説明

タンパク質ライブラリーのinsilico作成と選択

【課題】好ましい生物学的機能(例えば、生物学的および/または治療的に重要な標的分子に対する改良された結合親和性)を有する最適化されたタンパク質について、タンパク質ライブラリーを効率的に作成しスクリーニングするための方法の提供。
【解決手段】所望のタンパク質のライブラリーを構築する方法は、以下の工程を含む:リード配列を複数のテスタータンパク質配列と比較し;そして複数のテスタータンパク質配列から、リード配列と少なくとも15%の配列同一性を有する少なくとも2つのペプチドセグメントを選択し(選択されたペプチドセグメントはヒットライブラリーを形成する);そしてリード配列をヒットライブラリーで置換することにより、設計したタンパク質のライブラリーを形成する。


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【特許請求の範囲】
【請求項1】
抗体配列のライブラリーを構築する方法であって、この方法は以下の工程を含む:
リード抗体の重鎖(VH)または軽鎖(VL)の可変領域のアミノ酸配列を提供し;
リード抗体のCDR中のアミノ酸配列を同定し;
リード抗体のVHまたはVL領域中の1つのCDRを選択し;
選択されたCDR中に少なくとも3つの連続したアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を提供し(選択されたアミノ酸配列はリード配列である);
リード配列を複数のテスタータンパク質配列と比較し;そして
複数のテスタータンパク質配列から、リード配列と少なくとも15%の配列同一性を有する少なくとも2つのペプチドセグメントを選択する(選択されたペプチドセグメントはヒットライブラリーを形成する)。
【請求項2】
リード配列の長さは5〜100aaである、請求項1の方法。
【請求項3】
リード配列の長さは6〜80aaである、請求項1の方法。
【請求項4】
リード配列の長さは8〜50aaである、請求項1の方法。
【請求項5】
CDR中のアミノ酸配列を同定する工程は、Kabat基準またはチョチア(Chothia)基準を使用して行われる、請求項1の方法。
【請求項6】
リード配列は、CDR1、CDR2、CDR3、FR1-CDR1、CDR1-FR2、FR2-CDR2、CDR2-FR3、FR3-CDR3、CDR3-FR4、FR1-CDR1-FR2、FR2-CDR2-FR3、およびFR3-CDR3-FR4よりなる群から選択されるリード抗体のVHまたはVL内の領域からのアミノ酸配列を含む、請求項1の方法。
【請求項7】
リード配列は、選択されたCDR中に少なくとも6つの連続的アミノ酸残基を含む、請求項1の方法。
【請求項8】
リード配列は、選択されたCDR中に少なくとも7つの連続的アミノ酸残基を含む、請求項1の方法。
【請求項9】
リード配列は、選択されたCDR中にすべてのアミノ酸残基を含む、請求項1の方法。
【請求項10】
リード配列は、選択されたCDRにすぐ隣接する少なくとも1つのアミノ酸残基をさらに含む、請求項1の方法。
【請求項11】
リード配列は、選択されたCDRにフランクするFR中に少なくとも1つのアミノ酸残基をさらに含む、請求項1の方法。
【請求項12】
リード配列は、選択されたCDRのC末端またはN末端に隣接する1つ以上のCDRもしくはFRをさらに含む、請求項1の方法。
【請求項13】
複数のテスタータンパク質配列は抗体配列を含む、請求項1の方法。
【請求項14】
複数のテスタータンパク質配列はヒト抗体配列を含む、請求項1の方法。
【請求項15】
複数のFRテスタータンパク質配列は、VHまたはVL中に少なくとも70%のヒト配列を有するヒト化抗体配列を含む、請求項1の方法。
【請求項16】
複数のFRテスタータンパク質配列は、ヒト生殖細胞系抗体配列を含む、請求項1の方法。
【請求項17】
複数のテスタータンパク質配列は、抗体のCDRについてNIHのジーンバンク、Swiss-Protデータベース、およびKabatデータベースからなるデータベースから検索される、請求項1の方法。
【請求項18】
リード配列を複数のテスタータンパク質配列と比較する工程は、BLAST、PSI-BLAST、プロフィールHMM、およびCOBLATHよりなる群から選択されるアルゴリズムにより行われる、請求項1の方法。
【請求項19】
ヒットライブラリー中の選択されたペプチドセグメントとリード配列との配列同一性は、少なくとも25%である、請求項1の方法。
【請求項20】
ヒットライブラリー中の選択されたペプチドセグメントとリード配列との配列同一性は、少なくとも35%である、請求項1の方法。
【請求項21】
ヒットライブラリー中の選択されたペプチドセグメントとリード配列との配列同一性は、少なくとも45%である、請求項1の方法。
【請求項22】
以下の工程をさらに含む請求項1の方法:
ヒットライブラリーのアミノ酸配列をコードするDNAセグメントを含む核酸ライブラリーを構築する。
【請求項23】
以下の工程をさらに含む請求項1の方法:
ヒットライブラリーのアミノ酸位置変種プロフィールを作成し;
アミノ酸位置変種を対応する遺伝子コドンに逆翻訳することにより、ヒットライブラリーのアミノ酸位置変種プロフィールを核酸位置変種プロフィールに変換し;そして
核酸位置変種をコンビナトリアル的に組合せてDNAセグメントの縮重核酸ライブラリーを構築する。
【請求項24】
遺伝子コドンは、細菌での発現に好適なものである、請求項23の方法。
【請求項25】
遺伝コドンは、DNAセグメントの縮重核酸ライブラリーの多様性が、1×107 未満であるように選択される、請求項23の方法。
【請求項26】
遺伝コドンは、DNAセグメントの縮重核酸ライブラリーの多様性が、1×106 未満であるように選択される、請求項23の方法。
【請求項27】
以下の工程をさらに含む請求項23の方法:
縮重核酸ライブラリーのDNAセグメントを宿主生物細胞中に導入し;
縮重核酸ライブラリーによりコードされるヒットライブラリーのアミノ酸配列を含有する組換え抗体が宿主生物細胞中で産生されるように、DNAセグメントを宿主細胞中で発現させ;そして
106 M-1 より高い親和性で標的抗原に結合する組換え抗体を選択する。
【請求項28】
選択された組換え抗体の親和性は108 M-1より高い、請求項27の方法。
【請求項29】
選択された組換え抗体の親和性は109 M-1より高い、請求項27の方法。
【請求項30】
宿主生物は、細菌、酵母、植物、昆虫および哺乳動物よりなる群から選択される、請求項27の方法。
【請求項31】
組換え抗体は、完全に組み立てられた抗体、Fab断片、Fv断片、または1本鎖抗体よりなる群から選択される、請求項27の方法。
【請求項32】
組換え抗体はファージ粒子の表面上に表示される、請求項27の方法。
【請求項33】
ファージ粒子の表面上に表示される組換え抗体は、VHとVLにより形成される2本鎖ヘテロダイマーでもよい、請求項32の方法。
【請求項34】
VHおよびVL鎖のヘテロダイマー化は、それぞれVHとVL鎖に融合した2つの非抗体ポリペプチド鎖の間で形成されたヘテロダイマーにより促進される、請求項33の方法。
【請求項35】
非抗体ポリペプチド鎖は、それぞれヘテロダイマー受容体GABAB R1(GR1)とR2(GR2)から得られる、請求項34の方法。
【請求項36】
ファージ粒子の表面上に表示される組換え抗体は、ペプチドリンカーで連結されたVHとVLを含有する1本鎖抗体である、請求項32の方法。
【請求項37】
ファージ粒子の表面上の1本鎖抗体の表示は、1本鎖抗体とGR1との融合体とファージpIIIキャプシドタンパク質とGR2との融合体とで形成されるヘテロダイマーにより促進される、請求項36の方法。
【請求項38】
標的抗原は、小有機分子、タンパク質、ペプチド、核酸およびポリ炭水化物よりなる群から選択される、請求項27の方法。
【請求項39】
抗体配列のライブラリーを構築する方法であって、この方法は以下の工程を含む:
リード抗体の重鎖(VH)または軽鎖(VL)の可変領域のアミノ酸配列を提供し;
リード抗体のCDRとFR中のアミノ酸配列を同定し;
リード抗体のVHまたはVL領域中の1つのCDRを選択し;
選択されたCDR中に少なくとも3つの連続したアミノ酸残基を含む第1のアミノ酸配列を提供し(選択されたアミノ酸配列はCDRリード配列である);
CDRリード配列を複数のテスタータンパク質配列と比較し;
複数のCDRテスタータンパク質配列から、CDRリード配列と少なくとも15%の配列同一性を有する少なくとも2つのペプチドセグメントを選択し(選択されたペプチドセグメントはCDRヒットライブラリーを形成する);
リード抗体のVHまたはVL領域中に1つのFRを選択し;
選択されたFR中に少なくとも3つの連続したアミノ酸残基を含む第2のアミノ酸配列を提供し(選択されたアミノ酸配列はFRリード配列である);
FRリード配列を複数のFRテスタータンパク質配列と比較し;そして
複数のFRテスタータンパク質配列から、FRリード配列と少なくとも15%の配列同一性を有する少なくとも2つのペプチドセグメントを選択し(選択されたペプチドセグメントはFRヒットライブラリーを形成する);そして
CDRヒットライブラリーとFRヒットライブラリーとを組合せてヒットライブラリーを形成する。
【請求項40】
複数のCDRテスタータンパク質配列は、ヒトまたは非ヒト抗体のアミノ酸配列を含む、請求項39の方法。
【請求項41】
複数のFRテスタータンパク質配列は、ヒト抗体のアミノ酸配列を含んでよい、請求項39の方法。
【請求項42】
複数のFRテスタータンパク質配列は、VHまたはVL中に少なくとも70%のヒト配列を有するヒト化抗体配列を含む、請求項39の方法。
【請求項43】
複数のFRテスタータンパク質配列は、ヒト生殖細胞系抗体配列を含む、請求項39の方法。
【請求項44】
少なくとも1つの複数のCDRテスタータンパク質配列は、複数のFRテスタータンパク質配列とは異なる、請求項39の方法。
【請求項45】
複数のCDRテスタータンパク質配列はヒトもしくは非ヒト抗体配列であり、複数のFRテスタータンパク質配列はヒト抗体配列である、請求項39の方法。
【請求項46】
以下の工程をさらに含む請求項39の方法:
ヒットライブラリーのアミノ酸配列をコードするDNAセグメントを含む核酸ライブラリーを構築する。
【請求項47】
以下の工程をさらに含む請求項39の方法:
CDRヒットライブラリーのアミノ酸位置変種プロフィールを作成し;
アミノ酸位置変種を対応する遺伝子コドンに逆翻訳することにより、CDRヒットライブラリーのアミノ酸位置変種プロフィールを第1の核酸位置変種プロフィールに変換し;そして
核酸位置変種をコンビナトリアル的に組合せてDNAセグメントの縮重CDR核酸ライブラリーを構築する。
【請求項48】
ライブラリー抗体配列を構築する方法であって、この方法は以下の工程を含む:
リード抗体の重鎖(VH)または軽鎖(VL)の可変領域のアミノ酸配列を提供し;
リード抗体のFR中のアミノ酸配列を同定し;
リード抗体のVHまたはVL領域中の1つのFRを選択し;
選択されたFR中に少なくとも3つの連続したアミノ酸残基を含む第1のアミノ酸配列を提供し(選択されたアミノ酸配列は第1のFRリード配列である);
第1のリードFR配列を複数のFRテスタータンパク質配列と比較し;そして
複数のFRテスタータンパク質配列から、第1のFRリード配列と少なくとも15%の配列同一性を有する少なくとも2つのペプチドセグメントを選択する(選択されたペプチドセグメントはFRヒットライブラリーを形成する)。
【請求項49】
以下の工程をさらに含む請求項48の方法:
選択されたFRとは異なるFR中に少なくとも3つの連続したアミノ酸残基を含む第2のアミノ酸配列を提供し(選択されたアミノ酸配列は第2のFRリード配列である);
第2のFRリード配列を複数のFRテスタータンパク質配列と比較し;
複数のFRテスタータンパク質配列から、第2のFRリード配列と少なくとも15%の配列同一性を有する少なくとも2つのペプチドセグメントを選択し(選択されたペプチドセグメントは第2のFRヒットライブラリーを形成する);そして
第1のFRヒットライブラリーと第2のFRヒットライブラリーとを組合せてヒットライブラリーを形成する。
【請求項50】
リードFR配列は、リード抗体のVH FR1、VH FR2、VH FR3、VH FR4、VL FR1、VL FR2、VL FR3、およびVL FR4よりなる群から選択される選択されたFR中に、少なくとも5つの連続的アミノ酸残基を含む、請求項48の方法。
【請求項51】
請求項48の方法であって、以下の工程をさらに含む:
ヒットライブラリーのアミノ酸配列をコードするDNAセグメントを含む核酸または縮重核酸ライブラリーを構築する。
【請求項52】
複数のFRテスタータンパク質配列は、CDRが削除された抗体配列を含む、請求項48の方法。
【請求項53】
複数のFRテスタータンパク質配列は、CDRが削除されたヒト抗体配列を含む、請求項48の方法。
【請求項54】
リード配列プロフィールに基づいて抗体配列のライブラリーを構築する方法であって、この方法は以下の工程を含む:
リード抗体の重鎖(VH)または軽鎖(VL)の可変領域のアミノ酸配列を提供し;
リード抗体のCDR中のアミノ酸配列を同定し;
リード抗体のVHまたはVL領域中の1つのCDRを選択し;
選択されたCDR中に少なくとも3つの連続したアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を提供し(選択されたアミノ酸配列はリード配列である);
リード配列の3次元構造を提供し;
リード配列の構造に基づいてリード配列プロフィールを作成し;
リード配列プロフィールを複数のテスタータンパク質配列と比較し;そして
複数のテスタータンパク質配列から、リード配列と少なくとも10%の配列同一性を有する少なくとも2つのペプチドセグメントを選択する(選択されたペプチドセグメントはヒットライブラリーを形成する)。
【請求項55】
リード配列の3次元構造は、X線結晶解析、核磁気共鳴(NMR)分光法、または理論的構造モデル化から得られる構造である、請求項54の方法。
【請求項56】
リード配列プロフィールを作成する工程は以下の工程を含む請求項54の方法:
リード配列の構造を複数のテスタータンパク質セグメントの構造と比較し;
リード配列とテスタータンパク質セグメントの主鎖コンフォメーションの差の自乗平均の平方根を決定し;
主鎖コンフォメーションの差の自乗平均の平方根が5Å未満であるテスタータンパク質セグメントを選択し;そして
選択されたテスタータンパク質セグメントのアミノ酸配列をリード配列と整列させてリード配列プロフィールを作成する。
【請求項57】
主鎖コンフォメーションの差の自乗平均の平方根が4Å未満である、請求項56の方法。
【請求項58】
主鎖コンフォメーションの差の自乗平均の平方根が2Å未満である、請求項56の方法。
【請求項59】
リード配列プロフィールを作成する工程は以下の工程を含む請求項54の方法:
リード配列の構造を複数のテスタータンパク質セグメントの構造と比較し;
リード配列とテスタータンパク質セグメントの主鎖コンフォメーションのZスコアを決定し;
Zスコアが2より大きい、好ましくは3より大きい、さらに好ましくは4より大きい、および最も好ましくは5より大きいテスタータンパク質セグメントのセグメントを選択し;そして
選択されたテスタータンパク質セグメントのアミノ酸配列をリード配列と整列させてリード配列プロフィールを作成する。
【請求項60】
リード配列プロフィールを作成する工程は、CE、MAPS、モンテカルロおよび3Dクラスタリングアルゴリズムよりなる群から選択されるアルゴリズムにより行われる、請求項54の方法。
【請求項61】
以下の工程をさらに含む請求項54の方法:
ヒットライブラリーのアミノ酸配列をコードするDNAセグメントを含む核酸ライブラリーを構築する。
【請求項62】
以下の工程をさらに含む請求項54の方法:
ヒットライブラリーのアミノ酸位置変種プロフィールを作成し;
アミノ酸位置変種を対応するトリヌクレオチドコドンに逆翻訳することにより、ヒットライブラリーのアミノ酸位置変種プロフィールを核酸位置変種プロフィールに変換し;そして
核酸位置変種をコンビナトリアル的に組合せてDNAセグメントの縮重核酸ライブラリーを構築する。
【請求項63】
リード配列に基づいて変異抗体のライブラリーを構築するためのコンピューターによる方法であって、この方法は以下の工程を含む:
入力としてリード抗体のCDR領域中の少なくとも3つの連続的アミノ酸残基を含むアミノ酸配列を取り(アミノ酸配列はリード配列である);
コンピューターが実行できるロジックを使用してリード配列を複数のテスタータンパク質配列と比較し;
複数のテスタータンパク質配列から、リード配列と少なくとも15%の配列同一性を有する少なくとも2つのペプチドセグメントを選択し;そして
出力として、ヒットライブラリーを形成する選択されたペプチドを作成する。
【請求項64】
リード配列に基づいて変異抗体のライブラリーを構築するためのロジックを含むコンピューターで読める媒体であって、ロジックは、
入力としてリード抗体のCDRの少なくとも3つの連続的アミノ酸残基を含むアミノ酸配列を取り(アミノ酸配列はリード配列である);
リード配列を複数のテスタータンパク質配列と比較し;
複数のテスタータンパク質配列から、リード配列と少なくとも15%の配列同一性を有する少なくとも2つのペプチドセグメントを選択し;そして
出力として、ヒットライブラリーを形成する選択されたペプチドを作成する、ロジックを含む上記媒体。
【請求項65】
リード抗体の構造に基づいて抗体のライブラリーを構築する方法であって、この方法は以下の工程を含む:
リード抗体の重鎖(VH)または軽鎖(VL)の可変領域のアミノ酸配列を提供し(リード抗体は、リード構造鋳型として定義される既知の3次元構造を有する);
リード抗体のCDR中のアミノ酸配列を同定し;
リード抗体のVHまたはVL領域中の1つのCDRを選択し;
選択されたCDR中に少なくとも3つの連続したアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を提供し(選択されたアミノ酸配列はリード配列である);
リード配列を複数のテスタータンパク質配列と比較し;
複数のテスタータンパク質配列から、リード配列と少なくとも10%の配列同一性を有する少なくとも2つのペプチドセグメントを選択し(選択されたペプチドセグメントはヒットライブラリーを形成する);
スコア化関数を使用して、ヒットライブラリーのメンバーがリード構造鋳型と構造的に適合性があるかどうかを決定し;そして
リード配列と同等であるかまたはよりすぐれたスコアのヒットライブラリーのメンバーを選択する。
【請求項66】
リード配列の長さは5〜100aaである、請求項65の方法。
【請求項67】
リード配列の長さは6〜80aaである、請求項65の方法。
【請求項68】
リード配列の長さは8〜50aaである、請求項65の方法。
【請求項69】
CDR中のアミノ酸配列を同定する工程は、Kabat基準またはチョチア(Chothia)基準を使用して行われる、請求項65の方法。
【請求項70】
リード配列は、CDR1、CDR2、CDR3、FR1-CDR1、CDR1-FR2、FR2-CDR2、CDR2-FR3、FR3-CDR3、CDR3-FR4、FR1-CDR1-FR2、FR2-CDR2-FR3、およびFR3-CDR3-FR4よりなる群から選択されるリード抗体のVHまたはVL内の領域からのアミノ酸配列を含む、請求項65の方法。
【請求項71】
リード配列は、選択されたCDR中に少なくとも6つの連続的アミノ酸残基を含む、請求項65の方法。
【請求項72】
リード配列は、選択されたCDR中に少なくとも7つの連続的アミノ酸残基を含む、請求項65の方法。
【請求項73】
リード配列は、選択されたCDR中にすべてのアミノ酸残基を含む、請求項65の方法。
【請求項74】
リード配列は、選択されたCDRにすぐ隣接する少なくとも1つのアミノ酸残基をさらに含む、請求項65の方法。
【請求項75】
リード配列は、選択されたCDRにフランクするFR中に少なくとも1つのアミノ酸残基をさらに含む、請求項65の方法。
【請求項76】
リード配列は、選択されたCDRのC末端またはN末端に隣接する1つ以上のCDRもしくはFRをさらに含む、請求項65の方法。
【請求項77】
複数のテスタータンパク質配列は抗体配列を含む、請求項65の方法。
【請求項78】
複数のテスタータンパク質配列はヒト抗体配列を含む、請求項65の方法。
【請求項79】
複数のFRテスタータンパク質配列は、VHまたはVL中に少なくとも70%のヒト配列を有するヒト化抗体配列を含む、請求項65の方法。
【請求項80】
複数のFRテスタータンパク質配列は、ヒト生殖細胞系抗体配列を含む、請求項65の方法。
【請求項81】
複数のテスタータンパク質配列は、抗体のCDRについてNIHのジーンバンク、Swiss-Protデータベース、およびKabatデータベースからなるデータベースから検索される、請求項65の方法。
【請求項82】
リード配列を複数のテスタータンパク質配列と比較する工程は、BLAST、PSI-BLAST、プロフィールHMM、およびCOBLATHよりなる群から選択されるアルゴリズムにより行われる、請求項65の方法。
【請求項83】
ヒットライブラリー中の選択されたペプチドセグメントとリード配列との配列同一性は、少なくとも25%である、請求項65の方法。
【請求項84】
ヒットライブラリー中の選択されたペプチドセグメントとリード配列との配列同一性は、少なくとも35%である、請求項65の方法。
【請求項85】
ヒットライブラリー中の選択されたペプチドセグメントとリード配列との配列同一性は、少なくとも45%である、請求項65の方法。
【請求項86】
スコア化関数は、静電的相互作用、ファンデアワールス相互作用、静電的溶媒和エネルギー、溶媒がアクセス可能な表面溶媒和エネルギー、およびコンフォメーションエントロピーよりなる群から選択されるエネルギースコア化関数である、請求項65の方法。
【請求項87】
スコア化関数は、Amberフォースフィールド(forcefiled)、Charmm フォースフィールド、Discover cvff フォースフィールド、ECEPP フォースフィールド、GROMOS フォースフィールド、OPLS フォースフィールド、MMFF94 フォースフィールド、Tripos フォースフィールド、MM3 フォースフィールド、Dreiding フォースフィールド、およびUNRES フォースフィールドよりなる群から選択されるフォースフィールドを含むスコア化関数である、請求項65の方法。
【請求項88】
ヒットライブラリーのメンバーを選択する工程は、
ΔEtotal = Evdw + Ebond + Eangel + Eelectrostatics + Esolvation
の式に基づいて計算されるリード配列より低いかまたは同等の総エネルギーを有するヒットライブラリーのメンバーを選択することを含む、請求項65の方法。
【請求項89】
ヒットライブラリーのメンバーを選択する工程は、改良されたスコア化関数
ΔGb = ΔGMM + ΔGsol - TΔSSS
(式中、
ΔGMM = ΔGele + ΔGvdw (1)
ΔGsol = ΔGele-sol + ΔGASA (2))
を使用して、結合状態と非結合状態の差として計算されるリード配列より小さい結合フリーエネルギーを有するヒットライブラリーのメンバーを選択することを含む、請求項65の方法。
【請求項90】
リード構造鋳型は完全に組み立てられたリード抗体である、請求項65の方法。
【請求項91】
リード構造鋳型はリード抗体のVHまたはVLの3D構造である、請求項65の方法。
【請求項92】
リード構造鋳型は、リード抗体のCDRまたはFRの3D構造またはこれらの組合せである、請求項65の方法。
【請求項93】
リード構造鋳型は、X線結晶解析、核磁気共鳴(NMR)分光法、または理論的構造モデル化から得られる構造である、請求項65の方法。
【請求項94】
以下の工程をさらに含む請求項65の方法:
ヒットライブラリーのアミノ酸配列をコードするDNA配列を含む核酸ライブラリーを構築する。
【請求項95】
以下の工程をさらに含む請求項65の方法:
ヒットライブラリーのアミノ酸位置変種プロフィールを作成し;
アミノ酸位置変種を対応する遺伝子コドンに逆翻訳することにより、ヒットライブラリーのアミノ酸位置変種プロフィールを核酸位置変種プロフィールに変換し;そして
核酸位置変種をコンビナトリアル的に組合せてDNAセグメントの縮重核酸ライブラリーを構築する。
【請求項96】
遺伝子コドンは、細菌での発現に好適なものである、請求項95の方法。
【請求項97】
遺伝子コドンは、DNAセグメントの縮重核酸ライブラリーの多様性が、1×107 未満であるように選択される、請求項95の方法。
【請求項98】
遺伝子コドンは、DNAセグメントの縮重核酸ライブラリーの多様性が、1×106 未満であるように選択される、請求項95の方法。
【請求項99】
以下の工程をさらに含む請求項95の方法:
縮重核酸ライブラリーのDNAセグメントを宿主生物細胞中に導入し;
縮重核酸ライブラリーによりコードされるヒットライブラリーのアミノ酸配列を含有する組換え抗体が宿主生物細胞中で産生されるように、DNAセグメントを宿主細胞中で発現させ;そして
106 M-1より高い親和性で標的抗原に結合する組換え抗体を選択する。
【請求項100】
選択された組換え抗体の親和性が108 M-1より高い、請求項99の方法。
【請求項101】
選択された組換え抗体の親和性が109 M-1より高い、請求項99の方法。
【請求項102】
宿主生物は、細菌、酵母、植物、昆虫および哺乳動物よりなる群から選択される、請求項99の方法。
【請求項103】
組換え抗体は、完全に組み立てられた抗体、Fab断片、Fv断片、または1本鎖抗体よりなる群から選択される、請求項99の方法。
【請求項104】
組換え抗体はファージ粒子の表面上に表示される、請求項99の方法。
【請求項105】
ファージ粒子の表面上に表示される組換え抗体は、VHとVLにより形成される2本鎖ヘテロダイマーである、請求項104の方法。
【請求項106】
VHおよびVL鎖のヘテロダイマー化は、それぞれVHとVL鎖に融合した2つの非抗体ポリペプチド鎖の間で形成されたヘテロダイマーにより促進される、請求項105の方法。
【請求項107】
非抗体ポリペプチド鎖は、それぞれヘテロダイマー受容体GABAB R1(GR1)とR2(GR2)から得られる、請求項106の方法。
【請求項108】
ファージ粒子の表面上に表示される組換え抗体は、ペプチドリンカーで連結されたVHとVLを含有する1本鎖抗体である、請求項104の方法。
【請求項109】
ファージ粒子の表面上の1本鎖抗体の表示は、1本鎖抗体とGR1との融合体とファージpIIIキャプシドタンパク質とGR2との融合体とで形成されるヘテロダイマーにより促進される、請求項108の方法。
【請求項110】
標的抗原は、小有機分子、タンパク質、ペプチド、核酸およびポリ炭水化物よりなる群から選択される、請求項99の方法。
【請求項111】
抗体配列のライブラリーを構築する方法であって、この方法は以下の工程を含む:
リード抗体の重鎖(VH)または軽鎖(VL)の可変領域のアミノ酸配列を提供し(リード抗体は、リード構造鋳型として定義される既知の3次元構造を有する);
リード抗体のCDR中のアミノ酸配列を同定し;
リード抗体のVHまたはVL領域中の1つのCDRを選択し;
選択されたCDR中に少なくとも3つの連続したアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を提供し(選択されたアミノ酸配列はリード配列である);
リード配列プロフィールを複数のテスタータンパク質配列と比較し;
複数のテスタータンパク質配列から、リード配列と少なくとも10%の配列同一性を有する少なくとも2つのペプチドセグメントを選択し(選択されたペプチドセグメントはヒットライブラリーを形成する);
リード配列の各位置に現れるアミノ酸変種の頻度に基づきヒットライブラリーの適用ウイルス粒子を作成し;
ヒットライブラリー中のアミノ酸変種を組合せて、ヒット変種ライブラリーを形成するヒット変種の組合せを作成し;
スコア化関数を使用して、ヒット変種ライブラリーのメンバーがリード構造鋳型と構造的に適合性があるかどうかを決定し;そして
リード配列と同等であるかまたはよりすぐれたスコアのヒット変種ライブラリーのメンバーを選択する。
【請求項112】
ヒットライブラリー中のアミノ酸変種を組合せる工程は以下を含む請求項111の方法:
出現頻度が4回より大きいアミノ酸変種を選択する。
【請求項113】
ヒットライブラリー中のアミノ酸変種を組合せる工程は以下を含む請求項111の方法:
出現頻度が6回より大きいアミノ酸変種を選択する。
【請求項114】
ヒットライブラリー中のアミノ酸変種を組合せる工程は以下を含む請求項111の方法:
出現頻度が各位置で総変種の5%より大きいアミノ酸変種を選択する。
【請求項115】
ヒットライブラリー中のアミノ酸変種を組合せる工程は以下を含む請求項111の方法:
出現頻度が各位置で総変種の10%より大きいアミノ酸変種を選択し;そして
ヒットライブラリー中の選択されたアミノ酸変種を組合せて、ヒット変種ライブラリーを形成するヒット変種の組合せを生成する。
【請求項116】
ヒットライブラリー中のアミノ酸変種を組合せる工程は以下を含む請求項111の方法:
出現頻度が各位置で総変種の5%より大きいアミノ酸変種を選択し;
出現頻度が各位置で総変種の5%と等しいかまたはそれより小さい場合、リード配列のアミノ酸を選択し;そして
ヒットライブラリー中の選択されたアミノ酸変種を組合せて、ヒット変種ライブラリーを形成するヒット変種の組合せを生成する。
【請求項117】
スコア化関数は、静電的相互作用、ファンデアワールス相互作用、静電的溶媒和エネルギー、溶媒がアクセス可能な表面溶媒和エネルギー、およびコンフォメーションエントロピーよりなる群から選択されるエネルギースコア化関数である、請求項111の方法。
【請求項118】
スコア化関数は、Amberフォースフィールド(forcefiled)、Charmm フォースフィールド、Discover cvff フォースフィールド、ECEPP フォースフィールド、GROMOS フォースフィールド、OPLS フォースフィールド、MMFF94 フォースフィールド、Tripos フォースフィールド、MM3 フォースフィールド、Dreiding フォースフィールド、およびUNRES フォースフィールドよりなる群から選択されるフォースフィールドを含むスコア化関数である、請求項111の方法。
【請求項119】
以下の工程をさらに含む請求項111の方法:
ヒットライブラリーの選択されたメンバーのアミノ酸配列をコードするDNAセグメントを含む核酸ライブラリーを構築する。
【請求項120】
以下の工程をさらに含む請求項111の方法:
ヒット変種ライブラリーの選択されたメンバーを少なくとも2つのサブヒット変種ライブラリーに分解し;
サブヒット変種ライブラリーのアミノ酸位置変種プロフィールを作成し;
アミノ酸位置変種を対応する遺伝子コドンに逆翻訳することにより、選択されたサブヒット変種ライブラリーのアミノ酸位置変種プロフィールを核酸位置変種プロフィールに変換し;そして
核酸位置変種をコンビナトリアル的に組合せてDNAセグメントの縮重核酸ライブラリーを構築する。
【請求項121】
ヒット変種ライブラリーを分解する工程は以下を含む請求項120の方法:
リード配列と同等かまたはより優れたスコアを有するヒット変種ライブラリーの10〜30メンバーをランダムに選択する(選択されたメンバーはサブ変種ライブラリーを形成する)。
【請求項122】
ヒット変種ライブラリーを分解する工程は以下を含む請求項120の方法:
ヒット変種ライブラリーのアミノ酸位置変種プロフィールを作成して、ヒット変種プロフィールを得て;そして
ある距離のカットオフ(4.5Å〜8Å)を使用して、リード構造鋳型のCα、Cβまたは重い原子の接触地図に基づき、ヒット変種プロフィールをサブ変種プロフィールのセグメントに分解する。
【請求項123】
ヒット変種ライブラリーを分解する工程は以下を含む請求項120の方法:
ヒット変種ライブラリーのアミノ酸位置変種プロフィールを作成して、ヒット変種プロフィールを得て;そして
6Å−8Åの距離カットオフを使用して、リード構造鋳型のCα、Cβまたは重い原子の接触地図に基づき、ヒット変種プロフィールをサブ変種プロフィールのセグメントに分解する。
【請求項124】
複数の抗体の構造集合体に基づいて抗体のライブラリーを構築する方法であって、この方法は以下の工程を含む:
リード抗体の重鎖(VH)または軽鎖(VL)の可変領域のアミノ酸配列を提供し(リード抗体は、既知の3次元構造を有する);
リード抗体以外のVHもしくはVL領域中の異なる配列を有する1つ以上の抗体の3D構造を提供し;
リード抗体と1つ以上の抗体とを組合せて構造集合体を形成し(構造集合体はリード構造鋳型として定義される);
リード抗体のCDR中のアミノ酸配列を同定し;
リード抗体のVHまたはVL領域中の1つのCDRを選択し;
選択されたCDR中に少なくとも3つの連続したアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を提供し(選択されたアミノ酸配列はリード配列である);
リード配列を複数のテスタータンパク質配列と比較し;
複数のテスタータンパク質配列から、リード配列と少なくとも10%の配列同一性を有する少なくとも2つのペプチドセグメントを選択し(選択されたペプチドセグメントはヒットライブラリーを形成する);
リード配列の各位置に現れるアミノ酸変種の頻度に基づきヒットライブラリーのアミノ酸位置変種プロフィールを作成し;
ヒットライブラリー中のアミノ酸変種を組合せて、ヒット変種ライブラリーを形成するヒット変種の組合せを生成させ;
スコア化関数を使用して、ヒット変種ライブラリーのメンバーがリード構造鋳型と構造的に適合性があるかどうかを決定し;そして
リード配列と同等であるかまたはよりすぐれたスコアのヒット変種ライブラリーのメンバーを選択する。
【請求項125】
リード抗体の構造に基づいて抗体のライブラリーを構築する方法であって、この方法は以下の工程を含む:
a) リード抗体の重鎖(VH)または軽鎖(VL)の可変領域のアミノ酸配列を提供し(リード抗体は、既知の3次元構造を有する);
b) リード抗体のCDR中のアミノ酸配列を同定し;
c) リード抗体のVHまたはVL領域中の1つのCDRを選択し;
d) 選択されたCDR中に少なくとも3つの連続したアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を提供し(選択されたアミノ酸配列はリード配列として定義される);
e) リード配列を複数のテスタータンパク質配列と比較し;
f) 複数のテスタータンパク質配列から、リード配列と少なくとも10%の配列同一性を有する少なくとも2つのペプチドセグメントを選択し(選択されたペプチドセグメントはヒットライブラリーを形成する);
g) リード配列の各位置に現れるアミノ酸変種の頻度に基づきヒットライブラリーのアミノ酸位置変種プロフィールを作成し;
h) ヒットライブラリー中のアミノ酸変種を組合せて、ヒット変種ライブラリーを形成するヒット変種の組合せを生成させ;
i) スコア化関数を使用して、ヒット変種ライブラリーのメンバーがリード構造鋳型と構造的に適合性があるかどうかを決定し;
j) リード配列と同等であるかまたはよりすぐれたスコアのヒット変種ライブラリーのメンバーを選択し;
k) ヒット変種ライブラリーの選択されたメンバーのアミノ酸配列をコードするDNAセグメントを含む縮重核酸ライブラリーを構築し;
l) 核酸ライブラリーの多様性を決定し、多様性が1×106より大きい場合は、核酸ライブラリーの多様性が1×106と等しいかまたはより小さくなるまで工程j)〜l)を繰り返し;
m) 縮重核酸ライブラリー中のDNAセグメントを宿主生物の細胞中に導入し;
n) ヒットライブラリーのアミノ酸配列を含有する組換え抗体が宿主生物細胞中で産生されるように、DNAセグメントを宿主細胞中で発現させ;
o) 106 M-1より高い親和性で標的抗原に結合する組換え抗体を選択し;そして
p) 106 M-1より高い親和性で標的抗原に結合する組換え抗体が見つからない場合、工程e)〜o)を繰り返す。
【請求項126】
リード抗体の構造に基づいて抗体のライブラリーを構築する方法であって、この方法は以下の工程を含む:
a) リード抗体の重鎖(VH)または軽鎖(VL)の可変領域のアミノ酸配列を提供し(リード抗体は、リード構造鋳型として定義される既知の3次元構造を有する);
b) リード抗体のCDR中のアミノ酸配列を同定し;
c) リード抗体のVHまたはVL領域中の1つのCDRを選択し;
d) 選択されたCDR中に少なくとも3つの連続したアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を提供し(選択されたアミノ酸配列はリード配列として定義される);
e) リード配列の1つ以上のアミノ酸残基を1つ以上の異なるアミノ酸残基で置換してリード配列を変異させて、リード配列変異体ライブラリーを作成し;
f) 第1のスコア化関数を使用して、リード配列変異体ライブラリーがリード構造鋳型と構造的に適合性があるかどうかを決定し;
g) リード配列と同等であるかまたはよりすぐれたスコアのリード配列変異体を選択し;
h) リード配列を複数のテスタータンパク質配列と比較し;
i) 複数のテスタータンパク質配列から、リード配列と少なくとも10%の配列同一性を有する少なくとも2つのペプチドセグメントを選択し(選択されたペプチドセグメントはヒットライブラリーを形成する);
j) リード配列の各位置に現れるアミノ酸変種の頻度に基づきヒットライブラリーのアミノ酸位置変種プロフィールを作成し;
k) ヒットライブラリー中のアミノ酸変種を組合せて、ヒット変種の組合せを生成させ;
l) 選択された配列変異体をヒット変種の組合せと組合せて、ヒット変種ライブラリーを産生させ;
m) 第2のスコア化関数を使用して、ヒット変種ライブラリーのメンバーがリード構造鋳型と構造的に適合性があるかどうかを決定し;
n) リード配列と同等であるかまたはよりすぐれたスコアのヒット変種ライブラリーのメンバーを選択し;
o) ヒット変種ライブラリーの選択されたメンバーのアミノ酸配列をコードするDNAセグメントを含む縮重核酸ライブラリーを構築し;
p) 核酸ライブラリーの多様性を決定し、多様性が1×106より大きい場合は、核酸ライブラリーの多様性が1×106と等しいかまたはより小さくなるまで工程n)〜p)を繰り返し;
q) 縮重核酸ライブラリー中のDNAセグメントを宿主生物の細胞中に導入し;
r) ヒットライブラリーのアミノ酸配列を含有する組換え抗体が宿主生物細胞中で産生されるように、DNAセグメントを宿主細胞中で発現させ;
s) 106 M-1より高い親和性で標的抗原に結合する組換え抗体を選択し;そして
t) 106 M-1より高い親和性で標的抗原に結合する組換え抗体が見つからない場合、工程e)〜s)を繰り返す。
【請求項127】
以下の工程を含む、設計されるタンパク質のライブラリーを構築する方法:
リードタンパク質から得られるアミノ酸配列を提供し(このアミノ酸配列はリード配列と呼ぶ);
リード配列を複数のテスタータンパク質配列と比較し;そして
複数のFRテスタータンパク質配列から、リード配列と少なくとも15%の配列同一性を有する少なくとも2つのペプチドセグメントを選択し(選択されたペプチドセグメントはヒットライブラリーを形成する);そして
リード配列をヒットライブラリーで置換して設計されるタンパク質のライブラリーを形成する。
【請求項128】
リード配列の長さは好ましくは5〜100aaである、請求項127の方法。
【請求項129】
リード配列の長さは好ましくは6〜80aaである、請求項127の方法。
【請求項130】
リード配列の長さは好ましくは8〜50aaである、請求項127の方法。
【請求項131】
リードタンパク質は、酵素受容体、サイトカイン、腫瘍サプレッサー、ケモカイン、抗体および増殖因子よりなる群から選択される種類のタンパク質である、請求項127の方法。
【請求項132】
複数のテスタータンパク質配列はヒトタンパク質配列を含む、請求項127の方法。
【請求項133】
複数のテスタータンパク質配列は、それぞれ少なくとも70%のヒト配列を有するヒト化タンパク質配列を含む、請求項127の方法。
【請求項134】
複数のテスタータンパク質配列は、ジーンバンク(GenBank)またはSwiss-Protデータベースのタンパク質データベースから検索される、請求項127の方法。
【請求項135】
リード配列を複数のテスタータンパク質配列と比較する工程は、BLAST、PSI-BLAST、プロフィールHMM、およびCOBLATHよりなる群から選択されるアルゴリズムにより行われる、請求項127の方法。
【請求項136】
ヒットライブラリー中の選択されたペプチドセグメントとリード配列との配列同一性は、少なくとも25%である、請求項127の方法。
【請求項137】
ヒットライブラリー中の選択されたペプチドセグメントとリード配列との配列同一性は、少なくとも35%である、請求項127の方法。
【請求項138】
ヒットライブラリー中の選択されたペプチドセグメントとリード配列との配列同一性は、少なくとも45%である、請求項127の方法。
【請求項139】
以下の工程を含む請求項127の方法:
設計されるタンパク質のライブラリーから所望の機能を有するタンパク質を選択する。
【請求項140】
所望の機能はリードタンパク質の改良された生物学的機能である、請求項139の方法。
【請求項141】
改良された生物学的機能は、安定性の増強、酵素活性の増強、リードタンパク質の同種のリガンドへの結合親和性の増強、およびあらかじめ決められた生物の発現の増強よりなる群から選択される、請求項140の方法。
【請求項142】
以下の工程をさらに含む請求項127の方法:
ヒットライブラリーのアミノ酸配列をコードするDNAセグメントを含む核酸ライブラリーを構築する。
【請求項143】
以下の工程をさらに含む請求項127の方法:
ヒットライブラリーのアミノ酸位置変種プロフィールを作成し;
ヒットライブラリー中のアミノ酸変種を組合せて、ヒット変種ライブラリーを形成するヒット変種の組合せを生成し;そして
ヒット変種ライブラリーから好ましい機能を有するタンパク質を選択する。
【請求項144】
以下の工程をさらに含む請求項143の方法:
スコア化関数を使用して、ヒットライブラリーのメンバーが構造的に、リード配列またはリードタンパク質の3次元構造と適合するかどうかを決定し;そして
リード配列またはリードタンパク質とスコアが同等かまたはより優れたメンバーを選択する。
【請求項145】
リード配列またはリードタンパク質の3次元構造は、X線結晶解析、核磁気共鳴(NMR)分光法、または理論的構造モデル化から得られる構造である、請求項144の方法。
【請求項146】
スコア化関数は、静電的相互作用、ファンデアワールス相互作用、静電的溶媒和エネルギー、溶媒がアクセス可能な表面溶媒和エネルギー、およびコンフォメーションエントロピーよりなる群から選択されるエネルギースコア化関数である、請求項144の方法。
【請求項147】
スコア化関数は、Amberフォースフィールド(forcefiled)、Charmm フォースフィールド、Discover cvff フォースフィールド、ECEPP フォースフィールド、GROMOS フォースフィールド、OPLS フォースフィールド、MMFF94 フォースフィールド、Tripos フォースフィールド、MM3 フォースフィールド、Dreiding フォースフィールド、およびUNRES フォースフィールドよりなる群から選択されるフォースフィールドを含むスコア化関数である、請求項127の方法。
【請求項148】
メンバーを選択する工程は、
ΔEtotal = Evdw + Ebond + Eangel + Eelectrostatics + Esolvation
の式に基づいて計算されるリード配列またはリードタンパク質より低いかまたは同等の総エネルギーを有するメンバーを選択することを含む、請求項143の方法。
【請求項149】
メンバーを選択する工程は、改良されたスコア化関数
ΔGb = ΔGMM + ΔGsol - TΔSSS
(式中、
ΔGMM = ΔGele + ΔGvdw (1)
ΔGsol = ΔGele-sol + ΔGASA (2))
を使用して、結合状態と非結合状態の差として計算されるリード配列またはリードタンパク質より小さい結合フリーエネルギーを有するメンバーを選択することを含む、請求項143の方法。
【請求項150】
以下の工程をさらに含む請求項127の方法:
設計されるタンパク質のライブラリーのアミノ酸配列をコードするDNAセグメントを含む核酸ライブラリーを構築し;
核酸ライブラリーを発現させて組換えタンパク質のライブラリーを作成し;そして
組換えタンパク質のライブラリーから所望の機能を有するタンパク質を選択する。
【請求項151】
以下の工程をさらに含む請求項127の方法:
ヒットライブラリーのアミノ酸位置変種プロフィールを作成し;
アミノ酸位置変種を対応する遺伝子コドンに逆翻訳することにより、ヒットライブラリーのアミノ酸位置変種プロフィールを核酸位置変種プロフィールに変換し;
核酸位置変種をコンビナトリアル的に組合せてDNAセグメントの縮重核酸ライブラリーを構築し;
縮重核酸ライブラリーを発現させて組換えタンパク質のライブラリーを作成し;そして
組換えタンパク質のライブラリーから所望の機能を有するタンパク質を選択する。
【請求項152】
抗体のVEGFへの結合親和性が106 M-1より高く、モノクローナル抗体の重鎖CDR3は、配列番号36〜48および63〜125よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ヒト血管内皮増殖因子(VEGF)に対する抗体。
【請求項153】
抗体の重鎖CDR1は、配列番号19〜30よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項152の抗体。
【請求項154】
モノクローナル抗体の重鎖CDR2は、配列番号31〜305よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項152の抗体。
【請求項155】
抗体は、モノクローナル抗体、Fab、Fv、または1本鎖抗体である、請求項152の抗体。
【請求項156】
抗体のVEGFへの結合親和性が106 M-1より高く、抗体の重鎖可変領域(VH)は、配列番号126、128、129、130、および131よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、抗体の軽鎖可変領域(VL)は配列番号127のアミノ酸配列を含む、ヒト血管内皮増殖因子(VEGF)に対する抗体。

【図1A】
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【図1B】
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【図1C】
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【図1D】
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【図1E】
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【図1F】
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【図1G】
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【図1H】
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【図2A】
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【図2B】
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【図2C】
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【図3】
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【図4】
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【図5】
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【図6】
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【図7】
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【図8】
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【図9A−B】
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【図10A】
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【図10B】
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【図11】
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【図12A−B】
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【図12C】
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【図12D−E】
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【図13A】
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【図13B】
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【図13C】
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【図14A】
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【図14B】
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【図14C】
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【図15A】
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【図15B】
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【図16A】
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【図16B】
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【図17A】
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【図17B】
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【図18】
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【図19A】
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【図19B】
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【図19C】
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【図19D】
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【図20】
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【図21】
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【図22A】
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【図22B】
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【図23A】
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【図23B】
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【図24】
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【図25A】
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【図25B】
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【図26】
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【図27】
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【図28A】
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【図28B】
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【図28C】
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【図28D】
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【図29】
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【図30】
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【図31】
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【図32】
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【図33A】
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【図33B】
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【図34A】
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【図34B】
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【図35A−B】
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【図36】
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【図37】
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【図38A】
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【図38B−1】
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【図38B−2】
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【図38C】
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【図38D】
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【図39A】
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【図39B】
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【図40A】
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【図40B】
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【図41】
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【図42A】
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【図42B】
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【図42C】
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【図42D】
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【図43A】
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【図43B】
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【図44】
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【図45】
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【図46】
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【公開番号】特開2010−88451(P2010−88451A)
【公開日】平成22年4月22日(2010.4.22)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2009−284767(P2009−284767)
【出願日】平成21年12月16日(2009.12.16)
【分割の表示】特願2004−508241(P2004−508241)の分割
【原出願日】平成15年5月20日(2003.5.20)
【公序良俗違反の表示】
(特許庁注:以下のものは登録商標)
1.フロッピー
【出願人】(504041309)アブマクシス,インコーポレイティド (3)
【Fターム(参考)】