タンパク質を単離および／または精製する方法
本発明は、生物学的活性があるタンパク質、好ましくはＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−α類似体を単離および／または精製する方法に関する。本発明の方法は、９８％を超える純度を有するタンパク質、好ましくはＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−α類似体の高収率の生成をもたらす。記載する方法は、タンパク質、好ましくはＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−α類似体の工業生産に特に適している。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非常に純粋な形でタンパク質を単離および／または精製する方法に関する。このことは、特定の順序の精製ステップで、特定のクロマトグラフィー用担体を使用することによって達成される。本発明の方法は広範囲のタンパク質、好ましくは腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）およびＴＮＦ−α類似体に適用することができる。
【背景技術】
【０００２】
医学界では、非常に純粋な形のタンパク質を提供することが必要とされている。したがって、低レベルの不純物を有する充分に精製されたタンパク質を提供することは、今日の医薬品産業にとって重要である。１つのこのような方法を本発明において記載する。さらに、本発明の方法は非常に経済的で効率がよく、タンパク質、好ましくはＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−α類似体の工業生産に使用することができる。ヒトＴＮＦ−αは、サイトカインのファミリーに属するタンパク質である。ヒトＴＮＦ−αは、細胞免疫応答と関係がある因子のカスケードにおける必須要素であり、種々の急性感染症および慢性の免疫または炎症疾患の病因と関係がある。一般に、ヒトＴＮＦ−αは、健康な生物と不健康な生物の両方において多面発現性活性を有する。ＴＮＦ−αは広範囲の抗腫瘍効果を示し、局所療法の抗癌剤として医学界において使用されている。全身使用により副作用を引き起こすその毒性のために、より少ない副作用を有し、抗腫瘍活性が保存またはさらに増大した多くのＴＮＦ−α類似体が設計および調製されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は、タンパク質、好ましくはＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−α類似体を単離および／または精製するための非常に効率の良い方法を提供すること、および生物学的活性があるタンパク質、好ましくは精製された生物学的に活性のある形のＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−α類似体、ならびにこれらを含む医薬組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明によれば、高純度のタンパク質、好ましくはＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−α類似体は、親和性クロマトグラフィーステップを含む単離および／または精製法を使用することによって、得られることが分かった。前記親和性クロマトグラフィーは、グリコサミノグリカン、特にヘパリンが結合している親和性クロマトグラフィー用担体上で実施することが好ましい。このステップは高い最終純度の好ましくはＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−α類似体に必要不可欠であり、同じことがグリコサミノグリカンと結合する全てのタンパク質、例えば他の残りのタンパク質より高い親和性を有するヘパリンに当てはまると思われる。本発明の好ましい実施形態において適用される、わずか２つの追加のクロマトグラフィーステップ、好ましくはアニオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーを、高純度のタンパク質を得るために使用することができる。言い換えれば、本発明によりグリコサミノグリカンが結合している親和性クロマトグラフィー用担体を適用することによって得られる、タンパク質の既に高い純度を、追加のクロマトグラフィーステップを導入することによってさらに高めることができる。２つの追加のクロマトグラフィーステップは、グリコサミノグリカン親和性クロマトグラフィーと連続して使用することができることが好ましく、最も好ましくはアニオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーである。本発明による方法は、共有結合ＴＮＦ三量体を分離するのに特に適している。
【０００５】
タンパク質、好ましくはＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−α類似体を単離および／または精製する方法は、９８％を超える純度を有する、生物学的活性があるタンパク質、好ましくはＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−α類似体の生成をもたらす。
【０００６】
この方法は、多量のタンパク質、好ましくはＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−α類似体の生成に適しており、タンパク質、好ましくはＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−α類似体の工業生産に適している。
【０００７】
本発明は、
不純物の存在下でタンパク質を含む混合物を準備すること、および
グリコサミノグリカンが結合している親和性クロマトグラフィー用担体に前記混合物を負荷すること
を含む、タンパク質を単離および／または精製する方法を提供する。特に前記方法は、以下のステップ：
ａ．不純物の存在下でタンパク質を含む前記混合物を、グリコサミノグリカンが結合している親和性クロマトグラフィー用担体に負荷するステップ、
ｂ．グリコサミノグリカンが結合している親和性クロマトグラフィー用担体に、タンパク質を選択的に結合させるステップ、および
ｃ．グリコサミノグリカンが結合している親和性クロマトグラフィー用担体からタンパク質を溶出させて、タンパク質を提供するステップを含む。
【０００８】
本発明の好ましい実施形態において、負荷の前に、タンパク質混合物を酸性化して５．５〜７．５の範囲のｐＨ、好ましくは約６．０のｐＨを得る。本発明の他の実施形態は、親和性クロマトグラフィーの前または後に実施することができ、アニオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィーおよび親和性クロマトグラフィーからなる群から選択される１つまたは複数のクロマトグラフィーステップをさらに含む、本明細書で前に記載した方法である。より好ましいのは、以下のクロマトグラフィーステップ：
ａ．アニオン交換クロマトグラフィー、および
ｂ．グリコサミノグリカンが結合した親和性クロマトグラフィー用担体を用いる親和性クロマトグラフィー、および
ｃ．サイズ排除クロマトグラフィー
を含む、本明細書で前に言及した方法である。
【０００９】
グリコサミノグリカンはヘパラン硫酸およびヘパリンからなる群から選択されることが好ましく、ヘパリンが使用されることがより好ましい。親和性クロマトグラフィーは、ヘパリンＳｅｐｈａｒｏｓｅ担体上で実施することが最も好ましい。アニオン交換クロマトグラフィーは、ＤＥＡＥ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ担体上で実施することが好ましい。サイズ排除クロマトグラフィーは、特にＳｕｐｅｒｏｓｅ１２上で実施する。
【００１０】
本発明内において、タンパク質はタンパク質構造中に１つまたは複数のアミノ酸領域（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）ＸＹＺ（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）を含むタンパク質、および１つまたは複数のアミノ酸配列領域（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）ＸＹＺ（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）が導入されたタンパク質からなる群から選択されることが好ましく、「（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）」がリシンまたはアルギニンを指し、Ｘ、ＹおよびＺが、全ての可能な組合せで使用することができるＳｅｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、ＧｌｎおよびＡｓｎを含む群から選択される、小さな、柔軟性のある、極性および／または荷電アミノ酸を指し、および：
特に、本明細書で前に記載したタンパク質は、タンパク質構造中に１つまたは複数のアミノ酸領域（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）ＸＹＺ（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）を生来含む。
【００１１】
１つまたは複数のアミノ酸領域（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）ＸＹＺ（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）をタンパク質構造中に導入されている。
【００１２】
タンパク質はＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−α類似体を含む群から選択される。
【００１３】
本発明内で好ましいのは、
以下のクロマトグラフィーステップ：
ａ．アニオン交換クロマトグラフィー、および
ｂ．グリコサミノグリカンが結合した親和性クロマトグラフィー用担体を用いる親和性クロマトグラフィー、および
ｃ．サイズ排除クロマトグラフィー
を含む本明細書で前に記載した方法である。
【００１４】
特に好ましいのは、選択するグリコサミノグリカンがヘパリンである、本明細書で前に記載した方法である。最も好ましいのは、
クロマトグラフィーステップ：
ａ．アニオン交換クロマトグラフィー、および
ｂ．グリコサミノグリカンが結合した親和性クロマトグラフィー用担体を用いる親和性クロマトグラフィー、および
ｃ．サイズ排除クロマトグラフィー
を含み、
タンパク質がＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−α類似体からなる群から選択され、グリコサミノグリカンがヘパリンである、本明細書で前に記載した方法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明は、グリコサミノグリカン、好ましくはヘパリンが結合している親和性クロマトグラフィー用担体上で実施することが好ましい親和性クロマトグラフィーを含む、タンパク質を単離および／または精製する方法に関する。さらに本発明の方法は、特定の順序のプレクロマトグラフィーおよび精製ステップを含む。
【００１６】
本発明の方法は、グリコサミノグリカン、特にヘパリンが結合している親和性クロマトグラフィー用担体とのタンパク質の有効な結合または高い親和性を可能にする１つまたは複数のアミノ酸領域を含む全てのタンパク質に使用することができる。このアミノ酸領域は領域（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）ＸＹＺ（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）であることが好ましい。したがって、本発明の方法は、それらのタンパク質構造中に１つまたは複数のアミノ酸領域（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）ＸＹＺ（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）を含むタンパク質に適用することができる。タンパク質は、それらのタンパク質構造中に１つまたは複数のアミノ酸領域（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）ＸＹＺ（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）を生来含むことができる。さらに本発明の方法は、１つまたは複数のアミノ酸領域（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）ＸＹＺ（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）を導入されているタンパク質、特に表面上に塩基性アミノ酸残基を既に有しているタンパク質に適用することができる。アミノ酸領域のこのような導入は、例えば変異誘発によって、特にアミノ酸置換、添加および／またはアミノ酸挿入によって実施することができる。本発明の方法はＴＮＦリガンドファミリーのメンバー、特にＴＮＦ−α、ＴＮＦ−α類似体およびＴＮＦ−β（リンホトキシン）に適用することが好ましい。タンパク質は、ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−α類似体からなる群から選択されることが最も好ましい。
【００１７】
本明細書で使用する用語「（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）」は、アミノ酸配列中のリシンまたはアルギニンのいずれかの使用を指す。したがって、アミノ酸領域（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）ＸＹＺ（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）は、アミノ酸領域ＡｒｇＸＹＺＡｒｇ、ＡｒｇＸＹＺＬｙｓ、ＬｙｓＸＹＺＬｙｓおよびＬｙｓＸＹＺＡｒｇからなる群から選択される。本明細書で使用する配列「ＸＹＺ」中において、Ｘ、ＹおよびＺは、全ての可能な組合せで使用することができるＳｅｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、ＧｌｎおよびＡｓｎを含む群から選択される、小さな、柔軟性のある、極性および／または荷電アミノ酸を指す。本発明の方法によって単離および／または精製されるタンパク質の、アミノ酸配列中に含まれる好ましいアミノ酸領域は、ＡｒｇＳｅｒＳｅｒＳｅｒＡｒｇおよびＡｒｇＧｌｎＨｉｓＰｒｏＬｙｓである。最も好ましいアミノ酸領域は、ＡｒｇＳｅｒＳｅｒＳｅｒＡｒｇである。
【００１８】
本明細書で使用する用語「ＴＮＦ−α」は、原型アミノ酸配列を有するヒトＴＮＦ−αのポリペプチドを指す。生物学的活性があるＴＮＦ−αは、３つの等しいＮ末端アミノ酸領域ＡｒｇＳｅｒＳｅｒＳｅｒＡｒｇを有する小型の三量体の構造を有する。
【００１９】
本明細書で使用する用語「共有結合三量体」は、少なくとも２つのサブユニットを含み、共有結合しており、サブユニット間の結合がジスルフィド結合ではない、三量体形のＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−α類似体を指す。この用語は、用語「非還元性三量体」と交換可能である。
【００２０】
本明細書で使用する用語「ＴＮＦ−α類似体」は、幾つかの変異、欠失、および挿入を有する、あるいは一般にＴＮＦ−αのアミノ酸配列の任意の変化を有するポリペプチドを指す。
【００２１】
本明細書で使用する用語「ＬＫ−８０５」は、変異Ｇｌｕ１０７Ｌｙｓが導入されているＴＮＦ−α類似体を指す。ＬＫ−８０５は、従来技術のＮｏｖａｋｏｖｉｅ ＳらＣｙｔｏｋｉｎｅ．１９９７ ９（８）：５９７〜８０４中に記載された。
【００２２】
本明細書で使用する用語「溶出」は、クロマトグラフィーカラムからの吸着物質の洗浄または抽出を指す。
【００２３】
本明細書で使用する用語「溶出液」は、クロマトグラフィーカラムからの洗浄または抽出によって得られる溶液を指す。
【００２４】
本明細書で使用する用語「不純物」は、タンパク質、好ましくはＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−α類似体の生物学的活性がある分子とは異なる物質、したがって分子に生物学的活性がない物質を指す。不純物は、タンパク質、ＤＮＡ、（リポ）多糖などの、他の宿主細胞物質、およびタンパク質、好ましくはＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−α類似体の調製および処理において使用されている添加剤なども含む可能性がある。用語不純物は、ＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−α類似体の共有結合三量体も含む。
【００２５】
本明細書に示す不純物は、この不純物と同じ濃度範囲内の検量線を使用し、参照物質としてＴＮＦを使用する、クーマシー染色したドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）ゲルの濃度分析を指す。
【００２６】
本発明のタンパク質を単離および／または精製する方法は、
不純物の存在下でタンパク質を含む混合物を準備すること、およびグリコサミノグリカンが結合した親和性クロマトグラフィー用担体に前記混合物を負荷することを含むことによって特に定義される。
【００２７】
グリコサミノグリカンはヘパリンおよびヘパラン硫酸からなる群から選択される。本発明の好ましい実施形態では、ヘパリンが結合した親和性クロマトグラフィー用担体を使用する。
【００２８】
本発明の方法は、以下のステップ：
不純物の存在下でタンパク質を含む混合物を、グリコサミノグリカンが結合した親和性クロマトグラフィー用担体に負荷するステップ、
グリコサミノグリカンが結合した親和性クロマトグラフィー用担体に、タンパク質を選択的に結合させるステップ、および
グリコサミノグリカンが結合した担体からタンパク質を溶出させて、タンパク質を提供するステップを含むことが好ましい。
【００２９】
本発明の好ましい実施形態では、グリコサミノグリカンはヘパリンである。
【００３０】
好ましい実施形態では本発明は、ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−α類似体を単離および／または精製する方法に関するものであり、不純物の存在下でタンパク質を含む混合物を準備すること、およびグリコサミノグリカンが結合した親和性クロマトグラフィー用担体に前記混合物を負荷することを含むことによって特に定義される。
【００３１】
特に、好ましい実施形態の方法は、以下のステップ：
不純物の存在下でＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−α類似体を含む混合物を、ヘパリンが結合した親和性クロマトグラフィー用担体に負荷するステップ、
ヘパリンが結合した親和性クロマトグラフィー用担体に、タンパク質を選択的に結合させるステップ、および
ヘパリンが結合した親和性クロマトグラフィー用担体からタンパク質を溶出させて、タンパク質を提供するステップを含む。
【００３２】
本発明のタンパク質、特にＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−α類似体を単離および／または精製する方法は、親和性クロマトグラフィー以外に、親和性クロマトグラフィーの前または後に実施することができる、アニオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィーおよび親和性クロマトグラフィーからなる群から選択される１つまたは複数のクロマトグラフィーステップをさらに含むことができる。この精製ステップは、異なる組合せおよび／または異なる順序で適用することができる。
【００３３】
本発明の好ましい実施形態において、この方法はアニオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーをさらに含み、アニオン交換クロマトグラフィーは親和性クロマトグラフィーの前に実施することが好ましく、サイズ排除クロマトグラフィーは親和性クロマトグラフィーの後で実施する。
【００３４】
本発明の好ましい実施形態において、タンパク質、特にＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−α類似体を単離および／または精製する方法は、
以下のクロマトグラフィーステップ：
ａ．アニオン交換クロマトグラフィー、および
ｂ．グリコサミノグリカンが結合した親和性クロマトグラフィー用担体を用いる親和性クロマトグラフィー、および
ｃ．サイズ排除クロマトグラフィー
を含む。
【００３５】
グリコサミノグリカンは、ヘパラン硫酸およびヘパリンからなる群から選択されることが好ましい。グリコサミノグリカンはヘパリンであることが最も好ましい。
【００３６】
クロマトグラフィーステップａ．、ｂ．およびｃ．は、ａ．、ｂ．およびｃ．の順序で実施することが好ましいが、この順序は異なってもよい。
【００３７】
本発明の方法は医学分野の臨床用途に適した、タンパク質、好ましくはＴＮＦ−αおよび／またはＴＮＦ−α類似体の生成をもたらす。
【００３８】
本発明の単離および／または精製する方法によって得られる、生物学的活性があるタンパク質、特にＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−α類似体は、治療有効量の生物学的活性があるタンパク質、好ましくはＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−α類似体、および薬剤として許容可能な補助物質を含む医薬組成物の調製に適している。
【００３９】
本発明の方法によって、短い単離および／または精製法において得られる活性形のタンパク質、好ましくはＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−α類似体を保つ能力は、生物学的活性があるタンパク質、好ましくはＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−α類似体、およびこれを含む医薬組成物の高い収率だけではなく、高い純度および有効性にも貢献する。
【００４０】
本明細書で使用する用語「治療有効量」は、生物学的活性があるタンパク質、好ましくはＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−α類似体の治療効果を有する、生物学的活性があるタンパク質、好ましくはＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−α類似体の量を指す。
【００４１】
適切な薬剤として許容可能な補助物質には、タンパク質、特にＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−α類似体、療法において有用な適切な希釈剤、アジュバントおよび／または担体がある。
【００４２】
本発明の方法、特に追加のアニオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーのステップの実施によって得られる、生物学的活性があるＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−α類似体は、癌の治療、および癌を治療するための医薬品の調製に使用することができる。
【００４３】
前記タンパク質は、ＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−α類似体の指標である全ての他の疾患を治療するための医薬品の調製にも使用することができる。
【００４４】
したがって、本発明の方法によって得られる純粋で生物学的活性があるＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−α類似体を含む医薬組成物は、当業者に知られている方法で、前述の疾患を治療するのに有効な治療量で患者に投与することができる。
【００４５】
本発明のタンパク質を単離および／または精製する方法を実施するのに好ましい実施形態を以下に記載する。
【００４６】
本発明のタンパク質を単離および／または精製する方法は、プレクロマトグラフィーステップで始めることが好ましい。プレクロマトグラフィーステップは、それ自体が知られている発酵生産慣習に従う、宿主細胞の形質転換、および宿主細胞、すなわち発現菌株の培養を含む。この菌株は一般に栄養培地上で単コロニーから始めて増殖させるが、低温保存した細胞懸濁液（細胞塊）を利用することも可能である。この菌株は一般に多段階の方法で培養して、さらに使用するのに充分なバイオマスを得る。適切な宿主細胞は、例えば細菌細胞であってよい。本発明に従い利用する細菌宿主細胞は、例えばエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）種などのグラム陰性菌（例えばエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ））、または他のグラム陰性菌、例えばシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種（シュードモナス・エルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）など）、またはカウロバクター（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ）種（カウロバクター・クレセンツス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）など）、またはグラム陽性菌、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種など（特にバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）であってよい。エシェリヒア・コリが宿主細胞として特に好ましい。プレクロマトグラフィーステップは細胞の破壊、硫酸アンモニウム（ＡＳ）またはポリエチレングリコールを用いたタンパク質分画の清澄なホモジェネートおよび沈殿からの核酸の沈殿を含むことができる。
【００４７】
本発明の方法は、アニオン交換クロマトグラフィーまたはカチオン交換クロマトグラフィーであってよい、第１のクロマトグラフィーステップにより続ける。最も好ましくは、アニオン交換クロマトグラフィーを適用する。
【００４８】
本発明の方法は、クロマトグラフィー用担体への、不純物の存在下でタンパク質を含む混合物の負荷で始める。この混合物（負荷溶液）は、細胞の破壊後に直接得られる上清、清澄ホモジェネートからの核酸の沈殿後の上清、タンパク質沈殿が適切なバッファーに溶けた溶液、８Ｍの尿素または６ＭのＧｎｄＨＣｌなどの強力な変性剤の存在下の封入体溶液または懸濁液（または混合物）、および変性濃度の変性剤（例えば１％サルコシル、２％サルコシルまたは１％ドデシル硫酸ナトリウム）の存在下の溶液、例えば変性剤／界面活性剤の希釈、透析、限外濾過または除去による事前復元に施した溶液からなる群から選択される。酵母、真菌または哺乳動物細胞系などの分泌系中での発現の場合、上清または濃縮上清または培養培地を負荷溶液として使用することができる。アニオン交換／カチオン交換カラムからの第１の溶出から生成した溶出液は、アニオン交換／カチオン交換カラムに再度負荷するための負荷溶液として使用することもできる。ヘパリンＳｅｐｈａｒｏｓｅ親和性クロマトグラフィーから生成した溶出液を、アニオン交換／カチオン交換カラムに負荷することもできる。
【００４９】
カラムに負荷する前に、負荷溶液として使用する不純物の存在下でタンパク質を含む混合物は、好ましくは脱塩して、結合に干渉する可能性がある塩（残りの硫酸アンモニウムまたは酢酸アンモニウムまたはいずれかの他の塩）を除去する。負荷溶液のｐＨは、使用するイオン交換クロマトグラフィー（アニオンまたはカチオン）の型に依存する。アニオン交換クロマトグラフィー用の負荷溶液の好ましいｐＨは、（ｐＩが約６．８である）ＴＮＦ−αと同等なｐＩ値を有するＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−α類似体の場合７．５〜８．５の範囲であり、一方ＴＮＦ−αより高いｐＩ値を有するＴＮＦ−α類似体の場合、８．５〜９．５の範囲のｐＨが好ましい。負荷溶液のｐＨは、例えばＮａＯＨ溶液、またはリン酸溶液などの低濃度の酸溶液、または高ｐＨまたは低ｐＨバッファー溶液を加えることによって調整することが好ましい。バッファー交換を実施して、適切なｐＨを得ることもできる。
【００５０】
好ましくはアニオン交換クロマトグラフィーである、第１のクロマトグラフィーステップは、大部分のＥ．コリタンパク質および他の可溶性要素を除去するために使用する。第１のクロマトグラフィーステップは、宿主細胞由来の核酸、リポ多糖およびタンパク質の捕捉ステップとして、タンパク質、特にＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−α類似体のイオン化異性体、および変更したｐＩ値を有する変化（損傷）形のタンパク質、特にＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−α類似体を除去するために使用することもできる。カラムに負荷したサンプル中の標的タンパク質の量に関して、このステップの収率は約９０％である。
【００５１】
さまざまなアニオン交換クロマトグラフィー用担体を使用することができ、ＤＥＡＥ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−６Ｂ、ＤＥＡＥ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ、Ｑ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ、Ｑ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰ、Ｑ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＸＬ、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌ、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ、ＱＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ、ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ、ＱＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ、Ｍｉｎｉ−Ｑ、Ｍｏｎｏ−Ｑ、Ｍｏｎｏ−Ｐ、Ｓｏｕｒｃｅ１５Ｑ、Ｓｏｕｒｃｅ３０Ｑ、ＡＮＸ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅなどからなる群から選択することができる。アニオン交換クロマトグラフィーは、ＤＥＡＥ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ担体上で実施することが好ましい。
【００５２】
カチオン交換クロマトグラフィー使用の場合、さまざまなカチオン交換クロマトグラフィー用担体を使用することができ、ＣＭ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−６Ｂ、ＣＭ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ、ＳＰ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ、ＳＰ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰ、ＳＰ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＸＬ、ＣＭ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ、ＣＭ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ、ＣＭ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ、ＳＰ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ、ＭｉｎｉＳ、ＭｏｎｏＳ、Ｓｏｕｒｃｅ１５Ｓ、Ｓｏｕｒｃｅ３０Ｓ、ＴＳＫゲルＳＰ−５ＰＷ、ＴＳＫゲルＳＰ−５ＰＷ−Ｈｒ、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ Ｈｉｇｈ Ｓ担体、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ Ｓ担体、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ ＣＭ担体からなる群から選択することができる。
【００５３】
アニオン交換クロマトグラフィー用の負荷溶液中の塩濃度は、タンパク質とカラムの結合を可能にするために低いことが好ましい。このことは、バッファー交換に適した方法によって達成される。タンパク質とカラムの結合は、溶液のｐＨにも依存する。７．５〜８．５のｐＨ範囲を有するさまざまなバッファーを、負荷およびタンパク質、特にＴＮＦ−αと同等なｐＩ値を有するＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−α類似体とアニオン交換クロマトグラフィー用担体の結合用に使用することができ、さまざまなバッファーはリン酸、トリス／ＨＣｌ、酢酸、クエン酸、トリス／酢酸、コハク酸、マロン酸、２−（Ｎ−モルホリノエタンスルホン酸）（ＭＥＳ）および他のバッファーからなる群から選択することができる。リン酸バッファーを使用するのが好ましい。リン酸バッファーは１０〜４０ｍＭの濃度範囲、好ましくは１０〜２０ｍＭの濃度範囲で使用することができる。
【００５４】
ＴＮＦ−αより高いｐＩ値を有するＴＮＦ−α類似体を単離および／または精製する場合、８．５〜９．５のｐＨ範囲を有するさまざまなバッファーを負荷、および大部分のＥ．コリタンパク質と担体の結合用に使用することができる。このｐＨは、標的タンパク質と担体の結合を妨げる。
【００５５】
アニオン交換クロマトグラフィーにおいては、カラム負荷の後にに、カラムの洗浄およびカラムからのタンパク質の溶出が続く。バッファー溶液中に高濃度の塩を加えた後の増大したイオン強度のために、溶出が起こる。ステップ勾配、直線勾配、およびステップ勾配と直線勾配の適切な組合せを、溶出用に使用することができる。ステップ勾配と直線勾配の適切な組合せを使用することが好ましい。洗浄および溶出用に使用することができる溶出バッファーは、リン酸、トリス／ＨＣｌ、酢酸、クエン酸、トリス／酢酸、コハク酸、マロン酸、ＭＥＳ、およびＮａＣｌまたはＫＣｌなどの塩を加えた他の適切なバッファーからなる群から選択することができる。溶出が得られるイオン強度および塩濃度は、バッファー溶液のｐＨに依存する。ＴＮＦ−αと同等なｐＩ値を有するＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−α類似体を溶出させるために、５０〜１５０ｍＭの範囲の値の塩濃度を使用することが好ましい。バッファーのｐＨが高くなるほど、カラムからのタンパク質の溶出には低いイオン強度が必要とされる。
【００５６】
溶出液において、ＴＮＦ−αと同等なｐＩ値（約６．８）を有する三量体、生物学的活性があるＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−α類似体が、８０％を超える純度で得られる。ＴＮＦ−αより高いｐＩ値を有するＴＮＦ−α類似体の場合、ＴＮＦ−α類似体は、８０％を超える純度で、三量体の、生物学的活性がある形で流出分画中において得られる。
【００５７】
本発明の方法の第２のクロマトグラフィーステップは、グリコサミノグリカンが結合している親和性クロマトグラフィー用担体を好ましくは含む、親和性クロマトグラフィーであることが好ましい。グリコサミノグリカンはヘパリンおよびヘパラン硫酸からなる群から選択される。本発明の好ましい実施形態においては、ヘパリンは親和性クロマトグラフィーの親和性クロマトグラフィー用担体と結合させる。
【００５８】
このステップは、本発明の方法によって得られるタンパク質の最終純度に不可欠なステップである。このステップにおいては、タンパク質、好ましくはＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−α類似体は、他の残留Ｅ．コリタンパク質および他の不純物より、特異的、すなわちより高い親和性で、親和性クロマトグラフィー用担体と結合する。
【００５９】
親和性クロマトグラフィー用担体はヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６ＦＦ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＡＦ−ヘパリン−６５０Ｍなどからなる群から選択される。親和性クロマトグラフィー用担体は、ヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ担体であることが好ましい。
【００６０】
第２のクロマトグラフィーステップ用の負荷溶液として使用される、不純物の存在下でタンパク質を含む混合物は、ＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−α類似体を含むアニオンクロマトグラフィー溶出液、またはＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−α類似体を含むアニオンクロマトグラフィーの流出分画であることが好ましい。
【００６１】
このステップは、有意に高いタンパク質結合能を与える低いｐＨにおいて行うことが好ましい。したがって、負荷の前に、混合物を酸性化して、ｐＨ５．５〜７．５を得ることが好ましい。混合物のｐＨは約ｐＨ６．０であることが好ましい。好ましくはタンパク質の変性を引き起こさない１００ｍＭのＨ３ＰＯ４または他のいずれかの希釈酸を使用することによって、混合物を酸性化する。この段階において、（ＴＮＦ−αと比較して）同等または高いｐＩ値を有するＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−α類似体の結合能は、ｐＨ６．０を有するバッファー中でサンプルを適用することによって本質的に増大させることができる。５．５〜７．５のｐＨ範囲、好ましくは約ｐＨ６．０を有するさまざまなバッファーを、負荷および（ＴＮＦ−αと比較して）同等または高いｐＩ値を有するＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−α類似体と親和性クロマトグラフィー用担体の結合用に使用することができ、さまざまなバッファーはリン酸、トリス／ＨＣｌ、酢酸、クエン酸、トリス／酢酸、コハク酸、マロン酸、２−（Ｎ−モルホリノエタンスルホン酸）（ＭＥＳ）および他のバッファーからなる群から選択することができる。リン酸バッファーを使用するのが好ましい。リン酸バッファーは１０〜４０ｍＭの濃度範囲、好ましくは１０〜２０ｍＭの濃度範囲で使用することができる。
【００６２】
担体との結合後、カラムの洗浄およびカラムからのタンパク質の溶出によって、この方法を続ける。適切な溶出勾配を使用して、残留Ｅ．コリタンパク質を最初に溶出させ、次にＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−α類似体を溶出させる最大の分離を得ることによって、溶出を実施することができる。ステップ勾配、直線勾配、およびステップ勾配と直線勾配の適切な組合せを使用することができる。ステップ勾配と直線勾配の適切な組合せを使用することが好ましい。
【００６３】
洗浄および溶出用に使用することができる溶出バッファーは、リン酸、トリス／ＨＣｌ、酢酸、クエン酸、トリス／酢酸、コハク酸、マロン酸、ＭＥＳ、およびＮａＣｌまたはＫＣｌなどの塩を加えた他の適切なバッファーからなる群から選択することができる。０〜５００ｍＭのＮａＣｌの直線勾配を異なる勾配で使用して、最大の分離を得ることが好ましい。溶出が得られるイオン強度および塩濃度は、バッファー溶液のｐＨに依存する。ＴＮＦ−αと同等なｐＩ値を有するＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−α類似体を溶出させるために、１００〜１５０ｍＭの範囲の値の塩濃度を使用することができ、ＴＮＦ−αより高いｐＩ値を有するＴＮＦ−α類似体に関しては、１５０〜２５０ｍＭの範囲の塩濃度を使用することができる。バッファーのｐＨが高くなるほど、カラムからのタンパク質の溶出には低いイオン強度が必要とされる。
【００６４】
溶出液において、生物学的活性があるＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−α類似体が、９８％を超える純度で得られる。
【００６５】
本発明の方法の第３のクロマトグラフィーステップは、サイズ排除クロマトグラフィーであることが好ましい。サイズ排除クロマトグラフィーは、微量の二量体および高度凝集形のタンパク質、特にＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−α類似体を除去するのに特に有効である。
【００６６】
望むならば、親和性カラムから得られた溶出液を、如何なる他の中間ステップも必要とせずにゲル濾過カラムに直接負荷することができる。サイズ排除クロマトグラフィーカラムに負荷する前に、親和性カラムから得られた溶出液を濃縮して、負荷サンプルの体積を減少させることが好ましい。異なる方法、すなわち限外濾過、硫酸アンモニウム沈殿、次に小体積の適切なバッファー中での分離、または他のいずれかの適切な方法を使用することができる。硫酸アンモニウム沈殿を使用することが好ましい。
【００６７】
さまざまなサイズ排除クロマトグラフィー用担体を使用することができ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００ＨＲ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−１００ＨＲ、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−７５、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１５０、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６ＢおよびＣＬ−６Ｂ、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００、ＴＳＫゲルＧ−２５００ＰＷ、ＴＳＫゲルＧ−３０００ＰＷ、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ−６０、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ−１００、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ−５０、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ−５５、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ６５などからなる群から選択することができる。サイズ排除クロマトグラフィーは、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２上で実施することが好ましい。
【００６８】
サイズ排除クロマトグラフィー用の広いｐＨ範囲の負荷溶液を使用することができる。溶液の負荷およびタンパク質の溶出は、同じバッファーを使用することによって実施することができる。さまざまなバッファーを使用することができ、バッファーは７．０〜８．０の範囲にｐＨを保つことができるリン酸、トリスおよび他の適切なバッファーからなる群から選択することができる。７．０〜８．０のｐＨを有するリン酸バッファーを使用することができる。負荷用には、２０〜１００ｍＭの濃度範囲、より好ましくは３０ｍＭと５０ｍＭの間の濃度範囲で、リン酸バッファーを使用することが好ましい。サイズ排除クロマトグラフィーバッファー中の塩濃度は、１００〜５００ｍＭ、好ましくは約２００ｍＭの範囲であってよい。２００ｍＭのＮａＣｌを含むＰＢＳバッファー（Ｍａｎｉａｔｉｓ）を使用することが好ましい。溶出液において、生物学的活性がある、適切にフォールディングされたタンパク質、特にＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−α類似体が、９８％を超える純度および完全な生物活性で得られる。
【００６９】
以下の実施例は本発明のさまざまな実施形態を例示する目的で与え、何らかの形式で本発明を制限することは意味しない。
【実施例１】
【００７０】
ヘパリンＳｅｐｈａｒｏｓｅカラム上でのさまざまなｐＨにおけるＴＮＦαの結合能の測定
Ｐ１：１０ｍＭのＫ−リン酸、ｐＨ８．０
Ｐ２：１０ｍＭのＫ−リン酸、ｐＨ８．０、１ＭのＮａＣｌ
Ｐ３：１０ｍＭのＫ−リン酸、ｐＨ６．０
Ｐ４：１０ｍＭのＫ−リン酸、ｐＨ６．０、１ＭのＮａＣｌ
【００７１】
ｐＨ８．０での結合能
カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＨＲ１０／１０、Ｖｍａｔｒｉｘ＝８．３０ｍｌ）を、負荷前に負荷剤バッファーＰ１を用いて平衡状態にする。カラムに４０ｍｌのサンプルを負荷する（ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ溶出液、ｐＨ８．０；ＤＥＡＥ−溶出液は実施例２に記載するのと同様に調製する。）。カラムに負荷したタンパク質の合計量は９．５ｍｇであり、ＴＮＦ−αの量は９ｍｇである。結合タンパク質はバッファーＰ２を用いて溶出させる。流量は２ｍｌ／分であり、２ｍｌの分画を回収し、全プロセスを室温（２２℃）で実施する。流出分画および結合分画はＴＮＦ−αを含む。結合分画中のＴＮＦ−αの量は６，６ｍｇであり、流出分画中の量は２．２ｍｇである。ｐＨ８．０においてヘパリンＳｅｐｈａｒｏｓｅ１ｍＬ当たり約０．８ｍｇのＴＮＦ−αが結合する（これらの条件での最大能力）。
【００７２】
ｐＨ６．０での結合能
カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＨＲ１０／１０、Ｖｍａｔｒｉｘ＝８．３０ｍｌ）を、負荷前に負荷剤バッファーＰ３を用いて平衡状態にする。カラムに７ｍｌのサンプルを負荷する（ＤＥＡＥ−溶出液、ｐＨ６．０に酸性化；ＤＥＡＥ−溶出液は実施例２に記載するのと同様に調製する）。カラムに負荷したタンパク質の合計量は１３．５ｍｇであり、ＴＮＦ−αの量は１２．５ｍｇである。結合タンパク質はバッファーＰ４を用いて溶出させる。流量は２ｍｌ／分であり、２ｍｌの分画を回収し、全プロセスを室温（２２℃）で実施する。流出分画はＴＮＦ−αを含まない。結合分画中のＴＮＦ−αの量は１２ｍｇである。ｐＨ６．０においてヘパリンＳｅｐｈａｒｏｓｅ１ｍＬ当たり少なくとも１．４ｍｇのＴＮＦ−αが結合する（これらの条件での最小能力）。
【００７３】
ヘパリンＳｅｐｈａｒｏｓｅへのＴＮＦ−αの結合能力は、ｐＨ８と比較してｐＨ６．０では有意に高いことが分かる。少なくとも２倍多くのＴＮＦ−αがｐＨ６では結合する。これは方法の経済性を有意に改善し、ＴＮＦ−α類似体の精製にも適用することができる。
【実施例２】
【００７４】
生物学的活性があるＴＮＦ−αの単離および／または精製
負荷サンプル（バイオマス）の調製：
以下の発現系：細菌菌株Ｅ．コリＢＬ２１（ＤＥ３）、プラスミド：Ｅ．コリ中での発現用に最適化させたＴＮＦ−αの適切に挿入された遺伝子を含むｐＣｙｄｃｌ（担体プラスミドＢＢＧ４、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して、出発物質を調製する。発現プラスミドｐＣｙｄｃｌは、抑制遺伝子ｃｌ８５７を部分的に欠失させることによって市販のプラスミドｐＣＹＴＥＸＰ１（Ｍｅｄａｃ、Ｈａｍｂｕｒｇ）から調製する。ｐＣｙｄｃｌを使用して、タンパク質の充分な蓄積をもたらす、低温での標的タンパク質の構成的発現が得られる（Ｖ．Ｍｅｎａｒｔ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、８３、Ｎｏ．２、１８１〜１９０、２００３）。３０℃において振盪フラスコ中の培養物（合計体積：２Ｌ）中で、タンパク質を発現させる。湿潤洗浄バイオマスの重量は約１７ｇ（８，５ｇ／Ｌ）である。
【００７５】
プレクロマトグラフィーステップ
細胞の破壊
バイオマスを、７０ｍｌ（約４倍体積）のバッファーＰ５０／３０（５０ｍＭのＴＲＩＳ／ＨＣｌ、３０ｍＭのＮａＣｌ）中に再懸濁させる。懸濁液はｕｌｔｒａｔｕｒａｘ ＰＴ３１００（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ）を使用して均質化する。作業圧力１０００００ｋＰａで高圧ホモジェナイザーＥｍｕｌｓｉＦｌｅｘ−Ｃ５（Ａｖｅｓｔｉｎ）を使用して、細胞を破壊する。破壊後、細胞タンパク質の固形細胞部分および不溶性部分を、１５０００ｒｐｍおよび４℃での３０分間の遠心分離によって除去する。
【００７６】
核酸の沈殿
遠心分離後の上清において、ポリエチレンイミンを用いて核酸を沈殿させる。この上清に、磁気攪拌器で混合しながら、５％のポリエチレンイミンを最終濃度０．１％までゆっくり加える。１５０００ｒｐｍおよび４℃での３０分間の遠心分離によって、沈殿を除去する。
【００７７】
可溶性タンパク質の沈殿
遠心分離後の上清において、硫酸アンモニウムを用いて可溶性タンパク質を沈殿させる。固形硫酸アンモニウムを６５％の飽和度（４３０ｇ／ｌ）まで上清にゆっくり加え、ｐＨは７．０と８．０の間の最終ｐＨに同時に調整する。硫酸アンモニウム沈殿の上清中のタンパク質の合計量は４９５ｍｇである（湿潤バイオマス１ｇ当たり約２９ｍｇのタンパク質）。硫酸アンモニウム沈殿の懸濁液は、５０ｍｇのタンパク質をそれぞれ含む等分試料に分ける。１５０００ｒｐｍおよび４℃での３０分間の遠心分離後、上清を注ぎ出し、同じ条件下において３０分間再度遠心分離し、上清の水滴は濾過紙によって完全に吸い取る。生成した硫酸アンモニウム沈殿は４℃で保存する。
【００７８】
ＴＮＦ−αの含量の測定
クーマシーブルーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの濃度分析を使用することによって、可溶性分画中のＴＮＦ−αの含量を、それぞれのプレクロマトグラフィーステップ後に測定する。細胞破壊後の上清中のＴＮＦ−αの含量は、約３５〜４５％のＴＮＦ−αである。核酸の沈殿後、ＴＮＦの含量は４０〜５０％さらに増大する。硫酸アンモニウム沈殿を調製することによって、サンプルのさらなる富化を達成する。硫酸アンモニウム沈殿の溶液中のＴＮＦ−αの含量は６０〜８０％である。
【００７９】
クロマトグラフィーステップ
クロマトグラフィー用のバッファー
Ｐ１：１０ｍＭのＫ−リン酸、ｐＨ８．０
Ｐ２：１０ｍＭのＫ−リン酸、ｐＨ８．０、１ＭのＮａＣｌ
Ｐ３：１０ｍＭのＫ−リン酸、ｐＨ６．０
Ｐ４：１０ｍＭのＫ−リン酸、ｐＨ６．０、１ＭのＮａＣｌ
Ｐ５：ＰＢＳ、ｐＨ７．４、２００ｍＭのＮａＣｌ
Ｐ６：ＰＢＳ、ｐＨ７．４、５００ｍＭのＮａＣｌ
【００８０】
ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに負荷するためのサンプルの調製
硫酸アンモニウム沈殿の等分試料（タンパク質の合計量約５０ｍｇ）を、約５ｍｌのバッファーＰ１に溶かす。サンプルはＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに負荷する前にＰＤ−１０カラムを使用して脱塩して、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅとの結合に干渉する残りの硫酸アンモニウムおよび他の塩を除去する。脱塩サンプルはバッファーＰ１を用いて１０ｍｌに希釈し、ブラッドフォード法により測定して最終濃度は５．３ｍｇ／ｍｌである。
【００８１】
第１のクロマトグラフィーステップ
アニオンクロマトグラフィー、クロマトグラフィー用担体：ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＨＲ１０／１０、Ｖｍａｔｒｉｘ＝７．８５ｍｌ）に、約５ｍｌのサンプルを２回負荷する。負荷サンプル中のタンパク質の合計量は約５０ｍｇであり、ＴＮＦ−αの量は３７，５ｍｇである。それぞれの負荷前に、開始バッファーＰ１を用いてカラムを平衡状態にする。流量は２ｍｌ／分であり、２ｍｌの分画を回収し、全プロセスを室温（１８〜２２℃）で実施する。クロマトグラムを図３中に示し、２０分と３０分の間の主要なピーク（Ｂ）の分画を集める。第１のクロマトグラフィーステップ後に集めた分画中のタンパク質の濃度は、ブラッドフォード法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ Ｍ．Ｍ．１９７６．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：２４８〜２５４）により測定して０．８ｍｇ／ｍｌであり、タンパク質の合計量は約３６ｍｇであり、ＴＮＦ−αは約３４ｍｇである（純度９４％まで）。したがって、第１のクロマトグラフィーステップの収率は９０％である。
【００８２】
サンプルの酸性化
ＴＮＦ−αを含むＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅからの溶出液は、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＹＭ１０膜を有するＡｍｉｃｏｎセル中で約２０ｍｌに濃縮する。ブラッドフォード法により測定して最終濃度は１．７ｍｇ／ｍｌであり、タンパク質の量は約３４ｍｇであり、ＴＮＦ−αは約３３ｍｇである。濃縮の収率は約９７％である。濃縮サンプルは１００ｍＭのＨ３ＰＯ４を使用してｐＨ６．０に酸性化する（酸１００μＬ／タンパク質サンプル１ｍｌ）
【００８３】
第２のクロマトグラフィーステップ
親和性クロマトグラフィー、クロマトグラフィー用担体：ヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ
カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＨＲ１０／１０、Ｖｍａｔｒｉｘ＝８．６０ｍｌ）を、それぞれの負荷前に開始バッファーＰ３を用いて平衡状態にする。約７ｍｌのサンプルを３回カラムに負荷する。カラム上に負荷するタンパク質の合計量は３４ｍｇであり、ＴＮＦ−αの量は３２ｍｇである。この型のクロマトグラフィーにおいて使用した、両方のバッファーのｐＨは６．０である。流量は２ｍｌ／分であり、２ｍｌの分画を回収し、全プロセスを室温（２２℃）で実施する。クロマトグラムを図４中に示し、２０分と３０分の間の主要なピークの分画を集める。サンプル中のタンパク質の濃度は、ブラッドフォード法によって測定する。第２のクロマトグラフィーステップ後のタンパク質の合計量は２２ｍｇであり、ＴＮＦ−αは２１．５ｍｇである（純度約９８％）。このステップの収率は約６７％であり、主な消失はクロマトグラフィーのピークをカットする際に存在して、最後のクロマトグラフィーステップの最も純粋な分画を選択する。
【００８４】
Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２上に負荷する前のサンプルの調製
サイズ排除クロマトグラフィー前に、サンプルは硫酸アンモニウム沈殿と共に濃縮し、次いで小体積のバッファーＰ５中に沈殿を溶かす。固形硫酸アンモニウムを６０％の飽和度（４３０ｇ／ｌ）まで溶液にゆっくり加える。１５０００ｒｐｍおよび４℃での６０分間の遠心分離後、上清を注ぎ出し、同じ条件下において３０分間再度遠心分離し、上清の飛沫は濾過紙によって完全に吸い取る。硫酸アンモニウム沈殿は９００μｌのバッファーＰ５中に溶かす。沈殿および溶解の収率は約７０％である。
【００８５】
第３のクロマトグラフィーステップ
サイズ排除クロマトグラフィー、クロマトグラフィー用担体：Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２
バッファーＰ５を用いて平衡状態にしたカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＨＲ１０／３０、Ｖｍａｔｒｉｘ＝２３．８ｍｌ、パッキング済み）に、約３００μｌのサンプルを３回負荷する。流量は０．２ｍｌ／分である。このクロマトグラフィーステップのクロマトグラムは図５中に示す。０．２ｍｌの分画を回収し、６６分と７４分の間の主要なピークの分画を集める。最終サンプル中のＴＮＦ−αの濃度は約２．５ｍｇ／ｍｌであり、サンプルの体積は４．８ｍｌである。適切な体積の５ＭのＮａＣｌをサンプルに加えて、０．５ＭのＮａＣｌの最終濃度を得る。サンプルはバッファーＰ６を用いて、１ｍｇ／ｍｌのＴＮＦ−αの濃度に希釈する。２８０ｎｍでの吸光度測定から計算したＴＮＦ−αの最終濃度は１．０３ｍｇ／ｍｌである。したがって、ＴＮＦ−αの合計量は１２．５ｍｇである。最後のクロマトグラフィーステップの収率は８０％である。ＴＮＦ−αの単離の全体収率は３３％（３０〜３５％）である。
【００８６】
精製タンパク質の特徴付け
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
共有結合三量体は、標準的なＳＤＳ−ＰＡＧＥで非還元性二量体として見られる。１μｇ、２μｇおよび５μｇのＴＮＦ−αを負荷してＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施する。クーマシー染色したゲル上において（図２）、５μｇの負荷では、微量の非還元性二量体が、ＴＮＦ−α単量体に属する主要バンド以外に目に見える状態である。非還元性二量体の量は１％未満である。ＴＮＦ−αの分解産物に属するバンドは、この負荷では見られない。クーマシーブルー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの濃度測定を使用することによって、最終純度を測定する。共有結合三量体の量は、以下の標準（純水ＴＮＦ）負荷：０．０５μｇ、０．１μｇ、０．２５μｇおよび０．５μｇによって作製した検量線を用いて、５μｇのサンプル負荷において非還元性二量体に属するバンドを比較することによって測定する。
【００８７】
ウエル当たり１μｇのタンパク質負荷、および高感度銀染色において、ＴＮＦ−α単量体に属する主要スポットおよび低強度の非還元性二量体以外に、目に見える状態である他のタンパク質バンドは存在しない。
【００８８】
インビトロでのＴＮＦ−αおよびその類似体の固有細胞毒性の測定−細胞を固定するための方法
固有細胞毒性活性を、ＦｌｉｃｋおよびＧｉｆｆｏｒｄ（Ｆｌｉｃｋ、Ｄ．Ａ．、Ｇｉｆｆｏｒｄ、Ｇ．Ｅ．１９８４ ６８：１６７〜１７５）の改変手順に従いＬ−９２９細胞系（マウス線維芽細胞）を使用して測定する。１００Ｉの培養培地中に２×１０４個の細胞を、マイクロタイタープレートのそれぞれのウエル中に接種し、２４時間インキュベートする（３７Ｃ、５％ＣＯ２）。インキュベーション後、（ＷＨＯ ＴＮＦ−α標準８７／６５０を使用して調製した）内ＴＮＦ−α標準およびＴＮＦ−α類似体の一連の希釈液を、２ｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤの存在下においてウエルに加える。プレートを１８〜２０時間再度インキュベートする（３７Ｃ、５％ＣＯ２）。生命力のある細胞を次いで２．５％のグルタルアルデヒドを用いて固定し、２０％メタノール中の０．５％クリスタルバイオレットを用いて染色する。プレートを乾燥させ、１００ｌの１％ＳＤＳをそれぞれのウエルに加える。室温（２５℃まで）で１０分間の振盪後、５７０ｎｍにおいて光学濃度を測定する。測定した光学濃度から、細胞濃度の自然対数を得る。ＴＮＦ−αおよびその類似体の特異的細胞毒性活性は、最大細胞毒性の５０％を生じる、すなわちタンパク質を含まない対照ウエル（陰性対照）中の細胞数に関して５０％の細胞が生存しているサンプルと、標準の希釈液とを比較することによって測定する。Ｌ−９２９細胞において測定した固有細胞毒性は３〜４×１０７ＩＵ／ｍｇである。
【実施例３】
【００８９】
ＬＫ−８０５（Ｅ１０７Ｋ）の単離および／または精製
出発物質（バイオマス）の調製
以下の発現系：細菌菌株大腸菌、ＢＬ２１（ＤＥ３）、類似体ＬＫ−８０５の適切に挿入された遺伝子を有するプラスミドｐＣｙｄｃｌを使用して、出発物質を調製する。発現プラスミドｐＣｙｄｃｌは、抑制遺伝子ｃｌ８５７を部分的に欠失させることによって市販のプラスミドｐＣＹＴＥＸＰ１（Ｍｅｄａｃ、Ｈａｍｂｕｒｇ）から調製する。ｐＣｙｄｃｌを使用して、タンパク質の充分な蓄積をもたらす、低温での標的タンパク質の構成的発現が得られる（Ｖ．Ｍｅｎａｒｔ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、８３、Ｎｏ．２、１８１〜１９０、２００３）。
【００９０】
３０℃において振盪フラスコ中の培養物（合計体積：２Ｌ）中で、タンパク質を発現させる。湿潤洗浄バイオマスの重量は１７ｇまで（８，５ｇ／Ｌ）である。
【００９１】
プレクロマトグラフィーステップ
細胞の破壊
バイオマスを、７０ｍｌ（約４倍体積）のバッファーＰ５０／３０（５０ｍＭのトリス／ＨＣｌ、３０ｍＭのＮａＣｌ）中に再懸濁させる。懸濁液はｕｌｔｒａｔｕｒａｘ ＰＴ３１００（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ）を使用して均質化する。作業圧力１０００００ｋＰａで高圧ホモジェナイザーＥｍｕｌｓｉＦｌｅｘ−Ｃ５（Ａｖｅｓｔｉｎ）を使用して、細胞を破壊する。破壊後、細胞タンパク質の固形細胞部分および不溶性部分を、１５０００ｒｐｍおよび４℃での３０分間の遠心分離によって除去する。
【００９２】
核酸の沈殿
遠心分離後の上清において、ポリエチレンイミンを用いて核酸を沈殿させる。この上清に、磁気攪拌器で混合しながら、５％のポリエチレンイミンを最終濃度０．１％までゆっくり加える。１５０００ｒｐｍおよび４℃での３０分間の遠心分離によって、沈殿を除去する。
【００９３】
可溶性タンパク質の沈殿
遠心分離後の上清において、硫酸アンモニウムを用いて可溶性タンパク質を沈殿させる。固形硫酸アンモニウムを６５％の飽和度（４３０ｇ／ｌ）まで上清にゆっくり加え、ｐＨを６．５と７．５の間の最終ｐＨに同時に調整する。硫酸アンモニウム沈殿の懸濁液中のタンパク質の合計量は５２３ｍｇである（湿潤バイオマス１ｇ当たり約３０ｍｇのタンパク質）。硫酸アンモニウム沈殿の懸濁液は、５０ｍｇのタンパク質をそれぞれ含む等分試料に分ける。１５０００ｒｐｍおよび４℃での３０分間の遠心分離後、上清を注ぎ出し、同じ条件下において３０分間再度遠心分離し、上清の飛沫は濾過紙によって完全に吸い取る。生成した硫酸アンモニウム沈殿は４℃で保存する。
【００９４】
ＬＫ−８０５の含量の測定
可溶性分画中のＬＫ−８０５の割合は、クーマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの濃度分析を使用することによって、それぞれのプレクロマトグラフィーステップ後に測定する。細胞破壊後の上清中には約５０％のＬＫ−８０５が存在し、核酸の沈殿後の上清中には、約６４％のＬＫ−８０５が存在し、核酸の除去によって標的タンパク質が消失しないことを意味する。サンプルのさらなる富化は硫酸アンモニウム沈殿を調製することによって達成され、硫酸アンモニウム沈殿の溶液中のＬＫ−８０５の割合は約６６％である。
【００９５】
クロマトグラフィーステップ
クロマトグラフィー用のバッファー
Ｐ１ａ：１０ｍＭのＫ−リン酸、ｐＨ９．０
Ｐ２ａ：１０ｍＭのＫ−リン酸、ｐＨ９．０、１ＭのＮａＣｌ
Ｐ３：１０ｍＭのＫ−リン酸、ｐＨ６．０
Ｐ４：１０ｍＭのＫ−リン酸、ｐＨ６．０、１ＭのＮａＣｌ
ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに負荷するためのサンプルの調製
【００９６】
硫酸アンモニウム沈殿の等分試料（タンパク質の合計量約１００ｍｇ）を、１０ｍｌのバッファーＰ１ａに溶かす。ＹＭ１０膜を使用して５０ｍｌのＡｍｉｃｏｎセル（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）中で脱塩することによって、硫酸アンモニウムを除去する。脱塩サンプル中のタンパク質の濃度は、ブラッドフォード法により測定して７．５５ｍｇ／ｍｌである。２つの１８ｍｌ体積の脱塩サンプルをカラムに負荷する。
【００９７】
第１のクロマトグラフィーステップ
アニオンクロマトグラフィー、クロマトグラフィー用担体：ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＨＲ１０／１０、Ｖｍａｔｒｉｘ＝７．８５ｍｌ）に、サンプル（約９０ｍｇ）を約１８ｍｌ負荷する。それぞれの負荷前に、開始バッファーＰ１ａに対してカラムを平衡状態にする。流量は２ｍｌ／分に保ち、２ｍｌの分画を回収し、全プロセスを室温（２２℃）で実施する。サンプルは完全に脱塩し、ｐＨはタンパク質のｐＩ値（ｐＩＶＬＫ−８０５＝８．５６）を超えるが、ＬＫ−８０５はＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅと結合しない。しかしながら、大部分のＥ．コリタンパク質はこれらの条件下で結合する。非結合分画を集める。第１のクロマトグラフィーステップ後に集めた分画中のタンパク質の濃度は、ブラッドフォード法により測定して２．３８ｍｇ／ｍｌである。純度は８０％と８５％の間である。ＬＫ−８０５に関する第１のクロマトグラフィーステップの収率は９５％である。
【００９８】
ヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅへの負荷前のサンプルの酸性化
ヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅへの負荷前に、１００ｍＭのＨ３ＰＯ４を用いてサンプルを酸性化する。段階的に、一定の攪拌中、サンプル３０ｍｌ当たり３ｍｌの酸を加える（１００μＬ／サンプル１ｍｌ）。
【００９９】
第２のクロマトグラフィーステップ
親和性クロマトグラフィー、クロマトグラフィー用担体：ヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ
カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＨＲ１０／１０、Ｖｍａｔｒｉｘ＝８．６０ｍｌ）を、それぞれの負荷前に開始バッファーＰ３を用いて平衡状態にする。約７ｍｌのサンプルを３回カラムに負荷する。この型のクロマトグラフィーにおいて使用した、両方のバッファーのｐＨは６．０である。流量は２ｍｌ／分であり、２ｍｌの分画を回収し、全プロセスを室温で実施する。１〜５００ｍＭのＮａＣｌ勾配は、５ＶＫではなくＴＮＦ−α−１０ＶＫよりも漸進的である。タンパク質は２００〜２５０ｍＭのＮａＣｌで溶出させる。サンプル中のタンパク質の濃度は、ブラッドフォード法により測定して１．２ｍｇ／ｍｌである。第２のクロマトグラフィーステップの収率は６０％である。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】プレクロマトグラフィーステップ後の、ＴＮＦ−αを含む混合物のクーマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。矢印は、ＴＮＦ−αを含むバンドを示す。 凡例 レーン１：分子量標準、Ｌｏｗ Ｒａｎｇｅ（Ｂｉｏ Ｒａｄ）、レーン２：細胞破壊後の上清、負荷５μｇ、レーン３：ポリエチレンイミンを用いた核酸の沈殿後の上清、負荷５μｇ、レーン４：硫酸アンモニウム沈殿の溶液、負荷５μｇ。
【図２】最終的な純粋ＴＮＦ−αのクーマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。矢印は、ＴＮＦ−αを含むバンドを示す。 凡例 レーン１：１μｇのＴＮＦ−α、レーン２：２μｇのＴＮＦ−α、レーン３：分子量標準、Ｌｏｗ Ｒａｎｇｅ（Ｂｉｏ Ｒａｄ）、レーン４：５μｇのＴＮＦ−α。
【図３】アニオン担体ＤＥＡＥ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いたカラムＨＲ１０／１０を使用するクロマトグラフィーによる分離を示す図である。クロマトグラムは、時間（分）に従う２８０ｎｍにおける吸光度の変化（Ａ２８０）（───）およびバッファーＰ２の割合（---）を示す。 ピークＡ−Ｅ．コリタンパク質を含む流出分画；ピークＢ−ＴＮＦ−αを含む結合タンパク質および残りのＥ．コリタンパク質。
【図４】ヘパリンＳｅｐｈａｒｏｓｅ６ＦＦ担体を用いたカラムＨＲ１０／１０を使用するクロマトグラフィーによる分離を示す図である。クロマトグラムは、時間（分）に従う２８０ｎｍにおける吸光度の変化（Ａ２８０）（───）およびバッファーＰ４の割合（---）を示す。矢印は、ＴＮＦ−αを含むピークを示す。
【図５】Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２担体上でのクロマトグラフィーによる分離を示す図である。クロマトグラムは、２８０ｎｍにおける吸光度の変化（Ａ２８０）（───）を示す。矢印は、ＴＮＦ−αを含むピークを示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非常に純粋な形でタンパク質を単離および／または精製する方法に関する。このことは、特定の順序の精製ステップで、特定のクロマトグラフィー用担体を使用することによって達成される。本発明の方法は広範囲のタンパク質、好ましくは腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）およびＴＮＦ−α類似体に適用することができる。
【背景技術】
【０００２】
医学界では、非常に純粋な形のタンパク質を提供することが必要とされている。したがって、低レベルの不純物を有する充分に精製されたタンパク質を提供することは、今日の医薬品産業にとって重要である。１つのこのような方法を本発明において記載する。さらに、本発明の方法は非常に経済的で効率がよく、タンパク質、好ましくはＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−α類似体の工業生産に使用することができる。ヒトＴＮＦ−αは、サイトカインのファミリーに属するタンパク質である。ヒトＴＮＦ−αは、細胞免疫応答と関係がある因子のカスケードにおける必須要素であり、種々の急性感染症および慢性の免疫または炎症疾患の病因と関係がある。一般に、ヒトＴＮＦ−αは、健康な生物と不健康な生物の両方において多面発現性活性を有する。ＴＮＦ−αは広範囲の抗腫瘍効果を示し、局所療法の抗癌剤として医学界において使用されている。全身使用により副作用を引き起こすその毒性のために、より少ない副作用を有し、抗腫瘍活性が保存またはさらに増大した多くのＴＮＦ−α類似体が設計および調製されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は、タンパク質、好ましくはＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−α類似体を単離および／または精製するための非常に効率の良い方法を提供すること、および生物学的活性があるタンパク質、好ましくは精製された生物学的に活性のある形のＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−α類似体、ならびにこれらを含む医薬組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明によれば、高純度のタンパク質、好ましくはＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−α類似体は、親和性クロマトグラフィーステップを含む単離および／または精製法を使用することによって、得られることが分かった。前記親和性クロマトグラフィーは、グリコサミノグリカン、特にヘパリンが結合している親和性クロマトグラフィー用担体上で実施することが好ましい。このステップは高い最終純度の好ましくはＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−α類似体に必要不可欠であり、同じことがグリコサミノグリカンと結合する全てのタンパク質、例えば他の残りのタンパク質より高い親和性を有するヘパリンに当てはまると思われる。本発明の好ましい実施形態において適用される、わずか２つの追加のクロマトグラフィーステップ、好ましくはアニオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーを、高純度のタンパク質を得るために使用することができる。言い換えれば、本発明によりグリコサミノグリカンが結合している親和性クロマトグラフィー用担体を適用することによって得られる、タンパク質の既に高い純度を、追加のクロマトグラフィーステップを導入することによってさらに高めることができる。２つの追加のクロマトグラフィーステップは、グリコサミノグリカン親和性クロマトグラフィーと連続して使用することができることが好ましく、最も好ましくはアニオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーである。本発明による方法は、共有結合ＴＮＦ三量体を分離するのに特に適している。
【０００５】
タンパク質、好ましくはＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−α類似体を単離および／または精製する方法は、９８％を超える純度を有する、生物学的活性があるタンパク質、好ましくはＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−α類似体の生成をもたらす。
【０００６】
この方法は、多量のタンパク質、好ましくはＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−α類似体の生成に適しており、タンパク質、好ましくはＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−α類似体の工業生産に適している。
【０００７】
本発明は、
不純物の存在下でタンパク質を含む混合物を準備すること、および
グリコサミノグリカンが結合している親和性クロマトグラフィー用担体に前記混合物を負荷すること
を含む、タンパク質を単離および／または精製する方法を提供する。特に前記方法は、以下のステップ：
ａ．不純物の存在下でタンパク質を含む前記混合物を、グリコサミノグリカンが結合している親和性クロマトグラフィー用担体に負荷するステップ、
ｂ．グリコサミノグリカンが結合している親和性クロマトグラフィー用担体に、タンパク質を選択的に結合させるステップ、および
ｃ．グリコサミノグリカンが結合している親和性クロマトグラフィー用担体からタンパク質を溶出させて、タンパク質を提供するステップを含む。
【０００８】
本発明の好ましい実施形態において、負荷の前に、タンパク質混合物を酸性化して５．５〜７．５の範囲のｐＨ、好ましくは約６．０のｐＨを得る。本発明の他の実施形態は、親和性クロマトグラフィーの前または後に実施することができ、アニオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィーおよび親和性クロマトグラフィーからなる群から選択される１つまたは複数のクロマトグラフィーステップをさらに含む、本明細書で前に記載した方法である。より好ましいのは、以下のクロマトグラフィーステップ：
ａ．アニオン交換クロマトグラフィー、および
ｂ．グリコサミノグリカンが結合した親和性クロマトグラフィー用担体を用いる親和性クロマトグラフィー、および
ｃ．サイズ排除クロマトグラフィー
を含む、本明細書で前に言及した方法である。
【０００９】
グリコサミノグリカンはヘパラン硫酸およびヘパリンからなる群から選択されることが好ましく、ヘパリンが使用されることがより好ましい。親和性クロマトグラフィーは、ヘパリンＳｅｐｈａｒｏｓｅ担体上で実施することが最も好ましい。アニオン交換クロマトグラフィーは、ＤＥＡＥ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ担体上で実施することが好ましい。サイズ排除クロマトグラフィーは、特にＳｕｐｅｒｏｓｅ１２上で実施する。
【００１０】
本発明内において、タンパク質はタンパク質構造中に１つまたは複数のアミノ酸領域（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）ＸＹＺ（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）を含むタンパク質、および１つまたは複数のアミノ酸配列領域（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）ＸＹＺ（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）が導入されたタンパク質からなる群から選択されることが好ましく、「（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）」がリシンまたはアルギニンを指し、Ｘ、ＹおよびＺが、全ての可能な組合せで使用することができるＳｅｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、ＧｌｎおよびＡｓｎを含む群から選択される、小さな、柔軟性のある、極性および／または荷電アミノ酸を指し、および：
特に、本明細書で前に記載したタンパク質は、タンパク質構造中に１つまたは複数のアミノ酸領域（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）ＸＹＺ（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）を生来含む。
【００１１】
１つまたは複数のアミノ酸領域（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）ＸＹＺ（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）をタンパク質構造中に導入されている。
【００１２】
タンパク質はＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−α類似体を含む群から選択される。
【００１３】
本発明内で好ましいのは、
以下のクロマトグラフィーステップ：
ａ．アニオン交換クロマトグラフィー、および
ｂ．グリコサミノグリカンが結合した親和性クロマトグラフィー用担体を用いる親和性クロマトグラフィー、および
ｃ．サイズ排除クロマトグラフィー
を含む本明細書で前に記載した方法である。
【００１４】
特に好ましいのは、選択するグリコサミノグリカンがヘパリンである、本明細書で前に記載した方法である。最も好ましいのは、
クロマトグラフィーステップ：
ａ．アニオン交換クロマトグラフィー、および
ｂ．グリコサミノグリカンが結合した親和性クロマトグラフィー用担体を用いる親和性クロマトグラフィー、および
ｃ．サイズ排除クロマトグラフィー
を含み、
タンパク質がＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−α類似体からなる群から選択され、グリコサミノグリカンがヘパリンである、本明細書で前に記載した方法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明は、グリコサミノグリカン、好ましくはヘパリンが結合している親和性クロマトグラフィー用担体上で実施することが好ましい親和性クロマトグラフィーを含む、タンパク質を単離および／または精製する方法に関する。さらに本発明の方法は、特定の順序のプレクロマトグラフィーおよび精製ステップを含む。
【００１６】
本発明の方法は、グリコサミノグリカン、特にヘパリンが結合している親和性クロマトグラフィー用担体とのタンパク質の有効な結合または高い親和性を可能にする１つまたは複数のアミノ酸領域を含む全てのタンパク質に使用することができる。このアミノ酸領域は領域（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）ＸＹＺ（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）であることが好ましい。したがって、本発明の方法は、それらのタンパク質構造中に１つまたは複数のアミノ酸領域（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）ＸＹＺ（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）を含むタンパク質に適用することができる。タンパク質は、それらのタンパク質構造中に１つまたは複数のアミノ酸領域（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）ＸＹＺ（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）を生来含むことができる。さらに本発明の方法は、１つまたは複数のアミノ酸領域（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）ＸＹＺ（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）を導入されているタンパク質、特に表面上に塩基性アミノ酸残基を既に有しているタンパク質に適用することができる。アミノ酸領域のこのような導入は、例えば変異誘発によって、特にアミノ酸置換、添加および／またはアミノ酸挿入によって実施することができる。本発明の方法はＴＮＦリガンドファミリーのメンバー、特にＴＮＦ−α、ＴＮＦ−α類似体およびＴＮＦ−β（リンホトキシン）に適用することが好ましい。タンパク質は、ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−α類似体からなる群から選択されることが最も好ましい。
【００１７】
本明細書で使用する用語「（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）」は、アミノ酸配列中のリシンまたはアルギニンのいずれかの使用を指す。したがって、アミノ酸領域（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）ＸＹＺ（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）は、アミノ酸領域ＡｒｇＸＹＺＡｒｇ、ＡｒｇＸＹＺＬｙｓ、ＬｙｓＸＹＺＬｙｓおよびＬｙｓＸＹＺＡｒｇからなる群から選択される。本明細書で使用する配列「ＸＹＺ」中において、Ｘ、ＹおよびＺは、全ての可能な組合せで使用することができるＳｅｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、ＧｌｎおよびＡｓｎを含む群から選択される、小さな、柔軟性のある、極性および／または荷電アミノ酸を指す。本発明の方法によって単離および／または精製されるタンパク質の、アミノ酸配列中に含まれる好ましいアミノ酸領域は、ＡｒｇＳｅｒＳｅｒＳｅｒＡｒｇおよびＡｒｇＧｌｎＨｉｓＰｒｏＬｙｓである。最も好ましいアミノ酸領域は、ＡｒｇＳｅｒＳｅｒＳｅｒＡｒｇである。
【００１８】
本明細書で使用する用語「ＴＮＦ−α」は、原型アミノ酸配列を有するヒトＴＮＦ−αのポリペプチドを指す。生物学的活性があるＴＮＦ−αは、３つの等しいＮ末端アミノ酸領域ＡｒｇＳｅｒＳｅｒＳｅｒＡｒｇを有する小型の三量体の構造を有する。
【００１９】
本明細書で使用する用語「共有結合三量体」は、少なくとも２つのサブユニットを含み、共有結合しており、サブユニット間の結合がジスルフィド結合ではない、三量体形のＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−α類似体を指す。この用語は、用語「非還元性三量体」と交換可能である。
【００２０】
本明細書で使用する用語「ＴＮＦ−α類似体」は、幾つかの変異、欠失、および挿入を有する、あるいは一般にＴＮＦ−αのアミノ酸配列の任意の変化を有するポリペプチドを指す。
【００２１】
本明細書で使用する用語「ＬＫ−８０５」は、変異Ｇｌｕ１０７Ｌｙｓが導入されているＴＮＦ−α類似体を指す。ＬＫ−８０５は、従来技術のＮｏｖａｋｏｖｉｅ ＳらＣｙｔｏｋｉｎｅ．１９９７ ９（８）：５９７〜８０４中に記載された。
【００２２】
本明細書で使用する用語「溶出」は、クロマトグラフィーカラムからの吸着物質の洗浄または抽出を指す。
【００２３】
本明細書で使用する用語「溶出液」は、クロマトグラフィーカラムからの洗浄または抽出によって得られる溶液を指す。
【００２４】
本明細書で使用する用語「不純物」は、タンパク質、好ましくはＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−α類似体の生物学的活性がある分子とは異なる物質、したがって分子に生物学的活性がない物質を指す。不純物は、タンパク質、ＤＮＡ、（リポ）多糖などの、他の宿主細胞物質、およびタンパク質、好ましくはＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−α類似体の調製および処理において使用されている添加剤なども含む可能性がある。用語不純物は、ＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−α類似体の共有結合三量体も含む。
【００２５】
本明細書に示す不純物は、この不純物と同じ濃度範囲内の検量線を使用し、参照物質としてＴＮＦを使用する、クーマシー染色したドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）ゲルの濃度分析を指す。
【００２６】
本発明のタンパク質を単離および／または精製する方法は、
不純物の存在下でタンパク質を含む混合物を準備すること、およびグリコサミノグリカンが結合した親和性クロマトグラフィー用担体に前記混合物を負荷することを含むことによって特に定義される。
【００２７】
グリコサミノグリカンはヘパリンおよびヘパラン硫酸からなる群から選択される。本発明の好ましい実施形態では、ヘパリンが結合した親和性クロマトグラフィー用担体を使用する。
【００２８】
本発明の方法は、以下のステップ：
不純物の存在下でタンパク質を含む混合物を、グリコサミノグリカンが結合した親和性クロマトグラフィー用担体に負荷するステップ、
グリコサミノグリカンが結合した親和性クロマトグラフィー用担体に、タンパク質を選択的に結合させるステップ、および
グリコサミノグリカンが結合した担体からタンパク質を溶出させて、タンパク質を提供するステップを含むことが好ましい。
【００２９】
本発明の好ましい実施形態では、グリコサミノグリカンはヘパリンである。
【００３０】
好ましい実施形態では本発明は、ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−α類似体を単離および／または精製する方法に関するものであり、不純物の存在下でタンパク質を含む混合物を準備すること、およびグリコサミノグリカンが結合した親和性クロマトグラフィー用担体に前記混合物を負荷することを含むことによって特に定義される。
【００３１】
特に、好ましい実施形態の方法は、以下のステップ：
不純物の存在下でＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−α類似体を含む混合物を、ヘパリンが結合した親和性クロマトグラフィー用担体に負荷するステップ、
ヘパリンが結合した親和性クロマトグラフィー用担体に、タンパク質を選択的に結合させるステップ、および
ヘパリンが結合した親和性クロマトグラフィー用担体からタンパク質を溶出させて、タンパク質を提供するステップを含む。
【００３２】
本発明のタンパク質、特にＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−α類似体を単離および／または精製する方法は、親和性クロマトグラフィー以外に、親和性クロマトグラフィーの前または後に実施することができる、アニオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィーおよび親和性クロマトグラフィーからなる群から選択される１つまたは複数のクロマトグラフィーステップをさらに含むことができる。この精製ステップは、異なる組合せおよび／または異なる順序で適用することができる。
【００３３】
本発明の好ましい実施形態において、この方法はアニオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーをさらに含み、アニオン交換クロマトグラフィーは親和性クロマトグラフィーの前に実施することが好ましく、サイズ排除クロマトグラフィーは親和性クロマトグラフィーの後で実施する。
【００３４】
本発明の好ましい実施形態において、タンパク質、特にＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−α類似体を単離および／または精製する方法は、
以下のクロマトグラフィーステップ：
ａ．アニオン交換クロマトグラフィー、および
ｂ．グリコサミノグリカンが結合した親和性クロマトグラフィー用担体を用いる親和性クロマトグラフィー、および
ｃ．サイズ排除クロマトグラフィー
を含む。
【００３５】
グリコサミノグリカンは、ヘパラン硫酸およびヘパリンからなる群から選択されることが好ましい。グリコサミノグリカンはヘパリンであることが最も好ましい。
【００３６】
クロマトグラフィーステップａ．、ｂ．およびｃ．は、ａ．、ｂ．およびｃ．の順序で実施することが好ましいが、この順序は異なってもよい。
【００３７】
本発明の方法は医学分野の臨床用途に適した、タンパク質、好ましくはＴＮＦ−αおよび／またはＴＮＦ−α類似体の生成をもたらす。
【００３８】
本発明の単離および／または精製する方法によって得られる、生物学的活性があるタンパク質、特にＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−α類似体は、治療有効量の生物学的活性があるタンパク質、好ましくはＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−α類似体、および薬剤として許容可能な補助物質を含む医薬組成物の調製に適している。
【００３９】
本発明の方法によって、短い単離および／または精製法において得られる活性形のタンパク質、好ましくはＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−α類似体を保つ能力は、生物学的活性があるタンパク質、好ましくはＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−α類似体、およびこれを含む医薬組成物の高い収率だけではなく、高い純度および有効性にも貢献する。
【００４０】
本明細書で使用する用語「治療有効量」は、生物学的活性があるタンパク質、好ましくはＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−α類似体の治療効果を有する、生物学的活性があるタンパク質、好ましくはＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−α類似体の量を指す。
【００４１】
適切な薬剤として許容可能な補助物質には、タンパク質、特にＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−α類似体、療法において有用な適切な希釈剤、アジュバントおよび／または担体がある。
【００４２】
本発明の方法、特に追加のアニオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーのステップの実施によって得られる、生物学的活性があるＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−α類似体は、癌の治療、および癌を治療するための医薬品の調製に使用することができる。
【００４３】
前記タンパク質は、ＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−α類似体の指標である全ての他の疾患を治療するための医薬品の調製にも使用することができる。
【００４４】
したがって、本発明の方法によって得られる純粋で生物学的活性があるＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−α類似体を含む医薬組成物は、当業者に知られている方法で、前述の疾患を治療するのに有効な治療量で患者に投与することができる。
【００４５】
本発明のタンパク質を単離および／または精製する方法を実施するのに好ましい実施形態を以下に記載する。
【００４６】
本発明のタンパク質を単離および／または精製する方法は、プレクロマトグラフィーステップで始めることが好ましい。プレクロマトグラフィーステップは、それ自体が知られている発酵生産慣習に従う、宿主細胞の形質転換、および宿主細胞、すなわち発現菌株の培養を含む。この菌株は一般に栄養培地上で単コロニーから始めて増殖させるが、低温保存した細胞懸濁液（細胞塊）を利用することも可能である。この菌株は一般に多段階の方法で培養して、さらに使用するのに充分なバイオマスを得る。適切な宿主細胞は、例えば細菌細胞であってよい。本発明に従い利用する細菌宿主細胞は、例えばエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）種などのグラム陰性菌（例えばエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ））、または他のグラム陰性菌、例えばシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種（シュードモナス・エルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）など）、またはカウロバクター（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ）種（カウロバクター・クレセンツス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）など）、またはグラム陽性菌、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種など（特にバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）であってよい。エシェリヒア・コリが宿主細胞として特に好ましい。プレクロマトグラフィーステップは細胞の破壊、硫酸アンモニウム（ＡＳ）またはポリエチレングリコールを用いたタンパク質分画の清澄なホモジェネートおよび沈殿からの核酸の沈殿を含むことができる。
【００４７】
本発明の方法は、アニオン交換クロマトグラフィーまたはカチオン交換クロマトグラフィーであってよい、第１のクロマトグラフィーステップにより続ける。最も好ましくは、アニオン交換クロマトグラフィーを適用する。
【００４８】
本発明の方法は、クロマトグラフィー用担体への、不純物の存在下でタンパク質を含む混合物の負荷で始める。この混合物（負荷溶液）は、細胞の破壊後に直接得られる上清、清澄ホモジェネートからの核酸の沈殿後の上清、タンパク質沈殿が適切なバッファーに溶けた溶液、８Ｍの尿素または６ＭのＧｎｄＨＣｌなどの強力な変性剤の存在下の封入体溶液または懸濁液（または混合物）、および変性濃度の変性剤（例えば１％サルコシル、２％サルコシルまたは１％ドデシル硫酸ナトリウム）の存在下の溶液、例えば変性剤／界面活性剤の希釈、透析、限外濾過または除去による事前復元に施した溶液からなる群から選択される。酵母、真菌または哺乳動物細胞系などの分泌系中での発現の場合、上清または濃縮上清または培養培地を負荷溶液として使用することができる。アニオン交換／カチオン交換カラムからの第１の溶出から生成した溶出液は、アニオン交換／カチオン交換カラムに再度負荷するための負荷溶液として使用することもできる。ヘパリンＳｅｐｈａｒｏｓｅ親和性クロマトグラフィーから生成した溶出液を、アニオン交換／カチオン交換カラムに負荷することもできる。
【００４９】
カラムに負荷する前に、負荷溶液として使用する不純物の存在下でタンパク質を含む混合物は、好ましくは脱塩して、結合に干渉する可能性がある塩（残りの硫酸アンモニウムまたは酢酸アンモニウムまたはいずれかの他の塩）を除去する。負荷溶液のｐＨは、使用するイオン交換クロマトグラフィー（アニオンまたはカチオン）の型に依存する。アニオン交換クロマトグラフィー用の負荷溶液の好ましいｐＨは、（ｐＩが約６．８である）ＴＮＦ−αと同等なｐＩ値を有するＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−α類似体の場合７．５〜８．５の範囲であり、一方ＴＮＦ−αより高いｐＩ値を有するＴＮＦ−α類似体の場合、８．５〜９．５の範囲のｐＨが好ましい。負荷溶液のｐＨは、例えばＮａＯＨ溶液、またはリン酸溶液などの低濃度の酸溶液、または高ｐＨまたは低ｐＨバッファー溶液を加えることによって調整することが好ましい。バッファー交換を実施して、適切なｐＨを得ることもできる。
【００５０】
好ましくはアニオン交換クロマトグラフィーである、第１のクロマトグラフィーステップは、大部分のＥ．コリタンパク質および他の可溶性要素を除去するために使用する。第１のクロマトグラフィーステップは、宿主細胞由来の核酸、リポ多糖およびタンパク質の捕捉ステップとして、タンパク質、特にＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−α類似体のイオン化異性体、および変更したｐＩ値を有する変化（損傷）形のタンパク質、特にＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−α類似体を除去するために使用することもできる。カラムに負荷したサンプル中の標的タンパク質の量に関して、このステップの収率は約９０％である。
【００５１】
さまざまなアニオン交換クロマトグラフィー用担体を使用することができ、ＤＥＡＥ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−６Ｂ、ＤＥＡＥ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ、Ｑ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ、Ｑ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰ、Ｑ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＸＬ、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌ、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ、ＱＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ、ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ、ＱＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ、Ｍｉｎｉ−Ｑ、Ｍｏｎｏ−Ｑ、Ｍｏｎｏ−Ｐ、Ｓｏｕｒｃｅ１５Ｑ、Ｓｏｕｒｃｅ３０Ｑ、ＡＮＸ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅなどからなる群から選択することができる。アニオン交換クロマトグラフィーは、ＤＥＡＥ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ担体上で実施することが好ましい。
【００５２】
カチオン交換クロマトグラフィー使用の場合、さまざまなカチオン交換クロマトグラフィー用担体を使用することができ、ＣＭ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−６Ｂ、ＣＭ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ、ＳＰ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ、ＳＰ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰ、ＳＰ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＸＬ、ＣＭ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ、ＣＭ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ、ＣＭ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ、ＳＰ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ、ＭｉｎｉＳ、ＭｏｎｏＳ、Ｓｏｕｒｃｅ１５Ｓ、Ｓｏｕｒｃｅ３０Ｓ、ＴＳＫゲルＳＰ−５ＰＷ、ＴＳＫゲルＳＰ−５ＰＷ−Ｈｒ、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ Ｈｉｇｈ Ｓ担体、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ Ｓ担体、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ ＣＭ担体からなる群から選択することができる。
【００５３】
アニオン交換クロマトグラフィー用の負荷溶液中の塩濃度は、タンパク質とカラムの結合を可能にするために低いことが好ましい。このことは、バッファー交換に適した方法によって達成される。タンパク質とカラムの結合は、溶液のｐＨにも依存する。７．５〜８．５のｐＨ範囲を有するさまざまなバッファーを、負荷およびタンパク質、特にＴＮＦ−αと同等なｐＩ値を有するＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−α類似体とアニオン交換クロマトグラフィー用担体の結合用に使用することができ、さまざまなバッファーはリン酸、トリス／ＨＣｌ、酢酸、クエン酸、トリス／酢酸、コハク酸、マロン酸、２−（Ｎ−モルホリノエタンスルホン酸）（ＭＥＳ）および他のバッファーからなる群から選択することができる。リン酸バッファーを使用するのが好ましい。リン酸バッファーは１０〜４０ｍＭの濃度範囲、好ましくは１０〜２０ｍＭの濃度範囲で使用することができる。
【００５４】
ＴＮＦ−αより高いｐＩ値を有するＴＮＦ−α類似体を単離および／または精製する場合、８．５〜９．５のｐＨ範囲を有するさまざまなバッファーを負荷、および大部分のＥ．コリタンパク質と担体の結合用に使用することができる。このｐＨは、標的タンパク質と担体の結合を妨げる。
【００５５】
アニオン交換クロマトグラフィーにおいては、カラム負荷の後にに、カラムの洗浄およびカラムからのタンパク質の溶出が続く。バッファー溶液中に高濃度の塩を加えた後の増大したイオン強度のために、溶出が起こる。ステップ勾配、直線勾配、およびステップ勾配と直線勾配の適切な組合せを、溶出用に使用することができる。ステップ勾配と直線勾配の適切な組合せを使用することが好ましい。洗浄および溶出用に使用することができる溶出バッファーは、リン酸、トリス／ＨＣｌ、酢酸、クエン酸、トリス／酢酸、コハク酸、マロン酸、ＭＥＳ、およびＮａＣｌまたはＫＣｌなどの塩を加えた他の適切なバッファーからなる群から選択することができる。溶出が得られるイオン強度および塩濃度は、バッファー溶液のｐＨに依存する。ＴＮＦ−αと同等なｐＩ値を有するＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−α類似体を溶出させるために、５０〜１５０ｍＭの範囲の値の塩濃度を使用することが好ましい。バッファーのｐＨが高くなるほど、カラムからのタンパク質の溶出には低いイオン強度が必要とされる。
【００５６】
溶出液において、ＴＮＦ−αと同等なｐＩ値（約６．８）を有する三量体、生物学的活性があるＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−α類似体が、８０％を超える純度で得られる。ＴＮＦ−αより高いｐＩ値を有するＴＮＦ−α類似体の場合、ＴＮＦ−α類似体は、８０％を超える純度で、三量体の、生物学的活性がある形で流出分画中において得られる。
【００５７】
本発明の方法の第２のクロマトグラフィーステップは、グリコサミノグリカンが結合している親和性クロマトグラフィー用担体を好ましくは含む、親和性クロマトグラフィーであることが好ましい。グリコサミノグリカンはヘパリンおよびヘパラン硫酸からなる群から選択される。本発明の好ましい実施形態においては、ヘパリンは親和性クロマトグラフィーの親和性クロマトグラフィー用担体と結合させる。
【００５８】
このステップは、本発明の方法によって得られるタンパク質の最終純度に不可欠なステップである。このステップにおいては、タンパク質、好ましくはＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−α類似体は、他の残留Ｅ．コリタンパク質および他の不純物より、特異的、すなわちより高い親和性で、親和性クロマトグラフィー用担体と結合する。
【００５９】
親和性クロマトグラフィー用担体はヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６ＦＦ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＡＦ−ヘパリン−６５０Ｍなどからなる群から選択される。親和性クロマトグラフィー用担体は、ヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ担体であることが好ましい。
【００６０】
第２のクロマトグラフィーステップ用の負荷溶液として使用される、不純物の存在下でタンパク質を含む混合物は、ＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−α類似体を含むアニオンクロマトグラフィー溶出液、またはＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−α類似体を含むアニオンクロマトグラフィーの流出分画であることが好ましい。
【００６１】
このステップは、有意に高いタンパク質結合能を与える低いｐＨにおいて行うことが好ましい。したがって、負荷の前に、混合物を酸性化して、ｐＨ５．５〜７．５を得ることが好ましい。混合物のｐＨは約ｐＨ６．０であることが好ましい。好ましくはタンパク質の変性を引き起こさない１００ｍＭのＨ３ＰＯ４または他のいずれかの希釈酸を使用することによって、混合物を酸性化する。この段階において、（ＴＮＦ−αと比較して）同等または高いｐＩ値を有するＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−α類似体の結合能は、ｐＨ６．０を有するバッファー中でサンプルを適用することによって本質的に増大させることができる。５．５〜７．５のｐＨ範囲、好ましくは約ｐＨ６．０を有するさまざまなバッファーを、負荷および（ＴＮＦ−αと比較して）同等または高いｐＩ値を有するＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−α類似体と親和性クロマトグラフィー用担体の結合用に使用することができ、さまざまなバッファーはリン酸、トリス／ＨＣｌ、酢酸、クエン酸、トリス／酢酸、コハク酸、マロン酸、２−（Ｎ−モルホリノエタンスルホン酸）（ＭＥＳ）および他のバッファーからなる群から選択することができる。リン酸バッファーを使用するのが好ましい。リン酸バッファーは１０〜４０ｍＭの濃度範囲、好ましくは１０〜２０ｍＭの濃度範囲で使用することができる。
【００６２】
担体との結合後、カラムの洗浄およびカラムからのタンパク質の溶出によって、この方法を続ける。適切な溶出勾配を使用して、残留Ｅ．コリタンパク質を最初に溶出させ、次にＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−α類似体を溶出させる最大の分離を得ることによって、溶出を実施することができる。ステップ勾配、直線勾配、およびステップ勾配と直線勾配の適切な組合せを使用することができる。ステップ勾配と直線勾配の適切な組合せを使用することが好ましい。
【００６３】
洗浄および溶出用に使用することができる溶出バッファーは、リン酸、トリス／ＨＣｌ、酢酸、クエン酸、トリス／酢酸、コハク酸、マロン酸、ＭＥＳ、およびＮａＣｌまたはＫＣｌなどの塩を加えた他の適切なバッファーからなる群から選択することができる。０〜５００ｍＭのＮａＣｌの直線勾配を異なる勾配で使用して、最大の分離を得ることが好ましい。溶出が得られるイオン強度および塩濃度は、バッファー溶液のｐＨに依存する。ＴＮＦ−αと同等なｐＩ値を有するＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−α類似体を溶出させるために、１００〜１５０ｍＭの範囲の値の塩濃度を使用することができ、ＴＮＦ−αより高いｐＩ値を有するＴＮＦ−α類似体に関しては、１５０〜２５０ｍＭの範囲の塩濃度を使用することができる。バッファーのｐＨが高くなるほど、カラムからのタンパク質の溶出には低いイオン強度が必要とされる。
【００６４】
溶出液において、生物学的活性があるＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−α類似体が、９８％を超える純度で得られる。
【００６５】
本発明の方法の第３のクロマトグラフィーステップは、サイズ排除クロマトグラフィーであることが好ましい。サイズ排除クロマトグラフィーは、微量の二量体および高度凝集形のタンパク質、特にＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−α類似体を除去するのに特に有効である。
【００６６】
望むならば、親和性カラムから得られた溶出液を、如何なる他の中間ステップも必要とせずにゲル濾過カラムに直接負荷することができる。サイズ排除クロマトグラフィーカラムに負荷する前に、親和性カラムから得られた溶出液を濃縮して、負荷サンプルの体積を減少させることが好ましい。異なる方法、すなわち限外濾過、硫酸アンモニウム沈殿、次に小体積の適切なバッファー中での分離、または他のいずれかの適切な方法を使用することができる。硫酸アンモニウム沈殿を使用することが好ましい。
【００６７】
さまざまなサイズ排除クロマトグラフィー用担体を使用することができ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００ＨＲ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−１００ＨＲ、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−７５、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１５０、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６ＢおよびＣＬ−６Ｂ、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００、ＴＳＫゲルＧ−２５００ＰＷ、ＴＳＫゲルＧ−３０００ＰＷ、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ−６０、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ−１００、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ−５０、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ−５５、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ６５などからなる群から選択することができる。サイズ排除クロマトグラフィーは、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２上で実施することが好ましい。
【００６８】
サイズ排除クロマトグラフィー用の広いｐＨ範囲の負荷溶液を使用することができる。溶液の負荷およびタンパク質の溶出は、同じバッファーを使用することによって実施することができる。さまざまなバッファーを使用することができ、バッファーは７．０〜８．０の範囲にｐＨを保つことができるリン酸、トリスおよび他の適切なバッファーからなる群から選択することができる。７．０〜８．０のｐＨを有するリン酸バッファーを使用することができる。負荷用には、２０〜１００ｍＭの濃度範囲、より好ましくは３０ｍＭと５０ｍＭの間の濃度範囲で、リン酸バッファーを使用することが好ましい。サイズ排除クロマトグラフィーバッファー中の塩濃度は、１００〜５００ｍＭ、好ましくは約２００ｍＭの範囲であってよい。２００ｍＭのＮａＣｌを含むＰＢＳバッファー（Ｍａｎｉａｔｉｓ）を使用することが好ましい。溶出液において、生物学的活性がある、適切にフォールディングされたタンパク質、特にＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−α類似体が、９８％を超える純度および完全な生物活性で得られる。
【００６９】
以下の実施例は本発明のさまざまな実施形態を例示する目的で与え、何らかの形式で本発明を制限することは意味しない。
【実施例１】
【００７０】
ヘパリンＳｅｐｈａｒｏｓｅカラム上でのさまざまなｐＨにおけるＴＮＦαの結合能の測定
Ｐ１：１０ｍＭのＫ−リン酸、ｐＨ８．０
Ｐ２：１０ｍＭのＫ−リン酸、ｐＨ８．０、１ＭのＮａＣｌ
Ｐ３：１０ｍＭのＫ−リン酸、ｐＨ６．０
Ｐ４：１０ｍＭのＫ−リン酸、ｐＨ６．０、１ＭのＮａＣｌ
【００７１】
ｐＨ８．０での結合能
カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＨＲ１０／１０、Ｖｍａｔｒｉｘ＝８．３０ｍｌ）を、負荷前に負荷剤バッファーＰ１を用いて平衡状態にする。カラムに４０ｍｌのサンプルを負荷する（ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ溶出液、ｐＨ８．０；ＤＥＡＥ−溶出液は実施例２に記載するのと同様に調製する。）。カラムに負荷したタンパク質の合計量は９．５ｍｇであり、ＴＮＦ−αの量は９ｍｇである。結合タンパク質はバッファーＰ２を用いて溶出させる。流量は２ｍｌ／分であり、２ｍｌの分画を回収し、全プロセスを室温（２２℃）で実施する。流出分画および結合分画はＴＮＦ−αを含む。結合分画中のＴＮＦ−αの量は６，６ｍｇであり、流出分画中の量は２．２ｍｇである。ｐＨ８．０においてヘパリンＳｅｐｈａｒｏｓｅ１ｍＬ当たり約０．８ｍｇのＴＮＦ−αが結合する（これらの条件での最大能力）。
【００７２】
ｐＨ６．０での結合能
カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＨＲ１０／１０、Ｖｍａｔｒｉｘ＝８．３０ｍｌ）を、負荷前に負荷剤バッファーＰ３を用いて平衡状態にする。カラムに７ｍｌのサンプルを負荷する（ＤＥＡＥ−溶出液、ｐＨ６．０に酸性化；ＤＥＡＥ−溶出液は実施例２に記載するのと同様に調製する）。カラムに負荷したタンパク質の合計量は１３．５ｍｇであり、ＴＮＦ−αの量は１２．５ｍｇである。結合タンパク質はバッファーＰ４を用いて溶出させる。流量は２ｍｌ／分であり、２ｍｌの分画を回収し、全プロセスを室温（２２℃）で実施する。流出分画はＴＮＦ−αを含まない。結合分画中のＴＮＦ−αの量は１２ｍｇである。ｐＨ６．０においてヘパリンＳｅｐｈａｒｏｓｅ１ｍＬ当たり少なくとも１．４ｍｇのＴＮＦ−αが結合する（これらの条件での最小能力）。
【００７３】
ヘパリンＳｅｐｈａｒｏｓｅへのＴＮＦ−αの結合能力は、ｐＨ８と比較してｐＨ６．０では有意に高いことが分かる。少なくとも２倍多くのＴＮＦ−αがｐＨ６では結合する。これは方法の経済性を有意に改善し、ＴＮＦ−α類似体の精製にも適用することができる。
【実施例２】
【００７４】
生物学的活性があるＴＮＦ−αの単離および／または精製
負荷サンプル（バイオマス）の調製：
以下の発現系：細菌菌株Ｅ．コリＢＬ２１（ＤＥ３）、プラスミド：Ｅ．コリ中での発現用に最適化させたＴＮＦ−αの適切に挿入された遺伝子を含むｐＣｙｄｃｌ（担体プラスミドＢＢＧ４、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して、出発物質を調製する。発現プラスミドｐＣｙｄｃｌは、抑制遺伝子ｃｌ８５７を部分的に欠失させることによって市販のプラスミドｐＣＹＴＥＸＰ１（Ｍｅｄａｃ、Ｈａｍｂｕｒｇ）から調製する。ｐＣｙｄｃｌを使用して、タンパク質の充分な蓄積をもたらす、低温での標的タンパク質の構成的発現が得られる（Ｖ．Ｍｅｎａｒｔ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、８３、Ｎｏ．２、１８１〜１９０、２００３）。３０℃において振盪フラスコ中の培養物（合計体積：２Ｌ）中で、タンパク質を発現させる。湿潤洗浄バイオマスの重量は約１７ｇ（８，５ｇ／Ｌ）である。
【００７５】
プレクロマトグラフィーステップ
細胞の破壊
バイオマスを、７０ｍｌ（約４倍体積）のバッファーＰ５０／３０（５０ｍＭのＴＲＩＳ／ＨＣｌ、３０ｍＭのＮａＣｌ）中に再懸濁させる。懸濁液はｕｌｔｒａｔｕｒａｘ ＰＴ３１００（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ）を使用して均質化する。作業圧力１０００００ｋＰａで高圧ホモジェナイザーＥｍｕｌｓｉＦｌｅｘ−Ｃ５（Ａｖｅｓｔｉｎ）を使用して、細胞を破壊する。破壊後、細胞タンパク質の固形細胞部分および不溶性部分を、１５０００ｒｐｍおよび４℃での３０分間の遠心分離によって除去する。
【００７６】
核酸の沈殿
遠心分離後の上清において、ポリエチレンイミンを用いて核酸を沈殿させる。この上清に、磁気攪拌器で混合しながら、５％のポリエチレンイミンを最終濃度０．１％までゆっくり加える。１５０００ｒｐｍおよび４℃での３０分間の遠心分離によって、沈殿を除去する。
【００７７】
可溶性タンパク質の沈殿
遠心分離後の上清において、硫酸アンモニウムを用いて可溶性タンパク質を沈殿させる。固形硫酸アンモニウムを６５％の飽和度（４３０ｇ／ｌ）まで上清にゆっくり加え、ｐＨは７．０と８．０の間の最終ｐＨに同時に調整する。硫酸アンモニウム沈殿の上清中のタンパク質の合計量は４９５ｍｇである（湿潤バイオマス１ｇ当たり約２９ｍｇのタンパク質）。硫酸アンモニウム沈殿の懸濁液は、５０ｍｇのタンパク質をそれぞれ含む等分試料に分ける。１５０００ｒｐｍおよび４℃での３０分間の遠心分離後、上清を注ぎ出し、同じ条件下において３０分間再度遠心分離し、上清の水滴は濾過紙によって完全に吸い取る。生成した硫酸アンモニウム沈殿は４℃で保存する。
【００７８】
ＴＮＦ−αの含量の測定
クーマシーブルーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの濃度分析を使用することによって、可溶性分画中のＴＮＦ−αの含量を、それぞれのプレクロマトグラフィーステップ後に測定する。細胞破壊後の上清中のＴＮＦ−αの含量は、約３５〜４５％のＴＮＦ−αである。核酸の沈殿後、ＴＮＦの含量は４０〜５０％さらに増大する。硫酸アンモニウム沈殿を調製することによって、サンプルのさらなる富化を達成する。硫酸アンモニウム沈殿の溶液中のＴＮＦ−αの含量は６０〜８０％である。
【００７９】
クロマトグラフィーステップ
クロマトグラフィー用のバッファー
Ｐ１：１０ｍＭのＫ−リン酸、ｐＨ８．０
Ｐ２：１０ｍＭのＫ−リン酸、ｐＨ８．０、１ＭのＮａＣｌ
Ｐ３：１０ｍＭのＫ−リン酸、ｐＨ６．０
Ｐ４：１０ｍＭのＫ−リン酸、ｐＨ６．０、１ＭのＮａＣｌ
Ｐ５：ＰＢＳ、ｐＨ７．４、２００ｍＭのＮａＣｌ
Ｐ６：ＰＢＳ、ｐＨ７．４、５００ｍＭのＮａＣｌ
【００８０】
ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに負荷するためのサンプルの調製
硫酸アンモニウム沈殿の等分試料（タンパク質の合計量約５０ｍｇ）を、約５ｍｌのバッファーＰ１に溶かす。サンプルはＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに負荷する前にＰＤ−１０カラムを使用して脱塩して、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅとの結合に干渉する残りの硫酸アンモニウムおよび他の塩を除去する。脱塩サンプルはバッファーＰ１を用いて１０ｍｌに希釈し、ブラッドフォード法により測定して最終濃度は５．３ｍｇ／ｍｌである。
【００８１】
第１のクロマトグラフィーステップ
アニオンクロマトグラフィー、クロマトグラフィー用担体：ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＨＲ１０／１０、Ｖｍａｔｒｉｘ＝７．８５ｍｌ）に、約５ｍｌのサンプルを２回負荷する。負荷サンプル中のタンパク質の合計量は約５０ｍｇであり、ＴＮＦ−αの量は３７，５ｍｇである。それぞれの負荷前に、開始バッファーＰ１を用いてカラムを平衡状態にする。流量は２ｍｌ／分であり、２ｍｌの分画を回収し、全プロセスを室温（１８〜２２℃）で実施する。クロマトグラムを図３中に示し、２０分と３０分の間の主要なピーク（Ｂ）の分画を集める。第１のクロマトグラフィーステップ後に集めた分画中のタンパク質の濃度は、ブラッドフォード法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ Ｍ．Ｍ．１９７６．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：２４８〜２５４）により測定して０．８ｍｇ／ｍｌであり、タンパク質の合計量は約３６ｍｇであり、ＴＮＦ−αは約３４ｍｇである（純度９４％まで）。したがって、第１のクロマトグラフィーステップの収率は９０％である。
【００８２】
サンプルの酸性化
ＴＮＦ−αを含むＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅからの溶出液は、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＹＭ１０膜を有するＡｍｉｃｏｎセル中で約２０ｍｌに濃縮する。ブラッドフォード法により測定して最終濃度は１．７ｍｇ／ｍｌであり、タンパク質の量は約３４ｍｇであり、ＴＮＦ−αは約３３ｍｇである。濃縮の収率は約９７％である。濃縮サンプルは１００ｍＭのＨ３ＰＯ４を使用してｐＨ６．０に酸性化する（酸１００μＬ／タンパク質サンプル１ｍｌ）
【００８３】
第２のクロマトグラフィーステップ
親和性クロマトグラフィー、クロマトグラフィー用担体：ヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ
カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＨＲ１０／１０、Ｖｍａｔｒｉｘ＝８．６０ｍｌ）を、それぞれの負荷前に開始バッファーＰ３を用いて平衡状態にする。約７ｍｌのサンプルを３回カラムに負荷する。カラム上に負荷するタンパク質の合計量は３４ｍｇであり、ＴＮＦ−αの量は３２ｍｇである。この型のクロマトグラフィーにおいて使用した、両方のバッファーのｐＨは６．０である。流量は２ｍｌ／分であり、２ｍｌの分画を回収し、全プロセスを室温（２２℃）で実施する。クロマトグラムを図４中に示し、２０分と３０分の間の主要なピークの分画を集める。サンプル中のタンパク質の濃度は、ブラッドフォード法によって測定する。第２のクロマトグラフィーステップ後のタンパク質の合計量は２２ｍｇであり、ＴＮＦ−αは２１．５ｍｇである（純度約９８％）。このステップの収率は約６７％であり、主な消失はクロマトグラフィーのピークをカットする際に存在して、最後のクロマトグラフィーステップの最も純粋な分画を選択する。
【００８４】
Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２上に負荷する前のサンプルの調製
サイズ排除クロマトグラフィー前に、サンプルは硫酸アンモニウム沈殿と共に濃縮し、次いで小体積のバッファーＰ５中に沈殿を溶かす。固形硫酸アンモニウムを６０％の飽和度（４３０ｇ／ｌ）まで溶液にゆっくり加える。１５０００ｒｐｍおよび４℃での６０分間の遠心分離後、上清を注ぎ出し、同じ条件下において３０分間再度遠心分離し、上清の飛沫は濾過紙によって完全に吸い取る。硫酸アンモニウム沈殿は９００μｌのバッファーＰ５中に溶かす。沈殿および溶解の収率は約７０％である。
【００８５】
第３のクロマトグラフィーステップ
サイズ排除クロマトグラフィー、クロマトグラフィー用担体：Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２
バッファーＰ５を用いて平衡状態にしたカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＨＲ１０／３０、Ｖｍａｔｒｉｘ＝２３．８ｍｌ、パッキング済み）に、約３００μｌのサンプルを３回負荷する。流量は０．２ｍｌ／分である。このクロマトグラフィーステップのクロマトグラムは図５中に示す。０．２ｍｌの分画を回収し、６６分と７４分の間の主要なピークの分画を集める。最終サンプル中のＴＮＦ−αの濃度は約２．５ｍｇ／ｍｌであり、サンプルの体積は４．８ｍｌである。適切な体積の５ＭのＮａＣｌをサンプルに加えて、０．５ＭのＮａＣｌの最終濃度を得る。サンプルはバッファーＰ６を用いて、１ｍｇ／ｍｌのＴＮＦ−αの濃度に希釈する。２８０ｎｍでの吸光度測定から計算したＴＮＦ−αの最終濃度は１．０３ｍｇ／ｍｌである。したがって、ＴＮＦ−αの合計量は１２．５ｍｇである。最後のクロマトグラフィーステップの収率は８０％である。ＴＮＦ−αの単離の全体収率は３３％（３０〜３５％）である。
【００８６】
精製タンパク質の特徴付け
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
共有結合三量体は、標準的なＳＤＳ−ＰＡＧＥで非還元性二量体として見られる。１μｇ、２μｇおよび５μｇのＴＮＦ−αを負荷してＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施する。クーマシー染色したゲル上において（図２）、５μｇの負荷では、微量の非還元性二量体が、ＴＮＦ−α単量体に属する主要バンド以外に目に見える状態である。非還元性二量体の量は１％未満である。ＴＮＦ−αの分解産物に属するバンドは、この負荷では見られない。クーマシーブルー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの濃度測定を使用することによって、最終純度を測定する。共有結合三量体の量は、以下の標準（純水ＴＮＦ）負荷：０．０５μｇ、０．１μｇ、０．２５μｇおよび０．５μｇによって作製した検量線を用いて、５μｇのサンプル負荷において非還元性二量体に属するバンドを比較することによって測定する。
【００８７】
ウエル当たり１μｇのタンパク質負荷、および高感度銀染色において、ＴＮＦ−α単量体に属する主要スポットおよび低強度の非還元性二量体以外に、目に見える状態である他のタンパク質バンドは存在しない。
【００８８】
インビトロでのＴＮＦ−αおよびその類似体の固有細胞毒性の測定−細胞を固定するための方法
固有細胞毒性活性を、ＦｌｉｃｋおよびＧｉｆｆｏｒｄ（Ｆｌｉｃｋ、Ｄ．Ａ．、Ｇｉｆｆｏｒｄ、Ｇ．Ｅ．１９８４ ６８：１６７〜１７５）の改変手順に従いＬ−９２９細胞系（マウス線維芽細胞）を使用して測定する。１００Ｉの培養培地中に２×１０４個の細胞を、マイクロタイタープレートのそれぞれのウエル中に接種し、２４時間インキュベートする（３７Ｃ、５％ＣＯ２）。インキュベーション後、（ＷＨＯ ＴＮＦ−α標準８７／６５０を使用して調製した）内ＴＮＦ−α標準およびＴＮＦ−α類似体の一連の希釈液を、２ｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤの存在下においてウエルに加える。プレートを１８〜２０時間再度インキュベートする（３７Ｃ、５％ＣＯ２）。生命力のある細胞を次いで２．５％のグルタルアルデヒドを用いて固定し、２０％メタノール中の０．５％クリスタルバイオレットを用いて染色する。プレートを乾燥させ、１００ｌの１％ＳＤＳをそれぞれのウエルに加える。室温（２５℃まで）で１０分間の振盪後、５７０ｎｍにおいて光学濃度を測定する。測定した光学濃度から、細胞濃度の自然対数を得る。ＴＮＦ−αおよびその類似体の特異的細胞毒性活性は、最大細胞毒性の５０％を生じる、すなわちタンパク質を含まない対照ウエル（陰性対照）中の細胞数に関して５０％の細胞が生存しているサンプルと、標準の希釈液とを比較することによって測定する。Ｌ−９２９細胞において測定した固有細胞毒性は３〜４×１０７ＩＵ／ｍｇである。
【実施例３】
【００８９】
ＬＫ−８０５（Ｅ１０７Ｋ）の単離および／または精製
出発物質（バイオマス）の調製
以下の発現系：細菌菌株大腸菌、ＢＬ２１（ＤＥ３）、類似体ＬＫ−８０５の適切に挿入された遺伝子を有するプラスミドｐＣｙｄｃｌを使用して、出発物質を調製する。発現プラスミドｐＣｙｄｃｌは、抑制遺伝子ｃｌ８５７を部分的に欠失させることによって市販のプラスミドｐＣＹＴＥＸＰ１（Ｍｅｄａｃ、Ｈａｍｂｕｒｇ）から調製する。ｐＣｙｄｃｌを使用して、タンパク質の充分な蓄積をもたらす、低温での標的タンパク質の構成的発現が得られる（Ｖ．Ｍｅｎａｒｔ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、８３、Ｎｏ．２、１８１〜１９０、２００３）。
【００９０】
３０℃において振盪フラスコ中の培養物（合計体積：２Ｌ）中で、タンパク質を発現させる。湿潤洗浄バイオマスの重量は１７ｇまで（８，５ｇ／Ｌ）である。
【００９１】
プレクロマトグラフィーステップ
細胞の破壊
バイオマスを、７０ｍｌ（約４倍体積）のバッファーＰ５０／３０（５０ｍＭのトリス／ＨＣｌ、３０ｍＭのＮａＣｌ）中に再懸濁させる。懸濁液はｕｌｔｒａｔｕｒａｘ ＰＴ３１００（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ）を使用して均質化する。作業圧力１０００００ｋＰａで高圧ホモジェナイザーＥｍｕｌｓｉＦｌｅｘ−Ｃ５（Ａｖｅｓｔｉｎ）を使用して、細胞を破壊する。破壊後、細胞タンパク質の固形細胞部分および不溶性部分を、１５０００ｒｐｍおよび４℃での３０分間の遠心分離によって除去する。
【００９２】
核酸の沈殿
遠心分離後の上清において、ポリエチレンイミンを用いて核酸を沈殿させる。この上清に、磁気攪拌器で混合しながら、５％のポリエチレンイミンを最終濃度０．１％までゆっくり加える。１５０００ｒｐｍおよび４℃での３０分間の遠心分離によって、沈殿を除去する。
【００９３】
可溶性タンパク質の沈殿
遠心分離後の上清において、硫酸アンモニウムを用いて可溶性タンパク質を沈殿させる。固形硫酸アンモニウムを６５％の飽和度（４３０ｇ／ｌ）まで上清にゆっくり加え、ｐＨを６．５と７．５の間の最終ｐＨに同時に調整する。硫酸アンモニウム沈殿の懸濁液中のタンパク質の合計量は５２３ｍｇである（湿潤バイオマス１ｇ当たり約３０ｍｇのタンパク質）。硫酸アンモニウム沈殿の懸濁液は、５０ｍｇのタンパク質をそれぞれ含む等分試料に分ける。１５０００ｒｐｍおよび４℃での３０分間の遠心分離後、上清を注ぎ出し、同じ条件下において３０分間再度遠心分離し、上清の飛沫は濾過紙によって完全に吸い取る。生成した硫酸アンモニウム沈殿は４℃で保存する。
【００９４】
ＬＫ−８０５の含量の測定
可溶性分画中のＬＫ−８０５の割合は、クーマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの濃度分析を使用することによって、それぞれのプレクロマトグラフィーステップ後に測定する。細胞破壊後の上清中には約５０％のＬＫ−８０５が存在し、核酸の沈殿後の上清中には、約６４％のＬＫ−８０５が存在し、核酸の除去によって標的タンパク質が消失しないことを意味する。サンプルのさらなる富化は硫酸アンモニウム沈殿を調製することによって達成され、硫酸アンモニウム沈殿の溶液中のＬＫ−８０５の割合は約６６％である。
【００９５】
クロマトグラフィーステップ
クロマトグラフィー用のバッファー
Ｐ１ａ：１０ｍＭのＫ−リン酸、ｐＨ９．０
Ｐ２ａ：１０ｍＭのＫ−リン酸、ｐＨ９．０、１ＭのＮａＣｌ
Ｐ３：１０ｍＭのＫ−リン酸、ｐＨ６．０
Ｐ４：１０ｍＭのＫ−リン酸、ｐＨ６．０、１ＭのＮａＣｌ
ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに負荷するためのサンプルの調製
【００９６】
硫酸アンモニウム沈殿の等分試料（タンパク質の合計量約１００ｍｇ）を、１０ｍｌのバッファーＰ１ａに溶かす。ＹＭ１０膜を使用して５０ｍｌのＡｍｉｃｏｎセル（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）中で脱塩することによって、硫酸アンモニウムを除去する。脱塩サンプル中のタンパク質の濃度は、ブラッドフォード法により測定して７．５５ｍｇ／ｍｌである。２つの１８ｍｌ体積の脱塩サンプルをカラムに負荷する。
【００９７】
第１のクロマトグラフィーステップ
アニオンクロマトグラフィー、クロマトグラフィー用担体：ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＨＲ１０／１０、Ｖｍａｔｒｉｘ＝７．８５ｍｌ）に、サンプル（約９０ｍｇ）を約１８ｍｌ負荷する。それぞれの負荷前に、開始バッファーＰ１ａに対してカラムを平衡状態にする。流量は２ｍｌ／分に保ち、２ｍｌの分画を回収し、全プロセスを室温（２２℃）で実施する。サンプルは完全に脱塩し、ｐＨはタンパク質のｐＩ値（ｐＩＶＬＫ−８０５＝８．５６）を超えるが、ＬＫ−８０５はＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅと結合しない。しかしながら、大部分のＥ．コリタンパク質はこれらの条件下で結合する。非結合分画を集める。第１のクロマトグラフィーステップ後に集めた分画中のタンパク質の濃度は、ブラッドフォード法により測定して２．３８ｍｇ／ｍｌである。純度は８０％と８５％の間である。ＬＫ−８０５に関する第１のクロマトグラフィーステップの収率は９５％である。
【００９８】
ヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅへの負荷前のサンプルの酸性化
ヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅへの負荷前に、１００ｍＭのＨ３ＰＯ４を用いてサンプルを酸性化する。段階的に、一定の攪拌中、サンプル３０ｍｌ当たり３ｍｌの酸を加える（１００μＬ／サンプル１ｍｌ）。
【００９９】
第２のクロマトグラフィーステップ
親和性クロマトグラフィー、クロマトグラフィー用担体：ヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ
カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＨＲ１０／１０、Ｖｍａｔｒｉｘ＝８．６０ｍｌ）を、それぞれの負荷前に開始バッファーＰ３を用いて平衡状態にする。約７ｍｌのサンプルを３回カラムに負荷する。この型のクロマトグラフィーにおいて使用した、両方のバッファーのｐＨは６．０である。流量は２ｍｌ／分であり、２ｍｌの分画を回収し、全プロセスを室温で実施する。１〜５００ｍＭのＮａＣｌ勾配は、５ＶＫではなくＴＮＦ−α−１０ＶＫよりも漸進的である。タンパク質は２００〜２５０ｍＭのＮａＣｌで溶出させる。サンプル中のタンパク質の濃度は、ブラッドフォード法により測定して１．２ｍｇ／ｍｌである。第２のクロマトグラフィーステップの収率は６０％である。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】プレクロマトグラフィーステップ後の、ＴＮＦ−αを含む混合物のクーマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。矢印は、ＴＮＦ−αを含むバンドを示す。 凡例 レーン１：分子量標準、Ｌｏｗ Ｒａｎｇｅ（Ｂｉｏ Ｒａｄ）、レーン２：細胞破壊後の上清、負荷５μｇ、レーン３：ポリエチレンイミンを用いた核酸の沈殿後の上清、負荷５μｇ、レーン４：硫酸アンモニウム沈殿の溶液、負荷５μｇ。
【図２】最終的な純粋ＴＮＦ−αのクーマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。矢印は、ＴＮＦ−αを含むバンドを示す。 凡例 レーン１：１μｇのＴＮＦ−α、レーン２：２μｇのＴＮＦ−α、レーン３：分子量標準、Ｌｏｗ Ｒａｎｇｅ（Ｂｉｏ Ｒａｄ）、レーン４：５μｇのＴＮＦ−α。
【図３】アニオン担体ＤＥＡＥ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いたカラムＨＲ１０／１０を使用するクロマトグラフィーによる分離を示す図である。クロマトグラムは、時間（分）に従う２８０ｎｍにおける吸光度の変化（Ａ２８０）（───）およびバッファーＰ２の割合（---）を示す。 ピークＡ−Ｅ．コリタンパク質を含む流出分画；ピークＢ−ＴＮＦ−αを含む結合タンパク質および残りのＥ．コリタンパク質。
【図４】ヘパリンＳｅｐｈａｒｏｓｅ６ＦＦ担体を用いたカラムＨＲ１０／１０を使用するクロマトグラフィーによる分離を示す図である。クロマトグラムは、時間（分）に従う２８０ｎｍにおける吸光度の変化（Ａ２８０）（───）およびバッファーＰ４の割合（---）を示す。矢印は、ＴＮＦ−αを含むピークを示す。
【図５】Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２担体上でのクロマトグラフィーによる分離を示す図である。クロマトグラムは、２８０ｎｍにおける吸光度の変化（Ａ２８０）（───）を示す。矢印は、ＴＮＦ−αを含むピークを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
不純物の存在下でタンパク質を含む混合物を準備すること、および
グリコサミノグリカンが結合している親和性クロマトグラフィー用担体に前記混合物を負荷すること
を含む、タンパク質を単離および／または精製する方法。
【請求項２】
以下のステップ：
ａ．不純物の存在下でタンパク質を含む前記混合物を、グリコサミノグリカンが結合している親和性クロマトグラフィー用担体に負荷するステップ、
ｂ．グリコサミノグリカンが結合している親和性クロマトグラフィー用担体に、タンパク質を選択的に結合させるステップ、および
ｃ．グリコサミノグリカンが結合している親和性クロマトグラフィー用担体からタンパク質を溶出させて、タンパク質を提供するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
負荷の前に前記混合物を酸性化して５．５〜７．５の範囲のｐＨを得る、請求項１および２に記載の方法。
【請求項４】
前記混合物のｐＨが約６．０である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
請求項２に記載の方法の前または後に実施することができる、アニオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィーおよび親和性クロマトグラフィーからなる群から選択される１つまたは複数のクロマトグラフィーステップをさらに含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
以下のクロマトグラフィーステップ：
ａ．アニオン交換クロマトグラフィー、および
ｂ．グリコサミノグリカンが結合している親和性クロマトグラフィー用担体を用いる親和性クロマトグラフィー、および
ｃ．サイズ排除クロマトグラフィー
を含む請求項５に記載の方法。
【請求項７】
グリコサミノグリカンがヘパラン硫酸およびヘパリンからなる群から選択される、請求項１、２および６に記載の方法。
【請求項８】
グリコサミノグリカンがヘパリンである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
親和性クロマトグラフィー用担体がヘパリンＳｅｐｈａｒｏｓｅである、請求項１、２および６に記載の方法。
【請求項１０】
アニオン交換クロマトグラフィーがＤＥＡＥ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ担体上で実施される、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
サイズ排除クロマトグラフィーがＳｕｐｅｒｏｓｅ１２上で実施される、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
前記タンパク質がタンパク質構造中に１つまたは複数のアミノ酸領域（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）ＸＹＺ（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）を含むタンパク質、および１つまたは複数のアミノ酸配列領域（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）ＸＹＺ（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）が導入されたタンパク質からなる群から選択され、「（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）」はリシンまたはアルギニンを指し、Ｘ、ＹおよびＺは、全ての可能な組合せで使用することができるＳｅｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、ＧｌｎおよびＡｓｎを含む群から選択される、小さな、柔軟性のある、極性および／または荷電アミノ酸を指す、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
タンパク質がタンパク質構造中に１つまたは複数のアミノ酸領域（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）ＸＹＺ（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）を生来含んでいる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
１つまたは複数のアミノ酸領域（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）ＸＹＺ（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）がタンパク質構造中に導入されている、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
タンパク質がＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−α類似体を含む群から選択される、請求項１２から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
以下のクロマトグラフィーステップ：
ａ．アニオン交換クロマトグラフィー、および
ｂ．グリコサミノグリカンが結合している親和性クロマトグラフィー用担体を用いる親和性クロマトグラフィー、および
ｃ．サイズ排除クロマトグラフィー
を含む請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
選択されたグリコサミノグリカンがヘパリンである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
以下のクロマトグラフィーステップ：
ａ．アニオン交換クロマトグラフィー、
ｂ．グリコサミノグリカンが結合している親和性クロマトグラフィー用担体を用いる親和性クロマトグラフィー、および
ｃ．サイズ排除クロマトグラフィー
を含み、
タンパク質がＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−α類似体からなる群から選択され、グリコサミノグリカンがヘパリンである、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１】
不純物の存在下でタンパク質を含む混合物を準備すること、および
グリコサミノグリカンが結合している親和性クロマトグラフィー用担体に前記混合物を負荷すること
を含む、タンパク質を単離および／または精製する方法。
【請求項２】
以下のステップ：
ａ．不純物の存在下でタンパク質を含む前記混合物を、グリコサミノグリカンが結合している親和性クロマトグラフィー用担体に負荷するステップ、
ｂ．グリコサミノグリカンが結合している親和性クロマトグラフィー用担体に、タンパク質を選択的に結合させるステップ、および
ｃ．グリコサミノグリカンが結合している親和性クロマトグラフィー用担体からタンパク質を溶出させて、タンパク質を提供するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
負荷の前に前記混合物を酸性化して５．５〜７．５の範囲のｐＨを得る、請求項１および２に記載の方法。
【請求項４】
前記混合物のｐＨが約６．０である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
請求項２に記載の方法の前または後に実施することができる、アニオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィーおよび親和性クロマトグラフィーからなる群から選択される１つまたは複数のクロマトグラフィーステップをさらに含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
以下のクロマトグラフィーステップ：
ａ．アニオン交換クロマトグラフィー、および
ｂ．グリコサミノグリカンが結合している親和性クロマトグラフィー用担体を用いる親和性クロマトグラフィー、および
ｃ．サイズ排除クロマトグラフィー
を含む請求項５に記載の方法。
【請求項７】
グリコサミノグリカンがヘパラン硫酸およびヘパリンからなる群から選択される、請求項１、２および６に記載の方法。
【請求項８】
グリコサミノグリカンがヘパリンである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
親和性クロマトグラフィー用担体がヘパリンＳｅｐｈａｒｏｓｅである、請求項１、２および６に記載の方法。
【請求項１０】
アニオン交換クロマトグラフィーがＤＥＡＥ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ担体上で実施される、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
サイズ排除クロマトグラフィーがＳｕｐｅｒｏｓｅ１２上で実施される、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
前記タンパク質がタンパク質構造中に１つまたは複数のアミノ酸領域（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）ＸＹＺ（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）を含むタンパク質、および１つまたは複数のアミノ酸配列領域（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）ＸＹＺ（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）が導入されたタンパク質からなる群から選択され、「（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）」はリシンまたはアルギニンを指し、Ｘ、ＹおよびＺは、全ての可能な組合せで使用することができるＳｅｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、ＧｌｎおよびＡｓｎを含む群から選択される、小さな、柔軟性のある、極性および／または荷電アミノ酸を指す、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
タンパク質がタンパク質構造中に１つまたは複数のアミノ酸領域（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）ＸＹＺ（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）を生来含んでいる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
１つまたは複数のアミノ酸領域（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）ＸＹＺ（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）がタンパク質構造中に導入されている、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
タンパク質がＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−α類似体を含む群から選択される、請求項１２から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
以下のクロマトグラフィーステップ：
ａ．アニオン交換クロマトグラフィー、および
ｂ．グリコサミノグリカンが結合している親和性クロマトグラフィー用担体を用いる親和性クロマトグラフィー、および
ｃ．サイズ排除クロマトグラフィー
を含む請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
選択されたグリコサミノグリカンがヘパリンである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
以下のクロマトグラフィーステップ：
ａ．アニオン交換クロマトグラフィー、
ｂ．グリコサミノグリカンが結合している親和性クロマトグラフィー用担体を用いる親和性クロマトグラフィー、および
ｃ．サイズ排除クロマトグラフィー
を含み、
タンパク質がＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−α類似体からなる群から選択され、グリコサミノグリカンがヘパリンである、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２００８−５０２７０８（Ｐ２００８−５０２７０８Ａ）
【公表日】平成２０年１月３１日（２００８．１．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５１７０９７（Ｐ２００７−５１７０９７）
【出願日】平成１７年５月２０日（２００５．５．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００５５０７
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１１２９８２
【国際公開日】平成１７年１２月１日（２００５．１２．１）
【出願人】（５０４３５９２９３）レツク・フアーマシユーテイカルズ・デー・デー (60)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年１月３１日（２００８．１．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年５月２０日（２００５．５．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００５５０７
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１１２９８２
【国際公開日】平成１７年１２月１日（２００５．１２．１）
【出願人】（５０４３５９２９３）レツク・フアーマシユーテイカルズ・デー・デー (60)
【Ｆターム（参考）】
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