タンパク質生成におけるまたはそれに関する改善
本発明は、形質転換されたコケ植物、酵母、繊毛虫類または藻類細胞中などの非動物真核生物の細胞中において、異種のグリコシル化タンパク質を生成する方法に関する。特に本方法は、ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）細胞などのコケ植物細胞中で、例えばヒトなどの哺乳類で使用するための医薬品タンパク質などのシアル酸残基を含んでなる動物グリコシル化パターンを含んでなる、グリコシル化タンパク質を生成する方法、そのために必要なＤＮＡおよびＲＮＡなどの遺伝物質、ベクター、宿主細胞、その中に遺伝物質を導入する方法、およびその使用に関する。さらに本発明は、本発明の方法に従って得られる新規のポリペプチドおよびタンパク質に関する。さらに本発明は、形質転換された非哺乳類真核生物の細胞、組織または生物中で、シアル酸またはＣＭＰ−シアル酸を生成する方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、形質転換されたコケ植物、酵母、繊毛虫類または藻類細胞中などの非動物真核生物の細胞中において、異種のグリコシル化タンパク質を生成する方法に関する。特に本方法は、ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）細胞などのコケ植物細胞中で、例えばヒトなどの哺乳類で使用するための医薬品タンパク質などのシアル酸残基を含んでなる動物グリコシル化パターンを含んでなる、グリコシル化タンパク質を生成する方法、そのために必要なＤＮＡおよびＲＮＡなどの遺伝物質、ベクター、宿主細胞、その中に遺伝物質を導入する方法、およびその使用に関する。さらに本発明は、本発明の方法に従って得られる新規のポリペプチドおよびタンパク質に関する。さらに本発明は、形質転換された非哺乳類真核生物の細胞、組織または生物中で、シアル酸またはＣＭＰ−シアル酸を生成する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
植物は、広範な組み換えタンパク質の生成に適した生物である（マー（Ｍａ）ら、Ｎａｔ Ｇｅｎ ４、７９４〜８０５頁、２００３年）。ヒトをはじめとする哺乳類で使用するための医薬品タンパク質に関しては、グリコシル化などの翻訳後修飾が必要とされることが多い。しかし例えばヒトにおいて医薬品として使用される予定のタンパク質配列生成に適した異種性遺伝子で形質転換された真核生物細胞系中では、次のような問題に遭遇する。このようなタンパク質上のグリコシル化パターンは天然パターン、すなわちその中にタンパク質が導入された真核生物の細胞系のパターンを獲得することが多く、非動物の、すなわち例えば非哺乳類のグリコシル化パターンを含んでなるグリコシル化タンパク質が生成され、次にこれらは例えばヒトのような哺乳類などの動物で適用すると、免疫原性および／またはアレルゲン性であるかもしれない。
【０００３】
哺乳類由来糖タンパク質と比べて、植物特異的糖タンパク質は２つの追加的な残基を含有する。過去には、植物によって生成された組み換え糖タンパク質の用途は、このようなタンパク質上に獲得される植物特異的Ｎ−グリコシル化によって制限された。コケ植物の場合はコプリヴォラ（Ｋｏｐｒｉｖｏｖａ）ら（Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ ２、５１７〜５２３頁、２００４年）が、種子植物の場合はシュトラッサー（Ｓｔｒａｓｓｅｒ）ら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ５６１、１３２〜１３６頁、２００４年）が、異なるアプローチを使用してこの制限を克服するのに成功している。２件の研究で発生させた植物は、上述の２つの植物特異的糖残基を欠く複雑なＮ−グリコシル化を示した。
【０００４】
さらに植物糖タンパク質には末端β−１，４ガラクトース残基が見つからず、植物中にβ−１，４ガラクトシル転移酵素が存在しないことが示唆される。タバコ植物中（ベイカー（Ｂａｋｋｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９８、２８９９〜２９０４頁、２００１年）、タバコＢＹ２細胞中（パラクパック（Ｐａｌａｃｐａｃ）ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９６、４６９２〜４６９７頁、１９９９年）、ならびに配偶半数体コケ植物中（ヒューター（Ｈｕｅｔｈｅｒ）ら、Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ ７、２９２〜２９９頁、２００５年）へのこの酵素の安定した組み込みおよび発現について記載されている。組み換えヒトβ−１，４−ガラクトシル転移酵素は機能性であり、遺伝子導入材料から単離されたタンパク質は末端β−１，４−ガラクトース残基を示した。
【０００５】
本発明は、哺乳類などの動物においてなおもさらに改善された機能性があるポリペプチドおよびタンパク質が生成されることを確実にするための既存方法のさらなる改善に関する。
【０００６】
最も複雑なＮ−グリカン構造物は、ヒトタンパク質をはじめとする哺乳類タンパク質上に存在し、末端糖残基としてシアル酸を含有する。シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）の非遺伝子導入懸濁液培養細胞中のシアル酸付加複合糖質の存在が、最近シャア（Ｓｈａｈ）ら（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２１、１４７０〜１４７１頁、２００３年）によって記載されているが、これらの結果は議論中である（セヴェノ（Ｓｅｖｅｎｏ）ら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １１、１３５１〜１３５３頁、２００４年）。
【０００７】
しかし先行技術は、シアル酸付加がコケ植物でも起きるかどうか、そして所望のＮ−グリカンの特徴を有する異種の糖タンパク質の組み換え発現ができるようになるかについて、いかなる情報も提供しない。さらに先行技術においてコケ植物中のシアル酸の純粋な存在に関して、利用できるデータはない。
【０００８】
Ｎ−グリカン上へのシアル酸付加の必須条件は、活性化ノイラミン酸（ＣＭＰ ＮｅｕＡｃ）の存在である。哺乳類では、ＣＭＰ ＮｅｕＡｃの前駆物質であるＮｅｕＡｃ（シアル酸）の合成に異なる酵素が関与する。ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミン−６−キナーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＡＦ１５５６６３）は、ＭａｎＮＡｃ−６Ｐを発生させる役目をしており、それはＮ−アセチルノイラミン酸リン酸シンターゼ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０１８９４６）によって処理されてＮｅｕＡｃ−９Ｐになる。ＮｅｕＡｃ−９ＰをＮｅｕＡｃに処理する役目をする酵素については、これまで記載されていなかった。ＮｅｕＡｃの活性化は、哺乳類細胞核中で起きる。活性化シアル酸（ＣＭＰ ＮｅｕＡｃ）を発生させる役目をしているのは、酵素ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０１８６８６）である。活性化生成物は核からゴルジ体中に転位置しなくてはならず、この過程にＣＭＰ−シアル酸輸送体（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００６４１６）が関与する。最後に、例えば１，４結合−ガラクトース残基などの末端糖残基上へのＣＭＰ ＮｅｕＡｃの転移によって、Ｎ−グリカン上へのシアル酸付加が起きる。この目的のために、シアリル転移酵素（例えばα−２，６シアリル転移酵素、アクセッション番号：ＮＭ＿００３０３２）の発現を確実にしなくてはならない。半数体非脈管陸生植物であるコケ植物のヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）を組み換えタンパク質生成のために使用することができる（特許文献１）。
【０００９】
コケ植物の生活環は、光独立栄養的配偶世代によって大半が占められる。その生活環は胞子体が優勢な世代である高等植物のそれとは完全に異なり、高等植物とコケ植物の間には、顕著に多くの相違が観察される。
【００１０】
コケ植物の配偶体は、２つのはっきりと区別できる発達段階によって特徴づけられる。先端生長を通じて発達する原糸体は生育して、２種のみの細胞タイプ（クロロネマおよびカウロネマ細胞）の繊維網目状組織になる。ガメトフォアと称される第２段階は、茎生の生育によって単純な先端系とは区別される。どちらの段階も光独立栄養的に活性である。より複雑なガメトフォアへの分化なしの原糸体の培養が、フラスコ内の懸濁液培養ならびにバイオリアクター培養で示されている（特許文献１）。高等植物では、わずかな細胞タイプのみを含有する、完全に分化して光独立栄養的に活性の多細胞組織の培養については記載されていない。コケ植物細胞系の遺伝的安定性は、植物細胞培養と比べて重要な利点を提供する。高等植物の細胞培養では二次代謝はより分化しており、これが二次代謝産物プロフィールに違いをもたらす。
【００１１】
さらに生化学的レベルにおいて、コケ植物と高等植物との間にはいくつかの重要な違いがある。ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）中の硫酸固定は、高等植物と顕著に異なる。高等植物中の硫酸固定の主要酵素は、アデノシン５’−ホスホ硫酸還元酵素である。ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）では、ホスホ−アデノシン５’−ホスホ硫酸還元酵素を通じた代替経路が共存する（コプリヴォラ（Ｋｏｐｒｉｖｏｖａ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７、３２１９５〜３２２０１頁、２００２年）。この経路は、高等植物では特徴付けられていない。
【００１２】
さらなる違いは、細胞壁の再生に反映される。高等植物に由来するプロトプラストは、培養液とは無関係に新しい細胞壁を迅速に再生する。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を通じた高等植物のプロトプラスト中へのＤＮＡの直接転移は、細胞壁再生過程を遅延させるための４〜１０℃でのプレインキュベーションを必要とする（特許文献２）。対照的にニセツリガネゴケ属（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ）の原糸体に由来するプロトプラストの細胞壁再生は、培養液に依存する。プロトプラストは長期にわたり、細胞壁の再生なしに培養できる。理論による制約は意図しないが、細胞壁再生およびタンパク質グリコシル化に必須のプロトプラストの分泌機構が、高等植物とは異なるようである。さらにヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）は、その核ＤＮＡ中で高度に効率的な相同的組換えを示し、これは植物に固有の特性であって特異的遺伝子破壊を可能にするものであり（ガーク（Ｇｉｒｋｅ）ら、Ｐｌａｎｔ Ｊ １５、３９〜４８頁、１９９８年、ストレップ（Ｓｔｒｅｐｐ）ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５、４３６８〜４３７３頁、１９９８年、コプリヴォラ（Ｋｏｐｒｉｖｏｖａ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７、３２１９５〜３２２０１頁、２００２年、レスキ（Ｒｅｓｋｉ）によるレビュー、Ｐｌａｎｔａ ２０８、３０１〜３０９頁、１９９９年、シェーファー（Ｓｃｈａｅｆｅｒ）および（Ｚｒｙｄ）、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓ １２７、１４３０〜１４３８頁、２００１年、シェーファー（Ｓｃｈａｅｆｅｒ）、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ．５３、４７７〜５０１頁、２００２年）、高等植物との根本的相違をさらに例証する。
【特許文献１】国際公開第０１／２５４５６号パンフレット
【特許文献２】米国特許第５，５０８，１８４号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
動物グリコシル化パターンを含んでなる動物タンパク質、特にシアル酸残基を含有するヒトグリコシル化パターンをその上に含んでなるグリコシル化ヒトタンパク質を生成するより効率的な方法を提供することが、本発明の目的である。ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）などのコケ植物中において、動物グリコシル化パターンを含んでなる異種動物タンパク質、特にシアル酸残基を含有するヒトグリコシル化パターンを含んでなるヒトタンパク質を生成するための効率的な方法を提供することもまた目的である。
【００１４】
これらおよびその他の目的は、以下に提供する説明および実施例から明らかになるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明のコケ植物細胞は、ニセツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ）、ヒョウタンゴケ（Ｆｕｎａｒｉａ）、ミズゴケ（Ｓｐｈａｇｎｕｍ）、ヤノウエノアカゴケゼニゴケ（Ｃｅｒａｔｏｄｏｎ）、ゼニゴケ（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ）、およびダンゴゴケ（Ｓｐｈａｅｒｏｃａｒｐｏｓ）属からのコケおよびゼニゴケ種よりなる群から選択される。コケ植物細胞は好ましくはヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）からのものである。
【００１６】
ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）細胞などのコケ植物細胞は、本明細書に記載されるような本発明の方法に従った形質転換に適したあらゆる細胞であることができ、コケ植物プロトプラスト細胞、原糸体組織中に見られる細胞またはその他の細胞タイプであってもよい。確かに当業者は、形質転換された原糸体組織など、本発明に従う形質転換コケ植物細胞集団を含んでなるコケ植物体組織もまた、本発明の態様を形成することを理解するであろう。
【００１７】
本発明に従って、コケ植物細胞中における発現を駆動する外来性プロモーターと操作可能に結合する、少なくとも１つのヌクレオチド配列を含んでなる、好ましくはヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）細胞である形質転換コケ植物細胞が提供され、前記少なくとも１つのヌクレオチド配列は、コケ植物細胞中で発現されかつ哺乳類ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミン−６−キナーゼ、哺乳類Ｎ−アセチルノイラミン酸リン酸シンターゼ（シアル酸シンターゼ）、哺乳類ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼ、哺乳類ＣＭＰ−シアル酸輸送体、ガラクトシル転移酵素、および哺乳類シアリル転移酵素から選択される、機能性哺乳類タンパク質をコードする。
【００１８】
形質転換コケ植物細胞は、形質転換コケ植物細胞に関して上述される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つの核酸配列を含んでなってもよく、このような配列は機能性タンパク質をコードでき、前記核酸配列はそれぞれ外来性プロモーターと操作可能に結合する。典型的にこのようなヌクレオチド配列は哺乳類配列であり、好ましくはヒト核酸配列から選択される。
【００１９】
本発明の形質転換コケ植物細胞は、典型的にβ−１，４ガラクトシル転移酵素、好ましくはヒトβ−１，４ガラクトシル転移酵素ヌクレオチド配列を含んでなる。
【００２０】
本発明の形質転換コケ植物細胞で使用されるシアリル転移酵素は、典型的に哺乳類α−２，６またはα−２，３シアリル転移酵素から選択され、好ましくはヒトα−２，６シアリル転移酵素ヌクレオチド配列である。
【００２１】
本発明の形質転換コケ植物細胞は、その中でフコシル転移酵素および／またはキシロシル転移酵素活性が顕著に低下され、または除去された細胞である。この効果は例えば、好ましくはｉ）機能不全フコシル転移酵素ヌクレオチド配列および／またはｉｉ）機能不全キシロシル−転移酵素ヌクレオチド配列を含んでなる本発明の形質転換コケ植物細胞を使用して達成されてもよい。
【００２２】
「機能不全」とは、ここでの用法では、フコシル転移酵素（ｆｕｃＴ）およびキシロシル転移酵素（ｘｙｌＴ）の指名された転移酵素ヌクレオチド配列が、１，３結合フコシルおよび１，２結合キシロシル残基を含んでなる植物様グリコシル化パターンで植物Ｎ−結合グリカンを改変できる、機能性ｆｕｃＴおよびｘｙｌＴタンパク質コードするｍＲＮＡを実質的にコードできないことを意味する。好ましくは機能不全ｆｕｃＴおよびｘｙｌＴ植物転移酵素ヌクレオチド配列は、核コケ植物ゲノム（あらかじめ人為的にその他の核酸配列で形質転換されていないコケ植物細胞中にある真の天然コケ植物ゲノムであるか、またはその中であらかじめ所望の核酸配列で核酸配列挿入がなされた形質転換核コケ植物ゲノムにあるかにかかわらず）に含まれる内在性の、すなわちゲノムの天然ｆｕｃＴおよびｘｙｌＴ遺伝子中への外来性ヌクレオチド配列の標的を定めた挿入を含んでなり、それは機能性ｆｕｃＴおよびｘｙｌＴ転移酵素活性をコードするｍＲＮＡの転写を実質的に阻害または抑制する。
【００２３】
当業者に知られているように、フコシル転移酵素および／またはキシロシル転移酵素活性が欠損しているコケ植物細胞は、ＲＮＡｉおよびアンチセンス技術をはじめとするその他の技術によっても生成できる。これらの全ての方法は、その中でフコシル転移酵素および／またはキシロシル転移酵素活性が顕著に低下され、または除去された好ましいコケ植物細胞をもたらす。
【００２４】
本発明のコケ植物細胞またはその祖先は、本明細書に記載されるように哺乳類グリコシル化パターンでグリコシル化された、対象となるタンパク質の一次配列をコードする、対象となる異種遺伝子であらかじめ形質転換されたもののいずれであってもよい。好ましくはグリコシル化パターンはヒト型である。あるいはコケ植物細胞は、本明細書に記載されるとおり本発明の方法に従って、哺乳類グリコシル化パターンがその中に配置される必要がある、少なくとも１つの対象となる主要タンパク質配列、典型的にヒト、またはウシ、ヒツジ、ウマ、およびブタ種などの家畜種をはじめとする哺乳類で使用するための少なくとも１つの対象となる医薬品タンパク質をコードするヌクレオチド配列で、個別に、すなわち同時にまたは長い間かけて形質転換されてもよい。このようなヒトをはじめとする哺乳類で使用するための医薬品糖タンパク質としては、限定されるものではないが、好ましくはＶＥＧＦなどのヒトタンパク質であるタンパク質と、α−インターフェロン、β−インターフェロン、γ−インターフェロンなどのインターフェロンと、第ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、およびＸＩＩ因子から選択される血液凝固因子と、黄体化ホルモン、濾胞刺激ホルモンをはじめとする生殖ホルモンと、表皮性成長因子、血小板由来成長因子をはじめとする成長因子と、顆粒球コロニー刺激因子などと、プロラクチンと、オキシトシンと、甲状腺刺激ホルモンと、副腎皮質刺激ホルモンと、カルシトニンと、副甲状腺ホルモンと、ソマトスタチンと、エリスロポエチン（ＥＰＯ）と、β−グルコセレブロシダーゼなどの酵素と、ＴＮＦα受容体リガンド結合領域とＩｇＧなどのＦｃ部分、受容体、表面タンパク質、膜貫通タンパク質との融合タンパク質の融合タンパク質と、生理学的に活性なそれらの断片が挙げられる。さらに本発明の方法を使用して、特異性モノクローナル抗体などの抗体、または生理学的に活性なそれらの断片を生成できる。これらの抗体またはそれらの断片は、ヒト化またはヒト抗体キメラであってもよい。
【００２５】
好ましくは、ｉ）コケ植物細胞中における発現を駆動する外来性プロモーターと操作可能に結合して、コケ植物細胞中で発現される機能性哺乳類ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミン−６−キナーゼをコードするヌクレオチド配列、ｉｉ）前記コケ植物細胞中における発現を駆動する外来性プロモーターと操作可能に結合して、コケ植物細胞中で発現される機能性哺乳類Ｎ−アセチルノイラミン酸リン酸シンターゼ（シアル酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列、ｉｉｉ）前記コケ植物細胞中における発現を駆動する外来性プロモーターと操作可能に結合して、コケ植物細胞中で発現される機能性哺乳類ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼをコードするヌクレオチド配列、ｉｖ）前記コケ植物細胞中における発現を駆動する外来性プロモーターと操作可能に結合して、コケ植物細胞中で発現される機能性哺乳類ＣＭＰ−シアル酸輸送体をコードするヌクレオチド配列、ｖ）前記コケ植物細胞中における発現を駆動する外来性プロモーターと操作可能に結合して、コケ植物細胞中で発現される機能性哺乳類ガラクトシル転移酵素をコードするヌクレオチド配列、およびｖｉ）前記コケ植物細胞中における発現を駆動する外来性プロモーターと操作可能に結合して、コケ植物細胞中で発現される機能性哺乳類シアリル転移酵素をコードするヌクレオチド配列を含んでなるコケ植物細胞が提供される。
【００２６】
好ましくは、ｉ）機能不全フコシル転移酵素ヌクレオチド配列、ｉｉ）機能不全キシロシル転移酵素ヌクレオチド配列、ｉｉｉ）コケ植物細胞中における発現を駆動する外来性プロモーターと操作可能に結合して、コケ植物細胞中で発現される機能性哺乳類ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミン−６−キナーゼをコードするヌクレオチド配列、ｉｖ）前記コケ植物細胞中における発現を駆動する外来性プロモーターと操作可能に結合して、コケ植物細胞中で発現される機能性哺乳類Ｎ−アセチルノイラミン酸リン酸シンターゼ（シアル酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列、ｖ）前記コケ植物細胞中における発現を駆動する外来性プロモーターと操作可能に結合して、コケ植物細胞中で発現される機能性哺乳類ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼをコードするヌクレオチド配列、ｖｉ）前記コケ植物細胞中における発現を駆動する外来性プロモーターと操作可能に結合して、コケ植物細胞中で発現される機能性哺乳類ＣＭＰ−シアル酸輸送体をコードするヌクレオチド配列、ｖｉｉ）前記コケ植物細胞中における発現を駆動する外来性プロモーターと操作可能に結合して、コケ植物細胞中で発現される機能性ガラクトシル転移酵素をコードするヌクレオチド配列、およびｖｉｉｉ）前記コケ植物細胞中における発現を駆動する外来性プロモーターと操作可能に結合して、コケ植物細胞中で発現される機能性哺乳類シアリル転移酵素をコードするヌクレオチド配列を含んでなる形質転換コケ植物細胞が提供される。
【００２７】
当業者は、酵素ヌクレオチド配列がｃＤＮＡ配列であってもよく、またはゲノムＤＮＡ配列であってもよく、本発明の形質転換コケ植物細胞またはコケ植物組織中に生じる所望のグリコシル化外来性タンパク質上のＮ−グリカングリコシル化パターンが、完全に哺乳類パターンでなければ、実質的に哺乳類パターン（シアル酸残基を含んでなることを意味する）であり、最も好ましくは適切ならばヒトパターンである限りは、変性的に同等のヌクレオチド配列を含んでなってもよいことを理解するであろう。
【００２８】
バイオリアクター内におけるナシゴケ（Ｌｅｐｔｏｂｒｙｕｍ ｐｙｒｉｆｏｒｍｅ）およびムラサキミズゴケ（Ｓｐｈａｇｎｕｍ ｍａｇｅｌｌａｎｉｃｕｍ）などの本発明で使用するのに適したコケ植物の培養に関する詳細情報は、先行技術で知られている（例えばＥ．ウィルバート（Ｗｉｌｂｅｒｔ）、「アラキドン酸代謝を特に考慮したコケの大量培養に関する生物工学的研究（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｔｕｄｉｅｓ ｃｏｎｃｅｒｎｉｎｇ ｔｈｅ ｍａｓｓ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｍｏｓｓｅｓ ｗｉｔｈ ｐａｒｔｉｃｕｌａｒ ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）」、マインツ大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍａｉｎｚ）博士論文、１９９１年、Ｈ．ルドルフ（Ｒｕｄｏｌｐｈ）およびＳ．ラスムッセン（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ）、「バイオリアクター内で培養されたミズゴケの二次代謝の研究（Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｏｆ Ｓｐｈａｇｎｕｍ ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ ｉｎ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ）」、Ｃｒｙｐｔ．Ｂｏｔ．、３、６７〜７３頁、１９９２年を参照されたい）。本発明の目的で特に好ましいのは、分子生物学技術がこの生物上で実行されていることから、ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）の使用である（レビューについてはＲ．レスキ（Ｒｅｓｋｉ）、「コケの生育、遺伝、および分子生物学（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｍｏｓｓｅｓ）」、Ｂｏｔ．Ａｃｔａ、１１１、１〜１５頁、１９９８年、を参照されたい）。コケ植物の培養のためには、微量元素のような栄養補給剤を伴う（バウア（Ｂａｕｒ）ら、Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ ３、３３１〜３４０頁、２００５年）または伴わない（ワイゼ（Ｗｅｉｓｅ）ら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７０、３３７〜３４５頁、２００６年）培地が使用できる。
【００２９】
異種タンパク質生成のために、ニセツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ）の生物工学的活用に適した形質転換系が開発されている。例えば粒子銃を使用して、原糸体組織内への直接ＤＮＡ転移によって形質転換が成功裏に実施されている。コケプロトプラスト内へのＰＥＧ媒介ＤＮＡ転移もまた、成功裏に達成されている。ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）については、ＰＥＧ媒介形質転換方法に関して何度も記載されており、一過性および安定した形質転換体の双方をもたらす（例えばＫ．ロイター（Ｒｅｕｔｔｅｒ）およびＲ．レスキ（Ｒｅｓｋｉ）、「完全分化コケ植物のバイオリアクター培養中の異種のタンパク質生成（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ ｆｕｌｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｍｏｓｓ ｐｌａｎｔｓ」Ｐ１．Ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２、１４２〜１４７頁、１９９６年を参照されたい）。さらにコケ植物によるＰＥＧ媒介形質転換法でマーカーフリー形質転換も達成でき（シュテマー（Ｓｔｅｍｍｅｒ）Ｃ．、コッホ（Ｋｏｃｈ）Ａ．、およびゴール（Ｇｏｒｒ）Ｇ．、「ヒメツリガネゴケのマーカーフリー形質転換（Ｍａｒｋｅｒ−ｆｒｅｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ」、Ｍｏｓｓ ２００４年、第７回年次コケ国際会議（Ｔｈｅ ７ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｍｏｓｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ）、フライブルク（Ｆｒｅｉｇｕｒｇ）、ドイツ）、引き続く複数ヌクレオチド配列導入のために使用できる。
【００３０】
本発明のさらに別の態様では、
ｉ）コケ植物細胞中における発現を駆動する外来性プロモーターと操作可能に結合する核酸配列を含んでなる少なくとも１つの単離された核酸配列を前記コケ植物細胞中に導入するステップであって、前記少なくとも１つの単離された核酸配列が、コケ植物細胞中で発現しかつ哺乳類ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミン−６−キナーゼ、哺乳類Ｎ−アセチルノイラミン酸リン酸シンターゼ（シアル酸シンターゼ）、哺乳類ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼ、哺乳類ＣＭＰ−シアル酸輸送体、ガラクトシル転移酵素、および哺乳類シアリル転移酵素から選択される機能性タンパク質、好ましくはヒトタンパク質をコードするステップと、
ｉｉ）前記細胞中に、コケ植物細胞中における発現を駆動する外来性プロモーターと操作可能に結合する核酸配列を含んでなる、単離された核酸配列をさらに導入するステップであって、前記核酸が少なくとも１つのグリコシル化哺乳類ポリペプチドをコードするステップと
を含んでなる、コケ植物細胞中で少なくとも１つの外来性グリコシル化哺乳類タンパク質を生成する方法が提供される。
【００３１】
ステップｉｉ）があらかじめ達成されている場合、方法は、
ｉ）前記コケ植物細胞中における発現を駆動する外来性プロモーターと操作可能に結合する核酸配列を含んでなる、形質転換コケ植物細胞を使用するステップであって、前記核酸が少なくとも１つのグリコシル化哺乳類ポリペプチドをコードするステップと、
ｉｉ）前記コケ植物細胞中に、コケ植物細胞中における発現を駆動する外来性プロモーターと操作可能に結合する核酸配列を含んでなる少なくとも１つの単離された核酸配列を導入するステップであって、前記少なくとも１つの単離された核酸配列が、コケ植物細胞中で発現されかつ哺乳類ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミン−６−キナーゼ、哺乳類Ｎ−アセチルノイラミン酸リン酸シンターゼ（シアル酸シンターゼ）、哺乳類ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼ、哺乳類ＣＭＰ−シアル酸輸送体、ガラクトシル転移酵素、および哺乳類シアリル転移酵素から選択される機能性タンパク質をコードするステップと
を含んでなる。
【００３２】
コケ植物細胞を形質転換する方法は、形質転換コケ植物細胞に対して少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つの上述の核酸配列で前記細胞を形質転換するステップを含んでなってもよく、このような配列は機能性タンパク質をコードでき、前記核酸配列はそれぞれ外来性プロモーターと操作可能に結合する。典型的にこのようなヌクレオチド配列は哺乳類配列であり、好ましくはヒト核酸配列から選択される。
【００３３】
本発明の方法は、典型的に機能性ガラクトシル転移酵素、例えば好ましくはヒトβ−１，４ガラクトシル転移酵素ヌクレオチド配列などの哺乳類β−１，４ガラクトシル転移酵素を本発明の形質転換コケ植物細胞に導入するステップを含んでなる。
【００３４】
本発明の方法は、典型的に、本発明の形質転換コケ植物細胞で使用されるシアリル転移酵素もまた用いて、それは典型的に哺乳類α−２，６またはα−２，３シアリル転移酵素ヌクレオチド配列から選択され、好ましくはヒトα−２，６シアリル転移酵素ヌクレオチド配列であるポリヌクレオチドによってコードされる。
【００３５】
本発明の形質転換コケ植物細胞は、典型的に、その中でフコシル転移酵素および／またはキシロシル転移酵素活性が顕著に低下されまたは除去された細胞である。
【００３６】
本発明の好ましい実施態様では、
ｉ）コケ植物細胞中における発現を駆動する外来性プロモーターと操作可能に結合する核酸を含んでなる第１の単離された核酸配列を形質転換コケ植物細胞中に導入するステップであって、前記核酸が少なくとも１つのＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミン−６−キナーゼをコードするステップと、
ｉｉ）コケ植物細胞中における発現を駆動する外来性プロモーターと操作可能に結合する核酸を含んでなる単離された核酸配列を前記細胞中にさらに導入するステップであって、前記核酸が少なくとも１つのＮ−アセチルノイラミン酸リン酸シンターゼ（シアル酸シンターゼ）をコードするステップと、
ｉｉｉ）コケ植物細胞中における発現を駆動する外来性プロモーターと操作可能に結合する核酸を含んでなる単離された核酸配列を前記細胞中にさらに導入するステップであって、前記核酸が少なくとも１つのＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼをコードするステップと、
ｉｖ）コケ植物細胞中における発現を駆動する外来性プロモーターと操作可能に結合する核酸を含んでなる単離された核酸配列を前記細胞中にさらに導入するステップであって、前記核酸が少なくとも１つの哺乳類ＣＭＰ−シアル酸輸送体ポリペプチドをコードするステップと、
ｖ）コケ植物細胞中における発現を駆動する外来性プロモーターと操作可能に結合する核酸を含んでなる単離された核酸配列を前記細胞中にさらに導入するステップであって、前記核酸が少なくとも１つのガラクトシル転移酵素ポリペプチドをコードするステップと、
ｖｉ）コケ植物細胞中における発現を駆動する外来性プロモーターと操作可能に結合する核酸を含んでなる単離された核酸配列を前記細胞中にさらに導入するステップであって、前記核酸が少なくとも１つの哺乳類シアリル転移酵素ポリペプチドをコードするステップと、
ｖｉｉ）コケ植物細胞中における発現を駆動する外来性プロモーターと操作可能に結合する核酸を含んでなる単離された核酸配列を前記細胞中にさらに導入するステップであって、前記核酸が少なくとも１つのグリコシル化哺乳類ポリペプチドをコードするステップと
を含んでなる、形質転換コケ植物細胞中で少なくとも１つの異種のまたは外来性グリコシル化哺乳類タンパク質を生成する方法が提供される。
【００３７】
本明細書に示唆されるとおり、少なくとも１つのガラクトシル転移酵素ポリペプチドは、好ましくは哺乳類β−１，４ガラクトシル転移酵素（β−１，４ ｇａｌＴ）であり、最も好ましくはヒトβ−１，４ガラクトシル転移酵素ポリペプチドであり、少なくとも１つの哺乳類シアリル転移酵素ポリペプチドは好ましくはα−２，３またはα−２，６シアリル転移酵素であり、最も好ましくはヒトα−２，６シアリル転移酵素ポリペプチドである。
【００３８】
さらに好ましくは上の方法は、以下のステップをさらに含んでなる。
ｖｉｉｉ）内在性フコシル転移酵素ヌクレオチド配列を機能不全にするヌクレオチド配列、
ｉｘ）内在性キシロシル転移酵素ヌクレオチド配列を機能不全にするヌクレオチド配列。
【００３９】
あるいは上記の方法は、その中でフコシル転移酵素および／またはキシロシル転移酵素活性が顕著に低下され、または除去されたコケ植物細胞を利用する。
【００４０】
好ましくは上述の全てのグリコシル化哺乳類タンパク質は、ヒト型である。本発明で生成が企図されるその他のタンパク質としては、獣医医療で使用するためのタンパク質が挙げられ、本明細書に記載されるヒトタンパク質の動物相同体に相当してもよい。
【００４１】
外来性プロモーターは、プロモーターを表示するものであり、すなわち対象となる核酸配列の前方に導入されて、それと操作可能に結合する。したがって外来性プロモーターは、本明細書に定義されるとおり選択された核酸構成要素の前方に配置されたものであり、野生型の環境に見られるように、通常対象となる核酸構成要素と結びつく自然または天然プロモーターからは構成されない。したがってプロモーターは対象となるコケ植物細胞由来であってもよいが、野生型コケ植物細胞中において、前方で対象となる核酸と操作可能に結合してはならない。典型的に外来性プロモーターは、宿主細胞以外の供給源から宿主コケ植物細胞に転移されるものである。
【００４２】
本明細書に記載されるとおりの（哺乳類）酵素およびグリコシル化哺乳類タンパク質をコードするｃＤＮＡは、例えばここで定義されるように、そして本発明によって提供されるように、（哺乳類）酵素に操作可能に結合して、グリコシル化哺乳類タンパク質のための核酸配列および／または第２の核酸配列をコードする誘導性または構成的プロモーターなど、コケ植物細胞中で作動可能な少なくとも１つのタイプのプロモーターを含有する。考察するように、これによって遺伝子発現の制御が可能になる。
【００４３】
プロモーターに適用される「誘導性」という用語は、当業者によって良く理解されている。本質的に、誘導性プロモーターの制御下にある発現は（細胞内で発生しても、または外来性に提供されてもよい）加えられた刺激に答えて、「スイッチが入り」または増大する。刺激の性質は、プロモーターの間で変動する。いくつかの誘導性プロモーターは、適切な刺激の不在下では、わずかなまたは検出不可能なレベルの発現（または発現なし）しか引き起こさない。その他の誘導性プロモーターは、刺激の不在下で検出可能な構成的発現を引き起こす。刺激不在下での発現レベルにかかわらず、あらゆる誘導性プロモーターからの発現は妥当な刺激の存在下で増大する。好ましい状況では、表現型の特徴を変更するのに効果的な量で適切な刺激が加わると、発現レベルが増大する。したがって刺激不在下において所望の表現型をもたらすには低すぎる（事実上ゼロでもよい）基礎水準の発現を引き起こす、誘導性（または「スイッチ可能」）プロモーターを使用してもよい。刺激を加えると、発現は所望の表現型をもたらすレベルに増大する（またはスイッチが入る）。
【００４４】
本明細書に示唆されるとおり、コケ植物発現系は、当業者にも知られている。コケ植物プロモーター、特にヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）プロモーターは、宿主ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼに結合して、コード配列（例えば構造的遺伝子）のｍＲＮＡへの下流（３’）転写を開始できるあらゆるＤＮＡ配列である。プロモーターは通常、コード配列の５’末端近位に位置する転写開始領域を有する。この転写開始領域は、通常ＲＮＡポリメラーゼ結合部位（「ＴＡＴＡボックス」）および転写開始部位を含む。コケ植物プロモーターはまた、上流活性化因子配列（ＵＡＳ）と称される第２の領域を有してもよく、それは存在する場合、通常、構造的遺伝子より遠位である。ＵＡＳは制御される（誘導性）発現を可能にする。構成的発現はＵＡＳの不在下で起きる。制御される発現は正または負のどちらであってもよく、それによって転写は増強または低減される。
【００４５】
当業者は、コケ植物代謝経路中で酵素をコードするコケ植物プロモーター配列が、特に有用なプロモーター配列を提供できることを理解するであろう。
【００４６】
さらに天然において生じない合成プロモーターもまた、コケ植物プロモーターとして機能してもよい。例えば１つのコケ植物プロモーターのＵＡＳ配列を別のコケ植物プロモーターの転写活性化領域と連結して、合成雑種プロモーターを作り出してもよい。適切なプロモーターの例は、ザイドラー（Ｚｅｉｄｌｅｒ）ら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．３０、１９９〜２０５頁、１９９６年によってヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）のＴＯＰ １０発現系で使用されたものである。さらにコケ植物プロモーターは、コケ植物ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼに結合して転写を開始する能力を有する、非コケ植物起源の天然プロモーター含むことができる。このようなプロモーターの例としては、記載されているもの、とりわけ、コメＰ−アクチン１プロモーターおよびクラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）ＲｂｃＳプロモーター（ザイドラー（Ｚｅｉｄｌｅｒ）ら、Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１５４、６４１〜６５０頁、１９９９年、コーエン（Ｃｏｈｅｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：１０７８頁、１９８０年、ヘニコフ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、２８３：８３５頁、１９８１年、ヘレンベルク（Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ）ら、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、９６：１１９頁、１９８１年、Ｋ．Ｎ．ティムズ（Ｔｉｍｍｓ）およびＡ．ピューラー（Ｐｕｈｌｅｒ）編、「医学的、環境的、および商業的に重要なプラスミド（Ｐｌａｓｍｉｄｓ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ）」より、ヘレンベルク（Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ）ら、「酵母サッカロミセス・セレヴィシエにおける細菌抗生物質抵抗性遺伝子の発現（Ｔｈｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ Ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）」１９７９年、メルスロー−ピュイガロン（Ｍｅｒｃｅｒａｕ−Ｐｕｉｇａｌｏｎ）ら、Ｇｅｎｅ、１１：１６３頁、１９８０年、パンティエ（Ｐａｎｔｈｉｅｒ）ら、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．、２：１０９頁、１９８０年）が挙げられる。
【００４７】
ＤＮＡ分子は、コケ植物において細胞内で発現されてもよい。プロモーター配列は、ＤＮＡ分子と直接結合していてもよく、その場合、組み換えタンパク質のＮ末端の第１のアミノ酸は常にメチオニンであり、それはｍＲＮＡ上のＡＵＧ開始コドンによってコードされる。所望ならば、Ｎ末端のメチオニンは、臭化シアンとのインキュベーションによって、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）でタンパク質から切断されてもよい。
【００４８】
あるいは外来性タンパク質はまた、コケ植物細胞中または外への外来性タンパク質分泌を提供するリーダー配列断片を含んでなる融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子を作り出すことで、コケ植物細胞から増殖培地内に分泌されてもよい。好ましくはリーダー断片と外来性遺伝子との間にコードされ、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）または生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）のいずれかで切断されることができる処理部位がある。リーダー配列断片は、通常、細胞からのタンパク質分泌を指示する、疎水性アミノ酸を含んでなるシグナルペプチドをコードする。
【００４９】
適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、分泌経路を標的とするコケ植物タンパク質の遺伝子から得ることができ、それもまたコケ植物細胞中への分泌を提供するかもしれない、ＶＥＧＦリーダーなどの非コケ植物起源リーダーなどが存在する。
【００５０】
コケ植物細胞によって認識され、その中で機能性である転写終止配列は、翻訳ストップコドンに対して３’に位置する調節領域であり、したがってプロモーターと共にコード配列に隣接する。これらの配列は、ＤＮＡによってコードされるポリペプチドに翻訳できるｍＲＮＡの転写を指示する。ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）中で機能する適切な終止配列の例は、カリフラワーモザイクウイルスの終止領域である。
【００５１】
典型的にプロモーター、（所望ならば）リーダー、対象となるコード配列、および転写終止配列を含んでなる構成要素は、本発明の発現コンストラクト内でひとまとめにされる。発現コンストラクトは、細菌などの宿主中での安定維持ができる染色体外要素である、ＤＮＡプラスミド中で維持されることが多い。ＤＮＡプラスミドは２つの複製起点を有してもよく、それによって例えば発現のためのコケ植物中で、およびクローニングおよび増幅のための原核生物宿主で、維持できるようになる。一般的に、プラスミドが原核生物宿主細胞中でクローニングおよび増幅のための１つの複製起点を有すれば十分である。さらにＤＮＡプラスミドは、高コピー数または低コピー数のどちらのプラスミドであってもよい。高コピー数のプラスミドは、一般に約５〜約２００個、および通常約１０〜約１５０個の範囲のコピー数を有する。高コピー数プラスミドを含有する宿主は、好ましくは少なくとも約１０個、およびより好ましくは少なくとも約２０個を有する。宿主に対するベクターおよび外来性タンパク質の効果次第で、高コピー数または低コピー数のどちらのベクターを選択してもよい（例えば前出のブレーク（Ｂｒａｋｅ）らを参照されたい）。
【００５２】
あるいは発現コンストラクトは、組み込み型ベクターと共にコケ植物ゲノム中に組み込むことができる。組み込み型ベクターは、通常、コケ植物染色体に相同的な少なくとも１つの配列を含有し、ベクターが発現コンストラクトに隣接する２つの相同的な配列を組み込むことができ、好ましくは含有できるようにする。組み込み型ベクターは、本明細書に記載されるとともに例示されるとおり、ベクター中への包含に適した相同的配列を分泌することで、コケ中の特定遺伝子座に特異的であってもよい。１つ以上の発現コンストラクトを組み込んでもよい。ベクター中に含まれる染色体配列は、ベクター全体の組み込みをもたらすベクター中の単一セグメント、または発現コンストラクトのみの安定した組み込みをもたらすことができる、染色体中の隣接するセグメントに相同的でベクター中の発現コンストラクトと隣接する２つのセグメントとして生じることができる。
【００５３】
通常、染色体外および組み込み発現コンストラクトは選択マーカーを含有して、形質転換されたコケ植物細胞の選択を可能にしてもよい。さらにマーカーフリー形質転換法も使用できる。
【００５４】
選択マーカーは、コケ植物細胞でＧ４１８およびハイグロマイシンＢのそれぞれに対する耐性を与える、Ｇ４１８またはハイグロマイシンＢ耐性遺伝子などのコケ宿主中で発現できる生合成遺伝子を含んでもよい。さらに適切な選択マーカーは、コケ植物細胞に、金属などの有毒化合物存在下で生育する能力も提供する。
【００５５】
あるいは、上述のいくつかの構成要素は、形質転換ベクター中でまとめることができる。形質転換ベクターは、上述のように、通常、ＤＮＡプラスミド内で維持されるか、または組み込み型ベクターに発達させるかのどちらかの選択マーカーを含んでなる。
【００５６】
外来性ＤＮＡをコケ植物細胞中に導入する方法は技術分野でよく知られており、とりわけ次に記載される。シェーファー（Ｓｃｈａｅｆｅｒ）Ｄ．Ｇ．、「ヒメツリガネゴケのための原理およびプロトコル（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍｏｓｓ Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）」、ローザンヌ大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｌａｕｓａｎｎｅ）環境学研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｅｃｏｌｏｇｙ）植物細胞遺伝学研究室（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、Ｄｉｄｉｅｒ．Ｓｃｈａｅｆｅｒ＠ｉｅ−ｐｃ．ｕｎｉｌ．ｃｈ、２００１年５月、ロイター（Ｒｅｕｔｔｅｒ）Ｋ．およびレスキ（Ｒｅｓｋｉ）Ｒ．、Ｐｌａｎｔ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第２巻、第３号、１９９６年９月、ザイドラー（Ｚｅｉｄｌｅｒ）ら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．３０、１９９〜２０５頁、１９９６年。
【００５７】
当業者は上述のように、容易に組み換え核酸配列または遺伝子発現のためのベクターを構築し、プロトコルをデザインできる。プロモーター配列、ターミネーター断片、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子、および必要に応じたその他の配列をはじめとする適切な制御配列を含有する適切なベクターを、選択または構築できる。さらに詳しくは、例えば、「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」第２版、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ｌ９８９年を参照されたい。例えば核酸コンストラクト調製、変異誘発、配列決定、細胞中へのＤＮＡ導入および遺伝子発現、およびタンパク質分析における核酸操作のための多くの既知の技術およびプロトコルについては、オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編、「分子生物学における現行のプロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」第２版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９９２年で詳細に記載される。サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）らおよびオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）らの開示は、参照によって本明細書に援用する。
【００５８】
必然的に当業者は、シアル酸付加されるものを含む、グリコシル化される適切な（ヒト）酵素およびポリペプチドをコードする各核酸配列が、それ自体の外来性プロモーターおよびターミネーターの調節管理下にあることを理解するであろう。２つ以上の標的タンパク質が単一キャリアＲＮＡから生成されることになっている場合、それらが例えばコケ植物細胞培養系の収穫相中で、異なるタンパク質−特異性抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）への結合によって、容易に分離できることが好ましい。
【００５９】
上述のように、選択可能な遺伝的マーカーは遺伝子導入コケ植物細胞の選択を容易にするかもしれず、これらは本明細書に示唆されるとおりの選択可能な表現型を与えるキメラ遺伝子からなってもよい。
【００６０】
グリコシル化および／またはシアル酸付加のための選択されるヒト酵素核酸配列およびポリペプチド配列をコケ植物細胞中に導入する場合、当業者によく知られている特定の配慮が必要である。挿入される核酸は、転写を駆動する効果的な調節因子を含有するコンストラクト内で構築しなくてはならない。細胞中へコンストラクトを輸送する方法が利用可能でなくてはならない。ひとたびコンストラクトが細胞膜内に入ると、内在性染色体への組み込みは生じるかもまたは生じないかもしれない。
【００６１】
本発明はコケ植物細胞の形質転換に適した核酸ベクターを提供し、哺乳類ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミン−６−キナーゼ、哺乳類Ｎ−アセチル−ノイラミン酸リン酸シンターゼ（シアル酸シンターゼ）、哺乳類ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼ、哺乳類ＣＭＰ−シアル酸輸送体、ガラクトシル転移酵素、および哺乳類シアリル転移酵素から選択される少なくとも１つの機能性ポリペプチドをコードする、少なくとも１つの単離されたポリヌクレオチド配列を含む。当業者は、本発明がまた、コケ植物細胞の形質転換に適した１セットの核酸ベクターも提供し、前記セットが上記で定義したように、それぞれが少なくとも１つの単離されたポリヌクレオチド配列を含んでなる、少なくとも２つのベクターを含んでなることを理解するであろう。同様に本発明は、上記で定義したように形質転換コケ植物細胞を生成する方法で使用するためのこの核酸ベクターセットを提供する。
【００６２】
本発明は、上述のように、ベクターまたはコンストラクトで形質転換された宿主細胞、特にコケ植物、酵母、繊毛虫類または藻類細胞などの非動物真核生物細胞、または原核生物（微生物）細胞をさらに包含する。このようにして、本明細書に示唆されるような本発明のヌクレオチド配列を含むコケ植物細胞などの宿主細胞が提供される。細胞内でヌクレオチド配列は、染色体中に組み込まれてもよい。
【００６３】
また本発明に従って、本明細書に記載されるとおり、発現調節のための制御配列の操作的な調節下で、本発明によって提供されるように、少なくとも１つのヌクレオチド配列、特に異種のヌクレオチド配列がそのゲノム中に組み込まれたコケ植物細胞が提供される。コード配列は、その発現のために核酸配列と自然には結合しないものなど、本発明で用いられる核酸配列に対して異種または外来性であってもよい、１つ以上の制御配列と操作可能に結合していてもよい。本発明に従ったヌクレオチド配列を外的誘導性プロモーターの制御下に置いて、発現を使用者の制御下に置いてもよい。本発明のさらに別の態様は、本発明で使用することが企図される核酸配列、または本発明で使用することが企図される配列を含む少なくとも１つの適切なベクターまたはベクターセットをコケ植物細胞中に導入するステップと、ベクターとコケ植物細胞ゲノムとの間の遺伝子組み換えを引き起こし、またはそれを可能にして、前記配列をゲノム中に導入するステップを含む、このようなコケ植物細胞、特にヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）細胞を作る方法を提供する。本発明は、ＧａｌＴヌクレオチドおよび／または哺乳類グリコシル化パターンがそれに付加されることになっているポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含有して、祖先細胞へのヌクレオチド配列導入の結果として本発明における使用に適した、コケ植物細胞、特にヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）細胞にまで及ぶ。
【００６４】
「異種の」という用語は、遺伝子操作を使用して、すなわちヒトの介入によって、論議されているヌクレオチドの遺伝子／配列がコケ植物細胞、またはその祖先中に導入されたことを示すために使用してもよい。遺伝子導入コケ植物細胞、すなわち論議されているヌクレオチド配列について遺伝子導入されたコケ植物細胞が提供されてもよい。導入遺伝子はゲノム外ベクター上にあっても、または好ましくは安定してゲノム中に組み込まれてもよい。異種遺伝子が、内在性同等遺伝子、すなわち常態では同一または同様の機能を果たすものを置換してもよく、または挿入配列は、内在性遺伝子またはその他の配列に追加的であってもよい。異種遺伝子導入の利点は、好みに従って発現に影響を与えるために、配列の発現を選択されたプロモーター制御下に置く能力である。コケ植物細胞に対して異種の、または外性または外来性のヌクレオチド配列は、そのタイプ、株または種の細胞中で非天然であってもよい。したがってヌクレオチド配列は、異なるタイプまたは種のコケ植物細胞の文脈内で、ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）細胞などの特定タイプのコケ植物細胞のコード配列を含んでもよく、またはそれに由来してもよい。さらに別の可能性は、発現調節のためにプロモーター配列などの１つ以上の制御配列と操作可能に結合するような、その中でそれまたは相同体が自然に見られるが、ヌクレオチド配列が、細胞中で、またはその細胞タイプまたは種または株中で自然に生じない核酸に結合し、および／またはそれに隣接する、コケ植物細胞中に配置されるヌクレオチド配列に関する。コケ植物またはその他の宿主細胞中の配列は、同定可能に異種性、外性または外来性であってもよい。
【００６５】
本発明は、本明細書に開示されるような本発明に従った、または本明細書の情報および提案に従って得られる、核酸分子組み合わせの所望のポリペプチド発現産物もまた包含する。例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの適切な宿主細胞中で、適切な条件下においてそれをコードするヌクレオチド配列からの発現によって、このような発現産物を作る方法もまた提供される。当業者は、容易にベクターを構築して、発現および組み換え遺伝子発現生成物回収のためのプロトコルおよびシステムをデザインできる。
【００６６】
本発明はまた、遺伝子導入非動物細胞の生成における、哺乳類ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−グルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミン−６−キナーゼ、哺乳類Ｎ−アセチルノイラミン酸リン酸シンターゼ（シアル酸シンターゼ）、哺乳類ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼ、哺乳類ＣＭＰ−シアル酸輸送体、ガラクトシル転移酵素、および哺乳類シアリル−転移酵素から選択される少なくとも１つのタンパク質をコードする、少なくとも１つのポリヌクレオチド配列の使用も企図し、前記遺伝子導入非動物細胞は好ましくはコケ植物、酵母、繊毛虫類または藻類細胞である。
【００６７】
さらに好ましくは、本発明の宿主細胞は、コケ植物、またはコケ植物の部分、またはコケ植物抽出物または誘導体またはコケ植物細胞培養に含まれる。
【００６８】
さらに上記で定義されるようなコケ植物細胞を含んでなる、コケ植物体またはコケ植物組織が提供される。
【００６９】
本発明はまた、上記で定義されるような少なくとも１つの核酸ベクターまたは１セットの核酸ベクターをコケ植物細胞中に組み込むステップと、コケ植物を前記細胞から再生させるステップを含む、形質転換コケ植物体を生成する方法も提供する。
【００７０】
さらに本発明は、
ｉ）非哺乳類真核細胞、組織または生物を哺乳類ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−グルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミン−６−キナーゼ、哺乳類Ｎ−アセチルノイラミン酸リン酸シンターゼ（シアル酸シンターゼ）、哺乳類ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼから選択される少なくとも１つのポリペプチドをコードする、少なくとも１つのポリヌクレオチド配列で形質転換するステップ、
ｉｉ）請求項２３〜２５のいずれか一項で定義されるとおりの少なくとも１つのベクターまたは１セットのベクターを前記非哺乳類真核細胞、組織または生物中に導入するステップ、または
ｉｉｉ）哺乳類ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−グルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチル−マンノサミン−６−キナーゼ、哺乳類Ｎ−アセチルノイラミン酸リン酸シンターゼ（シアル酸シンターゼ）、哺乳類ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼから選択される少なくとも１つのポリペプチドをコードする、少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含んでなる、あらかじめ形質転換された非哺乳類真核細胞、組織または生物を使用するステップ、および、任意にｉ）、ｉｉ）および／またはｉｉｉ）で処理または定義された細胞、組織または生物からのシアル酸またはＣＭＰ−シアル酸を回収、精製または単離するステップ
を含んでなる、形質転換された非哺乳類真核細胞、組織または生物中にシアル酸またはＣＭＰ−シアル酸生成する方法を提供する。
【００７１】
好ましくは、前記非哺乳類細胞、組織または生物は、酵母、繊毛虫類または藻類細胞、組織または生物である。
【００７２】
本発明に従って生成されるポリペプチドは、本明細書に記載されるとおりの（ａ）ポリペプチドのアレル、変異型、断片、誘導体、突然変異体または相同体であってもよい。アレル、変異型、断片、誘導体、突然変異体または相同体は、上記に示唆されるポリペプチドと実質的に同一機能を有してもよく、本明細書に示されるとおりの、またはその機能性突然変異体であってもよい。本明細書に記載されるとおりのヒトで使用するための医薬品タンパク質の文脈で、当業者はこのようなタンパク質の一次配列およびそれらのグリコシル化パターンが、ヒトで見られるものを模倣するまたは好ましくはそれと同一であることを理解するであろう。
【００７３】
本発明のアミノ酸配列に関連する「相同性」は、同一性または類似性、好ましくは同一性を指すために使用されてもよい。上記に既述したように、高レベルのアミノ酸同一性は、例えば本明細書で同定されるあらゆるドメインなど、機能的に有意なドメインまたは領域に限定されてもよい。
【００７４】
特に本明細書において提供される特定のコケ植物由来ポリペプチド配列の相同体が、このような相同体の突然変異体、変異型、断片、および誘導体として本発明によって提供される。このような相同体は、本明細書においてなされる開示の使用によって容易に得られる。必然的に当業者は、遺伝暗号の縮重のために、対象となる哺乳類タンパク質、特に対象となるヒトタンパク質の正確なコピー（すなわち１００％同一）であるアミノ酸配列を生じる相同体以外のグリコシル化タンパク質配列相同体それ自体が、本発明に包含されることを理解するであろう。したがって本発明は、本明細書に定義され、本明細書に提供される配列情報を使用して得られる、ヒト酵素機能があるアミノ酸配列を含むポリペプチドにまで及ぶ。相同体は、このようなタンパク質が本発明の文脈に適する活性を有するという条件で、本明細書に記載されるとおり、先行技術に記載されている、すなわち実施例の項で提供されるデータベースアクセッション番号の下のアミノ酸配列と、アミノ酸レベルで、好ましくは少なくとも約５０％、または少なくとも５５％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％相同性、または少なくとも約８５％、または少なくとも約８８％相同性、または少なくとも約９０％相同性、最も好ましくは少なくとも約９５％以上の相同性、すなわち同一性を有してもよい。
【００７５】
特定の実施態様では、特異的配列のアレル、変異型、誘導体、突然変異誘導体、突然変異体または相同体は、特異的配列と、例えば約２０％、または約２５％、または約３０％、または約３５％、または約４０％または約４５％のわずかな全体的相同性を示してもよい。しかし機能的に有意なドメインまたは領域では、アミノ酸相同性はより高くあってもよい。推定上の機能的に有意なドメインまたは領域は、相同体の配列比較をはじめとするバイオインフォマティクス法を使用して同定できる。
【００７６】
異なるポリペプチドの機能的に有意なドメインまたは領域は、コードする核酸からの融合タンパク質としての発現のために組み合わせてもよい。例えば、適切ならば酵素活性を持つ得られた発現産物が様々な親タンパク質の断片を含むように、異なる相同体の特に有利なまたは望ましい特性をハイブリッドタンパク質中で組み合わせてもよい。
【００７７】
アミノ酸配列の類似性は、当該技術分野で標準的に使用されるアルシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜１０頁、１９９０年のＴＢＬＡＳＴＮプログラムによって定義され判定されるとおりのものであってもよい。特にマトリックスＢＬＯＳＵＭ６２およびＧＡＰペナルティ：存在：１１、延長：１と共に、ＴＢＬＡＳＴＮ２．０を使用してもよい。使用してもよい別の標準プログラムはベストフィット（ＢｅｓｔＦｉｔ）であり、これは米国５３７１１ウィスコンシン州マジソン市サイエンス・ドライブのジェネティックス・コンピューター・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（５７５Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ ５３７１１））からのウィスコンシンパッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ）、バージョン８、１９９４年９月、の一部である。ベストフィット（ＢｅｓｔＦｉｔ）は、２つの配列間の類似性の最良セグメントの最適アラインメントをする。最適アラインメントは、スミス（Ｓｍｉｔｈ）およびウォーターマン（Ｗａｔｅｒｍａｎ）、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２〜４８９頁、１９８１年の局所的相同性アルゴリズムを使用して、ギャップを挿入してマッチ数を最大化して見いだされる。その他のアルゴリズムとしては、ニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）およびブンシュ（Ｗｕｎｓｃｈ）アルゴリズムを使用して、２つの完全な配列を整列させ、マッチ数を最大化してギャップ数を最小化するＧＡＰが挙げられる。どんなアルゴリズムもそうであるように、一般にデフォルトパラメーターが使用され、ＧＡＰの場合はギャップ生成ペナルティ＝１２およびギャップ延長ペナルティ＝４である。あるいは、ギャップ生成ペナルティ３およびギャップ延長ペナルティ０．１を使用してもよい。ピアースン（Ｐｅａｒｓｏｎ）およびリップマン（Ｌｉｐｍａｎ）、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５：２４４４〜２４４８頁、１９８８年の方法を使用するアルゴリズムＦＡＳＴＡは、さらに別の代案である。
【００７８】
本明細書での「相同性」および「相同的」のどちらの用語の使用も、例えば２つのヌクレオチド配列が適切な条件下で再結合するのに十分に類似であることのみを要する「相同的組換え」などの標準的使用に沿って、比較された配列間のいかなる必然的な進化的関係も暗示しない。
【００７９】
本明細書に援用する全ての参考文献の教示は、明細書の教示に組み込まれるものと理解される。
【実施例】
【００８０】
方法および材料
植物材料
レスキ（Ｒｅｓｋｉ）ら、ヒメツリガネゴケのゲノム分析（Ｇｅｎｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｓｓ Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ（Ｈｅｄｗ．）Ｂ．Ｓ．Ｇ．）」、Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２４４、３５２〜３５９頁、１９９４年により特性決定されたヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ（Ｈｅｄｗ．）Ｂ．Ｓ．Ｇ．）野生型株を使用した。これはＨ．Ｌ．Ｋ．ホワイトハウス（Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ）によって英国ハンティンドンシア（Ｈｕｎｔｉｎｇｄｏｎｓｈｉｒｅ）のグランスデン・ウッド（Ｇｒａｎｓｄｅｎ Ｗｏｏｄ）で収集され、エンゲル（Ｅｎｇｅｌ）（Ａｍ Ｊ Ｂｏｔ ５５、４３８〜４４６頁、１９６８年）によって繁殖された１６／１４株の継代培養である。Ｎ−グリカンのコア構造上に２つの植物特異的糖残基を欠いている（コプリヴォラ（Ｋｏｐｒｉｖｏｖａ）ら、Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ ２、５１７〜５２３頁、２００４年）および／またはヒト１，４ガラクトシル転移酵素を含有する（ヒューター（Ｈｕｅｔｈｅｒ）ら、Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ ７、２９２〜２９９頁、２００５年）糖鎖改変された遺伝子導入ニセツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ）株もまた使用した。
【００８１】
標準培養条件
レスキ（Ｒｅｓｋｉ）およびアベル（Ａｂｅｌ）、Ｐｌａｎｔａ １６５、３５４〜３５８頁、１９８５年の単純無機液体変性クノップ培地中（１０００ｍｇ／Ｌ Ｃａ（ＮＯ３）２×４Ｈ２Ｏ ２５０ｍｇ／Ｌ ＫＣｌ、２５０ｍｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、２５０ｍｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏおよび１２．５ｍｇ／Ｌ ＦｅＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、ｐＨ５．８）中において、無菌条件下で植物を無菌状態で生育させた。培養条件は、例えばバウア（Ｂａｕｒ）ら、Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ ３、３３１〜３４０頁、２００５年、またはワイゼ（Ｗｅｉｓｅ）ら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７０、３３７〜３４５頁、２００６年に記載されるとおり変動できる。２００ｍＬの培養液を含有する５００ｍＬエルレンマイアーフラスコ内で植物を生育させ、フラスコを１２０ｒｐｍに設定した独国のＢ．ブラウン・バイオテック・インターナショナル（Ｂ．Ｂｒａｕｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｇｅｒｍａｎｙ））からのサートマット（Ｃｅｒｔｏｍａｔ）Ｒ振盪機上で振盪した。生育箱内の条件は、２５＋／−３℃および１６：８時間の明暗期であった。２本の蛍光灯（オスラム（Ｏｓｒａｍ）Ｌ５８Ｗ／２５）によってフラスコを上から照明し、３５マイクロモル−１ｍ−２を提供した。培養は、独国シュタウフェン（Ｓｔａｕｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のＩＫＡからのウルトラタラックス（Ｕｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘ）ホモジナイザーを使用した分散と、１００ｍＬの新鮮なクノップ培地を含有する２本の新しい５００ｍＬエルレンマイアーフラスコへの接種によって週に１回継代培養した。
【００８２】
プロトプラスト単離および形質転換
バウア（Ｂａｕｒ）ら、Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１１９、３３２〜３４２頁、２００５年で以前記載されたようにして、プロトプラスト単離を実施した。プロトプラストを計数するために、小さな容積の懸濁液をフックス−ローゼンタール（Ｆｕｃｈｓ−Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ）チャンバーに移した。選択マーカー付き（ストレップ（Ｓｔｒｅｐｐ）ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５、４３６８〜４３７３頁、１９９８年）またはマーカーフリー（シュテマー（Ｓｔｅｍｍｅｒ）Ｃ．、コッホ（Ｋｏｃｈ）Ａ．、およびゴール（Ｇｏｒｒ）Ｇ．、「ヒメツリガネゴケのマーカーフリー形質転換（Ｍａｒｋｅｒ−ｆｒｅｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ」、Ｍｏｓｓ ２００４年、第７回年次コケ国際会議（Ｔｈｅ ７ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｍｏｓｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ）を伴うプロトプラスト内へのＰＥＧ媒介直接ＤＮＡ転移によって形質転換を実施した。ＰＥＧ媒介ＤＮＡ転移によって、適切なＤＮＡコンストラクトを同時にプロトプラスト中に導入して、同時形質転換を実施した。
【００８３】
ＰＣＲスクリーニング
適切なプライマーを使用して、ＰＣＲによって異種のＤＮＡコンストラクトの導入を分析した（以下参照）。
【００８４】
シアル酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）の分析
糖タンパク質の単離のために、２ｍＭのジチオスレイトールおよび１μｇ／ｍＬのロイペプチンを含有するｐＨ７．５の１５ｍＬ ２５ｍＭトリス／ＨＣｌ緩衝液に組織を懸濁し、ウルトラタラックス（ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘ）で均質化した。スラリーにトリトンＸ−１００（０．２５％、ｗ／ｖ）を添加して、混合物を４℃で６０分間撹拌した。懸濁液を遠心分離して、可溶性物質を０．４５μｍのフィルターに通過させた。抽出物をｐＨ６．０の２５ｍＭ酢酸アンモニウムに対して徹底的に透析した。得られた透析産物を等容積の４Ｍ酢酸と混合し、８０℃に３時間保った。次にアミコン（Ａｍｉｃｏｎ）からの３ｋＤａカットオフセントリプレップ（Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ）ＹＭ−３装置を使用して、サンプルを限外濾過した。濾液を真空内で濃縮した。
【００８５】
５０μＬのアリコートをＤＭＢで誘導体化した（アルトマン（Ａｌｔｍａｎｎ）およびロモノソフ（Ｌｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ）、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８１、１１１１〜１１１４頁、２０００年、ハラ（Ｈａｒａ）ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６４、１３８〜１４５頁、１９８７年）。ＤＭＢ標識ケト糖酸を逆相カラム（サーモハイパーシル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｈｙｐｅｒｓｉｌ）ＯＤＳ、２５０×４ｍｍ、５μｍ）上で分離して、流速１．２ｍＬ／分でｐＨ５．５の５０ｍＭ酢酸アンモニウムで溶出した。分析物を２０分間で７．６〜１１．４％のアセトニトリルの軽度の勾配で溶出し、蛍光定量的に検出した（ハラ（Ｈａｒａ）ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６４、１３８〜１４５頁、１９８７年）。
【００８６】
ＥＳＩ質量分光（ＥＳＩ−ＭＳ）分析によって、ＤＭＢ−Ｎｅｕ５Ａｃを含有する単離された画分を分析した。ＭＳＭＳ様式のＥＳＩ−ＭＳによって活性化シアル酸（ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ）を分析した。
【００８７】
実施例
１．１ ヒトＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミン−６−キナーゼのクローニング
ヒトＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミン−６−キナーゼ（アクセッション番号：ＡＦ１５５６６３）をコードするｃＤＮＡを植物発現ベクターｐＲＴ１０１中にクローニングした（テップフェール（Ｔｏｅｐｆｅｒ）ら、Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １５、５８９０頁、１９８７年）。得られたコンストラクト中で、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミン−６−キナーゼは３５Ｓプロモーターおよび３５Ｓターミネーターの制御下であり、共に発現コンストラクトと称された。形質転換手順のために、発現コンストラクトを切除した。３５Ｓプロモーターおよび３５Ｓターミネーター制御下のＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミン−６−キナーゼを含有する直線化断片をヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）株の形質転換のために使用した。
【００８８】
平行するアプローチにおいて、ヒトＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミン−６−キナーゼ（アクセッション番号：ＡＦ１５５６６３）をコードするｃＤＮＡをｔｕｂ３プロモーター（アクセッション番号：ＡＹ７２４４７１）およびヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）（Ｐｐ）のα−１，３フコシル転移酵素遺伝子のターミネーターの制御下で、プラスミドｐＢＳ中にクローニングした。ヒトＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミン−６−キナーゼｃＤＮＡをｐＢＳ中へクローニングするのに先だって、ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）のα−１，３フコシル転移酵素遺伝子
（５’−ＣＧＧＴＧＡＴＣＣＣＧＴＴＴＴＣＡＴＡＴＣＡＧＴＧＴＡＴＴＡＴＣＡＴＣＡＧＴＧＡＣＴＧＣＡＴＡＴＴＧＡＣＡＣＣＣＡＡＴＴＣＴＧＡＴＧＡＴＴＴＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＴＴＧＧＴＡＴＧＧＴＴＡＣＡＴＧＣＴＴＴＴＣＡＧＡＧＧＴＴＴＣＴＡＴＧＣＣＧＣＴＧＡＧＴＡＴＴＴＴＣＣＴＧＡＡＴＣＧＣＧＡＧＧＴＧＴＧＡＣＡＧＧＴＴＡＴＣＴＧＣＧＣＣＧＴＣＣＡＣＣＣＡＡＴＡＴＴＴＴＡＴＧＡＴＧＡＧＴＣＧＡＴＧＡＴＴＣＧＴＧＡＧＡＣＴＡＡＴＣＴＡＧＣＴＴＡＡＣＣＴＴＴＴＴＣＴＴＡＣＴＧＧＣＡＡＧＴＣＡＡＡＡＴＴＧＡＧＴＴＴＡＡＡＡＴＡＴＴＴＣＡＧＴＡＴＣＣＴＧＴＴＡＧＴＡＡＴＴＴＣＡＧＡＣＡＣＡＴＧＴＡＴＴＣＴＡＴＧＴＣＴＣＡＴＡＣＴＣＴＴＴＡＣＧＴＧＡＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＡＣＴＴＡＴＡＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＴＣＴＧＴＡＧＡＴＣＡＣＴＧＴＴＴＴＡＧＣＧＣＡＴＡＣＡＡＡＧＡＣＡＡＴＴＧＴＣＴＡＡＡＴＡＴＴＴＴＴＡＡＡＧＡＡＧＧＴＧＡＴＡＴＴＴＴＡＴＴＡＴＡＡＧＡＴＡＧＡＡＧＴＣＡＡＴＡＴＧＴＴＴＴＴＴＴＧＴＴＡＴＧＣＡＣＡＴＧＡＣＴＴＧＡＡＴＡＡＡＡＴＡＡＡＴＴＴＴＴＴＴＧＴＴＡＧＡＴＴＴＡＡＡＴＡＣＴＴＴＴＴＧＡＡＴＴＡＴＡＧＣＴＴＴＧＴＴＧＡＡＡＴＴＡＡＧＧＡＡＴＴＴＡＴＡＴＴＣＡＴＡＡＧＡＡＧＣＴＡＣＴＣＧＡＡＣＡＡＡＴＴＴＡＣＡＡＡＧＡＧＡＡＣＡＴＴＴＧＡＴＡＡＧＴＡＡＡＡＧＴＡＡＴＴＡＡＡＡＧＴＴＴＴＴＴＴＴＡＡＴＴＴＡＡＡＡＡＧＡＴＴＡＡＴＴＴＴＴＡＴＴＡＡＴＡＡＧＡＡＧＡＡＣＴＴＧＧＡＡＡＧＴＴＡＧＡＡＡＡＡＴＡＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＡＡＡＴＴＡＡＧＡＡＡＡＣＡＡＧＧＣＡＡＡＡＣＴＴＴＡＡＴＴＴＡＣＡＡＡＴＡＣＴＴＡＡＴＧＴＡＧＡＴＴＡＡＴＴＴＴＣＴＴＡＴＴＡＴＡＴＡＴＴＡＧＣＡＣＡＡＡＴＴＡＴＣＡＴＴＡＴＧＴＧＡＴＡＴＴＴＴＡＴＧＴＴＡＴＴＧＴ−３’）
（配列番号１）のターミネーターをプライマーＭｏＢ５５８
（５’−ＧＴＴＣＣＧＣＧＧＴＧＡＴＣＣＣＧＴＴＴＴＣＡＴＡＴＣＡＧＴＧＴＡＴＴ−３’）
（配列番号２）およびプライマーＭｏＢ５５７
（５’−ＴＴＴＧＡＧＣＴＣＴＡＣＧＴＡＡＣＡＡＴＡＡＣＡＴ−ＡＡＡＡＴＡＴＣＡＣＡ−３’）
（配列番号３）を使用して、ＰＣＲにより増幅した。増幅した断片をＳａｃＩＩおよびＳａｃＩで切断し、これもまたＳａｃＩＩおよびＳａｃＩで切断したｐＢＳ中にライゲートした。
【００８９】
ヒトＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミン−６−キナーゼ（アクセッション番号：ＡＦ１５５６６３）をコードするｃＤＮＡをＰｐ ｔｕｂ３プロモーターおよび５’ＵＴＲ（アクセッション番号：ＡＹ７２４４７１）とライゲートし、プライマーＭＯＢ１１０８
（５’−ＧＡＴＧＧＡＴＣＣＡＴＴＧＣＣＡＡＴＧＴＡＴＴＧＡＴＴＧＧＣ−３’）
（配列番号４）、ＭＯＢ１１２４
（５’−ＧＴＴＡＴＴＴＣＣＡＴＴＣＴＴＣＴＣＣＡＴＣＴＴＣＧＣＴＡＡＧＧＡＴＧＡＴＣＴＡＣ−３’）
（配列番号５）、およびＭＯＢ１１２５
（５’−ＧＴＣＴＣＴＡＧＡＣＴＡＧＴＡＧＡＴＣＣＴＧＣＧＴＧＴ−３’）
（配列番号６）を使用して、重複ＰＣＲによって増幅した。得られた断片をＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで切断し、Ｐｐ α−１，３フコシル転移酵素遺伝子のターミネーターを含有するｐＢＳ中にライゲートしてＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで切断した。ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）の形質転換のためには、Ｐｐ ｔｕｂ３プロモーター、ヒトＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミン−６−キナーゼのｃＤＮＡ、およびＰｐ α−１，３フコシル転移酵素遺伝子のターミネーターを含んでなる、ＫｐｎＩおよびＳｎａＢＩ切除発現コンストラクトを使用した。
【００９０】
１．２ ヒトＮ−アセチルノイラミン酸リン酸シンターゼのクローニング
ヒトＮ−アセチルノイラミン酸リン酸シンターゼ（アクセッション番号：ＮＭ＿０１８９４６）をコードするｃＤＮＡを植物発現ベクターｐＲＴ１０１中にクローニングした（テップフェール（Ｔｏｅｐｆｅｒ）ら、Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １５、５８９０頁、１９８７年）。ヒトＮ−アセチルノイラミン酸リン酸シンターゼをコードするｃＤＮＡをプライマーＭＯＢ７８５
（５’−ＧＧＣＣＴＧＣＡＧＡＴＧＣＣＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧ−３’）
（配列番号７）およびプライマーＭＯＢ７８６
（５’−ＧＣＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＡＧＡＣＴＴＧＡＴＴＴＴＴＴＴＧＣＣＡＴＧＡ−３’）
（配列番号８）を使用して、ＰＣＲによって増幅した。増幅生成物をＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩで切断し、ｐＲＴ１０１中にクローニングした。得られたコンストラクト中で、Ｎ−アセチルノイラミン酸リン酸シンターゼは、まとめて発現コンストラクトと称される３５Ｓプロモーターおよび３５Ｓターミネーターの制御下であった。形質転換手順のために、Ｓｐｈ Ｉで発現コンストラクトを切断した。３５Ｓプロモーターおよび３５Ｓターミネーター制御下のＮ−アセチルノイラミン酸リン酸シンターゼを含有する直線化断片をヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）株の形質転換のために使用した。
【００９１】
１．３ ヒトＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼのクローニング
ヒトＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼ（アクセッション番号：ＮＭ＿０１８６８６）をコードするｃＤＮＡを植物発現ベクターｐＲＴ１０１中にクローニングした（テップフェール（Ｔｏｅｐｆｅｒ）ら、Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １５、５８９０頁、１９８７年）。ヒトＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼをコードするｃＤＮＡをプライマーＭＯＢ８３５
（５’−ＡＴＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＡＣＴＣＧＧＴＧＧＡＧＡＡＧＧＧ−３’）
（配列番号９）およびプライマーＭＯＢ８３６
（５’−ＴＧＡＧＧＡＴＣＣＣＴＡＴＴＴＴＴＧＧＣＡＴＧＡＡＴＴＡＴＴＡＡＣＣＴ−３’）
（配列番号１０）を使用して、ＰＣＲによって増幅した。増幅生成物をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断し、ｐＲＴ１０１中にクローニングした。得られたコンストラクト中で、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼは、まとめて発現コンストラクトと称される３５Ｓプロモーターおよび３５Ｓターミネーターの制御下であった。形質転換手順のために、Ｓｐｈ Ｉで発現コンストラクトを切断した。３５Ｓプロモーターおよび３５Ｓターミネーター制御下のＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼを含有する直線化断片をヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）株の形質転換のために使用した。
【００９２】
１．４ ヒトＣＭＰ−シアル酸輸送体のクローニング
ヒトＣＭＰ−シアル酸輸送体（アクセッション番号：ＮＭ＿００６４１６）をコードするｃＤＮＡを植物発現ベクターｐＲＴ１０１中にクローニングした（テップフェール（Ｔｏｅｐｆｅｒ）ら、Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １５、５８９０頁、１９８７年）。ヒトＣＭＰ−シアル酸輸送体をコードするｃＤＮＡをプライマーＭＯＢ６３８
（５’−ＧＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＡ−ＡＣＣＡＴＧＧＣＴＧＣＣＣＣＧＡ−３’）
（配列番号１１）およびプライマーＭＯＢ６３９
（５’−ＡＴＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＣＡＣＡＣＣＡＡＴＡＡＣＴＣＴＣ−３’）
（配列番号１２）を使用して、ＰＣＲによって増幅した。得られた断片をＳａｃＩおよびＢａｍＨＩで切断し、ｐＲＴ１０１中にクローニングした。得られたコンストラクト中で、ＣＭＰ−シアル酸輸送体は、まとめて発現コンストラクトと称される３５Ｓプロモーターおよび３５Ｓターミネーターの制御下であった。形質転換手順のために、Ｈｉｎｄ ＩＩＩで発現コンストラクトを切断した。３５Ｓプロモーターおよび３５Ｓターミネーター制御下のＣＭＰ−シアル酸輸送体を含有する直線化断片をヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）株の形質転換のために使用した。
【００９３】
１．５ ヒトβ−１，４ガラクトシル転移酵素のクローニング
ヒューター（Ｈｕｅｔｈｅｒ）ら、Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ ７、２９２〜２９９頁、２００５年、に記載されるようにして、ヒトβ−１，４ガラクトシル転移酵素のクローニングを実施した。得られたコンストラクト中で、β−１，４ガラクトシル転移酵素は、まとめて発現コンストラクトと称される３５Ｓプロモーターおよび３５Ｓターミネーターの制御下であった。形質転換手順のために発現コンストラクトを切断した。３５Ｓプロモーターおよび３５Ｓターミネーター制御下のβ−１，４ガラクトシル転移酵素を含有する直線化断片をヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）株の形質転換のために使用した。
【００９４】
１．６ ヒトα−２，６シアリル転移酵素のクローニング
ヒトα−２，６シアリル−転移酵素（アクセッション番号：ＮＭ＿００３０３２）をコードするｃＤＮＡを植物発現ベクターｐＲＴ１０１中にクローニングした（テップフェール（Ｔｏｅｐｆｅｒ）ら、Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １５、５８９０頁、１９８７年）。ヒトα−２，６シアリル転移酵素をコードするｃＤＮＡをプライマーＭＯＢ６３６
（５’−ＧＣＴＧＡＧＣＴＣＧＡ−ＡＣＡＣＡＴＣＴＴＣＡＴＴＡＴＧ−３’）
（配列番号１３）およびプライマーＭＯＢ６３７
（５’−ＧＡＴＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＣＡＧＴＧＡＡＴＧＧＴＣＣＧ−３’）
（配列番号１４）を使用して、ＰＣＲによって増幅した。増幅生成物をＳａｃＩおよびＢａｍＨＩで切断して、ｐＲＴ１０１中にクローニングした。得られたコンストラクト中で、α−２，６シアリル転移酵素は、まとめて発現コンストラクトと称される３５Ｓプロモーターおよび３５Ｓターミネーターの制御下であった。形質転換手順のために発現コンストラクトをＨｉｎｄ ＩＩＩで切断した。３５Ｓプロモーターおよび３５Ｓターミネーター制御下のα−２，６シアリル転移酵素を含有する直線化断片をヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）株の形質転換のために使用した。
【００９５】
１．７ 形質転換のスクリーニングおよび分析
１．１〜１．６に記載されるコンストラクトの同時形質転換によるＰＥＧ媒介直接ＤＮＡ転移によって、異なるニセツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ）株の形質転換を実施した。
【００９６】
次のようにそれぞれ各コンストラクトに適したプライマーを使用することで、ゲノムＤＮＡ上でＰＣＲによって遺伝子導入株を同定した。１．１：Ｐｐ ｔｕｂ３プロモーターおよびＰｐ α−１，３フコシル転移酵素ターミネーター制御下のヒトＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミン−６−キナーゼにはプライマーＭＯＢ１２１４
（５’−ＧＣＡＧＧＣＴＧＣＣＣＴＴＣＣＴＡＴ−３’）
（配列番号１５）およびプライマーＭＯＢ１１９６
（５’−ＡＧＡＧＡＴＡＴＴＣＴＣＣＴＴＣＡＣ−３’）
（配列番号１６）；１．２：３５Ｓプロモーターおよび３５Ｓターミネーター制御下のヒトＮ−アセチルノイラミン酸リン酸シンターゼにはプライマーＭＯＢ１２１３
（５’−ＡＴＧＣＣＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＧＡＧ−３’）
（配列番号１７）およびプライマーＭＯＢ１２１２
（５’−ＧＴＧＴＣＴＣＣＡＧＡＴＣＣＡＡＣ−３’）
（配列番号１８）；１．３：３５Ｓプロモーターおよび３５Ｓターミネーター制御下のヒトＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼにはプライマーＭＯＢ８３５
（５’−ＡＴＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＡＣＴＣＧＧＴＧＧＡＧＡＡＧＧＧ−３’）
（配列番号９）およびプライマーＭＯＢ１１５３
（５’−ＴＣＧＧＴＣＡＣＴＴＣＡＣＧＡＡＣＴ−３’）
（配列番号１９）；１．４：３５Ｓプロモーターおよび３５Ｓターミネーター制御下のヒトＣＭＰ−シアル酸輸送体にはプライマーＭＯＢ６３８
（５’−ＧＴＣＧＡＧＣＴＣ−ＧＧＡＡＣＣＡＴＧＧＣＴＧＣＣＣＣＧＡ−３’）
（配列番号１１）およびＭＯＢ１１５１
（５’−ＣＡＧＡＴＣＧＧＡＧＣＣＡＡＧＴＴＣＴＧ−３’）
（配列番号２０）；１．５：ヒューター（Ｈｕｅｔｈｅｒ）ら、Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ ７、２９２〜２９９頁、２００５年、に記載されるようなヒトβ−１，４ガラクトシル転移酵素；１．６：３５Ｓプロモーターおよびターミネーター制御下のヒトα−２，６シアリル転移酵素にはプライマーＭＯＢ６３６
（５’−ＧＣＴＧＡＧＣＴＣＧＡＡＣＡＣＡＴＣＴＴＣＡＴＴＡＴＧ−３’）
（配列番号１３）およびプライマーＭＯＢ１１４９
（５’−ＣＧＣＴＧＡＣＡＧＣＡＣＡＡＣＡＧＣ−３’）
（配列番号２１）。
【００９７】
全てのコンストラクト（１．１〜１．６）について遺伝子導入性の株を糖タンパク質上のＮ−グリカンに結合するシアル酸、ならびに遊離シアル酸（ＮｅｕＡｃ５）およびＣＭＰ−シアル酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ５）について分析した。
【００９８】
分析したコケ植物株は、全てのコンストラクト（１．１〜１．６）について遺伝子導入性であり、糖タンパク質のＮ−グリカンに由来する顕著なシアル酸含量を示した。
【００９９】
（１００ｎｍｏｌ／ｇまでの）大量の遊離シアル酸が検出された。遺伝子導入コケ植物中のシアル酸は、標準と比べて同一のスペクトルを示したＭＳＭＳ分析によって確認され、野生型ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）では検出されなかった。
【０１００】
遺伝子導入コケ植物中で高収率の活性化シアル酸（ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ）が検出された。対照的に野生型ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）では、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃは検出できなかった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、形質転換されたコケ植物、酵母、繊毛虫類または藻類細胞中などの非動物真核生物の細胞中において、異種のグリコシル化タンパク質を生成する方法に関する。特に本方法は、ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）細胞などのコケ植物細胞中で、例えばヒトなどの哺乳類で使用するための医薬品タンパク質などのシアル酸残基を含んでなる動物グリコシル化パターンを含んでなる、グリコシル化タンパク質を生成する方法、そのために必要なＤＮＡおよびＲＮＡなどの遺伝物質、ベクター、宿主細胞、その中に遺伝物質を導入する方法、およびその使用に関する。さらに本発明は、本発明の方法に従って得られる新規のポリペプチドおよびタンパク質に関する。さらに本発明は、形質転換された非哺乳類真核生物の細胞、組織または生物中で、シアル酸またはＣＭＰ−シアル酸を生成する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
植物は、広範な組み換えタンパク質の生成に適した生物である（マー（Ｍａ）ら、Ｎａｔ Ｇｅｎ ４、７９４〜８０５頁、２００３年）。ヒトをはじめとする哺乳類で使用するための医薬品タンパク質に関しては、グリコシル化などの翻訳後修飾が必要とされることが多い。しかし例えばヒトにおいて医薬品として使用される予定のタンパク質配列生成に適した異種性遺伝子で形質転換された真核生物細胞系中では、次のような問題に遭遇する。このようなタンパク質上のグリコシル化パターンは天然パターン、すなわちその中にタンパク質が導入された真核生物の細胞系のパターンを獲得することが多く、非動物の、すなわち例えば非哺乳類のグリコシル化パターンを含んでなるグリコシル化タンパク質が生成され、次にこれらは例えばヒトのような哺乳類などの動物で適用すると、免疫原性および／またはアレルゲン性であるかもしれない。
【０００３】
哺乳類由来糖タンパク質と比べて、植物特異的糖タンパク質は２つの追加的な残基を含有する。過去には、植物によって生成された組み換え糖タンパク質の用途は、このようなタンパク質上に獲得される植物特異的Ｎ−グリコシル化によって制限された。コケ植物の場合はコプリヴォラ（Ｋｏｐｒｉｖｏｖａ）ら（Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ ２、５１７〜５２３頁、２００４年）が、種子植物の場合はシュトラッサー（Ｓｔｒａｓｓｅｒ）ら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ５６１、１３２〜１３６頁、２００４年）が、異なるアプローチを使用してこの制限を克服するのに成功している。２件の研究で発生させた植物は、上述の２つの植物特異的糖残基を欠く複雑なＮ−グリコシル化を示した。
【０００４】
さらに植物糖タンパク質には末端β−１，４ガラクトース残基が見つからず、植物中にβ−１，４ガラクトシル転移酵素が存在しないことが示唆される。タバコ植物中（ベイカー（Ｂａｋｋｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９８、２８９９〜２９０４頁、２００１年）、タバコＢＹ２細胞中（パラクパック（Ｐａｌａｃｐａｃ）ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９６、４６９２〜４６９７頁、１９９９年）、ならびに配偶半数体コケ植物中（ヒューター（Ｈｕｅｔｈｅｒ）ら、Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ ７、２９２〜２９９頁、２００５年）へのこの酵素の安定した組み込みおよび発現について記載されている。組み換えヒトβ−１，４−ガラクトシル転移酵素は機能性であり、遺伝子導入材料から単離されたタンパク質は末端β−１，４−ガラクトース残基を示した。
【０００５】
本発明は、哺乳類などの動物においてなおもさらに改善された機能性があるポリペプチドおよびタンパク質が生成されることを確実にするための既存方法のさらなる改善に関する。
【０００６】
最も複雑なＮ−グリカン構造物は、ヒトタンパク質をはじめとする哺乳類タンパク質上に存在し、末端糖残基としてシアル酸を含有する。シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）の非遺伝子導入懸濁液培養細胞中のシアル酸付加複合糖質の存在が、最近シャア（Ｓｈａｈ）ら（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２１、１４７０〜１４７１頁、２００３年）によって記載されているが、これらの結果は議論中である（セヴェノ（Ｓｅｖｅｎｏ）ら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １１、１３５１〜１３５３頁、２００４年）。
【０００７】
しかし先行技術は、シアル酸付加がコケ植物でも起きるかどうか、そして所望のＮ−グリカンの特徴を有する異種の糖タンパク質の組み換え発現ができるようになるかについて、いかなる情報も提供しない。さらに先行技術においてコケ植物中のシアル酸の純粋な存在に関して、利用できるデータはない。
【０００８】
Ｎ−グリカン上へのシアル酸付加の必須条件は、活性化ノイラミン酸（ＣＭＰ ＮｅｕＡｃ）の存在である。哺乳類では、ＣＭＰ ＮｅｕＡｃの前駆物質であるＮｅｕＡｃ（シアル酸）の合成に異なる酵素が関与する。ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミン−６−キナーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＡＦ１５５６６３）は、ＭａｎＮＡｃ−６Ｐを発生させる役目をしており、それはＮ−アセチルノイラミン酸リン酸シンターゼ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０１８９４６）によって処理されてＮｅｕＡｃ−９Ｐになる。ＮｅｕＡｃ−９ＰをＮｅｕＡｃに処理する役目をする酵素については、これまで記載されていなかった。ＮｅｕＡｃの活性化は、哺乳類細胞核中で起きる。活性化シアル酸（ＣＭＰ ＮｅｕＡｃ）を発生させる役目をしているのは、酵素ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０１８６８６）である。活性化生成物は核からゴルジ体中に転位置しなくてはならず、この過程にＣＭＰ−シアル酸輸送体（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００６４１６）が関与する。最後に、例えば１，４結合−ガラクトース残基などの末端糖残基上へのＣＭＰ ＮｅｕＡｃの転移によって、Ｎ−グリカン上へのシアル酸付加が起きる。この目的のために、シアリル転移酵素（例えばα−２，６シアリル転移酵素、アクセッション番号：ＮＭ＿００３０３２）の発現を確実にしなくてはならない。半数体非脈管陸生植物であるコケ植物のヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）を組み換えタンパク質生成のために使用することができる（特許文献１）。
【０００９】
コケ植物の生活環は、光独立栄養的配偶世代によって大半が占められる。その生活環は胞子体が優勢な世代である高等植物のそれとは完全に異なり、高等植物とコケ植物の間には、顕著に多くの相違が観察される。
【００１０】
コケ植物の配偶体は、２つのはっきりと区別できる発達段階によって特徴づけられる。先端生長を通じて発達する原糸体は生育して、２種のみの細胞タイプ（クロロネマおよびカウロネマ細胞）の繊維網目状組織になる。ガメトフォアと称される第２段階は、茎生の生育によって単純な先端系とは区別される。どちらの段階も光独立栄養的に活性である。より複雑なガメトフォアへの分化なしの原糸体の培養が、フラスコ内の懸濁液培養ならびにバイオリアクター培養で示されている（特許文献１）。高等植物では、わずかな細胞タイプのみを含有する、完全に分化して光独立栄養的に活性の多細胞組織の培養については記載されていない。コケ植物細胞系の遺伝的安定性は、植物細胞培養と比べて重要な利点を提供する。高等植物の細胞培養では二次代謝はより分化しており、これが二次代謝産物プロフィールに違いをもたらす。
【００１１】
さらに生化学的レベルにおいて、コケ植物と高等植物との間にはいくつかの重要な違いがある。ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）中の硫酸固定は、高等植物と顕著に異なる。高等植物中の硫酸固定の主要酵素は、アデノシン５’−ホスホ硫酸還元酵素である。ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）では、ホスホ−アデノシン５’−ホスホ硫酸還元酵素を通じた代替経路が共存する（コプリヴォラ（Ｋｏｐｒｉｖｏｖａ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７、３２１９５〜３２２０１頁、２００２年）。この経路は、高等植物では特徴付けられていない。
【００１２】
さらなる違いは、細胞壁の再生に反映される。高等植物に由来するプロトプラストは、培養液とは無関係に新しい細胞壁を迅速に再生する。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を通じた高等植物のプロトプラスト中へのＤＮＡの直接転移は、細胞壁再生過程を遅延させるための４〜１０℃でのプレインキュベーションを必要とする（特許文献２）。対照的にニセツリガネゴケ属（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ）の原糸体に由来するプロトプラストの細胞壁再生は、培養液に依存する。プロトプラストは長期にわたり、細胞壁の再生なしに培養できる。理論による制約は意図しないが、細胞壁再生およびタンパク質グリコシル化に必須のプロトプラストの分泌機構が、高等植物とは異なるようである。さらにヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）は、その核ＤＮＡ中で高度に効率的な相同的組換えを示し、これは植物に固有の特性であって特異的遺伝子破壊を可能にするものであり（ガーク（Ｇｉｒｋｅ）ら、Ｐｌａｎｔ Ｊ １５、３９〜４８頁、１９９８年、ストレップ（Ｓｔｒｅｐｐ）ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５、４３６８〜４３７３頁、１９９８年、コプリヴォラ（Ｋｏｐｒｉｖｏｖａ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７、３２１９５〜３２２０１頁、２００２年、レスキ（Ｒｅｓｋｉ）によるレビュー、Ｐｌａｎｔａ ２０８、３０１〜３０９頁、１９９９年、シェーファー（Ｓｃｈａｅｆｅｒ）および（Ｚｒｙｄ）、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓ １２７、１４３０〜１４３８頁、２００１年、シェーファー（Ｓｃｈａｅｆｅｒ）、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ．５３、４７７〜５０１頁、２００２年）、高等植物との根本的相違をさらに例証する。
【特許文献１】国際公開第０１／２５４５６号パンフレット
【特許文献２】米国特許第５，５０８，１８４号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
動物グリコシル化パターンを含んでなる動物タンパク質、特にシアル酸残基を含有するヒトグリコシル化パターンをその上に含んでなるグリコシル化ヒトタンパク質を生成するより効率的な方法を提供することが、本発明の目的である。ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）などのコケ植物中において、動物グリコシル化パターンを含んでなる異種動物タンパク質、特にシアル酸残基を含有するヒトグリコシル化パターンを含んでなるヒトタンパク質を生成するための効率的な方法を提供することもまた目的である。
【００１４】
これらおよびその他の目的は、以下に提供する説明および実施例から明らかになるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明のコケ植物細胞は、ニセツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ）、ヒョウタンゴケ（Ｆｕｎａｒｉａ）、ミズゴケ（Ｓｐｈａｇｎｕｍ）、ヤノウエノアカゴケゼニゴケ（Ｃｅｒａｔｏｄｏｎ）、ゼニゴケ（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ）、およびダンゴゴケ（Ｓｐｈａｅｒｏｃａｒｐｏｓ）属からのコケおよびゼニゴケ種よりなる群から選択される。コケ植物細胞は好ましくはヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）からのものである。
【００１６】
ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）細胞などのコケ植物細胞は、本明細書に記載されるような本発明の方法に従った形質転換に適したあらゆる細胞であることができ、コケ植物プロトプラスト細胞、原糸体組織中に見られる細胞またはその他の細胞タイプであってもよい。確かに当業者は、形質転換された原糸体組織など、本発明に従う形質転換コケ植物細胞集団を含んでなるコケ植物体組織もまた、本発明の態様を形成することを理解するであろう。
【００１７】
本発明に従って、コケ植物細胞中における発現を駆動する外来性プロモーターと操作可能に結合する、少なくとも１つのヌクレオチド配列を含んでなる、好ましくはヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）細胞である形質転換コケ植物細胞が提供され、前記少なくとも１つのヌクレオチド配列は、コケ植物細胞中で発現されかつ哺乳類ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミン−６−キナーゼ、哺乳類Ｎ−アセチルノイラミン酸リン酸シンターゼ（シアル酸シンターゼ）、哺乳類ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼ、哺乳類ＣＭＰ−シアル酸輸送体、ガラクトシル転移酵素、および哺乳類シアリル転移酵素から選択される、機能性哺乳類タンパク質をコードする。
【００１８】
形質転換コケ植物細胞は、形質転換コケ植物細胞に関して上述される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つの核酸配列を含んでなってもよく、このような配列は機能性タンパク質をコードでき、前記核酸配列はそれぞれ外来性プロモーターと操作可能に結合する。典型的にこのようなヌクレオチド配列は哺乳類配列であり、好ましくはヒト核酸配列から選択される。
【００１９】
本発明の形質転換コケ植物細胞は、典型的にβ−１，４ガラクトシル転移酵素、好ましくはヒトβ−１，４ガラクトシル転移酵素ヌクレオチド配列を含んでなる。
【００２０】
本発明の形質転換コケ植物細胞で使用されるシアリル転移酵素は、典型的に哺乳類α−２，６またはα−２，３シアリル転移酵素から選択され、好ましくはヒトα−２，６シアリル転移酵素ヌクレオチド配列である。
【００２１】
本発明の形質転換コケ植物細胞は、その中でフコシル転移酵素および／またはキシロシル転移酵素活性が顕著に低下され、または除去された細胞である。この効果は例えば、好ましくはｉ）機能不全フコシル転移酵素ヌクレオチド配列および／またはｉｉ）機能不全キシロシル−転移酵素ヌクレオチド配列を含んでなる本発明の形質転換コケ植物細胞を使用して達成されてもよい。
【００２２】
「機能不全」とは、ここでの用法では、フコシル転移酵素（ｆｕｃＴ）およびキシロシル転移酵素（ｘｙｌＴ）の指名された転移酵素ヌクレオチド配列が、１，３結合フコシルおよび１，２結合キシロシル残基を含んでなる植物様グリコシル化パターンで植物Ｎ−結合グリカンを改変できる、機能性ｆｕｃＴおよびｘｙｌＴタンパク質コードするｍＲＮＡを実質的にコードできないことを意味する。好ましくは機能不全ｆｕｃＴおよびｘｙｌＴ植物転移酵素ヌクレオチド配列は、核コケ植物ゲノム（あらかじめ人為的にその他の核酸配列で形質転換されていないコケ植物細胞中にある真の天然コケ植物ゲノムであるか、またはその中であらかじめ所望の核酸配列で核酸配列挿入がなされた形質転換核コケ植物ゲノムにあるかにかかわらず）に含まれる内在性の、すなわちゲノムの天然ｆｕｃＴおよびｘｙｌＴ遺伝子中への外来性ヌクレオチド配列の標的を定めた挿入を含んでなり、それは機能性ｆｕｃＴおよびｘｙｌＴ転移酵素活性をコードするｍＲＮＡの転写を実質的に阻害または抑制する。
【００２３】
当業者に知られているように、フコシル転移酵素および／またはキシロシル転移酵素活性が欠損しているコケ植物細胞は、ＲＮＡｉおよびアンチセンス技術をはじめとするその他の技術によっても生成できる。これらの全ての方法は、その中でフコシル転移酵素および／またはキシロシル転移酵素活性が顕著に低下され、または除去された好ましいコケ植物細胞をもたらす。
【００２４】
本発明のコケ植物細胞またはその祖先は、本明細書に記載されるように哺乳類グリコシル化パターンでグリコシル化された、対象となるタンパク質の一次配列をコードする、対象となる異種遺伝子であらかじめ形質転換されたもののいずれであってもよい。好ましくはグリコシル化パターンはヒト型である。あるいはコケ植物細胞は、本明細書に記載されるとおり本発明の方法に従って、哺乳類グリコシル化パターンがその中に配置される必要がある、少なくとも１つの対象となる主要タンパク質配列、典型的にヒト、またはウシ、ヒツジ、ウマ、およびブタ種などの家畜種をはじめとする哺乳類で使用するための少なくとも１つの対象となる医薬品タンパク質をコードするヌクレオチド配列で、個別に、すなわち同時にまたは長い間かけて形質転換されてもよい。このようなヒトをはじめとする哺乳類で使用するための医薬品糖タンパク質としては、限定されるものではないが、好ましくはＶＥＧＦなどのヒトタンパク質であるタンパク質と、α−インターフェロン、β−インターフェロン、γ−インターフェロンなどのインターフェロンと、第ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、およびＸＩＩ因子から選択される血液凝固因子と、黄体化ホルモン、濾胞刺激ホルモンをはじめとする生殖ホルモンと、表皮性成長因子、血小板由来成長因子をはじめとする成長因子と、顆粒球コロニー刺激因子などと、プロラクチンと、オキシトシンと、甲状腺刺激ホルモンと、副腎皮質刺激ホルモンと、カルシトニンと、副甲状腺ホルモンと、ソマトスタチンと、エリスロポエチン（ＥＰＯ）と、β−グルコセレブロシダーゼなどの酵素と、ＴＮＦα受容体リガンド結合領域とＩｇＧなどのＦｃ部分、受容体、表面タンパク質、膜貫通タンパク質との融合タンパク質の融合タンパク質と、生理学的に活性なそれらの断片が挙げられる。さらに本発明の方法を使用して、特異性モノクローナル抗体などの抗体、または生理学的に活性なそれらの断片を生成できる。これらの抗体またはそれらの断片は、ヒト化またはヒト抗体キメラであってもよい。
【００２５】
好ましくは、ｉ）コケ植物細胞中における発現を駆動する外来性プロモーターと操作可能に結合して、コケ植物細胞中で発現される機能性哺乳類ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミン−６−キナーゼをコードするヌクレオチド配列、ｉｉ）前記コケ植物細胞中における発現を駆動する外来性プロモーターと操作可能に結合して、コケ植物細胞中で発現される機能性哺乳類Ｎ−アセチルノイラミン酸リン酸シンターゼ（シアル酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列、ｉｉｉ）前記コケ植物細胞中における発現を駆動する外来性プロモーターと操作可能に結合して、コケ植物細胞中で発現される機能性哺乳類ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼをコードするヌクレオチド配列、ｉｖ）前記コケ植物細胞中における発現を駆動する外来性プロモーターと操作可能に結合して、コケ植物細胞中で発現される機能性哺乳類ＣＭＰ−シアル酸輸送体をコードするヌクレオチド配列、ｖ）前記コケ植物細胞中における発現を駆動する外来性プロモーターと操作可能に結合して、コケ植物細胞中で発現される機能性哺乳類ガラクトシル転移酵素をコードするヌクレオチド配列、およびｖｉ）前記コケ植物細胞中における発現を駆動する外来性プロモーターと操作可能に結合して、コケ植物細胞中で発現される機能性哺乳類シアリル転移酵素をコードするヌクレオチド配列を含んでなるコケ植物細胞が提供される。
【００２６】
好ましくは、ｉ）機能不全フコシル転移酵素ヌクレオチド配列、ｉｉ）機能不全キシロシル転移酵素ヌクレオチド配列、ｉｉｉ）コケ植物細胞中における発現を駆動する外来性プロモーターと操作可能に結合して、コケ植物細胞中で発現される機能性哺乳類ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミン−６−キナーゼをコードするヌクレオチド配列、ｉｖ）前記コケ植物細胞中における発現を駆動する外来性プロモーターと操作可能に結合して、コケ植物細胞中で発現される機能性哺乳類Ｎ−アセチルノイラミン酸リン酸シンターゼ（シアル酸シンターゼ）をコードするヌクレオチド配列、ｖ）前記コケ植物細胞中における発現を駆動する外来性プロモーターと操作可能に結合して、コケ植物細胞中で発現される機能性哺乳類ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼをコードするヌクレオチド配列、ｖｉ）前記コケ植物細胞中における発現を駆動する外来性プロモーターと操作可能に結合して、コケ植物細胞中で発現される機能性哺乳類ＣＭＰ−シアル酸輸送体をコードするヌクレオチド配列、ｖｉｉ）前記コケ植物細胞中における発現を駆動する外来性プロモーターと操作可能に結合して、コケ植物細胞中で発現される機能性ガラクトシル転移酵素をコードするヌクレオチド配列、およびｖｉｉｉ）前記コケ植物細胞中における発現を駆動する外来性プロモーターと操作可能に結合して、コケ植物細胞中で発現される機能性哺乳類シアリル転移酵素をコードするヌクレオチド配列を含んでなる形質転換コケ植物細胞が提供される。
【００２７】
当業者は、酵素ヌクレオチド配列がｃＤＮＡ配列であってもよく、またはゲノムＤＮＡ配列であってもよく、本発明の形質転換コケ植物細胞またはコケ植物組織中に生じる所望のグリコシル化外来性タンパク質上のＮ−グリカングリコシル化パターンが、完全に哺乳類パターンでなければ、実質的に哺乳類パターン（シアル酸残基を含んでなることを意味する）であり、最も好ましくは適切ならばヒトパターンである限りは、変性的に同等のヌクレオチド配列を含んでなってもよいことを理解するであろう。
【００２８】
バイオリアクター内におけるナシゴケ（Ｌｅｐｔｏｂｒｙｕｍ ｐｙｒｉｆｏｒｍｅ）およびムラサキミズゴケ（Ｓｐｈａｇｎｕｍ ｍａｇｅｌｌａｎｉｃｕｍ）などの本発明で使用するのに適したコケ植物の培養に関する詳細情報は、先行技術で知られている（例えばＥ．ウィルバート（Ｗｉｌｂｅｒｔ）、「アラキドン酸代謝を特に考慮したコケの大量培養に関する生物工学的研究（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｔｕｄｉｅｓ ｃｏｎｃｅｒｎｉｎｇ ｔｈｅ ｍａｓｓ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｍｏｓｓｅｓ ｗｉｔｈ ｐａｒｔｉｃｕｌａｒ ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）」、マインツ大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍａｉｎｚ）博士論文、１９９１年、Ｈ．ルドルフ（Ｒｕｄｏｌｐｈ）およびＳ．ラスムッセン（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ）、「バイオリアクター内で培養されたミズゴケの二次代謝の研究（Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｏｆ Ｓｐｈａｇｎｕｍ ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ ｉｎ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ）」、Ｃｒｙｐｔ．Ｂｏｔ．、３、６７〜７３頁、１９９２年を参照されたい）。本発明の目的で特に好ましいのは、分子生物学技術がこの生物上で実行されていることから、ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）の使用である（レビューについてはＲ．レスキ（Ｒｅｓｋｉ）、「コケの生育、遺伝、および分子生物学（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｍｏｓｓｅｓ）」、Ｂｏｔ．Ａｃｔａ、１１１、１〜１５頁、１９９８年、を参照されたい）。コケ植物の培養のためには、微量元素のような栄養補給剤を伴う（バウア（Ｂａｕｒ）ら、Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ ３、３３１〜３４０頁、２００５年）または伴わない（ワイゼ（Ｗｅｉｓｅ）ら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７０、３３７〜３４５頁、２００６年）培地が使用できる。
【００２９】
異種タンパク質生成のために、ニセツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ）の生物工学的活用に適した形質転換系が開発されている。例えば粒子銃を使用して、原糸体組織内への直接ＤＮＡ転移によって形質転換が成功裏に実施されている。コケプロトプラスト内へのＰＥＧ媒介ＤＮＡ転移もまた、成功裏に達成されている。ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）については、ＰＥＧ媒介形質転換方法に関して何度も記載されており、一過性および安定した形質転換体の双方をもたらす（例えばＫ．ロイター（Ｒｅｕｔｔｅｒ）およびＲ．レスキ（Ｒｅｓｋｉ）、「完全分化コケ植物のバイオリアクター培養中の異種のタンパク質生成（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ ｆｕｌｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｍｏｓｓ ｐｌａｎｔｓ」Ｐ１．Ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２、１４２〜１４７頁、１９９６年を参照されたい）。さらにコケ植物によるＰＥＧ媒介形質転換法でマーカーフリー形質転換も達成でき（シュテマー（Ｓｔｅｍｍｅｒ）Ｃ．、コッホ（Ｋｏｃｈ）Ａ．、およびゴール（Ｇｏｒｒ）Ｇ．、「ヒメツリガネゴケのマーカーフリー形質転換（Ｍａｒｋｅｒ−ｆｒｅｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ」、Ｍｏｓｓ ２００４年、第７回年次コケ国際会議（Ｔｈｅ ７ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｍｏｓｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ）、フライブルク（Ｆｒｅｉｇｕｒｇ）、ドイツ）、引き続く複数ヌクレオチド配列導入のために使用できる。
【００３０】
本発明のさらに別の態様では、
ｉ）コケ植物細胞中における発現を駆動する外来性プロモーターと操作可能に結合する核酸配列を含んでなる少なくとも１つの単離された核酸配列を前記コケ植物細胞中に導入するステップであって、前記少なくとも１つの単離された核酸配列が、コケ植物細胞中で発現しかつ哺乳類ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミン−６−キナーゼ、哺乳類Ｎ−アセチルノイラミン酸リン酸シンターゼ（シアル酸シンターゼ）、哺乳類ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼ、哺乳類ＣＭＰ−シアル酸輸送体、ガラクトシル転移酵素、および哺乳類シアリル転移酵素から選択される機能性タンパク質、好ましくはヒトタンパク質をコードするステップと、
ｉｉ）前記細胞中に、コケ植物細胞中における発現を駆動する外来性プロモーターと操作可能に結合する核酸配列を含んでなる、単離された核酸配列をさらに導入するステップであって、前記核酸が少なくとも１つのグリコシル化哺乳類ポリペプチドをコードするステップと
を含んでなる、コケ植物細胞中で少なくとも１つの外来性グリコシル化哺乳類タンパク質を生成する方法が提供される。
【００３１】
ステップｉｉ）があらかじめ達成されている場合、方法は、
ｉ）前記コケ植物細胞中における発現を駆動する外来性プロモーターと操作可能に結合する核酸配列を含んでなる、形質転換コケ植物細胞を使用するステップであって、前記核酸が少なくとも１つのグリコシル化哺乳類ポリペプチドをコードするステップと、
ｉｉ）前記コケ植物細胞中に、コケ植物細胞中における発現を駆動する外来性プロモーターと操作可能に結合する核酸配列を含んでなる少なくとも１つの単離された核酸配列を導入するステップであって、前記少なくとも１つの単離された核酸配列が、コケ植物細胞中で発現されかつ哺乳類ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミン−６−キナーゼ、哺乳類Ｎ−アセチルノイラミン酸リン酸シンターゼ（シアル酸シンターゼ）、哺乳類ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼ、哺乳類ＣＭＰ−シアル酸輸送体、ガラクトシル転移酵素、および哺乳類シアリル転移酵素から選択される機能性タンパク質をコードするステップと
を含んでなる。
【００３２】
コケ植物細胞を形質転換する方法は、形質転換コケ植物細胞に対して少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つの上述の核酸配列で前記細胞を形質転換するステップを含んでなってもよく、このような配列は機能性タンパク質をコードでき、前記核酸配列はそれぞれ外来性プロモーターと操作可能に結合する。典型的にこのようなヌクレオチド配列は哺乳類配列であり、好ましくはヒト核酸配列から選択される。
【００３３】
本発明の方法は、典型的に機能性ガラクトシル転移酵素、例えば好ましくはヒトβ−１，４ガラクトシル転移酵素ヌクレオチド配列などの哺乳類β−１，４ガラクトシル転移酵素を本発明の形質転換コケ植物細胞に導入するステップを含んでなる。
【００３４】
本発明の方法は、典型的に、本発明の形質転換コケ植物細胞で使用されるシアリル転移酵素もまた用いて、それは典型的に哺乳類α−２，６またはα−２，３シアリル転移酵素ヌクレオチド配列から選択され、好ましくはヒトα−２，６シアリル転移酵素ヌクレオチド配列であるポリヌクレオチドによってコードされる。
【００３５】
本発明の形質転換コケ植物細胞は、典型的に、その中でフコシル転移酵素および／またはキシロシル転移酵素活性が顕著に低下されまたは除去された細胞である。
【００３６】
本発明の好ましい実施態様では、
ｉ）コケ植物細胞中における発現を駆動する外来性プロモーターと操作可能に結合する核酸を含んでなる第１の単離された核酸配列を形質転換コケ植物細胞中に導入するステップであって、前記核酸が少なくとも１つのＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミン−６−キナーゼをコードするステップと、
ｉｉ）コケ植物細胞中における発現を駆動する外来性プロモーターと操作可能に結合する核酸を含んでなる単離された核酸配列を前記細胞中にさらに導入するステップであって、前記核酸が少なくとも１つのＮ−アセチルノイラミン酸リン酸シンターゼ（シアル酸シンターゼ）をコードするステップと、
ｉｉｉ）コケ植物細胞中における発現を駆動する外来性プロモーターと操作可能に結合する核酸を含んでなる単離された核酸配列を前記細胞中にさらに導入するステップであって、前記核酸が少なくとも１つのＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼをコードするステップと、
ｉｖ）コケ植物細胞中における発現を駆動する外来性プロモーターと操作可能に結合する核酸を含んでなる単離された核酸配列を前記細胞中にさらに導入するステップであって、前記核酸が少なくとも１つの哺乳類ＣＭＰ−シアル酸輸送体ポリペプチドをコードするステップと、
ｖ）コケ植物細胞中における発現を駆動する外来性プロモーターと操作可能に結合する核酸を含んでなる単離された核酸配列を前記細胞中にさらに導入するステップであって、前記核酸が少なくとも１つのガラクトシル転移酵素ポリペプチドをコードするステップと、
ｖｉ）コケ植物細胞中における発現を駆動する外来性プロモーターと操作可能に結合する核酸を含んでなる単離された核酸配列を前記細胞中にさらに導入するステップであって、前記核酸が少なくとも１つの哺乳類シアリル転移酵素ポリペプチドをコードするステップと、
ｖｉｉ）コケ植物細胞中における発現を駆動する外来性プロモーターと操作可能に結合する核酸を含んでなる単離された核酸配列を前記細胞中にさらに導入するステップであって、前記核酸が少なくとも１つのグリコシル化哺乳類ポリペプチドをコードするステップと
を含んでなる、形質転換コケ植物細胞中で少なくとも１つの異種のまたは外来性グリコシル化哺乳類タンパク質を生成する方法が提供される。
【００３７】
本明細書に示唆されるとおり、少なくとも１つのガラクトシル転移酵素ポリペプチドは、好ましくは哺乳類β−１，４ガラクトシル転移酵素（β−１，４ ｇａｌＴ）であり、最も好ましくはヒトβ−１，４ガラクトシル転移酵素ポリペプチドであり、少なくとも１つの哺乳類シアリル転移酵素ポリペプチドは好ましくはα−２，３またはα−２，６シアリル転移酵素であり、最も好ましくはヒトα−２，６シアリル転移酵素ポリペプチドである。
【００３８】
さらに好ましくは上の方法は、以下のステップをさらに含んでなる。
ｖｉｉｉ）内在性フコシル転移酵素ヌクレオチド配列を機能不全にするヌクレオチド配列、
ｉｘ）内在性キシロシル転移酵素ヌクレオチド配列を機能不全にするヌクレオチド配列。
【００３９】
あるいは上記の方法は、その中でフコシル転移酵素および／またはキシロシル転移酵素活性が顕著に低下され、または除去されたコケ植物細胞を利用する。
【００４０】
好ましくは上述の全てのグリコシル化哺乳類タンパク質は、ヒト型である。本発明で生成が企図されるその他のタンパク質としては、獣医医療で使用するためのタンパク質が挙げられ、本明細書に記載されるヒトタンパク質の動物相同体に相当してもよい。
【００４１】
外来性プロモーターは、プロモーターを表示するものであり、すなわち対象となる核酸配列の前方に導入されて、それと操作可能に結合する。したがって外来性プロモーターは、本明細書に定義されるとおり選択された核酸構成要素の前方に配置されたものであり、野生型の環境に見られるように、通常対象となる核酸構成要素と結びつく自然または天然プロモーターからは構成されない。したがってプロモーターは対象となるコケ植物細胞由来であってもよいが、野生型コケ植物細胞中において、前方で対象となる核酸と操作可能に結合してはならない。典型的に外来性プロモーターは、宿主細胞以外の供給源から宿主コケ植物細胞に転移されるものである。
【００４２】
本明細書に記載されるとおりの（哺乳類）酵素およびグリコシル化哺乳類タンパク質をコードするｃＤＮＡは、例えばここで定義されるように、そして本発明によって提供されるように、（哺乳類）酵素に操作可能に結合して、グリコシル化哺乳類タンパク質のための核酸配列および／または第２の核酸配列をコードする誘導性または構成的プロモーターなど、コケ植物細胞中で作動可能な少なくとも１つのタイプのプロモーターを含有する。考察するように、これによって遺伝子発現の制御が可能になる。
【００４３】
プロモーターに適用される「誘導性」という用語は、当業者によって良く理解されている。本質的に、誘導性プロモーターの制御下にある発現は（細胞内で発生しても、または外来性に提供されてもよい）加えられた刺激に答えて、「スイッチが入り」または増大する。刺激の性質は、プロモーターの間で変動する。いくつかの誘導性プロモーターは、適切な刺激の不在下では、わずかなまたは検出不可能なレベルの発現（または発現なし）しか引き起こさない。その他の誘導性プロモーターは、刺激の不在下で検出可能な構成的発現を引き起こす。刺激不在下での発現レベルにかかわらず、あらゆる誘導性プロモーターからの発現は妥当な刺激の存在下で増大する。好ましい状況では、表現型の特徴を変更するのに効果的な量で適切な刺激が加わると、発現レベルが増大する。したがって刺激不在下において所望の表現型をもたらすには低すぎる（事実上ゼロでもよい）基礎水準の発現を引き起こす、誘導性（または「スイッチ可能」）プロモーターを使用してもよい。刺激を加えると、発現は所望の表現型をもたらすレベルに増大する（またはスイッチが入る）。
【００４４】
本明細書に示唆されるとおり、コケ植物発現系は、当業者にも知られている。コケ植物プロモーター、特にヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）プロモーターは、宿主ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼに結合して、コード配列（例えば構造的遺伝子）のｍＲＮＡへの下流（３’）転写を開始できるあらゆるＤＮＡ配列である。プロモーターは通常、コード配列の５’末端近位に位置する転写開始領域を有する。この転写開始領域は、通常ＲＮＡポリメラーゼ結合部位（「ＴＡＴＡボックス」）および転写開始部位を含む。コケ植物プロモーターはまた、上流活性化因子配列（ＵＡＳ）と称される第２の領域を有してもよく、それは存在する場合、通常、構造的遺伝子より遠位である。ＵＡＳは制御される（誘導性）発現を可能にする。構成的発現はＵＡＳの不在下で起きる。制御される発現は正または負のどちらであってもよく、それによって転写は増強または低減される。
【００４５】
当業者は、コケ植物代謝経路中で酵素をコードするコケ植物プロモーター配列が、特に有用なプロモーター配列を提供できることを理解するであろう。
【００４６】
さらに天然において生じない合成プロモーターもまた、コケ植物プロモーターとして機能してもよい。例えば１つのコケ植物プロモーターのＵＡＳ配列を別のコケ植物プロモーターの転写活性化領域と連結して、合成雑種プロモーターを作り出してもよい。適切なプロモーターの例は、ザイドラー（Ｚｅｉｄｌｅｒ）ら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．３０、１９９〜２０５頁、１９９６年によってヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）のＴＯＰ １０発現系で使用されたものである。さらにコケ植物プロモーターは、コケ植物ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼに結合して転写を開始する能力を有する、非コケ植物起源の天然プロモーター含むことができる。このようなプロモーターの例としては、記載されているもの、とりわけ、コメＰ−アクチン１プロモーターおよびクラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）ＲｂｃＳプロモーター（ザイドラー（Ｚｅｉｄｌｅｒ）ら、Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１５４、６４１〜６５０頁、１９９９年、コーエン（Ｃｏｈｅｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：１０７８頁、１９８０年、ヘニコフ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、２８３：８３５頁、１９８１年、ヘレンベルク（Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ）ら、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、９６：１１９頁、１９８１年、Ｋ．Ｎ．ティムズ（Ｔｉｍｍｓ）およびＡ．ピューラー（Ｐｕｈｌｅｒ）編、「医学的、環境的、および商業的に重要なプラスミド（Ｐｌａｓｍｉｄｓ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ）」より、ヘレンベルク（Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ）ら、「酵母サッカロミセス・セレヴィシエにおける細菌抗生物質抵抗性遺伝子の発現（Ｔｈｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ Ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）」１９７９年、メルスロー−ピュイガロン（Ｍｅｒｃｅｒａｕ−Ｐｕｉｇａｌｏｎ）ら、Ｇｅｎｅ、１１：１６３頁、１９８０年、パンティエ（Ｐａｎｔｈｉｅｒ）ら、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．、２：１０９頁、１９８０年）が挙げられる。
【００４７】
ＤＮＡ分子は、コケ植物において細胞内で発現されてもよい。プロモーター配列は、ＤＮＡ分子と直接結合していてもよく、その場合、組み換えタンパク質のＮ末端の第１のアミノ酸は常にメチオニンであり、それはｍＲＮＡ上のＡＵＧ開始コドンによってコードされる。所望ならば、Ｎ末端のメチオニンは、臭化シアンとのインキュベーションによって、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）でタンパク質から切断されてもよい。
【００４８】
あるいは外来性タンパク質はまた、コケ植物細胞中または外への外来性タンパク質分泌を提供するリーダー配列断片を含んでなる融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子を作り出すことで、コケ植物細胞から増殖培地内に分泌されてもよい。好ましくはリーダー断片と外来性遺伝子との間にコードされ、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）または生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）のいずれかで切断されることができる処理部位がある。リーダー配列断片は、通常、細胞からのタンパク質分泌を指示する、疎水性アミノ酸を含んでなるシグナルペプチドをコードする。
【００４９】
適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、分泌経路を標的とするコケ植物タンパク質の遺伝子から得ることができ、それもまたコケ植物細胞中への分泌を提供するかもしれない、ＶＥＧＦリーダーなどの非コケ植物起源リーダーなどが存在する。
【００５０】
コケ植物細胞によって認識され、その中で機能性である転写終止配列は、翻訳ストップコドンに対して３’に位置する調節領域であり、したがってプロモーターと共にコード配列に隣接する。これらの配列は、ＤＮＡによってコードされるポリペプチドに翻訳できるｍＲＮＡの転写を指示する。ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）中で機能する適切な終止配列の例は、カリフラワーモザイクウイルスの終止領域である。
【００５１】
典型的にプロモーター、（所望ならば）リーダー、対象となるコード配列、および転写終止配列を含んでなる構成要素は、本発明の発現コンストラクト内でひとまとめにされる。発現コンストラクトは、細菌などの宿主中での安定維持ができる染色体外要素である、ＤＮＡプラスミド中で維持されることが多い。ＤＮＡプラスミドは２つの複製起点を有してもよく、それによって例えば発現のためのコケ植物中で、およびクローニングおよび増幅のための原核生物宿主で、維持できるようになる。一般的に、プラスミドが原核生物宿主細胞中でクローニングおよび増幅のための１つの複製起点を有すれば十分である。さらにＤＮＡプラスミドは、高コピー数または低コピー数のどちらのプラスミドであってもよい。高コピー数のプラスミドは、一般に約５〜約２００個、および通常約１０〜約１５０個の範囲のコピー数を有する。高コピー数プラスミドを含有する宿主は、好ましくは少なくとも約１０個、およびより好ましくは少なくとも約２０個を有する。宿主に対するベクターおよび外来性タンパク質の効果次第で、高コピー数または低コピー数のどちらのベクターを選択してもよい（例えば前出のブレーク（Ｂｒａｋｅ）らを参照されたい）。
【００５２】
あるいは発現コンストラクトは、組み込み型ベクターと共にコケ植物ゲノム中に組み込むことができる。組み込み型ベクターは、通常、コケ植物染色体に相同的な少なくとも１つの配列を含有し、ベクターが発現コンストラクトに隣接する２つの相同的な配列を組み込むことができ、好ましくは含有できるようにする。組み込み型ベクターは、本明細書に記載されるとともに例示されるとおり、ベクター中への包含に適した相同的配列を分泌することで、コケ中の特定遺伝子座に特異的であってもよい。１つ以上の発現コンストラクトを組み込んでもよい。ベクター中に含まれる染色体配列は、ベクター全体の組み込みをもたらすベクター中の単一セグメント、または発現コンストラクトのみの安定した組み込みをもたらすことができる、染色体中の隣接するセグメントに相同的でベクター中の発現コンストラクトと隣接する２つのセグメントとして生じることができる。
【００５３】
通常、染色体外および組み込み発現コンストラクトは選択マーカーを含有して、形質転換されたコケ植物細胞の選択を可能にしてもよい。さらにマーカーフリー形質転換法も使用できる。
【００５４】
選択マーカーは、コケ植物細胞でＧ４１８およびハイグロマイシンＢのそれぞれに対する耐性を与える、Ｇ４１８またはハイグロマイシンＢ耐性遺伝子などのコケ宿主中で発現できる生合成遺伝子を含んでもよい。さらに適切な選択マーカーは、コケ植物細胞に、金属などの有毒化合物存在下で生育する能力も提供する。
【００５５】
あるいは、上述のいくつかの構成要素は、形質転換ベクター中でまとめることができる。形質転換ベクターは、上述のように、通常、ＤＮＡプラスミド内で維持されるか、または組み込み型ベクターに発達させるかのどちらかの選択マーカーを含んでなる。
【００５６】
外来性ＤＮＡをコケ植物細胞中に導入する方法は技術分野でよく知られており、とりわけ次に記載される。シェーファー（Ｓｃｈａｅｆｅｒ）Ｄ．Ｇ．、「ヒメツリガネゴケのための原理およびプロトコル（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍｏｓｓ Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）」、ローザンヌ大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｌａｕｓａｎｎｅ）環境学研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｅｃｏｌｏｇｙ）植物細胞遺伝学研究室（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、Ｄｉｄｉｅｒ．Ｓｃｈａｅｆｅｒ＠ｉｅ−ｐｃ．ｕｎｉｌ．ｃｈ、２００１年５月、ロイター（Ｒｅｕｔｔｅｒ）Ｋ．およびレスキ（Ｒｅｓｋｉ）Ｒ．、Ｐｌａｎｔ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第２巻、第３号、１９９６年９月、ザイドラー（Ｚｅｉｄｌｅｒ）ら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．３０、１９９〜２０５頁、１９９６年。
【００５７】
当業者は上述のように、容易に組み換え核酸配列または遺伝子発現のためのベクターを構築し、プロトコルをデザインできる。プロモーター配列、ターミネーター断片、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子、および必要に応じたその他の配列をはじめとする適切な制御配列を含有する適切なベクターを、選択または構築できる。さらに詳しくは、例えば、「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」第２版、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ｌ９８９年を参照されたい。例えば核酸コンストラクト調製、変異誘発、配列決定、細胞中へのＤＮＡ導入および遺伝子発現、およびタンパク質分析における核酸操作のための多くの既知の技術およびプロトコルについては、オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編、「分子生物学における現行のプロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」第２版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９９２年で詳細に記載される。サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）らおよびオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）らの開示は、参照によって本明細書に援用する。
【００５８】
必然的に当業者は、シアル酸付加されるものを含む、グリコシル化される適切な（ヒト）酵素およびポリペプチドをコードする各核酸配列が、それ自体の外来性プロモーターおよびターミネーターの調節管理下にあることを理解するであろう。２つ以上の標的タンパク質が単一キャリアＲＮＡから生成されることになっている場合、それらが例えばコケ植物細胞培養系の収穫相中で、異なるタンパク質−特異性抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）への結合によって、容易に分離できることが好ましい。
【００５９】
上述のように、選択可能な遺伝的マーカーは遺伝子導入コケ植物細胞の選択を容易にするかもしれず、これらは本明細書に示唆されるとおりの選択可能な表現型を与えるキメラ遺伝子からなってもよい。
【００６０】
グリコシル化および／またはシアル酸付加のための選択されるヒト酵素核酸配列およびポリペプチド配列をコケ植物細胞中に導入する場合、当業者によく知られている特定の配慮が必要である。挿入される核酸は、転写を駆動する効果的な調節因子を含有するコンストラクト内で構築しなくてはならない。細胞中へコンストラクトを輸送する方法が利用可能でなくてはならない。ひとたびコンストラクトが細胞膜内に入ると、内在性染色体への組み込みは生じるかもまたは生じないかもしれない。
【００６１】
本発明はコケ植物細胞の形質転換に適した核酸ベクターを提供し、哺乳類ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミン−６−キナーゼ、哺乳類Ｎ−アセチル−ノイラミン酸リン酸シンターゼ（シアル酸シンターゼ）、哺乳類ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼ、哺乳類ＣＭＰ−シアル酸輸送体、ガラクトシル転移酵素、および哺乳類シアリル転移酵素から選択される少なくとも１つの機能性ポリペプチドをコードする、少なくとも１つの単離されたポリヌクレオチド配列を含む。当業者は、本発明がまた、コケ植物細胞の形質転換に適した１セットの核酸ベクターも提供し、前記セットが上記で定義したように、それぞれが少なくとも１つの単離されたポリヌクレオチド配列を含んでなる、少なくとも２つのベクターを含んでなることを理解するであろう。同様に本発明は、上記で定義したように形質転換コケ植物細胞を生成する方法で使用するためのこの核酸ベクターセットを提供する。
【００６２】
本発明は、上述のように、ベクターまたはコンストラクトで形質転換された宿主細胞、特にコケ植物、酵母、繊毛虫類または藻類細胞などの非動物真核生物細胞、または原核生物（微生物）細胞をさらに包含する。このようにして、本明細書に示唆されるような本発明のヌクレオチド配列を含むコケ植物細胞などの宿主細胞が提供される。細胞内でヌクレオチド配列は、染色体中に組み込まれてもよい。
【００６３】
また本発明に従って、本明細書に記載されるとおり、発現調節のための制御配列の操作的な調節下で、本発明によって提供されるように、少なくとも１つのヌクレオチド配列、特に異種のヌクレオチド配列がそのゲノム中に組み込まれたコケ植物細胞が提供される。コード配列は、その発現のために核酸配列と自然には結合しないものなど、本発明で用いられる核酸配列に対して異種または外来性であってもよい、１つ以上の制御配列と操作可能に結合していてもよい。本発明に従ったヌクレオチド配列を外的誘導性プロモーターの制御下に置いて、発現を使用者の制御下に置いてもよい。本発明のさらに別の態様は、本発明で使用することが企図される核酸配列、または本発明で使用することが企図される配列を含む少なくとも１つの適切なベクターまたはベクターセットをコケ植物細胞中に導入するステップと、ベクターとコケ植物細胞ゲノムとの間の遺伝子組み換えを引き起こし、またはそれを可能にして、前記配列をゲノム中に導入するステップを含む、このようなコケ植物細胞、特にヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）細胞を作る方法を提供する。本発明は、ＧａｌＴヌクレオチドおよび／または哺乳類グリコシル化パターンがそれに付加されることになっているポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含有して、祖先細胞へのヌクレオチド配列導入の結果として本発明における使用に適した、コケ植物細胞、特にヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）細胞にまで及ぶ。
【００６４】
「異種の」という用語は、遺伝子操作を使用して、すなわちヒトの介入によって、論議されているヌクレオチドの遺伝子／配列がコケ植物細胞、またはその祖先中に導入されたことを示すために使用してもよい。遺伝子導入コケ植物細胞、すなわち論議されているヌクレオチド配列について遺伝子導入されたコケ植物細胞が提供されてもよい。導入遺伝子はゲノム外ベクター上にあっても、または好ましくは安定してゲノム中に組み込まれてもよい。異種遺伝子が、内在性同等遺伝子、すなわち常態では同一または同様の機能を果たすものを置換してもよく、または挿入配列は、内在性遺伝子またはその他の配列に追加的であってもよい。異種遺伝子導入の利点は、好みに従って発現に影響を与えるために、配列の発現を選択されたプロモーター制御下に置く能力である。コケ植物細胞に対して異種の、または外性または外来性のヌクレオチド配列は、そのタイプ、株または種の細胞中で非天然であってもよい。したがってヌクレオチド配列は、異なるタイプまたは種のコケ植物細胞の文脈内で、ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）細胞などの特定タイプのコケ植物細胞のコード配列を含んでもよく、またはそれに由来してもよい。さらに別の可能性は、発現調節のためにプロモーター配列などの１つ以上の制御配列と操作可能に結合するような、その中でそれまたは相同体が自然に見られるが、ヌクレオチド配列が、細胞中で、またはその細胞タイプまたは種または株中で自然に生じない核酸に結合し、および／またはそれに隣接する、コケ植物細胞中に配置されるヌクレオチド配列に関する。コケ植物またはその他の宿主細胞中の配列は、同定可能に異種性、外性または外来性であってもよい。
【００６５】
本発明は、本明細書に開示されるような本発明に従った、または本明細書の情報および提案に従って得られる、核酸分子組み合わせの所望のポリペプチド発現産物もまた包含する。例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの適切な宿主細胞中で、適切な条件下においてそれをコードするヌクレオチド配列からの発現によって、このような発現産物を作る方法もまた提供される。当業者は、容易にベクターを構築して、発現および組み換え遺伝子発現生成物回収のためのプロトコルおよびシステムをデザインできる。
【００６６】
本発明はまた、遺伝子導入非動物細胞の生成における、哺乳類ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−グルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミン−６−キナーゼ、哺乳類Ｎ−アセチルノイラミン酸リン酸シンターゼ（シアル酸シンターゼ）、哺乳類ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼ、哺乳類ＣＭＰ−シアル酸輸送体、ガラクトシル転移酵素、および哺乳類シアリル−転移酵素から選択される少なくとも１つのタンパク質をコードする、少なくとも１つのポリヌクレオチド配列の使用も企図し、前記遺伝子導入非動物細胞は好ましくはコケ植物、酵母、繊毛虫類または藻類細胞である。
【００６７】
さらに好ましくは、本発明の宿主細胞は、コケ植物、またはコケ植物の部分、またはコケ植物抽出物または誘導体またはコケ植物細胞培養に含まれる。
【００６８】
さらに上記で定義されるようなコケ植物細胞を含んでなる、コケ植物体またはコケ植物組織が提供される。
【００６９】
本発明はまた、上記で定義されるような少なくとも１つの核酸ベクターまたは１セットの核酸ベクターをコケ植物細胞中に組み込むステップと、コケ植物を前記細胞から再生させるステップを含む、形質転換コケ植物体を生成する方法も提供する。
【００７０】
さらに本発明は、
ｉ）非哺乳類真核細胞、組織または生物を哺乳類ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−グルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミン−６−キナーゼ、哺乳類Ｎ−アセチルノイラミン酸リン酸シンターゼ（シアル酸シンターゼ）、哺乳類ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼから選択される少なくとも１つのポリペプチドをコードする、少なくとも１つのポリヌクレオチド配列で形質転換するステップ、
ｉｉ）請求項２３〜２５のいずれか一項で定義されるとおりの少なくとも１つのベクターまたは１セットのベクターを前記非哺乳類真核細胞、組織または生物中に導入するステップ、または
ｉｉｉ）哺乳類ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−グルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチル−マンノサミン−６−キナーゼ、哺乳類Ｎ−アセチルノイラミン酸リン酸シンターゼ（シアル酸シンターゼ）、哺乳類ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼから選択される少なくとも１つのポリペプチドをコードする、少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含んでなる、あらかじめ形質転換された非哺乳類真核細胞、組織または生物を使用するステップ、および、任意にｉ）、ｉｉ）および／またはｉｉｉ）で処理または定義された細胞、組織または生物からのシアル酸またはＣＭＰ−シアル酸を回収、精製または単離するステップ
を含んでなる、形質転換された非哺乳類真核細胞、組織または生物中にシアル酸またはＣＭＰ−シアル酸生成する方法を提供する。
【００７１】
好ましくは、前記非哺乳類細胞、組織または生物は、酵母、繊毛虫類または藻類細胞、組織または生物である。
【００７２】
本発明に従って生成されるポリペプチドは、本明細書に記載されるとおりの（ａ）ポリペプチドのアレル、変異型、断片、誘導体、突然変異体または相同体であってもよい。アレル、変異型、断片、誘導体、突然変異体または相同体は、上記に示唆されるポリペプチドと実質的に同一機能を有してもよく、本明細書に示されるとおりの、またはその機能性突然変異体であってもよい。本明細書に記載されるとおりのヒトで使用するための医薬品タンパク質の文脈で、当業者はこのようなタンパク質の一次配列およびそれらのグリコシル化パターンが、ヒトで見られるものを模倣するまたは好ましくはそれと同一であることを理解するであろう。
【００７３】
本発明のアミノ酸配列に関連する「相同性」は、同一性または類似性、好ましくは同一性を指すために使用されてもよい。上記に既述したように、高レベルのアミノ酸同一性は、例えば本明細書で同定されるあらゆるドメインなど、機能的に有意なドメインまたは領域に限定されてもよい。
【００７４】
特に本明細書において提供される特定のコケ植物由来ポリペプチド配列の相同体が、このような相同体の突然変異体、変異型、断片、および誘導体として本発明によって提供される。このような相同体は、本明細書においてなされる開示の使用によって容易に得られる。必然的に当業者は、遺伝暗号の縮重のために、対象となる哺乳類タンパク質、特に対象となるヒトタンパク質の正確なコピー（すなわち１００％同一）であるアミノ酸配列を生じる相同体以外のグリコシル化タンパク質配列相同体それ自体が、本発明に包含されることを理解するであろう。したがって本発明は、本明細書に定義され、本明細書に提供される配列情報を使用して得られる、ヒト酵素機能があるアミノ酸配列を含むポリペプチドにまで及ぶ。相同体は、このようなタンパク質が本発明の文脈に適する活性を有するという条件で、本明細書に記載されるとおり、先行技術に記載されている、すなわち実施例の項で提供されるデータベースアクセッション番号の下のアミノ酸配列と、アミノ酸レベルで、好ましくは少なくとも約５０％、または少なくとも５５％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％相同性、または少なくとも約８５％、または少なくとも約８８％相同性、または少なくとも約９０％相同性、最も好ましくは少なくとも約９５％以上の相同性、すなわち同一性を有してもよい。
【００７５】
特定の実施態様では、特異的配列のアレル、変異型、誘導体、突然変異誘導体、突然変異体または相同体は、特異的配列と、例えば約２０％、または約２５％、または約３０％、または約３５％、または約４０％または約４５％のわずかな全体的相同性を示してもよい。しかし機能的に有意なドメインまたは領域では、アミノ酸相同性はより高くあってもよい。推定上の機能的に有意なドメインまたは領域は、相同体の配列比較をはじめとするバイオインフォマティクス法を使用して同定できる。
【００７６】
異なるポリペプチドの機能的に有意なドメインまたは領域は、コードする核酸からの融合タンパク質としての発現のために組み合わせてもよい。例えば、適切ならば酵素活性を持つ得られた発現産物が様々な親タンパク質の断片を含むように、異なる相同体の特に有利なまたは望ましい特性をハイブリッドタンパク質中で組み合わせてもよい。
【００７７】
アミノ酸配列の類似性は、当該技術分野で標準的に使用されるアルシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜１０頁、１９９０年のＴＢＬＡＳＴＮプログラムによって定義され判定されるとおりのものであってもよい。特にマトリックスＢＬＯＳＵＭ６２およびＧＡＰペナルティ：存在：１１、延長：１と共に、ＴＢＬＡＳＴＮ２．０を使用してもよい。使用してもよい別の標準プログラムはベストフィット（ＢｅｓｔＦｉｔ）であり、これは米国５３７１１ウィスコンシン州マジソン市サイエンス・ドライブのジェネティックス・コンピューター・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（５７５Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ ５３７１１））からのウィスコンシンパッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ）、バージョン８、１９９４年９月、の一部である。ベストフィット（ＢｅｓｔＦｉｔ）は、２つの配列間の類似性の最良セグメントの最適アラインメントをする。最適アラインメントは、スミス（Ｓｍｉｔｈ）およびウォーターマン（Ｗａｔｅｒｍａｎ）、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２〜４８９頁、１９８１年の局所的相同性アルゴリズムを使用して、ギャップを挿入してマッチ数を最大化して見いだされる。その他のアルゴリズムとしては、ニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）およびブンシュ（Ｗｕｎｓｃｈ）アルゴリズムを使用して、２つの完全な配列を整列させ、マッチ数を最大化してギャップ数を最小化するＧＡＰが挙げられる。どんなアルゴリズムもそうであるように、一般にデフォルトパラメーターが使用され、ＧＡＰの場合はギャップ生成ペナルティ＝１２およびギャップ延長ペナルティ＝４である。あるいは、ギャップ生成ペナルティ３およびギャップ延長ペナルティ０．１を使用してもよい。ピアースン（Ｐｅａｒｓｏｎ）およびリップマン（Ｌｉｐｍａｎ）、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５：２４４４〜２４４８頁、１９８８年の方法を使用するアルゴリズムＦＡＳＴＡは、さらに別の代案である。
【００７８】
本明細書での「相同性」および「相同的」のどちらの用語の使用も、例えば２つのヌクレオチド配列が適切な条件下で再結合するのに十分に類似であることのみを要する「相同的組換え」などの標準的使用に沿って、比較された配列間のいかなる必然的な進化的関係も暗示しない。
【００７９】
本明細書に援用する全ての参考文献の教示は、明細書の教示に組み込まれるものと理解される。
【実施例】
【００８０】
方法および材料
植物材料
レスキ（Ｒｅｓｋｉ）ら、ヒメツリガネゴケのゲノム分析（Ｇｅｎｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｓｓ Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ（Ｈｅｄｗ．）Ｂ．Ｓ．Ｇ．）」、Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２４４、３５２〜３５９頁、１９９４年により特性決定されたヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ（Ｈｅｄｗ．）Ｂ．Ｓ．Ｇ．）野生型株を使用した。これはＨ．Ｌ．Ｋ．ホワイトハウス（Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ）によって英国ハンティンドンシア（Ｈｕｎｔｉｎｇｄｏｎｓｈｉｒｅ）のグランスデン・ウッド（Ｇｒａｎｓｄｅｎ Ｗｏｏｄ）で収集され、エンゲル（Ｅｎｇｅｌ）（Ａｍ Ｊ Ｂｏｔ ５５、４３８〜４４６頁、１９６８年）によって繁殖された１６／１４株の継代培養である。Ｎ−グリカンのコア構造上に２つの植物特異的糖残基を欠いている（コプリヴォラ（Ｋｏｐｒｉｖｏｖａ）ら、Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ ２、５１７〜５２３頁、２００４年）および／またはヒト１，４ガラクトシル転移酵素を含有する（ヒューター（Ｈｕｅｔｈｅｒ）ら、Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ ７、２９２〜２９９頁、２００５年）糖鎖改変された遺伝子導入ニセツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ）株もまた使用した。
【００８１】
標準培養条件
レスキ（Ｒｅｓｋｉ）およびアベル（Ａｂｅｌ）、Ｐｌａｎｔａ １６５、３５４〜３５８頁、１９８５年の単純無機液体変性クノップ培地中（１０００ｍｇ／Ｌ Ｃａ（ＮＯ３）２×４Ｈ２Ｏ ２５０ｍｇ／Ｌ ＫＣｌ、２５０ｍｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、２５０ｍｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏおよび１２．５ｍｇ／Ｌ ＦｅＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、ｐＨ５．８）中において、無菌条件下で植物を無菌状態で生育させた。培養条件は、例えばバウア（Ｂａｕｒ）ら、Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ ３、３３１〜３４０頁、２００５年、またはワイゼ（Ｗｅｉｓｅ）ら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７０、３３７〜３４５頁、２００６年に記載されるとおり変動できる。２００ｍＬの培養液を含有する５００ｍＬエルレンマイアーフラスコ内で植物を生育させ、フラスコを１２０ｒｐｍに設定した独国のＢ．ブラウン・バイオテック・インターナショナル（Ｂ．Ｂｒａｕｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｇｅｒｍａｎｙ））からのサートマット（Ｃｅｒｔｏｍａｔ）Ｒ振盪機上で振盪した。生育箱内の条件は、２５＋／−３℃および１６：８時間の明暗期であった。２本の蛍光灯（オスラム（Ｏｓｒａｍ）Ｌ５８Ｗ／２５）によってフラスコを上から照明し、３５マイクロモル−１ｍ−２を提供した。培養は、独国シュタウフェン（Ｓｔａｕｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のＩＫＡからのウルトラタラックス（Ｕｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘ）ホモジナイザーを使用した分散と、１００ｍＬの新鮮なクノップ培地を含有する２本の新しい５００ｍＬエルレンマイアーフラスコへの接種によって週に１回継代培養した。
【００８２】
プロトプラスト単離および形質転換
バウア（Ｂａｕｒ）ら、Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１１９、３３２〜３４２頁、２００５年で以前記載されたようにして、プロトプラスト単離を実施した。プロトプラストを計数するために、小さな容積の懸濁液をフックス−ローゼンタール（Ｆｕｃｈｓ−Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ）チャンバーに移した。選択マーカー付き（ストレップ（Ｓｔｒｅｐｐ）ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５、４３６８〜４３７３頁、１９９８年）またはマーカーフリー（シュテマー（Ｓｔｅｍｍｅｒ）Ｃ．、コッホ（Ｋｏｃｈ）Ａ．、およびゴール（Ｇｏｒｒ）Ｇ．、「ヒメツリガネゴケのマーカーフリー形質転換（Ｍａｒｋｅｒ−ｆｒｅｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ」、Ｍｏｓｓ ２００４年、第７回年次コケ国際会議（Ｔｈｅ ７ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｍｏｓｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ）を伴うプロトプラスト内へのＰＥＧ媒介直接ＤＮＡ転移によって形質転換を実施した。ＰＥＧ媒介ＤＮＡ転移によって、適切なＤＮＡコンストラクトを同時にプロトプラスト中に導入して、同時形質転換を実施した。
【００８３】
ＰＣＲスクリーニング
適切なプライマーを使用して、ＰＣＲによって異種のＤＮＡコンストラクトの導入を分析した（以下参照）。
【００８４】
シアル酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）の分析
糖タンパク質の単離のために、２ｍＭのジチオスレイトールおよび１μｇ／ｍＬのロイペプチンを含有するｐＨ７．５の１５ｍＬ ２５ｍＭトリス／ＨＣｌ緩衝液に組織を懸濁し、ウルトラタラックス（ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘ）で均質化した。スラリーにトリトンＸ−１００（０．２５％、ｗ／ｖ）を添加して、混合物を４℃で６０分間撹拌した。懸濁液を遠心分離して、可溶性物質を０．４５μｍのフィルターに通過させた。抽出物をｐＨ６．０の２５ｍＭ酢酸アンモニウムに対して徹底的に透析した。得られた透析産物を等容積の４Ｍ酢酸と混合し、８０℃に３時間保った。次にアミコン（Ａｍｉｃｏｎ）からの３ｋＤａカットオフセントリプレップ（Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ）ＹＭ−３装置を使用して、サンプルを限外濾過した。濾液を真空内で濃縮した。
【００８５】
５０μＬのアリコートをＤＭＢで誘導体化した（アルトマン（Ａｌｔｍａｎｎ）およびロモノソフ（Ｌｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ）、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８１、１１１１〜１１１４頁、２０００年、ハラ（Ｈａｒａ）ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６４、１３８〜１４５頁、１９８７年）。ＤＭＢ標識ケト糖酸を逆相カラム（サーモハイパーシル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｈｙｐｅｒｓｉｌ）ＯＤＳ、２５０×４ｍｍ、５μｍ）上で分離して、流速１．２ｍＬ／分でｐＨ５．５の５０ｍＭ酢酸アンモニウムで溶出した。分析物を２０分間で７．６〜１１．４％のアセトニトリルの軽度の勾配で溶出し、蛍光定量的に検出した（ハラ（Ｈａｒａ）ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６４、１３８〜１４５頁、１９８７年）。
【００８６】
ＥＳＩ質量分光（ＥＳＩ−ＭＳ）分析によって、ＤＭＢ−Ｎｅｕ５Ａｃを含有する単離された画分を分析した。ＭＳＭＳ様式のＥＳＩ−ＭＳによって活性化シアル酸（ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ）を分析した。
【００８７】
実施例
１．１ ヒトＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミン−６−キナーゼのクローニング
ヒトＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミン−６−キナーゼ（アクセッション番号：ＡＦ１５５６６３）をコードするｃＤＮＡを植物発現ベクターｐＲＴ１０１中にクローニングした（テップフェール（Ｔｏｅｐｆｅｒ）ら、Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １５、５８９０頁、１９８７年）。得られたコンストラクト中で、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミン−６−キナーゼは３５Ｓプロモーターおよび３５Ｓターミネーターの制御下であり、共に発現コンストラクトと称された。形質転換手順のために、発現コンストラクトを切除した。３５Ｓプロモーターおよび３５Ｓターミネーター制御下のＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミン−６−キナーゼを含有する直線化断片をヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）株の形質転換のために使用した。
【００８８】
平行するアプローチにおいて、ヒトＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミン−６−キナーゼ（アクセッション番号：ＡＦ１５５６６３）をコードするｃＤＮＡをｔｕｂ３プロモーター（アクセッション番号：ＡＹ７２４４７１）およびヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）（Ｐｐ）のα−１，３フコシル転移酵素遺伝子のターミネーターの制御下で、プラスミドｐＢＳ中にクローニングした。ヒトＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミン−６−キナーゼｃＤＮＡをｐＢＳ中へクローニングするのに先だって、ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）のα−１，３フコシル転移酵素遺伝子
（５’−ＣＧＧＴＧＡＴＣＣＣＧＴＴＴＴＣＡＴＡＴＣＡＧＴＧＴＡＴＴＡＴＣＡＴＣＡＧＴＧＡＣＴＧＣＡＴＡＴＴＧＡＣＡＣＣＣＡＡＴＴＣＴＧＡＴＧＡＴＴＴＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＴＴＧＧＴＡＴＧＧＴＴＡＣＡＴＧＣＴＴＴＴＣＡＧＡＧＧＴＴＴＣＴＡＴＧＣＣＧＣＴＧＡＧＴＡＴＴＴＴＣＣＴＧＡＡＴＣＧＣＧＡＧＧＴＧＴＧＡＣＡＧＧＴＴＡＴＣＴＧＣＧＣＣＧＴＣＣＡＣＣＣＡＡＴＡＴＴＴＴＡＴＧＡＴＧＡＧＴＣＧＡＴＧＡＴＴＣＧＴＧＡＧＡＣＴＡＡＴＣＴＡＧＣＴＴＡＡＣＣＴＴＴＴＴＣＴＴＡＣＴＧＧＣＡＡＧＴＣＡＡＡＡＴＴＧＡＧＴＴＴＡＡＡＡＴＡＴＴＴＣＡＧＴＡＴＣＣＴＧＴＴＡＧＴＡＡＴＴＴＣＡＧＡＣＡＣＡＴＧＴＡＴＴＣＴＡＴＧＴＣＴＣＡＴＡＣＴＣＴＴＴＡＣＧＴＧＡＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＡＣＴＴＡＴＡＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＴＣＴＧＴＡＧＡＴＣＡＣＴＧＴＴＴＴＡＧＣＧＣＡＴＡＣＡＡＡＧＡＣＡＡＴＴＧＴＣＴＡＡＡＴＡＴＴＴＴＴＡＡＡＧＡＡＧＧＴＧＡＴＡＴＴＴＴＡＴＴＡＴＡＡＧＡＴＡＧＡＡＧＴＣＡＡＴＡＴＧＴＴＴＴＴＴＴＧＴＴＡＴＧＣＡＣＡＴＧＡＣＴＴＧＡＡＴＡＡＡＡＴＡＡＡＴＴＴＴＴＴＴＧＴＴＡＧＡＴＴＴＡＡＡＴＡＣＴＴＴＴＴＧＡＡＴＴＡＴＡＧＣＴＴＴＧＴＴＧＡＡＡＴＴＡＡＧＧＡＡＴＴＴＡＴＡＴＴＣＡＴＡＡＧＡＡＧＣＴＡＣＴＣＧＡＡＣＡＡＡＴＴＴＡＣＡＡＡＧＡＧＡＡＣＡＴＴＴＧＡＴＡＡＧＴＡＡＡＡＧＴＡＡＴＴＡＡＡＡＧＴＴＴＴＴＴＴＴＡＡＴＴＴＡＡＡＡＡＧＡＴＴＡＡＴＴＴＴＴＡＴＴＡＡＴＡＡＧＡＡＧＡＡＣＴＴＧＧＡＡＡＧＴＴＡＧＡＡＡＡＡＴＡＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＡＡＡＴＴＡＡＧＡＡＡＡＣＡＡＧＧＣＡＡＡＡＣＴＴＴＡＡＴＴＴＡＣＡＡＡＴＡＣＴＴＡＡＴＧＴＡＧＡＴＴＡＡＴＴＴＴＣＴＴＡＴＴＡＴＡＴＡＴＴＡＧＣＡＣＡＡＡＴＴＡＴＣＡＴＴＡＴＧＴＧＡＴＡＴＴＴＴＡＴＧＴＴＡＴＴＧＴ−３’）
（配列番号１）のターミネーターをプライマーＭｏＢ５５８
（５’−ＧＴＴＣＣＧＣＧＧＴＧＡＴＣＣＣＧＴＴＴＴＣＡＴＡＴＣＡＧＴＧＴＡＴＴ−３’）
（配列番号２）およびプライマーＭｏＢ５５７
（５’−ＴＴＴＧＡＧＣＴＣＴＡＣＧＴＡＡＣＡＡＴＡＡＣＡＴ−ＡＡＡＡＴＡＴＣＡＣＡ−３’）
（配列番号３）を使用して、ＰＣＲにより増幅した。増幅した断片をＳａｃＩＩおよびＳａｃＩで切断し、これもまたＳａｃＩＩおよびＳａｃＩで切断したｐＢＳ中にライゲートした。
【００８９】
ヒトＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミン−６−キナーゼ（アクセッション番号：ＡＦ１５５６６３）をコードするｃＤＮＡをＰｐ ｔｕｂ３プロモーターおよび５’ＵＴＲ（アクセッション番号：ＡＹ７２４４７１）とライゲートし、プライマーＭＯＢ１１０８
（５’−ＧＡＴＧＧＡＴＣＣＡＴＴＧＣＣＡＡＴＧＴＡＴＴＧＡＴＴＧＧＣ−３’）
（配列番号４）、ＭＯＢ１１２４
（５’−ＧＴＴＡＴＴＴＣＣＡＴＴＣＴＴＣＴＣＣＡＴＣＴＴＣＧＣＴＡＡＧＧＡＴＧＡＴＣＴＡＣ−３’）
（配列番号５）、およびＭＯＢ１１２５
（５’−ＧＴＣＴＣＴＡＧＡＣＴＡＧＴＡＧＡＴＣＣＴＧＣＧＴＧＴ−３’）
（配列番号６）を使用して、重複ＰＣＲによって増幅した。得られた断片をＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで切断し、Ｐｐ α−１，３フコシル転移酵素遺伝子のターミネーターを含有するｐＢＳ中にライゲートしてＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで切断した。ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）の形質転換のためには、Ｐｐ ｔｕｂ３プロモーター、ヒトＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミン−６−キナーゼのｃＤＮＡ、およびＰｐ α−１，３フコシル転移酵素遺伝子のターミネーターを含んでなる、ＫｐｎＩおよびＳｎａＢＩ切除発現コンストラクトを使用した。
【００９０】
１．２ ヒトＮ−アセチルノイラミン酸リン酸シンターゼのクローニング
ヒトＮ−アセチルノイラミン酸リン酸シンターゼ（アクセッション番号：ＮＭ＿０１８９４６）をコードするｃＤＮＡを植物発現ベクターｐＲＴ１０１中にクローニングした（テップフェール（Ｔｏｅｐｆｅｒ）ら、Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １５、５８９０頁、１９８７年）。ヒトＮ−アセチルノイラミン酸リン酸シンターゼをコードするｃＤＮＡをプライマーＭＯＢ７８５
（５’−ＧＧＣＣＴＧＣＡＧＡＴＧＣＣＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧ−３’）
（配列番号７）およびプライマーＭＯＢ７８６
（５’−ＧＣＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＡＧＡＣＴＴＧＡＴＴＴＴＴＴＴＧＣＣＡＴＧＡ−３’）
（配列番号８）を使用して、ＰＣＲによって増幅した。増幅生成物をＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩで切断し、ｐＲＴ１０１中にクローニングした。得られたコンストラクト中で、Ｎ−アセチルノイラミン酸リン酸シンターゼは、まとめて発現コンストラクトと称される３５Ｓプロモーターおよび３５Ｓターミネーターの制御下であった。形質転換手順のために、Ｓｐｈ Ｉで発現コンストラクトを切断した。３５Ｓプロモーターおよび３５Ｓターミネーター制御下のＮ−アセチルノイラミン酸リン酸シンターゼを含有する直線化断片をヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）株の形質転換のために使用した。
【００９１】
１．３ ヒトＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼのクローニング
ヒトＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼ（アクセッション番号：ＮＭ＿０１８６８６）をコードするｃＤＮＡを植物発現ベクターｐＲＴ１０１中にクローニングした（テップフェール（Ｔｏｅｐｆｅｒ）ら、Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １５、５８９０頁、１９８７年）。ヒトＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼをコードするｃＤＮＡをプライマーＭＯＢ８３５
（５’−ＡＴＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＡＣＴＣＧＧＴＧＧＡＧＡＡＧＧＧ−３’）
（配列番号９）およびプライマーＭＯＢ８３６
（５’−ＴＧＡＧＧＡＴＣＣＣＴＡＴＴＴＴＴＧＧＣＡＴＧＡＡＴＴＡＴＴＡＡＣＣＴ−３’）
（配列番号１０）を使用して、ＰＣＲによって増幅した。増幅生成物をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断し、ｐＲＴ１０１中にクローニングした。得られたコンストラクト中で、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼは、まとめて発現コンストラクトと称される３５Ｓプロモーターおよび３５Ｓターミネーターの制御下であった。形質転換手順のために、Ｓｐｈ Ｉで発現コンストラクトを切断した。３５Ｓプロモーターおよび３５Ｓターミネーター制御下のＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼを含有する直線化断片をヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）株の形質転換のために使用した。
【００９２】
１．４ ヒトＣＭＰ−シアル酸輸送体のクローニング
ヒトＣＭＰ−シアル酸輸送体（アクセッション番号：ＮＭ＿００６４１６）をコードするｃＤＮＡを植物発現ベクターｐＲＴ１０１中にクローニングした（テップフェール（Ｔｏｅｐｆｅｒ）ら、Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １５、５８９０頁、１９８７年）。ヒトＣＭＰ−シアル酸輸送体をコードするｃＤＮＡをプライマーＭＯＢ６３８
（５’−ＧＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＡ−ＡＣＣＡＴＧＧＣＴＧＣＣＣＣＧＡ−３’）
（配列番号１１）およびプライマーＭＯＢ６３９
（５’−ＡＴＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＣＡＣＡＣＣＡＡＴＡＡＣＴＣＴＣ−３’）
（配列番号１２）を使用して、ＰＣＲによって増幅した。得られた断片をＳａｃＩおよびＢａｍＨＩで切断し、ｐＲＴ１０１中にクローニングした。得られたコンストラクト中で、ＣＭＰ−シアル酸輸送体は、まとめて発現コンストラクトと称される３５Ｓプロモーターおよび３５Ｓターミネーターの制御下であった。形質転換手順のために、Ｈｉｎｄ ＩＩＩで発現コンストラクトを切断した。３５Ｓプロモーターおよび３５Ｓターミネーター制御下のＣＭＰ−シアル酸輸送体を含有する直線化断片をヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）株の形質転換のために使用した。
【００９３】
１．５ ヒトβ−１，４ガラクトシル転移酵素のクローニング
ヒューター（Ｈｕｅｔｈｅｒ）ら、Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ ７、２９２〜２９９頁、２００５年、に記載されるようにして、ヒトβ−１，４ガラクトシル転移酵素のクローニングを実施した。得られたコンストラクト中で、β−１，４ガラクトシル転移酵素は、まとめて発現コンストラクトと称される３５Ｓプロモーターおよび３５Ｓターミネーターの制御下であった。形質転換手順のために発現コンストラクトを切断した。３５Ｓプロモーターおよび３５Ｓターミネーター制御下のβ−１，４ガラクトシル転移酵素を含有する直線化断片をヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）株の形質転換のために使用した。
【００９４】
１．６ ヒトα−２，６シアリル転移酵素のクローニング
ヒトα−２，６シアリル−転移酵素（アクセッション番号：ＮＭ＿００３０３２）をコードするｃＤＮＡを植物発現ベクターｐＲＴ１０１中にクローニングした（テップフェール（Ｔｏｅｐｆｅｒ）ら、Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １５、５８９０頁、１９８７年）。ヒトα−２，６シアリル転移酵素をコードするｃＤＮＡをプライマーＭＯＢ６３６
（５’−ＧＣＴＧＡＧＣＴＣＧＡ−ＡＣＡＣＡＴＣＴＴＣＡＴＴＡＴＧ−３’）
（配列番号１３）およびプライマーＭＯＢ６３７
（５’−ＧＡＴＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＣＡＧＴＧＡＡＴＧＧＴＣＣＧ−３’）
（配列番号１４）を使用して、ＰＣＲによって増幅した。増幅生成物をＳａｃＩおよびＢａｍＨＩで切断して、ｐＲＴ１０１中にクローニングした。得られたコンストラクト中で、α−２，６シアリル転移酵素は、まとめて発現コンストラクトと称される３５Ｓプロモーターおよび３５Ｓターミネーターの制御下であった。形質転換手順のために発現コンストラクトをＨｉｎｄ ＩＩＩで切断した。３５Ｓプロモーターおよび３５Ｓターミネーター制御下のα−２，６シアリル転移酵素を含有する直線化断片をヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）株の形質転換のために使用した。
【００９５】
１．７ 形質転換のスクリーニングおよび分析
１．１〜１．６に記載されるコンストラクトの同時形質転換によるＰＥＧ媒介直接ＤＮＡ転移によって、異なるニセツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ）株の形質転換を実施した。
【００９６】
次のようにそれぞれ各コンストラクトに適したプライマーを使用することで、ゲノムＤＮＡ上でＰＣＲによって遺伝子導入株を同定した。１．１：Ｐｐ ｔｕｂ３プロモーターおよびＰｐ α−１，３フコシル転移酵素ターミネーター制御下のヒトＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミン−６−キナーゼにはプライマーＭＯＢ１２１４
（５’−ＧＣＡＧＧＣＴＧＣＣＣＴＴＣＣＴＡＴ−３’）
（配列番号１５）およびプライマーＭＯＢ１１９６
（５’−ＡＧＡＧＡＴＡＴＴＣＴＣＣＴＴＣＡＣ−３’）
（配列番号１６）；１．２：３５Ｓプロモーターおよび３５Ｓターミネーター制御下のヒトＮ−アセチルノイラミン酸リン酸シンターゼにはプライマーＭＯＢ１２１３
（５’−ＡＴＧＣＣＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＧＡＧ−３’）
（配列番号１７）およびプライマーＭＯＢ１２１２
（５’−ＧＴＧＴＣＴＣＣＡＧＡＴＣＣＡＡＣ−３’）
（配列番号１８）；１．３：３５Ｓプロモーターおよび３５Ｓターミネーター制御下のヒトＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼにはプライマーＭＯＢ８３５
（５’−ＡＴＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＡＣＴＣＧＧＴＧＧＡＧＡＡＧＧＧ−３’）
（配列番号９）およびプライマーＭＯＢ１１５３
（５’−ＴＣＧＧＴＣＡＣＴＴＣＡＣＧＡＡＣＴ−３’）
（配列番号１９）；１．４：３５Ｓプロモーターおよび３５Ｓターミネーター制御下のヒトＣＭＰ−シアル酸輸送体にはプライマーＭＯＢ６３８
（５’−ＧＴＣＧＡＧＣＴＣ−ＧＧＡＡＣＣＡＴＧＧＣＴＧＣＣＣＣＧＡ−３’）
（配列番号１１）およびＭＯＢ１１５１
（５’−ＣＡＧＡＴＣＧＧＡＧＣＣＡＡＧＴＴＣＴＧ−３’）
（配列番号２０）；１．５：ヒューター（Ｈｕｅｔｈｅｒ）ら、Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ ７、２９２〜２９９頁、２００５年、に記載されるようなヒトβ−１，４ガラクトシル転移酵素；１．６：３５Ｓプロモーターおよびターミネーター制御下のヒトα−２，６シアリル転移酵素にはプライマーＭＯＢ６３６
（５’−ＧＣＴＧＡＧＣＴＣＧＡＡＣＡＣＡＴＣＴＴＣＡＴＴＡＴＧ−３’）
（配列番号１３）およびプライマーＭＯＢ１１４９
（５’−ＣＧＣＴＧＡＣＡＧＣＡＣＡＡＣＡＧＣ−３’）
（配列番号２１）。
【００９７】
全てのコンストラクト（１．１〜１．６）について遺伝子導入性の株を糖タンパク質上のＮ−グリカンに結合するシアル酸、ならびに遊離シアル酸（ＮｅｕＡｃ５）およびＣＭＰ−シアル酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ５）について分析した。
【００９８】
分析したコケ植物株は、全てのコンストラクト（１．１〜１．６）について遺伝子導入性であり、糖タンパク質のＮ−グリカンに由来する顕著なシアル酸含量を示した。
【００９９】
（１００ｎｍｏｌ／ｇまでの）大量の遊離シアル酸が検出された。遺伝子導入コケ植物中のシアル酸は、標準と比べて同一のスペクトルを示したＭＳＭＳ分析によって確認され、野生型ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）では検出されなかった。
【０１００】
遺伝子導入コケ植物中で高収率の活性化シアル酸（ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ）が検出された。対照的に野生型ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）では、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃは検出できなかった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コケ植物細胞における発現を駆動する外来性プロモーターと操作可能に結合する、少なくとも１つのヌクレオチド配列を含んでなる形質転換コケ植物細胞であって、前記少なくとも１つのヌクレオチド配列が、前記コケ植物細胞中で発現されかつ哺乳類ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチル−マンノサミン−６−キナーゼ、哺乳類Ｎ−アセチルノイラミン酸リン酸シンターゼ（シアル酸シンターゼ）、哺乳類ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼ、哺乳類ＣＭＰ−シアル酸輸送体、ガラクトシル転移酵素、および哺乳類シアリル−転移酵素から選択される機能性タンパク質をコードする、形質転換コケ植物細胞。
【請求項２】
前記コケ植物細胞が、前記６つの機能性タンパク質の少なくとも２つをコードする少なくとも２つの核酸配列を含んでなり、前記核酸配列がそれぞれ外来性プロモーターと操作可能に結合する、請求項１に記載の形質転換コケ植物細胞。
【請求項３】
前記コケ植物細胞が、前記６つの機能性タンパク質の少なくとも３つをコードする少なくとも３つの核酸配列を含んでなり、前記核酸配列がそれぞれ外来性プロモーターと操作可能に結合する、請求項１または２に記載の形質転換コケ植物細胞。
【請求項４】
前記コケ植物細胞が、前記６つの機能性タンパク質の少なくとも４つをコードする少なくとも４つの核酸配列を含んでなり、前記核酸配列がそれぞれ外来性プロモーターと操作可能に結合する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の形質転換コケ植物細胞。
【請求項５】
前記コケ植物細胞が、前記６つの機能性タンパク質の少なくとも５つをコードする少なくとも５つの核酸配列を含んでなり、前記核酸配列がそれぞれ外来性プロモーターと操作可能に結合する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の形質転換コケ植物細胞。
【請求項６】
前記コケ植物細胞が、請求項１に記載の前記６つの核酸配列の６つ全てを含んでなり、それぞれが外来性プロモーターと操作可能に結合する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の形質転換コケ植物細胞。
【請求項７】
前記核酸配列が哺乳類、好ましくはヒトの核酸配列である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の形質転換コケ植物細胞。
【請求項８】
前記ガラクトシル転移酵素が、β−１，４ガラクトシル転移酵素、好ましくはヒトβ−１，４ガラクトシル転移酵素ヌクレオチド配列である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の形質転換コケ植物細胞。
【請求項９】
前記シアリル転移酵素が、α−２，６またはα−２，３シアリル転移酵素から選択され、好ましくはヒトα−２，６シアリル転移酵素ヌクレオチド配列である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の形質転換コケ植物細胞。
【請求項１０】
フコシル転移酵素および／またはキシロシル転移酵素活性が顕著に低下され、または除去される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の形質転換コケ植物細胞。
【請求項１１】
ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）細胞である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の形質転換コケ植物細胞。
【請求項１２】
ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）の原糸体組織に含まれる、請求項１１に記載の形質転換コケ植物細胞。
【請求項１３】
ｉ）コケ植物細胞中に、コケ植物細胞中における発現を駆動する外来性プロモーターと操作可能に結合する核酸配列を含んでなる少なくとも１つの単離された核酸配列を導入するステップであって、前記少なくとも１つの単離された核酸配列が、前記コケ植物細胞中で発現されかつ哺乳類ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノ−サミン−６−キナーゼ、哺乳類Ｎ−アセチルノイ−ラミン酸リン酸シンターゼ（シアル酸シンターゼ）、哺乳類ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼ、哺乳類ＣＭＰ−シアル酸輸送体、ガラクトシル転移酵素、および哺乳類シアリル転移酵素から選択される機能性タンパク質をコードするステップと、
ｉｉ）前記細胞中に、コケ植物細胞中における発現を駆動する外来性プロモーターと操作可能に結合する核酸配列を含んでなる単離された核酸配列をさらに導入するステップであって、前記核酸が少なくとも１つのグリコシル化哺乳類ポリペプチドをコードするステップと
を含んでなる、形質転換コケ植物細胞中で少なくとも１つの外来性グリコシル化哺乳類タンパク質を生成する方法。
【請求項１４】
ｉ）コケ植物細胞中における発現を駆動する外来性プロモーターと操作可能に結合する核酸配列を含んでなる形質転換コケ植物細胞を使用するステップであって、前記核酸が少なくとも１つのグリコシル化哺乳類ポリペプチドをコードするステップと、
ｉｉ）前記コケ植物細胞中に、コケ植物細胞中における発現を駆動する外来性プロモーターと操作可能に結合する核酸配列を含んでなる少なくとも１つの単離された核酸配列を導入するステップであって、前記少なくとも１つの単離された核酸配列は、コケ植物細胞中で発現されかつ哺乳類ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノ−サミン−６−キナーゼ、哺乳類Ｎ−アセチルノイ−ラミン酸リン酸シンターゼ（シアル酸シンターゼ）、哺乳類ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼ、哺乳類ＣＭＰ−シアル酸輸送体、ガラクトシル転移酵素、および哺乳類シアリル転移酵素から選択される機能性タンパク質をコードするステップと
を含んでなる、形質転換コケ植物細胞中で少なくとも１つの外来性グリコシル化哺乳類タンパク質を生成する方法。
【請求項１５】
グリコシル化哺乳類ポリペプチドがヒトポリペプチドである、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ポリペプチドが、ＶＥＧＦと、α−インターフェロン、β−インターフェロン、γ−インターフェロンなどのインターフェロンと、第ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、およびＸＩＩ因子から選択される血液凝固因子と、黄体化ホルモン、濾胞刺激ホルモンをはじめとする生殖ホルモンと、表皮性成長因子、血小板由来成長因子をはじめとする成長因子と、顆粒球コロニー刺激因子と、プロラクチンと、オキシトシンと、甲状腺刺激ホルモンと、副腎皮質刺激ホルモンと、カルシトニンと、副甲状腺ホルモンと、ソマトスタチンと、エリスロポエチン（ＥＰＯ）と、β−グルコセレブロシダーゼなどの酵素と、ＴＮＦα受容体リガンド結合領域とＩｇＧのＦｃ部分、受容体、表面タンパク質、膜貫通タンパク質、モノクローナル抗体との融合タンパク質などの融合タンパク質と、生理学的に活性なそれらの断片から選択されるポリペプチド群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ｉ）内在性コケ植物フコシル転移酵素ヌクレオチド配列を機能不全にするヌクレオチド配列、および／または
ｉｉ）内在性コケ植物キシロシル転移酵素ヌクレオチド配列機能不全にする第２のヌクレオチド配列
を導入するステップをさらに含んでなる、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記コケ植物細胞が、その中でフコシル転移酵素および／またはキシロシル転移酵素活性が顕著に低下されまたは除去されたコケ植物細胞である、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記外来性プロモーターが、誘導性、化学制御、構成的またはコケ植物細胞特異性プロモーターから選択される請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１３〜１９のいずれか一項に記載の方法で使用するための機能性ガラクトシル転移酵素をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２１】
請求項１３〜１９のいずれか一項に記載の方法で使用するための組み換え哺乳類ガラクトシル転移酵素をコードする、請求項２０に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２２】
請求項１３〜１９のいずれか一項に記載の方法で使用するための組み換えヒトβ−１，４ガラクトシル転移酵素をコードする、請求項２１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２３】
コケ植物細胞の形質転換に適し、哺乳類ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミン−６−キナーゼ、哺乳類Ｎ−アセチル−ノイラミン酸リン酸シンターゼ（シアル酸シンターゼ）、哺乳類ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼ、哺乳類ＣＭＰ−シアル酸輸送体、ガラクトシル転移酵素、および哺乳類シアリル転移酵素から選択される少なくとも１つの機能性ポリペプチドをコードする、少なくとも１つの単離されたポリヌクレオチド配列を含む核酸ベクター。
【請求項２４】
請求項２３に記載の少なくとも１つの単離されたポリヌクレオチド配列をそれぞれが含む少なくとも２つのベクターを含んでなる、コケ植物細胞の形質転換に適した１セットの核酸ベクター。
【請求項２５】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の形質転換コケ植物細胞を生成する方法で使用するための請求項２４に記載の１セットの核酸ベクター。
【請求項２６】
哺乳類ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチル−マンノサミン−６−キナーゼ、哺乳類Ｎ−アセチルノイラミン酸リン酸シンターゼ（シアル酸シンターゼ）、哺乳類ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼ、哺乳類ＣＭＰ−シアル酸輸送体、ガラクトシル転移酵素、および哺乳類シアリル転移酵素から選択される機能性ポリペプチドをコードする、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチド配列を含有する、または請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の少なくとも１つの核酸ベクターまたは１セットの核酸ベクターを含有する、宿主細胞。
【請求項２７】
コケ植物細胞である、請求項２６に記載の宿主細胞。
【請求項２８】
原核生物細胞である、請求項２６に記載の宿主細胞。
【請求項２９】
酵母、繊毛または藻類細胞である、請求項２６に記載の宿主細胞。
【請求項３０】
形質転換の手段によって、前記少なくとも１つのポリヌクレオチドまたは前記少なくとも１つの核酸ベクターまたは前記セットの核酸ベクターを細胞に組み込むステップを含む、請求項２６〜２９のいずれか一項に記載の宿主細胞を生成する方法。
【請求項３１】
哺乳類ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−グルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミン−６−キナーゼ、哺乳類Ｎ−アセチルノイラミン酸リン酸シンターゼ（シアル酸シンターゼ）、哺乳類ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼ、哺乳類ＣＭＰ−シアル酸輸送体、ガラクトシル転移酵素、および哺乳類シアリル転移酵素から選択される少なくとも１つのタンパク質をコードする、少なくとも１つのポリヌクレオチド配列の、遺伝子導入非動物細胞の生成における使用。
【請求項３２】
前記遺伝子導入非動物細胞がコケ植物細胞である、請求項３１に記載の使用。
【請求項３３】
前記遺伝子導入非動物細胞が酵母、繊毛虫類または藻類細胞である、請求項３１に記載の使用。
【請求項３４】
コケ植物、またはコケ植物の一部、またはコケ植物抽出物または誘導体中に、またはコケ植物細胞培養物中に含まれる、請求項２６または２７に記載の宿主細胞。
【請求項３５】
請求項２７、３２、または３４のいずれか一項に記載のコケ植物細胞を含んでなる、コケ植物体またはコケ植物組織。
【請求項３６】
請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の少なくとも１つの核酸ベクターまたは１セットの核酸ベクターをコケ植物細胞中に組み込むステップと、前記細胞からコケ植物を再生するステップとを含む、形質転換コケ植物体を生成する方法。
【請求項３７】
ｉ）非哺乳類真核細胞、組織または生物を、哺乳類ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−グルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミン−６−キナーゼ、哺乳類Ｎ−アセチルノイラミン酸リン酸シンターゼ（シアル酸シンターゼ）、哺乳類ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼから選択される少なくとも１つのポリペプチドをコードする、少なくとも１つのポリヌクレオチド配列で形質転換するステップ、
ｉｉ）請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の少なくとも１つのベクターまたは１セットのベクターを前記非哺乳類真核細胞、組織または生物に導入するステップ、または
ｉｉｉ）哺乳類ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−グルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチル−マンノサミン−６−キナーゼ、哺乳類Ｎ−アセチルノイラミン酸リン酸シンターゼ（シアル酸シンターゼ）、哺乳類ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼから選択される少なくとも１つのポリペプチドをコードする、少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含んでなる、あらかじめ形質転換された非哺乳類真核細胞、組織または生物を使用するステップ、および、任意にｉ）、ｉｉ）および／またはｉｉｉ）で処理されまたは定義される細胞、組織または生物からシアル酸またはＣＭＰ−シアル酸を回収、精製または単離するステップ
を含んでなる、形質転換された前記非哺乳類真核細胞、組織または生物中で、シアル酸またはＣＭＰ−シアル酸を生成する方法。
【請求項３８】
前記非哺乳類細胞、組織または生物が、酵母、繊毛虫類または藻類細胞、組織または生物である、請求項３７に記載の方法。
【請求項１】
コケ植物細胞における発現を駆動する外来性プロモーターと操作可能に結合する、少なくとも１つのヌクレオチド配列を含んでなる形質転換コケ植物細胞であって、前記少なくとも１つのヌクレオチド配列が、前記コケ植物細胞中で発現されかつ哺乳類ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチル−マンノサミン−６−キナーゼ、哺乳類Ｎ−アセチルノイラミン酸リン酸シンターゼ（シアル酸シンターゼ）、哺乳類ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼ、哺乳類ＣＭＰ−シアル酸輸送体、ガラクトシル転移酵素、および哺乳類シアリル−転移酵素から選択される機能性タンパク質をコードする、形質転換コケ植物細胞。
【請求項２】
前記コケ植物細胞が、前記６つの機能性タンパク質の少なくとも２つをコードする少なくとも２つの核酸配列を含んでなり、前記核酸配列がそれぞれ外来性プロモーターと操作可能に結合する、請求項１に記載の形質転換コケ植物細胞。
【請求項３】
前記コケ植物細胞が、前記６つの機能性タンパク質の少なくとも３つをコードする少なくとも３つの核酸配列を含んでなり、前記核酸配列がそれぞれ外来性プロモーターと操作可能に結合する、請求項１または２に記載の形質転換コケ植物細胞。
【請求項４】
前記コケ植物細胞が、前記６つの機能性タンパク質の少なくとも４つをコードする少なくとも４つの核酸配列を含んでなり、前記核酸配列がそれぞれ外来性プロモーターと操作可能に結合する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の形質転換コケ植物細胞。
【請求項５】
前記コケ植物細胞が、前記６つの機能性タンパク質の少なくとも５つをコードする少なくとも５つの核酸配列を含んでなり、前記核酸配列がそれぞれ外来性プロモーターと操作可能に結合する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の形質転換コケ植物細胞。
【請求項６】
前記コケ植物細胞が、請求項１に記載の前記６つの核酸配列の６つ全てを含んでなり、それぞれが外来性プロモーターと操作可能に結合する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の形質転換コケ植物細胞。
【請求項７】
前記核酸配列が哺乳類、好ましくはヒトの核酸配列である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の形質転換コケ植物細胞。
【請求項８】
前記ガラクトシル転移酵素が、β−１，４ガラクトシル転移酵素、好ましくはヒトβ−１，４ガラクトシル転移酵素ヌクレオチド配列である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の形質転換コケ植物細胞。
【請求項９】
前記シアリル転移酵素が、α−２，６またはα−２，３シアリル転移酵素から選択され、好ましくはヒトα−２，６シアリル転移酵素ヌクレオチド配列である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の形質転換コケ植物細胞。
【請求項１０】
フコシル転移酵素および／またはキシロシル転移酵素活性が顕著に低下され、または除去される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の形質転換コケ植物細胞。
【請求項１１】
ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）細胞である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の形質転換コケ植物細胞。
【請求項１２】
ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）の原糸体組織に含まれる、請求項１１に記載の形質転換コケ植物細胞。
【請求項１３】
ｉ）コケ植物細胞中に、コケ植物細胞中における発現を駆動する外来性プロモーターと操作可能に結合する核酸配列を含んでなる少なくとも１つの単離された核酸配列を導入するステップであって、前記少なくとも１つの単離された核酸配列が、前記コケ植物細胞中で発現されかつ哺乳類ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノ−サミン−６−キナーゼ、哺乳類Ｎ−アセチルノイ−ラミン酸リン酸シンターゼ（シアル酸シンターゼ）、哺乳類ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼ、哺乳類ＣＭＰ−シアル酸輸送体、ガラクトシル転移酵素、および哺乳類シアリル転移酵素から選択される機能性タンパク質をコードするステップと、
ｉｉ）前記細胞中に、コケ植物細胞中における発現を駆動する外来性プロモーターと操作可能に結合する核酸配列を含んでなる単離された核酸配列をさらに導入するステップであって、前記核酸が少なくとも１つのグリコシル化哺乳類ポリペプチドをコードするステップと
を含んでなる、形質転換コケ植物細胞中で少なくとも１つの外来性グリコシル化哺乳類タンパク質を生成する方法。
【請求項１４】
ｉ）コケ植物細胞中における発現を駆動する外来性プロモーターと操作可能に結合する核酸配列を含んでなる形質転換コケ植物細胞を使用するステップであって、前記核酸が少なくとも１つのグリコシル化哺乳類ポリペプチドをコードするステップと、
ｉｉ）前記コケ植物細胞中に、コケ植物細胞中における発現を駆動する外来性プロモーターと操作可能に結合する核酸配列を含んでなる少なくとも１つの単離された核酸配列を導入するステップであって、前記少なくとも１つの単離された核酸配列は、コケ植物細胞中で発現されかつ哺乳類ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノ−サミン−６−キナーゼ、哺乳類Ｎ−アセチルノイ−ラミン酸リン酸シンターゼ（シアル酸シンターゼ）、哺乳類ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼ、哺乳類ＣＭＰ−シアル酸輸送体、ガラクトシル転移酵素、および哺乳類シアリル転移酵素から選択される機能性タンパク質をコードするステップと
を含んでなる、形質転換コケ植物細胞中で少なくとも１つの外来性グリコシル化哺乳類タンパク質を生成する方法。
【請求項１５】
グリコシル化哺乳類ポリペプチドがヒトポリペプチドである、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ポリペプチドが、ＶＥＧＦと、α−インターフェロン、β−インターフェロン、γ−インターフェロンなどのインターフェロンと、第ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、およびＸＩＩ因子から選択される血液凝固因子と、黄体化ホルモン、濾胞刺激ホルモンをはじめとする生殖ホルモンと、表皮性成長因子、血小板由来成長因子をはじめとする成長因子と、顆粒球コロニー刺激因子と、プロラクチンと、オキシトシンと、甲状腺刺激ホルモンと、副腎皮質刺激ホルモンと、カルシトニンと、副甲状腺ホルモンと、ソマトスタチンと、エリスロポエチン（ＥＰＯ）と、β−グルコセレブロシダーゼなどの酵素と、ＴＮＦα受容体リガンド結合領域とＩｇＧのＦｃ部分、受容体、表面タンパク質、膜貫通タンパク質、モノクローナル抗体との融合タンパク質などの融合タンパク質と、生理学的に活性なそれらの断片から選択されるポリペプチド群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ｉ）内在性コケ植物フコシル転移酵素ヌクレオチド配列を機能不全にするヌクレオチド配列、および／または
ｉｉ）内在性コケ植物キシロシル転移酵素ヌクレオチド配列機能不全にする第２のヌクレオチド配列
を導入するステップをさらに含んでなる、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記コケ植物細胞が、その中でフコシル転移酵素および／またはキシロシル転移酵素活性が顕著に低下されまたは除去されたコケ植物細胞である、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記外来性プロモーターが、誘導性、化学制御、構成的またはコケ植物細胞特異性プロモーターから選択される請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１３〜１９のいずれか一項に記載の方法で使用するための機能性ガラクトシル転移酵素をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２１】
請求項１３〜１９のいずれか一項に記載の方法で使用するための組み換え哺乳類ガラクトシル転移酵素をコードする、請求項２０に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２２】
請求項１３〜１９のいずれか一項に記載の方法で使用するための組み換えヒトβ−１，４ガラクトシル転移酵素をコードする、請求項２１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２３】
コケ植物細胞の形質転換に適し、哺乳類ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミン−６−キナーゼ、哺乳類Ｎ−アセチル−ノイラミン酸リン酸シンターゼ（シアル酸シンターゼ）、哺乳類ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼ、哺乳類ＣＭＰ−シアル酸輸送体、ガラクトシル転移酵素、および哺乳類シアリル転移酵素から選択される少なくとも１つの機能性ポリペプチドをコードする、少なくとも１つの単離されたポリヌクレオチド配列を含む核酸ベクター。
【請求項２４】
請求項２３に記載の少なくとも１つの単離されたポリヌクレオチド配列をそれぞれが含む少なくとも２つのベクターを含んでなる、コケ植物細胞の形質転換に適した１セットの核酸ベクター。
【請求項２５】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の形質転換コケ植物細胞を生成する方法で使用するための請求項２４に記載の１セットの核酸ベクター。
【請求項２６】
哺乳類ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチル−マンノサミン−６−キナーゼ、哺乳類Ｎ−アセチルノイラミン酸リン酸シンターゼ（シアル酸シンターゼ）、哺乳類ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼ、哺乳類ＣＭＰ−シアル酸輸送体、ガラクトシル転移酵素、および哺乳類シアリル転移酵素から選択される機能性ポリペプチドをコードする、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチド配列を含有する、または請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の少なくとも１つの核酸ベクターまたは１セットの核酸ベクターを含有する、宿主細胞。
【請求項２７】
コケ植物細胞である、請求項２６に記載の宿主細胞。
【請求項２８】
原核生物細胞である、請求項２６に記載の宿主細胞。
【請求項２９】
酵母、繊毛または藻類細胞である、請求項２６に記載の宿主細胞。
【請求項３０】
形質転換の手段によって、前記少なくとも１つのポリヌクレオチドまたは前記少なくとも１つの核酸ベクターまたは前記セットの核酸ベクターを細胞に組み込むステップを含む、請求項２６〜２９のいずれか一項に記載の宿主細胞を生成する方法。
【請求項３１】
哺乳類ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−グルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミン−６−キナーゼ、哺乳類Ｎ−アセチルノイラミン酸リン酸シンターゼ（シアル酸シンターゼ）、哺乳類ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼ、哺乳類ＣＭＰ−シアル酸輸送体、ガラクトシル転移酵素、および哺乳類シアリル転移酵素から選択される少なくとも１つのタンパク質をコードする、少なくとも１つのポリヌクレオチド配列の、遺伝子導入非動物細胞の生成における使用。
【請求項３２】
前記遺伝子導入非動物細胞がコケ植物細胞である、請求項３１に記載の使用。
【請求項３３】
前記遺伝子導入非動物細胞が酵母、繊毛虫類または藻類細胞である、請求項３１に記載の使用。
【請求項３４】
コケ植物、またはコケ植物の一部、またはコケ植物抽出物または誘導体中に、またはコケ植物細胞培養物中に含まれる、請求項２６または２７に記載の宿主細胞。
【請求項３５】
請求項２７、３２、または３４のいずれか一項に記載のコケ植物細胞を含んでなる、コケ植物体またはコケ植物組織。
【請求項３６】
請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の少なくとも１つの核酸ベクターまたは１セットの核酸ベクターをコケ植物細胞中に組み込むステップと、前記細胞からコケ植物を再生するステップとを含む、形質転換コケ植物体を生成する方法。
【請求項３７】
ｉ）非哺乳類真核細胞、組織または生物を、哺乳類ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−グルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミン−６−キナーゼ、哺乳類Ｎ−アセチルノイラミン酸リン酸シンターゼ（シアル酸シンターゼ）、哺乳類ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼから選択される少なくとも１つのポリペプチドをコードする、少なくとも１つのポリヌクレオチド配列で形質転換するステップ、
ｉｉ）請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の少なくとも１つのベクターまたは１セットのベクターを前記非哺乳類真核細胞、組織または生物に導入するステップ、または
ｉｉｉ）哺乳類ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−グルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチル−マンノサミン−６−キナーゼ、哺乳類Ｎ−アセチルノイラミン酸リン酸シンターゼ（シアル酸シンターゼ）、哺乳類ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼから選択される少なくとも１つのポリペプチドをコードする、少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含んでなる、あらかじめ形質転換された非哺乳類真核細胞、組織または生物を使用するステップ、および、任意にｉ）、ｉｉ）および／またはｉｉｉ）で処理されまたは定義される細胞、組織または生物からシアル酸またはＣＭＰ−シアル酸を回収、精製または単離するステップ
を含んでなる、形質転換された前記非哺乳類真核細胞、組織または生物中で、シアル酸またはＣＭＰ−シアル酸を生成する方法。
【請求項３８】
前記非哺乳類細胞、組織または生物が、酵母、繊毛虫類または藻類細胞、組織または生物である、請求項３７に記載の方法。
【公表番号】特表２００９−５０１０１１（Ｐ２００９−５０１０１１Ａ）
【公表日】平成２１年１月１５日（２００９．１．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５２０７９３（Ｐ２００８−５２０７９３）
【出願日】平成１８年７月１２日（２００６．７．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／００６８３１
【国際公開番号】ＷＯ２００７／００６５７０
【国際公開日】平成１９年１月１８日（２００７．１．１８）
【出願人】（５０８０１０２５９）グリーンオーベーション ビオテッヒ ゲーエムベーハー (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１月１５日（２００９．１．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年７月１２日（２００６．７．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／００６８３１
【国際公開番号】ＷＯ２００７／００６５７０
【国際公開日】平成１９年１月１８日（２００７．１．１８）
【出願人】（５０８０１０２５９）グリーンオーベーション ビオテッヒ ゲーエムベーハー (1)
【Ｆターム（参考）】
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