タンパク質リシンメチル化酵素Ｓｅｔ７／９の阻害物質を含有する疾患の予防・治療剤
【課題】本発明の目的は、ヒストンメチル化酵素Ｓｅｔ７／９阻害剤、がん細胞の増殖抑制剤、及び、エストロゲン受容体の過剰に起因する疾患の予防・治療剤を提供することにある。
【解決手段】本発明者らは、上記課題を解決するべく、発明者らが独自に開発したハイスループットなＨＭＴ活性測定法を適用してスクリーニングを実施し、シプロヘプタジンをＳｅｔ７／９の阻害物質として同定した。さらに、シプロヘプタジンは、in vitroにおいてＳｅｔ７／９を選択的に阻害し、乳がん細胞のＥＲαの発現レベルを低下させ、乳がん細胞のエストロゲン依存的な増殖を抑制した。このことから、Ｓｅｔ７／９阻害物質が、エストロゲン受容体の過剰に起因する疾患の予防・治療剤になりうることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【解決手段】本発明者らは、上記課題を解決するべく、発明者らが独自に開発したハイスループットなＨＭＴ活性測定法を適用してスクリーニングを実施し、シプロヘプタジンをＳｅｔ７／９の阻害物質として同定した。さらに、シプロヘプタジンは、in vitroにおいてＳｅｔ７／９を選択的に阻害し、乳がん細胞のＥＲαの発現レベルを低下させ、乳がん細胞のエストロゲン依存的な増殖を抑制した。このことから、Ｓｅｔ７／９阻害物質が、エストロゲン受容体の過剰に起因する疾患の予防・治療剤になりうることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒストンメチル化酵素Ｓｅｔ７／９阻害剤、がん細胞の増殖抑制剤、及び、エストロゲン受容体の過剰に起因する疾患の予防・治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ステロイドホルモンの一種であるエストロゲンは、その核内受容体であるエストロゲン受容体（ＥＲα）を介して特定の遺伝子の転写を活性化する（図１）。エストロゲンが結合したＥＲαは、リン酸化を受けた後二量体化し、例えばＮＣＯＡ１等のco-activatorとＥＲＥ（estrogen response element）に結合して下流の遺伝子の転写を活性化する。エストロゲンシグナルの生理的な役割として、乳腺細胞の増殖促進、卵巣排卵制御、脂質代謝制御、及び、インスリン作用などが知られている。また、多くの乳がん（約７５％）ではＥＲαを過剰に発現しており、ＥＲα依存的に細胞増殖することから、エストロゲンシグナルを標的とした抗がん剤がこれまでに開発されている。
【０００３】
エストロゲンシグナルを標的とした既存の抗がん剤としては、タモキシフェン等のＥＲαのアンタゴニストの他、エストロゲン生成に関わるアロマターゼの阻害剤などが存在する（図２）。しかし、タモキシフェンには、長期間投与すると、乳がん細胞に耐性が生じるという問題点がある。また、タモキシフェンは生体内でＣＹＰ２Ｄ６（チトクローム Ｐ４５０ ２Ｄ６）によりエンドキシフェンに代謝されて強い抗腫瘍効果を発揮するという作用機序を有するため、ＣＹＰ２Ｄ６を欠損した患者では効果が弱いという問題点もある。一方、前述のアロマターゼの阻害剤の場合、エストロゲン量そのものを低下させてしまうため、生体に必要なエストロゲンの機能まで損なわれるという問題点がある。例えば、エストロゲンは破骨細胞のアポトーシスを誘導し、骨密度の維持に寄与しているため、アロマターゼ阻害剤により、骨代謝異常などの副作用が生じる場合がある。このように、エストロゲンシグナルを標的とした既存の抗がん剤には問題点があった。
【０００４】
一方、ＥＲαの分解制御に関連して、ＥＲαの３０２番目のリシン残基（Ｋ３０２）が、ユビキチン化やメチル化といったタンパク質の翻訳後修飾を受けることが知られている。ユビキチン化とは、ユビキチンと呼ばれる７６アミノ酸からなるタンパク質のＣ末端グリシン残基が、３つの酵素、すなわち、ユビキチン活性化酵素（Ｅ１）、ユビキチン結合酵素（Ｅ２）、さらにユビキチン転移酵素（ユビキチンリガーゼ）（Ｅ３）からなるユビキチンシステムによって標的タンパク質のリシン残基に結合され、ユビキチンが標的タンパク質に付加される反応である。また、メチル化とは、タンパク質やＤＮＡ、様々な基質にメチル基が置換または付加される反応である。タンパク質のメチル化では、メチル化酵素の触媒作用によって、通常、アルギニン残基又はリシン残基にメチル基が付加される。アルギニン残基は２箇所までメチル化され、リシン残基は３箇所までメチル化され得る。
【０００５】
前述のＥ３ユビキチンリガーゼのうち、ＥＲαのＥ３ユビキチンリガーゼとしては、ＭＤＭ２、ＣＨＩＰ、及び、ＢＲＣＡ１／ＢＡＲＤ複合体が知られており、ＥＲαのＫ３０２がユビキチン化されると、ＥＲαはプロテアソームで分解される（非特許文献１）。一方で、メチル化酵素Ｓｅｔ７／Ｓｅｔ９（両者は同一酵素であり、以後Ｓｅｔ７／９と簡略表記する）は、ＥＲαのＫ３０２をメチル化することでＥＲαのユビキチン化を阻害し、プロテアソームでのＥＲαの分解を阻害すると考えられている（非特許文献２）。すなわち、Ｓｅｔ７／９によるＥＲαのメチル化は、ＥＲαのユビキチン化を抑制することにより、ＥＲαの安定性を増加させる（図３）。
【０００６】
Ｓｅｔ７／９は、当初ヒストンＨ３のＫ４（４番目のリシン残基）のεアミノ基をメチル化する酵素として発見されたが、現在はＥＲαやｐ５３等の非ヒストンタンパク質をメチル化することが知られている。Ｓｅｔ７／９の既知の標的タンパク質を表１に示す。
【０００７】
【表１】
【０００８】
また、Ｓｅｔ７／９は、メチル化活性に必要なＳＥＴドメインを有するが、他のメチル化酵素Ｇ９ａやＳＵＶ３９Ｈ１と異なり、システインに富んだｐｒｅ−ＳＥＴドメインや、ｐｏｓｔ−ＳＥＴドメインを持たないという特徴がある（図４）。そして、そのＸ線結晶構造解析から、多くのメチル化酵素と異なり、Ｓｅｔ７／９は主にモノメチル化反応を触媒すると考えられている（非特許文献３）。このように、Ｓｅｔ７／９に関する知見はいくつか得られていたものの、Ｓｅｔ７／９の機能（標的タンパク質のメチル化）を阻害する物質はこれまで知られていなかった。
【０００９】
また、シプロヘプタジン（cyproheptadine）は、抗アレルギー薬（抗ヒスタミン薬）として臨床で用いられている化合物である。しかし、このシプロヘプタジンがＳｅｔ７／９の機能を阻害することは全く知られていなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Eakin C M et al., PNAS, 104, 5794-5799 (2007)
【非特許文献２】Subramanian K et al., Molecular Cell, 30, 336-347 (2008)
【非特許文献３】Xiao B et al., Nature, 421, 652-656 (2003)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、ヒストンメチル化酵素Ｓｅｔ７／９阻害剤、がん細胞の増殖抑制剤、及び、エストロゲン受容体の過剰に起因する疾患の予防・治療剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決するべく、メチル化酵素Ｓｅｔ７／９に着目し、本発明者らが独自に開発したハイスループットなヒストンメチル化酵素活性の測定方法（特願２０１０−２０２４８４）を利用して、ケミカルライブラリーの１３，０００種の化合物から、Ｓｅｔ７／９阻害剤のスクリーニングを行い、シプロヘプタジンを同定した。そこで、本発明者らは、シプロヘプタジンについて解析を行い、（ａ）シプロヘプタジンがin vitroにおいてＳｅｔ７／９を選択的に阻害すること、（ｂ）シプロヘプタジンが、乳がん細胞においてＥＲαの発現レベルを低下させること、（ｃ）シプロヘプタジンが、乳がん細胞のエストロゲン依存的な増殖を抑制すること、及び、（ｄ）シプロヘプタジンが、乳がん細胞を移植したマウスにおいて、抗腫瘍効果（腫瘍の増殖抑制効果）を発揮することを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、本発明は、（１）シプロヘプタジン又はその塩を含有するヒストンメチル化酵素Ｓｅｔ７／９阻害剤に関する。
【００１４】
また、本発明は、（２）ヒストンメチル化酵素Ｓｅｔ７／９の阻害物質を含有する、がん細胞の増殖抑制剤や、（３）ヒストンメチル化酵素Ｓｅｔ７／９の阻害物質が、シプロヘプタジン又はその塩である上記（２）に記載のがん細胞の増殖抑制剤や、（４）がん細胞が、乳がん細胞である上記（３）に記載のがん細胞の増殖抑制剤に関する。
【００１５】
さらに、本発明は、（５）ヒストンメチル化酵素Ｓｅｔ７／９の阻害物質を含有する、エストロゲン受容体の過剰に起因する疾患の予防・治療剤や、（６）ヒストンメチル化酵素Ｓｅｔ７／９の阻害物質が、シプロヘプタジン又はその塩である上記（５）に記載の疾患の予防・治療剤や、（７）エストロゲン受容体の過剰に起因する疾患が、がんである上記（５）又は（６）に記載の疾患の予防・治療剤や、（８）がんが、乳がんである上記（７）に記載の疾患の予防・治療剤に関する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、ヒストンメチル化酵素Ｓｅｔ７／９を阻害することや、がん細胞の増殖を抑制することや、エストロゲン受容体の過剰に起因する疾患を予防及び／又は治療することができる。
【００１７】
また、本発明のヒストンメチル化酵素Ｓｅｔ７／９阻害剤や、がん細胞の増殖抑制剤や、エストロゲン受容体の過剰に起因する疾患の予防・治療剤は、エストロゲンシグナルを標的とした既存の抗がん剤等と作用機序が異なる。したがって、本発明は、かかる既存の抗がん剤で十分な増殖抑制効果や予防・治療効果が得られなかったがんに対しても、増殖抑制効果や予防・治療効果が期待でき、また、かかる既存の抗がん剤との併用効果も期待できる。
【００１８】
さらに、シプロヘプタジンは、抗アレルギー薬として既に市販されていて、重篤な副作用などの問題もほとんど無いことが期待され、実際、マウスへの投与試験では、毒性などの重篤な副作用は見られなかった。そのため、シプロヘプタジンを用いる場合は、今後の臨床開発に要するコストや労力が少なくて済み、実用性もきわめて高いという利点がある。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ＥＲαを介したエストロゲンシグナルの活性化について説明した図である。
【図２】エストロゲンシグナルを標的とした既存の抗がん剤、タモキシフェン及びアロマターゼ阻害剤について説明した図である。
【図３】ユビキチン化とメチル化によるＥＲαの分解制御について説明した図である。
【図４】Ｓｅｔ７／９の機能、構造について説明した図である。
【図５】蛍光ペプチド（ぺプチジルＭＣＡ）を用いたヒストンメチル化酵素測定法の原理を説明した図である。
【図６】蛍光ペプチド（ぺプチジルＭＣＡ）を用いたヒストンメチル化酵素の特異性を評価した結果を示す図である。Ｓｅｔ７／９及びＧ９ａはそれぞれの基質を特異的にメチル化し、Ｓｅｔ７／９はその基質の中でもＥＲα由来のＡｃ−ＥＲα（２９９−３０２）−ＭＣＡと最も高い反応性を示した。
【図７】Ｓｅｔ７／９のメチル化活性がシプロヘプタジンにより阻害されることを、蛍光検出及びウェスタンブロッティング法により示した図である。
【図８】シプロヘプタジンによるＳｅｔ７／９のメチル化活性の阻害様式が、拮抗阻害であることを示す図である。
【図９】シプロヘプタジンの添加、又はＳｅｔ７／９のノックダウンによりＥＲαのタンパク質発現量が低下するが、シプロヘプタジンの添加によりＡＲのタンパク質発現量は変化しないことを示す図である。
【図１０】シプロヘプタジンの添加が、タモキシフェンの添加と同様に、ＥＲＥの活性を抑制することを示す図である。
【図１１】シプロヘプタジンの添加が、タモキシフェンの添加と同様に、エストロゲン刺激によるｐＳ２のｍＲＮＡの発現を抑制することを示す図である。
【図１２】シプロヘプタジンの添加が、タモキシフェンの添加と同様に、ＭＣＦ７細胞のエストロゲン依存的な増殖を抑制することを示す図である。
【図１３】シプロヘプタジンの添加が、乳がん細胞の増殖を抑制することを示す図である。
【図１４】シプロヘプタジンの添加が、カンプトテシンにより誘導されるｐ５３の発現及び増殖抑制効果に、影響を与えないことを示す図である。
【図１５】シプロヘプタジンの抗腫瘍試験に用いる移植用マウスにおける、がん細胞の移植部位等を示す図である。
【図１６】シプロヘプタジンの抗腫瘍試験の投薬スケジュールや結果を示す図である。左上のグラフは、各群のマウスにおける相対腫瘍増殖率の平均値の推移を示し、右上のグラフは、各群のマウスの平均体重の増減の推移を示し、左下の表は、経過日数１１日及び１５日の各群のマウスにおける相対腫瘍増殖率の平均値を示し、右下の図は投薬スケジュールを示す。投薬スケジュールの上段の▼は、［Cyproheptadine塩酸水和物２０ｍｇ／ｋｇ×１ i.p.］群における投与サンプルの投与日を示し、中段の▼は、［Cyproheptadine塩酸水和物４０ｍｇ／ｋｇ×１ i.p.］群における投与サンプルの投与日を示し、下段の▼は、［Cyproheptadine塩酸水和物２０ｍｇ／ｋｇ×８ i.p.］群における投与サンプルの投与日を示す。
【図１７】シプロヘプタジンの急性毒性の有無を確認する試験の投薬スケジュールや、各群のマウスの平均体重の増減の推移を示す図である。投薬スケジュールの上段の▲は、［Cyproheptadine塩酸水和物２０ｍｇ／ｋｇ×１ i.p.］群における投与サンプルの投与日を示し、中段の▲は、［Cyproheptadine塩酸水和物４０ｍｇ／ｋｇ×１ i.p.］群における投与サンプルの投与日を示し、下段の▲は、［Cyproheptadine塩酸水和物２０ｍｇ／ｋｇ×８ i.p.］群における投与サンプルの投与日を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明のヒストンメチル化酵素Ｓｅｔ７／９阻害剤（以下、「本発明のＳｅｔ７／９阻害剤」とも略す。）としては、シプロヘプタジン又はその塩（以下、「シプロヘプタジン等」とも表示する。）を含有している限り特に制限されず、また、本発明のがん細胞の増殖抑制剤（以下、「本発明の増殖抑制剤」とも略す。）や、本発明のエストロゲン受容体（ＥＲα）の過剰に起因する疾患の予防・治療剤（以下、単に「本発明の予防・治療剤」とも表示する。）としては、Ｓｅｔ７／９の阻害物質（以下、「Ｓｅｔ７／９阻害物質」とも略す。）を含有している限り特に制限されない。本発明のＳｅｔ７／９阻害剤に関して、シプロヘプタジン等がＳｅｔ７／９を阻害する作用機序は不明である。また、本発明の増殖抑制剤や本発明の予防・治療剤の作用機序の詳細は不明であるが、Ｓｅｔ７／９阻害物質（例えば、シプロヘプタジン等）が、Ｓｅｔ７／９によるＥＲαのメチル化を阻害し、ＥＲαのユビキチン化及びその分解を促進して、細胞内の過剰なＥＲα量を低下させることで、がん細胞に対する増殖抑制効果を発揮したり、ＥＲαの過剰に起因する疾患に対する予防効果及び／又は治療効果を発揮する可能性が考えられる。なお、以下、本発明のＳｅｔ７／９阻害剤、本発明の増殖抑制剤、及び、本発明の予防・治療剤をまとめて、単に「本発明の剤」とも表示する。
【００２１】
上記の本発明におけるＳｅｔ７／９阻害物質としては、以下の一般式（化１）で表されるシプロヘプタジン（4-(5H-ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン-5-イリデン)-1-メチルピペリジン）又はその塩を好適に例示することができる。
【００２２】
【化１】
【００２３】
シプロヘプタジンの塩としては、特に制限されないが、薬学的に許容される無機酸又は有機酸の酸付加塩を好適に例示することができ、前述の無機酸の付加塩としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等を好適に例示することができ、前述の有機酸の付加塩としては、酢酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、アスコルビン酸塩等を好適に例示することができ、中でも、塩酸塩を特に好適に例示することができる。シプロヘプタジンやその塩は、市販のシプロヘプタジン塩酸塩を利用して適宜製造することができる。
【００２４】
本発明におけるＳｅｔ７／９阻害物質とは、Ｓｅｔ７／９（すなわち、Ｓｅｔ７／９タンパク質）が標的タンパク質又は標的ペプチドをメチル化することを阻害する物質を意味する。前述のＳｅｔ７／９タンパク質及びＳｅｔ７／９遺伝子としては、哺乳動物由来のものを好適に例示することができ、中でも、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー由来のものをより好適に例示することができ、中でも、ヒト由来のものとして、Ｇｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＮＭ＿０３０６４８、ＧＩ：８３０３５１３５に記載されたＳｅｔ７／９タンパク質やＳｅｔ７／９遺伝子を特に好適に例示することができる。かかるヒトＳｅｔ７／９遺伝子の塩基配列として、配列番号１に示される塩基配列を例示することができ、ヒトＳｅｔ７／９のアミノ酸配列として、配列番号２に示されるアミノ酸配列を例示することができる。Ｓｅｔ７／９の上記標的ペプチドとしては、ヒトのヒストンＨ３のアミノ酸番号１−４のアミノ酸残基からなるペプチド（ＡＲＴＫ；配列番号６）や、ヒトのｐ５３のアミノ酸番号３６９−３７２のアミノ酸残基からなるペプチド（ＬＫＳＫ；配列番号７）や、ヒトのＥＲαのアミノ酸番号２９９−３０２のアミノ酸残基からなるペプチド（ＫＲＳＫ；配列番号８）を好適に例示することができる。
【００２５】
ある物質がＳｅｔ７／９阻害活性を有しているかどうかは、本発明者らが独自に開発したヒストンメチル化酵素活性の測定方法（特願２０１０−２０２４８４）を好適に利用することができる。かかる測定方法の詳細は、前記特許出願に記載されているが、その測定原理の概要を図５に示す。図５から分かるように、まず、ヒストンメチル化酵素の基質となるペプチドと色素標識（ＭＣＡ：4-methyl-coumaryl-7-amide）を有するペプチジルＭ
ＣＡを、基質化合物として用意する。このペプチジルＭＣＡにトリプシンを作用させると、ペプチジルＭＣＡのＬｙｓとＭＣＡの間のアミド結合が切断されて、ＡＭＣ（7-amino-4-methyl-coumarin）が遊離する。一方、このペプチジルＭＣＡは、そのリシンのε位のアミノ基がヒストンメチル化酵素（ＨＭＴ）によりメチル化を受けると、リシンとＡＭＣ間のアミド結合はトリプシンにより分解されなくなる。ＡＭＣは、ＡＭＣがペプチドと結合したクマリン（即ちぺプチジルＭＣＡ）と蛍光特性が異なるため、その相違を利用して、トリプシンの作用完了後に、ＡＭＣのみの蛍光強度、あるいはメチル化されて残存するぺプチジルＭＣＡのみの蛍光強度を測定することで、ヒストンメチル化酵素の活性を定量的に測定することが可能となる。ＡＭＣのみの蛍光強度を測定する場合は、例えば、励起波長λｅｘ＝３９０ｎｍ、蛍光波長λｅｍ＝４６０ｎｍで測定することを好適に例示することができ、ぺプチジルＭＣＡのみの蛍光強度を測定する場合は、例えば、励起波長λｅｘ＝３３０ｎｍ、蛍光波長λｅｍ＝３９５ｎｍ、より好ましくは励起波長λｅｘ＝３３０ｎｍ、蛍光波長λｅｍ＝３８０ｎｍで測定することを好適に例示することができる。
【００２６】
本発明の剤に含有されるＳｅｔ７／９阻害物質あるいはシプロヘプタジンの量としては、Ｓｅｔ７／９阻害効果が得られる限り特に制限されないが、例えば、本発明の剤の全量に対して例えば０．０００１〜９９．９９９９質量％、好ましくは０．００１〜８０質量％、より好ましくは０．００１〜５０質量％、さらに好ましくは０．００５〜２０質量％を好適に例示することができる。
【００２７】
本発明の剤には、Ｓｅｔ７／９阻害効果が得られる限り、本発明におけるＳｅｔ７／９阻害物質あるいはシプロヘプタジン以外に、他のがん細胞の増殖抑制剤や、前述の疾患に対する予防効果及び／又は治療効果を奏する他の物質などの任意成分を含んでいてもよい。
【００２８】
本発明の剤の剤型としては、例えば、散剤、顆粒剤、錠剤、溶液剤、乳剤、懸濁剤、シロップ剤、カプセル剤、坐剤、注射剤などを例示することができる。これらの製剤は、本発明におけるＳｅｔ７／９阻害物質に、製剤上の必要に応じて、適宜の薬学的に許容される担体、例えば、溶媒、賦形剤、結合剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、等張化剤、緩衝剤、安定化剤、無痛化剤、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、滑沢剤、崩壊剤、湿潤剤、吸着剤、甘味剤、希釈剤などの任意成分を配合することにより製造することができる。
【００２９】
本発明の剤の投与方法は、対象においてＳｅｔ７／９阻害効果が得られる限り特に制限されず、直腸内投与、口腔内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与等の非経口投与、あるいは、経口投与を例示することができる。また、インビトロの系の場合は、本発明の剤を対象細胞に添加等することにより、本発明の剤を対象細胞に接触させることや、本発明の剤を対象細胞内に注入することを例示することができる。
【００３０】
本発明の剤の投与量としては、対象においてＳｅｔ７／９阻害効果が得られる限り特に制限されず、投与対象となる個体、器官、局所部位、組織、投与対象となる個体の年齢・体重等に応じて、適宜選択することができる。本発明の予防・治療剤の投与量の好適な例としては、Ｓｅｔ７／９阻害物質換算で、例えば、１日当たり０．０００１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは、０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、さらに好ましくは０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重となるように、１日につき、例えば、１〜３回投与すること等を好適に例示することができる。また、本発明の剤をインビトロの系で用いる場合は、Ｓｅｔ７／９阻害物質換算で、０．０１ｎＭ〜１０Ｍ、好ましくは１ｎＭ〜１００ｍＭとなるように対象細胞に接触させることを好適に例示することができる。なお、本発明におけるＳｅｔ７／９阻害物質として、シプロヘプタジン等を用いる場合は、Ｓｅｔ７／９阻害物質換算として、シプロヘプタジン塩酸塩換算を利用することが好ましい。
【００３１】
本発明の剤の投与対象としては、哺乳動物又は哺乳動物細胞を好適に例示することができ、かかる哺乳動物の中でも、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーをより好適に例示することができ、中でも、ヒトを特に好適に例示することができる。
【００３２】
本発明の予防・治療剤が予防・治療する対象とするエストロゲン受容体の過剰に起因する疾患としては、エストロゲン受容体の過剰に起因する疾患である限り特に制限されないが、例えば、女性特有の組織、子宮や卵巣、乳房における筋腫やがん等を好適に例示することができ、中でも、乳がん、乳腺線維腺腫、乳腺症、子宮筋腫、子宮腺筋症、子宮内膜増殖症、子宮内膜がん、子宮体がん、胞状奇胎、絨毛がん、卵巣腫瘍、卵巣嚢腫、卵巣がんをより好適に例示することができ、中でも、乳がんを特に好適に例示することができる。
【００３３】
本発明の増殖抑制剤が対象とするがん細胞としては、本発明におけるＳｅｔ７／９阻害物質が増殖抑制効果を発揮する限り特に制限されないが、乳がん細胞を好適に例示することができ、中でも、ヒト乳がん細胞をより好適に例示することができ、中でも、ＭＣＦ−７、ＨＢＣ−４、ＢＳＹ−１、ＨＢＣ−５、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１をさらに好適に例示することができ、中でも、ＭＣＦ−７を特に例示することができる。
【００３４】
なお、本発明の他の態様として、本発明のＳｅｔ７／９阻害剤、増殖抑制剤、又は、予防・治療剤の製造における、本発明におけるＳｅｔ７／９阻害物質あるいはシプロヘプタジン等の使用：や、本発明におけるＳｅｔ７／９阻害物質あるいはシプロヘプタジン等の、本発明のＳｅｔ７／９阻害剤、増殖抑制剤、又は、予防・治療剤としての使用：や、本発明におけるＳｅｔ７／９阻害物質あるいはシプロヘプタジン等を、本発明のＳｅｔ７／９阻害剤、増殖抑制剤、又は、予防・治療剤に使用する方法：や、Ｓｅｔ７／９の阻害における、本発明におけるＳｅｔ７／９阻害物質あるいはシプロヘプタジン等の使用：や、がん細胞の増殖抑制における、本発明におけるＳｅｔ７／９阻害物質あるいはシプロヘプタジン等の使用：や、エストロゲン受容体の過剰に起因する疾患の予防・治療における、本発明におけるＳｅｔ７／９阻害物質あるいはシプロヘプタジン等の使用：や、本発明のＳｅｔ７／９阻害剤を対象又は対象細胞へ投与することを特徴とするＳｅｔ７／９の阻害方法：や、本発明のＳｅｔ７／９阻害剤を対象又は対象細胞へ投与することを特徴とするがん細胞の増殖抑制方法：や、本発明のＳｅｔ７／９阻害剤を対象又は対象細胞へ投与することを特徴とするエストロゲン受容体の過剰に起因する疾患の予防・治療方法も例示することができる。これらの使用や方法における文言の内容やその好ましい態様は、前述したとおりである。
【００３５】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例】
【００３６】
［Ｈｉｓ−Ｓｅｔ７／９、ＧＳＴ−Ｇ９ａ及びＧＳＴ−ヒストンＨ３（１−２０）タンパク質の調製］
配列番号２に示すＳｅｔ７／９とヒスチジンタグの融合タンパク質（Ｈｉｓ−Ｓｅｔ７／９）を発現するベクターとして、pET28a(+)−Set7/9を国立遺伝学研究所から入手した
。また、配列番号４に示すｍＧ９ａ（７０６番目のアミノ酸からストップコドン）とＧＳＴタグの融合タンパク質を発現するベクターとして、pGEX-4T-1-mG9aを京都大学から入手した。また、ＧＳＴとヒストンＨ３の１−５７番目のアミノ酸配列からなる融合タンパク質（ＧＳＴ−ヒストンＨ３（１−５７））を発現するベクターとして、pGEX-4T-3-histone H3を京都大学から入手した。これらの発現ベクターを大腸菌に形質転換してタンパク質を産生させ、大腸菌を破砕し、ＮｉビーズまたはグルタチオンセファロースによりＨｉｓ−Ｓｅｔ７／９、ＧＳＴ−Ｇ９ａ及びＧＳＴ−ヒストンＨ３（１−５７）タンパク質を精製した。
【００３７】
［ペプチジルＭＣＡの作製］
メチル化酵素Ｓｅｔ７／９及びＧ９ａによるメチル化の基質として、ペプチジルＭＣＡの標的リシンのＮ末端側に特定のアミノ酸配列を有するペプチジルＭＣＡを合成した。すなわち、Ｓｅｔ７／９によるメチル化の基質であるヒストンＨ３の一部のアミノ酸配列（アミノ酸番号１−４：配列番号６）を、標的リシンのＮ末端側に有するペプチジルＭＣＡとして、Ａｃ（アセチル基）−ＡＲＴＫ−ＭＣＡを作製し、Ｓｅｔ７／９によるメチル化の基質であるｐ５３の一部のアミノ酸配列（アミノ酸番号３６９−３７２：配列番号７）を、標的リシンのＮ末端側に有するペプチジルＭＣＡとして、Ａｃ−ＬＫＳＫ−ＭＣＡを作製し、Ｓｅｔ７／９によるメチル化の基質であるＥＲαの一部のアミノ酸配列（アミノ酸番号２９９−３０２：配列番号８）を、標的リシンのＮ末端側に有するペプチジルＭＣＡとして、Ａｃ−ＫＲＳＫ−ＭＣＡを作製し、Ｇ９ａによるメチル化の基質であるヒストンＨ３の一部のアミノ酸配列（アミノ酸番号１−９：配列番号９）を、標的リシンのＮ末端側に有するペプチジルＭＣＡとして、Ａｃ−ＡＲＴＫＱＴＡＲＫ−ＭＣＡを作製した。これらのペプチジルＭＣＡは、以降本明細書において、それぞれＡｃ−ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ３（１−４）−ＭＣＡ、Ａｃ−ｐ５３（３６９−３７２）−ＭＣＡ、Ａｃ−ＥＲα（２９９−３０２）−ＭＣＡ、Ａｃ−ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ３（１−９）−ＭＣＡと表す。
【００３８】
［蛍光ペプチドを用いたヒストンメチル化酵素の特異性の評価］
蛍光ペプチドを用いたヒストンメチル化酵素測定法により、ヒストンメチル化酵素Ｓｅｔ７／９の基質特異性を調べた。９６穴プレート（黒）に１０μＬの２×ＨＭＴ activity buffer（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、４０ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、５００ｍＭ スクロース）、０．４μＬのＢＳＡ溶液（１５０μｇ／ｍＬ）、Ｈｉｓ−Ｓｅｔ７／９又はＧＳＴ−Ｇ９ａ、及び、蒸留水を加えて計１８μＬの反応液を調製し、室温で１時間インキュベートした。次いで、１μＬのＳＡＭ（S-(5’-Adenosyl)-L-methyonine chloride；Ｈｉｓ−ｓｅｔ７／９に対しては２ｍＭ、ＧＳＴ−Ｇ９ａに対しては２０ｍＭ）及び１μＬのペプチジルＭＣＡ溶液（１．２ｍＭ）を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。その後、３０μＬのトリプシン溶液（２０ｍｇ／ｍＬ）を添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。反応液の蛍光強度を励起波長λｅｘ＝３３０ｎｍ、蛍光波長λｅｍ＝３８０ｎｍで測定することによりトリプシン添加後残存するメチル化されたペプチジルＭＣＡ量を測定し、メチル化酵素の活性を評価した。
【００３９】
図６に示すように、標的リシンのＮ末端側のアミノ酸配列を変化させることで、ＨＭＴの基質特異性を評価することができた。Ｓｅｔ７／９のメチル化の対象となる部位のコンセンサス配列はＸ（任意のアミノ酸）−塩基性アミノ酸−親水性アミノ酸−Ｋ（リシン残基）であり、標的リシンはヒストンＨ３のＫ４、ｐ５３のＫ３７２、ＥＲαのＫ３０２であり、その中でもＥＲα由来のＡｃ−ＥＲα（２９９−３０２）−ＭＣＡがＳｅｔ７／９と最も高い反応性を示した（図６左パネル）。一方、これらを基質としないＧ９ａを用いた場合は、メチル化活性は検出されず、Ｇ９ａの基質であるＡｃ−ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ３（１−９）−ＭＣＡを基質とした場合のみメチル化活性が検出された（図６右パネル）。
【００４０】
［Ｓｅｔ７／９の阻害剤のスクリーニング］
ＲＩＫＥＮ ＮＰｄｅｐｏ（理化学研究所ケミカルバイオロジー研究領域天然化合物バンク）の１３，０００化合物に対し、以下の条件でＳｅｔ７／９の阻害剤のスクリーニングを行った。３８４穴プレート（黒）に５μＬの２×ＨＭＴ activity buffer（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、４０ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、５００ｍＭ スクロース）、０．２μＬのＢＳＡ溶液（１５０μｇ／ｍＬ）、Ｈｉｓ−Ｓｅｔ７／９、１ｍｇ／ｍｌの被検物質を０．５μＬ、及び蒸留水を加えて計９μＬの反応液を調製し、室温で１時間インキュベートした。次いで、０．５μＬのＳＡＭ（２ｍＭ）及び０．５μＬのＡｃ−ＥＲα（２９９-３０２）−ＭＣＡ溶液（１．２ｍＭ）を添加して、３７℃で１時間インキュベートした。その後、１５μＬのトリプシン溶液（２０ｍｇ／ｍＬ）を添加して、３７℃で１５分間インキュベートした。反応液の蛍光強度を励起波長λｅｘ＝３９０ｎｍ、蛍光波長λｅｍ＝４６０ｎｍで測定することによりＡＭＣ量を、また励起波長λｅｘ＝３３０ｎｍ、蛍光波長λｅｍ＝３８０ｎｍで測定することによりメチル化されたペプチジルＭＣＡ量を測定し、メチル化酵素の活性を評価した。スクリーニングの結果、抗アレルギー薬として臨床で用いられている、セロトニン受容体及びヒスタミン受容体（Ｈ１）のアンタゴニストであるシプロヘプタジン（Cyproheptadine、別名periactin）がＳｅｔ７／９のメチル化活性を抑制したことから、シプロヘプタジンをＳｅｔ７／９の阻害剤として同定した。
【００４１】
［シプロヘプタジンによるＳｅｔ７／９活性の阻害作用；fluorescence-based assay］
シプロヘプタジンによるヒストンメチル化酵素阻害作用がＳｅｔ７／９特異的であるか調べるために、次の条件でin vitro ＨＭＴアッセイを行った。９６穴プレート（黒）に２×ＨＭＴ activity buffer（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、４０ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、５００ｍＭ スクロース）を１０μＬ、ＢＳＡ（１５０μｇ／ｍＬ）を０．４μＬ、Ｈｉｓ−Ｓｅｔ７／９（０．２５ｍｇ／ｍＬ）を４μＬ、及び各濃度のシプロヘプタジンを１μＬ添加し、蒸留水を加えて計１８μＬの反応液を調製した後、室温で１時間インキュベートした。その後、ＳＡＭ（２ｍＭ）を１μＬ、Ａｃ−ＥＲα（２９９−３０２）−ＭＣＡ（１．２ｍＭ）を１μＬ添加した。暗所、３７℃で１時間反応させた後、トリプシン（２０ｍｇ／ｍＬ）を３０μＬ添加し、更に暗所、３７℃で１５分間反応させた。その後蛍光プレートリーダーでメチル化されたペプチジルＭＣＡの蛍光強度（励起波長λｅｘ＝３３０ｎｍ、蛍光波長λｅｍ＝３８０ｎｍ）を測定した。薬剤のＳｅｔ７／９メチル化活性の阻害率を、（コントロールの蛍光強度−薬剤存在下の蛍光強度）／（コントロールの蛍光強度−Ｈｉｓ−Ｓｅｔ９非存在下の蛍光強度）×１００という数式により算出した。Ｇ９ａへの影響は、Ｈｉｓ−Ｓｅｔ７／９をＧＳＴ−Ｇ９ａに、また蛍光基質をＡｃ−ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ３（１−９）−ＭＣＡに、更にＳＡＭを２ｍＭ溶液から２０ｍＭ溶液に置き換えて同様に検討した（図７左）。この結果より、シプロヘプタジンはＧ９ａを阻害することなく、Ｓｅｔ７／９を選択的に阻害することが示された。
【００４２】
［シプロヘプタジンによるＳｅｔ７／９活性の阻害作用；Western blotting］
また、シプロヘプタジンによる、ヒストンＨ３のＫ４に対するＳｅｔ７／９のメチル化活性の阻害効果を調べるために、ＧＳＴ−ヒストンＨ３（１−５７）を基質として用いてin vitro ＨＭＴアッセイを行い、ウェスタンブロッティングにより検出した。２×ＨＭＴ activity buffer（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、４０ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、５００ｍＭ スクロース）を１０μＬ、ＢＳＡ（３０μｇ／ｍＬ）を２μＬ、Ｈｉｓ−Ｓｅｔ７／９（１．７ｍｇ／ｍＬ）を２．４μＬ、及び各濃度のシプロヘプタジンを１μＬ添加し、蒸留水を加えて計１６μＬにした後、室温で１時間インキュベートした。その後、ＳＡＭ（１０ｍＭ）を２μＬ、ＧＳＴ−ヒストンＨ３（１−５７）（０．２ｍｇ／ｍＬ）を２μＬ添加した。３７℃で１時間反応させた後、１０μＬのサンプルbuffer（１７６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、７．１％ ＳＤＳ、０．３５％ ブロモフェノールブルー、３５％ グリセロール、１５％ ２−メルカプトエタノール）を加え、１００℃で３分間ボイルすることでタンパク質を変性させた。その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ウェスタンブロッティング法により、各タンパク質を検出した。用いた一次抗体は、抗６×Ｈｉｓ抗体（ＭＢＬ社製、PM032）、ヒストンＨ３のＫ４のメチル化を検出する抗ヒストンＨ３Ｋ４ｍｅ１抗体（Upstate社製、07-436）、及び抗ＧＳＴ抗体（Cell Signaling社製、2622）である。図７右下パネルに示すように、シプロヘプタジン濃度依存的に、Ｓｅｔ７／９のヒストンＨ３のＫ４におけるメチル化が阻害されることが確認できた。
【００４３】
［シプロヘプタジンによるＳｅｔ７／９活性の阻害のキネティクス］
シプロヘプタジンがＳｅｔ７／９活性を阻害するしくみを調べるために、Ｓｅｔ７／９とＡｃ−ＥＲα（２９９−３０２）−ＭＣＡによるin vitro ＨＭＴアッセイにおける、シプロヘプタジンの阻害様式を調べた。ＳＡＭの濃度に対してLine weaver-Burkプロットをとると反拮抗阻害を表したのに対し（図８左パネル）、ペプチジルＭＣＡに対してLine weaver-Burkプロットをとると拮抗阻害を表したことから（図８中央パネル）、シプロヘプタジンによるＳｅｔ７／９活性の阻害は、酵素とメチル基受容体の相互作用部位に結合する阻害様式であることがわかった。さらに、シプロヘプタジンの濃度に対してDixonプロットをとることにより、シプロヘプタジンによるＳｅｔ７／９活性の阻害反応の阻害定数Ｋｉは１５μＭであることがわかった（図８右パネル）。
【００４４】
［シプロヘプタジンがＥＲαの発現に及ぼす影響］
ＨＥＫ２９３Ｔ（ヒト胎児腎臓由来）細胞、ＨｅＬａ（ヒト子宮頸がん由来）細胞、ＭＣＦ７（ヒト乳がん由来）細胞におけるＥＲα及びＳｅｔ７／９の発現量をウェスタンブロッティング法により調べたところ、ＭＣＦ７細胞でのみ両者の発現が確認された（図９の上段左パネル）。そこで、以下の実験ではＭＣＦ７細胞を使用した。
【００４５】
次に、シプロヘプタジンによるＥＲαの発現量への影響を調べた。１２穴プレートに１穴あたりＭＣＦ７細胞を１×１０５個まき、２４時間後、各濃度のシプロヘプタジンを添加した。４８時間培養した後、細胞を回収し、ＲＩＰＡ buffer（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．８）、１．５％ TritonX-100、１％ デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ ＳＤＳ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＮａＦ、０．１ｍＭ オルトバナジン酸トリナトリウム）を加え、細胞を可溶化した。得られた各細胞可溶化液のタンパク質濃度をそろえた後、タンパク質溶液の１／２量のサンプルbuffer（１７６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、７．１％ ＳＤＳ、０．３５％ ブロモフェノールブルー、３５％ グリセロール、１５％ ２−メルカプトエタノール）を加え、１００℃で３分間ボイルすることでタンパク質を変性させた。その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ウェスタンブロッティング法により、ＥＲα、Ｓｅｔ７／９、α−tubulinを検出した（図９）。用いた一次抗体は抗ＥＲα抗体（Cell Signaling社製、2513）、抗Ｓｅｔ７／９抗体（Cell Signaling社製、2813）、及び抗α−tubulin抗体（SIGMA社製、T5168）である。この結果より、シプロヘプタジンの濃度依存的に、ＥＲαの発現量が低下することが示された（図９の上段中央パネル）。
【００４６】
さらに、Ｓｅｔ７／９ノックダウンによるＥＲαの発現量への影響を調べた。１２穴プレートに１穴あたりＭＣＦ７細胞を１×１０５個まき、配列番号１０〜１３で示される４種類のＳｅｔ７／９に対するｓｉＲＮＡ（short interfering ＲＮＡ）、ｓｉＳｅｔ７／９を導入し、４８時間後に上述と同様の手法で細胞を回収し、ウェスタンブロッティング法によりＥＲα、Ｓｅｔ７／９、α−tubulinを検出した。添加したｓｉＳｅｔ７／９量に依存してＳｅｔ７／９発現量及びＥＲα発現量が減少した（図９の上段右パネル）。その一方で、同様にしてＡＲ（Androgen Receptor）を発現しているＬＮＣａＰ（ヒト前立腺がん細胞由来）細胞を用いて、シプロヘプタジン添加によりＡＲ発現量が影響を受けるか調べたところ、ＡＲの発現量は変化しなかった（図９の下段左パネル及び中央パネル）。
【００４７】
［シプロヘプタジンがＥＲ転写活性に及ぼす影響］
シプロヘプタジンのＥＲ転写活性に及ぼす影響を調べるために、dual luciferase assayにより、ＥＲＥ（estrogen responsive element）レポーターアッセイを行った（図１０上段）。２４穴プレートに１穴あたりＭＣＦ７細胞を１．５×１０４個まき、２４時間後、ＰＢＳ ５００μＬで細胞を洗浄した後、チャコール処理でステロイドホルモンを除去したＦＢＳを１０％含む、フェノールレッド不含のＲＰＭＩ培地を５００μＬ添加した。４８時間培養した後、再度培地を、チャコール処理ＦＢＳを１０％含むフェノールレッド不含のＲＰＭＩ培地（５００μＬ）に交換し、リポフェクトアミン２０００を用いてpGL4-3×ERE-TA2（０．５μｇ）及びpGL4.74[hRluc/TK]（０．１μｇ）を細胞にトランスフェクションした。トランスフェクション後６時間後に各濃度の薬剤（タモキシフェン又はシプロヘプタジン）を添加し、更に１８時間培養した後、エストロゲンの一種であるβ−エストラジオールを、各濃度添加した。２４時間培養した後、培地を除去し、lysis buffer（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ TritonX-100）１２０μＬを加え、−８０℃で３０分以上静置し細胞を溶解した。この細胞可溶化液を５０μＬずつ９６穴プレート（白）に移し、５０μＬのluciferase buffer（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．５ｍＭ ＣｏＡ、０．５ｍＭ ＡＴＰ、０．２５ｍＭ Ｄ−ルシフェリン）および１００μＬのrenilla buffer（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１μＭ coelenterazine）を順次加え、その都度、発光強度を発光プレートリーダーで測定することにより、firefly luciferase及びrenilla luciferaseの発光強度を取得した。得られたfirefly luciferaseの値をrenilla luciferaseの値で割ることにより、ＥＲＥの活性を算出した。リガンド（β−エストラジオール）依存的にＥＲＥは活性化されるが（図１０下段左パネル）、タモキシフェンやシプロヘプタジン添加によりこの活性化は抑えられることがわかった（図１０下段右パネル）。シプロヘプタジンは、タモキシフェンと同様に、ＥＲαの発現を抑制する濃度で、エストロゲンによる細胞増殖の促進を阻害した。
【００４８】
［シプロヘプタジンがエストロゲン刺激によるｐＳ２のｍＲＮＡの発現に及ぼす影響］
ｐＳ２は、エストロゲンに応答し、ＥＲαに依存して発現するエストロゲンシグナルのマーカー遺伝子である。シプロヘプタジンのエストロゲンシグナルへの影響をより詳細に調べるために、シプロヘプタジンが、エストロゲン刺激によるｐＳ２のｍＲＮＡの発現に及ぼす影響を調べた。６０ｍｍディッシュにＭＣＦ７細胞を１×１０５個まき、２４時間後、ＰＢＳ ３ｍＬで細胞を洗浄した後、チャコール処理でステロイドホルモンを除去したＦＢＳを１０％含むフェノールレッド不含のＲＰＭＩ培地を３ｍＬ添加した。４８時間培養した後、再度チャコール処理でステロイドホルモンを除去したＦＢＳを１０％含むフェノールレッド不含のＲＰＭＩ培地３ｍＬに交換した後、各濃度の薬剤（タモキシフェン又はシプロヘプタジン）を添加した。２４時間培養した後、１０ｎＭのβ−エストラジオールを添加した。更に２４時間培養した後、細胞をTrizol Reagent（Invitrogen社製）で回収し、ＲＮＡを抽出した。Oligo (dT) 12-18 Primerを用い、逆転写酵素（M-MLV Reverse Transcriptase RNaseH Minus（Point Mutant）（Promega社製））によりｃＤＮＡを作製し、これをテンプレートとして、配列番号１４及び１５、又は、配列番号１６及び１７に示すプライマーを用いてＰＣＲを行い、ｐＳ２又はＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現を検出した。ｐＳ２はエストロゲンに応答して、ＥＲα依存的に、ＥＲＥプロモーターを介して発現した（図１１左パネル）。しかし、ＥＲαの発現を抑制し、ＥＲＥプロモーター活性を阻害する濃度のシプロヘプタジンをＭＣＦ７細胞に添加すると、タモキシフェンと同様にエストロゲン刺激によるｐＳ２のｍＲＮＡの発現は抑制された（図１１右パネル）。
【００４９】
［シプロヘプタジンがエストロゲン依存的な細胞増殖に及ぼす影響］
シプロヘプタジンがエストロゲン依存的な細胞増殖に及ぼす影響を調べた。２４穴プレートに１穴あたりＭＣＦ７細胞を１．５×１０４個まき、２４時間後、ＰＢＳ ５００μＬで細胞を洗浄した後、チャコール処理でステロイドホルモンを除去したＦＢＳを１０％含むフェノールレッド不含のＲＰＭＩ培地を５００μＬ添加した。その後、各濃度の薬剤（タモキシフェン又はシプロヘプタジン）を添加した後、各濃度のβ−エストラジオールを添加した。９６時間培養した後、細胞をトリプシンではがし、血球計算盤で細胞数を測定した。ＭＣＦ７はβ−エストラジオール濃度依存的な細胞増殖を示すが（図１２左パネル）、タモキシフェン及びシプロヘプタジンの添加により、その細胞増殖が抑えられることがわかった（図１２右パネル）。すなわち、タモキシフェンと同様に、シプロヘプタジンはエストロゲン添加による細胞増殖の亢進を阻害し、その濃度はＥＲαの発現を抑制する濃度と一致することが示された。
【００５０】
［シプロヘプタジンが乳がん細胞の増殖に及ぼす影響］
シプロヘプタジンが、乳がん細胞の増殖に及ぼす影響を調べた。５種類の乳がん細胞（ＨＢＣ−４、ＢＳＹ−１、ＨＢＣ−５、ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）をそれぞれ９６ウェルプレートにまき込み、翌日サンプル溶液を添加、２日間培養した。これらの細胞増殖を、細胞内のタンパク質総量を検出するスルホローダミンＢによる比色定量で測定し、ＧＩ５０値（５０％の増殖抑制を示すシプロヘプタジン濃度）を算出した（図１３）。シプロヘプタジンはいずれの乳がん細胞においても細胞増殖の亢進を阻害することが示された。
【００５１】
［シプロヘプタジンのカンプトテシンにより誘導されるｐ５３の発現及び細胞増殖抑制に及ぼす影響］
ｐ５３の３７２番目のリジン残基（Ｋ３７２）は、Ｓｅｔ７／９によりメチル化されることで安定化することが報告されている（Nature, 432, 353-360, 2004）。シプロヘプタジンによりＥＲα以外のＳｅｔ７／９の基質が影響を受けるか調べるため、ｐ５３について調べた。１２穴プレートに１穴あたりＭＣＦ７細胞を１×１０５個まき、２４時間後、０．３μｇ／ｍＬのカンプトテシン（Camptothecin、ＣＰＴ）を添加した。０〜１２時間培養した後、細胞を回収し、ＲＩＰＡ buffer（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．８）、１．５％ TritonX-100、１％ デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ ＳＤＳ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＮａＦ、０．１ｍＭ オルトバナジン酸トリナトリウム）で細胞を可溶化した。得られた各細胞可溶化液のタンパク質濃度をそろえた後、タンパク質溶液の１／２量のサンプルbuffer（１７６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、７．１％ ＳＤＳ、０．３５％ ブロモフェノールブルー、３５％ グリセロール、１５％ ２−メルカプトエタノール）を加え、１００℃で３分間ボイルすることでタンパク質を変性させた。その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ウェスタンブロッティング法により、ｐ５３、Ｓｅｔ７／９、α−tubulinを検出した。用いた一次抗体は抗ｐ５３抗体（SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY社製、sc-6243）、抗Ｓｅｔ７／９抗体（Cell Signaling社製、2813）、及び抗α−tubulin抗体（SIGMA社製、T5168）である。ｐ５３はＣＰＴにより安定化するが（図１４左上パネル）、ＥＲαの発現を抑制する濃度のシプロヘプタジンを添加しても、ＣＰＴにより誘導されるｐ５３の発現量は変化しなかった（図１４右上パネル）。また、配列番号１０〜１３で示される４種のｓｉＳｅｔ７／９を用いたＳｅｔ７／９の発現ノックダウンでも、ｐ５３の発現量は減少しなかった（図１４左下パネル）。さらに、９６穴プレートに１穴あたり１００μＬのＲＰＭＩ培地にＭＣＦ７細胞を１穴あたり０．４×１０４個まき、２４時間後に、シプロヘプタジン０又は４３μＭ存在下でＣＰＴを１穴あたり１００μＬのＲＰＭＩ培地に溶解して添加した。３７℃、５％ＣＯ２下で４８時間細胞をインキュベートした後、２０μＬのＷＳＴ−１試薬（DOJINDO Laboratories製）を添加し、更に２時間インキュベートした。その後マイクロプレートリーダーで吸光度を測定してＷＳＴ−１アッセイを行い、ＣＰＴの半数阻害濃度ＩＣ５０を算出した。その結果、シプロヘプタジン添加によって、ｐ５３による細胞増殖抑制は影響を受けなかった（図１４右下パネル）。In vivoにおいてＳｅｔ７／９はｐ５３を制御していない可能性が考えられる。
【００５２】
［in vivoにおける、シプロヘプタジンの抗腫瘍試験］
シプロヘプタジンが、in vivoにおいて抗腫瘍効果（腫瘍の増殖抑制効果）を発揮することを確認するために、以下のような方法で抗腫瘍試験を行った。
【００５３】
愛媛大学大学院医学系研究科より入手したＭＣＦ７細胞を、ＤＭＥＭ培地（Wako社製、044-29765）を含む直径１０ｃｍのディッシュ中で、３７℃、４８時間培養した。ディッシュ４枚分のＭＣＦ７細胞につき、４５０μＬのHank’s Buffer（GIBCO社製、HBSS 14170）でＭＣＦ７細胞を懸濁し、移植用のＭＣＦ７細胞液を得た。
【００５４】
上記のＭＣＦ７細胞液の移植対象として、雌のヌードマウス（Balb/C-nu/nu、日本チャールスリバー株式会社製）を３６匹用意し、それらを４つの群に分けた。これらの各ヌードマウスの右肩皮下、２箇所の乳腺の計３箇所（図１５参照）に、上記移植用のＭＣＦ７細胞液を１箇所あたり１５０μＬ（細胞数は約２×１０７個）ずつ注入することによって、ＭＣＦ７細胞の移植を行った。移植から１３日目に４群について投与サンプルの投与を開始した。以下、投与サンプルの投与開始日の前日を０日としたときの経過日数を、単に「経過日数」と表示する。１つ目の群では、コントロールとして、１０ｍｇ／ｋｇのビヒクルを経過日数１日から８日まで、１日１回腹腔内投与（i.p.）し、２つ目の群では、２０ｍｇ／ｋｇのシプロヘプタジン塩酸水和物（SIGMA社製）を経過日数１日に１回腹腔内投与し、３つ目の群では、４０ｍｇ／ｋｇのシプロヘプタジン塩酸水和物を経過日数１日に１回腹腔内投与し、４つ目の群では、２０ｍｇ／ｋｇのシプロヘプタジン塩酸水和物を経過日数１日から８日まで、１日１回腹腔内投与した（図１６の右下の投薬スケジュール）。
【００５５】
上記の４つの群の各マウスについて、経過日数が、１日、４日、８日、１１日、及び、１５日のときに、腫瘍の体積と体重を測定した。各群について、経過日数が１日のとき（投与日）の腫瘍の体積の平均測定値を１とした場合の、腫瘍の体積の平均測定値の相対比率を、相対腫瘍増殖率として、グラフに表した（図１６の左上のグラフ）。また、各群について、経過日数が１日のときのマウスの平均体重を０とした場合の、体重の平均値の増減（ｇ）もグラフに表した（図１６の右上のグラフ）。これらの結果から、シプロヘプタジン塩酸水和物を投与した３つのいずれの群（Cyproheptadine塩酸水和物２０ｍｇ／ｋｇ×１ i.p.；Cyproheptadine塩酸水和物４０ｍｇ／ｋｇ×１ i.p.；Cyproheptadine 塩酸水和物２０ｍｇ／ｋｇ×８ i.p.）でも、コントロール群（vehicle １０ｍｇ／ｋｇ×８ i.p.）と比較して相対腫瘍増殖率の低下がみられ、中でも経過日数１１日及び１５日では、有意な低下がみられた（図１６の左下の表）。そして、各群の体重の平均値の増減に有意な差はみられなかったことから、相対腫瘍増殖率の低下は、シプロヘプタジン塩酸水和物の作用であることが示された。なお、シプロヘプタジン塩酸水和物のこの抗腫瘍効果は、シプロヘプタジン塩酸水和物の投与量や投薬回数による大きな差はみられなかった（図１６の左上のグラフ）。
【００５６】
また、シプロヘプタジンの急性毒性の有無を確認するために、さきほどと同じ投薬スケジュール（図１７の下の投薬スケジュール）にて前述の４つの群の投与サンプルの投与実験を行った。ただし、コントロール群については、前述の１０ｍｇ／ｋｇのビヒクルに代えて、２０ｍｇ／ｋｇのビヒクルを用いた。投与後のマウスの様子を観察したところ、シプロヘプタジン塩酸水和物の投与から１０分経過後くらいから、じっと動かなくなり、傾眠又は嗜眠様の症状を示したが、投与から２時間経過後にはその症状がみられなくなった。経過日数が１〜１５日のときの、各群の体重の平均値の増減をグラフに表した（図１７の上グラフ）。その結果、投与開始の翌日（経過日数２日）に、シプロヘプタジン塩酸水和物の投与量に依存して、体重の減少度合いが大きくなったが、経過日数が増えるにつれて徐々に体重が回復し、いずれの経過日数においても、各群の間に有意差はみられなかった。これらの結果から、シプロヘプタジンは毒性の点で特に問題ないことが示された。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明は、ヒストンメチル化酵素Ｓｅｔ７／９阻害剤の分野や、がん細胞の増殖抑制剤の分野や、エストロゲン受容体の過剰に起因する疾患の予防・治療剤の分野に好適に利用することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒストンメチル化酵素Ｓｅｔ７／９阻害剤、がん細胞の増殖抑制剤、及び、エストロゲン受容体の過剰に起因する疾患の予防・治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ステロイドホルモンの一種であるエストロゲンは、その核内受容体であるエストロゲン受容体（ＥＲα）を介して特定の遺伝子の転写を活性化する（図１）。エストロゲンが結合したＥＲαは、リン酸化を受けた後二量体化し、例えばＮＣＯＡ１等のco-activatorとＥＲＥ（estrogen response element）に結合して下流の遺伝子の転写を活性化する。エストロゲンシグナルの生理的な役割として、乳腺細胞の増殖促進、卵巣排卵制御、脂質代謝制御、及び、インスリン作用などが知られている。また、多くの乳がん（約７５％）ではＥＲαを過剰に発現しており、ＥＲα依存的に細胞増殖することから、エストロゲンシグナルを標的とした抗がん剤がこれまでに開発されている。
【０００３】
エストロゲンシグナルを標的とした既存の抗がん剤としては、タモキシフェン等のＥＲαのアンタゴニストの他、エストロゲン生成に関わるアロマターゼの阻害剤などが存在する（図２）。しかし、タモキシフェンには、長期間投与すると、乳がん細胞に耐性が生じるという問題点がある。また、タモキシフェンは生体内でＣＹＰ２Ｄ６（チトクローム Ｐ４５０ ２Ｄ６）によりエンドキシフェンに代謝されて強い抗腫瘍効果を発揮するという作用機序を有するため、ＣＹＰ２Ｄ６を欠損した患者では効果が弱いという問題点もある。一方、前述のアロマターゼの阻害剤の場合、エストロゲン量そのものを低下させてしまうため、生体に必要なエストロゲンの機能まで損なわれるという問題点がある。例えば、エストロゲンは破骨細胞のアポトーシスを誘導し、骨密度の維持に寄与しているため、アロマターゼ阻害剤により、骨代謝異常などの副作用が生じる場合がある。このように、エストロゲンシグナルを標的とした既存の抗がん剤には問題点があった。
【０００４】
一方、ＥＲαの分解制御に関連して、ＥＲαの３０２番目のリシン残基（Ｋ３０２）が、ユビキチン化やメチル化といったタンパク質の翻訳後修飾を受けることが知られている。ユビキチン化とは、ユビキチンと呼ばれる７６アミノ酸からなるタンパク質のＣ末端グリシン残基が、３つの酵素、すなわち、ユビキチン活性化酵素（Ｅ１）、ユビキチン結合酵素（Ｅ２）、さらにユビキチン転移酵素（ユビキチンリガーゼ）（Ｅ３）からなるユビキチンシステムによって標的タンパク質のリシン残基に結合され、ユビキチンが標的タンパク質に付加される反応である。また、メチル化とは、タンパク質やＤＮＡ、様々な基質にメチル基が置換または付加される反応である。タンパク質のメチル化では、メチル化酵素の触媒作用によって、通常、アルギニン残基又はリシン残基にメチル基が付加される。アルギニン残基は２箇所までメチル化され、リシン残基は３箇所までメチル化され得る。
【０００５】
前述のＥ３ユビキチンリガーゼのうち、ＥＲαのＥ３ユビキチンリガーゼとしては、ＭＤＭ２、ＣＨＩＰ、及び、ＢＲＣＡ１／ＢＡＲＤ複合体が知られており、ＥＲαのＫ３０２がユビキチン化されると、ＥＲαはプロテアソームで分解される（非特許文献１）。一方で、メチル化酵素Ｓｅｔ７／Ｓｅｔ９（両者は同一酵素であり、以後Ｓｅｔ７／９と簡略表記する）は、ＥＲαのＫ３０２をメチル化することでＥＲαのユビキチン化を阻害し、プロテアソームでのＥＲαの分解を阻害すると考えられている（非特許文献２）。すなわち、Ｓｅｔ７／９によるＥＲαのメチル化は、ＥＲαのユビキチン化を抑制することにより、ＥＲαの安定性を増加させる（図３）。
【０００６】
Ｓｅｔ７／９は、当初ヒストンＨ３のＫ４（４番目のリシン残基）のεアミノ基をメチル化する酵素として発見されたが、現在はＥＲαやｐ５３等の非ヒストンタンパク質をメチル化することが知られている。Ｓｅｔ７／９の既知の標的タンパク質を表１に示す。
【０００７】
【表１】
【０００８】
また、Ｓｅｔ７／９は、メチル化活性に必要なＳＥＴドメインを有するが、他のメチル化酵素Ｇ９ａやＳＵＶ３９Ｈ１と異なり、システインに富んだｐｒｅ−ＳＥＴドメインや、ｐｏｓｔ−ＳＥＴドメインを持たないという特徴がある（図４）。そして、そのＸ線結晶構造解析から、多くのメチル化酵素と異なり、Ｓｅｔ７／９は主にモノメチル化反応を触媒すると考えられている（非特許文献３）。このように、Ｓｅｔ７／９に関する知見はいくつか得られていたものの、Ｓｅｔ７／９の機能（標的タンパク質のメチル化）を阻害する物質はこれまで知られていなかった。
【０００９】
また、シプロヘプタジン（cyproheptadine）は、抗アレルギー薬（抗ヒスタミン薬）として臨床で用いられている化合物である。しかし、このシプロヘプタジンがＳｅｔ７／９の機能を阻害することは全く知られていなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Eakin C M et al., PNAS, 104, 5794-5799 (2007)
【非特許文献２】Subramanian K et al., Molecular Cell, 30, 336-347 (2008)
【非特許文献３】Xiao B et al., Nature, 421, 652-656 (2003)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、ヒストンメチル化酵素Ｓｅｔ７／９阻害剤、がん細胞の増殖抑制剤、及び、エストロゲン受容体の過剰に起因する疾患の予防・治療剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決するべく、メチル化酵素Ｓｅｔ７／９に着目し、本発明者らが独自に開発したハイスループットなヒストンメチル化酵素活性の測定方法（特願２０１０−２０２４８４）を利用して、ケミカルライブラリーの１３，０００種の化合物から、Ｓｅｔ７／９阻害剤のスクリーニングを行い、シプロヘプタジンを同定した。そこで、本発明者らは、シプロヘプタジンについて解析を行い、（ａ）シプロヘプタジンがin vitroにおいてＳｅｔ７／９を選択的に阻害すること、（ｂ）シプロヘプタジンが、乳がん細胞においてＥＲαの発現レベルを低下させること、（ｃ）シプロヘプタジンが、乳がん細胞のエストロゲン依存的な増殖を抑制すること、及び、（ｄ）シプロヘプタジンが、乳がん細胞を移植したマウスにおいて、抗腫瘍効果（腫瘍の増殖抑制効果）を発揮することを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、本発明は、（１）シプロヘプタジン又はその塩を含有するヒストンメチル化酵素Ｓｅｔ７／９阻害剤に関する。
【００１４】
また、本発明は、（２）ヒストンメチル化酵素Ｓｅｔ７／９の阻害物質を含有する、がん細胞の増殖抑制剤や、（３）ヒストンメチル化酵素Ｓｅｔ７／９の阻害物質が、シプロヘプタジン又はその塩である上記（２）に記載のがん細胞の増殖抑制剤や、（４）がん細胞が、乳がん細胞である上記（３）に記載のがん細胞の増殖抑制剤に関する。
【００１５】
さらに、本発明は、（５）ヒストンメチル化酵素Ｓｅｔ７／９の阻害物質を含有する、エストロゲン受容体の過剰に起因する疾患の予防・治療剤や、（６）ヒストンメチル化酵素Ｓｅｔ７／９の阻害物質が、シプロヘプタジン又はその塩である上記（５）に記載の疾患の予防・治療剤や、（７）エストロゲン受容体の過剰に起因する疾患が、がんである上記（５）又は（６）に記載の疾患の予防・治療剤や、（８）がんが、乳がんである上記（７）に記載の疾患の予防・治療剤に関する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、ヒストンメチル化酵素Ｓｅｔ７／９を阻害することや、がん細胞の増殖を抑制することや、エストロゲン受容体の過剰に起因する疾患を予防及び／又は治療することができる。
【００１７】
また、本発明のヒストンメチル化酵素Ｓｅｔ７／９阻害剤や、がん細胞の増殖抑制剤や、エストロゲン受容体の過剰に起因する疾患の予防・治療剤は、エストロゲンシグナルを標的とした既存の抗がん剤等と作用機序が異なる。したがって、本発明は、かかる既存の抗がん剤で十分な増殖抑制効果や予防・治療効果が得られなかったがんに対しても、増殖抑制効果や予防・治療効果が期待でき、また、かかる既存の抗がん剤との併用効果も期待できる。
【００１８】
さらに、シプロヘプタジンは、抗アレルギー薬として既に市販されていて、重篤な副作用などの問題もほとんど無いことが期待され、実際、マウスへの投与試験では、毒性などの重篤な副作用は見られなかった。そのため、シプロヘプタジンを用いる場合は、今後の臨床開発に要するコストや労力が少なくて済み、実用性もきわめて高いという利点がある。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ＥＲαを介したエストロゲンシグナルの活性化について説明した図である。
【図２】エストロゲンシグナルを標的とした既存の抗がん剤、タモキシフェン及びアロマターゼ阻害剤について説明した図である。
【図３】ユビキチン化とメチル化によるＥＲαの分解制御について説明した図である。
【図４】Ｓｅｔ７／９の機能、構造について説明した図である。
【図５】蛍光ペプチド（ぺプチジルＭＣＡ）を用いたヒストンメチル化酵素測定法の原理を説明した図である。
【図６】蛍光ペプチド（ぺプチジルＭＣＡ）を用いたヒストンメチル化酵素の特異性を評価した結果を示す図である。Ｓｅｔ７／９及びＧ９ａはそれぞれの基質を特異的にメチル化し、Ｓｅｔ７／９はその基質の中でもＥＲα由来のＡｃ−ＥＲα（２９９−３０２）−ＭＣＡと最も高い反応性を示した。
【図７】Ｓｅｔ７／９のメチル化活性がシプロヘプタジンにより阻害されることを、蛍光検出及びウェスタンブロッティング法により示した図である。
【図８】シプロヘプタジンによるＳｅｔ７／９のメチル化活性の阻害様式が、拮抗阻害であることを示す図である。
【図９】シプロヘプタジンの添加、又はＳｅｔ７／９のノックダウンによりＥＲαのタンパク質発現量が低下するが、シプロヘプタジンの添加によりＡＲのタンパク質発現量は変化しないことを示す図である。
【図１０】シプロヘプタジンの添加が、タモキシフェンの添加と同様に、ＥＲＥの活性を抑制することを示す図である。
【図１１】シプロヘプタジンの添加が、タモキシフェンの添加と同様に、エストロゲン刺激によるｐＳ２のｍＲＮＡの発現を抑制することを示す図である。
【図１２】シプロヘプタジンの添加が、タモキシフェンの添加と同様に、ＭＣＦ７細胞のエストロゲン依存的な増殖を抑制することを示す図である。
【図１３】シプロヘプタジンの添加が、乳がん細胞の増殖を抑制することを示す図である。
【図１４】シプロヘプタジンの添加が、カンプトテシンにより誘導されるｐ５３の発現及び増殖抑制効果に、影響を与えないことを示す図である。
【図１５】シプロヘプタジンの抗腫瘍試験に用いる移植用マウスにおける、がん細胞の移植部位等を示す図である。
【図１６】シプロヘプタジンの抗腫瘍試験の投薬スケジュールや結果を示す図である。左上のグラフは、各群のマウスにおける相対腫瘍増殖率の平均値の推移を示し、右上のグラフは、各群のマウスの平均体重の増減の推移を示し、左下の表は、経過日数１１日及び１５日の各群のマウスにおける相対腫瘍増殖率の平均値を示し、右下の図は投薬スケジュールを示す。投薬スケジュールの上段の▼は、［Cyproheptadine塩酸水和物２０ｍｇ／ｋｇ×１ i.p.］群における投与サンプルの投与日を示し、中段の▼は、［Cyproheptadine塩酸水和物４０ｍｇ／ｋｇ×１ i.p.］群における投与サンプルの投与日を示し、下段の▼は、［Cyproheptadine塩酸水和物２０ｍｇ／ｋｇ×８ i.p.］群における投与サンプルの投与日を示す。
【図１７】シプロヘプタジンの急性毒性の有無を確認する試験の投薬スケジュールや、各群のマウスの平均体重の増減の推移を示す図である。投薬スケジュールの上段の▲は、［Cyproheptadine塩酸水和物２０ｍｇ／ｋｇ×１ i.p.］群における投与サンプルの投与日を示し、中段の▲は、［Cyproheptadine塩酸水和物４０ｍｇ／ｋｇ×１ i.p.］群における投与サンプルの投与日を示し、下段の▲は、［Cyproheptadine塩酸水和物２０ｍｇ／ｋｇ×８ i.p.］群における投与サンプルの投与日を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明のヒストンメチル化酵素Ｓｅｔ７／９阻害剤（以下、「本発明のＳｅｔ７／９阻害剤」とも略す。）としては、シプロヘプタジン又はその塩（以下、「シプロヘプタジン等」とも表示する。）を含有している限り特に制限されず、また、本発明のがん細胞の増殖抑制剤（以下、「本発明の増殖抑制剤」とも略す。）や、本発明のエストロゲン受容体（ＥＲα）の過剰に起因する疾患の予防・治療剤（以下、単に「本発明の予防・治療剤」とも表示する。）としては、Ｓｅｔ７／９の阻害物質（以下、「Ｓｅｔ７／９阻害物質」とも略す。）を含有している限り特に制限されない。本発明のＳｅｔ７／９阻害剤に関して、シプロヘプタジン等がＳｅｔ７／９を阻害する作用機序は不明である。また、本発明の増殖抑制剤や本発明の予防・治療剤の作用機序の詳細は不明であるが、Ｓｅｔ７／９阻害物質（例えば、シプロヘプタジン等）が、Ｓｅｔ７／９によるＥＲαのメチル化を阻害し、ＥＲαのユビキチン化及びその分解を促進して、細胞内の過剰なＥＲα量を低下させることで、がん細胞に対する増殖抑制効果を発揮したり、ＥＲαの過剰に起因する疾患に対する予防効果及び／又は治療効果を発揮する可能性が考えられる。なお、以下、本発明のＳｅｔ７／９阻害剤、本発明の増殖抑制剤、及び、本発明の予防・治療剤をまとめて、単に「本発明の剤」とも表示する。
【００２１】
上記の本発明におけるＳｅｔ７／９阻害物質としては、以下の一般式（化１）で表されるシプロヘプタジン（4-(5H-ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン-5-イリデン)-1-メチルピペリジン）又はその塩を好適に例示することができる。
【００２２】
【化１】
【００２３】
シプロヘプタジンの塩としては、特に制限されないが、薬学的に許容される無機酸又は有機酸の酸付加塩を好適に例示することができ、前述の無機酸の付加塩としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等を好適に例示することができ、前述の有機酸の付加塩としては、酢酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、アスコルビン酸塩等を好適に例示することができ、中でも、塩酸塩を特に好適に例示することができる。シプロヘプタジンやその塩は、市販のシプロヘプタジン塩酸塩を利用して適宜製造することができる。
【００２４】
本発明におけるＳｅｔ７／９阻害物質とは、Ｓｅｔ７／９（すなわち、Ｓｅｔ７／９タンパク質）が標的タンパク質又は標的ペプチドをメチル化することを阻害する物質を意味する。前述のＳｅｔ７／９タンパク質及びＳｅｔ７／９遺伝子としては、哺乳動物由来のものを好適に例示することができ、中でも、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー由来のものをより好適に例示することができ、中でも、ヒト由来のものとして、Ｇｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＮＭ＿０３０６４８、ＧＩ：８３０３５１３５に記載されたＳｅｔ７／９タンパク質やＳｅｔ７／９遺伝子を特に好適に例示することができる。かかるヒトＳｅｔ７／９遺伝子の塩基配列として、配列番号１に示される塩基配列を例示することができ、ヒトＳｅｔ７／９のアミノ酸配列として、配列番号２に示されるアミノ酸配列を例示することができる。Ｓｅｔ７／９の上記標的ペプチドとしては、ヒトのヒストンＨ３のアミノ酸番号１−４のアミノ酸残基からなるペプチド（ＡＲＴＫ；配列番号６）や、ヒトのｐ５３のアミノ酸番号３６９−３７２のアミノ酸残基からなるペプチド（ＬＫＳＫ；配列番号７）や、ヒトのＥＲαのアミノ酸番号２９９−３０２のアミノ酸残基からなるペプチド（ＫＲＳＫ；配列番号８）を好適に例示することができる。
【００２５】
ある物質がＳｅｔ７／９阻害活性を有しているかどうかは、本発明者らが独自に開発したヒストンメチル化酵素活性の測定方法（特願２０１０−２０２４８４）を好適に利用することができる。かかる測定方法の詳細は、前記特許出願に記載されているが、その測定原理の概要を図５に示す。図５から分かるように、まず、ヒストンメチル化酵素の基質となるペプチドと色素標識（ＭＣＡ：4-methyl-coumaryl-7-amide）を有するペプチジルＭ
ＣＡを、基質化合物として用意する。このペプチジルＭＣＡにトリプシンを作用させると、ペプチジルＭＣＡのＬｙｓとＭＣＡの間のアミド結合が切断されて、ＡＭＣ（7-amino-4-methyl-coumarin）が遊離する。一方、このペプチジルＭＣＡは、そのリシンのε位のアミノ基がヒストンメチル化酵素（ＨＭＴ）によりメチル化を受けると、リシンとＡＭＣ間のアミド結合はトリプシンにより分解されなくなる。ＡＭＣは、ＡＭＣがペプチドと結合したクマリン（即ちぺプチジルＭＣＡ）と蛍光特性が異なるため、その相違を利用して、トリプシンの作用完了後に、ＡＭＣのみの蛍光強度、あるいはメチル化されて残存するぺプチジルＭＣＡのみの蛍光強度を測定することで、ヒストンメチル化酵素の活性を定量的に測定することが可能となる。ＡＭＣのみの蛍光強度を測定する場合は、例えば、励起波長λｅｘ＝３９０ｎｍ、蛍光波長λｅｍ＝４６０ｎｍで測定することを好適に例示することができ、ぺプチジルＭＣＡのみの蛍光強度を測定する場合は、例えば、励起波長λｅｘ＝３３０ｎｍ、蛍光波長λｅｍ＝３９５ｎｍ、より好ましくは励起波長λｅｘ＝３３０ｎｍ、蛍光波長λｅｍ＝３８０ｎｍで測定することを好適に例示することができる。
【００２６】
本発明の剤に含有されるＳｅｔ７／９阻害物質あるいはシプロヘプタジンの量としては、Ｓｅｔ７／９阻害効果が得られる限り特に制限されないが、例えば、本発明の剤の全量に対して例えば０．０００１〜９９．９９９９質量％、好ましくは０．００１〜８０質量％、より好ましくは０．００１〜５０質量％、さらに好ましくは０．００５〜２０質量％を好適に例示することができる。
【００２７】
本発明の剤には、Ｓｅｔ７／９阻害効果が得られる限り、本発明におけるＳｅｔ７／９阻害物質あるいはシプロヘプタジン以外に、他のがん細胞の増殖抑制剤や、前述の疾患に対する予防効果及び／又は治療効果を奏する他の物質などの任意成分を含んでいてもよい。
【００２８】
本発明の剤の剤型としては、例えば、散剤、顆粒剤、錠剤、溶液剤、乳剤、懸濁剤、シロップ剤、カプセル剤、坐剤、注射剤などを例示することができる。これらの製剤は、本発明におけるＳｅｔ７／９阻害物質に、製剤上の必要に応じて、適宜の薬学的に許容される担体、例えば、溶媒、賦形剤、結合剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、等張化剤、緩衝剤、安定化剤、無痛化剤、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、滑沢剤、崩壊剤、湿潤剤、吸着剤、甘味剤、希釈剤などの任意成分を配合することにより製造することができる。
【００２９】
本発明の剤の投与方法は、対象においてＳｅｔ７／９阻害効果が得られる限り特に制限されず、直腸内投与、口腔内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与等の非経口投与、あるいは、経口投与を例示することができる。また、インビトロの系の場合は、本発明の剤を対象細胞に添加等することにより、本発明の剤を対象細胞に接触させることや、本発明の剤を対象細胞内に注入することを例示することができる。
【００３０】
本発明の剤の投与量としては、対象においてＳｅｔ７／９阻害効果が得られる限り特に制限されず、投与対象となる個体、器官、局所部位、組織、投与対象となる個体の年齢・体重等に応じて、適宜選択することができる。本発明の予防・治療剤の投与量の好適な例としては、Ｓｅｔ７／９阻害物質換算で、例えば、１日当たり０．０００１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは、０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、さらに好ましくは０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重となるように、１日につき、例えば、１〜３回投与すること等を好適に例示することができる。また、本発明の剤をインビトロの系で用いる場合は、Ｓｅｔ７／９阻害物質換算で、０．０１ｎＭ〜１０Ｍ、好ましくは１ｎＭ〜１００ｍＭとなるように対象細胞に接触させることを好適に例示することができる。なお、本発明におけるＳｅｔ７／９阻害物質として、シプロヘプタジン等を用いる場合は、Ｓｅｔ７／９阻害物質換算として、シプロヘプタジン塩酸塩換算を利用することが好ましい。
【００３１】
本発明の剤の投与対象としては、哺乳動物又は哺乳動物細胞を好適に例示することができ、かかる哺乳動物の中でも、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーをより好適に例示することができ、中でも、ヒトを特に好適に例示することができる。
【００３２】
本発明の予防・治療剤が予防・治療する対象とするエストロゲン受容体の過剰に起因する疾患としては、エストロゲン受容体の過剰に起因する疾患である限り特に制限されないが、例えば、女性特有の組織、子宮や卵巣、乳房における筋腫やがん等を好適に例示することができ、中でも、乳がん、乳腺線維腺腫、乳腺症、子宮筋腫、子宮腺筋症、子宮内膜増殖症、子宮内膜がん、子宮体がん、胞状奇胎、絨毛がん、卵巣腫瘍、卵巣嚢腫、卵巣がんをより好適に例示することができ、中でも、乳がんを特に好適に例示することができる。
【００３３】
本発明の増殖抑制剤が対象とするがん細胞としては、本発明におけるＳｅｔ７／９阻害物質が増殖抑制効果を発揮する限り特に制限されないが、乳がん細胞を好適に例示することができ、中でも、ヒト乳がん細胞をより好適に例示することができ、中でも、ＭＣＦ−７、ＨＢＣ−４、ＢＳＹ−１、ＨＢＣ−５、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１をさらに好適に例示することができ、中でも、ＭＣＦ−７を特に例示することができる。
【００３４】
なお、本発明の他の態様として、本発明のＳｅｔ７／９阻害剤、増殖抑制剤、又は、予防・治療剤の製造における、本発明におけるＳｅｔ７／９阻害物質あるいはシプロヘプタジン等の使用：や、本発明におけるＳｅｔ７／９阻害物質あるいはシプロヘプタジン等の、本発明のＳｅｔ７／９阻害剤、増殖抑制剤、又は、予防・治療剤としての使用：や、本発明におけるＳｅｔ７／９阻害物質あるいはシプロヘプタジン等を、本発明のＳｅｔ７／９阻害剤、増殖抑制剤、又は、予防・治療剤に使用する方法：や、Ｓｅｔ７／９の阻害における、本発明におけるＳｅｔ７／９阻害物質あるいはシプロヘプタジン等の使用：や、がん細胞の増殖抑制における、本発明におけるＳｅｔ７／９阻害物質あるいはシプロヘプタジン等の使用：や、エストロゲン受容体の過剰に起因する疾患の予防・治療における、本発明におけるＳｅｔ７／９阻害物質あるいはシプロヘプタジン等の使用：や、本発明のＳｅｔ７／９阻害剤を対象又は対象細胞へ投与することを特徴とするＳｅｔ７／９の阻害方法：や、本発明のＳｅｔ７／９阻害剤を対象又は対象細胞へ投与することを特徴とするがん細胞の増殖抑制方法：や、本発明のＳｅｔ７／９阻害剤を対象又は対象細胞へ投与することを特徴とするエストロゲン受容体の過剰に起因する疾患の予防・治療方法も例示することができる。これらの使用や方法における文言の内容やその好ましい態様は、前述したとおりである。
【００３５】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例】
【００３６】
［Ｈｉｓ−Ｓｅｔ７／９、ＧＳＴ−Ｇ９ａ及びＧＳＴ−ヒストンＨ３（１−２０）タンパク質の調製］
配列番号２に示すＳｅｔ７／９とヒスチジンタグの融合タンパク質（Ｈｉｓ−Ｓｅｔ７／９）を発現するベクターとして、pET28a(+)−Set7/9を国立遺伝学研究所から入手した
。また、配列番号４に示すｍＧ９ａ（７０６番目のアミノ酸からストップコドン）とＧＳＴタグの融合タンパク質を発現するベクターとして、pGEX-4T-1-mG9aを京都大学から入手した。また、ＧＳＴとヒストンＨ３の１−５７番目のアミノ酸配列からなる融合タンパク質（ＧＳＴ−ヒストンＨ３（１−５７））を発現するベクターとして、pGEX-4T-3-histone H3を京都大学から入手した。これらの発現ベクターを大腸菌に形質転換してタンパク質を産生させ、大腸菌を破砕し、ＮｉビーズまたはグルタチオンセファロースによりＨｉｓ−Ｓｅｔ７／９、ＧＳＴ−Ｇ９ａ及びＧＳＴ−ヒストンＨ３（１−５７）タンパク質を精製した。
【００３７】
［ペプチジルＭＣＡの作製］
メチル化酵素Ｓｅｔ７／９及びＧ９ａによるメチル化の基質として、ペプチジルＭＣＡの標的リシンのＮ末端側に特定のアミノ酸配列を有するペプチジルＭＣＡを合成した。すなわち、Ｓｅｔ７／９によるメチル化の基質であるヒストンＨ３の一部のアミノ酸配列（アミノ酸番号１−４：配列番号６）を、標的リシンのＮ末端側に有するペプチジルＭＣＡとして、Ａｃ（アセチル基）−ＡＲＴＫ−ＭＣＡを作製し、Ｓｅｔ７／９によるメチル化の基質であるｐ５３の一部のアミノ酸配列（アミノ酸番号３６９−３７２：配列番号７）を、標的リシンのＮ末端側に有するペプチジルＭＣＡとして、Ａｃ−ＬＫＳＫ−ＭＣＡを作製し、Ｓｅｔ７／９によるメチル化の基質であるＥＲαの一部のアミノ酸配列（アミノ酸番号２９９−３０２：配列番号８）を、標的リシンのＮ末端側に有するペプチジルＭＣＡとして、Ａｃ−ＫＲＳＫ−ＭＣＡを作製し、Ｇ９ａによるメチル化の基質であるヒストンＨ３の一部のアミノ酸配列（アミノ酸番号１−９：配列番号９）を、標的リシンのＮ末端側に有するペプチジルＭＣＡとして、Ａｃ−ＡＲＴＫＱＴＡＲＫ−ＭＣＡを作製した。これらのペプチジルＭＣＡは、以降本明細書において、それぞれＡｃ−ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ３（１−４）−ＭＣＡ、Ａｃ−ｐ５３（３６９−３７２）−ＭＣＡ、Ａｃ−ＥＲα（２９９−３０２）−ＭＣＡ、Ａｃ−ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ３（１−９）−ＭＣＡと表す。
【００３８】
［蛍光ペプチドを用いたヒストンメチル化酵素の特異性の評価］
蛍光ペプチドを用いたヒストンメチル化酵素測定法により、ヒストンメチル化酵素Ｓｅｔ７／９の基質特異性を調べた。９６穴プレート（黒）に１０μＬの２×ＨＭＴ activity buffer（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、４０ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、５００ｍＭ スクロース）、０．４μＬのＢＳＡ溶液（１５０μｇ／ｍＬ）、Ｈｉｓ−Ｓｅｔ７／９又はＧＳＴ−Ｇ９ａ、及び、蒸留水を加えて計１８μＬの反応液を調製し、室温で１時間インキュベートした。次いで、１μＬのＳＡＭ（S-(5’-Adenosyl)-L-methyonine chloride；Ｈｉｓ−ｓｅｔ７／９に対しては２ｍＭ、ＧＳＴ−Ｇ９ａに対しては２０ｍＭ）及び１μＬのペプチジルＭＣＡ溶液（１．２ｍＭ）を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。その後、３０μＬのトリプシン溶液（２０ｍｇ／ｍＬ）を添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。反応液の蛍光強度を励起波長λｅｘ＝３３０ｎｍ、蛍光波長λｅｍ＝３８０ｎｍで測定することによりトリプシン添加後残存するメチル化されたペプチジルＭＣＡ量を測定し、メチル化酵素の活性を評価した。
【００３９】
図６に示すように、標的リシンのＮ末端側のアミノ酸配列を変化させることで、ＨＭＴの基質特異性を評価することができた。Ｓｅｔ７／９のメチル化の対象となる部位のコンセンサス配列はＸ（任意のアミノ酸）−塩基性アミノ酸−親水性アミノ酸−Ｋ（リシン残基）であり、標的リシンはヒストンＨ３のＫ４、ｐ５３のＫ３７２、ＥＲαのＫ３０２であり、その中でもＥＲα由来のＡｃ−ＥＲα（２９９−３０２）−ＭＣＡがＳｅｔ７／９と最も高い反応性を示した（図６左パネル）。一方、これらを基質としないＧ９ａを用いた場合は、メチル化活性は検出されず、Ｇ９ａの基質であるＡｃ−ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ３（１−９）−ＭＣＡを基質とした場合のみメチル化活性が検出された（図６右パネル）。
【００４０】
［Ｓｅｔ７／９の阻害剤のスクリーニング］
ＲＩＫＥＮ ＮＰｄｅｐｏ（理化学研究所ケミカルバイオロジー研究領域天然化合物バンク）の１３，０００化合物に対し、以下の条件でＳｅｔ７／９の阻害剤のスクリーニングを行った。３８４穴プレート（黒）に５μＬの２×ＨＭＴ activity buffer（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、４０ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、５００ｍＭ スクロース）、０．２μＬのＢＳＡ溶液（１５０μｇ／ｍＬ）、Ｈｉｓ−Ｓｅｔ７／９、１ｍｇ／ｍｌの被検物質を０．５μＬ、及び蒸留水を加えて計９μＬの反応液を調製し、室温で１時間インキュベートした。次いで、０．５μＬのＳＡＭ（２ｍＭ）及び０．５μＬのＡｃ−ＥＲα（２９９-３０２）−ＭＣＡ溶液（１．２ｍＭ）を添加して、３７℃で１時間インキュベートした。その後、１５μＬのトリプシン溶液（２０ｍｇ／ｍＬ）を添加して、３７℃で１５分間インキュベートした。反応液の蛍光強度を励起波長λｅｘ＝３９０ｎｍ、蛍光波長λｅｍ＝４６０ｎｍで測定することによりＡＭＣ量を、また励起波長λｅｘ＝３３０ｎｍ、蛍光波長λｅｍ＝３８０ｎｍで測定することによりメチル化されたペプチジルＭＣＡ量を測定し、メチル化酵素の活性を評価した。スクリーニングの結果、抗アレルギー薬として臨床で用いられている、セロトニン受容体及びヒスタミン受容体（Ｈ１）のアンタゴニストであるシプロヘプタジン（Cyproheptadine、別名periactin）がＳｅｔ７／９のメチル化活性を抑制したことから、シプロヘプタジンをＳｅｔ７／９の阻害剤として同定した。
【００４１】
［シプロヘプタジンによるＳｅｔ７／９活性の阻害作用；fluorescence-based assay］
シプロヘプタジンによるヒストンメチル化酵素阻害作用がＳｅｔ７／９特異的であるか調べるために、次の条件でin vitro ＨＭＴアッセイを行った。９６穴プレート（黒）に２×ＨＭＴ activity buffer（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、４０ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、５００ｍＭ スクロース）を１０μＬ、ＢＳＡ（１５０μｇ／ｍＬ）を０．４μＬ、Ｈｉｓ−Ｓｅｔ７／９（０．２５ｍｇ／ｍＬ）を４μＬ、及び各濃度のシプロヘプタジンを１μＬ添加し、蒸留水を加えて計１８μＬの反応液を調製した後、室温で１時間インキュベートした。その後、ＳＡＭ（２ｍＭ）を１μＬ、Ａｃ−ＥＲα（２９９−３０２）−ＭＣＡ（１．２ｍＭ）を１μＬ添加した。暗所、３７℃で１時間反応させた後、トリプシン（２０ｍｇ／ｍＬ）を３０μＬ添加し、更に暗所、３７℃で１５分間反応させた。その後蛍光プレートリーダーでメチル化されたペプチジルＭＣＡの蛍光強度（励起波長λｅｘ＝３３０ｎｍ、蛍光波長λｅｍ＝３８０ｎｍ）を測定した。薬剤のＳｅｔ７／９メチル化活性の阻害率を、（コントロールの蛍光強度−薬剤存在下の蛍光強度）／（コントロールの蛍光強度−Ｈｉｓ−Ｓｅｔ９非存在下の蛍光強度）×１００という数式により算出した。Ｇ９ａへの影響は、Ｈｉｓ−Ｓｅｔ７／９をＧＳＴ−Ｇ９ａに、また蛍光基質をＡｃ−ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ３（１−９）−ＭＣＡに、更にＳＡＭを２ｍＭ溶液から２０ｍＭ溶液に置き換えて同様に検討した（図７左）。この結果より、シプロヘプタジンはＧ９ａを阻害することなく、Ｓｅｔ７／９を選択的に阻害することが示された。
【００４２】
［シプロヘプタジンによるＳｅｔ７／９活性の阻害作用；Western blotting］
また、シプロヘプタジンによる、ヒストンＨ３のＫ４に対するＳｅｔ７／９のメチル化活性の阻害効果を調べるために、ＧＳＴ−ヒストンＨ３（１−５７）を基質として用いてin vitro ＨＭＴアッセイを行い、ウェスタンブロッティングにより検出した。２×ＨＭＴ activity buffer（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、４０ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、５００ｍＭ スクロース）を１０μＬ、ＢＳＡ（３０μｇ／ｍＬ）を２μＬ、Ｈｉｓ−Ｓｅｔ７／９（１．７ｍｇ／ｍＬ）を２．４μＬ、及び各濃度のシプロヘプタジンを１μＬ添加し、蒸留水を加えて計１６μＬにした後、室温で１時間インキュベートした。その後、ＳＡＭ（１０ｍＭ）を２μＬ、ＧＳＴ−ヒストンＨ３（１−５７）（０．２ｍｇ／ｍＬ）を２μＬ添加した。３７℃で１時間反応させた後、１０μＬのサンプルbuffer（１７６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、７．１％ ＳＤＳ、０．３５％ ブロモフェノールブルー、３５％ グリセロール、１５％ ２−メルカプトエタノール）を加え、１００℃で３分間ボイルすることでタンパク質を変性させた。その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ウェスタンブロッティング法により、各タンパク質を検出した。用いた一次抗体は、抗６×Ｈｉｓ抗体（ＭＢＬ社製、PM032）、ヒストンＨ３のＫ４のメチル化を検出する抗ヒストンＨ３Ｋ４ｍｅ１抗体（Upstate社製、07-436）、及び抗ＧＳＴ抗体（Cell Signaling社製、2622）である。図７右下パネルに示すように、シプロヘプタジン濃度依存的に、Ｓｅｔ７／９のヒストンＨ３のＫ４におけるメチル化が阻害されることが確認できた。
【００４３】
［シプロヘプタジンによるＳｅｔ７／９活性の阻害のキネティクス］
シプロヘプタジンがＳｅｔ７／９活性を阻害するしくみを調べるために、Ｓｅｔ７／９とＡｃ−ＥＲα（２９９−３０２）−ＭＣＡによるin vitro ＨＭＴアッセイにおける、シプロヘプタジンの阻害様式を調べた。ＳＡＭの濃度に対してLine weaver-Burkプロットをとると反拮抗阻害を表したのに対し（図８左パネル）、ペプチジルＭＣＡに対してLine weaver-Burkプロットをとると拮抗阻害を表したことから（図８中央パネル）、シプロヘプタジンによるＳｅｔ７／９活性の阻害は、酵素とメチル基受容体の相互作用部位に結合する阻害様式であることがわかった。さらに、シプロヘプタジンの濃度に対してDixonプロットをとることにより、シプロヘプタジンによるＳｅｔ７／９活性の阻害反応の阻害定数Ｋｉは１５μＭであることがわかった（図８右パネル）。
【００４４】
［シプロヘプタジンがＥＲαの発現に及ぼす影響］
ＨＥＫ２９３Ｔ（ヒト胎児腎臓由来）細胞、ＨｅＬａ（ヒト子宮頸がん由来）細胞、ＭＣＦ７（ヒト乳がん由来）細胞におけるＥＲα及びＳｅｔ７／９の発現量をウェスタンブロッティング法により調べたところ、ＭＣＦ７細胞でのみ両者の発現が確認された（図９の上段左パネル）。そこで、以下の実験ではＭＣＦ７細胞を使用した。
【００４５】
次に、シプロヘプタジンによるＥＲαの発現量への影響を調べた。１２穴プレートに１穴あたりＭＣＦ７細胞を１×１０５個まき、２４時間後、各濃度のシプロヘプタジンを添加した。４８時間培養した後、細胞を回収し、ＲＩＰＡ buffer（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．８）、１．５％ TritonX-100、１％ デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ ＳＤＳ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＮａＦ、０．１ｍＭ オルトバナジン酸トリナトリウム）を加え、細胞を可溶化した。得られた各細胞可溶化液のタンパク質濃度をそろえた後、タンパク質溶液の１／２量のサンプルbuffer（１７６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、７．１％ ＳＤＳ、０．３５％ ブロモフェノールブルー、３５％ グリセロール、１５％ ２−メルカプトエタノール）を加え、１００℃で３分間ボイルすることでタンパク質を変性させた。その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ウェスタンブロッティング法により、ＥＲα、Ｓｅｔ７／９、α−tubulinを検出した（図９）。用いた一次抗体は抗ＥＲα抗体（Cell Signaling社製、2513）、抗Ｓｅｔ７／９抗体（Cell Signaling社製、2813）、及び抗α−tubulin抗体（SIGMA社製、T5168）である。この結果より、シプロヘプタジンの濃度依存的に、ＥＲαの発現量が低下することが示された（図９の上段中央パネル）。
【００４６】
さらに、Ｓｅｔ７／９ノックダウンによるＥＲαの発現量への影響を調べた。１２穴プレートに１穴あたりＭＣＦ７細胞を１×１０５個まき、配列番号１０〜１３で示される４種類のＳｅｔ７／９に対するｓｉＲＮＡ（short interfering ＲＮＡ）、ｓｉＳｅｔ７／９を導入し、４８時間後に上述と同様の手法で細胞を回収し、ウェスタンブロッティング法によりＥＲα、Ｓｅｔ７／９、α−tubulinを検出した。添加したｓｉＳｅｔ７／９量に依存してＳｅｔ７／９発現量及びＥＲα発現量が減少した（図９の上段右パネル）。その一方で、同様にしてＡＲ（Androgen Receptor）を発現しているＬＮＣａＰ（ヒト前立腺がん細胞由来）細胞を用いて、シプロヘプタジン添加によりＡＲ発現量が影響を受けるか調べたところ、ＡＲの発現量は変化しなかった（図９の下段左パネル及び中央パネル）。
【００４７】
［シプロヘプタジンがＥＲ転写活性に及ぼす影響］
シプロヘプタジンのＥＲ転写活性に及ぼす影響を調べるために、dual luciferase assayにより、ＥＲＥ（estrogen responsive element）レポーターアッセイを行った（図１０上段）。２４穴プレートに１穴あたりＭＣＦ７細胞を１．５×１０４個まき、２４時間後、ＰＢＳ ５００μＬで細胞を洗浄した後、チャコール処理でステロイドホルモンを除去したＦＢＳを１０％含む、フェノールレッド不含のＲＰＭＩ培地を５００μＬ添加した。４８時間培養した後、再度培地を、チャコール処理ＦＢＳを１０％含むフェノールレッド不含のＲＰＭＩ培地（５００μＬ）に交換し、リポフェクトアミン２０００を用いてpGL4-3×ERE-TA2（０．５μｇ）及びpGL4.74[hRluc/TK]（０．１μｇ）を細胞にトランスフェクションした。トランスフェクション後６時間後に各濃度の薬剤（タモキシフェン又はシプロヘプタジン）を添加し、更に１８時間培養した後、エストロゲンの一種であるβ−エストラジオールを、各濃度添加した。２４時間培養した後、培地を除去し、lysis buffer（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ TritonX-100）１２０μＬを加え、−８０℃で３０分以上静置し細胞を溶解した。この細胞可溶化液を５０μＬずつ９６穴プレート（白）に移し、５０μＬのluciferase buffer（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．５ｍＭ ＣｏＡ、０．５ｍＭ ＡＴＰ、０．２５ｍＭ Ｄ−ルシフェリン）および１００μＬのrenilla buffer（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１μＭ coelenterazine）を順次加え、その都度、発光強度を発光プレートリーダーで測定することにより、firefly luciferase及びrenilla luciferaseの発光強度を取得した。得られたfirefly luciferaseの値をrenilla luciferaseの値で割ることにより、ＥＲＥの活性を算出した。リガンド（β−エストラジオール）依存的にＥＲＥは活性化されるが（図１０下段左パネル）、タモキシフェンやシプロヘプタジン添加によりこの活性化は抑えられることがわかった（図１０下段右パネル）。シプロヘプタジンは、タモキシフェンと同様に、ＥＲαの発現を抑制する濃度で、エストロゲンによる細胞増殖の促進を阻害した。
【００４８】
［シプロヘプタジンがエストロゲン刺激によるｐＳ２のｍＲＮＡの発現に及ぼす影響］
ｐＳ２は、エストロゲンに応答し、ＥＲαに依存して発現するエストロゲンシグナルのマーカー遺伝子である。シプロヘプタジンのエストロゲンシグナルへの影響をより詳細に調べるために、シプロヘプタジンが、エストロゲン刺激によるｐＳ２のｍＲＮＡの発現に及ぼす影響を調べた。６０ｍｍディッシュにＭＣＦ７細胞を１×１０５個まき、２４時間後、ＰＢＳ ３ｍＬで細胞を洗浄した後、チャコール処理でステロイドホルモンを除去したＦＢＳを１０％含むフェノールレッド不含のＲＰＭＩ培地を３ｍＬ添加した。４８時間培養した後、再度チャコール処理でステロイドホルモンを除去したＦＢＳを１０％含むフェノールレッド不含のＲＰＭＩ培地３ｍＬに交換した後、各濃度の薬剤（タモキシフェン又はシプロヘプタジン）を添加した。２４時間培養した後、１０ｎＭのβ−エストラジオールを添加した。更に２４時間培養した後、細胞をTrizol Reagent（Invitrogen社製）で回収し、ＲＮＡを抽出した。Oligo (dT) 12-18 Primerを用い、逆転写酵素（M-MLV Reverse Transcriptase RNaseH Minus（Point Mutant）（Promega社製））によりｃＤＮＡを作製し、これをテンプレートとして、配列番号１４及び１５、又は、配列番号１６及び１７に示すプライマーを用いてＰＣＲを行い、ｐＳ２又はＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現を検出した。ｐＳ２はエストロゲンに応答して、ＥＲα依存的に、ＥＲＥプロモーターを介して発現した（図１１左パネル）。しかし、ＥＲαの発現を抑制し、ＥＲＥプロモーター活性を阻害する濃度のシプロヘプタジンをＭＣＦ７細胞に添加すると、タモキシフェンと同様にエストロゲン刺激によるｐＳ２のｍＲＮＡの発現は抑制された（図１１右パネル）。
【００４９】
［シプロヘプタジンがエストロゲン依存的な細胞増殖に及ぼす影響］
シプロヘプタジンがエストロゲン依存的な細胞増殖に及ぼす影響を調べた。２４穴プレートに１穴あたりＭＣＦ７細胞を１．５×１０４個まき、２４時間後、ＰＢＳ ５００μＬで細胞を洗浄した後、チャコール処理でステロイドホルモンを除去したＦＢＳを１０％含むフェノールレッド不含のＲＰＭＩ培地を５００μＬ添加した。その後、各濃度の薬剤（タモキシフェン又はシプロヘプタジン）を添加した後、各濃度のβ−エストラジオールを添加した。９６時間培養した後、細胞をトリプシンではがし、血球計算盤で細胞数を測定した。ＭＣＦ７はβ−エストラジオール濃度依存的な細胞増殖を示すが（図１２左パネル）、タモキシフェン及びシプロヘプタジンの添加により、その細胞増殖が抑えられることがわかった（図１２右パネル）。すなわち、タモキシフェンと同様に、シプロヘプタジンはエストロゲン添加による細胞増殖の亢進を阻害し、その濃度はＥＲαの発現を抑制する濃度と一致することが示された。
【００５０】
［シプロヘプタジンが乳がん細胞の増殖に及ぼす影響］
シプロヘプタジンが、乳がん細胞の増殖に及ぼす影響を調べた。５種類の乳がん細胞（ＨＢＣ−４、ＢＳＹ−１、ＨＢＣ−５、ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）をそれぞれ９６ウェルプレートにまき込み、翌日サンプル溶液を添加、２日間培養した。これらの細胞増殖を、細胞内のタンパク質総量を検出するスルホローダミンＢによる比色定量で測定し、ＧＩ５０値（５０％の増殖抑制を示すシプロヘプタジン濃度）を算出した（図１３）。シプロヘプタジンはいずれの乳がん細胞においても細胞増殖の亢進を阻害することが示された。
【００５１】
［シプロヘプタジンのカンプトテシンにより誘導されるｐ５３の発現及び細胞増殖抑制に及ぼす影響］
ｐ５３の３７２番目のリジン残基（Ｋ３７２）は、Ｓｅｔ７／９によりメチル化されることで安定化することが報告されている（Nature, 432, 353-360, 2004）。シプロヘプタジンによりＥＲα以外のＳｅｔ７／９の基質が影響を受けるか調べるため、ｐ５３について調べた。１２穴プレートに１穴あたりＭＣＦ７細胞を１×１０５個まき、２４時間後、０．３μｇ／ｍＬのカンプトテシン（Camptothecin、ＣＰＴ）を添加した。０〜１２時間培養した後、細胞を回収し、ＲＩＰＡ buffer（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．８）、１．５％ TritonX-100、１％ デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ ＳＤＳ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＮａＦ、０．１ｍＭ オルトバナジン酸トリナトリウム）で細胞を可溶化した。得られた各細胞可溶化液のタンパク質濃度をそろえた後、タンパク質溶液の１／２量のサンプルbuffer（１７６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、７．１％ ＳＤＳ、０．３５％ ブロモフェノールブルー、３５％ グリセロール、１５％ ２−メルカプトエタノール）を加え、１００℃で３分間ボイルすることでタンパク質を変性させた。その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ウェスタンブロッティング法により、ｐ５３、Ｓｅｔ７／９、α−tubulinを検出した。用いた一次抗体は抗ｐ５３抗体（SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY社製、sc-6243）、抗Ｓｅｔ７／９抗体（Cell Signaling社製、2813）、及び抗α−tubulin抗体（SIGMA社製、T5168）である。ｐ５３はＣＰＴにより安定化するが（図１４左上パネル）、ＥＲαの発現を抑制する濃度のシプロヘプタジンを添加しても、ＣＰＴにより誘導されるｐ５３の発現量は変化しなかった（図１４右上パネル）。また、配列番号１０〜１３で示される４種のｓｉＳｅｔ７／９を用いたＳｅｔ７／９の発現ノックダウンでも、ｐ５３の発現量は減少しなかった（図１４左下パネル）。さらに、９６穴プレートに１穴あたり１００μＬのＲＰＭＩ培地にＭＣＦ７細胞を１穴あたり０．４×１０４個まき、２４時間後に、シプロヘプタジン０又は４３μＭ存在下でＣＰＴを１穴あたり１００μＬのＲＰＭＩ培地に溶解して添加した。３７℃、５％ＣＯ２下で４８時間細胞をインキュベートした後、２０μＬのＷＳＴ−１試薬（DOJINDO Laboratories製）を添加し、更に２時間インキュベートした。その後マイクロプレートリーダーで吸光度を測定してＷＳＴ−１アッセイを行い、ＣＰＴの半数阻害濃度ＩＣ５０を算出した。その結果、シプロヘプタジン添加によって、ｐ５３による細胞増殖抑制は影響を受けなかった（図１４右下パネル）。In vivoにおいてＳｅｔ７／９はｐ５３を制御していない可能性が考えられる。
【００５２】
［in vivoにおける、シプロヘプタジンの抗腫瘍試験］
シプロヘプタジンが、in vivoにおいて抗腫瘍効果（腫瘍の増殖抑制効果）を発揮することを確認するために、以下のような方法で抗腫瘍試験を行った。
【００５３】
愛媛大学大学院医学系研究科より入手したＭＣＦ７細胞を、ＤＭＥＭ培地（Wako社製、044-29765）を含む直径１０ｃｍのディッシュ中で、３７℃、４８時間培養した。ディッシュ４枚分のＭＣＦ７細胞につき、４５０μＬのHank’s Buffer（GIBCO社製、HBSS 14170）でＭＣＦ７細胞を懸濁し、移植用のＭＣＦ７細胞液を得た。
【００５４】
上記のＭＣＦ７細胞液の移植対象として、雌のヌードマウス（Balb/C-nu/nu、日本チャールスリバー株式会社製）を３６匹用意し、それらを４つの群に分けた。これらの各ヌードマウスの右肩皮下、２箇所の乳腺の計３箇所（図１５参照）に、上記移植用のＭＣＦ７細胞液を１箇所あたり１５０μＬ（細胞数は約２×１０７個）ずつ注入することによって、ＭＣＦ７細胞の移植を行った。移植から１３日目に４群について投与サンプルの投与を開始した。以下、投与サンプルの投与開始日の前日を０日としたときの経過日数を、単に「経過日数」と表示する。１つ目の群では、コントロールとして、１０ｍｇ／ｋｇのビヒクルを経過日数１日から８日まで、１日１回腹腔内投与（i.p.）し、２つ目の群では、２０ｍｇ／ｋｇのシプロヘプタジン塩酸水和物（SIGMA社製）を経過日数１日に１回腹腔内投与し、３つ目の群では、４０ｍｇ／ｋｇのシプロヘプタジン塩酸水和物を経過日数１日に１回腹腔内投与し、４つ目の群では、２０ｍｇ／ｋｇのシプロヘプタジン塩酸水和物を経過日数１日から８日まで、１日１回腹腔内投与した（図１６の右下の投薬スケジュール）。
【００５５】
上記の４つの群の各マウスについて、経過日数が、１日、４日、８日、１１日、及び、１５日のときに、腫瘍の体積と体重を測定した。各群について、経過日数が１日のとき（投与日）の腫瘍の体積の平均測定値を１とした場合の、腫瘍の体積の平均測定値の相対比率を、相対腫瘍増殖率として、グラフに表した（図１６の左上のグラフ）。また、各群について、経過日数が１日のときのマウスの平均体重を０とした場合の、体重の平均値の増減（ｇ）もグラフに表した（図１６の右上のグラフ）。これらの結果から、シプロヘプタジン塩酸水和物を投与した３つのいずれの群（Cyproheptadine塩酸水和物２０ｍｇ／ｋｇ×１ i.p.；Cyproheptadine塩酸水和物４０ｍｇ／ｋｇ×１ i.p.；Cyproheptadine 塩酸水和物２０ｍｇ／ｋｇ×８ i.p.）でも、コントロール群（vehicle １０ｍｇ／ｋｇ×８ i.p.）と比較して相対腫瘍増殖率の低下がみられ、中でも経過日数１１日及び１５日では、有意な低下がみられた（図１６の左下の表）。そして、各群の体重の平均値の増減に有意な差はみられなかったことから、相対腫瘍増殖率の低下は、シプロヘプタジン塩酸水和物の作用であることが示された。なお、シプロヘプタジン塩酸水和物のこの抗腫瘍効果は、シプロヘプタジン塩酸水和物の投与量や投薬回数による大きな差はみられなかった（図１６の左上のグラフ）。
【００５６】
また、シプロヘプタジンの急性毒性の有無を確認するために、さきほどと同じ投薬スケジュール（図１７の下の投薬スケジュール）にて前述の４つの群の投与サンプルの投与実験を行った。ただし、コントロール群については、前述の１０ｍｇ／ｋｇのビヒクルに代えて、２０ｍｇ／ｋｇのビヒクルを用いた。投与後のマウスの様子を観察したところ、シプロヘプタジン塩酸水和物の投与から１０分経過後くらいから、じっと動かなくなり、傾眠又は嗜眠様の症状を示したが、投与から２時間経過後にはその症状がみられなくなった。経過日数が１〜１５日のときの、各群の体重の平均値の増減をグラフに表した（図１７の上グラフ）。その結果、投与開始の翌日（経過日数２日）に、シプロヘプタジン塩酸水和物の投与量に依存して、体重の減少度合いが大きくなったが、経過日数が増えるにつれて徐々に体重が回復し、いずれの経過日数においても、各群の間に有意差はみられなかった。これらの結果から、シプロヘプタジンは毒性の点で特に問題ないことが示された。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明は、ヒストンメチル化酵素Ｓｅｔ７／９阻害剤の分野や、がん細胞の増殖抑制剤の分野や、エストロゲン受容体の過剰に起因する疾患の予防・治療剤の分野に好適に利用することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シプロヘプタジン又はその塩を含有するヒストンメチル化酵素Ｓｅｔ７／９阻害剤。
【請求項２】
ヒストンメチル化酵素Ｓｅｔ７／９の阻害物質を含有する、がん細胞の増殖抑制剤。
【請求項３】
ヒストンメチル化酵素Ｓｅｔ７／９の阻害物質が、シプロヘプタジン又はその塩である請求項２に記載のがん細胞の増殖抑制剤。
【請求項４】
がん細胞が、乳がん細胞である請求項３に記載のがん細胞の増殖抑制剤。
【請求項５】
ヒストンメチル化酵素Ｓｅｔ７／９の阻害物質を含有する、エストロゲン受容体の過剰に起因する疾患の予防・治療剤。
【請求項６】
ヒストンメチル化酵素Ｓｅｔ７／９の阻害物質が、シプロヘプタジン又はその塩である請求項５に記載の疾患の予防・治療剤。
【請求項７】
エストロゲン受容体の過剰に起因する疾患が、がんである請求項５又は６に記載の疾患の予防・治療剤。
【請求項８】
がんが、乳がんである請求項７に記載の疾患の予防・治療剤。
【請求項１】
シプロヘプタジン又はその塩を含有するヒストンメチル化酵素Ｓｅｔ７／９阻害剤。
【請求項２】
ヒストンメチル化酵素Ｓｅｔ７／９の阻害物質を含有する、がん細胞の増殖抑制剤。
【請求項３】
ヒストンメチル化酵素Ｓｅｔ７／９の阻害物質が、シプロヘプタジン又はその塩である請求項２に記載のがん細胞の増殖抑制剤。
【請求項４】
がん細胞が、乳がん細胞である請求項３に記載のがん細胞の増殖抑制剤。
【請求項５】
ヒストンメチル化酵素Ｓｅｔ７／９の阻害物質を含有する、エストロゲン受容体の過剰に起因する疾患の予防・治療剤。
【請求項６】
ヒストンメチル化酵素Ｓｅｔ７／９の阻害物質が、シプロヘプタジン又はその塩である請求項５に記載の疾患の予防・治療剤。
【請求項７】
エストロゲン受容体の過剰に起因する疾患が、がんである請求項５又は６に記載の疾患の予防・治療剤。
【請求項８】
がんが、乳がんである請求項７に記載の疾患の予防・治療剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
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【図１２】
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【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【公開番号】特開２０１２−１０２０８７（Ｐ２０１２−１０２０８７Ａ）
【公開日】平成２４年５月３１日（２０１２．５．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２２４６０４（Ｐ２０１１−２２４６０４）
【出願日】平成２３年１０月１２日（２０１１．１０．１２）
【出願人】（５０４１７４１３５）国立大学法人九州工業大学 (489)
【出願人】（０００１７３５８８）公益財団法人がん研究会 (34)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年５月３１日（２０１２．５．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１０月１２日（２０１１．１０．１２）
【出願人】（５０４１７４１３５）国立大学法人九州工業大学 (489)
【出願人】（０００１７３５８８）公益財団法人がん研究会 (34)
【Ｆターム（参考）】
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