウスモノクローナル抗体のSpA結合量を比較することにより、フェロセン修飾抗体がフェロセン結合によりSpA結合能が低下していないことを確認する。
【００４４】
本方法によって、ＳｐＡ結合部位及びＨＳＡ結合部位が修飾されていない抗体を得ることができる。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明にかかるタンパク質修飾方法は、複数の特異的結合部位の生物活性を維持したまま、修飾物質によるタンパク質の修飾を行うことができ、タンパク質の特異的相互作用を用いた分析方法の修飾タンパク作成方法として有用である。また、医学、薬学、生物学、化学、食品学等の諸分野における免疫反応測定抗体の修飾方法等の用途にも応用できる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】本発明の各工程を示す図
【図２】測定しようとするタンパク質を修飾物質により修飾する具体的な方法を示す図
【図３】抗体の模式図
【図４】特許文献１に開示されているタンパク質の修飾方法を示す図
【図５】抗体を表面上に有する基板を示す図
【符号の説明】
【００４７】
１ 第１の保護剤
２ 被修飾タンパク質
３ 修飾物質
４ 第２の保護剤
９ 第１の特異的結合部位２１および第２の特異的結合部位２２のいずれもが修飾されていないタンパク質
１０ 第１カラム
１１ 第２カラム
２１ 第１の特異的結合部位
２２ 第２の特異的結合部位
【技術分野】
【０００１】
本発明はタンパク質を修飾する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の濃度を測定する方法として、測定しようとするタンパク質と結合する物質を修飾物質により修飾し、次いでこの修飾物質の濃度を電気化学的または光学的に測定することによって、当該タンパク質の濃度を間接的に測定する方法を例示することができる。
【０００３】
図２は、測定しようとするタンパク質を修飾物質により修飾する具体的な方法を示している。図２ではタンパク質は抗体であり、修飾物質は蛍光物質である。まず、抗体を含む溶液中に蛍光物質を添加する。すると、蛍光物質は抗体と結合する。ここで、図３に示すように、抗体はＹ文字型である。そして、２つのＦａｂ領域および１つのＦｃ領域を有している。これら３つの領域は、いずれも「特異的結合部位」として知られている。
【０００４】
２つのＦａｂ領域には抗原が特異的に結合する。しかし、２つのＦａｂ領域のいずれにも蛍光物質が結合した抗体には、その後、２つのＦａｂ領域のいずれにも抗原が特異的に結合しない。すなわち、そのような抗体は、抗原に対して不活性性を有する。
【０００５】
そこで、２つのＦａｂ領域のいずれにも蛍光物質が結合した抗体を排除する方法が、特許文献１に開示されている。図４に示すように、特許文献１に示された方法では、まず、抗原と抗体とを反応させ、複合体を得る。次に、複合体に修飾物質を結合させる。修飾物質が結合した複合体から、抗原を解離させる。
【０００６】
この方法では、修飾物質は抗体のＦａｂ領域に結合しない。なぜなら、修飾物質が抗体に結合する時には、抗体のＦａｂ領域は抗原と特異的に結合しているからである。よって、Ｆａｂ領域に修飾物質が全く結合していない抗体を得ることができる。
【０００７】
【特許文献１】特開平４−３５５３６９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
典型的なバイオセンサにおいては、図５に示すように、Ｆｃ領域を介して抗体を基板上に固定する。しかし、特許文献１に示される方法では、修飾物質はＦｃ領域にも結合し得る。Ｆｃ領域に蛍光物質が結合した抗体は、Ｆｃ領域に特異的に結合する物質を表面上に有する基板に結合しない。すなわち、そのような抗体もまた、部分的な不活性性を有する。
【０００９】
抗体だけでなく、一般的なタンパク質も、このような不活性性の問題を有する。すなわち、抗体におけるＦａｂ領域およびＦｃ領域のように、タンパク質が有する２以上の特異結合部位が、修飾物質によって不活性化する。
【００１０】
本発明の目的は、タンパク質が有する２以上の特異結合部位の活性を維持可能な、タンパク質の修飾方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記目的を達成する本発明は、タンパク質を修飾物質により修飾する方法であって、
前記タンパク質（２）は、第１の特異的結合部位（２１）および第２の特異的結合部位（２２）を有しており、
前記方法は、以下の工程を順に有する：
前記第１の特異的結合部位（２１）に特異的に結合する第１の保護剤（１）に、前記タンパク質（２）を接触させる第１工程、
前記タンパク質（２）に、前記修飾物質（３）を供給する第２工程、
前記第１の保護剤（１）と第１の特異的結合部位（２１）とを解離させる第３工程、
前記第２の特異的結合部位（２２）に特異的に結合する第２の保護剤（４）に、前記第１〜３工程を順に経たタンパク質（２）を接触させると共に、前記修飾物質（３）によって前記第２の特異的結合部位（２２）が不活性化している前記タンパク質（２）を除去する第４工程、および
前記第２の保護剤（４）と第２の特異的結合部位（２２）とを解離させる第５工程。
前記タンパク質（２）は抗体であり得る。前記第１の特異的結合部位（２１）はＦｃ領域であり、前記第２の特異的結合部位（２２）はＦａｂ領域であり得る。前記第１の保護剤（４）がプロテインＡまたはプロテインＧであり得る。
【００１２】
上記課題を解決する本発明を、図面を参照しながら説明する。
まず、図１（ａ）の左側に示すように、第１の保護剤１を壁面に具備している第１カラム１０を準備する。この第１の保護剤１は、タンパク質２が有する第１の特異的結合部位２１と特異的に結合する。タンパク質２が抗体であって、かつ第１の特異的結合部位２１がそのＦｃ部位である場合、第１の保護剤１として、プロテインＡおよびプロテインＧを挙げることができる。
【００１３】
この第１カラム１０に、タンパク質２を供給する。すると、タンパク質２が有する第１の特異的結合部位２１と、第１の保護剤１とが特異的に結合する（図１（ａ）右側を参照）。これによって、第１の特異的結合部位２１は第１の保護剤１によって保護される。
【００１４】
次に、図１（ｂ）左側に示すように、タンパク質２を修飾物質３によって修飾する。ここでは、修飾物質３としてフェロセンが用いられる。第１カラム１０に修飾物質３を供給する。すると、第１カラム１０内部のタンパク質２が、修飾物質３によって修飾される。ただし、第１の特異的結合部位２１は第１の保護剤１によって保護されているので、第１の特異的結合部位２１は修飾物質３によって修飾されない（図１（ｂ）右側を参照）。
【００１５】
修飾を終了した後、図１（ｃ）に示すように、第１の保護剤１と第１の特異的結合部位２１とを解離させることによって、第１カラム１０からタンパク質２を取り出す。具体的には、０．１Ｍクエン酸ナトリウムバッファ（ｐＨ：４．０）を第１カラム１０に供給する。こうして得られたタンパク質２は修飾物質３によって修飾されている。ただし、その第１の特異的結合部位２１は修飾されていない。
【００１６】
図１（ａ）から図１（ｃ）までによって得られたタンパク質２の中には、全ての第２の特異的結合部位２２が修飾物質３によって修飾されているものがある。ここで、タンパク質２が抗体である場合、第２の特異的結合部位２２とは、２つのＦａｂ部位を意味する。すなわち、図１（ｃ）の右から２つめの抗体は、２つのＦａｂの両者が修飾物質３によって修飾されている。このようなタンパク質２は不要である。なぜなら、このようなタンパク質２は、抗原に対して不活性であるためである。すなわち、このようなタンパク質２は、本来であれば抗原と特異結合反応すべきであるにも関わらず、抗原と特異結合反応しないからである。そのため、得られたタンパク質２から、全ての第２の特異的結合部位２２が修飾物質３によって修飾されているタンパク質２を除去する。なお、図１（ｃ）の左から１番目および２番目の抗体のように、一部の第２の特異的結合部位２２に修飾物質が修飾されている抗体は、残余の第２の特異的結合部位２２が抗原と特異結合反応する。従って、このような抗体は、除去の対象ではない。
以下、この除去方法を説明する。
【００１７】
以下、この除去方法を説明する。図１（ｄ）に示すように、まず、第２の保護剤４を壁面に有している第２カラム１１を準備する。この第２の保護剤４は、タンパク質２が有する第２の特異的結合部位２２と特異的に結合する。タンパク質２が抗体であって、かつ第２の特異的結合部位２２がそのＦａｂ部位である場合、第２の保護剤４としては、抗原を挙げることができる。
【００１８】
次に、図１（ｅ）に示すように、この第２カラム１１に、図１（ａ）〜図１（ｃ）によって得られたタンパク質２を供給する。すると、少なくとも一部の第２の特異的結合部位２２が修飾されていないタンパク質２は、第２の保護剤４と結合し、第２カラム１１内部に留まる。一方、全ての第２の特異的結合部位２２が修飾されているタンパク質８は第２カラム１１に留まることができず、第２カラム１１から排出される（図１（ｅ）右側参照）。
【００１９】
最後に、図１（ｆ）に示すように、第２カラム１１内部に留まっているタンパク質２を第２カラム１１から取り出す。具体的には、第２カラム１１内部に０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ：２．７）を供給することによって、タンパク質２を第２カラム１１から取り出すことができる。
【００２０】
得られたタンパク質２の第１の特異的結合部位２１は修飾されておらず、かつ少なくとも一部の第２の特異的結合部位２２も修飾されていない。すなわち、２つ以上の特異的結合部位が修飾されておらず、それらの活性が維持されている。このようにして、第１の特異的結合部位２１および少なくとも一部の第２の特異的結合部位が修飾されていないタンパク質９を得ることができる。
【発明の効果】
【００２１】
本発明により、２以上の特異結合部位の活性を維持可能な、修飾物質によるタンパク質の修飾方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、実施の形態を用いて、抗体の特異的結合部位であるプロテインA（以下SpAと略す）結合部位及び抗原結合部位の生物活性を維持したまま、抗体の修飾を行う方法について説明する。
【００２３】
抗体には抗HSAマウスモノクローナルIgG1（以下マウスモノクローナル抗体と略す）を用い、修飾物質には、Fe(C5H5)2（以下フェロセンと略す）を用いる。
【００２４】
なお、以下実施の形態に示すバッファーや水溶液の調製には、Milli-Q SP TOC（Millipore製）でろ過した純水を使用する。また、特に記載のない塩やバッファーを調整する試薬は、いずれも和光純薬工業製のものを使用する。
【００２５】
（実施の形態１）
フェロセン結合した抗体の獲得
以下の精製において、化学薬品は使用前に0.045μmのフィルターを通す。また、精製に用いる結合バッファーは0.2 M NaHCO3、0.5MNaCl（pH 8.9）を用い、溶出バッファーは0.1M クエン酸ナトリウム（pH4.0）を用いる。なお、第１の保護剤にはSpAを使用し、ＳｐＡカラムには、HiTrap ProteinA HP 1mL カラム (GE ヘルスケア バイオサイエンス株式会社製)を使用する。カラム内への送液にはペリスタポンプ(IWAKI、PST-100N)を用い、流速1ml/minで送液をおこなう。
【００２６】
まず、結合バッファーでシリンジを満たし、ストッパーを取り除き、シリンジとSpAカラムをつなぐ。次に、ＳｐＡカラムの先端を折り、5mlの純水を流し、エタノール防腐剤を洗い流す。続いて5mlの溶出バッファーを流してＳｐＡカラムを再生し、5〜10mlの結合バッファーを流して平衡させる。
【００２７】
マウスモノクローナル抗体(1 mg/ml)10mlをSpAカラムに流し、SpAに結合させる。ここでSpAカラムから排出される溶液はSpAと結合しなかったマウスモノクローナル抗体を含んでいるため、回収して、3回ＳｐＡカラム内を通過させる。
【００２８】
再び結合バッファーを、ＳｐＡカラム中に全量5ml流してカラム内を満たし、非特異的にSpAに結合した不純物を取り除く。
【００２９】
次に、SpAに結合したマウスモノクローナル抗体とフェロセンを接触させ、マウスモノクローナル抗体をフェロセンで修飾を行う。1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride（EDC、Fluka製）、N-hydroxy succinimide （NHS、Fluka製）がそれぞれ0.1M溶解した水溶液1mlを作成し、それにフェロセンモノカルボン酸（和光純薬工業製）を2mg加えて室温で二時間攪拌させてフェロセンモノカルボン酸を活性化させる。攪拌後、上記SpAカラム内に送液し、25℃のインキュベータで一晩静置し、フェロセンモノカルボン酸とＳｐＡカラム内のマウスモノクローナル抗体を反応させる。翌日、5〜10mlの結合バッファーでＳｐＡカラム内を洗い、不純物を取り除く。続いて、溶出バッファーを3ml流し、排出される溶液を500μlずつ1.5mlのエペンドルフチューブにＳｐＡ結合部位が修飾されていないフェロセン修飾抗体を回収する。回収した溶液は1 M Tris（pH9.0）により直ちに中和する。
【００３０】
（実施の形態２） HSA結合カラムによる抗体精製
以下の精製において、化学薬品は使用前に0.045μmのフィルターを通す。また、精製に用いる洗浄バッファーは0.1 M 酢酸ナトリウム、0.5 M NaCl（pH 4.0）、カップリングバッファーは0.2 M NaHCO3、0.5 M NaCl（pH 8.3）、ブロッキングバッファーは0.5 Mモノエタノールアミン、0.5 M NaCl（pH 8.3）、平衡化バッファーは10ｍMリン酸緩衝生理食塩水（pH7.4）（PBS）を使用し、HSAはシグマ社製 （Lot：111K-7612）を使用する。なお、第2の保護剤にはHSAを使用し、HSA結合カラムには、HiTrap NHS activated HP 1mLカラム(GE ヘルスケア バイオサイエンス株式会社製)を使用する。カラム内への送液にはペリスタポンプ(IWAKI、PST-100N)を用いる。
【００３１】
まずHSA結合カラムにシリンジを接続し、１mM 冷HClを5ml流速200μl/sで送液し、HSA結合カラムを洗浄する。次に、5mg/mlのHSA溶液（0.2 M NaHCO3、0.5 M NaCl、pH8.3）１mlを、流速200μl/秒で送液する。HSA結合カラム出口を付属のストッププラグで密閉し、室温で20分間放置する。そして、カップリングバッファーを、流速200μl/sで3ml送液し、カップリング反応をさせる。 6mlのブロッキングバッファー、6mlの洗浄バッファー、6mlのブロッキングバッファーをそれぞれ流速200μl/sで送液した後、室温で20分間放置して、未反応活性基のブロッキングをする。そして、洗浄バッファー、ブロッキングバッファー、洗浄バッファー、平衡化バッファーをそれぞれ流速200μl/sで６ｍｌ送液して上記ＨＳＡ結合カラムを平衡化する。
【００３２】
上記HSA結合カラムへ0.02M リン酸ナトリウムバッファー（pH 7.0）を、流速1ml/minで2ml流す。次に実施の形態1で作成したＳｐＡ結合部位に修飾が修飾されていないフェロセン修飾抗体溶液10mlを、上記HＳＡ結合カラム中へ流す。HＳＡ結合カラムから排出された溶液はHSAと結合しなかったフェロセン修飾抗体を含んでいるため、回収して、3回カラム内を通過させる。再び上記リン酸ナトリウムバッファーを、ＨＳＡ結合カラム中に10ml流すことにより、抗原結合部位2か所にフェロセンが結合した抗体を排除する。そして、0.1M Glycine-HCl (pH 2.7)をＨＳＡ結合カラム中に3ml流し、500μlずつ1.5mlのエペンドルフチューブにＳｐＡ結合部位及びHSA結合部位が修飾されていないフェロセン修飾抗体を回収する。回収した溶液は、1M Tris（pH 9.0）により直ちに中和する。
【００３３】
（実施の形態３）
フェロセン修飾抗体の電気化学性質評価
電気化学測定には電気化学アナライザー（ALSモデル660A、BAS社）を使用し、サイクリックボルタンメトリー（CV）法により実施する。なお、参照電極にAg/AgCl (飽和KCl)（RE-1C 参照電極、ＢＡＳ社製）、カウンター電極に白金電極（VC-2用Ptカウンター電極、ＢＡＳ社製）作用極に金電極（SAUE金電極、外径3.0mm、内径1.6mm、ＢＡＳ社製）を用いる3極構成とし、25℃で測定を行う。
【００３４】
測定の20分以上前に、サンプルバイアルにPBSバッファーを20mL入れ、サンプルホルダーをセットする。飽和塩化銀参照電極およびカウンター電極（白金電極）をセットする。測定前に作用電極を研磨用アルミナ(BAS社製、PK-3セル研磨キット）で研磨する。ケーブルの接続リード線を作用電極、カウンター電極、参照電極にそれぞれつなぐ。フェロセン溶液をサンプルバイアルに、金電極をサンプルホルダー（9mmφ、ＢＡＳ社製）内に入れ、ポテンシャルスイーパーによって作用電極の電位（0〜600mV）を掃引して電流を測定し、電流−電位曲線を得る。サンプルバイアルを洗浄し、金電極を洗浄および研磨した後、3mg/mlフェロセン修飾抗体溶液をサンプルバイアルに入れ、同様に測定を行う。得られた電流−電位曲線を比較してそのピークが一致していることにより、フェロセン溶液とマウスモノクローナル抗体に結合したフェロセン溶液の酸化還元ピーク位置を比較し、マウスモノクローナル抗体にフェロセンが結合していること、及びフェロセンがマウスモノクローナル抗体に結合することで、フェロセン自身の電気化学性質が変わらないことを確認する。
【００３５】
（実施の形態４） ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)で抗原結合状態を確認
実施の形態2で作成したフェロセン修飾抗体と抗原であるHSA（シグマ社製 Lot：111K-7612）の反応特性について、ELISA法を用いて調べる。
【００３６】
まず、HSAをPBS（8g/lのNaCl、0.2g/lのKCl、0.2g/lのKH2PO4、2.9g/lのNa2HPO4-12H2O ）で2.5μg/mlになるよう希釈し、得られた溶液をマイクロプレート（米国Corning社製のE.I.A.・R.I.A. 8Well Strip）の１穴あたり100μlずつ分注し、室温で一晩静置して抗原を基板にコーティングする。抗原が固相化されていないネガティブコントロールの穴には、何も入れずに室温で一晩静置する。翌日、抗原タンパクで被覆されなかったかもしれない部分を、抗原とは無関係のタンパク質（1％Casein-PBS-Az）で埋める。
【００３７】
アスピレータで抗原溶液を除去した後、1％Casein-PBS-Azを各穴に200μlずつ加え、室温に30分間静置し、プレートのブロッキングを行う。ブロッキング後、固相の洗浄を米国BIO-RAD社製のMICRO PLATE WASHER MODEL 1550を使用し、PBSで３回行う。
【００３８】
次に、実施の形態2で作成したフェロセン修飾抗体と、フェロセン未修飾マウスモノクローナル抗体を、各々1％Casein-PBS-Azを用いて10-6mg/ml、10-5mg/ml、3×10-5mg/ml、10-4mg/ml、3×10-4mg/ml、10-3mg/ml、または10-2mg/mlに希釈し、抗原被覆の穴と抗原被覆が行われていないネガティブコントロール(ブロッキングタンパクのみを被覆した) の穴とに100μlずつ入れ、室温で３時間反応させた後、固相の洗浄を3回行う。バックグラウンド値を得るためのコントロールの穴には、抗体を入れずに、1％Casein-PBS-Azのみ100μlずつ入れ、室温で3時間反応させた後、固相の洗浄を3回行う。
【００３９】
さらに、ペルオキシダーゼ修飾抗マウスIgG-ヤギ抗体（Affinity Purified Antibody Peroxidase Labeled Goat anti-Mouse IgG(H+L) Human Serum Absorbed (Kirkegaard Perry Laboratories社製）)を1％Casein-PBSで0.1mg/mlに希釈して、各穴に100μlずつ入れ、室温で30分間反応させた後、固相の洗浄を3回行う。ついで、基質として、ｏ-フェニレンジアミン（OPD）（和光純薬工業製）を使用し、酵素反応を行った。反応液（80mgのOPD、20mlのPCB（35.8g/lのNa2HPO4、20mlの無水クエン酸（21g/l（pH5.0））、8μlの30%H2O2）を使用直前に調整し、各穴に100μlずつ入れ、室温で3分間反応させる。
【００４０】
マイクロプレートの穴に反応液を入れたときと同じ順序、同じ速さで反応停止液（4NH2SO4)を各穴に25μl入れ、各穴の酵素反応の時間を一定にする。酵素反応停止後、自動吸光度測定器MICRO PLATEREADER MPR A4（TOYO SODＡ社製）で、492nmの吸光度を測定する。そして、フェロセン修飾抗体とフェロセン未修飾マウスモノクローナル抗体の抗原結合曲線を比較することにより、フェロセン修飾抗体がフェロセン結合により抗原結合能が低下していないことを確認する。
【００４１】
（実施の形態５）
SpAに対する抗体の結合能を確認
SpAに対する抗体の結合能はSPR（surface Plasmon resonance）によって確認することができる。測定装置には、BIACORE3000(GEヘルスケア バイオサイエンス株式会社製)を使用し、流量は10μl/分とする。
【００４２】
まず、SpA（ＳＩＧＭＡ社製、０６７Ｋ１３５３１）をセンサーチップ上に固定化する。センサーチップには、金属膜の表面がカルボキシメチルデキストランで覆われたCM5(GEヘルスケア バイオサイエンス株式会社製)を用いる。
【００４３】
PBS（pH7.4）を用い、SpA40μg/mlを調整する。次に、ビアコア用バイアル（Plastic Vials、φ7mm、GEヘルスケア バイオサイエンス株式会社製）にろ過した10mM酢酸（0.1M酢酸、0.1M酢酸ナトリウム）（pH4.5）、EDC/NHS（アミンカップリングキット(GEヘルスケア バイオサイエンス株式会社製)中のN-hydroxysuccinimide（NHS）とN-ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride（EDC）をそれぞれ100mMおよび400mMの濃度で溶解させ、等容量ずつ混合する）、エタノールアミン（1.0M Ethanolamine-HCl pH8.5）(アミンカップリングキット(GEヘルスケア バイオサイエンス株式会社製)をそれぞれ400μl入れ、上記センサーチップをセットする。SPRセンサーにEDC/NHSをインジェクトし、 CMデキストラン中のカルボキシル基を活性化させる。次に、SpAのアミノ基と結合させるため、上記SpA溶液をインジェクトし、最後にNHS基をブロッキングするため、エタノールアミンをインジェクトし、SpAをセンサーチップに固定化する。実施の形態2で作成したフェロセン修飾抗体及びフェロセン未修飾マウスモノクローナル抗体を100nMに調製する。反応における溶媒には10mMリン酸バッファー、0.005重量％TWEEN 20 Detergent（CALBIOCHEM製）（pH7.4）を用いる。これらのフェロセン修飾抗体溶液及びフェロセン未修飾マウスモノクローナル抗体溶液を、ビアコア用バイアル（Plastic Vials、φ7mm、GEヘルスケア バイオサイエンス株式会社製）に各々入れ、セットする。センサーチップ上に上記フェロセン修飾抗体溶液をインジェクトし、SpAに抗体を結合させる。次に、上記溶媒を流してSpAと結合していないフェロセン修飾抗体を取り除き、SpAに結合したフェロセン修飾抗体の量を測定する。フェロセン未修飾マウスモノクローナル抗体でも同様に測定を行う。そして、フェロセン修飾抗体とフェロセン未修飾マウスモノクローナル抗体のSpA結合量を比較することにより、フェロセン修飾抗体がフェロセン結合によりSpA結合能が低下していないことを確認する。
【００４４】
本方法によって、ＳｐＡ結合部位及びＨＳＡ結合部位が修飾されていない抗体を得ることができる。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明にかかるタンパク質修飾方法は、複数の特異的結合部位の生物活性を維持したまま、修飾物質によるタンパク質の修飾を行うことができ、タンパク質の特異的相互作用を用いた分析方法の修飾タンパク作成方法として有用である。また、医学、薬学、生物学、化学、食品学等の諸分野における免疫反応測定抗体の修飾方法等の用途にも応用できる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】本発明の各工程を示す図
【図２】測定しようとするタンパク質を修飾物質により修飾する具体的な方法を示す図
【図３】抗体の模式図
【図４】特許文献１に開示されているタンパク質の修飾方法を示す図
【図５】抗体を表面上に有する基板を示す図
【符号の説明】
【００４７】
１ 第１の保護剤
２ 被修飾タンパク質
３ 修飾物質
４ 第２の保護剤
９ 第１の特異的結合部位２１および第２の特異的結合部位２２のいずれもが修飾されていないタンパク質
１０ 第１カラム
１１ 第２カラム
２１ 第１の特異的結合部位
２２ 第２の特異的結合部位
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質を修飾物質により修飾する方法であって、
前記タンパク質は、第１の特異的結合部位および第２の特異的結合部位を有しており、
前記方法は、以下の工程を順に有する：
前記第１の特異的結合部位に特異的に結合する第１の保護剤に、前記タンパク質を接触させる第１工程、
前記タンパク質に、前記修飾物質を供給する第２工程、
前記第１の保護剤と第１の特異的結合部位とを解離させる第３工程、
前記第２の特異的結合部位に特異的に結合する第２の保護剤に、前記第１〜３工程を順に経たタンパク質を接触させると共に、前記修飾物質によって前記第２の特異的結合部位が不活性化している前記タンパク質を除去する第４工程、および
前記第２の保護剤と第２の特異的結合部位とを解離させる第５工程。
【請求項２】
前記タンパク質が抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１の特異的結合部位がＦｃ領域であり、前記第２の特異的結合部位がＦａｂ領域である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の保護剤がプロテインＡまたはプロテインＧである、請求項１に記載の方法。
【請求項１】
タンパク質を修飾物質により修飾する方法であって、
前記タンパク質は、第１の特異的結合部位および第２の特異的結合部位を有しており、
前記方法は、以下の工程を順に有する：
前記第１の特異的結合部位に特異的に結合する第１の保護剤に、前記タンパク質を接触させる第１工程、
前記タンパク質に、前記修飾物質を供給する第２工程、
前記第１の保護剤と第１の特異的結合部位とを解離させる第３工程、
前記第２の特異的結合部位に特異的に結合する第２の保護剤に、前記第１〜３工程を順に経たタンパク質を接触させると共に、前記修飾物質によって前記第２の特異的結合部位が不活性化している前記タンパク質を除去する第４工程、および
前記第２の保護剤と第２の特異的結合部位とを解離させる第５工程。
【請求項２】
前記タンパク質が抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１の特異的結合部位がＦｃ領域であり、前記第２の特異的結合部位がＦａｂ領域である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の保護剤がプロテインＡまたはプロテインＧである、請求項１に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１０−２２９０４４（Ｐ２０１０−２２９０４４Ａ）
【公開日】平成２２年１０月１４日（２０１０．１０．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−７５５４０（Ｐ２００９−７５５４０）
【出願日】平成２１年３月２６日（２００９．３．２６）
【出願人】（０００００５８２１）パナソニック株式会社 (73,050)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１０月１４日（２０１０．１０．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月２６日（２００９．３．２６）
【出願人】（０００００５８２１）パナソニック株式会社 (73,050)
【Ｆターム（参考）】
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