タンパク質安定化調合物
【課題】凍結乾燥された骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）を安定化して、ＢＭＰが再水和時に生物活性の少なくとも６０％を保持し、再水和した液体生成物を外科医が容易に扱うことができるタンパク質安定化調合物を提供する。
【解決手段】凍結乾燥された組成物、およびそれに続くそれらの保管と復元のための賦形剤としてトレハロースを主として含む、ＢＭＰが安定化された調合物および組成物。また、緩衝剤および界面活性剤を含む他の賦形剤をも含むことができる。
【解決手段】凍結乾燥された組成物、およびそれに続くそれらの保管と復元のための賦形剤としてトレハロースを主として含む、ＢＭＰが安定化された調合物および組成物。また、緩衝剤および界面活性剤を含む他の賦形剤をも含むことができる。
【発明の詳細な説明】
【開示の内容】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、処理、保存、および復元の過程で、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）および密接に関連のある成長分化因子（ＧＤＦ）を安定化するための方法および調合物（formulations）に関する。さらに特定すれば、本発明は、ｒｈＧＤＦ−５を送達するための媒体として使用される種々の基質を含む、凍結乾燥、保存、および復元（reconstitution）の過程でｒｈＧＤＦ−５を保護するための、トレハロースおよび他の賦形剤を含む調合物に関する。さらに、本発明は、様々な筋骨格の欠陥および症状を治療するためにそのような調合物を調製および使用するための方法を含む。
【０００２】
〔発明の背景〕
生物学的分子（生体分子）は、三次元構造または立体配座（conformation）を有し、生体分子の生物活性および性質についてはこの構造に依存している。そのような生体分子の例は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、およびタンパク質を含む。これらの生体分子は生命に必須であり、様々な医学的疾患および症状の治療における、治療薬および治療標的を代表する。タンパク質は、広範な生体分子のクラスを代表する。酵素、成長因子、受容体、抗体、およびシグナル分子等の異なるクラスのタンパク質は、それらの生物活性について立体配座構造に依存している。他のタンパク質のクラスは、例えばコラーゲンおよび軟骨のように、主として構造的なものであり（structural）、それ自体は生物活性を有していない。
【０００３】
ｐＨ、温度、溶媒、オスモル濃度（osmolality）、その他の変化等の様々な環境に生体分子を曝露することは、生体分子の立体配座状態を不可逆的に変化させることまたは変性することができ、生体分子を生物学的に不活性にする。これらの生体分子の不活性化に関与する機構のうちいくつかは、凝集、酸化、加水分解および脱アミドを含む様々なタイプの結合切断、ならびに、架橋結合および他の共有結合を含む様々なタイプの結合形成を含み、例としてジスルフィド結合の転位（rearrangement）がある。
【０００４】
骨形態形成タンパク質および密接に関連のある成長分化因子は（単量体および二量体の形で）、タンパク質のＴＧＦ−βスーパーファミリーに属している。このタンパク質のクラスは、当初はその異所性軟骨内性骨形成を誘導する能力によって同定された、骨形態形成タンパク質のファミリーのメンバーを含む（Chengら、「Osteogenic activity of the fourteen types of human bone morphogenic proteins」 J. Bone Joint Surg. Am. 85A: 1544-52 (2003)を参照）。これらのタンパク質のいくつかには別名がある（Loriesら、Cytokine Growth Factor Rev 16:287-98 (2005)を参照）。このファミリーの全てのメンバーは、カルボキシ末端側の活性ドメインを含む共通の構造的特徴を共有し、成熟したときの鎖長でおよそ９７〜１０６アミノ酸である。全てのメンバーは、３つの分子内ジスルフィド結合および１つの分子間ジスルフィド結合を形成する、高度に保存されたシステイン残基のパターンを共有する。活性型は、ジスルフィド結合した単一のファミリーメンバーのホモ二量体、または２つの異なるメンバーのヘテロ二量体であることができる。（MassagueのAnnu. Rev. Cell Biol. 6:957 (1990)、SampathらのJ. Biol. Chem. 265:13198 (1990)、OzkaynakらのEMBO J. 9:2085-93 (1990)、WhartonらのPNAS 88:9214-18 (1991)、CelesteらのPNAS 87:9843-47 (1990)、LyonsらのPNAS 86:4554-58 (1989)、米国特許番号第５，０１１，６９１号、および米国特許番号第５，２６６，６８３号、を参照）。
【０００５】
多くの糖が、溶液中で生体分子を安定化し、分離した細胞および生体分子に保護を提供できることが周知である。これらの化合物は、様々な種において凍結防止剤および浸透圧調節剤として周知である（YanceyのJ. Exper. Biol. 208:2819-30 (2005)を参照）。凍結乾燥された薬剤用タンパク質の開発において、糖（サッカライドおよび多価アルコール）は、タンパク質の安定性を改善し、有効期間を延長するためにしばしば調合物に加えられる。糖の安定化作用の機構に関して、２つの主要な理論がある。１）糖賦形剤は、固体の状態でタンパク質を希釈することに寄与し、希釈することによって、タンパク質−タンパク質相互作用を減少させ、凝集等の分子劣化を防止する。２）糖賦形剤は、ガラス様基質を提供し、基質中ではタンパク質の移動度、したがって反応性が最小化される。これらの機構の双方において、糖が非結晶質のタンパク質に接触する相のままであることが重要な意味を持つ。高温および高湿度等の様々な環境因子が、糖の結晶化を誘発し得る。したがって、使用される条件および物質を、検討中の特定の生体分子およびシステムに適するように最適化することが重要である。
【０００６】
凍結乾燥（フリーズドライ）は、生体分子を保存するために通常使用される方法である。フリーズドライは一般的に、生体分子の生物活性に対して、凍結融解（freeze-thawing）または温度によって誘発される変性よりも破壊的であると考えられている。損傷の程度は、異なる生体分子および異なる条件で大幅に変化し、様々な研究者が異なったシステムを研究してきた。水溶液の凍結は、不安定な化合物に凍結そのものよりも損傷を与える可能性のある溶質濃度の初期上昇を作り出す。糖、タンパク質、ポリマー、緩衝液、および界面活性剤等の賦形剤は、生体分子の活性を安定化するために添加可能であるが、その効果の程度は限られており、システムに依存して異なる。Croweらは、乾燥したリン脂質二重層およびタンパク質の糖による安定化を記載しており（Biochem. J. 242:1-10 (1987)）、また、「The trehalose myth revisited: Introduction to a symposium on stabilization of cells in the dry state」 Cryobiology 43,89-105 (2001)の中で、細胞のトレハロース安定化の機構の最近の理解を概説している。現在の考えは、生存可能で有用な凍結乾燥されたタンパク質を保持するためには、２つの別個の異なった必要条件があるというものである。その必要条件とは、１）タンパク質は、凍結過程の間に保護されなければならない、２）タンパク質は、後続の乾燥および復元の間に保護されなければならない。これらは、必ずしもある１つの賦形剤または条件セットによって満たされる必要は無い、異なった必要条件である。
【０００７】
様々な研究者が、様々な生体分子を保護するために様々な賦形剤を使用することについて報告してきた。例えば、Glogerらは（Intl. J. Pharm. 260:59-68 (2003)）、タンパク質を安定化するために低分子量のデキストランを使用した、アビスクミン（aviscumine）の溶解保護（lyoprotection）を記載しており、緩衝系およびポリソルベート８０のみが凍結過程においてタンパク質を保護することに適しているが、乾燥過程においてタンパク質を保護するためにはデキストランが必要であることを示した。Goodnoughらは（Appl. Env. Biol. 58(10):3426-28 (1992)）、安定化剤として血清アルブミンを使用し、また様々な他の賦形剤を使用した、凍結乾燥過程におけるボツリヌス毒素A型の安定化を研究し、どの賦形剤も有益な効果を持たなかったが、凍結乾燥混合液から塩化ナトリウムを除くことによって、またｐＨを制御することによって、活性毒素の回収率が劇的に改善されたことを報告した。Costantinoらは（J. Pharm. Sci. 87 (11):1412-20 (1998)）、凍結乾燥された組み換えヒト成長ホルモンの安定性および構造に対する様々なサッカライドの効果を記載しており、試験された全ての賦形剤がタンパク質の安定性を劇的に改善したことを示した。Ramosらは（Appl. Envir. Microbiol. 63 (10):4020-25 (1997)）、２−Ｏ−β−マンノシルグリセレート（2-O-β-mannosylglycerate）は、様々な起源から単離されたいくつかのデヒドロゲナーゼ酵素の熱ストレスからの保護において効果的であることを示し、また、２−Ｏ−β−マンノシルグリセレートによって与えられる保護は、研究された全ての酵素に対してトレハロースに類似しているかあるいはトレハロースより優れていたが、パイロコッカスフリオサス（P. furiosis）から単離されたグルタミン酸デヒドロゲナーゼの保護においては効果的ではなかったことを示した。Brusらは（J. Control. Rel. 95:119-31 (2004)）、フリーズドライによるオリゴヌクレオチド−ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）複合体の安定化を研究し、これらの複合体はスクロースまたはトレハロース等の糖の添加から利益を得ることは無かったが、プラスミド−ＰＥＩ複合体はそのような糖の添加から利益を得たことを報告した。これらの研究者は、様々な生体分子に対して様々な方法によって測定された、異なった程度の成功を報告している。これらの研究者でＢＭＰの保護について報告した者はいない。
【０００８】
したがって、何が生体分子の溶解保護を提供できる賦形剤の最適な組み合わせであるのかについては、相反する証拠が存在する。全ての生体分子に対して最適となるような如何なる賦形剤の組み合わせも存在しないが、研究中の生体分子に対する望みどおりの結果を得るためには、かなり著しい程度の実験が必要である。凍結乾燥、保管、および使用の過程でＢＭＰを保護するための、薬学的に許容できる賦形剤の組み合わせに対する需要が残っている。
【０００９】
〔発明の概要〕
本発明は、概して、様々な調合物および組成物におけるＢＭＰの安定化と、それによる少なくとも６０％の生物活性の保持、ならびに、例えば温度および湿度などの保存条件における要件の改善に関する。本発明は、ＢＭＰを含む凍結乾燥された組成物のための、およびそれに続くそれらの保管と復元のための賦形剤としてトレハロースを主として含む調合物を含み、緩衝剤および界面活性剤を含む他の賦形剤をさらに含む。
【００１０】
本発明者らは、驚くべきことに、凍結乾燥中およびその後においてＢＭＰの生物活性を保持する上でトレハロースが十分であり、かつ他の賦形剤よりも優れていることを発見した。多くの他の生体分子の安定化においては、得られる保護の量に関して糖の間でほとんど差異は無いが、ＢＭＰに対しては大きな差異がある。この発見は、追加の賦形剤に対する副作用の可能性が無い、患者の様々な筋骨格の欠陥を治療するための組成物を提供する。本発明者らはまた、驚くべきことに、アスコルビン酸およびグルタチオン等の抗酸化物質の添加は、トレハロースと共に凍結乾燥されたＢＭＰの安定性を増加させず、むしろトレハロースによって提供された安定性を減じることも発見した。
【００１１】
本発明の目的は、凍結乾燥されたＢＭＰを安定化するのに十分な量のトレハロースを使用して、ＢＭＰが再水和時に生物活性の少なくとも６０％を保持し、再水和した液体生成物を外科医が容易に扱うことができるようにすることである。
【００１２】
本発明の別の目的は、凍結乾燥されたＢＭＰを安定化するのに十分な量のトレハロース、少なくとも１種のＢＭＰ、および追加の賦形剤を使用して、ＢＭＰが再水和時に生物活性の少なくとも６０％を保持し、再水和した液体生成物を外科医が容易に扱うことができるようにすることであり、追加の賦形剤は、緩衝剤、界面活性剤、およびそれらの混合物からなる群より選択される。
【００１３】
本発明の別の目的は、凍結乾燥されたＢＭＰを安定化するのに十分な量のトレハロース、少なくとも１種のＢＭＰ、および細分化されたコラーゲン繊維（morselized collagen fibers）を使用して、安定で再水和時に生物活性の少なくとも６０％を保持するＢＭＰを含む、凍結乾燥された生体適合性の流動性材料を調製する方法および組成物を提供し、再水和した生成物を外科医が容易に扱うことができるようにすることである。
【００１４】
本発明の別の目的は、凍結乾燥されたＢＭＰを安定化するのに十分な量のトレハロース、少なくとも１種のＢＭＰ、および生体適合性基質を使用して、安定で再水和時に生物活性の少なくとも６０％を保持するＢＭＰを含む、凍結乾燥された生体適合性基質を調製するための方法および組成物を提供し、再水和した生成物を外科医が容易に扱うことができるようにすることである。例となる生体適合性基質には、コラーゲン、ミネラル化コラーゲン（mineralized collagen）、リン酸カルシウム塩、カルシウム含有セラミックス、自原性（autogenic）、同種異系および異種発生性を含む様々な源（sources）からの骨、ならびに、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ＰＬＡ−ＰＧＡコポリマー、ポリカーボネート、ポリカプロラクトン、およびそれらの混合物を含むポリマーが含まれる。
【００１５】
本発明の別の目的は、凍結乾燥されたＢＭＰを安定化するのに十分な量のトレハロース、少なくとも１種のＢＭＰ、生体適合性基質および追加の賦形剤を使用して、安定で再水和時に生物活性の少なくとも６０％を保持するＢＭＰを含む、凍結乾燥された生体適合性基質を調製するための方法および組成物を提供し、再水和した展性の生成物を外科医が容易に扱うことができるようにすることであり、追加の賦形剤は、緩衝剤、界面活性剤、およびそれらの混合物からなる群より選択される。
【００１６】
本発明の別の目的は、トレハロース、低分子量デキストラン、シクロデキストリン、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールエステル、およびそれらの混合物からなる群より選択される１つまたはそれ以上の溶解保護剤を、凍結乾燥されたＢＭＰを安定化するのに十分な量使用し、且つ、少なくとも１種のＢＭＰを使用して凍結乾燥されたＢＭＰを調製する方法および組成物を提供し、ＢＭＰが再水和時に生物活性の少なくとも６０％を保持し、再水和した生成物産物を外科医が容易に扱うことができるようにすることである。
【００１７】
本発明の別の目的は、トレハロース、低分子量デキストラン、シクロデキストリン、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールエステル、およびそれらの混合物からなる群より選択される１つまたはそれ以上の溶解保護剤、少なくとも１種のＢＭＰ、ならびにコラーゲンを使用して、安定で再水和時に生物活性の少なくとも６０％を保持するＢＭＰを含む、凍結乾燥された生体適合性コラーゲン基質を調製する方法および組成物を提供し、再水和した展性の生成物を外科医が容易に扱うことができるようにすることである。
【００１８】
本発明の別の目的は、トレハロース、低分子量デキストラン、シクロデキストリン、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールエステル、およびそれらの混合物からなる群より選択される１つまたはそれ以上の溶解保護剤、少なくとも１種のＢＭＰ、ならびに細分化されたコラーゲン繊維を使用して、安定で再水和時に生物活性の少なくとも６０％を保持するＢＭＰを含む、凍結乾燥された生体適合性の流動性物質を調製する方法および組成物を提供し、再水和した生成物を外科医が容易に扱うことができるようにすることである。
【００１９】
本発明のさらに別の目的は、少なくとも一つの溶解保護剤と少なくとも一つのＢＭＰとの凍結乾燥混合物を含む組成物を使用して、患者を治療することである。このような組成物は、復元された（reconstituted）ＢＭＰ溶液を、例えば骨折、骨の裂け目（bone gap）、骨空隙、椎間板、軟骨欠損、腱、靭帯、および類似物等の患者の解剖学的構造の領域に直接適用することによって、または復元されたＢＭＰ溶液を、例えば人工股関節、人工膝関節、人工肩関節、人工椎間板および類似物等の骨に接触する人工インプラント、腱アンカー、靭帯アンカー、縫合糸、ステープルおよび類似物、ならびに骨置換ケージ、自己由来骨細片、同種異系骨細片、異種骨細片、脱ミネラル化骨細片および類似物などの、患者に植え込まれる装置に適用することによって、様々な筋骨格の欠陥を治療する際に治癒過程を改善させるために有用である。
【００２０】
水溶液または乾燥固体の原体形態（bulk forms）のＢＭＰは不安定であり、タンパク質の生物活性を保持するためには−２０℃より低い温度での冷蔵が必要である。ＢＭＰは、凝集、ジスルフィド結合の転位、脱アミドおよび酸化の影響を受けやすいため、凍結乾燥されたＢＭＰの生物活性を保存および保護するための調合物に対する需要が存在する。
【００２１】
改善された安定性および保存性を有する凍結乾燥ＢＭＰ製品に対する需要が存在する。
【００２２】
水溶液を用いて復元し、椎間板、非関節軟骨および関節軟骨等の軟組織へ注入してそのような組織の再生を促進するために使用される、凍結乾燥ＢＭＰ製品に対する需要が存在する。
【００２３】
外科医が使用するために植え込み可能な生体適合性骨格に適正なＢＭＰ濃度で供給され、供給されることによって、浪費および望まれない手術部位への導入を含む、汚染、不適切な投与量、ならびにこぼれを含む、取り扱いに関連するリスクの多くを最小化するか、または排除する凍結乾燥ＢＭＰ製品に対する需要が存在する。
【００２４】
手術部位に容易に適用されることができる生体適合性の流動性物質に復元されることができる、凍結乾燥ＢＭＰ製品に対する需要が存在する。
【００２５】
〔発明の詳細な説明〕
ＢＭＰが発見されて以来、様々な筋骨格の欠陥や症状の処置における治療的使用に適した組成物を見出すための多数の研究活動があった。現在では、凍結乾燥固体として販売されるＢＭＰを含む製品が存在し、その製品は、使用時に液体状態に復元されて外科医によって植え込まれるべき骨格または外科的治療部位に対して適用されなければならない。現在のｒｈＢＭＰ−２の調合物は、スクロースＮＦ、グリシンＵＳＰ、Ｌ−グルタミン酸ＦＣＣ、塩化ナトリウムＵＳＰ、およびポリソルベート８０ＮＦを賦形剤として使用しており、室温（１５〜２５℃）で保存してよい。現在のＯＰ−１の調合物は、ウシコラーゲンのみを使用し、２〜８℃で保存しなければならない。復元されたＢＭＰの安定性に対する賦形剤の有効性を記載した報文は存在しない。
【００２６】
他の者は、マンニトール、スクロースおよびそれらの混合物を使用することによって、ＰＬＧＡ等のポリマー基質中にＢＭＰを埋め込むことによって、メチオニン等の抗酸化剤を添加することによって、ヒスチジン、アルギニン、シクロデキストリンおよびウシ血清アルブミン等の他の賦形剤を添加することによって、ならびにＴＷＥＥＮ８０等の界面活性剤を添加することによって、またはそれらの組み合わせによって、凍結乾燥過程におけるＢＭＰの安定性を増進しようと試みてきた。これらの試みは、様々な程度の限定的な成功を収めてきた。
【００２７】
米国特許番号第５，３１８，８９８号および第５，５１６，６５４号は、培養液中に硫酸デキストランを使用することによるＢＭＰ産生の改良プロセスを開示しているが、その利点がどのようにして達成されたかの機構を議論しておらず、また、タンパク質を安定化するための他の有用な賦形剤も開示していない。米国特許番号第５，３８５，８８７号において、Yimらは、ＢＭＰを送り込むための凍結乾燥された組成物および調合物を開示しており、その組成物はＢＭＰ、糖、グリシンおよびグルタミン酸を含む。Yimらは、Ｗ−２０アルカリフォスファターゼ分析で証明されるように、凍結乾燥された調合物が生物活性を保っていることを開示しているが、彼らは、他の調合物に対してどれか一つの調合物についてでも量的な利点を示すような調合物に関する比較データを開示していない。これらの発明者は、ＢＭＰの溶解保護に関するトレハロースのスクロースに対する優位性を議論も認識もしていない。
【００２８】
本発明は、凍結乾燥、保存、および、患者を治療するための水溶液を用いた復元に有用で、安定なＢＭＰの調合物を調製および使用する方法および組成物を提供する。本発明は、説明に役立つ実施形態について以下に記載されており、ＢＭＰの例としてｒｈＧＤＦ−５を使用する。本発明が多くの異なった適用および実施形態で実施されてよいこと、ならびに本発明がその適用において本明細書に示される特定の実施例に特に限定されないことを当業者は理解するであろう。以下に続く実施例は、本発明の様々な実施形態および利点のいくつかを説明するが、当業者は、本発明の範囲および意図を逸脱することなく、他の類似の実施形態をとることができることを理解するであろう。
【００２９】
本発明は、１つの態様において、後に続く骨および軟骨の欠陥の外科的治療における使用のために、安定な凍結乾燥されたＢＭＰを調製するための方法および組成物を提供する。本明細書において熟慮されているように、そのような組成物は、少なくとも一種のＢＭＰ、および、ＢＭＰを安定化するのに十分な量のトレハロースを含む。そのような組成物は、復元されたタンパク質溶液を、例えば骨折、骨の裂け目、骨空隙、椎間板、癒合のために外科的に準備された椎間板隙、軟骨欠損、腱、靭帯および類似物等の患者の解剖学的構造の領域に直接に適用するか、あるいは、人工股関節、人工膝関節、人工肩関節、人工椎間板、腱アンカー、靭帯アンカー、縫合糸、ステープル、骨ケージ、自己由来骨細片、同種異系骨細片、異種骨細片、脱ミネラル化骨細片および類似物等の、骨または軟骨に接触して患者に植え込まれるべき物質に対して、直接適用することによって、様々な筋骨格の欠陥の治療に有用である。
【００３０】
本明細書中で使用されているように、用語「モルフォゲン（morphogen）」「骨モルフォゲン（bone morphogen）」、「骨形成タンパク質（bone morphogenic protein）」、「骨形態形成タンパク質（bone morphogenetic protein）」、「ＢＭＰ」、「骨原性タンパク質（osteogenic protein）」、「骨原性因子（osteogenic factor）」、「成長分化因子（Growth & Differentiation Factor）」、および「ＧＤＦ」は、ｒｈＧＤＦ−５によって代表されるクラスのタンパク質を包含する。しかし、通常の当業者は理解するであろうことであるが、ｒｈＧＤＦ−５は単に、ＢＭＰとして機能することのできる真の組織モルフォゲンのＴＧＦ−βファミリーサブクラスの代表であり、説明を限定する意図は無い。用語「凍結防止剤（cryoprotectant）」は、凍結の過程で生体分子を安定化することのできる分子を指し示すために使用され、現在の文脈においては、フリーズドライ（凍結乾燥）の過程で生体分子を安定化することのできる分子を指し示す用語「溶解保護剤（lyoprotectant）」と等価である。本明細書中で使用されているように、用語「細分化された（morselized）」は以下の操作によって得られた生成物を、また用語「細分化（morselization）」は以下の操作の過程を指し示しており、操作とは、切断、せん断、分断、粉砕、微粉砕、あるいはそうでない場合、個々の粒子または繊維の全体のサイズが減じられるように、ある量の生体適合性基質、例えばコラーゲン、のサイズを減じることである。本明細書中で使用されているように、用語「賦形剤」は、少なくとも一つのＢＭＰに添加される少なくとも一つの追加的な化合物を指し示し、追加的な化合物は、アミノ酸、タンパク質、緩衝剤、界面活性剤およびそれらの混合物からなる群より選択される。
【００３１】
ｒｈＧＤＦ−５は、ｐＨ４．５〜ｐＨ１０．５の範囲の中性のｐＨでは溶解性が低いことが知られている。このｐＨ範囲においてｒｈＧＤＦ−５製品を調合して製造することは難しいであろう。ゆえに本発明者らは、タンパク質調合物の開発に好適なｐＨ範囲を選択するために重要な、ｐＨ３およびｐＨ４の緩衝液中でのｒｈＧＤＦ−５の溶解度を評価するための研究を設計した。研究の結果は実施例１１に記載されている。ｒｈＧＤＦ−５の溶解度は、緩衝液のｐＨにのみ依存するのではなく、緩衝溶液のイオン強度にも依存する。ｐＨ４において、およそ１０ｍｇ／ｍＬのｒｈＧＤＦ−５溶液は、５および１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液中で白濁していた一方で、５０および１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液中では、ｒｈＧＤＦ−５は大きな粒子を形成し、最終的には沈殿した。別の研究では（データは示されていない）、ｒｈＧＤＦ−５がｐＨ３．５およびｐＨ４の５ｍＭリン酸緩衝液に３．５ｍｇ／ｍＬで調合され、この場合にも、溶液は白濁していた。
【００３２】
通常、タンパク質物質の溶解度は、過飽和／沈殿した溶液の遠心分離または濾過の後にタンパク質濃度を測定することによって決定される。しかし、いくつかの白濁したタンパク質溶液は、遠心分離または濾過するのが困難である。不溶の粒子を除去するために白濁した溶液を遠心分離または濾過（０．２２μｍ）にかけた後でさえ、非常に多くの場合、粒子が非常に微細であることから濾液は依然として白濁しているため成功せず、時にはタンパク質がフィルター表面に固着し、したがって濾液はほとんどのタンパク質を失う。ゆえに、ｒｈＧＤＦ−５が、３．５ｍｇ／ｍＬまたは１０ｍｇ／ｍＬでｐＨ３．５またはｐＨ４の緩衝液中に調合された場合、透明な溶液を得ることは困難であろう。
【００３３】
ｒｈＧＤＦ−５が、１０ｍｇ／ｍＬで５ｍＭ、１０ｍＭ、および２５ｍＭのｐＨ３．０のリン酸ナトリウム溶液中に調合された場合、タンパク質溶液は透明であったが、ｒｈＧＤＦ−５が、１０ｍｇ／ｍＬで５０ｍＭおよび１００ｍＭのリン酸ナトリウム等のより高いイオン強度の溶液中に調合された場合、ｒｈＧＤＦ−５溶液は白濁していた。したがって、好ましい実施形態においては、ｒｈＧＤＦ−５は、およそｐＨ３．０の低イオン強度の緩衝液中に調合されるべきである。
【００３４】
本発明による一つの実施形態においては、組成物は、少なくとも一つのＢＭＰと、ＢＭＰを安定化するのに十分な量のトレハロースとの混合水溶液を凍結乾燥することによって調製することができ、生体適合性基質を含む生成物について、トレハロースのＢＭＰに対する乾燥重量比率は、１ｍｇのＢＭＰにつき約１ｍｇ〜約５００ｍｇのトレハロースの範囲であり、さらに好ましくは、１ｍｇのＢＭＰにつき約５ｍｇ〜約２００ｍｇのトレハロースの範囲である。トレハロースの添加は、凍結乾燥された調合物のタンパク質の溶解度および安定性を改善する。凍結乾燥は、当業者に一般的に周知の慣例にしたがって行われる。
【００３５】
別の実施形態においては、本発明による組成物は、少なくとも一つのＢＭＰ、ＢＭＰを安定化するのに十分な量のトレハロース、および、緩衝剤の混合水溶液を凍結乾燥することによって調製することができる。緩衝剤の添加は、凍結乾燥された調合物のタンパク質の溶解度および安定性を改善する。当業者に周知の生体適合性緩衝剤は、グリシン、酢酸のナトリウム塩、カリウム塩またはカルシウム塩、クエン酸のナトリウム塩、カリウム塩またはカルシウム塩、乳酸のナトリウム塩、カリウム塩またはカルシウム塩、一塩基リン酸（mono-basic phosphate）、二塩基リン酸（di-basic phosphate）、三塩基リン酸（tri-basic phosphate）、およびそれらの混合物を含むリン酸のナトリウム塩またはカリウム塩を含む。緩衝剤は、充填剤（bulking agent）として機能するために、組成物に対して添加されたグリシンを付加的に有することができる。グリシンは、１ｍｇのＢＭＰにつき約０．０４ｍｇ〜約２００ｍｇのグリシンの割合で、さらに好ましくは、０．０４ｍｇのＢＭＰにつき約１ｍｇ〜約８０ｍｇのグリシンの割合で添加される。緩衝剤および充填剤の添加は、ｐＨが約２．０〜約５．０のｐＨ単位の間に制御されている場合に、さらに好ましくは、約２．５〜約４．５のｐＨ単位の間に制御されている場合に、トレハロースのみを有する組成物よりもわずかに優れたタンパク質の安定性を提供する。
【００３６】
また別の実施形態において、本発明による組成物および方法は、少なくとも一つのＢＭＰと、ＢＭＰを安定化するのに十分な量のトレハロースと、緩衝剤と、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０およびそれらの混合物からなる群より選択される界面活性剤との混合水溶液を凍結乾燥することによって調製することができる。界面活性剤は、１ｍｇのＢＭＰにつき約０．００１ｍｇ〜約０．２ｍｇの濃度で添加される。界面活性剤の添加は、溶解度および凍結乾燥の特性を変化させることによって、タンパク質に付加的な安定性を提供する。凍結乾燥は、当業者に一般的に周知の慣例にしたがって行われる。
【００３７】
本発明の別の実施形態において、安定な凍結乾燥されたＢＭＰを調製するための組成物および方法は、少なくとも一つのＢＭＰ、少なくとも一つのＢＭＰを安定化するのに十分な量の溶解保護剤であるトレハロース、および少なくとも一つの付加的な賦形剤によって構成され、付加的な賦形剤は、緩衝剤および界面活性剤からなる群より選択される。そのような緩衝剤および界面活性剤の添加は、トレハロースを単一の賦形剤として有する組成物よりも、凍結乾燥されたＢＭＰの安定性に増加する改善を提供する。
【００３８】
別の実施形態において、本発明による組成物および方法は、少なくとも一つのＢＭＰと少なくとも一つの賦形剤との溶液を凍結乾燥されたコラーゲンの上に堆積させることによって調製でき、その後にＢＭＰ／コラーゲン混合物の凍結乾燥ができる。コラーゲンは、オプションとして、ヒーロス（Healos）（登録商標）として知られ、米国特許番号第５，９７２，３８５号、第５，８６６，１６５号、第５，７７６，１９３号、第５，４５５，２３１号、および第５，２３１，１６９号に記載されている物質によって提供されるように、架橋またはミネラル化されるか、あるいは架橋およびミネラル化されることができる。本実施形態において提供される組成物は、整形外科の分野における病状の治療に特に有用であり、骨、軟骨、または腱を生成させるために外科医が容易に手術部位に設置することのできる、柔軟な、展性の素材を提供する。ＢＭＰ／コラーゲン混合物は、滅菌水、生理食塩水および骨髄穿刺液を含む水溶液を用いて復元することができ、骨折、骨の裂け目、骨空隙、脊椎固定術のために外科的に準備された椎間板隙等の患者の欠陥部位に直接適用されることができる。さらに、ＢＭＰ／コラーゲン混合物は、骨細片と、脊椎固定術の過程で椎間板隙に挿入されるインプラントとの間の空間に充填するため、裂けるかまたは損傷した腱、裂けるかまたは損傷した靭帯、関節軟骨の軟骨欠損および関節軟骨の肋軟骨下欠損等の損傷または欠失した軟骨のある領域に充填するために使用することができる。
【００３９】
別の実施形態において、本発明による組成物および方法は、少なくとも一つのＢＭＰと少なくとも一つの賦形剤との凍結乾燥された混合物を調製することによって、凍結乾燥されたＢＭＰ混合物を水、生理食塩水または骨髄穿刺液を用いて復元することによって、そして、復元されたＢＭＰ溶液を凍結乾燥コラーゲンの上に乗せてからＢＭＰ／コラーゲン混合物の外科的植え込みを行うことによって、利用することができる。コラーゲンは、オプションとして、ヒーロス（登録商標）として知られている物質によって提供されるように、架橋またはミネラル化されるか、あるいは架橋およびミネラル化されることができる。本実施形態において提供される組成物および方法は、整形外科の分野における病状の治療に特に有用であり、骨、軟骨または腱を生成させるために外科医が容易に手術部位に設置することのできる、柔軟な、展性の素材を提供する。ＢＭＰ／コラーゲン混合物は、骨折、骨の裂け目、骨空隙、脊椎固定術のために外科的に準備された椎間板隙等の患者の欠陥部位に直接適用することができ、骨細片と脊椎固定術の過程で椎間板隙に挿入されるインプラントとの間の空間を満たすために、また、裂けるかまたは損傷した腱、裂けるかまたは損傷した靭帯、関節軟骨の軟骨欠損、および関節軟骨の肋軟骨下欠損等の損傷または欠失した軟骨のある領域を満たすために使用することができる。本実施形態において提供される組成物および方法はまた、ＢＭＰをコラーゲン物質から分離した成分および容器として有することによって、保存および調製を簡略化するために特に有用である。
【００４０】
別の実施形態において、本発明による組成物および方法は、少なくとも一つのＢＭＰと少なくとも一つの賦形剤との溶液を、凍結乾燥され、細分化されたコラーゲン上に堆積させることによって調製でき、その後、ＢＭＰ／細分化されたコラーゲン混合物の凍結乾燥ができる。細分化されたコラーゲンは、任意に、架橋またはミネラル化されるか、あるいは架橋およびミネラル化されていることができる。このような細分化によって、直径約２５ミクロン、長さ約１１０ミクロンの小さいコラーゲン繊維が提供され、手術部位に注入するのに好適な流動性の組成物をもたらす。このような組成物の復元は、滅菌水、生理食塩水または骨髄穿刺液等の水溶液とコラーゲンゲルとの混合物を使用して行うことができ、コラーゲンゲルが復元された生成物の粘度を制御する。コラーゲンゲルは、約０．１％〜約３０％（質量／質量）のコラーゲンを、さらに好ましくは約０．３％〜約３．０％（質量／質量）のコラーゲンを含み、コラーゲンゲルの粘度は、好ましくは約１０ｃＰ〜約４００ｃＰ、さらに好ましくは約７０ｃＰ〜約１００ｃＰである。コラーゲンゲルのｐＨは、好ましくは約４．０ｐＨ単位〜約８．０ｐＨ単位である。このような組成物は、骨折、骨の裂け目、骨空隙、および脊椎固定術のために外科的に準備された椎間板隙を含むがそれらに限定されない様々な筋骨格の症状を治療するために有用であり、骨細片と脊椎固定術の過程で椎間板隙に挿入されるインプラントとの間の空間を満たすために、また、裂けるかまたは損傷した腱、裂けるかまたは損傷した靭帯、関節軟骨の軟骨欠損および関節軟骨の肋軟骨下欠損等のような損傷または欠失した軟骨のある領域を満たすために有用である。
【００４１】
別の実施形態において、本発明による組成物および方法は、少なくとも一つのＢＭＰと少なくとも一つの賦形剤との凍結乾燥混合物を調製することによって、凍結乾燥されたＢＭＰ混合物を水または生理食塩水を用いて復元することによって、そして、復元されたＢＭＰ溶液を椎間板に注入することによって、利用することができる。本実施形態において提供される組成物および方法は、椎間板を治療する際に特に有用である。
【００４２】
〔発明の実施例〕
以下の実施例において、使用される実験方法は以下の通りである。
ＲＰ−ＨＰＬＣ純度研究のために、復元されたｒｈＧＤＦ−５試験試料を、１０ｍＭ塩酸（ＨＣｌ）を用いて０．１ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈し、Vydac２１８ＴＰ５２カラム上で５０℃、０．３ｍＬ／分の流速で逆相ＨＰＬＣにかけた。ｒｈＧＤＦ−５は、２１４ｎｍでのＵＶ検出を用いて、０．１５％トリフルオロ酢酸中でアセトニトリル勾配を用いて溶出された。
【００４３】
円偏光二色性（ＣＤ）研究のために、ＡＶＩＶモデル６０ＤＳ円偏光二色性分光偏光計上で円偏光二色性分光分析を行った。対応する賦形剤の走査を用いたベースライン擬似測定（baseline placebo runs）を、試料の走査から減算した。走査は平均残基重量（Mean Residue Weight）（１１５の値）を用いて正規化し、以下の等式に代入した。
＝［０．１×Ｍ残基］／［濃度（ｍｇ／ｍＬ）×光路長］
【００４４】
の値は、平均残基楕円率（mean residue ellipticities）を与えるために各々の波長で計算した。最後に、プログラムPROSECｖ.2.1（１９８７年にＡＶＩＶアソシエイツ（AVIV Associates）により著作権取得）を使用して、二次構造見積りが決定された。
【００４５】
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を、マイクロカル（MicroCal）ＶＰ−ＤＳＣ機器上で行った。走査速度は６０℃／時間であった。温度範囲は５〜１００℃であった。機器ベースライン走査（擬似データ）を、試験試料熱走査から減算した。タンパク質濃度は０．３３ｍｇ／ｍＬであった。
【００４６】
結晶化度判定（Crystallinity Assessment）のために偏光顕微鏡法（ＰＬＭ）が使用された。相対湿度が１％の乾燥エアバッグ中で、微量の固体試料をバイアルから取り出した。固体試料はガラススライド上に広げられ、固体試料上に一滴のシリカオイルが滴下された。次に、ソニー製ＣＣＤ−ＩＲＩＳ／ＲＧＢカラービデオカメラおよび偏光付属品が備えられたゼイス光学顕微鏡（Zeiss Optical Microscope）を用いて、スライドを検査した。画像を取り込むためにフラッシュバス（Flash Bus）ＦＢＧソフトウェアが使用された。
【００４７】
ｒｈＧＤＦ−５原体（bulk rhGDF-5）は、１０ｍＭ塩酸中に３．８ｍｇ／ｍＬの濃度で、−８０℃の凍結形態でバイオファーム社（Biopharm）から入手した。凍結タンパク質原体は、調合物に使用する前に、２〜８℃で一晩かけて解凍した。
【００４８】
実施例１：ヒーロス（登録商標）細片（非滅菌）とｒｈＧＤＦ−５（０．５ｍｇ／ｍＬ、５ｍＬ／細片）およびトレハロース５０ｍｇ／ｍＬ。各々の細片は、２．５ｍｇのｒｈＧＤＦ−５と２５０ｍｇのトレハロースを有した。
【００４９】
トレハロース溶液の調製：
２５．４８ｇのトレハロース二水和物が注意深く秤量され、滅菌ポリプロピレン瓶に移され、それに室温で３５０ｍＬの純水が加えられ、透明な溶液が得られるまでゆっくりと撹拌された。透明な溶液に対して、ｐＨを３．９に調整するために０．１規定の塩酸が一滴ずつ加えられ、次に、４００ｍＬの最終液量を得るために純水を用いて液量が調整された。ｐＨが測定され、４．２であることが見出された。溶液は０．２２ミクロンのフィルターを通して濾過され、タンパク質溶液を希釈するために直接使用された。
【００５０】
ｒｈＧＤＦ−５溶液のトレハロース溶液を用いた希釈：
２２．３９ｍＬのｒｈＧＤＦ−５溶液が注意深くポリプロピレンフラスコに移され、そこに液量を１５０ｍＬに調整するために注意深くトレハロース溶液が加えられた。ｐＨが測定され、２．５であることが見出された。溶液は室温で１５分間撹拌された。タンパク質濃度を正確に計算するために、ＵＶ吸光係数を得た。ＵＶの示度に基づいて、さらにトレハロース溶液を加えて、１７０ｍＬの溶液中に０．５ｍｇ／ｍＬの望ましい濃度を得た。ｐＨが測定され、２．７であることが見出された。ＵＶの示度は０．４９９ｍｇ／ｍＬのタンパク質含有量を示した。
【００５１】
ｒｈＧＤＦ−５／トレハロース溶液は、０．２２ミクロンのフィルターを通して濾過され、ヒーロス（登録商標）細片上に分注するために直接使用された。滅菌ピペットを使用して、各々の細片についてｒｈＧＤＦ−５／トレハロース溶液の合計が５ｍＬになるように、細片上の２点に２．５ｍＬのｒｈＧＤＦ−５／トレハロース溶液が同様に分注された。細片は小さな２ｃｍ×５ｃｍのＰＥＴＧトレイに挿入され、小さなトレイは大きなＰＥＴＧトレイに挿入され、凍結乾燥された。各々の大きなトレイは２４の細片を収容する。
【００５２】
表１ａ：表１ａ：２５℃における、細片あたりトレハロース（２５０ｍｇ）およびｒｈＧＤＦ−５（２．５ｍｇ）を用いたヒーロス（登録商標）の安定性（実施例１）
【表１】
【００５３】
表１ｂ：２〜８℃における、細片あたりトレハロース（２５０ｍｇ）およびｒｈＧＤＦ−５（２．５ｍｇ）を用いたヒーロス（登録商標）の安定性（実施例１）
【表２】
【００５４】
実施例２：ヒーロス（登録商標）細片（非滅菌）とｒｈＧＤＦ−５（０．５ｍｇ／ｍＬ、５ｍＬ／細片）およびマンニトール５０ｍｇ／ｍＬ。各々の細片は、２．５ｍｇのｒｈＧＤＦ−５と２５０ｍｇのマンニトールを有した。
【００５５】
マンニトール溶液の調製：
２３．０３ｇのマンニトールが注意深く秤量され、滅菌ポリプロピレン瓶に移され、それに室温で３５０ｍＬの純水が加えられ、透明な溶液が得られるまでゆっくりと撹拌された。ｐＨが測定され、７．２であることが見出された。ｐＨを３．８に調整するために０．１規定の塩酸が一滴ずつ加えられ、次に、４００ｍＬの最終液量を得るために純水を用いて液量が調整された。ｐＨが測定され、３．９であることが見出された。溶液は０．２２ミクロンのフィルターを通して濾過され、タンパク質溶液を希釈するために直接使用された。
【００５６】
ｒｈＧＤＦ−５溶液のマンニトール溶液を用いた希釈：
２２．３７ｍＬのｒｈＧＤＦ−５溶液が注意深くポリプロピレンフラスコに移され、そこに液量を１５０ｍＬに調整するために注意深くマンニトール溶液が加えられた。ｐＨが測定され、２．７であることが見出された。溶液は室温で１５分間撹拌された。正確なタンパク質濃度を計算するために、ＵＶ吸光係数が取得された。ＵＶの示度に基づいて、１７０ｍＬの溶液中に０．５ｍｇ／ｍＬの望ましい濃度を得るためにさらにマンニトール溶液が加えられた。ｐＨが測定され、２．８であることが見出された。ＵＶの示度は０．４９３ｍｇ／ｍＬのタンパク質含有量を示した。
【００５７】
ｒｈＧＤＦ−５／マンニトール溶液は、０．２２ミクロンのフィルターを通して濾過され、ヒーロス（登録商標）細片上に分注するために直接使用された。滅菌ピペットを使用して、各々の細片につきｒｈＧＤＦ−５／マンニトール溶液の合計が５ｍＬになるように、２．５ｍＬのｒｈＧＤＦ−５／マンニトール溶液が細片上の２点に同様に分注された。細片は小さな２ｃｍ×５ｃｍのＰＥＴＧトレイに挿入され、小さなトレイは大きなＰＥＴＧトレイに挿入され、凍結乾燥された。各々の大きなトレイは２４の細片を収容する。
【００５８】
表２ａ：２５℃における、細片あたりマンニトール（２５０ｍｇ）およびｒｈＧＤＦ−５（２．５ｍｇ）を用いたヒーロス（登録商標）の安定性（実施例２）
【表３】
【００５９】
表２ｂ：２〜８℃における、細片あたりマンニトール（２５０ｍｇ）およびｒｈＧＤＦ−５（２．５ｍｇ）を用いたヒーロス（登録商標）の安定性（実施例２）
【表４】
【００６０】
実施例３：ヒーロス（登録商標）細片（滅菌）とｒｈＧＤＦ−５（０．５ｍｇ／ｍＬ、５ｍＬ／細片）およびトレハロース１００ｍｇ／ｍＬ。各々の細片は、２．５ｍｇのｒｈＧＤＦ−５と５００ｍｇのトレハロースを有した。
【００６１】
トレハロース溶液の調製：
２５．４９ｇのトレハロース二水和物が注意深く秤量され、滅菌ポリプロピレン瓶に移され、そこに室温で１９０ｍＬの純水が加えられ、透明な溶液が得られるまでゆっくりと撹拌された。透明なトレハロース溶液のｐＨが測定され、６．２であることが見出された。ｐＨを調整するためにトレハロース溶液に塩酸は加えられなかった。２００ｍＬの最終液量を得るために、純水を用いて液量が調整された。ｐＨが測定され、６．３であることが見出された。溶液は、タンパク質溶液を希釈するために直接使用された。
【００６２】
ｒｈＧＤＦ−５溶液のトレハロース溶液を用いた希釈：
２３．０３ｍＬのｒｈＧＤＦ−５溶液が注意深くポリプロピレンフラスコに移され、そこに液量を１７０ｍＬに調整するために注意深くトレハロース溶液が加えられた。ｐＨが測定され、３．０であることが見出された。溶液は室温で１５分間撹拌された。タンパク質濃度を正確に計算するために、ＵＶ吸光係数が取得された。ＵＶの示度に基づいて、さらにトレハロース溶液が加えられ、１７５ｍＬの溶液中に０．５ｍｇ／ｍＬの望ましい濃度を得られた。ｐＨが測定され、３．０であることが見出された。ＵＶの示度は０．５１８ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を示した。
【００６３】
ｒｈＧＤＦ−５／トレハロース溶液は、０．２２ミクロンのフィルターを通して濾過され、滅菌ヒーロス（登録商標）細片上に分注するために直接使用された。滅菌ピペットを使用して、各々の細片について、ｒｈＧＤＦ−５／トレハロース溶液の合計が５ｍＬになるように、細片上の２点に２．５ｍＬのｒｈＧＤＦ−５／トレハロース溶液が同様に分注された。細片はスチールトレイに置かれ、トレイは注意深く滅菌二重パウチに封入され、滅菌条件下での凍結乾燥のために移された。
【００６４】
表３ａ：２〜８℃における、細片あたりトレハロース（５００ｍｇ）／ｒｈＧＤＦ−５（２．５ｍｇ）を用いたヒーロス（登録商標）の安定性（実施例３）
【表５】
【００６５】
実施例４：ヒーロス（登録商標）細片（滅菌）と低用量ｒｈＧＤＦ−５（５ｍＬ／細片、０．５ｍｇ／ｍＬ）、トレハロース４０ｍｇ／ｍＬ、およびグリシン１０ｍｇ／ｍＬ。各々の細片は、２．５ｍｇのｒｈＧＤＦ−５、２００ｍｇのトレハロースおよび５０ｍｇのグリシンを有した。
【００６６】
トレハロース／グリシン溶液の調製：
１７．８４ｇのトレハロース二水和物および４．０３ｇのグリシンが注意深く秤量され、滅菌ポリプロピレン瓶に移され、それに室温で３００ｍＬの純水が加えられ、透明な溶液が得られるまでゆっくりと撹拌された。ｐＨが測定され、５．５であることが見出された。どのような酸も加えること無く、液量は純水を用いて３５０ｍＬに調整された。ｐＨが測定され、５．５であることが見出された。
【００６７】
ｒｈＧＤＦ−５溶液のトレハロース／グリシン溶液を用いた希釈：
３９．４７ｍＬのｒｈＧＤＦ−５溶液が注意深くポリプロピレンフラスコに移され、それに液量を２９５ｍＬに調整するために注意深くトレハロース／グリシン溶液が加えられた。ｐＨが測定され、４．１であることが見出された。溶液は室温で１５分間撹拌された。タンパク質濃度を正確に計算するために、ＵＶ吸光係数が取得された。ＵＶの示度に基づいてトレハロース溶液が加えられ、３００ｍＬの溶液中に０．５ｍｇ／ｍＬの望ましい濃度を得た。ｐＨが測定され、４．１であることが見出された。ＵＶの示度は０．５０７ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を示した。
【００６８】
溶液は０．２２ミクロンのフィルターを通して濾過され、滅菌ヒーロス（登録商標）細片上に分注するために直接使用された。滅菌ピペットを使用して、各々の細片についてｒｈＧＤＦ−５溶液の合計が５ｍＬになるように、細片上の２点に２．５ｍＬのｒｈＧＤＦ−５／トレハロース／グリシン溶液が同様に分注された。細片はスチールトレイに置かれ、トレイは注意深く滅菌二重パウチに封入され、滅菌条件下での凍結乾燥のために移された。
【００６９】
表４ａ：２〜８℃における、細片あたりトレハロース（２００ｍｇ）／ｒｈＧＤＦ−５（２．５ｍｇ）／グリシン（５０ｍｇ）を用いたヒーロス（登録商標）の安定性（実施例４）
【表６】
【００７０】
表４ｂ：２５℃における、細片あたりトレハロース（２００ｍｇ）／ｒｈＧＤＦ−５（２．５ｍｇ）／グリシン（５０ｍｇ）を用いたヒーロス（登録商標）の安定性（実施例４）
【表７】
【００７１】
実施例５：ヒーロス（登録商標）細片（滅菌）とｒｈＧＤＦ−５（０．５ｍｇ／ｍＬ、２．５ｍｇ／細片）、トレハロース４０ｍｇ／ｍＬ、グリシン１０ｍｇ／ｍＬ、およびポリソルベート０．１ｍｇ／ｍＬ。各々の細片は、２．５ｍｇのｒｈＧＤＦ−５、２００ｍｇのトレハロース、５０ｍｇのグリシン、および０．５ｍｇのポリソルベート８０を有した。
【００７２】
ポリソルベート８０溶液の調製：
２３．０３ｍｇのポリソルベート８０が５０ｍＬの滅菌使い捨てチューブの中に秤量され、それに２５ｍＬの純水が加えられ、均一な溶液を得るために２分間振り混ぜられた。
【００７３】
トレハロース／グリシン／ポリソルベート溶液の調製：
１０．１９ｇのトレハロース二水和物、および２．３０３ｇのグリシンが注意深く秤量され、滅菌ポリプロピレン瓶に移され、それに２５ｍＬの上記のポリソルベート８０溶液が加えられた。ポリソルベートのチューブは、２５ｍＬの純水で２回ゆすがれ、ゆすぎ液はトレハロース／グリシン／ポリソルベート溶液に移された。合計液量を１９０ｍＬにするために追加量の純水がトレハロース／グリシン／ポリソルベート溶液に加えられた。溶液は透明な溶液を得るために２分間撹拌された。溶液のｐＨが測定され、５．６であることが見出された。液量は純水を用いて２００ｍＬに調整された。ｐＨが測定され、５．５であることが見出された。
【００７４】
ｒｈＧＤＦ−５溶液のトレハロース／グリシン／ポリソルベート溶液を用いた希釈：
２３．０３ｍＬのｒｈＧＤＦ−５溶液が注意深くポリプロピレンフラスコに移され、それに液量を１７０ｍＬに調整するために注意深くトレハロース／グリシン／ポリソルベート溶液が加えられた。ｐＨが測定され、４．１であることが見出された。溶液は室温で１５分間撹拌された。タンパク質濃度を正確に計算するために、ＵＶ吸光係数が取得された。ＵＶの示度に基づいてさらにトレハロース／グリシン／ポリソルベート溶液が加えられ、１７５ｍＬの溶液中に０．５ｍｇ／ｍＬの望ましい濃度を得た。ｐＨが測定され、４．１であることが見出された。ＵＶの示度は０．５１０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を示した。
【００７５】
溶液は０．２２ミクロンのフィルターを通して濾過され、層流フード（laminar flow hood）中の無菌条件下で滅菌ヒーロス（登録商標）細片上に分注するために直接使用された。滅菌ピペットを使用して、各々の細片についてｒｈＧＤＦ−５／トレハロース／グリシン／ポリソルベート溶液の合計が５ｍＬになるように、細片上の２点に２．５ｍＬのｒｈＧＤＦ−５／トレハロース／グリシン／ポリソルベート溶液が同様に分注された。細片はスチールトレイに置かれ、トレイは注意深く滅菌二重パウチに封入され、滅菌条件下での凍結乾燥のために移された。
【００７６】
表５ａ：２〜８℃における、細片あたりトレハロース（２００ｍｇ）／ｒｈＧＤＦ−５（２．５ｍｇ）／グリシン（５０ｍｇ）／ポリソルベート８０（０．５ｍｇ）を用いたヒーロス（登録商標）の安定性（実施例４）
【表８】
【００７７】
実施例６：ｒｈＧＤＦ−５（０．５ｍｇ／ｍＬ）にトレハロース（５０ｍｇ／ｍＬ）を加えた凍結乾燥されたバイアル生成物
トレハロース溶液の調製：
滅菌ポリプロピレン瓶に１２．１６ｇのトレハロース二水和物および磁気撹拌子が入れられ、それに室温で１９０ｍＬの純水が加えられた。溶液は、トレハロースが完全に溶解されるまで室温で撹拌された。ｐＨが測定され、６．５であることが見出された。透明なトレハロース溶液に対して、ｐＨを５．８に調整するために０．１規定の塩酸が一滴ずつ加えられた。液量は純水で２００ｍＬに調整され、ｐＨが測定され、５．５であることが見出された。溶液は０．２２ミクロンのフィルターを通して濾過され、タンパク質溶液を希釈するために直接使用された。
【００７８】
ｒｈＧＤＦ−５溶液のトレハロース溶液を用いた希釈：
１４．４７ｍＬのｒｈＧＤＦ−５溶液が注意深くポリプロピレンフラスコに移され、そこに最終液量を１００ｍＬにするために、瓶を旋回しながらトレハロース溶液がゆっくりと加えられた。溶液は、室温で１５分間、時折旋回された。ｐＨが測定され、３．０であることが見出された。ＵＶの示度に基づいてさらにトレハロース溶液が加えられ、１１０ｍＬの溶液中に０．５ｍｇ／ｍＬの望ましい濃度を得た。ｐＨが測定され、３．１であることが見出された。ＵＶの示度は０．５１０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を示した。溶液は０．２２ミクロンのフィルターを通して濾過され、バイアルに分注するために直接使用された。
【００７９】
バイアルへの充填：１．１ｍＬのｒｈＧＤＦ−５／トレハロース溶液が、５ｍＬのタイプ１フリントガラスバイアルに手動で分注され、凍結乾燥機への装填に先立って各々のバイアルはストッパーで部分的に閉じられた。凍結乾燥後、ストッパーは押し込まれ、圧着された。生成物は白色から灰白色のケーク（cake）として得られた。
【００８０】
表６ａ：２〜８℃における、ｒｈＧＤＦ−５（０．５ｍｇ／ｍＬ）にトレハロース（５０ｍｇ／ｍＬ）を加えたバイアルの安定性（実施例６）
【表９】
【００８１】
表６ｂ：２５℃における、ｒｈＧＤＦ−５（０．５ｍｇ／ｍＬ）にトレハロース（５０ｍｇ／ｍＬ）を加えたバイアルの安定性（実施例６）
【表１０】
【００８２】
実施例７：ｒｈＧＤＦ−５（０．５ｍｇ／ｍＬ）にマンニトール（５０ｍｇ／ｍＬ）を加えた凍結乾燥されたバイアル生成物
マンニトール溶液の調製：
滅菌ポリプロピレン瓶に１１．５２ｇのマンニトールおよび磁気撹拌子が入れられ、それに室温で１８５ｍＬの純水が加えられた。混合液は、マンニトールが完全に溶解されるまで室温で１０分間撹拌された。ｐＨが測定され、６．６であることが見出された。透明な溶液に対して、ｐＨを５．５に調整するために０．１規定の塩酸が一滴ずつ加えられた。液量は純水で２００ｍＬに調整され、ｐＨが測定され、５．７であることが見出された。溶液は０．２２ミクロンのフィルターを通して濾過され、タンパク質溶液を希釈するために直接使用された。
【００８３】
ｒｈＧＤＦ−５溶液のマンニトール溶液を用いた希釈：
ポリプロピレンフラスコに１４．４８ｍＬのｒｈＧＤＦ−５溶液が注意深く移され、そこに液量が１００ｍＬになるまでマンニトール溶液が注意深く加えられた。溶液は室温で１５分間撹拌された。タンパク質濃度を正確に計算するために、ＵＶ吸光係数が取得された。ＵＶの示度に基づいてさらにマンニトール溶液が加えられ、１１０ｍＬの溶液中に０．５ｍｇ／ｍＬの望ましいタンパク質濃度を得た。ｐＨが測定され、３．１であることが見出された。ＵＶの示度は０．４９８ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を示した。溶液は０．２２ミクロンのフィルターを通して濾過され、バイアルに分注するために直接使用された。
【００８４】
バイアルへの充填：１．１ｍＬのマンニトール／ｒｈＧＤＦ−５溶液が、５ｍＬのタイプ１フリントガラスバイアルに手動で分注され、凍結乾燥機への装填に先立って各々のバイアルはストッパーで部分的に閉じられた。凍結乾燥後、ストッパーは押し込まれ、圧着された。生成物は白色から灰白色のケークとして得られた。
【００８５】
表７ａ：２〜８℃における、ｒｈＧＤＦ−５（０．５ｍｇ／ｍＬ）にマンニトール（５０ｍｇ／ｍＬ）を加えたバイアルの安定性（実施例７）
【表１１】
【００８６】
表７ｂ：２５℃における、ｒｈＧＤＦ−５（０．５ｍｇ／ｍＬ）にマンニトール（５０ｍｇ／ｍＬ）を加えたバイアルの安定性（実施例７）
【表１２】
【００８７】
実施例８：グリシン−塩酸ｐＨ３．０緩衝液中でｒｈＧＤＦ−５（０．５ｍｇ／ｍＬ）にトレハロース（５０ｍｇ／ｍＬ）を加えた凍結乾燥されたバイアル生成物
トレハロース溶液の調製：
滅菌ポリプロピレン瓶に１２．１６ｇのトレハロース二水和物および磁気撹拌子が入れられ、それに室温で２００ｍＬの５ｍＭグリシン−塩酸緩衝液ｐＨ３．０が加えられた。溶液は、トレハロースが完全に溶解されるまで室温で撹拌された。トレハロース／グリシン溶液のｐＨは、３．１であった。溶液は０．２２ミクロンのフィルターを通して濾過され、タンパク質溶液を希釈するために直接使用された。
【００８８】
ｒｈＧＤＦ−５溶液のトレハロース溶液を用いた希釈：
ｒｈＧＤＦ−５原体の溶液が、分子量３０００のカットオフの膜を用いて、２〜８℃で一晩、５ｍＭグリシン−塩酸緩衝液に対して透析された。透析後、溶液は３．８ｍｇ／ｍＬにわずかに濃縮された。１４．４７ｍＬのｒｈＧＤＦ−５溶液が注意深くポリプロピレンフラスコに移され、そこに最終液量を１００ｍＬにするために、瓶を旋回しながらトレハロース−グリシン溶液がゆっくりと加えられた。溶液は、室温で１５分間、時折旋回された。ｐＨが測定され、３．０であることが見出された。ＵＶの示度に基づいてさらにトレハロース−グリシン溶液が加えられ、１１０ｍＬの溶液中に０．５ｍｇ／ｍＬの望ましいタンパク質濃度を得た。ｐＨが測定され、３．０であることが見出された。ＵＶの示度は０．５０７ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を示した。溶液は０．２２ミクロンのフィルターを通して濾過され、バイアルに分注するために直接使用された。
【００８９】
バイアルへの充填：１．１ｍＬのｒｈＧＤＦ−５／トレハロース溶液が、５ｍＬのタイプ１フリントガラスバイアルに手動で分注され、凍結乾燥機への装填に先立って各々のバイアルはストッパーで部分的に閉じられた。凍結乾燥後、ストッパーは押し込まれ、圧着された。生成物は白色から灰白色のケークとして得られた。
【００９０】
表８：グリシン−塩酸緩衝液ｐＨ３．０中でｒｈＧＤＦ−５（０．５ｍｇ／ｍＬ）にトレハロース（５０ｍｇ／ｍＬ）を加えたバイアルの安定性（実施例８）
【表１３】
【００９１】
実施例９：ｐＨ３．０のリン酸緩衝液中でｒｈＧＤＦ−５（０．５ｍｇ／ｍＬ）にトレハロース（５０ｍｇ／ｍＬ）を加えた凍結乾燥されたバイアル生成物
トレハロース溶液の調製：
滅菌ポリプロピレン瓶に１２．１６ｇのトレハロース二水和物および磁気撹拌子が入れられ、それに室温で２００ｍＬの５ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ３．０が加えられた。溶液は、トレハロースが完全に溶解されるまで室温で撹拌された。トレハロース／リン酸緩衝溶液のｐＨは、３．０であった。溶液は０．２２ミクロンのフィルターを通して濾過され、タンパク質溶液を希釈するために直接使用された。
【００９２】
ｒｈＧＤＦ−５溶液のトレハロース溶液を用いた希釈：
ｒｈＧＤＦ−５原体の溶液が、分子量３０００のカットオフの膜を用いて、２〜８℃で一晩、リン酸緩衝液に対して透析された。透析後、溶液は３．８ｍｇ／ｍＬにわずかに濃縮された。１４．４７ｍＬのｒｈＧＤＦ−５溶液が注意深くポリプロピレンフラスコに移され、そこに最終液量を１００ｍＬにするために、瓶を旋回しながらトレハロース／リン酸緩衝溶液がゆっくりと加えられた。溶液は、室温で１５分間、時折旋回された。ｐＨが測定され、３．０であることが見出された。ＵＶの示度に基づいてトレハロース／リン酸緩衝溶液が加えられ、１１０ｍＬの溶液中に０．５ｍｇ／ｍＬの望ましいタンパク質濃度を得た。ｐＨが測定され、３．０であることが見出された。ＵＶの示度は０．５０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を示した。溶液は０．２２ミクロンのフィルターを通して濾過され、バイアルに分注するために直接使用された。
【００９３】
バイアルへの充填：１．１ｍＬのｒｈＧＤＦ−５／トレハロース溶液が、５ｍＬのタイプ１フリントガラスバイアルに手動で分注され、凍結乾燥機への装填に先立って各々のバイアルはストッパーで部分的に閉じられた。凍結乾燥後、ストッパーは押し込まれ、圧着された。生成物は白色から灰白色のケークとして得られた。
【００９４】
表９：ｐＨ３．０のリン酸緩衝液中でｒｈＧＤＦ−５（０．５ｍｇ／ｍＬ）にトレハロース（５０ｍｇ／ｍＬ）を加えたバイアルの安定性（実施例９）
【表１４】
【００９５】
実施例１０：細分化されたコラーゲン円柱と２．５ｍｇのｒｈＧＤＦ−５および２５０ｍｇのトレハロース
トレハロース溶液の調製：
９．５６ｇのトレハロース二水和物が注意深く秤量され、滅菌ポリプロピレン瓶に移され、そこに室温で１４５ｍＬの純水が加えられ、透明な溶液が得られるまでゆっくりと撹拌された。透明なトレハロース溶液のｐＨが測定され、５．３であることが見出された。１５０ｍＬの最終液量をえるために、純水を用いて液量が調整された。溶液のｐＨが測定され、５．３であることが見出された。溶液は、タンパク質溶液を希釈するために直接使用された。
【００９６】
ｒｈＧＤＦ−５溶液のトレハロース溶液を用いた希釈：
１６．４５ｍＬのｒｈＧＤＦ−５溶液が注意深くポリプロピレンフラスコに移され、それに、液量を１２０ｍＬに調整するために、トレハロース溶液が注意深く加えられた。ｐＨが測定され、２．９であることが見出された。溶液は、室温で１５分間撹拌された。タンパク質濃度を正確に計算するために、ＵＶ吸光係数が取得された。ＵＶの示度に基づいて、さらにトレハロース溶液が加えられ、１２５ｍＬの溶液中に０．５ｍｇ／ｍＬの望ましいタンパク質濃度を得た。ｐＨが測定され、２．９であることが見出された。ＵＶの示度は０．４９８ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を示した。
【００９７】
ｒｈＧＤＦ−５／トレハロース溶液の細分化されたコラーゲン円柱への投与
溶液は０．２２ミクロンのフィルターを通して濾過され、溶液は、テフロン型中に詰められた、事前に形成された細分化されたコラーゲン円柱上に分注するために直接使用された。各々の円柱には、凍結乾燥に先立って５ｍＬのｒｈＧＤＦ−５／トレハロース溶液が投与された。
【００９８】
表１０：２〜８℃における、円柱あたりｒｈＧＤＦ−５（２．５ｍｇ）およびトレハロース（２５０ｍｇ）を用いた細分化されたコラーゲン円柱の安定性（実施例１０）
【表１５】
【００９９】
下記の表１１中のデータは、２〜８℃の試料のＲＰ−ＨＰＬＣ試験には遅い溶出ピークが存在するが、−２０℃の試料には存在しないことにより実証されているように、賦形剤を含まずにヒーロス（登録商標）上に分注され凍結乾燥されたｒｈＧＤＦ−５は、−２０℃では安定だが、２〜８℃では安定でないことを示す。
【０１００】
表１１：２〜８℃および−２０℃における、賦形剤を含まない５ｍＬのｒｈＧＤＦ−５（０．５ｍｇ／ｍＬ）を用いたヒーロス（登録商標）細片の安定性
【表１６】
【０１０１】
賦形剤および可溶性コラーゲンゲルを用いて流動性の細分化されたコラーゲン／ｒｈＧＤＦ−５を作成する異なった実施例が開発され、各々の実施例の性能、安定性および製造の容易さに関して評価された。
【０１０２】
細分化されたコラーゲン実施例１：
−細分化されたコラーゲン円柱とｒｈＧＤＦ−５が乾燥形態に凍結乾燥される
−湿潤形態のコラーゲンゲルは分離しておかれる
−双方は２〜８℃で別々の注入器中に分離しておかれる
−双方は注入に先立って混合される
【０１０３】
細分化されたコラーゲン実施例２：
−細分化されたコラーゲン円柱とｒｈＧＤＦ−５とコラーゲンゲルとが湿潤形態で混合される（凍結乾燥されない）
−全てが２〜８℃で一本の注入器中に湿潤形態でおかれ、使用可能な状態
【０１０４】
細分化されたコラーゲン実施例３：
−細分化されたコラーゲン円柱とｒｈＧＤＦ−５とコラーゲンゲルとが乾燥形態で凍結乾燥される
−全てが２〜８℃で一本の注入器中に乾燥形態で入れられる
−注入に先立って水で再水和する
【０１０５】
細分化されたコラーゲン実施例４：
−細分化されたコラーゲン円柱とコラーゲンゲルは共にペースト状
−ｒｈＧＤＦ−５は乾燥形態で分離しておかれる
−双方は２〜８℃で別々の注入器中に分離しておかれる
−双方は注入に先立って混合される
【０１０６】
細分化されたコラーゲン実施例５：
−細分化されたコラーゲン円柱とコラーゲンゲルは共に乾燥形態
−ｒｈＧＤＦ−５は乾燥形態で分離しておかれる
−双方は２〜８℃で別々の注入器中に分離しておかれる
−ｒｈＧＤＦ−５を滅菌水または骨髄穿刺液を用いて復元する
−注入に先立って、乾燥した細分化されたコラーゲンおよびコラーゲンは、復元されたｒｈＧＤＦ−５溶液と混合される
【０１０７】
緩衝剤および抗酸化剤の存在および非存在下で、マンニトール、スクロースおよびトレハロース等のいくつかの賦形剤を用いて、ｒｈＧＤＦ−５の安定性が、ＲＰ−ＨＰＬＣ、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）、円偏光二色性分光分析（ＣＤ）、偏光顕微鏡法（ＰＬＭ）、および生物学的検定の技術を使用して評価された。スクロースを含有する幾つかの凍結乾燥されたｒｈＧＤＦ−５の調合物は、保存の過程で望ましくない黄色およびガラス状ケーク構造を発生させたため、有望ではなかった。
【０１０８】
凍結乾燥されたｒｈＧＤＦ−５の調合物の融解挙動が、ＤＳＣを使用して研究された。ＤＳＣデータは、トレハロースおよびマンニトールに基づく調合物のどちらも、ｒｈＧＤＦ−５原体の熱安定性を大幅に改善することを示した。
【０１０９】
図１、図２および図３は、ｒｈＧＤＦ−５のトレハロース調合物およびマンニトール調合物のＤＳＣプロファイルの比較を、ｒｈＧＤＦ−５原体のＤＳＣプロファイルと比較して示す。ｒｈＧＤＦ−５原体は、２つの主要な転移を示し、一つは４０℃近傍であり、もう一つは８５℃近傍である。高温の転移はおそらくタンパク質の熱変性を表わしている。最初の吸熱転移の融解温度（Ｔｍ）が賦形剤の存在下で７〜１４℃増加していることは、興味深いことである。この点のみで考えた場合、この研究は、トレハロースおよびマンニトールの双方とも安定化剤として同様に効果的である可能性があることを示唆する。
【０１１０】
トレハロース／ｒｈＧＤＦ−５調合物のＰＬＭ（偏光顕微鏡法）は、図４に示されている。試料は主立った複屈折現象を示さない。したがって、系は非晶質であり、これは治療的応用に理想的である。図５は、保存期間の後のマンニトール／ｒｈＧＤＦ−５調合物のＰＬＭを示す。試料中には多くの結晶が観察され、保存の過程でマンニトールが結晶化したことを示している。この結果は、トレハロースがｒｈＧＤＦ−５に対するより良い溶解保護剤であることを示唆する。遠紫外ＣＤスペクトルは、トレハロースに基づく調合物が、天然タンパク質原体の二次構造分布に相当する二次構造分布を有することを明らかにした。
【０１１１】
様々な賦形剤と共に凍結乾燥されたｒｈＧＤＦ−５のＰＲ−ＨＰＬＣによるリアルタイムの安定性研究は、トレハロース存在下のｒｈＧＤＦ−５が、５０ｍｇ／ｍＬまたは１００ｍｇ／ｍＬの何れの濃度でも、緩衝剤が有っても無くても、また、ポリソルベートが有っても無くても、２〜８℃および１５〜２５℃の保存条件で一貫してｒｈＧＤＦ−５に改善された安定性を与えたことを明瞭に示した一方で、マンニトールは類似の保存条件下で同等のレベルの安定性を提供することができなかった。
【０１１２】
凍結乾燥されたケーク調合物のリアルタイム安定性研究は、室温および２〜８℃の保存条件で、主ピークが大幅に減少する一方で凝集ピークが増加することによって証明されるように、マンニトールはタンパク質を安定化しないことを明瞭に示した。凝集物は、免疫反応および副作用を引き起こす可能性があるため、タンパク質調合物の中で最も望ましくない種である。対照的に、トレハロースは、リアルタイム安定性研究に証明されるように、特に２〜８℃の保存条件で、凝集物の形成を阻害して主ピークを保護することによって、タンパク質を非常に良く安定化した。したがって、トレハロースは、調合物中でｒｈＧＤＦ−５を安定化することにおいてマンニトールよりも優れている。また、リアルタイム安定性データは、ｐＨを制御するための緩衝剤としてリン酸またはグリシンを有するｒｈＧＤＦ−５／トレハロース調合物が、緩衝剤を含まないｒｈＧＤＦ−５／トレハロース調合物よりもさらに優れていることを示す。リアルタイム安定性データは、ｒｈＧＤＦ−５／トレハロース／グリシン調合物の理想的な保存は２〜８℃であり、また、２５℃での保存も適切であることを示す。
【０１１３】
トレハロースに基づくｒｈＧＤＦ−５調合物の好ましい生化学的および生物物理的データに加えて、これらの調合物はまた、アルカリフォスファターゼの生物学的分析においても有効性を示した。分析の物理的化学的方法、生体外分析、およびリアルタイム安定性データは、様々な筋骨格疾病の治療における使用に対して、コラーゲンに基づいた組み合わせ生成物と同様に、凍結乾燥された単体生成物（stand-alone product）においてもｒｈＧＤＦ−５の安定化におけるトレハロースの優れた賦形剤としての見込みを示す。
【０１１４】
実施例１１：異なったイオン強度の溶液および２つのｐＨ緩衝液（ｐＨ３およびｐＨ４）中のｒｈＧＤＦ−５の溶解度
この研究においては、様々なイオン強度のリン酸ナトリウム緩衝溶液が使用された。タンパク質原体の溶液は、およそ１０ｍｇ／ｍＬに濃縮され、ｐＨ３またはｐＨ４の、５、１０、２５、５０および１００ｍＭのリン酸緩衝液を用いて透析された。透析後、試料は透明性を点検され、ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計上でタンパク質濃度が分析された。詳細な手順は下記に記載されている。
【０１１５】
緩衝液の調製
ｐＨ３の１００ｍＭリン酸緩衝液：
１３．５ｍＬの濃縮Ｈ３ＰＯ４（１４．８Ｍ）溶液が２０００ｍＬビーカーに移され、それに、１９００ｍＬの目盛りまで脱イオン水が加えられた。溶液は、ＮａＯＨ溶液でｐＨ３に滴定され、２０００ｍＬのメスシリンダーに移された。２０００ｍＬにするために追加の水が加えられた。内容物はビーカーに再び移され、十分に混合された。
【０１１６】
ｐＨ３の５０ｍＭリン酸緩衝液：
６．７６ｍＬの濃縮Ｈ３ＰＯ４（１４．８Ｍ）溶液が２０００ｍＬビーカーに移され、それに、１９００ｍＬの目盛りまで脱イオン水が加えられた。溶液は、ＮａＯＨ溶液でｐＨ３に滴定され、２０００ｍＬのメスシリンダーに移された。２０００ｍＬにするために追加の水が加えられた。内容物はビーカーに再び移され、十分に混合された。
【０１１７】
ｐＨ３の２５ｍＭリン酸緩衝液：
３．３９ｍＬの濃縮Ｈ３ＰＯ４（１４．８Ｍ）溶液が２０００ｍＬビーカーに移され、続いて１９００ｍＬの目盛りまで脱イオン水が加えられた。溶液はＮａＯＨ溶液でｐＨ３に滴定され、２０００ｍＬのメスシリンダーに移された。２０００ｍＬにするために追加の水が加えられた。内容物はビーカーに再び移され、十分に混合された。
【０１１８】
ｐＨ３の１０ｍＭリン酸緩衝液：
１．３５ｍＬの濃縮Ｈ３ＰＯ４（１４．８Ｍ）溶液が２０００ｍＬビーカーに移され、それに、１９００ｍＬの目盛りまで脱イオン水が加えられた。溶液はＮａＯＨ溶液でｐＨ３に滴定され、２０００ｍＬのメスシリンダーに移された。２０００ｍＬにするために追加の水が加えられた。内容物はビーカーに再び移され、十分に混合された。
【０１１９】
ｐＨ３の５ｍＭリン酸緩衝液：
０．６７６ｍＬの濃縮Ｈ３ＰＯ４（１４．８Ｍ）が２０００ｍＬビーカーに移され、続いて１９００ｍＬの目盛りまで脱イオン水が加えられた。溶液はＮａＯＨ溶液でｐＨ３に滴定され、２０００ｍＬのメスシリンダーに移された。２０００ｍＬにするために追加の水が加えられた。内容物はビーカーに再び移され、十分に混合された。
【０１２０】
試料調製
タンパク質原体ｒｈＧＤＦ−５（ロット番号２１４２１３１）が２〜８℃で解凍された。タンパク質原体溶液（３．８ｍｇ／ｍＬで２４ｍＬ）が、遠心濾過装置（ポールライフサイエンス社（Pall Life Science）、カタログ番号ＯＤ０１０Ｃ３７、分画分子量１０Ｋ（10K MWCO））を使用して、およそ６ｍＬの液量まで濃縮された。およそ０．９ｍＬの濃縮されたｒｈＧＤＦ−５溶液は、各々の透析カセット（ピアス社（Pierce）、カタログ番号６６３８０）に移され、室温で一晩、リン酸緩衝液に対して透析された。濃縮されたｒｈＧＤＦ−５溶液は、注意深く透析カセットから取り除かれ、溶液の透明性を点検するために小さなガラスバイアルに入れられた。ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計上で、分析手法の項に記載されているように、タンパク質濃度が決定された。
【０１２１】
ｐＨ４における溶解度
ｐＨ４．０の緩衝液は、ＮａＯＨ溶液をｐＨ３の緩衝液にさらに加えることによって、ｐＨ３の緩衝液から調製された。タンパク質溶液は、室温で一晩、ｐＨ４の緩衝液に対して透析された。試料は溶液の透明度およびタンパク質濃度を分析された。
【０１２２】
分析手法
小さなガラスバイアル中の溶液試料は、透明度および粒子に関して点検された。試料バイアルは黒色背景に対して垂直の光を使用して検査された。試験試料の透明度は、対照として純水試料と比較された。各々の溶液試料のｐＨは、較正されたｐＨメーターを使用して直接測定された。
【０１２３】
結果
１０ｍｇ／ｍＬのｒｈＧＤＦ−５溶液の溶解度研究の結果は、５、１０および２５ｍＭのリン酸ナトリウムのより低いイオン強度の緩衝液は、透明な溶液をもたらして良い溶解度を示す一方で、５０および１００ｍＭのリン酸ナトリウムのより高いイオン強度の緩衝液は、白濁した溶液をもたらして低い溶解度を示すことを表した。ｐＨ４では、５および１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液は白濁した溶液をもたらし、低い溶解度を示した。２５、５０および１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液は、遠心後に透明な溶液をもたらしたが、タンパク質の回収量はほとんどゼロであり、タンパク質が沈殿したことを示した。したがって、ｐＨ３近傍の低イオン強度の緩衝液は、より高いｐＨのより高いイオン強度の緩衝液よりも好ましい。
【０１２４】
実施例１２：５％トレハロースを含む様々な緩衝液中の様々な温度でのｒｈＧＤＦ−５の安定性
この研究では、凍結乾燥および５℃での保存の過程の５％トレハロース溶液中の０．７ｍｇ／ｍＬのｒｈＧＤＦ−５の保護に対する様々な緩衝液の影響に関して試験された。試験された緩衝液は、５ｍＭグリシン−塩酸ｐＨ３、５ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ３、５ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ３、１０ｍＭ乳酸ナトリウムｐＨ３、０．０１％ＴＦＡ水溶液、１ｍＭ塩酸、および、トレハロースを含まない１ｍＭ塩酸中のｒｈＧＤＦ−５の対照溶液である。緩衝液は以下のように調製された。
【０１２５】
５ｍＭグリシン緩衝液、ｐＨ３
２０００ｍＬビーカーに０．７５ｇのグリシン（分子量７５．０５）および１９００ｍＬの脱イオン水が入れられ、溶液は撹拌しながら塩酸溶液でｐＨ３に滴定された。２０００ｍＬにするために追加の水が加えられ、十分に混合された。
【０１２６】
５ｍＭクエン酸緩衝液、ｐＨ３
２０００ｍＬビーカーに２．１１ｇのクエン酸一水和物（分子量２１０．１４）および１９００ｍＬの脱イオン水が入れられ、溶液は水酸化ナトリウム（ＮａＣｌ）溶液でｐＨ３に滴定された。２０００ｍＬにするために追加の水が加えられ、溶液は混合された。
【０１２７】
５ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ３
０．６７６ｍＬのリン酸溶液（１４．８Ｍ）が１９００ｍＬの脱イオン水を含む２０００ｍＬビーカーに移され、溶液は水酸化ナトリウム溶液でｐＨ３に滴定された。２０００ｍＬにするために追加の水が加えられ、溶液は十分に混合された。
【０１２８】
１０ｍＭ乳酸緩衝液、ｐＨ３
２０００ｍＬサイズのビーカーに１．８１ｇの乳酸（分子量９０．０８）および１９００ｍＬの脱イオン水が入れられ、得られた溶液は水酸化ナトリウム溶液でｐＨ３に滴定された。２０００ｍＬにするために追加の水が加えられ、溶液は十分に混合された。
【０１２９】
１ｍＭ塩酸溶液
１ｍＬの２規定塩酸溶液が１９００ｍＬの脱イオン水を含む２０００ｍＬビーカーに移された。溶液の最終液量は、さらに脱イオン水を加えることによって２０００ｍＬの目盛りに調整された。
【０１３０】
０．０１％ＴＦＡ溶液
０．２ｍＬのＴＦＡ溶液が１９００ｍＬの脱イオン水を含む２０００ｍＬビーカーに移された。溶液の最終液量は、追加の水を加えることによって２０００ｍＬに調整され、溶液は十分に混合された。
【０１３１】
調合物の調製
タンパク質原体ｒｈＧＤＦ−５（ロット番号２１４２１３１）が２〜８℃で解凍された。タンパク質原体溶液（３．８ｍｇ／ｍＬで５５ｍＬ）が、遠心濾過装置（ポールライフサイエンス社、カタログ番号ＯＤ０１０Ｃ３７、分画分子量１０Ｋ）を使用して、およそ１０ｍＬの液量まで濃縮された。およそ１．４ｍＬの濃縮されたｒｈＧＤＦ−５溶液は、各々の透析カセット（ピアス社、カタログ番号６６３８０）に移され、カセットは２〜８℃で一晩、試験緩衝液に対して透析された。
【０１３２】
ｒｈＧＤＦ−５溶液は、注意深く透析カセットから取り除かれ、小さなガラス瓶に移された。ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計を使用して、溶液のタンパク質濃度が測定された。タンパク質は、およそ０．７ｍｇ／ｍＬの割合で試験緩衝液中に５％（質量／体積）トレハロースと共に調合され、０．２２μｍのフィルターを通して濾過された。溶液は、凍結乾燥に先立って、２〜８℃で保存された。
【０１３３】
充填および凍結乾燥
各々の調合溶液は、３ｍＬのガラスバイアル（ウエスト製薬サービス（West Pharmaceutical Services）、カタログ番号６８０００３１６）に、１ｍＬ／バイアルで充填された。バイアルはストッパー（ウエスト製薬サービス、カタログ番号９９１５０６３０）で部分的に閉じられ、凍結乾燥機（ＦＴＳシステム社、LyoStar II）に移された。凍結乾燥過程をモニターするために、熱電対が偽バイアル内に置かれた。対照として、トレハロースを含まない別の調合物もまた試験された。４．５ｍｇ／ｍＬのｒｈＧＤＦ−５を含む１ｍＭ塩酸溶液２００μＬが、各々のガラスバイアルに移され、凍結乾燥された。
【０１３４】
分析手法
凍結乾燥ケークの完全性
凍結乾燥された試料は、各々の時点で、凍結乾燥されたケークのひび割れ、収縮および崩壊について点検された。
【０１３５】
復元時間
１ｍＬの脱イオン水が、各々の凍結乾燥された試料に加えられ、穏やかに混合された。復元時間が記録された。
【０１３６】
溶液の透明性−外観
小さなガラスバイアル中の溶液試料は、透明性および粒子に関して点検された。試料バイアルは、黒色背景に対して垂直の光を使用して検査された。試験試料の透明度は、対照として純水試料と比較された。
【０１３７】
ｐＨ方法
各々の溶液試料のｐＨは、較正されたｐＨメーターを使用して直接測定された。
【０１３８】
ＵＶ分光法
タンパク質濃度は、ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計を使用して決定された。ｒｈＧＤＦ−５の濃度は、２８０ｎｍにおける１．１６ｍＬ／ｍｇ×ｃｍの吸光係数を使用して計算された。
【０１３９】
ＨＰＬＣ法
非還元ｒｐＨＰＬＣ法（商標 ００５１ Ｄ）が、タンパク質の修飾された種をモニターするために使用された。試験試料は、５０ｍＭ酢酸を用いておよそ０．１ｍｇ ｒｈＧＤＦ−５／ｍＬの溶液に希釈された。希釈された試料（各々が５０μＬ）は、ＨＰＬＣカラム（Vydac ２１８ＴＰ５２、Ｃ１８カラム）に注入された。試料は、０．１５％（体積／体積）ＴＦＡを含む水および０．１５％（体積／体積）ＴＦＡを含むアセトニトリルを移動相として、０．３ｍＬ／分で溶出された。溶出されたピークは２１４ｎｍで検出された。各々のピーク面積の割合を計算して、主ピークおよび微小ピーク（分解ピーク）の変化をモニターした。
【０１４０】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
タンパク質の凝集物が、ＳＥＣ法を使用してモニターされた。典型的には、各々の試験試料の３０μＬがＳＥＣカラム（ＴＯＳＯＨバイオサイエンス社（TOSOH Bioscience）、カタログ番号 ０８５４０）に直接注入され、０．１％（体積／体積）ＴＦＡおよび４５％（体積／体積）アセトニトリルを含む水を用いて０．５ｍＬ／分の速度で溶出された。タンパク質のピークは２８０ｎｍでモニターされ、凝集の割合が計算された。
【０１４１】
ゲル電気泳動
タンパク質の凝集物および分解された小片も、ゲル電気泳動法を使用してモニターされた。典型的には、およそ１０μｇのタンパク質が乾燥され、１０％β−メルカプトエタノールを含むか、または含まない７０μＬのＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液（インビトロジェン社（Invitrogen）、カタログ番号ＬＣ２６７６）を用いて復元された。試料は９５℃で５分間インキュベートされた。各々の試料のおよそ１８μＬがゲル（インビトロジェン社、カタログ番号ＮＰ０３４１Ｂｏｘ）に供給された。ゲルは、ランニング緩衝液（インビトロジェン社、カタログ番号ＮＰ０００２）を使用して、２００ボルトで約３５分間泳動された。ゲルは、次にSimplyblue溶液（インビトロジェン社、カタログ番号ＬＣ６０６０）を用いて染色され、脱イオン水を用いて脱色された。ゲルは、走査され、画像が収集された。
【０１４２】
生物活性分析
６ヶ月における安定性試料（グリシン調合物および塩酸調合物）だけが生物活性について分析された。細胞に基づいた分析（商標 ００４６）を使用し、試料の安定性を決定するためにアルカリフォスファターゼ活性を測定した。
【０１４３】
水分含有量
含水量分析が、カールフィッシャー滴定法を使用してＰＤＤによって行われた。
【０１４４】
結果
凍結乾燥されたケークの完全性
全ての保存条件の試験試料ケークは、時間ゼロから９ヶ月の時点まで、固体および白から灰白色の外観を呈した。トレハロースまたはスクロース等の糖が充填剤として使用される際に通常観察されるように、ケークの周囲にわずかな収縮が観察されるか、あるいは、ケークはバイアルのガラス壁からわずかに離れていた。全ての試験試料でケークの崩壊は無かった。通常、ケークの崩壊は、復元時間を変化させ、タンパク質の不安定性につながる可能性がある。トレハロースの存在しない調合物では、白色で、ふわふわした軽いケークが得られた。
【０１４５】
復元時間
試験時には、１ｍＬの水が各々の試料バイアルに加えられた。試料は穏やかに混合され、復元時間が記録された。ケークの溶解が完了するためには、およそ３０秒〜４０秒が必要とされた。
【０１４６】
溶液の透明性
復元された溶液試料は、黒色背景上で垂直の光の下で検査され、全ての試験試料は透明および無色であることが見出された。
【０１４７】
ｐＨ
復元された溶液のｐＨが、較正されたｐＨメーターを使用して測定された。研究の過程を通して、全ての調合物に渡って大幅なｐＨ値の変化は無かった。トレハロース／緩衝剤を含む調合物試料のｐＨは、３．０±０．２付近であった。トレハロースを含まない調合物のｐＨは約４．０であった。
【０１４８】
ＵＶ分光法
タンパク質濃度は、ＵＶ−ＶＩＳ分光光度計上で測定された。研究を通して、グリシン緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、乳酸緩衝液または０．０１％ＴＦＡを含むｒｈＧＤＦ−５／トレハロース調合物のタンパク質濃度に大幅な変化は無かった。２８０ｎｍでの吸光度は、２５℃／６０％および４０℃／７５％相対湿度で保存された場合、ｒｈＧＤＦ−５／トレハロース／塩酸調合物において増加した。タンパク質の濃度は、４０℃で保存された調合物で増加していたように見えた。時間ゼロでの０．７ｍｇ／ｍＬの初期タンパク質濃度は、６ヶ月の時点で１ｍｇ／ｍＬに増加した。これは、トレハロースが、２８０ｎｍで類似の吸光度を有するフルフラール化合物に分解した可能性を意味すると思われる。
【０１４９】
非還元ｒｈＨＰＬＣの結果
非還元ｒｈＨＰＬＣ法を使用して、メチオニンの酸化、脱アミド反応および他の反応によって形成されるｒｈＧＤＦ−５の分解種をモニターした。塩酸調合物およびトレハロースを含まない調合物を除いて、２〜８℃および２５℃で９ヶ月間保存された全ての調合物について、主ピークの割合に大幅な変化は無かった。両調合物は、９ヶ月の時点で、主ピークは９０％より少なかった。
【０１５０】
しかし、調合物が、４０℃／７５％相対湿度等の促進された保存条件で保存された場合、一つの調合物（すなわち、ｒｈＧＤＦ−５／トレハロース／グリシン）だけが、６ヶ月の時点で主ピークは９１％より多かった。促進された保存条件下では、他の調合物はｒｈＧＤＦ−５／トレハロース／グリシン調合物ほど安定ではなかった。特に、ｒｈＧＤＦ−５／トレハロース／塩酸調合物は、６ヶ月の時点で主ピークは６６％しかなかった。図６および図７は、４０℃／７５％相対湿度で６ヶ月保存された、ｒｈＧＤＦ−５／トレハロース／グリシン調合物およびｒｈＧＤＦ−５／トレハロース／塩酸調合物のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図８、図９、および図１０は、５℃、２５℃、および４０℃での保存を試験された様々な緩衝液のタンパク質回収割合（％）を示す。
【０１５１】
ｒｐＨＰＬＣ分析の結果は、トレハロースとグリシン緩衝液の組み合わせが、保存の過程で、凍結乾燥されたｒｈＧＤＦ−５に最良の安定性を提供することを示す。さらに、塩酸の強酸が、タンパク質およびトレハロース双方に対して不安定化の効果を有する可能性があるため、ｒｈＧＤＦ−５／トレハロース／塩酸の調合物は、より不安定である。
【０１５２】
実施例１３：５％トレハロースを含むｐＨ３グリシン緩衝液中の様々な温度でのｒｈＧＤＦ−５の安定性
この研究では、ｒｈＧＤＦ−５は、５％（質量／体積）トレハロースおよびｐＨ３の５ｍＭグリシン−塩酸緩衝液に、およそ０．０１、０．０３、０．１、２．５、４．５および９ｍｇ／ｍＬで調合された。調合溶液を用いて、１ｍＬ／バイアルの割合で３ｍＬガラスバイアルに充填され、バイアルは凍結乾燥された。凍結乾燥された試料バイアルは、２〜８℃、２５℃／６０％相対湿度、および、４０℃／７５％相対湿度で保存された。各々の設定された時点で、試料は、生成物の安定性について分析された。この研究で使用された方法は、ケーク外観、復元時間、溶液透明度、ｐＨ、ｒｐＨＰＬＣ（逆相高速液体クロマトグラフィー）、ＵＶ（紫外分光法）、ＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）およびゲル電気泳動を含む。３つの保存条件での６ヶ月の保存の後、下は０．１ｍｇ／ｍＬから上は０．９ｍｇ／ｍＬまでのタンパク質濃度で、調合物に大幅な変化は観察されなかったことが見出された。０．０１および０．０３ｍｇ／ｍＬ等の、タンパク質濃度が低すぎた場合、既存の方法は、微小な変化を検出するのに十分強力ではなかった。
【０１５３】
この研究の結果は、様々なタンパク質濃度で、トレハロースおよびグリシン−塩酸を含む凍結乾燥ｒｈＧＤＦ−５調合物は、２〜８℃、２５℃／６０％相対湿度で少なくとも６ヶ月間安定であったことを示す。４０℃／７５％相対湿度の促進された保存条件で保存された生成物に、６ヶ月の時点で、ｒｐＨＰＬＣプロファイルのわずかな変化が見られた。
【０１５４】
実施例１４：５％トレハロースを含むｐＨ３グリシン緩衝液中の様々な温度での異なった濃度のｒｈＧＤＦ−５の安定性
この研究では、ｒｈＧＤＦ−５は、５％（質量／体積）トレハロースおよびｐＨ３の５ｍＭグリシン緩衝液に、０．０１、０．０３、０．１、２．５、４．５および９．０ｍｇ／ｍＬのｒｈＧＤＦ−５濃度で調合された。さらに、比較のために、４．５ｍｇ／ｍＬのｒｈＧＤＦ−５の一つの調合物が、１０％（質量／体積）トレハロースおよび５ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ３）を用いて調製された。調合溶液は次に、１ｍＬ／バイアルの割合で３ｍＬガラスバイアルに充填され、凍結乾燥された。凍結乾燥された試料は、安定チャンバ（stability chamber）に保存された。
【０１５５】
５ｍＭグリシン−塩酸緩衝液、ｐＨ３
３×０．７５ｇのグリシン（分子量７５．０７）が、３個の２０００ｍＬビーカーに秤量され、およそ１９００ｍＬの脱イオン水が各々のビーカーに加えられた。溶液は、塩酸溶液を用いてｐＨ３に滴定された。各々のビーカーに、２０００ｍＬの最終液量にするために追加の水が加えられ、十分に混合された。
【０１５６】
調合物調製
タンパク質原体ｒｈＧＤＦ−５（ロット番号２１４２１３１）が２〜８℃で解凍された。タンパク質溶液（３．８ｍｇ／ｍＬで９６ｍＬ）が、４つの遠心濾過装置（ポールライフサイエンス社、カタログ番号ＯＤ０１０Ｃ３７、分画分子量１０Ｋ）を使用して、全てを含めた合計液量がおよそ２４ｍＬになるまで濃縮された。およそ３×８ｍＬの濃縮されたｒｈＧＤＦ−５溶液は、３つの透析カセット（ピアス社、カタログ番号６６３８０）に移され、２〜８℃で一晩、グリシン−塩酸緩衝液に対して透析された。
【０１５７】
ｒｈＧＤＦ−５溶液は、透析カセットから小さなガラス瓶に移された。ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計を使用して、タンパク質濃度が測定された。タンパク質は、上に記載されたように、５％または１０％（質量／体積）トレハロースおよび５ｍＭグリシン緩衝液に、様々な濃度で調合された。調合溶液は、０．２２μｍのフィルターを用いて濾過され、凍結乾燥に先立って、２〜８℃で保存された。
【０１５８】
充填および凍結乾燥
各々の調合溶液は、３ｍＬのガラスバイアル（ウエスト製薬サービス、カタログ番号６８０００３１６）に、１ｍＬ／バイアルの割合で充填された。ストッパー（ウエスト製薬サービス、カタログ番号９９１５０６３０）が、バイアル上に部分的に置かれた。試料バイアルは、凍結乾燥機（ＦＴＳシステム社、LuoStar II）に移された。凍結乾燥過程の温度プロファイルをモニターするために、熱電対が偽バイアル内に置かれた。
【０１５９】
使用された分析方法は、実施例１１および実施例１２中で上記されたものと同様である。
【０１６０】
結果
凍結乾燥されたケークの完全性
全ての保存条件の試料ケークは、時間ゼロから６ヶ月の時点まで固体および白色の外観を呈した。ケークの周囲にわずかな収縮が観察されるか、または、ケークはバイアルのガラス壁からわずかに離れていた。これは、トレハロースまたはスクロース等の糖が充填剤として使用される場合にきわめてよく起こる。全ての試験試料でケークの崩壊は見られなかった。
【０１６１】
復元時間
試験時には、１ｍＬの水が各々の試料バイアルに加えられた。バイアルは穏やかに混合され、復元時間が記録された。ケークが溶解するためには、およそ３０秒〜４０秒かかった。
【０１６２】
溶液の透明性
タンパク質溶液が黒色背景に対して垂直の光を用いて検査された場合、全ての復元試料は透明および無色の外観を呈した。
【０１６３】
ｐＨ
復元された溶液が、ｐＨを測定するために使用された。研究の過程を通して、全ての試料に大幅なｐＨの変化は観察されなかった。調合物のｐＨ値は、３．０〜３．３の範囲内であった。
【０１６４】
ＵＶ分光法
ＵＶ分光法を使用して、タンパク質濃度が測定された。ＵＶスペクトルはまた、タンパク質の凝集に関する情報（ベースライン光散乱）も提供することができた。０．０１〜０．１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度に対しては、１０ｍｍキュベットが使用された。２〜９ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度に対しては、希釈せずまたは試料を破壊すること無く、１ｍｍキュベットが使用された。安定性研究の過程を通じて、０．１〜９ｍｇ／ｍＬの試料にタンパク質濃度の大幅な変化は観察されなかった。０．０１および０．０３ｍｇ／ｍＬの低濃度試料に対しては、吸光度が低すぎたために、より変動が見られた。将来の研究として、低濃度試料のために、新たな試料調製方法が必要とされるべきである。
【０１６５】
非還元ｒｈＨＰＬＣの結果
非還元ｒｈＨＰＬＣ法を用いて、メチオニンの酸化および脱アミド等のｒｈＧＤＦ−５の分解種をモニターした。２〜８℃、２５℃および４０℃で６ヶ月間の保存を通して全ての試料において、主ピークの割合の大幅な変化は観測されなかった。６ヶ月間保存された試料のｒｈＧＤＦ−５の主ピークは、依然として９６％以上回収され、これは時間ゼロの試料から得られたデータに匹敵していた。０．０１および０．０３ｍｇ／ｍＬの低濃度試料は、ＨＰＬＣ法によって分析することが困難であった。将来の研究のために新たな試料調製が必要とされるべきである。
【０１６６】
ＳＥＣ
タンパク質の凝集をモニターするために、ＳＥＣが使用された。６ヶ月の安定性研究を通して試験された全ての試料の凝集に、大幅な変化は見出されなかった。０．０１および０．０３ｍｇ／ｍＬの低濃度試料は分析されなかった。
【０１６７】
ゲル電気泳動
タンパク質の凝集および分解種もゲル電気泳動法を使用してモニターされた。６ヶ月の保存を通して全ての試料に大幅な変化は見出されなかった。
【０１６８】
タンパク質の断片は、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで発見されなかったことから、保存の過程でどの試料にも形成されなかった。
【０１６９】
水分含有量
試料の水分含有量は低く、０．１９〜０．３２％の範囲であった。タンパク質濃度と水分含有量との間には、相関または傾向は見られなかった。
【０１７０】
ｒｐＨＰＬＣおよびＳＥＣクロマトグラフィーによって証明されるように、結果は、トレハロースおよびグリシン緩衝液存在下の凍結乾燥されたｒｈＧＤＦ−５生成物が、２〜８℃、２５℃／６０％相対湿度、および、４０℃／７５％相対湿度で少なくとも６ヶ月間安定であることを示す。タンパク質は、０．１〜９ｍｇ／ｍＬ（凍結乾燥前）の範囲の様々な濃度で、５％（質量／体積）トレハロース／５ｍＭグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ３）を用いて調合することができ、凍結乾燥することができる。タンパク質が、０．０１ｍｇ／ｍＬおよび０．０３ｍｇ／ｍＬ等の低濃度で調合された場合、既存の方法は変化を検出することにいくつかの限界を有する。
【０１７１】
本発明は、実例となる実施形態に関連して記載されてきた。本発明の範囲を逸脱すること無く上記の調合物にある種の変更が行われてよいため、上記の記載に含まれるか、または添付の図に示される全ての事柄は、限定的な意味ではなく実例として解釈されるべきであることが意図される。例えば、本発明の説明に役立つ実施形態の調合物は、ＢＭＰと共に使用されることに限定されず、あらゆる適切な生物系についての他の生体分子と共に使用できることを、当業者は認識するであろう。
【０１７２】
特許請求の範囲は、本明細書に記載される発明の包括的および特定的な特徴全て、ならびに、文言上その範囲にあると言ってよい発明の範疇についての主張の全てを網羅することを意図したものであることもまた理解されるべきである。
【０１７３】
〔実施の態様〕
（１）組成物において、
少なくとも一種のＢＭＰと、
前記ＢＭＰを安定化するために十分な量のトレハロースと、
を含む、組成物。
（２）実施態様１に記載の組成物において、
約２．５〜約３．５のｐＨを有するグリシン緩衝溶液、
をさらに含む、組成物。
（３）実施態様１に記載の組成物において、
前記ＢＭＰが、ｒｈＧＤＦ−５である、組成物。
（４）実施態様２に記載の組成物において、
前記ＢＭＰが、ｒｈＧＤＦ−５である、組成物。
（５）ＢＭＰを安定化するための方法において、
ａ）少なくとも一種のＢＭＰおよび前記ＢＭＰを安定化するために十分な量のトレハロースを含む組成物を提供することと、
ｂ）前記混合物を凍結乾燥することと、
を含む、方法。
（６）実施態様５に記載の方法において、
約２．５〜約３．５のｐＨを有するグリシン緩衝溶液を加えること、
をさらに含む、方法。
（７）実施態様５または実施態様６に記載の方法において、
前記ＢＭＰが、ｒｈＧＤＦ−５である、方法。
（８）哺乳動物に植え込むための装置において、
少なくとも一種の凍結乾燥ＢＭＰであって、実施態様５に記載の方法にしたがって凍結乾燥された、少なくとも一種の凍結乾燥ＢＭＰ、
を含む、装置。
（９）実施態様８に記載の装置において、
生物分解性のコラーゲン基質、
をさらに含む、装置。
（１０）実施態様８に記載の装置において、
前記ＢＭＰが、ｒｈＧＤＦ−５である、装置。
（１１）哺乳動物に植え込むための装置において、
少なくとも一種の凍結乾燥されたＢＭＰであって、実施態様６に記載の方法にしたがって凍結乾燥された、少なくとも一種の凍結乾燥ＢＭＰ、
を含む、装置。
（１２）実施態様１１に記載の装置において、
生物分解性のコラーゲン基質、
をさらに含む、装置。
（１３）実施態様１１に記載の装置において、
前記ＢＭＰが、ｒｈＧＤＦ−５である、装置。
【図面の簡単な説明】
【０１７４】
【図１】図１は、実施例６に記載されている、ｒｈＧＤＦ−５のトレハロース調合物のＤＳＣプロファイルを示す。
【図２】図２は、実施例７に記載されている、ｒｈＧＤＦ−５のマンニトール調合物のＤＳＣプロファイルを示す。
【図３】図３は、ｒｈＧＤＦ−５天然タンパク質のＤＳＣプロファイルを示す。
【図４】図４は、実施例６に記載されている、ｒｈＧＤＦ−５のトレハロース調合物の偏光顕微鏡検査を示す。
【図５】図５は、実施例７に記載されている、ｒｈＧＤＦ−５のマンニトール調合物の偏光顕微鏡検査を示す。
【図６】図６は、実施例１２に記載されている、４０℃／７５％相対湿度で６ヶ月後のｒｈＧＤＦ−５／トレハロース／グリシン調合物のｒｐＨＰＬＣプロファイルを示す。
【図７】図７は、実施例１２に記載されている、４０℃／７５％相対湿度で６ヶ月後のｒｈＧＤＦ−５／トレハロース／塩酸調合物のｒｐＨＰＬＣのプロファイルを示す。
【図８】図８は、実施例１２に記載されている、５℃で保存した場合の、試験された各種緩衝液の各種時点でのタンパク質回収率（％）を示す。
【図９】図９は、実施例１２に記載されている、２５℃で保存した場合の、試験された各種緩衝液の各種時点でのタンパク質回収率（％）を示す。
【図１０】図１０は、実施例１２に記載されている、４０℃で保存した場合の、試験された各種緩衝液の各種時点でのタンパク質回収率（％）を示す。
【図１１】図１１は、実施例１４に記載されている、ｐＨ３グリシン緩衝液中、５％または１０％トレハロースで凍結乾燥された、各種濃度のｒｈＧＤＦ−５の、選択された温度での安定性を示す。
【開示の内容】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、処理、保存、および復元の過程で、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）および密接に関連のある成長分化因子（ＧＤＦ）を安定化するための方法および調合物（formulations）に関する。さらに特定すれば、本発明は、ｒｈＧＤＦ−５を送達するための媒体として使用される種々の基質を含む、凍結乾燥、保存、および復元（reconstitution）の過程でｒｈＧＤＦ−５を保護するための、トレハロースおよび他の賦形剤を含む調合物に関する。さらに、本発明は、様々な筋骨格の欠陥および症状を治療するためにそのような調合物を調製および使用するための方法を含む。
【０００２】
〔発明の背景〕
生物学的分子（生体分子）は、三次元構造または立体配座（conformation）を有し、生体分子の生物活性および性質についてはこの構造に依存している。そのような生体分子の例は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、およびタンパク質を含む。これらの生体分子は生命に必須であり、様々な医学的疾患および症状の治療における、治療薬および治療標的を代表する。タンパク質は、広範な生体分子のクラスを代表する。酵素、成長因子、受容体、抗体、およびシグナル分子等の異なるクラスのタンパク質は、それらの生物活性について立体配座構造に依存している。他のタンパク質のクラスは、例えばコラーゲンおよび軟骨のように、主として構造的なものであり（structural）、それ自体は生物活性を有していない。
【０００３】
ｐＨ、温度、溶媒、オスモル濃度（osmolality）、その他の変化等の様々な環境に生体分子を曝露することは、生体分子の立体配座状態を不可逆的に変化させることまたは変性することができ、生体分子を生物学的に不活性にする。これらの生体分子の不活性化に関与する機構のうちいくつかは、凝集、酸化、加水分解および脱アミドを含む様々なタイプの結合切断、ならびに、架橋結合および他の共有結合を含む様々なタイプの結合形成を含み、例としてジスルフィド結合の転位（rearrangement）がある。
【０００４】
骨形態形成タンパク質および密接に関連のある成長分化因子は（単量体および二量体の形で）、タンパク質のＴＧＦ−βスーパーファミリーに属している。このタンパク質のクラスは、当初はその異所性軟骨内性骨形成を誘導する能力によって同定された、骨形態形成タンパク質のファミリーのメンバーを含む（Chengら、「Osteogenic activity of the fourteen types of human bone morphogenic proteins」 J. Bone Joint Surg. Am. 85A: 1544-52 (2003)を参照）。これらのタンパク質のいくつかには別名がある（Loriesら、Cytokine Growth Factor Rev 16:287-98 (2005)を参照）。このファミリーの全てのメンバーは、カルボキシ末端側の活性ドメインを含む共通の構造的特徴を共有し、成熟したときの鎖長でおよそ９７〜１０６アミノ酸である。全てのメンバーは、３つの分子内ジスルフィド結合および１つの分子間ジスルフィド結合を形成する、高度に保存されたシステイン残基のパターンを共有する。活性型は、ジスルフィド結合した単一のファミリーメンバーのホモ二量体、または２つの異なるメンバーのヘテロ二量体であることができる。（MassagueのAnnu. Rev. Cell Biol. 6:957 (1990)、SampathらのJ. Biol. Chem. 265:13198 (1990)、OzkaynakらのEMBO J. 9:2085-93 (1990)、WhartonらのPNAS 88:9214-18 (1991)、CelesteらのPNAS 87:9843-47 (1990)、LyonsらのPNAS 86:4554-58 (1989)、米国特許番号第５，０１１，６９１号、および米国特許番号第５，２６６，６８３号、を参照）。
【０００５】
多くの糖が、溶液中で生体分子を安定化し、分離した細胞および生体分子に保護を提供できることが周知である。これらの化合物は、様々な種において凍結防止剤および浸透圧調節剤として周知である（YanceyのJ. Exper. Biol. 208:2819-30 (2005)を参照）。凍結乾燥された薬剤用タンパク質の開発において、糖（サッカライドおよび多価アルコール）は、タンパク質の安定性を改善し、有効期間を延長するためにしばしば調合物に加えられる。糖の安定化作用の機構に関して、２つの主要な理論がある。１）糖賦形剤は、固体の状態でタンパク質を希釈することに寄与し、希釈することによって、タンパク質−タンパク質相互作用を減少させ、凝集等の分子劣化を防止する。２）糖賦形剤は、ガラス様基質を提供し、基質中ではタンパク質の移動度、したがって反応性が最小化される。これらの機構の双方において、糖が非結晶質のタンパク質に接触する相のままであることが重要な意味を持つ。高温および高湿度等の様々な環境因子が、糖の結晶化を誘発し得る。したがって、使用される条件および物質を、検討中の特定の生体分子およびシステムに適するように最適化することが重要である。
【０００６】
凍結乾燥（フリーズドライ）は、生体分子を保存するために通常使用される方法である。フリーズドライは一般的に、生体分子の生物活性に対して、凍結融解（freeze-thawing）または温度によって誘発される変性よりも破壊的であると考えられている。損傷の程度は、異なる生体分子および異なる条件で大幅に変化し、様々な研究者が異なったシステムを研究してきた。水溶液の凍結は、不安定な化合物に凍結そのものよりも損傷を与える可能性のある溶質濃度の初期上昇を作り出す。糖、タンパク質、ポリマー、緩衝液、および界面活性剤等の賦形剤は、生体分子の活性を安定化するために添加可能であるが、その効果の程度は限られており、システムに依存して異なる。Croweらは、乾燥したリン脂質二重層およびタンパク質の糖による安定化を記載しており（Biochem. J. 242:1-10 (1987)）、また、「The trehalose myth revisited: Introduction to a symposium on stabilization of cells in the dry state」 Cryobiology 43,89-105 (2001)の中で、細胞のトレハロース安定化の機構の最近の理解を概説している。現在の考えは、生存可能で有用な凍結乾燥されたタンパク質を保持するためには、２つの別個の異なった必要条件があるというものである。その必要条件とは、１）タンパク質は、凍結過程の間に保護されなければならない、２）タンパク質は、後続の乾燥および復元の間に保護されなければならない。これらは、必ずしもある１つの賦形剤または条件セットによって満たされる必要は無い、異なった必要条件である。
【０００７】
様々な研究者が、様々な生体分子を保護するために様々な賦形剤を使用することについて報告してきた。例えば、Glogerらは（Intl. J. Pharm. 260:59-68 (2003)）、タンパク質を安定化するために低分子量のデキストランを使用した、アビスクミン（aviscumine）の溶解保護（lyoprotection）を記載しており、緩衝系およびポリソルベート８０のみが凍結過程においてタンパク質を保護することに適しているが、乾燥過程においてタンパク質を保護するためにはデキストランが必要であることを示した。Goodnoughらは（Appl. Env. Biol. 58(10):3426-28 (1992)）、安定化剤として血清アルブミンを使用し、また様々な他の賦形剤を使用した、凍結乾燥過程におけるボツリヌス毒素A型の安定化を研究し、どの賦形剤も有益な効果を持たなかったが、凍結乾燥混合液から塩化ナトリウムを除くことによって、またｐＨを制御することによって、活性毒素の回収率が劇的に改善されたことを報告した。Costantinoらは（J. Pharm. Sci. 87 (11):1412-20 (1998)）、凍結乾燥された組み換えヒト成長ホルモンの安定性および構造に対する様々なサッカライドの効果を記載しており、試験された全ての賦形剤がタンパク質の安定性を劇的に改善したことを示した。Ramosらは（Appl. Envir. Microbiol. 63 (10):4020-25 (1997)）、２−Ｏ−β−マンノシルグリセレート（2-O-β-mannosylglycerate）は、様々な起源から単離されたいくつかのデヒドロゲナーゼ酵素の熱ストレスからの保護において効果的であることを示し、また、２−Ｏ−β−マンノシルグリセレートによって与えられる保護は、研究された全ての酵素に対してトレハロースに類似しているかあるいはトレハロースより優れていたが、パイロコッカスフリオサス（P. furiosis）から単離されたグルタミン酸デヒドロゲナーゼの保護においては効果的ではなかったことを示した。Brusらは（J. Control. Rel. 95:119-31 (2004)）、フリーズドライによるオリゴヌクレオチド−ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）複合体の安定化を研究し、これらの複合体はスクロースまたはトレハロース等の糖の添加から利益を得ることは無かったが、プラスミド−ＰＥＩ複合体はそのような糖の添加から利益を得たことを報告した。これらの研究者は、様々な生体分子に対して様々な方法によって測定された、異なった程度の成功を報告している。これらの研究者でＢＭＰの保護について報告した者はいない。
【０００８】
したがって、何が生体分子の溶解保護を提供できる賦形剤の最適な組み合わせであるのかについては、相反する証拠が存在する。全ての生体分子に対して最適となるような如何なる賦形剤の組み合わせも存在しないが、研究中の生体分子に対する望みどおりの結果を得るためには、かなり著しい程度の実験が必要である。凍結乾燥、保管、および使用の過程でＢＭＰを保護するための、薬学的に許容できる賦形剤の組み合わせに対する需要が残っている。
【０００９】
〔発明の概要〕
本発明は、概して、様々な調合物および組成物におけるＢＭＰの安定化と、それによる少なくとも６０％の生物活性の保持、ならびに、例えば温度および湿度などの保存条件における要件の改善に関する。本発明は、ＢＭＰを含む凍結乾燥された組成物のための、およびそれに続くそれらの保管と復元のための賦形剤としてトレハロースを主として含む調合物を含み、緩衝剤および界面活性剤を含む他の賦形剤をさらに含む。
【００１０】
本発明者らは、驚くべきことに、凍結乾燥中およびその後においてＢＭＰの生物活性を保持する上でトレハロースが十分であり、かつ他の賦形剤よりも優れていることを発見した。多くの他の生体分子の安定化においては、得られる保護の量に関して糖の間でほとんど差異は無いが、ＢＭＰに対しては大きな差異がある。この発見は、追加の賦形剤に対する副作用の可能性が無い、患者の様々な筋骨格の欠陥を治療するための組成物を提供する。本発明者らはまた、驚くべきことに、アスコルビン酸およびグルタチオン等の抗酸化物質の添加は、トレハロースと共に凍結乾燥されたＢＭＰの安定性を増加させず、むしろトレハロースによって提供された安定性を減じることも発見した。
【００１１】
本発明の目的は、凍結乾燥されたＢＭＰを安定化するのに十分な量のトレハロースを使用して、ＢＭＰが再水和時に生物活性の少なくとも６０％を保持し、再水和した液体生成物を外科医が容易に扱うことができるようにすることである。
【００１２】
本発明の別の目的は、凍結乾燥されたＢＭＰを安定化するのに十分な量のトレハロース、少なくとも１種のＢＭＰ、および追加の賦形剤を使用して、ＢＭＰが再水和時に生物活性の少なくとも６０％を保持し、再水和した液体生成物を外科医が容易に扱うことができるようにすることであり、追加の賦形剤は、緩衝剤、界面活性剤、およびそれらの混合物からなる群より選択される。
【００１３】
本発明の別の目的は、凍結乾燥されたＢＭＰを安定化するのに十分な量のトレハロース、少なくとも１種のＢＭＰ、および細分化されたコラーゲン繊維（morselized collagen fibers）を使用して、安定で再水和時に生物活性の少なくとも６０％を保持するＢＭＰを含む、凍結乾燥された生体適合性の流動性材料を調製する方法および組成物を提供し、再水和した生成物を外科医が容易に扱うことができるようにすることである。
【００１４】
本発明の別の目的は、凍結乾燥されたＢＭＰを安定化するのに十分な量のトレハロース、少なくとも１種のＢＭＰ、および生体適合性基質を使用して、安定で再水和時に生物活性の少なくとも６０％を保持するＢＭＰを含む、凍結乾燥された生体適合性基質を調製するための方法および組成物を提供し、再水和した生成物を外科医が容易に扱うことができるようにすることである。例となる生体適合性基質には、コラーゲン、ミネラル化コラーゲン（mineralized collagen）、リン酸カルシウム塩、カルシウム含有セラミックス、自原性（autogenic）、同種異系および異種発生性を含む様々な源（sources）からの骨、ならびに、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ＰＬＡ−ＰＧＡコポリマー、ポリカーボネート、ポリカプロラクトン、およびそれらの混合物を含むポリマーが含まれる。
【００１５】
本発明の別の目的は、凍結乾燥されたＢＭＰを安定化するのに十分な量のトレハロース、少なくとも１種のＢＭＰ、生体適合性基質および追加の賦形剤を使用して、安定で再水和時に生物活性の少なくとも６０％を保持するＢＭＰを含む、凍結乾燥された生体適合性基質を調製するための方法および組成物を提供し、再水和した展性の生成物を外科医が容易に扱うことができるようにすることであり、追加の賦形剤は、緩衝剤、界面活性剤、およびそれらの混合物からなる群より選択される。
【００１６】
本発明の別の目的は、トレハロース、低分子量デキストラン、シクロデキストリン、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールエステル、およびそれらの混合物からなる群より選択される１つまたはそれ以上の溶解保護剤を、凍結乾燥されたＢＭＰを安定化するのに十分な量使用し、且つ、少なくとも１種のＢＭＰを使用して凍結乾燥されたＢＭＰを調製する方法および組成物を提供し、ＢＭＰが再水和時に生物活性の少なくとも６０％を保持し、再水和した生成物産物を外科医が容易に扱うことができるようにすることである。
【００１７】
本発明の別の目的は、トレハロース、低分子量デキストラン、シクロデキストリン、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールエステル、およびそれらの混合物からなる群より選択される１つまたはそれ以上の溶解保護剤、少なくとも１種のＢＭＰ、ならびにコラーゲンを使用して、安定で再水和時に生物活性の少なくとも６０％を保持するＢＭＰを含む、凍結乾燥された生体適合性コラーゲン基質を調製する方法および組成物を提供し、再水和した展性の生成物を外科医が容易に扱うことができるようにすることである。
【００１８】
本発明の別の目的は、トレハロース、低分子量デキストラン、シクロデキストリン、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールエステル、およびそれらの混合物からなる群より選択される１つまたはそれ以上の溶解保護剤、少なくとも１種のＢＭＰ、ならびに細分化されたコラーゲン繊維を使用して、安定で再水和時に生物活性の少なくとも６０％を保持するＢＭＰを含む、凍結乾燥された生体適合性の流動性物質を調製する方法および組成物を提供し、再水和した生成物を外科医が容易に扱うことができるようにすることである。
【００１９】
本発明のさらに別の目的は、少なくとも一つの溶解保護剤と少なくとも一つのＢＭＰとの凍結乾燥混合物を含む組成物を使用して、患者を治療することである。このような組成物は、復元された（reconstituted）ＢＭＰ溶液を、例えば骨折、骨の裂け目（bone gap）、骨空隙、椎間板、軟骨欠損、腱、靭帯、および類似物等の患者の解剖学的構造の領域に直接適用することによって、または復元されたＢＭＰ溶液を、例えば人工股関節、人工膝関節、人工肩関節、人工椎間板および類似物等の骨に接触する人工インプラント、腱アンカー、靭帯アンカー、縫合糸、ステープルおよび類似物、ならびに骨置換ケージ、自己由来骨細片、同種異系骨細片、異種骨細片、脱ミネラル化骨細片および類似物などの、患者に植え込まれる装置に適用することによって、様々な筋骨格の欠陥を治療する際に治癒過程を改善させるために有用である。
【００２０】
水溶液または乾燥固体の原体形態（bulk forms）のＢＭＰは不安定であり、タンパク質の生物活性を保持するためには−２０℃より低い温度での冷蔵が必要である。ＢＭＰは、凝集、ジスルフィド結合の転位、脱アミドおよび酸化の影響を受けやすいため、凍結乾燥されたＢＭＰの生物活性を保存および保護するための調合物に対する需要が存在する。
【００２１】
改善された安定性および保存性を有する凍結乾燥ＢＭＰ製品に対する需要が存在する。
【００２２】
水溶液を用いて復元し、椎間板、非関節軟骨および関節軟骨等の軟組織へ注入してそのような組織の再生を促進するために使用される、凍結乾燥ＢＭＰ製品に対する需要が存在する。
【００２３】
外科医が使用するために植え込み可能な生体適合性骨格に適正なＢＭＰ濃度で供給され、供給されることによって、浪費および望まれない手術部位への導入を含む、汚染、不適切な投与量、ならびにこぼれを含む、取り扱いに関連するリスクの多くを最小化するか、または排除する凍結乾燥ＢＭＰ製品に対する需要が存在する。
【００２４】
手術部位に容易に適用されることができる生体適合性の流動性物質に復元されることができる、凍結乾燥ＢＭＰ製品に対する需要が存在する。
【００２５】
〔発明の詳細な説明〕
ＢＭＰが発見されて以来、様々な筋骨格の欠陥や症状の処置における治療的使用に適した組成物を見出すための多数の研究活動があった。現在では、凍結乾燥固体として販売されるＢＭＰを含む製品が存在し、その製品は、使用時に液体状態に復元されて外科医によって植え込まれるべき骨格または外科的治療部位に対して適用されなければならない。現在のｒｈＢＭＰ−２の調合物は、スクロースＮＦ、グリシンＵＳＰ、Ｌ−グルタミン酸ＦＣＣ、塩化ナトリウムＵＳＰ、およびポリソルベート８０ＮＦを賦形剤として使用しており、室温（１５〜２５℃）で保存してよい。現在のＯＰ−１の調合物は、ウシコラーゲンのみを使用し、２〜８℃で保存しなければならない。復元されたＢＭＰの安定性に対する賦形剤の有効性を記載した報文は存在しない。
【００２６】
他の者は、マンニトール、スクロースおよびそれらの混合物を使用することによって、ＰＬＧＡ等のポリマー基質中にＢＭＰを埋め込むことによって、メチオニン等の抗酸化剤を添加することによって、ヒスチジン、アルギニン、シクロデキストリンおよびウシ血清アルブミン等の他の賦形剤を添加することによって、ならびにＴＷＥＥＮ８０等の界面活性剤を添加することによって、またはそれらの組み合わせによって、凍結乾燥過程におけるＢＭＰの安定性を増進しようと試みてきた。これらの試みは、様々な程度の限定的な成功を収めてきた。
【００２７】
米国特許番号第５，３１８，８９８号および第５，５１６，６５４号は、培養液中に硫酸デキストランを使用することによるＢＭＰ産生の改良プロセスを開示しているが、その利点がどのようにして達成されたかの機構を議論しておらず、また、タンパク質を安定化するための他の有用な賦形剤も開示していない。米国特許番号第５，３８５，８８７号において、Yimらは、ＢＭＰを送り込むための凍結乾燥された組成物および調合物を開示しており、その組成物はＢＭＰ、糖、グリシンおよびグルタミン酸を含む。Yimらは、Ｗ−２０アルカリフォスファターゼ分析で証明されるように、凍結乾燥された調合物が生物活性を保っていることを開示しているが、彼らは、他の調合物に対してどれか一つの調合物についてでも量的な利点を示すような調合物に関する比較データを開示していない。これらの発明者は、ＢＭＰの溶解保護に関するトレハロースのスクロースに対する優位性を議論も認識もしていない。
【００２８】
本発明は、凍結乾燥、保存、および、患者を治療するための水溶液を用いた復元に有用で、安定なＢＭＰの調合物を調製および使用する方法および組成物を提供する。本発明は、説明に役立つ実施形態について以下に記載されており、ＢＭＰの例としてｒｈＧＤＦ−５を使用する。本発明が多くの異なった適用および実施形態で実施されてよいこと、ならびに本発明がその適用において本明細書に示される特定の実施例に特に限定されないことを当業者は理解するであろう。以下に続く実施例は、本発明の様々な実施形態および利点のいくつかを説明するが、当業者は、本発明の範囲および意図を逸脱することなく、他の類似の実施形態をとることができることを理解するであろう。
【００２９】
本発明は、１つの態様において、後に続く骨および軟骨の欠陥の外科的治療における使用のために、安定な凍結乾燥されたＢＭＰを調製するための方法および組成物を提供する。本明細書において熟慮されているように、そのような組成物は、少なくとも一種のＢＭＰ、および、ＢＭＰを安定化するのに十分な量のトレハロースを含む。そのような組成物は、復元されたタンパク質溶液を、例えば骨折、骨の裂け目、骨空隙、椎間板、癒合のために外科的に準備された椎間板隙、軟骨欠損、腱、靭帯および類似物等の患者の解剖学的構造の領域に直接に適用するか、あるいは、人工股関節、人工膝関節、人工肩関節、人工椎間板、腱アンカー、靭帯アンカー、縫合糸、ステープル、骨ケージ、自己由来骨細片、同種異系骨細片、異種骨細片、脱ミネラル化骨細片および類似物等の、骨または軟骨に接触して患者に植え込まれるべき物質に対して、直接適用することによって、様々な筋骨格の欠陥の治療に有用である。
【００３０】
本明細書中で使用されているように、用語「モルフォゲン（morphogen）」「骨モルフォゲン（bone morphogen）」、「骨形成タンパク質（bone morphogenic protein）」、「骨形態形成タンパク質（bone morphogenetic protein）」、「ＢＭＰ」、「骨原性タンパク質（osteogenic protein）」、「骨原性因子（osteogenic factor）」、「成長分化因子（Growth & Differentiation Factor）」、および「ＧＤＦ」は、ｒｈＧＤＦ−５によって代表されるクラスのタンパク質を包含する。しかし、通常の当業者は理解するであろうことであるが、ｒｈＧＤＦ−５は単に、ＢＭＰとして機能することのできる真の組織モルフォゲンのＴＧＦ−βファミリーサブクラスの代表であり、説明を限定する意図は無い。用語「凍結防止剤（cryoprotectant）」は、凍結の過程で生体分子を安定化することのできる分子を指し示すために使用され、現在の文脈においては、フリーズドライ（凍結乾燥）の過程で生体分子を安定化することのできる分子を指し示す用語「溶解保護剤（lyoprotectant）」と等価である。本明細書中で使用されているように、用語「細分化された（morselized）」は以下の操作によって得られた生成物を、また用語「細分化（morselization）」は以下の操作の過程を指し示しており、操作とは、切断、せん断、分断、粉砕、微粉砕、あるいはそうでない場合、個々の粒子または繊維の全体のサイズが減じられるように、ある量の生体適合性基質、例えばコラーゲン、のサイズを減じることである。本明細書中で使用されているように、用語「賦形剤」は、少なくとも一つのＢＭＰに添加される少なくとも一つの追加的な化合物を指し示し、追加的な化合物は、アミノ酸、タンパク質、緩衝剤、界面活性剤およびそれらの混合物からなる群より選択される。
【００３１】
ｒｈＧＤＦ−５は、ｐＨ４．５〜ｐＨ１０．５の範囲の中性のｐＨでは溶解性が低いことが知られている。このｐＨ範囲においてｒｈＧＤＦ−５製品を調合して製造することは難しいであろう。ゆえに本発明者らは、タンパク質調合物の開発に好適なｐＨ範囲を選択するために重要な、ｐＨ３およびｐＨ４の緩衝液中でのｒｈＧＤＦ−５の溶解度を評価するための研究を設計した。研究の結果は実施例１１に記載されている。ｒｈＧＤＦ−５の溶解度は、緩衝液のｐＨにのみ依存するのではなく、緩衝溶液のイオン強度にも依存する。ｐＨ４において、およそ１０ｍｇ／ｍＬのｒｈＧＤＦ−５溶液は、５および１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液中で白濁していた一方で、５０および１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液中では、ｒｈＧＤＦ−５は大きな粒子を形成し、最終的には沈殿した。別の研究では（データは示されていない）、ｒｈＧＤＦ−５がｐＨ３．５およびｐＨ４の５ｍＭリン酸緩衝液に３．５ｍｇ／ｍＬで調合され、この場合にも、溶液は白濁していた。
【００３２】
通常、タンパク質物質の溶解度は、過飽和／沈殿した溶液の遠心分離または濾過の後にタンパク質濃度を測定することによって決定される。しかし、いくつかの白濁したタンパク質溶液は、遠心分離または濾過するのが困難である。不溶の粒子を除去するために白濁した溶液を遠心分離または濾過（０．２２μｍ）にかけた後でさえ、非常に多くの場合、粒子が非常に微細であることから濾液は依然として白濁しているため成功せず、時にはタンパク質がフィルター表面に固着し、したがって濾液はほとんどのタンパク質を失う。ゆえに、ｒｈＧＤＦ−５が、３．５ｍｇ／ｍＬまたは１０ｍｇ／ｍＬでｐＨ３．５またはｐＨ４の緩衝液中に調合された場合、透明な溶液を得ることは困難であろう。
【００３３】
ｒｈＧＤＦ−５が、１０ｍｇ／ｍＬで５ｍＭ、１０ｍＭ、および２５ｍＭのｐＨ３．０のリン酸ナトリウム溶液中に調合された場合、タンパク質溶液は透明であったが、ｒｈＧＤＦ−５が、１０ｍｇ／ｍＬで５０ｍＭおよび１００ｍＭのリン酸ナトリウム等のより高いイオン強度の溶液中に調合された場合、ｒｈＧＤＦ−５溶液は白濁していた。したがって、好ましい実施形態においては、ｒｈＧＤＦ−５は、およそｐＨ３．０の低イオン強度の緩衝液中に調合されるべきである。
【００３４】
本発明による一つの実施形態においては、組成物は、少なくとも一つのＢＭＰと、ＢＭＰを安定化するのに十分な量のトレハロースとの混合水溶液を凍結乾燥することによって調製することができ、生体適合性基質を含む生成物について、トレハロースのＢＭＰに対する乾燥重量比率は、１ｍｇのＢＭＰにつき約１ｍｇ〜約５００ｍｇのトレハロースの範囲であり、さらに好ましくは、１ｍｇのＢＭＰにつき約５ｍｇ〜約２００ｍｇのトレハロースの範囲である。トレハロースの添加は、凍結乾燥された調合物のタンパク質の溶解度および安定性を改善する。凍結乾燥は、当業者に一般的に周知の慣例にしたがって行われる。
【００３５】
別の実施形態においては、本発明による組成物は、少なくとも一つのＢＭＰ、ＢＭＰを安定化するのに十分な量のトレハロース、および、緩衝剤の混合水溶液を凍結乾燥することによって調製することができる。緩衝剤の添加は、凍結乾燥された調合物のタンパク質の溶解度および安定性を改善する。当業者に周知の生体適合性緩衝剤は、グリシン、酢酸のナトリウム塩、カリウム塩またはカルシウム塩、クエン酸のナトリウム塩、カリウム塩またはカルシウム塩、乳酸のナトリウム塩、カリウム塩またはカルシウム塩、一塩基リン酸（mono-basic phosphate）、二塩基リン酸（di-basic phosphate）、三塩基リン酸（tri-basic phosphate）、およびそれらの混合物を含むリン酸のナトリウム塩またはカリウム塩を含む。緩衝剤は、充填剤（bulking agent）として機能するために、組成物に対して添加されたグリシンを付加的に有することができる。グリシンは、１ｍｇのＢＭＰにつき約０．０４ｍｇ〜約２００ｍｇのグリシンの割合で、さらに好ましくは、０．０４ｍｇのＢＭＰにつき約１ｍｇ〜約８０ｍｇのグリシンの割合で添加される。緩衝剤および充填剤の添加は、ｐＨが約２．０〜約５．０のｐＨ単位の間に制御されている場合に、さらに好ましくは、約２．５〜約４．５のｐＨ単位の間に制御されている場合に、トレハロースのみを有する組成物よりもわずかに優れたタンパク質の安定性を提供する。
【００３６】
また別の実施形態において、本発明による組成物および方法は、少なくとも一つのＢＭＰと、ＢＭＰを安定化するのに十分な量のトレハロースと、緩衝剤と、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０およびそれらの混合物からなる群より選択される界面活性剤との混合水溶液を凍結乾燥することによって調製することができる。界面活性剤は、１ｍｇのＢＭＰにつき約０．００１ｍｇ〜約０．２ｍｇの濃度で添加される。界面活性剤の添加は、溶解度および凍結乾燥の特性を変化させることによって、タンパク質に付加的な安定性を提供する。凍結乾燥は、当業者に一般的に周知の慣例にしたがって行われる。
【００３７】
本発明の別の実施形態において、安定な凍結乾燥されたＢＭＰを調製するための組成物および方法は、少なくとも一つのＢＭＰ、少なくとも一つのＢＭＰを安定化するのに十分な量の溶解保護剤であるトレハロース、および少なくとも一つの付加的な賦形剤によって構成され、付加的な賦形剤は、緩衝剤および界面活性剤からなる群より選択される。そのような緩衝剤および界面活性剤の添加は、トレハロースを単一の賦形剤として有する組成物よりも、凍結乾燥されたＢＭＰの安定性に増加する改善を提供する。
【００３８】
別の実施形態において、本発明による組成物および方法は、少なくとも一つのＢＭＰと少なくとも一つの賦形剤との溶液を凍結乾燥されたコラーゲンの上に堆積させることによって調製でき、その後にＢＭＰ／コラーゲン混合物の凍結乾燥ができる。コラーゲンは、オプションとして、ヒーロス（Healos）（登録商標）として知られ、米国特許番号第５，９７２，３８５号、第５，８６６，１６５号、第５，７７６，１９３号、第５，４５５，２３１号、および第５，２３１，１６９号に記載されている物質によって提供されるように、架橋またはミネラル化されるか、あるいは架橋およびミネラル化されることができる。本実施形態において提供される組成物は、整形外科の分野における病状の治療に特に有用であり、骨、軟骨、または腱を生成させるために外科医が容易に手術部位に設置することのできる、柔軟な、展性の素材を提供する。ＢＭＰ／コラーゲン混合物は、滅菌水、生理食塩水および骨髄穿刺液を含む水溶液を用いて復元することができ、骨折、骨の裂け目、骨空隙、脊椎固定術のために外科的に準備された椎間板隙等の患者の欠陥部位に直接適用されることができる。さらに、ＢＭＰ／コラーゲン混合物は、骨細片と、脊椎固定術の過程で椎間板隙に挿入されるインプラントとの間の空間に充填するため、裂けるかまたは損傷した腱、裂けるかまたは損傷した靭帯、関節軟骨の軟骨欠損および関節軟骨の肋軟骨下欠損等の損傷または欠失した軟骨のある領域に充填するために使用することができる。
【００３９】
別の実施形態において、本発明による組成物および方法は、少なくとも一つのＢＭＰと少なくとも一つの賦形剤との凍結乾燥された混合物を調製することによって、凍結乾燥されたＢＭＰ混合物を水、生理食塩水または骨髄穿刺液を用いて復元することによって、そして、復元されたＢＭＰ溶液を凍結乾燥コラーゲンの上に乗せてからＢＭＰ／コラーゲン混合物の外科的植え込みを行うことによって、利用することができる。コラーゲンは、オプションとして、ヒーロス（登録商標）として知られている物質によって提供されるように、架橋またはミネラル化されるか、あるいは架橋およびミネラル化されることができる。本実施形態において提供される組成物および方法は、整形外科の分野における病状の治療に特に有用であり、骨、軟骨または腱を生成させるために外科医が容易に手術部位に設置することのできる、柔軟な、展性の素材を提供する。ＢＭＰ／コラーゲン混合物は、骨折、骨の裂け目、骨空隙、脊椎固定術のために外科的に準備された椎間板隙等の患者の欠陥部位に直接適用することができ、骨細片と脊椎固定術の過程で椎間板隙に挿入されるインプラントとの間の空間を満たすために、また、裂けるかまたは損傷した腱、裂けるかまたは損傷した靭帯、関節軟骨の軟骨欠損、および関節軟骨の肋軟骨下欠損等の損傷または欠失した軟骨のある領域を満たすために使用することができる。本実施形態において提供される組成物および方法はまた、ＢＭＰをコラーゲン物質から分離した成分および容器として有することによって、保存および調製を簡略化するために特に有用である。
【００４０】
別の実施形態において、本発明による組成物および方法は、少なくとも一つのＢＭＰと少なくとも一つの賦形剤との溶液を、凍結乾燥され、細分化されたコラーゲン上に堆積させることによって調製でき、その後、ＢＭＰ／細分化されたコラーゲン混合物の凍結乾燥ができる。細分化されたコラーゲンは、任意に、架橋またはミネラル化されるか、あるいは架橋およびミネラル化されていることができる。このような細分化によって、直径約２５ミクロン、長さ約１１０ミクロンの小さいコラーゲン繊維が提供され、手術部位に注入するのに好適な流動性の組成物をもたらす。このような組成物の復元は、滅菌水、生理食塩水または骨髄穿刺液等の水溶液とコラーゲンゲルとの混合物を使用して行うことができ、コラーゲンゲルが復元された生成物の粘度を制御する。コラーゲンゲルは、約０．１％〜約３０％（質量／質量）のコラーゲンを、さらに好ましくは約０．３％〜約３．０％（質量／質量）のコラーゲンを含み、コラーゲンゲルの粘度は、好ましくは約１０ｃＰ〜約４００ｃＰ、さらに好ましくは約７０ｃＰ〜約１００ｃＰである。コラーゲンゲルのｐＨは、好ましくは約４．０ｐＨ単位〜約８．０ｐＨ単位である。このような組成物は、骨折、骨の裂け目、骨空隙、および脊椎固定術のために外科的に準備された椎間板隙を含むがそれらに限定されない様々な筋骨格の症状を治療するために有用であり、骨細片と脊椎固定術の過程で椎間板隙に挿入されるインプラントとの間の空間を満たすために、また、裂けるかまたは損傷した腱、裂けるかまたは損傷した靭帯、関節軟骨の軟骨欠損および関節軟骨の肋軟骨下欠損等のような損傷または欠失した軟骨のある領域を満たすために有用である。
【００４１】
別の実施形態において、本発明による組成物および方法は、少なくとも一つのＢＭＰと少なくとも一つの賦形剤との凍結乾燥混合物を調製することによって、凍結乾燥されたＢＭＰ混合物を水または生理食塩水を用いて復元することによって、そして、復元されたＢＭＰ溶液を椎間板に注入することによって、利用することができる。本実施形態において提供される組成物および方法は、椎間板を治療する際に特に有用である。
【００４２】
〔発明の実施例〕
以下の実施例において、使用される実験方法は以下の通りである。
ＲＰ−ＨＰＬＣ純度研究のために、復元されたｒｈＧＤＦ−５試験試料を、１０ｍＭ塩酸（ＨＣｌ）を用いて０．１ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈し、Vydac２１８ＴＰ５２カラム上で５０℃、０．３ｍＬ／分の流速で逆相ＨＰＬＣにかけた。ｒｈＧＤＦ−５は、２１４ｎｍでのＵＶ検出を用いて、０．１５％トリフルオロ酢酸中でアセトニトリル勾配を用いて溶出された。
【００４３】
円偏光二色性（ＣＤ）研究のために、ＡＶＩＶモデル６０ＤＳ円偏光二色性分光偏光計上で円偏光二色性分光分析を行った。対応する賦形剤の走査を用いたベースライン擬似測定（baseline placebo runs）を、試料の走査から減算した。走査は平均残基重量（Mean Residue Weight）（１１５の値）を用いて正規化し、以下の等式に代入した。
＝［０．１×Ｍ残基］／［濃度（ｍｇ／ｍＬ）×光路長］
【００４４】
の値は、平均残基楕円率（mean residue ellipticities）を与えるために各々の波長で計算した。最後に、プログラムPROSECｖ.2.1（１９８７年にＡＶＩＶアソシエイツ（AVIV Associates）により著作権取得）を使用して、二次構造見積りが決定された。
【００４５】
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を、マイクロカル（MicroCal）ＶＰ−ＤＳＣ機器上で行った。走査速度は６０℃／時間であった。温度範囲は５〜１００℃であった。機器ベースライン走査（擬似データ）を、試験試料熱走査から減算した。タンパク質濃度は０．３３ｍｇ／ｍＬであった。
【００４６】
結晶化度判定（Crystallinity Assessment）のために偏光顕微鏡法（ＰＬＭ）が使用された。相対湿度が１％の乾燥エアバッグ中で、微量の固体試料をバイアルから取り出した。固体試料はガラススライド上に広げられ、固体試料上に一滴のシリカオイルが滴下された。次に、ソニー製ＣＣＤ−ＩＲＩＳ／ＲＧＢカラービデオカメラおよび偏光付属品が備えられたゼイス光学顕微鏡（Zeiss Optical Microscope）を用いて、スライドを検査した。画像を取り込むためにフラッシュバス（Flash Bus）ＦＢＧソフトウェアが使用された。
【００４７】
ｒｈＧＤＦ−５原体（bulk rhGDF-5）は、１０ｍＭ塩酸中に３．８ｍｇ／ｍＬの濃度で、−８０℃の凍結形態でバイオファーム社（Biopharm）から入手した。凍結タンパク質原体は、調合物に使用する前に、２〜８℃で一晩かけて解凍した。
【００４８】
実施例１：ヒーロス（登録商標）細片（非滅菌）とｒｈＧＤＦ−５（０．５ｍｇ／ｍＬ、５ｍＬ／細片）およびトレハロース５０ｍｇ／ｍＬ。各々の細片は、２．５ｍｇのｒｈＧＤＦ−５と２５０ｍｇのトレハロースを有した。
【００４９】
トレハロース溶液の調製：
２５．４８ｇのトレハロース二水和物が注意深く秤量され、滅菌ポリプロピレン瓶に移され、それに室温で３５０ｍＬの純水が加えられ、透明な溶液が得られるまでゆっくりと撹拌された。透明な溶液に対して、ｐＨを３．９に調整するために０．１規定の塩酸が一滴ずつ加えられ、次に、４００ｍＬの最終液量を得るために純水を用いて液量が調整された。ｐＨが測定され、４．２であることが見出された。溶液は０．２２ミクロンのフィルターを通して濾過され、タンパク質溶液を希釈するために直接使用された。
【００５０】
ｒｈＧＤＦ−５溶液のトレハロース溶液を用いた希釈：
２２．３９ｍＬのｒｈＧＤＦ−５溶液が注意深くポリプロピレンフラスコに移され、そこに液量を１５０ｍＬに調整するために注意深くトレハロース溶液が加えられた。ｐＨが測定され、２．５であることが見出された。溶液は室温で１５分間撹拌された。タンパク質濃度を正確に計算するために、ＵＶ吸光係数を得た。ＵＶの示度に基づいて、さらにトレハロース溶液を加えて、１７０ｍＬの溶液中に０．５ｍｇ／ｍＬの望ましい濃度を得た。ｐＨが測定され、２．７であることが見出された。ＵＶの示度は０．４９９ｍｇ／ｍＬのタンパク質含有量を示した。
【００５１】
ｒｈＧＤＦ−５／トレハロース溶液は、０．２２ミクロンのフィルターを通して濾過され、ヒーロス（登録商標）細片上に分注するために直接使用された。滅菌ピペットを使用して、各々の細片についてｒｈＧＤＦ−５／トレハロース溶液の合計が５ｍＬになるように、細片上の２点に２．５ｍＬのｒｈＧＤＦ−５／トレハロース溶液が同様に分注された。細片は小さな２ｃｍ×５ｃｍのＰＥＴＧトレイに挿入され、小さなトレイは大きなＰＥＴＧトレイに挿入され、凍結乾燥された。各々の大きなトレイは２４の細片を収容する。
【００５２】
表１ａ：表１ａ：２５℃における、細片あたりトレハロース（２５０ｍｇ）およびｒｈＧＤＦ−５（２．５ｍｇ）を用いたヒーロス（登録商標）の安定性（実施例１）
【表１】
【００５３】
表１ｂ：２〜８℃における、細片あたりトレハロース（２５０ｍｇ）およびｒｈＧＤＦ−５（２．５ｍｇ）を用いたヒーロス（登録商標）の安定性（実施例１）
【表２】
【００５４】
実施例２：ヒーロス（登録商標）細片（非滅菌）とｒｈＧＤＦ−５（０．５ｍｇ／ｍＬ、５ｍＬ／細片）およびマンニトール５０ｍｇ／ｍＬ。各々の細片は、２．５ｍｇのｒｈＧＤＦ−５と２５０ｍｇのマンニトールを有した。
【００５５】
マンニトール溶液の調製：
２３．０３ｇのマンニトールが注意深く秤量され、滅菌ポリプロピレン瓶に移され、それに室温で３５０ｍＬの純水が加えられ、透明な溶液が得られるまでゆっくりと撹拌された。ｐＨが測定され、７．２であることが見出された。ｐＨを３．８に調整するために０．１規定の塩酸が一滴ずつ加えられ、次に、４００ｍＬの最終液量を得るために純水を用いて液量が調整された。ｐＨが測定され、３．９であることが見出された。溶液は０．２２ミクロンのフィルターを通して濾過され、タンパク質溶液を希釈するために直接使用された。
【００５６】
ｒｈＧＤＦ−５溶液のマンニトール溶液を用いた希釈：
２２．３７ｍＬのｒｈＧＤＦ−５溶液が注意深くポリプロピレンフラスコに移され、そこに液量を１５０ｍＬに調整するために注意深くマンニトール溶液が加えられた。ｐＨが測定され、２．７であることが見出された。溶液は室温で１５分間撹拌された。正確なタンパク質濃度を計算するために、ＵＶ吸光係数が取得された。ＵＶの示度に基づいて、１７０ｍＬの溶液中に０．５ｍｇ／ｍＬの望ましい濃度を得るためにさらにマンニトール溶液が加えられた。ｐＨが測定され、２．８であることが見出された。ＵＶの示度は０．４９３ｍｇ／ｍＬのタンパク質含有量を示した。
【００５７】
ｒｈＧＤＦ−５／マンニトール溶液は、０．２２ミクロンのフィルターを通して濾過され、ヒーロス（登録商標）細片上に分注するために直接使用された。滅菌ピペットを使用して、各々の細片につきｒｈＧＤＦ−５／マンニトール溶液の合計が５ｍＬになるように、２．５ｍＬのｒｈＧＤＦ−５／マンニトール溶液が細片上の２点に同様に分注された。細片は小さな２ｃｍ×５ｃｍのＰＥＴＧトレイに挿入され、小さなトレイは大きなＰＥＴＧトレイに挿入され、凍結乾燥された。各々の大きなトレイは２４の細片を収容する。
【００５８】
表２ａ：２５℃における、細片あたりマンニトール（２５０ｍｇ）およびｒｈＧＤＦ−５（２．５ｍｇ）を用いたヒーロス（登録商標）の安定性（実施例２）
【表３】
【００５９】
表２ｂ：２〜８℃における、細片あたりマンニトール（２５０ｍｇ）およびｒｈＧＤＦ−５（２．５ｍｇ）を用いたヒーロス（登録商標）の安定性（実施例２）
【表４】
【００６０】
実施例３：ヒーロス（登録商標）細片（滅菌）とｒｈＧＤＦ−５（０．５ｍｇ／ｍＬ、５ｍＬ／細片）およびトレハロース１００ｍｇ／ｍＬ。各々の細片は、２．５ｍｇのｒｈＧＤＦ−５と５００ｍｇのトレハロースを有した。
【００６１】
トレハロース溶液の調製：
２５．４９ｇのトレハロース二水和物が注意深く秤量され、滅菌ポリプロピレン瓶に移され、そこに室温で１９０ｍＬの純水が加えられ、透明な溶液が得られるまでゆっくりと撹拌された。透明なトレハロース溶液のｐＨが測定され、６．２であることが見出された。ｐＨを調整するためにトレハロース溶液に塩酸は加えられなかった。２００ｍＬの最終液量を得るために、純水を用いて液量が調整された。ｐＨが測定され、６．３であることが見出された。溶液は、タンパク質溶液を希釈するために直接使用された。
【００６２】
ｒｈＧＤＦ−５溶液のトレハロース溶液を用いた希釈：
２３．０３ｍＬのｒｈＧＤＦ−５溶液が注意深くポリプロピレンフラスコに移され、そこに液量を１７０ｍＬに調整するために注意深くトレハロース溶液が加えられた。ｐＨが測定され、３．０であることが見出された。溶液は室温で１５分間撹拌された。タンパク質濃度を正確に計算するために、ＵＶ吸光係数が取得された。ＵＶの示度に基づいて、さらにトレハロース溶液が加えられ、１７５ｍＬの溶液中に０．５ｍｇ／ｍＬの望ましい濃度を得られた。ｐＨが測定され、３．０であることが見出された。ＵＶの示度は０．５１８ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を示した。
【００６３】
ｒｈＧＤＦ−５／トレハロース溶液は、０．２２ミクロンのフィルターを通して濾過され、滅菌ヒーロス（登録商標）細片上に分注するために直接使用された。滅菌ピペットを使用して、各々の細片について、ｒｈＧＤＦ−５／トレハロース溶液の合計が５ｍＬになるように、細片上の２点に２．５ｍＬのｒｈＧＤＦ−５／トレハロース溶液が同様に分注された。細片はスチールトレイに置かれ、トレイは注意深く滅菌二重パウチに封入され、滅菌条件下での凍結乾燥のために移された。
【００６４】
表３ａ：２〜８℃における、細片あたりトレハロース（５００ｍｇ）／ｒｈＧＤＦ−５（２．５ｍｇ）を用いたヒーロス（登録商標）の安定性（実施例３）
【表５】
【００６５】
実施例４：ヒーロス（登録商標）細片（滅菌）と低用量ｒｈＧＤＦ−５（５ｍＬ／細片、０．５ｍｇ／ｍＬ）、トレハロース４０ｍｇ／ｍＬ、およびグリシン１０ｍｇ／ｍＬ。各々の細片は、２．５ｍｇのｒｈＧＤＦ−５、２００ｍｇのトレハロースおよび５０ｍｇのグリシンを有した。
【００６６】
トレハロース／グリシン溶液の調製：
１７．８４ｇのトレハロース二水和物および４．０３ｇのグリシンが注意深く秤量され、滅菌ポリプロピレン瓶に移され、それに室温で３００ｍＬの純水が加えられ、透明な溶液が得られるまでゆっくりと撹拌された。ｐＨが測定され、５．５であることが見出された。どのような酸も加えること無く、液量は純水を用いて３５０ｍＬに調整された。ｐＨが測定され、５．５であることが見出された。
【００６７】
ｒｈＧＤＦ−５溶液のトレハロース／グリシン溶液を用いた希釈：
３９．４７ｍＬのｒｈＧＤＦ−５溶液が注意深くポリプロピレンフラスコに移され、それに液量を２９５ｍＬに調整するために注意深くトレハロース／グリシン溶液が加えられた。ｐＨが測定され、４．１であることが見出された。溶液は室温で１５分間撹拌された。タンパク質濃度を正確に計算するために、ＵＶ吸光係数が取得された。ＵＶの示度に基づいてトレハロース溶液が加えられ、３００ｍＬの溶液中に０．５ｍｇ／ｍＬの望ましい濃度を得た。ｐＨが測定され、４．１であることが見出された。ＵＶの示度は０．５０７ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を示した。
【００６８】
溶液は０．２２ミクロンのフィルターを通して濾過され、滅菌ヒーロス（登録商標）細片上に分注するために直接使用された。滅菌ピペットを使用して、各々の細片についてｒｈＧＤＦ−５溶液の合計が５ｍＬになるように、細片上の２点に２．５ｍＬのｒｈＧＤＦ−５／トレハロース／グリシン溶液が同様に分注された。細片はスチールトレイに置かれ、トレイは注意深く滅菌二重パウチに封入され、滅菌条件下での凍結乾燥のために移された。
【００６９】
表４ａ：２〜８℃における、細片あたりトレハロース（２００ｍｇ）／ｒｈＧＤＦ−５（２．５ｍｇ）／グリシン（５０ｍｇ）を用いたヒーロス（登録商標）の安定性（実施例４）
【表６】
【００７０】
表４ｂ：２５℃における、細片あたりトレハロース（２００ｍｇ）／ｒｈＧＤＦ−５（２．５ｍｇ）／グリシン（５０ｍｇ）を用いたヒーロス（登録商標）の安定性（実施例４）
【表７】
【００７１】
実施例５：ヒーロス（登録商標）細片（滅菌）とｒｈＧＤＦ−５（０．５ｍｇ／ｍＬ、２．５ｍｇ／細片）、トレハロース４０ｍｇ／ｍＬ、グリシン１０ｍｇ／ｍＬ、およびポリソルベート０．１ｍｇ／ｍＬ。各々の細片は、２．５ｍｇのｒｈＧＤＦ−５、２００ｍｇのトレハロース、５０ｍｇのグリシン、および０．５ｍｇのポリソルベート８０を有した。
【００７２】
ポリソルベート８０溶液の調製：
２３．０３ｍｇのポリソルベート８０が５０ｍＬの滅菌使い捨てチューブの中に秤量され、それに２５ｍＬの純水が加えられ、均一な溶液を得るために２分間振り混ぜられた。
【００７３】
トレハロース／グリシン／ポリソルベート溶液の調製：
１０．１９ｇのトレハロース二水和物、および２．３０３ｇのグリシンが注意深く秤量され、滅菌ポリプロピレン瓶に移され、それに２５ｍＬの上記のポリソルベート８０溶液が加えられた。ポリソルベートのチューブは、２５ｍＬの純水で２回ゆすがれ、ゆすぎ液はトレハロース／グリシン／ポリソルベート溶液に移された。合計液量を１９０ｍＬにするために追加量の純水がトレハロース／グリシン／ポリソルベート溶液に加えられた。溶液は透明な溶液を得るために２分間撹拌された。溶液のｐＨが測定され、５．６であることが見出された。液量は純水を用いて２００ｍＬに調整された。ｐＨが測定され、５．５であることが見出された。
【００７４】
ｒｈＧＤＦ−５溶液のトレハロース／グリシン／ポリソルベート溶液を用いた希釈：
２３．０３ｍＬのｒｈＧＤＦ−５溶液が注意深くポリプロピレンフラスコに移され、それに液量を１７０ｍＬに調整するために注意深くトレハロース／グリシン／ポリソルベート溶液が加えられた。ｐＨが測定され、４．１であることが見出された。溶液は室温で１５分間撹拌された。タンパク質濃度を正確に計算するために、ＵＶ吸光係数が取得された。ＵＶの示度に基づいてさらにトレハロース／グリシン／ポリソルベート溶液が加えられ、１７５ｍＬの溶液中に０．５ｍｇ／ｍＬの望ましい濃度を得た。ｐＨが測定され、４．１であることが見出された。ＵＶの示度は０．５１０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を示した。
【００７５】
溶液は０．２２ミクロンのフィルターを通して濾過され、層流フード（laminar flow hood）中の無菌条件下で滅菌ヒーロス（登録商標）細片上に分注するために直接使用された。滅菌ピペットを使用して、各々の細片についてｒｈＧＤＦ−５／トレハロース／グリシン／ポリソルベート溶液の合計が５ｍＬになるように、細片上の２点に２．５ｍＬのｒｈＧＤＦ−５／トレハロース／グリシン／ポリソルベート溶液が同様に分注された。細片はスチールトレイに置かれ、トレイは注意深く滅菌二重パウチに封入され、滅菌条件下での凍結乾燥のために移された。
【００７６】
表５ａ：２〜８℃における、細片あたりトレハロース（２００ｍｇ）／ｒｈＧＤＦ−５（２．５ｍｇ）／グリシン（５０ｍｇ）／ポリソルベート８０（０．５ｍｇ）を用いたヒーロス（登録商標）の安定性（実施例４）
【表８】
【００７７】
実施例６：ｒｈＧＤＦ−５（０．５ｍｇ／ｍＬ）にトレハロース（５０ｍｇ／ｍＬ）を加えた凍結乾燥されたバイアル生成物
トレハロース溶液の調製：
滅菌ポリプロピレン瓶に１２．１６ｇのトレハロース二水和物および磁気撹拌子が入れられ、それに室温で１９０ｍＬの純水が加えられた。溶液は、トレハロースが完全に溶解されるまで室温で撹拌された。ｐＨが測定され、６．５であることが見出された。透明なトレハロース溶液に対して、ｐＨを５．８に調整するために０．１規定の塩酸が一滴ずつ加えられた。液量は純水で２００ｍＬに調整され、ｐＨが測定され、５．５であることが見出された。溶液は０．２２ミクロンのフィルターを通して濾過され、タンパク質溶液を希釈するために直接使用された。
【００７８】
ｒｈＧＤＦ−５溶液のトレハロース溶液を用いた希釈：
１４．４７ｍＬのｒｈＧＤＦ−５溶液が注意深くポリプロピレンフラスコに移され、そこに最終液量を１００ｍＬにするために、瓶を旋回しながらトレハロース溶液がゆっくりと加えられた。溶液は、室温で１５分間、時折旋回された。ｐＨが測定され、３．０であることが見出された。ＵＶの示度に基づいてさらにトレハロース溶液が加えられ、１１０ｍＬの溶液中に０．５ｍｇ／ｍＬの望ましい濃度を得た。ｐＨが測定され、３．１であることが見出された。ＵＶの示度は０．５１０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を示した。溶液は０．２２ミクロンのフィルターを通して濾過され、バイアルに分注するために直接使用された。
【００７９】
バイアルへの充填：１．１ｍＬのｒｈＧＤＦ−５／トレハロース溶液が、５ｍＬのタイプ１フリントガラスバイアルに手動で分注され、凍結乾燥機への装填に先立って各々のバイアルはストッパーで部分的に閉じられた。凍結乾燥後、ストッパーは押し込まれ、圧着された。生成物は白色から灰白色のケーク（cake）として得られた。
【００８０】
表６ａ：２〜８℃における、ｒｈＧＤＦ−５（０．５ｍｇ／ｍＬ）にトレハロース（５０ｍｇ／ｍＬ）を加えたバイアルの安定性（実施例６）
【表９】
【００８１】
表６ｂ：２５℃における、ｒｈＧＤＦ−５（０．５ｍｇ／ｍＬ）にトレハロース（５０ｍｇ／ｍＬ）を加えたバイアルの安定性（実施例６）
【表１０】
【００８２】
実施例７：ｒｈＧＤＦ−５（０．５ｍｇ／ｍＬ）にマンニトール（５０ｍｇ／ｍＬ）を加えた凍結乾燥されたバイアル生成物
マンニトール溶液の調製：
滅菌ポリプロピレン瓶に１１．５２ｇのマンニトールおよび磁気撹拌子が入れられ、それに室温で１８５ｍＬの純水が加えられた。混合液は、マンニトールが完全に溶解されるまで室温で１０分間撹拌された。ｐＨが測定され、６．６であることが見出された。透明な溶液に対して、ｐＨを５．５に調整するために０．１規定の塩酸が一滴ずつ加えられた。液量は純水で２００ｍＬに調整され、ｐＨが測定され、５．７であることが見出された。溶液は０．２２ミクロンのフィルターを通して濾過され、タンパク質溶液を希釈するために直接使用された。
【００８３】
ｒｈＧＤＦ−５溶液のマンニトール溶液を用いた希釈：
ポリプロピレンフラスコに１４．４８ｍＬのｒｈＧＤＦ−５溶液が注意深く移され、そこに液量が１００ｍＬになるまでマンニトール溶液が注意深く加えられた。溶液は室温で１５分間撹拌された。タンパク質濃度を正確に計算するために、ＵＶ吸光係数が取得された。ＵＶの示度に基づいてさらにマンニトール溶液が加えられ、１１０ｍＬの溶液中に０．５ｍｇ／ｍＬの望ましいタンパク質濃度を得た。ｐＨが測定され、３．１であることが見出された。ＵＶの示度は０．４９８ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を示した。溶液は０．２２ミクロンのフィルターを通して濾過され、バイアルに分注するために直接使用された。
【００８４】
バイアルへの充填：１．１ｍＬのマンニトール／ｒｈＧＤＦ−５溶液が、５ｍＬのタイプ１フリントガラスバイアルに手動で分注され、凍結乾燥機への装填に先立って各々のバイアルはストッパーで部分的に閉じられた。凍結乾燥後、ストッパーは押し込まれ、圧着された。生成物は白色から灰白色のケークとして得られた。
【００８５】
表７ａ：２〜８℃における、ｒｈＧＤＦ−５（０．５ｍｇ／ｍＬ）にマンニトール（５０ｍｇ／ｍＬ）を加えたバイアルの安定性（実施例７）
【表１１】
【００８６】
表７ｂ：２５℃における、ｒｈＧＤＦ−５（０．５ｍｇ／ｍＬ）にマンニトール（５０ｍｇ／ｍＬ）を加えたバイアルの安定性（実施例７）
【表１２】
【００８７】
実施例８：グリシン−塩酸ｐＨ３．０緩衝液中でｒｈＧＤＦ−５（０．５ｍｇ／ｍＬ）にトレハロース（５０ｍｇ／ｍＬ）を加えた凍結乾燥されたバイアル生成物
トレハロース溶液の調製：
滅菌ポリプロピレン瓶に１２．１６ｇのトレハロース二水和物および磁気撹拌子が入れられ、それに室温で２００ｍＬの５ｍＭグリシン−塩酸緩衝液ｐＨ３．０が加えられた。溶液は、トレハロースが完全に溶解されるまで室温で撹拌された。トレハロース／グリシン溶液のｐＨは、３．１であった。溶液は０．２２ミクロンのフィルターを通して濾過され、タンパク質溶液を希釈するために直接使用された。
【００８８】
ｒｈＧＤＦ−５溶液のトレハロース溶液を用いた希釈：
ｒｈＧＤＦ−５原体の溶液が、分子量３０００のカットオフの膜を用いて、２〜８℃で一晩、５ｍＭグリシン−塩酸緩衝液に対して透析された。透析後、溶液は３．８ｍｇ／ｍＬにわずかに濃縮された。１４．４７ｍＬのｒｈＧＤＦ−５溶液が注意深くポリプロピレンフラスコに移され、そこに最終液量を１００ｍＬにするために、瓶を旋回しながらトレハロース−グリシン溶液がゆっくりと加えられた。溶液は、室温で１５分間、時折旋回された。ｐＨが測定され、３．０であることが見出された。ＵＶの示度に基づいてさらにトレハロース−グリシン溶液が加えられ、１１０ｍＬの溶液中に０．５ｍｇ／ｍＬの望ましいタンパク質濃度を得た。ｐＨが測定され、３．０であることが見出された。ＵＶの示度は０．５０７ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を示した。溶液は０．２２ミクロンのフィルターを通して濾過され、バイアルに分注するために直接使用された。
【００８９】
バイアルへの充填：１．１ｍＬのｒｈＧＤＦ−５／トレハロース溶液が、５ｍＬのタイプ１フリントガラスバイアルに手動で分注され、凍結乾燥機への装填に先立って各々のバイアルはストッパーで部分的に閉じられた。凍結乾燥後、ストッパーは押し込まれ、圧着された。生成物は白色から灰白色のケークとして得られた。
【００９０】
表８：グリシン−塩酸緩衝液ｐＨ３．０中でｒｈＧＤＦ−５（０．５ｍｇ／ｍＬ）にトレハロース（５０ｍｇ／ｍＬ）を加えたバイアルの安定性（実施例８）
【表１３】
【００９１】
実施例９：ｐＨ３．０のリン酸緩衝液中でｒｈＧＤＦ−５（０．５ｍｇ／ｍＬ）にトレハロース（５０ｍｇ／ｍＬ）を加えた凍結乾燥されたバイアル生成物
トレハロース溶液の調製：
滅菌ポリプロピレン瓶に１２．１６ｇのトレハロース二水和物および磁気撹拌子が入れられ、それに室温で２００ｍＬの５ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ３．０が加えられた。溶液は、トレハロースが完全に溶解されるまで室温で撹拌された。トレハロース／リン酸緩衝溶液のｐＨは、３．０であった。溶液は０．２２ミクロンのフィルターを通して濾過され、タンパク質溶液を希釈するために直接使用された。
【００９２】
ｒｈＧＤＦ−５溶液のトレハロース溶液を用いた希釈：
ｒｈＧＤＦ−５原体の溶液が、分子量３０００のカットオフの膜を用いて、２〜８℃で一晩、リン酸緩衝液に対して透析された。透析後、溶液は３．８ｍｇ／ｍＬにわずかに濃縮された。１４．４７ｍＬのｒｈＧＤＦ−５溶液が注意深くポリプロピレンフラスコに移され、そこに最終液量を１００ｍＬにするために、瓶を旋回しながらトレハロース／リン酸緩衝溶液がゆっくりと加えられた。溶液は、室温で１５分間、時折旋回された。ｐＨが測定され、３．０であることが見出された。ＵＶの示度に基づいてトレハロース／リン酸緩衝溶液が加えられ、１１０ｍＬの溶液中に０．５ｍｇ／ｍＬの望ましいタンパク質濃度を得た。ｐＨが測定され、３．０であることが見出された。ＵＶの示度は０．５０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を示した。溶液は０．２２ミクロンのフィルターを通して濾過され、バイアルに分注するために直接使用された。
【００９３】
バイアルへの充填：１．１ｍＬのｒｈＧＤＦ−５／トレハロース溶液が、５ｍＬのタイプ１フリントガラスバイアルに手動で分注され、凍結乾燥機への装填に先立って各々のバイアルはストッパーで部分的に閉じられた。凍結乾燥後、ストッパーは押し込まれ、圧着された。生成物は白色から灰白色のケークとして得られた。
【００９４】
表９：ｐＨ３．０のリン酸緩衝液中でｒｈＧＤＦ−５（０．５ｍｇ／ｍＬ）にトレハロース（５０ｍｇ／ｍＬ）を加えたバイアルの安定性（実施例９）
【表１４】
【００９５】
実施例１０：細分化されたコラーゲン円柱と２．５ｍｇのｒｈＧＤＦ−５および２５０ｍｇのトレハロース
トレハロース溶液の調製：
９．５６ｇのトレハロース二水和物が注意深く秤量され、滅菌ポリプロピレン瓶に移され、そこに室温で１４５ｍＬの純水が加えられ、透明な溶液が得られるまでゆっくりと撹拌された。透明なトレハロース溶液のｐＨが測定され、５．３であることが見出された。１５０ｍＬの最終液量をえるために、純水を用いて液量が調整された。溶液のｐＨが測定され、５．３であることが見出された。溶液は、タンパク質溶液を希釈するために直接使用された。
【００９６】
ｒｈＧＤＦ−５溶液のトレハロース溶液を用いた希釈：
１６．４５ｍＬのｒｈＧＤＦ−５溶液が注意深くポリプロピレンフラスコに移され、それに、液量を１２０ｍＬに調整するために、トレハロース溶液が注意深く加えられた。ｐＨが測定され、２．９であることが見出された。溶液は、室温で１５分間撹拌された。タンパク質濃度を正確に計算するために、ＵＶ吸光係数が取得された。ＵＶの示度に基づいて、さらにトレハロース溶液が加えられ、１２５ｍＬの溶液中に０．５ｍｇ／ｍＬの望ましいタンパク質濃度を得た。ｐＨが測定され、２．９であることが見出された。ＵＶの示度は０．４９８ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を示した。
【００９７】
ｒｈＧＤＦ−５／トレハロース溶液の細分化されたコラーゲン円柱への投与
溶液は０．２２ミクロンのフィルターを通して濾過され、溶液は、テフロン型中に詰められた、事前に形成された細分化されたコラーゲン円柱上に分注するために直接使用された。各々の円柱には、凍結乾燥に先立って５ｍＬのｒｈＧＤＦ−５／トレハロース溶液が投与された。
【００９８】
表１０：２〜８℃における、円柱あたりｒｈＧＤＦ−５（２．５ｍｇ）およびトレハロース（２５０ｍｇ）を用いた細分化されたコラーゲン円柱の安定性（実施例１０）
【表１５】
【００９９】
下記の表１１中のデータは、２〜８℃の試料のＲＰ−ＨＰＬＣ試験には遅い溶出ピークが存在するが、−２０℃の試料には存在しないことにより実証されているように、賦形剤を含まずにヒーロス（登録商標）上に分注され凍結乾燥されたｒｈＧＤＦ−５は、−２０℃では安定だが、２〜８℃では安定でないことを示す。
【０１００】
表１１：２〜８℃および−２０℃における、賦形剤を含まない５ｍＬのｒｈＧＤＦ−５（０．５ｍｇ／ｍＬ）を用いたヒーロス（登録商標）細片の安定性
【表１６】
【０１０１】
賦形剤および可溶性コラーゲンゲルを用いて流動性の細分化されたコラーゲン／ｒｈＧＤＦ−５を作成する異なった実施例が開発され、各々の実施例の性能、安定性および製造の容易さに関して評価された。
【０１０２】
細分化されたコラーゲン実施例１：
−細分化されたコラーゲン円柱とｒｈＧＤＦ−５が乾燥形態に凍結乾燥される
−湿潤形態のコラーゲンゲルは分離しておかれる
−双方は２〜８℃で別々の注入器中に分離しておかれる
−双方は注入に先立って混合される
【０１０３】
細分化されたコラーゲン実施例２：
−細分化されたコラーゲン円柱とｒｈＧＤＦ−５とコラーゲンゲルとが湿潤形態で混合される（凍結乾燥されない）
−全てが２〜８℃で一本の注入器中に湿潤形態でおかれ、使用可能な状態
【０１０４】
細分化されたコラーゲン実施例３：
−細分化されたコラーゲン円柱とｒｈＧＤＦ−５とコラーゲンゲルとが乾燥形態で凍結乾燥される
−全てが２〜８℃で一本の注入器中に乾燥形態で入れられる
−注入に先立って水で再水和する
【０１０５】
細分化されたコラーゲン実施例４：
−細分化されたコラーゲン円柱とコラーゲンゲルは共にペースト状
−ｒｈＧＤＦ−５は乾燥形態で分離しておかれる
−双方は２〜８℃で別々の注入器中に分離しておかれる
−双方は注入に先立って混合される
【０１０６】
細分化されたコラーゲン実施例５：
−細分化されたコラーゲン円柱とコラーゲンゲルは共に乾燥形態
−ｒｈＧＤＦ−５は乾燥形態で分離しておかれる
−双方は２〜８℃で別々の注入器中に分離しておかれる
−ｒｈＧＤＦ−５を滅菌水または骨髄穿刺液を用いて復元する
−注入に先立って、乾燥した細分化されたコラーゲンおよびコラーゲンは、復元されたｒｈＧＤＦ−５溶液と混合される
【０１０７】
緩衝剤および抗酸化剤の存在および非存在下で、マンニトール、スクロースおよびトレハロース等のいくつかの賦形剤を用いて、ｒｈＧＤＦ−５の安定性が、ＲＰ−ＨＰＬＣ、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）、円偏光二色性分光分析（ＣＤ）、偏光顕微鏡法（ＰＬＭ）、および生物学的検定の技術を使用して評価された。スクロースを含有する幾つかの凍結乾燥されたｒｈＧＤＦ−５の調合物は、保存の過程で望ましくない黄色およびガラス状ケーク構造を発生させたため、有望ではなかった。
【０１０８】
凍結乾燥されたｒｈＧＤＦ−５の調合物の融解挙動が、ＤＳＣを使用して研究された。ＤＳＣデータは、トレハロースおよびマンニトールに基づく調合物のどちらも、ｒｈＧＤＦ−５原体の熱安定性を大幅に改善することを示した。
【０１０９】
図１、図２および図３は、ｒｈＧＤＦ−５のトレハロース調合物およびマンニトール調合物のＤＳＣプロファイルの比較を、ｒｈＧＤＦ−５原体のＤＳＣプロファイルと比較して示す。ｒｈＧＤＦ−５原体は、２つの主要な転移を示し、一つは４０℃近傍であり、もう一つは８５℃近傍である。高温の転移はおそらくタンパク質の熱変性を表わしている。最初の吸熱転移の融解温度（Ｔｍ）が賦形剤の存在下で７〜１４℃増加していることは、興味深いことである。この点のみで考えた場合、この研究は、トレハロースおよびマンニトールの双方とも安定化剤として同様に効果的である可能性があることを示唆する。
【０１１０】
トレハロース／ｒｈＧＤＦ−５調合物のＰＬＭ（偏光顕微鏡法）は、図４に示されている。試料は主立った複屈折現象を示さない。したがって、系は非晶質であり、これは治療的応用に理想的である。図５は、保存期間の後のマンニトール／ｒｈＧＤＦ−５調合物のＰＬＭを示す。試料中には多くの結晶が観察され、保存の過程でマンニトールが結晶化したことを示している。この結果は、トレハロースがｒｈＧＤＦ−５に対するより良い溶解保護剤であることを示唆する。遠紫外ＣＤスペクトルは、トレハロースに基づく調合物が、天然タンパク質原体の二次構造分布に相当する二次構造分布を有することを明らかにした。
【０１１１】
様々な賦形剤と共に凍結乾燥されたｒｈＧＤＦ−５のＰＲ−ＨＰＬＣによるリアルタイムの安定性研究は、トレハロース存在下のｒｈＧＤＦ−５が、５０ｍｇ／ｍＬまたは１００ｍｇ／ｍＬの何れの濃度でも、緩衝剤が有っても無くても、また、ポリソルベートが有っても無くても、２〜８℃および１５〜２５℃の保存条件で一貫してｒｈＧＤＦ−５に改善された安定性を与えたことを明瞭に示した一方で、マンニトールは類似の保存条件下で同等のレベルの安定性を提供することができなかった。
【０１１２】
凍結乾燥されたケーク調合物のリアルタイム安定性研究は、室温および２〜８℃の保存条件で、主ピークが大幅に減少する一方で凝集ピークが増加することによって証明されるように、マンニトールはタンパク質を安定化しないことを明瞭に示した。凝集物は、免疫反応および副作用を引き起こす可能性があるため、タンパク質調合物の中で最も望ましくない種である。対照的に、トレハロースは、リアルタイム安定性研究に証明されるように、特に２〜８℃の保存条件で、凝集物の形成を阻害して主ピークを保護することによって、タンパク質を非常に良く安定化した。したがって、トレハロースは、調合物中でｒｈＧＤＦ−５を安定化することにおいてマンニトールよりも優れている。また、リアルタイム安定性データは、ｐＨを制御するための緩衝剤としてリン酸またはグリシンを有するｒｈＧＤＦ−５／トレハロース調合物が、緩衝剤を含まないｒｈＧＤＦ−５／トレハロース調合物よりもさらに優れていることを示す。リアルタイム安定性データは、ｒｈＧＤＦ−５／トレハロース／グリシン調合物の理想的な保存は２〜８℃であり、また、２５℃での保存も適切であることを示す。
【０１１３】
トレハロースに基づくｒｈＧＤＦ−５調合物の好ましい生化学的および生物物理的データに加えて、これらの調合物はまた、アルカリフォスファターゼの生物学的分析においても有効性を示した。分析の物理的化学的方法、生体外分析、およびリアルタイム安定性データは、様々な筋骨格疾病の治療における使用に対して、コラーゲンに基づいた組み合わせ生成物と同様に、凍結乾燥された単体生成物（stand-alone product）においてもｒｈＧＤＦ−５の安定化におけるトレハロースの優れた賦形剤としての見込みを示す。
【０１１４】
実施例１１：異なったイオン強度の溶液および２つのｐＨ緩衝液（ｐＨ３およびｐＨ４）中のｒｈＧＤＦ−５の溶解度
この研究においては、様々なイオン強度のリン酸ナトリウム緩衝溶液が使用された。タンパク質原体の溶液は、およそ１０ｍｇ／ｍＬに濃縮され、ｐＨ３またはｐＨ４の、５、１０、２５、５０および１００ｍＭのリン酸緩衝液を用いて透析された。透析後、試料は透明性を点検され、ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計上でタンパク質濃度が分析された。詳細な手順は下記に記載されている。
【０１１５】
緩衝液の調製
ｐＨ３の１００ｍＭリン酸緩衝液：
１３．５ｍＬの濃縮Ｈ３ＰＯ４（１４．８Ｍ）溶液が２０００ｍＬビーカーに移され、それに、１９００ｍＬの目盛りまで脱イオン水が加えられた。溶液は、ＮａＯＨ溶液でｐＨ３に滴定され、２０００ｍＬのメスシリンダーに移された。２０００ｍＬにするために追加の水が加えられた。内容物はビーカーに再び移され、十分に混合された。
【０１１６】
ｐＨ３の５０ｍＭリン酸緩衝液：
６．７６ｍＬの濃縮Ｈ３ＰＯ４（１４．８Ｍ）溶液が２０００ｍＬビーカーに移され、それに、１９００ｍＬの目盛りまで脱イオン水が加えられた。溶液は、ＮａＯＨ溶液でｐＨ３に滴定され、２０００ｍＬのメスシリンダーに移された。２０００ｍＬにするために追加の水が加えられた。内容物はビーカーに再び移され、十分に混合された。
【０１１７】
ｐＨ３の２５ｍＭリン酸緩衝液：
３．３９ｍＬの濃縮Ｈ３ＰＯ４（１４．８Ｍ）溶液が２０００ｍＬビーカーに移され、続いて１９００ｍＬの目盛りまで脱イオン水が加えられた。溶液はＮａＯＨ溶液でｐＨ３に滴定され、２０００ｍＬのメスシリンダーに移された。２０００ｍＬにするために追加の水が加えられた。内容物はビーカーに再び移され、十分に混合された。
【０１１８】
ｐＨ３の１０ｍＭリン酸緩衝液：
１．３５ｍＬの濃縮Ｈ３ＰＯ４（１４．８Ｍ）溶液が２０００ｍＬビーカーに移され、それに、１９００ｍＬの目盛りまで脱イオン水が加えられた。溶液はＮａＯＨ溶液でｐＨ３に滴定され、２０００ｍＬのメスシリンダーに移された。２０００ｍＬにするために追加の水が加えられた。内容物はビーカーに再び移され、十分に混合された。
【０１１９】
ｐＨ３の５ｍＭリン酸緩衝液：
０．６７６ｍＬの濃縮Ｈ３ＰＯ４（１４．８Ｍ）が２０００ｍＬビーカーに移され、続いて１９００ｍＬの目盛りまで脱イオン水が加えられた。溶液はＮａＯＨ溶液でｐＨ３に滴定され、２０００ｍＬのメスシリンダーに移された。２０００ｍＬにするために追加の水が加えられた。内容物はビーカーに再び移され、十分に混合された。
【０１２０】
試料調製
タンパク質原体ｒｈＧＤＦ−５（ロット番号２１４２１３１）が２〜８℃で解凍された。タンパク質原体溶液（３．８ｍｇ／ｍＬで２４ｍＬ）が、遠心濾過装置（ポールライフサイエンス社（Pall Life Science）、カタログ番号ＯＤ０１０Ｃ３７、分画分子量１０Ｋ（10K MWCO））を使用して、およそ６ｍＬの液量まで濃縮された。およそ０．９ｍＬの濃縮されたｒｈＧＤＦ−５溶液は、各々の透析カセット（ピアス社（Pierce）、カタログ番号６６３８０）に移され、室温で一晩、リン酸緩衝液に対して透析された。濃縮されたｒｈＧＤＦ−５溶液は、注意深く透析カセットから取り除かれ、溶液の透明性を点検するために小さなガラスバイアルに入れられた。ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計上で、分析手法の項に記載されているように、タンパク質濃度が決定された。
【０１２１】
ｐＨ４における溶解度
ｐＨ４．０の緩衝液は、ＮａＯＨ溶液をｐＨ３の緩衝液にさらに加えることによって、ｐＨ３の緩衝液から調製された。タンパク質溶液は、室温で一晩、ｐＨ４の緩衝液に対して透析された。試料は溶液の透明度およびタンパク質濃度を分析された。
【０１２２】
分析手法
小さなガラスバイアル中の溶液試料は、透明度および粒子に関して点検された。試料バイアルは黒色背景に対して垂直の光を使用して検査された。試験試料の透明度は、対照として純水試料と比較された。各々の溶液試料のｐＨは、較正されたｐＨメーターを使用して直接測定された。
【０１２３】
結果
１０ｍｇ／ｍＬのｒｈＧＤＦ−５溶液の溶解度研究の結果は、５、１０および２５ｍＭのリン酸ナトリウムのより低いイオン強度の緩衝液は、透明な溶液をもたらして良い溶解度を示す一方で、５０および１００ｍＭのリン酸ナトリウムのより高いイオン強度の緩衝液は、白濁した溶液をもたらして低い溶解度を示すことを表した。ｐＨ４では、５および１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液は白濁した溶液をもたらし、低い溶解度を示した。２５、５０および１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液は、遠心後に透明な溶液をもたらしたが、タンパク質の回収量はほとんどゼロであり、タンパク質が沈殿したことを示した。したがって、ｐＨ３近傍の低イオン強度の緩衝液は、より高いｐＨのより高いイオン強度の緩衝液よりも好ましい。
【０１２４】
実施例１２：５％トレハロースを含む様々な緩衝液中の様々な温度でのｒｈＧＤＦ−５の安定性
この研究では、凍結乾燥および５℃での保存の過程の５％トレハロース溶液中の０．７ｍｇ／ｍＬのｒｈＧＤＦ−５の保護に対する様々な緩衝液の影響に関して試験された。試験された緩衝液は、５ｍＭグリシン−塩酸ｐＨ３、５ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ３、５ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ３、１０ｍＭ乳酸ナトリウムｐＨ３、０．０１％ＴＦＡ水溶液、１ｍＭ塩酸、および、トレハロースを含まない１ｍＭ塩酸中のｒｈＧＤＦ−５の対照溶液である。緩衝液は以下のように調製された。
【０１２５】
５ｍＭグリシン緩衝液、ｐＨ３
２０００ｍＬビーカーに０．７５ｇのグリシン（分子量７５．０５）および１９００ｍＬの脱イオン水が入れられ、溶液は撹拌しながら塩酸溶液でｐＨ３に滴定された。２０００ｍＬにするために追加の水が加えられ、十分に混合された。
【０１２６】
５ｍＭクエン酸緩衝液、ｐＨ３
２０００ｍＬビーカーに２．１１ｇのクエン酸一水和物（分子量２１０．１４）および１９００ｍＬの脱イオン水が入れられ、溶液は水酸化ナトリウム（ＮａＣｌ）溶液でｐＨ３に滴定された。２０００ｍＬにするために追加の水が加えられ、溶液は混合された。
【０１２７】
５ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ３
０．６７６ｍＬのリン酸溶液（１４．８Ｍ）が１９００ｍＬの脱イオン水を含む２０００ｍＬビーカーに移され、溶液は水酸化ナトリウム溶液でｐＨ３に滴定された。２０００ｍＬにするために追加の水が加えられ、溶液は十分に混合された。
【０１２８】
１０ｍＭ乳酸緩衝液、ｐＨ３
２０００ｍＬサイズのビーカーに１．８１ｇの乳酸（分子量９０．０８）および１９００ｍＬの脱イオン水が入れられ、得られた溶液は水酸化ナトリウム溶液でｐＨ３に滴定された。２０００ｍＬにするために追加の水が加えられ、溶液は十分に混合された。
【０１２９】
１ｍＭ塩酸溶液
１ｍＬの２規定塩酸溶液が１９００ｍＬの脱イオン水を含む２０００ｍＬビーカーに移された。溶液の最終液量は、さらに脱イオン水を加えることによって２０００ｍＬの目盛りに調整された。
【０１３０】
０．０１％ＴＦＡ溶液
０．２ｍＬのＴＦＡ溶液が１９００ｍＬの脱イオン水を含む２０００ｍＬビーカーに移された。溶液の最終液量は、追加の水を加えることによって２０００ｍＬに調整され、溶液は十分に混合された。
【０１３１】
調合物の調製
タンパク質原体ｒｈＧＤＦ−５（ロット番号２１４２１３１）が２〜８℃で解凍された。タンパク質原体溶液（３．８ｍｇ／ｍＬで５５ｍＬ）が、遠心濾過装置（ポールライフサイエンス社、カタログ番号ＯＤ０１０Ｃ３７、分画分子量１０Ｋ）を使用して、およそ１０ｍＬの液量まで濃縮された。およそ１．４ｍＬの濃縮されたｒｈＧＤＦ−５溶液は、各々の透析カセット（ピアス社、カタログ番号６６３８０）に移され、カセットは２〜８℃で一晩、試験緩衝液に対して透析された。
【０１３２】
ｒｈＧＤＦ−５溶液は、注意深く透析カセットから取り除かれ、小さなガラス瓶に移された。ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計を使用して、溶液のタンパク質濃度が測定された。タンパク質は、およそ０．７ｍｇ／ｍＬの割合で試験緩衝液中に５％（質量／体積）トレハロースと共に調合され、０．２２μｍのフィルターを通して濾過された。溶液は、凍結乾燥に先立って、２〜８℃で保存された。
【０１３３】
充填および凍結乾燥
各々の調合溶液は、３ｍＬのガラスバイアル（ウエスト製薬サービス（West Pharmaceutical Services）、カタログ番号６８０００３１６）に、１ｍＬ／バイアルで充填された。バイアルはストッパー（ウエスト製薬サービス、カタログ番号９９１５０６３０）で部分的に閉じられ、凍結乾燥機（ＦＴＳシステム社、LyoStar II）に移された。凍結乾燥過程をモニターするために、熱電対が偽バイアル内に置かれた。対照として、トレハロースを含まない別の調合物もまた試験された。４．５ｍｇ／ｍＬのｒｈＧＤＦ−５を含む１ｍＭ塩酸溶液２００μＬが、各々のガラスバイアルに移され、凍結乾燥された。
【０１３４】
分析手法
凍結乾燥ケークの完全性
凍結乾燥された試料は、各々の時点で、凍結乾燥されたケークのひび割れ、収縮および崩壊について点検された。
【０１３５】
復元時間
１ｍＬの脱イオン水が、各々の凍結乾燥された試料に加えられ、穏やかに混合された。復元時間が記録された。
【０１３６】
溶液の透明性−外観
小さなガラスバイアル中の溶液試料は、透明性および粒子に関して点検された。試料バイアルは、黒色背景に対して垂直の光を使用して検査された。試験試料の透明度は、対照として純水試料と比較された。
【０１３７】
ｐＨ方法
各々の溶液試料のｐＨは、較正されたｐＨメーターを使用して直接測定された。
【０１３８】
ＵＶ分光法
タンパク質濃度は、ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計を使用して決定された。ｒｈＧＤＦ−５の濃度は、２８０ｎｍにおける１．１６ｍＬ／ｍｇ×ｃｍの吸光係数を使用して計算された。
【０１３９】
ＨＰＬＣ法
非還元ｒｐＨＰＬＣ法（商標 ００５１ Ｄ）が、タンパク質の修飾された種をモニターするために使用された。試験試料は、５０ｍＭ酢酸を用いておよそ０．１ｍｇ ｒｈＧＤＦ−５／ｍＬの溶液に希釈された。希釈された試料（各々が５０μＬ）は、ＨＰＬＣカラム（Vydac ２１８ＴＰ５２、Ｃ１８カラム）に注入された。試料は、０．１５％（体積／体積）ＴＦＡを含む水および０．１５％（体積／体積）ＴＦＡを含むアセトニトリルを移動相として、０．３ｍＬ／分で溶出された。溶出されたピークは２１４ｎｍで検出された。各々のピーク面積の割合を計算して、主ピークおよび微小ピーク（分解ピーク）の変化をモニターした。
【０１４０】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
タンパク質の凝集物が、ＳＥＣ法を使用してモニターされた。典型的には、各々の試験試料の３０μＬがＳＥＣカラム（ＴＯＳＯＨバイオサイエンス社（TOSOH Bioscience）、カタログ番号 ０８５４０）に直接注入され、０．１％（体積／体積）ＴＦＡおよび４５％（体積／体積）アセトニトリルを含む水を用いて０．５ｍＬ／分の速度で溶出された。タンパク質のピークは２８０ｎｍでモニターされ、凝集の割合が計算された。
【０１４１】
ゲル電気泳動
タンパク質の凝集物および分解された小片も、ゲル電気泳動法を使用してモニターされた。典型的には、およそ１０μｇのタンパク質が乾燥され、１０％β−メルカプトエタノールを含むか、または含まない７０μＬのＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液（インビトロジェン社（Invitrogen）、カタログ番号ＬＣ２６７６）を用いて復元された。試料は９５℃で５分間インキュベートされた。各々の試料のおよそ１８μＬがゲル（インビトロジェン社、カタログ番号ＮＰ０３４１Ｂｏｘ）に供給された。ゲルは、ランニング緩衝液（インビトロジェン社、カタログ番号ＮＰ０００２）を使用して、２００ボルトで約３５分間泳動された。ゲルは、次にSimplyblue溶液（インビトロジェン社、カタログ番号ＬＣ６０６０）を用いて染色され、脱イオン水を用いて脱色された。ゲルは、走査され、画像が収集された。
【０１４２】
生物活性分析
６ヶ月における安定性試料（グリシン調合物および塩酸調合物）だけが生物活性について分析された。細胞に基づいた分析（商標 ００４６）を使用し、試料の安定性を決定するためにアルカリフォスファターゼ活性を測定した。
【０１４３】
水分含有量
含水量分析が、カールフィッシャー滴定法を使用してＰＤＤによって行われた。
【０１４４】
結果
凍結乾燥されたケークの完全性
全ての保存条件の試験試料ケークは、時間ゼロから９ヶ月の時点まで、固体および白から灰白色の外観を呈した。トレハロースまたはスクロース等の糖が充填剤として使用される際に通常観察されるように、ケークの周囲にわずかな収縮が観察されるか、あるいは、ケークはバイアルのガラス壁からわずかに離れていた。全ての試験試料でケークの崩壊は無かった。通常、ケークの崩壊は、復元時間を変化させ、タンパク質の不安定性につながる可能性がある。トレハロースの存在しない調合物では、白色で、ふわふわした軽いケークが得られた。
【０１４５】
復元時間
試験時には、１ｍＬの水が各々の試料バイアルに加えられた。試料は穏やかに混合され、復元時間が記録された。ケークの溶解が完了するためには、およそ３０秒〜４０秒が必要とされた。
【０１４６】
溶液の透明性
復元された溶液試料は、黒色背景上で垂直の光の下で検査され、全ての試験試料は透明および無色であることが見出された。
【０１４７】
ｐＨ
復元された溶液のｐＨが、較正されたｐＨメーターを使用して測定された。研究の過程を通して、全ての調合物に渡って大幅なｐＨ値の変化は無かった。トレハロース／緩衝剤を含む調合物試料のｐＨは、３．０±０．２付近であった。トレハロースを含まない調合物のｐＨは約４．０であった。
【０１４８】
ＵＶ分光法
タンパク質濃度は、ＵＶ−ＶＩＳ分光光度計上で測定された。研究を通して、グリシン緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、乳酸緩衝液または０．０１％ＴＦＡを含むｒｈＧＤＦ−５／トレハロース調合物のタンパク質濃度に大幅な変化は無かった。２８０ｎｍでの吸光度は、２５℃／６０％および４０℃／７５％相対湿度で保存された場合、ｒｈＧＤＦ−５／トレハロース／塩酸調合物において増加した。タンパク質の濃度は、４０℃で保存された調合物で増加していたように見えた。時間ゼロでの０．７ｍｇ／ｍＬの初期タンパク質濃度は、６ヶ月の時点で１ｍｇ／ｍＬに増加した。これは、トレハロースが、２８０ｎｍで類似の吸光度を有するフルフラール化合物に分解した可能性を意味すると思われる。
【０１４９】
非還元ｒｈＨＰＬＣの結果
非還元ｒｈＨＰＬＣ法を使用して、メチオニンの酸化、脱アミド反応および他の反応によって形成されるｒｈＧＤＦ−５の分解種をモニターした。塩酸調合物およびトレハロースを含まない調合物を除いて、２〜８℃および２５℃で９ヶ月間保存された全ての調合物について、主ピークの割合に大幅な変化は無かった。両調合物は、９ヶ月の時点で、主ピークは９０％より少なかった。
【０１５０】
しかし、調合物が、４０℃／７５％相対湿度等の促進された保存条件で保存された場合、一つの調合物（すなわち、ｒｈＧＤＦ−５／トレハロース／グリシン）だけが、６ヶ月の時点で主ピークは９１％より多かった。促進された保存条件下では、他の調合物はｒｈＧＤＦ−５／トレハロース／グリシン調合物ほど安定ではなかった。特に、ｒｈＧＤＦ−５／トレハロース／塩酸調合物は、６ヶ月の時点で主ピークは６６％しかなかった。図６および図７は、４０℃／７５％相対湿度で６ヶ月保存された、ｒｈＧＤＦ−５／トレハロース／グリシン調合物およびｒｈＧＤＦ−５／トレハロース／塩酸調合物のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図８、図９、および図１０は、５℃、２５℃、および４０℃での保存を試験された様々な緩衝液のタンパク質回収割合（％）を示す。
【０１５１】
ｒｐＨＰＬＣ分析の結果は、トレハロースとグリシン緩衝液の組み合わせが、保存の過程で、凍結乾燥されたｒｈＧＤＦ−５に最良の安定性を提供することを示す。さらに、塩酸の強酸が、タンパク質およびトレハロース双方に対して不安定化の効果を有する可能性があるため、ｒｈＧＤＦ−５／トレハロース／塩酸の調合物は、より不安定である。
【０１５２】
実施例１３：５％トレハロースを含むｐＨ３グリシン緩衝液中の様々な温度でのｒｈＧＤＦ−５の安定性
この研究では、ｒｈＧＤＦ−５は、５％（質量／体積）トレハロースおよびｐＨ３の５ｍＭグリシン−塩酸緩衝液に、およそ０．０１、０．０３、０．１、２．５、４．５および９ｍｇ／ｍＬで調合された。調合溶液を用いて、１ｍＬ／バイアルの割合で３ｍＬガラスバイアルに充填され、バイアルは凍結乾燥された。凍結乾燥された試料バイアルは、２〜８℃、２５℃／６０％相対湿度、および、４０℃／７５％相対湿度で保存された。各々の設定された時点で、試料は、生成物の安定性について分析された。この研究で使用された方法は、ケーク外観、復元時間、溶液透明度、ｐＨ、ｒｐＨＰＬＣ（逆相高速液体クロマトグラフィー）、ＵＶ（紫外分光法）、ＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）およびゲル電気泳動を含む。３つの保存条件での６ヶ月の保存の後、下は０．１ｍｇ／ｍＬから上は０．９ｍｇ／ｍＬまでのタンパク質濃度で、調合物に大幅な変化は観察されなかったことが見出された。０．０１および０．０３ｍｇ／ｍＬ等の、タンパク質濃度が低すぎた場合、既存の方法は、微小な変化を検出するのに十分強力ではなかった。
【０１５３】
この研究の結果は、様々なタンパク質濃度で、トレハロースおよびグリシン−塩酸を含む凍結乾燥ｒｈＧＤＦ−５調合物は、２〜８℃、２５℃／６０％相対湿度で少なくとも６ヶ月間安定であったことを示す。４０℃／７５％相対湿度の促進された保存条件で保存された生成物に、６ヶ月の時点で、ｒｐＨＰＬＣプロファイルのわずかな変化が見られた。
【０１５４】
実施例１４：５％トレハロースを含むｐＨ３グリシン緩衝液中の様々な温度での異なった濃度のｒｈＧＤＦ−５の安定性
この研究では、ｒｈＧＤＦ−５は、５％（質量／体積）トレハロースおよびｐＨ３の５ｍＭグリシン緩衝液に、０．０１、０．０３、０．１、２．５、４．５および９．０ｍｇ／ｍＬのｒｈＧＤＦ−５濃度で調合された。さらに、比較のために、４．５ｍｇ／ｍＬのｒｈＧＤＦ−５の一つの調合物が、１０％（質量／体積）トレハロースおよび５ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ３）を用いて調製された。調合溶液は次に、１ｍＬ／バイアルの割合で３ｍＬガラスバイアルに充填され、凍結乾燥された。凍結乾燥された試料は、安定チャンバ（stability chamber）に保存された。
【０１５５】
５ｍＭグリシン−塩酸緩衝液、ｐＨ３
３×０．７５ｇのグリシン（分子量７５．０７）が、３個の２０００ｍＬビーカーに秤量され、およそ１９００ｍＬの脱イオン水が各々のビーカーに加えられた。溶液は、塩酸溶液を用いてｐＨ３に滴定された。各々のビーカーに、２０００ｍＬの最終液量にするために追加の水が加えられ、十分に混合された。
【０１５６】
調合物調製
タンパク質原体ｒｈＧＤＦ−５（ロット番号２１４２１３１）が２〜８℃で解凍された。タンパク質溶液（３．８ｍｇ／ｍＬで９６ｍＬ）が、４つの遠心濾過装置（ポールライフサイエンス社、カタログ番号ＯＤ０１０Ｃ３７、分画分子量１０Ｋ）を使用して、全てを含めた合計液量がおよそ２４ｍＬになるまで濃縮された。およそ３×８ｍＬの濃縮されたｒｈＧＤＦ−５溶液は、３つの透析カセット（ピアス社、カタログ番号６６３８０）に移され、２〜８℃で一晩、グリシン−塩酸緩衝液に対して透析された。
【０１５７】
ｒｈＧＤＦ−５溶液は、透析カセットから小さなガラス瓶に移された。ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計を使用して、タンパク質濃度が測定された。タンパク質は、上に記載されたように、５％または１０％（質量／体積）トレハロースおよび５ｍＭグリシン緩衝液に、様々な濃度で調合された。調合溶液は、０．２２μｍのフィルターを用いて濾過され、凍結乾燥に先立って、２〜８℃で保存された。
【０１５８】
充填および凍結乾燥
各々の調合溶液は、３ｍＬのガラスバイアル（ウエスト製薬サービス、カタログ番号６８０００３１６）に、１ｍＬ／バイアルの割合で充填された。ストッパー（ウエスト製薬サービス、カタログ番号９９１５０６３０）が、バイアル上に部分的に置かれた。試料バイアルは、凍結乾燥機（ＦＴＳシステム社、LuoStar II）に移された。凍結乾燥過程の温度プロファイルをモニターするために、熱電対が偽バイアル内に置かれた。
【０１５９】
使用された分析方法は、実施例１１および実施例１２中で上記されたものと同様である。
【０１６０】
結果
凍結乾燥されたケークの完全性
全ての保存条件の試料ケークは、時間ゼロから６ヶ月の時点まで固体および白色の外観を呈した。ケークの周囲にわずかな収縮が観察されるか、または、ケークはバイアルのガラス壁からわずかに離れていた。これは、トレハロースまたはスクロース等の糖が充填剤として使用される場合にきわめてよく起こる。全ての試験試料でケークの崩壊は見られなかった。
【０１６１】
復元時間
試験時には、１ｍＬの水が各々の試料バイアルに加えられた。バイアルは穏やかに混合され、復元時間が記録された。ケークが溶解するためには、およそ３０秒〜４０秒かかった。
【０１６２】
溶液の透明性
タンパク質溶液が黒色背景に対して垂直の光を用いて検査された場合、全ての復元試料は透明および無色の外観を呈した。
【０１６３】
ｐＨ
復元された溶液が、ｐＨを測定するために使用された。研究の過程を通して、全ての試料に大幅なｐＨの変化は観察されなかった。調合物のｐＨ値は、３．０〜３．３の範囲内であった。
【０１６４】
ＵＶ分光法
ＵＶ分光法を使用して、タンパク質濃度が測定された。ＵＶスペクトルはまた、タンパク質の凝集に関する情報（ベースライン光散乱）も提供することができた。０．０１〜０．１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度に対しては、１０ｍｍキュベットが使用された。２〜９ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度に対しては、希釈せずまたは試料を破壊すること無く、１ｍｍキュベットが使用された。安定性研究の過程を通じて、０．１〜９ｍｇ／ｍＬの試料にタンパク質濃度の大幅な変化は観察されなかった。０．０１および０．０３ｍｇ／ｍＬの低濃度試料に対しては、吸光度が低すぎたために、より変動が見られた。将来の研究として、低濃度試料のために、新たな試料調製方法が必要とされるべきである。
【０１６５】
非還元ｒｈＨＰＬＣの結果
非還元ｒｈＨＰＬＣ法を用いて、メチオニンの酸化および脱アミド等のｒｈＧＤＦ−５の分解種をモニターした。２〜８℃、２５℃および４０℃で６ヶ月間の保存を通して全ての試料において、主ピークの割合の大幅な変化は観測されなかった。６ヶ月間保存された試料のｒｈＧＤＦ−５の主ピークは、依然として９６％以上回収され、これは時間ゼロの試料から得られたデータに匹敵していた。０．０１および０．０３ｍｇ／ｍＬの低濃度試料は、ＨＰＬＣ法によって分析することが困難であった。将来の研究のために新たな試料調製が必要とされるべきである。
【０１６６】
ＳＥＣ
タンパク質の凝集をモニターするために、ＳＥＣが使用された。６ヶ月の安定性研究を通して試験された全ての試料の凝集に、大幅な変化は見出されなかった。０．０１および０．０３ｍｇ／ｍＬの低濃度試料は分析されなかった。
【０１６７】
ゲル電気泳動
タンパク質の凝集および分解種もゲル電気泳動法を使用してモニターされた。６ヶ月の保存を通して全ての試料に大幅な変化は見出されなかった。
【０１６８】
タンパク質の断片は、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで発見されなかったことから、保存の過程でどの試料にも形成されなかった。
【０１６９】
水分含有量
試料の水分含有量は低く、０．１９〜０．３２％の範囲であった。タンパク質濃度と水分含有量との間には、相関または傾向は見られなかった。
【０１７０】
ｒｐＨＰＬＣおよびＳＥＣクロマトグラフィーによって証明されるように、結果は、トレハロースおよびグリシン緩衝液存在下の凍結乾燥されたｒｈＧＤＦ−５生成物が、２〜８℃、２５℃／６０％相対湿度、および、４０℃／７５％相対湿度で少なくとも６ヶ月間安定であることを示す。タンパク質は、０．１〜９ｍｇ／ｍＬ（凍結乾燥前）の範囲の様々な濃度で、５％（質量／体積）トレハロース／５ｍＭグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ３）を用いて調合することができ、凍結乾燥することができる。タンパク質が、０．０１ｍｇ／ｍＬおよび０．０３ｍｇ／ｍＬ等の低濃度で調合された場合、既存の方法は変化を検出することにいくつかの限界を有する。
【０１７１】
本発明は、実例となる実施形態に関連して記載されてきた。本発明の範囲を逸脱すること無く上記の調合物にある種の変更が行われてよいため、上記の記載に含まれるか、または添付の図に示される全ての事柄は、限定的な意味ではなく実例として解釈されるべきであることが意図される。例えば、本発明の説明に役立つ実施形態の調合物は、ＢＭＰと共に使用されることに限定されず、あらゆる適切な生物系についての他の生体分子と共に使用できることを、当業者は認識するであろう。
【０１７２】
特許請求の範囲は、本明細書に記載される発明の包括的および特定的な特徴全て、ならびに、文言上その範囲にあると言ってよい発明の範疇についての主張の全てを網羅することを意図したものであることもまた理解されるべきである。
【０１７３】
〔実施の態様〕
（１）組成物において、
少なくとも一種のＢＭＰと、
前記ＢＭＰを安定化するために十分な量のトレハロースと、
を含む、組成物。
（２）実施態様１に記載の組成物において、
約２．５〜約３．５のｐＨを有するグリシン緩衝溶液、
をさらに含む、組成物。
（３）実施態様１に記載の組成物において、
前記ＢＭＰが、ｒｈＧＤＦ−５である、組成物。
（４）実施態様２に記載の組成物において、
前記ＢＭＰが、ｒｈＧＤＦ−５である、組成物。
（５）ＢＭＰを安定化するための方法において、
ａ）少なくとも一種のＢＭＰおよび前記ＢＭＰを安定化するために十分な量のトレハロースを含む組成物を提供することと、
ｂ）前記混合物を凍結乾燥することと、
を含む、方法。
（６）実施態様５に記載の方法において、
約２．５〜約３．５のｐＨを有するグリシン緩衝溶液を加えること、
をさらに含む、方法。
（７）実施態様５または実施態様６に記載の方法において、
前記ＢＭＰが、ｒｈＧＤＦ−５である、方法。
（８）哺乳動物に植え込むための装置において、
少なくとも一種の凍結乾燥ＢＭＰであって、実施態様５に記載の方法にしたがって凍結乾燥された、少なくとも一種の凍結乾燥ＢＭＰ、
を含む、装置。
（９）実施態様８に記載の装置において、
生物分解性のコラーゲン基質、
をさらに含む、装置。
（１０）実施態様８に記載の装置において、
前記ＢＭＰが、ｒｈＧＤＦ−５である、装置。
（１１）哺乳動物に植え込むための装置において、
少なくとも一種の凍結乾燥されたＢＭＰであって、実施態様６に記載の方法にしたがって凍結乾燥された、少なくとも一種の凍結乾燥ＢＭＰ、
を含む、装置。
（１２）実施態様１１に記載の装置において、
生物分解性のコラーゲン基質、
をさらに含む、装置。
（１３）実施態様１１に記載の装置において、
前記ＢＭＰが、ｒｈＧＤＦ−５である、装置。
【図面の簡単な説明】
【０１７４】
【図１】図１は、実施例６に記載されている、ｒｈＧＤＦ−５のトレハロース調合物のＤＳＣプロファイルを示す。
【図２】図２は、実施例７に記載されている、ｒｈＧＤＦ−５のマンニトール調合物のＤＳＣプロファイルを示す。
【図３】図３は、ｒｈＧＤＦ−５天然タンパク質のＤＳＣプロファイルを示す。
【図４】図４は、実施例６に記載されている、ｒｈＧＤＦ−５のトレハロース調合物の偏光顕微鏡検査を示す。
【図５】図５は、実施例７に記載されている、ｒｈＧＤＦ−５のマンニトール調合物の偏光顕微鏡検査を示す。
【図６】図６は、実施例１２に記載されている、４０℃／７５％相対湿度で６ヶ月後のｒｈＧＤＦ−５／トレハロース／グリシン調合物のｒｐＨＰＬＣプロファイルを示す。
【図７】図７は、実施例１２に記載されている、４０℃／７５％相対湿度で６ヶ月後のｒｈＧＤＦ−５／トレハロース／塩酸調合物のｒｐＨＰＬＣのプロファイルを示す。
【図８】図８は、実施例１２に記載されている、５℃で保存した場合の、試験された各種緩衝液の各種時点でのタンパク質回収率（％）を示す。
【図９】図９は、実施例１２に記載されている、２５℃で保存した場合の、試験された各種緩衝液の各種時点でのタンパク質回収率（％）を示す。
【図１０】図１０は、実施例１２に記載されている、４０℃で保存した場合の、試験された各種緩衝液の各種時点でのタンパク質回収率（％）を示す。
【図１１】図１１は、実施例１４に記載されている、ｐＨ３グリシン緩衝液中、５％または１０％トレハロースで凍結乾燥された、各種濃度のｒｈＧＤＦ−５の、選択された温度での安定性を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組成物において、
少なくとも一種のＢＭＰと、
前記ＢＭＰを安定化するために十分な量のトレハロースと、
を含む、組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物において、
約２．５〜約３．５のｐＨを有するグリシン緩衝溶液、
をさらに含む、組成物。
【請求項３】
請求項１に記載の組成物において、
前記ＢＭＰが、ｒｈＧＤＦ−５である、組成物。
【請求項４】
請求項２に記載の組成物において、
前記ＢＭＰが、ｒｈＧＤＦ−５である、組成物。
【請求項５】
ＢＭＰを安定化するための方法において、
ａ）少なくとも一種のＢＭＰおよび前記ＢＭＰを安定化するために十分な量のトレハロースを含む組成物を提供することと、
ｂ）前記混合物を凍結乾燥することと、
を含む、方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法において、
約２．５〜約３．５のｐＨを有するグリシン緩衝溶液を加えること、
をさらに含む、方法。
【請求項７】
請求項５または請求項６に記載の方法において、
前記ＢＭＰが、ｒｈＧＤＦ−５である、方法。
【請求項８】
哺乳動物に植え込むための装置において、
少なくとも一種の凍結乾燥ＢＭＰであって、請求項５に記載の方法にしたがって凍結乾燥された、少なくとも一種の凍結乾燥ＢＭＰ、
を含む、装置。
【請求項９】
請求項８に記載の装置において、
生物分解性のコラーゲン基質、
をさらに含む、装置。
【請求項１０】
請求項８に記載の装置において、
前記ＢＭＰが、ｒｈＧＤＦ−５である、装置。
【請求項１１】
哺乳動物に植え込むための装置において、
少なくとも一種の凍結乾燥されたＢＭＰであって、請求項６に記載の方法にしたがって凍結乾燥された、少なくとも一種の凍結乾燥ＢＭＰ、
を含む、装置。
【請求項１２】
請求項１１に記載の装置において、
生物分解性のコラーゲン基質、
をさらに含む、装置。
【請求項１３】
請求項１１に記載の装置において、
前記ＢＭＰが、ｒｈＧＤＦ−５である、装置。
【請求項１】
組成物において、
少なくとも一種のＢＭＰと、
前記ＢＭＰを安定化するために十分な量のトレハロースと、
を含む、組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物において、
約２．５〜約３．５のｐＨを有するグリシン緩衝溶液、
をさらに含む、組成物。
【請求項３】
請求項１に記載の組成物において、
前記ＢＭＰが、ｒｈＧＤＦ−５である、組成物。
【請求項４】
請求項２に記載の組成物において、
前記ＢＭＰが、ｒｈＧＤＦ−５である、組成物。
【請求項５】
ＢＭＰを安定化するための方法において、
ａ）少なくとも一種のＢＭＰおよび前記ＢＭＰを安定化するために十分な量のトレハロースを含む組成物を提供することと、
ｂ）前記混合物を凍結乾燥することと、
を含む、方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法において、
約２．５〜約３．５のｐＨを有するグリシン緩衝溶液を加えること、
をさらに含む、方法。
【請求項７】
請求項５または請求項６に記載の方法において、
前記ＢＭＰが、ｒｈＧＤＦ−５である、方法。
【請求項８】
哺乳動物に植え込むための装置において、
少なくとも一種の凍結乾燥ＢＭＰであって、請求項５に記載の方法にしたがって凍結乾燥された、少なくとも一種の凍結乾燥ＢＭＰ、
を含む、装置。
【請求項９】
請求項８に記載の装置において、
生物分解性のコラーゲン基質、
をさらに含む、装置。
【請求項１０】
請求項８に記載の装置において、
前記ＢＭＰが、ｒｈＧＤＦ−５である、装置。
【請求項１１】
哺乳動物に植え込むための装置において、
少なくとも一種の凍結乾燥されたＢＭＰであって、請求項６に記載の方法にしたがって凍結乾燥された、少なくとも一種の凍結乾燥ＢＭＰ、
を含む、装置。
【請求項１２】
請求項１１に記載の装置において、
生物分解性のコラーゲン基質、
をさらに含む、装置。
【請求項１３】
請求項１１に記載の装置において、
前記ＢＭＰが、ｒｈＧＤＦ−５である、装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２００８−２３１０９１（Ｐ２００８−２３１０９１Ａ）
【公開日】平成２０年１０月２日（２００８．１０．２）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２００７−３２２１７６（Ｐ２００７−３２２１７６）
【出願日】平成１９年１２月１３日（２００７．１２．１３）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．テフロン
【出願人】（５０７３２４１１９）ジョンソン・アンド・ジョンソン・リジェネレイティブ・セラピューティックス・エルエルシー (4)
【氏名又は名称原語表記】Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， ＬＬＣ
【住所又は居所原語表記】３２５ Ｐａｒａｍｏｕｎｔ Ｄｒｉｖｅ， Ｒａｙｎｈａｍ， ＭＡ ０２７６７， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１０月２日（２００８．１０．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−３２２１７６（Ｐ２００７−３２２１７６）
【出願日】平成１９年１２月１３日（２００７．１２．１３）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．テフロン
【出願人】（５０７３２４１１９）ジョンソン・アンド・ジョンソン・リジェネレイティブ・セラピューティックス・エルエルシー (4)
【氏名又は名称原語表記】Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， ＬＬＣ
【住所又は居所原語表記】３２５ Ｐａｒａｍｏｕｎｔ Ｄｒｉｖｅ， Ｒａｙｎｈａｍ， ＭＡ ０２７６７， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
【Ｆターム（参考）】
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